(57)【要約】【課題】本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いた免疫測定法において、検体中の夾雑物がＳＰＦＳのセンサ部（一次抗体、固相化層、金属薄膜等）に非特異的に吸着することによって生じる非特異的シグナルの抑制方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分析法（ＳＰＦＳ）を用いた免疫測定法（一次抗体に替えて測定対象化合物に対するレセプターを用いる場合を含む）における夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法であって、検体に金属イオンを添加する前処理を行う前処理工程を含む非特異的シグナルの抑制方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン励起増強蛍光分析法（ＳＰＦＳ）を用いた免疫測定法（一次抗体に替えて測定対象化合物に対するレセプターを用いる場合を含む）における夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法であって、
検体に金属イオンを添加する前処理を行う前処理工程を含む非特異的シグナルの抑制方法。
【請求項２】
前記前処理を行った検体についてのバックグランドに対するシグナルの比（Ｓ／Ｂ）が前記前処理を行わない検体についてのＳ／Ｂより大きい請求項１に記載の非特異的シグナルの抑制方法。
【請求項３】
前記前処理が、検体にＦｅ3+イオン又はＺｎ2+イオンを１０μＭ〜５Ｍ添加する前処理である請求項１又は２に記載の非特異的シグナルの抑制方法。
【請求項４】
前記検体が血漿又は血清である請求項１〜３いずれかに記載の非特異的シグナルの抑制方法。
【請求項５】
前記測定対象化合物が糖タンパク質又は糖脂質である請求項１〜４いずれかに記載の非特異的シグナルの抑制方法。
【請求項６】
前記測定対象化合物がシアル酸を含む糖鎖を有する糖タンパク質又は糖脂質である請求項１〜５いずれかに記載の非特異的シグナルの抑制方法。
【請求項７】
前記検体が血漿又は血清であり、前記測定対象化合物がシアル酸を含む糖鎖を有する糖タンパク質又は糖脂質であり、
ＳＰＦＳのセンサ部に捕捉された測定対象化合物を標識するためのレクチンを用いて、前記測定対象化合物由来のシグナルを測定する測定工程を更に含む請求項１〜３いずれかに記載の非特異的シグナルの抑制方法。
【請求項８】
前記測定対象化合物が前立腺特異抗原（prostate specific antigen、ＰＳＡ）である請求項６又は７に記載の非特異的シグナルの抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いた免疫測定法における夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法に関する。更に詳しくは、上記測定法において、検体中の夾雑物がＳＰＦＳのセンサ部に非特異的に吸着することによって生じる非特異的シグナルの抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや動物の血液、尿、その他の生体試料中に含まれる腫瘍マーカー、特定のタンパク質、その他の抗原を検出、定量することは、今日の医療分野における診断や生物、生化学の分野における研究において広く行われている。そして、微量の測定対象化合物（抗原）を特異的に検出する方法として免疫測定法が用いられている。免疫測定法の一つに、一次抗体で捕捉した抗原を二次抗体を用いて標識するサンドイッチ法があり、二次抗体に蛍光標識抗体等を用いる方法が広く実施されている。二次抗体の替わりに、測定対象化合物が有する糖鎖と結合するレクチンを標識して用いる方法も知られている。
【０００３】
また、免疫測定法において、抗原抗体反応により捕捉された標識蛍光分子を極めて効率的に励起し、高感度に検出する方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）が知られている。ＳＰＦＳでは、抗原より照射したレーザー光等の励起光が、金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に表面プラズモン（粗密波）を発生させることによって、光源より照射した励起光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得ることができる。そして、ＳＰＦＳを用いた免疫測定法では、この電場増強効果により、金属薄膜の表面近傍に捕捉した測定対象化合物と結合した蛍光物質を効率良く励起させ、増強された蛍光発光を観察することによって、極めて微量の測定対象化合物も測定可能となる。
【０００４】
一方、血液（血清、血漿）のような生体試料中には、測定対象化合物以外に種々のタンパク質、脂質、その他の夾雑物が含まれており、免疫測定法において、これらの夾雑物が一次抗体や二次抗体あるいは抗体を固定化するための支持体等に非特異的に吸着し、この夾雑物に蛍光標識体が結合することにより、夾雑物由来の非特異的シグナルが発生し、バックグランドノイズの原因となる。特に、ＳＰＦＳを用いた免疫測定法の場合は、化学発光法を用いた場合に比べ１００倍以上の高感度を実現しており、そのため化学発光法では検出されなかった非特異的シグナルも検出され、測定感度の低下が起こる。また、ＳＰＦＳの場合は、夾雑物を介して蛍光標識体がセンサ部（一次抗体、固相化層、金属薄膜等）に僅かでも付着してしまうと、屈折率が変化して電場増強効果に影響を及ぼすことになり、その結果、蛍光測定のバックグランドノイズが不安定になり、高感度測定の障害となることもある。ＳＰＦＳにおけるこの問題は、特に血清のようなクルードな検体の測定時に大きな問題となる。
【０００５】
この問題に関して、ＳＰＦＳにおけるセンサエリア上の非特異的吸着を防止する対策として、ＳＰＦＳ測定用流路において、フロー方向に対して上流に精製エリアを配置し、その下流にセンサエリアを配置するＳＰＦＳ用センサチップが提案されている（特許文献１）。このように、ＳＰＦＳにおける非特異的シグナルの抑制及びバックグランドノイズの低減については既に提案されているが、検体、測定対象化合物、測定目的、操作性、費用等に応じて、最も効果的な方法を選ぶことは重要であり、更なる提案が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開WO2012/023391号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いた免疫測定法において、検体中の夾雑物がＳＰＦＳのセンサ部（一次抗体、固相化層、金属薄膜等）に非特異的に吸着することによって生じる非特異的シグナルの抑制方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＳＰＦＳを用いた免疫測定法で生じる非特異的シグナルの原因は血漿、血清等の検体中の夾雑物がセンサ部に非特異的に吸着することにあり、この夾雑物が測定対象化合物以外のタンパク質、脂質、等であるということに着目して検討した。その結果、この夾雑物の構造を特定の処理方法により変化（変性）させることで、夾雑物のセンサ部への非特異的吸着を抑制でき、夾雑物由来の非特異的シグナル（バックグラウンド）を大幅に低下させることができること、更に、測定対象化合物への影響を最小限に抑え、測定対象化合物由来のシグナルの低下を相対的に小さなものに留めることにより、測定において重視される前記バックグラウンドの値に対する当該シグナルの値の比率（Ｓ／Ｂ比）を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明の一側面では、本発明の非特異的シグナルの抑制方法は次の通りである。
