(57)【要約】【課題】  腫瘍抗原の発現と関係する疾患の処置を目的とする組成物および方法を提供すること。【解決手段】  腫瘍抗原に特異的なキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)、それをコードするベクターおよび本発明のＣＡＲを含む組み換えＴ細胞を含む組成物、または腫瘍抗原と結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する遺伝子修飾されたＴ細胞を投与する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍抗原の発現と関係する疾患を有する対象の処置において免疫エフェクター細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて使用するための、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子を含む免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団)を含む組成物であって、ここで、
(ｉ)ＣＡＲ分子が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインが疾患と関係する腫瘍抗原と結合し、該腫瘍抗原が甲状腺刺激ホルモン受容体(ＴＳＨＲ)；ＣＤ１７１；ＣＳ−１(ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９および１９Ａ２４)；Ｃ型レクチン様分子−１(ＣＬＬ−１)；ガングリオシドＧＤ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−８)ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)；Ｔｎ抗原(Ｔｎ  Ａｇ)；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ＦＬＴ３)；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；Ｂ７Ｈ３(ＣＤ２７６)；ＫＩＴ(ＣＤ１１７)；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２(ＩＬ−１３Ｒａ２)；インターロイキン１１受容体アルファ(ＩＬ−１１Ｒａ)；前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)；プロテアーゼセリン２１(ＰＲＳＳ２１)；血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)；ルイス(Ｙ)抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲ−ベータ)；ステージ特異的胚性抗原−４(ＳＳＥＡ−４)；ムチン１、細胞表面関連(ＭＵＣ１)；上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)；神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)；炭酸脱水酵素IX(ＣＡIX)；プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニット、ベータ型、９(ＬＭＰ２)；エフリンＡ型受容体２(ＥｐｈＡ２)；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子(ｓＬｅ)；ガングリオシドＧＭ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ；ＴＧＳ５；高分子量黒色腫関連抗原(ＨＭＷＭＡＡ)；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド(ＯＡｃＧＤ２)；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１(ＴＥＭ１／ＣＤ２４８)；腫瘍内皮マーカー７関連(ＴＥＭ７Ｒ)；クローディン６(ＣＬＤＮ６)；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ(ＧＰＲＣ５Ｄ)；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１(ＣＸＯＲＦ６１)；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)；ポリシアル酸；胎盤特異的１(ＰＬＡＣ１)；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド(ＧｌｏｂｏＨ)の六糖部分；乳腺分化抗原(ＮＹ−ＢＲ−１)；ウロプラキン２(ＵＰＫ２)；Ａ型肝炎ウイルス細胞性受容体１(ＨＡＶＣＲ１)；アドレナリン受容体ベータ３(ＡＤＲＢ３)；パンネキシン３(ＰＡＮＸ３)；Ｇタンパク質共役受容体２０(ＧＰＲ２０)；リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ９(ＬＹ６Ｋ)；嗅覚受容体５１Ｅ２(ＯＲ５１Ｅ２)；ＴＣＲガンマ選択的リーディングフレームタンパク質(ＴＡＲＰ)；ウィルムス腫瘍タンパク質(ＷＴ１)；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異体遺伝子６(ＥＴＶ６−ＡＭＬ)；精子タンパク質１７(ＳＰＡ１７)；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ(ＸＡＧＥ１)；アンギオポエチン結合細胞表面受容体２(Ｔｉｅ  ２)；黒色腫癌精巣抗原−１(ＭＡＤ−ＣＴ−１)；黒色腫癌精巣抗原−２(ＭＡＤ−ＣＴ−２)；Ｆｏｓ関連抗原１；ｐ５３変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(ｈＴＥＲＴ)；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害剤(ＭＬ−ＩＡＰ)；ＥＲＧ(膜貫通型プロテアーゼ、セリン２(ＴＭＰＲＳＳ２)ＥＴＳ融合遺伝子)；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ(ＮＡ１７)；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３(ＰＡＸ３)；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄細胞腫ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ(ＭＹＣＮ)；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ(ＲｈｏＣ)；チトクロムＰ４５０  １Ｂ１(ＣＹＰ１Ｂ１)；ＣＣＣＴＣ結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(ＢＯＲＩＳ)；Ｔ細胞３により認識される扁平上皮細胞癌抗原(ＳＡＲＴ３)；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５(ＰＡＸ５)；プロアクロシン結合タンパク質ｐ３２(ＯＹ−ＴＥＳ１)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(ＬＣＫ)；Ａキナーゼアンカータンパク質４(ＡＫＡＰ−４)；滑膜肉腫、Ｘ切断点２(ＳＳＸ２)；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１(ＬＡＩＲ１)；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント(ＦＣＡＲ)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２(ＬＩＬＲＡ２)；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ(ＣＤ３００ＬＦ)；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ(ＣＬＥＣ１２Ａ)；骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２(ＥＭＲ２)；リンパ球抗原７５(ＬＹ７５)；グリピカン−３(ＧＰＣ３)；Ｆｃ受容体様５(ＦＣＲＬ５)；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１(ＩＧＬＬ１)からなる群から選択され；そして
(ii)免疫細胞の有効性を高める薬剤が
(ｉ)タンパク質ホスファターゼ阻害剤；
(ii)キナーゼ阻害剤；
(iii)サイトカイン；
(iv)免疫阻害分子の阻害剤；または
(ｖ)ＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤
の１以上から選択される、組成物。
【請求項２】
腫瘍抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法であって、対象に免疫細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子を含む免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団の有効量を投与することを含み、ここで、
(ｉ)ＣＡＲ分子が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインが疾患と関係する腫瘍抗原と結合し、該腫瘍抗原はＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１からなる群から選択され；そして
(ii)免疫細胞の有効性を高める薬剤が
(ｉ)タンパク質ホスファターゼ阻害剤；
(ii)キナーゼ阻害剤；
(iii)サイトカイン；
(iv)免疫阻害分子の阻害剤；または
(ｖ)ＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤
の１以上から選択され、それにより対象を処置する、方法。
【請求項３】
腫瘍抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法であって、対象に、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子を含む免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団の有効量を投与することを含み、ここで、
(ｉ)ＣＡＲ分子が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインが疾患と関係する腫瘍抗原と結合し、該腫瘍抗原はＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、インターロイキン−１１受容体ａ(ＩＬ−１１Ｒａ)、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来増殖因子受容体−ベータ(ＰＤＧＦＲ−ベータ)、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１からなる群から選択され；そして
(ii)ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインが、抗原結合ドメインが由来する抗体より少なくとも５倍低い結合親和性を有する、
方法。
【請求項４】
腫瘍抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法であって、対象に、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子を含む免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団の有効量を投与することを含み、ここで、ＣＡＲ分子が抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、該細胞内ドメインは共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインは疾患と関係する腫瘍抗原と結合し、該腫瘍抗原がＴＳＨＲ、ＴＳＨＲ、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＧＤ３、Ｔｎ  Ａｇ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１から選択され、
それにより対象を処置する、方法。
【請求項５】
腫瘍抗原の発現と関係する疾患が腫瘍抗原の発現と関係する増殖性疾患、前癌状態、癌および非癌関連徴候からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項６】
癌が慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、急性白血病、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病(Ｂ−ＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞性腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症または前白血病状態からなる群の１以上から選択される血液癌である、請求項５に記載の使用または方法。
【請求項７】
癌が結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、肺非小細胞癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨の癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣の癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄の軸の腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発癌、該癌の組み合わせおよび該癌の転移病巣からなる群から選択される、請求項５に記載の使用または方法。
【請求項８】
(ｉ)タンパク質ホスファターゼ阻害剤がＳＨＰ−１阻害剤および／またはＳＨＰ−２阻害剤であり；
(ii)キナーゼ阻害剤がＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、パルボシクリブ)、ｍＴＯＲ阻害剤(例えば、ラパマイシンまたはエベロリムス)、ＭＮＫ阻害剤またはデュアルＰ１３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤の１以上から選択され；
(iii)免疫阻害分子を阻害する薬剤が阻害分子の発現を阻害する抗体または抗体フラグメント、阻害性核酸、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を含み；および／または
(iv)ＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤がシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせから選択される、
請求項１〜２または５〜７のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項９】
免疫阻害分子がＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３およびＣＥＡＣＡＭ−５からなる群から選択される、請求項１〜２または５〜８のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項１０】
阻害分子を阻害する薬剤が阻害分子またはそのフラグメントを含む第一ポリペプチドおよび細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチドを含み、ここで、該第一および第二ポリペプチドがＣＡＲ含有免疫細胞上に発現され、ここで、(ｉ)第一ポリペプチドがＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３およびＣＥＡＣＡＭ−５またはそのフラグメントを含む；および／または(ii)第二ポリペプチドが一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜２または５〜８のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項１１】
一次シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータの機能的ドメインを含む；および／または共刺激シグナル伝達ドメインが４１ＢＢ、ＣＤ２７およびＣＤ２８から選択されるタンパク質の機能的ドメインを含む、請求項１０に記載の使用または方法。
【請求項１２】
サイトカインがＩＬ−１５またはＩＬ−２１または両者から選択される、請求項１〜２または５〜１１のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項１３】
ＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター細胞の有効性を高める薬剤を実質的に同時にまたは逐次的に投与する、請求項１〜２または５〜１２のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項１４】
ＣＡＲ分子を含む免疫細胞をＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて投与する、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項１５】
ＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子を、ＣＡＲ発現細胞もしくは細胞の集団の前にまたはアフェレシスの前に投与する、請求項１４に記載の使用または方法。
【請求項１６】
対象がヒトである、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項１７】
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子であって、ここで、ＣＡＲが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインがＴＳＨＲ、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＧＤ３、Ｔｎ  Ａｇ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１からなる群から選択される腫瘍抗原と結合する、単離核酸分子。
【請求項１８】
(ｉ)抗原結合ドメインが抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２、単一ドメイン抗体(ＳＤＡＢ)、ＶＨまたはＶＬドメインまたはラクダ類ＶＨＨドメインを含む；および／または
(ii)膜貫通ドメインがＴ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｃからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１７に記載の単離核酸分子。
【請求項１９】
コードされる膜貫通ドメインが
(ｉ)配列番号１２のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列；または
(ii)配列番号１２のアミノ酸配列を含む、
請求項１７または１８に記載の単離核酸分子。
【請求項２０】
膜貫通ドメインをコードする核酸配列が配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２１】
抗原結合ドメインがヒンジ領域により膜貫通ドメインに接続され、ここで、該ヒンジ領域核酸は、配列番号２または配列番号６を含むアミノ酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列をコードするか；または該ヒンジ領域は配列番号３または配列番号７のヌクレオチド配列またはヌクレオチドそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１７〜２０のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２２】
細胞内シグナル伝達ドメインが一次シグナル伝達ドメインをコードする配列および／または共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む、請求項１７〜２１に記載の単離核酸分子。
【請求項２３】
細胞内シグナル伝達ドメインが一次シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む、請求項１７〜２２のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２４】
コード化一次シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲIIａ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項２２または２３に記載の単離核酸分子。
【請求項２５】
コード化一次シグナル伝達ドメインが
(ｉ)配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列；または
(ii)配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を含む、
請求項２２〜２４のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２６】
細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列または一次シグナル伝達ドメインをコードする配列および共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む、請求項１７〜２５のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２７】
コード化共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項２６に記載の単離核酸分子。
【請求項２８】
コード化共刺激シグナル伝達ドメインが
(ｉ)配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列；または
(ii)配列番号１４または配列番号１６の配列を含む、
請求項１７〜２７のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２９】
共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列が配列番号１５または配列番号１７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１７〜２７のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項３０】
コード化細胞内ドメインが配列番号１４または配列番号１６の配列および配列番号１８または配列番号２０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が同じフレーム内に、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される、請求項１７〜２９のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項３１】
細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列が配列番号１５または配列番号１７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号１９または配列番号２１の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１７〜２９のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項３２】
配列番号２を含むリーダー配列をさらに含む、請求項１７〜３１のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項３３】
抗原結合ドメインが抗原結合ドメインが由来する抗体より少なくとも５倍低い結合親和性を有する、請求項１７〜３２のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項３４】
請求項１７〜３３のいずれかに記載のＣＡＲ分子をコードする核酸分子を含むベクターであって、ここで、ベクターがＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターから選択される、ベクター。
【請求項３５】
ＥＦ−１プロモーター、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーターまたはホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターから選択されるプロモーターをさらに含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
ＥＦ−１プロモーターが配列番号１の配列を含む、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
ベクターがインビトロ転写ベクターであるかまたはベクターがポリ(Ａ)テイルまたは３’ＵＴＲをさらに含む、請求項３４〜３６のいずれかに記載のベクター。
【請求項３８】
請求項１７〜３３のいずれかに記載の核酸分子によりコードされる、ポリペプチド分子。
【請求項３９】
抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)ポリペプチド分子であって、ここで、該抗原結合ドメインがＴＳＨＲ、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＧＤ３、Ｔｎ  Ａｇ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１からなる群から選択される腫瘍抗原と結合する、単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項４０】
(ｉ)抗原結合ドメインが抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２、単一ドメイン抗体(ＳＤＡＢ)、ＶＨまたはＶＬドメインまたはラクダ類ＶＨＨドメインを含む；および／または
(ii)膜貫通ドメインがＴ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｃからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、
請求項３９に記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項４１】
膜貫通ドメインが
(ｉ)配列番号１２のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列；または
(ii)配列番号１２の配列を含む、
請求項３９または４０に記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項４２】
抗原結合ドメインがヒンジ領域により膜貫通ドメインに接続され、ここで、該ヒンジ領域が配列番号２または配列番号６またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項３９〜４１のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項４３】
細胞内シグナル伝達ドメインが一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含み、ここで、一次シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲIIａ、ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１２から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項３９〜４２のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項４４】
一次シグナル伝達ドメインが
(ｉ)配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列；または
(ii)配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を含む、
請求項４３に記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項４５】
細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激シグナル伝達ドメインまたは一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含み、ここで、共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫＧ２Ｄからなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項３９〜４４のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項４６】
共刺激シグナル伝達ドメインが配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項４３〜４５のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項４７】
共刺激シグナル伝達ドメインが配列番号１４または配列番号１６の配列を含む、請求項４３〜４６のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項４８】
細胞内ドメインが配列番号１４または配列番号１６の配列および配列番号１８または配列番号２０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が同じフレーム内に、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される、請求項４３〜４７のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項４９】
配列番号２の配列を含むリーダー配列をさらに含む、請求項３０〜４８のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項５０】
抗原結合ドメインが抗原結合ドメインが由来する抗体より少なくとも５倍低い結合親和性を有する、請求項３９〜４９のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子。
【請求項５１】
(ｉ)請求項１７〜３３のいずれかに記載の核酸分子；
(ii)請求項３８〜５０のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチド分子；または
(iii)請求項３４〜３７のいずれかに記載のベクター
を含む、免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞の集団)。
【請求項５２】
第一ＣＡＲ分子をコードする請求項１７〜３３のいずれかに記載の第一核酸分子、請求項３８〜５０のいずれかに記載の第一ＣＡＲポリペプチド分子または請求項３４〜３７のいずれかに記載のベクターを含み、さらに第二ＣＡＲ分子をコードする第二核酸分子、第二ＣＡＲポリペプチド分子または第二ＣＡＲ分子をコードする核酸分子を含む第二ベクターを含む、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
第二ＣＡＲ分子が第一ＣＡＲ分子と同じ抗原を標的とし、ここで、第二ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインが第一ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインと異なる、請求項５１または５２に記載の細胞。
【請求項５４】
第二ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインが第一ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインと異なる抗原を標的とする、請求項５１〜５３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５５】
第一ＣＡＲ分子が共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、一次シグナル伝達ドメインを含まず、第二ＣＡＲ分子が一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない、請求項５１〜５４のいずれかに記載の細胞。
【請求項５６】
第一ＣＡＲ分子が４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＯＸ−４０からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達を含む共刺激シグナル伝達ドメインを含み、第二ＣＡＲ分子がＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項５５に記載の細胞。
【請求項５７】
第二ＣＡＲが阻害性ＣＡＲであり、ここで、阻害性ＣＡＲが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害分子の細胞内ドメインを含み、ここで、阻害分子がＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３およびＣＥＡＣＡＭ−５からなる群から選択される、請求項５６に記載の細胞。
【請求項５８】
第二ＣＡＲ分子が一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータの機能的ドメインを含む一次シグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢの機能的ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項５７に記載の細胞。
【請求項５９】
第二ＣＡＲ分子が配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の細胞。
【請求項６０】
免疫エフェクター細胞がヒトＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞)またはヒトＮＫ細胞であり、所望により、ここで、Ｔ細胞がジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)および／またはイカロス欠損である、請求項５１〜５９のいずれかに記載の細胞。
【請求項６１】
ＣＡＲ分子が
(ｉ)請求項１７〜３３のいずれかに記載の核酸分子によりコードされる；
(ii)請求項３８〜５０のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチド分子；または
(iii)請求項３４〜３７のいずれかに記載のベクターによりコードされる、
請求項１〜１６のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項６２】
使用するまたは投与される免疫エフェクター細胞が請求項５１〜６０のいずれかに記載のものである、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項６３】
ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団)を製造する方法であって、請求項３４〜３７のいずれかに記載のベクターまたは請求項１７〜３３のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸分子を、ＣＡＲ分子が発現される条件下に、免疫エフェクター細胞に導入することを含む、方法。
【請求項６４】
ａ)免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し；そして
ｂ)集団からＴ制御性細胞を除去し、それによりＴ制御性枯渇細胞の集団を提供することを含み；
ここで、工程ａ)およびｂ)を、ＣＡＲをコードする核酸を集団に導入する前に行う、
請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
Ｔ制御性細胞を、抗ＣＤ２５抗体または抗ＧＩＴＲ抗体を使用して細胞集団から除去する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＲＮＡ操作細胞(例えば、ＲＮＡ操作免疫エフェクター細胞)の集団を産生する方法であって、インビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞または細胞の集団に導入することを含み、ここで、ＲＮＡが請求項１７〜３３のいずれかに記載のＣＡＲをコードする核酸分子を含む、方法。
【請求項６７】
対象に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、対象に請求項６１〜８０のいずれかに記載の免疫エフェクター細胞の有効量を投与することを含み、ここで、該細胞が自己Ｔ細胞または同種Ｔ細胞または自己Ｔ細胞または同種ＮＫ細胞である、方法。
【請求項６８】
同種Ｔ細胞または同種ＮＫ細胞が機能的ＴＣＲまたは機能的ＨＬＡの発現を欠くかまたは発現が低い、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
医薬として使用するための、請求項１７〜３３のいずれかに記載の単離核酸分子、請求項３８〜５０のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子、請求項５１〜６０のいずれかに記載の免疫エフェクター細胞または請求項３４〜３７のいずれかに記載のベクター。
【請求項７０】
腫瘍抗原を発現する疾患の処置に使用するための、請求項１７〜３３のいずれかに記載の単離核酸分子、請求項３８〜５０のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子、請求項５１〜６０のいずれかに記載の免疫エフェクター細胞または請求項３４〜３７のいずれかに記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国出願６１／９５３,７８３号(２０１４年３月１５日出願)、米国出願６１／９７６,３７５号(２０１４年４月７日出願)、米国出願６２／０２７,１５４(２０１４年７月２１日出願)、米国出願６２／０７６,１４６号(２０１４年１１月６日出願)および米国出願６２／０９７,２８６(２０１４年１２月２９日出願)に基づく優先権を主張する。これらの出願の内容の全体を引用により本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して腫瘍抗原の発現と関係する疾患を処置するための、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
自己Ｔ細胞、特にキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を形質導入したＴ細胞を用いる養子細胞移入(ＡＣＴ)治療は、血液癌の治験で見込みが示されている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要約
本発明は、少なくとも一部、ここに記載する腫瘍抗原に結合するＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の、該腫瘍抗原の発現と関係する癌の処置における使用に関する。
【０００５】
ＣＡＲコード化核酸
したがって、ある面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子に関し、ここで、ＣＡＲは、ここに記載する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン)(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激ドメイン)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、腫瘍抗原は、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１(別名ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９および１９Ａ２４)；Ｃ型レクチン様分子−１(ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１)；ＣＤ３３；上皮細胞増殖因子受容体変異体III(ＥＧＦＲｖIII)；ガングリオシドＧ２(ＧＤ２)；ガングリオシドＧＤ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−８)ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟抗原(ＢＣＭＡ)；Ｔｎ抗原((Ｔｎ  Ａｇ)または(ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ))；前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１(ＲＯＲ１)；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ＦＬＴ３)；腫瘍関連糖タンパク質７２(ＴＡＧ７２)；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原(ＣＥＡ)；上皮性細胞接着分子(ＥＰＣＡＭ)；Ｂ７Ｈ３(ＣＤ２７６)；ＫＩＴ(ＣＤ１１７)；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２(ＩＬ−１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２)；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ(ＩＬ−１１Ｒａ)；前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)；プロテアーゼセリン２１(精巣ｉｎまたはＰＲＳＳ２１)；血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)；ルイス(Ｙ)抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲ−ベータ)；ステージ特異的胚性抗原−４(ＳＳＥＡ−４)；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン−タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)；ムチン１、細胞表面関連(ＭＵＣ１)；上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)；神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)；プロスターゼ；前立腺酸ホスファターゼ(ＰＡＰ)；伸長因子２変異型(ＥＬＦ２Ｍ)；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(ＦＡＰ)；インシュリン様増殖因子１受容体(ＩＧＦ−Ｉ受容体)、炭酸脱水酵素IX(ＣＡIX)；プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニット、ベータ型、９(ＬＭＰ２)；糖タンパク質１００(ｇｐ１００)；易切断領域(ＢＣＲ)およびエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１(Ａｂｌ)からなる癌遺伝子融合タンパク質(ｂｃｒ−ａｂｌ)；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２(ＥｐｈＡ２)；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子(ｓＬｅ)；ガングリオシドＧＭ３(ａＮｅｕ５Ａｃ(２−３)ｂＤＧａｌｐ(１−４)ｂＤＧｌｃｐ(１−１)Ｃｅｒ)；トランスグルタミナーゼ５(ＴＧＳ５)；高分子量黒色腫関連抗原(ＨＭＷＭＡＡ)；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド(ＯＡｃＧＤ２)；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１(ＴＥＭ１／Ｃ���２４８)；腫瘍内皮マーカー７関連(ＴＥＭ７Ｒ)；クローディン６(ＣＬＤＮ６)；甲状腺刺激ホルモン受容体(ＴＳＨＲ)；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ(ＧＰＲＣ５Ｄ)；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１(ＣＸＯＲＦ６１)；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)；ポリシアル酸；胎盤特異的１(ＰＬＡＣ１)；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド(ＧｌｏｂｏＨ)の六糖部分；乳腺分化抗原(ＮＹ−ＢＲ−１)；ウロプラキン２(ＵＰＫ２)；Ａ型肝炎ウイルス細胞性受容体１(ＨＡＶＣＲ１)；アドレナリン受容体ベータ３(ＡＤＲＢ３)；パンネキシン３(ＰＡＮＸ３)；Ｇタンパク質共役受容体２０(ＧＰＲ２０)；リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ９(ＬＹ６Ｋ)；嗅覚受容体５１Ｅ２(ＯＲ５１Ｅ２)；ＴＣＲガンマ選択的リーディングフレームタンパク質(ＴＡＲＰ)；ウィルムス腫瘍タンパク質(ＷＴ１)；癌／精巣抗原１(ＮＹ−ＥＳＯ−１)；癌／精巣抗原２(ＬＡＧＥ−１ａ)；黒色腫関連抗原１(ＭＡＧＥ−Ａ１)；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異体遺伝子６(ＥＴＶ６−ＡＭＬ)；精子タンパク質１７(ＳＰＡ１７)；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ(ＸＡＧＥ１)；アンギオポエチン結合細胞表面受容体２(Ｔｉｅ  ２)；黒色腫癌精巣抗原−１(ＭＡＤ−ＣＴ−１)；黒色腫癌精巣抗原−２(ＭＡＤ−ＣＴ−２)；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３(ｐ５３)；ｐ５３変異体；プロテイン；サバイビン(surviving)；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１(ＰＣＴＡ−１またはガレクチン８)、Ｔ細胞１により認識される黒色腫抗原(メランＡまたはＭＡＲＴ１)；ラット肉腫(Ｒａｓ)変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(ｈＴＥＲＴ)；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害剤(ＭＬ−ＩＡＰ)；ＥＲＧ(膜貫通型プロテアーゼ、セリン２(ＴＭＰＲＳＳ２)ＥＴＳ融合遺伝子)；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ(ＮＡ１７)；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３(ＰＡＸ３)；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄細胞腫ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ(ＭＹＣＮ)；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ(ＲｈｏＣ)；チロシナーゼ関連タンパク質２(ＴＲＰ−２)；チトクロムＰ４５０  １Ｂ１(ＣＹＰ１Ｂ１)；ＣＣＣＴＣ結合因子(亜鉛フィンガータンパク質)様(ＢＯＲＩＳまたはBrother of the Regulator of Imprinted Sites)、Ｔ細胞３により認識される扁平上皮細胞癌抗原(ＳＡＲＴ３)；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５(ＰＡＸ５)；プロアクロシン結合タンパク質ｐ３２(ＯＹ−ＴＥＳ１)；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(ＬＣＫ)；Ａキナーゼアンカータンパク質４(ＡＫＡＰ−４)；滑膜肉腫、Ｘ切断点２(ＳＳＸ２)；終末糖化産物受容体(ＲＡＧＥ−１)；腎臓ユビキタス１(ＲＵ１)；腎臓ユビキタス２(ＲＵ２)；レグマイン；ヒト乳頭腫ウイルスＥ６(ＨＰＶ  Ｅ６)；ヒト乳頭腫ウイルスＥ７(ＨＰＶ  Ｅ７)；腸管カルボキシルエステラーゼ；ヒートショックタンパク質７０−２変異型(ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２)；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１(ＬＡＩＲ１)；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント(ＦＣＡＲまたはＣＤ８９)；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２(ＬＩＬＲＡ２)；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバー(ＣＤ３００ＬＦ)；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ(ＣＬＥＣ１２Ａ)；骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２(ＥＭＲ２)；リンパ球抗原７５(ＬＹ７５)；グリピカン−３(ＧＰＣ３)；Ｆｃ受容体様５(ＦＣＲＬ５)；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１(ＩＧＬＬ１)から選択される１以上である。
【０００６】
ある態様において、コード化ＣＡＲ分子により結合される腫瘍抗原は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＧＤ３、Ｔｎ  Ａｇ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１から選択される１以上である。
【０００７】
ある態様において、コード化ＣＡＲ分子により結合される腫瘍抗原は、ＴＳＨＲ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６ＫおよびＯＲ５１Ｅ２から選択される１以上である。
【０００８】
ある態様において、コード化ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２、単一ドメイン抗体(ＳＤＡＢ)、ＶＨまたはＶＬドメインまたはラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【０００９】
ある態様において、コード化ＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む。
【００１０】
ある態様において、コード化膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列または配列番号１２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コード化膜貫通ドメインは配列番号１２の配列を含む。
【００１１】
他の態様において、核酸分子は、例えば、配列番号１３の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、ＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
ある態様において、コード化抗原結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通ドメインに接続される。ある態様において、コード化ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジのアミノ酸配列、例えば、配列番号２；またはＩｇＧ４ヒンジのアミノ酸配列、例えば、配列番号６または配列番号２または６と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。他の態様において、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、それぞれＣＤ８ヒンジまたはＩｇＧ４ヒンジに対応する配列番号３または配列番号７の配列または配列番号３または７と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００１３】
他の態様において、核酸分子は、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列および／または共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインをコードする。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列および共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。
【００１４】
ある態様において、コード化一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【００１５】
ある態様において、コード化一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。コード化ＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメインは、配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含み得る。ある態様において、コード化一次シグナル伝達ドメインは、配列番号１８または配列番号２０の配列を含む。他の態様において、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１９または配列番号２１の配列の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００１６】
ある態様において、コード化細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列および共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含み得る。ある態様において、コード化共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６またはＮＫＧ２Ｄから選択される１以上のタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【００１７】
ある態様において、コード化共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コード化共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４または配列番号１６の配列を含む。他の態様において、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１５または配列番号１７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００１８】
他の態様において、コード化細胞内ドメインは配列番号１４または配列番号１６の配列および配列番号１８または配列番号２０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレーム内に、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
【００１９】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１５または配列番号１７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号１９または配列番号２１の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００２０】
ある態様において、核酸分子は、さらにリーダー配列を含む。ある態様において、リーダー配列は、配列番号２の配列を含む。
【００２１】
ある態様において、コード化抗原結合ドメインは、１０−４Ｍ〜１０−８Ｍの結合親和性ＫＤを有する。
【００２２】
ある態様において、コード化抗原結合ドメインは、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、上に提供する標的に対するここに記載する抗原結合ドメインである。
【００２３】
ある態様において、コード化ＣＡＲ分子は、標的抗原に対して１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、例えば、１０−６Ｍまたは１０−７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗原結合ドメインである。ある態様において、抗原結合ドメインは、対照抗体、例えば、ここに記載する抗体より少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍または１,０００倍低い結合親和性を有する。ある態様において、コード化抗原結合ドメインは、対照抗体(例えば、抗原結合ドメインが由来する抗体)より少なくとも５倍低い結合親和性を有する。
【００２４】
ある面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子に関し、ここで、ＣＡＲは、腫瘍支持抗原(例えば、ここに記載する腫瘍支持抗原)に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン)(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激ドメイン)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、腫瘍支持抗原は、間質細胞または骨髄球性由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)上に存在する抗原である。
【００２５】
ベクター
他の面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターに関する。ある態様において、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターから選択される。ある態様において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００２６】
ある態様において、ベクターは、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸配列およびｉｎｈＫＩＲ細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＫＩＲ膜貫通ドメイン；および阻害剤細胞質ドメイン、例えば、ＩＴＩＭドメイン、例えば、ｉｎｈＫＩＲ  ＩＴＩＭドメインを含む阻害分子をコードする核酸配列を含む。ある態様において、阻害分子は、天然に存在するｉｎｈＫＩＲまたは天然に存在するｉｎｈＫＩＲと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有するまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０残基を超えては異ならない配列である。
【００２７】
ある態様において、阻害分子をコードする核酸配列は、ＳＬＡＭファミリー細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリー膜貫通ドメイン；および阻害剤細胞質ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリードメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリーＩＴＩＭドメインを含む。ある態様において、阻害分子は、天然に存在するＳＬＡＭファミリーメンバーまたは天然に存在するＳＬＡＭファミリーメンバーと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有するまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０残基を超えては異ならない配列である。
【００２８】
ある態様において、ベクターは、さらにプロモーター。ある態様において、プロモーターは、ＥＦ−１プロモーター、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーターまたはホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターから選択される。ある態様において、プロモーターは、ＥＦ−１プロモーターである。ある態様において、ＥＦ−１プロモーターは、配列番号１の配列を含む。
【００２９】
ある態様において、ベクターは、インビトロ転写ベクター、例えば、ここに記載する核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。ある態様において、ベクター中の核酸配列は、さらに、ポリ(Ａ)テイル、例えば、約１５０アデノシン塩基(配列番号３３)を含む、例えば、ここに記載するポリＡテイルを含む。ある態様において、ベクター中の核酸配列は、さらに、３’ＵＴＲ、例えば、ヒトベータ−グロブリン由来の３’ＵＴＲの少なくとも１反復を含む、例えば、ここに記載する３’ＵＴＲを含む。ある態様において、ベクター中の核酸配列は、さらにプロモーター、例えば、Ｔ２プロモーターを含む。
【００３０】
ＣＡＲポリペプチド
他の面において、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離ＣＡＲポリペプチド分子に関し、ここで、該抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＦＡＰ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロテイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１から選択される１以上の腫瘍抗原に結合する。
【００３１】
ある態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＧＤ３、Ｔｎ  Ａｇ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１から選択される１以上の腫瘍抗原に結合する。
【００３２】
ある態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６ＫおよびＯＲ５１Ｅ２のから選択される１以上の腫瘍抗原に結合する。
【００３３】
ある態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２、単一ドメイン抗体(ＳＤＡＢ)、ＶＨまたはＶＬドメインまたはラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【００３４】
ある態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＮＫＧ２Ｃから選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。
【００３５】
他の態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン、例えば、配列番号１２の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の配列を含む。
【００３６】
他の態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通ドメインに接続される。ある態様において、コード化ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ、例えば、配列番号２のアミノ酸配列またはＩｇＧ４ヒンジ、例えば、配列番号６のアミノ酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００３７】
他の態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む。他の態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。他の態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。さらに別の態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【００３８】
他の態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメインは、配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含み得る。ある態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号１８または配列番号２０の配列を含む。
【００３９】
ある態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列および共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含み得る。ある態様において、コード化共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６またはＮＫＧ２Ｄから選択される１以上のタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【００４０】
ある態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３の修飾を有するが、修飾が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コード化共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１４または配列番号１６の配列を含む。他の態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の細胞内ドメインは配列番号１４または配列番号１６の配列および配列番号１８または配列番号２０の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレーム内に、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
【００４１】
ある態様において、ＣＡＲポリペプチド分子は、さらにリーダー配列を含む。ある態様において、リーダー配列は、配列番号２の配列を含む。
【００４２】
ある態様において、ＣＡＲポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、１０−４Ｍ〜１０−８Ｍの結合親和性ＫＤを有する。ある態様において、抗原結合ドメインはここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、上に提供する標的に対するここに記載する抗原結合ドメインである。ある態様において、ＣＡＲ分子は、標的抗原に対する１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、例えば、１０−６Ｍまたは１０−７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、対照抗体、例えば、ここに記載する抗体より少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍または１,０００倍低い結合親和性を有する。ある態様において、コード化抗原結合ドメインは、対照抗体(例えば、抗原結合ドメインが由来する抗体)より少なくとも５倍低い結合親和性を有する。
【００４３】
他の面において、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離ＣＡＲポリペプチド分子に関し、ここで、該抗原結合ドメインは腫瘍支持抗原(例えば、ここに記載する腫瘍支持抗原)に結合する。ある態様において、腫瘍支持抗原は、間質細胞または骨髄球性由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)上に存在する抗原である。
【００４４】
ＣＡＲ発現細胞
他の面において、本発明は、ここに記載する核酸分子、ＣＡＲポリペプチド分子またはベクターを含む、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞集団)に関する。
【００４５】
ある態様において、細胞はヒトＴ細胞である。ある態様において、細胞は、ここに記載する細胞、例えば、ヒトＴ細胞、例えば、ここに記載するヒトＴ細胞；またはヒトＮＫ細胞、例えば、ここに記載するヒトＮＫ細胞である。ある態様において、ヒトＴ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞である。ある態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ある態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、イカロス欠損である。ある態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、ＤＧＫおよびイカロスの両者が欠損している。
【００４６】
他の態様において、ここに記載するＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子の例は、例えば、ここに記載するように、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータのような阻害分子またはこれらのいずれかのフラグメントの第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するように、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８を含む)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ−１またはそのフラグメントの第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０または４−ＩＢＢシグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
【００４７】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、第二ＣＡＲ、例えば、例えば、同じ標的(例えば、上記標的)または異なる標的に対する異なる抗原結合ドメインを含む第二ＣＡＲをさらに含み得る。ある態様において、第二ＣＡＲは、第一ＣＡＲの標的と同じ癌細胞型上に発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、第一抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一抗原および第二の、異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
【００４８】
理論に拘束されるべきでないが、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＯＸ−４０の第一ＣＡＲへのおよび一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの第二ＣＡＲへの配置は、両標的が発現される場所である細胞へのＣＡＲ活性を限定できる。ある態様において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、例えば、上記標的を標的とする抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第一ＣＡＲにより標的とされる抗原と異なる抗原(例えば、第一標的と同じ癌細胞型に発現される抗原)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の態様において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、例えば、上記標的を標的とする抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第一ＣＡＲにより標的とされる抗原と異なる抗原(例えば、第一標的と同じ癌細胞型に発現される抗原)を標的とし、該抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
【００４９】
ある態様において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、ここに記載するＣＡＲ、例えば、上記標的に対するＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞に見られるが、癌細胞に見られない抗原、例えば、標的をまた発現する正常細胞に結合する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
【００５０】
ある態様において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ここに記載する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを含む第一ＣＡＲおよびＰＤ１細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む第二ＣＡＲを含む。
【００５１】
ある態様において、細胞は、さらに、ｉｎｈＫＩＲ細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＫＩＲ膜貫通ドメイン；および阻害剤細胞質ドメイン、例えば、ＩＴＩＭドメイン、例えば、ｉｎｈＫＩＲ  ＩＴＩＭドメインを含む阻害分子を含む。ある態様において、阻害分子は、天然に存在するｉｎｈＫＩＲまたは天然に存在するｉｎｈＫＩＲと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有するまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０残基を超えては異ならない配列である。
【００５２】
ある態様において、細胞は、さらに、ＳＬＡＭファミリー細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリー膜貫通ドメイン；および阻害剤細胞質ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリードメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリーＩＴＩＭドメインを含む阻害分子を含む。ある態様において、阻害分子は、天然に存在するＳＬＡＭファミリーメンバーまたは天然に存在するＳＬＡＭファミリーメンバーと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％相同性を有するまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０残基を超えては異ならない配列である。
【００５３】
ある態様において、細胞における第二ＣＡＲは阻害性ＣＡＲであり、ここで、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害分子の細胞内ドメインを含む。阻害分子は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３およびＣＥＡＣＡＭ−５の１以上から選択され得る。ある態様において、第二ＣＡＲ分子は、ＰＤ１の細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む。
【００５４】
ある態様において、細胞における第二ＣＡＲ分子は、さらに、一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００５５】
他の態様において、細胞における細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的ドメインを含む一次シグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢの機能的ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【００５６】
ある態様において、細胞における第二ＣＡＲ分子は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
ある態様において、第一ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、第二ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含まない。例えば、第一ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、第二ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインはラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【００５８】
処置法／組み合わせ治療
他の面において、本発明は、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子またはＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子をコードする核酸を含む細胞を投与することを含む、方法を提供する。ある態様において、対象はここに記載する障害を有し、例えば、対象は癌を有し、例えば、対象はここに記載する標的抗原を発現する癌を有する。ある態様において、対象はヒトである。
【００５９】
他の面において、本発明は、対象に、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を含む細胞の有効量を投与することを含む、ここに記載する癌関連抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法に関する。
【００６０】
さらに別の面において、本発明は、対象に、ＣＡＲ分子を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞集団)の有効量を投与することを含む、腫瘍抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法に関し、ここで、ＣＡＲ分子は抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、該細胞内ドメインは共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインは、疾患と関係する腫瘍抗原、例えばここに記載する腫瘍抗原と結合する。
【００６１】
関連する面において、本発明は、腫瘍抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法に関する。本方法は、対象にＣＡＲ分子を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞集団)の有効量を、免疫細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与することを含み、ここで、
(ｉ)ＣＡＲ分子は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインは疾患と関係する腫瘍抗原、例えばここに開示する腫瘍抗原と結合し；そして
(ii)免疫細胞の有効性を高める薬剤は、
(ｉ)タンパク質ホスファターゼ阻害剤；
(ii)キナーゼ阻害剤；
(iii)サイトカイン；
(iv)免疫阻害分子の阻害剤；または
(ｖ)ＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤
の１以上が選択される。
【００６２】
関連する面において、本発明は、対象に、ＣＡＲ分子を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞集団)の有効量を投与することを含む、腫瘍抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法に関し、ここで、
(ｉ)ＣＡＲ分子は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインは疾患と関係する腫瘍抗原、例えば、ここに開示する腫瘍抗原と結合し；そして
(ii)ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが由来する抗体より少なくとも５倍低い結合親和性を有する。
【００６３】
他の面において、本発明は、腫瘍抗原の発現と関係する疾患、例えば、ここに記載する障害を有する対象の処置に使用するための、ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載するＣＡＲ分子)を含む免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞集団)を含む組成物に関する。
【００６４】
上記方法または使用のずれかのある態様において、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原と関係する疾患は、癌または悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患から選択されるか、またはここに記載する腫瘍抗原の発現と関連する非癌関連徴候である。ある態様において、疾患は、ここに記載する癌、例えば、ここに記載する標的と関係するとしてここに記載する癌である。ある態様において、疾患は、血液癌である。ある態様において、血液癌は、白血病である。ある態様において、癌はＢ細胞性急性リンパ性白血病(“ＢＡＬＬ”)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(“ＴＡＬＬ”)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の急性白血病；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病；Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞性腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および骨髄球性血液細胞の産生不良(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである“前白血病状態”を含むが、これらに限定されないさらなる血液癌または血液学的状態からなる群から選択され、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患は、ここに記載する腫瘍抗原を発現する非典型的および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患；およびこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。他の態様において、ここに記載する腫瘍抗原と関係する疾患は、固形腫瘍である。
【００６５】
上記方法または使用のずれかのある態様において、疾患と関係する腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＦＡＰ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロテイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１の１以上が選択される。
【００６６】
上記方法または使用のいずれかの他の態様において、疾患と関係する腫瘍抗原は、ＴＳＨＲ、ＴＳＨＲ、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＧＤ３、Ｔｎ  Ａｇ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１から選択される１以上である。
【００６７】
上記方法または使用のいずれかの他の態様において、疾患と関係する腫瘍抗原は、ＴＳＨＲ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６ＫおよびＯＲ５１Ｅ２から選択される１以上である。
【００６８】
ある態様において、方法または使用を、免疫エフェクター細胞の有効性を高める薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて実施する。
【００６９】
上記方法または使用のいずれかにおいて、腫瘍抗原の発現と関係する疾患は、腫瘍抗原の発現と関係する増殖性疾患、前癌状態、癌および非癌関連徴候からなる群から選択される。
【００７０】
癌は、血液癌、例えば、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、急性白血病、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病(Ｂ−ＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞性腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症または前白血病状態から選択される１以上の癌であり得る。
【００７１】
癌は、結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、肺非小細胞癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣の癌、外陰の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発癌、該癌の組み合わせおよび該癌の転移病巣からも選択できる。
【００７２】
ここに記載する方法または使用のある態様において、ＣＡＲ分子を、免疫エフェクター細胞の有効性を高める薬剤、例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、サイトカイン、免疫阻害分子の阻害剤の１以上；またはＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤と組み合わせて投与する。
【００７３】
ここに記載する方法または使用のある態様において、タンパク質ホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤および／またはＳＨＰ−２阻害剤である。
【００７４】
ここに記載する方法または使用の他の態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、パルボシクリブ)、ＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブまたはＲＮ−４８６)、ｍＴＯＲ阻害剤(例えば、ラパマイシンまたはエベロリムス(ＲＡＤ００１))、ＭＮＫ阻害剤またはデュアルＰ１３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤の１以上が選択される。ある態様において、ＢＴＫ阻害剤は、インターロイキン−２誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低下させないまたは阻止しない。
【００７５】
ここに記載する方法または使用の他の態様において、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、阻害分子の発現を阻害する抗体または抗体フラグメント、阻害性核酸、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を含む。
【００７６】
ここに記載する方法または使用の他の態様において、ＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせから選択される。
【００７７】
ここに記載する方法または使用のある態様において、免疫阻害分子は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３およびＣＥＡＣＡＭ−５からなる群から選択される。
【００７８】
他の態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、阻害分子またはそのフラグメントを含む第一ポリペプチドおよび細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチドを含み、ここで、該第一および第二ポリペプチドはＣＡＲ含有免疫細胞上に発現され、ここで、(ｉ)第一ポリペプチドはＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３およびＣＥＡＣＡＭ−５またはそのフラグメントを含む；および／または(ii)第二ポリペプチドは一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的ドメインを含む；および／または共刺激シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ、ＣＤ２７およびＣＤ２８から選択されるタンパク質の機能的ドメインを含む。
【００７９】
他の態様において、サイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１または両者から選択される。
【００８０】
他の態様において、ＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞および第二の、例えば、ここに開示する組み合わせ治療のいずれか(例えば、免疫エフェクター細胞の有効性を高める薬剤)は、実質的に同時にまたは逐次的に投与される。
【００８１】
他の態様において、ＣＡＲ分子を含む免疫細胞を、ＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子を、ＣＡＲ発現細胞もしくは細胞集団の前にまたはアフェレシスの前に投与する。
【００８２】
ある態様において、リンパ球注入、例えば同種リンパ球注入を癌の処置に使用し、ここで、リンパ球注入は、本発明の少なくとも１つのＣＡＲ発現細胞を含む。ある態様において、自己リンパ球注入を癌の処置に使用し、ここで、自己リンパ球注入は、ここに記載する少なくとも１つのＣＡＲ発現細胞を含む。
【００８３】
ある態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ある態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、イカロス欠損である。ある態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、ＤＧＫおよびイカロスの両者が欠損している。
【００８４】
ある態様において、本方法は、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞とＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を組み合わせて投与することを含み、ここで、該薬剤は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１またはこれらの組み合わせである。サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞の投与と組み合わせて、例えば、同時にまたは直後に送達できる。あるいは、サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の投与後長期間の後、例えば、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の評価後送達され得る。ある態様において、サイトカインを、対象に、上記細胞または細胞集団投与と同時に(例えば、同じ日に投与)または投与後間もなく(例えば、投与後１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後に投与)投与する。他の態様において、サイトカインを、対象に、上記細胞または細胞集団投与から長期間(例えば、例えば、少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間またはそれ以上)の後または細胞に対する対象の応答の評価後に投与する。
【００８５】
他の態様において、ＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与と関係する副作用の１以上を軽減する薬剤と組み合わせて投与する。ＣＡＲ発現細胞の投与と関係する副作用は、サイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)または血球貪食性リンパ組織球症(ＨＬＨ)から選択され得る。
【００８６】
前記方法または使用のいずれかの態様において、ＣＡＲ分子を発現する細胞を、腫瘍抗原の発現と関係する疾患を処置する薬剤、例えば、ここに開示する第二または第三療法のいずれかと組み合わせて投与する。さらなる代表的組み合わせは、次の１以上を含む。
【００８７】
他の態様において、例えば、ここに記載する、ＣＡＲ分子を発現する細胞を、他の薬剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与できる。ある態様において、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、さらに、他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現できる。
【００８８】
例えば、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、阻害分子(例えば、免疫阻害剤分子)を阻害する薬剤であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。
【００８９】
ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである阻害性核酸である。ある態様において、阻害性核酸は、ＣＡＲ分子の要素をコードする核酸と連結される。例えば、阻害分子は、ＣＡＲ発現細胞上に発現され得る。
【００９０】
他の態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、ここに記載する分子、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む薬剤である。ある態様において、本薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータのような阻害分子またはこれらのいずれかのフラグメントの第一ポリペプチド(例えば、これらのいずれかの少なくとも細胞外ドメインの部分)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するように、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８を含む)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、本薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメントの第一ポリペプチド(例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの部分)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
【００９１】
ある態様において、本発明のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、以前に幹細胞移植、例えば、自己幹細胞移植を受けている対象に投与される。
【００９２】
ある態様において、本発明のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、以前にメルファランの投与を受けている対象に態様される。
【００９３】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与される。
【００９４】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与される。理論に拘束されるべきでないが、低い、免疫増強用量(例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能を改善するには十分な用量)での処置は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の減少またはＰＤ−１陰性細胞の増加を伴うと考えられる。ＰＤ−１陰性Ｔ細胞ではなく、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞は、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞との結合により疲弊され得る。
【００９５】
ある態様において、この方法を使用して、対象におけるここに記載するＣＡＲ細胞の性能を最適化できる。理論に拘束されるべきでないが、ある態様において、内在性、非修飾免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の性能が改善されると考えられる。理論に拘束されるべきでないが、ある態様において、標的抗原ＣＡＲ発現細胞の性能が改善されると考えられる。他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作されているまたは操作される細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増やすまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞比を高める量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理できる。
【００９６】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与前に開始する。ある態様において、ＣＡＲ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過性に、増加されているように、ｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な投与の後に投与する。
【００９７】
ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作される細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、対象におけるまたは対象から採取した、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過性に、増加されているように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な投与の後に採取する。
【００９８】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与と関係する副作用の１以上を軽減する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
【００９９】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ここに記載する癌関連抗原と関係する疾患を処置する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
【０１００】
ある態様において、例えば、ここに記載する、２以上のＣＡＲ分子を発現する細胞を、癌を処置するために、それを必要とする対象に投与する。ある態様において、例えば、ここに記載する、ＣＡＲ発現細胞を含む細胞集団を、癌を処置するために、それを必要とする対象に投与する。
【０１０１】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ここに記載する用量および／または投与スケジュールで投与する。
【０１０２】
ある態様において、ＣＡＲ分子を、例えば、インビトロ転写を使用して、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)に導入し、対象(例えば、ヒト)は、ＣＡＲ分子を含む細胞の最初の投与と、ＣＡＲ分子を含む細胞のその後の１回以上の投与を受け、ここで、その後の１回以上の投与は、先の投与の後、１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に行う。ある態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞の１回を超える投与を、対象(例えば、ヒト)に１週間当たりに行い、例えば、１週間あたりＣＡＲ分子を含む細胞を２回、３回または４回投与する。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、１週間あたりＣＡＲ分子を含む細胞の１回を超える投与を受け(例えば、１週間当たり２回、３回または４回投与)(ここではサイクルとも呼ぶ)、続いて１週間ＣＡＲ分子を含む細胞の投与をせず、次いでＣＡＲ分子を含む細胞の１回を超えるさらなる投与(例えば、１週間あたりＣＡＲ分子を含む細胞の１回を超える投与)を対象に行う。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)はＣＡＲ分子を含む細胞を１サイクルを超えて受け、各サイクルの間の時間は１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日より短い。ある態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞を、隔日で１週間３回投与する。ある態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞を、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上投与する。
【０１０３】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、疾患、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌の第一選択治療として投与する。他の態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、疾患、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌の第二、第三、第四選択治療として投与する。
【０１０４】
ある態様において、ここに記載する細胞集団を投与する。
【０１０５】
他の面において、本発明は、医薬として使用するための、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離ポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクターおよび本発明のＣＡＲを含む細胞に関する。
【０１０６】
他の面において、本発明は、ここに記載する癌関連抗原を発現する疾患の処置に使用するための、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離ポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクターおよび本発明のＣＡＲを含む細胞に関する。
【０１０７】
他の面において、本発明は、サイトカイン、例えば、ここに記載するＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１と組み合わせて医薬として使用するための、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて医薬として使用するための、ここに記載するサイトカインに関する。
【０１０８】
他の面において、本発明は、と組み合わせて医薬として使用するための、キナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞に関するここに記載する。他の面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて医薬として使用するための、ここに記載するキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤に関する。
【０１０９】
他の面において、本発明は、ＣＡＲにより標的とされる腫瘍抗原を発現する疾患の処置における、サイトカイン、例えば、ここに記載するＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１と組み合わせて使用するための、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、ＣＡＲにより標的とされる腫瘍抗原を発現する疾患の処置における、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて使用するための、ここに記載するサイトカインに関する。
【０１１０】
他の面において、本発明は、ＣＡＲにより標的とされる腫瘍抗原を発現する疾患の処置における、ここに記載するキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するための、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、ＣＡＲにより標的とされる腫瘍抗原を発現する疾患の処置における、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて使用するためのここに記載するキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤に関する。
【０１１１】
他の面において、本発明は、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子またはＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子をコードする核酸を含む細胞を投与することを含む、方法を提供する。ある態様において、対象はここに記載する障害を有し、例えば、対象は癌を有し、例えば、対象は癌を有し、ここに記載する腫瘍支持抗原を発現する腫瘍支持細胞を有する。ある態様において、対象はヒトである。
【０１１２】
他の面において、本発明は、対象に、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を含む細胞の有効量を投与することを含む、ここに記載する腫瘍支持抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法に関する。
【０１１３】
さらに別の面において、本発明は、対象に、ＣＡＲ分子を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞集団)の有効量を投与することを含む、腫瘍支持抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法に関し、ここで、ＣＡＲ分子は抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、該細胞内ドメインは共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインは、疾患と関係する腫瘍支持抗原、例えばここに記載する腫瘍支持抗原と結合する。
【０１１４】
関連する面において、本発明は、腫瘍支持抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法に関する。本方法は、対象に、ＣＡＲ分子を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞集団)の有効量を、免疫細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与することを含み、ここで、
(ｉ)ＣＡＲ分子は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインは疾患と関係する腫瘍支持抗原、例えばここに記載する腫瘍支持抗原と結合し；そして
(ii)免疫細胞の有効性を高める薬剤は、
(ｉ)タンパク質ホスファターゼ阻害剤；
(ii)キナーゼ阻害剤；
(iii)サイトカイン；
(iv)免疫阻害分子の阻害剤；または
(ｖ)ＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤
の１以上が選択される。
【０１１５】
関連する面において、本発明は、対象に、ＣＡＲ分子を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞集団)の有効量を投与することを含む、腫瘍支持抗原の発現と関係する疾患を有する対象を処置する方法に関し、ここで、
(ｉ)ＣＡＲ分子は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインは疾患と関係する腫瘍支持抗原、例えば、ここに記載する腫瘍支持抗原と結合し；そして
(ii)ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが由来する抗体より少なくとも５倍低い結合親和性を有する。
【０１１６】
他の面において、本発明は、腫瘍支持抗原の発現と関係する疾患、例えば、ここに記載する障害を有する対象の処置に使用するための、ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載するＣＡＲ分子)を含む免疫エフェクター細胞(例えば、免疫エフェクター細胞集団)を含む組成物に関する。
【０１１７】
上記方法または使用のいずれかにおいて、腫瘍支持抗原の発現と関係する疾患は、腫瘍支持抗原の発現と関係する増殖性疾患、前癌状態、癌および非癌関連徴候からなる群から選択される。ある態様において、ここに記載する腫瘍支持抗原と関係する疾患は、固形腫瘍である。
【０１１８】
ここに記載する方法または使用のある態様において、ＣＡＲ分子を、他の薬剤と組み合わせて投与する。ある態様において、薬剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＮＫ阻害剤またはデュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤およびそれらの組み合わせであり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン、ヒドロクロライド(別名パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１)のような、例えば、ＣＤ４／６阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブのような、例えば、ここに記載するＢＴＫ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、ＯＳＩ−０２７のような、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。デュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ＰＦ−０４６９５１０２であり得る。
【０１１９】
ここに記載する方法または使用のある態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン；クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６)；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、塩酸塩(Ｐ２７６−００)；１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)；インジスラム(Ｅ７０７０)；ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)；パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)；ジナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)；Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ３８７０３２)；４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(ＭＬＮ８０５４)；５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)；４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)；４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)；およびＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
【０１２０】
ここに記載する方法または使用のある態様において、キナーゼ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)であり、パルボシクリブを、一定期間、１日約５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ(例えば、７５ｍｇ、１００ｍｇまたは１２５ｍｇ)の用量で、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日間連日または２１日サイクルの７〜１２日間連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２サイクルまたはそれ以上のパルボシクリブを投与する。
【０１２１】
ここに記載する方法または使用のある態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。ある態様において、ＢＴＫ阻害剤はインターロイキン−２誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低下または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
【０１２２】
ここに記載する方法または使用のある態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)であり、イブルチニブを、一定期間、１日約２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６００ｍｇ(例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇまたは５６０ｍｇ)の用量で、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクル連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２サイクルまたはそれ以上のイブルチニブを投与する。
【０１２３】
ここに記載する方法または使用のある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＩＴＫのキナーゼ活性を阻害しないＢＴＫ阻害剤、例えば、ＲＮ−４８６であり、ＲＮ−４８６を、一定期間、１日約１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、２１０ｍｇ、２２０ｍｇ、２３０ｍｇ、２４０ｍｇ、２５０ｍｇ(例えば、１５０ｍｇ、２００ｍｇまたは２５０ｍｇ)の用量で、例えば、２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７サイクルまたはそれ以上のＲＮ−４８６を投与する。
【０１２４】
ここに記載する方法または使用のある態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られるリダフォロリムス(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィナート；エベロリムス(ＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９)；セマピモド；(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩(ＳＦ１１２６)；およびＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
【０１２５】
ここに記載する方法または使用のある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、一定期間、１日約３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ(例えば、６ｍｇ)の用量で、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２サイクルまたはそれ以上のラパマイシンを投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを、一定期間、１日約２ｍｇ、２.５ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ(例えば、１０ｍｇ)の用量で、例えば、２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２サイクルまたはそれ以上のエベロリムスを投与する。
【０１２６】
ここに記載する方法または使用のある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５−２；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
【０１２７】
ここに記載する方法または使用のある態様において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)；アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)；３−[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択される、デュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。
【０１２８】
ここに記載する方法または使用のある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を、対象に、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、ここに記載するタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤、例えば、スチボグルコン酸ナトリウムのような、例えば、ここに記載するＳＨＰ−１阻害剤である。ある態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−２阻害剤である。
