(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団の増殖を抑制し、固形癌、血液癌を治療する方法の提供。【解決手段】胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、及び胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞、並びにそれらの組合せを使用して、それを含む組成物を、腫瘍細胞又は腫瘍細胞の集団と接触させることを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、前記腫瘍細胞をヒト胎盤灌流液細胞と接触さ
せることを含む方法。
【請求項２】
前記腫瘍細胞が血液癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍細胞が固形癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍細胞が、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄リ
ンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌
細胞、大腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、大腸直腸癌細胞、大腸直腸腺癌細胞、また
は網膜芽細胞腫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記胎盤灌流液が、胎盤脈管構造のみを通過した灌流液である、請求項１に記載の方法
。
【請求項６】
前記胎盤灌流液が、前記胎盤脈管構造を通過し、前記胎盤の母体側から回収される、請
求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記灌流液が、前記胎盤脈管構造に０．９％ＮａＣｌ溶液を通過させることによって取
得される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記灌流液が培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記灌流液が、複数の赤血球を取り除くように処理されている、請求項１に記載の方法
。
【請求項１０】
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの接触である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの接触である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記接触が、ヒトにおける接触である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の胎盤灌流液細胞が、胎盤灌流液に由来する総有核細胞である、請求項１に記
載の方法。
【請求項１４】
前記胎盤灌流液細胞が、少なくとも１つのタイプの細胞を取り除くように処理されてい
る、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記胎盤灌流液細胞が、少なくとも１つのタイプの細胞を濃縮するように処理されてい
る、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記胎盤灌流液細胞が、少なくとも約５０％のＣＤ５６＋胎盤細胞を含む、請求項１に
記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＤ５６＋細胞が、ＣＤ５６コンジュゲートマイクロビーズによって選択される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記灌流液細胞および前記腫瘍細胞が、腫瘍細胞１個当たり約５個の灌流液細胞の比率
で接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記灌流液細胞および前記腫瘍細胞が、腫瘍細胞１個当たり約１０個の灌流液細胞の比
率で接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、前記腫瘍細胞を複数のＣＤ５６＋、ＣＤ１６
−胎盤中間ナチュラルキラー（ＰＩＮＫ）細胞と接触させることを含む方法。
【請求項２１】
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記接触が、ヒトにおいて生じる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍細胞が、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄リ
ンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌
細胞、大腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、大腸直腸癌細胞、大腸
直腸腺癌細胞、または網膜芽細胞腫細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＩＮＫ細胞が、マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１
２７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、
ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−３ｐ、ｈ
ｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｃ、
ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈ
ｓａ−ｍｉＲ−５２０ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６４、ｈｓａ
−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａの
うち１つまたは複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に高いレベル
で発現する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
免疫調節化合物と接触しなかった同等数のＰＩＮＫ細胞よりも検出可能な程度に多くの
グランザイムＢを前記ＰＩＮＫ細胞が発現するのに十分な量で十分な時間、前記ＰＩＮＫ
細胞を前記免疫調節化合物と接触させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫調節化合物が、レナリドマイドまたはポマリドマイドである、請求項２６に記
載の方法。
【請求項２８】
免疫調節化合物と接触しなかった同等数のＰＩＮＫ細胞よりも検出可能な程度に大きな
前記腫瘍細胞に対する細胞傷害性を前記ＰＩＮＫ細胞が示すのに十分な量で十分な時間、
前記ＰＩＮＫ細胞を前記免疫調節化合物と接触させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫調節化合物が、レナリドマイドまたはポマリドマイドである、請求項２８に記
載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＩＮＫ細胞が、前記免疫調節化合物と接触しなかった同等数のＰＩＮＫ細胞より
高いレベルで、ＢＡＸ、ＣＣＬ５、ＣＣＲ５、ＣＳＦ２、ＦＡＳ、ＧＵＳＢ、ＩＬ２ＲＡ
、またはＴＮＦＲＳＦ１８のうち１つまたは複数を発現する、請求項２６または請求項２
６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＩＮＫ細胞が、前記免疫調節化合物と接触しなかった同等数のＰＩＮＫ細胞より
高いレベルで、ＡＣＴＢ、ＢＡＸ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＲ５、ＣＳＦ１
、ＣＳＦ２、ＥＣＥ１、ＦＡＳ、ＧＮＬＹ、ＧＵＳＢ、ＧＺＭＢ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ２ＲＡ
、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＬＴＡ、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、ＳＫＩ、およびＴＢＸ２１のうち
１つまたは複数を発現する、請求項２６または請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、前記腫瘍細胞を混合ナチュラルキラー細胞と
接触させることを含み、前記混合ナチュラルキラー細胞が、胎盤灌流液から単離されたナ
チュラルキラー細胞、および臍帯血から単離されたナチュラルキラー細胞を含み、前記臍
帯血が、前記胎盤灌流液が取得された胎盤から単離される方法。
【請求項３３】
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記接触が、ヒトにおいて生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍細胞が、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄リ
ンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌
細胞、大腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、大腸直腸癌細胞、大腸
直腸腺癌細胞、または網膜芽細胞腫細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記混合ナチュラルキラー細胞が、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３＋ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４６＋ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＮＫｐ３０＋ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋２Ｂ４＋ナチュラルキラー細胞、または
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＣＤ９４＋ナチュラルキラー細胞
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ナチュラルキラー細胞が培養されていない、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記混合ナチュラルキラー細胞が、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３＋ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４６＋ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４４＋ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＮＫｐ３０＋ナチュラルキラー細胞を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記ナチュラルキラー細胞が培養されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ナチュラルキラー細胞が、約２１日間培養されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
単離されたＣＤ５６＋、ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞を含む組成物であって、前記
ナチュラルキラー細胞が胎盤灌流液から単離され、前記ナチュラルキラー細胞が前記組成
物中の細胞の少なくとも５０％を占める組成物。
【請求項４３】
前記ナチュラルキラー細胞が、前記組成物中の細胞の少なくとも８０％を占める、請求
項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記組成物が、単離されたＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を含む、請求
項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞が、前記ＣＤ５６＋、ＣＤ１６−ナ
チュラルキラー細胞とは異なる個体に由来する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ナチュラルキラー細胞が、単一の個体に由来する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４７】
前記単離されたナチュラルキラー細胞が、少なくとも２つの異なる個体に由来するナチ
ュラルキラー細胞を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４８】
単離された胎盤灌流液を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４９】
前記胎盤灌流液が、前記ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来する、請求項３６に記
載の組成物。
【請求項５０】
前記胎盤灌流液が、前記ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来する胎盤灌流液を
含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項５１】
胎盤灌流液細胞を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記胎盤灌流液細胞が、前記ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来する、請求項３９
に記載の組成物。
【請求項５３】
前記胎盤灌流液細胞が、前記ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来する、請求項
３９に記載の組成物。
【請求項５４】
単離された胎盤灌流液および単離された胎盤灌流液細胞を含み、前記単離された灌流液
および前記単離された胎盤灌流液細胞が異なる個体に由来する、請求項３０に記載の組成
物。
【請求項５５】
前記胎盤灌流液が、少なくとも２つの個体に由来する胎盤灌流液を含む、請求項３６に
記載の組成物。
【請求項５６】
前記胎盤灌流液細胞が、少なくとも２つの個体に由来する、請求項３９に記載の組成物
。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年９月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／９９５，７６３
号、および２００８年８月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／０９０，５５５号
の利益を請求するものであり、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ
る。
【０００２】
１．技術分野
胎盤灌流液、胎盤灌流液由来細胞、胎盤に由来する、例えば胎盤灌流液に由来するナチ
ュラルキラー細胞、ならびに／または胎盤に由来する、例えば胎盤灌流液に由来するナチ
ュラルキラー細胞、および臍帯血に由来するナチュラルキラー細胞を含む混合ナチュラル
キラー細胞と、腫瘍細胞を接触させることにより腫瘍細胞の成長または増殖を抑制する方
法が本明細書で提示される。胎盤に由来する、例えば胎盤灌流液、例えばヒト胎盤灌流液