表面プラズモン励起増強蛍光分析法（ＳＰＦＳ）を用いた免疫測定法（一次抗体に替えて測定対象化合物に対するレセプターを用いる場合を含む）における夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法であって、
（１）検体に酸又はアルカリを添加する前処理、
（２）検体に金属イオンを添加する前処理、及び
（３）検体を加熱する前処理
の少なくとも一つの前処理を行うことを特徴とする非特異的シグナルの抑制方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＳＰＦＳを用いた免疫測定法において、検体中の夾雑物がＳＰＦＳのセンサ部に非特異的に吸着することによって生じる非特異的シグナル（バックグランド）を大幅に低下させることができる。更に、本発明によれば、測定対象化合物への影響を最小限に抑えた上で、すなわち、測定対象化合物由来のシグナルの低下を相対的に小さなものに留めた上で、夾雑物由来の非特異的シグナルを抑制できる。
【００１１】
その結果、本発明によれば、ＳＰＦＳを用いた免疫測定法において、血漿や血清のような夾雑物を含む検体であっても、バックグランドノイズの低減及びバックグランドの値に対する測定対象化合物由来のシグナルの値の比率（Ｓ／Ｂ比）の向上を図ることができ、極めて微量な測定対象化合物のより正確な測定が可能となる。
【００１２】
また、本発明で用いる前処理は複雑な工程を必要とせず、ＳＰＦＳ用のセンサチップに特殊な領域を配置する必要もないので、操作性やコストを犠牲にすることなく高い効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明で使用する上で好適なＳＰＦＳ用測定装置の全体構成を模式的に示す概略図である。
【図２】図２は、図１の測定装置のセンサチップ周辺の部分拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いた免疫測定法における夾雑物由来の非特的シグナルの抑制方法である。以下に、本発明の非特異的シグナルの抑制方法について説明する。
【００１５】
１．測定対象化合物
（１）検体
本発明は、用いる検体は特に制限はなく、例えば、ヒトや動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、細胞、組織及び器官及びこれらの調整物（例えば、生検標本）が挙げられる。特に、癌抗原、腫瘍マーカーを含む可能性のある血液、血清及び血漿は測定する生体試料として好適である。
【００１６】
血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液等の液性の試料は、必要に応じて、適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、器官等の固形の試料は、適当な緩衝液を加えてホモジェナイズして、懸濁液又はその上清を、そのまま、又は更に希釈して使用することができる。
【００１７】
（２）測定対象化合物
測定対象化合物は、免疫測定法でリガンド（抗体）によって捕捉可能な物質であればよい。また、サンドイッチ法の蛍光標識体としてレクチンを用いる場合は、糖鎖を有する物質を測定対象化合物とする。
【００１８】
このような測定対象化合物としては、例えば、タンパク質（糖タンパク質を含む）、脂質（糖脂質を含む）、これらの修飾分子、複合体等を挙げることができ、好ましい測定対象化合物としては、前立腺特異抗原（prostate specific antigen、ＰＳＡ）その他の腫瘍マーカーが挙げられる。なお、前立腺癌患者のＰＳＡの糖鎖がα２，３−結合またはα２，６−結合したシアル酸を有することが知られている。
【００１９】
２．前処理
本発明では、（i）検体に酸又はアルカリを添加する前処理、(ii)検体に金属イオンを添加する前処理、及び、（iii）検体を加熱する前処理の少なくとも一つの前処理を実施する。これらの前処理を単独で行っても、組み合わせて行ってもよい。前処理は、検体中の夾雑物がＳＰＦＳのセンサ部に非特異的に吸着することを抑制するために行うため、検体を後述するＳＰＦＳ用測定装置の測定領域へ供給する（センサチップの金属薄膜上の反応層に接触させる）前に行う。以下、それぞれの前処理について説明する。
【００２０】
（１）検体に酸又はアルカリを添加する前処理
添加する酸、アルカリに特に制限はなく、有機酸、無機酸いずれも使用可能である。
酸、アルカリは、検体中で所定のｐＨを維持するために、通常は緩衝液の形で検体に添加する。緩衝液は、目的とするｐＨに応じて適宜選択すればよく、例えば、ｐＨ１．０〜２．２では塩酸−塩化カリウム緩衝液、ｐＨ２．２〜３．６ではグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ３．０〜６．２ではクエン酸緩衝液、ｐＨ３．０〜５．６では酢酸緩衝液、ｐＨ２．６〜７．０ではクエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ５．８〜８．０ではリン酸緩衝液、ｐＨ７．２〜９．０ではトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．６〜１０．６ではグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．２〜１０．６では炭酸−重炭酸緩衝液、ｐＨ１１．０〜１２．０ではリン酸水素２ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、等がある。
【００２１】