【０１２９】
ここに記載する方法または使用のある態様において、ＣＡＲ分子を他の薬剤と組み合わせて投与し、該薬剤はサイトカインである。サイトカインは、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１またはこれらの組み合わせであり得る。他の態様において、ＣＡＲ分子を、チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与する。例えば、ある態様において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータから選択される阻害分子を阻害する。
【０１３０】
ＣＡＲ発現細胞の製造法
他の面において、本発明は、細胞、例えば、ここに記載するＴ細胞またはＮＫ細胞に、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むベクター；またはＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を導入(例えば、形質導入)することを含む、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団)を産生する方法に関する。
【０１３１】
本方法における細胞は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞またはこれらの組み合わせ)である。ある態様において、本方法における細胞はジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)および／またはイカロス欠損である。
【０１３２】
ある態様において、ＣＡＲをコードする核酸分子の導入はＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターの形質導入またはＣＡＲをコードする核酸分子のトランスフェクトを含み、ここで、核酸分子は、インビトロ転写ＲＮＡである。
【０１３３】
ある態様において、本方法は、さらに、
ａ. 免疫エフェクター細胞集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し；そして
ｂ. 集団からＴ制御性細胞を除去し、それによりＴ制御性枯渇細胞集団を提供し；
ここで、工程ａ)およびｂ)を、ＣＡＲをコードする核酸を集団に導入する前に行う。
【０１３４】
方法の態様において、Ｔ制御性細胞はＣＤ２５＋  Ｔ細胞を含み、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントを使用して細胞集団から除去される。抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントは、基質、例えば、ビーズと結合され得る。
【０１３５】
他の態様において、工程(ｂ)により提供されるＴ制御性枯渇細胞集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
【０１３６】
さらに別の態様において、本方法は、さらに
ＣＡＲをコードする核酸を集団に導入する前に、Ｔ制御性枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞集団を提供するために、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原を発現する細胞を、集団から除去することを含む。腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂまたはこれらの組み合わせから選択できる。
【０１３７】
他の態様において、本方法は、さらに
ＣＡＲをコードする核酸を集団に導入する前に、Ｔ制御性枯渇および阻害分子枯渇細胞集団を提供するために、チェックポイント阻害剤を発現する細胞を集団から除去することを含む。チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡおよびＬＡＩＲ１から選択できる。
【０１３８】
さらに、ここに開示する態様は、免疫エフェクター細胞集団の提供を包含する。提供される免疫エフェクター細胞集団は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはＣＤ４５ＲＯの１以上の発現に基づき選択できる。ある態様において、提供される免疫エフェクター細胞集団は、ＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である。
【０１３９】
本方法のある態様において、本方法は、さらにＣＡＲをコードする核酸分子が導入された後に、細胞集団を増殖することを含む。
ある態様において、細胞集団は、８日またはそれ以下の期間増殖される。
【０１４０】
ある態様において、細胞集団を、５日間の培養で増殖し、得られた細胞は、同じ培養条件で、９日間培養で増殖された同じ細胞よりも強力である。
【０１４１】
他の態様において、細胞集団を５日の培養で増殖し、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。
【０１４２】
さらに別の態様において、細胞集団を、５日間の培養で増殖し、得られた細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。
【０１４３】
他の態様において、細胞集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤および／または細胞表面上の共刺激分子を刺激するリガンドの存在下の細胞の培養により増殖させる。薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントと結合したビーズである。
【０１４４】
他の態様において、細胞集団を、１４日増殖期間にわたり、フローサイトメトリーで測定して細胞の少なくとも２００倍、２５０倍、３００倍または３５０倍増加をもたらす、１以上のインターロイキンを含む適切な培地で増殖させる。
【０１４５】
他の態様において、細胞集団を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下で増殖させる。
【０１４６】
ある態様において、本方法は、さらに、適切な増殖期間の後、細胞集団を凍結保存することを含む。
【０１４７】
さらに別の態様において、ここに開示する細胞を製造する方法は、さらに、免疫エフェクター細胞集団と、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡであり得る。
【０１４８】
本発明はまた、外来性ＲＮＡを一過性に発現する、ＲＮＡ操作細胞、例えば、ここに記載する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の集団を産生する方法も提供する。本方法は、インビトロ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、ここで、ＲＮＡは、ここに記載するＣＡＲ分子をコードする核酸を含む。
【０１４９】
他の面において、本発明は、対象にＣＡＲ分子を含む細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞の有効量を投与することを含む、対象に抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。ある態様において、細胞は、自己Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。ある態様において、細胞は、同種Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。ある態様において、対象はヒトである。
【０１５０】
ある面において、本発明は、例えば、ここに記載する、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、自己細胞集団を含む。ある態様において、ベクターはレトロウイルスベクターである。ある態様において、ベクターは、本明細書の他で記載する自己不活性化レンチウイルスベクターである。ある態様において、ベクターを(例えば、トランスフェクトまたは電気穿孔により)細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に送達し、ここで、ベクターは、ここに記載する本発明のＣＡＲをコードする核酸分子を含み、これはｍＲＮＡ分子として転写され、本発明のＣＡＲはＲＮＡ分子から翻訳されて、細胞の表面に発現される。
【０１５１】
他の面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の集団を提供する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある態様において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の集団は、ここに記載する第一腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞およびここに記載する第二腫瘍抗原に結合する異なる抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。他の例として、ＣＡＲ発現細胞集団は、ここに記載する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびここに記載する腫瘍抗原以外を標的とするための抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
【０１５２】
他の面において、本発明は、細胞集団を提供し、ここで、該集団における少なくとも一つの細胞は、ここに記載する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞は、他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、ここに記載する分子、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む薬剤である。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、２Ｂ４およびＴＩＧＩＴまたはこれらのいずれかのフラグメントのような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するように、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８を含む)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ−１またはそのフラグメントの第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０または４−ＩＢＢシグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
【０１５３】
ある態様において、例えば、ここに記載する、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子は、ｍＲＮＡ分子として発現される。ある態様において、遺伝子修飾された本発明のＣＡＲを発現する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、細胞に所望のＣＡＲ(例えば、ベクター配列不含)をコードするＲＮＡ分子をトランスフェクトまたは電気穿孔することにより産生できる。ある態様において、本発明のＣＡＲ分子は、取り込まれたらＲＮＡ分子から翻訳され、組み換え細胞の表面に発現される。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】図１：腫瘍および細胞株上のＥｒｂＢ２表面発現のフローサイトメトリー検出を示す一群の画像である。細胞を、抗ＥｒｂＢ２アフィボディ−ビオチンで染色し、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン(ＡＰＣ)で検出した(白抜きヒストグラム)；ＡＰＣ単独とインキュベートした細胞は、背景を示す(灰色ヒストグラム)。
【０１５５】
【図２】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ：フローサイトメトリーおよび定量的ＰＣＲによるＥｒｂＢ２検出のコレクションである。定量的ＰＣＲにより検出されるＥｒｂＢ２のコピー数(ＥｒｂＢ２／１Ｅ６アクチン)(図２Ａ)。図１におけるヒストグラムに示すようなＥｒｂＢ２平均蛍光強度(ＥｒｂＢ２  ＭＦＩ)(図２Ｂ)。コレクションを、フローサイトメトリーにより検出されたＥｒｂＢ２発現(ＭＦＩ、ｘ軸)および定量的ＰＣＲ(ｙ軸)でプロットした。ＥｒｂＢ２定量的ＰＣＲに使用する順方向および逆方向プライマーおよびプローブは次のとおりである。ＥｒｂＢ２−１Ｆ、ＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＴ(配列番号５０)；ＥｒｂＢ２−１Ｒ、ＴＣＡＡＡＣＧＴＧＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＧＧＴ(配列番号６６)；ＥｒｂＢ２−１Ｍ２、ＦＡＭ−ＣＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧ(配列番号５１)。
【０１５６】
【図３】図３：ｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞における親和性調整ＣＡＲ発現のＦＡＣＳ分析を示す一群の画像である。Ｔ細胞を、記載したＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔し、エレクトロポレーション１日後、ＣＡＲ発現を抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ抗体(ＣＤ１９−ＢＢＺについて)またはＥｒｂＢ２−Ｆｃ(ＥｒｂＢ２−ＢＢＺ  ＣＡＲについて)を使用して検出した。エレクトロポレーションしないＴ細胞を、陰性対照として使用した。
【０１５７】
【図４】図４：腫瘍細胞による刺激が測定された後のＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ１３７(４−１ＢＢ)発現の誘導を示す一群の画像である。エレクトロポレーション１日後多様なＣＡＲ  Ｔ細胞(ＫＤ、ｎＭ)を記載する腫瘍細胞株と共培養し、ＣＤ１３７発現を２４時間後に測定した。
【０１５８】
【図５】図５：培養上清におけるサイトカイン分泌を測定した(ＥＬＩＳＡ)。Ｔ細胞を、示すように５μｇまたは１０μｇ親和性調整ＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔した。エレクトロポレーション１日後、ＣＡＲ  Ｔ細胞を記載する腫瘍細胞株と２４時間共培養した。棒グラフは、ＩＦＮ−ガンマについての代表的実験の結果を示す(値は２回の平均±ＳＤを表す)。
【０１５９】
【図６】図６：培養上清におけるサイトカイン分泌を測定した(ＥＬＩＳＡ)。Ｔ細胞を、示すように５μｇまたは１０μｇ親和性調整ＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔した。エレクトロポレーション１日後、ＣＡＲ  Ｔ細胞を記載する腫瘍細胞株と２４時間共培養した。棒グラフは、ＩＬ−２の代表的実験の結果を示す(値は２回の平均±ＳＤを表す)。
【０１６０】
【図７】図７：腫瘍により刺激されているＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ上方制御。Ｔ細胞を、５μｇまたは１０μｇの記載するｓｃＦｖをコードするＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔し、１日後、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、記載する細胞株と４時間共培養し、ＣＤ１０７ａ発現をＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞上のゲーティングにより測定した。
【０１６１】
【図８】図８：さらなる腫瘍細胞株を、ビオチン−ＥｒｂＢ２アフィボディ(ストレプトアビジン−ＰＥ)染色を使用するフローサイトメトリーによりＥｒｂＢ２発現について試験したことを示す一群の画像である(白抜きヒストグラム)。ストレプトアビジン−ＰＥでのみ染色された同じ細胞を陰性対照として使用した(灰色ヒストグラム)。
【０１６２】
【図９】図９：ＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＴ細胞を、Ｃで試験した腫瘍株で刺激した。ＳＫ−ＯＫ３、ＢＴ−４７４、ＨＣＣ２２８１、ＭＤＡ−３６１、ＭＤＡ−４５３、ＨＣＣ−１４１９、ＨＣＣ−１５６９、ＵＡＣＣ−８１２およびＬｎＣａｐはＥｒｂＢ２増幅腫瘍であることが報告されているが、ＭＤＡ−１７５、ＭＣＦ−１０Ａ、ＨＣＣ３８、ＨＧ２６１はＥｒｂＢ２低または陰性細胞株であることが報告されている。４時間刺激後、Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａをフローサイトメトリー染色によりモニターし、ＣＤ１０７ａを発現する細胞％をプロットした。
【０１６３】
【図１０】図１０：Ｋ５６２細胞の認識を記載する量のＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡで電気穿孔し、記載するｓｃＦｖを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞(ＫＤ、ｎＭ)を標的と４時間共培養し、ＣＤ１０７ａ発現％をＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞上で定量したことを示す一群の画像である。
【０１６４】
【図１１Ａ】図１１Ａ：エレクトロポレーション後のＫ５６２細胞におけるＥｒｂＢ２発現を示す一群の画像である。Ｋ５６２細胞を、記載する量のＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡで電気穿孔し、染色はＥｒｂＢ２発現細胞を示す(白抜きヒストグラム)；二次抗体のみとインキュベートした細胞は背景を示す(灰色ヒストグラム)。
【０１６５】
【図１１Ｂ】図１１Ｂ：ＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡ電気穿孔Ｋ５６２細胞により刺激された一団のＥｒｂＢ２  ＣＡＲＴ細胞によるＩＦＮ−ガンマ分泌。Ｋ５６２細胞を、示すように、２μｇまたは１０μｇＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を記載するＫ５６２標的と共培養し、ＩＦＮ−ガンマ分泌を２４時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１６６】
【図１２】図１２：ＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡ電気穿孔Ｋ５６２細胞による刺激後の一団の親和性調整ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を示す一群の画像である。休息Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、１０μｇ  ＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔した。Ｋ５６２細胞を、記載する用量のＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡまたは対照ＣＤ１９  ｍＲＮＡ(１９ＢＢＢＺ)で電気穿孔した。Ｔ細胞および照射標的を７日培養し(１：１比)、ＣＦＳＥ希釈をフローサイトメトリーにより測定した(ＣＤ３ゲート開閉)；分裂Ｔ細胞％を示す。
【０１６７】
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃ：ＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡ電気穿孔Ｎａｌｍ６−ＣＢＧ標的細胞に対する一団のＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性を測定した。Ｔ細胞を記載するとおり、ＥｒｂＢ２またはＣＤ１９  ＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔した。ＣＤ１９＋ｖｅ  Ｎａｌｍ６−ＣＢＧ(クリックビートル緑色)標的細胞を、記載する用量のＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡで電気穿孔した：１０μｇ  ＥｒｂＢ２  ＲＮＡ(図１３Ａ)；１μｇ  ＥｒｂＢ２  ＲＮＡ(図１３Ｂ)；および０.１μｇ  ＥｒｂＢ２  ＲＮＡ(図１３Ｃ)。エレクトロポレーション１日後、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｎａｌｍ６−ＣＢＧ細胞と記載するＥ：Ｔ比で共培養し、特異的溶解％を８時間後に計算した。
【０１６８】
【図１４】図１４：記載する一次細胞株におけるＥｒｂＢ２発現を示す一群の画像である。一次細胞株を抗ＥｒＢｂ２アフィボディ−ビオチンを使用して染色し、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン(ＡＰＣ)を使用して検出した(白抜きヒストグラム)；ＡＰＣのみで染色した細胞を対照として使用した(灰色ヒストグラム)。
【０１６９】
【図１５】図１５：一次細胞株上のＥｒｂＢ２の選択的ターゲティング。一団のＣＡＲ  Ｔ細胞を記載する一次細胞株で４時間刺激し、ＣＤ１０７ａを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の％をＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞上のゲーティングにより測定した。
【０１７０】
【図１６】図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃ：Ｔ細胞が、記載するとおり、レンチウイルス形質導入(ＬＶＶ)またはｍＲＮＡエレクトロポレーション(ＲＮＡ)を使用する高(４Ｄ５)または低(４Ｄ５−５)親和性ＥｒｂＢ２  ＣＡＲで修飾されたことを示す、画像の群である。ＣＡＲ発現％および輝度をＥｒｂＢ２−Ｆｃを使用して測定した(図１６Ａ)。ＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡで電気穿孔した一団の腫瘍株およびＫ５６２細胞上のＥｒｂＢ２発現をフローサイトメトリーにより検出した(図１６Ｂおよび１６Ｃ)；細胞＋細胞パーセンテージおよび(ＭＦＩ)をＫ５６２細胞に対して示す。
【０１７１】
【図１７】図１７：記載する腫瘍株のＣＡＲ  Ｔ細胞認識を示す一群の画像である。記載する腫瘍株で４時間刺激後、レンチウイルス形質導入またはｍＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲ  Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ上方制御を測定した(ＣＤ３＋細胞でゲート開閉)。
【０１７２】
【図１８】図１８：記載する量のＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡで電気穿孔したＫ５６２細胞のＣＡＲ  Ｔ細胞認識を示す、画像の群である。ＣＤ１０７ａ発現の誘発を、ＥｒｂＢ２電気穿孔Ｋ５６２細胞で４時間刺激後、ＣＤ３＋細胞上のゲーティングによりレンチウイルス形質導入またはｍＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲ  Ｔ細胞で測定した。
【０１７３】
【図１９】図１９：レンチウイルス形質導入またはｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａのＥｒｂＢ２標的依存的上方制御を示す、画像の群である。図４Ａの主文に示すように、Ｔ細胞を、過発現から低レベルまでの種々のレベルでＥｒｂＢ２を発現する腫瘍細胞株で４時間刺激した。ＣＤ１０７ａ上方制御をフローサイトメトリーにより検出した(ＣＤ３＋ゲート開閉)。
【０１７４】
【図２０】図２０：レンチウイルス形質導入またはＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮ−ガンマ分泌を、１８時間後ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１７５】
【図２１】図２１：記載する量のＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡで電気穿孔したＫ５６２細胞で刺激１８時間後に測定した、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮ−ガンマ産生。
【０１７６】
【図２２】図２２：親和性調整ＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞により処置したマウスにおける進行型血管新生化腫瘍の退縮を示す一連の画像である。側腹部腫瘍を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ−／−(ＮＳＧ)マウスへの５×１０６  ＳＫ−ＯＶ３−ＣＢＧ(ｓ.ｃ.)の注射により確立した(ｎ＝５)。腫瘍接種１８日後、マウスを腫瘍負荷が等しくなるように無作為化し、高親和性(４Ｄ５.ＢＢＺ)または低親和性(４Ｄ５−５.ＢＢＺ)ＣＡＲのいずれかを発現する１×１０７レンチウイルス形質導入Ｔ細胞で処置した。非形質導入Ｔ細胞(Ｔ細胞単独)で処置したマウスは対照として役立った。動物を、腫瘍接種後、記載する時点で造影した。
【０１７７】
【図２３】図２３：親和性調整ＣＡＲによる高ＥｒｂＢ２(ＳＫ−ＯＶ３)および低ＥｒｂＢ２(ＰＣ３)発現腫瘍のインビボ鑑別を示す一連の画像である。レンチウイルス形質導入により異なる親和性ＥｒｂＢ２  ＣＡＲで修飾されたＴ細胞を、二重腫瘍移植ＮＳＧマウスにおいて試験した。マウスに、０日目に、右側腹部にＰＣ３−ＣＢＧ腫瘍細胞(１ｅ６細胞／マウス、ｓ.ｃ.)をインプラントした。５日目同じマウスに、左側腹部にＳＫ−ＯＶ３−ＣＢＧ腫瘍細胞(５ｅ６細胞／マウス、ｓ.ｃ.)を与えた。マウスを、ＰＣ３腫瘍接種後２３日目にＴ細胞(ｉ.ｖ.)で処置した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、記載するように、１０ｅ６／マウス(１０Ｍ)または３ｅ６／マウス(３Ｍ)の１回注射として与えた。非形質導入Ｔ細胞で処置した細胞は、対照として役立った。動物を、ＰＣ３腫瘍接種後記載する時間に造影した。
【０１７８】
【図２４】図２４：記載する親和性調整ＥｒｂＢ２  ＣＡＲで処置した二重腫瘍移植ＮＳＧマウスにおけるＳＫ−ＯＶ３腫瘍サイズ。ＳＫ−ＯＶ３腫瘍サイズを経時的に測定し(日、ｘ軸)、腫瘍体積を計算し、プロットした(ｍｍ３、ｙ軸)。
【０１７９】
【図２５】図２５：記載する親和性調整ＥｒｂＢ２  ＣＡＲで処置した二重腫瘍移植ＮＳＧマウスにおけるＰＣ３腫瘍サイズ。ＰＣ３腫瘍サイズを経時的に測定し(日、ｘ軸)、腫瘍体積を計算し、プロットした(ｍｍ３、ｙ軸)。
【０１８０】
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂ：ＥＧＦＲ  ＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＴ細胞上のＣＡＲ発現を示す一連の画像であり、抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂにより染色し、フローサイトメトリー染色により検出した(図２６Ａ)；ｓｃＦｖの親和性を示す(ｎＭ)。腫瘍株(図２６Ｂ)を抗ＥＧＦＲアフィボディ−ＦＩＴＣで染色し(白抜きヒストグラム)、同じ細胞を、アイソタイプ対照としてマウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣで染色した(灰色ヒストグラム)。
【０１８１】
【図２７】図２７：ＥＧＦＲ  ＣＡＲ認識感受性は、親和性と相関する。ｓｃＦｖの記載する親和性を有する一団のＥＧＦＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞(ＫＤ、ｎＭ)を、図２６Ｂに示す密度で、一団のＥＧＦＲを発現する腫瘍で刺激した。４時間刺激後、ＣＡＲ  Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ上方制御を、ＣＤ３＋細胞上のゲーティングにより検出した。
【０１８２】
【図２８】図２８：記載する量のＥＧＦＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＫ５６２細胞におけるＥｒｂＢ２発現を示す一連の画像である。ＥＧＦＲ発現を、エレクトロポレーション１４時間後、抗ＥＧＦＲアフィボディ−ＦＩＴＣ染色を使用して検出した。
【０１８３】
【図２９】図２９：ＥＧＦＲ  ＣＡＲ認識感受性は、親和性と相関する。Ｔ細胞を、記載するように異なる親和性を有する一団のＥＧＦＲ  ＣＡＲで電気穿孔し、図３０に示すように異なるレベルのＥＧＦＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＫ５６２で刺激した。４時間刺激後、ＣＡＲ  Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ発現を、ＣＤ３＋細胞上のゲーティングにより測定した。
【０１８４】
【図３０】図３０：親和性調整ＥＧＦＲ  ＣＡＲを使用する一次細胞株および腫瘍細胞の親和性依存的認識。Ｔ細胞を、記載するＥＧＦＲ  ＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔した。エレクトロポレーション１日後、ＣＡＲ  Ｔ細胞を一団の細胞で４時間刺激し、ＣＡＲ  Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ発現誘導を定量した(ＣＤ３＋ゲート開閉)。
【０１８５】
【図３１】図３１：親和性調整ＥＧＦＲ  ＣＡＲで修飾したＴ細胞による一次細胞株の差次的認識。ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋二重陽性細胞のパーセンテージをプロットした。
【０１８６】
【図３２】図３２：ＩｇＧ１−Ｆｃによる対照処理と比較した、ＰＤ１  ＣＡＲのＮＦＡＴ誘導性プロモーター駆動ルシフェラーゼ活性を記載する。ＦＩＧ２２Ｂは、ＩｇＧ１−Ｆｃによる対照処理と比較した、ＰＤ１−ＥＣＤ−ＴＭ−ＦＲＢおよびＦＫＢＰ−４  １ＢＢ−ＣＤ３ゼータを含むＰＤ１  ＲＣＡＲのＮＦＡＴ誘導性プロモーター駆動ルシフェラーゼ活性を記載する。
【０１８７】
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂ：葉酸受容体アルファ(ＦＲＡ)特異的完全ヒトキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)Ｔ細胞の産生。(図３３Ａ)ＣＤ３ζ細胞質ドメイン単独(Ｃ４−ｚ)またはＣＤ２７共刺激モジュール(Ｃ４−２７ｚ)との組み合わせを含むＣ４ベースのＣＡＲ構築物の略図。マウス抗ヒトＦＲＡ  ＭＯｖ１９−２７ｚ  ＣＡＲも示す。(図３３Ｂ)Ｃ４  ＣＡＲを発現する両サブセットでのＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性細胞の形質導入Ｔ細胞を示す一連の画像である。非形質導入(ＵＮＴ)Ｔ細胞(灰色ヒストグラム)と比較した、レンチウイルスでの形質導入後、Ｃ４  ＣＡＲ発現(白抜きヒストグラム)を、ビオチン標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)染色と、続くストレプトアビジン−フィコエリスリンにより検出した。形質導入効率を、括弧内のＣＡＲ発現のパーセンテージとともに示す。ＳｃＦｖ、一本鎖抗体可変フラグメントＬ、リンカー；Ｃ４、抗ＦＲＡ  ｓｃＦｖ；ＶＨ、可変Ｈ鎖；ＶＬ、可変Ｌ鎖；ＴＭ、膜貫通領域。
【０１８８】
【図３４】図３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｃ、３４Ｄおよび３４Ｅ。インビトロでのＦＲ特異的Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲとＣＤ２７共刺激エンドドメインの抗腫瘍活性の比較。(図３４Ａ)一次ヒトＴ細胞上のＣ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ発現がビオチン標識組み換えＦＲＡタンパク質と、続くＳＡ−ＰＥにより検出できることを示す、一連の画像である。示されるように、ＣＤ８＋  ＴおよびＣＤ８−(ＣＤ４＋)細胞の両者が、フローサイトメトリーで測定してＣＡＲを効率的に発現できる。(図３４Ｂ)Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞が生物発光死滅アッセイにおいて溶解性機能を示したことを示す、一連のグラフである。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、記載するＥ／Ｔ比で、２０時間を越えてＦＲ＋  ＳＫＯＶ３およびＡ１８４７を殺した。非形質導入Ｔ細胞は、陰性対照として役立った。少なくとも３回の独立した実験からの３連ウェルの平均およびＳＤを示す。(図３４Ｃ)Ｃ４またはＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＦＲＡ＋標的細胞(ＳＫＯＶ３、Ａ１８４７およびＴ４７Ｄ)およびＦＲＡ−(Ｃ３０)と、１：１  Ｅ：Ｔ比で共培養した。(図３４Ｄ)Ｃ４またはＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞がゴルジ阻害剤の存在下、５時間、ＳＫＯＶ３細胞で刺激され、細胞内ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ−ａおよびＩＬ−２についてフローサイトメトリーで分析したことを示す、一連の画像である。(図３４Ｅ)ＦＲＡ＋腫瘍細胞(１：１０、１：３、１：１、３：１および１０：１比)と一夜共培養した後の、Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＩＦＮ−ｇ放出アッセイ。
【０１８９】
【図３５】図３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃおよび３５Ｄ：Ｃ４−ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性はＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞と同等である。(図３５Ａ)Ｃ４−２７ｚおよびＭＯｖ１９−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が介在する腫瘍退縮。確立された皮下腫瘍を担持するＮＳＧマウスを、４０日目および４５日目に、１×１０７  Ｃ４−２７ｚおよびＭＯｖ１９−２７ｚ  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞または対照ＣＤ１９−２７ｚおよびＵＮＴ  Ｔ細胞または食塩水のｉ.ｖ.注射により処置した。腫瘍増殖を、キャリパー測定により評価した。Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲまたはＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞(約６０％ＣＡＲ発現)で処置した腫瘍は退行した(矢印はＴ細胞注入の日を示す)；食塩水、ＵＮＴまたはＣＤ１９−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した腫瘍は、最初のＴ細胞投与後３週間退行しなかった。(図３５Ｂ)ＳＫＯＶ３  ｆＬｕｃ＋バイオルミネセンスシグナルが、最初のＴ細胞投与３週間後、ＣＤ１９−２７ｚおよび対照処置群と比較して、Ｃ４−２７ｚおよびＭＯｖ１９−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置マウスで減少したことを示す、一連の画像である。(図３５Ｃ)Ｔ細胞治療後、摘除した腫瘍検体の巨視的評価。腫瘍を、最初のＴ細胞注射約４５日後の、安楽死の時点でマウスから採取した。(図３５Ｄ)インビボでのＣ４  ＣＡＲおよびＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の安定な持続。末梢血を、最初のＴ細胞注入３週間後に採取し、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞／血液μｌの絶対数を定量した。平均細胞数±ＳＥＭを、全群についてｎ＝５で示す。
【０１９０】
【図３６】図３６Ａ、３６Ｂおよび３６Ｃ：Ｃ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、インビトロで最小細胞毒性活性を示した。(図３６Ａ)ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞および正常上皮性卵巣細胞株ＩＯＳＥ６が極めて低レベルのＦＲＡを発現することを示す、一連の画像である。ＳＫＯＶ３およびＣ３０は、それぞれ、陽性および陰性対照として役立った。(図３６Ｂ)Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＭＯｖ１９−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、低レベルの表面ＦＲＡを発現する、正常２９３Ｔ細胞およびＩＯＳＥ  ６細胞株と一夜インキュベーション後最小量のＩＦＮ−γを発現する。(図３６Ｃ)Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２９３ＴまたはＩＯＳＥ６細胞で５時間、ゴルジ阻害剤存在下で刺激し、細胞内ＩＦＮ−ｇおよびＴＮＦ−ａについてフローサイトメトリーで分析したことを示す、一連の画像である。
【０１９１】
【図３７】図３７Ａおよび３７Ｂ：完全ヒトＣ４  ＣＡＲがＴ細胞表面上で発現され、検出される。(図３７Ａ)レンチウイルス力価(形質導入単位、ＴＵ)を、濃縮ウイルスの１：３から最終希釈１：６,５６１までの３倍連続希釈に基づくＳｕｐＴ１細胞を使用して決定したことを示す、一連の画像である。Ｃ４  ＣＡＲコード化レンチウイルスは、並行して、同じ産生および濃縮プロトコールにしたがって、ＭＯｖ１９  ＣＡＲコード化レンチウイルスの力価と比較したとき、高い力価を有する。(図３７Ｂ)一次ヒトＴ細胞を、１、２または５の感染効率(ＭＯＩ)でＣ４  ＣＡＲまたはＭＯｖ１９  ＣＡＲコード化レンチウイルスと感染させたことを示す、一連の画像である。これらのデータは、少なくとも３回の独立した実験の一つを現す。
【０１９２】
【図３８】図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃ：図３８Ａおよび３８Ｂは、ゴルジ阻害剤の存在下、５時間、ＦＲＡ＋  ＳＫＯＶ３細胞で刺激され、細胞内ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ−ａおよびＩＬ−２についてフローサイトメトリーで分析した非形質導入Ｔ細胞およびゴルジ阻害剤の存在下、５時間、ＦＲＡ−Ｃ３０細胞で刺激され、細胞内ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ−ａおよびＩＬ−２についてフローサイトメトリーで分析したＣ４またはＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を示す。図３８Ｃは、ＳＫＯＶ３、Ａ１８４７およびＴ４７Ｄ腫瘍細胞株上のαＦＲ発現を示す；Ｃ３０細胞株を陰性対照として使用した。
【０１９３】
【図３９】図３９Ａ、３９Ｂ、３９Ｃ：ＣＡＲ下方制御が、ＭＯｖ１９  ＣＡＲの抗腫瘍活性を障害させ得るが、Ｃ４  ＣＡＲでは障害させないことを示す、一連の画像である。Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ゴルジ阻害剤の存在下、５時間、ＳＫＯＶ３またはＣ３０細胞で刺激し、Ｔ細胞表面のＣＡＲ発現および細胞内ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２についてフローサイトメトリーにより分析した。(図３９Ａ)ＣＡＲ発現のフローサイトメトリー分析は、αＦＲ＋またはαＦＲ腫瘍細胞との４時間共培養により変わる。(図３９Ｂ)ＭＯｖ１９およびＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞をαＦＲ＋またはαＦＲ腫瘍細胞と共培養し、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤで染色した。アポトーシス細胞を、ゲート開閉細胞のパーセンテージとして示す。図３９Ｃにおいて、細胞をＣＤ１３７について染色した。
【０１９４】
【図４０】図４０：ＣＡＲ発現のフローサイトメトリー分析がＦＲＡ＋腫瘍細胞(１：１０、１：３、１：１、３：１および１０：１比で)一夜共培養後に変わることを示す、一連の画像である。
【０１９５】
【図４１】図４１Ａおよび４１Ｂを含む図４１は、プラセボと比較して、インフルエンザワクチン株に対する力価の増加を示すグラフである。図４１Ａにおいて、ワクチン接種４週間後、プラセボコホートにおける増加と比較して、３インフルエンザワクチン株(Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８)の各々に対するインフルエンザ幾何平均力価のベースラインを超える増加が、治療企図集団におけるＲＡＤ００１投薬コホートの各々について示される。太黒線は、本治験の主要エンドポイントを満たすために、３種のインフルエンザワクチン株中２種で満たされることが必要である、プラセボに対する力価の１.２倍増加を示す。星印“＊”は、プラセボに対するＧＭＴ力価の造花が、少なくとも８０％の事後確率で１を越えることを示す。図４１Ｂは、ベースラインインフルエンザ力価≦１：４０を有する対象のサブセットについて図４１Ａと同じデータを示す。
【０１９６】
【図４２】図４２は、ワクチン接種４週間後の、ＲＡＤ００１濃度対各インフルエンザワクチン株に対する幾何平均力価の倍増加の一連の散布図を示す。ＲＡＤ００１濃度(投与１時間後)を、対象が４週間投薬された後に測定した。薬物動態測定した全対象は分析セットに含まれた。ベースラインに対するワクチン接種４週間後の幾何平均力価の増加倍率をｙ軸に示す。
【０１９７】
【図４３】図４３は、プラセボと比較して、異種インフルエンザ株に対する力価の増加を示す、グラフである。ワクチン接種４週間後の、プラセボコホートに対する、インフルエンザワクチンに含まれない２種の異種インフルエンザ株(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に対するインフルエンザ幾何平均力価のベースラインを超える増加を、治療企図集団におけるＲＡＤ００１投薬コホートの各々について示す。＊は、プラセボに対する力価の増加が、少なくとも８０％の事後確率で１を超えることを示す。
【０１９８】
【図４４】図４４Ａおよび４４Ｂを含む図４４は、インフルエンザワクチン接種前後のＩｇＧおよびＩｇＭレベルのグラフである。抗Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９インフルエンザＩｇＧおよびＩｇＭのレベルを、インフルエンザワクチン接種前および４週間後に対象から得た血清で測定した。抗Ｈ１Ｎ１インフルエンザＩｇＧおよびＩｇＭレベルのベースラインからワクチン接種４週間後の変化有意な変化は、ＲＡＤ００１コホートとプラセボコホートの間で検出されなかった(クラスカル・ウォリス順位和検定による全ｐ値＞０.０５)。
【０１９９】
【図４５】図４５Ａ、４５Ｂおよび４５Ｃを含む図４５は、ＲＡＤ００１処置後の、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８のパーセントの減少およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞の増加を表すグラフである。ＰＤ−１陽性ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞のパーセントを、ベースライン、治験薬処置６週間後(６週目)および治験薬中止６週間後およびインフルエンザワクチン接種４週間後(１２週目)でのＰＢＭＣサンプルのＦＡＣＳ分析により決定した。図４５Ａは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、ＲＡＤ００１を０.５ｍｇ／日(ｎ＝２５)、５ｍｇ／週(ｎ＝２９)および２０ｍｇ／週(ｎ＝３０)の用量レベルで受けているコホートにおいて、１２週目でＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の有意な減少(−３７.１％から−２８.５％)があり、それぞれ、ｐ＝０.００２(０.０２)、ｐ＝０.００３(ｑ＝０.０３)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)であったことを示す。図４５Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、ＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を０.５ｍｇ／日(ｎ＝２５)、５ｍｇ／週(ｎ＝２９)および２０ｍｇ／週(ｎ＝３０)の用量レベルで受けているコホートにおいて、１２週目でＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の有意な減少(−４３.３％から−３８.５％)があり、それぞれ、ｐ＝０.０１(０.０５)、ｐ＝０.００７(ｑ＝０.０４)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)であったことを示す。図４５Ｃは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、ＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を０.５ｍｇ／日(ｎ＝２５)、５ｍｇ／週(ｎ＝２９)および２０ｍｇ／週(ｎ＝３０)の用量レベルで受けているコホートにおいて、１２週目でＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞の有意な増加(３.０％から４.９％)があり、それぞれ、ｐ＝０.０００７(０.０２)、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.０７)およびｐ＝０.０３(ｑ＝０.０８)であったことを示す。
【０２００】
【図４６】図４６Ａおよび４６Ｂを含む図４６は、ＲＡＤ００１処置後のＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８のパーセントの減少およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞の増加を表すグラフである。ＰＤ−１陽性ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞のパーセントを、ベースライン、治験薬処置６週間後(６週目)および治験薬中止６週間後およびインフルエンザワクチン接種４週間後(１２週目)でのＰＢＭＣサンプルのＦＡＣＳ分析により決定した。図４６Ａは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、ＲＡＤ００１を０.５ｍｇ／日(ｎ＝２５)、５ｍｇ／週(ｎ＝２９)および２０ｍｇ／週(ｎ＝３０)の用量レベルで受けているコホートにおいて、１２週目でＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の有意な減少(−３７.１％から−２８.５％)があり、それぞれ、ｐ＝０.００２(０.０２)、ｐ＝０.００３(ｑ＝０.０３)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)であったことを示す。図４６Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、ＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を０.５ｍｇ／日(ｎ＝２５)、５ｍｇ／週(ｎ＝２９)および２０ｍｇ／週(ｎ＝３０)の用量レベルで受けているコホートにおいて、１２週目でＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の有意な減少(−４３.３％から−３８.５％)があり、それぞれ、ｐ＝０.０１(０.０５)、ｐ＝０.００７(ｑ＝０.０４)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)であったことを示す。図４５Ｃは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、ＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を０.５ｍｇ／日(ｎ＝２５)、５ｍｇ／週(ｎ＝２９)および２０ｍｇ／週(ｎ＝３０)の用量レベルで受けているコホートにおいて、１２週目でＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞の有意な増加(３.０％から４.９％)があり、それぞれ、ｐ＝０.０００７(０.０２)、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.０７)およびｐ＝０.０３(ｑ＝０.０８)であったことを示す。
【０２０１】
【図４７】図４７は、高齢対象で、ＲＡＤ００１に応答して、運動およびエネルギーが増加することを示す一連のグラフである。
【０２０２】
【図４８】図４８Ａおよび４８Ｂを含む図４８は、細胞株におけるＰ７０  Ｓ６Ｋ活性に対するＲＡＤ００１の効果を示す。図４８Ａは、ＲＡＤ００１の毎週および毎日の高用量でのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を示す；図４８Ｂは、ＲＡＤ００１の毎週の低用量でのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を示す。
【０２０３】
【図４９】図４９Ａ、４９Ｂ、４９Ｃ、４９Ｄ、４９Ｅおよび４９Ｆ：個体サンプルにおける次の遺伝子についての標準化ＭＦＩ値を表すグラフである：ＣＤ７９Ａ(図４９Ａ)、ＣＣＲ２(図４９Ｂ)、ＴＮＦＲＳＦ１７(図４９Ｃ)、ＨＳＰＢ１(図４９Ｄ)、ＣＤ７２(図４９Ｅ)およびＣＤ４８(図４９Ｆ)。Ｙ軸は標準化ＭＦＩを表す；Ｘ軸は標的遺伝子を表す。
【０２０４】
【図５０】図５０Ａ、５０Ｂ、５０Ｃ、５０Ｄ、５０Ｅおよび５０Ｆ：個体サンプルにおける次の遺伝子についての標準化ＭＦＩ値を表すグラフである：ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ(図５０Ａ)、ＩＬ３ＲＡ(図５０Ｂ)、ＳＩＧＬＥＣ１(図５０Ｃ)、ＬＡＩＲ１(図５０Ｄ)、ＦＣＡＲ(図５０Ｅ)およびＣＤ７９Ｂ(図５０Ｆ)。Ｙ軸は標準化ＭＦＩを表す；Ｘ軸は標的遺伝子を表す。
【０２０５】
【図５１】図５１Ａ、５１Ｂ、５１Ｃ、５１Ｄ、５１Ｅおよび５１Ｆ：個体サンプルにおける次の遺伝子についての標準化ＭＦＩ値を表すグラフである：ＬＩＬＲＡ２(図５１Ａ)、ＣＤ３７(図５１Ｂ)、ＣＤ３００ＬＦ(図５１Ｃ)、ＣＬＥＣ１２Ａ(図５１Ｄ)、ＢＳＴ２(図５１Ｅ)およびＣＤ２７６(図５１Ｆ)。Ｙ軸は標準化ＭＦＩを表す；Ｘ軸は標的遺伝子を表す。
【０２０６】
【図５２】図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃ、５２Ｄ、５２Ｅおよび５２Ｆ：個体サンプルにおける次の遺伝子についての標準化ＭＦＩ値を表すグラフである：ＥＭＲ２(図５２Ａ)、ＨＳＰＨ１(図５２Ｂ)、ＲＧＳ１３(図５２Ｃ)、ＣＬＥＣＬ１(図５２Ｄ)、ＳＰＮ(図５２Ｅ)およびＣＤ２００(図５２Ｆ)。Ｙ軸は標準化ＭＦＩを表す；Ｘ軸は標的遺伝子を表す。
【０２０７】
【図５３】図５３Ａ、５３Ｂ、５３Ｃ、５３Ｄ、５３Ｅおよび５３Ｆ：個体サンプルにおける次の遺伝子についての標準化ＭＦＩ値を表すグラフである：ＬＹ７５(図５３Ａ)、ＳＩＲＰＢ１(図５３Ｂ)、ＦＬＴ３(図５３Ｃ)、ＣＤ２２(図５３Ｄ)、ＰＴＰＲＣ(図５３Ｅ)およびＧＰＲＣ５Ｄ(図５３Ｆ)。Ｙ軸は標準化ＭＦＩを表す；Ｘ軸は標的遺伝子を表す。
【０２０８】
【図５４】図５４Ａ、５４Ｂ、５４Ｃ、５４Ｄ、５４Ｅおよび５４Ｆ：個体サンプルにおける次の遺伝子についての標準化ＭＦＩ値を表すグラフである：ＵＭＯＤＬ１(図５４Ａ)、ＣＤ７４(図５４Ｂ)、ＭＳ４Ａ３(図５４Ｃ)、ＣＤ３０２(図５４Ｄ)、ＴＮＦＲＦＳＦ１３Ｂ(図５４Ｅ)およびＭＳＮ(図５４Ｆ)。Ｙ軸は標準化ＭＦＩを表す；Ｘ軸は標的遺伝子を表す。
【０２０９】
【図５５】図５５Ａ、５５Ｂ、５５Ｃ、５５Ｄ、５５Ｅおよび５５Ｆ：個体サンプルにおける次の遺伝子についての標準化ＭＦＩ値を表すグラフである：ＫＩＴ(図５５Ａ)、ＧＰＣ３(図５５Ｂ)、ＣＤ１０１(図５５Ｃ)、ＣＤ３００Ａ(図５５Ｄ)、ＳＥＭＡ４Ｄ(図５５Ｅ)およびＣＤ８６(図５５Ｆ)。Ｙ軸は標準化ＭＦＩを表す；Ｘ軸は標的遺伝子を表す。
【０２１０】
【図５６】図５６Ａ、５６Ｂ、５６Ｃ、５６Ｄ、５６Ｅおよび５６Ｆ：個体サンプルにおける次の遺伝子についての標準化ＭＦＩ値を表すグラフである：ＳＩＧＬＥＣ５(図５６Ａ)、ＧＰＲ１１４(図５６Ｂ)、ＦＣＲＬ５(図５６Ｃ)、ＲＯＲ１(図５６Ｄ)、ＰＴＧＦＲＮ(図５６Ｅ)およびＩＧＬＬ１(図５６Ｆ)。Ｙ軸は標準化ＭＦＩを表す；Ｘ軸は標的遺伝子を表す。
【０２１１】
【図５７】図５７Ａ、５７Ｂ、５７Ｃ、５７Ｄおよび５７Ｅ：個体サンプルにおける次の遺伝子についての標準化ＭＦＩ値を表すグラフである：ＣＤ２４４(図５７Ａ)、ＣＤ１９(図５７Ｂ)、ＣＤ３４(図５７Ｃ)、ＢＳＴ１(図５７Ｄ)およびＴＦＲＣ(図５７Ｅ)。Ｙ軸は標準化ＭＦＩを表す；Ｘ軸は標的遺伝子を表す。
【０２１２】
【図５８】図５８：ＡＭＬ、ＡＬＬ、正常骨髄(ＮＢＭ)またはＯＶ３５７細胞株(ＯＶ３５７)からのＰＰ１Ｂハウスキーピング遺伝子に対する、平均標準化ＭＦＩ値の累積的表示である。Ｙ軸は標準化ＭＦＩを表す；Ｘ軸は標的遺伝子を表す。
【０２１３】
【図５９】図５９Ａおよび５９Ｂ：葉酸受容体αを標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞の産生。図５９Ａは、Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲベクターの模式図である。図５９Ｂは、レンチウイルス形質導入４８時間後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現の一連の代表的ＦＡＣＳヒストグラムプロットである。
【０２１４】
【図６０】図６０：卵巣腫瘍マウスモデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞と種々のサイトカインの組合せを試験するための、インビボ実験の模式図である。
【０２１５】
【図６１】図６１：種々のサイトカイン暴露Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗ＣＤ１９−２７ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍増殖曲線である。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。矢印は、Ｔ細胞注入の時点を示す。
【０２１６】
【図６２】図６２：バイオルミネセンス画像は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の最初の静脈内注射の直前(３８日目)、２週間後(５３日目)および５週間後(７４日目)のＮＳＧマウスにおけるｆＬｕｃ＋  ＳＫＯＶ３腫瘍を示す。
【０２１７】
【図６３】図６３：ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の最初の投与１５日後の、マウス末梢血における循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞数の定量化である。
【０２１８】
【図６４】図６４：マウス血液における循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＣＡＲ発現の定量化である。
【０２１９】
【図６５】図６５：ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ染色に基づく、マウス血液における循環ヒトＴ細胞のＴ細胞サブセットの分布である。
【０２２０】
【図６６】図６６：マウス血液における循環ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＣＤ２７およびＣＤ２８発現の定量化を表す一連のグラフである。
【０２２１】
【図６７】図６７Ａ、６７Ｂおよび６７Ｃ：新鮮または解凍ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した、腫瘍微小環境におけるｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞(ＴＩＬ)の経時的機能性喪失。Ａ)細胞毒性アッセイ(ＥＭＭＥＳＯ  ＴＩＬエクスビボ死滅アッセイ(即時収集))；Ｂ)ＩＦＮγ放出アッセイ(３０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２一夜休息前／後の５Ｋ  ＥＭＭＥＳＯ／ｆｆｌｕｃ細胞と２０時間５０：１共培養した後のＩＦＮガンマレベル)；およびＣ)ＥＲＫシグナル伝達のウェスタンブロット分析(リン酸化による)。
【０２２２】
【図６８】図６８：ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性に対するＤＧＫの欠失の影響。標的細胞死滅パーセントを、種々のエフェクター：標的比で評価する。
【０２２３】
【図６９】図６９：ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生および放出に対するＤＧＫの欠失の影響。ＩＦＮγの濃度を、種々のエフェクター：標的比で評価する。
【０２２４】
【図７０】図７０：ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞のＥＲＫシグナル伝達またはＴ細胞活性化に対するＤＧＫの欠失の影響。Ｂ：アルブミン、Ｍ：メソテリン、３／２８：ＣＤ３／ＣＤ２８刺激細胞。
【０２２５】
【図７１】図７１：細胞毒性活性に関するｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞のＴＧＦβ感受性に対するＤＧＫの欠失の影響。
【０２２６】
【図７２】図７２Ａおよび７２Ｂ：腫瘍マウスモデルにおけるｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞の治療有効性に対するＤＧＫの欠失の影響。Ａ)抗腫瘍活性に対する影響を、経時的腫瘍体積により示す。Ｂ)腫瘍浸潤性細胞の持続および増殖。
【０２２７】
【図７３】図７３Ａ、７３Ｂ、７３Ｃ、７３Ｄ、７３Ｅおよび７３Ｆは、イカロスのレベルが低下したＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるサイトカイン産生および細胞毒性メディエーター放出を示す。図７３Ａは、フローサイトメトリー(左パネル)およびウェスタンブロット(右パネル)で測定した、野生型およびＩｋｚｆ１＋／−  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるイカロス発現を示す。メソテリン被覆ビーズ、ＰＭＡ／イオノマイシン(ＰＭＡ／Ｉ)またはＢＳＡ被覆ビーズ(対照)で刺激後、ＩＦＮ−γ(図７３Ｂ)、ＴＮＦ−α(図７３Ｃ)およびＩＬ−２(図７３Ｄ)、細胞毒性メディエーターグランザイムＢ(図７３Ｅ)およびＣＤ１０７ａ発現(図７３Ｆ)を産生する細胞のパーセンテージを決定した。
【０２２８】
【図７４】図７４Ａ、７４Ｂおよび７４Ｃ：イカロスのドミナントネガティブアレル(ＩｋＤＮ)を有するＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるサイトカイン産生および細胞毒性メディエーター放出。メソテリン被覆ビーズ、ＰＭＡ／イオノマイシン(ＰＭＡ／Ｉ)またはＢＳＡ被覆ビーズ(対照)で刺激後、ＩＦＮ−γ(図７４Ａ)、ＩＬ−２(図７４Ｂ)およびＣＤ１０７ａ発現(図７４Ｃ)を産生する細胞のパーセンテージを決定した。
【０２２９】
【図７５】図７５Ａ、７５Ｂ、７５Ｃ、７５Ｄおよび７５Ｅ。イカロスの枯渇は、抗原刺激後のＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化およびシグナル伝達を増強しなかった。Ｉｋｚｆ１＋／−  ＣＡＲ  Ｔ細胞における記載する時点でのＣＤ６９(図７５Ａ)、ＣＤ２５(図７５Ｂ)および４−１ＢＢ(図７５Ｃ)のレベルを、フローサイトメトリーにより決定した。図７５Ｄにおいて、ＲＡＳ／ＥＲＫシグナル伝達経路を、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でのＴＣＲ刺激後に、野生型(ＷＴ)およびイカロスドミナントネガティブ細胞(ＩｋＤＮ)で試験した。リン酸化ＰＬＣγ、リン酸化Ｌｃｋ、リン酸化ＪＮＫ、リン酸化Ａｋｔ、リン酸化ＥＲＫ、リン酸化ＩＫＫαおよびＩκＢαのようなリン酸化ＴＣＲシグナル伝達タンパク質のレベルを、ウェスタンブロットにより評価した。図７５Ｅにおいて、ＭｅｓｏＣＡＲを形質導入したＷＴおよびＩｋＤＮ細胞をＢＳＡまたはメソテリン被覆ビーズで刺激し、下流シグナル伝達経路を、リン酸化ＥＲＫおよびリン酸化ＰＬＣγのレベルを評価することによるウェスタンブロットにより試験した。
【０２３０】
【図７６】図７６Ａ、７６Ｂ、７６Ｃ、７６Ｄおよび７６Ｅ：ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるイカロスの減少は、インビトロで標的細胞ＡＥ１７またはメソテリン発現ＡＥ１７(ＡＥ１７  ｍｅｓｏ)に対する応答を増強する。図７６Ａは、記載するエフェクター：標的細胞比でのＷＴおよびＩｋｚｆ１＋／−  ｍｅｓｏ  ＣＡＲＴ細胞におけるＩＦＮγ産生を示す。ｍｅｓｏ  ＣＡＲ発現ＷＴおよびＩｋｚｆ１＋／−(図７６Ｂ)およびＩｋＤＮ(図７６Ｃ)の細胞溶解を記載するエフェクター：標的細胞比で測定した。記載するエフェクター：標的細胞比でで形質導入したＷＴおよびＩｋｚｆ１＋／−のＩＦＮγ産生(図７６Ｄ)および細胞溶解(図７６Ｅ)を測定し、ここで、標的細胞は、ＦＡＰ発現３Ｔ３細胞であった。
【０２３１】
【図７７】図７７Ａ、７７Ｂおよび７７Ｃ：インビボでの確立された腫瘍に対するイカロスが枯渇したＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、確立されたメソテリン発現ＡＥ１７腫瘍を担持するマウスに投与した。ｍｅｓｏＣＡＲ発現ＷＴおよびＩｋｚｆ１＋／−(図７７Ａ)またはＩｋＤＮ(図７７Ｂ)の投与後、腫瘍体積を測定した。ＦＡＰ−ＣＡＲ発現ＷＴおよびＩｋｚｆ１＋／−の投与後、腫瘍体積を測定した(図７５Ｃ)。
【０２３２】
【図７８】図７８Ａ、７８Ｂ、７８Ｃ、７８Ｄ、７８Ｅおよび７８Ｆ：ＷＴ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した、免疫抑制性腫瘍微小環境におけるＩｋｚｆ１＋／−  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続および抵抗の増加。ＣＡＲ発現ＷＴまたはＩｋｚｆ１＋／細胞(ＧＦＰ陽性)のパーセンテージを、脾臓(図７８Ａ)および腫瘍(図７８Ｂ)から採取したフローサイトメトリーにより検出した。注入３日後に脾臓または腫瘍から採取したＣＡＲ  Ｔ細胞の機能的能力を、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体(図７８Ｃ)またはＰＭＡ／イオノマイシン(ＰＭＡ／Ｉ)(図７８Ｄ)での刺激後のＩＦＮγ産生の測定により評価した。制御性Ｔ細胞(ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋発現)およびマクロファージ(ＣＤ２０６発現)を、注入９日後に脾臓または腫瘍から採取したＣＡＲ  Ｔ細胞上のＴｒｅｇまたはマクロファージマーカーの発現の測定により評価した。
【０２３３】
【図７９】図７９Ａおよび７９Ｂ：イカロスレベルが低いＴ細胞は、可溶性阻害因子ＴＧＦβおよびアデノシンに対し低感受性である。ＭｅｓｏＣＡＲ発現ＷＴ、Ｉｋｚｆ１＋／−およびＩｋＤＮ細胞を、ＴＧＦ−βまたはアデノシンに応答してＩＦＮγ(図７９Ａ)および細胞毒性(図７９Ｂ)を産生する能力について試験した。
【０２３４】
【図８０】図８０Ａおよび８０Ｂは、癌細胞株およびＣＡＲＴ細胞上のＩＬ−７受容体(ＣＤ１２７)発現を示す。ＲＬ(マントル細胞リンパ腫)、ＪＥＫＯ(Ｊｅｋｏ−１としても知られる、マントル細胞リンパ腫)およびＮａｌｍ−６(Ｂ−ＡＬＬ)(図８０Ａ)の３種の癌細胞株におけるＣＤ１２７の発現を、フローサイトメトリー分析で測定した。ＮＳＧマウスに注入され、循環しているＣＤ３陽性(ＣＡＲＴ)細胞上のＣＤ１２７発現を、フローサイトメトリー分析で測定した(図８０Ｂ)。
【０２３５】
【図８１】図８１Ａ、８１Ｂおよび８１Ｃは、ＣＡＲＴ１９処置と続くＩＬ−７処置後の抗腫瘍応答を示す。０日目にルシフェラーゼ発現マントルリンパ腫細胞株(ＲＬ−ｌｕｃ)を移植したＮＳＧマウスを、種々の用量のＣＡＲＴ１９細胞で６日目に処置し、腫瘍負荷をモニターした。マウス４群に分け、ＣＡＲＴ１９細胞を受けないか、０.５×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞(ＣＡＲＴ１９  ０.５Ｅ６)、１×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞(ＣＡＲＴ１９  １Ｅ６)または２×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞(ＣＡＲＴ１９  ２Ｅ６)を受けた。ＣＡＲＴ処置後の腫瘍負荷を、バイオルミネセンス(平均ＢＬＩ)の検出により測定した(図８１Ａ)。０.５×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞(ＣＡＲＴ１９  ０.５Ｅ６)または１×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞(ＣＡＲＴ１９  １Ｅ６)を受けたマウスを、組み換えヒトＩＬ−７(ｒｈＩＬ−７)を受けるか受けないかに無作為化した。平均バイオルミネセンス(ＢＬＩ)により表される腫瘍負荷を、図８１Ａからの３匹のマウス(＃３８２７、＃３８２９および＃３８１５、記載する初期ＣＡＲＴ１９用量を受けた)でモニターし、これらは、８５日目から開始するＩＬ−７を受けた(図８１Ｂ)。ＩＬ−７を、週３回のＩＰ注射により投与した。８５日目前(ＰＲＥ)および１１５日目後(ＰＯＳＴ)の、ここでは平均バイオルミネセンス(ＢＬＩ)により表す腫瘍負荷を、ＩＬ−７を受けなかったマウス(ＣＴＲＬ)およびＩＬ−７処置を受けたマウス(ＩＬ−７)で比較した(図８１Ｃ)。
【０２３６】
【図８２】図８２Ａおよび８２Ｂは、ＩＬ−７処置後のＴ細胞動態を示す。血中に検出されるヒトＴ細胞のレベルを、ＩＬ−７を受けたマウスまたは対照マウスの各々でモニターした(図８２Ａ)。ＩＬ−７処置開始前(ＰＲＥ)および１４日後(１４日目)に、血中で検出されるＣＡＲＴ１９細胞(ＣＤ３＋細胞)のレベルを測定した(図８２Ｂ)。
【０２３７】
【図８３】図８３は、フローサイトメトリーにより検出される、ＩＬ−７受容体(ＩＬ−７Ｒ)発現を示す一連の画像である。上のパネルは、白血病細胞におけるＩＬ−７Ｒを示す：ＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ１４(上の左)、Ｂ−ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６(上の真ん中)および初代ＡＭＬ(上の右)。下のパネルは、ＣＡＲＴ処置を受けたＡＭＬのマウスモデルにおける再発後のＡＭＬ細胞におけるＩＬ−７Ｒを示す：非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)(下の左)、ＣＡＲＴ３３処置マウス(下の真ん中)およびＣＡＲＴ１２３処置マウス(下の右)。
【０２３８】
【図８４】図８４は、ＮＳＧマウスにルシフェラーゼ＋  ＭＯＬＭ１４を移植し、非形質導入細胞(ＵＴＤ)、ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３で処置し、腫瘍負荷を評価するための連続的ＢＬＩが続く、実験的スキーマを示す。初期疾患応答後に再発を経験したマウスを無作為化して、処置を受けない(ＩＬ−７無し)または週３回ＩＬ−７  ２００ｎｇ  ＩＰを受けさせた。連続的ＢＬＩを、腫瘍負荷、生存およびＴ細胞増殖を評価するために実施した。
【０２３９】
【図８５】図８５Ａ、８５Ｂおよび８５Ｃは、ＣＡＲＴ処置と続くＩＬ−７処置後の抗腫瘍応答を示す。ルシフェラーゼ発現ＭＯＬＭ１４細胞を移植したＮＳＧマウスを、非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)、ＣＡＲＴ３３細胞またはＣＡＲＴ１２３細胞で処置した。ＣＡＲＴ処置後の腫瘍負荷をバイオルミネセンス造影(ＢＬＩ)により測定した(図８５Ａ)。ＣＡＲＴ１２３またはＣＡＲＴ３３を受けたマウスは、最初はＴ細胞処置に応答したが、Ｔ細胞１４日後までに再発した。これらのマウスを、２８日目にＩＬ−７での処置をするかしないかに割り振った。ＩＬ−７(ＩＬ−７)または対照処置(ＩＬ−７なし)後の腫瘍負荷をバイオルミネセンス造影(ＢＬＩ)により測定した(図８５Ｂ)。ＩＬ−７処置中のバイオルミネセンス造の代表的画像を図８５Ｃに示す。
【０２４０】
【図８６】図８６Ａおよび８６Ｂは、再発したＡＭＬモデルにおけるＩＬ−７処置後のＴ細胞増殖および生存を示す。ＩＬ−７処置は、腫瘍負荷の減少と相関するＴ細胞増殖を生じた(図８６Ａ)：Ｔ細胞増殖を、血中のＴ細胞の測定により評価し(右Ｙ軸、バイオルミネセンス造影(ＢＬＩ、左Ｙ軸)と比較した。ＩＬ−７処置または対照を受けたマウスの生存を、ＭＯＬＭ１４注射時からモニターした(図８６Ｂ)。
【０２４１】
【図８７】図８７。この模式図は、ＲＣＡＲ配置の２例の構造を示す。抗原結合メンバーは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびスイッチドメインを含む。細胞内結合メンバーは、スイッチドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。２種の配置は、ここに記載する第一スイッチドメインおよび第二スイッチドメインが、抗原結合メンバーおよび細胞内結合メンバーに対して異なる配向であってよいことを示す。他のＲＣＡＲ配置は、ここにさらに記載される。
【０２４２】
【図８８】図８８Ａ、８８Ｂは、αＦＲ解離アッセイの結果を示す一連のグラフである。Ｃ４−２７ｚまたはＭＯｖ１９−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を組み換えビオチニル化αＦＲタンパク質で標識し、次いで、３７℃(図８８Ａ)または４℃(図８８Ｂ)で、経時的アッセイにおいて、過剰の非ビオチニル化αＦＲ存在下インキュベートした。保持αＦＲパーセント(ｙ軸)を標準化し、平均蛍光強度(ＭＦＩ)インキュベーション後÷インキュベーション前ＭＦＩ×１００として採点した。
【０２４３】
【図８９】図８９は、ビオチニル化αＦＲタンパク質のαＦＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞への結合に対する力価測定分析を示すグラフである。３回の独立した実験からの代表的実験結果を示す。
【０２４４】
【図９０】図９０Ａ、９０Ｂ、９０Ｃ、９０Ｄ、９０Ｅ：インビトロおよびインビボでのＣ４  ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞の抗腫瘍活性。(Ａ)記載するＥ／Ｔ比での１８時間バイオルミネセンスアッセイにおける、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるαＦＲ発現腫瘍細胞ＳＫＯＶ３の細胞毒性。非形質導入(ＵＮＴ)Ｔ細胞およびＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、陰性エフェクター対照として役立った。Ｃ３０細胞は、陰性標的細胞対照として役立った。腫瘍細胞生存能パーセントを、(実験サンプルの平均発光−背景／アッセイに使用した標的細胞の投入数の平均発光−背景)×１００として計算した。全てのデータを３ウェルの平均として示す。(Ｂ)確立されたｓ.ｃ.腫瘍を担持するＮＳＧマウスを、腫瘍接種後４０日目に１×１０７  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞の静脈内(ｉ.ｖ.)注射により処置した。腫瘍増殖を、キャリパー測定により評価した[Ｖ＝１／２(長さ×幅２)]。(Ｃ)腫瘍進行をインビボバイオルミネセンス造影により追跡した。ＣＤ２７シグナルの取り込みはインビボで抗腫瘍活性を増強した；Ｃ４−２７ｚ  Ｔ細胞治療は、ＣＤ２７共刺激ドメインを欠くＣ４−ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞での治療より優れていた。(Ｄ)ＮＳＧマウスは、３×１０  ＳＫＯＶ３  ｆＬｕｃ腫瘍細胞のｉ.ｐ.注射を受け、３群に無作為化後、腫瘍接種後２１日目および２５日目のｉ.ｖ.点滴によりＵＮＴ  Ｔ細胞またはＣ４−２７ｚもしくはＣＤ１９−２７ｚ  ＣＡＲを発現するＴ細胞による治療を開始した。バイオルミネセンス画像は、２回目のｉ.ｖ.注射の直前および２週間後の、ＮＳＧマウスにおけるｆＬｕｃ＋  ＳＫＯＶ３腫瘍を示す。(Ｅ)腫瘍接種後２１日目および２５日目の１×１０７  ＣＡＲ−Ｔ細胞の２回目のｉ.ｖ.注射の前および２週間後に、ｆＬｕｃ腫瘍細胞からの光子放射を定量し、平均±ＳＤバイオルミネセンスシグナルを決定した。２回目の細胞注射１４日後に、Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞群と対照Ｔ細胞群で腫瘍負荷に有意差があった(ｐ＝０.００２)。これらの結果は、Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が介在する抗腫瘍活性が、インビボで抗原特異的であったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０２４５】
詳細な記載
定義
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されているのと同じ意味を有する。
【０２４６】
ここで使用する単数表現は、冠詞の文法的目的語が１または１を超えること(すなわち、少なくとも１)を意味する。例えば、“成分”は１の成分または１を超える成分を意味する。
【０２４７】
ここで使用する用語としての“約”は、量、期間などのような測定可能な値を記載するとき、特定値からの±２０％またはいくつかの態様においては±１０％またはいくつかの態様においては±５％またはいくつかの例においては±１％またはいくつかの態様においては±０.１％の変動を、このような変動が開示する方法の実施に適切である限り、包含することを意図する。
【０２４８】
用語“キメラ抗原受容体”またはあるいは“ＣＡＲ”は、免疫エフェクター細胞におけるとき、標的細胞、概して癌細胞に対する特異性および細胞内シグナル産生を備えた細胞を提供する、概して最も単純な態様において２個の、一連のポリペプチドをいう。ある態様において、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび下に定義する刺激分子および／または共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)を含む。ある面において、一連のポリペプチドは、互いに隣接している。ある態様において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在下、ポリペプチドを互いに連結できる、例えば、抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結できる、二量体化スイッチを含む。ある面において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と結合するゼータ鎖である。ある面において、細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、下に定義する少なくとも１共刺激分子由来の１以上の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある面において、共刺激分子は、ここに記載する共刺激分子、例えば、４−１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８から選択される。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに１以上の共刺激分子由来の２個の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインならびに少なくとも１以上の共刺激分子由来の２個の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ−ｔｅｒ)に任意のリーダー配列を含む。ある面において、ＣＡＲは、さらに、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は、所望により、細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞膜への局在化の間に、抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)から開裂される。
【０２４９】
ここに記載するもののような特異的腫瘍マーカーＸを標的とする抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖまたはＴＣＲ)を含むＣＡＲはまたＸＣＡＲと呼ぶ。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲを、ＣＤ１９ＣＡＲと呼ぶ。
【０２５０】
用語“シグナル伝達ドメイン”は、第二メッセンジャーを産生することによりまたはこのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、規定されたシグナル伝達経路を経て細胞活性を制御するために、細胞内で情報を伝達することにより作用する、タンパク質の機能的部分をいう。
【０２５１】
ここで使用する用語“抗体”は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列をいう。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、複数鎖または一本鎖または完全免疫グロブリンであってよく、天然源または組み換え源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
【０２５２】
用語“抗体フラグメント”は、抗原のエピトープと特異的に相互作用(例えば、結合、立体障害、安定化／脱安定化、空間分布により)する能力を維持する、抗体の少なくとも一つの部分をいう。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ(ｓｄＦｖ)、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、直線状抗体、ｓｄＡｂ(ＶＬまたはＶＨのいずれか)のような単一ドメイン抗体、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成された多特異的抗体および単離ＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、二重特異的抗体、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗原結合フラグメントを、フィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づき、足場に移植できる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する、米国特許６,７０３,１９９参照)。
【０２５３】
用語“ｓｃＦｖ”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントを含む融合タンパク質をいい、ここで、軽鎖および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短可動性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、単一鎖ポリペプチドとして発現されることができ、ｓｃＦｖは、それが由来する完全抗体の特異性を維持する。断らない限り、ここで使用するｓｃＦｖは、ＶＬおよびＶＨ可変領域をいずれの順番でもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に対して、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでよく、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでよい。
【０２５４】
本発明のＣＡＲの抗体またはその抗体フラグメントを含む部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、ヒト化抗体または二重特異的抗体を含む、隣接するポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。あるＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(“Ｋａｂａｔ”番号付けスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948(“Ｃｈｏｔｈｉａ”番号付けスキーム)に記載のものまたはこれらの組み合わせを含む、任意の数の周知のスキームを使用して、決定できる。
【０２５５】
ここで使用する用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、少なくとも１免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントをいう。用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、抗体および抗体フラグメントを含む。ある態様において、抗体分子は、多特異的抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、複数のドメインの第一免疫グロブリン可変ドメイン配列は第一エピトープに結合特異性を有し、複数のドメインの第二免疫グロブリン可変ドメイン配列は第二エピトープに結合特異性を有する。ある態様において、多特異的抗体分子は、二重特異的抗体分子である。二重特異的抗体は、２を超える抗原に特異性を有しない。二重特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
【０２５６】
本発明のＣＡＲの抗体またはその抗体フラグメントを含む部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、ヒト化抗体または二重特異的抗体を含む、隣接するポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【０２５７】
用語“抗体重鎖”は、抗体分子の天然に存在する立体構造において存在するポリペプチド鎖の２タイプの大きいほうをいい、通常抗体が属するクラスを決定する。
【０２５８】
用語“抗体軽鎖”は、抗体分子の天然に存在する立体構造において存在するポリペプチド鎖の２タイプの小さいほうをいう。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、２個の主用な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
【０２５９】
用語“組み換え抗体”は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系により発現された抗体のような、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生される抗体をいう。本用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により産生された抗体および該ＤＮＡ分子が抗体タンパク質または抗体を特定化するアミノ酸配列を発現し、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列が、当分野で利用可能であり、周知である組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列テクノロジーを利用して得られているものを意味すると解釈すべきである。
【０２６０】
用語“抗原”または“Ａｇ”は、免疫応答を惹起する分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特定の免疫担当細胞の活性化または両者を含み得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含むあらゆる巨大分子が抗原として役立ち得ることを理解する。さらに、抗原は、組み換えまたはゲノムＤＮＡ由来であり得る。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、したがって、ここで使用される用語としての“抗原”をコードすると理解する。さらに、当業者は、抗原がもっぱら遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってコードされる必要がないことを理解する。本発明は、１を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を惹起するポリペプチドをコードするために多様な組み合わせで配置されることを含むが、これらに限定されないことは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原がそもそも“遺伝子”によりコードされる必要がないことを理解する。抗原は、合成により産生できまたは生物学的サンプルに由来できまたはポリペプチド以外の巨大分子であるはずであることは明らかである。このような生物学的サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的要素を伴う液体を含み得るが、これらに限定されない。
【０２６１】
用語“抗癌効果”は、例えば、腫瘍体積減少、癌細胞数減少、転移数減少、余命延長、癌細胞増殖減少、癌細胞生存率低下または癌性状態と関係する多様な生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない多様な手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。“抗癌効果”はまた、まず第一に癌の出現の予防におけるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても顕在化され得る。用語“抗腫瘍効果”は、例えば、腫瘍体積減少、腫瘍細胞数減少、腫瘍細胞増殖減少または腫瘍細胞生存率低下を含むが、これらに限定されない多様な手段により顕在化され得る生物学的効果をいう。
【０２６２】
用語“自己”は、後に再導入される個体と同じ個体に由来するあらゆる物質をいう。
【０２６３】
用語“同種”は、物質が導入される個体と同じ種の異なる個体由来のあらゆる物質をいう。一箇所以上の座位における遺伝子が同一でないとき、２つ以上の個体は、互いに同種異系ということができる。ある面において、同じ種の個体からの同種異系物質は遺伝的に充分異なり得て、抗原的に相互作用する。
【０２６４】
用語“異種”は、異なる種の動物由来の移植片を意味する。
【０２６５】
用語“癌”は、異常な細胞の無制御の増殖により特徴付けられる疾患である。癌細胞は局所的にまたは血流およびリンパ系を通して体の他の部分に広がることができる。多様な癌の例をここに記載し、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。用語“腫瘍”および“癌”はここでは交換可能に使用し、例えば、いずれの用語も固形および液体の、例えば、汎発性のまたは循環している、腫瘍を含む。ここで使用する用語“癌”または“腫瘍”は前悪性、ならびに悪性癌および腫瘍を含む。
【０２６６】
“に由来する”は、該用語がここで使用されている限り、第一分子と第二分子の相関を示す。それは一般に第一分子と第二分子の構造的類似性をいい、第二分子に由来する第一分子に対する過程または起源の限定を示唆または包含しない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを産生する能力を有するように、十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。それは、細胞内シグナル伝達ドメインを産生する特定の過程の限定を示唆または包含せず、例えば、それは、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、該細胞内シグナル伝達ドメインに到達するために、ＣＤ３ゼータ配列から出発し、望まない配列を除去するかまたは変異を付与しなければならないことを意味しない。
【０２６７】
擁護“ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患”は、例えば、癌または悪性腫瘍のような増殖性疾患または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態を含み、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患またはここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞と関係する状態；またはここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含むが、これらに限定されない。ある面において、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する癌は、血液癌である。ある面において、ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する癌は、固形癌である。さらにここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患は、例えば、非典型的および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性がここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する疾患を含むが、これらに限定されない。ここに記載する腫瘍抗原の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患、(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、またはどの時点でも発現した。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常レベルでまたは低下したレベルで存在し得る。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質をある点で産生し、その後、検出可能な腫瘍抗原タンパク質を実質的に産生しない。
【０２６８】
用語“保存的配列修飾”は、該アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特性に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準法により、本発明の抗体または抗体フラグメントに導入できる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。それゆえに、本発明のＣＡＲ内の１以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー内の他のアミノ酸残基に置き換えることができ、改変されたＣＡＲを、ここに記載する機能的アッセイを使用して試験できる。
【０２６９】
用語“刺激”は、刺激分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ)とその同族リガンド(またはＣＡＲの場合腫瘍抗原)の結合により誘導され、それにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達または適切なＮＫ受容体またはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを介するシグナル伝達のような、しかし、これらに限定されないシグナル伝達事象に介在する、一次応答をいう。刺激は、ある分子の改変された発現に介在し得る。
【０２７０】
用語“刺激分子”は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともある面について刺激方向に免疫細胞の活性化を盛業する、細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞)により発現される分子をいう。ある面において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドと充填されたＭＨＣ分子の結合により、開始され、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の仲介にいたる、一次シグナルである。刺激方向で作用する一次細胞質シグナル伝達配列(別名“一次シグナル伝達ドメイン”)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られる、シグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用である細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明の特異的ＣＡＲにおいて、任意の１以上の本発明のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特異的ＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１８として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。本発明の特異的ＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号２０として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。
【０２７１】
用語“抗原提示細胞”または“ＡＰＣ”は、主要組織適合遺伝子複合体(ＭＨＣ)とその表面で複合体化した外来性抗原を呈示する、アクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示させる。
【０２７２】
“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、該用語がここで使用される限り、分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを産生する。例えば、ＣＡＲＴ細胞における、免疫エフェクター機能の例は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解性活性およびヘルパー活性を含む。
【０２７３】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。代表的一次細胞内シグナル伝達ドメインは、一次刺激または抗原依存的刺激
を担う分子由来のものを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性細胞内ドメインを含む。代表的共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナルまたは抗原非依存的刺激を担う分子由来のものを含む。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含むことができる。
【０２７４】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。
【０２７５】
用語“ゼータ”またはあるいは“ゼータ鎖”、“ＣＤ３ゼータ”または“ＴＣＲ−ゼータ”は、GenBan Acc. No. BAG36664.1として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基として規定され、“ゼータ刺激ドメイン”またはあるいは“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”または“ＴＣＲ−ゼータ刺激ドメイン”は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分な、ゼータ鎖またはその機能的誘導体の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として規定される。ある面において、ＣＤ３ゼータの細胞質ドメインは、GenBank Acc. No. BAG36664.1の残基５２〜１６４またはその機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基を含む。ある面において、“ゼータ刺激ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”は配列番号１８として提供される配列である。ある面において、“ゼータ刺激ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”は配列番号２０として提供される配列である。
【０２７６】
用語“共刺激分子”は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、増殖のような、しかし、これに限定されないＴ細胞による共刺激応答を仲介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーをいう。共刺激分子は、効率的免疫応答に寄与する抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)を含むが、これらに限定されない。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されない。
【０２７７】
共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、次のタンパク質ファミリーで表される：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)および活性化ＮＫ細胞受容体。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。
【０２７８】
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子またはその機能的フラグメントまたは誘導体の細胞内部分全体または天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体を含み得る。
【０２７９】
用語“４−１ＢＢ”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基を有する、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーをいい、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2のアミノ酸残基２１４〜２５５または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基として規定される。ある面において、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、配列番号１４として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。
【０２８０】
“免疫エフェクター細胞”は、その用語がここで使用される限り、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞および骨髄系由来貪食細胞を含む。
【０２８１】
“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、その用語がここで使用される限り、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の、機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅を促進するまたは増殖もしくは拡大を阻止するＴ細胞またはＮＫ細胞の特性をいう。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激が免疫エフェクター機能または応答の例である。
【０２８２】
用語“コードする”は、生物学的過程において、規定されたヌクレオチド配列(例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)または規定されたアミノ酸配列を有する他のポリマーおよび巨大分子を合成するための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおける特異的ヌクレオチド配列の固有の特性およびそれに由来する生物学的特性をいう。それゆえに、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および遺伝子またはｃＤＮＡの転写用鋳型として使用する非コード鎖は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするということができる。
【０２８３】
特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの変性バージョンであるおよび同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。用語タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はまたタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンでイントロンを含み得る限り、イントロンも含み得る。
【０２８４】
用語“有効量”または“治療有効量”はここでは交換可能に使用し、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、ここに記載する化合物、製剤、物質または組成物の量をいう。
【０２８５】
用語“内在性”は、生物、細胞、組織もしくは系内部からのまたは生物、細胞、組織もしくは系の内部で産生されたあらゆる物質をいう。
【０２８６】
用語“外来性”は、生物、細胞、組織もしくは系外部からのまたは生物、細胞、組織もしくは系の外部で産生されたあらゆる物質をいう。
【０２８７】
用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をいう。
【０２８８】
用語“移送ベクター”は、単離核酸を含むおよび単離核酸の細胞への送達に使用できる、組成物をいう。直線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない多数のベクターが当分野で知られる。それゆえに、用語“移送ベクター”は、自己複製するプラスミドまたはウイルスをいう。本用語は、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への移入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むとも解釈すべきである。ウイルス移入ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
【０２８９】
用語“発現ベクター”は、発現させるべきヌクレオチド配列に操作可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なｃｉｓ作用領域を含み、他の発現のための要素は、宿主細胞によりまたはインビトロ発現系において供給できる。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを取り込む、コスミド、プラスミド(例えば、ネイキッドのまたはリポソームに含まれた)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス)を含む、当分野で知られる全てのこのようなものを含む。
【０２９０】
用語“レンチウイルス”は、レトロウイルス科ファミリーをいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できる点でレトロウイルスの中で独特であり、相当量の遺伝的情報を宿主細胞のＤＮＡに送達でき、それゆえに、遺伝子送達ベクターの最も効率的方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
【０２９１】
用語“レンチウイルスベクター”は、特にMilone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)に提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部由来のベクターをいう。臨床施設において使用し得るレンチウイルスベクターの他の例は、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸＴＭベクター系などを含むが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られる。
【０２９２】
用語“相同”または“同一性”は、２重合分子間、例えば、２ＤＮＡ分子または２ＲＮＡ分子のような、２核酸分子間または２ポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性をいう。２分子の両者におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットにより占拠されているとき、例えば、２ＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンで占拠されているならば、それらは、その位置について相同または同一である。２配列間の相同性は、整合または相同位置の数の直接の関数であり、例えば、２配列の位置の半分(例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５位置)が相同であるならば、２配列は５０％相同であり、位置の９０％(例えば、１０中９)が整合しているまたは相同であるならば、２配列は９０％相同である。
【０２９３】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列)である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体および抗体そのフラグメントは、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)であり、ここで、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基で置き換わっている。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基が、対応する非ヒト残基により置き換わっている。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない、残基を含む。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメント性能をさらに精緻化し、最適化する。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、少なくとも１および一般に２、可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンに対応し、ＦＲ領域の全てまたは相当部分はヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、一般にヒト免疫グロブリンのものも含み得る。さらなる詳細について、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照のこと。
【０２９４】
“完全ヒト”は、分子全体がヒト起源であるまたは抗体または免疫グロブリンのヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントのような免疫グロブリンをいう。
【０２９５】
用語“単離されている”は、天然状態から改変されているまたは取り出されていることを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、その天然状態で共存する物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは“単離されている”。単離核酸またはタンパク質は実質的に純粋な形態で存在できまたは、例えば、宿主細胞のような非天然環境で存在できる。
【０２９６】
本発明の文脈において、普通に存在する核酸塩基について、次の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンをいい、“Ｃ”はシトシンをいい、“Ｇ”はグアノシンをいい、“Ｔ”はチミジンをいい、“Ｕ”はウリジンをいう。
【０２９７】
用語“操作可能に連結”または“転写制御”は、異種核酸配列の発現を生じる、制御性配列と異種核酸配列の間の機能的結合をいう。例えば、第一核酸配列が、第二核酸配列と機能的関係に配置されているとき、第一核酸配列は第二核酸配列に操作可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響するならば、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結している。操作可能に連結したＤＮＡ配列は互いに隣接していてよく、例えば、２個のタンパク質コード領域を合わせるために必要であれば、同じリーディングフレーム内にある。
【０２９８】
免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)または胸骨内、腫瘍内注射または点滴法をいう。
【０２９９】
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)およびそのポリマーをいう。特に限定しない限り、本用語は、対照核酸と類似する結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似する方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸をいう。特に断らない限り、特定の核酸配列はまたその保存的に修飾されたバリアント(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列ならびに明示的に示される配列を包含するもとも含意される。特異的に、縮重コドン置換は、１以上の選択した(または全ての)コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている、配列の産生により達成され得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
【０３００】
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は交換可能に使用し、ペプチド結合により共有結合的に連結されるアミノ酸残基からなる化合物をいう。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２アミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチド配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに結合した２以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。ここで使用する本用語は、例えば、当分野でペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも一般に呼ばれる短鎖および当分野で一般にタンパク質と呼ばれ、多くのタイプが存在する長鎖の両者をいう。“ポリペプチド”は、とりわけ、例えば、生物学的活性フラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
【０３０１】
用語“プロモーター”は、細胞の合成機構または導入された合成機構により認識され、ポリヌクレオチド配列の特定の転写の開始に必要なＤＮＡ配列をいう。
【０３０２】
用語“プロモーター／制御配列”は、プロモーター／制御配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要である核酸配列をいう。いくつかの例において、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例において、この配列はまた遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の制御要素も含み得る。プロモーター／制御性配列は、例えば、組織特異的態様で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【０３０３】
用語“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定化するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、細胞の大部分または全部の生理学的条件下で、細胞において遺伝子産物の産生をさせる、ヌクレオチド配列をいう。
【０３０４】
用語“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定化するポリヌクレオチドと操作可能に連結し、実質的にプロモーターに対応するインデューサーが細胞に存在するときのみ、遺伝子産物の産生をさせる、ヌクレオチド配列をいう。
【０３０５】
用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定化するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときのみ、遺伝子産物の産生をさせる、ヌクレオチド配列をいう。
【０３０６】
用語“癌関連抗原”または“腫瘍抗原”は、交換可能に、癌細胞の表面上に、全体的にまたはフラグメントとして発現し(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)、薬物が癌細胞を優先的にターゲティングするのに有用である、分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)をいう。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞および癌細胞の両者に発現するマーカー、例えば、細胞系譜マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過発現している、例えば、正常細胞と比較して１倍過発現、２倍過発現、３倍過発現またはそれ以上過発現している細胞表面分子である。ある態様において、腫瘍抗原は、癌細胞で不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞で発現する分子と比較して欠失、付加または変異を含む分子である。ある態様において、腫瘍抗原は、癌細胞の細胞表面上に排他的に、全体的にまたはフラグメントとして発現し(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)、正常細胞の表面上では合成されず、または発現しない。ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドと結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＣＡＲを含む。通常、内在性タンパク質由来のペプチドは、主要組織適合抗原複合体(ＭＨＣ)クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)により認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全有核細胞により構成的に発現する。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の独特なクラスを表す。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況においてウイルスまたは腫瘍抗原由来のペプチドを標的化するＴＣＲ様抗体が記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーのようなライブラリーのスクリーニングにより同定できる。
【０３０７】
用語“腫瘍支持抗原”または“癌支持抗原”は、細胞の表面上に発現される分子(一般にタンパク質、炭水化物または脂質)を交換可能に表し、これは、それ自体癌性ではないが、例えば、増殖または生存、例えば、免疫細胞に対する抵抗の増強により、癌細胞を支持する。このタイプの代表的細胞は、間質細胞および骨髄球由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)を含む。腫瘍支持抗原自体、抗原が癌細胞を支持する細胞上に呈示される以上、腫瘍細胞の支持において役割を果たす必要はない。
【０３０８】
ｓｃＦｖの文脈において使用する用語“可動性ポリペプチドリンカー”または“リンカー”は、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を合わせるために、単独でまたは組み合わせて使用される、グリシンおよび／またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーをいう。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(式中、ｎは１以上の正の整数である)を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３。ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０(配列番号２８)。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２９)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号３０)を含むが、これらに限定されない。他の態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)の複数反復(配列番号３１)を含む。ＷＯ２０１２／１３８４７５号(本明細書に引用により包含させる)に記載のリンカーも本発明の範囲内に包含される。
【０３０９】
ここで使用する、５’キャップ(ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ  ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも呼ぶ)は、転写開始点の直ぐ後の真核メッセンジャーＲＮＡの“前面”または５’末端に付加されている、修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初の転写ヌクレオチドに連結する末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は転写と連動し、各々が互いに影響し合うように共転写的に起こる。転写開始の直ぐ後、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと結合するキャップ合成複合体により結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応である。合成は、多工程生化学反応として進行する。キャッピング部分は、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能性を調節するように修飾できる。