に由来するナチュラルキラー細胞の固有の集団を産生する方法も本明細書で提供される。
胎盤灌流液およびそれに由来するナチュラルキラー細胞を使用して腫瘍細胞の増殖を抑制
する方法がさらに本明細書で提供される。
【背景技術】
【０００３】
２．背景技術
胎盤灌流液は、胎盤脈管構造に灌流溶液を通過させることによって取得される胎盤細胞
の回収物、および胎盤の脈管構造、胎盤の母体表面、またはその両方に由来する灌流液体
の回収物を含む。哺乳動物の胎盤を灌流する方法は、例えば、米国特許第７，０４５，１
４６号および米国特許第７，２５５，８７９号に記載されている。灌流によって取得され
る胎盤細胞の集団は異種性であり、造血性（ＣＤ３４＋）細胞、顆粒球、単球、およびマ
クロファージなどの有核細胞、少ないパーセンテージ（１％未満）の組織培養基質接着性
胎盤幹細胞、ならびにナチュラルキラー細胞が含まれている。現在に至るまで、腫瘍細胞
増殖の抑制における、胎盤灌流液の使用または灌流液に由来する胎盤細胞の集団の使用に
ついては誰も記述していない。
【０００４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の主要な構成要素となる細胞傷害性リ
ンパ球である。ＮＫ細胞は、ヒトにおいては、Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）、ＣＤ３
、または表面免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｂ細胞受容体を発現しないが、通常は、表面マーカ
ーＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）およびＣＤ５６を発現する。ＮＫ細胞は細胞傷害性であり
、それらの細胞質中の小顆粒には、グランザイムとして知られているパーフォリンおよび
プロテアーゼなどの特殊なタンパク質が含有されている。パーフォリンは、死が予定され
ている細胞のすぐ近くに放出されると、標的細胞の細胞膜に孔を形成し、そこからグラン
ザイムおよび関連分子が進入可能になり、アポトーシスが誘導される。あるグランザイム
、グランザイムＢ（グランザイム２および細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連セリンエステラー
ゼ１としても知られている）は、細胞性免疫反応において、標的細胞アポトーシスの急速
誘導に重要なセリンプロテアーゼである。
【０００５】
ＮＫ細胞は、インターフェロンまたはマクロファージ由来サイトカインに応答して活性
化される。活性化されたＮＫ細胞は、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と呼ばれ
る。ＮＫ細胞は、細胞の細胞傷害活性を制御する「活性化受容体」および「抑制性受容体
」と呼ばれる２つのタイプの表面受容体を保有している。
【０００６】
他の活性の中でも、ＮＫ細胞は、腫瘍の宿主拒絶に役割を果たす。癌細胞は、クラスＩ
ＭＨＣの発現を低減するか、または発現しないため、ＮＫ細胞の標的になり得る。ＰＢＭ
Ｃまたは骨髄から単離されたヒトＮＫ細胞のハプロタイプ一致性移植は、検出可能な移植
片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有することなく、強力な抗白血病効果を媒介することを示唆す
る臨床データが蓄積されている。Ｒｕｇｇｅｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：２０９７
〜２１００ページ（２００２）を参照されたい。ナチュラルキラー細胞は、主要組織適合
複合体（ＭＨＣ）タンパク質を欠如しているか、またはそのレベルの低減を示す細胞によ
って活性化され得る。活性化され増殖したＮＫ細胞およびＬＡＫ細胞は、進行癌を有する
患者のｅｘ  ｖｉｖｏ療法またはｉｎ  ｖｉｖｏ治療の両方に使用されており、白血病な
どの骨髄関連疾患、乳癌、およびあるタイプのリンパ腫に対してある程度の成功を収めて
きた。ＬＡＫ細胞治療では、患者はまずＩＬ−２を、次いで白血球フェレーシスを受容し
、その後、回収された自己血液細胞を数日間ＩＬ−２の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏインキュ
ベーションおよび培養することが必要とされる。治療を完了するためには、ＬＡＫ細胞を
比較的高用量のＩＬ−２と一緒に再注入しなければならない。このパージ治療（purging 
treatment）は高価であり、重篤な副作用を引き起こす場合がある。これらの副作用には
、体液貯留、肺水腫、血圧低下、および高熱が含まれる。
【０００７】
腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の死滅においてＮＫ細胞が有利な特性を有するにも関
わらず、ＮＫ細胞は、主に培養および増殖中にそれらの腫瘍標的能力および殺腫瘍能力を
維持するのが困難であるため、依然として取扱いが難しく免疫療法に応用することが難し
いままである。したがって、当技術分野では、ナチュラルキラー細胞を便利に供給するこ
とが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
３．概要
腫瘍細胞増殖を抑制するための、胎盤灌流液；胎盤灌流液に由来する細胞、例えば胎盤
灌流液に由来する総有核細胞；胎盤灌流液細胞および臍帯血細胞の組合せ；および／また
は胎盤に由来するナチュラルキラー細胞、例えば胎盤灌流液に由来するナチュラルキラー
細胞もしくは胎盤組織の消化によって取得されるナチュラルキラー細胞の使用が本明細書
で提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの態様では、腫瘍細胞または腫瘍細胞の集団の増殖を抑制する方法であって、腫瘍
細胞または腫瘍細胞の集団をヒト胎盤灌流液と接触させることを含む方法が本明細書で提
供される。この方法の特定の実施形態では、腫瘍細胞は１つの血液癌細胞である。別の特
定の実施形態では、腫瘍細胞は複数の血液癌細胞である。別の特定の実施形態では、腫瘍
細胞は１つの固形腫瘍細胞である。別の特定の実施形態では、腫瘍細胞は複数の固形腫瘍
細胞である。別の実施形態では、腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細
胞白血病細胞、慢性骨髄リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白
血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、大腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細
胞、網膜芽細胞腫細胞、大腸直腸癌細胞、または大腸直腸腺癌細胞である。別の特定の実
施形態では、前記接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる。別の特定の実施形態では、前記接触
はｉｎ  ｖｉｖｏで生じる。より特定の実施形態では、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ接触はヒトに
おいて生じる。
【００１０】
別の特定の実施形態では、前記胎盤灌流液は、胎盤脈管構造を通過した、例えば胎盤脈
管構造のみを通過した灌流液である。別の特定の実施形態では、前記胎盤灌流液は、胎盤
脈管構造を通過し、胎盤の母体側から回収される。別の特定の実施形態では、前記胎盤灌
流液中の細胞のすべてまたは実質的にすべてが（例えば９０％、９５％、９８％、または
９９％を超えている）、胎児細胞である。別の特定の実施形態では、胎盤灌流液は、胎児
細胞および母体細胞を含む。より特定の実施形態では、前記胎盤灌流液中の胎児細胞は、
前記灌流液中の細胞の約９０％、８０％、７０％、６０％、または５０％未満を占める。
別の特定の実施形態では、前記灌流液は、胎盤脈管構造に０．９％ＮａＣｌ溶液を通過さ
せることによって取得される。別の特定の実施形態では、前記灌流液は培地を含む。別の
特定の実施形態では、前記灌流液は、複数の赤血球を取り除くように処理されている。
【００１１】
別の態様では、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、腫瘍細
胞または複数の腫瘍細胞を複数の胎盤灌流液細胞と接触させることを含む方法が本明細書
で提供される。別の特定の実施形態では、前記複数の胎盤灌流液細胞は、胎盤灌流液に由
来する総有核細胞であるか、または胎盤灌流液に由来する総有核細胞を含む。別の特定の
実施形態では、前記胎盤灌流液または胎盤灌流液細胞、例えば胎盤灌流液に由来する総有
核細胞は、少なくとも１つのタイプの細胞を取り除くように処理されている。別の特定の
実施形態では、前記接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる。別の特定の実施形態では、前記接
触はｉｎ  ｖｉｖｏで生じる。より特定の実施形態では、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ接触は、哺
乳動物、例えばヒトにおいて生じる。別の特定の実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は、
少なくとも１つのタイプの細胞、例えばＣＤ５６＋細胞を濃縮するように処理されている
。別の特定の実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は、ＣＤ５６＋胎盤細胞である。より特
定の実施形態では、ＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞、例
えば胎盤中間ナチュラルキラー（ＰＩＮＫ、placental intermediate natural killer）
細胞であり、例えば、胎盤組織を機械的にまたは酵素的に破壊することによって取得され
る胎盤灌流液細胞または胎盤細胞から取得される。別の特定の実施形態では、前記ＣＤ５
６＋細胞は、ＣＤ５６コンジュゲートマイクロビーズによって選択される。別の特定の実
施形態では、前記ＣＤ５６＋細胞は、同等数のＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細
胞よりも検出可能な程度に低いＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、またはＣＤ９４の発現を示す細
胞を含む。別の特定の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞はＣＤ３−である。より特定の実施形
態では、前記胎盤灌流液細胞中の細胞の少なくとも５０％は、前記ＣＤ５６＋細胞である
。ＣＤ５６＋細胞が前記胎盤灌流液細胞の少なくとも５０％である、より特定の実施形態
では、腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄リ
ンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌
細胞、大腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽細胞腫細胞、大
腸直腸癌細胞、または大腸直腸腺癌細胞である。特定の実施形態では、前記接触は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの接触である。別の実施形態では、前記接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、例
えば哺乳動物、例えばヒトにおける接触である。
【００１２】
別の態様では、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、腫瘍細
胞または複数の腫瘍細胞を胎盤、例えばＰＩＮＫ細胞に由来する複数のナチュラルキラー
細胞と接触させることを含む方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、胎盤に
由来するナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液から取得されるナチュラルキラー細胞であ
る。別の特定の実施形態では、ナチュラルキラー細胞は、胎盤組織の物理的な破壊および
／または酵素消化によって取得されるナチュラルキラー細胞である。別の特定の実施形態
では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞、例えばＰ
ＩＮＫ細胞である。別の特定の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞は、例えば、胎
盤灌流液細胞、または胎盤組織の物理的な破壊および／もしくは酵素消化によって取得さ
れる細胞から、ＣＤ５６コンジュゲートマイクロビーズによって選択される。別の特定の
実施形態では、ナチュラルキラー細胞はＣＤ３−である。特定の実施形態では、複数のナ
チュラルキラー細胞は、ナチュラルキラー細胞を含む細胞集団中にある細胞の少なくとも
８０％である。別の特定の実施形態では、前記接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる。別の特
定の実施形態では、前記接触はｉｎ  ｖｉｖｏで生じる。より特定の実施形態では、前記
ｉｎ  ｖｉｖｏ接触は、哺乳動物、例えばヒトにおいて生じる。
【００１３】
本方法の別の特定の実施形態では、前記複数のナチュラルキラー細胞は、同等数のＣＤ
５６＋ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に低いＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ
４６、またはＣＤ９４の発現を示す細胞を含む。別の特定の実施形態では、前記複数のナ
チュラルキラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞は、マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１００
、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、ｈｓ
ａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉ
Ｒ−５１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｂ、ｈｓａ
−ｍｉＲ−５１７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ、ｈｓａ−
ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｈ、ｈｓａ−ｍ
ｉＲ−５６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、および／またはｈｓ
ａ−ｍｉＲ−９９ａのうち１つまたは複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可
能な程度に高いレベルで発現する。
【００１４】
別の特定の実施形態では、前記複数のナチュラルキラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞は、
免疫調節化合物と接触しない同等数の前記ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に
多くのグランザイムＢを、前記複数のナチュラルキラー細胞が発現するのに十分な量およ
び十分な時間で、前記免疫調節化合物と接触される。より特定の実施形態では、前記免疫
調節化合物は、レナリドマイドまたはポマリドマイドである。別の特定の実施形態では、
前記複数のナチュラルキラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞は、免疫調節化合物、例えばレナ
リドマイドまたはポマリドマイドと接触しない同等数の前記ナチュラルキラー細胞よりも
