(57)【要約】【課題】高いＷｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質の新規な製造方法を提供すること。【解決手段】Ｗｎｔ蛋白質発現細胞をアファミン含有培地で培養して得られる培養物からＷｎｔ蛋白質を製造する方法であって、以下の工程（１）および／または工程（２）を含むことを特徴とする製造方法：（１）培養物中のＷｎｔ蛋白質を、アファミンを標的とするアフィニティー精製により取得する工程、（２）培養物中のＷｎｔ蛋白質を、アファミンとの複合体を形成したままアフィニティー精製により取得する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｎｔ蛋白質発現細胞をアファミン含有培地で培養して得られる培養物からＷｎｔ蛋白質を製造する方法であって、以下の工程（１）および／または工程（２）を含むことを特徴とする製造方法：
（１）培養物中のＷｎｔ蛋白質を、アファミンを標的とするアフィニティー精製により取得する工程、
（２）培養物中のＷｎｔ蛋白質を、アファミンとの複合体を形成したままアフィニティー精製により取得する工程。
【請求項２】
培養物が界面活性剤を含まないことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
界面活性剤を使用しないことを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
製造されるＷｎｔ蛋白質が、アファミンと複合体を形成しており、かつＷｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
アファミン含有培地が、血清含有培地である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
血清がウシ由来の血清である請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
アファミン含有培地が、精製アファミンを添加した培地である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
精製アファミンが、アフィニティータグを有する組換えアファミンである請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
アファミン含有培地が、当該培地で培養中のアファミン発現細胞から分泌されるアファミンを含む培地である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
アファミン発現細胞が、Ｗｎｔ蛋白質とアファミンの両方を発現する細胞である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
アファミン発現細胞から分泌されるアファミンが、アフィニティータグを有する組換えアファミンである請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
Ｗｎｔ蛋白質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
Ｗｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質を、界面活性剤を含まない溶液中で保存する方法であって、精製されたＷｎｔ蛋白質をアファミンと複合体を形成している状態で保存することを特徴とする精製されたＷｎｔ蛋白質の保存方法。
【請求項１４】
Ｗｎｔ活性を有することを特徴とする精製されたＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体。
【請求項１５】
精製されたＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体を含有するＷｎｔシグナル活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｗｎｔ蛋白質の製造方法および保存方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｗｎｔ蛋白質は、高等生物の発生と形態形成に重要なモルフォゲンとして発見された分泌型蛋白質であり、ヒトやマウスでは１９種類のタイプが知られている。近年、Ｗｎｔ蛋白質は、骨形成（非特許文献１）、がん（非特許文献２）、幹細胞の維持（非特許文献３）などに深く関わることが認識され、医学生物学研究者だけでなく製薬企業からも注目されている。Ｗｎｔ蛋白質は特定のセリン残基が脂肪酸（パルミトレイン酸）で修飾されており（非特許文献４，５）、強い疎水性により水溶液中では凝集・変性するため、精製および保存が非常に難しいことが広く知られている。一方、この脂肪酸修飾はＷｎｔ蛋白質の生理活性に必須であり、受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ蛋白質との結合に関与することが報告されている（非特許文献６）。このように、Ｗｎｔ蛋白質は近年非常に注目を浴びている研究対象および研究ツールであるが、精製および保存の困難性がＷｎｔ蛋白質に関連する研究の大きな障害となっている。
【０００３】
Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ａなどのＷｎｔ蛋白質を安定発現するＬ細胞（マウス線維芽細胞由来）が樹立され、ＡＴＣＣなどから入手可能である（ATCC CRL-2647、ATCC CRL-2814など）。Ｗｎｔ活性を評価する研究では、ほとんどの場合、これらＷｎｔ蛋白質産生細胞の培養上清を未精製の状態で使用している。しかし、培養上清中のＷｎｔ蛋白質の濃度を決定できないため、定量的な検討ができないという問題がある。また、Ｗｎｔ蛋白質の細胞からの分泌には、培地へのウシ胎児血清の添加を必要とするため、必然的に上記の培養上清にはウシ胎児血清が含まれることになる。したがって、血清中の成分が影響を及ぼす可能性があるアッセイ（たとえば細胞分化アッセイなど）には、Ｗｎｔ蛋白質産生細胞の培養上清を使用できない。このような問題から、精製したＷｎｔ蛋白質を使用することが、種々の局面で望まれている。
【０００４】
現在、Ｗｎｔ蛋白質の精製法は、Ｗｎｔ蛋白質の安定発現細胞の培養上清から複数のクロマトグラフィーによって行う方法が確立している（非特許文献７）。また、この方法で製造された精製Ｗｎｔ蛋白質が、Ｒ＆Ｄシステムズ社等から市販されている。しかしながら、非特許文献７の精製方法は非常に煩雑でその実施にはかなりの習熟が必要であり、大規模の蛋白質精製設備を必要とする。さらにこの方法はその一連の過程で常に界面活性剤および高濃度の塩の添加が必須であり、この方法で精製されたＷｎｔ蛋白質を使用すると、界面活性剤や塩が同時に添加されてしまうという問題がある。しかも、非特許文献７の方法で精製されたＷｎｔ蛋白質を、活性を維持したまま保存することが極めて難しく、市販の精製Ｗｎｔ蛋白質は高価であるにもかかわらず、活性は非常に低い。すなわち、現在の技術では、高純度で濃度が既知であり、かつ、生理的緩衝液に溶解した状態で高い活性を保持したＷｎｔ蛋白質を取得することは不可能である。したがって、このようなＷｎｔ蛋白質を提供することができれば、Ｗｎｔ蛋白質に関連する多くの有用な研究を飛躍的に加速することが可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Baron & Kneissel, Nature Med., 19, 179 (2013)
【非特許文献２】Anastas & Moon, Nature Rev. Cancer, 13, 11 (2013)
【非特許文献３】Van Camp et al., Stem Cell Rev., 10, 207 (2014)
【非特許文献４】Willert et al., Nature, 423, 448 (2003)
【非特許文献５】Kishida et al., Mol. Cell. Biol., 24, 4487 (2004)
【非特許文献６】Janda et al., Science, 337, 59 (2012)
【非特許文献７】Willert, Methods Mol Biol., 468, 17 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、高いＷｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質の新規な製造方法、およびＷｎｔ活性を損なうことなくＷｎｔ蛋白質を溶液中で保存する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明は、上記の課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］Ｗｎｔ蛋白質発現細胞をアファミン含有培地で培養して得られる培養物からＷｎｔ蛋白質を製造する方法であって、以下の工程（１）および／または工程（２）を含むことを特徴とする製造方法：
（１）培養物中のＷｎｔ蛋白質を、アファミンを標的とするアフィニティー精製により取得する工程、
（２）培養物中のＷｎｔ蛋白質を、アファミンとの複合体を形成したままアフィニティー精製により取得する工程。
［２］界面活性剤を使用しないことを特徴とする前記［１］に記載の製造方法。
［３］製造されるＷｎｔ蛋白質が、アファミンと複合体を形成しており、かつＷｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］アファミン含有培地が、血清含有培地である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］血清がウシ由来の血清である前記［４］に記載の製造方法。
［６］アファミン含有培地が、精製アファミンを添加した培地である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［７］精製アファミンが、アフィニティータグを有する組換えアファミンである前記［６］に記載の製造方法。
［８］アファミン含有培地が、当該培地で培養中のアファミン発現細胞から分泌されるアファミンを含む培地である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［９］アファミン発現細胞が、Ｗｎｔ蛋白質とアファミンの両方を発現する細胞である前記［８］に記載の製造方法。
［１０］アファミン発現細胞から分泌されるアファミンが、アフィニティータグを有する組換えアファミンである前記［８］または［９］に記載の製造方法。
［１１］Ｗｎｔ蛋白質が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６からなる群から選択されることを特徴とする前記［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］Ｗｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質を界面活性剤を含まない溶液中で保存する方法であって、Ｗｎｔ蛋白質をアファミンと複合体を形成している状態で保存することを特徴とするＷｎｔ蛋白質の保存方法。
［１３］Ｗｎｔ活性を有することを特徴とするＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体。