【０３１０】
ここで使用する、“インビトロ転写ＲＮＡ”は、インビトロで合成されているＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである。一般に、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡを産生するために使用される鋳型を含む。
【０３１１】
ここで使用する、“ポリ(Ａ)”は、ｍＲＮＡにポリアデニル化により結合している一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい態様において、ポリＡは５０〜５０００(配列番号３４)であり、好ましくは６４を超え、より好ましくは１００を超え、最も好ましくは３００または４００を超える。ポリ(Ａ)配列は、局在化、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡ機能性を調節するために、化学的または酵素的に修飾され得る。
【０３１２】
ここで使用する、“ポリアデニル化”は、ポリアデニリル部分またはその修飾変異体の、メッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合をいう。真核生物において、大部分のメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は、３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用を介してプレｍＲＮＡに付加された、アデニンヌクレオチドの長い配列(しばしば数百)である。高等真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物上に付加される。ポリ(Ａ)テイルおよびそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護することを助ける。ポリアデニル化はまた転写終結、ｍＲＮＡの核からの輸出および翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、核内でＤＮＡのＲＮＡへの転写直後に起こるが、さらに後に細胞質でも起こり得る。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により開裂される。開裂部位は、通常開裂部位近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在により特徴付けられる。ｍＲＮＡが開裂された後、アデノシン残基は、開裂部位の遊離３’末端に付加される。
【０３１３】
ここで使用する、“一過性”は、数時間、数日または数週の期間の非統合導入遺伝子の発現をいい、ここで、発現の期間は、ゲノムに統合されたまたは宿主細胞における安定なプラスミドレプリコン内に含まれるときの該遺伝子の発現期間より短い。
【０３１４】
ここで使用する、用語“処置”および“処置する”は、１以上の治療(例えば、本発明のＣＡＲのような１以上の治療剤)の投与に起因する、増殖性障害の進行、重症度および／またはの減少または改善または増殖性障害の１以上の症状(好ましくは、１以上の認識できる症状)の改善をいう。特定の態様において、用語“処置”および“処置する”は、腫瘍の増殖のような、必ずしも患者により認識され得るものではない、増殖性障害の少なくとも１つの測定可能な身体的パラメーターの改善をいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、例えば、認識できる症状の安定化により、身体的に、例えば、身体的パラメーターの安定化により、生理学的にまたは両者による、増殖性障害の進行阻止をいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、腫瘍サイズまたは癌性細胞数の減少または安定化をいう。
【０３１５】
用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナルの伝達における役割を有する、多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。用語“細胞表面受容体”は、細胞の膜を超えてシグナルを受け、かつシグナルを伝達できる、分子および分子の複合体をいう。
【０３１６】
用語“対象”は、免疫応答が惹起され得る生存生物(例えば、哺乳動物、ヒト)を含むことを意図する。
【０３１７】
用語“実質的に精製された”細胞は、本質的に他の細胞型を含まない、細胞をいう。実質的に精製された細胞はまた、その天然に存在する状態で通常関係している他の細胞型と分離されている細胞もいう。いくつかの例において、実質的に精製された細胞集団は、同種の細胞集団をいう。他の場合において、本用語は、その天然状態で本来関係している細胞から分離されている、細胞を単にいう。ある面において、細胞はインビトロで培養される。他の面において、細胞はインビトロで培養されない。
【０３１８】
ここで使用する用語“治療”は、処置を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解または根絶により得られる。
【０３１９】
ここで使用する用語“予防”は、疾患または疾患状態の予防または防御的処置をいう。
【０３２０】
本発明において、“腫瘍抗原”または“過増殖性障害抗原”または“過増殖性障害と関係する抗原”は、特定の過増殖性障害に共通する抗原をいう。ある面において、本発明の過増殖性障害抗原は、原発または転移黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌のような腺癌などを含むが、これらに限定されない癌由来である。
【０３２１】
用語“トランスフェクト”または“形質転換”または“形質導入”は、外来性核酸を宿主細胞に移入または導入する過程をいう。“トランスフェクトされた”または“形質転換された”または“形質導入された”細胞は、外来性核酸がトランスフェクト、形質転換または形質導入されているものである。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
【０３２２】
用語“特異的に結合する”は、サンプルに存在する結合パートナー(例えば、腫瘍抗原)タンパク質を認識し、結合するが、サンプルにおける他の分子を実質的に認識または結合しない抗体またはリガンドをいう。
【０３２３】
“調節可能なキメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)”は、該用語がここで使用される限り、ＲＣＡＲＸ細胞において、ＲＣＡＲＸ細胞に標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および調節可能な細胞内シグナル産生または増殖を提供し、ＲＣＡＲＸ細胞の免疫エフェクター特性を最適化できるポリペプチドのセット、一般に最も単純な態様では２個のポリペプチドをいう。ＲＣＡＲＸ細胞は、抗原結合ドメインにより結合される抗原を含む標的細胞に対する特異性を提供するために、少なくとも一部、抗原結合ドメインに依存する。ある態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子の存在下、細胞内シグナル伝達ドメインを抗原結合ドメインに結合できる、二量体化スイッチを含む。
【０３２４】
“膜アンカー”または“膜係留ドメイン”は、その用語がここで使用される限り、原形質膜に細胞外または細胞内ドメインを係留するのに十分なポリペプチドまたは基、例えば、ミリストイル基をいう。
【０３２５】
“スイッチドメイン”は、例えば、ＲＣＡＲをいうとき、その用語がここで使用される限り、二量体化分子の存在下、他のスイッチドメインと結合する物質、一般にポリペプチドベースの物質をいう。結合は、第一スイッチドメインに連結、例えば、融合した第一物質と第二スイッチドメインに連結、例えば、融合した第二物質の機能的カップリングをもたらす。第一および第二スイッチドメインは、集合的に二量体化スイッチと呼ぶ。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに同じであり、例えば、それらは、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ばれる。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに異なり、例えば、それらは、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ばれる。ある態様において、スイッチは細胞内である。ある態様において、スイッチは細胞外である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物質、例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢベースであり、二量体化分子は小分子、例えば、ラパログである。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物質、例えば、ｍｙｃペプチドに結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子はポリペプチド、そのフラグメントまたはポリペプチドの多量体、例えば、１以上のｍｙｃ  ｓｃＦｖに結合するｍｙｃリガンドまたはｍｙｃリガンドの多量体である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースの物質、例えば、ｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は抗体またはそのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。
【０３２６】
“二量体化分子”は、例えば、ＲＣＡＲをいうとき、その用語がここで使用される限り、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する分子をいう。ある態様において、二量体化分子は対象に天然に存在しないかまたは有意な二量体化をもたらす濃度で存在しない。ある態様において、二量体化分子は小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
【０３２７】
用語“生物学的同等”は、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の対照用量または対照量により産生される効果と同等な効果を生じるのに必要な、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬剤の量のをいう。ある態様において、効果は、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害により測定して、例えば、インビボまたはインビトロアッセイにおいて評価して、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、ｍＴＯＲ阻害のレベルである。ある態様において、効果は、細胞選別により測定して、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の改変である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を達成する、量または用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の改変を達成する量または用量である。
【０３２８】
用語“低い、免疫増強用量”は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンまたは触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用したとき、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定して、ｍＴＯＲ活性を完全ではなく一部阻害する、ｍＴＯＲ阻害剤の用量をいう。例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼの阻害により、ｍＴＯＲ活性を評価する方法はここに記載する。用量は、完全な免疫抑制を生じるには不十分であるが、免疫応答を増強するには十分である。ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞減少および／またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞数増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比増加をもたらす。ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ナイーブＴ細胞数の増加をもたらす。ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、次の一以上をもたらす：
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、次のマーカーＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２の１以上の発現の増加；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、ＫＬＲＧ１の発現の減少；および
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次のＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加の特性の任意の１つまたは組み合わせを有する細胞の数の増加；
ここで、上記変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【０３２９】
ここで使用する“難治性”は、処置に応答しない疾患、例えば、癌をいう。ある態様において、難治性癌は、処置の前または開始時に該処置に耐性であり得る。他の態様において、難治性癌は、処置中に耐性となり得る。難治性癌はまた耐性癌とも呼ばれる。
【０３３０】
ここで使用する“再発した”は、例えば、前の治療剤での治療、例えば、癌治療の後、一定期間の改善の後の、疾患(例えば、癌)または癌のような疾患の徴候および症状の回帰をいう。
【０３３１】
範囲：本明細書をとおして、本発明の多様な面を範囲の形式で示すことができる。範囲の形式での記載は単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する確実な制限として解釈すべきではないと理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲ならびに該範囲内の個々の数値が具体的に開示されていると解釈すべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような部分範囲ならびに該範囲内の個々の数、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６が具体的に開示されていると解釈すべきである。他の例として、９５〜９９％同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するなにかを含み、かつ、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性のような部分範囲を含む。これは、範囲の広さに関わらず、適用される。
【０３３２】
概要
本発明のＣＡＲで操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を使用する癌のような疾患の処置に使用するための、組成物および方法がここで提供される。
【０３３３】
ある面において、本発明は、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原に対する特異的結合のために操作された、抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)を含む、多数のキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を提供する。ある面において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供し、ここで、操作された免疫エフェクター細胞は、抗癌特性を示す。ある面において、細胞はＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲは、細胞表面上に発現される。ある態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。ある態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。あるこのような態様において、細胞はＣＡＲを安定に発現し得る。他の態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。あるこのような態様において、細胞は、ＣＡＲを一過性に発現し得る。
【０３３４】
ある面において、ここに記載するＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。ある面において、このような抗体フラグメントは、同等な結合親和性を保持する点で機能的であり、例えば、それらは、由来するＩｇＧ抗体と同じ抗原に同等な親和性で結合する。他の態様において、抗体フラグメントは低結合親和性を有し、例えば、同じ抗原に由来する抗体より低い結合親和性で結合するが、ここに記載する生物学的応答を提供する点で機能的である。ある態様において、ＣＡＲ分子は、標的抗原に対して１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、例えば、１０−６Ｍまたは１０−７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗体フラグメントを含む。ある態様において、抗体フラグメントは、対照抗体、例えば、ここに記載する抗体より少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍または１,０００倍低い結合親和性を有する。
【０３３５】
ある面においてこのような抗体フラグメントは、当業者に理解されるように、免疫応答の活性化、その標的抗原から始まるシグナル伝達の阻害、キナーゼ活性の阻害などを含み得るが、これらに限定されない生物学的応答を提供する点で、機能的である。
【０３３６】
ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、由来するｓｃＦｖのマウス配列と比較してヒト化されている、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【０３３７】
ある面において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列が哺乳動物細胞において発現されるようにコドン最適化されている核酸分子によりコードされる。ある面において、本発明のＣＡＲ構築物全体が、配列全体が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている、核酸分子によりコードされる。コドン最適化は、コードＤＮＡにおける同義コドン(すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が種毎に偏向しているとの発見をいう。このようなコドン同義性は、同一ポリペプチドが多様なヌクレオチド配列によりコードされることを可能とする。多様なコドン最適化方法が当分野で知られ、例えば、少なくとも米国特許５,７８６,４６４号および同第６,１１４,１４８号に開示された方法を含む。
【０３３８】
ある面において、本発明のＣＡＲは、特異的抗体の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達分子を合わせる。例えば、ある面において、細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータ鎖、４−１ＢＢおよびＣＤ２８シグナル伝達モジュールおよびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ある面において、抗原結合ドメインは、ここに記載する腫瘍抗原に結合する。
【０３３９】
さらに、本発明は、ＣＡＲおよびＣＡＲ発現細胞および、数ある疾患の中で、癌またはここに記載する腫瘍抗原を発現する細胞または組織が関与するあらゆる悪性腫瘍もしくは自己免疫性疾患の処置のための医薬または方法におけるその使用を提供する。
【０３４０】
ある面において、本発明のＣＡＲは、ここに記載する腫瘍抗原を発現する正常細胞を根絶でき、それにより細胞移植前の細胞コンディショニング治療としての使用のために適用可能である。ある面において、ここに記載する腫瘍抗原を発現する正常細胞は正常幹細胞であり、細胞移植は幹細胞移植である。
【０３４１】
ある面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供し、ここで、操作された免疫エフェクター細胞は抗腫瘍特性を示す。好ましい抗原は、ここに記載する癌関連抗原(すなわち、腫瘍抗原)である。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化された抗体フラグメントを含む。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化されたｓｃＦｖを含む。したがって、本発明は、ヒト化抗原結合ドメインを含み、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に設計されたＣＡＲおよび養子治療のためのその使用法を提供する。
【０３４２】
ある面において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７シグナルドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメインおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個の細胞内ドメインを含む。ある面において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)またはＣＤ２８以外である１以上の共刺激分子由来の、少なくとも１個の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０３４３】
本発明のＣＡＲの多様な要素のいくつかの例の配列を表１に挙げ、ここで、ａａはアミノ酸であり、ｎａは対応するペプチドをコードする核酸である。
【表１】
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【表２】
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【０３４４】
【表３】
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【表４】
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【０３４５】
【表５】
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【表６】
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【０３４６】
【表７】
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【表８】
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【０３４７】
【表９】
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【表１０】
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【０３４８】
癌関連抗原
本発明は、免疫エフェクター細胞を癌に向けさせる１以上のＣＡＲを含むように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供する。これは、癌関連抗原に特異的なＣＡＲ上の抗原結合ドメインにより達成される。本発明のＣＡＲにより標的となり得る２クラスの癌関連抗原(腫瘍抗原)がある。(１)癌細胞の表面上に発現される癌関連抗原；および(２)癌関連抗原であって、それ自体細胞内であるが、しかしながら、このような抗原(ペプチド)のフラグメントがＭＨＣ(主要組織適合抗原複合体)により癌細胞の表面上に提示される抗原。
【０３４９】
したがって、本発明は、次の癌関連抗原(腫瘍抗原)を標的とするＣＡＲを提供する：ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１。
【０３５０】
腫瘍支持抗原
本発明のＣＡＲは、腫瘍支持抗原(例えば、腫瘍支持抗原)に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)を含み得る。ある態様において、腫瘍支持抗原は、間質細胞または骨髄球由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)上に存在する抗原である。間質細胞は、微小環境における細胞分裂を促進するために増殖因子を分泌できる。ＭＤＳＣ細胞はＴ細胞増殖および活性化を阻害できる。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は腫瘍支持細胞を破壊し、それにより間接的に腫瘍増殖または生存を阻害する。
【０３５１】
ある態様において、間質細胞抗原は骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)およびテネイシンの１以上から選択される。ある態様において、ＦＡＰ特異的抗体は、シブロツズマブと結合について競合するかまたは同じＣＤＲを有する。ある態様において、ＭＤＳＣ抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５およびＣＤ６６ｂの１以上から選択される。したがって、ある態様において、腫瘍支持抗原は、骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)またはテネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５およびＣＤ６６ｂの１以上から選択される。
【０３５２】
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)
本発明は、ＣＡＲをコードする配列を含む組み換えＤＮＡ構築物を包含し、ここで、ＣＡＲは、ここに記載する癌関連抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント)を含み、ここで、抗原結合ドメインの配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と隣接し、かつ同じリーディングフレーム内である。細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインの少なくとも一部を含むＣＡＲの部分をいう。
【０３５３】
特定の面において、本発明のＣＡＲ構築物はｓｃＦｖドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖの前に、配列番号２に提供するような任意のリーダー配列があり、後ろに配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０に提供するような任意のヒンジ配列、配列番号１２に提供するような膜貫通領域、配列番号１４または配列番号１６を含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号１８または配列番号２０を含むＣＤ３ゼータ配列があってよく、例えば、ここで、これらドメインは、隣接し、かつ同じリーディングフレーム内であり、単一融合タンパク質を形成する。
【０３５４】
ある面において、代表的ＣＡＲ構築物は、任意のリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および細胞内刺激ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内刺激ドメイン)を含む。ある面において、代表的ＣＡＲ構築物は、任意のリーダー配列(例えば、ここに記載するリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激シグナル伝達ドメイン)および／または細胞内一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン)を含む。
【０３５５】
代表的リーダー配列は配列番号２として提供される。代表的ヒンジ／スペーサー配列は、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０として提供される。代表的膜貫通ドメイン配列は配列番号１２として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの代表的配列は、配列番号１４として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの代表的配列は、配列番号１６として提供される。代表的ＣＤ３ゼータドメイン配列は、配列番号１８または配列番号２０として提供される。
【０３５６】
ある面において、本発明はＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に隣接し、かつ同じリーディングフレームにある、例えば、ここに記載する、抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含む。
【０３５７】
ある面において、本発明はＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は、抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、ここで、配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に隣接し、かつ同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲにおいて使用できる代表的細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢなどの１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。
【０３５８】
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用する、例えば核酸分子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの核酸分子の導出またはそれを含む細胞および組織から直接単離のような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の核酸を、クローン化ではなくむしろ合成的に製造できる。
【０３５９】
本発明は、細胞に直接形質導入され得る、ＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含む。
【０３６０】
本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトされ得るＲＮＡ構築物も含む。トランスフェクションにおいて使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、一般に５０〜２０００塩基長(配列番号３２)の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)(例えば、ここに記載する３’および／または５’ＵＴＲ)、５’キャップ(例えば、ここに記載する５’キャップ)および／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)(例えば、ここに記載するＩＲＥＳ)、発現させるべき核酸およびポリＡテイルを含む構築物を産生するための、特に設計したプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含む。このように産生したＲＮＡは、異なる種の細胞を効率的にトランスフェクトできる。ある態様において、鋳型は、ＣＡＲのための配列を含む。ある態様において、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターは、エレクトロポレーションにより、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に形質導入される。
【０３６１】
抗原結合ドメイン
ある面において、本発明のＣＡＲは、抗原結合ドメインとも呼ぶ、標的特異的結合要素を含む。部分の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関係する標的細胞上の細胞表面マーカーとして働くリガンドを認識するように選択し得る。それゆえに、本発明のＣＡＲにおける抗原結合ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス、細菌および寄生虫感染、自己免疫性疾患および癌細胞と関係するものを含む。
【０３６２】
ある面において、ＣＡＲ介在Ｔ細胞応答は、所望の抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインのＣＡＲ内への設計の手段により、目的の抗原に向けることができる。
【０３６３】
ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインを含む部分は、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
【０３６４】
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体および、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)およびラクダ類由来ナノボディの可変ドメイン(ＶＨＨ)のような単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されない機能的そのフラグメントを含むが、これらに限定されない抗原ならびに組み換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲなどのような当分野で抗原結合ドメインとして機能することが知られる代替スキャフォールドと結合するあらゆるドメインであり得る。いくつかの例において、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが最終的に使用されるのと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおける使用のために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０３６５】
ある態様において、ＣＤ２２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Haso et al., Blood, 121(7): 1165-1174 (2013); Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903 (2010); Kato et al., Leuk Res 37(1):83-88 (2013); Creative BioMart (creativebiomart.net): MOM-18047-S(P)に記載の抗体の、抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６６】
ある態様において、ＣＳ−１に対する抗原結合ドメインは、エロツズマブ(ＢＭＳ)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲであり、例えば、Tai et al., 2008, Blood 112(4):1329-37; Tai et al., 2007, Blood. 110(5):1656-63を参照のこと。
【０３６７】
ある態様において、ＣＬＬ−１に対する抗原結合ドメインは、R&D, ebiosciences, Abcam、例えば、PE-CLL1-hu Cat# 353604(BioLegend);およびＰＥ−ＣＬＬ１(ＣＬＥＣ１２Ａ) Cat# 562566(BD)から利用可能な抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６８】
ある態様において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインは、例えば、Bross et al., Clin Cancer Res 7(6):1490-1496 (2001)(ゲムツズマブ オゾガマイシン、ｈＰ６７.6),Caron et al., Cancer Res 52(24):6761-6767 (1992)(リンツズマブ、ＨｕＭ１９５), Lapusan et al., Invest New Drugs 30(3):1121-1131 (2012)(ＡＶＥ９６３３)、Aigner et al., Leukemia 27(5): 1107-1115 (2013)(ＡＭＧ３３０、ＣＤ３３  ＢｉＴＥ), Dutour et al., Adv hematol 2012:683065 (2012)およびPizzitola et al., Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62 (2014)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６９】
ある態様において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Mujoo et al., Cancer Res. 47(4):1098-1104 (1987); Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1985), Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987), Cheung et al., J Clin Oncol 16(9):3053-3060 (1998), Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204 (1992)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ある態様において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、ｍＡｂ  １４.１８、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４.１８、ｈｕ１４.１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６０Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６.１および８Ｈ９から選択される抗体の抗原結合部分である、例えば、ＷＯ２０１２０３３８８５号、ＷＯ２０１３０４０３７１号、ＷＯ２０１３１９２２９４号、ＷＯ２０１３０６１２７３号、ＷＯ２０１３１２３０６１号、ＷＯ２０１３０７４９１６およびＷＯ２０１３８５５５２号参照。ある態様において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、米国公開２０１００１５０９１０号またはＰＣＴ公開ＷＯ２０１１１６０１１９号に記載の抗体の抗原結合部分である。
【０３７０】
ある態様において、ＢＣＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２０１２１６３８０５号、ＷＯ２００１１２８１２号およびＷＯ２００３０６２４０１号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７１】
ある態様において、Ｔｎ抗原に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ８,４４０,７９８号、Brooks et al., PNAS 107(22):10056-10061 (2010)およびStone et al., OncoImmunology 1(6):863-873(2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７２】
ある態様において、ＰＳＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Parker et al., Protein Expr Purif 89(2):136-145 (2013)、ＵＳ２０１１０２６８６５６号(Ｊ５９１  ＳｃＦｖ)；Frigerio et al, European J Cancer 49(9):2223-2232 (2013)(ｓｃＦｖＤ２Ｂ)；ＷＯ２００６１２５４８１号(ｍＡｂ  ３／Ａ１２、３／Ｅ７および３／Ｆ１１)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲ、および一本鎖抗体フラグメント(ｓｃＦｖ  Ａ５およびＤ７)である。
【０３７３】
ある態様において、ＲＯＲ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Hudecek et al., Clin Cancer Res 19(12):3153-3164 (2013)；ＷＯ２０１１１５９８４７号；およびＵＳ２０１３０１０１６０７号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７４】
ある態様において、ＦＬＴ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２０１１０７６９２２、ＵＳ５７７７０８４、ＥＰ０７５４２３０、ＵＳ２００９０２９７５２９に記載の抗体およびいくつかの市販のカタログ抗体(R&D, ebiosciences, Abcam)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７５】
ある態様において、ＴＡＧ７２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Hombach et al., Gastroenterology 113(4):1163-1170 (1997)に記載の抗体；およびＡｂｃａｍ  ａｂ６９１の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７６】
ある態様において、ＦＡＰに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ostermann et al., Clinical Cancer Research 14:4584-4592 (2008)(ＦＡＰ５)、米国特許公開２００９／０３０４７１８号；シブロツズマブ(例えば、Hofheinz et al., Oncology Research and Treatment 26(1), 2003);およびTran et al., J Exp Med 210(6):1125-1135 (2013)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７７】
ある態様において、ＣＤ３８に対する抗原結合ドメインは、ダラツムマブ(例えば、Groen et al., Blood 116(21):1261-1262 (2010)参照)；ＭＯＲ２０２(例えば、ＵＳ８,２６３,７４６参照)；またはＵＳ８,３６２,２１１号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７８】
ある態様において、ＣＤ４４ｖ６に対する抗原結合ドメインは、例えば、Casucci et al., Blood 122(20):3461-3472 (2013)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３７９】
ある態様において、ＣＥＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Chmielewski et al., Gastoenterology 143(4):1095-1107 (2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８０】
ある態様において、ＥＰＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、ＭＴ１１０、ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３二重特異的Ａｂ(例えば、clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596参照)；エドレコロマブ；３６２２Ｗ９４；ＩＮＧ−１；およびアデカツムマブ(ＭＴ２０１)から選択される抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８１】
ある態様において、ＰＲＳＳ２１に対する抗原結合ドメインは、米国特許第８,０８０,６５０号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８２】
ある態様において、Ｂ７Ｈ３に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＧＡ２７１(Macrogenics)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８３】
ある態様において、ＫＩＴに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７９１５３９１号、ＵＳ２０１２０２８８５０６号およびいくつかの市販のカタログ抗体に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８４】
ある態様において、ＩＬ−１３Ｒａ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＷＯ２００８／１４６９１１号、ＷＯ２００４０８７７５８号、いくつかの市販のカタログ抗体およびＷＯ２００４０８７７５８号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８５】
ある態様において、ＣＤ３０に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７０９０８４３Ｂ１号およびＥＰ０８０５８７１号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８６】
ある態様において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７２５３２６３号；ＵＳ８,２０７,３０８号；ＵＳ２０１２０２７６０４６号；ＥＰ１０１３７６１号；ＷＯ２００５０３５５７７；およびＵＳ６４３７０９８号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８７】
ある態様において、ＣＤ１７１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Hong et al., J Immunother 37(2):93-104 (2014)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３８８】
ある態様において、ＩＬ−１１Ｒａに対する抗原結合ドメインは、Ａｂｃａｍ(cat# ab55262)またはNovus Biologicals(cat# EPR5446)から入手可能な抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。ＩＬ−１１Ｒａに対する抗原結合ドメインは、ペプチドである、例えば、Huang et al., Cancer Res 72(1):271-281 (2012)参照。
【０３８９】
ある態様において、ＰＳＣＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Morgenroth et al., Prostate 67(10):1121-1131 (2007)(ｓｃＦｖ  ７Ｆ５)；Nejatollahi et al., J of Oncology 2013 (2013), article ID 839831(ｓｃＦｖ  Ｃ５−ＩＩ)；および米国特許公開２００９０３１１１８１号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３９０】
ある態様において、ＶＥＧＦＲ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Chinnasamy et al., J Clin Invest 120(11):3953-3968 (2010)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３９１】
ある態様において、ルイスＹに対する抗原結合ドメインは、例えば、Kelly et al., Cancer Biother Radiopharm 23(4):411-423 (2008)(ｈｕ３Ｓ１９３  Ａｂ  (ｓｃＦｖｓ)); Dolezal et al., Protein Engineering 16(1):47-56 (2003)(ＮＣ１０  ｓｃＦｖ)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３９２】
ある態様において、ＣＤ２４に対する抗原結合ドメインは、例えば、Maliar et al., Gastroenterology 143(5):1375-1384(2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３９３】
ある態様において、ＰＤＧＦＲ−ベータ対する抗原結合ドメインは、抗体Ａｂｃａｍ  ａｂ３２５７０の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３９４】
ある態様において、ＳＳＥＡ−４に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＣ８１３(Cell Signaling)または他の商業的に入手可能な抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３９５】
ある態様において、ＣＤ２０に対する抗原結合ドメインは、抗体リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブまたはＧＡ１０１の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３９６】
ある態様において、葉酸受容体アルファに対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＧＮ８５３またはＵＳ２０１２０００９１８１号；ＵＳ４８５１３３２号、ＬＫ２６：ＵＳ５９５２４８４号に記載する抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３９７】
ある態様において、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)に対する抗原結合ドメインは、抗体トラスツズマブまたはペルツズマブの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３９８】
ある態様において、ＭＵＣ１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＳＡＲ５６６６５８の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３９９】
ある態様において、ＥＧＦＲに対する抗原結合ドメインは、抗体セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブまたはマツズマブの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４００】
ある態様において、ＮＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン２−２Ｂ：ＭＡＢ５３２４(EMD Millipore)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである
【０４０１】
ある態様において、エフリンＢ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Abengozar et al., Blood 119(19):4565-4576 (2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４０２】
ある態様において、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ８３４４１１２Ｂ２号；ＥＰ２３２２５５０Ａ１号；ＷＯ２００６／１３８３１５またはＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２９９５号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４０３】
ある態様において、ＣＡＩＸに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン３０３１２３(Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４０４】
ある態様において、ＬＭＰ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７,４１０,６４０号またはＵＳ２００５０１２９７０１号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４０５】
ある態様において、ｇｐ１００に対する抗原結合ドメインは、抗体ＨＭＢ４５、ＮＫＩベータＢまたはＷＯ２０１３１６５９４０号またはＵＳ２０１３０２９５００７号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである
【０４０６】
ある態様において、チロシナーゼに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ５８４３６７４号；またはＵＳ１９９５０５０４０４８号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４０７】
ある態様において、ＥｐｈＡ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Yu et al., Mol Ther 22(1):102-111 (2014)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４０８】
ある態様において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ７２５３２６３号；ＵＳ８,２０７,３０８号；ＵＳ２０１２０２７６０４６号；ＥＰ１０１３７６１Ａ３号；２０１２０２７６０４６号；ＷＯ２００５０３５５７７；またはＵＳ６４３７０９８号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４０９】
ある態様において、フコシルＧＭ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ２０１００２９７１３８号；またはＷＯ２００７／０６７９９２号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４１０】
ある態様において、ｓＬｅに対する抗原結合ドメインは、抗体Ｇ１９３(ルイスＹについて)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである、Scott AM et al, Cancer Res 60: 3254-61 (2000)参照、またNeeson et al, J Immunol May 2013 190 (Meeting Abstract Supplement) 177.10にも記載されている。
【０４１１】
ある態様において、ＧＭ３に対する抗原結合ドメインは、抗体ＣＡ  ２５２３４４９(ｍＡｂ  １４Ｆ７)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４１２】
ある態様において、ＨＭＷＭＡＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Kmiecik et al., Oncoimmunology 3(1):e27185 (2014) (PMID: 24575382)(ｍＡｂ９.２.２７)；ＵＳ６５２８４８１号；ＷＯ２０１００３３８６６号；またはＵＳ２０１４０００４１２４号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４１３】
ある態様において、ｏ−アセチル−ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、抗体８Ｂ６の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４１４】
ある態様において、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８に対する抗原結合ドメインは、例えば、Marty et al., Cancer Lett 235(2):298-308 (2006); Zhao et al., J Immunol Methods 363(2):221-232 (2011)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４１５】
ある態様において、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＡＢ０２７(Ganymed Pharmaceuticals)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲであり、例えば、clinicaltrial.gov/show/NCT02054351参照。
【０４１６】
ある態様において、ＴＳＨＲに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ８,６０３,４６６号；ＵＳ８,５０１,４１５号；またはＵＳ８,３０９,６９３号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４１７】
ある態様において、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合ドメインは、抗体ＦＡＢ６３００Ａ(R&D Systems)；またはＬＳ−Ａ４１８０(Lifespan Biosciences)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４１８】
ある態様において、ＣＤ９７に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＵＳ６,８４６,９１１号；de Groot et al., J Immunol 183(6):4127-4134 (2009)に記載の抗体；またはＲ＆Ｄからの抗体：ＭＡＢ３７３４の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４１９】
ある態様において、ＡＬＫに対する抗原結合ドメインは、例えば、Mino-Kenudson et al., Clin Cancer Res 16(5):1561-1571 (2010)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４２０】
ある態様において、ポリシアル酸に対する抗原結合ドメインは、例えば、Nagae et al., J Biol Chem 288(47):33784-33796(2013)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４２１】
ある態様において、ＰＬＡＣ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ghods et al., Biotechnol Appl Biochem 2013 doi:10.1002/bab.1177に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４２２】
ある態様において、ＧｌｏｂｏＨに対する抗原結合ドメインは、抗体ＶＫ９；または例えば、Kudryashov V et al, Glycoconj J.15(3):243-9 ( 1998), Lou et al., Proc Natl Acad Sci USA 111(7):2482-2487 (2014); MBr1: Bremer E-G et al. J Biol Chem 259:14773-14777 (1984)に記載の抗原結合部分である。
【０４２３】
ある態様において、ＮＹ−ＢＲ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Jager et al., Appl Immunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83 (2007)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４２４】
ある態様において、ＷＴ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Dao et al., Sci Transl Med 5(176):176ra33 (2013)；またはＷＯ２０１２／１３５８５４号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４２５】
ある態様において、ＭＡＧＥ−Ａ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Willemsen et al., J Immunol 174(12):7853-7858 (2005)(ＴＣＲ様ｓｃＦｖ)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４２６】
ある態様において、精子タンパク質１７に対する抗原結合ドメインは、例えば、Song et al., Target Oncol 2013 Aug 14 (PMID: 23943313); Song et al., Med Oncol 29(4):2923-2931 (2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４２７】
ある態様において、Ｔｉｅ  ２に対する抗原結合ドメインは、抗体ＡＢ３３(Cell Signaling Technology)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４２８】
ある態様において、ＭＡＤ−ＣＴ−２に対する抗原結合ドメインは、例えば、PMID: 2450952；ＵＳ７６３５７５３号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４２９】
ある態様において、Ｆｏｓ関連抗原１に対する抗原結合ドメインは、抗体１２Ｆ９(Novus Biologicals)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４３０】
ある態様において、メランＡ／ＭＡＲＴ１に対する抗原結合ドメインは、ＥＰ２５１４７６６Ａ２号；またはＵＳ７,７４９,７１９号に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４３１】
ある態様において、肉腫転座切断点に対する抗原結合ドメインは、例えば、Luo et al, EMBO Mol. Med. 4(6):453-461(2012)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４３２】
ある態様において、ＴＲＰ−２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Wang et al, J Exp Med. 184(6):2207-16 (1996)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４３３】
ある態様において、ＣＹＰ１Ｂ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Maecker et al, Blood 102 (9): 3287-3294 (2003)に記載の抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４３４】
ある態様において、ＲＡＧＥ−１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＡＢ５３２８(EMD Millipore)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４３５】
ある態様において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素に対する抗原結合ドメインは、抗体カタログ番号ＬＳ−Ｂ９５−１００(Lifespan Biosciences)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４３６】
ある態様において、腸管カルボキシルエステラーゼに対する抗原結合ドメインは、抗体４Ｆ１２：カタログ番号ＬＳ−Ｂ６１９０−５０(Lifespan Biosciences)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４３７】
ある態様において、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２に対する抗原結合ドメインは、抗体Lifespan Biosciences：モノクローナル：カタログ番号ＬＳ−Ｃ１３３２６１−１００(Lifespan Biosciences)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４３８】
ある態様において、ＣＤ７９ａに対する抗原結合ドメインは、Ａｂｃａｍから入手可能な抗体抗ＣＤ７９ａ抗体[ＨＭ４７／Ａ９](ａｂ３１２１)；Cell Signaling Technologyから入手可能な抗体ＣＤ７９Ａ抗体＃３３５１；または抗体ＨＰＡ０１７７４８−Sigma Aldrichから入手可能なウサギで産生される抗ＣＤ７９Ａ抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４３９】
ある態様において、ＣＤ７９ｂに対する抗原結合ドメインは、Dornan et al., “Therapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate, anti-CD79b-vc-MMAE, for the treatment of non-Hodgkin lymphoma” Blood. 2009 Sep 24;114(13):2721-9. doi: 10.1182/blood-2009-02-205500. Epub 2009 Jul 24に記載の抗ＣＤ７９ｂである、抗体ポラツズマブ  ベドチンまたは“4507 Pre-Clinical Characterization of T Cell-Dependent Bispecific Antibody Anti-CD79b/CD3 As a Potential Therapy for B Cell Malignancies” Abstracts of 56th ASH Annual Meeting and Exposition, San Francisco, CA December 6-9 2014に記載の二重特異的抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４４０】
ある態様において、ＣＤ７２に対する抗原結合ドメインは、Myers, and Uckun, “An anti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia.” Leuk Lymphoma. 1995 Jun;18(1-2):119-22に記載の抗体Ｊ３−１０９またはPolson et al., “Antibody-Drug Conjugates for the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma: Target and Linker-Drug Selection” Cancer Res March 15, 2009 69; 2358に記載の抗ＣＤ７２(１０Ｄ６.８.１、ｍＩｇＧ１)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４４１】
ある態様において、ＬＡＩＲ１に対する抗原結合ドメインは、ProSpecから可能な抗体ＡＮＴ−３０１  ＬＡＩＲ１抗体；またはBioLegendから入手可能な抗ヒトＣＤ３０５(ＬＡＩＲ１)抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４４２】
ある態様において、ＦＣＡＲに対する抗原結合ドメインは、Sino Biological Inc.から入手可能な抗体ＣＤ８９／ＦＣＡＲ抗体(Catalog# 10414-H08H)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４４３】
ある態様において、ＬＩＬＲＡ２に対する抗原結合ドメインは、Abnovaから入手可能な抗体ＬＩＬＲＡ２モノクローナル抗体(Ｍ１７)、クローン３Ｃ７またはLifespan Biosciencesから入手可能なマウス抗ＬＩＬＲＡ２抗体、モノクローナル(２Ｄ７)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４４４】
ある態様において、ＣＤ３００ＬＦに対する抗原結合ドメインは、BioLegendから入手可能な抗体マウス抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル[ＵＰ−Ｄ２]またはR&D Systemsから入手可能なラット抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル[２３４９０３]の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４４５】
ある態様において、ＣＬＥＣ１２Ａに対する抗原結合ドメインは、Noordhuis et al., “Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugates and Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody” 53rd ASH Annual Meeting and Exposition, December 10-13, 2011に記載の抗体二重特異的Ｔ細胞Ｅｎｇａｇｅｒ(ＢｉＴＥ)ｓｃＦｖ−抗体およびＡＤＣおよびＭＣＬＡ−１１７(Ｍｅｒｕｓ)の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４４６】
ある態様において、ＢＳＴ２(ＣＤ３１７とも呼ぶ)に対する抗原結合ドメインは、Antibodies-Onlineから入手可能な抗体マウス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル[３Ｈ４]またはR&D Systemsから入手可能なマウス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル[６９６７３９]の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４４７】
ある態様において、ＥＭＲ２(ＣＤ３１２とも呼ぶ)に対する抗原結合ドメインは、Lifespan Biosciencesから入手可能な抗体マウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル[ＬＳ−Ｂ８０３３]またはR&D Systemsから入手可能なマウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル[４９４０２５]の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４４８】
ある態様において、ＬＹ７５に対する抗原結合ドメインは、EMD Milliporeから入手可能な抗体マウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル[ＨＤ３０]またはLife Technologiesから入手可能なマウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル[Ａ１５７９７]の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４４９】
ある態様において、ＧＰＣ３に対する抗原結合ドメインは、Nakano K, Ishiguro T, Konishi H, et al. Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafting and stability optimization. Anticancer Drugs. 2010 Nov;21(10):907-916に記載の抗体ｈＧＣ３３または全３種ともFeng et al., “Glypican-3 antibodies: a new therapeutic target for liver cancer.” FEBS Lett. 2014 Jan 21;588(2):377-82に記載されているＭＤＸ−１４１４、ＨＮ３またはＹＰ７の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４５０】
ある態様において、ＦＣＲＬ５に対する抗原結合ドメインは、Elkins et al., “FcRL5 as a target of antibody-drug conjugates for the treatment of multiple myeloma” Mol Cancer Ther. 2012 Oct;11(10):2222-32に記載の抗ＦｃＲＬ５抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４５１】
ある態様において、ＩＧＬＬ１に対する抗原結合ドメインは、Lifespan Biosciencesから入手可能な抗体マウス抗免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル[ＡＴ１Ｇ４]、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能なマウス抗免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル[ＨＳＬ１１]の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０４５２】
ある態様において、抗原結合ドメインは、上に挙げた抗体からの１、２、３(例えば、全３)の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３および／または上に挙げた抗体からの１、２、３(例えば、全３)の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、上に挙げた抗体の重鎖可変領域および／または可変軽鎖領域を含む。
【０４５３】
他の面において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントを含む。ある面において、非ヒト抗体はヒト化されており、ここで、抗体の特異的配列または領域は、ヒトにおいて天然に産生される抗体またはそのフラグメントに対する類似性を増加するように修飾されている。ある面において、抗原結合ドメインはヒト化されている。
【０４５４】
ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植(例えば、各々を、その全体を引用により本明細書に包含させる欧州特許ＥＰ２３９,４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許５,２２５,５３９号、５,５３０,１０１号および５,５８５,０８９号参照)、ベニアリングまたはリサーフェシング(例えば、各々を、その全体を引用により本明細書に包含させる欧州特許ＥＰ５９２,１０６号およびＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814;およびRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973)、鎖シャッフリング(例えば、その全体を引用により本明細書に包含させる米国特許５,５６５,３３２号参照)および例えば、各々を、その全体を引用により本明細書に包含させる米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許６,４０７,２１３号、米国特許５,７６６,８８６号、国際公開ＷＯ９３１７１０５号、Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)およびPedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)に開示された技術を含むが、これらに限定されない多様な技術を使用して産生できる。しばしば、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変する、例えば改善するために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置き換えられる。これらのフレームワーク置換は当分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置の異常フレームワーク残基を同定するための配列比較により、同定される(例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるQueen et al.、米国特許５,５８５,０８９号；およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323参照)。
【０４５５】
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒトである供給源からの１以上のアミノ酸残基をその中に残す。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば“移入”残基と呼ばれ、これは、一般に“移入”可変ドメインから取られる。ここに提供されるとおり、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒト免疫グロブリン分子およびフレームワーク領域からの１以上のＣＤＲを含み、フレームワークを含むアミノ酸残基は、完全にまたは大部分ヒト生殖系列由来である。抗体または抗体フラグメントのヒト化のための多数の技術が当分野で周知であり、本質的にWinterら(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従い、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列に置き換えることにより、すなわち、ＣＤＲ移植(その全体を引用により本明細書に包含させるＥＰ２３９,４００号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許４,８１６,５６７号；６,３３１,４１５号；５,２２５,５３９号；５,５３０,１０１号；５,５８５,０８９号；６,５４８,６４０号)により、実施できる。このようなヒト化抗体および抗体フラグメントにおいて、実質的に完全ヒト可変ドメイン未満が非ヒト種からの対応する配列により置換されている。ヒト化抗体は、しばしば、あるＣＤＲ残基および恐らくあるフレームワーク(ＦＲ)残基が、齧歯類抗体における類似部位からの残基により置換されている、ヒト抗体である。抗体および抗体フラグメントのヒト化はまたベニアリングまたはリサーフェシング(ＥＰ５９２,１０６号；ＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994);およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994))または鎖シャッフリング(米国特許５,５６５,３３２号)により達成でき、それらの各々を、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【０４５６】
ヒト化抗体の製造に使用する、軽および重両者のヒト可変ドメインは、抗原性を低減させるためである。いわゆる“最良適合”法に従い、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知ヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。齧歯類のものに最も近いヒト配列を、次いで、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として受容する(内容をその全体を引用により本明細書に包含させる、Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用できる(例えば、内容を、その全体を引用により本明細書に包含させる、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)参照)。ある態様において、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、全４のフレームワーク領域は、ＶＨ４＿４−５９生殖系列配列由来である。ある態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸から、１、２、３、４または５の修飾、例えば、置換を含み得る。ある態様において、軽鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、全４のフレームワーク領域は、ＶＫ３＿１.２５生殖系列配列由来である。ある態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸から、１、２、３、４または５の修飾、例えば、置換を含み得る。
【０４５７】
ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗体フラグメントを含む部分は、標的抗原に対する高親和性および他の都合よい生物学的特性を保持しながらヒト化される。本発明のある面によって、ヒト化抗体および抗体フラグメントは、親配列の分析および親およびヒト化配列の三次元モデルを使用する多様な概念的ヒト化産物の工程により製造される。三次元免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者に馴染み深い。選択した候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体構造を模式化し、表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらのディスプレーの調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンが標的抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基を、標的抗原に対する親和性増加のような、所望の抗体または抗体フラグメント特徴が達成されるように、レシピエントおよび移入配列から選択し、組み合わせできる。一般に、ＣＤＲ残基は直接的におよび最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
【０４５８】
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、元の抗体と類似する抗原性特異性を、例えば、本発明において、ここに記載するヒト癌関連抗原と結合する能力を保持し得る。ある態様において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、ここに記載するヒト癌関連抗原の結合の親和性および／または特異性が改善され得る。
【０４５９】
ある面において、本発明の抗原結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的特色または特性により特徴付けられる。例えば、ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインを含む部分は、ここに記載する腫瘍抗原と特異的に結合する。
【０４６０】
ある面において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある面において、ここに記載するような抗癌関連抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２または二機能性(例えば二重特異的)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))。ある面において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、ここに記載するような癌関連抗原タンパク質と、野生型のまたは増強された親和性で結合する。
【０４６１】
いくつかの例において、ｓｃＦｖは、当分野で知られる方法に従い、製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426 and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。ＳｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域を連結することにより製造できる。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含む。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するのかに影響する。実際、短ポリペプチドリンカーを用いたとき(例えば、５〜１０アミノ酸)、鎖内折りたたみは阻止される。鎖間折りたたみも、機能的エピトープ結合部位を形成するために２可変領域を合わせるために必要である。リンカー配向およびサイズの例は、例えば、引用により本明細書に包含させるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号を参照のこと。
【０４６２】
ｓｃＦｖは、ＶＬ領域とＶＨ領域の間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある態様において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(式中、ｎは１以上の正の整数である)(配列番号２２)のような数セットのグリシンおよびセリン反復を含む。ある態様において、リンカーは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２９)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号３０)であり得る。リンカー長の変動は、活性を保持または増強し、活性試験で優れた有効性をもたらし得る。
【０４６３】
他の面において、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体(“ＴＣＲ”)またはそのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲ(ｓｃＴＣＲ)である。このようなＴＣＲを製造する方法は当分野で知られる。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)参照(引用文献は、その全体を引用により本明細書に包含させる)。例えば、リンカー(例えば、可動性ペプチド)により連結されているＴ細胞クローンからのＶαおよびＶβ遺伝子を含む、ｓｃＴＣＲを設計できる。この試みは、それ自体が細胞内であるが、しかしながら、このような抗原(ペプチド)のフラグメントは、ＭＨＣにより癌細胞表面に呈示されている癌関連標的には極めて有用である。
【０４６４】
二重特異的ＣＡＲ
ある態様において多特異的抗体分子は、二重特異的抗体分子である。二重特異的抗体は２を超える抗原に特異性を有しない。二重特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある態様において、第一エピトープおよび第二エピトープは同じ抗原上、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)である。ある態様において、第一エピトープおよび第二エピトープは重複する。ある態様において、第一エピトープおよび第二エピトープは重複しない。ある態様において、第一エピトープおよび第二エピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)である。ある態様において、二重特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列ならびに第二エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある態様において、二重特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある態様において、二重特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある態様において、二重特異的抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントを含む。
【０４６５】
ある態様において、抗体分子は多特異的(例えば、二重特異的または三重特異的)抗体分子である。二重特異的またはヘテロ二量体抗体分子の製造法は当分野で知られ、例えば、ＵＳ５７３１１６８号に記載されている、例えば、“ホール内のノブ”アプローチ；例えば、ＷＯ０９／０８９００４号、ＷＯ０６／１０６９０５号およびＷＯ２０１０／１２９３０４号に記載の、静電ステアリングＦｃ対形成；例えば、ＷＯ０７／１１０２０５号に記載の、鎖交換操作ドメイン(ＳＥＥＤ)ヘテロ二量体形成；例えば、ＷＯ０８／１１９３５３号、ＷＯ２０１１／１３１７４６号およびＷＯ２０１３／０６０８６７号に記載のＦａｂアーム交換；例えば、ＵＳ４４３３０５９号に記載のような、アミン反応性基とスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性反応材を使用して二重特異的構造を産生するための、例えば、抗体架橋による、二重抗体コンジュゲート；例えば、ＵＳ４４４４８７８号に記載のような、２重鎖間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを経る、異なる抗体からの半抗体(重−軽鎖対またはＦａｂ)の組み換えにより産生された二重特異的抗体決定基；例えば、ＵＳ５２７３７４３号に記載のような、三機能的抗体、例えば、スルフヒドリル反応性基により架橋された３Ｆａｂ’フラグメント；例えば、ＵＳ５５３４２５４号に記載のような生合成結合タンパク質、例えば、Ｃ末端テイル、好ましくは、ジスルフィドまたはアミン反応性化学的架橋を経て架橋されたｓｃＦｖの対；例えば、ＵＳ５５８２９９６号に記載のような、二機能性抗体、例えば、定常ドメインが置き換えられている、ロイシンジッパー(例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ)により二量体化された、異なる結合特異性を有するＦａｂフラグメント；例えば、ＵＳ５５９１８２８号に記載のような、二重特異的およびオリゴ特異的一価およびオリゴ価受容体、例えば、一方の抗体のＣＨ１領域と他方の抗体の一般に結合した軽鎖を伴うＶＨ領域の間のポリペプチドスペーサーを介して連結した２抗体(２Ｆａｂフラグメント)のＶＨ−ＣＨ１領域；例えば、ＵＳ５６３５６０２号に記載のような、二重特異的ＤＮＡ−抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二本鎖断片を介する抗体またはＦａｂフラグメントの架橋；例えば、ＵＳ５６３７４８１号に記載のような、二重特異的融合タンパク質、例えば、２ｓｃＦｖとその間の親水性らせんペプチドリンカーおよび完全定常領域を含む発現構築物；例えば、ＵＳ５８３７２４２号に記載のような、多価および多特異的結合タンパク質、例えば、Ｉｇ重鎖可変領域の結合領域を伴う第一ドメインとＩｇ軽鎖可変領域の結合領域を伴う第二ドメインを有するポリペプチドの二量体、一般に二重特異的抗体(二重特異的、三重特異的または四重特異的分子を創製するための高次構造も包含される)；例えば、ＵＳ５８３７８２１号に記載のような、二重特異的／多価分子を形成するために二量体化され得る、さらにペプチドスペーサーで抗体ヒンジ領域およびＣＨ３領域に接続された連結したＶＬ鎖およびＶＨ鎖を有するミニボディ構築物；二重特異的ダイアボディを形成するために二量体を形成できる、短ペプチドリンカー(例えば、５または１０アミノ酸)でまたはリンカー無しでいずれかの配向���連結したＶＨドメインおよびＶＬドメイン；例えば、ＵＳ５８４４０９４号に記載のような、三量体および四量体；例えば、ＵＳ５８６４０１９号に記載のような、一連のＦＶ(またはｓｃＦｖ)を形成するために、ＶＬドメインとさらに結合した、Ｃ末端で架橋可能基によりペプチド結合により接続した一連のＶＨドメイン(またはファミリーメンバーにおけるＶＬドメイン)；および例えば、ＵＳ５８６９６２０号に記載のような、ｓｃＦＶまたは二重特異的抗体タイプ形態の両者を使用して、例えば、ホモ二価、ヘテロ二価、三価および四価構造を形成するように、ペプチドリンカーにより連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインの両者が、非共有結合または化学的架橋を介して多価構造に合わされている一本鎖結合ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。さらなる代表的な多特異的および二重特異的分子ならびにそれを製造する方法は、例えば、ＵＳ５９１０５７３号、ＵＳ５９３２４４８号、ＵＳ５９５９０８３号、ＵＳ５９８９８３０号、ＵＳ６００５０７９号、ＵＳ６２３９２５９号、ＵＳ６２９４３５３号、ＵＳ６３３３３９６号、ＵＳ６４７６１９８号、ＵＳ６５１１６６３号、ＵＳ６６７０４５３号、ＵＳ６７４３８９６号、ＵＳ６８０９１８５号、ＵＳ６８３３４４１号、ＵＳ７１２９３３０号、ＵＳ７１８３０７６号、ＵＳ７５２１０５６号、ＵＳ７５２７７８７号、ＵＳ７５３４８６６号、ＵＳ７６１２１８１号、ＵＳ２００２００４５８７Ａ１号、ＵＳ２００２０７６４０６Ａ１号、ＵＳ２００２１０３３４５Ａ１号、ＵＳ２００３２０７３４６Ａ１号、ＵＳ２００３２１１０７８Ａ１号、ＵＳ２００４２１９６４３Ａ１号、ＵＳ２００４２２０３８８Ａ１号、ＵＳ２００４２４２８４７Ａ１号、ＵＳ２００５００３４０３Ａ１号、ＵＳ２００５００４３５２Ａ１号、ＵＳ２００５０６９５５２Ａ１号、ＵＳ２００５０７９１７０Ａ１号、ＵＳ２００５１００５４３Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０４９Ａ１号、ＵＳ２００５１３６０５１Ａ１号、ＵＳ２００５１６３７８２Ａ１号、ＵＳ２００５２６６４２５Ａ１号、ＵＳ２００６０８３７４７Ａ１号、ＵＳ２００６１２０９６０Ａ１号、ＵＳ２００６２０４４９３Ａ１号、ＵＳ２００６２６３３６７Ａ１号、ＵＳ２００７００４９０９Ａ１号、ＵＳ２００７０８７３８１Ａ１号、ＵＳ２００７１２８１５０Ａ１号、ＵＳ２００７１４１０４９Ａ１号、ＵＳ２００７１５４９０１Ａ１号、ＵＳ２００７２７４９８５Ａ１号、ＵＳ２００８０５０３７０Ａ１号、ＵＳ２００８０６９８２０Ａ１号、ＵＳ２００８１５２６４５Ａ１号、ＵＳ２００８１７１８５５Ａ１号、ＵＳ２００８２４１８８４Ａ１号、ＵＳ２００８２５４５１２Ａ１号、ＵＳ２００８２６０７３８Ａ１号、ＵＳ２００９１３０１０６Ａ１号、ＵＳ２００９１４８９０５Ａ１号、ＵＳ２００９１５５２７５Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３５９Ａ１号、ＵＳ２００９１６２３６０Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８５１Ａ１号、ＵＳ２００９１７５８６７Ａ１号、ＵＳ２００９２３２８１１Ａ１号、ＵＳ２００９２３４１０５Ａ１号、ＵＳ２００９２６３３９２Ａ１号、ＵＳ２００９２７４６４９Ａ１号、ＥＰ３４６０８７Ａ２号、ＷＯ０００６６０５Ａ２号、ＷＯ０２０７２６３５Ａ２号、ＷＯ０４０８１０５１Ａ１号、ＷＯ０６０２０２５８Ａ２号、ＷＯ２００７０４４８８７Ａ２号、ＷＯ２００７０９５３３８Ａ２号、ＷＯ２００７１３７７６０Ａ２号、ＷＯ２００８１１９３５３Ａ１号、ＷＯ２００９０２１７５４Ａ２号、ＷＯ２００９０６８６３０Ａ１号、ＷＯ９１０３４９３Ａ１号、ＷＯ９３２３５３７Ａ１号、ＷＯ９４０９１３１Ａ１号、ＷＯ９４１２６２５Ａ２号、ＷＯ９５０９９１７Ａ１号、ＷＯ９６３７６２１Ａ２号、ＷＯ９９６４４６０Ａ１号に記載されている。上に引用した出願の内容を、その全体を引用により本明細書に包含させる。
【０４６６】
二重特異的抗体分子の各抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)内で、ＶＨは、ＶＬの上流でも下流でもよい。ある態様において、二重特異的抗体分子全体が配置ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２であるように、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＨ(ＶＨ１)がそのＶＬ(ＶＬ１)の上流に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、ＶＬ(ＶＬ２)がそのＶＨ(ＶＨ２)の上流に配置される。他の態様において、二重特異的抗体分子全体が配置ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２であるように、上流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、ＶＬ(ＶＬ１)がそのＶＨ(ＶＨ１)の上流に配置され、下流抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、ＶＨ(ＶＨ２)がそのＶＬ(ＶＬ２)の上流に配置される。所望により、リンカーは、構築物がＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置されるならば、２抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)の間、例えば、ＶＬ１とＶＬ２の間または構築物がＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置されるならば、ＶＨ１とＶＨ２の間に配置される。リンカーは、ここに記載するリンカー、例えば、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは４である)(配列番号６５)であり得る。一般に、２ｓｃＦｖ間のリンカーは、２ｓｃＦｖドメイン間の誤対合を避けるのに十分長くなければならない。所望により、リンカーは、第一ｓｃＦｖのＶＬとＶＨの間に配置される。所望により、リンカーは、第二ｓｃＦｖのＶＬとＶＨの間に配置される。複数リンカーを有する構築物において、任意の２以上のリンカーは同じでも異なってもよい。したがって、ある態様において、二重特異的ＣＡＲは、ＶＬ、ＶＨおよび所望により１以上のリンカーを、ここに記載する配置で含む。
【０４６７】
安定性および変異
ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ分子(例えば、可溶性ｓｃＦｖ)の安定性を、従来の対照ｓｃＦｖ分子または完全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)を参照して評価できる。ある態様において、ヒト化ｓｃＦｖは、記載するアッセイにおいて、対照結合分子(例えば従来のｓｃＦｖ分子)よりも約０.１℃、約０.２５℃、約０.５℃、約０.７５℃、約１℃、約１.２５℃、約１.５℃、約１.７５℃、約２℃、約２.５℃、約３℃、約３.５℃、約４℃、約４.５℃、約５℃、約５.５℃、約６℃、約６.５℃、約７℃、約７.５℃、約８℃、約８.５℃、約９℃、約９.５℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃または約１５℃大きい熱安定性を有する。
【０４６８】
ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性改善は、その後ＣＡＲ構築物全体にもたらされ、ＣＡＲ構築物の治療特性改善に至る。ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性は、従来の抗体と比較して、少なくとも約２℃または３℃改善できる。ある態様において、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して、１℃改善された熱安定性を有する。他の態様において、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して、２℃改善された熱安定性を有する。他の態様において、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃改善された熱安定性を有する。例えば、ここに開示するｓｃＦｖ分子と該ｓｃＦｖ  ＶＨおよびＶＬが由来する抗体のｓｃＦｖ分子または抗体のＦａｂフラグメントの間で、比較できる。熱安定性は、当分野で知られる方法を使用して測定できる。例えば、ある態様において、Ｔｍを測定できる。Ｔｍを測定する方法およびタンパク質安定性を決定する他の方法は、下にさらに詳細に記載する。
【０４６９】
ｓｃＦｖにおける変異(可溶性ｓｃＦｖのヒト化または直接変異誘発に起因)は、ｓｃＦｖの安定性を変えることができ、ｓｃＦｖおよびＣＡＲ構築物の全体的安定性を改善する。ヒト化ｓｃＦｖの安定性を、Ｔｍ、変性温度および凝集温度のような測定を使用して、マウスｓｃＦｖと比較する。
【０４７０】
変異体ｃＦｖの結合能を、当分野で知られ、ここに記載するアッセイを使用して、決定できる。
【０４７１】
ある態様において、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異ｓｃＦｖがＣＡＲ構築物への安定性改善に寄与するように、ヒト化過程に起因する少なくとも１変異を含む。他の態様において、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異ｓｃＦｖがＣＡＲ構築物への安定性改善に寄与するように、ヒト化過程に起因する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の変異を含む。
【０４７２】
タンパク質安定性を評価する方法
抗原結合ドメインの安定性を、例えば、下記方法を使用して、評価し得る。このような方法は、協同的に変性する多ドメイン単位(例えば、単一変性転移を示す多ドメインタンパク質)で最も不安定なドメインが最初に変性するかまたは全体的安定性閾値を制限する、多重熱変性転移の決定を可能にする。最も不安定なドメインは、多数の付加的方法により決定できる。変異誘発は、どのドメインが全体的安定性を制限するかを探索するために実施できる。さらに、多ドメインタンパク質のプロテアーゼ耐性を、最も不安定なドメインがＤＳＣまたは他のスペクトル方法により内因的に変性することが知られる条件下で実施できる(Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692)。最も不安定なドメインが同定されたら、そのドメインをコードする配列(またはその一部)を、本方法における試験配列として用い得る。
【０４７３】
ａ)熱安定性
組成物の熱安定性を、当分野で知られる多数の非限定的生物物理学的または生化学的技術を使用して分析し得る。ある態様において、熱安定性を、分析的スペクトロスコピーにより評価する。
【０４７４】
代表的分析的スペクトロスコピー法は示差走査熱量測定(ＤＳＣ)である。ＤＳＣは、ほとんどのタンパク質またはタンパク質ドメインの変性に付随する熱吸収に感受性である熱量計を用いる(例えば、Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988参照)。タンパク質の熱安定性を決定するために、タンパク質サンプルを熱量計に入れ、ＦａｂまたはｓｃＦｖが変性するまで温度を上げる。タンパク質が変性する温度が全体的タンパク質安定性の指標である。
【０４７５】
他の代表的分析的スペクトロスコピー法は、円二色性(ＣＤ)スペクトロスコピーである。ＣＤスペクトロメトリーは、温度上昇の関数として組成物の光学活性を測定する。円二色性(ＣＤ)スペクトロスコピーは、構造非対称により生じる左回り偏光対右回り偏光の吸収の差異を測定する。乱れたまたは変性した構造は、ＣＤスペクトルを、秩序だったまたは折りたたまれた構造のものと極めて異なるものとする。ＣＤスペクトルは、温度上昇の変性効果に対するタンパク質の感受性を反映し、それゆえに、タンパク質の熱安定性の指標である(van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000参照)。
【０４７６】
熱安定性を測定するための他の代表的分析的スペクトロスコピー法は、蛍光発光スペクトロスコピーである(van Mierlo and Steemsma, supra参照)。熱安定性を測定するためのさらに別の代表的分析的スペクトロスコピー法は、核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトロスコピーである(例えばvan Mierlo and Steemsma, supra参照)。
【０４７７】
組成物の熱安定性は、生化学的に測定できる。熱安定性を測定するための代表的生化学的方法は、熱負荷アッセイである。“熱負荷アッセイ”において、組成物を、一定期間、一定範囲の高温に付す。例えば、ある態様において、試験ｓｃＦｖ分子またはｓｃＦｖ分子を含む分子を、例えば、１〜１.５時間、広範囲の温度上昇に付す。次いで、タンパク質の活性を、関連する生化学的アッセイによりアッセイする。例えば、タンパク質が結合タンパク質(例えばｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ含有ポリペプチド)であるならば、結合タンパク質の結合活性を、機能的または定量的ＥＬＩＳＡにより決定できる。
【０４７８】
このようなアッセイは、ハイスループット形式で行うことができ、大腸菌およびハイスループットスクリーニングを使用する実施例に開示のものである。抗原結合ドメインのライブラリー、例えば、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ変異体を含むものを、当分野で知られる方法を使用して、創製し得る。例えば、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインの、例えば、ｓｃＦｖの、発現を誘発でき、例えば、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを熱負荷に付し得る。負荷させた試験サンプルを、結合についてアッセイでき、安定であるここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖをスケールアップし、さらに特徴づけさせ得る。
【０４７９】
熱安定性を、上記技術のいずれか(例えば分析的スペクトロスコピー技術)を使用する、組成物の融解温度(Ｔｍ)の測定により評価する。融解温度は、組成物の分子の５０％が折りたたまれた状態にある、熱転移曲線の中点の温度である(例えば、Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692参照)。ある態様において、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。ある態様において、ＩｇＧのＴｍ値は約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。ある態様において、多価抗体のＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。
【０４８０】
熱安定性はまた、分析的熱量測定技術(例えばＤＳＣ)を使用する組成物の比熱または熱容量(Ｃｐ)の測定によっても評価される。組成物の比熱は、１ｍｏｌの水の温度を１℃上げるのに必要なエネルギー(例えばkcal／mol)である。大きなＣｐが変性したまたは不活性のタンパク質組成物の特徴である。組成物の熱容量変化(ΔＣｐ)を、熱転移前後の組成物の比熱の決定により測定する。熱安定性はまた変性のギブズ自由エネルギー(ΔＧ)、変性のエンタルピー(ΔＨ)または変性のエントロピー(ΔＳ)を含む、熱力学的安定性の他のパラメーターの測定または決定によっても評価し得る。上記生化学的アッセイの１以上(例えば熱負荷アッセイ)を使用して、組成物の５０％がその活性(例えば結合活性)を保持する温度(すなわちＴＣ値)を決定する。
【０４８１】
さらに、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖへの変異を付して、未変異のここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖと比較して、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性を改変できる。ここに記載する癌関連抗原のヒト化抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖをＣＡＲ構築物に取り込んだとき、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ヒト化ｓｃＦｖは、本発明のＣＡＲ全体的に熱安定性を与える。ある態様において、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、ここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖに熱安定性を与える一変異を含む。他の態様において、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖに熱安定性を与える複数変異を含む。ある態様において、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖにおける複数変異は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性にさらなる効果を有する。
【０４８２】
ｂ)凝集％
組成物の安定性は、その凝集する能力の測定により決定できる。凝集は、多数の非限定的生化学的または生物物理学的技術により測定できる。例えば、組成物の凝集は、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を使用して、評価し得る。ＳＥＣは、サイズに基づき分子を分ける。カラムに、イオンおよび小分子を内側に入れるが、大型のものは入れない重合ゲルの半固体ビーズを充填する。タンパク質組成物をカラムの上に載せたとき、小型の折りたたまれたタンパク質(すなわち非凝集タンパク質)は、大タンパク質凝集体よりも大量の溶媒に分散する。その結果、大凝集体はカラムをより迅速に移動し、この方法で混合物をその成分に分離または分画できる。各フラクションを、ゲルから溶出されるに従い、別々に定量化(例えば光散乱により)できる。したがって、組成物の凝集％を、フラクションの濃度とゲルに適用したタンパク質の総濃度の比較により決定できる。安定な組成物は、本質的に単一フラクションとしてカラムから溶出し、溶出プロファイルまたはクロマトグラムで本質的に単一ピークを有する。
【０４８３】
ｃ)結合親和性
組成物の安定性は、その標的結合親和性の決定により評価できる。結合親和性を決定するための多種多様な方法が当分野で知られる。代表的な結合親和性を測定するための方法は、表面プラズモン共鳴を用いる。表面プラズモン共鳴は、例えばBIAcore system(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)を使用する、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化の検出により、実時間生体分子特異的相互作用の分析を可能にする光学現象である。さらなる記載について、Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277参照。
【０４８４】
ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ここに記載する抗原結合ドメインアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有し、該抗原結合ドメインは、ここに記載する抗原結合ドメインの所望の機能的特性を維持する。
【０４８５】
ある特定の面において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。
【０４８６】
多様な面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域内(例えば、ＶＨおよび／またはＶＬ)、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上のアミノ酸の修飾により、操作される。ある特定の面において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。
【０４８７】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、アミノ酸配列が(例えば、野生型から)変えられるが、所望の活性が変えられないようにさらに修飾され得ることを当業者は理解する。例えば、“非必須”アミノ酸残基でのアミノ酸置換を生じるさらなるヌクレオチド置換を、タンパク質になし得る。例えば、分子内の非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置き換え得る。他の態様において、アミノ酸鎖を、側鎖ファミリーメンバーの順番および／または組成が異なる構造的に類似する鎖に置き換えることができ、例えば、あるアミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる保存的置換をなし得る。
【０４８８】
類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で規定されており、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。
【０４８９】
２以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における同一性パーセントは、同じである２以上の配列をいう。次の配列比較アルゴリズムの一つを使用してまたは手動アライメントおよび目視により測定して、比較窓または指定領域にわたり比較し、最大一致のために配列して、２配列が、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定のパーセンテージ(例えば、特定の領域にわたり、または、特定しないとき、全配列にわたり、６０％同一性、所望により７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性)で有するならば、２配列は“実質的に同一”である。所望により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)長の領域またはより好ましくは１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸)長の領域にわたり存在する。
【０４９０】
配列比較のために、一般に一方の配列は対照配列として働き、それに対して、試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および対照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用できまたは代替パラメーターを指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づき、対照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。比較のための配列のアライメントの方法は、当分野で周知である。比較のための配列の最適アライメントを、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似法による検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動アライメントおよび目視(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)により実施できる。
【０４９１】
配列同一性および配列類似性パーセントの決定に適するアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２.０アルゴリズムであり、これはAltschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; and Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410にそれぞれ記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Informationから公的に入手可能である。
【０４９２】
２アミノ酸配列間の同一性パーセントはまたE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)のアルゴリズムを決定しても使用でき、これは、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれ、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する。さらに、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453アルゴリズムを使用して決定でき、これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに組み込まれ(www.gcg.comで利用可能)、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用する。
【０４９３】
ある面において、本発明は、機能的に等価な分子を産生する、出発抗体またはフラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)アミノ酸配列の修飾を意図する。例えば、ＣＡＲに包含される、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬは、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域と少なくとも約７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を維持するように修飾できる。本発明は、機能的に等価な分子を産生するための、ＣＡＲ構築物全体の修飾、例えば、ＣＡＲ構築物の多様なドメインの１以上のアミノ酸配列における修飾を意図する。ＣＡＲ構築物は、出発ＣＡＲ構築物と少なくとも約７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を維持するように修飾できる。