検出可能な程度に大きな前記腫瘍細胞に対する細胞傷害性を、前記複数のナチュラルキラ
ー細胞が示すのに十分な量および十分な時間で、前記免疫調節化合物と接触される。別の
特定の実施形態では、前記複数のナチュラルキラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞は、前記免
疫調節化合物と接触しない同等数の前記ナチュラルキラー細胞より高いレベルでＢＡＸ、
ＣＣＬ５、ＣＣＲ５、ＣＳＦ２、ＦＡＳ、ＧＵＳＢ、ＩＬ２ＲＡ、またはＴＮＦＲＳＦ１
８のうち１つまたは複数を発現する。別の特定の実施形態では、前記複数のナチュラルキ
ラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞は、前記免疫調節化合物と接触しない同等数の前記ナチュ
ラルキラー細胞より高いレベルでＡＣＴＢ、ＢＡＸ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、Ｃ
ＣＲ５、ＣＳＦ１、ＣＳＦ２、ＥＣＥ１、ＦＡＳ、ＧＮＬＹ、ＧＵＳＢ、ＧＺＭＢ、ＩＬ
１Ａ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＬＴＡ、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、ＳＫＩ、および
ＴＢＸ２１のうち１つまたは複数を発現する。
【００１５】
別の実施形態では、胎盤に由来するナチュラルキラー細胞は、別の供給源、例えば胎盤
血および／または臍帯血に由来するナチュラルキラー細胞と混合され、例えば、混合ナチ
ュラルキラー細胞を形成する。本明細書中で使用される場合、「胎盤に由来する（１つま
たは複数の）ナチュラルキラー細胞」という語句は、臍帯血または胎盤血に由来するナチ
ュラルキラー細胞を含まない。より特定の実施形態では、胎盤に由来するナチュラルキラ
ー細胞は、約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５
、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：
６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５
：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、
６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、
２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：１
５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５
５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９
５、または１：１００などの比率で、別の供給源に由来するナチュラルキラー細胞と混合
される。
【００１６】
特定の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は培養されず、末梢血に由来する同等
数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６−
ナチュラルキラー細胞；末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能
な程度に少数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞；末梢血に由来する
同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＫＩＲ
２ＤＬ２／Ｌ３＋ナチュラルキラー細胞；末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細
胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４６＋ナチュラルキラー細胞
；末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３
−ＣＤ５６＋ＮＫｐ３０＋ナチュラルキラー細胞；末梢血に由来する同等数のナチュラル
キラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３−ＣＤ５６＋２Ｂ４＋ナチュラルキラー
細胞；または末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも出可能な程度により
多数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ９４＋ナチュラルキラー細胞を含む。他の特定の実施形態
では、混合ナチュラルキラー細胞は培養され、末梢血に由来する同等数のナチュラルキラ
ー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３＋ナチュ
ラルキラー細胞；末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度
に多数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４６＋ナチュラルキラー細胞；末梢血に由来する同等
数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４４
＋ナチュラルキラー細胞；末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可
能な程度に多数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ３０＋ナチュラルキラー細胞を含む。
【００１７】
上記方法のいずれかの特定の実施形態では、腫瘍細胞は固形腫瘍細胞である。別の特定
の実施形態では、腫瘍細胞は、液性腫瘍細胞、例えば血液腫瘍細胞である。より特定の実
施形態では、腫瘍細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性
骨髄リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞
、肺癌細胞、大腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽細胞腫細
胞、大腸直腸癌細胞、または大腸直腸腺癌細胞である。
【００１８】
別の態様では、単離された胎盤ＣＤ５６＋、ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞、例えば
ＰＩＮＫ細胞を含む組成物が本明細書で提供される。特定の実施形態では、前記胎盤ナチ
ュラルキラー細胞は、胎盤灌流液から単離される。別の特定の実施形態では、前記胎盤ナ
チュラルキラー細胞は、胎盤組織の物理的な破壊および／または酵素消化によって胎盤か
ら単離される。別の特定の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞は、組成物中にある
細胞の少なくとも５０％を占める。特定の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞は、
組成物中にある細胞の少なくとも８０％を占める。別の特定の実施形態では、前記組成物
は、単離されたＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を含む。より特定の実施形
態では、前記ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は、前記ＣＤ５６＋、ＣＤ１
６−ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来する。別の特定の実施形態では、前記単
離されたＣＤ５６＋、ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞は、単一の個体に由来する。より
特定の実施形態では、前記単離されたＣＤ５６＋、ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞は、
少なくとも２つの異なる個体に由来するナチュラルキラー細胞を含む。別の特定の実施形
態では、前記胎盤のナチュラルキラー細胞、例えば前記ＰＩＮＫ細胞は、増殖される。
【００１９】
より特定の実施形態では、組成物は、胎盤ナチュラルキラー細胞および別の供給源に由
来するナチュラルキラー細胞を含む。特定の実施形態では、前記他の供給源は、臍帯血（
cord blood）および／または臍帯血（umbilical cord blood）である。別の特定の実施形
態では、前記他の供給源は末梢血である。より特定の実施形態では、胎盤に由来するナチ
ュラルキラー細胞は、約１００：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、
７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５
５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０
：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、
７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、
３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１
０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５
０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９
０、１：９５、または１：１００などの比率で、別の供給源に由来するナチュラルキラー
細胞と混合される。
【００２０】
別の特定の実施形態では、組成物は、単離された胎盤灌流液を含む。より特定の実施形
態では、前記胎盤灌流液は、前記ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来する。別のより
特定の実施形態では、前記胎盤灌流液は、前記ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由
来する胎盤灌流液を含む。別の特定の実施形態では、前記胎盤灌流液中の細胞のすべてま
たは実質的にすべてが（例えば９０％、９５％、９８％、または９９％を超えている）、
胎児細胞である。別の特定の実施形態では、胎盤灌流液は、胎児細胞および母体細胞を含
む。より特定の実施形態では、前記胎盤灌流液中の胎児細胞は、前記灌流液中にある細胞
の約９０％、８０％、７０％、６０％、または５０％未満を占める。別の特定の実施形態
では、前記灌流液は、胎盤脈管構造に０．９％ＮａＣｌ溶液を通過させることによって取
得される。別の特定の実施形態では、前記灌流液は培地を含む。別の特定の実施形態では
、前記灌流液は、複数の赤血球を取り除くように処理されている。
【００２１】
別の特定の実施形態では、組成物は胎盤灌流液細胞を含む。より特定の実施形態では、
前記胎盤灌流液細胞は、前記ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来する。別のより特定
の実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は、前記ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由
来する。別の特定の実施形態では、組成物は、単離された胎盤灌流液および単離された胎
盤灌流液細胞を含み、前記単離された灌流液および前記単離された胎盤灌流液細胞は、異
なる個体に由来する。胎盤灌流液を含む上記実施形態のいずれかの、別のより特定の実施
形態では、前記胎盤灌流液は、少なくとも２つの個体に由来する胎盤灌流液を含む。胎盤
灌流液細胞を含む上記実施形態のいずれかの、別のより特定の実施形態では、前記単離さ
れた胎盤灌流液細胞は、少なくとも２つの個体に由来する。組成物は、単離されたＰＩＮ
Ｋ細胞をさらに含むことができ、ＰＩＮＫ細胞は、前記胎盤灌流液または前記灌流液細胞
とは異なる個体に由来する。
【００２２】
別の態様では、胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する方法であって、複数の胎盤細胞を
取得することと、前記複数の胎盤細胞に由来するナチュラルキラー細胞を単離することと
を含む方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、胎盤細胞は、胎盤灌流液細胞
、例えば胎盤灌流液に由来する総有核細胞であるか、またはそれらを含む。別の特定の実
施形態では、前記複数の胎盤細胞は、胎盤組織の機械的および／または酵素的な消化によ
って取得される胎盤細胞であるか、またはそれらを含む。別の実施形態では、前記単離は
、１つまたは複数の抗体を使用して実施される。より特定の実施形態では、前記１つまた
は複数の抗体は、ＣＤ３、ＣＤ１６、またはＣＤ５６に対する抗体のうち１つまたは複数
を含む。より特定の実施形態では、前記単離は、前記複数の胎盤細胞中のＣＤ５６−細胞
からＣＤ５６＋細胞を単離することを含む。より特定の実施形態では、前記単離は、ＣＤ
５６−またはＣＤ１６＋である胎盤細胞からＣＤ５６＋、ＣＤ１６−胎盤細胞を単離する
ことを含む。より特定の実施形態では、前記単離は、ＣＤ５６−、ＣＤ１６＋、またはＣ
Ｄ３＋である胎盤細胞からＣＤ５６＋、ＣＤ１６−、ＣＤ３−胎盤細胞を単離することを
含む。別の実施形態では、胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する前記方法は、少なくとも
５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、
９８％、または少なくとも９９％がＣＤ５６＋、ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞である
胎盤細胞の集団に帰着する。
【００２３】
上記方法のある種の実施形態では、胎盤灌流液細胞は、培養液中で増殖される。種々の
実施形態では、細胞は、少なくとも、約、または多くとも１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、
２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日間増殖されている。特
定の実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は、支持細胞層の存在下でおよび／または少なく
とも１つのサイトカインの存在下で増殖されている。より特定の実施形態では、前記支持
細胞層は、Ｋ５６２細胞または末梢血単核細胞を含む。別のより特定の実施形態では、前
記少なくとも１つのサイトカインは、インターロイキン２である。
【００２４】
３．１．定義
本明細書中で使用される場合、「混合ナチュラルキラー細胞」は、例えば、胎盤灌流液
は臍帯血と同じ胎盤から取得されている一致した臍帯およびヒト胎盤灌流液に由来するナ
チュラルキラー細胞である。両方に由来するナチュラルキラー細胞は、別々にまたは同時
に単離されて、混合される。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ＰＩＮＫ」および「ＰＩＮＫ細胞」は、ヒト胎盤、例
えばヒト胎盤灌流液または機械的および／または酵素的に破壊された胎盤組織から取得さ
れる胎盤中間ナチュラルキラー細胞を指す。細胞は、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−であり
、例えば、フローサイトメトリー、例えばＣＤ５６およびＣＤ１６に対する抗体を使用し
た蛍光活性化細胞ソーティングによって決定される。ＰＩＮＫ細胞は、臍帯血または末梢