［１４］Ｗｎｔ蛋白質−アファミン複合体を含有するＷｎｔシグナル活性化剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、Ｗｎｔ蛋白質の新規な製造方法および保存方法を提供することができる。本発明の製造方法によれば、高いＷｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質を、特殊な設備を用いることなく簡便かつ短時間で製造することができる。また、本発明の保存方法によれば、Ｗｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質を界面活性剤を含まない溶液中で、活性を損なうことなく、長期間安定に保存することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】アフィニティータグ付きマウスＷｎｔ３ａ（Ｗ−Ｗｎｔ３ａ）の構造を示す図である。
【図２】Ｌ−３ａ細胞およびＷ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ細胞の培養上清中のＷｎｔ３ａ蛋白質をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す図である。
【図３】Ｌ−３ａ細胞およびＷ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ細胞の培養上清を試料として、ＴＣＦレポーターアッセイを行った結果を示す図である。
【図４】Ｐ２０．１抗体セファロースを用いてＷ−Ｗｎｔ３ａを精製する過程において得られたｗａｓｈフラクション（ｗａｓｈ１〜５）およびｅｌｕｔｅフラクション（ｅｌｕｔｅ１〜１０）を電気泳動に供した結果を示す図である。
【図５】組換えヒトアファミンを添加した血清不含培地を用いてＷｎｔ３ａ発現細胞（Ｌ３ａ、Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ）を培養し、上清中のＷｎｔ３ａをウエスタンブロッティングで検出した結果を示す図である。
【図６】５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含む培地または血清の代わりに組換えヒトアファミンを添加した培地でＷ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫを培養した上清中のＷ−Ｗｎｔ３ａを、Ｐ２０．１抗体セファロースを用いて精製し、電気泳動に供した結果を示す図である。
【図７】抗ウシアファミンポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いて、ウシ胎児血清中のアファミンを免疫沈降させ、電気泳動で確認した結果を示す図である。
【図８】ウシ胎児血清を含む培地を用いてＷｎｔ３ａ発現細胞（Ｌ３ａ、Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ）を培養し、培養上清から抗ウシアファミンモノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行い、得られた沈降物を電気泳動およびウエスタンブロッティングに供した結果を示す図である。
【図９】Ｗ−Ｗｎｔ３ａ安定発現株（Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ）の培養上清を、Ｐ２０．１抗体セファロースを用いて精製し、界面活性剤を含まない試料と界面活性剤を含む試料を調製し、これらの試料をゲルろ過クロマトグラフィーに供した結果を示す図である。
【図１０】図９のゲルろ過クロマトグラフィーにおいてそれぞれ１６本のフラクションを採取し、電気泳動に供してクマシー染色した結果、抗Ｗｎｔ３ａ抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した結果、および抗ウシアファミン抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した結果を示す図である。
【図１１】Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体の活性を、ＴＣＦレポーターアッセイにより確認した結果を示す図である。
【図１２】４℃または−８０℃で保存したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体の活性を、ＴＣＦレポーターアッセイにより確認した結果を示す図である。
【図１３】Ｐ２０．１抗体セファロースを用いてＷ−Ｗｎｔ５ａを精製する過程において得られたｗａｓｈフラクション（ｗａｓｈ１〜５）およびｅｌｕｔｅフラクション（ｅｌｕｔｅ１〜１０）を電気泳動に供した結果を示す図である。
【図１４】Ｗ−Ｗｎｔ５ａ安定発現株（Ｗ−Ｗｎｔ５ａ／ＨＥＫ）の培養上清を、Ｐ２０．１抗体セファロースを用いて精製し、ゲルろ過クロマトグラフィーに供し、第１ピークの１〜６フラクション、第２ピークの７〜１５フラクションを採取し、電気泳動に供してＯＲＩＯＬＥ染色した結果、抗Ｗｎｔ５ａ抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した結果を示す図である。
【図１５】Ｗｎｔ５ａ−アファミン複合体および単体のＷｎｔ５ａの活性を、Ｄｖｌ２のリン酸化を指標に評価した結果を示す図である。
【図１６】抗ウシアファミンモノクローナル抗体を用いて、Ｌ−３ａ細胞の培養上清からタグの付いていないＷｎｔ３ａを精製する過程において得られたｗａｓｈフラクション（ｗａｓｈ１〜５）およびｅｌｕｔｅフラクション（ｅｌｕｔｅ１〜１０）を電気泳動に供した結果を示す図である。
【図１７】Ｗｎｔ３ａ／ヒトアファミン共発現で得られる複合体の分泌促進効果を示す図である。
【図１８】Ｗｎｔ３ａ／ヒトアファミン共発現細胞の培養上清からの抗ＰＡタグ抗体を用いた精製の結果を示す図である。
【図１９】Ｗｎｔ３ａ／ヒトアファミン共発現細胞の培養上清から精製した複合体の活性をＴＣＦレポーターアッセイにより確認した結果を示す図である。
【図２０】Ｗｎｔ３ａ／ヒトアファミン共発現で得られた複合体をゲルろ過クロマトグラフィーに供したクロマトチャート、および２箇所のピークのフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す図である。
【図２１】１２種類のヒトＷｎｔのいずれかとヒトアファミンとの共発現細胞の培養上清から抗ＰＡタグ抗体を用いて免疫沈降し、沈降物をビオチン修飾抗ＰＡタグ抗体によるウエスタンブロッティングに供した結果を示す図である。
【図２２】１２種類のヒトＷｎｔのいずれかとヒトアファミンとの共発現細胞の培養上清からＰ２０．１抗体を用いて免疫沈降し、沈降物をビオチン修飾抗ＰＡタグ抗体によるウエスタンブロッティングに供した結果を示す図である。
【図２３】ヒトＷｎｔ３／ヒトアファミン共発現で得られた複合体をゲルろ過クロマトグラフィーに供したクロマトチャート、および２箇所のピークのフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔Ｗｎｔ蛋白質の製造方法〕
本発明は、新規なＷｎｔ蛋白質の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、Ｗｎｔ蛋白質発現細胞をアファミン含有培地で培養して得られる培養物からＷｎｔ蛋白質を製造する方法であって、以下の工程（１）および／または工程（２）を含むものであればよい。
（１）培養物中のＷｎｔ蛋白質を、アファミンを標的とするアフィニティー精製により取得する工程
（２）培養物中のＷｎｔ蛋白質を、アファミンとの複合体を形成したままアフィニティー精製により取得する工程
本発明の製造方法は、Ｗｎｔ蛋白質発現細胞をアファミン含有培地で培養して得られる培養物からＷｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質を製造できる限り、工程（１）、工程（２）以外の工程を含んでいてもよく、その内容は限定されない。
【００１１】
本発明の製造方法により製造されるＷｎｔ蛋白質の由来は特に限定されず、各種生物由来のＷｎｔ蛋白質を好適に製造することができる。好ましくは哺乳動物由来のＷｎｔ蛋白質である。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられるが、限定されない。哺乳動物のＷｎｔ蛋白質としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６が挙げられる。
【００１２】
Ｗｎｔ蛋白質発現細胞は、Ｗｎｔ蛋白質を発現する細胞であれば細胞の由来（生物種や培養形態）は特に限定されず、Ｗｎｔ蛋白質を安定発現する細胞でもよく、Ｗｎｔ蛋白質を一過性に発現する細胞でもよい。例えば、マウスＷｎｔ３ａを安定発現するＬ細胞（ATCC CRL-2647）、マウスＷｎｔ５ａを安定発現するＬ細胞（ATCC CRL-2814）などを好ましく用いることができる。また、Ｗｎｔ蛋白質を発現する細胞は、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。すなわち、所望のＷｎｔ蛋白質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入してＷｎｔ蛋白質発現細胞を作製することができる。作製されたＷｎｔ蛋白質を安定発現する細胞、またはＷｎｔ蛋白質を一過性に発現する細胞は、いずれも本発明の製造方法に好適に用いることができる。Ｗｎｔ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。主なＷｎｔ蛋白質のアミノ酸配列および塩基配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を表１に示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
Ｗｎｔ蛋白質発現細胞により発現されるＷｎｔ蛋白質は、Ｗｎｔ活性を有する限り、Ｗｎｔ蛋白質のフラグメントでもよく、Ｗｎｔ蛋白質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。Ｗｎｔ蛋白質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列は特に限定されないが、例えばアフィニティータグのアミノ酸配列などが挙げられる。また、Ｗｎｔ蛋白質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから取得できるアミノ酸配列と完全に一致している必要はなく、Ｗｎｔ活性を有する限り、データベースから取得できるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列であってもよい。
【００１５】
ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから取得できるＷｎｔ蛋白質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、データベースから取得できるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。「１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。また、実質的に同一のアミノ酸配列は、データベースから取得できるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列が挙げられる。
【００１６】
Ｗｎｔ蛋白質発現細胞の培養に用いる培地は特に限定されず、細胞の種類に応じて適切な培地を公知の培地から選択して用いることができる。培養期間も特に限定されず、培地交換せずに培養可能な期間を適宜選択すればよい。アファミンは、アルブミンファミリーに属する糖蛋白質であり、血液や体液中に存在することが知られているが、その機能についてはほとんど知られていない。細胞培養に用いる培地に通常添加される血清には、当該血清を採取した動物のアファミンが含まれている。したがって、アファミン含有培地として血清含有培地を好適に用いることができる。血清は、細胞培養用に調製された血清であれば特に限定されないが、ウシ由来の血清であることが好ましい。ウシ由来の血清としては、ウシ胎児血清、新生コウシ血清、コウシ血清等が挙げられ、いずれも好適に用いることができる。血清の添加量は特に限定されず、使用するＷｎｔ蛋白質発現細胞の培養に推奨される濃度になるように培地に添加すればよい。