添加後の検体のｐＨは、検体と測定対象化合物に応じて、その測定の目的から、検体中の夾雑物由来の非特異的シグナルが必要な程度に抑制され、測定対象化合物のシグナルの低下が許容できる範囲で選べばよい。特に、シアル酸を含む糖鎖は酸、アルカリ等の前処理で切断その他の変性が起こりやすく（特に糖鎖の末端に結合したシアル酸は切断されやすい）、測定対象化合物がシアル酸を含む糖鎖を有する糖タンパク質又は糖脂質である場合、特に、このような測定対象化合物を標識したレクチンを用いて測定する場合には、測定化合物のシグナル低下の許容範囲を考慮して合目的的な範囲で前処理条件（添加後の検体のｐＨ）を選ぶ必要がある。そのような前処理条件の範囲は（４）で後述する方法で評価し、適宜調整することができるが、一般的には、検体に酸を添加して検体のｐＨを１〜４にする前処理又は検体にアルカリを添加して検体のｐＨを８〜１１にする前処理が好ましい（実施例１及び３の処理方法１〜５を参照）。
【００２２】
処理時間は効果が得られる範囲で適宜選べばよく、例えば、所定のｐＨで室温にて３０分放置すればよい。その後、必要に応じ、生理食塩水へのバッファー交換等により、検体の当初のｐＨ等へ戻せば良い。
【００２３】
（２）検体に金属イオンを添加する前処理
添加する金属イオンは、検体中の夾雑物であるタンパク質、脂質、等の変性を起こさせる金属イオンであればよく、特に、重金属イオンが好ましい。重金属イオンとしては、例えば、Ｐｂ2+、Ｃｒ3+、Ｆｅ3+、Ｆｅ2+、Ｃｄ2+、Ｎｉ2+、Ｈｇ2+、Ｃｏ2+、Ｓｎ2+、Ｓｎ4+、Ｍｎ2+、Ｍｏ3+、Ｗ3+、Ｚｎ2+、Ｃｕ2+、Ａｇ2+等を挙げることができる。使用にあたっては、廃液等の環境汚染を考慮することが好ましく、この点からは、例えば、Ｆｅ3+、Ｚｎ2+が好ましい。
【００２４】
測定対象化合物が糖タンパク質や糖脂質等の糖複合体、特に、シアル酸を含む糖鎖を有する糖タンパク質又は糖脂質である場合には、「検体に金属イオンを添加する前処理」が好ましい。シアル酸を含む糖鎖は酸、アルカリ、加熱等の前処理で切断その他の変性が起こりやすい（特に糖鎖の末端に結合したシアル酸は切断されやすい）が、この点、金属イオンは糖タンパク質や糖脂質の糖鎖部分へは影響がなく、タンパク質部分や脂質部分のみに作用する。従って、測定対象化合物が糖鎖を有する場合（特に、測定対象化合物がシアル酸を含む糖鎖を有する糖タンパク質又は糖脂質である場合）、「検体に金属イオンを添加する前処理」は測定対象化合物の糖鎖構造の変化を防ぎ、かつ、夾雑物の非特異的吸着を抑制する上で好ましく、サンドイッチ法の二次抗体に替えて標識したレクチンを用いて糖鎖を有する測定対象化合物を測定する場合には特に好ましい。
【００２５】
また、「検体に金属イオンを添加する前処理」は、検体を中性条件下で前処理することが可能であり、その後の抗原抗体反応へも特に影響がなく測定可能である。従って、前処理後は、金属イオンを除去することなく、そのままＳＰＦＳを用いた免疫測定法を行うことができ、また、必要に応じて、生理食塩水へのバッファー交換等により、添加した金属イオンを検体から除去した後、測定を行ってもよい。
【００２６】
金属イオンの添加方法は、特に制限はないが、通常は金属塩として添加する。金属塩としては、無機酸の塩や有機酸の塩として添加することができ、好ましくは、水溶性の塩として添加する。このような水溶性の塩は、例えば強酸の塩であり、一例として、Ｆｅ3+の場合はＦｅＣｌ3、Ｆｅ2（ＳＯ4）3、Ｚｎ2+の場合はＺｎＣｌ2、ＺｎＳＯ4として添加すればよい。
【００２７】
添加する金属イオンの濃度は、夾雑物の吸着防止効果と測定対象化合物への影響の点から適宜選択すればよいが、通常は、１０μＭ〜５Ｍ、好ましくは、５０μＭ〜１００ｍＭ、を添加する（実施例１及び３の処理方法６及び７を参照）。
【００２８】
（３）検体を加熱する前処理
検体を加熱する前処理は、検体と測定対象化合物に応じて、その測定の目的から、検体中の夾雑物由来の非特異的シグナルが必要な程度に抑制され、測定対象化合物のシグナルの低下が許容できる範囲で選べばよい。特に、シアル酸を含む糖鎖は加熱等の前処理で切断その他の変性が起こりやすく（特に糖鎖の末端に結合したシアル酸は切断されやすい）、測定対象化合物がシアル酸を含む糖鎖を有する糖タンパク質又は糖脂質である場合、特に、このような測定対象化合物を標識したレクチンを用いて測定する場合には、測定化合物のシグナル低下の許容範囲を考慮して合目的的な範囲で前処理条件（加熱温度及び時間）を選ぶ必要がある。そのような前処理条件の範囲は後述する方法で評価し、適宜調整できるが、一般的には、検体を９５〜１００℃で５〜１０分間加熱する前処理が好ましい（実施例２及び３の処理方法８を参照）。
【００２９】
加熱処理の方法は、特に制限はないが、例えば、市販のヒートブロックを用いて、所定の温度に設定して所定の時間、検体を加熱すればよい。
【００３０】
（４）前処理条件の効果の評価方法
前処理条件の効果は、前処理を行った検体についてのバックグランドに対するシグナルの比（Ｓ／Ｂ）と前処理を行わない検体についてのＳ／Ｂとを比較することで評価することができる（実施例及び比較例を参照）。
【００３１】
ここで、検体のバックグランド（Ｂ）とは、測定対象化合物を含まない検体について、ＳＰＦＳを用いた免疫測定法で測定した場合のシグナルの値である。検体のシグナル（Ｓ）とは、測定対象化合物を含む検体について、ＳＰＦＳを用いた免疫測定法で測定した場合のシグナルの値である。両シグナルの値からＳ／Ｂを算出する（この場合のＳは、正確にはＢの上乗せとして観察されるシグナル（Ｓ＋Ｂ）であるが、Ｓに比べてＢが小さいことから、Ｓ／Ｂの値をバックグランドに対するシグナルの比として用いる）。
【００３２】
前処理を行った検体のＳ／Ｂ（後述の実施例１の処理方法１〜７及び実施例２の処理方法８）と前処理を行わない検体のＳ／Ｂ（後述の比較例１の処理方法９）を比較し、前処理を行ったＳ／Ｂの値が前処理を行わない検体のＳ／Ｂに比べ、大きければ本発明の前処理の条件として使用できる。その大きさは、その測定の目的を考慮して決めればよく、前処理方法、検体、測定対象化合物などによっても変わってくるが、例えば、検体が血清であり、測定対象化合物が糖タンパク質又は糖脂質である場合には、サンドイッチ法の二次抗体として標識された抗体を用いる場合は、両Ｓ／Ｂの比、すなわち、（前処理を行った検体についてのＳ／Ｂ）／（前処理を行わない検体についてのＳ／Ｂ）は、好ましくは１．５以上、更に好ましくは２以上である。同様の検体と測定対象化合物の場合で、サンドイッチ法の二次抗体に替えて標識したレクチンを用いる場合は、両Ｓ／Ｂの比（前処理を行った検体についてのＳ／Ｂ）／（前処理を行わない検体についてのＳ／Ｂ）は、好ましくは５．０以上、更に好ましくは、６．０以上である。
【００３３】
なお、上記のＳ／Ｂの測定において、測定対象化合物を含まない検体は、例えば、血清の場合は市販されているもの（正常ヒトプール血清）を用いることができる。測定対象化合物を含む検体は、この市販の血清に測定対象化合物の標準品（ＰＳＡの場合は、ＰＳＡ産生細胞の培養上清から調製）を一定量加えて作製することができる。前処理を行った場合と前処理を行わない場合の検体は、使用する市販の検体、測定対象化合物添加量等は同条件で測定することは言うまでもない。
【００３４】