血から取得されない。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「胎盤灌流液」は、胎盤、例えばヒト胎盤の少なくとも
一部、例えば胎盤脈管構造を通過し、胎盤を通過中に灌流溶液によって回収される複数の
細胞を含む灌流溶液を意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「胎盤灌流液細胞」は、胎盤灌流液から単離された、ま
たは単離可能な有核細胞、例えば総有核細胞を意味する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「腫瘍細胞抑制」および「腫瘍細胞増殖の抑制」などは
、例えば腫瘍細胞の前記集団中の腫瘍細胞のうち１つまたは複数を死滅させることによっ
て、例えば腫瘍細胞の集団を、ＰＩＮＫ細胞、ＰＩＮＫ細胞を含む細胞の集団、混合ナチ
ュラルキラー細胞、混合ナチュラルキラー細胞を含む細胞の集団、またはヒト胎盤灌流液
などと接触させることによって、腫瘍細胞の集団の成長を遅延させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ）由来のＣＤ５６マイクロビーズによって選択される細胞について、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ５６抗体を用いたフローサイトメトリーの結果を示す図である。単離された細胞の大部分はＣＤ５６＋ＣＤ３−である。
【図２Ａ】２４時間培養中のＰＩＮＫ細胞および／または腫瘍細胞によるサイトカインの産生を示す図である。胎盤灌流液由来中間ナチュラルキラー細胞（ＰＩＮＫ）細胞単独によるか、またはＫＧ−１ａ腫瘍細胞の存在下でインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の分泌を示す図である。ＰＩＮＫ細胞およびＫＧ−１ａ細胞を単独でまたは１：１の比率で組み合わせて培養した。Ｙ軸：産生によって産生されたＩＦＮγのピコグラム。
【図２Ｂ】２４時間培養中のＰＩＮＫ細胞および／または腫瘍細胞によるサイトカインの産生を示す図である。ＰＩＮＫ細胞単独によるか、またはＫＧ−１ａ腫瘍細胞の存在下での顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の分泌を示す図である。ＰＩＮＫ細胞およびＫＧ−１ａ細胞を単独でまたは１：１の比率で組み合わせて培養した。Ｙ軸：産生によって生成されたＧＭ−ＣＳＦのピコグラム。
【図３】ＰＩＮＫ細胞と腫瘍細胞との比率を１：１、５：１、１０：１または２０：１にした２４時間の共培養におけるＫＧ−１ａ腫瘍細胞に対するＰＩＮＫ細胞の細胞傷害性を示す図である。Ｘ軸：ＰＩＮＫ細胞と腫瘍細胞の比率。Ｙ軸：ＰＩＮＫ細胞がない場合の腫瘍細胞と比較した、死滅した腫瘍細胞の百分率。
【図４】Ｋ５６２細胞に関して、２１日間培養した胎盤ＮＫ細胞と末梢血（ＰＢ）ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す図である。エラーバーは、培養された胎盤ＮＫ細胞の４ユニットまたは培養された末梢血ＮＫ細胞の３ユニットの標準偏差を表す。
【図５】ＨＰＰ細胞と腫瘍細胞との比率を１：１、５：１、１０：１もしくは２０：１または１００：１にした２４時間の共培養におけるＫＧ−１ａ腫瘍細胞に対する、胎盤から得られた全ヒト胎盤灌流液の細胞傷害性を示す図である。Ｘ軸：ＨＰＰ細胞と腫瘍細胞の比率。Ｙ軸：ＨＰＰ細胞がない場合の腫瘍細胞と比較した、死滅した腫瘍細胞の百分率。
【図６】ＨＰＰ細胞またはＵＣＢ細胞と腫瘍細胞との連続希釈を１００：１、５０：１、２５：１、１２．５：１、６．２５：１、３．１２：１、１．５６：１または０．７８：１にした４８時間の共培養におけるＫＧ−１ａ腫瘍細胞に対する、胎盤から得られた全ヒト胎盤灌流液、および臍帯血の細胞傷害性を示す図である。Ｘ軸：ＨＰＰ細胞または臍帯細胞と腫瘍細胞の比率。Ｙ軸：ＨＰＰ細胞または臍帯細胞がない場合の腫瘍細胞と比較した、４８時間の培養時間後の死滅した腫瘍細胞の百分率。
【図７】ＨＰＰ細胞と腫瘍細胞との連続希釈を１００：１、５０：１、２５：１、１２．５：１、６．２５：１、３．１２：１、１．５６：１または０．７８：１にした４８時間の共培養におけるＫＧ−１ａ腫瘍細胞に対する、胎盤から得られた全ヒト胎盤灌流液の細胞傷害性を示す図である。回収された灌流液、または１００Ｕ／ｍＬもしくは１０００Ｕ／ｍＬのインターロイキン−２（ＩＬ−２）で２４時間刺激された灌流液のいずれかが使用された。Ｘ軸：ＨＰＰ細胞と腫瘍細胞の比率。Ｙ軸：ＨＰＰ細胞がない場合の腫瘍細胞と比較した、４８時間の培養時間後の死滅した腫瘍細胞の百分率。
【図８】腫瘍細胞に対して５０：１の比率でのＨＰＰまたはＵＣＢ細胞との培養後、腫瘍細胞株集団に対する、ヒト胎盤灌流液の細胞傷害効果を示す図である。図８Ａ：２４時間の共培養。図８Ｂ：４８時間の共培養。Ｘ軸：試験された腫瘍細胞株。Ｙ軸：腫瘍細胞が存在しない場合の腫瘍細胞数と比較した、共培養後の死滅した腫瘍細胞の百分率。
【図９】ＨＰＰ細胞と腫瘍細胞の比率が様々である、ＫＧ−１ａ腫瘍細胞と共培養されたＨＰＰ細胞によるＩＦＮγ産生を示す図である。Ｘ軸：ＨＰＰ細胞と腫瘍細胞の比率を含む実験条件。Ｙ軸：２４時間の共培養後の１ミリリットル当たりのＩＦＮγレベル。
【図１０】腫瘍細胞集団との共培養におけるＨＰＰまたはＵＣＢ細胞によるＩＦＮγの産生の図である。ＨＰＰまたはＵＣＢ細胞は、２４時間（図１０Ａ）または４８時間（図１０Ｂ）の腫瘍細胞株と５０：１の比率で共培養された。ＩＦＮγレベルは、ルミネックスアッセイ（ＨＣＹＴＯ−６０Ｋ−０３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって決定された。Ｘ軸：試験された腫瘍細胞株。Ｙ軸：腫瘍細胞が存在しない場合に産生されたＩＦＮγのピコグラムと比較した、ＨＰＰまたはＵＣＢ細胞によって産生されたＩＦＮγのピコグラム。
【図１１】体積にして約３３２ｍｍ３のＫＧ−１細胞腫瘍を有するマウスに、２×１０７のヒト胎盤灌流（ＨＰＰ）細胞の投与に基づく腫瘍サイズの減少を示す図である。腫瘍内ＨＰＰ細胞を皮下の腫瘍部位に直接注入した。ＩＶ−静脈内に投与したＨＰＰ細胞。コントロール−ビヒクルのみの投与。腫瘍体積ｍｍ３。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
５．詳細な説明
腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の成長または増殖を抑制するための、胎盤から取得され
る胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、および／または胎盤灌流液由来ナチュラルキラー（「Ｐ
ＩＮＫ」）細胞の使用が本明細書で提供される。特に、胎盤灌流液、例えばヒト胎盤灌流
液から単離された、または機械的および／もしくは酵素的に破壊された胎盤組織から単離
されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫ細胞の集団、ＮＫ細胞を取得する方法、
ならびに上記細胞を使用する方法が本明細書で提供される。ナチュラルキラー細胞を含む
細胞の集団、例えば胎盤細胞の集団も本明細書で提供される。胎盤灌流液を取得する方法
および胎盤灌流液から細胞を取得する方法は、下記の５．１節に記述されている。胎盤灌
流液由来ナチュラルキラー細胞、および上記細胞を取得する方法は、下記の５．２節に記
述されている。腫瘍細胞の増殖を抑制するために、胎盤灌流液、胎盤灌流液由来細胞、ま
たは胎盤灌流液由来ナチュラルキラー細胞、例えば中間ナチュラルキラー細胞を使用する
方法は、下記の５．３節に記述されている。
【００３１】
５．１．胎盤灌流液
５．１．１．細胞回収組成物
本明細書で提供される胎盤灌流液、灌流液細胞、および胎盤灌流液由来ナチュラルキラ
ー細胞は、胎盤細胞回収組成物を使用して、哺乳動物、例えばヒトの分娩後胎盤を灌流す
ることによって回収することができる。灌流液は、任意の生理学的に許容される溶液、例
えば生理食塩水、培地、またはより複雑な細胞回収組成物を用いて胎盤を灌流することに
より、胎盤から回収することができる。胎盤の灌流に好適であり、灌流液細胞、例えば総
有核胎盤灌流液細胞またはＰＩＮＫ細胞の回収および保存に好適な細胞回収組成物は、関
連する米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号に詳細に記述されており、それら
は参照によりそれらの全体が本明細書中に組み込まれる。
【００３２】
細胞回収組成物は、幹細胞の回収および／または培養に好適な任意の生理学的に許容さ
れる溶液、例えば、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、改良ク
レブス溶液、イーグル溶液、０．９％ＮａＣｌなど）、および培地（例えば、ＤＭＥＭ、
Ｈ．ＤＭＥＭなど）を含むことができる。
【００３３】
細胞回収組成物は、胎盤細胞を保存する、すなわち、胎盤細胞の死滅を防止するか、ま
たは胎盤細胞の死滅を遅延させ、回収時から培養時までに死滅するかまたはそれに近い状
態にある細胞集団中の胎盤細胞の数を低減する傾向のある１つまたは複数の成分を含むこ
とができる。そのような成分は、例えばアポトーシス阻害剤（例えば、カスパーゼ阻害剤
またはＪＮＫ阻害剤）；血管拡張剤（例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナ
トリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホ
ルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、
インドメタシンまたは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害薬など）；ネクロー
シス阻害剤（例えば、２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−ペンチルアミノ−マレ
イミド、ピロリジンジチオカルバマート、またはクロナゼパム）；ＴＮＦ−α阻害剤；お
よび／または酸素運搬ペルフルオロカーボン（例えば、臭化ペルフルオロオクチル、臭化
ペルフルオロデシルなど）であり得る。
【００３４】
細胞回収組成物は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えばメタロプロテアーゼ、セリ
ンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、ＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅ
などを含むことができる。そのような酵素には、これらに限定されないが、コラゲナーゼ
（例えば、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ、クロストリジウム・ヒストリチ
クム（Clostridium histolyticum）に由来するコラゲナーゼなど）；ディスパーゼ、サー
モリシン、エラスターゼ、トリプシン、リベラーゼ、およびヒアルロニダーゼなどが含ま
れる。
【００３５】
細胞回収組成物は、殺菌的または静菌的に有効な量の抗生物質を含むことができる。あ
る非制限的な実施形態では、抗生物質は、マクロライド（例えば、トブラマイシン）、セ
ファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、
セファクロル、セフィキシム、またはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エリス
ロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ）、またはキノロン（例えば、オフロキ
サシン、シプロフロキサシン、またはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、ストレプ
トマイシンなどである。特定の実施形態では、抗生物質は、グラム（＋）および／または
グラム（−）細菌、例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）および黄色ブドウ球菌（
Staphylococcus aureus）などに対して活性である。
【００３６】
細胞回収組成物は、以下の化合物のうち１つまたは複数を含むこともできる：アデノシ
ン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；Ｄ−グルコース（約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ）；マグネシ
ウムイオン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）；１つの実施形態では、内皮完全性および細胞生存
性を維持するのに十分な量で存在する、分子量が２０，０００ダルトンを超える巨大分子
（例えば、約２５ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌ、または約４０ｇ／ｌ〜約６０ｇ／ｌで存在す
る、合成または天然のコロイド、デキストランまたはポリエチレングリコールなどのポリ
サッカライド）；酸化防止剤（例えば、約２５μＭ〜約１００μＭで存在するブチル化ヒ
ドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンＣ、または
ビタミンＥ）；還元剤（例えば、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在するＮ−アセチルシステ
イン）；細胞へのカルシウム進入を防止する作用剤（例えば、約２μＭ〜約２５μＭで存
在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌ）
；１つの実施形態では、残血凝固の防止に役立つのに十分な量で存在する抗凝血剤（例え
ば、約１０００単位／ｌ〜約１００，０００単位／ｌの濃度で存在するヘパリンまたはヒ
ルジン）；またはアミロライド含有化合物（例えば、約１．０μＭ〜約５μＭで存在する
アミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチ
ルアミロライド、またはイソブチルアミロライド）。
【００３７】
５．１．２．胎盤の回収および取扱い
一般的に、ヒト胎盤は、出産後に胎盤が娩出した直後に回収される。好ましい実施形態
では、胎盤は、インフォームドコンセントの後、および患者の完全な病歴を取得し、胎盤
に関連づけた後で、患者から回収される。好ましくは、病歴は分娩後も継続する。そのよ
うな病歴は、そこから回収された胎盤または細胞のその後の使用を調整するために使用す
ることができる。例えば、ヒト胎盤細胞は、病歴に照らして、胎盤に関連する幼児、また
は幼児の親、幼児の兄弟、もしくは幼児の他の親類の個別化医療のために使用することが
できる。
【００３８】
灌流液の回収に先立って、臍帯血および胎盤血は取り除かれる。ある種の実施形態では
、分娩後に、胎盤中の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血回収処理に供することが
できる。典型的には、針またはカニューレを使用し、重力の助けを借りて胎盤を放血する
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎの米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌらの米国
特許第５，４１５，６６５号を参照）。針またはカニューレは通常臍帯静脈に設置され、
胎盤を穏やかにマッサージして胎盤からの臍帯血の排血を支援する。そのような臍帯血回
収は商業的に実施されており、例えば、ＬｉｆｅＢａｎｋ  Ｉｎｃ．社、Ｃｅｄａｒ  Ｋ
ｎｏｌｌｓ、Ｎ．Ｊ．、ＶｉａＣｏｒｄ社、Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ社
、およびＣｒｙｏＣｅｌｌ社がある。好ましくは、胎盤は、臍帯血回収中の組織破壊を最
小限にするために、それ以上の操作をせずに重力で排血される。
【００３９】