【００１７】
また、アファミン含有培地として精製アファミンを添加した培地を用いることができる。精製アファミンは、血清含有培地に添加してもよく、血清不含培地に添加してもよい。精製アファミンは、天然のアファミンを公知の方法で精製したものでもよく、組換えアファミンでもよい。組換えアファミンは、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。すなわち、アファミンをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入して組換えアファミンを発現させ、公知の精製方法を用いて精製することにより製造することができる。組換えアファミンは、アフィニティータグを付加したアファミンであってもよい。付加するアフィニティータグは特に限定されず、公知のアフィニティータグから適宜選択して用いることができる。好ましくは、特異的抗体により認識されるアフィニティータグである。具体的には、例えば、ＦＬＡＧタグ、ＭＹＣタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグなどが挙げられる。また、本発明者が開発したアミノ酸配列ＹＰＧＱ（配列番号１）を３〜５回繰りかえしたアミノ酸配列を有するタグ（以下、「ターゲットタグ」とも称する）、アミノ酸配列ＧＶＡＭＰＧＡＥＤＤＶＶ（配列番号２）を有するタグ（以下「ＰＡタグ」とも称する）なども好適に用いることができる。
【００１８】
また、アファミン含有培地として、当該培地で培養中のアファミン発現細胞から分泌されるアファミンを含む培地を用いることができる。アファミン発現細胞としては、Ｗｎｔ蛋白質とアファミンの両方を発現する細胞を用いてもよく、アファミンを発現する細胞を用いてもよい。アファミン発現細胞から分泌されるアファミンは、アファミン発現細胞が内因性に有するアファミン遺伝子由来の天然アファミンでもよく、導入されたアファミン発現ベクター由来の組換えアファミンでもよい。組換えアファミンを発現・分泌する細胞は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより作製することができる。アファミン発現細胞として、Ｗｎｔ蛋白質とアファミンの両方を発現する細胞を用いる場合は、当該細胞を培養することで目的の培養物が得られる。アファミン発現細胞として、Ｗｎｔ蛋白質を発現しないアファミン発現細胞を用いる場合は、Ｗｎｔ蛋白質発現細胞とアファミン発現細胞を共培養することで目的の培養物が得られる。
【００１９】
アファミンはどのような生物由来のアファミンでもよいが、哺乳動物由来のアファミンが好ましい。哺乳動物としては、例えばヒト、ウシ等が挙げられる。主な哺乳動物のアファミンのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。例えば、ヒトアファミンのアミノ酸配列はＡＡＡ２１６１２、これをコードする遺伝子の塩基配列はＬ３２１４０のアクセッション番号で登録されている。また、ウシアファミンのアミノ酸配列はＤＡＡ２８５６９、これをコードする遺伝子の塩基配列はＧＪ０６０９６８のアクセッション番号で登録されている。
【００２０】
精製アファミンを血清不含培地に添加してアファミン含有培地を調製する場合、精製アファミンの添加量は特に限定されないが、約１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌが好ましく、約２０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌがさらに好ましい。血清含有培地、またはアファミン発現細胞から分泌されるアファミンを含有する培地に精製アファミンを添加して培地中のアファミン濃度を高めることにより、Ｗｎｔ蛋白質収量を増大させることができる。血清含有培地に精製アファミンを添加する場合は、添加しない場合よりＷｎｔ蛋白質収量を増大できる範囲で、添加量を適宜設定することが好ましい。
【００２１】
Ｗｎｔ蛋白質発現細胞をアファミン含有培地で培養すれば、Ｗｎｔ蛋白質発現細胞が発現したＷｎｔ蛋白質を含む培養物が得られる。本発明の製造方法は、この培養物からＷｎｔ蛋白質を製造する方法である。培養物としては、培養上清、培養上清と細胞の混合物、培養上清と細胞破砕物の混合物などが挙げられ、公知の方法により調製することができる。Ｗｎｔ蛋白質は分泌型蛋白質であるので、通常培地中に分泌される。したがって、培養物は培養上清を含むものであることが好ましく、細胞を除去した培養上清がより好ましい。
【００２２】
本発明者らは、Ｗｎｔ蛋白質発現細胞をアファミン含有培地で培養すると、Ｗｎｔ蛋白質発現細胞から分泌されたＷｎｔ蛋白質が培地中のアファミンと１対１で結合し、複合体を形成していることを見出した。それゆえ、本発明の製造方法の工程（１）は、培養物中のＷｎｔ蛋白質を、アファミンを標的とするアフィニティー精製により取得することを可能にしたことが特徴である。アファミンを標的とするアフィニティー精製法は特に限定されず、公知のアフィニティー精製法から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば抗アファミン抗体を用いる方法、アフィニティータグを付加した組換えアファミンを利用する方法、ビオチン標識したアファミンを利用する方法、抗体以外のアファミン結合分子（低分子化合物を含む）を利用する方法などが挙げられる。
【００２３】
抗アファミン抗体を用いる方法を実施する場合、抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。ポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして取得することができる。すなわち、抗原（アファミンまたはそのフラグメント）をＰＢＳに溶解し、所望により通常のアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）を適量混合したものを免疫原として哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫する。免疫方法は特に限定されないが、例えば、１回または適当な間隔で複数回、皮下注射または腹腔内注射する方法が好ましい。次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより取得することができる。モノクローナル抗体は、上記免疫された哺乳動物から得た免疫細胞（例えば脾細胞）とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって得ることができる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。さらに、ファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。
【００２４】
抗アファミン抗体を用いる方法を実施する場合、抗体を担体に固定化した固定化抗体を用いることが好ましい。抗体を固定する担体は特に限定されず、公知の担体から適宜選択して用いることができる。例えば、セファロース（GEヘルスケア社）、アフィゲル（BIO-RAD社）等を好適に用いることができる。抗体を担体に固定する方法は、担体の種類等に応じて適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、セファロースを用いる場合には、抗体をカップリングバッファーで透析し、次いでＣＮＢｒ活性化セファロース（GEヘルスケア）と抗体とを室温で約１〜２時間混合することにより、セファロース固定化抗体を作製することができる。
【００２５】
抗アファミン抗体を用いる方法を実施する場合、上記固定化抗体をカラムに充填して使用するカラム法、試料と混合して懸濁状態で結合させるバッチ法をともに利用できる。前者の場合には、固定化抗体をカラムに充填し、カラムにＷｎｔ蛋白質発現細胞をアファミン含有培地で培養して得られた培養物を流し、培養物中に形成されたＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体を抗アファミン抗体に捕捉させる。後者の場合は、培養物１０ｍＬあたり１００μＬ程度の固定化抗体を加えて穏やかに混和し、培養物中に形成されたＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体を抗アファミン抗体に捕捉させてからカラムに充填する。
【００２６】
アフィニティータグを付加した組換えアファミンを利用する方法を実施する場合は、用いたアフィニティータグに応じて公知のアフィニティータグシステムから最適なシステムを選択することができる。ビオチン標識したアファミンを利用する方法を実施する場合は、例えばアビジン固定化担体、ストレプトアビジン固定化担体などを用いることができる。アファミンに結合する結合因子（タンパク質および低分子化合物）を用いる場合にはこれらの因子を固定化した担体を用いることができる。これらの方法を実施する場合も、上記抗アファミン抗体を利用する方法と同様に、カラム法およびバッチ法をともに利用できる。
【００２７】
本発明の製造方法は、水溶性が低く凝集によって不活化しやすいＷｎｔ蛋白質をアファミンとの複合体の状態で単離することを特徴としている。本発明者らにより、Ｗｎｔ蛋白質発現細胞から分泌されたＷｎｔ蛋白質は培地中のアファミンと１対１で結合して複合体を形成し、安定に存在していることが見出された。その結果、アファミンとの複合体の状態で精製することでＷｎｔ蛋白質を可溶性かつ高活性のままで得ることが可能になった。本発明の製造方法はＷｎｔ蛋白質をアファミンで保護された状態で得るため、精製過程および精製後においてＷｎｔ蛋白質に界面活性剤や高濃度の塩を添加する必要がない。したがって、本発明により、界面活性剤や塩を含まない状態で精製されたＷｎｔ蛋白質を提供することが可能となる。
【００２８】
本発明の製造方法の工程（２）には、アファミンまたはＷｎｔ蛋白質を標的とするアフィニティー精製において捕捉されたＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体の溶出操作が含まれる。捕捉されたＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体を溶出する方法は特に限定されず、用いたアフィニティー精製手段に応じて適切な溶出方法を選択して用いることができる。例えば、本発明者らが開発したターゲットタグを用いる場合には、ヒトトロンビン受容体ＰＡＲ４のＮ末端部分に由来するアミノ酸配列を含むペプチド（例えば、実施例で使用したＰＡＲ４−Ｃ８ペプチド（ＰＲＧＹＰＧＱＶ、配列番号３））を溶離物質として含む溶出バッファーを好適に用いることができる。ペプチドの濃度は特に限定されないが、例えば約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌが好ましい。また、本発明者らが開発したＰＡタグを用いる場合には、ヒトポドプラニンのＰＬＡＧドメイン由来のアミノ酸配列を含むペプチド（ＰＡ１４）を溶離物質として含む溶出バッファーを好適に用いることができる。アファミンまたはＷｎｔ蛋白質に付加するアフィニティータグにはこのほかにも多くの市販のものが利用可能であるが、それぞれのアフィニティー精製システムに応じた溶出方法のうち、アファミンとＷｎｔ蛋白質の間の相互作用を破壊しない条件であれば広く用いることができる。