３．表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いた免疫測定法
本発明では免疫測定法（イムノアッセイ法）を用いており、抗原抗体反応でセンサ部に捕捉された標識蛍光分子をＳＰＦＳによって励起させ、増強させた蛍光発光を測定する。従って、本発明で用いる免疫測定法は、蛍光免疫測定法（蛍光イムノアッセイ法）であればいずれも使用可能であり、通常はサンドイッチ法が用いられる。以下に、サンドイッチ法を用いた本発明について説明する。
【００３５】
（１）免疫測定法
（ａ）リガンド
本発明で使用するリガンド（サンドイッチ法の一次抗体）は、測定対象化合物を特異的に認識して結合する抗体である。特に、測定対象化合物に対するモノクローナル抗体が好適である。なお、本発明では、測定対象化合物に応じて、そのレセプターもリガンドとして用いることができ、本発明の範囲には、サンドイッチ法の一次抗体に替えて測定対象化合物に対するレセプターを用いる場合も含んでいる。
【００３６】
癌抗原、腫瘍マーカー等を測定対象化合物とする場合は、その抗原に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体等）をリガンドとして用いることが適切である。例えば、ヒトＰＳＡ（前立腺特異抗原）を測定対象化合物とする場合は、抗ヒトＰＳＡ抗体を用いればよい。
【００３７】
なお、上記のリガンド（サンドイッチ法の一次抗体）は測定対象化合物を特異的に捕捉する物質を意味し、完全抗体のみならず任意の抗体断片または誘導体を含み、完全抗体に加え、Ｆａｂ、Ｆａｂ'2、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等の各種抗体も包含される。
【００３８】
（ｂ）リガンドの固相化
本発明では、上記（ａ）のリガンドを通して測定対象化合物を捕捉し、捕捉した測定対象化合物に結合した蛍光標識分子をＳＰＦＳによって励起する必要がある。従って、リガンドはＳＰＦＳのセンサ部の金属薄膜上に固相化（固定化）する。金属薄膜上への固相化の方法は通常の方法を用いればよく、詳細は後述のＳＰＦＳにおいて説明する。
【００３９】
（ｃ）蛍光標識体
本発明では、上記（ｂ）でリガンドを通してＳＰＦＳのセンサ部の金属薄膜上に捕捉された測定対象化合物を蛍光標識するために、二次抗体、レクチン、その他、通常のサンドイッチ法で使用可能な蛍光標識体が用いられる。
【００４０】
二次抗体としては、例えば、測定対象化合物上のリガンド（一次抗体）とは別のエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用し、蛍光標識抗体を作製することができる。
また、測定対象化合物が糖鎖を有する場合、その糖鎖と高い結合能で結合するレクチンもサンドイッチ法の蛍光標識体として用いることができる。レクチンとしては、リシンＢ鎖関連の「Ｒ型レクチン」、「カルネキシン・カルレティキュリン」、「Ｃ型レクチン」、「ガレクチン」、「豆科レクチン」、「Ｌ型レクチン」、「Ｐ型レクチン」、「アネキシン」、「Ｉ型レクチン」等、種々のものがあるが、目的にあったものを用いればよく、例えば、測定対象化合物が前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の場合はＷＦＡ（ノダフジレクチン）、ＳＢＡ（ダイズレクチン）、ＴＪＡ−ＩＩ（キカラスウリレクチン）、測定対象化合物がα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の場合はＬＣＡ（レンズマメレクチン）、ＡＡＬ（ヒイロチャワンダケレクチン）、ＡＯＬ（アスペルギルス・オリゼレクチン）、測定対象が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の場合はＴＪＡ−Ｉ（キカラスウリレクチン）等が挙げられる。
【００４１】
蛍光標識体の作製方法は、例えば、蛍光物質にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）とＮ−ヒドロキシコハク酸（ＮＨＳ）とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と抗体又はレクチンが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法、その他を用いることができる。
【００４２】
蛍光色素は特に限定されるものではないが、ＳＰＦＳを用いる本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜として金を用いる場合には、金薄膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が600ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ5，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）647等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属薄膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が400ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
【００４３】
（２）表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）
表面プラズモン励起増強蛍光分光（Surface Plasmon-field enhanced fluorescence spectroscopy:SPFS）法（ＳＰＦＳ）は、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉された測定対象化合物を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中に測定対象化合物がごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。ＳＰＦＳ法を用いる場合の測定部材は流路、ウエルのいずれの構成もとることができ、センサチップ、反応層、ＳＰＦＳシステム、ＳＰＦＳ測定装置等は通常用いられているものを用いることができる。
【００４４】
以下に、本発明で用いる表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）について図１及び図２を用いて説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、ＳＰＦＳの原理を用いた方法であればいずれも使用可能である。
【００４５】
（ａ）ＳＰＦＳ用測定装置