典型的には、胎盤は、臍帯血の回収および灌流液の回収のために、分娩室または出産室
から別の場所、例えば実験室に移送される。好ましくは、胎盤は、例えば近位臍帯をクラ
ンプして無菌ジップロックビニール袋に入れ、次いで断熱容器の中に置くことにより、無
菌の断熱移送デバイス（胎盤の温度を２０〜２８℃の間に維持する）で移送する。別の実
施形態では、胎盤は、米国特許第７，１４７，６２６号に実質的に記載されているように
、臍帯血回収キットで移送される。好ましくは、胎盤は、分娩の４〜２４時間後に実験室
に移送される。ある種の実施形態では、近位臍帯は、臍帯血を回収する前にクランプされ
ており、好ましくは胎盤の盤中４〜５ｃｍ（センチメートル）以内に挿入されている。他
の実施形態では、近位臍帯は、臍帯血を回収した後だが胎盤をさらに処理する前にクラン
プされる。
【００４０】
胎盤は、灌流液を回収する前に、無菌条件下で室温または５〜２５℃（摂氏）の温度の
いずれかで保管することができる。胎盤は、胎盤を灌流して任意の残留臍帯血を取り除く
前に、４８時間を超える期間および好ましくは４〜２４時間の期間保管することができる
。胎盤は、好ましくは５℃〜２５℃（摂氏）の温度で抗凝固溶液中で保管される。好適な
抗凝固溶液は、当技術分野で周知である。例えば、ヘパリンまたはワルファリンナトリウ
ムの溶液を使用することができる。好ましい実施形態では、抗凝固溶液は、ヘパリンの溶
液（例えば、１：１０００溶液中に１％ｗ／ｗ）を含む。放血された胎盤は、好ましくは
、保管後３６時間以内に胎盤灌流液を回収する。
【００４１】
５．１．３．胎盤灌流
哺乳動物胎盤を灌流する方法は、例えば、Ｈａｒｉｒｉの米国特許第７，０４５，１４
８号および第７．２５５，８７９号、および「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｓ」と
題する米国特許出願公開第２００７／０１９００４２号に開示されており、それらの開示
は参照によりそれらの全体がこれによって本明細書中に組み込まれる。
【００４２】
灌流液は、灌流溶液、例えば生理食塩水、培地、または上述の細胞回収組成物を、胎盤
脈管構造に通過させることによって取得することができる。１つの実施形態では、哺乳動
物胎盤は、臍帯動脈および臍帯静脈のいずれかまたは両方に灌流溶液を通過させることに
より灌流される。胎盤を通る灌流溶液の流れは、例えば胎盤への重力流を使用して達成す
ることができる。好ましくは、ポンプ、例えば蠕動ポンプを使用して、強制的に灌流溶液
を胎盤に流す。臍帯静脈には、例えば、無菌チューブなどの無菌接続器具に接続されてい
るカニューレ、例えばＴＥＦＬＯＮ（登録商標）またはプラスチックカニューレを用いて
カニューレ挿入する。無菌接続器具は、灌流マニフォールドに接続される。
【００４３】
灌流に備えて、好ましくは、臍帯動脈および臍帯静脈が胎盤のもっとも高い地点に位置
するように胎盤を配置する。胎盤は、胎盤脈管構造にまたは胎盤脈管構造および周辺組織
に灌流溶液を通過させることによって灌流することができる。１つの実施形態では、臍帯
動脈および臍帯静脈は、可撓性コネクターを介して灌流溶液の貯蔵容器に接続されている
ピペットに同時に接続される。灌流溶液は、臍帯静脈および動脈を通過する。灌流溶液は
、血管の壁面から滲出および／またはそれを通って胎盤の周辺組織へと通過し、妊娠中に
母体の子宮に付着していた胎盤表面から好適な開放容器に回収される。灌流溶液は、臍帯
開口部を介して導入することもでき、母体子宮壁と接触していた胎盤壁の開口部から流出
または浸出させることもできる。別の実施形態では、灌流溶液は、臍帯静脈を通過させて
臍帯動脈から回収するか、または臍帯動脈を通過させて臍帯静脈から回収し、すなわち、
胎盤脈管構造（胎児組織）のみを通過させる。
【００４４】
１つの実施形態では、例えば、臍帯動脈および臍帯静脈は、例えば可撓性コネクターを
介して灌流溶液の貯蔵容器に接続されているピペットに同時に接続される。灌流溶液は、
臍帯静脈および動脈を通過させる。灌流溶液は、血管の壁面から滲出および／またはそれ
を通って胎盤の周辺組織へと通過し、妊娠中に母体の子宮に付着していた胎盤表面から好
適な開放容器に回収される。灌流溶液は、臍帯開口部を介して導入することもでき、母体
子宮壁と接触していた胎盤壁の開口部から流出または浸出させることもできる。「受け皿
」法（"pan" method）と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤細胞は、典型
的には胎児細胞および母体細胞の混合物である。
【００４５】
別の実施形態では、灌流溶液は、臍帯静脈を通過させて臍帯動脈から回収されるか、ま
たは臍帯動脈を通過させて臍帯静脈から回収される。「閉回路」法（"closed circuit" m
ethod）と呼ぶことができるこの方法によって回収される胎盤細胞は、典型的には、ほと
んど独占的に胎児性である。
【００４６】
閉回路灌流法は、１つの実施形態では、以下のように実施することができる。分娩後の
胎盤は、出産後約４８時間以内に取得される。臍帯は、クランプされ、そのクランプ上部
で切断される。臍帯は廃棄してもよく、または例えば臍帯幹細胞を回収するように処理し
てもよく、および／または生体材料の生産用に臍帯膜を加工するように処理してもよい。
羊膜は、灌流中保持されていてもよく、または例えば指を用いた鈍的剥離を使用して絨毛
膜から分離してもよい。羊膜は、灌流前に絨毛膜から分離する場合は、例えば廃棄しても
よく、または例えば酵素消化によって幹細胞を取得するために、もしくは例えば羊膜生体
材料、例えば米国特許出願公開第２００４／００４８７９６号に記載の生体材料を生産す
るように処理してもよい。目に見える凝血および残血を、例えば滅菌ガーゼを使用して胎
盤からすべて取り除いた後、例えば臍帯膜を部分的に切断して臍帯断面を露出させること
により臍帯導管を露出させる。例えば閉じたワニ型クランプを各導管の切断末端まで進め
ることによって、導管を特定し開口させることができる。その後、灌流デバイスまたは蠕
動ポンプに接続された器具、例えばプラスチックチューブを、胎盤動脈の各々に挿入する
。ポンプは、この目的に好適な任意のポンプ、例えば蠕動ポンプであり得る。その後、無
菌回収貯蔵容器、例えば２５０ｍＬの回収バッグなどの血液バッグに接続されているプラ
スチックチューブを、胎盤静脈に挿入する。あるいは、ポンプに接続されたチューブを胎
盤静脈に挿入し、（１つまたは複数の）回収貯蔵容器へのチューブを胎盤動脈の一方また
は両方に挿入する。その後、胎盤を、大量の灌流溶液、例えば約７５０ｍｌの灌流溶液で
灌流する。その後、灌流液中の細胞を、例えば遠心分離によって回収する。
【００４７】
１つの実施形態では、近位臍帯は灌流中はクランプされており、より好ましくは、胎盤
の盤中４〜５ｃｍ（センチメートル）以内に挿入されてクランプされている。
【００４８】
放血過程中に哺乳動物胎盤からもたらされる灌流液体の最初の回収物は、一般的に臍帯
血および／または胎盤血の残留赤血球で着色されている。灌流が進行し残留臍帯血細胞が
胎盤から洗い流されると共に、灌流液体はより無色になる。一般的に、胎盤から血液を最
初に洗い流すのには、３０〜１００ｍＬの灌流液体が適当であるが、観察結果次第ではよ
り多くのまたはより少ない灌流液体を使用してもよい。
【００４９】
胎盤を灌流するために使用される灌流液体の容積は、回収される胎盤細胞数、胎盤の大
きさ、単一胎盤でなされる回収回数などに依存して異なっていてもよい。種々の実施形態
では、灌流液体の容積は、５０ｍＬから５０００ｍＬまで、５０ｍＬ〜４０００ｍＬ、５
０ｍＬ〜３０００ｍＬ、１００ｍＬ〜２０００ｍＬ、２５０ｍＬ〜２０００ｍＬ、５００
ｍＬ〜２０００ｍＬ、または７５０ｍＬ〜２０００ｍＬであってもよい。典型的には、胎
盤は、放血後に７００〜８００ｍＬの灌流液体で灌流される。
【００５０】
胎盤は、数時間または数日間にわたって複数回灌流することができる。胎盤を複数回灌
流する場合、胎盤は、容器または他の好適な入れ物の中で無菌状態で維持または培養する
ことができ、細胞回収組成物または標準的灌流溶液（例えば、抗凝血剤（例えば、ヘパリ
ン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）を有するまたは有し
ない、および／または抗菌剤（例えば、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）；スト
レプトマイシン（例えば４０〜１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（例えば４０Ｕ／ｍｌの
）、アムホテリシンＢ（例えば０．５μｇ／ｍｌの）などの抗生物質を有するまたは有し
ないリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）などの通常の生理食塩水）を用いて灌流するこ
とができる。１つの実施形態では、単離された胎盤は、灌流液の灌流および回収前に１、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４時間、または２日間もしくは３日間
以上、胎盤を維持または培養するように、灌流液を回収せずにある期間維持および培養さ
れる。灌流した胎盤は、１または複数の追加的な（１または複数の）時間、例えば１、２
、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１
８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間以上維持することができ、例えば７
００〜８００ｍＬの灌流液体で２回目の灌流を行うことができる。胎盤は、例えば１、２
、３、４、５、または６時間に１回、１、２、３、４、または５回以上灌流することがで
きる。好ましい実施形態では、胎盤の灌流、および灌流溶液、例えば胎盤細胞回収組成物
の回収は、回収された有核細胞の数が１００細胞／ｍｌ未満に減少するまで繰り返される
。様々な時点における灌流液をさらに個別に処理して、時間依存的な細胞の集団、例えば
総有核細胞を回収することができる。異なる時点の灌流液を貯留することもできる。
【００５１】
５．１．４．胎盤灌流液および胎盤灌流液細胞
胎盤灌流液は、異種性の細胞回収物を含む。典型的には、胎盤灌流液は使用前に赤血球
を取り除く。そのような除去は、有核血液細胞から赤血球を分離する公知の方法によって
実行することができる。ある種の実施形態では、灌流液または灌流液細胞は凍結保存され
る。ある種の他の実施形態では、胎盤灌流液または灌流液細胞は、胎児細胞のみを、また
は胎児細胞および母体細胞の組合せを含む。
【００５２】
典型的には、単回の胎盤灌流に由来する胎盤灌流液は、約１億〜約５億個の有核細胞を
含んでいる。ある種の実施形態では、胎盤灌流液または灌流液細胞は、ＣＤ３４＋細胞、
例えば造血性幹細胞または前駆細胞を含んでいる。そのような細胞は、より特定の実施形
態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−幹細胞もしくは前駆細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋幹細胞も
しくは前駆細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、および／または赤血球前駆細胞を含
むことができる。他の実施形態では、胎盤灌流液および胎盤灌流液細胞は、接着性胎盤幹
細胞、例えば、ＣＤ３４−幹細胞を含んでいる。他の実施形態では、胎盤灌流液および胎
盤灌流液細胞は、例えば内皮前駆細胞、骨前駆細胞、およびナチュラルキラー細胞を含ん
でいる。ある種の実施形態では、胎盤から回収し赤血球を取り除いたような胎盤灌流液、
またはそのような灌流液から単離された灌流液細胞は、約６〜７％のナチュラルキラー細
胞（ＣＤ３−、ＣＤ５６＋）；約２１〜２２％のＴ細胞（ＣＤ３＋）；約６〜７％のＢ細
胞（ＣＤ１９＋）；約１〜２％の内皮前駆細胞（ＣＤ３４＋、ＣＤ３１＋）；約２〜３％
の神経前駆細胞（ネスチン＋）；約２〜５％の造血性前駆細胞（ＣＤ３４＋）；および約
０．５〜１．５％接着性胎盤幹細胞（例えば、ＣＤ３４−、ＣＤ１１７−、ＣＤ１０５＋
、およびＣＤ４４＋）を含んでおり、それらは、例えばフローサイトメトリー、例えばＦ
ＡＣＳ分析によって決定される。
【００５３】
５．２．ＰＩＮＫ細胞を取得するための胎盤組織の破壊および消化
胎盤ナチュラルキラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞は、機械的および／または酵素的に破
壊された胎盤組織から取得することができる。
【００５４】
胎盤組織は、１つまたは複数の組織分解酵素、例えばメタロプロテアーゼ、セリンプロ
テアーゼ、中性プロテアーゼ、ＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅなどを使用して破壊するこ
とができる。そのような酵素には、これらに限定されないが、コラゲナーゼ（例えば、コ
ラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ、クロストリジウム・ヒストリチクムに由来す
るコラゲナーゼなど）；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、リベ
ラーゼ、およびヒアルロニダーゼなどが含まれる。消化した後、典型的には、消化された
組織をストレーナーまたはフィルターに通して、部分的に消化された細胞集塊を取り除き
、実質的に単一細胞化された懸濁液が後に残る。
【００５５】
ナチュラルキラー細胞は、胎盤細胞の懸濁液を取得した後、例えばＣＤ３およびＣＤ５
６に対する抗体を使用して単離することができる。特定の実施形態では、胎盤ナチュラル
キラー細胞は、ＣＤ５６＋である細胞を選択して第１の細胞集団を産生し、前記第１の細
胞集団をＣＤ３および／またはＣＤ１６に特異的な抗体と接触させ、前記第１の細胞集団
からＣＤ３＋またはＣＤ５６＋である細胞を取り除き、それによって実質的にＣＤ５６＋
およびＣＤ３−、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−、またはＣＤ５６＋、ＣＤ３−、およびＣ
Ｄ１６−である第２の細胞集団を産生することにより、単離することができる。
【００５６】
１つの実施形態では、磁気ビーズを使用して、胎盤細胞の懸濁液から胎盤ナチュラルキ
ラー細胞を単離する。例えば、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）技術、１つまた
は複数の特異的抗体、例えば抗ＣＤ５６抗体を含む磁気ビーズ（例えば、直径が約０．５
〜１００μｍ）に結合するそれらの能力に基づく粒子分離法を使用して、細胞を単離して
もよい。特定の細胞表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合による付
加を含めて、種々の有用な修飾を磁気マイクロスフェアに対して実施することができる。
その後、ビーズは、結合を可能にするために細胞と混合される。次いで、細胞を磁界に通
して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。１つの実施形態では、その後、
これらの細胞を単離し、追加的細胞表面マーカーに対する抗体を結合させた磁気ビーズと
再び混合する。細胞を再び磁界に通して、両方の抗体に結合した細胞を単離する。その後
、そのような細胞は、クローン単離用のマイクロタイター皿などの別々の皿に希釈するこ
とができる。
【００５７】
５．３．胎盤ナチュラルキラー細胞
１つの態様では、胎盤から、例えば胎盤灌流液から、ならびに／または機械的および／
もしくは酵素的に破壊された胎盤組織から取得可能なナチュラルキラー細胞の単離、特徴
付け、および使用、ならびにそのようなナチュラルキラー細胞を含む組成物の単離、特徴
付け、および使用が本明細書で提供される。特定の実施形態では、胎盤ナチュラルキラー
細胞は、「胎盤中間ナチュラルキラー細胞」または「ＰＩＮＫ」細胞であり、ＣＤ５６＋
ＣＤ１６−であることが特徴であり、つまりＣＤ５６細胞マーカーを提示しＣＤ１６細胞
マーカーを欠如しており、それは、例えばＣＤ１６およびＣＤ５６に対する抗体を使用し