【０４９４】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、多様な態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１以上のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通ドメインが由来するタンパク質の細胞外領域と結合する１以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５のアミノ酸)および／または膜貫通型タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と結合する１以上のさらなるアミノ酸(例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５のアミノ酸)を含むことができる。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインと結合しているもの、例えば、ある態様において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメインまたはヒンジドメインが由来するものと同じタンパク質に由来し得る。他の面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のいずれかのドメインが由来するのと同じタンパク質に由来しない。いくつかの例において、膜貫通ドメインは、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するため、このようなドメインの同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を避けるため、選択できまたはアミノ酸置換により修飾できる。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の他のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる面において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞に存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するために、修飾または置換され得る。
【０４９５】
膜貫通ドメインは、天然由来でも、組み換え供給源由来でもよい。供給源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合するときは、細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明で特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃの少なくとも膜貫通領域を含み得る。
【０４９６】
いくつかの例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合され得る。例えば、ある態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジ(例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ)、ＧＳリンカー(例えば、ここに記載するＧＳリンカー)、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号４のアミノ酸配列を含む(例えば、からなる)。ある面において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の膜貫通ドメインを含む(例えば、からなる)。
【０４９７】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
【化１】
2019206538.tif 000012
のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、
【化２】
2019206538.tif 000013
のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
【０４９８】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
【化３】
2019206538.tif 000014
のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、
【化４】
2019206538.tif 000015
のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
【０４９９】
ある面において、膜貫通ドメインを組み換えてよく、この場合、主としてロイシンおよびバリンのような疎水性残基を含む。ある面においてフェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が、組み換え膜貫通ドメインの各端に見られ得る。
【０５００】
所望により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域の間の結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適当なリンカーを提供する。例えば、ある面において、リンカーは、
【化５】
2019206538.tif 000016
のアミノ酸配列を含む。ある態様において、リンカーは、
【化６】
2019206538.tif 000017
のヌクレオチド配列によりコードされる。
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０５０１】
細胞質ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般にＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。用語“エフェクター機能”は、細胞の専門化された機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解性活性またはヘルパー活性であり得る。それゆえに、用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に専門化された機能の実施を指示するタンパク質の部分をいう。通常細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分を使用する限り、このような切断された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の代わりに使用し得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、それゆえに、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な、細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された部分を含むことを意図する。
【０５０２】
本発明のＣＡＲに使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体結合後のシグナル伝達開始に協調して働くＴ細胞受容体(ＴＣＲ)と共受容体の細胞質配列ならびにこれらの配列のあらゆる誘導体または変異体および同じ機能的能力を有するあらゆる組み換え配列を含む。
【０５０３】
ＴＣＲのみを介して産生されたシグナルがＴ細胞の完全活性化に不十分であり、二次的および／または共刺激シグナルも必要であることが知られる。それゆえに、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)を介する抗原依存性一次活性化を開始するものおよび二次的または共刺激シグナル(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)を提供するために抗原非依存的様式で作用するものの、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列により介在されるということができる。
【０５０４】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激方向または阻害方向のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激様式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
【０５０５】
本発明において得に有用なＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２のものを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０５０６】
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、天然のＩＴＡＭドメインと比較して活性が改変(例えば、増加または低下)された修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば、変異ＩＴＡＭドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または切断したＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
【０５０７】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを単独で含んでも、それを本発明の文脈においてのＣＡＲに有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてもよい。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの共刺激分子の細胞内ドメインを含む部分をいう。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の増殖、エフェクター機能および生存を増強し、インビボでヒトＴ細胞持続および抗腫瘍活性を増強することが示されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／ＣｂｐおよびＣＤ１９ａを含む。
【０５０８】
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、無作為にまたは特定の順番で互いに連結され得る。所望により、例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長の、短オリゴまたはポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間の結合を形成し得る。ある態様において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。ある態様において、単アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
【０５０９】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２以上の、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、２以上の、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により離される。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある態様において、リンカーはアラニン残基である。
【０５１０】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１４のシグナル伝達ドメインである。ある面において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のシグナル伝達ドメインである。
【０５１１】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、
【化７】
2019206538.tif 000018
のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、
【化８】
2019206538.tif 000019
の核酸配列によりコードされる。
【０５１２】
ある面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに第二ＣＡＲ、例えば、同じ標的または異なる標的(例えば、ここに記載する癌関連抗原以外の標的または異なるここに記載する癌関連抗原)に対する、例えば、異なる抗原結合ドメインを含む、第二ＣＡＲを含む。ある態様において、第二ＣＡＲは、癌関連抗原と同じ癌細胞型に発現される標的に対する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、第一抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一抗原および第二の、異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。理論に縛られることを望まないが、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＯＸ−４０の第一ＣＡＲへの配置および一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの第二ＣＡＲへの配置は、両標的が発現される場所である細胞へのＣＡＲ活性を限定できる。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載する標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一癌関連抗原ＣＡＲおよび異なる標的抗原(例えば、第一標的抗原と同じ癌細胞型に発現される抗原)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載する標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第一標的抗原以外の抗原(例えば、第一標的と同じ癌細胞型に発現される抗原抗原)を標的とし、該抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
【０５１３】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載するＸＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、ＣＬＬを発現する正常細胞にも見られるが、癌細胞に見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
【０５１４】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が２以上の異なるＣＡＲを含むとき、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第一および第二ＣＡＲを発現する細胞は、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインを、例えば、フラグメント、例えば、ｓｃＦｖとして有してよく、これは、第二ＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨＨである第二ＣＡＲの抗原結合ドメインと結合を形成しない。
【０５１５】
ある態様において、抗原結合ドメインは、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む、単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、天然に軽鎖を欠く結合分子、従来の４鎖抗体由来の単一ドメイン、操作されたドメインおよび抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は現在のあらゆるまたは将来のあらゆる単一ドメイン分子であり得る。ＳＤＡＢ分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されないあらゆる種由来であり得る。この用語はまたラクダ科動物およびサメ以外の種由来の天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
【０５１６】
ある面において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清において見られる新規抗原受容体(ＮＡＲ)として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来のもののような、魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲ(“ＩｇＮＡＲ”)の可変領域に由来する単一ドメイン分子を産生する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909参照。
【０５１７】
他の面によって、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に開示されている。明確にするために、この天然に重鎖を欠く重鎖分子由来の可変ドメインを、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、ここではＶＨＨまたはナノボディと記載する。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコ由来であり得る。ラクダ科以外の他の種も、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生でき、このようなＶＨＨは本発明の範囲内である。
【０５１８】
ＳＤＡＢ分子は、組み換え体、ＣＤＲ移植された、ヒト化された、ラクダ化された、脱免疫されたおよび／またはインビトロ産生された(例えば、ファージディスプレイにより選択)ものであり得る。
【０５１９】
複数受容体の抗原結合ドメイン間で相互作用する抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞が、例えば、抗原結合ドメインの１以上がその同族抗原と結合する能力を阻害するため、望ましくないことがあることも発見された。したがって、このような相互作用を最小化する、抗原結合ドメインを含む、第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞がここに開示される。このような相互作用を最小化する、抗原結合ドメインを含む、第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸ならびにこのような細胞および核酸を製造および使用する方法もここに開示される。ある態様において、該第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。
【０５２０】
ある態様において、本発明は、第一および第二ＣＡＲを含み、ここで、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメインおよび可変重ドメイメインを含まない。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはナノボディを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【０５２１】
ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトまたはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
【０５２２】
ある態様において、細胞の表面上に存在するとき、該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該二ＣＡＲの存在により実質的に低減されない。ある態様において、該第二ＣＡＲ存在下の該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、該第二ＣＡＲ非存在下の該第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【０５２３】
ある態様において、細胞の表面上に存在するとき、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より少なく互いに結合する。ある態様において、該第一ＣＡＲおよび該第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少なく相互に結合する。
【０５２４】
他の面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、ＰＤ１は、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、ここに記載する分子、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む薬剤である。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)のような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するように、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８を含む)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメントの第一ポリペプチド(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄性細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対する２リガンドが、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌で豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転され得る。
【０５２５】
ある態様において、薬剤は、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに融合した、阻害分子、例えば、プログラム細胞死１(ＰＤ１)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含む(ここではＰＤ１  ＣＡＲとも呼ぶ)。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、ここに記載するＸＣＡＲと組み合わせて使用したとき、Ｔ細胞の持続を改善する。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号２６において下線で示すＰＤ１の細胞外ドメインを含む、ＰＤ１  ＣＡＲである。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
【化９】
2019206538.tif 000020
【０５２６】
ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、下に示すアミノ酸配列を含む(配列番号３９)。
【化１０】
2019206538.tif 000021
【０５２７】
ある態様において、薬剤は、ＰＤ１  ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲのための核酸配列を下に示し、ＰＤ１  ＥＣＤは、下の配列番号２７で下線を引いている。
【化１１】
2019206538.tif 000022
【０５２８】
他の面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の集団を提供する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある態様において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞および異なる抗原結合ドメイン、例えば、異なるここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるＣＡＲの抗原結合ドメインにより結合される癌関連抗原と異なるここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含むことができる。他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびここに記載する癌関連抗原以外の標的に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
【０５２９】
他の面において、本発明は細胞の集団を提供し、ここで、集団における少なくとも１つの細胞はここに記載する癌関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞は他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、ＰＤ−１は、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低減させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、ここに記載する分子、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む薬剤である。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメントのような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ−１またはそのフラグメントの第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
【０５３０】
ある面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の集団、例えば、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を、他の薬剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。他の面において、本発明は、集団における少なくとも１つの細胞がここに記載する癌関連抗原の抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞が他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する細胞の集団を、他の薬剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。
【０５３１】
調節可能なキメラ抗原受容体
ある態様において、ＣＡＲ活性が制御できる調節可能なＣＡＲ(ＲＣＡＲ)が、ＣＡＲ治療の安全性および有効性を最適化するために望まれる。ＣＡＲ活性を制御できる多くの方法がある。例えば、二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用する、例えば、誘導性アポトーシス(例えば、Di et al., N Egnl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683参照)を、本発明のＣＡＲ治療における安全スイッチとして使用できる。ある面において、ＲＣＡＲは、ここに記載する標準的ＣＡＲの成分、例えば、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが別々のポリペプチドまたはメンバーに配置されている、一般に最も単純な態様において２つの、一連のポリペプチドを含む。ある態様において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在下、ポリペプチドを互いに連結できる、例えば、抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結できる、二量体化スイッチを含む。
【０５３２】
ある面において、ＲＣＡＲは、１)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；２)ここに記載するような、例えば、ここに記載する腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーの２のポリペプチドまたはメンバーを含む。所望により、ＲＣＡＲは、ここに記載する膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー上、抗原結合メンバー上または両者の上に配置できる。(特に断らない限り、ＲＣＡＲのメンバーまたは要素がここに記載されているとき、順番は示されるとおりであってよいが、他の順番も同様に含まれる。換言すると、ある態様において、順番は本文に記載したとおりであるが、他の態様において、順番は異なり得る。例えば、膜貫通領域の一方の要素の順番は例と異なってよく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの位置は、異なる、例えば、逆でよい)。
【０５３３】
ある態様において、第一および第二スイッチドメインは、細胞内または細胞外二量体化スイッチ由来であり得る。ある態様において、二量体化スイッチは、例えば、第一および第二スイッチドメインが同じであるホモ二量体化スイッチでも、例えば、第一および第二スイッチドメインが互いに異なるヘテロ二量体化スイッチでもよい。
【０５３４】
ある態様において、ＲＣＡＲは“マルチスイッチ”を含み得る。マルチスイッチは、ヘテロ二量体化スイッチドメインまたはホモ二量体化スイッチドメインを含み得る。マルチスイッチは、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーと無関係に、複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のスイッチドメインを含む。ある態様において、第一メンバーは複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは、複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。ある態様において、第一メンバーは、第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは、第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。
【０５３５】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０５３６】
ある態様において、抗原結合メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２または３の、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択されるここに記載する共刺激シグナル伝達ドメインを含み、ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む：４１ＢＢ−ＣＤ２７；４１ＢＢ−ＣＤ２７；ＣＤ２７−４１ＢＢ；４１ＢＢ−ＣＤ２８；ＣＤ２８−４１ＢＢ；ＯＸ４０−ＣＤ２８；ＣＤ２８−ＯＸ４０；ＣＤ２８−４１ＢＢ；または４１ＢＢ−ＣＤ２８。このような態様において、細胞内結合メンバーは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。一つのこのような態様において、ＲＣＡＲは、(１)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび２共刺激ドメインを含む抗原結合メンバーおよび第一スイッチドメイン；および(２)膜貫通ドメインまたは膜係留ドメインおよび少なくとも１つの一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む。
【０５３７】
ある態様は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞の表面上に係留されていないＲＣＡＲを提供する。これは、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞が、細胞を抗原結合メンバーをコードする配列でトランスフォームすることなく、１以上の抗原結合ドメインと好都合に対形成することを可能とする。このような態様において、ＲＣＡＲは、１)第一スイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは膜貫通ドメインまたは膜係留ドメインを含まず、所望により、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに３)第二抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインにより結合されるのと異なる抗原に結合する第二抗原結合ドメインを含む第二抗原結合メンバー；および第二スイッチドメインを含み得る。
【０５３８】
抗原結合メンバーが二重特異的活性化およびターゲティング能を含む、ＲＣＡＲもここで提供される。この態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２、３、４または５の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを含んでよく、ここで、各抗原結合ドメインが、標的抗原、例えば異なる抗原または同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合する。ある態様において、複数の抗原結合ドメインは直列であり、所望により、リンカーまたはヒンジ領域が抗原結合ドメインの各々の間に配置される。適当なリンカーおよびヒンジ領域は、ここに記載される。
【０５３９】
ある態様は、増殖のスイッチングを可能にする配置を有するＲＣＡＲを提供する。この態様において、ＲＣＡＲは、１)所望により、膜貫通ドメインまたは膜係留ドメイン；１以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択されるおよびスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーはスイッチドメインを含まないか、または細胞内シグナル伝達メンバーのスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーは、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーはヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような態様において、第二細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、二量体化スイッチは細胞内である。ある態様において、二量体化スイッチは細胞外である。
【０５４０】
ここに記載するＲＣＡＲ配置のいずれかにおいて、第一および第二スイッチドメインは、ここに記載するＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０５４１】
ここに記載するＲＣＡＲを含む細胞もここで提供される。ＲＣＡＲを発現するように操作されたあらゆる細胞を、ＲＣＡＲＸ細胞として使用できる。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と呼ぶ。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と呼ぶ。
【０５４２】
またここｎ提供されるのは、ＲＣＡＲコード化配列を含む核酸およびベクターである。ＲＣＡＲの多様な要素をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。ある態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列を、同じ核酸、例えば、ベクターに配置できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別のプロモーターの使用によりまたはバイシストロニック転写産物(単一翻訳産物の開裂によりまたは２つの別のタンパク質産物の翻訳により２つのタンパク質の産生を生じさせ得る)の使用により、達成できる。ある態様において、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列を、(ｉ)と(ii)の間に配置する。ある態様において、ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１  ＩＲＥＳをコードする配列を、(ｉ)と(ii)の間に配置する。これらの態様において、(ｉ)および(ii)は、単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、(ｉ)および(ii)が別々のｍＲＮＡとして転写されるように、第一プロモーターを(ｉ)に操作可能に連結し、第二プロモーターを(ii)に操作可能に連結する。
【０５４３】
あるいは、ＲＣＡＲの多様な要素をコードする配列を、異なる核酸分子、例えば、異なるプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。例えば、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列を第一核酸、例えば、第一ベクターに配置してよく、(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列を第二核酸、例えば、第二ベクターに配置してよい。
【０５４４】
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは、非共有結合でも共有結合でもよい。非共有結合二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有結合相互作用を促進する。において、共有結合二量体化スイッチ、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有結合相互作用を促進する。
【０５４５】
ある態様において、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰまたはＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２(ＦＫＢＰまたはＦＫ５０６結合タンパク質)は、天然産物免疫抑制剤、ラパマイシンの初期細胞内標的として働く豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰおよび大ＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰ(ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ)に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合に十分なＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51)。
【０５４６】
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログを使用できる。
【０５４７】
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は次のとおりである。
【化１２】
2019206538.tif 000023
【０５４８】
ある態様において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシンまたはラパログの存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメント、例えば、次のとおりである配列番号５４の下線部分である。
【化１３】
2019206538.tif 000024
【０５４９】
ＦＲＢのアミノ酸配列は次のとおりである。
【化１４】
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【０５５０】
“ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチ”は、該用語がここで使用されている限り、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の存在下で、ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰフラグメントまたはそのアナログを含み、配列番号５４または５５のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するか、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない第一スイッチドメイン；およびラパマイシンまたはラパログの存在下ＦＲＢまたはそのフラグメントまたはアナログと結合する能力を有するＦＲＢフラグメントまたはそのアナログを含み、配列番号５６のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するか、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１アミノ酸残基を超えて異ならない第二スイッチドメインを含む、二量体化スイッチをいう。ある態様において、ここに記載するＲＣＡＲは、配列番号５４(または配列番号５５)に開示するアミノ酸残基を含む一つのスイッチドメインおよび配列番号５６に開示するアミノ酸残基を含む一つのスイッチドメインを含む。
【０５５１】
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢベースのスイッチドメイン、例えば、修飾ＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインと、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の複合体形成が改変された、例えば、増強された、修飾ＦＲＢスイッチドメインを含む。ある態様において、修飾ＦＲＢスイッチドメインは、アミノ酸位置Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８での変異から選択される１以上の変異、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異を含み、ここで、該野生型アミノ酸が任意の他の天然に存在するアミノ酸に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２での変異を含み、ここで、Ｅ２０３２はフェニルアラニン(Ｅ２０３２Ｆ)、メチオニン(Ｅ２０３２Ｍ)、アルギニン(Ｅ２０３２Ｒ)、バリン(Ｅ２０３２Ｖ)、チロシン(Ｅ２０３２Ｙ)、イソロイシン(Ｅ２０３２Ｉ)(例えば、配列番号５７)またはロイシン(Ｅ２０３２Ｌ)(例えば、配列番号５８)に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＴ２０９８での変異を含み、ここで、Ｔ２０９８はフェニルアラニン(Ｔ２０９８Ｆ)またはロイシン(Ｔ２０９８Ｌ)(例えば、配列番号５９)に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２およびＴ２０９８での変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は任意のアミノ酸に変異され、Ｔ２０９８は任意のアミノ酸に変異され、例えば、配列番号６０である。ある態様において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌ変異(例えば、配列番号６１)を含む。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異(例えば、配列番号６２)を含む。
【０５５２】
【表１１】
2019206538.tif 000026
【０５５３】
他の適当な二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／バインダー二量体化スイッチおよびハロタグ／ｓｎａｐタグ二量体化スイッチを含む。ここに提供する指針に従い、このようなスイッチおよび関連する二量体化分子は、当業者には明らかである。
【０５５４】
二量体化分子
スイッチドメイン間の結合は、二量体化分子により促進される。二量体化分子存在下、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一スイッチドメインと結合した、例えば、融合したポリペプチドと第二スイッチドメインと結合した、例えば、融合したポリペプチドの間のシグナル伝達を可能にする。非律速レベルの二量体化分子存在下、シグナル伝達は、例えば、ここに記載する系において測定して、１.１倍、１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍増加する。
【０５５５】
ラパマイシンおよびラパマイシンアナログ(ラパログと呼ぶこともある)、例えば、ＲＡＤ００１を、ここに記載するＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。ある態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、ＲＡＤ００１(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびＡＰ２１９６７から選択できる。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチと使用するのに適するさらなるラパマイシンアナログは、さらに“組み合わせ治療”なる表題の部分または表題“代表的ｍＴＯＲ阻害剤”の部分に記載する。
【０５５６】
分裂ＣＡＲ
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、分裂ＣＡＲを使用する。分裂ＣＡＲ手法は、公開ＷＯ２０１４／０５５４４２号およびＷＯ２０１４／０５５６５７号にさらに詳細に記載される。簡潔には、分裂ＣＡＲ系は第一抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、４１ＢＢ)を有する第一ＣＡＲを発現する細胞を含み、細胞はまた第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を有する第二ＣＡＲを発現する。細胞が第一抗原と遭遇したとき、共刺激ドメインは活性化され、細胞が増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインは活性化され、細胞死活性が開始する。それゆえに、ＣＡＲ発現細胞は、両抗原の存在下でのみ完全活性化される。
【０５５７】
ＲＮＡトランスフェクション
インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲを産生する方法がここに開示される。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトできるＲＮＡ構築物をコードするＣＡＲも含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、一般に５０〜２０００塩基長(配列番号３２)の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現させるべき核酸およびポリＡテイルを含む構築物を産生するための特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含む。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞を効率的にトランスフェクトできる。ある面において、鋳型はＣＡＲのための配列を含む。
【０５５８】
ある面において、本発明のＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされる。ある面において、ここに記載するＣＡＲをコードするｍＲＮＡを、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ  ＮＫ細胞の産生のために免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に導入する。
【０５５９】
ある態様において、インビトロ転写ＲＮＡ  ＣＡＲを、一過性トランスフェクションの形で細胞に導入できる。ＲＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により産生した鋳型を使用してインビトロ転写により産生する。任意の供給源からの目的のＤＮＡを、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲによりインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接変換できる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列またはあらゆる他のＤＮＡの適切な供給源であり得る。インビトロ転写のための所望の鋳型は、ここに記載するＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲのための鋳型は、ここに記載する腫瘍関連抗原に対する抗体の単一鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域(例えば、ここに記載するヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメインのようなここに記載する膜貫通ドメイン)；および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインを含む、例えば、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む、細胞質領域を含む。
【０５６０】
ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であり得る。ある態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)の一部または全てを含み得る。核酸はエクソンおよびイントロンを含み得る。ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはヒト核酸配列である。他の態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、代替的に天然に存在する生物で通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。代表的人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームをコードするために一緒にライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。一緒にライゲートされたＤＮＡの部分は、単一生物由来でも、１種を超える生物由来でもよい。
【０５６１】
ＰＣＲを使用して、トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型を産生する。ＰＣＲを実施する方法は、当分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するためのプライマーは、ＰＣＲで鋳型として使用するＤＮＡの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計する。ここで使用する“実質的に相補的”は、プライマー配列における塩基の大部分または全てが相補的であるかまたは１以上の塩基が非相補的または不適正である、ヌクレオチド配列をいう。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下、意図するＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される(オープンリーディングフレーム)核酸の部分を増幅するように設計できる。プライマーはまた目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。ある態様において、プライマーは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野で周知である合成方法により産生できる。“順方向プライマー”は、増幅すべきＤＮＡ配列の上流にある、ＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“上流”は、コード鎖に対して増幅すべきＤＮＡ配列に対する５’位置をいう。“逆方向プライマー”は、増幅すべきＤＮＡ配列の下流である、二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“下流”は、コード鎖に対して増幅すべきＤＮＡ配列に対する３’位置をいう。
【０５６２】
ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼを、ここに開示する方法において使用できる。試薬およびポリメラーゼは、多数の供給源から商業的に入手可能である。
【０５６３】
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用し得る。ＲＮＡは、好ましくは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを有する。ある態様において、５’ＵＴＲは１〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加すべき５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのためのプライマーの設計を含むがこれらに限定されず、種々の方法により変えることができる。この試みを使用して、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクション後の最適翻訳効率を達成するのに必要な５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ長を修飾できる。
【０５６４】
５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、目的の核酸の天然に存在する、内在性５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列を、ＵＴＲ配列を順方向および逆方向プライマーに取り込むことによりまたは鋳型の任意の他の修飾により付加できる。目的の核酸に対して内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率の修飾に有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列におけるＡＵに富む配列がｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られる。それゆえに、３’ＵＴＲは、当分野で周知である、ＵＴＲの特性に基づき転写されたＲＮＡの安定性を高めるように選択または設計できる。
【０５６５】
ある態様において、５’ＵＴＲは、内在性核酸のコザック配列を含み得る。あるいは、目的の核酸に対して内在性ではない５’ＵＴＲが上記のようにＰＣＲにより付加されるとき、コンセンサスコザック配列を、５’ＵＴＲ配列の付加により再設計できる。コザック配列は、いくつかのＲＮＡ転写物の翻訳効率を高め得るが、効率的翻訳を可能にするために全てのＲＮＡが必要とするとは考えられない。多くのｍＲＮＡについてのコザック配列の必要性は当分野で知られる。他の態様において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の態様において、多様なヌクレオチドアナログを、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために３’または５’ＵＴＲに使用できる。
【０５６６】
遺伝子クローニングの必要性なしにＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能とするために、転写のプロモーターを、転写すべき配列の上流でＤＮＡ鋳型に結合しなければならない。ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの５’末端に付加したとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写すべきオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に取り込まれるようになる。ある好ましい態様において、プロモーターは、本明細書の他の場所に記載するＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当分野で知られる。
【０５６７】
好ましい態様において、ｍＲＮＡは、細胞におけるｍＲＮＡのリボソーム結合、翻訳の開始および安定性を規定する、５’末端および３’ポリ(Ａ)テイルの両者にキャップを有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞における発現に不適な、長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後にポリアデニル化されても、真核トランスフェクションに有効ではない通常サイズのｍＲＮＡをもたらす。
【０５６８】
直線状ＤＮＡ鋳型上で、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは鋳型の最後の塩基を越えて転写物の３’末端を伸長できる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。
【０５６９】
ＤＮＡ鋳型へのポリＡ／Ｔストレッチの組込みの従来の方法は分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡへのポリＡ／Ｔ配列の統合はプラスミドを不安定にする可能性があり、これが、細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型がしばしば欠失および他の異常により高度に汚染されている理由である。これは、クローニング法を面倒で時間がかかるものとするだけでなく、しばしば信頼できないものとする。これは、クローニングなしでポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチを伴うＤＮＡ鋳型の構築を可能とする方法が非常に望まれるかの理由である。
【０５７０】
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００Ｔテイル(配列番号３５)(サイズは５０〜５０００Ｔ(配列番号３６)であり得る)のようなポリＴテイルを含む逆方向プライマーの使用によりＰＣＲ中にまたはＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない任意の他の方法によりＰＣＲ後に産生できる。ポリ(Ａ)テイルはまたＲＮＡに安定性を提供し、分解を減らす。一般に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写ＲＮＡの安定性と正に相関する。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルは１００〜５０００アデノシン(配列番号３７)である。
【０５７１】
ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルは、さらに大腸菌ポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)のようなポリ(Ａ)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写に転写できる。ある態様において、１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチド(配列番号３８)へのポリ(Ａ)テイルの長さの増加が、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加をもたらす。さらに、異なる化学基の３’末端への付加は、ｍＲＮＡ安定性を増加できる。このような付加は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログを、ポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用してポリ(Ａ)テイルに取り込ませ得る。ＡＴＰアナログは、ＲＮＡの安定性をさらに増加できる。
【０５７２】
５’キャップもまたＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい態様において、ここに開示する方法により産生されたＲＮＡは５’キャップを含む。５’キャップは当分野で知られ、ここに記載す技術を使用して提供される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444(2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95(2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966(2005))。
【０５７３】
ここに開示する方法により産生されたＲＮＡはまた配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)配列を含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進する、あらゆるウイルスの、染色体のまたは人工的に設計された配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤のような細胞透過性および生存能促進する因子を含み得る、細胞エレクトロポレーションに適するあらゆる溶質が包含され得る。
【０５７４】
ＲＮＡは、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、ECM 830 (BTX)(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマー被包、ペプチド介在トランスフェクションまたは“遺伝子銃”のような微粒子銃送達系(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)を含むが、これらに限定されない多数の異なる方法、例えば、商業的に入手可能な方法のいずれかを使用して、標的細胞に導入できる。
【０５７５】
非ウイルス性送達法
ある面において、非ウイルス性の方法を使用して、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を細胞または組織または対象に送達できる。
【０５７６】
ある態様において、非ウイルス性の方法は、トランスポゾン(転位因子とも呼ばれる)の使用を含む。ある態様において、トランスポゾンは、ゲノムにおけるある場所にそれ自体挿入できる一片のＤＮＡ、例えば、自己複製し、そのコピーをゲノムに挿入できる一片のＤＮＡまたは長い核酸から切り出され、ゲノムの他の場所に挿入され得る一片のＤＮＡである。例えば、トランスポゾンは、転位のための遺伝子に隣接した逆方向反復からなるＤＮＡ配列である。
【０５７７】
トランスポゾンを使用する核酸送達の代表的方法は、Sleeping Beautyトランスポゾン系(ＳＢＴＳ)およびｐｉｇｇｙＢａｃ(ＰＢ)トランスポゾン系を含む。例えば、全てを引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; and Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83参照。
【０５７８】
ＳＢＴＳは、１)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび２)トランスポサーゼ酵素の供給源の２成分を含む。トランスポサーゼは、担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)からのトランスポゾンを、宿主細胞染色体／ゲノムのような標的ＤＮＡに転位できる。例えば、トランスポサーゼは担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子を含む)をプラスミドから切り出し、それを宿主細胞のゲノムに導入する。例えば、Aronovich et al. supra参照。
【０５７９】
代表的トランスポゾンは、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、全てを引用により本明細書に包含させる、Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47;およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971参照。代表的トランスポサーゼは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒタイプトランスポサーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポサーゼまたはＳＢ１１トランスポサーゼ(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現され得る、高活性トランスポサーゼ)を含む。例えば、全てを引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al.; Kebriaei et al.;およびGrabundzija et al.参照。
【０５８０】
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能にする。例えば、ＳＢＴＳのようなトランスポゾン系を使用する、ここに記載するＣＡＲを安定に発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を産生する方法をここに提供する。
【０５８１】
ここに記載する方法によって、ある態様において、ＳＢＴＳ要素を含む１以上の核酸、例えば、プラスミドを、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に送達する。例えば、核酸は、核酸(例えば、プラスミドＤＮＡ)送達の標準法、例えば、ここに記載する方法、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたはリポフェクションにより送達される。ある態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。ある態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸)を含むトランスポゾンならびにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の態様において、２核酸を伴う系、例えば、第一プラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第二プラスミドがトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、例えば、デュアル−プラスミド系を提供する。例えば、第一および第二核酸は、宿主細胞に共送達される。
【０５８２】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、ＳＢＴＳを使用する遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または操作メガヌクレアーゼ再設計ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用する遺伝子エディティングの組み合わせを使用することにより、産生される。
【０５８３】
ある態様において、非ウイルス性の送達法の使用は、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の再プログラムおよび対象への細胞の直接注入を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、容易性および比較的低コストでの患者集団に見合う十分量の産生、貯蔵中の安定性および免疫原性欠如を含むが、これらに限定されない。
【０５８４】
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明はまた、１以上のここに記載するＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を提供する。ある面において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。ある面において、核酸分子はＤＮＡ構築物として提供される。
【０５８５】
したがって、ある面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする核酸分子に関し、ここで、ＣＡＲは、ここに記載する腫瘍抗原と結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン(例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン)および刺激ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する共刺激シグナル伝達ドメイン)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載するゼータ鎖)を含む細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐの、少なくとも膜貫通領域を含み得る。
【０５８６】
ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、抗原結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジにより膜貫通ドメインに接続される。ある態様において、ヒンジ領域は、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、単離核酸分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６およびＰＡＧ／Ｃｂｐを含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号１６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、機能的４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１４または配列番号１６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号１８または配列番号２０の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレーム内に、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
【０５８７】
他の面において、本発明は、配列番号２のリーダー配列、ここに記載するｓｃＦｖドメイン、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)のヒンジ領域、配列番号１２の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有する膜貫通ドメイン、配列番号１４の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号１６の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ２７共刺激ドメインおよび配列番号１８または配列番号２０の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む、単離ＣＡＲをコードする核酸分子構築物に関する。
【０５８８】
他の面において、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする核酸分子分子に関し、ここで、該抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣＬ１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＲＳＳ２１、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１からなる群から選択される腫瘍抗原に結合する。
【０５８９】
ある態様において、コード化ＣＡＲ分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号１４の配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、機能的４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号１４の配列および配列番号１８の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレーム内に、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、ここに記載する抗癌関連抗原結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通ドメインに接続される。ある態様において、ヒンジ領域は配列番号４を含む。ある態様において、ヒンジ領域は配列番号６または配列番号８または配列番号１０を含む。
【０５９０】
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用する、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子の導出またはそれを含む細胞および組織から直接の単離のような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を、クローン化ではなくむしろ合成的に製造できる。
【０５９１】
本発明はまた本発明のＤＮＡが導入されている、ベクターも提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期の安定な組込みおよび娘細胞へのその伝播を可能にするため、長期遺伝子移入の達成に適当なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖細胞に形質導入できるため、マウス白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルス由来のベクターを超えるさらなる利点を有する。それらはまた低免疫原性のさらなる利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(ＰＢＳ)、１以上の(例えば、２)末端反復配列(ＬＴＲ)および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのようなウイルス構造遺伝子を欠き得る。代表的ガンマレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)およびそれ由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載される。
【０５９２】
他の態様において、所望の本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。他の態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、sleeping beauty、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９および亜鉛フィンガーヌクレアーゼのようなトランスポゾンの使用により達成される。下記引用により包含するJune et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716参照。
【０５９３】
概要において、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、一般にＣＡＲをコードする核酸ポリペプチドまたはその一部をプロモーターに操作可能に連結し、構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成される。ベクターは、真核生物における複製および組込みに適当であり得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
【０５９４】
本発明の発現構築物はまた標準的遺伝子送達プロトコールを使用する核酸免疫化および遺伝子治療にも使用し得る。遺伝子送達のための方法は当分野で知られる。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許５,３９９,３４６号、５,５８０,８５９号、５,５８９,４６６号参照。他の態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【０５９５】
核酸を、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。
【０５９６】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供され得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY)および他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１つの生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許６,３２６,１９３号)。
【０５９７】
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。その後、組み換えウイルスを、単離し、インビボまたはエクスビボで対象の細胞に送達できる。多数のレトロウイルス系が当分野で知られる。ある態様において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。ある態様において、レンチウイルスベクターを使用する。
【０５９８】
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。一般に、これらは、開始部位の領域３０〜１１０ｂｐ上流に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位下流に同様に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の間隙は、要素が互いに倒置または移動したときプロモーター機能が保持されるように、しばしば可動性である。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隙は、活性が低下し始める前、５０ｂｐ離れるまで増加できる。プロモーターによって、個々の要素が、転写を活性化するために協同的にまたは非依存的に機能できるように見える。代表的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。
【０５９９】
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲコード化核酸分子の発現が可能なプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然のＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う伸長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現である。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された核酸分子からのＣＡＲ発現の駆動に有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17 (8): 1453-1464 (2009)参照。ある面において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１として提供する配列を含む。
【０６００】
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それと操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターを含むが、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列も使用し得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に制限されるべきではない。誘導性プロモーターも、本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、その発現が望まれるとき、オンにでき、または発現が望まれないとき、その発現をオフにできる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０６０１】
ベクターはまた、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子から)、エピソーム複製および原核生物における複製を可能にする要素(例えばＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当分野で知られるその他)および／または選択を可能にする要素(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー)も含み得る。
【０６０２】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入すべき発現ベクターはまた、ウイルスベクターによるトランスフェクトまたは感染が求められる細胞の集団からの、発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両者も含み得る。他の面において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの別々の断片上で実施でき、共トランスフェクション過程において使用し得る。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の両者は、宿主細胞における発現を可能とするために適切な制御配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏのような抗生物質耐性遺伝子などを含む。
【０６０３】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞の同定および制御配列の機能性の評価のために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないかまたはそれにより発現されず、発現がある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子をいう。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後適当な時点でアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技術を使用して製造しても、商業的に得てもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を伴う構築物を、プロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤の評価のために使用し得る。
【０６０４】
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターの状況において、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に、当分野の任意の方法により容易に導入できる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段により、宿主細胞に移入される。
【０６０５】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入に好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０６０６】
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号参照。
【０６０７】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系のようなコロイド分散体系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達のような、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。
【０６０８】
非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の面において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含または複合体化または他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとしてまたは“崩壊”構造を有して存在し得る。それらはまた単に溶液に分散され、恐らく、サイズまたは形が均一ではない凝集体を形成し得る。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群およびその誘導体を含む。
【０６０９】
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ、コレステロール(“Ｃｈｏｉ”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL.)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液を、約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために、唯一の溶媒として使用する。“リポソーム”は、封入された脂質二重層または凝集体の産生により形成される多様な単および多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を伴う小胞構造を有することにより特徴付けられる。多層状リポソームは、水性媒体により分離された、複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質要素は、閉構造形成前に自己凝集し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であるかまたは単に脂質分子の不均一凝集体として存在すると考えられ得る。リポフェクタミン−核酸複合体もまた考慮される。
【０６１０】
外来性核酸を宿主細胞に導入するまたはそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ、薬剤の同定に使用するための例えば、免疫学的手段(ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット)により、特定のペプチドの存在または不在を検出するような“生化学的”アッセイまたは本発明の範囲内に入るここに記載するアッセイを含む。
【０６１１】
本発明は、さらにＣＡＲコード化核酸分子を含むベクターを提供する。ある面において、ＣＡＲベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入できる。ある面において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、１以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重分染色体)、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含むが、これらに限定されない、ベクターである。ある面において、ベクターは、哺乳動物免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)におけるＣＡＲ構築物の発現が可能である。ある面において、哺乳動物Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。ある面において、哺乳動物ＮＫ細胞はヒトＮＫ細胞である。
【０６１２】
細胞の供給源
増殖および遺伝的修飾または他の修飾の前に、細胞、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の供給源を、対象から得ることができる。用語“対象”は、免疫応答が惹起できる生存生物(例えば、哺乳動物)を含むことを意図する。対象の例は、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。
【０６１３】
本開示のある面において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ＦｉｃｏｌｌＴＭ分離のような、当業者に知られるあらゆる技術を使用して、対象から採取した血液の単位から得ることができる。ある好ましい面において、個体の循環血液からの細胞をアフェレシスにより得る。アフェレシス産物は、一般にＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含む、リンパ球、赤血球および血小板を含む。ある面において、アフェレシスにより採取した細胞は血漿画分を除去するために洗浄し、所望により、細胞を続くプロセシング過程のために適切な緩衝液または媒体に入れることができる。ある態様において、細胞を、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄する。別の態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよく、または全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いてよい。
【０６１４】
カルシウム非存在下の初期活性化過程は、活性化の増強に至り得る。当業者には容易に認識されるように、洗浄工程は、製造業者の指示に従う、半自動化“フロースルー”遠心分離(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)により達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａまたは他の緩衝剤を含むまたは含まない食塩水溶液のような、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。あるいは、アフェレシスサンプルの望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
【０６１５】
本適用の方法は、５％以下、例えば２％の、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、既知培養培地条件および組成物、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31に記載のものを用いることができることは認識される。
【０６１６】
ある面において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配による遠心分離または対向流遠心溶出法により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。
【０６１７】
ここに記載する方法は、例えば、ここに記載する、例えば、陰性選択技術を使用する、例えば、Ｔ制御性細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋  枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞の特異的亜集団、例えば、Ｔ細胞の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
【０６１８】
ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して集団から除去する。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドを、基質、例えば、ビーズにコンジュゲートするかまたは他に基質、例えば、ビーズ上に被覆させる。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントを、ここに記載の基質にコンジュゲートさせる。
【０６１９】
ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、ＭｉｌｔｅｎｙｉＴＭからのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除去する。ある態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比は１ｅ７細胞対２０μＬまたは１ｅ７細胞対１５μＬまたは１ｅ７細胞対１０μＬまたは１ｅ７細胞対５μＬまたは１ｅ７細胞対２.５μＬまたは１ｅ７細胞対１.２５μＬである。ある態様において、例えば、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇のために、５億細胞／ｍｌを使用する。さらなる面において、６億、７億、８億または９億細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。
【０６２０】
ある態様において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９  ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を含む。他の面において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１×１０１０(およびその間の任意の整数値)ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を含む。ある態様において、得られたＴ制御性枯渇細胞集団は、２×１０９  Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞またはそれ以下(例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７またはそれ以下のＣＤ２５＋細胞)を含む。
【０６２１】
ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞を、例えば、チュービング１６２−０１のような、枯渇チュービングセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して集団から除去する。ある態様において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を、例えば、ＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２.１のような、枯渇設定において動かす。
【０６２２】
特定の理論に縛られることを望まないが、アフェレシス前またはＣＡＲ発現細胞産物の製造中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少(例えば、望まない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数の減少)は、対象の再発リスクを減らし得る。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇する方法は当分野で知られる。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体(抗ＧＩＴＲここに記載する抗体)、ＣＤ２５枯渇およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０６２３】
ある態様において、製造法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞の数の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造法は、例えば、サンプル、例えば、アフェレシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)を接触させ、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。
【０６２４】
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞採取前にＴＲＥＧ細胞を減らす１以上の治療で前処置されており、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再び必要とするリスクを軽減する。ある態様において、ＴＲＥＧ細胞を低減する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、注入中または注入後に行い得る。
【０６２５】
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。
【０６２６】
ある態様において、除去すべき細胞の集団は、制御性Ｔ細胞または腫瘍細胞ではなく、ＣＡＲＴ細胞の増殖および／または機能に他に負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。ある態様において、このような細胞は、制御性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後にまたは他の順番で除去することが意図される。
【０６２７】
ここに記載する方法は、１を超える選択工程、例えば、１を超える枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。一つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを経る細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含み得る。
【０６２８】
ここに記載する方法は、さらに腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞の集団からの除去を含み、それによりＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供する。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを同じ基質、例えば、ビーズに結合でき、これを、細胞の除去に使用でき、または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれの順番で生じてもよい。
【０６２９】
チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１以上の集団からの除去を含み、それによりＴ制御性枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する。代表的チェックポイント阻害剤は、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡおよびＬＡＩＲ１を含む。ある態様において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御性、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを同じビーズに結合でき、それを細胞の除去に使用でき、または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は逐次的であり、例えば、いずれ順序の順番で生じてもよい。
【０６３０】
ここに記載する方法は、陽性選択工程を含み得る。例えば、Ｔ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ(登録商標)Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３ｘ２８)結合ビーズと、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間インキュベーションすることにより単離できる。ある態様において、時間は約３０分である。さらなる態様において、時間は、時間は３０分〜３６時間またはそれより長い範囲およびその間の任意の整数値である。さらなる態様において、時間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに他の態様において、時間は１０〜２４時間、例えば、２４時間である。腫瘍組織または免疫無防備状態個体から腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)を単離するような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕獲効率を高め得る。それゆえに、単にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合させる時間を短くするまたは長くするおよび／またはビーズ対Ｔ細胞比を増加または減少させる(さらにここに記載するとおり)ことにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択される。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団が、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択される。
【０６３１】
ある態様において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンまたは他の適切な分子、例えば、他のサイトカインの１以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載する方法により決定できる。
【０６３２】
陽性または陰性選択により所望の細胞の集団を単離するために、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度は変わり得る。ある面において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を一緒に混合する体積を顕著に低下させる(例えば、細胞濃度を増加させる)ことが望まれ得る。例えば、ある面において、１００億細胞／ｍｌ、９０億／ｍｌ、８０億／ｍｌ、７０億／ｍｌ、６０億／ｍｌまたは５０億／ｍｌの濃度を使用する。ある面において、１０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。さらなる面において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／ｍｌの濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。
【０６３３】
高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のまたは多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病性血液、腫瘍組織など)からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有しており、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋  Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０６３４】
関連する面において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を顕著に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞で選択する。例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋  Ｔ細胞より効率的に捕獲される。ある面において、使用する細胞の濃度は５×１０６／ｍｌである。他の面において、使用する濃度は約１×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌおよびその間の任意の整数値であり得る。
【０６３５】
他の面において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で、２〜１０℃または室温でローテータでインキュベートし得る。
【０６３６】
刺激のためのＴ細胞はまた洗浄工程後凍結させ得る。理論に縛られることを望まないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団から顆粒球およびある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液およびパラメーターが当分野で知られ、この状況において有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳまたは１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯまたは３１.２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ  ４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む培養培地または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１°／分の速度で−８０℃に凍結し、気相の液体窒素貯蔵タンクに保存する。制御凍結の他の方法ならびに直ぐに−２０℃または液体窒素の非制御凍結も使用できる。
【０６３７】
ある面において、凍結保存細胞をここに記載するように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化の前に室温で１時間休息させる。
【０６３８】
本発明の文脈においてまた意図されるのは、ここに記載する増殖させた細胞が必要である時の前の時点での、対象からの血液サンプルまたはアフェレシス産物の採取である。したがって、増殖する細胞の供給源を、必要な任意の時点で採取でき、Ｔ細胞のような所望の細胞を、ここに記載するような免疫エフェクター細胞治療により利益を得るあらゆる疾患または状態のための免疫エフェクター細胞治療へのその後の使用のために単離および凍結できる。ある面において、血液サンプルまたはアフェレシスを、一般に健常対象から採取する。ある面において、血液サンプルまたはアフェレシスを、一般に、疾患を発症するリスクにあるが、まだ疾患を発症していない健常対象から採取し、目的の細胞をその後の使用のために単離および凍結する。ある面において、Ｔ細胞を、その後の時点で増殖、凍結および使用し得る。ある面において、サンプルを、ここに記載する特定の疾患の診断の直後に、しかし、何らかの処置前に患者から採取する。さらなる面において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射のような他の免疫除去剤のような、手段での処置を含むが、これらに限定されないあらゆる関連する処置モダリティーの前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレシスから単離する。
【０６３９】
本発明のさらなる面において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置の後、患者から直接得る。この点に関して、ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直後、患者が通常該処置から回復するまでの間、得られるＴ細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適であるまたは改善されていることが観察されている。同様に、ここに記載する方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着およびインビボ増殖増強について好ましい状態であり得る。それゆえに、本発明の状況において、Ｔ細胞、樹状細胞または造血細胞系譜の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが意図される。さらに、ある面において、可動化(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化)およびコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増殖に好都合である条件を、特に、治療後の定められた時間枠中に、対象に形成できる。細胞型の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞を含む。
【０６４０】
ある態様において、免疫エフェクターＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得る。ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作される免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ細胞を、対象または対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が少なくとも一過性に増加するように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬から十分な時間後または十分な用量の後に、採取する。
【０６４１】
他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作されているまたは操作される免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増やすまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞比を高める量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処置できる。
【０６４２】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ  ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないかまたはＤＧＫ活性が低下したまたは阻害された細胞である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減または阻止するための遺伝的方法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞は、ここに記載するＤＧＫ阻害剤での処置により産生できる。
【０６４３】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロス  ＲＮＡまたはタンパク質を発現しないかまたはイカロス活性が低下したまたは阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減または阻止するための遺伝的方法、例えば、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処置により産生できる。
【０６４４】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損およびイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびイカロスを発現せずまたはＤＧＫおよびイカロス活性が低下または阻害されている。このようなＤＧＫおよびイカロス欠損細胞は、ここに記載する方法のいずれかにより賛成できる。
【０６４５】
ある態様において、ＮＫ細胞を対象から得る。他の態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株(Ｃｏｎｋｗｅｓｔ)である。
【０６４６】
同種ＣＡＲ
ここに記載する態様において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩの発現を欠く同種Ｔ細胞である。
【０６４７】
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように操作され、機能的ＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように操作されまたはその表面に微少の機能的ＴＣＲを産生するように操作され得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１以上の変異したまたは切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現する。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが、宿主で有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。
【０６４８】
ここに記載するＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作され得る。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１および／またはＨＬＡクラスＩＩが下方制御されるように操作され得る。
【０６４９】
ある態様において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩを欠き得る。
【０６５０】
機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、任意の適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。
【０６５１】
ある態様において、同種細胞は、例えば、ここに記載するいずれかの方法により、阻害分子を発現しないまたは阻害分子を低レベルで発現する細胞である。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下できる、阻害分子を発現しないまたは阻害分子を低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による、阻害分子の阻害はＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、例えば、ここに記載する、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用できる。
【０６５２】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現を、Ｔ細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して、阻害できる。
【０６５３】
Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系のような、任意の慣用の発現系を使用して達成できる。
【０６５４】
ＴＣＲの要素の発現を下方制御する代表的ｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開２０１２／０３２１６６７号に開示されている。ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現を下方制御する代表的ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開ＵＳ２００７／００３６７７３号に開示されている。
【０６５５】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ”は、一連の群生性等間隔短回文反復配列またはこのような一連の反復を含む系をいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”系は、ＴＣＲおよび／またはＨＬ遺伝子の発現抑制または変異に使用できる、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ由来の系をいう。
【０６５６】
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％および配列決定された古細菌の９０％に見られる。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172。この系は、プラスミドおよびファージのような外来遺伝的要素に対する抵抗性を付与する１種の原核生物免疫系であり、後天性免疫の形態を提供する。Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845。
【０６５７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子エディティング(特定の遺伝子のサイレンシング、増強または変更)に使用するために修飾されている。Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8。これは、真核細胞に、特別に設計したＣＲＩＳＰＲおよび１以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを導入することにより達成される。
【０６５８】
ＣＲＩＳＰＲ座位と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列は、交互の反復およびスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常細菌に対して外来であるプラスミドまたはファージ配列のような配列を含み、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーはＴＣＲまたはＨＬＡ遺伝子配列に由来する。
【０６５９】
ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質により小ＲＮＡに加工される。これらは、反復配列が隣接したスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質を、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルで外来性遺伝的要素に対して発現抑制するように導く。Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7。スペーサーは、それゆえに、ｓｉＲＮＡに類似して、ＲＮＡ分子の鋳型として働く。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。
【０６６０】
多くの異なるタイプの細菌で自然に生じるように、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置および構造、Ｃａｓ遺伝子の機能および数およびそれらの産物は種毎にいくぶん異なる。Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; and Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340。例えば、Ｃｓｅ(Ｃａｓサブタイプ、大腸菌)タンパク質(例えば、ＣａｓＡ)は、機能的複合体、Ｃａｓｃａｄｅを形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ転写物を、Ｃａｓｃａｄｅが保持するスペーサー−反復単位に加工する。Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964。他の原核生物において、Ｃａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲ転写物を加工する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化はＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２を必要としない。パイロコッカス・フリオサスおよび他の原核生物におけるＣｍｒ(Ｃａｓ  ＲＡＭＰモジュール)タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと機能的複合体を形成し、これは相補的標的ＲＮＡを認識し、開裂する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系は、二重らせんの各鎖のための２活性切断部位を有するヌクレアーゼであるタンパク質Ｃａｓ９を頼る。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせを、遺伝子エディティングのための系に使用できる。Pennisi (2013) Science 341: 833-836。