ＳＰＦＳ用測定装置は、基本的に、ＳＰＦＳ用測定部材が着脱可能となっており、使用する蛍光体に応じた適切な波長の励起光（好適にはレーザー光）を照射するための光源、励起光をセンサチップの金属薄膜の裏面に所定の角度で入射させるためのプリズム（透明支持体が平面基板状のセンサチップを使用する場合）、金属薄膜で反射した光を受光しその強度を測定する受光器、蛍光体から発せられる蛍光を集光するためのレンズおよびその蛍光の強度を測定するための検出器、励起光および蛍光から所定の波長を有する光のみを透過させそれ以外の光をカットするための各種のフィルタなどを備える。
【００４６】
免疫測定法に使用するＳＰＦＳ用測定装置の例として、図１及び図２を示す。
図１は、本発明で使用する上で好適なＳＰＦＳ用測定装置の全体構成を模式的に示す概略図である。図２は、図１の測定装置のセンサチップ周辺の部分拡大図である。
【００４７】
図１及び図２に示すように、定量測定装置１０は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２と、この誘電体部材１２の水平な上面１２ａに形成された金属薄膜１４とを有するセンサチップ１６を備えており、このセンサチップ１６は、定量測定装置１０のセンサチップ装填部１８に装填されている。
【００４８】
また、誘電体部材１２の下方の一方の側面１２ｂの側には、図に示すように、光源２０が配置されており、この光源２０からの入射光２２が、誘電体部材１２の外側下方から、誘電体部材１２の側面１２ｂに入射して、誘電体部材１２を介して、誘電体部材１２の上面１２ａに形成された金属薄膜１４に向かって照射されるようになっている。
【００４９】
また、光源２０と誘電体部材１２との間には、光源２０から照射されるレーザー光を、金属薄膜１４上で表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするための偏光フィルタを設けることもできる。
【００５０】
また、誘電体部材１２の下方の他方の側面１２ｃの側には、図５に示すように、入射光２２が金属薄膜１４によって反射された金属薄膜反射光２４を受光する受光手段２６が備えられている。
【００５１】
なお、光源２０には、光源２０から照射される入射光２２の、金属薄膜１４に対する入射角α１を適宜変更可能とする入射角調整手段（図示せず）が備えられている。一方で、受光手段２６にも、図示しない可動手段が備えられており、金属薄膜反射光２４の反射角が変わった場合にも、光源２０と同期して、確実に金属薄膜反射光２４を受光するように構成されている。
【００５２】
なお、センサチップ１６、光源２０、受光手段２６によって、定量測定装置１０のＳＰＲ測定を行うＳＰＲ測定部２８が構成されている。
また、センサチップ１６の上方には、後述するような蛍光物質が励起されて発光した蛍光３０を受光するための光検出手段３２が備えられている。
【００５３】
なお、センサチップ１６と、光検出手段３２との間には、例えば、カットフィルタや集光レンズなどを設けることもできる。
なお、センサチップ１６、光源２０、光検出手段３２によって、定量測定装置１０のＳＰＦＳ測定を行うＳＰＦＳ測定部３４が構成されている。
【００５４】
また、受光手段２６および光検出手段３２は、それぞれ、定量演算手段４０に接続されており、受光手段２６によって受光した金属薄膜反射光２４の光量と、光検出手段３２によって受光した蛍光３０の光量とが、定量演算手段４０に送信されるように構成されている。
【００５５】
また、後述する実施例のセンサチップ１６では、金属薄膜１４の上面１４ａに流路３６が形成されている。この流路３６の一部には、測定対象化合物（アナライト）と特異的に結合する分子（リガンド）が固相化されたセンサ部３８が設けられている。
【００５６】
（ｂ）ＳＰＦＳ用測定部材
上記のＳＰＦＳ用測定装置の内、ＳＰＦＳ用測定部材は、一般的に、サンドイッチ型免疫複合体を形成してＳＰＦＳによる蛍光測定を行うための場（測定領域）が形成されているセンサチップと、サンドイッチ型免疫複合体の形成などに用いられる各種の溶液（測定対象化合物を含む検体、蛍光標識体の溶液、その他の反応試薬等）を測定領域上に保持することのできる流路またはウェルを構築するための部材とを積層化した構成をとる。
【００５７】
センサチップは、基本的に、金属薄膜の裏面に励起光を導入するための透明支持体と、当該透明支持体上に形成された表面プラズモン共鳴を発生させるための金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された測定対象化合物をセンサ表面に捕捉するための反応層とを含み、更に必要に応じて、金属薄膜と反応層の間に形成された蛍光体が金属薄膜に近接しすぎることにより起こる蛍光の金属消光を防止するためのスペーサ層を含んでいてもよい。
【００５８】
反応層が形成されている部位が測定領域に相当する。流路またはウェルの底面全域に反応層を形成して測定領域としてもよいし、底面の一部のみに（必要であれば所望のパターニングで）反応層を形成して測定領域としてもよい。測定領域の面積は、一般的にレーザー光として照射される励起光の照射面積を考慮しながら調整することができる。例えば、励起光のスポット径が１ｍｍφ程度であれば、上記アッセイエリアは通常、少なくとも数ｍｍ四方の面積を有するものとなるよう設計される。
【００５９】
ＳＰＦＳのシステムを、密閉流路を通じて各種の溶液を送液する「流路型」とする場合、センサチップの上に、流路を形成するための穴のあいた「フローセル」を積載し、必要に応じてさらにその上に、上記フローセルの穴に対応する位置に送液導入口および送液排出口のあいた「天板」を積載し、これらを密着させて固定するようにして、測定部材を構築する。上記フローセルの穴に対応する位置のセンサチップ表面が、流路の底面をなし、そこに測定領域が形成される。流路型の場合、たとえばポンプやチューブを含む送液手段を用いて、各種の液体を送液導入口から流路内に送液して送液排出口から排出することができ、必要に応じて往復型、循環型の送液を行うこともできる。送液速度や送液（循環）時間などの条件は、試料の量や試料中のアナライトの濃度、流路ないしウェルのサイズや反応層の態様（固相化リガンドの密度等）、ポンプの性能等を考慮しながら、適宜調整することができる。
【００６０】
一方、ＳＰＦＳのシステムを、上記流路よりも広い空間に各種の溶液を貯留させる「ウェル型」とする場合、センサチップの上に、ウェルを形成するための貫通孔を有する「ウェル部材」を積載して固定することにより測定部材を構築する。ウェル型の場合、たとえばピペット状の部材を用いて、各種の液体をウェルに添加し、除去することができる。
【００６１】
上記フローセルは、たとえばシート状のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製とすることができる。上記天板は、測定領域から発せられる蛍光を測定できるよう透明性を有する材料で作製され、たとえばプレート状のポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製とすることができる。あるいは、フローセルおよび天板を、成形加工やフォトリソグラフィにより所望の形状にしたプラスチック製とすることも可能である。