て、フローサイトメトリー、例えば蛍光活性化細胞ソーティングによって上述のように決
定される。そのため、単離されたＰＩＮＫ細胞および単離された複数の複数ＰＩＮＫ細胞
が本明細書で提供されている。ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞と組み合わせ
てＣＤ５６＋ＣＤ１６−ＰＩＮＫ細胞を含む単離された複数の細胞も本明細書で提供され
ている。より特定の実施形態では、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は、胎盤
から、または別の供給源、例えば末梢血、臍帯血、または骨髄などから単離することがで
きる。したがって、種々の他の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞は、例えば約１：１０、２：
９、３：８、４：７：、５：６、６：５、７：４、８：３、９：２、１：１０、１：９、
１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、
４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または約９：１の比率で、ＣＤ５６＋ＣＤ１
６＋ナチュラルキラー細胞と混合することができる。この状況で使用される場合、「単離
された」とは、細胞がそれらの通常環境、例えば胎盤から取り除かれていることを意味す
る。
【００５８】
ある種の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞はＣＤ３−である。
【００５９】
他の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞は、完全成熟ナチュラルキラー細胞（例えばＣＤ１６
）によって提示される１つまたは複数の細胞マーカーを提示しないか、または完全成熟ナ
チュラルキラー細胞と比較して検出可能な程度に低減したレベルでそのような１つまたは
複数のマーカーを提示するか、またはナチュラルキラー細胞前駆体に付随するが完全成熟
ナチュラルキラー細胞には付随しない１つまたは複数の細胞マーカーを提示する。特定の
実施形態では、本明細書で提供されるＰＩＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ９４、および／
またはＮＫｐ４６を、完全成熟ＮＫ細胞よりも検出可能な程度に低いレベルで発現する。
別の特定の実施形態では、本明細書で提供される複数のＰＩＮＫ細胞は、全部で、ＮＫＧ
２Ｄ、ＣＤ９４、および／またはＮＫｐ４６を、同等数の完全成熟ＮＫ細胞よりも検出可
能な程度に低いレベルで発現する。
【００６０】
ある種の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞は、マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、ｈｓａ
−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ
−５１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｂ、ｈｓａ−
ｍｉＲ−５１７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ、ｈｓａ−ｍ
ｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｈ、ｈｓａ−ｍｉ
Ｒ−５６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、および／またはｈｓａ
−ｍｉＲ−９９ａのうち１つまたは複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能
な程度に高いレベルで発現する。
【００６１】
ある種の実施形態では、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞は、培養液中
で増殖されている。ある種の他の実施形態では、胎盤灌流液細胞は、培養液中で増殖され
ている。特定の実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は、支持細胞層の存在下でおよび／ま
たは少なくとも１つのサイトカインの存在下で増殖されている。より特定の実施形態では
、前記支持細胞層は、Ｋ５６２細胞または末梢血単核細胞を含む。別のより特定の実施形
態では、前記少なくとも１つのサイトカインは、インターロイキン２である。
【００６２】
別の実施形態では、単離された複数（例えば集団）のＰＩＮＫ細胞が本明細書で提供さ
れる。別の特定の実施形態では、単離された細胞の集団は、ＣＤ５６マイクロビーズによ
り細胞を胎盤灌流液から単離することによって産生される。種々の特定の実施形態では、
集団は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５
％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも約９９％のＰＩＮＫ細胞を含む。別の実
施形態では、複数のＰＩＮＫ細胞は、増殖されていないＰＩＮＫ細胞、例えば胎盤灌流液
から回収されたままのＰＩＮＫ細胞を含むか、またはそれらからなる。別の実施形態では
、複数のＰＩＮＫ細胞は、増殖されているＰＩＮＫ細胞を含むか、またはそれらからなる
。ナチュラルキラー細胞を増殖させる方法は、例えば、Ｏｈｎｏらの米国特許出願公開第
２００３／０１５７７１３号に記載されており、Ｙｓｓｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ  ７２（１）：２１９〜２２７ページ（１９８４）およびＬｉｔｗｉｎら、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８（４）：１３２１〜１３２６ページ（１９９３）および下記
実施例１のナチュラルキラー細胞増殖の記述も参照されたい。
【００６３】
他の実施形態では、単離された複数のＰＩＮＫ細胞は、完全成熟ナチュラルキラー細胞
（例えばＣＤ１６）によって提示される１つまたは複数の細胞マーカーを提示しないか、
または完全成熟ナチュラルキラー細胞と比較して検出可能な程度に低減したレベルでその
ような１つまたは複数のマーカーを提示するか、またはナチュラルキラー細胞前駆体に付
随するが、完全成熟ナチュラルキラー細胞には付随しない１つまたは複数の細胞マーカー
を提示する。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＰＩＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、
ＣＤ９４、および／またはＮＫｐ４６を、完全成熟ＮＫ細胞よりも検出可能な程度に低い
レベルで発現する。別の特定の実施形態では、本明細書で提供される複数のＰＩＮＫ細胞
は、全部で、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ９４、および／またはＮＫｐ４６を、同等数の完全成熟Ｎ
Ｋ細胞よりも検出可能な程度に低いレベルで発現する。
【００６４】
ある種の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞の集団は、マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１
００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、
ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−
ｍｉＲ−５１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｂ、ｈ
ｓａ−ｍｉＲ−５１７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ、ｈｓ
ａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｈ、ｈｓａ
−ｍｉＲ−５６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、および／または
ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａのうち１つまたは複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検
出可能な程度に高いレベルで発現する。別の特定の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞の集団は
、同等数の末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多量のグランザイムＢを
発現する。
【００６５】
他の実施形態では、本明細書で提供されるＰＩＮＫ細胞は、培養液中で増殖されている
。種々の特定の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞は、少なくとも、約、または多くとも１、２
、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１
８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日間培養され
ており、例えば培養液中で増殖されている。特定の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞は、約２
１日間培養される。
【００６６】
別の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞を含む単離された細胞の集団、例えば胎盤細胞が本明
細書で提供される。特定の実施形態では、単離された細胞の集団は、胎盤灌流液、例えば
胎盤灌流液細胞に由来する、自己由来の単離されたＰＩＮＫ細胞を含む総有核細胞である
。別の特定の実施形態では、単離された細胞の集団は、ＣＤ５６マイクロビーズにより細
胞を胎盤灌流液から単離することによって産生される単離された細胞の集団である。種々
の特定の実施形態では、集団は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも約９９％のＰＩ
ＮＫ細胞を含む。
【００６７】
分娩後の胎盤は、回収方法に依存して、胎児に由来する組織および細胞ならびに母体胎
盤灌流液に由来する組織および細胞を含むため、胎児細胞のみまたは実質的に大多数の胎
児細胞（例えば、約９０％、９５％、９８％、または９９％を超えている）を含むことが
できるか、または胎児細胞および母体細胞の混合物（例えば、胎児細胞は、灌流液の総有
核細胞の約９０％、８０％、７０％、６０％、または５０％未満を占める）を含むことが
できる。１つの実施形態では、ＰＩＮＫ細胞は、胎児胎盤細胞、例えば胎盤の閉回路灌流
から取得される細胞のみに由来しており（上記を参照）、この灌流では、実質的に大多数
の胎児胎盤細胞、または胎児胎盤細胞のみを含む灌流液がもたらされる。別の実施形態で
は、ＰＩＮＫ細胞は、胎児細胞および母体細胞、例えば受け皿法（上記参照）による灌流
によって取得される細胞に由来しており、受け皿法では、灌流によって胎児細胞および母
体胎盤細胞の混合物を含む灌流液がもたらされる。したがって、１つの実施形態では、胎
盤由来中間ナチュラルキラー細胞の集団が本明細書で提供され、それらの実質的な大多数
は胎児の遺伝子型を有する。別の実施形態では、胎児の遺伝子型を有するナチュラルキラ
ー細胞および母体の表現型を有するナチュラルキラー細胞を含む胎盤由来中間ナチュラル
キラー細胞の集団が本明細書で提供される。
【００６８】
非胎盤性供給源に由来するナチュラルキラー細胞を含む胎盤由来中間ナチュラルキラー
細胞の集団も、本明細書で提供される。例えば、１つの実施形態では、臍帯血、末梢血、
骨髄、または先述の２つ以上の組合せに由来するナチュラルキラー細胞も含むＰＩＮＫ細
胞の集団が本明細書で提供される。ＰＩＮＫ細胞を含むナチュラルキラー細胞の集団およ
び非胎盤性供給源に由来するナチュラルキラー細胞の集団は、例えば、約１：１０、２：
９、３：８、４：７：５：６、６：５、７：４、８：３、９：２、１０：１、１：９、１
：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４
：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１００：１、９５：５、９０：１０、
８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４
５：５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０
：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１００：１、９５：１、９０：１、８５：
１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：
１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１
、１：１、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１
：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１
：８０、１：８５、１：９０、１：９５、または約１：１００などの比率で細胞を含むこ
とができる。
【００６９】
臍帯血および単離されたＰＩＮＫ細胞の組合せが本明細書でさらに提供される。種々の
実施形態では、臍帯血は、臍帯血１ミリリットル当たりのＰＩＮＫ細胞が約１×１０４、
５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０
７、１×１０８、または５×１０８個以上のＰＩＮＫ細胞と混合される。
【００７０】
ＰＩＮＫ細胞を単離する方法も本明細書で提供される。１つの実施形態では、胎盤灌流
液を取得し、次いで胎盤灌流液をＣＤ５６＋細胞に特異的に結合する組成物、例えばＣＤ
５６に対する抗体と接触させ、その後前記結合に基づいてＣＤ５６＋細胞を分離すること
によってＰＩＮＫ細胞を回収し、ＣＤ５６＋細胞の集団を形成する。ＣＤ５６＋細胞の集
団は、単離されたナチュラルキラー細胞の集団を含む。特定の実施形態では、ＣＤ５６＋
細胞を、ＣＤ１６＋細胞と特異的に結合する組成物、例えばＣＤ１６およびＣＤ５６＋細
胞の集団に由来するＣＤ１６＋細胞に対する抗体と接触させる。別の特定の実施形態では
、ＣＤ３＋細胞も、ＣＤ５６＋細胞の集団から除外される。
【００７１】
１つの実施形態では、ＰＩＮＫ細胞は、胎盤灌流液から以下のように取得される。分娩
後のヒト胎盤を放血し、例えば約２００〜８００ｍＬの灌流溶液を用いて胎盤脈管構造の
みを灌流させる。特定の実施形態では、前記灌流前に胎盤から臍帯血を排血し、例えば灌
流溶液を用いて胎盤脈管構造を洗い流して残血を取り除く。灌流液を回収および処理して
、あらゆる残留赤血球を取り除く。灌流液中にある総有核細胞中のナチュラルキラー細胞
は、ＣＤ５６およびＣＤ１６の発現に基づいて単離することができる。ある種の実施形態
では、ＰＩＮＫ細胞の単離は、ＣＤ５６に対する抗体を使用した単離を含み、この単離で
は、単離された細胞はＣＤ５６＋である。別の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞の単離は、Ｃ
Ｄ１６に対する抗体を使用した単離を含み、この単離では、単離された細胞はＣＤ１６−
である。別の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞の単離は、ＣＤ５６に対する抗体を使用した単
離、およびＣＤ１６に対する抗体を使用した複数の非ＰＩＮＫ細胞の除外を含み、単離さ
れた細胞はＣＤ５６＋、ＣＤ１６−細胞である。
【００７２】
細胞分離は、当技術分野で公知である任意の方法、例えば蛍光活性化細胞ソーティング