【００２９】
工程（１）のアファミンを標的とするアフィニティー精製において捕捉されたＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体から、Ｗｎｔ蛋白質のみを遊離させ、精製することができる。すなわち、アフィニティー担体に固定化された抗体等とアファミンとの相互作用を解離させず、複合体を形成しているＷｎｔ蛋白質とアファミンとの相互作用を解離させる適当な溶離物質を選択することにより、Ｗｎｔ蛋白質のみを遊離させ、精製することができる。このような溶離物質としては、例えばＣＨＡＰＳ（[3-(3-cholamidepropyl)dimethylammonio-1-propanesulphonate]）、ＣＨＡＰＳＯ（[3-(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio-2-hydroxypropanesulfonate]）、コール酸、デオキシコール酸、トリトンＸ−１００（polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether）などが挙げられる。ＣＨＡＰＳを用いる場合、適当なバッファーを用いて、約０．３％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）の濃度範囲で用いることが好ましい。溶出後のＷｎｔ蛋白質は、例えば非特許文献７にあるのと同様の方法により適宜濃縮してその後の試験に用いることができる。
【００３０】
得られたＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体、またはＷｎｔ蛋白質がＷｎｔ活性を有することは、例えば、ＴＣＦレポーターアッセイにより確認することができる。ＴＣＦレポーターアッセイとは、Ｗｎｔシグナルが細胞に入ると特異的に活性化される転写因子であるＴ−ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＴＣＦ）の結合配列を持つルシフェラーゼ遺伝子を導入し、Ｗｎｔ活性の強さをルシフェラーゼの発光によって簡便に評価する方法である（Molenaar et al. Cell, 86, 391 (1996)）。ＴＣＦレポーターアッセイ以外には、Ｗｎｔシグナルが入ると細胞内のβカテニンが安定化することを利用して、βカテニンの量をウエスタンブロッティングによって定量評価する方法（Shibamoto, et al. Genes to cells, 3, 659 (1998)）などを用いることができる。また、Ｗｎｔ５ａのように、いわゆるｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙを介して細胞にシグナルを与えるＷｎｔ蛋白質については、細胞内アダプター蛋白質であるＤｖｌ２のリン酸化を見ることでＷｎｔ活性を評価する方法（Kikuchi et al. EMBO J. 29, 3470 (2010)）などを用いることができる。
【００３１】
本発明の製造方法により、Ｗｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質を、Ｗｎｔ蛋白質単独の形態、または、Ｗｎｔ蛋白質−アファミン複合体の形態で提供することができる。本発明の製造方法は、特殊な設備を必要とせず、１段階のアフィニティー精製でＷｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質を効率よく取得することができる。すなわち、本発明の製造方法は、極めて簡便かつ短時間に、容易な操作でＷｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質を製造できる点で、従来法（非特許文献７）と比較して格段に優れた製造方法である。さらに、本発明の製造方法で得られるＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体のＷｎｔ活性は、従来法（非特許文献７）で製造された市販品（R&D Systems社製）と比較して、１０倍以上比活性が高いことを、本発明者らは確認している（実施例５および図１１参照）。
【００３２】
〔Ｗｎｔ蛋白質の保存方法〕
本発明は、新規なＷｎｔ蛋白質の保存方法を提供する。本発明の保存方法は、Ｗｎｔ蛋白質をアファミンと複合体を形成している状態で保存することにより、Ｗｎｔ活性を著しく低下させることなく、界面活性剤を含まない溶液中で保存することができる方法である。界面活性剤を含まない溶液には、蛋白質の保存に通常用いられる各種バッファーを好適に用いることができる。具体的には、例えば、リン酸バッファー（20mM phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.0）、ＨＥＰＥＳバッファー（20mM HEPES, 150mM NaCl, oH 7.2）などが挙げられる。保存温度は室温以下であることが好ましく、約４℃以下であることがより好ましい。長期に保存する場合には−８０℃以下の凍結保存が好ましい。本発明者らは、Ｗｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質を、Ｗｎｔ蛋白質−アファミン複合体の形態でＰＢＳに溶解し、４℃で少なくとも１か月間以上、活性を低下させることなく保存できることを確認している。
【００３３】
〔Ｗｎｔ蛋白質−アファミン複合体〕
本発明は、Ｗｎｔ活性を有するＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体を提供する。本発明のＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体は、Ｗｎｔ蛋白質発現細胞をアファミン含有培地で培養して得られる培養物（例えば、培養上清）中に形成される。培養物中に形成されたＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体を精製する方法は特に限定されない。上記本発明の製造方法と同様に、アファミンを標的とするアフィニティー精製、Ｗｎｔ蛋白質を標的とするアフィニティー精製、アファミンまたはＷｎｔ蛋白質に付加したアフィニティータグを標的とするアフィニティー精製等を好適に用いることができる。
【００３４】
本発明のＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体を構成するＷｎｔ蛋白質の由来は特に限定されず、各種生物由来のＷｎｔ蛋白質を好適に用いることができる。好ましくは哺乳動物由来のＷｎｔ蛋白質である。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられるが、限定されない。哺乳動物のＷｎｔ蛋白質としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６が挙げられる。
【００３５】
本発明のＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体を構成するアファミンは特に限定されず、天然のアファミンでもよく、組換えアファミンでもよい。アファミンの由来も特に限定されず、各種生物由来のアファミンを好適に用いることができる。好ましくは哺乳動物由来のアファミンである。哺乳動物としては、例えばヒト、ウシ等が挙げられるが、限定されない。
【００３６】
本発明のＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体は、市販のＷｎｔ蛋白質（例えば、R&D Systems社製）と比較して、１０倍以上比活性が高いことが確認されている。さらに、本発明のＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体は、界面活性剤を含まない溶液に溶解した状態で、少なくとも１か月間以上４℃において活性を低下させずに保存することができる。本発明のＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体により、Ｗｎｔ蛋白質が関与する種々の研究分野において、多くの有用な研究を飛躍的に加速することが可能となる。
【００３７】
〔Ｗｎｔシグナル活性化剤〕
本発明は、Ｗｎｔ蛋白質−アファミン複合体を含有するＷｎｔシグナル活性化剤を提供する。本発明のＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体は、高いＷｎｔ活性を有しているので、効率よくＷｎｔシグナルを活性化することができる。本発明のＷｎｔシグナル活性化剤は、動物の発生・分化過程の分子メカニズムを解明する基礎研究において極めて有用なツールとなる。また、本発明のＷｎｔシグナル活性化剤は界面活性剤を含まないので、Ｗｎｔ蛋白質の幹細胞維持・分化誘導能に基づくｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の培養添加物として利用可能であり、これらの多能性幹細胞を用いた再生医療に関する研究開発にも応用可能である。さらに、がん治療薬などの開発においてＷｎｔ蛋白質を標的とした抗体や化合物のスクリーニング等の用途に用いることができる。
【００３８】
本願には、さらに以下の発明が含まれる。
（ａ）Ｗｎｔ蛋白質−アファミン複合体を用いるＷｎｔシグナル活性化方法。
（ｂ）Ｗｎｔシグナル活性化剤を製造するためのＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体の使用。
（ｃ）Ｗｎｔシグナルを活性化させるために使用されるＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４０】
〔実施例１：培養上清中でＷｎｔ３ａと複合体を形成する蛋白質の同定〕
１．Ｌ−３ａ細胞
マウスＷｎｔ３ａを安定発現するＬ細胞（Ｌ−３ａ）は、岡崎統合バイオサイエンスセンターの高田慎治教授らが樹立したもの（Shibamoto et al., Genes to Cells, 3, 659 (1998)）を同教授より供与いただいた。
【００４１】
２．Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ細胞
アフィニティータグ付きマウスＷｎｔ３ａ（以下「Ｗ−Ｗｎｔ３ａ」という）の構造を図１に示した。図１に示したように、Ｗ−Ｗｎｔ３ａは、マウスＷｎｔ３ａの成熟蛋白質部分（Genbank ACCESSION P27467の19-352残基、配列番号４）のＮ末端側に、配列番号５で示される配列が付加されている。配列番号５で示される配列には、ヒトプロラクチンのシグナル配列（配列番号６）、２１残基のターゲットタグ配列（配列番号７）および１１残基のｅＴＥＶ配列（配列番号８）が含まれる。ヒトプロラクチンのシグナル配列とターゲットタグ配列との間のＧＲＧは、クローニング用の制限酵素サイト（ＮｏｔＩ）を挿入したことで生じた人工配列である。すなわち、ヒトプロラクチンのシグナル配列をコードするＤＮＡ、ターゲットタグ配列をコードするＤＮＡ、ｅＴＥＶ配列をコードするＤＮＡ、マウスＷｎｔ３ａの成熟蛋白質部分をコードするＤＮＡをつないでＷ−Ｗｎｔ３ａのコンストラクト作製し、これを発現ベクターｐＥＢｍｕｌｔｉ−Ｈｙｇ（和光純薬工業）に組み込んだ。
【００４２】
Ｗ−Ｗｎｔ３ａ安定発現細胞株は以下のように作製した。
１）トランスフェクション前日にＨＥＫ２９３Ｓ＿ＧｎＴ１−細胞（Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ博士より供与）を１０ｃｍディッシュに播いて一晩培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