【０６６１】
それゆえに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を編集でき(塩基対の付加または欠失)または未成熟終止を導入でき、これは、そうしてＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を減少させる。あるいはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、ＲＮＡ干渉のように使用し、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を可逆性形式でオフにできる。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＴＣＲおよび／またはＨＬプロモーターに導くことができ、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断する。
【０６６２】
当分野で知られるテクノロジー、例えば、米国公開２０１４００６８７９７号およびCong (2013) Science 339: 819-823に記載のものを使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を産生できる。例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許８,８７１,４４５号；８,８６５,４０６号；８,７９５,９６５号；８,７７１,９４５号；および８,６９７,３５９号に記載されるもののような、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する当分野で知られる他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系も産生できる。
【０６６３】
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
“ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ”は、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
【０６６４】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ開裂ドメインを融合することにより人工的に産生される。転写アクティベーター様効果(ＴＡＬＥ)は、ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子の部分を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作できる。操作されたＴＡＬＥとＤＮＡ開裂ドメインを合わせることにより、ＨＬＡまたはＴＣＲ配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な、制限酵素を産生できる。次いで、これらを細胞に導入でき、そこで、それらはゲノムエディティングのために使用され得る。Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6;およびBoch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501。
【０６６５】
ＴＡＬＥは、ザントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目および１３番目のアミノ酸以外、反復した、高度に保存的３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２箇所は高度に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。それらは、それゆえに、所望のＤＮＡ配列と結合するように操作され得る。
【０６６６】
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型または変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ(Ｎ)と融合する。ＴＡＬＥＮにおいて使用するために、ＦｏｋＩについていくつかの変異が行われており、これらは、例えば、開裂特異性または活性の改善を含む。Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793;およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96。
【０６６７】
ＦｏｋＩドメインは、二量体として機能し、適切な配向および間隔を有する標的ゲノムにおける部位のための独特なＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ開裂ドメインの間のアミノ酸残基数および２の個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両者が、高レベルの活性を達成するために重要なパラメーターであると考えられる。Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8。
【０６６８】
ＨＬＡまたはＴＣＲ  ＴＡＬＥＮを細胞内で使用して、二重鎖切断(ＤＳＢ)を産生できる。変異は、修復機構が切断を非相同末端結合により不適切に修復するならば、切断部位に導入できる。例えば、不適切な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。あるいは、外来ＤＮＡを、ＴＡＬＥＮと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡの配列および染色体配列により、この方法はＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子における欠損の補正またはｗｔ  ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子におけるこのような欠損の導入に使用でき、そうして、ＨＬＡまたはＴＣＲの発現を減少させる。
【０６６９】
ＨＬＡまたはＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュラー要素を使用する多様なスキームを含む、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509。
【０６７０】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ”は、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼをいう。
【０６７１】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１以上の亜鉛フィンガーを含む。Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782;およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。
【０６７２】
亜鉛フィンガーは、１以上の亜鉛イオンにより安定化される小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、約３ｂｐ配列を認識できる。既知特異性の多様な亜鉛フィンガーを合わせて、約６ｂｐ、９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐまたは１８ｂｐ配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生できる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッドおよびツーハイブリッド系および哺乳動物細胞を含む、特異的配列を認識する亜鉛フィンガー(およびそれらの組み合わせ)を産生するための多様な選択およびモジュラーアセンブリー技術が利用可能である。
【０６７３】
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡを開裂するために二量体化しなければならない。それゆえに、ＺＦＮの対が、非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とすることが必要である。２の々のＺＦＮは、そのヌクレアーゼが適切に離れで、ＤＮＡの逆の鎖に結合しなければならない。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5。
【０６７４】
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡに二重鎖切断を創製でき、これは、不適切に修復されたならばフレームシフト変異を創製でき、細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲの発現および量の減少に至る。ＺＦＮはまた、ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子における変異のために相同組換えと使用もできる。
【０６７５】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲにおける配列に特異的なＺＦＮは、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。例えば、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国特許公開２０１１／０１５８９５７号；および米国特許公開２０１２／００６０２３０号参照。
【０６７６】
テロメラーゼ発現
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ある態様において、治療的Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短縮されたテロメアのために、患者における残留性が短く、したがって、テロメラーゼ遺伝子を用いるトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善し得る。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それゆえに、ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、異所性にテロメラーゼサブユニットを、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴ発現する。ある面において、本開示は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、ＣＡＲをコードする構築物と接触させる前に、同時にまたは後に核酸と接触させ得る。
【０６７７】
ある面において、本開示は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を製造する方法に関する。ある態様において、本方法は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を接触させ、そして、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能とする条件下に接触させることを含む。
【０６７８】
ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡである。ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動できるプロモーターを含む。
【０６７９】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Protein ID AAC51724.1のアミノ酸配列を有し(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)、次のとおりである。
【化１５】
2019206538.tif 000027
【０６８０】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号６３の配列と配列少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号６３の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方に欠失(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。
【０６８１】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Accession No. AF018167の核酸配列によりコードされる(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)。
【化１６】
2019206538.tif 000028
【化１７】
2019206538.tif 000029
【化１８】
2019206538.tif 000030
【０６８２】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号６４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する核酸によりコードされる。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号６４の核酸によりコードされる。
【０６８３】
免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の活性化および増殖
Ｔ細胞のような免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許６,３５２,６９４号；６,５３４,０５５号；６,９０５,６８０号；６,６９２,９６４号；５,８５８,３５８号；６,８８７,４６６号；６,９０５,６８１号；７,１４４,５７５号；７,０６７,３１８号；７,１７２,８６９号；７,２３２,５６６号；７,１７５,８４３号；５,８８３,２２３号；６,９０５,８７４号；６,７９７,５１４号；６,８６７,０４１号；および米国特許出願公開２００６０１２１００５号に記載する方法を使用して、一般的に活性化および増殖できる。
【０６８４】
一般に、免疫エフェクター細胞の集団、例えば、Ｔ制御性細胞枯渇細胞を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが結合した表面と接触させることにより増殖させ得る。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体または抗原結合そのフラグメントまたは抗ＣＤ２抗体との接触またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触により、ここに記載するように刺激し得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖刺激に適する条件下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用できる。抗ＣＤ２８抗体の例は９.３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８を含み(Diaclone, Besancon, France)、当分野で一般に知られる他の方法のように使用できる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
【０６８５】
ある面において、Ｔ細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールにより提供し得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中でも、表面と結合していてよい。表面に結合しているとき、薬剤は同じ表面(すなわち、“ｃｉｓ”形態)または別の表面(すなわち、“ｔｒａｎｓ”形態)に結合し得る。あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方のが溶液にあってよい。ある面において、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液中であるかまたは表面と結合する。ある面において、両剤は溶液中にあり得る。ある面において、薬剤は不溶性形態であり、Ｆｃ受容体または抗体または薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞のような表面に架橋され得る。この点に関して、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化および増殖のために意図される人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)について、米国特許出願公開２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照のこと。
【０６８６】
ある面において、２剤は、ビーズに、同じビーズ、すなわち、“ｃｉｓ”または別のビーズ、すなわち、“ｔｒａｎｓ”で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ３抗体または抗原結合そのフラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ２８抗体または抗原結合そのフラグメントであり、両剤が、等価な分子量で同じビーズに共固定化される。ある面において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖およびＴ細胞増殖のためのビーズに結合した１：１比の各抗体を使用する。本発明のある面において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増殖が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を使用する。ある特定の面において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、約１〜約３倍増加が観察される。ある面において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体比は１００：１〜１：１００およびその間の全ての整数値の範囲である。ある面において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合している、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８比が１未満である。ある面において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体比は２：１より大きい。ある特定の面において、ビーズに結合した１：１００  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある面において、ビーズに結合した１：７５  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる面において、ビーズに結合した１：５０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある面において、ビーズに結合した１：３０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある好ましい面において、ビーズに結合した１：１０  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある面において、ビーズに結合した１：３  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる面において、ビーズに結合した３：１  ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。
【０６８７】
１：５００〜５００：１およびその間の任意の整数値の粒子対細胞比を、Ｔ細胞または他の標的細胞の刺激のために使用し得る。当業者には容易に認識され得るように、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径による。例えば、小さいサイズのビーズは少ない細胞しか結合できず、大きなビーズはたくさん結合できる。ある面において、細胞対粒子比は、１：１００〜１００：１およびその間の任意の整数値の範囲であり、さらなる面において１：９〜９：１およびその間の任意の整数値からなる比をＴ細胞刺激に使用し得る。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は、上記のように変わりうるが、しかしながらある好ましい値は１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、一つの好ましい比は少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。ある面において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。ある特定の面において、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる面において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、ある面において、粒子対細胞比は、１日目は１：１〜１０：１であり、さらなる粒子をその後１０日目まで連日または隔日で細胞に添加し、最終比１：１〜１：１０である(添加の比の細胞数に基づく)。ある特定の面において、粒子対細胞比は刺激１日目に１：１であり、刺激３日目および５日目に１：５に調節する。ある面において、粒子を、１日目の１：１および刺激３日目および５日目の１：５の最終比に基づき、連日または隔日で添加する。ある面において、粒子対細胞比は、刺激１日目は２：１であり、刺激３日目および５日目に１：１０に調節する。ある面において、粒子を、１日目の１：１および３日目および５日目の１：１０の最終比に基づき、連日または隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径ならびに細胞サイズおよびタイプによる。ある面において、使用するための最も典型的な比は、１日目の１：１、２：１および３：１付近である。
【０６８８】
さらなる面において、Ｔ細胞のような細胞を、薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズおよび細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。異なる面において、培養前に、薬剤被覆ビーズおよび細胞を分離するが、一緒に培養する。さらなる面において、ビーズおよび細胞を、磁気力のような力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
【０６８９】
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ(３ｘ２８ビーズ)とＴ細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。ある面において、細胞(例えば、１０４〜１０９  Ｔ細胞)およびビーズ(例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ(登録商標)Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズを１：１比)を、緩衝液、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオン不含)中で合わせる。再び、任意の細胞濃度を使用し得ることは当業者には容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、サンプル中に極めて稀であり、サンプルの０.０１％しか含まれないかまたはサンプル全体(すなわち、１００％)が目的の標的細胞で構成され得る。したがって、あらゆる細胞数が本発明の状況と一体となる。ある面において、細胞と粒子の最大接触を確実にするために、粒子および細胞を混合する体積を顕著に減少させる(すなわち、細胞の濃度を高める)ことが望ましいことがある。例えば、ある面において、約１００億細胞／ｍｌ、９０億／ｍｌ、８０億／ｍｌ、７０億／ｍｌ、６０億／ｍｌ、５０億／ｍｌまたは２０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。ある面において、１億細胞／ｍｌ超を使用する。さらなる面において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらなる面において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌをの濃度使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用はＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋  Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０６９０】
ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸が形質導入された細胞を、例えば、ここに記載する方法により増殖する。ある態様において、細胞を、数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約１４日(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日)の期間の培養により増殖する。ある態様において、細胞は、４〜９日の期間増殖される。ある態様において、細胞は、８日以下、例えば、７日、６日または５日の期間増殖される。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件で、９日間培養で増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死、サイトカイン産生、活性化、遊走またはそれらの組み合わせにより規定され得る。ある態様において、５日増殖された細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加を示す。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。ある態様において、５日増殖された細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下に９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルのｐｇ／ｍｌで、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上増加する。
【０６９１】
Ｔ細胞の培養期間が６０日以上となるような、数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清(例えば、胎児ウシまたはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地  １６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  １５(Ｌｏｎｚａ))を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネートおよびＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、無血清または適切な量の血清(または血漿)が添加されたまたは規定されたセットのホルモンおよび／またはＴ細胞の増殖および拡大に十分な量のサイトカインが添加されたＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Vivo  １５およびＸ−Vivo  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)で維持される。
【０６９２】
ある態様において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)増加をもたらす１以上のインターロイキンを含む、適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増殖させる。ある態様において、細胞は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)の存在下増殖させる。
【０６９３】
ある態様において、ここに記載する方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞製造法は、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して、細胞集団から除去することを含む。細胞集団からＴ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を除去する方法は、ここに記載される。ある態様において、方法、例えば、製造法は、さらに細胞集団(例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞のようなＴ制御性細胞が枯渇されている細胞集団；または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと前に接触された細胞集団)とＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の接触を含む。例えば、細胞集団(例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている)を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下で増殖させる。
【０６９４】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで接触させることを含む。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者の組合せを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
【０６９５】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者を含む組成物と接触させる。ある態様において、接触は、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存および増殖をもたらす。
【０６９６】
種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より大きいヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目前まで主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８〜９日目後、Ｔ細胞の集団は、徐々に大きくなるＴＣ細胞の集団を含む。したがって、処置の目的によって、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されているならば、このサブセットを大きな程度まで増殖させることが有利であり得る。
【０６９７】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中に、顕著に、しかし大部分、再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特異的な目的のために活性化Ｔ細胞産物をあつらえる能力を可能とする。
【０６９８】
ここに記載するＣＡＲが構築されたら、適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのＴ細胞増殖の持続および抗癌活性のような、しかしこれらに限定されない分子の活性を評価するために、種々のアッセイが使用され得る。本発明のＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、下にさらに詳細に記載する。
【０６９９】
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を、単量体および二量体の存在を検出するために使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ＣＡＲを発現するＴ細胞(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の１：１混合物)をインビトロで１０日超増殖させ、続いて溶解および還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。完全長ＴＣＲ−ζ細胞質ドメインおよび内因性ＴＣＲ−ζ鎖を含むＣＡＲを、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合性二量体形成の評価を可能とするために非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用する
【０７００】
抗原刺激後のＣＡＲ＋  Ｔ細胞のインビトロ増殖を、フローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８  ａＡＰＣで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下に、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。代表的プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットの培養６日目に、フローサイトメトリーにより評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。あるいは、ＣＤ４＋とＣＤ８＋  Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用するＣＡＲとｅＧＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を、洗浄後、ここに記載する癌関連抗原＋  Ｋ５６２細胞(ここに記載する癌関連抗原を発現するＫ５６２)、野生型Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２野生型)またはＨＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体(Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８)の存在下刺激する。外来性ＩＬ−２を、１００ＩＵ／ｍｌを隔日で培養物に添加する。ＧＦＰ＋  Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。
【０７０１】
再刺激非存在下の持続するＣＡＲ＋  Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、平均Ｔ細胞体積(ｆｌ)を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激および１日目の記載するＣＡＲの形質導入後、培養８日目にCoulter Multisizer III粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して測定する。
【０７０２】
動物モデルも、ＣＡＲＴ活性の測定に使用できる。例えば、免疫欠損マウスにおける原発ヒトプレＢ  ＡＬＬを処置するための、ここに記載するヒト癌関連抗原特異的ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を使用する異種移植モデルを使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔にすれば、ＡＬＬ確立後、マウスを処置群に無作為化する。種々の数の癌関連抗原特異的ＣＡＲで操作されたＴ細胞を、１：１の等量比でＢ−ＡＬＬを担持するＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ-/-マウスに共注射する。マウスからの脾臓ＤＮＡにおける癌関連抗原特異的ＣＡＲベクターコピー数を、Ｔ細胞注射後、種々の時点で評価する。動物を、１週間間隔で白血病について評価する。末梢血における癌関連抗原＋  Ｂ−ＡＬＬ芽細胞数を、癌関連抗原−ζ  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞または偽形質導入Ｔ細胞を注射されたマウスで計数する。ログランク検定を使用して、群の生存曲線を比較する。さらに、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ-/-マウスへのＴ細胞注射４週間後の絶対的末梢血ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞数も分析する。マウスに、白血病性細胞を注射し、３週間後、ｅＧＦＰに連結したＣＡＲをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによりＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞を注射する。Ｔ細胞を、注入ＧＦＰ＋  Ｔ細胞の４５〜５０％に、注射前に偽形質導入細胞と混合することにより標準化し、フローサイトメトリーにより確認する。動物を、１週間間隔で白血病について評価する。ＣＡＲ＋  Ｔ細胞群の生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。
【０７０３】
用量依存的ＣＡＲ処置応答を評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。例えば、２１日目にＣＡＲ  Ｔ細胞、等しい数の偽形質導入Ｔ細胞で処置したまたはＴ細胞処置なしの、マウスにおいて白血病が確立した後３５〜７０日後に後、末梢血を得る。各群からのマウスを、ここに記載する末梢血癌関連抗原＋  ＡＬＬ芽細胞数の決定のために無作為に採血し、３５日目および４９日目に殺す。残りの動物を５７日目および７０日目に評価する。
【０７０４】
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、先に、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に記載されている。簡潔には、ＣＡＲ介在増殖の評価を、洗浄したＴ細胞と、ここに記載する癌関連抗原(Ｋ１９)またはＣＤ３２およびＣＤ１３７(ＫＴ３２−ＢＢＬ)を発現するＫ５６２細胞と、最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比２：１で混合することによりマイクロタイタープレートにおいて実施する。Ｋ５６２細胞を、使用前にガンマ線で照射する。抗ＣＤ３(クローンＯＫＴ３)および抗ＣＤ２８(クローン９.３)モノクローナル抗体を、これらのシグナルがエクスビボでの長期ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を支持するため、刺激Ｔ細胞増殖について陽性対照として役立つＫＴ３２−ＢＢＬ細胞の培養物に添加する。Ｔ細胞を、製造者により記載のとおり、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔＴＭ蛍光ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびフローサイトメトリーを使用して、培養において数える。ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ−２Ａ連結ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで操作されたＴ細胞を使用するＧＦＰ発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋  Ｔ細胞について、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を、ここに記載するビオチニル化組み換え癌関連抗原タンパク質および二次アビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出する。Ｔ細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現も、特異的モノクローナル抗体(BD Biosciences)を使用して同時に検出する。サイトカイン測定を、製造業者の指示に従いヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット(BD Biosciences, San Diego, CA)を使用して再刺激２４時間後に回収した上清で実施する。蛍光を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して評価し、データを製造業者の指示に従い分析する。
【０７０５】
細胞毒性を、標準的５１Ｃｒ−放出アッセイにより評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、標的細胞(Ｋ５６２株および初代プロＢ−ＡＬＬ細胞)に、５１Ｃｒ(ＮａＣｒＯ４として、New England Nuclear, Boston, MA)を、３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞を、ウェル中で完全ＲＰＭＩ中、標的細胞と種々のエフェクター細胞：標的細胞(Ｅ：Ｔ)比で混合する。さらなる培地のみ(自発的放出、ＳＲ)またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００洗剤１％溶液(全放出、ＴＲ)を含むウェルも調製する。３７℃で４時間のインキュベーション後、各ウェルから上清を回収する。放出された５１Ｃｒを、次いでガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co., Waltham, MA)を使用して測定する。各条件を少なくとも３回行い、溶解のパーセントを式：溶解％＝(ＥＲ−ＳＲ)／(ＴＲ−ＳＲ)(式中、ＥＲは各実験条件で放出された平均５１Ｃｒを示す)を使用して計算する。
【０７０６】
造影テクノロジーを使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送および増殖を評価できる。このようなアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)に記載されている。簡潔には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−(ＮＳＧ)マウスに、Ｎａｌｍ−６細胞をＩＶ注射し、７日後ＣＡＲ構築物でエレクトロポレーション４時間後Ｔ細胞を注射する。Ｔ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定にトランスフェクトされ、マウスをバイオルミネセンスについて造影する。あるいは、Ｎａｌｍ−６異種移植モデルにおけるＣＡＲ＋  Ｔ細胞の単回注射の治療有効性および特異性を、次のように測定できる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように形質導入したＮａｌｍ−６を注射し、続いて７日後に本発明のＣＡＲで電気穿孔したＴ細胞を１回尾静脈注射する。動物を、注射後種々の時点で造影する。例えば、５日目(処置２日前)および８日目(ＣＡＲ＋  ＰＢＬ後２４時間)に、代表的マウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを作成できる。
【０７０７】
ここでの実施例部分に記載のものならびに当分野で知られるものを含む、他のアッセイも、ここに記載するＣＡＲの評価に使用できる。
【０７０８】
治療適用
ある面において、本発明は、ここに記載する癌関連抗原の発現と関係する疾患を処置する方法を提供する。
【０７０９】
ある面において、本発明は、ＸＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、Ｘはここに記載する腫瘍抗原を表し、癌細胞は該Ｘ腫瘍抗原を発現する。
【０７１０】
ある面において、本発明は、ここに記載するＸＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＸを発現する。ある態様において、Ｘは正常細胞および癌細胞の両者で発現されるが、正常細胞では低レベルで発現される。ある態様において、本方法は、さらに、例えば、ここに記載するアッセイにより決定して、ＸＣＡＲがＸを発現する癌細胞と結合し、殺すことを可能にするが、Ｘを発現する正常細胞の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％以下が殺されることを可能にする親和性でＸと結合するＣＡＲを選択することを含む。例えば、図１３に記載するアッセイまたはＣｒ５１  ＣＴＬに基づくフローサイトメトリーのような細胞死アッセイを使用できる。ある態様において、選択したＣＡＲは、標的抗原に対する１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、１０〜５Ｍ〜１０−７Ｍ、例えば、１０−６Ｍまたは１０−７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗原結合ドメインを有する。ある態様において、選択した抗原結合ドメインは、対照抗体、例えば、ここに記載する抗体より少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍または１,０００倍低い結合親和性を有する。
【０７１１】
ある態様において、本発明は、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ１９を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＬＬ(急性リンパ芽球性白血病)、ＣＬＬ(慢性リンパ性白血病)、ＤＬＢＣＬ(汎発性大Ｂ細胞リンパ腫)、ＭＣＬ(マントル細胞リンパ腫)またはＭＭ(多発性骨髄腫)である。
【０７１２】
ある面において、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＧＦＲｖIIIを発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠芽腫である。
【０７１３】
ある面において、本発明は、メソテリンＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はメソテリンを発現する。ある態様において、処置する癌は中皮腫、膵臓癌または卵巣癌である。
【０７１４】
ある面において、本発明は、ＣＤ１２３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ１２３を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０７１５】
ある面において、本発明は、ＣＤ２２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ２２を発現する。ある態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０７１６】
ある面において、本発明は、ＣＳ−１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＳ−１を発現する。ある態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０７１７】
ある面において、本発明は、ＣＬＬ−１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＬＬ−１を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０７１８】
ある面において、本発明は、ＣＤ３３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ３３を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０７１９】
ある面において、本発明は、ＧＤ２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＤ２を発現する。ある態様において、処置する癌は神経芽腫である。
【０７２０】
ある面において、本発明は、ＢＣＭＡＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＢＣＭＡを発現する。ある態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０７２１】
ある面において、本発明は、ＴｎＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴｎ抗原を発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌である。
【０７２２】
ある面において、本発明は、ＰＳＭＡＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＳＭＡを発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０７２３】
ある面において、本発明は、ＲＯＲ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲＯＲ１を発現する。ある態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０７２４】
ある面において、本発明は、ＦＬＴ３  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＦＬＴ３を発現する。ある態様において、処置する癌はＡＭＬである。
【０７２５】
ある面において、本発明は、ＴＡＧ７２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＡＧ７２を発現する。ある態様において、処置する癌は消化器癌である。
【０７２６】
ある面において、本発明は、ＣＤ３８ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ３８を発現する。ある態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０７２７】
ある面において、本発明は、ＣＤ４４ｖ６ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ４４ｖ６を発現する。ある態様において、処置する癌は子宮頸癌、ＡＭＬまたはＭＭである。
【０７２８】
ある面において、本発明は、ＣＥＡＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＥＡを発現する。ある態様において、処置する癌は消化器癌または膵臓癌である。
【０７２９】
ある面において、本発明は、ＥＰＣＡＭＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＰＣＡＭを発現する。ある態様において、処置する癌は消化器癌である。
【０７３０】
ある面において、本発明は、Ｂ７Ｈ３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＢ７Ｈ３を発現する。
【０７３１】
ある面において、本発明は、ＫＩＴＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＫＩＴを発現する。ある態様において、処置する癌は消化器癌である。
【０７３２】
ある面において、本発明は、ＩＬ−１３Ｒａ２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＩＬ−１３Ｒａ２を発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠芽腫である。
【０７３３】
ある面において、本発明は、ＰＲＳＳ２１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＲＳＳ２１である。ある態様において、処置する癌は卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌から選択される。
【０７３４】
ある面において、本発明は、ＣＤ３０ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ３０を発現する。ある態様において、処置する癌はリンパ腫または白血病である。
【０７３５】
ある面において、本発明は、ＧＤ３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＤ３を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０７３６】
ある面において、本発明は、ＣＤ１７１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ１７１を発現する。ある態様において、処置する癌は神経芽腫、卵巣癌、黒色腫、乳癌、膵臓癌、結腸癌またはＮＳＣＬＣ(非小細胞性肺癌)である。
【０７３７】
ある面において、本発明は、ＩＬ−１１ＲａＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＩＬ−１１Ｒａを発現する。ある態様において、処置する癌は骨肉腫である。
【０７３８】
ある面において、本発明は、ＰＳＣＡＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＳＣＡを発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０７３９】
ある面において、本発明は、ＶＥＧＦＲ２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＶＥＧＦＲ２を発現する。ある態様において、処置する癌は、固形腫瘍である。
【０７４０】
ある面において、本発明は、ルイスＹＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はルイスＹを発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌またはＡＭＬである。
【０７４１】
ある面において、本発明は、ＣＤ２４ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ２４を発現する。ある態様において、処置する癌は膵臓癌である。
【０７４２】
ある面において、本発明は、ＰＤＧＦＲ−ベータＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＤＧＦＲ−ベータを発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌、前立腺癌、ＧＩＳＴ(消化器間質腫瘍)、ＣＭＬ、ＤＦＳＰ(隆起性皮膚線維肉腫)または神経膠腫である。
【０７４３】
ある面において、本発明は、ＳＳＥＡ−４ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＳＳＥＡ−４を発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠芽腫、乳癌、肺癌または幹細胞癌である。
【０７４４】
ある面において、本発明は、ＣＤ２０ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ２０を発現する。ある態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０７４５】
ある面において、本発明は、葉酸受容体アルファＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は葉酸受容体アルファを発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌、ＮＳＣＬＣ、子宮内膜癌、腎臓癌または他の固形腫瘍である。
【０７４６】
ある面において、本発明は、ＥＲＢＢ２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)を発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌、胃癌、結腸直腸癌、肺癌または他の固形腫瘍である。
【０７４７】
ある面において、本発明は、ＭＵＣ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＵＣ１を発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌、肺癌または他の固形腫瘍である。
【０７４８】
ある面において、本発明は、ＥＧＦＲＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＧＦＲを発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠芽腫、ＳＣＬＣ(小細胞肺癌)、ＳＣＣＨＮ(頭頸部扁平上皮細胞癌)、ＮＳＣＬＣまたは他の固形腫瘍である。
【０７４９】
ある面において、本発明は、ＮＣＡＭＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＮＣＡＭを発現する。ある態様において、処置する癌は神経芽腫または他の固形腫瘍である。
【０７５０】
ある面において、本発明は、ＣＡＩＸＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＡＩＸを発現する。ある態様において、処置する癌は腎臓癌、ＣＲＣ、子宮頸癌または他の固形腫瘍である。
【０７５１】
ある面において、本発明は、ＥｐｈＡ２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥｐｈＡ２を発現する。ある態様において、処置する癌はＧＢＭである。
【０７５２】
ある面において、本発明は、ＧＤ３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＤ３を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０７５３】
ある面において、本発明は、フコシルＧＭ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はフコシルＧＭを発現する。
【０７５４】
ある面において、本発明は、ｓＬｅＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｓＬｅを発現する。ある態様において、処置する癌はＮＳＣＬＣまたはＡＭＬである。
【０７５５】
ある面において、本発明は、ＧＭ３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＭ３を発現する。
【０７５６】
ある面において、本発明は、ＴＧＳ５ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＧＳ５を発現する。
【０７５７】
ある面において、本発明は、ＨＭＷＭＡＡＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＨＭＷＭＡＡを発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫、神経膠芽腫または乳癌である。
【０７５８】
ある面において、本発明は、ｏ−アセチル−ＧＤ２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｏ−アセチル−ＧＤ２を発現する。ある態様において、処置する癌は神経芽腫または黒色腫である。
【０７５９】
ある面において、本発明は、ＣＤ１９ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ１９を発現する。ある態様において、処置する癌は葉酸受容体ベータＡＭＬ、骨髄腫である。
【０７６０】
ある面において、本発明は、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＥＭ１／ＣＤ２４８を発現する。ある態様において、処置する癌は、固形腫瘍である。
【０７６１】
ある面において、本発明は、ＴＥＭ７ＲＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＥＭ７Ｒを発現する。ある態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０７６２】
ある面において、本発明は、ＣＬＤＮ６ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＬＤＮ６を発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌、肺癌または乳癌である。
【０７６３】
ある面において、本発明は、ＴＳＨＲＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＳＨＲを発現する。ある態様において、処置する癌は甲状腺癌または多発性骨髄腫である。
【０７６４】
ある面において、本発明は、ＧＰＲＣ５ＤＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＰＲＣ５Ｄを発現する。ある態様において、処置する癌は多発性骨髄腫である。
【０７６５】
ある面において、本発明は、ＣＸＯＲＦ６１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＸＯＲＦ６１を発現する。
【０７６６】
ある面において、本発明は、ＣＤ９７ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ９７を発現する。ある態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍、胃癌、膵臓癌、食道癌、神経膠芽腫、乳癌または結腸直腸癌である。
【０７６７】
ある面において、本発明は、ＣＤ１７９ａＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ１７９ａを発現する。ある態様において、処置する癌はＢ細胞悪性腫瘍である。
【０７６８】
ある面において、本発明は、ＡＬＫ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＡＬＫを発現する。ある態様において、処置する癌はＮＳＣＬＣ、ＡＬＣＬ(未分化大細胞リンパ腫)、ＩＭＴ(炎症性筋線維芽細胞腫)または神経芽腫である。
【０７６９】
ある面において、本発明は、ポリシアル酸ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はポリシアル酸を発現する。ある態様において、処置する癌は小細胞肺癌である。
【０７７０】
ある面において、本発明は、ＰＬＡＣ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＬＡＣ１を発現する。ある態様において、処置する癌はＨＣＣ(肝細胞癌)である。
【０７７１】
ある面において、本発明は、ＧｌｏｂｏＨＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧｌｏｂｏＨを発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌、胃癌、前立腺癌、肺癌、乳癌または膵臓癌である。
【０７７２】
ある面において、本発明は、ＮＹ−ＢＲ−１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＮＹ−ＢＲ−１を発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌である。
【０７７３】
ある面において、本発明は、ＵＰＫ２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＵＰＫ２を発現する。ある態様において、処置する癌は膀胱癌である。
【０７７４】
ある面において、本発明は、ＨＡＶＣＲ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＨＡＶＣＲ１を発現する。ある態様において、処置する癌は腎臓癌である。
【０７７５】
ある面において、本発明は、ＡＤＲＢ３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＡＤＲＢ３を発現する。ある態様において、処置する癌はユーイング肉腫である。
【０７７６】
ある面において、本発明は、ＰＡＮＸ３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＡＮＸ３を発現する。ある態様において、処置する癌は骨肉腫である。
【０７７７】
ある面において、本発明は、ＧＰＲ２０ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＰＲ２０を発現する。ある態様において、処置する癌はＧＩＳＴである。
【０７７８】
ある面において、本発明は、ＬＹ６ＫＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＹ６Ｋを発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌、肺癌、卵巣癌または子宮頸癌である。
【０７７９】
ある面において、本発明は、ＯＲ５１Ｅ２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＯＲ５１Ｅ２を発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０７８０】
ある面において、本発明は、ＴＡＲＰＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＡＲＰを発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌である。
【０７８１】
ある面において、本発明は、ＷＴ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＷＴ１を発現する。
【０７８２】
ある面において、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する。
【０７８３】
ある面において、本発明は、ＬＡＧＥ−１ａ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＡＧＥ−１ａを発現する。
【０７８４】
ある面において、本発明は、ＭＡＧＥ−Ａ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＡＧＥ−Ａ１を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０７８５】
ある面において、本発明は、ＭＡＧＥ  Ａ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＡＧＥ  Ａ１を発現する。
【０７８６】
ある面において、本発明は、ＥＴＶ６−ＡＭＬ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＴＶ６−ＡＭＬを発現する。
【０７８７】
ある面において、本発明は、精子タンパク質１７  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は精子タンパク質１７を発現する。ある態様において、処置する癌は卵巣癌、ＨＣＣまたはＮＳＣＬＣである。
【０７８８】
ある面において、本発明は、ＸＡＧＥ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＸＡＧＥ１を発現する。ある態様において、処置する癌はユーイング肉腫またはラブド肉腫である。
【０７８９】
ある面において、本発明は、Ｔｉｅ  ２  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴｉｅ  ２を発現する。ある態様において、処置する癌は、固形腫瘍である。
【０７９０】
ある面において、本発明は、ＭＡＤ−ＣＴ−１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＡＤ−ＣＴ−１を発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌または黒色腫である。
【０７９１】
ある面において、本発明は、ＭＡＤ−ＣＴ−２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＡＤ−ＣＴ−２を発現する。ある態様において、処置する癌は前立腺癌、黒色腫である。
【０７９２】
ある面において、本発明は、Ｆｏｓ関連抗原１  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＦｏｓ関連抗原１を発現する。ある態様において、処置する癌は神経膠腫、扁平上皮細胞癌または膵臓癌である。
【０７９３】
ある面において、本発明は、ｐ５３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｐ５３を発現する。
【０７９４】
ある面において、本発明は、プロステインＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はプロステインを発現する。
【０７９５】
ある面において、本発明は、サバイビンおよびテロメラーゼＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はサバイビンおよびテロメラーゼを発現する。
【０７９６】
ある面において、本発明は、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＣＴＡ−１／ガレクチン８を発現する。
【０７９７】
ある面において、本発明は、メランＡ／ＭＡＲＴ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はメランＡ／ＭＡＲＴ１を発現する。
【０７９８】
ある面において、本発明は、Ｒａｓ変異体ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲａｓ変異体を発現する。
【０７９９】
ある面において、本発明は、ｐ５３変異体ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｐ５３変異体を発現する。
【０８００】
ある面において、本発明は、ｈＴＥＲＴ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｈＴＥＲＴを発現する。
【０８０１】
ある面において、本発明は、肉腫転座切断点ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は肉腫転座切断点を発現する。ある態様において、処置する癌は肉腫である。
【０８０２】
ある面において、本発明は、ＭＬ−ＩＡＰ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＬ−ＩＡＰを発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０８０３】
ある面において、本発明は、ＥＲＧＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＲＧ(ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子)を発現する。
【０８０４】
ある面において、本発明は、ＮＡ１７ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＮＡ１７を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０８０５】
ある面において、本発明は、ＰＡＸ３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＡＸ３を発現する。ある態様において、処置する癌は肺胞横紋筋肉腫である。
【０８０６】
ある面において、本発明は、アンドロゲン受容体ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はアンドロゲン受容体を発現する。ある態様において、処置する癌は転移前立腺癌である。
【０８０７】
ある面において、本発明は、サイクリンＢ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はサイクリンＢ１を発現する。
【０８０８】
ある面において、本発明は、ＭＹＣＮＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＭＹＣＮを発現する。
【０８０９】
ある面において、本発明は、ＲｈｏＣ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲｈｏＣを発現する。
【０８１０】
ある面において、本発明は、ＴＲＰ−２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＴＲＰ−２を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０８１１】
ある面において、本発明は、ＣＹＰ１Ｂ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＹＰ１Ｂ１を発現する。ある態様において、処置する癌は乳癌、結腸癌、肺癌、食道癌、皮膚癌、リンパ節癌、脳腫瘍または精巣癌である。
【０８１２】
ある面において、本発明は、ＢＯＲＩＳ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＢＯＲＩＳを発現する。ある態様において、処置する癌は肺癌である。
【０８１３】
ある面において、本発明は、ＳＡＲＴ３ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＳＡＲＴ３を発現する。
【０８１４】
ある面において、本発明は、ＰＡＸ５ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＡＸ５を発現する。
【０８１５】
ある面において、本発明は、ＯＹ−ＴＥＳ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＯＹ−ＴＥＳ１を発現する。
【０８１６】
ある面において、本発明は、ＬＣＫ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＣＫを発現する。
【０８１７】
ある面において、本発明は、ＡＫＡＰ−４ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＡＫＡＰ−４を発現する。
【０８１８】
ある面において、本発明は、ＳＳＸ２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＳＳＸ２を発現する。
【０８１９】
ある面において、本発明は、ＲＡＧＥ−１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲＡＧＥ−１を発現する。ある態様において、処置する癌はＲＣＣ(腎臓細胞癌)または他の固形腫瘍である。
【０８２０】
ある面において、本発明は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はヒトテロメラーゼ逆転写酵素を発現する。ある態様において、処置する癌は固形腫瘍である。
【０８２１】
ある面において、本発明は、ＲＵ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲＵ１を発現する。
【０８２２】
ある面において、本発明は、ＲＵ２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＲＵ２を発現する。
【０８２３】
ある面において、本発明は、腸管カルボキシルエステラーゼＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞は腸管カルボキシルエステラーゼを発現する。ある態様において、処置する癌は甲状腺癌、ＲＣＣ、ＣＲＣ(結腸直腸癌)、乳癌または他の固形腫瘍である。
【０８２４】
ある面において、本発明は、プロスターＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はプロスターゼを発現する。
【０８２５】
ある面において、本発明は、ＰＡＰＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＰＡＰを発現する。
【０８２６】
ある面において、本発明は、ＩＧＦ−Ｉ受容体ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＩＧＦ−Ｉ受容体を発現する。
【０８２７】
ある面において、本発明は、ｇｐ１００  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｇｐ１００を発現する。
【０８２８】
ある面において、本発明は、ｂｃｒ−ａｂｌ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｂｃｒ−ａｂｌを発現する。
【０８２９】
ある面において、本発明は、チロシナーＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はチロシナーゼを発現する。
【０８３０】
ある面において、本発明は、フコシルＧＭ１ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はフコシルＧＭ１を発現する。
【０８３１】
ある面において、本発明は、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２を発現する。ある態様において、処置する癌は黒色腫である。
【０８３２】
ある面において、本発明は、ＣＤ７９ａ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ７９ａを発現する。
【０８３３】
ある面において、本発明は、ＣＤ７９ｂ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ７９ｂを発現する。
【０８３４】
ある面において、本発明は、ＣＤ７２  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ７２を発現する。
【０８３５】
ある面において、本発明は、ＬＡＩＲ１  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＡＩＲ１を発現する。
【０８３６】
ある面において、本発明は、ＦＣＡＲ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＦＣＡＲを発現する。
【０８３７】
ある面において、本発明は、ＬＩＬＲＡ２  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＩＬＲＡ２を発現する。
【０８３８】
ある面において、本発明は、ＣＤ３００ＬＦ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＤ３００ＬＦを発現する。
【０８３９】
ある面において、本発明は、ＣＬＥＣ１２Ａ  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＣＬＥＣ１２Ａを発現する。
【０８４０】
ある面において、本発明は、ＢＳＴ２  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＢＳＴ２を発現する。
【０８４１】
ある面において、本発明は、ＥＭＲ２  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＥＭＲ２を発現する。
【０８４２】
ある面において、本発明は、ＬＹ７５  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＬＹ７５を発現する。
【０８４３】
ある面において、本発明は、ＧＰＣ３  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＧＰＣ３を発現する。
【０８４４】
ある面において、本発明は、ＦＣＲＬ５  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＦＣＲＬ５を発現する。
【０８４５】
ある面において、本発明は、ＩＧＬＬ１  ＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を提供することによる、それを必要とする対象における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌細胞はＩＧＬＬ１を発現する。
【０８４６】
ある面において、本発明は、癌性腫瘍の増殖が阻害されるように、ＰＤ１  ＣＡＲを使用して、インビボで対象を処置する方法に関する。ＰＤ１  ＣＡＲを、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用し得る。あるいは、ＰＤ１  ＣＡＲを他のＣＡＲ、免疫原性薬剤、標準的癌処置または他の抗体と組み合わせて使用し得る。ある態様において、対象を、ＰＤ１  ＣＡＲおよびここに記載するＸＣＡＲで処置する。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲを、他のＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲおよびキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用する。
【０８４７】
他の面において、対象を処置する、例えば、対象における過増殖性状態または障害(例えば、癌)、例えば、固形腫瘍、軟組織腫瘍または転移病変を減少するまたは軽減する方法が提供される。ここで使用する用語“癌”は、病理組織学的タイプまたは侵襲性の段階と無関係に、全てのタイプの癌性増殖または発癌性過程、転移組織または悪性に形質転換した細胞、組織または臓器を含むことを意図する。固形腫瘍の例は、肝臓、肺、乳房、リンパ系、消化器(例えば、結腸)、尿生殖器(例えば、腎臓、尿路上皮性細胞)、前立腺および咽頭を冒すもの、多様な臓器系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺癌および癌を含む。腺癌は、大部分の結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、肺非小細胞癌、小腸癌および食道癌のような悪性腫瘍を含む。ある態様において、癌は黒色腫、例えば、進行期黒色腫である。前記癌の転移病変も、本発明の方法および組成物を使用して処置または予防できる。処置できる他の癌の例は、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域癌、胃癌、精巣癌、、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン疾患、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌および該癌の組み合わせを含む。転移癌、例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移癌(Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ.  (２００５)  Ｉｎｔ.  Ｉｍｍｕｎｏｌ.  １７：１３３−１４４)の処置を、ここに記載する抗体分子を使用して実施できる。
【０８４８】
増殖が阻止され得る代表的癌は、一般に免疫療法に応答性の癌を含む。処置のための癌の非限定的例は、黒色腫(例えば、転移悪性黒色腫)、腎臓癌(例えば明細胞癌)、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、乳癌、結腸癌および肺癌(例えば非小細胞性肺癌)を含む。さらに、難治性または再発性悪性腫瘍を、ここに記載する分子を使用して処置できる。
【０８４９】
ある面において、本発明は、哺乳動物免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)における発現のためにプロモーターに操作可能に連結したＣＡＲを含むベクターに関する。ある面において、本発明は、ここに記載する癌関連抗原を発現する癌の処置に使用するための、本発明のＣＡＲを発現する組み換え免疫エフェクター細胞を提供する。ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞が癌細胞を標的とし、癌の増殖が阻害されるように、その表面に少なくとも１癌関連抗原を発現する腫瘍細胞と接触させ得る。
【０８５０】
ある面において、本発明は、ＣＡＲＴが抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的とし、腫瘍の増殖が阻止されるように、癌細胞と本発明のＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む、癌の増殖を阻止する方法に関する。
【０８５１】
ある面において、本発明は、対象における癌を処置する方法に関する。本方法は、癌が対象において処置されるように、対象に本発明のＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。ある面において、ここに記載する癌関連抗原の発現と関係する癌は血液癌である。ある面において、血液癌は白血病またはリンパ腫である。ある面において、ここに記載する癌関連抗原の発現と関係する癌は、例えば、例えば、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病(“ＢＡＬＬ”)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(“ＴＡＬＬ”)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病を含むが、これらに限定されない、癌および悪性腫瘍を含む。ここに記載する癌関連抗原の発現と関係するさらなる癌または血液学的状態は、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞性腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および骨髄球性血液細胞の産生不良(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである“前白血病状態”などを含むが、これらに限定されない。さらにここに記載する癌関連抗原の発現と関係する疾患は、例えば、ここに記載する癌関連抗原の発現と関係する非典型的および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。
【０８５２】
ある態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞により処置され得る癌は多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫は、骨髄における血漿細胞クローンの蓄積により特徴付けられる、血液の癌である。多発性骨髄腫の現在の治療は、サリドマイドのアナログであるレナリドマイドでの処置を含むが、これらに限定されない。レナリドマイドは、抗腫瘍活性、血管形成阻害および免疫調節を含む活性を有する。一般に、骨髄腫細胞は、フローサイトメトリーにより、ここに記載する癌関連抗原発現は陰性であると考えられる。それゆえに、ある態様において、例えば、ここに記載する、ＣＤ１９  ＣＡＲを骨髄腫細胞の標的のために使用し得る。ある態様において、本発明のＣＡＲ治療を、１以上のさらなる治療、例えば、レナリドマイド処置と組み合わせて使用できる。
【０８５３】
本発明は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)がキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように遺伝子修飾され、ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞治療を含む。注入された細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を殺すことができる。抗体治療と異なり、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、インビボで複製でき、持続した腫瘍制御に至り得る長期持続をもたらす。多様な面において、患者に投与された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)またはその子孫は、患者で、患者にＴ細胞またはＮＫ細胞投与後少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年または５年持続する。
【０８５４】
本発明はまた、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)が、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を一過性に発現するように、例えば、インビトロ転写ＲＮＡにより修飾し、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、それを必要とするレシピエントに注入する、ある種の細胞治療を含む。注入した細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を殺すことができる。それゆえに、多様な面において、患者に投与した免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、患者にＴ細胞またはＮＫ細胞投与後、１ヶ月、例えば、３週間、２週間、１週間未満持続する。
【０８５５】
何らかの特定の理論に縛られないが、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)により惹起される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的免疫応答であり得るかまたはあるいは直接的対間接的免疫応答によるものであり得る。ある面において、ＣＡＲ形質導入免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、ここに記載する癌関連抗原を発現するヒト癌細胞に応答して特定の炎症誘発性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解性活性を示し、可溶性の癌関連抗原阻害に抵抗し、バイスタンダー細胞死に介在し、確立されたヒト腫瘍の退縮に介在する。例えば、癌関連抗原発現腫瘍の不均一な場における低抗原腫瘍細胞は、近辺の抗原陽性癌細胞に対して先に反応している癌関連抗原の再指向免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)による間接的破壊を受け得る。
【０８５６】
ある面において、本発明の完全ヒトＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)は、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化および／またはインビボ治療のための１種のワクチンである。ある面において、哺乳動物はヒトである。
【０８５７】
エクスビボ免疫化に関して、次の少なくとも１つが、哺乳動物に細胞を投与する前にインビトロで起こる。ｉ)細胞の増殖、ii)細胞へのＣＡＲをコードする核酸の導入またはiii)細胞の凍結保存。
【０８５８】
エクスビボ過程は当分野で周知であり、下によりより詳細に記載する。簡潔には、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)から単離し、ここに記載するＣＡＲを発現するベクターで遺伝子修飾(すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクト)する。ＣＡＲ修飾細胞を、哺乳動物レシピエントに投与して、治療効果を提供できる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、ＣＡＲ修飾細胞はレシピエントに対して自己であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに対して同種、同系または異種であり得る。
【０８５９】
造血幹および前駆細胞細胞のエクスビボ増殖は、引用により本明細書に包含させる米国特許５,１９９,９４２号に記載され、本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法は当分野で知られ、それゆえに本発明は、細胞のエクスビボ増殖なんらかの特定の方法に限定されない。簡潔には、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)のエクスビボ培養および増殖は、(１)哺乳動物の採取した末梢血または骨髄外植片からＣＤ３４＋造血幹および前駆細胞細胞を採取し；そして(２)このような細胞をエクスビボで増殖することを含む。米国特許５,１９９,９４２号に記載の細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子を細胞の培養および増殖に使用し得る。
【０８６０】
エクスビボ免疫化の点で細胞ベースのワクチンを使用するのに加えて、本発明はまた患者における抗原に対する免疫応答を惹起するための、インビボ免疫化のための組成物および方法も提供する。
【０８６１】
一般に、ここに記載する細胞活性化および増殖は、免疫無防備状態の個体で生じる疾患の処置および予防に利用し得る。特に、本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、ここに記載する癌関連抗原の発現と関係する疾患、障害および状態の処置に使用し得る。ある面において、本発明の細胞を、ここに記載する癌関連抗原の発現と関係する疾患、障害および状態を発症するリスクのある患者の処置に使用する。それゆえに、本発明は、治療有効量の本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、処置を必要とする対象に投与することを含む、ここに記載する癌関連抗原の発現と関係する疾患、障害および状態を処置または予防する方法を提供する。
【０８６２】
ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞を癌または悪性腫瘍のような増殖性疾患または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態の処置に使用し得る。さらにここに記載する癌関連抗原の発現と関係する疾患は、例えば、ここに記載する癌関連抗原を発現する非典型的および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。ここに記載する癌関連抗原の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。
【０８６３】
本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、単独でまたは希釈剤および／またはＩＬ−２または他のサイトカインまたは細胞集団のような他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与し得る。
【０８６４】
血液癌
血液癌状態は、血液、骨髄およびリンパ系に影響する白血病、リンパ腫および悪性リンパ増殖性状態のようなタイプの癌である。
【０８６５】
白血病は急性白血病および慢性白血病に分類できる。急性白血病はさらに急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)として分類され得る。慢性白血病は慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)および慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含む。他の関連する状態は、骨髄球性血液細胞の産生不良(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションであり、ＡＭＬに癌化するリスクがある、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ、以前は“前白血病状態”として知られる)である。
【０８６６】
リンパ腫は、リンパ球から生じる血液細胞腫瘍の群である。代表的リンパ腫は非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む。
【０８６７】
本発明は、癌を処置するための組成物および方法を提供する。ある面において、癌は、白血病またはリンパ腫である血液学的癌を含むが、これらに限定されない血液癌である。ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞を、例えば、例えば、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病(“ＢＡＬＬ”)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(“ＴＡＬＬ”)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病；例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞性腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および骨髄球性血液細胞の産生不良(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである“前白血病状態”などを含むが、これらに限定されないさらなる血液癌または血液学的状態のような、しかし、これらに限定されない癌および悪性腫瘍の処置に使用し得る。さらにここに記載する癌関連抗原の発現と関係する疾患は、例えば、ここに記載する癌関連抗原を発現する非典型的および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。
【０８６８】
本発明はまた、ここに記載する癌関連抗原発現細胞集団の増殖を阻止するかまたは減少するための方法も提供し、該方法は、ここに記載する癌関連抗原発現細胞を含む細胞の集団と、ここに記載する癌関連抗原発現細胞と結合する本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞を接触させることを含む。具体的な面において、本発明は、ここに記載する癌関連抗原を発現する癌細胞の増殖を阻止するかまたは低下させるための方法を提供し、本方法は、ここに記載する癌関連抗原発現癌細胞集団とここに記載する癌関連抗原発現細胞と結合する本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞を接触させることを含む。ある面において、本発明は、ここに記載する癌関連抗原を発現する癌細胞の増殖を阻止するかまたは減少するための方法を提供し、本方法は、ここに記載する癌関連抗原発現癌細胞集団とここに記載する癌関連抗原発現細胞と結合する本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞を接触させることを含む。ある面において、本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、骨髄球性白血病またはここに記載する癌関連抗原発現細胞と関係する他の癌を有する対象または動物モデルにおいて、陰性対照と比較して細胞および／または癌細胞の含量、数、量またはパーセンテージを少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させる。ある面において、対象はヒトである。
【０８６９】
本発明はまた、ここに記載する癌関連抗原発現細胞と関係する疾患(例えば、ここに記載する癌関連抗原を発現する血液癌または非典型的癌)を予防、処置および／または管理する方法も提供し、本方法は、それを必要とする対象にここに記載する癌関連抗原発現細胞と結合する本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞を投与することを含む。ある面において、対象はヒトである。ここに記載する癌関連抗原発現細胞と関係する障害の非限定的例は、自己免疫性障害(例えば狼瘡)、炎症性障害(例えばアレルギーおよび喘息)および癌(例えばここに記載する癌関連抗原を発現する血液癌または非典型的癌)を含む。
【０８７０】
本発明はまたここに記載する癌関連抗原発現細胞と関係する疾患を予防、処置および／または管理する方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象にここに記載する癌関連抗原発現細胞と結合する本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞を投与することを含む。ある面において、対象はヒトである。
【０８７１】
本発明は、ここに記載する癌関連抗原発現細胞と関係する癌の再発を予防する方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象に、ここに記載する癌関連抗原発現細胞と結合する本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞を投与することを含む。ある面において、本方法は、それを必要とする対象に、有効量のここに記載する癌関連抗原発現細胞と結合するここに記載するＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、有効量の他の治療と組み合わせて投与することを含む。
【０８７２】
組み合わせ治療
ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、他の既知薬剤および治療と組み合わせて使用し得る。ここで使用する“組み合わせて”投与するは２(またはそれ以上)の異なる処置を、対象が障害に苦しんでいる過程の間に対象に送達することを意味し、例えば、２以上の処置を、対象が障害と診断された後にかつ障害が治癒または撲滅される前にまたは処置が他の理由で中止される前に送達される。ある態様において、投与期間の重複があるように、一方の処置の送達は、第二の処置の送達開始時にまだ行われている。これは、ここでは“同時の”または“一緒の送達”ということがある。他の態様において、一方の処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。いずれかの場合のある態様において、処置は、組み合わせ投与のためにより有効である。例えば、第二処置はより有効である、例えば、等しい効果が少ない第二処置で見られるまたは第二処置が、第二処置を第一処置非存在下で投与したときに見られるよりも大きな程度で症状を軽減するまたは第一処置で同様な状況が見られる。ある態様において、送達は、障害と関係する症状または他のパラメーターの減少が、他方の処置の非存在下で一方の処置の送達で観察されるされるより大きい。２処置の効果は一部相加的、完全相加的または相加的より大きいものであり得る。送達は、送達した第一処置の効果が、第二剤の送達時になお検出可能であるようなものであり得る。
【０８７３】
ここに記載するＣＡＲ発現細胞および少なくとも１つのさらなる治療剤を同時に、同じまたは別の組成物でまたは逐次的に投与できる。逐次投与について、ここに記載するＣＡＲ発現細胞をまず投与し、さらなる薬剤を次に投与するかまたは投与の順番は逆でよい。
【０８７４】
ＣＡＲ治療および／または他の治療剤、方法またはモダリティーを、活動性障害の期間または寛解または低活動性疾患の期間に投与できる。ＣＡＲ治療を、他の処置の処置前、処置と同時、処置後または障害の寛解中に投与できる。
【０８７５】
組み合わせて投与するとき、ＣＡＲ治療およびさらなる薬剤(例えば、第二または第三薬剤)または全てを、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または投与より高い、低いまたは同じ量または用量で投与できる。ある態様において、ＣＡＲ治療、さらなる薬剤(例えば、第二または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％)。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)を生じるＣＡＲ治療、さらなる薬剤(例えば、第二または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、同じ治療効果を達成するのに必要な、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％低い)。
【０８７６】
さらなる面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、手術、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体治療のような他の免疫除去剤、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射、Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載されるようなペプチドワクチンと組み合わせる処置レジメンにおいて使用し得る。
【０８７７】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を化学療法剤と組み合わせて使用し得る。代表的化学療法剤は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ)、代謝拮抗剤(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン)を含む)、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)のような免疫調節剤を含む。
【０８７８】
組み合わせ治療における使用に考慮される一般的化学療法剤は、アナストロゾール(アリミデックス(登録商標))、ビカルタミド(カソデックス(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))、ブスルファン(マイレラン(登録商標))、ブスルファン注(ブスルフェクス(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、シスプラチン(Ｐｌａｔｉｎｏｌ(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)またはＮｅｏｓａｒ(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ(登録商標))、シタラビンリポソーム注射(ＤｅｐｏＣｙｔ(登録商標))、ダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ)、塩酸ダウノルビシン(Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射(ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))、デキサメサゾン、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、Ｒｕｂｅｘ(登録商標))、エトポシド(ベプシド(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、５−フルオロウラシル(アドルシル(登録商標)、エフデックス(登録商標))、フルタミド(Ｅｕｌｅｘｉｎ(登録商標))、テザシチビン、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(ハイドレア(登録商標))、イダルビシン(イダマイシン(登録商標))、イホスファミド(ＩＦＥＸ(登録商標))、イリノテカン(Ｃａｍｐｔｏｓａｒ(登録商標))、Ｌ−アスパラギナーゼ(ＥＬＳＰＡＲ(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(アルケラン(登録商標))、６−メルカプトプリン(ピュリネソール(登録商標))、メトトレキサート(Ｆｏｌｅｘ(登録商標))、ミトキサントロン(ノバントロン(登録商標))、マイロターグ、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ｐｈｏｅｎｉｘ(イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ)、ペントスタチン、ポリフェプロザン２０とカルムスチンインプラント(グリアデル(登録商標))、クエン酸タモキシフェン(ノルバデックス(登録商標))、テニポシド(Ｖｕｍｏｎ(登録商標))、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Ｔｉｒａｚｏｎｅ(登録商標))、注射用塩酸トポテカン(Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ(登録商標))、ビンブラスチン(Ｖｅｌｂａｎ(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
【０８７９】
代表的アルキル化剤は、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼン)：ウラシルマスタード(アミノウラシルマスタード(登録商標)、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ(登録商標)、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ(登録商標)、Ｎｏｒｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ(登録商標)、ウラムスチン(登録商標)、ウラムスチン(登録商標))、クロルメチン(Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｃｌａｆｅｎ(登録商標)、エンドキサン(登録商標)、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ(登録商標)、ＲｅｖｉｍｍｕｎｅＴＭ)、イホスファミド(Ｍｉｔｏｘａｎａ(登録商標))、メルファラン(アルケラン(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、ピポブロマン(Ａｍｅｄｅｌ(登録商標)、Ｖｅｒｃｙｔｅ(登録商標))、トリエチレンメラミン(ヘメル(登録商標)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標)、Ｈｅｘａｓｔａｔ(登録商標))、トリエチレンチオホスホロアミン、テモゾロミド(テモダール(登録商標))、チオテパ(Ｔｈｉｏｐｌｅｘ(登録商標))、ブスルファン(Ｂｕｓｉｌｖｅｘ(登録商標)、マイレラン(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、ロムスチン(ＣｅｅＮＵ(登録商標))、ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))およびダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))を含むが、これらに限定されない。さらなる代表的アルキル化剤は、オキサリプラチン(エロキサチン(登録商標))；テモゾロミド(テモダール(登録商標)およびＴｅｍｏｄａｌ(登録商標))；ダクチノマイシン(別名アクチノマイシン−Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ(登録商標))；メルファラン(別名Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタード、アルケラン(登録商標))；アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))；ベンダムスチン(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))；ブスルファン(ブスルフェクス(登録商標)およびマイレラン(登録商標))；カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))；ロムスチン(別名ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ(登録商標))；シスプラチン(別名ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ(登録商標)およびＰｌａｔｉｎｏｌ(登録商標)−ＡＱ)；クロラムブシル(リューケラン(登録商標))；シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)およびＮｅｏｓａｒ(登録商標))；ダカルバジン(別名ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))；アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；イホスファミド(Ｉｆｅｘ(登録商標))；Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ；プロカルバジン(Ｍａｔｕｌａｎｅ(登録商標))；メクロレタミン(別名窒素マスタード、ムスチンおよび塩酸メクロロエタミン、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))；ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))；チオテパ(別名チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ(登録商標))；シクロホスファミド(エンドキサン(登録商標)、シトキサン(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ(登録商標)、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ(登録商標))；およびベンダムスチンＨＣｌ(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))を含むが、これらに限定されない。
【０８８０】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にフルダラビン、シクロホスファミドおよび／またはリツキシマブと組み合わせて投与し得る。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にフルダラビン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ(ＦＣＲ)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。例えば、対象は、例えば、白血病性細胞において染色体１７の短腕の欠損(ｄｅｌ(１７ｐ))を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、フルダラビンを、約１０〜５０ｍｇ／ｍ２(例えば、約１０〜１５ｍｇ／ｍ２、１５〜２０ｍｇ／ｍ２、２０〜２５ｍｇ／ｍ２、２５〜３０ｍｇ／ｍ２、３０〜３５ｍｇ／ｍ２、３５〜４０ｍｇ／ｍ２、４０〜４５ｍｇ／ｍ２または４５〜５０ｍｇ／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、シクロホスファミドを、約２００〜３００ｍｇ／ｍ２(例えば、約２００〜２２５ｍｇ／ｍ２、２２５〜２５０ｍｇ／ｍ２、２５０〜２７５ｍｇ／ｍ２または２７５〜３００ｍｇ／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、リツキシマブを、約４００〜６００ｍｇ／ｍ２(例えば、４００〜４５０ｍｇ／ｍ２、４５０〜５００ｍｇ／ｍ２、５００〜５５０ｍｇ／ｍ２または５５０〜６００ｍｇ／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
【０８８１】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に、ベンダムスチンおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。例えば、対象は、染色体１７の短腕の欠損(例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ))を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、ベンダムスチンを、約７０〜１１０ｍｇ／ｍ２(例えば、７０〜８０ｍｇ／ｍ２、８０〜９０ｍｇ／ｍ２、９０〜１００ｍｇ／ｍ２または１００〜１１０ｍｇ／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、リツキシマブを、約４００〜６００ｍｇ／ｍ２(例えば、４００〜４５０ｍｇ／ｍ２、４５０〜５００ｍｇ／ｍ２、５００〜５５０ｍｇ／ｍ２または５５０〜６００ｍｇ／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
【０８８２】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよび／またはコルチコステロイド(例えば、プレドニゾン)と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン(Ｒ−ＣＨＯＰ)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)を有する。ある態様において、対象は、大きくない限定病期ＤＬＢＣＬ(例えば、７ｃｍ未満のサイズ／直径を有する腫瘍を含む)を有する。ある態様において、対象を、Ｒ−ＣＨＯＰと組み合わせた放射線で処置する。例えば、対象に、Ｒ−ＣＨＯＰ(例えば、１〜６サイクル、例えば、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクルまたは６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ)、続いて放射線を投与する。ある場合、対象に、放射線後にＲ−ＣＨＯＰ(例えば、１〜６サイクル、例えば、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクルまたは６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ)を投与する。
【０８８３】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にエトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよび／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にエトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびリツキシマブ(ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に用量調節ＥＰＯＣＨ−Ｒ(ＤＡ−ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、Ｍｙｃ再構成侵襲性Ｂ細胞リンパ腫を有する。