【００６２】
センサチップ上にフローセルまたはウェル部材を密着させて固定する手段は特に限定されるものではなく、一般的には物理的に上下から圧力をかけるようにすればよく、必要であれば、透明支持体と同じ光屈折率を有する接着剤、マッチングオイル、透明粘着シートなどを用いてもよい。
【００６３】
（ｃ）リガンドの金属薄膜上への固相化
金属薄膜上へのリガンドの固相化（固定化）方法の例として、ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：自己組織化単分子膜）を形成する方法を示す。
【００６４】
ＳＡＭは、リガンド、好ましくは固相化層を固定化する足場として、またプラズモンセンサをサンドイッチアッセイに用いた際に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、上記金属薄膜の、上記反応層側（透明支持体（図１及び図２では誘電体部材）とは接していないもう一方の表面）に形成される。
【００６５】
ＳＡＭが含む単分子としては、通常、炭素原子数4〜20程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは10-カルボキシ-1-デカンチオールが用いられる。炭素原子数4〜20のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
【００６６】
このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜がその表面に形成された透明支持体の該薄膜表面にマスク材からなる層が形成されたものを、10-カルボキシ-1-デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、10-カルボキシ-1-デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。
【００６７】
また、ＳＡＭを形成する前に「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよく、この場合、ＳＡＭが含む単分子としては、加水分解でシラノール基（Ｓｉ-ＯＨ）を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。
【００６８】
このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
このような「誘電体からなるスペーサ層」の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2），二酸化チタン（ＴｉＯ2）または酸化アルミニウム（Ａｌ2Ｏ3）を含むことが好ましい。
【００６９】
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常10ｎｍ〜1ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは30ｎｍ以下、より好ましくは10〜20ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは200ｎｍ〜1ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、400ｎｍ〜1,600ｎｍがより好ましい。
【００７０】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法，またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
【００７１】
固相化層は、上記ＳＡＭの、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成され、３次元構造を有するものである。
この「３次元構造」とは、後述するリガンドの固定化を、「センサ基板」表面（及びその近傍）の２次元に限定することなく、該基板表面から遊離した３次元空間にまで広げられる固相化層の構造をいう。
【００７２】
このような固相化層は、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。
【００７３】
ＣＭＤの分子量は、1ｋＤa以上5,000ｋＤa以下が好ましく、4ｋＤａ以上1,000ｋＤaがより好ましい。
固相化層（例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体からなるもの）は、その密度として2ｎｇ/ｍｍ2未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。上記高分子が上記ＳＡＭに、このような密度の範囲内で固相化されていると、プラズモンセンサをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。なお、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製「Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ5」の密度は2ｎｇ/ｍｍ2であった。この密度は、このＣＭ5基板および金膜のみの基板を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製のＳＰＲ測定機器により得られた測定シグナルにおいて、平均2000ＲＵを測定した結果、2ｎｇ/ｍｍ2と見積もられたものである。
【００７４】
固相化層の平均膜厚は、3ｎｍ以上80ｎｍ以下であることが好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などを用いて測定することができる。固相化層の平均膜厚がこのような範囲内であると、プラズモンセンサをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。
【００７５】
固相化層に含まれる高分子として、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）を用いた場合の、ＳＡＭ表面に固定化する方法を具体的に説明する。
すなわち、好ましくは分子量1ｋＤa以上5,000ｋＤa以下であり、上述したようなカルボキシメチルデキストランを0.01ｍｇ/ｍＬ以上100ｍｇ/ｍＬ以下と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を0.01ｍＭ以上300ｍＭ以下と、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を0.01ｍＭ以上500ｍＭ以下とを含むＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕に、透明支持体と金属薄膜とＳＡＭとがこの順序で積層された基板を0.2時間以上3.0時間以下浸漬し、ＳＡＭにカルボキシメチルデキストランを固定化することができる。