２）翌日、５０〜６０％コンフルエントになった細胞に、Ｗ−Ｗｎｔ３ａ発現ベクターをトランスフェクションした。すなわち、プラスミドＤＮＡおよびトランスフェクション試薬(X-tremeGENE HP、Roche)を添加した。プラスミドＤＮＡ：Ｘｔｒｅｍｅ＝１：３の割合になるよう混合し、細胞に添加した。ネガティブコントロールとして、ハイグロマイシン耐性を持たない空のベクターを用いて別のディッシュに同様に添加した。
３）トランスフェクションの翌日に培地を除き、選択抗生物質として０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（gibco, 10687-010）を含む培地に交換した。
４）３〜５日ごとに新しい培地（ハイグロマイシン含む）に交換し、細胞の増殖が良好になるのを待った。ネガティブコントロールの細胞はトランスフェクション６日後に全て死滅した。
５）トランスフェクションから２３日後、増殖が良好な細胞の培養上清中を、抗Ｗｎｔ３ａ抗体（岡崎統合バイオ高田教授より供与）を用いたウエスタンブロッティングに供し、Ｗｎｔ３ａの発現を確認した。
【００４３】
３．細胞培養方法
（３−１）Ｌ−３ａの培養
培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２＿１：１（gibco, 11320-033）を使用した。添加物として１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Fetal Calf Serum, FCS）、０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン（SIGMA,P4458）、１．４ｇ／Ｌ Ｄ−グルコースを加えた。細胞の維持・継代方法は、３〜４日ごとに細胞を２０倍程度に希釈した。
【００４４】
（３−２）Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫの培養
培地にはＤＭＥＭ（WAKO, 043-30085）を使用した。添加物として１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン（SIGMA, P4458）、１％ＮＥＡＡ（SIGMA, M7145）、選択抗生物質として０．２ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（gibco, 10687-010）を加えた。細胞の維持・継代方法は、３〜４日ごとに細胞を１０〜２０倍程度に希釈した。
【００４５】
４．ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングは以下のプロトコールで行った。
培養上清の希釈については次の「５．培養上清のＴＣＦレポーターアッセイ」に記述している。
１）培養上清５μｌを電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）し、ＰＶＤＦ膜に転写した。
２）ＰＶＤＦ膜をブロッキングした後、一次抗体（5μg/ml biotin-anti_Wnt3a抗体/TBST）で２時間染色した。一次抗体には、精製した抗Ｗｎｔ３ａ抗体をビオチン化試薬（PIERCE, EZ-Link NHS-Lc-Biotin）で標識したものを用いた。ＴＢＳＴの組成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０である。
３）二次抗体（0.4μg/ml Streptavidin-HRP/TBST)で１時間染色した。
４）ウエスタンブロッティング検出試薬（GE, ECLprime）により化学発光させ、撮影（GE, LAS4000mini）した。
【００４６】
ウエスタンブロッティングの結果を図２に示した。図２に示したようにどちらの細胞においても上清中に分泌されたＷｎｔ３ａ蛋白質の存在が確認できた。希釈系列の結果から、樹立した安定発現株（Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ）は、世界的な標準であるＬ−３ａ細胞と同程度なＷｎｔ３ａ産生能を持っていることがわかった。ただし、Ｎ末端のタグ配列のため、Ｌ−３ａ細胞が分泌する野生型Ｗｎｔ３ａ蛋白質と比べて若干分子量の大きいものが産生されていることが確認できた。
【００４７】
５．培養上清のＴＣＦレポーターアッセイ
ＴＣＦレポーターアッセイは次の手順で行なった。
（５−１）レポーター遺伝子のトランスフェクション
ＴＯＰｆｌａｓｈプラスミド（ＴＣＦ結合領域を含むホタルルシフェラーゼレポータープラスミド）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。この時トランスフェクション効率の影響を考慮して標準化するために、Ｒｅｎｉｌｌａプラスミド（ウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミド）を重トランスフェクションした。実際には１ウエル当たり５０ｎｇのＴＯＰ＿ＤＮＡと５ｎｇのＲｅｎｉｌｌａ＿ＤＮＡを混合し、２４ｗｅｌｌプレートに培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションを行った。トランスフェクション試薬には前述のＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ（Roche）をＤＮＡ：Ｘｔｒｅｍｅ=１：３の割合になるよう混合して使用した。
【００４８】
（５−２）Ｗｎｔ３ａ発現上清の添加
トランスフェクションの翌日、培地を静かに除きＷｎｔ３ａ発現上清と交換した。Ｗｎｔ３ａ発現上清は、Ｗｎｔ３ａ安定発現株を３〜４日間培養し、８０〜９０％コンフルエントになった培地を回収し、遠心分離により得られた上清である。Ｗｎｔ３ａ発現上清の希釈にはＨＥＫ２９３Ｔの培養上清（コンディションメディウム）を用いた。
【００４９】
（５−３）シグナルの検出
シグナル検出試薬には、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓｅｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）を使用した。Ｗｎｔ３ａ発現上清を添加した翌日、細胞が剥がれないよう培養上清を静かに除きＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）５００μｌで培養容器を洗浄し、キットに添付されているｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（×１）１００μｌで細胞を溶解した。細胞溶解液を遠心分離し、上清８μｌを９６ｗｅｌｌホワイトプレート（NUNC, 236105）にアプライした。添付のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩ４０μｌと反応させ、速やかにホタルルシフェラーゼ（firefly）の発光をプレートリーダーで測定した。測定後、添付のＳｔｏｐ＆Ｇｒｏ Ｒｅａｇｅｎｔ（×１）４０μｌを加えて、速やかにホタルルシフェラーゼによる発光を消光させ、ウミシイタケルシフェラーゼ（renilla）の発光を測定した。活性の値は次の式で計算した。
Activity ＝（firefly/renilla）−（firefly(BG)/renilla(BG)）
【００５０】
ＴＣＦレポーターアッセイの結果を図３に示した。図３に示したように、どちらの培養上清も同様な濃度依存性でＷｎｔシグナル活性を示した。この結果から、Ｎ末端にタグを付加したＷｎｔ３ａ（Ｗ−Ｗｎｔ３ａ）は、タグを付加していない野生型のＷｎｔ３ａと同様の生物活性を持つことが確認できた。
【００５１】
６．アフィニティータグシステムを用いたＷ−Ｗｎｔ３ａの精製
Ｗ−Ｗｎｔ３ａ安定発現株（Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ）をディッシュまたは多層フラスコなどで５〜７日間培養し、培地を回収した。遠心分離後フィルター（０．２２μｍ）を通した。集めた培養上清２２０ｍｌに３ｍｌのＰ２０．１抗体セファロースを加え、４℃で３時間回転混和した後、培地を空のカラムに通してセファロースを集めた。なお、Ｐ２０．１抗体は上記ターゲットタグ配列を特異的に認識する抗体であり、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０６１として国際寄託されているマウス−マウス  ハイブリドーマＰ２０．１によって産生されるモノクローナル抗体である（国際公開ＷＯ２００９−０９６１１２号参照）。
カラムに集めたセファロースを３ｍｌのＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7.5）で洗浄し洗浄液を回収した（ｗａｓｈフラクション）。洗浄操作を５回繰り返し、ｗａｓｈ１〜５のフラクションを得た。次いで、１回あたり３ｍｌのペプチド溶液（0.2mg/ml PAR4-C8 peptide/TBS）を用いて溶出し溶出液を回収した（ｅｌｕｔｅフラクション）。溶出操作を１０回繰り返し、ｅｌｕｔｅ１〜１０のフラクションを得た。ｗａｓｈ１〜５およびｅｌｕｔｅ１〜１０からそれぞれ１０μｌを取り、非還元状態で電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した。
【００５２】
電気泳動の結果を図４に示した。図４に示したように、ｗａｓｈフラクションには培地の血清由来の蛋白質が大量に混入していたが、５回の洗浄によってほぼ非特異的なバンドは消え、続いてｅｌｕｔｅフラクションからは３７ｋＤａのＷｎｔ３ａが特異的に精製されてきた。そしてこのとき、Ｗｎｔとともに分子量約６５ｋＤａの正体不明の蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘ）も同時に溶出されてきた。
【００５３】
７．精製蛋白質のＮ末端アミノ酸配列解析
上記で得られたｅｌｕｔｅフラクションを濃縮し、３７ｋＤａおよび６５ｋＤａのバンドそれぞれについてＮ末端アミノ酸配列をエドマン法によって決定したところ、以下の配列が得られた。
３７ｋＤａ：ＧＲＧＹＰＧＱＹＰＧ（配列番号９）
６５ｋＤａ：ＬＰＴＱＰＱＤＶＤＤ（配列番号１０）
前者はシグナル配列切断後のターゲットタグおよびベクター由来の配列を含む部分（図１の下線部）に一致することから、予想通りＷ−Ｗｎｔ３ａであることが確認できた。後者についてはデータベース検索の結果、ウシ血清蛋白質であるアファミンの成熟型の予想Ｎ末端配列（GenBank ACCESSION NP_001179104, afamin precursor [Bos taurus] の第２２位〜第３１位）と１００％一致し、分子量もほぼ一致したことから、ウシアファミンであることが強く疑われた。
【００５４】
８．ペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）解析によるウシアファミンの同定