【０８８４】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブおよび／またはレナリドマイドと組み合わせて投与する。レナリドマイド((ＲＳ)−３−(４−アミノ−１−オキソ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル)ピペリジン−２,６−ジオン)は免疫調節剤である。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブおよびレナリドマイドと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、濾胞性リンパ腫(ＦＬ)またはマントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)を有する。ある態様において、対象はＦＬを有し、先に癌治療剤での処置を受けていない。ある態様において、レナリドマイドを、約１０〜２０ｍｇ(例えば、１０〜１５ｍｇまたは１５〜２０ｍｇ)の用量で、例えば、連日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０ｍｇ／ｍ２(例えば、３５０〜３７５ｍｇ／ｍ２、３７５〜４００ｍｇ／ｍ２、４００〜４２５ｍｇ／ｍ２、４２５〜４５０ｍｇ／ｍ２、４５０〜４７５ｍｇ／ｍ２または４７５〜５００ｍｇ／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
【０８８５】
代表的ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス(以前はデフォロリムスとして知られる、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィナート、別名ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９であり、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３号に記載)；エベロリムス(アフィニトール(登録商標)またはＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９、シロリムス(登録商標))；セマピモド(ＣＡＳ  １６４３０１−５１−３)；テムシロリムス(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ  １０１３１０１−３６−４)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩(ＳＦ１１２６、ＣＡＳ  ９３６４８７−６７−１)およびＸＬ７６５を含む。
【０８８６】
代表的免疫調節剤は、例えば、アフツズマブ(Ｒｏｃｈｅ(登録商標)から入手可能)；ペグフィルグラスチム(Ｎｅｕｌａｓｔａ(登録商標))；レナリドマイド(ＣＣ−５０１３、レブリミド(登録商標))；サリドマイド(サロミド(登録商標))、ａｃｔｉｍｉｄ(ＣＣ４０４７)；およびＩＲＸ−２(インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、ＣＡＳ  ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能)を含む。
【０８８７】
代表的アントラサイクリンは、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)およびＲｕｂｅｘ(登録商標))；ブレオマイシン(ｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))；ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))；ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))；ミトキサントロン(ＤＨＡＤ、ノバントロン(登録商標))；エピルビシン(ＥｌｌｅｎｃｅＴＭ)；イダルビシン(イダマイシン(登録商標)、イダマイシンＰＦＳ(登録商標))；マイトマイシンＣ(ムタマイシン(登録商標))；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンを含む。
【０８８８】
代表的ビンカアルカロイドは、例えば、酒石酸ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビンデシン(Ｅｌｄｉｓｉｎｅ(登録商標)))；ビンブラスチン(別名硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ(登録商標)およびＶｅｌｂａｎ(登録商標))；およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
【０８８９】
代表的プロテオソーム阻害剤は、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標))；カーフィルゾミブ(ＰＸ−１７１−００７、(Ｓ)−４−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(((Ｓ)−４−メチル−１−((Ｒ)−２−メチルオキシラン−２−イル)−１−オキソペンタン−２−イル)アミノ)−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル)−２−((Ｓ)−２−(２−モルホリノアセトアミド)−４−フェニルブタンアミド)−ペンタンアミド)；マリゾミブ(ＮＰＩ−００５２)；イキサゾミブクエン酸エステル(ＭＬＮ−９７０８)；デランゾミブ(ＣＥＰ−１８７７０)；およびＯ−メチル−Ｎ−[(２−メチル−５−チアゾリル)カルボニル]−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−[(１Ｓ)−２−[(２Ｒ)−２−メチル−２−オキシラニル]−２−オキソ−１−(フェニルメチル)エチル]−Ｌ−セリンアミド(ＯＮＸ−０９１２)を含む。
【０８９０】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にブレンツキシマブと組み合わせて投与する。ブレンツキシマブは、抗ＣＤ３０抗体およびモノメチルオーリスタチンＥの抗体−薬物コンジュゲートである。ある態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、例えば、再発したまたは難治性ＨＬを有する。ある態様において、対象は、ＣＤ３０＋  ＨＬを含む。ある態様において、対象は、自己幹細胞移植(ＡＳＣＴ)を受けている。ある態様において、対象は、ＡＳＣＴを受けていない。ある態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３ｍｇ／ｋｇ(例えば、約１〜１.５ｍｇ／ｋｇ、１.５〜２ｍｇ／ｋｇ、２〜２.５ｍｇ／ｋｇまたは２.５〜３ｍｇ／ｋｇ)の用量で、例えば、静脈内に、例えば、３週間毎に投与する。
【０８９１】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にブレンツキシマブおよびダカルバジンと組み合わせてまたはブレンツキシマブおよびベンダムスチンと組み合わせて投与する。ダカルバジンは、化学名５−(３,３−ジメチル−１−トリアゼニル)イミダゾール−４−カルボキサミドを有するアルキル化剤である。ベンダムスチンは、化学名４−[５−[ビス(２−クロロエチル)アミノ]−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル]ブタン酸を有するアルキル化剤である。ある態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)を有する。ある態様において、対象は、先に癌治療剤での処置を受けていない。ある態様において、対象は少なくとも６０歳、例えば、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳またはそれ以上である。ある態様において、ダカルバジンを、約３００〜４５０ｍｇ／ｍ２(例えば、約３００〜３２５ｍｇ／ｍ２、３２５〜３５０ｍｇ／ｍ２、３５０〜３７５ｍｇ／ｍ２、３７５〜４００ｍｇ／ｍ２、４００〜４２５ｍｇ／ｍ２または４２５〜４５０ｍｇ／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、ベンダムスチンを、約７５〜１２５ｍｇ／ｍ２(例えば、７５〜１００ｍｇ／ｍ２または１００〜１２５ｍｇ／ｍ２、例えば、約９０ｍｇ／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３ｍｇ／ｋｇ(例えば、約１〜１.５ｍｇ／ｋｇ、１.５〜２ｍｇ／ｋｇ、２〜２.５ｍｇ／ｋｇまたは２.５〜３ｍｇ／ｋｇ)の用量で、例えば、静脈内に、例えば、３週間毎に投与する。
【０８９２】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤ２０阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体(例えば、抗ＣＤ２０単−または二重特異的抗体)またはそのフラグメントと組み合わせて投与する。代表的抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ−０１５(Trubion Pharmaceuticals)、オカラツズマブおよびＰｒｏ１３１９２１(Genentech)を含むが、これらに限定されない。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43参照。
【０８９３】
ある態様において、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブを含む。リツキシマブは、例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdfに記載のように、ＣＤ２０に結合し、ＣＤ２０発現細胞の細胞溶解を引き起こすキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１カッパである。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
【０８９４】
ある態様において、リツキシマブを、静脈内に、例えば、静脈内点滴として投与する。例えば、各注入は、約５００〜２０００ｍｇ(例えば、約５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００ｍｇ、８００〜８５０ｍｇ、８５０〜９００ｍｇ、９００〜９５０ｍｇ、９５０〜１０００ｍｇ、１０００〜１１００ｍｇ、１１００〜１２００ｍｇ、１２００〜１３００ｍｇ、１３００〜１４００ｍｇ、１４００〜１５００ｍｇ、１５００〜１６００ｍｇ、１６００〜１７００ｍｇ、１７００〜１８００ｍｇ、１８００〜１９００ｍｇまたは１９００〜２０００ｍｇ)のリツキシマブを提供する。ある態様において、リツキシマブを、１５０ｍｇ／ｍ２〜７５０ｍｇ／ｍ２、例えば、約１５０〜１７５ｍｇ／ｍ２、１７５〜２００ｍｇ／ｍ２、２００〜２２５ｍｇ／ｍ２、２２５〜２５０ｍｇ／ｍ２、２５０〜３００ｍｇ／ｍ２、３００〜３２５ｍｇ／ｍ２、３２５〜３５０ｍｇ／ｍ２、３５０〜３７５ｍｇ／ｍ２、３７５〜４００ｍｇ／ｍ２、４００〜４２５ｍｇ／ｍ２、４２５〜４５０ｍｇ／ｍ２、４５０〜４７５ｍｇ／ｍ２、４７５〜５００ｍｇ／ｍ２、５００〜５２５ｍｇ／ｍ２、５２５〜５５０ｍｇ／ｍ２、５５０〜５７５ｍｇ／ｍ２、５７５〜６００ｍｇ／ｍ２、６００〜６２５ｍｇ／ｍ２、６２５〜６５０ｍｇ／ｍ２、６５０〜６７５ｍｇ／ｍ２または６７５〜７００ｍｇ／ｍ２の用量で投与し、ここで、ｍ２は対象の体表面積を示す。ある態様において、リツキシマブを、少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投薬間隔を開けて投与する。例えば、リツキシマブを、少なくとも０.５週間、例えば、０.５週間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上の投薬間隔を開けて投与する。ある態様において、リツキシマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、一定期間、例えば、少なくとも２週間、例えば、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間またはそれ以上投与する。例えば、リツキシマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、処置サイクルあたり合計少なくとも４投与で投与する(例えば、処置サイクルあたり少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６またはそれ以上投与)。
【０８９５】
ある態様において、抗ＣＤ２０抗体は、オファツムマブを含む。オファツムマブは、分子量約１４９ｋＤａの抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブは、トランスジェニックマウスおよびハイブリドーマテクノロジーを使用して産生し、組み換えマウス細胞株(ＮＳ０)で発現され、精製される。例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；および治験番号ＮＣＴ０１３６３１２８、ＮＣＴ０１５１５１７６、ＮＣＴ０１６２６３５２およびＮＣＴ０１３９７５９１参照。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にオファツムマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
【０８９６】
ある態様において、オファツムマブを静脈内点滴として投与する。例えば、各注入は、約１５０〜３０００ｍｇ(例えば、約１５０〜２００ｍｇ、２００〜２５０ｍｇ、２５０〜３００ｍｇ、３００〜３５０ｍｇ、３５０〜４００ｍｇ、４００〜４５０ｍｇ、４５０〜５００ｍｇ、５００〜５５０ｍｇ、５５０〜６００ｍｇ、６００〜６５０ｍｇ、６５０〜７００ｍｇ、７００〜７５０ｍｇ、７５０〜８００ｍｇ、８００〜８５０ｍｇ、８５０〜９００ｍｇ、９００〜９５０ｍｇ、９５０〜１０００ｍｇ、１０００〜１２００ｍｇ、１２００〜１４００ｍｇ、１４００〜１６００ｍｇ、１６００〜１８００ｍｇ、１８００〜２０００ｍｇ、２０００〜２２００ｍｇ、２２００〜２４００ｍｇ、２４００〜２６００ｍｇ、２６００〜２８００ｍｇまたは２８００〜３０００ｍｇ)のオファツムマブを提供する。ある態様において、オファツムマブを約３００ｍｇの出発用量で開始し、続いて２０００ｍｇで、例えば、約１１回投与、例えば、２４週間投与する。ある態様において、オファツムマブを、少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投薬間隔を開けて投与する。例えば、オファツムマブを、少なくとも１週間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、２４週間、２６週間、２８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間またはそれ以上の投薬間隔で投与する。ある態様において、オファツムマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、一定期間、例えば、少なくとも１週間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間、４０週間、５０週間、６０週間またはそれ以上または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月またはそれ以上または１年、２年、３年、４年、５年またはそれ以上投与する。例えば、オファツムマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、処置サイクルあたり合計少なくとも２投与で投与する(例えば、処置サイクルあたり少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０またはそれ以上投与)。
【０８９７】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はオクレリズマブを含む。オクレリズマブは、例えば、治験番号ＮＣＴ０００７７８７０、ＮＣＴ０１４１２３３３、ＮＣＴ００７７９２２０、ＮＣＴ００６７３９２０、ＮＣＴ０１１９４５７０およびKappos et al. Lancet. 19.378 (2011):1779-87に記載される、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【０８９８】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はベルツズマブを含む。ベルツズマブはＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、治験番号ＮＣＴ００５４７０６６、ＮＣＴ００５４６７９３、ＮＣＴ０１１０１５８１およびGoldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55参照。
【０８９９】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１(別名オビヌツズマブまたはＲＯ５０７２７５９)は、ヒト化および糖操作された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; 治験番号ＮＣＴ０１９９５６６９、ＮＣＴ０１８８９７９７、ＮＣＴ０２２２９４２２およびＮＣＴ０１４１４２０５；およびwww.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf参照。
【０９００】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はＡＭＥ−１３３ｖを含む。ＡＭＥ−１３３ｖ(別名ＬＹ２４６９２９８またはオカラツズマブ)は、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲIIIａ受容体に対する親和性が増加され、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性が増強されたＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25;およびForero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403参照。
【０９０１】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１は、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲIIIａへの結合が良好であり、ＡＤＣＣが増強されるように操作されたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25;およびCasulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46；および治験番号ＮＣＴ００４５２１２７参照。
【０９０２】
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はＴＲＵ−０１５を含む。ＴＲＵ−０１５は、ＣＤ２０に対する抗体のドメイン由来の抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ−０１５はモノクローナル抗体より小さいが、Ｆｃ介在エフェクター機能を維持する。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25参照。ＴＲＵ−０１５は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインと連結した抗ＣＤ２０一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含むが、ＣＨ１およびＣＬドメインを欠く。
【０９０３】
ある態様において、抗ＣＤ２０ここに記載する抗体は、ここに記載する治療剤、例えば、化学療法剤(例えば、シトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、デメチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管または抗有糸分裂剤)、抗アレルギー剤、抗悪心剤(または鎮吐剤)、鎮痛剤または細胞保護剤とコンジュゲートしているかまたは他に結合している。
【０９０４】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＢ細胞リンパ腫２(ＢＣＬ−２)阻害剤(例えば、ベネトクラックス、別名ＡＢＴ−１９９またはＧＤＣ−０１９９)および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にベネトクラックスおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ベネトクラックスは、抗アポトーシスタンパク質、ＢＣＬ−２を阻害する小分子である。ベネトクラックス(４−(４−{[２−(４−クロロフェニル)−４,４−ジメチルシクロヘキシ−１−エン−１−イル]メチル}ピペラジン−１−イル)−Ｎ−({３−ニトロ−４−[(テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルメチル)アミノ]フェニル}スルホニル)−２−(１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン−５−イルオキシ)ベンズアミド)の構造を下に示す。
【化１９】
2019206538.tif 000031
【０９０５】
ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象は、再発したＣＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療剤を投与されている。ある態様において、ベネトクラックスを、約１５〜６００ｍｇ(例えば、１５〜２０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、５０〜７５ｍｇ、７５〜１００ｍｇ、１００〜２００ｍｇ、２００〜３００ｍｇ、３００〜４００ｍｇ、４００〜５００ｍｇまたは５００〜６００ｍｇ)の用量で、例えば、連日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０ｍｇ／ｍ２(例えば、３５０〜３７５ｍｇ／ｍ２、３７５〜４００ｍｇ／ｍ２、４００〜４２５ｍｇ／ｍ２、４２５〜４５０ｍｇ／ｍ２、４５０〜４７５ｍｇ／ｍ２または４７５〜５００ｍｇ／ｍ２)の用量で、静脈内に、例えば、月１回投与する。
【０９０６】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象にＴｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて投与する。Ｔｒｅｇ細胞の数を減らす(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与、ＧＩＴＲ機能調節を含む。理論に縛られることを望まないが、アフェレシス前またはここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与に対象におけるＴｒｅｇ細胞の数を減らすことは、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞(例えば、Ｔｒｅｇ)の数を減らし、対象の再発リスクを減らすと考えられる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象に、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体のようなＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象にシクロホスファミドと組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子(例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体)を、ＣＡＲ発現細胞の投与前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレシス前に投与できる。ある態様において、シクロホスファミドを、対象にＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレシス前に投与する。ある態様において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を、対象にＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレシス前に投与する。ある態様において、対象は癌(例えば、固形癌またはＡＬＬまたはＣＬＬのような血液癌)を有する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象はＡＬＬを有する。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌を有する。代表的ＧＩＴＲアゴニストは、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のような、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含む。
【０９０７】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスのようなラパログと組み合わせて投与する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、細胞のアフェレシス前に投与できる。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。
【０９０８】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ここに記載するＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレシス前に投与できる。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。
【０９０９】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、キナーゼ阻害剤と組み合わせて使用できる。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン、塩酸塩(別名パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１)のような、例えば、ＣＤ４／６阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブのような、例えば、ここに記載するＢＴＫ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、ＯＳＩ−０２７のような、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、例えば、ＰＦ−０４６９５１０２のような、ここに記載するデュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤である。
【０９１０】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン；クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６)；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロライド(Ｐ２７６−００)；１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)；インジスラム(Ｅ７０７０)；ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)；パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)；ジナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)；Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ３８７０３２)；４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(ＭＬＮ８０５４)；５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)；４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)；４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)；およびＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
【０９１１】
ある態様において、キナーゼ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)であり、パルボシクリブを、一定期間、１日約５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ(例えば、７５ｍｇ、１００ｍｇまたは１２５ｍｇ)の用量で、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日間連日または２１日サイクルの７〜１２日間連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のパルボシクリブを投与する。
【０９１２】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にサイクリン依存性キナーゼ(ＣＤＫ)４または６阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両者を標的とする阻害剤)、例えば、ここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、対象はＭＣＬを有する。ＭＣＬは、現在利用可能な治療にほとんど応答しない、すなわち、本質的に不治の侵襲性癌である。ＭＣＬの多くの場合、サイクリンＤ１(ＣＤＫ４／６のレギュレーター)がＭＣＬ細胞において発現される(例えば、免疫グロブリンおよびサイクリンＤ１遺伝子を含む染色体転座のため)。それゆえに、理論に縛られないが、ＭＣＬ細胞が高特異性(すなわち、正常免疫細胞に最小効果で)でＣＤＫ４／６阻害に高度に感受性であると考えられる。ＣＤＫ４／６阻害剤単独は、ＭＣＬの処置にいくぶん有効性を有しているが、部分的寛解しか達成されず、高い再発率である。代表的ＣＤＫ４／６阻害剤はＬＥＥ０１１(別名リボシクリブ)であり、その構造を下に示す。
【化２０】
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【０９１３】
理論に縛られないが、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＬＥＥ０１１または他のここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤)の投与は、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤と比較して、高い応答性、例えば、高い寛解率および／または低い再発率を達成できると考えられる。
【０９１４】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。好ましい態様において、ＢＴＫ阻害剤はインターロイキン−２誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低下または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
【０９１５】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)である。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にイブルチニブ(別名ＰＣＩ−３２７６５)と組み合わせて投与する。イブルチニブ(１−[(３Ｒ)−３−[４−アミノ−３−(４−フェノキシフェニル)−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−１−イル]ピペリジン−１−イル]プロプ−２−エン−１−オン)の構造を下に示す。
【化２１】
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【０９１６】
ある態様において、対象はＣＬＬ、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)または小リンパ性リンパ腫(ＳＬＬ)を有する。例えば、対象は、染色体１７の短腕の欠損(例えば、白血病性細胞においてｄｅｌ(１７ｐ))を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は再発したＣＬＬまたはＳＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療剤を投与されている(例えば、先に１種、２種、３種または４種の癌治療剤を投与されている)。ある態様において、対象は難治性ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。他の態様において、対象は濾胞性リンパ腫、例えば、再発または難治性濾胞性リンパ腫を有する。ある態様において、イブルチニブを、約３００〜６００ｍｇ／日(例えばｍｇ／日、約３００〜３５０ｍｇ／日、３５０〜４００ｍｇ／日、４００〜４５０ｍｇ／日、４５０〜５００ｍｇ／日、５００〜５５０ｍｇ／日または５５０〜６００ｍｇ／日、例えば、約４２０ｍｇ／日または約５６０ｍｇ／日)の用量で、例えば、経口で投与する。ある態様において、イブルチニブを、約２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６００ｍｇ(例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇまたは５６０ｍｇ)の用量で、連日一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のイブルチニブを投与する。理論に縛られないが、イブルチニブの投与は、Ｔ細胞増殖性応答を増強し、Ｔ細胞をＴヘルパー−２(Ｔｈ２)からＴヘルパー−１(Ｔｈ１)表現型にシフトさせ得ると考えられる。Ｔｈ１およびＴｈ２はヘルパーＴ細胞の表現型であり、Ｔｈ１とＴｈ２は異なる免疫応答経路を指向する。Ｔｈ１表現型は、例えば、細胞内病原体／ウイルスまたは癌性細胞のような細胞を細胞死させる、炎症誘発性応答または自己免疫性応答永続化と関係する。Ｔｈ２表現型は、好酸球蓄積および抗炎症性応答と関係する。
【０９１７】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；リダフォロリムス(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィナート、別名ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９；エベロリムス(ＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９)；セマピモド；(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩(ＳＦ１１２６)；およびＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
【０９１８】
ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、約３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ(例えば、６ｍｇ)の用量で連日、一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のラパマイシンを投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを、一定期間、１日約２ｍｇ、２.５ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ(例えば、１０ｍｇ)の用量で、例えば、２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクルまたはそれ以上のエベロリムスを投与する。
【０９１９】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５−２；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
【０９２０】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にホスホイノシチド３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)阻害剤(例えば、ここに記載するＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブまたはドゥベリシブ)および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にイデラリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にドゥベリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。イデラリシブ(別名ＧＳ−１１０１またはＣＡＬ−１０１；Gilead)は、ＰＩ３Ｋのデルタアイソフォームを遮断する小分子である。イデラリシブ(５−フルオロ−３−フェニル−２−[(１Ｓ)−１−(７Ｈ−プリン−６−イルアミノ)プロピル]−４(３Ｈ)−キナゾリノン)の構造を下に示す。
【化２２】
2019206538.tif 000034
【０９２１】
ドゥベリシブ(別名ＩＰＩ−１４５; Infinity PharmaceuticalsおよびAbbvie)は、ＰＩ３Ｋ−δ,γを遮断する小分子である。ドゥベリシブ(８−クロロ−２−フェニル−３−[(１Ｓ)−１−(９Ｈ−プリン−６−イルアミノ)エチル]−１(２Ｈ)−イソキノリノン)の構造を下に示す。
【化２３】
2019206538.tif 000035
【０９２２】
ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象は再発したＣＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療剤を投与されている(例えば、先に抗ＣＤ２０抗体を投与されているまたは先にイブルチニブを投与されている)。例えば、対象は、染色体１７の短腕の欠損(例えば、白血病性細胞においてｄｅｌ(１７ｐ))を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、対象は、染色体１１の長腕の欠損(ｄｅｌ(１１ｑ))を有する。他の態様において、対象は、ｄｅｌ(１１ｑ)を有しない。ある態様において、イデラリシブを、約１００〜４００ｍｇ(例えばｍｇ、１００〜１２５ｍｇ、１２５〜１５０ｍｇ、１５０〜１７５ｍｇ、１７５〜２００ｍｇ、２００〜２２５ｍｇ、２２５〜２５０ｍｇ、２５０〜２７５ｍｇ、２７５〜３００ｍｇ、３２５〜３５０ｍｇ、３５０〜３７５ｍｇまたは３７５〜４００ｍｇ)の用量で、例えば、ＢＩＤで投与する。ある態様において、ドゥベリシブを、約１５〜１００ｍｇ(例えば、約１５〜２５ｍｇ、２５〜５０ｍｇ、５０〜７５ｍｇまたは７５〜１００ｍｇ)の用量で、例えば、１日２回投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０ｍｇ／ｍ２(例えば、３５０〜３７５ｍｇ／ｍ２、３７５〜４００ｍｇ／ｍ２、４００〜４２５ｍｇ／ｍ２、４２５〜４５０ｍｇ／ｍ２、４５０〜４７５ｍｇ／ｍ２または４７５〜５００ｍｇ／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
【０９２３】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)；アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)；３−[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。
【０９２４】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)阻害剤と組み合わせて投与する。代表的ＡＬＫキナーゼは、クリゾチニブ(Pfizer)、セリチニブ(Novartis)、アレクチニブ(中外)、ブリガチニブ(別名ＡＰ２６１１３；Ariad)、エントレクチニブ(Ignyta)、ＰＦ−０６４６３９２２(Pfizer)、ＴＳＲ−０１１(Tesaro)(例えば、治験番号ＮＣＴ０２０４８４８８参照)、ＣＥＰ−３７４４０(Teva)およびＸ−３９６(Xcovery)を含むが、これらに限定されない。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌、例えば、肺癌を有する。
【０９２５】
クリゾチニブの化学名は、３−[(１Ｒ)−１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ]−５−(１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル)ピリジン−２−アミンである。セリチニブの化学名は、５−クロロ−Ｎ２−[２−イソプロポキシ−５−メチル−４−(４−ピペリジニル)フェニル]−Ｎ４−[２−(イソプロピルスルホニル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。アレクチニブの化学名は、９−エチル−６,６−ジメチル−８−(４−モルホリノピペリジン−１−イル)−１１−オキソ−６,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[ｂ]カルバゾール−３−カルボニトリルである。ブリガチニブの化学名は、５−クロロ−Ｎ２−{４−[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]−２−メトキシフェニル}−Ｎ４−[２−(ジメチルホスホｒｙｌ)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。エントレクチニブの化学名は、Ｎ−(５−(３,５−ジフルオロベンジル)−１Ｈ−インダゾール−３−イル)−４−(４−メチルピペラジン−１−イル)−２−((テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル)アミノ)ベンズアミドである。ＰＦ−０６４６３９２２(１０Ｒ)−７−アミノ−１２−フルオロ−２,１０,１６−トリメチル−１５−オキソ−１０,１５,１６,１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８,４−(メテノ)ピラゾロ[４,３−ｈ][２,５,１１]−ベンズオキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリルである。ＣＥＰ−３７４４０の化学的構造は、(Ｓ)−２−((５−クロロ−２−((６−(４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−イル)−１−メトキシ−６,７,８,９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[７]アヌレン−２−イル)アミノ)ピリミジン−４−イル)アミノ)−Ｎ−メチルベンズアミドである。Ｘ−３９６(Ｒ)−６−アミノ−５−(１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ)−Ｎ−(４−(４−メチルピペラジン−１−カルボニル)フェニル)ピリダジン−３−カルボキサミドである。
【０９２６】
カルシウム依存的ホスファターゼカルシニューリンを阻害する(シクロスポリンおよびＦＫ５０６)または増殖因子誘発シグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)も使用できる。さらなる面において、本発明の細胞組成物を、患者に骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤、体外照射療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドおよび／またはＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨのような抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて(例えば、前に、同時にまたは後に)投与し得る。ある面において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法後に投与する。例えば、ある態様において、対象を、高用量化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付す。ある態様において、移植後、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖細胞を手術の前または後に投与する。
【０９２７】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にインドールアミン２,３−ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)阻害剤と組み合わせて投与する。ＩＤＯは、アミノ酸、Ｌ−トリプトファンのキヌレニンへの分解を触媒する酵素である。多くの癌、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸部、胃、卵巣、頭部および肺の癌がＩＤＯを過発現する。ｐＤＣ、マクロファージおよび樹状細胞(ＤＣ)はＩＤＯを発現できる。理論に縛られないが、Ｌ−トリプトファン(例えば、ＩＤＯによる触媒)の減少が、Ｔ細胞アネルギーおよびアポトーシスの誘導により免疫抑制性環境をもたらすと考えられる。それゆえに、理論に縛られないが、ＩＤＯ阻害剤は、例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞の抑制または細胞死を減少させることにより、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の有効性を高め得る。ある態様において、対象は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸部、胃、卵巣、頭部または肺癌を有する。ＩＤＯの代表的阻害剤は、１−メチル−トリプトファン、インドキシモド(NewLink Genetics)(例えば、治験番号ＮＣＴ０１１９１２１６；  ＮＣＴ０１７９２０５０参照)およびＩＮＣＢ０２４３６０(Incyte Corp.)(例えば、治験番号ＮＣＴ０１６０４８８９；ＮＣＴ０１６８５２５５参照)を含むが、これらに限定されない
【０９２８】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に骨髄球由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)のモジュレーターと組み合わせて投与する。ＭＤＳＣは、多くの固形腫瘍の周辺および腫瘍部位に蓄積される。これらの細胞はＴ細胞応答を抑制し、それによりＣＡＲ発現細胞治療の有効性を邪魔する。理論に縛られないが、ＭＤＳＣモジュレーターの投与は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の有効性を増強すると考えられる。ある態様において、対象は固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、神経膠芽腫を有する。ＭＤＳＣの代表的モジュレーターは、ＭＣＳ１１０およびＢＬＺ９４５を含むが、これらに限定されない。ＭＣＳ１１０は、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)に対するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)である。例えば、治験番号ＮＣＴ００７５７７５７参照。ＢＬＺ９４５は、コロニー刺激因子１受容体(ＣＳＦ１Ｒ)の小分子阻害剤である。例えば、Pyonteck et al. Nat. Med. 19 (2013):1264-72参照。ＢＬＺ９４５の構造を下に示す。
【化２４】
2019206538.tif 000036
【０９２９】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞(例えば、引用により本明細書に包含させる、ＷＯ２０１２／０７９０００号に記載の、例えば、ＣＴＬ０１９)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象はＣＤ１９＋リンパ腫、例えば、ＣＤ１９＋非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、ＣＤ１９＋  ＦＬまたはＣＤ１９＋  ＤＬＢＣＬを有する。ある態様において、対象は再発したまたは難治性ＣＤ１９＋リンパ腫を有する。ある態様において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、対象にＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞の投与(例えば、注入)前に、同時にまたは後に投与する。一例として、リンパ球枯渇性化学療法剤を、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞の投与前に対象に投与する。例えば、リンパ球枯渇性化学療法剤は、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞注入の１〜４日(例えば、１日、２日、３日または４日)前に終わる。ある態様において、例えば、ここに記載のように、複数用量のＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞を投与する。例えば、一用量は約５×１０８  ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞を含む。ある態様において、リンパ球枯渇性化学療法剤を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、非ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)前に、同時にまたは後に対象に投与する。ある態様において、ＣＤ１９  ＣＡＲＴを、非ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載する非ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)前に、同時にまたは後に対象に投与する。
【０９３０】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にインターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドと組み合わせてまたはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５(Admune Therapeutics, LLC)と組み合わせて投与する。ｈｅｔＩＬ−１５は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒａのヘテロ二量体非共有結合複合体である。ｈｅｔＩＬ−１５は、例えば、本明細書に引用により包含させる米国８,１２４,０８４号、米国２０１２／０１７７５９８号、米国２００９／００８２２９９号、米国２０１２／０１４１４１３および米国２０１１／００８１３１１号に記載される。ある態様において、ｈｅｔ−ＩＬ−１５を皮下に投与する。ある態様において、対象は癌、例えば、固形癌、例えば、黒色腫または結腸癌を有する。ある態様において、対象は転移癌を有する。
【０９３１】
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与と関係する副作用を軽減または改善する薬剤を投与され得る。ＣＡＲ発現細胞の投与と関係する副作用は、ＣＲＳおよびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)とも呼ぶ血球貪食性リンパ組織球症(ＨＬＨ)を含むが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、摂食障害、筋肉痛、関節痛(arthalgias)、悪心、嘔吐および頭痛のような臨床構成上の徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹のような臨床的皮膚徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐および下痢のような臨床的消化器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸および低酸素血症のような臨床的呼吸器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧拡大、低血圧、心拍出量増加(早期)および潜在的心拍出量低下(後期)のような臨床的心血管徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高ｄ−二量体、出血を伴うまたは伴わない低フィブリノーゲン血症のような、臨床的凝固徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症のような臨床的腎臓徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症および高ビリルビン血症のような臨床的肝臓徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態変化、混乱、譫妄、換語困難または明らかな失語症、幻覚、振戦、測定障害(dymetria)、歩調変化および発作のような臨床的神経徴候および症状を含み得る。
【０９３２】
したがって、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を対象に投与し、さらにＣＡＲ発現細胞での処置の結果としての可溶性因子レベル上昇を管理する１以上の薬剤を投与することを含む。ある態様において、対象で上昇する可溶性因子はＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−６の１以上である。ある態様において、対象で上昇する因子はＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカインの１以上である。それゆえに、それゆえに、この副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の１以上を中和する薬剤である。ある態様において、これらの可溶性形態の１以上を中和する薬剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦαの阻害剤およびＩＬ−６の阻害剤である。ＴＮＦα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブのような抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害剤の他の例は、エタネルセプトのような融合タンパク質である。小分子ＴＮＦαの阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ(ｔｏｃ)、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ  ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ−９４５４２９、ＣＮＴＯ  １３６、ＣＰＳＩ−２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ−１０９、ＦＥ３０１およびＦＭ１０１のような抗ＩＬ−６抗体分子または抗ＩＬ−６受容体抗体分子である。ある態様において、抗ＩＬ−６受容体抗体分子はトシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例はアナキンラである。
【０９３３】
ある態様において、対象に、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を投与し得る。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、プログラム細胞死１(ＰＤ−１)は、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低減させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、例えば、ここに記載のように、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＣＡＲ発現細胞における阻害分子の発現を阻害できる。ある態様において、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある態様において、阻害分子はＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの態様において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲの要素、例えば、要素全部をコードする核酸と連結する。ある態様において、阻害シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子と結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る(例えば、イピリムマブ(別名ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１およびＹｅｒｖｏｙ(登録商標)として市販；Bristol-Myers Squibb；トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６として既知))。ある態様において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ(ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。
【０９３４】
ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄性細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ−１の２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が、ＰＤ−１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌に豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転できる。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載する本発明のＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ニボルマブ(別名ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６；Bristol-Myers Squibb)は、特異的にＰＤ−１を遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＰＤ−１に特異的に結合するニボルマブ(クローン５Ｃ４)および他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８,００８,４４９号およびＷＯ２００６／１２１１６８号に開示されている。ピディリズマブ(ＣＴ−０１１；Cure Tech)は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体はＷＯ２００９／１０１６１１号に開示されている。ペンブロリズマブ(以前はランブロリズマブとして知られ、ＭＫ０３４７５とも呼ばれる；Merck)は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、ＵＳ８,３５４,５０９号およびＷＯ２００９／１１４３３５号に開示されている。ＭＥＤＩ４７３６(Medimmune)は、ＰＤＬ１に結合し、リガンドとＰＤ１の相互作用を阻害するヒトモノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ(Genentech/Roche)は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＰＤ−Ｌ１に対するＭＤＰＬ３２８０Ａおよび他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許７,９４３,７４３号およびＵ.Ｓ公開２０１２００３９９０６号に記載されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤は、ＹＷ２４３.５５.Ｓ７０(重鎖および軽鎖可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４号の配列番号２０および２１に示される)およびＭＤＸ−１  １０５(別名ＢＭＳ−９３６５５９および例えば、ＷＯ２００７／００５８７４号に開示される抗ＰＤ−Ｌ１結合剤)である。ＡＭＰ−２２４(Ｂ７−ＤＣＩｇ；Amplimmune；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示)は、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ−１抗体は、とりわけ、ＡＭＰ  ５１４(Amplimmune)、例えば、ＵＳ８,６０９,０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０号および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９号に開示の抗ＰＤ−１抗体を含む。
【０９３５】
ＴＩＭ−３(Ｔ細胞免疫グロブリン−３)も、特にＩＦＮ−ｇ分泌ＣＤ４＋  Ｔヘルパー１およびＣＤ８＋  Ｔ細胞毒性１細胞において、Ｔ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞疲弊に重要な役割を有する。ＴＩＭ３とそのリガンド、例えば、ガレクチン−９(Ｇａｌ９)、ホスファチジルセリン(ＰＳ)およびＨＭＧＢ１の相互作用の阻害は免疫応答を高め得る。ＴＩＭ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体フラグメント、小分子またはペプチド阻害剤は、そのリガンドとの相互作用を阻害するためにＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０号およびＵＳ２０１００２４７５２１号に開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３−２３のヒト化バージョン(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示)およびクローン８Ｂ.２Ｃ１２(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示)を含む。ＴＩＭ３およびＰＤ−１を阻害する二特異性抗体はＵＳ２０１３０１５６７７４号に開示されている。
【０９３６】
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤)である。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。代表的抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体は、ＷＯ２０１０／１２５５７１号、ＷＯ２０１３／０８２３６６号、ＷＯ２０１４／０５９２５１およびＷＯ２０１４／０２２３３２号に開示され、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４；または例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８号、ＵＳ７,１３２,２５５号およびＷＯ９９／０５２５５２号に開示のようなその組み換え形態である。他の態様において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−５と結合するかまたは例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１号およびＵＳ２０１４／０２７１６１８号に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。
【０９３７】
理論に縛られることを望まないが、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５のような癌胎児性抗原細胞接着分子(ＣＥＡＣＡＭ)は、少なくとも一部、抗腫瘍免疫応答の阻害を仲介すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529参照)。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロ親和性リガンドとして、そしてＴＩＭ−３介在Ｔ細胞耐容性および疲弊に役割を有するとしてが記載されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848三種)。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＴＩＭ−３の共遮断が、異種移植結腸直腸癌モデルにおいて抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014), supra参照)。他の態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＰＤ−１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１号に記載されるようにＴ細胞耐容性を減少させる。それゆえに、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、ここに記載する他の免疫調節剤(例えば、抗ＰＤ−１および／または抗ＴＩＭ−３阻害剤)と使用して、癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣ)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌およびここに記載の他の癌に対する免疫応答を増強させ得る。
【０９３８】
ＬＡＧ−３(リンパ球活性化遺伝子−３またはＣＤ２２３)は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞疲弊に役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ−３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＢＭＳ−９８６０１６(Bristol-Myers Squib)は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１(Immutep)は、アンタゴニストＬＡＧ−３抗体であり、ＩＭＰ７３１(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は枯渇性ＬＡＧ−３抗体である。他のＬＡＧ−３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分とＭＨＣクラスＩＩ分子のＩｇの組み換え融合タンパク質であり、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を活性化するＩＭＰ３２１(Immutep)である。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０号に開示されている。
【０９３９】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第一ドメインおよび第二ドメインを含む融合タンパク質であってよく、ここで、第一ドメインは阻害分子またはそのフラグメントであり、第二ドメインは陽性シグナルと関係するポリペプチド、例えば、ここに記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。ある態様において、陽性シグナルと結合するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または例えば、ここに記載する、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞により発現される。他の態様において、融合タンパク質は、本発明のＣＡＲを発現しない細胞、例えば、Ｔ細胞により発現される。
【０９４０】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤はｍｉＲ−１７−９２である。
【０９４１】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲの活性を増強する薬剤はサイトカインである。サイトカインは、Ｔ細胞増殖、分化、生存および恒常性に関連する重要な機能を有する。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を受ける対象に投与できるサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１またはこれらの組み合わせを含む。好ましい態様において、投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１またはこれらの組み合わせである。サイトカインを、１日１回または１日１回以上、例えば、１日２回、１日３回または１日４回投与できる。サイトカインを、１日以上投与でき、例えば、サイトカインを２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間または４週間投与する。例えば、サイトカインを１日１回、７日間投与する。
【０９４２】
ある態様において、サイトカインをＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて投与する。サイトカインを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と同時にまたは一緒に投与でき、例えば、同じ日に投与する。サイトカインをＣＡＲ発現Ｔ細胞と同じ医薬組成物に製剤しても、別の医薬組成物に製剤してもよい。あるいは、サイトカインを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与後間もなく、例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後に投与してよい。サイトカインを１日を超える投薬レジメンで投与する態様において、サイトカイン投薬レジメンの１日目はＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与と同じ日でよく、またはサイトカイン投薬レジメンの１日目は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後であってよい。ある態様において、１日目に、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を対象に投与し、２日目に、サイトカインを１日１回、翌７日間投与する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて投与するサイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である。
【０９４３】
他の態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞の投与から一定期間後、例えば、ＣＡＲ発現細胞の投与から少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上の後に投与する。ある態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の評価後に投与する。例えば、対象にここに記載する用量およびレジメンに従い、ＣＡＲ発現細胞を投与する。ＣＡＲ発現細胞治療に対する対象の応答を、腫瘍増殖阻止、循環腫瘍細胞減少または腫瘍退縮を含む、ここに記載する方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ発現細胞の投与２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上後に評価する。ＣＡＲ発現細胞治療に対して十分な応答を示さない対象にサイトカインを投与し得る。ＣＡＲ発現細胞治療に対して応答が最適以下である対象へのサイトカインの投与は、ＣＡＲ発現細胞有効性または抗癌活性を改善する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現細胞の投与後に投与するサイトカインはＩＬ−７である。
【０９４４】
低用量のｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせ
ある態様において、ＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与される。
【０９４５】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量はを超えない、少なくとも５％、しかし９０％を超えない、少なくとも１０％、しかし９０％を超えない、少なくとも１５％、しかし９０％を超えない、少なくとも２０％、しかし９０％を超えない、少なくとも３０％、しかし９０％を超えない、少なくとも４０％、しかし９０％を超えない、少なくとも５０％、しかし９０％を超えない、少なくとも６０％、しかし９０％を超えないまたは少なくとも７０％、しかし９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
【０９４６】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし８０％を超えない、少なくとも１０％、しかし８０％を超えない、少なくとも１５％、しかし８０％を超えない、少なくとも２０％、しかし８０％を超えない、少なくとも３０％、しかし８０％を超えない、少なくとも４０％、しかし８０％を超えない、少なくとも５０％、しかし８０％を超えないまたは少なくとも６０％、しかし８０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
【０９４７】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし７０％を超えない、少なくとも１０％、しかし７０％を超えない、少なくとも１５％、しかし７０％を超えない、少なくとも２０％、しかし７０％を超えない、少なくとも３０％、しかし７０％を超えない、少なくとも４０％、しかし７０％を超えないまたは少なくとも５０％、しかし７０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
【０９４８】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし６０％を超えない、少なくとも１０％、しかし６０％を超えない、少なくとも１５％、しかし６０％を超えない、少なくとも２０％、しかし６０％を超えない、少なくとも３０％、しかし６０％を超えないまたは少なくとも４０％、しかし６０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
【０９４９】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし５０％を超えない、少なくとも１０％、しかし５０％を超えない、少なくとも１５％、しかし５０％を超えない、少なくとも２０％、しかし５０％を超えない、少なくとも３０％、しかし５０％を超えないまたは少なくとも４０％、しかし５０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
【０９５０】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし４０％を超えない、少なくとも１０％、しかし４０％を超えない、少なくとも１５％、しかし４０％を超えない、少なくとも２０％、しかし４０％を超えない、少なくとも３０％、しかし４０％を超えないまたは少なくとも３５％、しかし４０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
【０９５１】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし３０％を超えない、少なくとも１０％、しかし３０％を超えない、少なくとも１５％、しかし３０％を超えない、少なくとも２０％、しかし３０％を超えないまたは少なくとも２５％、しかし３０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
【０９５２】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし２０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし３０％を超えない、少なくとも１、２、３、４または５の％、しかし３５を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし４０％を超えないまたは少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし４５％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
【０９５３】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
【０９５４】
ここに記載するように、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度を、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の減少による、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性のレベルの減少により決定できる。ｍＴＯＲ阻害レベルは、ここに記載する方法により、例えばＢｏｕｌａｙアッセイまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定により評価できる。
【０９５５】
代表的ｍＴＯＲ阻害剤
ここで使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、細胞におけるｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物またはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はアロステリック阻害剤である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は触媒的阻害剤である。
【０９５６】
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシンアナログ(別名ラパログ)を含む、ラパマイシンに構造的および機能的類似性を有する化合物であるラパマイシン関連化合物およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む。
【０９５７】
ラパマイシンは、式Ａで示す構造を有する、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスにより産生される既知マクロライド抗生物質である。
【化２５】
2019206538.tif 000037
【０９５８】
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433；米国特許３,９２９,９９２号参照。ラパマイシンに対して多様な番号付けスキームが提案されている。混乱を避けるために、ここで特定のラパマイシンアナログを命名するとき、名称は、式Ａの番号付けスキームを使用するラパマイシンを参照して示す。
【０９５９】
本発明において有用なラパマイシンアナログは、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環上のヒドロキシル基がＯＲ１(ここで、Ｒ１はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである)により置換されているＯ置換アナログ、例えば、引用によりその内容を本明細書に包含させるＵＳ５,６６５,７７２号およびＷＯ９４／０９０１０号に記載の、エベロリムスとしても知られるＲＡＤ００１である。他の適当なラパマイシンアナログは、２６位または２８位に置換を有するものを含む。ラパマイシンアナログは、上記アナログのエピマー、特に４０位、２８位または２６位が置換されたアナログのエピマーであってよく、所望により、例えば、引用によりその内容を本明細書に包含させるＵＳ６,０１５,８１５号、ＷＯ９５／１４０２３号およびＷＯ９９／１５５３０号に記載の、例えば、ゾタロリムスとしてもＡＢＴ５７８、または引用によりその内容を本明細書に包含させるＵＳ７,０９１,２１３号、ＷＯ９８／０２４４１号およびＷＯ０１／１４３８７号に記載のラパマイシンアナログ、例えばリダフォロリムスとしても知られるＡＰ２３５７３のように、さらに水素化されていてよい。
【０９６０】
ＵＳ５,６６５,７７２号からの、本発明における使用に適するラパマイシンアナログは、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(４’−ヒドロキシメチル)ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[４’−(１,２−ジヒドロキシエチル)]ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[３’−(２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン−４(Ｓ)−イル)−プロプ−２’−エン−１’−イル]−ラパマイシン、(２’Ｅ,４’Ｓ)−４０−Ｏ−(４’,５’−ジヒドロキシペント−２’−エン−１’−イル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシ)プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(６−ヒドロキシ)ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキシ)エトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(３Ｓ)−２,２−ジメチルジオキソラン−３−イル]メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(２Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロプ−１−イル]−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチノイルオキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−モルホリノ)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９,４０−Ｏ,Ｏ−エチレン−ラパマイシン、(２６Ｒ)−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチンアミドエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−(Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルボエトキシアミド)エチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−エトキシカルボニルアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−トリルスルホンアミドエチル)−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−[２−(４’,５’−ジカルボエトキシ−１’,２’,３’−トリアゾール−１’−イル)−エチル]−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０９６１】
本発明において有用な他のラパマイシンアナログは、ラパマイシンのシクロヘキシル環のヒドロキシル基および／または２８位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基で置換されたアナログであり、例えば、ＵＳＲＥ４４,７６８号に見られるラパマイシンアナログ、例えばテムシロリムスとして知られる。
【０９６２】
本発明において有用な他のラパマイシンアナログは、例えば、その内容を引用により本明細書に包含させるＷＯ９５／１６６９１号およびＷＯ９６／４１８０７号に記載されるような、１６位のメトキシ基が他の置換基、好ましくは(所望によりヒドロキシ置換)アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジルまたはクロロベンジルで置換されているおよび／または３９位のメトキシ基が、ラパマイシンのシクロヘキシル環が３９位のメトキシ基を欠くシクロペンチル環になるように３９番炭素と共に欠失しているものを含む。アナログは、ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化されるおよび／または３２−カルボニルが還元されるようにさらに修飾され得る。
【０９６３】
ＷＯ９５／１６６９１号からのラパマイシンアナログは、１６−デメトキシ−１６−(ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(プロパルギル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−(２−メトキシエチル)−１６−ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(モルホリン−４−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−[Ｎ−メチル、Ｎ−(２−ピリジン−２−イル−エチル)]カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシンおよび３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)−４２−ノル−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０９６４】
ＷＯ９６／４１８０７号からのラパマイシンアナログは、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ−エチル)−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−メトキシ)エチル−ラパマイシンおよび３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０９６５】
他の適当なラパマイシンアナログは、その内容を引用により本明細書に包含させるＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載のウミロリムスである。
【０９６６】
エベロリムス(アフィニトール(登録商標))としても知られるＲＡＤ００１は、化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペンタオンを有する。
【０９６７】
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、シロリムス(ラパマイシン、ＡＹ−２２９８９)、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシン(別名テムシロリムスまたはＣＣＩ−７７９)およびリダフォロリムス(ＡＰ−２３５７３／ＭＫ−８６６９)を含む。アロステリックｍＴｏｒ阻害剤の他の例はゾタロリムス(ＡＢＴ５７８)およびウミロリムスを含む。
【０９６８】
これとは別にまたはこれに加えて、触媒的、ＡＴＰ競合的ｍＴＯＲ阻害剤が、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接的に標的とし、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両者を標的とすることが判明している。これらは、４ＥＢＰ１−Ｔ３７／４６リン酸化およびキャップ依存性翻訳のようなラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１アウトプットを修飾するため、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤よりも有効なｍＴＯＲＣ１の阻害剤である。
【０９６９】
触媒的阻害剤は、ＢＥＺ２３５または２−メチル−２−[４−(３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル)−フェニル]−プロピオニトリルまたはモノトシル酸塩形態；ＢＥＺ２３５の合成はＷＯ２００６／１２２８０６号に記載される；化学名{５−[２,４−ビス−((Ｓ)−３−メチル−モルホリン−４−イル)−ピリド[２,３ｄ]ピリミジン−７−イル]−２−メトキシ−フェニル}−メタノールを有するＣＣＧ１６８(ＡＺＤ−８０５５としても知られ、Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298)；３−[２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド(ＷＯ０９１０４０１９号)；３−(２−アミノベンゾ[ｄ]オキサゾール−５−イル)−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−アミン(ＷＯ１００５１０４３およびＷＯ２０１３０２３１８４)；Ｎ−(３−(Ｎ−(３−((３,５−ジメトキシフェニル)アミノ)キノキサリン−２−イル)スルファモイル)フェニル)−３−メトキシ−４−メチルベンズアミド(ＷＯ０７０４４７２９号およびＷＯ１２００６５５２号)；化学名１−[４−[４−(ジメチルアミノ)ピペリジン−１−カルボニル]フェニル]−３−[４−(４,６−ジモルホリノ−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素を有するＰＫＩ−５８７(Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645)；化学名２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−メトキシ−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドを有するＧＳＫ−２１２６４５８(ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＷＯ１０１１４４８４号)；(Ｅ)−Ｎ−(８−(６−アミノ−５−(トリフルオロメチル)ピリジン−３−イル)−１−(６−(２−シアノプロパン−２−イル)ピリジン−３−イル)−３−メチル−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−イリデン)シアナミド(ＷＯ１２００７９２６号)を含む。
【０９７０】
触媒的ｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、８−(６−メトキシ−ピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル)−１,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２−オン(ＷＯ２００６／１２２８０６)およびＫｕ−００６３７９４(Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42)を含む。Ｋｕ−００６３７９４は、ラパマイシンの哺乳動物標的特(ｍＴＯＲ)の異的阻害剤である。ＷＹＥ−３５４は、触媒的ｍＴｏｒ阻害剤の他の例である(Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。
【０９７１】
本発明によって有用なｍＴＯＲ阻害剤はまた前記のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩またはそのアナログも含む。
【０９７２】
ＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤を、ここに記載する特定の投与量に基づき、当分野で十分に確立された方法に基づき、送達のために製剤し得る。特に、米国特許６,００４,９７３(引用により本明細書に包含させる)は、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤で使用可能な製剤の例を提供する。
【０９７３】
ｍＴＯＲ阻害の評価
ｍＴＯＲは、キナーゼＰ７０  Ｓ６をリン酸化し、それによりＰ７０  Ｓ６キナーゼを活性化し、それがその基質をリン酸化することを可能にする。ｍＴＯＲ阻害の程度はＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害の程度で表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性レベルの減少、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の減少により決定できる。ｍＴＯＲ阻害のレベルを、阻害剤の非存在下、例えば、阻害剤の投与前にまたは阻害剤投与後にＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性(Ｐ７０  Ｓ６キナーゼが基質をリン酸化する能力)を測定することにより決定できる。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害のレベルは、ｍＴＯＲ阻害のレベルを提供する。それゆえに、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼが４０％阻害されるならば、ｍＴＯＲ活性は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性により測定して、４０％阻害される。ここでいう阻害の程度またはレベルは、投与間隔の間の阻害の平均レベルである。例えば、阻害剤を週に１回与えるとき、阻害のレベルは、その間隔の間の、すなわち１週間の阻害の平均レベルを示す。
【０９７４】
引用により本明細書に包含させるBoulay et al., Cancer Res, 2004, 64:252-61は、ｍＴＯＲ阻害のレベルの評価に使用できるアッセイを教示する(ここではＢｏｕｌａｙアッセイと称す)。ある態様において、アッセイは、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与前後の生物学的サンプルからのＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性の測定に頼る。サンプルを、ｍＴＯＲ阻害剤での処置後、予め選択した時間、例えば、処置の２４時間、４８時間および７２時間後に採り得る。例えば、皮膚または末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)からの生物学的サンプルを使用できる。総タンパク質抽出物をサンプルから調製する。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼを特異的に認識する抗体を使用した免疫沈降により、タンパク質抽出物からＰ７０  Ｓ６キナーゼを単離する。単離したＰ７０  Ｓ６キナーゼの活性を、インビトロキナーゼアッセイで測定する。単離したキナーゼを４０Ｓリボソームサブユニット基質(Ｐ７０  Ｓ６Ｋの内在性基質である)およびガンマ−３２Ｐと、該基質のリン酸化を可能とする条件下でインキュベートできる。次いで、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分割し、３２ＰシグナルをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用して解析する。４０Ｓリボソームサブユニットのサイズに対応する３２Ｐシグナルが、リン酸化された基質およびＰ７０  Ｓ６Ｋの活性を示す。キナーゼ活性の増加または減少を、リン酸化基質の３２Ｐシグナルの面積および強度を定量し(例えば、ImageQuant、Molecular Dynamicsを使用)、任意単位値を定量化シグナルに割り当て、投与後の値と投与前の値または対照値を比較することにより、計算できる。例えば、例えば、キナーゼ活性阻害パーセントを次の式で計算できる：１−(投与後に得た値／投与前に得た値)×１００。上記のとおり、阻害の程度またはレベルは、ここでは、投与の合間の阻害の平均レベルをいう。
【０９７５】
キナーゼ活性、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性を評価する方法もまた、引用により本明細書に包含させるＵＳ７,７２７,９５０号に提供されている。
ｍＴＯＲ阻害のレベルはまた、ＰＤ１陰性Ｔ細胞対ＰＤ１陽性Ｔ細胞の比の変化によっても評価できる。末梢血からのＴ細胞を、当分野で知られる方法によりＰＤ１陰性または陽性と同定できる。
【０９７６】
低用量ｍＴＯＲ阻害剤
ここに記載する方法は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなラパログを含むアロステリックの複数用量を使用する。対照的に、ｍＴＯＲ経路を完全にまたはほぼ完全に阻害するレベルの阻害剤は免疫抑制性であり、例えば、臓器移植片拒絶の予防に使用される。さらに、ｍＴＯＲを完全に阻害する高用量のラパログも腫瘍細胞増殖を阻止し、多様な癌の処置に使用されている(例えば、Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition.  Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2参照)。
【０９７７】
本発明は、少なくとも一部、現在臨床の現場で使用されるよりはるかに低用量のｍＴＯＲ阻害剤が、対象における免疫応答の増加に優れた効果を有し、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比を増加させるという驚くべき発見に基づく。ｍＴＯＲ活性を一部しか阻害しない低用量のｍＴＯＲ阻害剤が、ヒト対象における免疫応答を効率的に改善し、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比を増加できることは、驚きであった。
【０９７８】
これとは別にまたはこれに加えて、何らかの理論に縛られることを望まないが、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、非処置対象と比較して、ナイーブＴ細胞数を、例えば、少なくとも一過性に増加できると考えられる。これとは別にまたはこれに加えて、再び理論に縛られることを望まないが、十分な時間または十分な投薬後のｍＴＯＲ阻害剤での処置は、次の一以上をもたらすと考えられる：
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、次のマーカーＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２の１以上の発現の増加；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、ＫＬＲＧ１の発現の減少；および
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次のＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加の特性の任意の１つまたは組み合わせを有する細胞の数の増加；
そして、ここで、上記のいずれかの変化は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。記憶Ｔ細胞前駆体は、分化プログラムにおける初期にある記憶Ｔ細胞である。例えば、記憶Ｔ細胞は、次の１以上の特性を有する：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少および／またはＢＣＬ２増加。
【０９７９】
ある態様において、本発明は、選択した投薬レジメンで、例えば、１日１回または週に１回投与したとき、完全なまたは顕著な免疫抑制とは関係しないが、免疫応答の増強と関係する、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤の組成物または剤形に関する。
【０９８０】
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、徐放性製剤で提供できる。ここに記載する組成物または単位投与形態のいずれも、徐放性製剤として提供できる。ある態様において、徐放性製剤は、即時放出製剤より低いバイオアベイラビリティを有する。例えば、ある態様において、即時放出製剤と類似する治療効果を達成するために、徐放性製剤は、即時放出製剤で提供される阻害剤の量の約２〜約５倍、約２.５〜約３.５倍または約３倍有する。
【０９８１】
ある態様において、概して、１週間に１回投与に使用するための、単位剤形あたり０.１〜２０ｍｇ、０.５〜１０ｍｇ、２.５〜７.５ｍｇ、３〜６ｍｇまたは約５ｍｇを有する、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。１週間に１回投与のために、これらの即時放出製剤は、それぞれ、０.３〜６０ｍｇ、１.５〜３０ｍｇ、７.５〜２２.５ｍｇ、９〜１８ｍｇまたは約１５ｍｇのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。ある態様において、両者の形態を週に１回ベースで投与する。
【０９８２】
ある態様において、概して１日１回投与に使用するための、単位剤形あたり０.００５〜１.５ｍｇ、０.０１〜１.５ｍｇ、０.１〜１.５ｍｇ、０.２〜１.５ｍｇ、０.３〜１.５ｍｇ、０.４〜１.５ｍｇ、０.５〜１.５ｍｇ、０.６〜１.５ｍｇ、０.７〜１.５ｍｇ、０.８〜１.５ｍｇ、１.０〜１.５ｍｇ、０.３〜０.６ｍｇまたは約０.５ｍｇを有する、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。１日１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.０１５〜４.５ｍｇ、０.０３〜４.５ｍｇ、０.３〜４.５ｍｇ、０.６〜４.５ｍｇ、０.９〜４.５ｍｇ、１.２〜４.５ｍｇ、１.５〜４.５ｍｇ、１.８〜４.５ｍｇ、２.１〜４.５ｍｇ、２.４〜４.５ｍｇ、３.０〜４.５ｍｇ、０.９〜１.８ｍｇまたは約１.５ｍｇのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。１週間に１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.１〜３０ｍｇ、０.２〜３０ｍｇ、２〜３０ｍｇ、４〜３０ｍｇ、６〜３０ｍｇ、８〜３０ｍｇ、１０〜３０ｍｇ、１.２〜３０ｍｇ、１４〜３０ｍｇ、１６〜３０ｍｇ、２０〜３０ｍｇ、６〜１２ｍｇまたは約１０ｍｇのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。
【０９８３】
ある態様において、概して１日１回投与に使用するための、単位剤形あたり０.０１〜１.０ｍｇを有する、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。１日１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.０３〜３ｍｇのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。１週間に１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.２〜２０ｍｇのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。
【０９８４】
ある態様において、概して１週間に１回投与に使用するための、単位剤形あたり０.５〜５.０ｍｇを有する、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。１週間に１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、１.５〜１５ｍｇのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。
【０９８５】
上記のように、ｍＴＯＲ経路の一つの標的はＰ７０  Ｓ６キナーゼである。それゆえに、ここに記載する方法および組成物において有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、ｍＴＯＲ阻害剤非存在下のＰ７０  Ｓ６キナーゼの活性に対して、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の８０％未満の阻害を達成するのに十分なものである。さらなる面において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤非存在下のＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性に対して、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の３８％未満の阻害を達成するのに十分なｍＴＯＲ阻害剤の量を提供する。
【０９８６】
一つの面において、本発明の方法および組成物において有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、例えば、ヒト対象に投与したとき、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性を９０±５％(すなわち、８５〜９５％)、８９±５％、８８±５％、８７±５％、８６±５％、８５±５％、８４±５％、８３±５％、８２±５％、８１±５％、８０±５％、７９±５％、７８±５％、７７±５％、７６±５％、７５±５％、７４±５％、７３±５％、７２±５％、７１±５％、７０±５％、６９±５％、６８±５％、６７±５％、６６±５％、６５±５％、６４±５％、６３±５％、６２±５％、６１±５％、６０±５％、５９±５％、５８±５％、５７±５％、５６±５％、５５±５％、５４±５％、５４±５％、５３±５％、５２±５％、５１±５％、５０±５％、４９±５％、４８±５％、４７±５％、４６±５％、４５±５％、４４±５％、４３±５％、４２±５％、４１±５％、４０±５％、３９±５％、３８±５％、３７±５％、３６±５％、３５±５％、３４±５％、３３±５％、３２±５％、３１±５％、３０±５％、２９±５％、２８±５％、２７±５％、２６±５％、２５±５％、２４±５％、２３±５％、２２±５％、２１±５％、２０±５％、１９±５％、１８±５％、１７±５％、１６±５％、１５±５％、１４±５％、１３±５％、１２±５％、１１±５％または１０±５％阻害を達成するのに十分である。
【０９８７】
対象におけるＰ７０  Ｓ６キナーゼ活性は、例えば、米国特許７,７２７,９５０号に記載の方法に従い、ホスホＰ７０  Ｓ６Ｋレベルおよび／またはホスホＰ７０  Ｓ６レベルの免疫ブロット分析によるまたはインビトロキナーゼ活性アッセイによるような、当分野で知られる方法を使用して測定し得る。
【０９８８】
ｍＴＯＲ阻害剤の用量と関連してここで使用する用語“約”は、ｍＴＯＲ阻害剤の用量の最大±１０％ばらつきをいうが、記載した用量の周辺のばらつきを含まなくてよい。
【０９８９】
ある態様において、本発明は、目標トラフレベル内の投与量で、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を投与することを含む方法を提供する。ある態様において、トラフレベルは、臓器移植患者および癌患者で使用される投薬レジメンと関係するトラフレベルより有意に低い。ある態様においてｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌効果をもたらすトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルをもたらすように投与する。ある態様においてｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌適応症に使用するための、ＦＤＡが承認した添付文書に提供されるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルをもたらすように投与する。
【０９９０】
ある態様において、ここに開示する方法は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、対象に０.１〜１０ｎｇ／ｍｌ、０.１〜５ｎｇ／ｍｌ、０.１〜３ｎｇ／ｍｌ、０.１〜２ｎｇ／ｍｌまたは０.１〜１ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する用量で投与することを含む。
【０９９１】
ある態様において、ここに開示する方法は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、対象に目標トラフレベルの０.２〜１０ｎｇ／ｍｌ、０.２〜５ｎｇ／ｍｌ、０.２〜３ｎｇ／ｍｌ、０.２〜２ｎｇ／ｍｌまたは０.２〜１ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する用量で投与することを含む。
【０９９２】
ある態様において、ここに開示する方法は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、対象に０.３〜１０ｎｇ／ｍｌ、０.３〜５ｎｇ／ｍｌ、０.３〜３ｎｇ／ｍｌ、０.３〜２ｎｇ／ｍｌまたは０.３〜１ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する用量で投与することを含む。
【０９９３】
ある態様において、ここに開示する方法は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、対象に０.４〜１０ｎｇ／ｍｌ、０.４〜５ｎｇ／ｍｌ、０.４〜３ｎｇ／ｍｌ、０.４〜２ｎｇ／ｍｌまたは０.４〜１ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する用量で投与することを含む。
【０９９４】
ある態様において、ここに開示する方法は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、対象に０.５〜１０ｎｇ／ｍｌ、０.５〜５ｎｇ／ｍｌ、０.５〜３ｎｇ／ｍｌ、０.５〜２ｎｇ／ｍｌまたは０.５〜１ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する用量で投与することを含む。
【０９９５】
ある態様において、ここに開示する方法は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、対象に１〜１０ｎｇ／ｍｌ、１〜５ｎｇ／ｍｌ、１〜３ｎｇ／ｍｌまたは１〜２ｎｇ／ｍｌの目標トラフレベルを提供する用量で投与することを含む。
【０９９６】
ここで使用する用語“トラフレベル”は、次の投与直前の血漿中の薬物濃度または２回の投与の間の最少薬物濃度をいう。
【０９９７】
ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは約０.１〜４.９ｎｇ／ｍｌの範囲である。ある態様において、目標トラフレベルは３ｎｇ／ｍｌ以下、例えば、０.３ｇ／ｍｌ以下〜３ｎｇ／ｍｌである。ある態様において、目標トラフレベルは３ｎｇ／ｍｌ以下、例えば、０.３ｎｇ／ｍｌ以下〜１ｎｇ／ｍｌである。
【０９９８】
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１の特定した目標トラフレベルと生物学的同等である目標トラフレベルと関係する量で、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を使用できる。ある態様において、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の目標トラフレベルは、ここに記載するＲＡＤ００１のトラフレベルと同じレベルのｍＴＯＲ阻害(例えば、ここに記載する方法で測定して、例えば、Ｐ７０  Ｓ６の阻害)を示すレベルである。
【０９９９】
医薬組成物：ｍＴＯＲ阻害剤
一つの面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ細胞と組み合わせて使用するために製剤された、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤を含む医薬組成物に関する。
【１０００】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ここに記載する、さらなる薬剤と組み合わせて投与するために製剤される。
【１００１】
一般に、本発明の化合物は、単独でまたは１以上の治療剤と組み合わせて、当分野で知られる通常のかつ許容される方法のいずれかにより、上記の治療有効量で投与される。
【１００２】
医薬製剤は、慣用の溶解および混合法を使用して製造できる。例えば、原体物質(例えば、ｍＴＯＲ阻害剤または該化合物の安定化形態(例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知複合化薬物との複合体))を、ここに記載する添加物の１以上の存在下、適当な溶媒に溶解させる。ｍＴＯＲ阻害剤は、概して薬物の投与量を容易に制御可能とし、患者に洗練され、取り扱いが容易な製品を与えるような、医薬投与形態に製剤される。
【１００３】
本発明の化合物は、慣用の経路で、特に経腸的に、例えば、経口で、例えば、錠剤またはカプセルの形でまたは非経腸的に、例えば、注射可能溶液剤または懸濁液剤の形で、局所的に、例えば、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤またはクリーム剤の形でまたは経鼻または坐薬により、医薬組成物として投与され得る。ｍＴＯＲ阻害剤をここに記載する他の薬剤と組み合わせて(同時にまたは別々に)投与するとき、一つの面において、両成分を同じ経路で(例えば、非経腸的に)投与し得る。あるいは、他の薬剤を、ｍＴＯＲ阻害剤と異なる経路で投与し得る。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤を経口で投与してよく、他の薬剤を非経腸的に投与してよい。
【１００４】
持続放出
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、製品安定性要求を満たすおよび／または平均血漿ピーク濃度減少、薬物吸収の程度および血漿ピーク濃度の患者間および患者内ばらつき減少、Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ比減少および／または食効減少のような即時放出(ＩＲ)錠剤より都合よい薬物動態特性を有する、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む経口固体投与形態の形の医薬製剤として提供できる。提供された医薬製剤は、より厳密な用量調節を可能にするおよび／または有害事象の頻度を減少させ、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１での患者のより安全な処置を提供することができる。
【１００５】
ある態様において、本発明は、多粒子系であり、機能的層およびコーティングを有し得る、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤を提供する。
【１００６】
ここで使用する用語“持続放出、多粒子製剤”は、長時間にわたり、例えば少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間にわたり、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の放出を可能とする製剤である。持続放出製剤は、活性成分を摂取後長時間にわたり利用可能とするような方法で製剤された、例えば、ここに記載する、特別の添加物からなるマトリクスおよびコーティングを含み得る。
【１００７】
用語“持続放出”は用語“徐放”(ＳＲ)または“持効性放出”と交換可能に使用する。用語“持続放出”は、錠剤およびカプセル剤についての欧州薬局方(第７版)モノグラフおよびＵＳＰの医薬投与形態についての一般的な章＜１１５１＞の定義に従う、活性薬物物質を、経口投与直後ではなく、長時間にわたり放出する医薬製剤をいう。ここで使用する用語“即時放出”(ＩＲ)は、Guidance for Industry: “Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms” (FDA CDER, 1997)の定義に従い、６０分以内に活性薬物物質の８５％を放出する医薬製剤である。ある態様において、用語“即時放出”は、例えば、ここに記載する溶解アッセイで測定して、エベロリムスの錠剤からの３０分以内の放出を意味する。
【１００８】
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、ここに記載する溶解アッセイのような当分野で知られるアッセイを使用してインビトロ放出プロファイルにより特徴づけできる。３７℃でドデシル硫酸ナトリウム０.２％を含む９００ｍＬリン酸緩衝液ｐＨ６.８で魅した溶解容器で、それぞれＵＳＰ試験モノグラフ７１１および欧州薬局方試験モノグラフ２.９.３.に従い、ＵＳＰに従い、パドル法で、７５ｒｐｍで溶解を行う。
【１００９】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、インビトロ放出アッセイで、次の放出明細に従いｍＴＯＲ阻害剤を放出する。
０.５時間：＜４５％または＜４０、例えば、＜３０％
１時間：２０〜８０％、例えば、３０〜６０％
２時間：＞５０％または＞７０％、例えば、＞７５％３時間：＞６０％または＞６５％、例えば、＞８５％、例えば、＞９０％。
【１０１０】
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、インビトロ溶解アッセイで、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分または１２０分より速くｍＴＯＲ阻害剤の５０％を放出しない。
【１０１１】
バイオポリマー送達法
ある態様において、ここに開示する１以上のＣＡＲ発現細胞を、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与または送達し得る。バイオポリマー足場は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の送達、増殖および／または分散を支持または増強できる。バイオポリマー足場は、天然に存在するまたは合成であり得る生体適合性(例えば、実質的に炎症性または免疫応答を誘発しない)および／または生分解性ポリマーを含む。
【１０１２】