【００７６】
得られた固相化層の密度は、反応点数（ＳＡＭの官能基数），反応溶液のイオン強度およびｐＨ，ならびにカルボキシメチルデキストラン分子のカルボキシル基数に対するＷＳＣ濃度によって調整することができる。また固相化層の平均膜厚は、カルボキシメチルデキストランの分子量および反応時間によって調整することができる。
【００７７】
４．検体中の測定対象化合物の測定
検体中の測定対象化合物のシグナル測定は、通常のＳＰＦＳを用いた免疫測定法における手順に従って実施することができる。本発明の夾雑物由来の非特異的シグナルの抑制方法は、測定対象化合物を定性的に検出する場合、定量的に測定する場合、いずれにも実施することができる。
【００７８】
測定対象化合物を定量的に測定する場合は、例えば、市販の生体試料（血清等）に測定対象化合物の標準品を添加して本発明の前処理を行った後、シグナルを測定して検量線を作成する。次いで、測定する生体試料に同様の前処理を行った後、シグナルを測定し、そのシグナル強度を検量線にあてはめて、測定対象化合物の濃度を知ることができる。
【実施例】
【００７９】
以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行うが、本発明はこれにより限定されるものではない。
（定量測定装置の構成）
以下の実施例においては、測定装置として、ＳＰＦＳ測定装置を自作して使用した。当該ＳＰＦＳ測定装置は、上記３．（２）（ａ）「ＳＰＦＳ用測定装置」の定量測定装置１０と同様の構成である。以下の記載中の符号は、上記３．（２）（ａ）、図１及び図２の符号と同じである。
【００８０】
なお、上記構成のうち、光源２０として、波長６３５ｎｍの光を照射することができるレーザーダイオード（ＬＤ）を用いており、光源２０と誘電体部材１２との間には、光学フィルタとして減光フィルタ（中性濃度フィルタ）を設けてフォトン量を調整できるようにした。
【００８１】
また、誘電体部材１２としては、シグマ光機（株）製の６０度プリズムを用い、この誘電体部材１２の上部に、後述する、プラズモン励起センサを固定することによって、センサチップ１６を構成する。
また、センサチップ１６の上部には、集光レンズとして対物レンズを備え、光検出手段３２としては、光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いた。
【００８２】
（プラズモン励起センサの作製）
屈折率１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ  １０）をプラズマ洗浄し、この基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法によって形成した。その後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法によって形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。
【００８３】
このようにして金薄膜が形成された基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭ膜（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ：自己組織化単分子膜）を形成した。基板をこの溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
【００８４】
この基板にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）０．５ｍＭとカルボキシメチルデキストランＣＭＤ-５００−０６Ｉ４（名糖産業製：平均分子量５０万,置換度０．５１）１ｍｇ/ｍＬとを含む２５ｍＭのＭＥＳ緩衝生理食塩水および１０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）を０．８ｍＬ滴下し２０分間反応させＳＡＭ上にＣＭＤを固相化した。
【００８５】
高さ０．５ｍｍの流路となる溝を有し、溝の両端に貫通穴を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを、ＣＭＤ膜の表面が流路の内側となるように溝をＣＭＤ膜に対向させて基板上に配置し、流路の外側のＰＤＭＳ製シート上部から圧着して、ビスでＰＤＭＳ製シート（流路３６）とプラズモン励起センサとを固定した。
【００８６】
（抗体の固相化）
［調製例１］
〔抗ＰＳＡ抗体固相化基板〕
上記のとおりプラズモン励起センサを接続した外部流路に、超純水を１０分間、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２０分間、ペリスタポンプによって、室温（２５℃）、流速５００μＬ／分の条件で循環送液させ、プラズモン励起センサの表面を平衡化した。
【００８７】
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を５ｍＬ送液し、２０分間循環させた後、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｎｏ.７２、２．５ｍｇ／ｍＬ、ミクリ免疫研究所製）溶液２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ膜上に当該抗体を固相化し、抗ＰＳＡ抗体固相化ＳＡＭ膜を調製した。
その後、１重量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３０分間循環送液することによって、流路内の非特異吸着防止処理を行った。
【００８８】
（標識抗体および標識レクチンの作製）
［作製例１］
〔蛍光標識ＰＳＡ抗体〕
蛍光標識ＰＳＡ抗体を、蛍光物質ラベリングキット「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット」（インビトロジェン社製）を利用して作製した。ＰＳＡ抗体（２Ｅ２、ミクリ免疫研究所製）１００μｇ相当と、０．１Ｍ重炭酸ナトリウムと、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅとを混合し、室温で１時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅを取り除いて、蛍光標識ＰＳＡ抗体を得た。その後、吸光度を測定し蛍光標識ＰＳＡ抗体濃度を定量した。
【００８９】
［作製例２］
〔蛍光標識ＷＦＡレクチン〕