Ｎ末端配列分析の結果を確かめるため、ｐｒｏｔｅｉｎ ＸをＰＭＦ解析（プロテアーゼ消化と質量分析を組み合わせた解析法）に供した。ＰＭＦ解析は、島津テクノリサーチ社に委託して実施した。その結果、ウシアファミン（GenBank ACCESSION NP_001179104, afamin precursor [Bos taurus]）に対してきわめて高い信頼度（Mascotスコア:311）で一致し、最終的にｐｒｏｔｅｉｎ Ｘがウシのアファミンであると結論した。アファミンはアルブミンファミリーに属する分子量約６万６千の糖タンパク質で、ヒト血清中に約３０μｇ／ｍｌの濃度で存在する（Lichenstein et al. J. Biol. Chem. 269, 18149 (1994)）。血清アルブミン同様、様々な脂質、中でもビタミンＥに結合することが報告されているが（Jerkovic et al. J. Proteome Res. 4, 889 (2005)）、その生理的役割はわかっていない。ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘはアフィニティータグ精製したＷｎｔ３ａ試料の中に常に存在していたため、Ｗｎｔ３ａと安定な複合体を形成していることが示唆された。発現に用いた細胞はヒト由来のＨＥＫ細胞であるため、ウシアファミンは培地に添加したウシ胎児血清由来であると考えざるを得ない。すなわちＷｎｔ３ａは細胞から分泌される際に培地中のアファミンに結合し、そのまま複合体としてアフィニティー精製されてくるものと考えられた。
【００５５】
〔実施例２：Ｗｎｔ３ａと組換えヒトアファミンとの複合体形成〕
Ｗｎｔ蛋白質とアファミンの複合体はウシ血清中でのみ形成されるのか、あるいは他の因子の介在なしにＷｎｔ蛋白質にはアファミンと結合する能力があるかどうかを確認するために、組換えヒトアファミンを作製し、これを用いてＷｎｔ蛋白質との結合活性を調べた。
１．組換えヒトアファミンの作製
ヒトアファミン全長のｃＤＮＡはカナダのＬａｖａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＬｕｃ Ｂｅｌａｎｇｅｒ博士より供与を受けた。Ｃ末端にＰＡタグ（Fujii et al, Protein Expr. Purif., 95, 240 (2014)）を付加した発現コンストラクト（ｈＡＦＭ−ＰＡ）をライフテクノロジー社のＥｘｐｉ２９３システムを用いて一過性に発現させ、培養上清からＮＺ−１セファロースを用いて組換えヒトアファミンを一段階精製した。精製試料をＰＢＳに溶解し、濾過滅菌した後、以下の実験に供した。
【００５６】
２．組換えヒトアファミン添加によるＷｎｔ３ａの発現実験
１）Ｗｎｔ３ａ発現細胞（Ｌ３ａ、Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ）を１２ｗｅｌｌプレートに播き、血清入りの培地で一晩インキュベートして細胞をプレートに接着させた。
２）翌日、静かに培地を除き、血清を含む培地（５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ）または血清を含まない（０％ＦＣＳ）培地に交換した。
３）血清を含まない培地に、精製した組換えヒトアファミンを濃度が０、５、１０、２０、３０μｇ／ｍｌになるよう添加した。
４）５日間培養した後、培養上清を電気泳動に供し、抗Ｗｎｔ３ａ抗体によるウエスタンブロッティングを行った。
【００５７】
ウエスタンブロッティングの結果を図５に示した。図５に示したように、Ｗｎｔ３ａは血清の非存在下では培地中に分泌されないが、そこに精製した組換えヒトアファミンを添加することにより、濃度依存的に分泌が促進されることが明らかになった。
【００５８】
さらに、５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含む培地または血清の代わりに組換えヒトアファミンを添加した培地でＷ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫを培養した上清から、上記実施例１の「６．アフィニティータグシステムを用いたＷ−Ｗｎｔ３ａの精製」と同じ方法でＷ−Ｗｎｔ３ａを精製し、電気泳動に供した。
電気泳動の結果を図６に示した。図６に示したように、組換えヒトアファミンを添加した培地の培養上清では、ウシアファミンに代わってヒトアファミンがＷ−Ｗｎｔ３ａと複合体を形成した状態で精製された。
【００５９】
〔実施例３：抗ウシアファミン抗体を用いたＷｎｔ３ａ−アファミン複合体の免疫沈降〕
１．組換えウシアファミンの作製
ウシアファミン全長のｃＤＮＡはGenBank ACCESSION NM_001192175 Bos taurus afamin (AFM), mRNA の配列を参考にＤＮＡ合成により作製した。これを元にヒトアファミンと同様、Ｃ末端にＰＡタグを付加した発現コンストラクト（ｂＡＦＭ−ＰＡ）をライフテクノロジー社のＥｘｐｉ２９３システムを用いて一過性に発現させ、培養上清からＮＺ−１セファロースを用いて組換えウシアファミンを一段階精製した。タグ部分をＴＥＶプロテアーゼで切断除去した後、ゲル濾過精製して抗体作製のための抗原とした。
【００６０】
２．抗ウシアファミンポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗血清はウサギを用いて定法により作製した。ネイティブなウシアファミンを認識するモノクローナル抗体は、Ｂａｌｂ／ＣマウスとＰ３Ｕ１ミエローマ細胞を用いて定法により作製した。抗原コーティングプレートを用いたＥＬＩＳＡ法によってクローンをスクリーニングし、最終的に６クローンを樹立した。
【００６１】
３．樹立したモノクローナル抗体によるウシ血清中アファミンの免疫沈降
樹立した６つのモノクローナル抗体（Ｂ１１，Ｂ７２，Ｂ９１，Ｂ１１５，Ｂ２１２，Ｂ２１３）およびポリクローナルウサギ抗体について、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（GEヘルスケア）を用いて固定化レジンを作製し、これらと１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地を４℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳで洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファーで溶出したものをＳＤＳ電気泳動に供した。
【００６２】
電気泳動の結果を図７に示した。図７に示したように、ポリクローナル抗体以外では、Ｂ１１、Ｂ９１およびＢ２１２が血清から約７０ｋＤａのバンドを沈降させることができ、これらの抗体がウシアファミンをネイティブな状態で認識できることがわかった。
【００６３】
４．抗ウシアファミンモノクローナル抗体を用いたＷｎｔ３ａ−アファミン複合体の免疫沈降
Ｗｎｔ３ａ発現細胞（Ｌ−３ａおよびＷ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ）を３日間培養し、上清を回収した。この上清１ｍｌに抗ウシアファミンモノクローナル抗体（クローンナンバーＢ９１、以下「Ｂ９１」という。）を固定化したセファロースを２０μｌ加え、３時間回転混和した。遠心分離によりセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍｌのＴＢＳで３回セファロースを洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー３０μｌを加えて９５℃で２分間加熱して試料を溶出した。溶出した試料の８μｌを還元状態で電気泳動し、ＯＲＩＯＬＥで染色した。また、別途溶出した試料の４μｌを電気泳動に供し、抗Ｗｎｔ３ａ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った（実施例１参照）。
【００６４】
図８に電気泳動（左）およびウエスタンブロッティング（右）の結果を示した。図８からわかるように、Ｂ９１によって血清を含む培地からウシアファミンが沈降されること（電気泳動の矢印のバンド）、Ｗｎｔ３ａ発現細胞の培養上清から同時にＷｎｔ３ａが沈降されること（ウエスタンブロッティングのバンド）が示された。この結果から、アファミンはタグの有無にかかわらずＷｎｔ３ａと複合体を形成し、このＷｎｔ３ａ−アファミン複合体を、Ｂ９１を用いて精製できることが明らかになった。
【００６５】
〔実施例４：Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体のゲルろ過クロマトグラフィー〕
アファミンがＷｎｔ３ａと１対１の安定な複合体を形成していることを確認するために、分子サイズに応じて蛋白質を分離するゲル濾過クロマトグラフィーを行った。またこのとき、界面活性剤ＣＨＡＰＳ[3-(3-cholamidepropyl)dimethylammonio-1-propanesulphonate]の影響についても調べた。
【００６６】
１．サンプル調製
Ｗ−Ｗｎｔ３ａ安定発現株（Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ）を培養し、培養上清１ＬからＰ２０．１セファロースを用いて実施例１と同じ方法でＷ−Ｗｎｔ３ａを精製し、集めたフラクションを１ｍｌに濃縮した。これをＣＨＡＰＳ（−）のサンプルとした。また、このサンプルに対し終濃度１％（ｗ／ｖ）となるようＣＨＡＰＳを加えて１時間以上氷上で静置したものをＣＨＡＰＳ（＋）のサンプルとした。
【００６７】
２．ゲルろ過クロマトグラフィー
ゲルろ過にはＡＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア）を使用した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬを用いた。バッファーには、ＣＨＡＰＳ（−）の場合はＰＢＳ、ＣＨＡＰＳ（＋）の場合は終濃度１％（ｗ／ｖ）となるようＣＨＡＰＳを加えたＰＢＳを使用した。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎとし、２５０μｌを１フラクションとして回収した。
【００６８】
ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を図９に示した。図９に示したように、高分子量に相当する排除体積部分（Ｖ０）に大きいピークが見られたが、それに加えて１３〜１５ｍｌの溶出位置にピークが見られた。分子量スタンダードの溶出位置から、ＣＨＡＰＳ（−）サンプルのピークは約１０１ｋＤａ、ＣＨＡＰＳ（＋）サンプルのピークは約５５ｋＤａの分子量に相当することがわかった。
【００６９】
３．ゲルろ過フラクションの分析
回収したゲルろ過フラクションのうち、図１０の上段に示した１〜１６のフラクションからそれぞれ１０μｌを取り、非還元状態で電気泳動に供し、ＣＢＢ染色、または抗Ｗｎｔ３ａ抗体を用いたウエスタンブロッティング、または抗ウシアファミン抗体（ウサギ）を用いたウエスタンブロッティングを行った。ウエスタンブロッティングは、実施例１に記載の方法に従って実施した。ただし、ウシアファミンの検出には、実施例３で作製した抗ウシアファミンウサギポリクローナル抗体を一次抗体として２７μｇ／ｍｌ／ＴＢＳＴの濃度で使用し、二次抗体には０．４μｇ／ｍｌのａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ＨＲＰ／ＴＢＳＴを使用した。
【００７０】
結果を図１０に示した。図１０の左側パネルがＣＨＡＰＳ（−）サンプルの結果、右側パネルがＣＨＡＰＳ（＋）サンプルの結果である。図１０に示したように、ＣＨＡＰＳの非存在下ではアファミンとＷｎｔ３ａはフラクション１０〜１２にかけて現れる複合体として挙動しており、その予想分子量（１０１ｋＤａ）から、３７ｋＤａのＷｎｔ３ａと６６ｋＤａのアファミンが１対１で結合していることが示唆された。Ｗｎｔ３ａ蛋白質はフラクション１〜５にかけての高分子量領域にも存在していたが、それらのフラクションにはアファミンは存在せず、アファミンと複合体を形成したＷｎｔ３ａだけが単分散した分子種として挙動することが示された。一方、ＣＨＡＰＳ存在下のゲル濾過クロマトグラフィーにおいては、アファミンの溶出位置はＣＨＡＰＳ（−）条件とほとんど変化がなかったのに対し、Ｗｎｔ３ａは高分子量領域から単分散領域まで幅広く分布するようになり、アファミンと重なるピークは消滅した。
【００７１】