（ＦＡＣＳ）、または好ましくは特異的抗体をコンジュゲートさせたマイクロビーズを使
用した磁気細胞ソーティングによって達成することができる。磁気細胞分離は、例えばＡ
ＵＴＯＭＡＣＳ（商標）分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を使用して実施および自動化する
ことができる。
【００７３】
別の態様では、胎盤ナチュラルキラー細胞を単離する方法であって、複数の胎盤細胞を
取得することと、前記複数の胎盤細胞に由来するナチュラルキラー細胞を単離することと
を含む方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、胎盤細胞は、胎盤灌流液細胞
、例えば胎盤灌流液に由来する総有核細胞であるか、またはそれらを含む。別の特定の実
施形態では、前記複数の胎盤細胞は、胎盤組織の機械的および／または酵素的消化によっ
て取得される胎盤細胞であるか、またはそれらを含む。別の実施形態では、前記単離は、
１つまたは複数の抗体を使用して実施される。より特定の実施形態では、前記１つまたは
複数の抗体は、ＣＤ３、ＣＤ１６、またはＣＤ５６に対する抗体のうち１つまたは複数を
含む。より特定の実施形態では、前記単離は、前記複数の胎盤細胞中のＣＤ５６−細胞か
らＣＤ５６＋細胞を単離することを含む。より特定の実施形態では、前記単離は、ＣＤ５
６−またはＣＤ１６＋である胎盤細胞からＣＤ５６＋、ＣＤ１６−胎盤細胞、例えば胎盤
ナチュラルキラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞を単離することを含む。より特定の実施形態
では、前記単離は、ＣＤ５６−、ＣＤ１６＋、またはＣＤ３＋である胎盤細胞からＣＤ５
６＋、ＣＤ１６−、ＣＤ３−胎盤細胞を単離することを含む。別の実施形態では、胎盤ナ
チュラルキラー細胞を単離する前記方法は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％
、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも９９％
がＣＤ５６＋、ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞である、胎盤細胞の集団に帰着する。
【００７４】
５．４．一致した灌流液および臍帯血に由来する胎盤ナチュラルキラー細胞
本明細書中で混合ナチュラルキラー細胞と呼ばれる一致したユニットの胎盤灌流液およ
び臍帯血の組合せから取得されるか、または取得可能なナチュラルキラー細胞が本明細書
中でさらに提供される。本明細書中で使用される場合、「一致したユニット」とは、ＮＫ
細胞が胎盤灌流液細胞および臍帯血細胞から取得され、臍帯血細胞が、胎盤灌流液が取得
される胎盤に由来する臍帯血から取得され、つまり胎盤灌流液細胞および臍帯血細胞、な
らびに従って各々に由来するナチュラルキラー細胞が、同じ個体に由来することを示す。
【００７５】
ある種の実施形態では、混合胎盤キラー細胞は、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−であるナ
チュラルキラー細胞のみ、または実質的それらのみを含む。ある種の他の実施形態では、
混合胎盤キラー細胞は、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−であるＮＫ細胞、ならびにＣＤ５６
＋およびＣＤ１６＋であるＮＫ細胞を含む。ある種の特定の実施形態では、混合胎盤キラ
ー細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％、または９９．５％のＣＤ５６＋ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞（
ＰＩＮＫ細胞）を含む。
【００７６】
１つの実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は培養されていない。特定の実施形態
では、混合ナチュラルキラー細胞は、末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よ
りも検出可能な程度に多数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞を含む
。別の特定の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は、末梢血に由来する同等数のナ
チュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６−ナチュ
ラルキラー細胞を含む。別の特定の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は、末梢血
に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３−ＣＤ５
６＋ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３＋ナチュラルキラー細胞を含む。別の特定の実施形態では、混
合ナチュラルキラー細胞は、末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出
可能な程度に少数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４６＋ナチュラルキラー細胞を含む。別の
特定の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は、末梢血に由来する同等数のナチュラ
ルキラー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ３０＋ナチュラル
キラー細胞を含む。別の特定の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は、末梢血に由
来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３−ＣＤ５６＋
２Ｂ４＋ナチュラルキラー細胞を含む。別の特定の実施形態では、混合ナチュラルキラー
細胞は、末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少数の
ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ９４＋ナチュラルキラー細胞を含む。
【００７７】
別の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は、例えば２１日間培養されている。特
定の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は、末梢血に由来する同等数のナチュラル
キラー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３＋ナ
チュラルキラー細胞を含む。別の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は培養されて
いない。別の特定の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は、末梢血に由来する同等
数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４４
＋ナチュラルキラー細胞を含む。特定の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は、末
梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３−Ｃ
Ｄ５６＋ＮＫｐ３０＋ナチュラルキラー細胞を含む。
【００７８】
別の実施形態では、混合ナチュラルキラー細胞は、同等数の末梢血ナチュラルキラー細
胞よりも検出可能な程度に多量なグランザイムＢを発現する。
【００７９】
臍帯血および混合ナチュラルキラー細胞の組合せが本明細書中でさらに提供される。種
々の実施形態では、臍帯血は、臍帯血１ミリリットル当たりの混合ナチュラルキラー細胞
が約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×
１０７、５×１０７、１×１０８、または５×１０８個の混合ナチュラルキラー細胞と混
合される。
【００８０】
５．５．灌流液／細胞の組合せ
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、および胎盤ナチュラルキラ
ー細胞、例えば胎盤中間ナチュラルキラー細胞に加えて、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞
の増殖抑制に使用するための灌流液または細胞を含む組成物が本明細書で提供される。
【００８１】
５．５．１．胎盤灌流液、灌流液細胞、および胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の組合
せ
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、および／または上記の
５．１、５．３、または５．４節に記述されている混合ナチュラルキラー細胞の組合せを
含む組成物が本明細書中でさらに提供される。１つの実施形態では、例えば、例えば機械
的にまたは酵素的に破壊された胎盤灌流液細胞または胎盤組織から取得される複数の胎盤
灌流液細胞および／または複数の胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば胎盤中間ナチュラル
キラー細胞を補充したある容積の胎盤灌流液が本明細書で提供される。特定の実施形態で
は、例えば各１ミリリットルの胎盤灌流液は、約１×１０４、５×１０４、１×１０５、
５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、または５
×１０８個以上の胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、および／または混合
ナチュラルキラー細胞を補充している。別の実施形態では、複数の胎盤灌流液細胞は、胎
盤灌流液、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、および／または混合ナチュラルキラー細胞を
補充している。別の実施形態では、複数の胎盤中間ナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液
、胎盤灌流液細胞、および／または混合ナチュラルキラー細胞を補充している。ある種の
実施形態では、灌流液が補完に使用される場合、灌流液の容積は、細胞（溶液中）の全容
積＋灌流液の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１
０％、８％、６％、４％、２％、もしくは１％、それらを超える％、またはそれら未満で
ある。ある種の他の実施形態では、胎盤灌流液細胞が複数ＰＩＮＫ細胞および／または混
合ナチュラルキラー細胞と混合される場合、胎盤灌流液細胞は、一般的に、細胞総数の約
５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６
％、４％、２％、もしくは１％、それらを超える％、またはそれら未満を占める。ある種
の他の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞が複数の胎盤灌流液細胞および／または混合ナチュラ
ルキラー細胞と混合される場合、ＰＩＮＫ細胞は、一般的に、細胞総数の約５０％、４５
％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２
％、もしくは１％、それらを超える％、またはそれら未満を占める。ある種の他の実施形
態では、混合ナチュラルキラー細胞がＰＩＮＫ細胞および／または胎盤灌流液細胞と混合
される場合、混合ナチュラルキラー細胞は、一般的に、細胞総数の約５０％、４５％、４
０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％、も
しくは１％、それらを超える％、またはそれら未満を占める。ある種の他の実施形態では
、ＰＩＮＫ細胞、混合ナチュラルキラー細胞、または胎盤灌流液細胞が胎盤灌流液に補充
するために使用される場合、その中に細胞が懸濁される溶液（例えば、生理食塩水または
培地など）の容積は、灌流液＋細胞の総容積の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０
％、２５％、２０％、１５％、１０％、８％、６％、４％、２％、もしくは１％、それら
を超える％、またはそれら未満を占め、ＰＩＮＫ細胞は、補充前の１ミリリットル当たり
の細胞が約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６
、１×１０７、５×１０７、１×１０８、または５×１０８個以上になるように懸濁され
ている。
【００８２】
他の実施形態では、上記の組合せのいずれかは、次いで臍帯血または臍帯血に由来する
有核細胞と混合される。
【００８３】
２つ以上の供給源、例えば２つ以上の胎盤から取得され、混合、例えば貯留されている
、貯留された胎盤灌流液が本明細書でさらに提供される。そのような貯留された灌流液は
、各供給源からほぼ等容積の灌流液を含んでいてもよく、または各供給源から異なる容積
を含んでいてもよい。各供給源からの相対的な容積は、無作為に選択してもよく、あるい
は例えば１つもしくは複数の細胞性因子、例えばサイトカイン、増殖因子、もしくはホル
モンなどの濃度もしくは量；各供給源に由来する灌流液中の胎盤細胞の数；または各供給
源に由来する灌流液の他の特徴に基づいていてもよい。同一胎盤の複数回の灌流からの灌
流液は、同様に貯留することができる。
【００８４】
同様に、２つ以上の供給源、例えば２つ以上の胎盤から取得され貯留された胎盤灌流液
細胞および胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞が本明細書で提供される。そのような貯留
された細胞は、２つ以上の供給源からほぼ等しい数の細胞を含んでいてもよく、または貯
留された供給源のうち１つまたは複数から異なった数の細胞を含んでいてもよい。各供給
源からの細胞の相対数は、例えば、貯留される細胞中にある１つまたは複数の特定細胞タ
イプの数、例えばＣＤ３４＋細胞の数、ＣＤ５６＋細胞の数などに基づいて選択すること
ができる。
【００８５】
貯留物は、例えば胎盤灌流液細胞を補充した胎盤灌流液；胎盤由来中間ナチュラルキラ
ー（ＰＩＮＫ）細胞を補充した胎盤灌流液；胎盤灌流液細胞およびＰＩＮＫ細胞の両方を
補充した胎盤灌流液；胎盤灌流液を補充した胎盤灌流液細胞；ＰＩＮＫ細胞を補充した胎
盤灌流液細胞；胎盤灌流液およびＰＩＮＫ細胞の両方を補充した胎盤灌流液細胞；胎盤灌
流液を補充したＰＩＮＫ細胞；胎盤灌流液細胞を補充したＰＩＮＫ細胞；または胎盤灌流
液細胞および胎盤灌流液の両方を補充したＰＩＮＫ細胞を含んでいてもよい。
【００８６】
例えば所与の数の胎盤灌流液細胞もしくはＰＩＮＫ細胞または所与の容積の灌流液から
期待される腫瘍抑制（すなわち効力）の程度または量を決定するためにアッセイされた胎
盤灌流液、胎盤灌流液細胞、および胎盤中間ナチュラルキラー細胞、ならびにその貯留物
またはその組合せが本明細書でさらに提供される。例えば、細胞の等量またはサンプル数
を、そうでなければ腫瘍細胞が増殖するであろう条件下で既知数の腫瘍細胞と接触させ、
胎盤灌流液、灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、またはそれらの組合せの存在下に
おける経時的な（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０週以上）腫瘍
細胞の増殖速度を、灌流液、灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、またはそれらの組
合せの非存在下における同等数の腫瘍細胞の増殖と比較する。胎盤灌流液、胎盤灌流液細