蛍光標識ＷＦＡレクチンを、蛍光物質ラベリングキット「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット」（インビトロジェン社製）を利用して作製した。ＷＦＡレクチン（Ｌ-１３５０、Ｖｅｃｔｏｒ社）１００μｇ相当と、０．１Ｍ重炭酸ナトリウムと、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅとを混合し、室温で１時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅを取り除いて、蛍光標識ＷＦＡレクチンを得た。その後、吸光度を測定し標識レクチン濃度を定量した。
【００９０】
＜血清検体中のＰＳＡの測定＞
検体としてＰＳＡフリープールヒト血清を用意した。また、陽性検体として、ＰＳＡフリープール血清に、ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌細胞培養株）培養上清をＰＳＡ濃度１ｎｇ/ｍＬとなるように添加した血清サンプルを調製し、実施例１〜２における測定サンプルとした。なお、前記ＰＳＡフリープールヒト血清としては、コージンバイオ社から正常ヒトプール血清を購入し、ＥＬＩＳＡにてＰＳＡ濃度が１ｐｇ/ｍＬ以下であることを確認した血清を用いた。
この実質的にＰＳＡを含まない、非特異的反応を示す試料溶液５０μＬに対して各種検体前処理を施すことで観察されていた非特異的反応が抑制できるか検討を行った。
【００９１】
［実施例１］検体処理方法（酸処理（処理方法１，２,３）、アルカリ処理（処理方法４，５）、重金属添加（処理方法６，７））
試料溶液５０μＬに表１に示した緩衝液または金属塩溶液５０μＬを添加し、チューブ内で良く撹拌した。撹拌後室温にて３０分間放置した。放置後、生理食塩水へバッファー交換を行いＳＰＦＳ測定用サンプルとした。
【００９２】
［実施例２］加熱処理（処理方法８）
試料溶液５０μＬに生理食塩水を５０μＬ添加し、１００℃５分間加熱処理を行った。その後室温に放置し、ＳＰＦＳ測定用サンプルとした。
【００９３】
［比較例１］無処理（処理方法９）
試料溶液５０μＬに生理食塩水を５０μＬ添加し、ＳＰＦＳ測定用サンプルとした。
【００９４】
［実施例３］陽性検体試料溶液の処理
上記実施例１、２および比較例１と同様の処理を陽性検体試料においても実施した。
【００９５】
【表１】
2019078767.tif 000002
【００９６】
＜抗体―抗体測定系＞
各測定サンプルを抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）と反応させ、その後、蛍光標識ＰＳＡ抗体（作製例１）と接触させた。詳しくは以下の通りである。
【００９７】
測定サンプルを流路に０．1ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて２０分間循環送液させた。続いて、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。反応後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を標識したＰＳＡ抗体溶液（１μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの）を０．１ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて５分間送液した。再びＴｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。その後、定量測定装置によって、ＳＰＦＳ測定を行った。
【００９８】
ＳＰＦＳの測定結果を表２に示す。表中のシグナル値は実測値であり、ＰＳＡ添加血清のシグナル値はＰＳＡ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。
【００９９】
【表２】
2019078767.tif 000003
（注１）（前処理を行った検体についてのＳ／Ｂ）／（前処理を行わない検体についてのＳ／Ｂ）
タンパク質を変性させる効果がある前処理を行うことで、生理食塩水にて希釈するのみの処理方法に比べて血清バックグラウンドが低下し、S/Bが大幅に向上することが確認できた。
【０１００】
＜抗体―レクチン測定系＞
各測定サンプルを抗ＰＳＡ抗体を固相化した基板（調製例１）と反応させ、その後、蛍光標識ＷＦＡレクチン（作製例２）と接触させた。詳しくは以下の通りである。
【０１０１】
測定サンプルを流路に０．1ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて２０分間循環送液させた。続いて、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。反応後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を標識したＷＦＡレクチン溶液（１μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの）を０．１ｍＬ添加し、流速２００μＬ／分にて５分間送液した。再びＴｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、５分間洗浄した。その後、定量測定装置によって、ＳＰＦＳ測定を行った。
【０１０２】
ＳＰＦＳの測定結果を表３に示す。表中のシグナル値は実測値であり、ＰＳＡ添加血清のシグナル値はＰＳＡ由来のシグナル値＋バックグラウンドのシグナル値として示されている。
【０１０３】
【表３】
2019078767.tif 000004
（注２）（前処理を行った検体についてのＳ／Ｂ）／（前処理を行わない検体についてのＳ／Ｂ）
タンパク質を変性させる効果がある前処理を行うことで、生理食塩水にて希釈するのみの処理方法に比べて血清バックグラウンドが低下し、S/Bが大幅に向上することが確認できた。また、酸、アルカリによる処理よりも重金属添加による処理ではシグナルにあまり影響することなく、バックグラウンドのみ低減させることに成功した。
【符号の説明】
【０１０４】
１０      定量測定装置
１２      誘電体部材
１２ａ    上面
１２ｂ    側面
１２ｃ    側面
１４      金属薄膜
１４ａ    上面
１６      センサチップ
１８      センサチップ装填部
２０      光源
２２      入射光
２４      金属薄膜反射光
２６      受光手段
２８      ＳＰＲ測定部
３０      蛍光
３２      光検出手段
３４      ＳＰＦＳ測定部
３６      微細流路
３８      センサ部
４０      定量演算手段
【図１】
2019078767.tif 000005
【図２】
2019078767.tif 000006