以上の結果から、Ｗｎｔ３ａはアファミンと複合体を形成することで単分散の水溶性蛋白質として挙動するが、両者の相互作用はＣＨＡＰＳなどの界面活性剤で破壊され、解離したＷｎｔ３ａは多量体を形成しやすくなることが明らかになった。アファミンと結合していないＷｎｔ３ａは、すでに報告されているようにリポプロテイン複合体に取り込まれ（Newmann et al., Traffic, 10, 334 (2009)）、自身や他の蛋白質と共有結合、非共有結合を介した高分子凝集体を形成するものと考えられた。
【００７２】
〔実施例５：アファミンと複合体を形成した状態でＷｎｔ３ａは活性を持つ〕
市販のリコンビナントマウスＷｎｔ３ａ（High Purity）（R&Dシステムズ社、code:1324-WNP-010/CF）を購入し、Ｗｎｔ３ａ蛋白質として使用した。Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体は、実施例１でＰ２０．１セファロースを用いて精製したものを使用した。これらのＷｎｔ３ａ蛋白質またはＷｎｔ３ａ−アファミン複合体を、Ｗｎｔ３ａの濃度が２０μｇ／ｍｌになるようＰＢＳで希釈し、この溶液を「１倍希釈原液」として、１／３、１／１０、１／３０、１／１００になるようさらにＰＢＳで希釈した。これらの希釈液と新しい培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＤＭＥＭ）を１：９の割合で混合し、前日にＴＯＰｆｌａｓｈプラスミドをトランスフェクションしておいたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加した。ＴＣＦレポーターアッセイは、実施例１と同じ方法で実施した。
【００７３】
ＴＣＦレポーターアッセイの結果を図１１に示した。図１１に示したように、Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体は濃度依存的にＴＣＦレポーターを活性化した。この結果から、Ｗｎｔ３ａはアファミンが結合した状態でも生物活性（Ｗｎｔ活性）を発揮できることが明らかになった。また、市販の最高純度のＷｎｔ３ａ蛋白質（価格は10μgで約18万円）は活性発現に０．６７μｇ／ｍｌ（図１１の１／３０）以上の濃度を必要としたのに対し、Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体は０．０２μｇ／ｍｌ（図１１の１／１０００）以上で活性を検出できた。この結果から、本発明の製造方法により、市販品の１０倍以上の比活性を有するＷｎｔ３ａ活性蛋白質を調製できることが示された。
【００７４】
〔実施例６：Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体の保存安定性〕
精製したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体（濃度はＷｎｔ３ａ換算で約10μg/ml）をＰＢＳに透析置換し、そのまま４℃で、あるいは瞬間凍結してから−８０℃で１２日間保存した。凍結試料に関しては活性測定の前日に融解した。４℃試料と−８０℃保存試料をそれぞれ１／３、１／１０、１／３０、１／１００にＰＢＳで希釈した。これらの希釈液と新しい培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含むＤＭＥＭ）を１：９の割合で混合し、前日にＴＯＰｆｌａｓｈプラスミドをトランスフェクションしておいたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加した。ＴＣＦレポーターアッセイは、実施例１と同じ方法で実施した。
【００７５】
ＴＣＦレポーターアッセイの結果を図１２に示した。図１２に示したように、４℃で保存したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体と、−８０℃で保存したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体とは、ほぼ同様な濃度依存性でＷｎｔ活性を示した。この結果から、Ｗｎｔ３ａはアファミンと複合体を形成した状態で精製することにより、界面活性剤の非存在下で活性を保ったまま４℃保存できることがわかった。なお、発明者らは４℃で１か月保存したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体についても、Ｗｎｔ活性が低下しないことを確認している。
【００７６】
〔実施例７：Ｗｎｔ５ａ−アファミン複合体の精製〕
１．Ｗｎｔ５ａ−アファミン複合体の精製
実施例１の「２．Ｗ−Ｗｎｔ３ａ／ＨＥＫ細胞」に記載の方法に従い、Ｎ末端にターゲットタグを付加したＷｎｔ５ａ（以下「Ｗ−Ｗｎｔ５ａ」という）安定発現細胞株（Ｗ−Ｗｎｔ５ａ／ＨＥＫ細胞）を作成した。Ｗ−Ｗｎｔ５ａ安定発現細胞株の培養上清から、実施例１の「６．アフィニティータグシステムを用いたＷ−Ｗｎｔ３ａの精製」に準じてＷ−Ｗｎｔ５ａを精製した。具体的には、１Ｌの培養上清に１０ｍｌのＰ２０．１セファロースを加えて４℃で４時間回転混和した後、１０ｍｌのＴＢＳで５回洗浄し（ｗａｓｈ１〜５）、１０ｍｌのペプチド溶液（0.2mg/ml PAR4-C8 peptide/TBS）で１０回溶出した（ｅｌｕｔｅ１〜１０）。集めたフラクションを１０μｌずつ非還元状態で電気泳動に供し、泳動後のゲルをＣＢＢ染色した。
【００７７】
電気泳動の結果を図１３に示した。図１３に示したように、アフィニティークロマトグラフィーによって上清から精製された試料にはＷｎｔ５ａ蛋白質とともに血清中のアファミンが含まれており、Ｗｎｔ３ａの場合と全く同様の挙動（図４参照）を示した。この結果から、アファミンはＷｎｔ３ａだけでなく他のＷｎｔ蛋白質にも結合し、複合体を形成することがわかった。
【００７８】
２．Ｗｎｔ５ａ−アファミン複合体のゲル濾過分析
上記で精製したＷｎｔ５ａ−アファミン複合体を濃縮し、実施例４と同様にゲルろ過クロマトグラフィーに供した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬを用いた。バッファーにはＨＢＳ（20mM HEPES, 150mM NaCl, pH7.5）を使用し、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。２５０μｌを１フラクションとして分取した。
【００７９】
ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を図１４に示した。図１４上段に示したように、排除体積付近の高分子量領域に１番目のピークが、１３ｍｌ付近に２番目のピークが出現した。回収したゲルろ過フラクションのうち、図１４上段のチャートに１〜１５で示したフラクションから各１０μｌを非還元状態で電気泳動し、ＯＲＩＯＬＥ染色した（図１４左下）、または抗Ｗｎｔ５ａ抗体によるウエスタンブロッティング（図１４右下）を行った。これらの結果から、分子量約４０ｋＤａのバンドはＷｎｔ５ａであることが確認された。さらに、Ｗｎｔ５ａはＷｎｔ３ａと同様にウシ血清由来アファミンと１対１の複合体を形成しており、見かけ上分子量１５０ｋＤａの単量体蛋白質のように挙動することがわかった。
【００８０】
３．Ｗｎｔ５ａ−アファミン複合体の生物活性
Ｄｖｌ２のリン酸化を指標に、Ｗｎｔ５ａ−アファミン複合体の活性を評価した。上記１でアフィニティー精製したＷｎｔ５ａ−アファミン複合体と、従来の方法（Kurayoshi et al., Biochem. J. 402, 515-523 (2007)）で精製したＷｎｔ５ａ（１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ含有タグなし）を、ＣＨＡＰＳ濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）以下になるように、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む新鮮な培地で希釈した。
【００８１】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養し、Ｗｎｔ５ａ濃度が０、１０、２０および４０ｎｇ／ｍｌになるように精製したＷｎｔ５ａを培地に添加し、２時間処理した。ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（20 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1% Nonidet P-40, 137 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 20 μg/ml aprotinin, 20 μg/ml leupeptin, 5 mM NaF, 5 mM Na3VO4, and 50 mM β-glycerophosphate）を用いて細胞を溶解し、細胞溶解液を抗Ｄｖｌ２抗体（Cell signaling Technology社）を用いたウエスタンブロッティングに供した。
【００８２】
結果を図１５に示した。図１５の左側は従来の方法で精製したＷｎｔ５ａ（アファミンを含まない）の結果であり、図１５の右側はＷｎｔ５ａ−アファミン複合体の結果である。図１５に示したように、どちらのＷｎｔ５ａも１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度でＤｖｌ２のリン酸化を誘導することが示された。この結果から、Ｗｎｔ５ａ−アファミン複合体として精製しても、Ｗｎｔ活性を有するＷｎｔ５ａ蛋白質を調製できることが示された。
【００８３】
〔実施例８：抗アファミン抗体を用いたＷｎｔ蛋白質の精製〕
Ｗｎｔ蛋白質は細胞から分泌されると一部が培地中のアファミンに捕捉されて非共有結合的な１対１複合体となり、リポ蛋白質粒子などに取り込まれずに安定な分子として存在できる。そしてＷｎｔ蛋白質は１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳによってアファミンとの複合体から解離する。これらを利用して、アフィニティータグを付加していない野生型のＷｎｔ蛋白質を、細胞培養上清から簡便に精製することができることを確認した。
【００８４】
＜方法＞
タグの付いていないＷｎｔ３ａを安定発現する細胞株（Ｌ−３ａ）の培養上清２５０ｍｌに、抗ウシアファミンモノクローナル抗体（Ｂ９１）を固定化したセファロースを２．５ｍｌ加え、４℃で３時間回転混和した。培養上清を空のカラムに通してセファロースを集め、５ｍｌのＰＢＳで５回洗浄し（ｗａｓｈ１〜５）、次いで２．５ｍｌの１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ／ＰＢＳを加えて１０分間静置した後、溶出を行った。溶出操作を１０回繰り返した（ｅｌｕｔｅ１〜１０）。集めたフラクション（ｗａｓｈ１〜５、ｅｌｕｔｅ１〜１０）からそれぞれ１５μｌを取り、非還元状態で電気泳動に供し、泳動後のゲルをＣＢＢ染色液で染色した。
【００８５】
電気泳動の結果を図１６に示した。図１６に示したように、Ｂ９１カラムにＷｎｔ３ａ−アファミン複合体をキャプチャーした後にＣＨＡＰＳで溶出すると、Ｂ９１とアファミンの相互作用はＣＨＡＰＳの影響を受けないので、Ｗｎｔ３ａだけがアファミンから解離して溶出された。得られるＷｎｔ３ａはほぼ１００％の純度である。この方法を用いれば、２５０ｍｌのＬ−３ａ培養上清から、わずか２．５ｍＬのＢ９１セファロースを使用して１段階で６μｇのタグなしＷｎｔ３ａ蛋白質を精製することが可能であり、一連の作業は１日以内に完了する。これに対し、非特許文献７の方法では、４Ｌの培養上清から、何日もかけてＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ、ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎの４つのステップ、並びにそれらの間の濃縮およびバッファー交換のステップを経て約１００μｇのＷｎｔ３ａが精製できるとしている。すなわち本発明の製造方法を用いれば、培養上清あたりの収率は従来法と同等であり、極めて簡便かつ短時間に、特殊な設備を必要とせず、Ｗｎｔ蛋白質を取得できることが示された。