適当なバイオポリマーの例は、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギン酸／リン酸カルシウムセメント(ＣＰＣ)、ベータ−ガラクトシダーゼ(β−ＧＡＬ)、(１,２,３,４,６−ペンタアセチルａ−Ｄ−ガラクトース)、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ(３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシ−ヘキサノエート)(ＰＨＢＨＨｘ)、ポリ(ラクチド)、ポリ(カプロラクトン)(ＰＣＬ)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(ＰＬＧ)、ポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(ＰＬＧＡ)、ポリプロピレンオキシド(ＰＰＯ)、ポリビニルアルコール)(ＰＶＡ)、絹、大豆タンパク質および大豆タンパク質単離体の、単独でまたは任意の他のポリマー組成物との、あらゆる濃度およびあらゆる比での混合物を含むが、これらに限定されない。バイオポリマーは、接着または遊走促進分子、例えば、リンパ球のコラーゲン受容体に結合するコラーゲン模倣ペプチドおよび／または送達する細胞の送達、増殖または機能、例えば、抗癌活性を増強する刺激分子で増強または修飾され得る。バイオポリマー足場は、注射可能な、例えば、ゲルまたは半固体または固体組成物であり得る。
【１０１３】
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象への送達前にバイオポリマー足場上に播種する。ある態様において、バイオポリマー足場は、例えば、足場のバイオポリマーに取り込まれたまたはコンジュゲートされた、さらにここに記載する１以上のさらなる治療剤(例えば、他のＣＡＲ発現細胞、抗体または小分子)またはＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を含む。ある態様において、バイオポリマー足場を、例えば、腫瘍内に注射するかまたは腫瘍にまたは抗腫瘍効果を仲介するのに十分に腫瘍に近位に外科的にインプラントする。バイオポリマー組成物およびその送達のための方法さらなる例は、Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101；およびＷＯ２０１４／１１０５９１号に記載される。
【１０１４】
医薬組成物および処置
本発明の医薬組成物は、ここに記載のように、ＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；グリシンのようなポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、一つの面において静脈内投与用に製剤される。
【１０１５】
本発明の医薬組成物を、処置する(または予防する)疾患に適する方法で投与し得る。投与の量および頻度は、患者の状態および患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定され得る。
【１０１６】
ある態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される汚染物が実質的にない、例えば、検出可能なレベルで存在しない。ある態様において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルジノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびストレプトコッカス・ピオゲネスＡ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
【１０１７】
“免疫学的に有効量”、“抗腫瘍有効量”、“腫瘍阻害有効量”または“治療量”が示されるとき、本発明の組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染の程度または転移および患者(対象)の状態の個体差を考慮して医師が決定できる。ここに記載する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を含む医薬組成物を、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、いくつかの例において１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の範囲の用量で、これらの範囲内の全整数値を含み、投与し得ると一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物を、また、この用量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用して投与できる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。
【１０１８】
ある面において、活性化免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を対象に投与し、続いて血液を採り(またはアフェレシスを実施し)、本発明に従いそこからの免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を活性化し、これらの活性化し、かつ増殖させた免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を患者に再注入することが望ましいことがある。この過程を数週間毎に複数回実施できる。ある面において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血した血液から活性化できる。ある面において、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃまたは１００ｃｃの採血した血液から活性化する。
【１０１９】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、留置または移植を含む、任意の簡便な方法により実施し得る。ここに記載する組成物を、患者に経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内(ｉ.ｖ.)注射によりまたは腹腔内に投与し得る。一つの面において、本発明のＴ細胞組成物を、患者に皮内または皮下注射により投与するする。一つの面において、本発明のＴ細胞組成物を、ｉ.ｖ.注射により投与する。免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の組成物を、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射し得る。
【１０２０】
特に代表的な面において、対象は、白血球を採取し、エクスビボで富化または枯渇させて、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択および／または単離する、白血球除去を受け得る。これらのＴ細胞単離体を、当分野で知られる方法により増殖させ、１以上の本発明のＣＡＲ構築物が導入され、それにより本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞が創製されるように処理し得る。処置を必要とする対象を、その後高用量の化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付し得る。ある面において、移植後または移植と同時に、対象は、増殖させた本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞の注入を受ける。さらなる面において、増殖細胞を手術の前または後に投与する。
【１０２１】
患者に投与すべき上記処置の用量は、処置する状態の正確な性質および処置の受け手により変わる。ヒト投与のためのスケーリングは、当分野で認識されている習慣に従い実施できる。ＣＡＭＰＡＴＨの用量は、例えば、概して成人患者に１〜約１００ｍｇの範囲であり、通常連日、１〜３０日の期間投与する。好ましい１日用量は１〜１０ｍｇ／日であるが、いくつかの例において最大４０ｍｇ／日までの高用量を使用し得る(米国特許６,１２０,７６６号に記載)。
【１０２２】
ある態様において、ＣＡＲを、例えば、インビトロ転写を使用して免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)に導入し、対象(例えば、ヒト)は、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の初期投与と、その後の本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回以上の投与を受け、ここで、その後の１回以上の投与は、先の投与の後、１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に行う。ある態様において、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回を超える投与を、対象(例えば、ヒト)に１週間当たりに行い、例えば、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の２、３または４投与を週あたりに投与する。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の週あたり１回を超える投与を受け(例えば、１週間当たり２回、３回または４回投与)(ここではサイクルとも呼ぶ)、続いて１週間、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)投与されず、その後さらにＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回以上のさらなる投与(例えば、週あたりＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回を超える投与)を対象に投与する。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の１回を超えるサイクルの投与を受け、各サイクル間の期間は１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日より短い。ある態様において、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、隔日で１週間３回投与する。ある態様において、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上投与する。
【１０２３】
一つの面において、本発明のＣＡＲ発現細胞を、レンチウイルスのようなレンチウイルスウイルスベクターを使用して産生する。細胞、例えば、この方法で産生されたＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有する。
【１０２４】
一つの面において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴを、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、ここに記載するガンマレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを使用して産生する。これらのベクターを使用して産生されたＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有する。
【１０２５】
一つの面において、ＣＡＲＴは、形質導入４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日後、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ  ＣＡＲベクター送達により行われ得る。一つの面において、ＣＡＲ  ＲＮＡを、エレクトロポレーションによりＴ細胞に形質導入する。
【１０２６】
一過性発現ＣＡＲ免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)(特にマウスｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴ)を使用して処置される患者で生じ得る可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。
【１０２７】
この理論に縛られることを望まないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗ＣＡＲ応答を発達させる患者、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体が原因であると考えられる。細胞を産生する患者の抗体が、抗原への暴露の１０〜１４日の中断があるとき、ＩｇＧアイソタイプ(これはアナフィラキシーを生じない)からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けると考えられる。
【１０２８】
患者が一過性ＣＡＲ治療(例えばＲＮＡ形質導入により完成されたもののような)中に抗ＣＡＲ抗体応答を産生する高リスクにあるならば、ＣＡＲＴ注入中断は１０〜１４日を超えて継続してはならない。
【実施例】
【１０２９】
本発明を、次の実験的実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的として提供し、特に断らない限り限定を意図しない。そうして、本発明は、決して次の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ、ここに提供する教示の結果として明らかとなる任意かつ全ての異形を含むと解釈すべきである。
【１０３０】
実施例１：ＰＤ−１  ＣＡＲ
ある態様において、阻害分子、例えば、プログラム細胞死１(ＰＤ−１)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと融合できる。ある態様において、ＰＤ−１  ＣＡＲを単独で使用できる。ある態様において、ＰＤ−１  ＣＡＲを、他のＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９ＣＡＲと組み合わせて使用できる。ある態様において、ＰＤ−１  ＣＡＲは、Ｔ細胞の持続を改善する。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号２６で下線により示されるＰＤ−１の細胞外ドメインを含むＰＤ−１  ＣＡＲである(ＰＤ−１ドメインを下線を引く)。
【化２６】
2019206538.tif 000038
【１０３１】
ＰＤ−１  ＣＡＲの対応するヌクレオチド配列を下に示し、ＰＤ−１  ＥＣＤを下の配列番号２７で下線を引く(ＰＤ−１ドメインを下線を引く)。
【化２７】
2019206538.tif 000039
【１０３２】
他の阻害分子の例は、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄性細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ−１の２リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が、ＰＤ−１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌に豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転できる。
【１０３３】
ＮＦＡＴ−ＬＵＣレポーター(ＪＮＬ)を含むＪｕｒｋａｔ細胞を、ピューロマイシンを０.５μｇ／ｍｌで伴うＪｕｒｋａｔ細胞増殖培地で０.５×１０６／ｍｌ密度まで増殖させた。各トランスフェクションについて、３×１０６細胞を１００ｇで１０分遠沈させた。構築物あたり４μｇ  ＤＮＡをトランスフェクションあたりに使用した。Amaxa Nucleofector solution VおよびサプリメントＩを混合し、１００μｌを、ＤＮＡ構築物とチューブに添加した。次いで、混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。エレクトロポレーションを、Amaxa Nucleofector II Deviceを使用して設定Ｘ−００１の下に実施した。０.５ｍｌの増殖培地をエレクトロポレーション直後に添加し、混合物を、６ウェルプレートの１ウェル中の２ｍｌ増殖培地に添加した。２時間後、多様な濃度のラパログ化合物を細胞に添加した。細胞を、標的で被覆された組織培養プレートウェルに適用した。組織培養プレートを５μｇ／ｍｌのＰＤＬ１−ＦｃまたはＩｇＧ１−Ｆｃまたは任意の標的で、２時間、３７℃で被覆し、次いでブロッキング緩衝液(５％血清含有ＤＰＢＳ)で３０分遮断した。トランスフェクト細胞を、１００μｌ／ウェルで標的プレートに添加し、さらに１６時間インキュベートした。ウェルあたりLuciferase One Glo試薬１００μｌを添加した。サンプルを、５分、３７℃でインキュベートし、発光をＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して測定した。
【１０３４】
ＰＤ１  ＣＡＲ構築物は、ＰＤ１−ＥＣＤ−ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ゼータを含む。この構築物は、構築物をトランスフェクトした細胞、例えば、ＰＤ１  ＣＡＲをトランスフェクトしたＣＡＲＴ細胞の持続を改善し得る。
【１０３５】
図３２に示すように、ＰＤ１  ＣＡＲは、ＩｇＧ１−Ｆｃによる対照処理と比較して、ＮＦＡＴ誘導性プロモーター駆動ルシフェラーゼ活性の顕著なＰＤ１誘発活性化を示した。これは、ＰＤ１のＰＤＬ−１との相互作用が、ＰＤ１のＪｕｒｋａｔ細胞表面へのクラスタリングを起こすのに十分であり、ＮＦＡＴ経路の強い活性化を起こすことを示す。
【１０３６】
実施例２：ラクダ類単一ＶＨＨドメインベースのＣＡＲは、明らかな受容体相互作用なしに、ｓｃＦｖベースのＣＡＲと組み合わせてＴ細胞表面上に発現され得る
材料および方法：ＮＦＡＴ依存性プロモーター下にＧＦＰを発言するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞(ＮＦ−ＧＦＰ)に、メソテリン特異的活性化ＣＡＲ(ＳＳ１−ＣＡＲ)、ＣＤ１９特異的活性化ＣＡＲ(１９−ＣＡＲ)またはＥＧＦＲに特異的なラクダ類ＶＨＨドメインを使用して産生されたＣＡＲ(ＶＨＨ−ＣＡＲ)を形質導入した。活性化ＣＡＲの形質導入後、細胞を、活性化および阻害性ＣＡＲ(ＳＳ１＋１９ＰＤ１、１９＋１９ＰＤ１またはＶＨＨ＋１９ＰＤ１)の両者を共発現する細胞を産生するため、ＣＤ１９を認識するさらなる阻害性ＣＡＲ(１９−ＰＤ１)を形質導入した。形質導入したＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、１)全標的抗原を欠く(Ｋ５６２)、２)メソテリン(Ｋ−ｍｅｓｏ)、ＣＤ１９(Ｋ−１９)またはＥＧＦＲ(Ａ４３１)のみを発現する、３)ＥＧＦＲとメソテリン(Ａ４３１−メソテリン)またはＣＤ１９(Ａ４３１−ＣＤ１９)の組み合わせを発現するまたは４)ＣＤ１９とメソテリン(Ｋ−１９／ｍｅｓｏ)の組み合わせを発現する、異なる細胞株と２４時間共培養した。スティミュレーター細胞無し(ｎｏ  ｓｔｉｍ)またはＫ５６２と１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３(ＯＫＴ３)を含むさらなる条件も、それぞれＮＦＡＴ活性化の陰性および陽性対照として包含させた。ＮＦＡＴ活性化のマーカーとしてのＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより評価した。
【１０３７】
結果：ラクダ類および関連する種(例えばラマ)は、単一重鎖様可変ドメインを有する抗体を自然に産生する。ラクダ類ＶＨＨドメインとして知られるこのドメインは、軽鎖可変ドメインと対形成せずに存在するように進化している。受容体共発現中、同族リガンドに結合するｓｃＦｖの分裂により示されるように、細胞の表面上に呈示されたとき、２の異種ｓｃＦｖ分子を互いに解離および再結合できる可能性が判明した。本実施例は、ＶＨＨドメインベースのＣＡＲと組み合わせて、細胞の表面上に呈示されたｓｃＦｖ  ＣＡＲの間の予想される相互作用の減少を示した。Ｊｕｒｋａｔ表面上への２個のｓｃＦｖベースのＣＡＲ(ＳＳ１−ｚ活性化ＣＡＲおよびＣＤ１９−ＰＤ１阻害性ＣＡＲ)の共発現は、活性化ＣＡＲ(ＳＳ１−ｚ)が標的細胞上のその同族リガンドを認識することを不可能とし、阻害受容体のリガンドの不在にも関わらず、Ｔ細胞活性化を誘発できることが判明した。これは、表面上のリガンド結合の観察された現象と一致する。対照的に、同じ阻害性ＣＡＲ(ＣＤ１９−ＰＤ１)とラクダ類ＶＨＨベースの活性化ＣＡＲ(ＶＨＨ−ｚ)の共発現は、ＶＨＨベースの活性化ＣＡＲがその同族リガンドを認識する能力に影響を与えなかった。これらのデータは、ｓｃＦｖとＶＨＨドメインが相互作用する能力の減少のために、受容体間の顕著な相互作用なくＶＨＨベースの活性化ＣＡＲを、ｓｃＦｖベースのＣＡＲと共に発現できるモデルを支持する。
【１０３８】
実施例３：葉酸受容体−アルファ発現腫瘍を標的とするＣＡＲＴ
葉酸受容体α(ＦＲＡ)は、卵巣癌の約９０％、ならびに子宮内膜癌、腎臓、乳房、肺、膵臓、結腸直腸の癌および中皮腫で過発現し、その発現は、化学療法剤の先の投与に影響されない(例えば、Despierre et al., Gynecol Oncol 130, 192-199 (2013)参照)。正常組織において、ＦＲＡ発現は０であるかまたは低く、循環している抗ＦＲ剤には接触不可能であるように見える場所である、極性化上皮性細胞の尖端表面に制限される(Kelemen et al., International journal of cancer 119, 243-250 (2006))。
【１０３９】
腫瘍学におけるＣＡＲ−Ｔ細胞治療は、卵巣癌で最初に試験され、そこで、マウスＭＯｖ１８  ｓｃＦｖおよびＣＤ３ｚエンドドメインからなる抗ＦＲＡ  ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞の投与は、実行可能であることが示されたが、遺伝子修飾Ｔ細胞の持続が乏しいために、腫瘍退縮を誘発しなかった(Kershaw et al, Clin Cancer Res 12, 6106-6115 (2006))。
【１０４０】
この実施例において、我々は、ＣＡＲ導入遺伝子免疫原性の可能性のリスクを減らすために、完全ヒト抗ＦＲＡ  Ｃ４  ＣＡＲを構築した。ヒトＣ４  Ｆａｂフラグメントの結合親和性(２×１０７Ｍ−１)は、高親和性マウスＭＯｖ１９抗体よりも約５倍低かったが(Figini, M. et al. (1998) Cancer Res 58, 991-996)、ＦＲＡに対するその特異性を維持し、＜１０８Ｍ−１のＫ(ｄ)が、高い量の表面ＦＲＡを担持する腫瘍細胞との遭遇によりＣＡＲの排他的活性化を与えることが予測される。ターゲティングドメインを、組み合わせた細胞内ＣＤ２７およびＣＤ３ｚシグナル伝達鎖と連結して、この受容体の有効性をさらに増強した(以後“Ｃ４−２７ｚ”と称する)。さらに、Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲは、低レベル抗原を担持する正常細胞に対する活性が減少しており、抗原上、腫瘍外毒性の可能性のあるリスクが低下する。これらの結果は、広範なＦＲＡ発現悪性腫瘍に対する安全かつ有効な処置のための完全ヒトＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療に至る。
【１０４１】
材料および方法
細胞株。レンチウイルスパッケージングを、ＡＴＣＣから購入した不死化正常胎児腎臓２９３Ｔ細胞株で実施した。免疫ベースのアッセイに使用したヒト細胞株は、確立されたヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、Ａ１８４７、ＯＶＣＡＲ２、ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ４、ＯＶＣＡＲ５、Ａ２７８０、Ａ２００８、Ｃ３０およびＰＥＯ−１を含む。ヒトリンパ系細胞株ＳＵＰ−Ｔ１をレンチウイルス力価分析に使用した。バイオルミネセンスアッセイのために、標的癌細胞株をホタルルシフェラーゼ(ｆＬｕｃ)を発現するようにトランスフェクトした。マウス悪性中皮腫細胞株、ＡＥ１７(Steven Albelda, University of Pennsylvaniaから恵与)を陰性対照として使用した。全細胞株を、１０％熱不活化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ)を添加したＲＰＭＩ−１６４０であるＲ１０培地に維持した。
【１０４２】
ＣＡＲ構築およびレンチウイルス産生。Dr. Silvana Canevari(Figini, M. et al. (1998) Cancer Res 58, 991-996)から恵与された抗ＦＲａ  Ｃ４／ＡＦＲＡ４  ｓｃＦｖを含むｐＨＥＮ２プラスミドを、次のプライマーを使用する７２９ｂｐ  Ｃ４フラグメントのＰＣＲ増幅の鋳型として使用した：5'-ataggatcccagctggtggagtctgggggaggc-3'(配列番号５２)(ＢａｍＨＩは下線)および5'-atagctagcacctaggacggtcagcttggtccc-3'(配列番号５３)(ＮｈｅＩは下線)。先に記載された第三世代自己不活性化レンチウイルス発現ベクターｐＥＬＮＳをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化し、ゲル精製した。消化ＰＣＲ産物を、次いで、導入遺伝子発現が伸長因子−１α(ＥＦ−１α)プロモーターにより駆動されるＣＤ３ｚまたはＣＤ２７−ＣＤ３ｚ  Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むｐＥＬＮＳベクターに挿入した。得られた構築物を消化して、ｐＥＬＮＳ−Ｃ４−ｚまたはＣ４−２７ｚを得た。Parry, R.V., et al. (2003) The Journal of Immunology 171, 166-174に記載のように、高力価複製欠損レンチウイルスベクターを産生し、濃縮した。簡潔には、２９３Ｔ細胞を１５０ｃｍ２フラスコに播種し、製造者の指示に従いＥｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎ(Open Biosystems)を使用してトランスフェクトした。１５μｇのＦＲ特異的ＣＡＲ導入遺伝子プラスミドを、フラスコあたり１７４μｌのＥｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎ(１μｇ／μｌ)を用いて７μｇのｐＶＳＶ−Ｇ(ＶＳＶ糖タンパク質発現プラスミド)、１８μｇのｐＲＳＶ.ＲＥＶ(Ｒｅｖ発現プラスミド)および１８μｇのｐＭＤＬｇ／ｐ.ＲＲＥ(Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミド)と共トランスフェクトした。上清をトランスフェクション２４時間および４８時間後に回収し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ３２Ｔｉローター(Beckman Coulter)で２時間、２８,０００ｒｐｍの超遠心分離により１０倍濃縮した。あるいは、培地の単回採取を培地交換３０時間後に行った。あるいはウイルス含有培地を未濃縮でまたはＬｅｎｔｉ−Ｘコンセントレータ(Clontech, Cat# 631232)で濃縮して使用した。ウイルスをチューブに分け、力価測定または実験への使用の準備ができるまで−８０℃で保存した。実験に使用した全レンチウイルスは、濃縮貯蔵物からであった。
【１０４３】
レンチウイルス力価の決定。ＦＲＡ  ＣＡＲをコードする濃縮レンチウイルスベクターの力価を、Ｒ１０培地でベクター調製物を連続(３倍)希釈し、ＳＵＰ−Ｔ１細胞に形質導入することにより決定した。簡潔には、ＳＵＰ−Ｔ１細胞(２０,０００細胞／１００μｌ／ウェル)を、９６ウェルプレートの１ウェルに播種し、５０μｌの３倍希釈ベクター上清を移し、一夜インキュベートした。翌日、細胞に１００μｌの予め温めたＲ１０培地を供給した。形質導入２日後、ベクター力価を、ＣＡＲ発現の分析のために標準的フローサイトメトリー法を適用するフローサイトメトリーにより決定した。力価(形質導入単位[ＴＵ]＝(％陽性／１００)×２Ｅ４×２０×希釈。実験を全て少なくとも３回繰り返し、実験から得た平均力価をデータ分析に使用した。
【１０４４】
ヒトＴ細胞およびトランスフェクション。Human Immunology Core at University of Pennsylvaniaから購入した初代ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を、健常ボランティアドナーから、陰性選択による白血球除去後単離した。全検体を、University Institutional Review Boardにより承認されたプロトコール下に採取し、インフォームド・コンセント書面を各ドナーから得た。Ｔ細胞をＲ１０培地で培養し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体(ｍＡｂ)被覆ビーズ(Invitrogen)で刺激した。活性化１８〜２４時間後、ヒトＴ細胞スピノキュレーション法を使用して形質導入した。簡潔には、０.５×１０６  Ｔ細胞を感染効率(ＭＯＩ)２および５の濃縮Ｃ４−２７ｚおよびＭＯｖ１９−２７ｚベクターでそれぞれ感染させた。細胞とベクターの混合物を、卓上型遠心分離(Sorvall ST 40)で室温で９０分(２,５００ｒｐｍ)遠心分離した。ヒト組み換えインターロイキン−２(ＩＬ−２；Novartis)を２〜３日毎に１００ＩＵ／ｍＬ最終濃度まで添加し、０.５×１０６〜１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を維持した。増殖動態減少およびMultisizer 3 Coulter Counter(Beckman Coulter)、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して決定した細胞サイジングの両者で決定して、操作されたＴ細胞培養が休止したように見えたら、Ｔ細胞を機能的分析に使用する。
【１０４５】
フローサイトメトリー分析。次のモノクローナル抗体を、表現型分析に使用した：ＡＰＣ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ３；ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４；ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８；ＰＥ−抗ヒトＣＤ４５；ＰＥ抗ヒトＣＤ１３７。７−アミノアクチノマイシンＤ(７−ＡＡＤ)を生存能染色に使用した。全モノクローナル抗体をBD Biosciencesから購入した。Ｔ細胞移入実験において、末梢血を、後眼窩放血により得て、ヒトＣＤ４５、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の存在について染色した。ヒトＣＤ４５＋集団上でのゲーティング後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットを、製造業者の指示に記載のとおり、既知蛍光ビーズ数を用いるＴｒｕＣｏｕｎｔチューブ(BD Biosciences)を使用して定量化した。ＦＲａの腫瘍細胞表面発現をＭＯｖ１８  ｍＡｂ、続いてＡＰＣ標識ヤギ抗マウスＡｂを使用して実施した。Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ両者のＴ細胞表面発現を、それぞれビオチン標識組み換えＦＲａタンパク質(R&D Systems, Inc)と続くストレプトアビジン−ＡＰＣ(eBioscience, Inc.)またはビオチン標識ウサギ抗ヒトＩｇＧおよびヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ(ａｂ’)２フラグメントと続くストレプトアビジン−ＡＰＣを使用して評価した。細胞内サイトカイン染色について、細胞を、１０％ＣＯ２含有細胞インキュベーターで３７℃で４時間、リンモリブデン酸(ＰＭＡ)(３０ｎｇ／ｍＬ)(Sigma-Aldrich)、イオノマイシン(５００ｎｇ／ｍＬ)(Sigma-Aldrich)およびモネンシン(GolgiStop)(１μＬ／ｍＬ)(BD Biosciences)を含む培養培地で刺激した。ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を決定するために、細胞をＦＲｐｏｓ卵巣癌細胞と５時間共培養した。表面マーカーを染色した後、細胞を固定し、製造業者の指示に従いＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍおよびＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液(BD Biosciences)を使用して透過性化した。次いで、細胞を分析前にＰＥ抗ヒトＩＦＮ−γ、パシフィックブルー抗ヒトＴＮＦ−αまたはＦＩＴＣ抗ヒトＩＬ−２を含む蛍光結合サイトカイン抗体で染色した。フローサイトメトリーをＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  IIフローサイトメーター(BD Biosciences)で実施し、フローサイトメトリーデータをＦｌｏｗＪｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７.２.５ソフトウェア(Tree Star, Ashland, OR)で分析した。
【１０４６】
サイトカイン放出アッセイ。サイトカイン放出アッセイを、９６ウェル平底プレートで、ウェルあたり、２００μｌ体積のＲ１０培地中１×１０５  Ｔ細胞と１×１０５標的細胞をトリプリケートで共培養することにより実施した。２０〜２４時間後、共培養上清を、製造業者の指示に従い、ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ(BioLegend, San Diego, CA)を使用してＩＦＮ−γの存在についてアッセイした。価は、３ウェルの平均を表す。
【１０４７】
細胞毒性アッセイ。細胞ベースのバイオルミネセンスアッセイのために、５×１０４  ホタルルシフェラーゼ(ｆＬｕｃ)発現腫瘍細胞を、９６ウェルマイクロプレート(BD Biosciences)を使用して、異なる比の形質導入Ｔ細胞の存在下、Ｒ１０培地を用いて培養した。約２０時間、３７℃でインキュベーション後、各ウェルを、１μｌのＤ−ルシフェリン(０.０１５ｇ／ｍＬ)を再懸濁した５０μＬのＤＰＢＳで満たし、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳスペクトルで造影した。腫瘍細胞生存能パーセントを、(実験サンプルの平均発光−背景／アッセイに使用した標的細胞の投入数の平均発光−背景)×１００として計算した。全てのデータを３ウェルの平均として示す。
【１０４８】
ＣＡＲ  Ｔ細胞(５×１０５)を、２４ウェルプレートで、１ｍｌ中５×１０５  ＦＲｐｏｓ  Ａ１８４７癌細胞またはＦＲｎｅｇ  ＡＥ１７細胞と共培養した。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ(BD Biosciences)を共培養後添加した。細胞を、さらに４時間培養した。培養物をＭＯｖ１９またはＣ４  ｓｃＦｖ、続いてＣＤ３およびＣＤ８について染色した。透過性細胞を、次いで、ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ−ａおよびＩＬ−２産生について細胞内的に染色した。Ｔ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ８発現に対してゲート開閉し、さらにサイトカイン応答の可能性のあるパターンの全てを評価するために、Ｂｏｏｌｅａｎゲートプラットフォームを使用して、サイトカイン発現について分析した。
【１０４９】
卵巣癌の異種移植モデル。全ての動物を、Stem Cell and Xenograft Core of the Abramson Cancer Center, University of Pennsylvaniaから得た。６〜１２週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−鎖−／−(ＮＳＧ)マウスを、University of Pennsylvania IACUCが承認したプロトコール下、無病原体室内条件下、繁殖させ、処置し、維持した。確立された卵巣癌モデルについて、６〜１２週齢雌ＮＳＧマウスに、０日目に３×１０６  ＳＫＯＶ３  ｆＬｕｃ＋細胞を側腹部にｓ.ｃ.摂取した。腫瘍が約１ヶ月で触知可能となった後、ヒト初代Ｔ細胞(使用したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を１：１比で混合)を、上記のように活性化および形質導入した。Ｔ細胞増殖２週間後、腫瘍負荷が約２００〜３００ｍｍ３になったとき、マウスをＴ細胞で処置した。Ｔ細胞注射の経路、用量およびタイミングは、個々に図の凡例に示す。腫瘍寸法をカリパスで測定し、腫瘍体積を式Ｖ＝１／２(長さ×幅２)を使用して計算し、ここで、長さは、最長長手方向直径であり、幅は最長横径である。動物を、Ｔ細胞移入前、そしてその後ほぼ毎週造影して、腫瘍増殖を評価した。全てのインビボ実験について、“Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ”ソフトウェア(Xenogen)を使用してｆＬｕｃ＋細胞からの光子放射を定量した。腫瘍を、サイズ測定および免疫組織化学のために第一Ｔ細胞投与約４０日後の安楽死直後に摘除した。
【１０５０】
卵巣癌の腹腔内モデルについて、ＮＳＧマウスに、５×１０６  ＳＫＯＶ３  ｆＬｕｃ＋細胞をｉ.ｐ.注射した。腹腔内接種２０日後、十分に確立されたＳＫＯＶ３腫瘍を担持するマウスを数群にわけ、処置した。マウスが苦しみ、瀕死となったときに、マウスを殺し、剖検した。腫瘍進行の程度をモニターするために、マウスを毎週または二週毎に造影し、マウスの体重を測定した。全モデルにおいて、処置前に、群あたり４〜５匹のマウスに無作為化した。
【１０５１】
バイオルミネセンス造影。腫瘍増殖を生物発光造影(ＢＬＩ)によってもモニターした。ＢＬＩをＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ造影系を使用して行い、動物身体内のｆＬｕｃ発現細胞から放出される光子を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア(Xenogen)を使用して定量化した。簡潔には、ＳＫＯＶ３  ｆＬｕｃ＋腫瘍細胞を担持するマウスに、ＰＢＳに懸濁したＤ−ルシフェリン(１５０ｍｇ／ｋｇ原液、１００μＬのＤ−ルシフェリン／マウス体重１０ｇ)を腹腔内注射し、５〜１０分後イソフルラン麻酔下に造影した。光強度を表す疑似カラー画像(青、最低強度；赤、最高強度)を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅを使用して作成した。ＢＬＩ知見を剖検で確認した。
【１０５２】
統計解析。データを平均およびＳＤとして報告する。統計解析を、腫瘍負荷(腫瘍体積、光子数)について二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを使用して行った。スチューデントｔ検定を使用して、移入Ｔ細胞数、サイトカイン分泌および特定の細胞溶解の差異を評価した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５.０(GraphPad Software)を、統計計算に使用した。Ｐ＜０.０５を有意とみなした。
【１０５３】
結果
１. インビトロでのマウスＭＯｖ１９  ＣＡＲと比較したヒトＣ４  ＣＡＲの増強された機能
上記産生および濃縮プロトコールを使用して、我々は、Ｃ４  ＣＡＲコード化レンチウイルスが、恐らくヒトＴ細胞上でのヒトｃＦｖの効率的発現の結果として、マウスＭＯｖ１９  ＣＡＲより高い有効力価を有することを発見した(図３７ａ)。実際、我々は、Ｃ４  ＣＡＲレンチウイルスの１ほど低い感染効率(ＭＯＩ)が＞２０％ヒトＴ細胞の感染に十分であり、一方ＭＯｖ１９  ＣＡＲレンチウイルスは５のＭＯＩを必要とすることを観察した(図３７ｂ)。それゆえに、次の実験のために、Ｔ細胞を、それぞれ２および５のＭＯＩの濃縮Ｃ４−２７ｚおよびＭＯｖ１９−２７ｚベクターで感染させ、Ｔ細胞上のＣ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ両者の表面発現を、組み換えＦＲＡタンパク質染色により検出した(図３４ａ)。
【１０５４】
ＣＡＲ構築に使用したＳｃＦｖｓは、操作されたＴ細胞に対する活性化閾値を達成するために最小抗原親和性を必要としたが、しかしながら、高親和性ｓｃＦｖは、必ずしも低親和性ｓｃＦｖより高いＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化を誘発しなかった。ヒトＣ４  Ｆａｂフラグメントの結合親和性(２×１０７Ｍ−１)がマウスＭＯｖ１９より約５倍弱いため、我々は、高親和性抗ＦＲＡ  ｓｃＦｖを含むＭＯｖ１９  ＣＡＲとの比較により、完全ヒトＣ４  ＣＡＲの構築に使用したＣ４  ｓｃＦｖの低い親和性が再指示されたＴ細胞機能に影響するか否かを試験した。Ｃ４−２７ｚまたはＭＯｖ１９−２７ｚ  ＣＡＲを発現するように修飾したＴ細胞は、一夜共培養でほぼ等しい効率でＦＲＡＰＯＳ  ＳＫＯＶ３およびＡ１８４７腫瘍細胞を特異的に溶解した(図３４ｂ)。しかしながら、インビトロサイトカイン産生分析は、ＭＯｖ１９−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、等価な１：１  Ｅ：Ｔ比で一夜共培養後、Ｃ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞より有意に少ないＩＦＮ−γを分泌することを示した(図３４ｃ)。この結果は、５時間細胞内サイトカイン産生アッセイにより確認された。腫瘍活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞による５時間細胞内サイトカイン発現の代表的蛍光活性化セルソーター(ＦＡＣＳ)プロットは、Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両者が、ＦＲＡｐｏｓ  ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞と一夜インキュベートしたときＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２サイトカインを産生するが、ＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、これらのサイトカインをＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞より少なく産生したことを示す(図３４ｄ)。サイトカインを発現するＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度は、インビトロでＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞において観察されたより、ＩＦＮ−γについて５.６倍高く、ＴＮＦ−αについて６.１倍高く、ＩＬ−２について９倍高い。ＦＲＡＰＯＳまたはＦＲＡ陰性癌細胞と共培養した非形質導入Ｔ細胞またはＦＲＡ陰性癌細胞と共培養したＣＡＲ  Ｔ細胞は、炎症誘発性サイトカインを産生しなかった(図３８)。
【１０５５】
インビトロでの我々の結果は、ＦＲＡに対して中程度の親和性を有するＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、高親和性ｓｃＦｖを有するＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも機能的に優れることを示唆した。高親和性ＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞による機能低下を説明する機構を理解するために、我々は、抗原発現腫瘍細胞との共インキュベーション後、Ｔ細胞上のＣＡＲ発現を注意深く分析した。高レベルのＦＲＡを発現するＳＫＯＶ３癌細胞での刺激は、抗原結合後表面ＭＯｖ１９  ＣＡＲ発現の急速かつ顕著な下方制御を誘発した(図３９)。腫瘍細胞への暴露５時間後、ＭＯｖ１９  ＣＡＲ頻度は、Ｔ細胞の約６５％から約１％に急激に下方制御された。この知見は、同様に高レベルのＦＲＡを発現するＦＲＡＰＯＳ  Ａ１８４７細胞および乳癌細胞株Ｔ４７Ｄでも確認された(データは示していない)。比較として、Ｃ４  ＣＡＲは有意に下方制御されなかった(図３９)。細胞内サイトカイン発現分析は、Ｃ４  ＣＡＲ表面発現を維持するＴ細胞はＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２を産生するが、サイトカイン産生は、ＭＯｖ１９群のＣＡＲ陰性フラクションに排他的に検出されることが示され、ＣＡＲ下方制御およびサイトカイン産生が抗原遭遇後に生じることを示す。
【１０５６】
それぞれＳＫＯＶ３細胞で刺激後のＭＯｖ１９−ＣＡＲと比較したＣ４で修飾したＴ細胞におけるアポトーシス染色により測定して、アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋は類似する頻度であった。ＣＤ２８ドメインを有するＣＡＲは、４−１ＢＢと比較してＡＩＣＤが低かった(Ｒ１２：１６.４％／１８.４％対２Ａ２：３８.１％／３９.６％)。
【１０５７】
ＣＡＲと標的分子の間の全体的アビディティーは、ＣＡＲ発現におけるこの観察された差異を説明し得る。我々は、ＳＫＯＶ３細胞と共培養後のＣ４またはＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞による相対的ＣＡＲ発現に対するＴ細胞対標的細胞比の影響を評価した。１：１０、１：３および１：１の低いＥ：Ｔ比で、ＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、試験した最低Ｅ：Ｔ比で初期ＣＡＲ発現の約５０％を維持したＣ４  ＣＡＲと比較して、ＣＡＲ発現の有意な、用量依存的下方調節を示した。しかしながら、腫瘍抗原がより限定的である３：１および１０：１の高Ｅ：Ｔ比で、Ｃ４またはＭＯｖ１９  ＣＡＲのいずれかを担持するＴ細胞は、高ＣＡＲ発現を維持した(図４０)。抗原刺激後のＣＡＲ発現における変化と一致して、Ｃ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１：１０、１：３および１：１のＥ：Ｔ比でＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞より多いＩＦＮ−γを放出したが、３：１および１０：１のＥ：Ｔ比では類似する量であった(図３４ｅ)。それゆえに、ＣＡＲ下方制御は、高親和性ＭＯｖ１９  ｓｃＦｖを担持する抗ＦＲＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で抗原用量依存的様式で起こり、低抗原レベルにより感受性である。
【１０５８】
２. インビボでのＣ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の同等な抗腫瘍活性
インビボでのＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍能力を比較するために、大きな、確立された皮下ＳＫＯＶ３腫瘍(約３００ｍｍ３)を有するＮＳＧマウスに、腫瘍接種４０日および４７日後に１０７  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を静脈内注射した。食塩水、非形質導入Ｔ細胞またはＣＤ１９−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した動物における腫瘍は急速な増殖を続けた。対照的に、Ｃ４−２７ｚまたはＭＯｖ１９−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスは、最後の評価時点で全３対照群と比較して、腫瘍退縮を経験した(ｐ＜０.０００１)。ＭＯｖ１９−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性はＣ４−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりわずかに良いように見えるが、有意レベルではなかった(ｐ＝０.０５８；図３５ａ)。Ｔ細胞注射前および３週間後の腫瘍異種移植のＢＬＩは、対照Ｔ細胞を受けた全動物における腫瘍の進行性増殖を示したが、ＣＡＲ  Ｔ細胞群ではなかった(図３５ｂ)。腫瘍ＢＬＩ結果は、摘除した残留腫瘍のサイズと一致した(図３５ｃ)。次に、我々は、養子移入３週間後の末梢血における移入Ｔ細胞の持続を分析し、ＵＮＴおよびＣＤ１９−２７ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群と比較して、Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両者で処置された群のマウスで高いＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞数を検出し(図３５ｄ)、腫瘍抗原認識がインビボで養子移入Ｔ細胞の生存を駆動することが示唆された。これらの結果は、Ｃ４  ＣＡＲの抗腫瘍活性が、先に十分に記載された(例えば、Song et al., Blood 119, 696-706 (2012); Song et al., Cancer Res 71, 4617-4627 (2011)参照)ＭＯｖ１９  ＣＡＲと同等であることを示し、Ｃ４  ＣＡＲは、その親和性が低下しているにも関わらず、インビボ適用に適することが確認された。
【１０５９】
３. 低い親和性の抗ＦＲＡ  ＣＡＲは、“標的上”毒性のリスクを減らし得る
標的上毒性は、正常細胞で低レベルで発現される腫瘍結合抗原に特異的なＣＡＲ  Ｔ細胞の臨床試験で観察されており、そして取り組むべき重大問題は、高親和性のＣＡＲが毒性のリスクを高め得るか否かである。低レベルのＦＲＡを発現する正常細胞に対する、Ｃ４  ＣＡＲおよびＭＯｖ１９  ＣＡＲで修飾された初代ヒトＴ細胞の機能的効果を試験するために、我々は、低いが、検出可能なレベルのＦＲＡを発現するヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞または正常上皮性卵巣細胞株ＩＯＳＥ  ６およびＦＲＡＰＯＳ  ＳＫＯＶ３細胞と共培養後、Ｃ４  ＣＡＲおよびＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生を分析した(図３６ａ)。Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞はＳＫＯＶ３に対して応答し、大きな活性が再びＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞で観察された。しかしながら、大きなＩＦＮ−γサイトカイン産生は、低抗原発現細胞に対する応答においてＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で観察され、ＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞が低抗原により機能的に貪欲であり、感受性であることが示唆される(図３６ｂ)。一夜ＩＦＮ−γ放出アッセイで我々が観察したものに類似して、５時間細胞内サイトカイン分泌アッセイは、Ｃ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、多くのＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを正常細胞上の低抗原に応答して産生し(図３６ｃ)、これは、“標的上”サイトカインストームに対する一つの主に提案されている寄与因子である２８。これらのデータは、新たに記載したＣ４  ＣＡＲが、安全かつ有効な操作されたＴ細胞治療の送達のためのより適切な親和性を有し得ることを示唆する。
【１０６０】
４. 可溶性ａＦＲ抗原に対してＭＯｖ１９  ＣＡＲより低い親和性を有するＣ４  ＣＡＲ
ここに記載するインビトロ結果は、完全ヒトＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞より機能的に優れ、ＣＡＲ下方制御がＭＯｖ１９  ＣＡＲの抗腫瘍活性を障害するが、Ｃ４  ＣＡＲを障害しない可能性を示唆した。ＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞による機能低下を説明する機構を理解するために、組み換えαＦＲタンパク質に対する相対的結合を測定する実験を実施した。Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞にビオチン標識組み換えαＦＲタンパク質を予充填し、４℃または３７℃で、１０倍過剰の非ビオチニル化αＦＲコンペティター存在下、経時的に表面タンパク質解離を測定した。細胞表面上への抗原維持を、各培養終了後にフィコエリスリン(ＰＥ)結合ストレプトアビジン(ＳＡ)を添加することによりフローサイトメトリーで評価した。１時間以内に、いずれの温度でも、ＭＯｖ１９  ＣＡＲと比較してＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞の表面上で検出可能なαＦＲタンパク質は少なかった。解離レベルは時間および温度の両者に依存的であり、全試験条件下でＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞で高かった(図８８Ａ、図８８Ｂ)。類似する結果が、ビオチニル化αＦＲタンパク質のＭＯｖ１９およびＣ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞への結合に対する力価測定分析で得られた(図８９)。活性化Ｔ細胞を、ＭＯｖ１９−２７ｚまたはＣ４−２７ｚ−ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターで形質導入し、１４日目にＣＡＲ発現について評価した。１０万非形質導入(ＵＮＴ)またはＣＡＲ  Ｔ細胞を、０.２ｎＭ／サンプル、０.５ｎＭ／サンプル、１ｎＭ／サンプル、２ｎＭ／サンプル、５ｎＭ／サンプル、１０ｎＭ／サンプル、２０ｎＭ／サンプル、５０ｎＭ／サンプルまたは１２０ｎＭ／サンプルのビオチニル化αＦＲで染色した。Ｔ細胞を洗浄し、ＰＥ−ＳＡで染色した。Ｔ細胞をフローサイトメーターを使用して分析し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。これらの結果は、ＣＡＲ構築物におけるＣ４が、可溶性αＦＲ抗原に対してＭＯｖ１９  ＣＡＲより低い親和性を有することを示唆する。
【１０６１】
結論：
ＣＡＲの設計のために選択した完全ヒトＣ４  ｓｃＦｖの低下した親和性はＴ細胞認識に影響し得る。しかしながら、Ｃ４およびＭＯｖ１９  ＣＡＲで修飾したＴ細胞による腫瘍結合後のサイトカイン産生の直接比較は、低親和性を有するＣ４  ＣＡＲが、Ｅ／Ｔ比１：１で優れることを示した。これは高レベルの抗原と遭遇する、高親和性のＭＯｖ１９  ＣＡＲの急速な内部移行によるものであり得る。我々がＥ／Ｔ比を上げるとき、Ｃ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性はＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞と同等である。インビボで抗腫瘍活性をさらに比較するために、我々は、高親和性ＭＯｖ１９  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、インビボでＣ４  ＣＡＲと比較してわずかに優れる活性を仲介することを発見した。しかしながら、この差は統計学的有意ではなく、Ｃ４  ＣＡＲの親和性がインビボ適用に適することを示唆する。
【１０６２】
正常組織上のＴＡＡの発現に起因する可能性のある標的上、腫瘍外毒性は、ＣＡＲ手法の適用において考慮する必要がある。大きな抗腫瘍活性を有する高親和性ＣＡＲまたはＴＣＲの開発は、重篤な毒性に至り得る。我々の研究は、Ｃ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、低レベルのＦＲＡを発現する正常細胞と遭遇したとき、ＭＯｖ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、最小のサイトカインを放出することを示した。それゆえに、相対的低親和性Ｃ４  ＣＡＲは標的上毒性を低下させ得るが、一方高親和性ＭＯｖ１９  ＣＡＲはインビボでこのリスクを高め得る。
【１０６３】
実施例４：ＣＡＲの親和性低下は治療有効性を上昇させる
ＣＡＲ操作されたＴ細胞での養子細胞治療(ＡＣＴ)は、広範な悪性細胞を標的とし、殺すことができ、それによりある造血器悪性腫瘍の処置における耐久性の臨床応答を誘発する(Kochenderfer, J.N., et al. (2010) Blood 116:4099-4102; Porter, D.L., et al. (2011) N Engl J Med 365:725-733;およびBrentjens, R.J., et al. (2013) Sci Transl Med 5:177ra138)。しかしながら、多くの共通して標的とされる腫瘍抗原は健常組織によっても発現され、正常組織のＴ細胞介在破壊からの標的上腫瘍外毒性が、その他の点では有望なタイプの癌治療の開発および採用を制限している。ＣＡＲまたはＴＣＲ操作Ｔリンパ球での患者の癌処置と関連した重篤な有害事象の最近の報告は、安全かつ効率的な治療のための標的選択の臨界的重要性をさらに説明する(Lamers et al., 2006, J Clin Oncol. 24:e20; Parkhurst et al., 2011, Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19:620-6; Morgan et al., 2013, J Immunotherapy. 36:133-151; Linette et al., 2013, Blood. 122:863-71)。具体的に、高親和性ＣＡＲＴでのＥｒｂＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕまたはＣＤ３４０)のターゲティングは、正常心肺組織上の標的認識により、重篤な毒性をもたらし(Morgan et al., 2013, Mol Therapy. 18:843-851)、同様に、健常皮膚における相対的高レベルのＥＧＦＲの存在が、用量制限的皮膚毒性をもたらす(Perez-Soler et al., 2010, J Clin Oncol. 23:5235-46)。
【１０６４】
標的として高度に組織限定的抗原、癌精巣抗原、変異遺伝子産物またはウイルスタンパク質を選択することは、ＣＡＲＴ細胞使用の安全性プロファイルを顕著に改善する。しかしながら、これらの抗原のいずれも一般的癌に高頻度で存在せず、悪性細胞により排他的に構成的に発現されず、腫瘍増殖に機能的に重要ではなく、ＣＡＲＴで標的化能ではない。ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡおよびＧＤ２のような、ＣＡＲＴにより標的とされ得る上位の標的抗原の大部分が、重要な可能性のある正常組織で発現される(Cheever et al., 2009, Clinical Cancer Research. 15:5323-37)。ＣＡＲを産生する現在の戦略は、先の試験が活性化閾値がｓｃＦｖの親和性と逆に相関することを示しているため、高親和性のｓｃＦｖの選択からなる(Chmielewski et al., 2004, J Clin Oncol. 173:7647-53; and Hudecek et al., 2013, Clincial Cancer Research. 19:3153-64)。試験は、ＣＡＲの共刺激ドメインが活性化閾値に影響しないことを示す(Chmielewski et al., 2011, Gene Therapy. 18:62-72)。ＴＣＲ刺激後、最適Ｔ細胞活性化のための親和性の狭い窓があり、ＴＣＲの親和性増加が必ずしも処置有効性を改善しない(Zhong et al., 2013, Proc Natl Acad Sci USA. 110:6973-8; and Schmid et al., 2010, J Immunol. 184:4936-46)。
【１０６５】
この実施例において、Ｔ細胞に高親和性ｓｃＦｖを装備することが、ＣＡＲＴの腫瘍と、同じ抗原を低いレベルで発現する正常組織の不十分な鑑別により、ＣＡＲの有用性を制限し得るか否かが決定された。ｓｃＦｖの親和性の微調整が、腫瘍と、同じ抗原を低いレベルで発現する正常組織を区別するＣＡＲＴ細胞の能力を増加せるか否かも決定された。多様な癌で増幅または過発現しているが、また、正常組織によっても低レベルで発現される２種の確認された標的、ＥｒｂＢ２およびＥＧＦＲに対する親和性を有するＣＡＲを、複数の腫瘍株ならびに正常組織および臓器からの初代細胞株に対して、広範に試験した。ｓｃＦｖの親和性の低下が、頑強な抗腫瘍有効性を維持しながら、ＣＡＲの治療指数を顕著に増加させることが判明した。
【１０６６】
次の物質および方法を、本実施例に記載する実験において使用した。
細胞株および初代ヒトリンパ球
ＳＫ−ＢＲ３、ＳＫ−ＯＶ３、ＢＴ−４７４、ＭＣＦ７、ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４６８、ＨＣＣ２２８１、ＭＤＡ−３６１、ＭＤＡ−４５３、ＨＣＣ−１４１９、ＨＣＣ−１５６９、ＵＡＣＣ−８１２、ＬｎＣａｐ、ＭＤＡ−１７５、ＭＣＦ−１０Ａ、ＨＣＣ３８およびＨＧ２６１細胞株をAmerican Type Culture Collectionから購入し、指示どおり培養した。７種の初代細胞株(ケラチン生成細胞、骨芽細胞、腎臓上皮性、肺動脈内皮細胞、肺動脈平滑筋、神経前駆細胞、ＣＤ３４＋富化ＰＢＭＣ)をPromocellから購入し、それらのプロトコールに従い培養した。初代リンパ球を、University of Pennsylvania Human Immunology Coreにより正常ドナーから単離し、Ｒ１０培地(１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０；Invitrogen)で培養した。初代リンパ球を、記載のとおり、ＣＤ３およびＣＤ２８刺激抗体で被覆したマイクロビーズ(Life Technologies, Grand Island, NY, Catalog)で刺激した(Barrett et al., 2009, Proc Nat Acad Sci USA, 106:3360)。Ｔ細胞を、９０％ウシ胎児血清および１０％ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)の溶液中、１×１０８細胞／バイアルで１０日目に凍結保存した。
【１０６７】
ｍＲＮＡエレクトロポレーションおよびレンチウイルス形質導入のためのＣＡＲ構築物産生
ＥｒｂＢ２またはＥＧＦＲに対するＣＡＲ  ｓｃＦｖドメインを、関連する刊行物(Carter et al., 1992, Proc Nat Acad Sci USA, 89:4285; Zhou et al., 2007, J Mol Bio, 371:934)により提供される配列情報に基づき、ＰＣＲにより合成および／または増幅し、ＣＤ８膜貫通ドメインおよび４−１ＢＢおよびＣＤ３Ｚ細胞内シグナル伝達ドメインに連結させ、ｐＧＥＭ.６４Ａ  ＲＮＡベースのベクター(Zhao et al., 2010, Cancer Res, 70:9053)またはｐＴＲＰＥレンチウイルスベクター(Carpenito et al., 2009, Proc Nat Acad Sci USA, 106:3360)にサブクローン化した。
【１０６８】
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
ビオチニル化ＥｒｂＢ２を、２００ＲＵの密度でストレプトアビジン被覆センサーチップに動員した。親４Ｄ５抗体の結合親和性(Carter et al., 1992, Proc Nat Acad Sci USA, 89:4285)を組み換えｓｃＦｖと比較した。ｓｃＦｖの純度および原子質量を液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリーにより確認した。ＳｃＦｖサンプルを３倍連続希釈し、一定流速でチップ上に注入した。タンパク質複合体の結合および解離速度を、それぞれ２７０秒および４００秒モニターした。二重参照をブランク固定化フローセルおよび緩衝液ブランクに対して行い、データを１：１  ラングミュアモデルまたは定常状態親和性を使用して、適宜Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを用いてフィットさせた。
【１０６９】
ｍＲＮＡインビトロ転写およびＴ細胞エレクトロポレーション
Ｔ７  ｍＳｃｒｉｐｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｋｉｔ(CellScript)を使用して、ＩＶＴ  ＲＮＡを産生した。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激Ｔ細胞を、先に記載のとおり(Zhao et al., 2010, Cancer Res, 70:9053)ＢＴＸ  ＥＭ８３０(Harvard Apparatus BTX)を使用してＩＶＴ  ＲＮＡで電気穿孔した。簡潔にいうと、Ｔ細胞を３回洗浄し、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ(Invitrogen)に最終濃度１〜３×１０８細胞／ｍｌで再懸濁させた。続いて、０.１ｍｌの細胞を１０μｇのＩＶＴ  ＲＮＡ(または指示のとおり)と混合し、２ｍｍキュベットで電気穿孔した。
【１０７０】
フローサイトメトリー分析
抗体を次の業者から得た：抗ヒトＣＤ３(BD Biosciences、555335)、抗ヒトＣＤ８(BD Biosciences 555366)、抗ヒトＣＤ１０７ａ(BD Biosciences 555801)、抗ヒトＣＤ１３７(BD Biosciences 555956)。ＥｒｂＢ２の細胞表面発現をビオチン化抗ＥｒｂＢ２アフィボディ(Abcam、ab31890)により検出し、ＥＧＦＲをＦＩＴＣ結合抗ＥＧＦＲアフィボディ(Abcam、ab81872)により検出した。ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲおよびＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞発現を、ＥｒｂＢ２−Ｆｃ融合タンパク質(R&D system、1129-ER)、ＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質およびビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスＦ(ａｂ)２抗体(Jackson Immunoresearch、115-066-072)でそれぞれ検出し、４℃で２５分インキュベートし、２回洗浄した(２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ)。次いで、サンプルをＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  Ａｂ(eBioscience、12-4998-82)またはフィコエリスリン標識ストレプトアビジン(eBioscience、17-4317-82)で染色し、４℃で２５分インキュベートし、１回洗浄した。フローサイトメトリー獲得をＢＤ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒまたはＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ(BD Biosciences)で行った。分析をＦｌｏｗＪｏソフトウェア(Treestar)を使用して実施した。
【１０７１】
ＥＬＩＳＡアッセイ
標的細胞を洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌでＲ１０培地(１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０；Invitrogen)に懸濁した。１００μｌの各標的細胞型を９６ウェル丸底プレート(Corning)にデュプリケートで添加した。エフェクターＴ細胞を洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌでＲ１０培地に再懸濁し、１００μｌのＴ細胞を、記載するウェルにおいて標的細胞と合わせた。さらに、Ｔ細胞単独を含むウェルを調製した。プレートを３７℃で１８〜２０時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイ(eBioscience、88-7316-77; 88-7025-77)に付した。
【１０７２】
ＣＤ１０７ａ染色
細胞を、９６ウェルプレート中、１：１のＥ：Ｔ(１×１０５エフェクター：１×１０５標的)で１６０μｌの完全ＲＰＭＩ培地に播種した。２０μｌのフィコエリスリン標識抗ＣＤ１０７ａ  Ａｂ(BD Biosciences、５５５８０１)を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、Ｇｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ(３ｍｌ  ＲＰＭＩ培地中２μｌのＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ、２０μｌ／ウェル；BD Biosciences、５１−２０９２ＫＺ)を添加し、さらに２.５時間インキュベートした。次いで５μｌのＦＩＴＣ−抗ＣＤ８および５μｌのＡＰＣ−抗ＣＤ３を添加し、３７℃で３０分インキュベートした。インキュベーション後、サンプルをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。
【１０７３】
ＣＦＳＥベースのＴ細胞増殖アッセイ
休息しているＣＤ４  Ｔ細胞を洗浄し、１×１０７細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁した。次いで１２０μｌのＣＦＳＥ作業溶液(２５μＭ  ＣＦＳＥ)を１×１０７細胞に３.５分、２５℃で添加した。５％ＦＢＳ(ＰＢＳ中)で標識を停止させ、５％ＦＢＳで２回洗浄し、１０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ２含有Ｒ１０で培養した。一夜培養後、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を、多様な親和性ＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  ＲＮＡで電気穿孔した。エレクトロポレーション２〜４時間後、Ｔ細胞を、１×１０６／ｍｌの濃度でＲ１０培地(１０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ２含有)に懸濁した。腫瘍またはＫ５６２細胞株を照射し、１×１０６／ｍＬでＲ１０培地に懸濁した。細胞を、４８ウェルプレート中、１：１のＥ：Ｔ(５×１０５エフェクター：５×１０５標的)で１ｍｌの完全ＲＰＭＩ培地に播種した。Ｔ細胞をついで計数し、３日目から２日毎に給餌した。ＣＦＳＥ希釈を、３日目、５日目および７日目にフローサイトメトリーでモニターした。
【１０７４】
ルシフェラーゼベースのＣＴＬアッセイ
Ｎａｌｍ６−ＣＢＧ腫瘍細胞を産生し、次のようなルシフェラーゼベースのＣＴＬアッセイの修飾バージョンに用いた：クリックビートル緑色ルシフェラーゼ(ＣＢＧ)をｐＥＬＮＳベクターにクローン化し、レンチウイルスに封入し、ＮＡＬＭ６腫瘍細胞に形質導入し、ＣＢＧ発現についてソートした。得られたＮａｌｍ６−ＣＢＧ細胞を洗浄し、１×１０５細胞／ｍｌでＲ１０培地に再懸濁し、１００μｌのＣＢＧ標識細胞を異なる比のＴ細胞(例えば３０：１、１５：１など)と、一夜、３７℃でインキュベートした。１００μｌの混合物を、９６ウェル白色ルミノメータープレートに移し、１００μｌの基質を添加し、発光を直ぐに決定した。
【１０７５】
マウス異種移植試験
試験を、先に記載のものを少し修飾して実施した(Barrett et al., 2011, Human Gene Therapy, 22:1575; and Carpenito et al., 2009, PNAS, 106:336)。簡潔には、６〜１０週齢ＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ｇａｍｍａ(ＮＳＧ)マウスに、１×１０６  ＰＣ３−ＣＢＧ腫瘍細胞を、右側腹部に０日目に皮下注射し、同じマウスにＳＫ−ＯＶ３−ＣＢＧ腫瘍細胞(５×１０６細胞／マウス、ｓ.ｃ.)を左側腹部に５日目に与えた。マウスに、両腫瘍が約２００ｍｍ３の体積となるように、ＰＣ３−ＣＢＧ腫瘍接種２３日目に尾静脈からＴ細胞で処置した。レンチウイルス形質導入Ｔ細胞を１×１０７細胞／マウス(１０Ｍ)または３×１０６細胞／マウス(３Ｍ)で与えた。ＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞を、最初の処置は５×１０７細胞／マウスで与え、続いて２６日目、３０日目および３３日目の３処置を１×１０７  ＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞／マウスの用量で与えた。
【１０７６】
結果
抗ＥｒｂＢ２  ｓｃＦｖの親和性低下は、インビトロでＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療指数を改善する
フローサイトメトリーで測定して広範なＥｒｂＢ２発現の一団の腫瘍株を収集した(図１)。ＳＫ−ＯＶ３(卵巣癌)、ＳＫ−ＢＲ３(乳癌)、ＢＴ−４７４(乳癌)はＥｒｂＢ２を過発現し、一方ＥＭ−Ｍｅｓｏ(中皮腫)、ＭＣＦ７(乳癌)、２９３Ｔ(胚性腎臓２９３細胞)、Ａ５４９(肺癌)、６２４ｍｅｌ(黒色腫)、ＰＣ３(前立腺癌)、ＭＤＡ２３１(乳癌)はＥｒｂＢ２を低レベルで発現し、ＥｒｂＢ２はＭＤＡ４６８(乳癌)では検出されない。ＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡレベルも実時間ＰＣＲで測定し、二つの技術の間に強い相関があった(図２)。
【１０７７】
一団のＥｒｂＢ２  ＣＡＲを、親４Ｄ５抗体の公開された変異由来のｓｃＦｖを使用して構築した(Carter et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289)。ＥｒｂＢ２に対するＣＡＲをコードする配列を表２に示す。
【表１２】
2019206538.tif 000040
【表１３】
2019206538.tif 000041
【１０７８】
【表１４】
2019206538.tif 000042
【表１５】
2019206538.tif 000043
【１０７９】
ＥｒｂＢ２  ｓｃＦｖの一価親和性は約３桁変わり(表３)、互いに１０倍内の結合親和性を保持する対応する変異体抗体と対照的であった(Carter, P., et al. 1992)。
【表１６】
2019206538.tif 000044
【１０８０】
ＣＡＲを、多様なｓｃＦｖをＣＤ８アルファヒンジおよび膜貫通ドメインと、続いて４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン連結することにより構築した。ＣＡＲを、レンチウイルスベクターテクノロジーまたはＲＮＡベースのベクターへのクローニングにより発現させた(Zhao et al., 2010, Cancer Res, 70:9053)。インビトロ転写およびＴ細胞へのエレクトロポレーションによるｍＲＮＡの産生後、一団の親和性修飾ＥｒｂＢ２  ＲＮＡ  ＣＡＲの表面発現は類似した(図３)。認識閾値を比較するために、一団のＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＥｒｂＢ２高発現腫瘍細胞株(ＳＫ−ＢＲ３、ＳＫ−ＯＶ３およびＢＴ−４７４)またはＥｒｂＢ２低発現腫瘍細胞株(ＭＣＦ７、２９３Ｔ、Ａ５４９、６２４Ｍｅｌ、ＰＣ３、ＭＤＡ２３１およびＭＤＡ４６８)で刺激し、Ｔ細胞活性化をＣＤ１３７の上方制御(４−１ＢＢ；図４)、ＩＦＮ−γの分泌(図５)、ＩＬ−２の分泌(図６)および表面ＣＤ１０７ａ発現の誘発(図７)により評価した。ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞は、同種反応性の対照として役立った。低親和性ＣＡＲ  Ｔ細胞(４Ｄ５−５および４Ｄ５−３)は、増幅されたＥｒｂＢ２発現を有する腫瘍と強く反応性であり、ＥｒｂＢ２を低レベルで腫瘍株には、検出不可能なまたは低い反応性であった。対照的に、高親和性ＣＡＲ  Ｔ細胞(４Ｄ５および４Ｄ５−７)は、ＣＤ１３７上方制御、サイトカイン分泌およびＣＤ１０７ａ転座により証明されるように、高および低レベルのＥｒｂＢ２を発現する腫瘍株に強い反応性を示した。これらの結果を、さらなるＥｒｂＢ２発現細胞株のアッセイにより広げた(図８および９)。興味深いことに、高親和性ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低レベルのＥｒｂＢ２を発現する標的に曝したとき高レベルのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌し、低親和性ＣＡＲ  Ｔ細胞は、高レベルの標的を発現する細胞に暴露したときよりサイトカインを分泌する(図５および６)。予想通り、ＣＤ１９−ＢＢζ  ＣＡＲはＥｒｂＢ２発現細胞株に対して反応性ではなかった。要約すると、高親和性４Ｄ５−ＢＢζ  Ｔ細胞は、試験した全ＥｒｂＢ２発現株により認識され、一方低親和性ｓｃＦｖ、４Ｄ５−５−ＢＢζまたは４Ｄ５−３−ＢＢζを有するＣＡＲは、ＥｒｂＢ２を過発現する全腫瘍株と高度に反応性であったが、低いまたは検出不可能なレベルのＥｒｂＢ２を発現する細胞株との反応性は無視できた。
【１０８１】
低親和性ｓｃＦｖを有するＥｒｂＢ２  ＣＡＲは、低いおよび高いレベルのＥｒｂＢ２を発現する腫瘍細胞を区別する
上記結果に貢献するはずであるあらゆる腫瘍特異的効果を除外するために、一団のＥｒｂＢ２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性を、多様なレベルのＥｒｂＢ２を発現する単一腫瘍株についてアッセイした(種々の量のＥｒｂＢ２  ＲＮＡで電気穿孔したＫ５６２細胞)。一致して、高親和性ｓｃＦｖ(４Ｄ５および４Ｄ５−７)を発現するＴ細胞が、フローサイトメトリーにより検出可能なレベルの０.１μｇ  ｍＲＮＡより１００倍低い０.００１μｇもの低用量のＥｒｂＢ２  ＲＮＡで電気穿孔したＫ５６２細胞を認識することが示された(図１０、１１Ａおよび１１Ｂ)。対照的に、低親和性ｓｃＦｖ(４Ｄ５−５および４Ｄ５−３)を有するＣＡＲは、０.５μｇ(４Ｄ５−５；１０)またはそれ以上の用量のＥｒｂＢ２  ＲＮＡで電気穿孔したＫ５６２しか認識せず、ＣＡＲ  Ｔ細胞感受性が、高親和性４Ｄ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して２０００倍(４Ｄ５−３)〜５００倍(４Ｄ５−５)低下したことを示した。さらに、低親和性ＥｒｂＢ２  ＣＡＲ(４Ｄ５−５および４Ｄ５−３；図１１Ａおよび１１Ｂ)で観察された抗原用量関連反応性は、ＣＦＳＥベースの増殖アッセイの実施により確認された(図１２)。興味深いことに、ＣＡＲ  ＲＮＡ用量の１／５への減少は(１０μｇ  ＲＮＡ／１００μｌ  Ｔ細胞から２μｇ  ＲＮＡ／１００μｌ  Ｔ細胞)、サイトカイン分泌で評価してさらに低および高親和性ＣＡＲを有するＴ細胞の抗原認識閾値を増加させ、Ｔ細胞表面上のＣＡＲ密度の微調整が、重要な変数であるか、または２μｇのｍＲＮＡを超える量が全体的Ｔ細胞活性にいくぶん毒性を有し得ることを示唆する。
【１０８２】
ルシフェラーゼベースの細胞溶解性Ｔ細胞(ＣＴＬ)アッセイを使用して、親和性を低下させたＣＡＲを有するＴ細胞が、ＥｒｂＢ２を低レベルで発現する細胞を回避しながら、ＥｒｂＢ２過発現標的に対する強力な死滅活性を維持するか否かを決定した。Ｎａｌｍ６標的細胞を１０μｇ  ＥｒｂＢ２  ＲＮＡでトランスフェクトしたとき、高または低親和性ＥｒｂＢ２  ＣＡＲを有するＴ細胞は、効率的に標的細胞を溶解した(図１３Ａ)。高親和性ｓｃＦｖ(４Ｄ５および４Ｄ５−７)を有するＣＡは、１μｇ  ＥｒｂＢ２  ＲＮＡでトランスフェクトした標的細胞に強力な溶解性活性を示したが、低親和性ｓｃＦｖ(４Ｄ５−５および４Ｄ５−３)は死滅活性の低下を示した(図１３Ｂ)。最後に、高親和性ｓｃＦｖを有するＣＡＲのみが、０.１μｇ  ＥｒｂＢ２  ＲＮＡでエレクトロポレーションした後、極低量の標的を発現する標的細胞を殺すことができた(図１３Ｃ)。Ｎａｌｍ６がＣＤ１９陽性細胞株であるため、ＣＡＲＴ１９は、トランスフェクトしたＥｒｂＢ２  ＲＮＡのレベルと無関係に細胞溶解性活性を維持した。これらのデータは、ＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の親和性微調整が、ＥｒｂＢ２過発現腫瘍の、ＥｒｂＢ２発現が低レベルであるまたは検出不可能である腫瘍細胞からの鑑別を増強する。
【１０８３】
親和性を低下させたＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、生理学的レベルのＥｒｂＢ２の認識ができない
親４Ｄ５トラスツズマブ抗体からのｓｃＦｖを取り込んだ高親和性ＥｒｂＢ２  ＣＡＲの投与により生じる先の重篤な有害事象を考慮して(Morgan et al., 2010, Mol Therapy, 18:843)、親和性を低下させたＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の生理学的レベルのＥｒｂＢ２発現への反応性の可能性を評価することは最重要である。これに取り組むため、異なる臓器から単離した７種の初代細胞株を、ＥｒｂＢ２発現について試験した。初代株の大部分は検出可能なレベルの表面ＥｒｂＢ２を有し、神経前駆細胞株が、最高レベルのＥｒｂＢ２を発現した(図１４)。高親和性４Ｄ５  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＤ１０７ａレベルの上方制御により証明されるように、試験した全初代株に強く反応性であった(図１５)。しかしながら、親和性を低下させたＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  ４Ｄ５−５および４Ｄ５−３を発現するＴ細胞は、神経前駆細胞株への弱い反応性以外、初代株に反応性がなかった。これらの結果を、フローサイトメトリーにより低いまたは検出不可能なレベルのＥｒｂＢ２を有する細胞株の大きな一団の分析により確認した(図８および９)。
【１０８４】
レンチウイルス形質導入またはＲＮＡエレクトロポレーションを使用して発現される親和性調整ＥｒｂＢ２  ＣＡＲでの同等な効果
レンチウイルス形質導入により永続的にＣＡＲを発現するＴ細胞と、ｍＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲ  Ｔ細胞の同等性を確立するために、一団の親和性調整ＣＡＲを、レンチウイルス形質導入またはｍＲＮＡエレクトロポレーションのいずれかを使用して、同じ正常ドナーからのＴ細胞に発現させた(図１６Ａ)。Ｔ細胞を腫瘍細胞株(図１６Ｂ)または種々の量のＥｒｂＢ２を発現するＫ５６２細胞(図１６Ｃ)で刺激した。ＣＡＲ  Ｔ細胞認識および活性化を、ＣＤ１０７ａ上方制御(図１７および１８)、ＣＤ１３７上方制御(図１９)およびＩＦＮ−γ分泌(図２０および２１)によりモニターした。先のＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞結果に一致して、高親和性ＣＡＲを構成的に発現するＴ細胞は、ＥｒｂＢ２を発現する全細胞株と強い反応性を示し、抗原発現レベルとＴ細胞活性の間に相関関係は見られなかった。対照的に、レンチウイルステクノロジーにより発現される低親和性ＣＡＲを有するＴ細胞は、標的抗原発現と活性化の間に確固たる相関関係があった(図１７、１８、２０および２１)。これらの結果は、ＥｒｂＢ２抗原認識の感受性がｍＲＮＡ電気穿孔およびレンチウイルス形質導入ＣＡＲ  Ｔ細胞の両者で使用したｓｃＦｖ親和性に依存的であることを確認する。
【１０８５】
親和性を低下させたＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、インビボで腫瘍を除き、生理学的レベルのＥｒｂＢ２を発現する組織を無視する
上記インビトロ結果を広げるために、一連の実験を、進行型血管新生化腫瘍異種移植したＮＳＧマウスで実施した。図１における上記データに基づき、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫ−ＯＶ３を、代表的ＥｒｂＢ２過発現腫瘍として選択し、ヒト前立腺癌株であるＰＣ３を、正常組織ＥｒｂＢ２レベルのモデルのために選択した。ＮＳＧマウスにおける高親和性４Ｄ５  ｓｃＦｖまたは低親和性４５Ｄ−５  ｓｃＦｖのいずれかを発現するＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍有効性を、確立された側腹部ＳＫ−ＯＶ３腫瘍で１８日目に比較した(図２２)。連続的バイオルミネセンス造影は、高および低親和性ＣＡＲ  Ｔ細胞の両者が、腫瘍の迅速な除去をもたらすことを確認した。
【１０８６】
インビボで低親和性ＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療指数をさらに評価するために、マウスモデルを、高親和性(４Ｄ５：ＢＢζ)および低親和性(４Ｄ５−５：ＢＢζ)ＥｒｂＢ２  ＣＡＲの有効性および正常組織毒性を同時に比較するために設計した。ＳＫ−ＯＶ３およびＰＣ３腫瘍細胞株を、同じＮＳＧマウスの逆の側腹部に皮下注射し、腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したとき、Ｔ細胞を投与した。マウスに、２２日目に３×１０６または１×１０７  ＣＡＲ  Ｔ細胞を注射し(ｉ.ｖ.)、連続的バイオルミネセンス造影および腫瘍サイズ評価を実施した。ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかの用量で処置されたマウスは、ＥｒｂＢ２過発現ＳＫ−ＯＶ３腫瘍のほぼ完全な退縮を示した(図２３、２４および２５)。さらに、ＥｒｂＢ２を低レベルで発現する逆の側腹部のＰＣ３腫瘍のほぼ完全な退縮も、高親和性４Ｄ５ベースのＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスで観察された。対照的に、ＰＣ３の進行性の腫瘍増殖が低親和性４Ｄ５−５ベースのＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスで観察され、低親和性ＣＡＲ  Ｔ細胞がＥｒｂＢ２過発現腫瘍に有効であるが、生理学的レベルでＥｒｂＢ２を発現する細胞に対する反応性は限定的であるかまたは検出可能ではないことが示された。さらに、選択的腫瘍除去が、高および低用量のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスの両者で観察された。上記効果は、両腫瘍の進行性の腫瘍増殖が、偽形質導入Ｔ細胞で処置したマウスで観察されたため、非自己認識によるものではなかった。
【１０８７】
ｓｃＦｖの親和性調整は、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療指数を増加させる
ｓｃＦｖの親和性を微調整する戦略の広い適応性を試験するために、我々は、一団のＥＧＦＲ  ＣＡＲを試験した。ＥＧＦＲ：ＢＢζ  ＣＡＲを、親ヒト抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ１０由来のｓｃＦｖから構築した(Heitner et al., 2001, J Immunol Methods, 248:17-30)。ＥＧＦＲ  ＣＡＲをコードする核酸配列を表４に提供する。
【１０８８】
【表１７】
2019206538.tif 000045
【表１８】
2019206538.tif 000046
【表１９】
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【１０８９】
一団のＥＧＦＲ特異的ｓｃＦｖの一価親和性は、約３００倍の範囲で変化した(Zhoe et al., 2007, J Mol Biol, 371:934)。２２２４、Ｐ２−４、Ｐ３−５およびＣ１０  ｓｃＦｖを、ＲＮＡベースのベクターにクローン化し、Ｔ細胞ｍＲＮＡエレクトロポレーションのためにインビトロ転写した。ＣＡＲ表面発現レベルをアッセイし、ＥＧＦＲ構築物間で類似することが判明した(図２６Ａ)。一団のＥＧＦＲ  ＣＡＲの反応性を比較するために、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、細胞表面に広範なＥＧＦＲ発現を有するＥＧＦＲ発現腫瘍細胞株で刺激した(図２６Ｂ)。ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化を、ＣＤ１０７ａレベルの上方制御により評価し、データを図２７に要約する。高親和性ＥＧＦＲ  ＣＡＲ(２２２４：ＢＢζおよびＰ２−４：ＢＢζ)は、ＥＧＦＲ発現レベルと無関係に全ＥＧＦＲ陽性腫瘍株(ＭＤＡ４６８、ＭＤＡ２３１およびＳＫ−ＯＶ３)と反応した(図２７)。しかしながら、ＥＧＦＲ発現腫瘍株に対して低親和性ＥＧＦＲ  ＣＡＲ(Ｐ３−５.ＢＢＺおよびＣ１０.ＢＢＺ)により示される反応性は、ＥＧＦＲ発現レベルと相関しなかった。さらに、低親和性ＥＧＦＲ  ＣＡＲは、高親和性ＥＧＦＲ  ＣＡＲよりも強力な反応性をＥＧＦＲ過発現腫瘍、ＭＤＡ４６８に示し、同時にＥＧＦＲ低発現細胞に対してはるかに弱い応答を惹起した(図２７)。ＥＧＦＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞いずれもＥＧＦＲ陰性腫瘍株Ｋ５６２と反応しなかった。
【１０９０】
応答のレベルがｓｃＦｖ親和性およびＥＧＦＲ発現レベルと関連するを確認し、腫瘍特異的効果を排除するために、一団のＥＧＦＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡでのエレクトロポレーション後、種々のレベルのＥＧＦＲを発現するＫ５６２細胞と共培養した(図２８)。高親和性ＥＧＦＲ  ＣＡＲは、異なるレベルでＥＧＦＲを発現する標的細胞を区別できなかった(図２９)。例えば、ＣＡＲ  ２２２４を発現するＴ細胞は、２００倍異なる(０.１μｇ対２０μｇ)ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＫ５６２細胞と等しく良好に応答した。いずれにしても上記ＥｒｂＢ２  ＣＡＲ結果に一致して、低親和性ＥＧＦＲ  ＣＡＲ(Ｐ３−５およびＣ１０)は、Ｔ細胞応答とＥＧＦＲ発現レベルの高い相関を示し、データを図２９に要約する。
【１０９１】
低親和性ＥＧＦＲ  ＣＡＲの増加した安全性プロファイルを確認するために、我々は、異なる臓器由来の初代細胞に対するＥＧＦＲ  ＣＡＲの反応性を試験した。５種の初代細胞株および５種の腫瘍細胞株を、ＥＧＦＲの表面レベル(図３０)およびＣＡＲ  Ｔ細胞反応性を誘発する能力(図３１)について試験した。試験した初代細胞株のうち３種が検出可能なレベルのＥＧＦＲを発現し、２種は発現しなかった(肺動脈平滑筋およびＰＢＭＣ)。腫瘍細胞株のうちの２種(ＭＣＦ７およびＲａｊｉ)は、細胞表面に検出可能なＥＧＦＲを発現しなかった。ＥＧＦＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の比較において、高ＥＧＦＲ親和性ＣＡＲ(２２２４およびＰ２−４)を有するＴ細胞は、試験した全初代株およびＲａｊｉ以外の全腫瘍に反応性であった(図３１)。しかしながら、親和性を低下させたＥＧＦＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞Ｐ３−５およびＣ１０を有するＴ細胞は、試験した５種の初代細胞のいずれとも反応しなかった(図３１)。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＤ１９＋株ＲａｊｉおよびＰＢＭＣ株、恐らく、ＰＢＭＣ中のＢ細胞に応答したが、腫瘍株または他の初代細胞株のいずれとも応答しなかった。これらのデータは、ｓｃＦｖの親和性調整が、ＥｒｂＢ２またはＥＧＦＲのいずれかを標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞についての治療指数を増加させることを示す。
【１０９２】
考察
ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性が、一部腫瘍対正常組織における標的抗原の差次的発現により指示される。上記結果は、既知重篤標的上毒性を有するＣＡＲを、親和性調整により再操作でき、毒性を排除または減少しながら強力なインビボ有効性を維持することを示す。特に、トラスツズマブに基づく４Ｄ５  ＣＡＲは、心肺組織において発現される生理学的レベルのＥｒｂＢ２の認識により(Press et al., 1990, Oncogene, 5:953)、致死的毒性を有した(Morgan et al., 2010, Mol Ther, 18:843)。ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるｓｃＦｖのＫＤの２〜３ログの減少により、治療指数における実質的な改善がＥｒｂＢ２およびＥＧＦＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で示された。低親和性ｓｃＦｖを有するＣＡＲ  Ｔ細胞は、高親和性ＣＡＲと比較して同等に頑強な抗腫瘍活性をＥｒｂＢ２過発現腫瘍に対して示すが、生理学的レベルのＥｒｂＢ２に対してほとんど反応性を示さない。
【１０９３】
Ｂ細胞系譜抗原ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的なＣＡＲは、多様な群により試験されており、Ｂ細胞悪性腫瘍における強力な有効性が示されている(Maus et al., 2014, Blood, 123:2625)。しかしながら、固形腫瘍において、ＥＧＦＲｖiiiのような腫瘍特異的アイソフォームを例外として(Morgan et al., 2012, Human Gene Therapy)、標的上毒性は、ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する重い制限であると予測されている。この制限は、数桁異なる抗体ベースの治療と比較して、ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する標的感受性の低い制限のために、完全抗体または抗体薬物コンジュゲートを使用する抗体治療よりも、ＣＡＲでより重いと予測される。ＥｒｂＢ２またはＥＧＦＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔した標的細胞を使用する本試験は先の試験と一致し、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、約１００標的／細胞を有する腫瘍細胞を認識できる(Stone et al., 2012, Oncoimmunology, 1:863)。対照的に、ＥｒｂＢ２の増幅が初代ヒト乳癌の約２０％〜２５％で起こり、概して＞百万コピー／細胞でＥｒｂＢ２タンパク質の過発現をもたらす(Robertson et al., 1996, Cancer Res, 56:3823; and Vogel et al., 2002, J Clin Oncol, 20:719)。現時点で、入手可能なデータは、ＥｒｂＢ２指向性治療に難治性となったとき、癌細胞はＥｒｂＢ２発現を失わないことが示される(Ritter et al., 2007, Clin Cancer Res, 13:4909)。
【１０９４】
これらの知見はChmielewski(Chmielewski et al., 2004, J Immunol, 173:7647)の先の研究を支持し、高親和性ＣＡＲが、高または低標的発現レベルの標的細胞をあまり鑑別しないことを示唆する。しかしながら、本結果は、Chmielewskiらのとは、彼らの報告では、高親和性ＣＡＲ(１５ｐＭ〜１６ｎＭ範囲のＫＤ)のいずれもがＥｒｂＢ２を低レベルで発現する細胞と反応性ではなく、増幅ＥｒｂＢ２を有する腫瘍のみを認識する低親和性ＣＡＲが、高親和性ＣＡＲと比較してＴ細胞有効性の実質的な減少を示す点で異なる。対照的に、０.３ｎＭのＫＤを有する４ＤＦ５  ｓｃＦｖを使用したＥｒｂＢ２  ＣＡＲは、インビトロおよび侵襲性マウス腫瘍モデルの両者において、ケラチン生成細胞および検出可能なレベルの１／１００である極低量のＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞株と強く反応性であり、親和性調整ＣＡＲ  Ｔ細胞は、高親和性ＣＡＲと少なくとも同程度強力な反応性をＥｒｂＢ２増幅腫瘍に対して保持することが判明した。これらの差異を説明するいくつかの変数は、異なるエピトープを認識し得る異なるｓｃＦｖの使用(Ｃ５.６対４Ｄ５)、Ｔ細胞上のＣＡＲ表面発現レベルに影響する異なるＣＡＲシグナル伝達ドメイン配置(ゼータ単独対４−１ＢＢ−ゼータ)および異なる遺伝子移入手法(レトロウイルス形質導入対ＲＮＡエレクトロポレーションまたはレンチウイルス形質導入)を含む。まとめると、これは、関連する臨床状況においてＣＡＲの親和性を選択するときに、これらの因子の各々をを考慮すべきであることを示唆する。
【１０９５】
本実施例に記載する知見は、また、特定の腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)をターゲティングするＣＡＲの正確な親和性の重要性も証明する。インビトロおよびインビボ結果は互いに一致し、低親和性を有するＣＡＲは、高親和性ＣＡＲ(レンチウイルス形質導入およびＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲ  Ｔ細胞の両者)と少なくとも同程度強力なであるが、正常組織を表すＴＡＡ(ＥｒｂＢ２)を低発現する細胞への影響は最小であることを示す。対照的に、高親和性を有するＣＡＲは、正常組織を現す低発現ＴＡＡ細胞により反応性であった。それゆえに、高親和性を有するＣＡＲは、これらの結果が高親和性を有するＣＡＲが正常組織も標的とし得て、それゆえに有害副作用を生じるであろうことを証明するため、ＴＡＡが正常組織にも発現される癌に対して好ましくないであろう。まとめると、これらの結果は、ＣＡＲの親和性を、効力および安全性の理由により、癌の性質(例えば、ＴＡＡが癌細胞のみに発現されるかまたはＴＡＡが癌細胞で高レベルで発現されるが、正常組織でも低レベルで発現されるか)に関して考慮すべきであることを示す。
【１０９６】
より強力な養子移入戦略の出現は、弱い免疫治療的戦略を使用して、以前は安全と見なされていた標的の再評価を促している(Hinrichs et al., 2013, Nature Biotechnology, 31:999)。ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療指数を最大化するための戦略は、標的選択、ＣＡＲ設計、細胞製造および遺伝子移入技術を含む。親和性調整に加えて、標的上毒性の管理のために開発されている他の戦略は、デュアルＣＡＲ  Ｔ細胞手法(Kloss et al., 2013, Nat Biotech, 31:999;およびLanitis et al., 2013, Cancer Immunol Res, 1:43)、条件付き欠失および自殺系(Di Stasi et al., 2011, NEJM, 365:1673;およびWang et al., 2011, Blood, 118:1255)および一過性発現および自己限定的毒性を有するｍＲＮＡ  ＣＡＲを有するＴ細胞の反復注入(Beatty et al., 2014, Cancer Immunol Res, 2:112)の使用を含む。
【１０９７】
これらの結果は、親和性調整がＥｒｂＢ２およびＥＧＦＲに対する治療指数を増加できることを示す。ｓｃＦｖ親和性に加えて、他の標的に対する治療指数の増加のために試験を必要とする他の変数は、標的エピトープの位置、ヒンジの長さおよびシグナル伝達ドメインの性質を含む(Hudecek et al., 2013, Clin Cancer Res, 15:5323;およびGuedan et al., 2014, Blood, 124:1070)。
【１０９８】
要約すると、ＥｒｂＢ２およびＥＧＦＲは、先に、ＣＡＲ  Ｔ細胞に対して創薬が困難な標的と考えられていた。ＥｒｂＢ２およびＥＧＦＲの発現の調節不全が、しばしば乳、神経膠芽腫、肺、膵臓、卵巣、頭頸部扁平上皮細胞癌および結腸癌を含む複数のヒト癌で生じることを考慮して、これらの知見は、相当な臨床的重要性を有する。この親和性調整戦略は、確認された標的に対するＣＡＲの安全性プロファイルおよび臨床結果を改善するだけでなく、状況を標的上毒性のためにＣＡＲ  Ｔ細胞では先に創薬が不可能であった標的に対して広げる可能性を有する。より一般的に、これらの知見は、親和性調整が、安全かつより強力なＣＡＲを、多様な一般的癌に対する親和性を低下させたｓｃＦｖを用いることにより設計できることを示唆する。
【１０９９】
実施例５：高齢者における免疫老化に対するｍＴＯＲ阻害の効果
加齢と最も明確に結びついている経路の一つは、ｍＴＯＲ経路である。ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンがマウスで寿命を延長し、高齢マウスで多様な加齢関連状態を改善することが示されている(Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395; Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682;およびFlynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862)。それゆえに、これらの知見は、ｍＴＯＲ阻害剤がヒトにおける加齢および加齢関連状態に有益な効果を有し得ることを示す。
【１１００】
短い臨床試験時間枠で試験できる年齢関連表現型は免疫老化である。免疫老化は、感染に対する感受性の増加およびインフルエンザワクチン接種を含むワクチン接種に対する応答の減少に至る、高齢者で生じる免疫機能の減少である。年齢による免疫機能の減少は、造血幹細胞(ＨＳＣ)がナイーブリンパ球を産生する能力の減少および抗原刺激に対する応答が不完全な疲弊したＰＤ−１陽性リンパ球数の増加を含む、免疫欠損の蓄積による(Boraschi, D et al. (2013) Sci. Transl. Med.5:185ps8; Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798; and Shimatani, K et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15807-15812)。高齢マウスでの試験は、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンでの６週間の処置がＨＳＣ機能を若返らせ、ナイーブリンパ球産生増加、インフルエンザワクチン接種に対する応答改善および寿命延長に至ることを示した(Chen, C et al. (2009) Sci. Signal. 2:ra75)。
【１１０１】
ヒト加齢関連表現型に対するｍＴＯＲ阻害の効果およびｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が免疫老化を軽減するかを評価するために、ＲＡＤ００１またはプラセボを投与された高齢ボランティアにおけるインフルエンザワクチンに対する応答を評価した。ここに示す知見は、ＲＡＤ００１が、十分耐容性である用量で高齢ボランティアのインフルエンザワクチンに対する応答を増強したことを示唆する。ＲＡＤ００１はまた年齢とともに蓄積されるプログラム死(ＰＤ)−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔリンパ球のパーセンテージも減少させた。これらの結果は、ｍＴＯＲ阻害が高齢ボランティアにおける免疫老化に有益な効果を有することを示す。
ここに記載するとおり、ラパマイシン類似体であるｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１での６週間処置は、高齢ヒトボランティアにおけるインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善した。
【１１０２】
方法
研究集団
不安定な基礎疾患のない６５歳以上の高齢ボランティアが、ニュージーランドおよびオーストラリアの９箇所で参加した。スクリーニング時の除外基準はヘモグロビン＜９.０ｇ／ｄＬ、白血球数＜３,５００／ｍｍ３、好中球数＜２,０００／ｍｍ３または血小板数＜１２５,０００／ｍｍ３、未管理の糖尿病、不安定虚血性心疾患、臨床的に顕著な基礎肺疾患、免疫不全の病歴または免疫抑制性治療歴、凝固障害の病歴または長期抗凝固を必要とする  医学的状態、概算糸球体濾過速度＜３０ｍｌ／分、重度の未管理高コレステロール血症(＞３５０ｍｇ／ｄＬ、９.１ｍｍｏｌ／Ｌ)または高トリグリセリド血症(＞５００ｍｇ／ｄＬ、５.６ｍｍｏｌ／Ｌ)の存在を含んだ。
【１１０３】
処置アーム間のベースライン個体群統計学は類似した(表４)。２１８名の参加対象中、２１１名が治験を終了した。７名は治験を中止した。５名は有害事象(ＡＥ)が原因であり、１名は同意の上中止し、１名はプロトコール違反の結果、治験を去った。
【表２０】
2019206538.tif 000048
＊肥満度指数は、身長(ｍ)の二乗で除した体重(ｋｇ)である
【１１０４】
治験設計および遂行
２０１１年１２月から２０１２年４月まで、２１８名の高齢ボランティアが、無作為化、観察者盲検化、プラセボ対照試験に参加した。対象を、各処置アームにおけるＲＡＤ００１対プラセボ比５：２で、検証された自動化無作為化系を使用して処置アームに無作為化した。処置アームは
ＲＡＤ００１  ０.５ｍｇ連日またはプラセボ
ＲＡＤ００１  ５ｍｇ毎週またはプラセボ
ＲＡＤ００１  ２０ｍｇ毎週またはプラセボ
であった。
【１１０５】
ＲＡＤ００１  ０.５ｍｇ連日および２０ｍｇ毎週コホートにおけるプラセボがこれらのコホートにおけるＲＡＤ００１錠剤とわずかに異なったため、本治験は観察者盲検であった。対象を評価する治験職員は治験薬物を見ておらず、それゆえに完全に盲検式であった。全コホートの処置期間は６週間であり、その間、対象は２週間毎に診療所での安全性評価を受けた。対象が４週間投与された後、ＲＡＤ００１定常レベルを投与前および投与１時間後に測定した。６週間コースの治験薬完了後、対象はＲＡＤ００１が誘発した可能性のある免疫抑制から回復するために２週間休薬させ、その後株Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２  Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８を含む２０１２年季節性インフルエンザワクチンを接種した(Ａｇｒｉｐｐａｌ(登録商標), Novartis Vaccines and Diagnostics, Siena, Italy)。インフルエンザワクチン接種４週間後、対象から血清を採取し、インフルエンザ力価を測定した。３種のインフルエンザワクチン株ならびに２種の異種株(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に対する抗体力価を、標準血球凝集阻害アッセイにより測定した(Kendal, AP et al. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention B17-B35)。Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９特異的ＩｇＧおよびＩｇＭレベルを、先に記載のとおりインフルエンザワクチン接種前および４週間後に測定した(Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335)。結果を蛍光強度として表した。
【１１０６】
全ての対象にインフォームド・コンセント書類を渡した。治験は、医薬品の臨床試験の実施の基準の原則に従い、適切な倫理委員会および規制当局に承認された。
【１１０７】
安全性
有害事象評価ならびに血液学的および生化学的安全性評価のための採血は、来院日に実施した。有害事象情報は、対象が治験薬を受けている６週間の間、家で記載した日記からも集めた。全有害事象データを、インフォームド・コンセント時から最後の来院日から３０日後まで集めた。事象は治験医により軽度、中程度または重度と分類された。
【１１０８】
統計解析
幾何平均力価比の一次解析を、無情報事前分布を用いる正規ベイズ回帰モデルを使用して行った。このモデルを、対数尺度で各抗体力価に適合させた。各モデルの主要評価項目は８４日目測定値であった。６３日目測定値をアウトカムベクターに包含させた。モデルを、先のステートメントと混ぜたＳＡＳ  ９.２  ｐｒｏｃを使用してフィットさせた。マトリクス共分散構造は、非構造化(選択肢タイプ＝ＵＮ)として考慮した。平らである事前分布を使用した。抗体陽転率の二次解析のために、ロジスティック回帰を使用した。
治療企図集団は、少なくとも１回の完全用量の治験薬を投与され、有効性データに影響する重大なプロトコール逸脱がない全対象と定義された。治験に参加した２１８名の対象中１９９名治験が治療企図集団であった。
【１１０９】
免疫表現型検査
末梢血単核細胞を、ベースライン、６週間の治験薬処置後および対象が６週間治験薬物から離れており、インフルエンザワクチン接種した４週間後である治験の最後の３時点に採血した全血から単離した。７６ＰＢＭＣサブセットを、先に記載されたように、Human Immune Monitoring Center at Stanford University, CA, USAで８色免疫表現型検査パネルを使用したフローサイトメトリーにより解析した(Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200)。７６ＰＢＭＣサブセットを、８色凍結乾燥免疫表現型検査パネルを使用するフローサイトメトリーにより解析した(BD Lyoplate、BD Biosciences, San Diego, CA)。生存能＞８０％および２×１０６細胞を超える収量のＰＢＭＣサンプルを解析に入れた。
【１１１０】
ベースラインから治験薬処置６週目までおよびベースラインから治験の最後(１２週目)までの免疫表現型の相対的変化を、各ＲＡＤ００１投薬コホートで計算した。スチューデントＴ検定を行い、ベースラインから２回の採血時点までの免疫表現型の相対的変化が、それぞれ、プラセボ効果について調整した後、各投与群内で０とは有意に異なるかを試験した。処置効果解析における欠損値補完は行わなかった。それゆえに、患者がベースラインで表現型データ欠損があるとき、この患者は、この表現型の解析を行わなかった。患者の６週目または１２週目の表現型データが欠損しているとき、この患者は、影響する時点でのこの表現型の解析に貢献しなかった。
【１１１１】
３投薬群下の７６表現型の６０８試験を行い、プラセボ効果に対する処置効果を比較した。層別化偽発見率(ＦＤＲ)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した。細胞型群を層別因子として取り、各層内のＦＤＲ(ｑ値)計算をそれぞれ行った。全帰無仮説は、対応するｑ値≦０.１の０.０５有意水準で棄却された。０.０５有意水準および対応するｑ＜０.１で棄却される複数試験調節戦略は、結果の１０％未満が偽であることを確実にした。
【１１１２】
第二の解析において、免疫表現型は、全３のＲＡＤ００１投薬群を合わせたプールした処置群とプラセボ群で変化する。どの免疫表現型変化が処置群とプラセボ群を区別するかを決定するために、各測定した表現型の患者内細胞数比を、ベースラインと治験薬処置６週目およびベースラインと治験終了時(１２週目)で計算した。比を対数変換し、プールした処置およびプラセボ群の間の差異を検出するために、各時点の共分散の解析により分析した。７６表現型の１５２試験を実施して、プラセボ効果に対するプールした処置効果を比較した。層別化偽発見率(ＦＤＲ)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した(Benjamini, Y. et al. (1995) J. Roy. Statist. 57:289-300; and Sun, L. et al. (2006) Genet. Epidemiol. 30:519-530)。細胞型群を層別因子として取り、ＦＤＲ(ｑ値)計算を、それぞれ各層内で実施した。０.０５有意水準およびｑ値２０％未満での全帰無仮説は棄却された。これは、０.０５未満のＰ値および各観察された有意な結果が複数試験によるものである２０％未満の確率のみを棄却すると解釈できる。
【１１１３】
結果
一般に、ＲＡＤ００１は、特に０.５ｍｇ連日および５ｍｇ毎週投与レジメンで良好な耐容性であった。治験中に死亡例はなかった。３名の対象は、ＲＡＤ００１と無関係であると評価された４つの重篤な有害事象(ＳＡＥ)を経験した。４つのＳＡＥは、先に６週間５ｍｇ毎週ＲＡＤ００１の６週のコースを完了していた正常血小板数の対象の左眼の網膜出血とその後の失明；プラセボ処置対象における重度の背部痛およびプラセボ処置対象における重度の胃腸炎であった。あらゆる処置群における発生率＞２％の処置関連有害事象(ＡＥ)の一覧を表５に提供する。最も一般的なＲＡＤ００１関連ＡＥは、大部分の症例で、軽度であった口腔内潰瘍であった。全体的に、ＲＡＤ００１を投与された対象と、プラセボ処置対照の重度のＡＥ発生率は類似した。１つの重度のＡＥのみがＲＡＤ００１と関連すると評価され、２０ｍｇ毎週ＲＡＤ００１処置対象の口腔内潰瘍であった。
【１１１４】
【表２１】
2019206538.tif 000049
【１１１５】
ＲＡＤ００１が高齢ボランティアにおける免疫機能を改善する能力を、２０１２年の季節性インフルエンザワクチンに対する血清学的応答を測定することにより評価した。３種のインフルエンザワクチン株の各々に対するベースラインおよびインフルエンザワクチン接種４週間後の血球凝集阻害(ＨＩ)幾何平均力価(ＧＭＴ)を表６に示す。一次解析変数は、ＨＩ  ＧＭＴ比(ワクチン接種４週間後／ベースライン)であった。治験を、少なくとも３種のインフルエンザワクチン株中２種において、１)プラセボに対して相対的に≧１.２倍ＧＭＴ；および２)８０％以上が、１を超えるプラセボ補正ＧＭＴ比である事後確率の存在を証明できるように強化した。このエンドポイントは、ＭＦ−５９ワクチンアジュバントにより誘発されるインフルエンザＧＭＴ比の１.２倍増加がインフルエンザ疾病の減少と関連するために、選択した(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect 133:687-693)。
【１１１６】
【表２２】
2019206538.tif 000050
ベースラインは、インフルエンザワクチン接種２週間前を示す
４週目はインフルエンザワクチン接種４週間後を示す
Ｎはコホートあたりの対象数である
ＧＭＴは幾何平均力価である
ＧＭＴ比は、ワクチン接種４週目のＧＭＴ／ベースラインのＧＭＴである
ＣＶ％は、変動係数を示す
【１１１７】
治療企図(ＩＴＴ)集団において、高用量(２０ｍｇ毎週)コホートではなく、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１(０.５ｍｇ連日または５ｍｇ毎週)コホートが、治験の主要評価項目に合った(図４１Ａ)。これは、低用量でＲＡＤ００１の異なる免疫調節機構が存在し、高用量で、ｍＴＯＲ阻害の既知免疫抑制性効果が発揮されるようになる可能性を示す。さらに、本結果は、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１処置後の高齢者における免疫機能の改善傾向を示唆する。
サブグループ解析において、低ベースラインインフルエンザ力価(≦１：４０)のサブセットの対象は、ＩＴＴ集団より高い力価のＲＡＤ００１関連増加を経験した(図４１Ｂ)。これらのデータは、ＲＡＤ００１が、ベースラインで予防的(＞１：４０)力価を有さず、それゆえにインフルエンザ疾病の最高のリスクにある対象のインフルエンザワクチン応答の増強に特に有効であることを示す。
【１１１８】
ＲＡＤ００１濃度対各インフルエンザワクチン株に対する力価増加の散布図は、逆暴露／応答相関を示す(図４２)。Ｓ６キナーゼ(Ｓ６Ｋ)のｍＴＯＲ介在リン酸化に基づくモデリングおよびシミュレーションは、２０ｍｇ毎週投与レジメンがｍＴＯＲ介在Ｓ６Ｋ活性をほぼ完全に阻止し、５ｍｇ毎週投与レジメンはＳ６Ｋ活性を５０％を超えて阻止し、０.５ｍｇ連日投与レジメンは、Ｓ６Ｋリン酸化を投与の合間に約３８％まで阻止することを予測する(Tanaka, C et al. (2008) J. Clin. Oncol 26:1596-1602)。それゆえに、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１での、部分的ｍＴＯＲ阻害、例えば、ｍＴＯＲ介在Ｓ６Ｋリン酸化阻害は、高齢者の免疫応答の増強における高用量ＲＡＤ００１でのほぼ完全なｍＴＯＲ阻害よりも有効ではないにしても、有効であり得る。
【１１１９】
インフルエンザワクチン接種４週間後の抗体陽転率も評価した。抗体陽転は、ワクチン接種前力価陰性(すなわち、ＨＩ力価＜１：１０)から、ワクチン接種後ＨＩ力価≧１：４０への変化または非陰性(≧１：１０)ワクチン接種前ＨＩ力価からの少なくとも４倍増加として定義された。治療企図集団、Ｈ３Ｎ２およびＢ株への抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で増加したが、該増加は統計的有意性には合わなかった(表７)。ベースラインインフルエンザ力価≦１：４０の対象の亜集団において、ＲＡＤ００１処置はまたＨ３Ｎ２およびＢ株に対する抗体陽転率を増加させ、これらの結果は、０.５ｍｇ連日投薬コホートでＢ株に対して統計的有意性に達した。これらのデータは、さらにＲＡＤ００１が、高齢者におけるインフルエンザワクチン接種に対する血清学的応答を増強させたことを示す。
【表２３】
2019206538.tif 000051
＊  ＲＡＤ００１とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に１より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側ｐ値＜０.０５)
【１１２０】
現在の季節性インフルエンザワクチンは、しばしば、以前に広まったウイルスのバリアントとして存在するインフルエンザ株の継続する出現に対して適切な保護を提供しない。しかしながら、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの存在下でインフルエンザに対してワクチン接種したマウスは、プラセボと比較して、インフルエンザに対する広い血清学的応答を発達させた。広い血清学的応答は、ワクチンに含まれないインフルエンザの異種株での感染に対する保護を提供する、複数のサブタイプのインフルエンザにより発現される保存的エピトープに対する抗体を含んだ(Keating, R et al. (2013) Nat Immunology 14:2166-2178)。ＲＡＤ００１が高齢ボランティアにおけるインフルエンザに対する血清学的応答を広幅化するかについて、インフルエンザワクチン(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に含まれないインフルエンザの２種の異種株に対するＨＩ力価を測定した。異種株に対するＨＩ  ＧＭＴ比の増加は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で高かった(図４３)。さらに、異種株に対する抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で高かった。５ｍｇおよび２０ｍｇ毎週ＲＡＤ００１投薬コホートにおける抗体陽転率の増加は、Ｈ３Ｎ２異種株に対して統計的有意であった(表８)。プールしたＲＡＤ００１コホートについてのＨ３Ｎ２抗体陽転率は３９％であり、それに対しプラセボコホートは２０％であった(ｐ＝０.００７)。ここに示した結果は、ｍＴＯＲ阻害がインフルエンザワクチン接種に対する高齢ボランティアの血清学的応答を広幅化し、季節性インフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザの異種株に対する抗体力価を高めることを示唆する。
【１１２１】
ラパマイシンで処置したマウスにおけるインフルエンザの異種株に対する血清学的応答の広幅化は、Ｂ細胞におけるクラススイッチングの阻止および抗インフルエンザＩｇＭレベルの増加と関係している(Keating, R. et al. (2013) Nat Immunol 14:2166-2178)。しかしながら、クラススイッチングの阻止は、ワクチン接種後抗インフルエンザＩｇＭおよびＩｇＧレベルがＲＡＤ００１コホートとプラセボ処置コホート間で差がなかったため、ＲＡＤ００１で処置したヒトにおける広幅化された血清学的応答とは関係しない可能性がある(図４４)。
【表２４】
2019206538.tif 000052