【００８６】
〔実施例９：Ｗｎｔ３ａとヒトアファミンとの共発現によるＷｎｔ３ａ−アファミン複合体の精製〕
１．Ｗｎｔ３ａ／ヒトアファミン共発現のＷｎｔ３ａ分泌に与える効果
Ｎ末端にＰＡタグを付加したＷｎｔ３ａ発現コンストラクトとＮ末端にターゲットタグを付加したヒトアファミン発現コンストラクトを作製し、Ｅｘｐｉ２９３システム（Life Technologies Inc.）を用いてトランスフェクションし、Ｗｎｔ３ａとヒトアファミンを一過性に共発現するＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を作製した。別途、空ベクターまたはＰＡタグ付加Ｗｎｔ３ａ発現コンストラクトをＥｘｐｉ２９３システム（Life Technologies Inc.）を用いてトランスフェクションしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を作製した。
【００８７】
上記のトランスフェクションした各細胞を、血清を含まない培地で９０時間培養し、それぞれ上清を回収した。上清１ｍｌに抗ＰＡタグ抗体ＮＺ−１（Fujii et al. Protein Expres Purif 95, 240-247 (2014)）を固定化したセファロースを２０μｌ加え、１時間回転混和した。遠心分離によりセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍｌのＴＢＳで３回セファロースを洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー３０μｌを加えて９５℃で２分間加熱して試料を溶出した。溶出した試料を非還元状態で電気泳動し、泳動後のゲルをＣＢＢ染色液で染色した。
【００８８】
結果を図１７に示した。レーン３（mock）は空ベクターを、レーン１（Wnt3a）はＷｎｔ３ａ発現ベクターのみを、レーン２（Wnt3a＋hAFM）はＷｎｔ３ａとヒトアファミンの発現ベクターの混合物をそれぞれトランスフェクションした細胞の培養上清の抗ＰＡタグ抗体ＮＺ−１による免疫沈降の結果である。血清を含まない培地を用いたので、Ｗｎｔ３ａ発現ベクターのみをトランスフェクションした細胞の培養上清にはＷｎｔ３ａが分泌されていなかった（レーン１）。これに対し、Ｗｎｔ３ａ／ヒトアファミン共発現細胞の培養上清のからは、Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体が免疫沈降された（レーン２）。この結果から、アファミンと同時に共発現することによって、本来は血清を含まない培地中にはまったく分泌されないＷｎｔ３ａを、アファミンとの複合体の形態で培地中に分泌させることができた。
【００８９】
２．抗ＰＡタグ抗体を用いたＷｎｔ３ａの精製
上記と同様にＰＡタグ付加Ｗｎｔ３ａとターゲットタグ付加ヒトアファミンを一過性に共発現するＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を９０時間培養し、回収した培養上清に１／１００量のＮＺ−１セファロースを加えてＷｎｔ３ａ／ヒトアファミン複合体をレジンにキャプチャーした。レジンはＴＢＳで洗浄したのち、０．１ｍｇ／ｍｌのＰＡ１４ペプチド（ＥＧＧＶＡＭＰＧＡＥＤＤＶＶ、配列番号１１）を含むＴＢＳで溶出することにより、ＰＡタグ付きＷｎｔ３ａを精製した。図１８に示すように、レーン１（NR：非還元状態）およびレーン２（R：還元状態）の結果から、溶出物のなかにはＷｎｔ３ａとヒトアファミン以外にはほとんど夾雑物は存在しなかった。すなわち、Ｗｎｔ３ａとヒトアファミンを共発現させた細胞の培養上清から、抗ＰＡタグ抗体ＮＺ−１を用いることにより、１ステップでＷｎｔ３ａ−アファミン複合体を精製できることが示された。なお、データを示していないが、上記の方法を用いることによって、Ｗｎｔ３ａ／ヒトアファミン共発現細胞の培養上清３００ｍｌから約１７０μｇの収量のＷｎｔ３ａが得られた。これは、従来の精製法（非特許文献７）の収量の２０倍を超える収量に相当する。
【００９０】
上記のようにＷｎｔ３ａ／ヒトアファミン共発現細胞の培養上清から精製したＷｎｔ３ａ（ＰＡタグ付き）−アファミン（ターゲットタグ付き）複合体を実施例５と同様に希釈してＴＣＦレポーターアッセイを行なったところ、図１９に示したように、１／２００希釈（１００ｎｇ／ｍｌ）以上で活性がみられ、その濃度変化から、Ｗｎｔ活性は、血清含有培地から精製したＷｎｔ３ａ−アファミン複合体のＷｎｔ活性（図１２）と同等であった。
【００９１】
３．Ｗｎｔ３ａ−アファミン複合体のゲルろ過クロマトグラフィー
Ｗｎｔ３ａ／ヒトアファミン共発現細胞上清から精製した複合体をゲルろ過クロマトグラフィーに供した。ゲルろ過にはＡＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア）を使用した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬを、バッファーにはＰＢＳを使用した。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。出現した２つのピークのフラクションおよびゲルろ過クロマトグラフィーに供する前の試料について、ＳＤＳゲル電気泳動とクマシー染色に供した。
【００９２】
結果を図２０に示した。クロマトチャートからわかるように、高分子量に相当する排除体積部分（Ｖ０）および約１５０ｋＤａ付近に２つのピークが現れた。電気泳動結果からわかるように、フラクションＩには高分子凝集体が含まれ、フラクションＩＩにはアファミンとＷｎｔ３ａが等量含まれることが示された。なお、ｉｍｐｕｔはゲルろ過に供する前の試料である。
【００９３】
〔実施例１０：各種ヒトＷｎｔとヒトアファミンとの共発現によるＷｎｔ分泌〕
１２種類のヒトＷｎｔ（Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、およびＷｎｔ１０ｂ）について、Ｎ末端にＰＡタグを付加した発現コンストラクトを作製し、実施例９と同様に各ヒトＷｎｔ発現コンストラクトとＮ末端にターゲットタグを付加したヒトアファミン発現コンストラクトをＥｘｐｉ２９３システム（Life Technologies Inc.）を用いてトランスフェクションし、各ヒトＷｎｔとヒトアファミンを一過性に共発現するＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を作製した。別途、１２種類のＰＡタグ付加ヒトＷｎｔ発現コンストラクトのみをＥｘｐｉ２９３システム（Life Technologies Inc.）を用いてトランスフェクションしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を作製した。
【００９４】
上記のトランスフェクションした各細胞を、血清を含まない培地で９０時間培養し、それぞれ上清を回収した。上清１ｍｌにＮＺ−１セファロースまたはＰ２０．１セファロースを２０μｌ加え、１時間回転混和した。遠心分離によりセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍｌのＴＢＳで３回セファロースを洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー３０μｌを加えて９５℃で２分間加熱して試料を溶出した。溶出した試料をビオチン修飾ＮＺ−１を用いたウエスタンブロッティングに供した。
【００９５】
図２１にＮＺ−１セファロースを用いて免疫沈降させた試料の結果を示し、図２２にＰ２０．１セファロースを用いて免疫沈降させた試料の結果を示した。図２１からわかるように、１２種類全てのヒトＷｎｔについて、Ｗｎｔ−アファミン共発現細胞の培養上清（AFM＋）のほうが、Ｗｎｔ発現細胞の培養上清（AFM−）よりＷｎｔ分泌量が増大していた。また、図２２からわかるように、Ｗｎｔ−アファミン共発現細胞の培養上清（AFM＋）において、アファミンに付加されたターゲットタグに対する抗体を用いた免疫沈降によりＷｎｔが検出された。この結果から、１２種類のヒトＷｎｔは、いずれもアファミンと複合体を形成していることが明らかになった。
【００９６】
〔実施例１１：ヒトＷｎｔ３−ヒトアファミン複合体のゲルろ過クロマトグラフィー〕
ヒトＷｎｔ３／ヒトアファミン共発現細胞上清から精製した複合体をゲルろ過クロマトグラフィーに供した。ゲルろ過にはＡＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア）を使用した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬを、バッファーにはＰＢＳを使用した。流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。出現した２つのピークのフラクションおよびゲルろ過クロマトグラフィーに供する前の試料について、ＳＤＳゲル電気泳動とクマシー染色に供した。
【００９７】
結果を図２３に示した。クロマトチャートからわかるように、高分子量に相当する排除体積部分（Ｖ０）および約１５０ｋＤａ付近に２つのピークが現れた。電気泳動結果からわかるように、フラクションＩには高分子凝集体が含まれ、フラクションＩＩにはアファミンとＷｎｔ３が等量含まれることが示された。なお、ｉｍｐｕｔはゲルろ過に供する前の試料である。
【００９８】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月28日(2018.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｎｔ蛋白質発現細胞を精製アファミンまたは組換えアファミンを含有する培地で培養する工程、および培養上清を取得する工程を含むことを特徴とするＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体含有培養上清の製造方法。
【請求項２】
前記培地が血清不含培地である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
Ｗｎｔ蛋白質発現細胞と組換えアファミン発現細胞とを共培養するする工程、および培養上清を取得する工程を含むことを特徴とするＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体含有培養上清の製造方法。
【請求項４】
共培養に用いる培地が血清不含培地である請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
Ｗｎｔ蛋白質と組換えアファミンの両方を発現する細胞を培養する工程、および培養上清を取得する工程を含むことを特徴とするＷｎｔ蛋白質−アファミン複合体含有培養上清の製造方法。
【請求項６】
培養に用いる培地が血清不含培地である請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
Ｗｎｔ蛋白質と精製アファミンまたは組換えアファミンとの複合体を含有する培養上清。
【請求項８】
血清を含有しない請求項７に記載の培養上清。
【請求項９】
Ｗｎｔ蛋白質と精製アファミンまたは組換えアファミンとの複合体を含有し、界面活性剤を含有しない溶液。