＊  ＲＡＤ００１とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に１より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側ｐ値＜０.０５)
【１１２２】
ＲＡＤ００１が高齢ボランティアにおける免疫機能を増強する機構に取り組むため、免疫表現型検査を、ベースライン、治験薬処置６週間後およびインフルエンザワクチン接種４週間後(治験薬中止６週間後)に対象から得たＰＢＭＣサンプルで実施した。大部分のＰＢＭＣサブセットのパーセンテージはＲＡＤ００１コホートとプラセボの間で差がなかったが、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞のパーセンテージは、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で低かった(図４５)。ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞は年齢とともに蓄積し、ＰＤ−１がＴ細胞受容体誘発Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生および細胞溶解性機能を阻止するため、抗原刺激に対する不完全な応答を有する(Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798)。プラセボコホートにおいてＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージの経時的増加があった。１２週目(ワクチン接種４週間後)で、インフルエンザウイルスがＰＤ−１陽性Ｔ細胞を増加させることが示されているため、この増加はインフルエンザワクチン接種によるものであり得る(Erikson, JJ et al. (2012) JCI 122:2967-2982)。しかしながら、全ＲＡＤ００１コホートでＣＤ４  ＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージは６週目および１２週目でベースラインから下がった(図４５Ａ)。ＣＤ８  ＰＤ−１陽性細胞のパーセンテージも、２つの低用量ＲＡＤ００１コホートで６週目および１２週目の両者でベースラインから下がった(図４５Ｂ)。ＰＤ−１陰性ＣＤ４  Ｔ細胞のパーセンテージを評価し、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１コホートで増加した(図４５Ｃ)。
【１１２３】
ＲＡＤ００１コホートからの結果をプールし、ベースラインＰＤ−１発現の差異について調整したより厳密な統計解析下、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤコホート(ｎ＝８４)で、６週目にＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の３０.２％の統計的に有意な減少があり、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.１３)であった(図４６Ａ)。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤにおける１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の減少は３２.７％であり、ｐ＝０.０５(ｑ＝０.１９)である。図４６Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤ００１コホート(ｎ＝８４)における６週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の統計的に有意な３７.４％の減少を示し、ｐ＝０.００８(ｑ＝０.０７)である。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤ００１の１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８  Ｔ細胞減少は４１.４％であり、ｐ＝０.０６６(ｑ＝０.２１)である。それゆえに、図４５および４６の結果は、合わせて、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージのＲＡＤ００１関連減少が、免疫機能の増強に貢献している可能性を示唆する。
【１１２４】
結論
結論として、ここに提供したデータは、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が、インフルエンザワクチン接種に対する応答で評価して、ヒト高齢者の免疫学的機能における年齢関連減少を軽減し、この改善が許容されるリスク対効果バランスで得られることを示す。高齢マウスでの試験において、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンでの６週間処置はインフルエンザワクチン接種に対する応答を増加しただけでなく、寿命も延長し、免疫老化の改善は、加齢関連表現型に対するより広範な効果のマーカーであり得ることを示唆する。
【１１２５】
ＲＡＤ００１投薬をワクチン接種２週間前に中断したため、ＲＡＤ００１の免疫増強効果は、薬物処置中止後も残留する適切な細胞集団における変化により介在され得る。ここに示した結果は、ＲＡＤ００１が、プラセボと比較して疲弊したＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージを減少させたことを示す。ＰＤ−１発現はＴＣＲシグナル伝達により誘発され、慢性ウイルス感染を含む永続性抗原刺激の設定で高いままである。理論に縛られることを望まないが、ＲＡＤ００１が高齢ボランティアにおける慢性免疫活性化を減少し、それによりＰＤ−１発現を減少させた可能性がある。ＲＡＤ００１はまたイムノフィリンシクロスポリンＡについて報告されているように、ＰＤ−１発現を直接的にも阻害し得る(Oestreich, KJ et al. (2008) J Immunol. 181:4832-4839)。ＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージのＲＡＤ００１誘発減少は、Ｔ細胞応答の品質を改善させる可能性がある。これは、ｍＴＯＲ阻害が、マウスおよび霊長類におけるワクチン接種に対する記憶ＣＤ８  Ｔ細胞応答の品質を改善したことを示す試験と先の一致する(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。高齢マウスにおいて、ｍＴＯＲ阻害はまた造血幹細胞の数を増加させ、ナイーブリンパ球の産生増加に至ることも示されている(Chen, C et al. (2009) Sci Signal 2:ra75)。本実施例においてＲＡＤ００１対プラセボコホートでナイーブリンパ球のパーセンテージに有意な差は検出されなかったが、この可能性がある機構をさらに調査し得る。
【１１２６】
ＲＡＤ００１がインフルエンザの異種株に対する血清学的応答を広幅化する機構をさらに調査し得る。ラパマイシンも、インフルエンザワクチン接種後Ｂ細胞におけるクラススイッチングを阻止することが示されている。その結果、抗インフルエンザ抗体の独特のレパートリーが産生され、それがインフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザウイルスサブタイプでの致死的感染に対する株間保護を促進した(Keating, R et al. (2013) Nat Immunol. 14:2166-2178)。ここに記載した結果は、ＲＡＤ００１がインフルエンザワクチン接種２週間前にＲＡＤ００１を中止した高齢対象におけるＢ細胞クラススイッチングを改変したことを示さなかった。基礎機構をさらに解明する必要があるが、ここに記載する異種インフルエンザ株に対する血清学的応答の増加は、インフルエンザの季節性ワクチンと地域社会で広まっている株があまり適合していない年のインフルエンザ疾病に対する保護の増強に寄与し得る。
【１１２７】
インフルエンザ抗体力価に対するＲＡＤ００１の効果は、高齢者のインフルエンザワクチン接種に対する応答の増加について承認されているＭＦ５９ワクチンアジュバントの効果と同等であった(Podda, A (2001) Vaccine 19:2673-2680)。それゆえに、インフルエンザワクチン接種に対する抗体応答のＲＡＤ００１駆動増強は、高齢者におけるＭＦ５９アジュバント添加インフルエンザワクチンで証明される臨床的利益に翻訳され得る(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect. 133:687-693)。しかしながら、ＲＡＤ００１はまた臓器移植患者の免疫応答の抑制にも使用される。これらの外見上逆説的な結果は、ｍＴＯＲ阻害剤の免疫調節効果が用量および／または抗原依存性であり得る可能性を惹起する(Ferrer, IR et al. (2010) J Immunol. 185:2004-2008)。逆ＲＡＤ００１暴露／ワクチン接種応答相関の傾向がここで見られた。完全なｍＴＯＲ阻害は通常のシクロフィリン−ラパマイシン機構を介して免疫機能を抑制するが、部分的ｍＴＯＲ阻害は、少なくとも高齢者において、異なる加齢関連表現型阻害により免疫機能を増強する可能性がある。興味深いことに、ｍＴＯＲ活性は、高齢動物モデルにおける造血幹細胞を含む多様な組織で増加する(Chen C. et al. (2009) Sci Signal 2:ra75 and Barns, M. et al. (2014) Int J Biochem Cell Biol. 53:174-185)。それゆえに、ｍＴＯＲ活性の、若い組織で見られるレベルへの下落が、ｍＴＯＲ活性のより完全な抑制とは逆に、老化減少適応症に臨床的利益があり得る。
【１１２８】
加齢関連適応症の処置におけるＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤の安全性プロファイルは懸念されている。腫瘍学または臓器移植適応症で使用される用量でのＲＡＤ００１の毒性は、多くの加齢関連適応症では許容されないであろう口内炎、下痢、悪心、血球減少、高脂血および高血糖を含む。しかしながら、これらのＡＥは、血中のＲＡＤ００１のトラフレベルに関係する。それゆえに、本治験で使用したＲＡＤ００１投与レジメンは、トラフレベルを最少化するように選択した。０.５ｍｇ連日、５ｍｇ毎週および２０ｍｇ毎週投薬コホートの平均ＲＡＤ００１トラフレベルは、それぞれ０.９ｎｇ／ｍｌ、０.３ｎｇ／ｍｌ(定量下限)未満および０.７ｎｇ／ｍｌであった。これらのトラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンと関係するトラフレベルより顕著に低い。さらに、６週間の限られた処置コースが有害事象のリスクを減らした。これらの結果は、この治験で使用された投与レジメンが、高齢者のある状態については許容されるリスク対効果を有し得ることを示唆する。それにもかかわらず、ここに記載した試験の対象の相当数が、０.５ｍｇ連日ほど低い投薬でも口腔内潰瘍を発症した。それゆえに、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１の安全性プロファイルはさらなる治験を必要とする。現在利用可能なラパログよりも問題のない安全性プロファイルを有するｍＴＯＲ阻害剤は、将来加齢関連状態における良好な治療選択肢を提供し得る。
【１１２９】
実施例６：高齢者対象におけるワクチンに対する免疫応答の増強
免疫機能は高齢者で低下し、感染発生率増加およびワクチン接種に対する応答減少に至る。ｍＴＯＲ阻害がヒトにおいて抗加齢効果を有するかの決定の第一段階として、無作為化プラセボ対照治験を実施し、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が、高齢ボランティアにおけるワクチン接種に対する応答により評価された免疫機能の加齢関連低下を反転させるかを決定した。全例で、適切な患者同意を得て、治験は国の保健機関により承認された。
【１１３０】
ＲＡＤ００１の次の３投与レジメンを治験で使用した：
２０ｍｇ毎週(トラフレベル：０.７ｎｇ／ｍｌ)
５ｍｇ毎週(トラフレベルは検出限界以下であった)
０.５ｍｇ連日(トラフレベル：０.９ｎｇ／ｍｌ)
【１１３１】
移植および腫瘍適応症で承認されているＲＡＤ００１の用量より低いトラフレベルのために、これらの投与レジメンを選択した。トラフレベルは、体内の薬物の最低レベルである。１０ｍｇ連日腫瘍学投与レジメンに付随するＲＡＤ００１のトラフレベルは約２０ｎｇ／ｍｌである。０.７５〜１.５ｍｇ  ｂｉｄ移植投与レジメンに付随するトラフレベルは約３ｎｇ／ｍｌである。対照的に、我々の免疫化治験で使用した投与レジメンに付随するトラフレベルは３〜２０倍低かった。
【１１３２】
ＲＡＤ００１関連ＡＥがトラフレベルと関係するため、３投与レジメンは正常ボランティアに対する適切な安全性を有することが予測された。さらに、３用量は、一定範囲のｍＴＯＲ阻害を与えることが予想された。Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ(Ｐ７０  Ｓ６Ｋ)は、ｍＴＯＲによりリン酸化される下流標的である。Ｐ７０  Ｓ６Ｋリン酸化のレベルは、ｍＴＯＲ活性の指標として働く。ＲＡＤ００１の前臨床試験および臨床試験で得たＰ７０  Ｓ６Ｋリン酸化データのモデリングおよびシミュレーションに基づき、２０ｍｇ毎週が丸一週間ｍＴＯＲ活性をほぼ完全に阻害すると予測され、一方５ｍｇ毎週および０.５ｍｇ連日はｍＴＯＲ活性を一部阻害すると予測された。
【１１３３】
６５歳以上の高齢ボランティアを、３つのＲＡＤ００１処置群(５０対象／アーム)またはプラセボ(２０対象／アーム)の一つに無作為化した。対象を治験薬物で６週間処置し、２週間休薬し、インフルエンザワクチン接種(Aggrippal, Novartis)および肺炎球菌ワクチン接種(Pneumovax 23, Merck)をした。インフルエンザワクチン接種に対する応答を、ワクチン接種４週間後、インフルエンザワクチンの３インフルエンザ株(Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢインフルエンザサブタイプ)に対する血球凝集阻害アッセイによる幾何平均力価(ＧＭＴｓ)の測定により評価した。治験の主要評価項目は(１)安全性および耐容性および(２)ワクチン接種４週間後、プラセボと比較した、インフルエンザワクチン株の２／３のインフルエンザ力価の１.２倍増加であった。このエンドポイントは、インフルエンザ力価の１.２倍増加が、ワクチン接種後のインフルエンザ疾病の減少と関連し、それゆえに臨床的に適切であるために、選択した。５ｍｇ毎週および０.５ｍｇ  １日用量は十分耐容性であり、２０ｍｇ毎週用量と異なり、ＧＭＴ主要評価項目を満たした(図３３Ａ)。高齢ボランティアにおいてプラセボと比較して、ＲＡＤ００１がインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善しただけでなく、肺炎球菌ワクチン接種に対する応答も改善した。肺炎球菌ワクチンは、２３種の肺炎球菌血清型からの抗原を含む。血清型の７種に対する抗体力価を我々の対象で測定した。６／７血清型に対する抗体力価が、プラセボと比較して全３つのＲＡＤコホートで増加した。
【１１３４】
合わせたインフルエンザおよび肺炎球菌力価データは、部分的(８０〜１００％未満)ｍＴＯＲ阻害が、完全なｍＴＯＲ阻害よりも免疫機能における加齢関連低下の反転により有効であることを示す。
【１１３５】
実施例７：低用量ｍＴＯＲ阻害はエネルギーおよび運動を増やす
前臨床モデルにおいて、ラパログであるラパマイシンでのｍＴＯＲ阻害は、老齢マウスにおける自発的身体活動性を増加させる(Wilkinson et al. Rapamycin slows aging in mice. (2012) Aging Cell; 11:675-82)。興味深いことに、実施例２に記載した０.５ｍｇ連日投薬コホートの対象も、投与１年後のアンケートで、プラセボと比較してエネルギーおよび運動能の増加を報告した(図３９)。これらのデータは、ラパログでの部分的ｍＴＯＲ阻害が、単なる免疫機能を超えて加齢関連罹病率に対する効果を有し得ることを示唆する。
【１１３６】
実施例８：ＲＡＤ００１でのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害
モデリングおよびシミュレーションを実施し、ｍＴＯＲ活性を部分的に阻害すると予測されるＲＡＤ００１の連日および毎週用量範囲を予測した。上記のとおり、Ｐ７０  Ｓ６ＫはｍＴＯＲによりリン酸化され、Ｐ７０  Ｓ６Ｋのノックアウトが寿命を増加するため加齢とより密接に結びついたｍＴＯＲの下流標的である。それゆえにモデリングを、Ｐ７０  Ｓ６Ｋ活性を一部阻害するＲＡＤ００１の用量で行った。≧０.１ｍｇおよび＜２０ｍｇの範囲の毎週投薬がＰ７０  Ｓ６Ｋ活性の部分的阻害を達成すると予測される(図４８)。
【１１３７】
連日投薬について、３０ｐＭ〜４ｎＭの濃度のＲＡＤ００１が細胞株におけるＰ７０  Ｓ６Ｋ活性を部分的に阻害する(表９)。これらの血清濃度は、≧０.００５ｍｇ〜＜１.５ｍｇ連日のＲＡＤ００１の用量で達成されると予測される。
【表２５】
2019206538.tif 000053
【１１３８】
結論
Ｐ７０  Ｓ６Ｋを部分的にしか阻害しない用量のｍＴＯＲ阻害剤を用いる、加齢関連罹患を処置するまたは一般に免疫応答を増強する方法。加齢適応症における低用量のＲＡＤ００１での部分的ｍＴＯＲ阻害の有効性は予想外の発見である。≧０.１ｍｇ〜＜２０ｍｇ毎週および≧０.００５ｍｇ〜＜１.５ｍｇ連日のＲＡＤ００１用量範囲が部分的ｍＴＯＲ阻害を達成し、それゆえに加齢関連罹患または免疫応答の増強に有効性を有することが期待される。
【１１３９】
実施例９：ＣＡＲＴ治療に対する新規標的抗原の同定
ＣＡＲＴ治療についての戦略は、腫瘍細胞上の標的細胞表面抗原の優先的発現または標的を発現する正常細胞のアブレーションが臨床的に耐容性であるときによる。Ｂ細胞ＡＬＬにおいて、ＣＡＲＴ治療によるＣＤ１９へのターゲティングは、臨床的に有効であり、実行可能であることが示されている。しかしながら、Ｂ細胞ＡＬＬを有する一部患者は、ＣＤ１９を発現しないかもしくは低くまたはＣＡＲ１９治療後ＣＤ１９陰性疾患で再発する。さらに、Ｔ細胞ＡＬＬおよびＡＭＬは、ＣＡＲＴ１９細胞でのターゲティングに感受性ではない。それゆえに、種々の癌における標的表面抗原の欠如が、ＣＡＲベースの手法の開発を妨害している。この実施例において、急性白血病(ＡＬ)、例えば、ＡＬＬおよびＡＭＬにおける標的抗原発見の戦略を記載する。
【１１４０】
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ(Affymetrix)を使用して、急性白血病における標的抗原の５３候補遺伝子のＲＮＡレベルを測定した。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイは分枝ＤＮＡ(ｂＤＮＡ)アッセイを使用し、これは、捕獲標的ＲＮＡからのシグナルを増幅するためにｂＤＮＡ分子を使用するサンドイッチ核酸ハイブリダイゼーション法である。ＲＮＡを、精製または酵素操作なしにサンプル供給源から直接測定する。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅは、それゆえに、広いダイナミックレンジを有する頑強な、再現性のあるアッセイである。
【１１４１】
５３候補遺伝子を、４つの基準の１つに基づき試験するために選択した：
(ｉ)ＡＬにおける発現既知(陽性対照として)、例えば、Ｂ細胞ＡＬＬに対するＣＤ１９またはＡＭＬに対するＣＤ−３４；
(ii)ＡＬが造血細胞の悪性腫瘍であると仮定して、造血中の発現(例えば、ＥＭＲ２)；
(iii)発現が標的細胞の表面上にある可能性が高い；
(iv)これらの抗原を担持する正常組織または細胞のアブレーションが臨床的に耐容性であると予測されるとき。
【１１４２】
ＲＮＡを、３３名のＡＭＬ患者サンプル、７名のＡＬＬサンプル、３名の健常骨髄対照(ＮＢＭ)、ならびに各１つのＡＬＬ細胞株、ＡＭＬ細胞株および陰性対照として役立つ非造血器悪性腫瘍(Ａ３５７黒色腫)の一団から作製した。全サンプルをＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイでデュプリケートで流した。分析を次のとおり実施した。各遺伝子の平均背景読み取りおよび標準偏差を計算した。その遺伝子について平均＋３×ＳＤを超えない読み取り値および品質制御できないデュプリケートデータ点(例えば、デュプリケートのＣＶが＞１０％であるとき)を除外した。ハウスキーピング遺伝子(例えば、ＰＰ１ＢまたはＧＵＳＢ)を標準化した。ハウスキーピング遺伝子に相対的な各遺伝子の中央蛍光強度(ＭＦＩ)を示す。正常骨髄対照についてデータ点以上が利用可能であるとき、有意差の統計的計算を、ＡＮＯＶＡ、続いてダネット後検定を使用して実施した。候補遺伝子を、次のとおり下流調査を優先して並べた。
１. ＡＭＬおよびＡＬＬ＞ＮＢＭおよびＡ３５７
２. ＡＭＬまたはＡＬＬ＞ＮＢＭおよびＡ３５７
３. ＡＭＬおよびＡＬＬ＞Ａ３５７、しかしＮＢＭではない
４. ＡＭＬまたはＡＬＬ＞Ａ３５７、しかしＮＢＭではない
【１１４３】
各候補遺伝子について計算した標準化ＭＦＩ値を図４９〜５７に示す。図５８は、ＡＭＬおよびＡＬＬ、正常骨髄またはＡ３５７細胞株についてのＰＰ１Ｂハウスキーピング遺伝子に相対的な平均標準化ＭＦＩ値の累積的表示である。上記分析に基づき、急性白血病に対する次の新規標的抗原を同定した：Ｃ７９ａ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＣＤ７９ｂ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＣＬＥＣＬ１(ＣＬＬ−１)、ＬＹ７５、ＦＬＴ３、ＣＤ２２、ＫＩＴ、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５およびＩＧＬＬ１。
【１１４４】
標的遺伝子の下流調査は、細胞膜上のタンパク質発現レベルを確認するための患者検体のフローサイトメトリー、重要な正常組織上の標的抗原の存在を除外するための健常組織マイクロアレイでの免疫組織化学を含む。
【１１４５】
実施例１０：外来性サイトカイン投与によるＣＡＲ治療最適化
サイトカインは、Ｔ細胞増殖、分化、生存およびホメオスタシスに関連する重要な機能を有する。臨床使用のための最も重要なサイトカインファミリーの一つは、共通γ鎖(γｃ)ファミリーサイトカインであり、これはインターロイキン(ＩＬ)−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１を含む(Liao et al., 2013, Immunity, 38:13-25)。ＩＬ−２は、癌の免疫治療剤として広範に使用されている。ＩＬ−２のサプリメントは、臨床試験で抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍能を増強している(Xu et al., 2013, Lymphoma, 54:255-60)。しかしながら、ＩＬ−２の投与は、副作用および制御性Ｔ細胞の増殖の傾向および活性化誘発細胞死(ＡＩＣＤ)の効果のために制限される(Malek et al., 2010, Immunity, 33:153-65;およびLenardo et al., 1999, Annu Rev Immunol, 17:221-53)。ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１は、各々養子性免疫治療の有効性を増強でき、ＩＬ−２と比較して低毒性であると考えられる(Alves et al., 2007, Immunol Lett, 108:113-20)。上記サイトカインの徹底的な前臨床および臨床試験にも関わらず、ＣＡＲ−Ｔ細胞養子治療に対する多様な外来性γｃサイトカインの役割の多パラメーター比較試験は欠如している。
【１１４６】
γ鎖サイトカイン以外に、ＩＬ−１８は、免疫応答を制御する他の免疫刺激サイトカインであり、これは、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生を増強し、ＣＴＬの細胞溶解性活性を増強する(Srivastava et al., 2010, Curr Med Chem, 17:3353-7)。ＩＬ−１８の投与は、１０００μｇ／ｋｇの高用量に達しても、安全で十分に耐容される(Robertson et al., 2006, Clin Cancer Res, 12:4265-73)。それゆえに、ＩＬ−１８は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍を後押しするために使用する他の候補である。
【１１４７】
ＣＡＲ操作されたＴ(ＣＡＲ−Ｔ)細胞での養子治療の有効性をさらに増強するために、外来性サイトカインの投与を用いるＣＡＲ治療最適化を試験した。ＣＡＲ−Ｔ細胞免疫療法中に外来性に投与した種々のサイトカインの役割を比較し、臨床使用のための最適サイトカインを発見するために、卵巣癌動物モデルを使用してＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍能を試験した。
【１１４８】
次の物質および方法を、本実施例に記載する実験において使用した。
ＣＡＲ構築およびレンチウイルス製剤
ｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲベクターを先に記載のように構築し(レビュー中の原稿)、簡潔には、抗ＦＲα  Ｃ４／ＡＦＲＡ４  ｓｃＦｖを含むｐＨＥＮ２プラスミドを、5'-ataggatcccagctggtggagtctgggggaggc-3'(配列番号５２)および5'-atagctagcacctaggacggtcagcttggtccc-3'(配列番号５３)(ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩに下線を付した)のプライマーを使用するＣ４フラグメントのＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲ産物および第三世代自己不活性化レンチウイルス発現ベクターｐＥＬＮＳをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化した。消化ＰＣＲ産物を、次いで、導入遺伝子発現が伸長因子−１α(ＥＦ−１α)プロモーターにより駆動される、ＣＤ２７−ＣＤ３ｚ  Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含むｐＥＬＮＳベクターに導入した。
【１１４９】
高力価複製欠損レンチウイルスを、先に記載のように(レビュー中の原稿)Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎ(Open Biosystems)を使用して、４プラスミド(ｐＶＳＶ−Ｇ、ｐＲＳＶ.ＲＥＶ、ｐＭＤＬｇ／ｐ.ＲＲＥおよびｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲ)を用いるヒト胚性腎臓細胞株２９３Ｔ(２９３Ｔ)細胞のトランスフェクションにより産生した。トランスフェクション２４時間および４８時間後に上清を回収し、濾過した。培地を超遠心分離により濃縮した。あるいは、単回採取を培地交換３０時間後に行った。ウイルス含有培地を代替的に未濃縮で使用するかまたはレンチ−Ｘコンセントレータ(Clontech, Cat# 631232)により濃縮した。ウイルス力価を、限定的希釈方法を使用するレンチウイルスのＳｕｐＴ１細胞への形質導入効率に基づき決定した。
【１１５０】
Ｔ細胞および細胞株
末梢血リンパ球を、インフォームド・コンセント後、University Institutional Review Board at the University of Pennsylvaniaにより承認されたプロトコール下、健常ドナーから得た。初代Ｔ細胞を、陰性選択により精製後Human Immunology Coreから得た。Ｔ細胞を完全培地(１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０)で培養し、指示に従い、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂｓ被覆ビーズ(Invitrogen)で、１：１比で刺激した。活性化２４時間後、細胞を、５のＭＯＩでレンチウイルスで形質導入した。記載するサイトカインを、翌日から最終濃度１０ｎｇ／ｍＬまで形質導入Ｔ細胞に添加した。サイトカインを３日毎に交換した。
【１１５１】
レンチウイルスパッケージングに使用した２９３Ｔ細胞およびレンチウイルス力価測定に使用したＳｕｐＴ１細胞はＡＴＣＣから得た。確立された卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３(ＦＲα＋)およびＣ３０(ＦＲα−)を、サイトカイン分泌および細胞毒性アッセイの標的細胞として使用した。バイオルミネセンスアッセイのために、ＳＫＯＶ３を、ホタルルシフェラーゼ(ｆＬｕｃ)を発現するようにレンチウイルスで形質導入した。
【１１５２】
フローサイトメトリー分析および細胞選別
フローサイトメトリーを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏで実施した。抗ヒトＣＤ４５(ＨＩ３０)、ＣＤ３(ＨＩＴ３ａ)、ＣＤ８(ＨＩＴ８ａ)、ＣＤ４５ＲＡ(ＨＩ１００)、ＣＤ６２Ｌ(ＤＲＥＧ−５６)、ＣＣＲ７(Ｇ０４３Ｈ７)、ＩＬ−７Ｒα(Ａ０１９Ｄ５)、ＣＤ２７(Ｍ−Ｔ２７１)、ＣＤ２８(ＣＤ２８.２)、ＣＤ９５(ＤＸ２)、ＴＮＦ−α(ＭＡｂ１１)、ＩＦＮ−γ(４Ｓ.Ｂ３)、ＩＬ−２(ＭＱ１−１７Ｈ１２)、パーフォリン(Ｂ−Ｄ４８)、グランザイム−Ｂ(ＧＢ１１)をＢｉｏＬｅｇｅｎｄから得た。ビオチン−ＳＰ結合ウサギ抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)をJackson Immunoresearchから購入し、ＡＰＣ結合ストレプトアビジンをBiolegandから購入した。抗ヒトＢｃｌ−ｘｌ(７Ｂ２.５)をSouhernBiotechから購入した。アポトーシスキットおよびＴｒｕＣｏｕｎｔチューブをBD Bioscienceから得た。末梢血Ｔ細胞数について、血液を後眼窩放血から得て、ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の存在について染色した。ヒトＣＤ４５＋−ゲート開閉、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットを、製造業者の指示に従いＴｒｕＣｏｕｎｔチューブで定量化した。
【１１５３】
養子細胞治療のインビボ研究
雌非肥満糖尿病性／重症複合免疫不全／γ−鎖−／−(ＮＳＧ)マウス８〜１２週齢を、Stem Cell and Xenograft Core of the Abramson Cancer Center, University of Pennsylvaniaから得た。マウスに、０日目に３×１０６  ｆＬｕｃ＋  ＳＫＯＶ３細胞を側腹部に皮下注射した。処置前に、群あたり４匹または５匹のマウスに無作為化した。触知可能となった後、ヒト初代Ｔ細胞を、先に記載のように活性化および形質導入した。Ｔ細胞を、ＩＬ−２(５ｎｇ／ｍＬ)の存在下約２週間増殖させた。腫瘍負荷が約２５０〜３００ｍｍ３のとき、マウスに５×１０６  ＣＡＲ−Ｔ細胞または１００μｌ  食塩水を静脈内注射し、その後５μｇのＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１またはリン酸緩衝液(ＰＢＳ)を連日７日間腹腔内注射した。腫瘍寸法をカリパスで測定し、腫瘍体積を次の式を用いて計算した：腫瘍体積＝(長さ×幅２)／２。レシピエントマウス血液における移入Ｔ細胞の数および表現型を、後眼窩放血後にフローサイトメトリーにより決定した。腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えたときマウスを安楽死させ、さらなる分析のために直ぐに腫瘍を摘除した。
【１１５４】
統計解析
統計解析をＰｒｉｓｍ  ５(ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア)およびＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２０.０ソフトウェアで行った。データは、明記しない限り、平均±ＳＥＭとして示した。対応サンプルｔ検定またはノンパラメトリックウィルコクソン順位検定を２群の比較に使用し、反復測定ＡＮＯＶＡまたはフリードマン検定を３以上の群の差の統計的有意の検定に使用した。０.０５未満のＰ値のときに、実験値を統計学的有意とした。
【１１５５】
結果
抗ＦＲα  Ｃ４  ＣＡＲの構築および発現
ｐＥＬＮＳ−Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通領域に連結した抗ＦＲα  Ｃ４  ｓｃＦｖ、その後ろにＣＤ２７細胞内シグナル伝達モチーフと直列であるＣＤ３ζシグナル伝達部分からなった(図５９Ａ)。初代ヒトＴ細胞を、Ｃ４  ＣＡＲレンチウイルスベクターで効率的に形質導入し、形質導入４８時間後に検出したとき、４３％〜６５％の形質導入効率であった(図５９Ｂ)。ＣＡＲ発現レベルは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞で同等であった(５２.６±１０.２％対４９.５±１７.１％、Ｐ＝０.７１３)。
【１１５６】
動物モデルにおける多様なサイトカインの異なる抗腫瘍有効性
本試験は、ＣＡＲ−Ｔ細胞注射と組み合わせたインビボサイトカイン投与がＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強できるかを試験した。皮下ＳＫＯＶ３腫瘍を担持するマウスは、食塩水または５×１０６  Ｃ４−２７ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、３９日に静脈内注射された(図６０)。食塩水群と比較して、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療を受けたマウスは短期腫瘍退縮をし、腫瘍は５６日目から反跳し始めた(図６１)。多様なサイトカイン群の中で、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１注射を受けたマウスが最良の腫瘍抑制を示し、続いてＩＬ−２およびＩＬ−７であり、ＩＬ−１８およびＰＢＳ処置マウスは、最も重い腫瘍負荷を有した。末梢血における移入Ｔ細胞の持続を、養子移入１５日後および終了時に決定した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の最高数が、ＩＬ−１５、続いてＩＬ−２１で処置したマウスで見られた。＋１５日目ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞数は腫瘍退縮と一致し、最終腫瘍重量を予測した。マウスを腫瘍攻撃７３日後に殺し、ヒトＴ細胞存在下の腫瘍を分析した(図６３)。末梢血と同様、ＩＬ−１５で処置したマウスが腫瘍における最高Ｔ細胞数を示し、続いてＩＬ−２１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＰＢＳおよびＩＬ−１８であった(図６４)。ＣＤ４対ＣＤ８比は種々のサイトカイン群で同等であり、全サイトカイン群で血液および腫瘍の両者でＣＤ４＋  Ｔ細胞が優性であった。ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現は上記群と同等であったが(４５.１％〜６２.４％)、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１群は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８群よりＣＡＲ＋  ＣＤ４  Ｔ細胞の比率が高かった(図６５)。表現型に関して、腫瘍における全ＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＤ６２Ｌ−およびＣＣＲ７−であり、それらの３５％〜６０％がＣＤ４５ＲＡ＋(Ｔｅｍｒａ)を発現した(データは示していない)。ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ＣＤ２７発現を保持する可能性が高いが、ＣＤ２８発現はＣＤ４＋とＣＤ８＋  Ｔ細胞で同等であった(図６６)。
【１１５７】
考察
要約すると、これらの知見は、ＣＡＲ−Ｔ細胞養子治療の有効性を増強するための外来性サイトカイン投与のための重要な含意を有する。全γｃサイトカインは、ＣＡＲ−Ｔ細胞注射と組み合わせて投与したとき、卵巣マウスモデルにおける抗腫瘍有効性を増強した。ＩＬ−１５およびＩＬ−２１がインビボ追加のための最良のサイトカインであり、ＩＬ−７およびＩＬ−２は、抗腫瘍結果の改善を示した。ＩＬ−１８は、ＩＬ−１ファミリーに属する炎症誘発性サイトカインであり、これらのインビボ実験で抗腫瘍有効性に対する効果を示さなかった。
【１１５８】
実施例１１：ＤＧＫ阻害はＣＡＲＴ有効性を増強する
先の試験、例えば、実施例６に記載する実験は、ＣＡＲ  Ｔ細胞がインビボ(例えば、腫瘍微小環境)で経時的に有効性を失うことを示唆している。具体的に、腫瘍マウスモデルに注射したｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｔ細胞注入後腫瘍から単離し(例えば、３９日後、以後、腫瘍浸潤性リンパ球、ＴＩＬと称す)、新たに解凍したｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞との比較において機能的活性を評価した。結果は、エクスビボ死滅アッセイおよびＩＦＮγ放出アッセイにおいて、腫瘍から単離したｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原またはＣＤ３／ＣＤ２８刺激に対する応答において、腫瘍細胞を殺す能力が低下し(図６７Ａ)、ＩＦＮｇ産生が減少し(図６７Ｂ)、ＥＲＫシグナル伝達が減少し(ウェスタンブロット分析におけるリン酸化により示す、図６７Ｃ)、Ｔ細胞活性化の減少を示した。
【１１５９】
インビボでのＣＡＲ  Ｔ細胞活性の経時的減少を恐らく説明する阻害機構は、可溶性因子(ＴＧＦｂ、ＰＧＥ２、アデノシン、ＩＬ１０、ＲＡＧＥリガンドなど)、細胞対細胞接触(ＰＤ−１、Ｌａｇ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０など)および内因性活性化誘発細胞内陰性フィードバック系(ジアシルグリセロールキナーゼ：αおよびζアイソフォームｓ、Ｅｇｒｓ(２および３)、ＳＨＰ−１、ＮＦＡＴ２、ＢＬＩＭＰ−１、Ｉｔｃｈ、ＧＲＡＩＬ、Ｃｂｌ−ｂ、イカロスなど)を含む。Ｔ細胞活性化は、ＤＧＫのような因子を誘発できる。ＤＧＫは、次に、ＤＡＧのリン酸化によりＤＡＧシグナル伝達を阻害する。これが、Ｔ細胞活性化に至るＲＡＳ−ＥＲＫ−ＡＰ１経路のＤＡＧ誘発活性化を制限する。先の試験は、ＤＧＫαまたはＤＧＫζ欠損マウスが、シグナル伝達増強を示し、アネルギー誘発刺激により耐性であるように見えるＣＤ４  Ｔ細胞をもたらすことが示されている。
【１１６０】
インビトロ細胞毒性およびサイトカイン放出アッセイ
ＣＡＲＴ細胞有効性に対するＤＧＫ阻害の効果を試験するために、ＤＧＫ遺伝子ＤＧＫα、ＤＧＫζまたは両者が欠失したトランスジェニックマウスを使用した。野生型およびＤＧＫ欠損マウスからの脾臓Ｔ細胞を単離し、レトロウイルスを使用してｍｅｓｏＣＡＲ(ＳＳ１  ＢＢＺ)を発現するように形質導入した。ＭＩＧＲ１  ＣＡＲを対照として使用した。
【１１６１】
細胞毒性アッセイを、先の実施例に記載するものに類似する方法を使用して実施した。野生型およびＤＧＫ欠損(ＫＯ)ｍｅｓｏＣＡＲ発現細胞を多様なエフェクター：標的比でインキュベートし、細胞毒性(標的細胞死滅％)を定量した(図６８)。図６８に示すように、ＤＧＫの欠失は、特に低エフェクター：標的比で、ＣＡＲ  Ｔ細胞のエフェクター機能を著しく増強した。
【１１６２】
同様に、種々のエフェクター：標的比で１８時間後、標的細胞に対する応答においてＩＦＮγ放出を試験した。図６９に示すように、ＤＧＫの欠失は、特に低エフェクター：標的比で、ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞、特にａｔ低エフェクター：標的比のエフェクター機能を著しく増強した。
【１１６３】
野生型ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞と比較したＤＧＫ欠損ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞のウェスタンブロット分析はＥＲＫリン酸化の増加を示し(図７０)、ＤＧＫの存在がＥＲＫシグナル伝達を抑制するが、ＤＧＫの欠失がＥＲＫシグナル伝達の増加をもたらすことを示す。ＤＧＫ欠失背景におけるＥＲＫシグナル伝達増強は、ＤＧＫの阻害がＲａｓ−ＥＲＫ−ＡＰ１経路活性化、それゆえに、Ｔ細胞活性化をもたらすことを示唆する。
【１１６４】
最近の試験は、ＴＧＦβが、ＤＧＫ欠損がＴ細胞効果を増強させるのと同じシグナル伝達分子である、ＲＡＳ／ＥＲＫシグナル伝達の妨害により、腫瘍浸潤性ＣＤ８  Ｔ細胞の機能性を調節することを示している。ＴＧＦβに対するＤＧＫ欠損ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞の感受性を試験した。ＷＴおよびＤＧＫ欠損ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞を、メソテリン発現ＡＥ１７腫瘍細胞＋または−１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβと１８時間インキュベートした。これらのＴ細胞による細胞毒性およびＩＦＮｇ産生を測定した。図７１に示すように、ＴＧＦβは、ＷＴ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で死滅を５０％阻害した(矢印)。しかしながら、このＴＧＦβ誘発阻害は、ＤＧＫ欠失を有するＣＡＲ  Ｔ細胞では観察されず、ＤＧＫ欠損細胞がＴＧＦβ調節に感受性ではなく、ＴＧＦβのような阻害剤刺激により耐性であることを示し、これがＴ細胞活性の増加に貢献し得る。
【１１６５】
インビボでのｍｅｓｏＣＡＲおよびＤＧＫ阻害の治療有効性
次に、ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞の治療有効性を、ＤＧＫ阻害または欠損の状況下で試験した。ＡＥ１７ｍｅｓｏ腫瘍細胞(中皮腫細胞)をＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に注射した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき(約１週間後)、１０００万ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞を尾静脈に静脈内注射した。腫瘍体積を、少なくとも１８日間追跡した。
【１１６６】
ＤＧＫ欠損ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞は、野生型(ＷＴ)ｍｅｓｏＣＡＲおよび未処置細胞と比較して、増強されかつ長い抗腫瘍活性を示した(図７２Ａ)。具体的に、３種のＤＧＫ欠損ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞の各々は、注射後最大１８日までＷＴおよび未処置細胞と比較して、体積での腫瘍増殖の阻害を示した。ｍｅｓｏＣＡＲを発現するＤＧＫｚ欠損細胞はまた、マウスにおいて野生型ｍｅｓｏ  ＣＡＲ  Ｔ細胞より良好な持続および増殖を示した(図７２Ｂ)。
【１１６７】
これらの結果をまとめて、ｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞処置と組み合わせたＤＧＫ阻害は、治療におけるｍｅｓｏＣＡＲ  Ｔ細胞活性化および抗腫瘍活性を増強できることを示す。
【１１６８】
実施例１２：イカロス阻害は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍能力を増強する
ＣＡＲ  Ｔ細胞治療における一つの主要な障壁は、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)のようなＴ細胞シグナル伝達の内因性の負のレギュレーターの上方制御である。実施例１１に記載のように、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、インビボで経時的に有効性を喪失することが示されている。ＤＧＫのようなＴ細胞機能の負のレギュレーターの阻害は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性および機能を増強することが示された。
Ｔ細胞機能の他の重要な負のレギュレーターは転写因子イカロスである。近位ＴＣＲシグナル伝達に主に作用するＤＧＫと異なり、イカロスは、Ｓｉｎ３Ａ、ＣｔＢＰおよびＨＤＡＣのような染色質リモデリング複合体の動員を介して遺伝子発現を負に制御する亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質である。イカロスは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞においてサイトカイン産生および細胞溶解性機能に役割を有する。
この実施例において、イカロス発現が減少したレトロウイルス形質導入ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をインビトロおよびインビボで試験した。
【１１６９】
物質および方法
細胞株。マウスＡＥ１７中皮腫細胞は、Jackman et al., J Immunol. 2003;171:5051-63に記載された。ヒトメソテリンをレンチウイルス形質導入によりＡＥ１７細胞に導入した。３Ｔ３Ｂａｌｂ／Ｃ細胞をAmerican Type Culture Collectionから購入した。マウスＦＡＰ発現３Ｔ３ＢＡＬＢ／Ｃ(３Ｔ３.ＦＡＰ)細胞を、マウスＦＡＰのＦＡＰ−３Ｔ３親株へのレンチウイルス形質導入により創製した。
【１１７０】
動物。無病原体Ｃ５７ＢＬ／６マウスをCharles River Laboratories Inc.(Wilmington, MA)から購入した。イカロスＤＮＡ±マウスは、１野生型イカロスアレルおよび１ＤＮＡ結合ドメインが欠失したイカロスアレルを含む(Winandy et al., Cell. 1995; 83:289-99)。Ｉｋｚｆ１±マウスは、１つの野生型イカロスアレルおよびエクソン７の欠失を有する１つのアレルを有する(Avitahl et al., Immunity. 1999; 10:333-43)。全実験に使用した動物は、６〜１２週齢の雌マウスであり、無病原体動物施設で飼育した。
【１１７１】
初代マウスＴリンパ球の単離、形質導入および増殖。初代マウス脾臓Ｔ細胞を、製造業者(Miltenyi Biotec)の示唆のとおり“Ｐａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｅｇａｔivｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”を使用して単離し、−ＣＤ３(１μｇ／ｍＬ)および−ＣＤ２８(２μｇ／ｍＬ)で予め被覆した２４ウェルプレート(１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２添加  ＲＰＭＩ−１６４０２ｍＬ中４×１０６細胞／ウェル)で活性化した。４８時間後、細胞(１×１０６細胞／ウェル)をレトロウイルス(１ｍＬ  粗製ウイルス上清)と、レトロネクチン(５０μｇ／ｍＬ；Clontech)被覆２４ウェルプレート中で混合し、ブレーキ無しで、室温で４５分、１２００ｇで遠心分離した。一夜インキュベーション後、細胞を、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２とさらに４８時間増殖させた。
【１１７２】
抗原または抗体被覆ビーズ。組み換えメソテリン細胞外ドメインタンパク質、ウシ血清アルブミン(Fisher Scientific)または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体(eBioscience)を、製造業者の指示に従い、トシル活性化４.５μｍ  ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ(Invitrogen, #140-13)と化学的に架橋させた。
【１１７３】
免疫ブロッティング。抗メソテリン−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、ＢＳＡ、メソテリンまたは抗ＣＤ３抗体被覆ビーズ(２：１ビーズ対Ｔ細胞比で)と、５分および２０分インキュベートした。全細胞ライセートを次いで調製し、リン酸化ＥＲＫ、リン酸化ＡＫＴ、リン酸化ＩＫＫ、リン酸化ＪＮＫ、リン酸化Ｌｃｋ、リン酸化ＰＫＣ、リン酸化ＰＬＣまたはリン酸化ＺＡＰ７０に対して免疫ブロットした。Sigma Aldrichから購入した抗ホスホ−Ｌｃｋ以外、全抗ホスホ−タンパク質抗体をCell Signalingから購入した。イカロスへのＣ末端反応性ヤギ抗マウス抗体(ＳＣ−９８６１)およびヤギ抗マウスアクチン抗体(ＳＣ−１６１５)をSanta Cruzから購入した。β−アクチン発現レベルを、充填量の差異を標準化するために決定した。
【１１７４】
細胞毒性およびＩＦＮ  ＥＬＩＳＡ。ＡＥ１７、ＡＥ１７.ｍｅｓｏ、３Ｔ３および３Ｔ３.ＦＡＰ細胞を、記載のようにルシフェラーゼで形質導入した(Moon et al., Clinical Cancer Research. 2011; 17:4719-30)。Ｔ細胞および標的細胞を記載する比で、トリプリケートで、９６ウェル丸底プレートで共培養した。１８時間後、培養上清を、ＥＬＩＳＡを使用するＩＦＮ分析のために採取した(マウスＩＦＮ、ＢＤＯｐＥＩＡ)。形質導入Ｔ細胞の細胞毒性を、先に記載のアッセイを使用する細胞ライセートからの残存ルシフェラーゼ活性の検出により決定した(Riese et al., Cancer Res. 2013; 73:3566-77)。
【１１７５】
確立された腫瘍を担持するマウスへのＣＡＲ  Ｔ細胞移入。マウスに、２×１０６  ＡＥ１７.ｍｅｓｏ腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背外側側腹部に皮下注射した。大きな確立された腫瘍(１００〜１５０ｍｍ３)を担持するマウスを、野生型ＣＡＲ  Ｔ細胞、イカロス欠損ＣＡＲ  Ｔ細胞または未処置のままに無作為に振り分けた(最小５マウス／群、各実験を少なくとも１回反復)。１×１０７  Ｔ細胞を尾静脈から投与した。腫瘍サイズをそれぞれ電子スケールおよびノギスで測定した。
【１１７６】
９日目、Ｔ細胞活性評価のために、脾臓および腫瘍を、先に記載のように単細胞懸濁液に処理した(Moon et al., Clinical Cancer Research. 2014; 20(16):4262-73)。脾細胞および腫瘍単細胞懸濁液を可溶性抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体(１.０μｇ／ｍｌ)またはホルボールエステル／イオノマイシン(ＰＭＡ／Ｉ：３０ｎｇ／ｍｌ、１ｕＭ)で、Ｇｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ(BD Biosciences、０.６６μｌ／ｍｌ)存在下４〜６時間再刺激し、フローサイトメトリー分析のために採取した。
【１１７７】
フローサイトメトリーアッセイ。抗マウスＩＦＮ−γ(ＸＭＧ１)、抗マウスＣＤ２５(ＰＣ６１)、抗マウスＩＬ−２(ＪＥＳ６−１Ａ１２)、抗マウスＣＤ８(５３−６.７)、抗マウスＣＤ４４(ＩＭ７)および抗マウスＣＤ４(ＧＫ１.５)に対する蛍光色素結合抗体をBioLegendから購入した。定着性、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｑｕａ  ｓｔａｉｎ(Ｌ３４９５７)をInvitrogenから購入した。抗マウスグランザイムＢ(ＮＧＺＢ)およびＦｏｘＰ３(ＦＪＫ−１６ｓ)に対する蛍光色素抗体をeBioscienceから購入した。抗マウスＴＮＦ−α(ＭＰ６−ＸＴ２２)および抗マウスＣＤ６９(Ｈ１.２Ｆ３)に対する蛍光色素抗体をBD Biosciencesから購入した。細胞内サイトカイン染色について、細胞をＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ(BD Biosciences、０.６６μｇ／ｍｌ)で４〜６時間処理した。採集後、細胞を１％パラホルムアルデヒドで３０分固定し、遠沈し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次いで細胞をＢＤ  Ｐｅｒｍ  Ｗａｓｈ(BD Biosciences)で２回洗浄し、次いでサイトカイン抗体で４５分、室温で染色した。細胞をＢＤ  Ｐｅｒｍ  Ｗａｓｈで２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。転写因子染色について、細胞を、蛍光色素標識一次抗体で、２０分、氷上で表面染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、細胞をeBioscienceからのＦｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液で固定した。固定後、細胞を透過性化し、ＡＰＣ抗マウスＦｏｘＰ３で染色した。イカロス染色について、ウサギ抗マウスイカロス(Ａｂｃａｍ、ａｂ２６０８３、１：２０００)を使用した、続いてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＦｏｘＰ３キットで固定後および透過性化した。イカロス抗体での染色後、細胞を洗浄し、ＰＥ標識抗ウサギ二次抗体(１：２０００)で染色した。染色完了後、細胞をフローサイトメトリー分析のためにＣｙａｎＡＤＰ(Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ)で処理した。
【１１７８】
統計解析。全統計検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで実施した。２要因ＡＮＯＶＡを事後検定とともに実施し、＊  ｐ＜０.０５、＊＊  ｐ＜０.０１、＊＊＊  ｐ＜０.００１および＊＊＊＊  ｐ＜０.０００１であった。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【１１７９】
結果
イカロスのレベルが低下したＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるサイトカイン産生および細胞溶解性メディエーター放出は増強される
イカロスが減少した細胞溶解性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)がインビトロおよびインビボでエフェクター機能が増強していることを考慮して(O'Brien, et al., J Immunol. 2014; 192:5118-29)、イカロスの枯渇がＣＡＲ  Ｔ治療の有効性を改善するかを試験するために実験を実施した。Ｃ５７ＢＬ／６背景の野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびイカロスハプロ欠損マウス(Ｉｋｚｆ１±)から単離したＴ細胞を、抗メソテリンＣＡＲを発現するようにレトロウイルスで形質導入した。エクスビボ活性化、形質導入およびＩＬ２中の増殖後、野生型(ＷＴ)ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ  Ｔ細胞は、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットで少ないイカロスタンパク質を発現し続けることが確認された(図７３Ａ)。
【１１８０】
イカロスが多サイトカイン遺伝子座位の転写リプレッサーであるため(Thomas et al., J Immunol. 2007; 179:7305-15; Bandyopadhyay et al., Blood. 2006; 109:2878-2886; Thomas et al., J of Biological Chemistry. 2010; 285:2545-53;およびO'Brien et al., J Immunol. 2014; 192:5118-29)、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるイカロスの減少により自己分泌サイトカイン産生を生じるか、そしてイカロスハプロ欠損ＣＡＲ  Ｔ細胞が標的抗原に対して、そのＷＴカウンターパートよりも良好に応答するか否かも次に試験した。ＷＴおよびＩｋｚｆ１±ＣＡＲ  Ｔ細胞の両者を、ＢＳＡ(対照)またはメソテリン(ＣＡＲ抗原)で被覆したビーズで、２：１  ビーズ：Ｔ細胞比で６時間刺激し、フローサイトメトリーによりＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−βおよびＩＬ−２産生能を解析した。ベースライン(ＢＳＡ刺激)で、ＷＴ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較してＩＦＮ産生Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ  Ｔ細胞の約３倍の増加があったが(４.３５％対１.４％、図７３Ｂ)、ＩＬ−２産生細胞％に有意な差はなかった(図７３Ｄ)。メソテリン被覆ビーズでの刺激後、ＩＦＮ−γサイトカイン産生Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ  Ｔ細胞％の劇的な増加があったが(２５％)、応答はＷＴ  ＣＡＲ  Ｔ細胞でわずかであった(７％)。ＴＮＦ−α産生の増加も見られた(図７３Ｃ)。サイトカイン産生のこの増加が、種々の刺激について一般化されるのかまたはＣＡＲ抗原に限定されるのかを調べるために、ＷＴおよびＩｋｚｆ±ＣＡＲ  Ｔ細胞の両者をＰＭＡおよびイオノマイシンで６時間処理した。この場合、ＷＴカウンターパートと比較して多くのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−βおよびＩＬ−２サイトカイン産生細胞が、Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ  Ｔ細胞で観察された(図７３Ｂ〜７３Ｄ)。これらのデータは、イカロスが、Ｔ細胞またはＣＡＲ  Ｔ細胞でサイトカイン産生を抑制する律速因子の一つであるとの仮説を指示する。
【１１８１】
重要な細胞毒性メディエーターであるグランザイムＢは、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化イカロス欠損ＯＴ−Ｉ細胞で情報制御され、これがＯＶＡ発現ＥＬ４腫瘍細胞に対する細胞溶解性活性を増加させたことが示された(O'Brien et al., J Immunol. 2014; 192:5118-29)。グランザイムＢ産生がＣＡＲを担持するＩｋｚｆ±Ｔ細胞でも増加しているはずとの仮説が立てられた。ＷＴおよびＩｋｚｆ１±ＣＡＲ  Ｔ細胞の両者をＢＳＡ(ベースライン)またはメソテリン(ＣＡＲ抗原)被覆ビーズで、２：１  ビーズ：Ｔ細胞比で６時間刺激した。ＰＭＡ／イオノマイシンを、本アッセイの陽性対照として使用した。上記データに類似して、グランザイムＢレベルは、ベースラインでＷＴ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりＩｋｚｆ±ＣＡＲ  Ｔ細胞で高かった(ＢＳＡ刺激；図７３Ｅ)。メソテリン被覆ビーズまたはＰＭＡ／イオノマイシンのいずれかで刺激後、グランザイムＢレベルはＷＴおよびＩｋｚｆ±ＣＡＲ  Ｔ細胞の両者で増加したが、産生はＩｋｚｆ±ＣＡＲ  Ｔ細胞ではるかに高かった(図７３Ｅ)。イカロスが減少したＣＡＲ  Ｔ細胞の脱顆粒にも差異があるか否かを決定するために、抗原刺激後のＣＤ１０７ａ発現を評価した。野生型形質導入Ｔ細胞は、抗原再刺激後わずかなレベルのＣＤ１０７ａ発現を有したが、しかしながら、イカロスが減少したＴ細胞は増強したＣＤ１０７ａ上方制御を示した(図７３Ｆ)。それゆえに、再刺激に応答して、イカロスが減少したＣＴＬは、野生型カウンターパートと比較してより多く脱顆粒し、細胞毒性メディエーターをより多く放出する。
【１１８２】
ドミナントネガティブアレルでのイカロス枯渇はＣＡＲ  Ｔ細胞機能を増強する
イカロスレベルが低い細胞に加えて、マウスからのイカロスの一つのドミナントネガティブアレル(ＩｋＤＮ)を発現するＴ細胞を試験した。ＩｋＤＮを発現するトランスジェニックマウスのリンパ系発達は正常であるが、イカロス  ＤＮＡ結合活性が９０％減少した末梢Ｔ細胞を有する(Thomas et al., J Immunol. 2007; 179:7305-15;およびWinandy et al., Cell. 1995; 83:289-99)。ＷＴおよびＩｋＤＮマウスの脾臓から単離したＴ細胞を、プレート結合抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化し、メソテリンＣＡＲを形質導入し、続いてＩＬ−２で増殖させた。ＩｋＤＮ  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるイカロスのノックダウンがウェスタンで確認された。ＷＴおよびＩｋＤＮ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＢＳＡまたはメソテリン被覆ビーズのいずれかで２：１  ビーズ：Ｔ細胞比で６時間再負荷し、ＣＡＲ抗原に対してＩＦＮおよびＩＬ−２を産生する能力ならびに脱顆粒する能力を解析した。上記Ｉｋｚｆ１±データに類似して、ベースラインでいくぶんかの自己分泌ＩＦＮ−γ産生が観察されたが(図７４Ａ)、ＩＬ−２は観察されなかった(ＢＳＡ刺激；図７４Ｂ)。ＣＡＲとその標的抗原であるメソテリンとのライゲーションにより、ＩｋＤＮ  Ｔ細胞は、ＷＴ  Ｔ細胞より多くのＩＦＮ−γを産生した(メソテリン刺激；図７４Ａ)。ＣＤ１０７ａ上方制御で測定した脱顆粒も、野生型およびＩｋＤＮ  ＣＡＲ  Ｔ細胞両者で同様であった(図７４Ｄ)。
【１１８３】
イカロス枯渇は抗原刺激後のＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化およびシグナル伝達を増強しなかった
イカロスの枯渇がＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン放出を増強し、グランザイムＢレベルおよびＣＤ１０７ａ発現を増加させることを考慮して、可能性がある機構を探索した。エフェクター機能のこれらの変化が、野生型とＩｋｚｆ１±形質導入Ｔ細胞の活性化の差異によるものである可能性は妥当である。それゆえに、ＣＤ６９、ＣＤ２５および４−１ＢＢ(Ｔ細胞活性化のマーカー)のレベルを、メソテリン被覆ビーズで６時間および２４時間刺激後、フローサイトメトリーで測定した。早期活性化マーカーであるＣＤ６９は、野生型およびＩｋｚｆ１±細胞の両者で同程度に上方制御された(図７５Ａ)。長い刺激で、野生型およびＩｋｚｆ１±ＣＡＲ発現Ｔ細胞は同様のレベルのＣＤ６９を発現し続けたが、Ｉｋｚｆ１±形質導入Ｔ細胞はＣＤ２５発現の増加を示した(図７５Ｂ)。これは、Ｔ細胞活性化の差異を直接的には示さないが、しかしながら、Ｉｋｚｆ１±細胞によるＩＬ−２が増加するに連れて(図７５Ｄ)、ＩＬ−２ＲａであるＣＤ２５のポジティブ・フィードフォワード・ループで作用し得る(Depper et al., Proc Natl Acad of Sci USA. 1985; 82:4230-4;およびNakajima et al., Immunity. 1997; 7:691-701)。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢも、活性化Ｔ細胞で発現され(Vinay et al., Seminars in Immunology. 1998; 10:481-9)、抗原刺激後ＣＡＲ形質導入野生型およびＩｋｚｆ１±Ｔ細胞で類似のレベルで発現された(図７５Ｃ)。それゆえに、我々のＷＴおよびＩｋｚｆ１±形質導入Ｔ細胞の間の機能的差異は、Ｔ細胞活性化の差異によるものではなかった。
【１１８４】
実施例１１およびRiese et al., Cancer Research. 2013; 73:3566-77に記載した実験は、ＣＡＲ  Ｔ細胞における酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)の枯渇がＲＡＳ／ＥＲＫシグナル伝達の増加を起こし、これがＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化とよく相関したことを示す。ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でＴＣＲ刺激後のＷＴおよびイカロス欠損Ｔ細胞におけるいくつかのシグナル伝達経路を試験した。刺激Ｔ細胞からの溶解物を調製し、ＴＣＲからの近位(ＰＬＣおよびＬｃｋ)および遠位(ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、ＡＫＴおよびＩＫＫａ)シグナル伝達に関係する多様なホスホ−タンパク質について免疫ブロットした。イカロス欠損Ｔ細胞において、Ｌｃｋ、ＥＲＫおよびＡＫＴを含むいくつかのＴＣＲシグナル伝達タンパク質の構成的な低レベルのベースライン活性化があった(図７５Ｄ)。ＴＣＲ／ＣＤ２８刺激で、試験した全タンパク質は、刺激２０分後イカロス欠損Ｔ細胞でわずかに高かったホスホ−ＩＫＫ以外、ＷＴおよびイカロス欠損Ｔ細胞と比較して、同じレベルまでリン酸化された。ＮＦＢ経路が、イカロスレベルが減少したＴ細胞で増強されているかを調べるために、同じブロットを、ＩＫＫの下流標的であるＩＢに対して再プローブした。ＷＴおよびイカロス枯渇Ｔ細胞の両者でＩＢ分解に差異はなかった。ＣＡＲシグナル伝達を試験するために、ＷＴおよびＩｋＤＮメソテリンＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の両者を、メソテリン被覆ビーズで再刺激した。ＣＤ３／ＣＤ２８刺激のデータと同様、ＰＬＣおよびＥＲＫのリン酸化に差異は見られなかった(図７５Ｅ)。合わせて、これらのデータは、イカロスの枯渇がＴＣＲ／ＣＡＲ介在シグナル伝達を変えないことを示す。
【１１８５】
ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるイカロス減少は、その標的細胞に対する応答を増強する
イカロスが減少したＣＡＲ  Ｔ細胞によるエフェクター因子産生の増加を考慮して、インビトロでのその標的腫瘍細胞に対する有効性を試験した。野生型、Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ  Ｔ細胞発現メソＣＡＲを、異なる比で親腫瘍細胞株、ＡＥ１７またはメソテリン発現細胞株、ＡＥ１７メソと混合した。親細胞株と混合したとき、野生型、Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ  Ｔ細胞のいずれも、ＡＥ１７に応答したＩＦＮ−γ産生または細胞溶解ができなかった(図７６Ａ、７６Ｂおよび７６Ｃ)。対照的に、ＡＥ１７メソと反応させたとき、野生型Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生および細胞溶解は、Ｅ：Ｔ比が増加するに連れて増加した(図７６Ｂおよび７６Ｃ)。しかしながら、Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ  Ｔ細胞の両者は、最低Ｅ：Ｔ比１.３：１でも、野生型Ｔ細胞より有意に多いＩＦＮ−γを産生し、腫瘍溶解が有意に増加した(図７６Ｂおよび７６Ｃ)。
【１１８６】
この効果の一般化可能性を試験するために、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ−ＣＡＲ)を標的とし、上で使用したメソテリンＣＡＲと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを有する異なるＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞を試験した。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６から単離した同等に形質導入したＦＡＰ−ＣＡＲ脾臓Ｔ細胞の有効性を、Ｉｋｚｆ１±マウスのものと比較した。Ｉｋｚｆ１±ＦＡＰ−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＷＴ  ＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、インビトロでの特異性を維持して、３Ｔ３.ＦＡＰ細胞の溶解(図７６Ｄ)およびより多くのＩＦＮ分泌(図７６Ｅ)により効果的であった。
【１１８７】
イカロスの枯渇は確立された腫瘍に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を増強する
マウスにおける確立されたＡＥ１７メソ腫瘍の増殖制御における、イカロスが減少したメソテリン特異的Ｔ細胞(Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ)の能力を試験した。２００万のＡＥ１７メソ腫瘍細胞を、同質遺伝子的Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射し、大きな確立された腫瘍(約１００〜１５０ｍｍ３)を形成させた。ＷＴまたはイカロス欠損(Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ)マウスから調製した１０００万のＣＡＲ  Ｔ細胞を、次いで、この腫瘍担持マウスに養子移入し、腫瘍測定を続けた。野生型形質導入メソＣＡＲ  Ｔ細胞により軽度の腫瘍増殖阻害が誘発されたが、Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ形質導入メソＣＡＲ  Ｔ細胞の両者は、より顕著にＡＥ１７メソ腫瘍の増殖を阻止した(図７７Ａおよび７７Ｂ)。
【１１８８】
イカロスの減少が、ＦＡＰ−ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療可能性を増強するか否かも試験した。確立されたＡＥ１７メソ腫瘍(１００〜１５０ｍｍ３)を有するマウスに、１０００万の野生型またはＩｋｚｆ１±形質導入抗マウスＦＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を養子移入した。野生型形質導入細胞を投与されたマウスの腫瘍遅延は極微であり、ＡＥ１７メソ腫瘍は増殖を続けた(図７７)。対照的に、Ｉｋｚｆ１±形質導入Ｔ細胞は、腫瘍増殖を有意に遅延できた。
【１１８９】
Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＷＴ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも長く残留し、免疫抑制性腫瘍微小環境により抵抗性である
イカロス阻害ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性の増強を考慮して、Ｉｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞を使用する可能性がある機構を探索した。これらのメソＣＡＲ  Ｔ細胞がインビボで免疫抑制性腫瘍微小環境中どのように作動するかをさらに試験するために、養子移入３日後および９日後の腫瘍を収集し、これらの数および機能性を評価した。これらの二つの時点は、抗腫瘍免疫応答中の早期および後期時点でのそれらの活性の特徴づけを可能にした。
【１１９０】
移入３日目、我々は、脾臓(図７８Ａ)および腫瘍(図７８Ｂ)の両者で、野生型およびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度が類似することを観察した。これらの類似レベルは、野生型およびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞の両者が、最初に腫瘍に同様に良好に輸送されることを示す。９日の時点で、野生型メソＣＡＲ  Ｔ細胞およびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞両者の数は脾臓で減少した。しかしながら、腫瘍をこの時点で試験したとき、ＷＴメソＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、Ｉｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞数の有意な増加があった(図７８Ｂ)。これらのデータは、Ｉｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞が、免疫抑制性微小環境においてＷＴメソＣＡＲ  Ｔ細胞よりも良好に残留または増殖することを示す。
【１１９１】
腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)は、免疫抑制性腫瘍微小環境内のその同族抗原に応答して機能低下となり、腫瘍進行と関連する鍵となる現象である(Prinz et al., J Immunol. 2012; 188:5990-6000;およびKerkar et al., Cancer Res. 2012; 72:3125-30)。９日目に腫瘍に多くのＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞が存在したが、腫瘍微小環境によりまだ不利な影響を受けている可能性があった。機能性を評価するために、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を使用して、移入９日後野生型およびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞から単離したＴＩＬＳを刺激し、溶解性メディエーター産生の差異を特徴付けした。移入９日後、脾臓の野生型メソＣＡＲ  Ｔ細胞は、適度なレベルのＩＦＮを産生し続ける(図７８Ｃ)。予想通り、腫瘍から単離した野生型Ｔ細胞は、脾臓から単離した野生型Ｔ細胞と比較して、これらのサイトカイン産生がはるかに少ない。これは、野生型ＴＩＬが移入９日後機能低下的になり始めたことを示す。対照的に、脾臓Ｉｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞は、ベースラインでおよび刺激によりより多くのＩＦＮを産生する(図７８Ｃ)。野生型ＴＩＬと比較して、Ｉｋｚｆ１±ＴＩＬは、高量のＩＦＮ−γを産生した。これらのデータは、Ｉｋｚｆ１±ＴＩＬが免疫抑制性腫瘍微小環境に低感受性であり得ることを示す。
【１１９２】
ＴＩＬでしばしば見られるＴＣＲシグナル伝達の近位欠損迂回は、ＰＭＡ／イオノマイシン(ＰＭＡ／Ｉ)の使用により達成できる(Prinz et al., J Immunol. 2012; 188:5990-6000)。野生型およびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞をＰＭＡ／Ｉで再刺激して、ＴＣＲ刺激非感受性野生型およびＩｋｚｆ１±ＴＩＬが、他の刺激に応答してなおサイトカインを産生できるかを決定した。移入９日後、野生型ＴＩＬは、ＩＦＮ−γ産生の顕著な低下を示し(図７８Ｃ)、これはＰＭＡ／Ｉでの刺激により一部回復した(図７８Ｄ)。しかしながら、脾臓および腫瘍単離Ｉｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激は、野生型移入細胞と比較してなお増加したレベルのＩＦＮ−γを生じた。ＰＭＡ／Ｉ刺激によるＴＣＲシグナル伝達の何らかの欠損の迂回を介して、これらの結果は、ＩＦＮ−γ産生がクロマチンレベルで異なり、差次的イカロス機能による可能性があることを示す。
【１１９３】
移入Ｉｋｚｆ１±Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増加に鑑み、免疫抑制性腫瘍微小環境における本組成物の影響も試験し、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)および骨髄系由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)の数を９日目に評価した。移入９日後、野生型またはＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた宿主で同様のレベルのＴｒｅｇが観察された(図７８Ｅ)。概して免疫抑制性および腫瘍形成促進性Ｍ２マクロファージとして特徴付けられる、Ｌｙ６Ｇ−／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ２０６＋マクロファージの存在を検出した。処置９日目、ＣＤ２０６発現は全３群(未処置、野生型およびＩｋｚｆ１±)で類似した(図７８Ｆ)。
【１１９４】
イカロスが減少したＴ細胞は、可溶性阻害因子ＴＧＦおよびアデノシンに低感受性である
免疫抑制性腫瘍微小環境とメソＣＡＲ  Ｔ細胞の相互作用をさらに特徴付けるために、インビトロ培養系を利用した。ＩＤＯ、ＩＬ−１０、アデノシンおよびＴＧＦ−βのような可溶性阻害因子(Wang et al., Oncoimmunology. 2013; 2:e26492)は、浸潤性腫瘍リンパ球の阻止に貢献することが示されている。イカロス欠損ＣＡＲ  Ｔ細胞における選択した阻害因子のインビトロの効果を試験して、免疫抑制性環境がその溶解性機能に影響するか否かを決定した。野生型ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＴＧＦ−βおよびアデノシン存在下、ＩＦＮ−γを製造する能力が５０％減少し、溶解性機能が減少した(図７９)。イカロスのレベルが減少したＣＡＲ  Ｔ細胞(Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ)は、阻害剤非存在下で野生型カウンターパートより多くのＩＦＮ−γを製造し続け、ＴＧＦ−βおよびアデノシン存在下で、わずかしか阻害されなかった(図７９Ａ)。野生型Ｔ細胞と比較したＩｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の溶解性機能増加が観察された(図７９Ｂ)。これらのデータは、イカロスが減少したＴ細胞は、ＴＧＦ−βおよびアデノシン阻害に低感受性であることが示される。
【１１９５】
考察
本実施例において、腫瘍環境においてＣＡＲ発現Ｔ細胞を生存させ、そのエフェクター機能を増加させる新たな試みが同定された。Ｔ細胞機能に関与する多種多様な遺伝子、例えば、サイトカイン遺伝子(ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ)、細胞溶解性メディエーター(グランザイムＢ)およびＴ細胞分化に影響する重要なＴ−ｂｏｘ転写因子(Ｒ−ＢｅｔおよびＥｏｍｅｓ)を阻害することが知られる、転写リプレッサーイカロスの不活性化である。
【１１９６】
上記実験からの重要な知見は、イカロス機能が欠損したＣＡＲ  Ｔ細胞が、腫瘍増殖の抑制に野生型ＣＡＲ  Ｔ細胞より有意に良好であったことである(図３０)。これらの結果は複数の腫瘍モデルで、２種の異なるＣＡＲ構築物を使用して観察された。イカロスが制御する遺伝子が多数であるため、イカロスが免疫抑制に通常感受性である多くの経路を制御し得ることは妥当である。ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるイカロスレベル減少によるＩＦＮ−ｇ産生増加は、腫瘍におけるクラスＩ  ＭＨＣ発現を上方制御でき、それによりその免疫原性を改善し、抗血管形成活性を改善し、Ｔｈ１細胞のＳＴＡＴ１介在機能の駆動をする。ＩＦＮ−γ増加の可能性のある効果は、腫瘍内のマクロファージ表現型の改変であろうが、しかしながら、マクロファージ総数も、Ｍ２様マクロファージ比率も(ＣＤ２０６発現で測定して)差異は観察されなかった。ＩＬ−２産生増加もまたＣＤ４  Ｔｒｅｇ細胞の形成を増加させ得るが、しかしながら、ＷＴ  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびイカロス欠損ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した腫瘍を比較したとき、差異は観察されなかった。
【１１９７】
注射９日後、腫瘍浸潤性リンパ球数の増加が観察された。３日目のＷＴとイカロス欠損ＴＩＬの数が類似していたため、これは輸送増加によるものではなさそうである。むしろ、これらの結果は、イカロス欠損ＴＩＬが増殖増加または抗原誘発細胞死(ＡＩＣＤ)減少を示したことを示唆する。インビトロ試験は、２タイプのＴ細胞でＡＩＣが類似しており、この差異が増殖増加によるものであるとの可能性を高めた。これは、これらの細胞により産生されるＩＬ−２の増加と一致する。残留性の増加に加えて、イカロス欠損ＴＩＬは機能低下が低いように見える。腫瘍浸潤性ＣＡＲ  Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体またはＰＭＡおよびイオノマイシンで再刺激したとき、イカロス欠損を有するＣＡＲ  ＴＩＬは、野生型カウンターパートよりも多くのＩＦＮ−γを産生できた(図７８Ｃおよび７８Ｄ)。
【１１９８】
インビトロ試験は、インビボで観察された抗腫瘍有効性増加の機構的支持のさらなる試験を可能にした。イカロスの既知阻害機能と一致して、１つのイカロスアレルの欠失(Ｉｋｚｆ±)または１つのアレルのイカロスドミナントネガティブ構築物への置換(ＩｋＤＮ)は、ベースライン自己分泌ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢ産生がいくぶん増加したが(図２６)、より重要なことに、インビトロでのＴＣＲまたはＣＡＲ刺激後著しく増加したサイトカイン分泌および顆粒放出を示した、Ｔ細胞を生じた。これはインビトロでの腫瘍細胞致死増加に附随した。イカロス欠損ＣＡＲ  Ｔ細胞がＷＴ  ＣＡＲ  Ｔ細胞より低い活性化閾値を有するか否かを試験するために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを１０倍低いメソテリンタンパク質で被覆し、Ｉｋｚｆ±ＣＡＲ  Ｔ細胞がこの低密度でなおメソテリン抗原に応答し、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを産生できるが、ＷＴ  ＣＡＲ  Ｔ細胞はできなかったことを示した。イカロス障害ＣＡＲ  Ｔ細胞も、ＴＧＦ−βおよびアデノシンのような既知免疫抑制性因子による阻害に、より抵抗性であった(図３２)。これは、恐らく、サイトカイン(すなわちＩＬ−２およびＩＦＮ−γ)およびＴ細胞エフェクター(すなわちグランザイムＢ)遺伝子が、ＴＣＲ／ＣＡＲ活性化後イカロス欠損Ｔ細胞における転写のためにより利用しやすいとの事実による。これは、免疫抑制性腫瘍微小環境内の最適以下Ｔ細胞活性化に対する代償を助けると考えられる。
【１１９９】
先の試験、例えば、実施例１１において、第二メッセンジャージアシルグリセロールを代謝し、ＲＡＳ／ＥＲＫ活性化を制限する酵素であるＤＧＫの枯渇により、類似の表現型(すなわち細胞溶解およびＩＦＮ産生の増加)がＣＡＲ  Ｔ細胞で観察された。ＤＧＫ欠失を用いて、しかしながら、ＣＡＲ／ＴＣＲシグナル伝達経路の明確な変化が観察された。具体的に、ＲＡＳ／ＥＲＫ活性化は、ＴＣＲおよびＣＡＲ両者での活性化の後劇的に増強された。これは、ＣＤ６９上方制御の増加により測定して、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬおよびＩＦＮ−γのようなエフェクター分子の産生はどうであろうと、活性化を増加させた。パーフォリンおよびグランザイムＢは、ＷＴおよびＤＧＫ欠損ＣＡＲ  Ｔ細胞で類似した。イカロス欠損ＣＡＲ  Ｔ細胞が本試験で極めて異なる表現型であった。ＤＧＫ欠損ＣＡＲ  Ｔ細胞とは対照的に、イカロス欠損ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ６９およびＣＤ２５上方制御で示して類似のＣＡＲ／ＴＣＲ活性化(図７５)および複数のＴＣＲシグナル伝達分子のリン酸化により測定して類似のＣＡＲ／ＴＣＲシグナル伝達(図７５)およびカルシウムシグナル伝達を有した。ＤＧＫ欠損Ｔ細胞とは異なり、イカロス枯渇ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ベースラインで高いグランザイムＢおよびＩＦＮレベル(図７３および７４)ならびにＥＲＫおよびＡｋｔのようないくつかのＴＣＲシグナル伝達の構成的低レベル活性化を有した(図７５)。このベースライン活性化は、恐らく、ＩＦＮおよびグランザイムＢ遺伝子発現をトランス活性化するＥｏｍｅｓのような他の転写因子と協調する、Ｔ−ｂｅｔ(Ｔhomas et al., J of Biol Chemistry. 2010; 285:2545-53)の誘導による(Pearce et al., Science. 2003; 302:1041-3;およびIntelkofer et al., Nat Immunol. 2005; 6:1236-44)。
【１２００】
これらの知見は、遺伝的または生化学的試みのいずれかを使用して、形質導入ヒトＴ細胞(臨床試験)においてイカロスを治療ターゲティングとすることが有益である可能性を生じさせる。遺伝的試みは、マウスでこれらの結果を模倣し、ｓｈＲＮＡを使用したＣＡＲ  Ｔ細胞におけるイカロスのノックダウンまたは内在性イカロスと競合するためのドミナントネガティブ構築物の使用を含む。他の選択肢は、一過性にイカロスレベルを低下させる薬理学的阻害剤の使用である。最近の報告では、免疫調節剤であるレナリドマイドが、Ｅ３リガーゼ複合体ＣＲＬ４ＣＲＢＮによるユビキチン介在分解についてイカロスを標的とすることが示されている(Gandhi et al., Br J Haematol. 2013; 164:811-21; Kronke et al, Science. 2014; 343:301-5;およびSakamaki et al., Leukemia. 2013; 28:329-37)。レナリドマイドで処理したＣＤ３刺激ヒトＴ細胞は、イカロスレベルが減少したＴ細胞の重要な性質である、より多くのＩＬ−２を産生する(Gandhi et al., Br J Haematol. 2013; 164:811-21)。予備試験において、ＴＣＲ／ＣＤ２８刺激メソテリン−ＣＡＲ形質導入ヒトＰＢＭＣは、インビトロで、レナリドマイドでの前処理後、より多くのＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生した。それゆえに、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法とレナリドマイドのインビボ投与の組み合わせは、イカロスの阻害によるＴ細胞機能低下の回復のための治療戦略を提供し得る。
【１２０１】
結論として、この実施例は、転写リプレッサーのターゲティングがＣＡＲ介在抗腫瘍免疫を増強できることを最初に示す。本機構は、シグナル伝達の変化を伴わない、サイトカインおよびエフェクター機能増強を含んだ。この試みの臨床への転換は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるイカロスを標的とするｓｈＲＮＡ、ドミナントネガティブ構築物または薬理学的阻害剤(例えばレナリドマイド)の使用を介して進められ得る。
【１２０２】
実施例１４：外来性ＩＬ−７はＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を増強する
ＣＡＲ  Ｔ細胞の養子移入後、一部の患者は、最適以下のレベルの抗腫瘍活性をもたらし得る、ＣＡＲ  Ｔ細胞の限定的持続を経験する。この実施例において、外来性ヒトＩＬ−７投与の効果を、ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する初期最適以下応答が観察されているマウス異種移植モデルで評価する。
【１２０３】
リンパ腫モデルにおける外来性ＩＬ−７処置
ＩＬ−７受容体ＣＤ１２７の発現を、まず異なる癌細胞株およびＣＡＲ発現細胞で評価した。２マントル細胞リンパ腫細胞株(ＲＬおよびＪｅｋｏ−１)および１Ｂ−ＡＬＬ細胞株(Ｎａｌｍ−６)を、ＣＤ１２７発現についてフローサイトメトリーで分析した。図８０Ａに示すように、試験した３癌細胞株試験中、ＲＬはＣＤ１２７の最高発現を有し、続いてＪｅｋｏ−１およびＮａｌｍ−６であることが示された。ＣＡＲＴ１９細胞をＮＳＧマウスに注入し、ＣＤ１２７発現を、フローサイトメトリーにより循環ＣＡＲＴ１９細胞において評価した。図８０Ｂに示すように、ＣＤ１２７は全循環ＣＡＲＴ１９細胞で均一に発現される。
【１２０４】
次に、ＣＡＲＴ１９細胞の抗腫瘍活性に対する外来性ＩＬ−７処置の効果を、リンパ腫動物モデルにおいて評価した。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼ発現マントル細胞株(ＲＬ  ｌｕｃ)を０日目(Ｄ０)に移植し、続いて６日目にＣＡＲＴ１９細胞で処置した。ＮＳＧマウスを群に分け、ここで、第一群はＣＡＲＴ１９細胞を受けず、第二群は０.５×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞を受け、第三群は１×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞を受け、第４群は２×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞を受けた。腫瘍サイズを、８０日を越えて移植腫瘍の平均バイオルミネセンスを測定することによりモニターした。２×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウスのみが、腫瘍に対する拒絶および腫瘍増殖阻止を示した(図８１Ａ)。０.５×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞または１×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞を受けた２群のマウスは、最適以下の抗腫瘍応答を示した。これらの２群のマウスを次いで無作為化し、３匹のマウス(０.５×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス＃３８２７および＃３８２９および１×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス＃３８１５)は、８５日目に開始して、週に３回２００ｎｇ／マウスの用量で外来性組み換えヒトＩＬ−７の腹腔内注射を受け、２匹のマウスは受けなかった。平均バイオルミネセンスで決定した、８５〜１２５日目に外来性ＩＬ−７を受けたマウスの腫瘍負荷を図８１Ｂに示す。ＩＬ−７を受けた全マウスが、腫瘍負荷の１〜３ログ減少の劇的応答を示した。元々高用量ＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス(１×１０６  ＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス＃３８１５)は、より著明な応答を示した。ＩＬ−７処置を受けたマウスと対照で腫瘍負荷を比較したとき、ＩＬ−７処置前後で、腫瘍負荷における腫瘍減少は、ＩＬ−７処置を受けたマウスでのみ見られた(図８１Ｃ)。
【１２０５】
リンパ腫動物モデルにおけるＩＬ−７処置後のＴ細胞動態も試験した。ヒトＣＡＲＴ１９細胞は、ＩＬ−７処置は血液で検出不可能であった。ＩＬ−７での処置により、処置マウスにおけるＴ細胞数の急速であるが、不定の増加があった(図８２Ａ)。ＩＬ−７を受けたマウスで観察されるＴ細胞増殖の程度はまた腫瘍応答と相関した。ＩＬ−７処置中のピーク増殖時に血液で最高数のＴ細胞が検出されたマウス(マウス＃３８１５)は、腫瘍負荷の最も強い減少を有した(図８１Ｂ参照)。さらに、ピーク増殖の時間は、ベースラインとして注射したＴ細胞用量と相関した。血液中のＣＤ３発現細胞数／レベルも、ＩＬ−７処置前後に測定した。対照マウスにおいて、ＣＤ３発現細胞はほとんど検出されなかったが、ＩＬ−７−処置マウスは、ＩＬ−７処置後ＣＤ３＋細胞の有意な増加を示した(図８２Ｂ)。
【１２０６】
白血病モデルにおける外来性ＩＬ−７処置
ＩＬ−７受容体(ＣＤ１２７)発現を、フローサイトメトリーにより白血病細胞株(ＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ１４およびＢ−ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６)および初代ＡＭＬ細胞で測定した(図８３、上部パネル)。ＩＬ−７受容体発現は、Ｂ−ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６細胞で現れたが、ＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ１４または初代ＡＭＬではなかった。フローサイトメトリー分析は、ＩＬ−７受容体発現が腫瘍細胞のみで検出されるようにゲート開閉した。
【１２０７】
次に、ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３細胞の抗腫瘍活性に対する外来性ＩＬ−７処置の効果を、初期ＣＡＲＴ処置後再発したＡＭＬの白血病動物モデルで評価した(図８４)。ルシフェラーゼ発現ＭＯＬＭ１４細胞をＮＳＧマウスに注射し、マウスはＡＭＬを発症した。ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３処置を開始し、腫瘍負荷を連続バイオルミネセンス造影によりモニターした。非形質導入Ｔ細胞を対照として注射した。ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３処置を受けたマウスは、最初はＴ細胞処置に応答したが、Ｔ細胞注入１４日後までに再発した(図８５Ａ)。ＩＬ−７受容体発現を、ＡＭＬ再発を示したマウスにおけるフローサイトメトリーにより、ＡＭＬ細胞で測定した。ＩＬ−７受容体発現は、ＣＡＲＴ３３またはＣＡＲＴ１２３で処置されていても、再発したＡＭＬ細胞で観察されなかった(図８３、下部パネル)。
【１２０８】
２８日目、再発したマウスを無作為化し、未処置(対照)または２００ｎｇ／マウスを週３回腹腔内注射によるＩＬ−７処置に割り当てた。ＩＬ−７処置または対照処置後の腫瘍負荷を、毎週のバイオルミネセンス造影および応答によりモニターし、Ｔ細胞増殖および全体的生存も評価した。図８５Ｂは、ＩＬ−７処置後の最良の応答が、バイオルミネセンス造影(ＢＬＩ)で決定して、ＩＬ−７処置および対照群で見られたことを示す。代表的バイオルミネセンス画像を図８５Ｃに示し、２８日間のＩＬ−７または対照処置中、抗腫瘍応答がＩＬ−７処置を受けたマウスで増加したことが示される。Ｔ細胞増殖(例えば、ＣＡＲＴ３３およびＣＡＲＴ１２３)をマウスの血液から定量し、ＩＬ−７処置中の血液中のＴ細胞数が腫瘍負荷の減少と相関した(図８６Ａ)。ＩＬ−７処置を受けたマウスはまた生存ｎ延長も示した(図８６Ｂ)。
【１２０９】
まとめると、この実施例の結果は、外来性ＩＬ−７処置がインビボでＴ細胞増殖および抗腫瘍活性を増加させることを示し、ＣＡＲ治療後最適以下の結果または再発した患者へのＩＬ−７が、これらの患者における抗腫瘍応答を改善できることを示す。
【１２１０】
さらに記載せずとも、当業者は、前の記載および説明的実施例を使用して、本発明の化合物を製造および利用し、本願発明方法を実施できると考える。作業実施例は、本発明の多様な面を特に示すものであり、本開示を限定するものと解釈されるべきでない。
【１２１１】
均等物
ここに引用する各および全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明は、具体的面を参照して開示しているが、本発明の他の面および異形が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく他の当業者により考案され得ることは明らかである。下記特許請求の範囲は、全てのこのような面および等価な異形を含むと解釈されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９−１】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５−１】
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【図７５−２】
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【図７６−１】
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【図７７−１】
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【図７７−２】
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【図７８−１】
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【図７８−２】
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【図７８−３】
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【図７９−１】
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【図８０−１】
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【図８０−２】
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【図８０−３】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３−１】
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【図８３−２】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７−１】
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【図８７−２】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２−１】
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【図９２−２】
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【配列表】
2019206538000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月31日(2019.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍抗原の発現と関係する疾患を有する対象の処置においてサイトカインと組み合わせて投与される、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子を包含する免疫エフェクター細胞(ＣＡＲ発現細胞)を含む組成物であって、ここで、
ＣＡＲ分子が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、
サイトカインが、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１の組合せ、またはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドの組合せから選択される、
組成物。
【請求項２】
ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの組合せが、ｈｅｔＩＬ−１５を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
腫瘍抗原の発現と関係する疾患が腫瘍抗原の発現と関係する増殖性疾患、前癌状態、癌および非癌関連徴候からなる群より選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
癌が慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、急性白血病、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病(Ｂ−ＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞性腫瘍、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および前白血病状態の１以上から選択される血液の癌である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ＣＡＲ発現細胞およびサイトカインが別個の組成物で投与される、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ＣＡＲ発現細胞およびサイトカインが逐次的に投与される、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ＣＡＲ発現細胞がまず投与され、サイトカインが次に投与される、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
サイトカインが、ＣＡＲ発現細胞の投与の１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後に投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
サイトカインが、ＣＡＲ発現細胞の投与の少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１０週間後またはそれ以上後に投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
サイトカインがまず投与され、ＣＡＲ発現細胞が次に投与される、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項１１】
対象がさらに、
(a)タンパク質ホスファターゼ阻害剤；
(b)キナーゼ阻害剤；
(c)免疫阻害分子の阻害剤；または
(d)ＴＲＥＧ細胞のレベルもしくは活性を低下させる薬剤
から選択されるさらなる薬剤を投与される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
(ｉ)タンパク質ホスファターゼ阻害剤が、ＳＨＰ−１阻害剤および／またはＳＨＰ−２阻害剤であり；
(ii)キナーゼ阻害剤が、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＮＫ阻害剤またはデュアルＰ１３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤の１以上から選択され；
(iii)免疫阻害分子を阻害する薬剤が、阻害分子の発現を阻害する抗体または抗体フラグメント、阻害性核酸、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を含み；および／あるいは
(iv)ＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤が、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせから選択される、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
抗原結合ドメインが疾患と関係する腫瘍抗原と結合し、該腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＴＳＨＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、Ｃ型レクチン様分子−１(ＣＬＬ−１)、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ抗原(Ｔｎ  Ａｇ)、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３(ＦＬＴ３)、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３(ＣＤ２７６)、ＫＩＴ(ＣＤ１１７)、インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２(ＩＬ−１３Ｒａ２)、メソテリン、インターロイキン１１受容体アルファ(ＩＬ−１１Ｒａ)、前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)、プロテアーゼセリン２１(ＰＲＳＳ２１)、血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)、ルイス Ｙ 抗原、ＣＤ２４、血小板由来増殖因子受容体ベータ(ＰＤＧＦＲ−ベータ)、ステージ特異的胚性抗原−４(ＳＳＥＡ−４)、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ２／ｎｅｕ)、ムチン１細胞表面関連(ＭＵＣ１)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ)、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、炭酸脱水酵素IX(ＣＡＩＸ)、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、エフリンＡ型受容体２(ＥｐｈＡ２)、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子(ｓＬｅ)、ガングリオシドＧＭ３、ＴＧＳ５、高分子量黒色腫関連抗原(ＨＭＷＭＡＡ)、ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド(ＯＡｃＧＤ２)、葉酸受容体ベータ、腫瘍内皮マーカー１(ＴＥＭ１／ＣＤ２４８)、腫瘍内皮マーカー７関連(ＴＥＭ７Ｒ)、クローディン６(ＣＬＤＮ６)、Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ(ＧＰＲＣ５Ｄ)、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１(ＣＸＯＲＦ６１)、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)、ポリシアル酸、胎盤特異的１(ＰＬＡＣ１)、ＧｌｏｂｏＨ、乳腺分化抗原(ＮＹ−ＢＲ−１)、ウロプラキン２(ＵＰＫ２)、Ａ型肝炎ウイルス細胞性受容体１(ＨＡＶＣＲ１)、アドレナリン受容体ベータ３(ＡＤＲＢ３)、パンネキシン３(ＰＡＮＸ３)、Ｇタンパク質共役受容体２０(ＧＰＲ２０)、リンパ球抗原６複合体座位Ｋ９(ＬＹ６Ｋ)、嗅覚受容体５１Ｅ２(ＯＲ５１Ｅ２)、ＴＣＲガンマ選択的リーディングフレームタンパク質(ＴＡＲＰ)、ウィルムス腫瘍タンパク質(ＷＴ１)、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、ＭＡＧＥ  Ａ１、染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異体遺伝子６(ＥＴＶ６−ＡＭＬ)、精子タンパク質１７(ＳＰＡ１７)、Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ａ(ＸＡＧＥ１)、アンギオポエチン結合細胞表面受容体２(Ｔｉｅ  ２)、黒色腫癌精巣抗原−１(ＭＡＤ−ＣＴ−１)、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(ｈＴＥＲＴ)、肉腫転座切断点、アポトーシスの黒色腫阻害剤(ＭＬ−ＩＡＰ)、ＥＲＧ(膜貫通型プロテアーゼ、セリン２(ＴＭＰＲＳＳ２)ＥＴＳ融合遺伝子)、Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ(ＮＡ１７)、ペアードボックスタンパク質Ｐａ��−３(ＰＡＸ３)、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ｖ−ｍｙｃトリ骨髄細胞腫ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ(ＭＹＣＮ)、ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ(ＲｈｏＣ)、ＴＲＰ−２、チトクロムＰ４５０  １Ｂ１(ＣＹＰ１Ｂ１)、ＢＯＲＩＳ、Ｔ細胞３により認識される扁平上皮細胞癌抗原(ＳＡＲＴ３)、ＰＡＸ−５、プロアクロシン結合タンパク質ｐ３２(ＯＹ−ＴＥＳ１)、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(ＬＣＫ)、Ａキナーゼアンカータンパク質４(ＡＫＡＰ−４)、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン様受容体１(ＬＡＩＲ１)、ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント(ＦＣＡＲ)、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２(ＬＩＬＲＡ２)、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ(ＣＤ３００ＬＦ)、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ(ＣＬＥＣ１２Ａ)、骨髄間質細胞抗原２(ＢＳＴ２)、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２(ＥＭＲ２)、リンパ球抗原７５(ＬＹ７５)、グリピカン−３(ＧＰＣ３)、Ｆｃ受容体様５(ＦＣＲＬ５)および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１(ＩＧＬＬ１)からなる群から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ＣＡＲ分子の抗原結合ドメインが、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２、単一ドメイン抗体(ＳＤＡＢ)、ＶＨまたはＶＬドメインまたはラクダ類ＶＨＨドメインを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
(i)膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｃからなる群より選択されるたんぱく質の膜貫通ドメインを含むか；
(ii)膜貫通ドメインが、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含むか；あるいは
(iii)抗原結合ドメインがヒンジ領域により膜貫通ドメインに接続され、ここで、該ヒンジ領域は、配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
細胞内シグナル伝達ドメインが、(i)一次シグナル伝達ドメインを含むか；(ii)共刺激シグナル伝達ドメインを含むか；または、(iii) (i)および(ii)の両方を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
細胞内シグナル伝達ドメインが、
(i)ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲIIａ、ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１２のシグナル伝達ドメインを含む一次シグナル伝達ドメインを含むか、
(ii)ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６またはＮＫＧ２Ｄのシグナル伝達ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含むか、
(iii)配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列、配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列、および／あるいは配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含むか、あるいは
(iv)配列番号１５もしくは配列番号１７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列、および／あるいは配列番号１９もしくは配列番号２１の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含む、
請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
免疫エフェクター細胞が、ヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞であり、ここで、Ｔ細胞がジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)および／またはイカロス欠損である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月2日(2019.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
【図１１】図１１Ａ：エレクトロポレーション後のＫ５６２細胞におけるＥｒｂＢ２発現を示す一群の画像である。Ｋ５６２細胞を、記載する量のＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡで電気穿孔し、染色はＥｒｂＢ２発現細胞を示す(白抜きヒストグラム)；二次抗体のみとインキュベートした細胞は背景を示す(灰色ヒストグラム)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
図１１Ｂ：ＥｒｂＢ２  ｍＲＮＡ電気穿孔Ｋ５６２細胞により刺激された一団のＥｒｂＢ２  ＣＡＲＴ細胞によるＩＦＮ−ガンマ分泌。Ｋ５６２細胞を、示すように、２μｇまたは１０μｇＥｒｂＢ２  ＣＡＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を記載するＫ５６２標的と共培養し、ＩＦＮ−ガンマ分泌を２４時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2019206538.tif 000170
【図２】
2019206538.tif 000171
【図３】
2019206538.tif 000172
【図４−１】
2019206538.tif 000173
【図４−２】
2019206538.tif 000174
【図５】
2019206538.tif 000175
【図６】
2019206538.tif 000176
【図７】
2019206538.tif 000177
【図８】
2019206538.tif 000178
【図９】
2019206538.tif 000179
【図１０−１】
2019206538.tif 000180
【図１０−２】
2019206538.tif 000181
【図１０−３】
2019206538.tif 000182
【図１１】
2019206538.tif 000183
【図１２】
2019206538.tif 000184
【図１３】
2019206538.tif 000185
【図１４】
2019206538.tif 000186
【図１５】
2019206538.tif 000187
【図１６−１】
2019206538.tif 000188
【図１６−２】
2019206538.tif 000189
【図１７−１】
2019206538.tif 000190
【図１７−２】
2019206538.tif 000191
【図１８−１】
2019206538.tif 000192
【図１８−２】
2019206538.tif 000193
【図１９−１】
2019206538.tif 000194
【図１９−２】
2019206538.tif 000195
【図２０】
2019206538.tif 000196
【図２１】
2019206538.tif 000197
【図２２】
2019206538.tif 000198
【図２３】
2019206538.tif 000199
【図２４】
2019206538.tif 000200
【図２５】
2019206538.tif 000201
【図２６】
2019206538.tif 000202
【図２７】
2019206538.tif 000203
【図２８】
2019206538.tif 000204
【図２９】
2019206538.tif 000205
【図３０】
2019206538.tif 000206
【図３１】
2019206538.tif 000207
【図３２】
2019206538.tif 000208
【図３３】
2019206538.tif 000209
【図３４−１】
2019206538.tif 000210
【図３４−２】
2019206538.tif 000211
【図３５−１】
2019206538.tif 000212
【図３５−２】
2019206538.tif 000213
【図３６−１】
2019206538.tif 000214
【図３６−２】
2019206538.tif 000215
【図３６−３】
2019206538.tif 000216
【図３７−１】
2019206538.tif 000217
【図３７−２】
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【図３８−１】
2019206538.tif 000219
【図３８−２】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
2019206538.tif 000222
【図３９−３】
2019206538.tif 000223
【図４０−１】
2019206538.tif 000224
【図４０−２】
2019206538.tif 000225
【図４１】
2019206538.tif 000226
【図４２】
2019206538.tif 000227
【図４３】
2019206538.tif 000228
【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
2019206538.tif 000232
【図４８】
2019206538.tif 000233
【図４９】
2019206538.tif 000234
【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７−１】
2019206538.tif 000252
【図６７−２】
2019206538.tif 000253
【図６８】
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【図６９】
2019206538.tif 000255
【図７０】
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【図７１】
2019206538.tif 000257
【図７２】
2019206538.tif 000258
【図７３−１】
2019206538.tif 000259
【図７３−２】
2019206538.tif 000260
【図７４−１】
2019206538.tif 000261
【図７５−１】
2019206538.tif 000262
【図７５−２】
2019206538.tif 000263
【図７６−１】
2019206538.tif 000264
【図７６−２】
2019206538.tif 000265
【図７６−３】
2019206538.tif 000266
【図７７−１】
2019206538.tif 000267
【図７８−１】
2019206538.tif 000268
【図７８−２】
2019206538.tif 000269
【図７８−３】
2019206538.tif 000270
【図７９】
2019206538.tif 000271
【図８０】
2019206538.tif 000272
【図８１−１】
2019206538.tif 000273
【図８１−２】
2019206538.tif 000274
【図８２】
2019206538.tif 000275
【図８３】
2019206538.tif 000276
【図８４】
2019206538.tif 000277
【図８５−１】
2019206538.tif 000278
【図８５−２】
2019206538.tif 000279
【図８６】
2019206538.tif 000280
【図８７】
2019206538.tif 000281
【図８８】
2019206538.tif 000282
【図８９】
2019206538.tif 000283
【図９０−１】
2019206538.tif 000284
【図９０−２】
2019206538.tif 000285
【外国語明細書】
2019206538000001.pdf