胞、および／もしくはＰＩＮＫ細胞、またはその組合せもしくは貯留物の効力は、例えば
腫瘍細胞増殖を、例えば、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％
、４５％、または５０％等抑制するために必要とされる細胞の数または溶液の容積として
表すことができる。
【００８７】
ある種の実施形態では、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、およびＰＩＮＫ細胞は、医薬品
級の投与可能なユニットとして提供される。そのようなユニットは、個々の容積、例えば
１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍ
Ｌ、４５０ｍＬ、または５００ｍＬなどで提供することができる。そのようなユニットは
、指定された数の、例えば１ミリリットル当たりの細胞が１×１０４、５×１０４、１×
１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、
または５×１０８個以上の、または例えば１ユニット当たりの細胞が１×１０４、５×１
０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１
×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、または
１×１０１１個以上の、例えば胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、または
その両方を含有するように提供することができる。そのようなユニットは、指定された数
の胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、および／またはＰＩＮＫ細胞の任意の２つまたは３つす
べてを含有するように提供することができる。
【００８８】
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、および／またはＰＩＮＫ細胞の上記の組合せでは、胎盤
灌流液、胎盤灌流液細胞、および／またはＰＩＮＫ細胞のいずれか１つ、いずれか２つ、
または３つすべては、受容個体の自己由来（すなわち、受容個体から取得される）であっ
てもよく、または受容個体に同種性（すなわち、前記受容個体に由来する１つの他の個体
からついに取得される）であってもよい。
【００８９】
ＰＩＮＫ細胞、胎盤灌流液細胞、および／または胎盤灌流液の上記の組合せまたは貯留
物のいずれかは、例えば胎盤灌流液、末梢血、臍帯血、または骨髄などに由来するＣＤ５
６＋ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞を含むことができる。特定の実施形態では、その組
合せは、１ミリリットル当たり約、少なくとも約、または多くとも約１×１０４、５×１
０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、もしくは５×１０６個以上のそのようなナ
チュラルキラー細胞、または１ユニット当たり１×１０４、５×１０４、１×１０５、５
×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８
、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、もしくは１×１０１１個以上
の細胞を含む。ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は、天然供給源から単離して
使用してもよく、または上記の組合せまたは貯留物の１つに含有させる前に増殖させても
よい。ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞は、自己由来（すなわち、胎盤灌流液、胎盤灌流液
細胞、および／またはＰＩＮＫ細胞と同じ個体から取得されるか、または受容個体から取
得される）であってもよく、同種性（すなわち、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、および／
またはＰＩＮＫ細胞とは異なる個体から取得されるか、または受容個体ではない個体に由
来する）であってもよい。
【００９０】
好ましくは、各ユニットには、容積、細胞の数、細胞のタイプ、ユニットが特定のタイ
プの細胞について濃縮されているかどうかを指定するための表示が付けられており、かつ
／またはユニット中の所与の細胞数もしくはユニットの所与のミリリットル数の効力は、
特定の（１つまたは複数の）タイプの腫瘍細胞の増殖の測定可能な抑制を引き起こす。
【００９１】
単独でまたは胎盤灌流液細胞および／もしくは胎盤灌流液と組み合わせて胎盤中間ナチ
ュラルキラー細胞を含む組成物も、本明細書で提供される。したがって、別の態様では、
単離されたＣＤ５６＋、ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞を含む組成物が本明細書で提供
され、前記ナチュラルキラー細胞は胎盤灌流液から単離されており、前記ナチュラルキラ
ー細胞は、組成物中にある細胞の少なくとも５０％を占める。特定の実施形態では、前記
ナチュラルキラー細胞は、組成物中にある細胞の少なくとも８０％を占める。別の特定の
実施形態では、前記組成物は、単離されたＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞
を含む。より特定の実施形態では、前記ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞は
、前記ＣＤ５６＋、ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来する。別の特
定の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞は、単一の固体に由来する。より特定の実
施形態では、前記単離されたナチュラルキラー細胞は、少なくとも２つの異なる個体に由
来するナチュラルキラー細胞を含む。別の特定の実施形態では、組成物は、単離された胎
盤灌流液を含む。より特定の実施形態では、前記胎盤灌流液は、前記ナチュラルキラー細
胞と同じ個体に由来する。別のより特定の実施形態では、前記胎盤灌流液は、前記ナチュ
ラルキラー細胞とは異なる個体に由来する胎盤灌流液を含む。別の特定の実施形態では、
組成物は胎盤灌流液細胞を含む。より特定の実施形態では、前記胎盤灌流液細胞は、前記
ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来する。別のより特定の実施形態では、前記胎盤灌
流液細胞は、前記ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来する。別の特定の実施形態
では、組成物は、単離された胎盤灌流液および単離された胎盤灌流液細胞を含み、前記単
離された灌流液および前記単離された胎盤灌流液細胞は、異なる個体に由来する。胎盤灌
流液を含む上記の実施形態のいずれかの、別のより特定の実施形態では、前記胎盤灌流液
は、少なくとも２つの個体に由来する胎盤灌流液を含む。胎盤灌流液細胞を含む上記の実
施形態のいずれかの、別のより特定の実施形態では、前記単離された胎盤灌流液細胞は、
少なくとも２つの個体に由来する。
【００９２】
５．５．２．接着性胎盤幹細胞を含む組成物
他の実施形態では、胎盤灌流液、複数の胎盤灌流液細胞、および／もしくは複数のＰＩ
ＮＫ細胞、または前述のいずれかの組合せもしくは貯留物は、接着性胎盤幹細胞を補充し
ている。そのような幹細胞は、例えばＨａｒｉｒｉの米国特許第７，０４５，１４８号お
よび第７，２５５，８７９号に記載されている。接着性胎盤幹細胞は栄養芽細胞ではない
。
【００９３】
胎盤灌流液、複数の胎盤灌流液細胞、および／もしくは複数のＰＩＮＫ細胞、または先
述のいずれかの組合せもしくは貯留物は、例えば１ミリリットル当たり１×１０４、５×
１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、
１×１０８、または５×１０８個以上の細胞、または１×１０４、５×１０４、１×１０
５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×
１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、または１×１０１１個
以上の接着性胎盤細胞を補充することができる。例えば、組合せ中の接着性胎盤幹細胞は
、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、
２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または４０集団以上に倍増す
るように培養された接着性胎盤幹細胞であり得る。
【００９４】
接着性胎盤幹細胞は、初代培養液または細胞培養液中で培養される際に、組織培養基質
、例えば組織培養容器表面（例えば組織培養プラスチック）に接着する。培養液中の接着
性胎盤幹細胞は、一般的には、中央細胞体から伸長する多数の細胞質突起を有する、線維
芽細胞様の星状外観をしていると仮定されている。しかしながら、胎盤幹細胞は線維芽細
胞が示すよりも多数のそのような突起を示すため、接着性胎盤幹細胞は、同じ条件下で培
養された線維芽細胞とは形態学的に区別可能である。胎盤幹細胞は、培養液中ではより円
形または丸石形の形態であると一般的に仮定されている造血性幹細胞とも、形態学的に区
別可能である。
【００９５】
本明細書で提供される組成物および方法に有用な接着性胎盤幹細胞、および胎盤幹細胞
の集団は、幹細胞または幹細胞を含む細胞の集団を識別および／または単離するために使
用することができる複数のマーカーを発現する。本明細書で提供される組成物および方法
に有用な接着性胎盤幹細胞および接着性幹細胞集団には、幹細胞、および胎盤またはその
任意の一部（例えば、羊膜、絨毛膜、羊膜−絨毛膜板、胎盤葉、および臍帯など）から直
接的に取得される幹細胞含有細胞集団が含まれる。１つの実施形態では、接着性胎盤幹細
胞集団は、培養液中の接着性胎盤幹細胞の集団（すなわち２つ以上）、例えば容器、例え
ばバッグの中の集団である。
【００９６】
接着性胎盤幹細胞は、一般的に、マーカーＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ２００、ＨＬＡ
−Ｇ、および／またはＯＣＴ−４を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ３８、またはＣＤ４５を発現
しない。接着性胎盤幹細胞は、ＨＬＡ−ＡＢＣ（ＭＨＣ−１）およびＨＬＡ−ＤＲも発現
することができる。これらのマーカーを使用すると、接着性胎盤幹細胞を識別し、胎盤幹
細胞を他の幹細胞タイプと区別することができる。胎盤幹細胞は、ＣＤ７３およびＣＤ１
０５を発現することができるため、間葉系幹細胞様の特徴を示すことができる。しかしな
がら、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇ、胎児特異的マーカーを発現す
ることができるため、ＣＤ２００もＨＬＡ−Ｇも発現しない間葉系幹細胞、例えば骨髄由
来間葉系幹細胞と区別することができる。同様に、ＣＤ３４、ＣＤ３８、および／または
ＣＤ４５発現の欠如により、接着性胎盤幹細胞は非造血性幹細胞として識別される。
【００９７】
１つの実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ２００＋、ＨＬＡ−Ｇ＋であり、この
幹細胞は癌細胞増殖または腫瘍成長を検出可能な程度抑制する。特定の実施形態では、前
記接着性幹細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋でもある。別の特定の実施形態では、
前記接着性幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−でもある。より特定の
実施形態では、前記接着性幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋
、およびＣＤ１０５＋でもある。別の実施形態では、前記接着性幹細胞は、胚様体の形成
を可能にする条件下で培養されると、１つまたは複数の胚様体を産生する。
【００９８】
別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋で
あり、この幹細胞は癌細胞増殖または腫瘍成長を検出可能な程度抑制する。前記集団の特
定の実施形態では、前記接着性幹細胞はＨＬＡ−Ｇ＋である。別の特定の実施形態では、
前記接着性幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−である。別の特定の実
施形態では、前記接着性幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。
より特定の実施形態では、前記接着性幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、
およびＨＬＡ−Ｇ＋である。別の特定の実施形態では、前記接着性胎盤幹細胞は、胚様体
の形成を可能にする条件下で培養されると、１つまたは複数の胚様体を産生する。
【００９９】
別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ２００＋、ＯＣＴ−４＋であり、この幹
細胞は癌細胞増殖または腫瘍成長を検出可能な程度抑制する。特定の実施形態では、前記
接着性幹細胞は、ＣＤ７３＋およびＣＤ１０５＋である。別の特定の実施形態では、前記
接着性幹細胞はＨＬＡ−Ｇ＋である。別の特定の実施形態では、前記接着性幹細胞は、Ｃ
Ｄ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。より特定の実施形態では、前記接着性
幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＨ
ＬＡ−Ｇ＋である。別の特定の実施形態では、前記接着性胎盤幹細胞は、胚様体の形成を
可能にする条件下で培養されると、１つまたは複数の胚様体を産生する。
【０１００】
別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、およびＨＬＡ−
Ｇ＋であり、この接着性幹細胞は癌細胞増殖または腫瘍成長を検出可能な程度抑制する。
上記複数の特定の実施形態では、前記接着性幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、または
ＣＤ４５−でもある。別の特定の実施形態では、前記接着性幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ
３８−、およびＣＤ４５−でもある。別の特定の実施形態では、前記接着性幹細胞は、Ｏ
ＣＴ−４＋でもある。別の特定の実施形態では、前記接着性幹細胞は、ＣＤ２００＋でも
ある。より特定の実施形態では、前記接着性幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４
５−、ＯＣＴ−４＋、およびＣＤ２００＋でもある。
【０１０１】
別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞はＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋幹細胞であり、前記
幹細胞は胚様体の形成を可能にする条件下で１つまたは複数の胚様体を産生し、前記接着
性幹細胞は癌細胞増殖または腫瘍成長を検出可能な程度抑制する。別の特定の実施形態で
は、前記接着性幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、またはＣＤ４５−でもある。別の特
定の実施形態では、前記接着性幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−で
もある。別の特定の実施形態では、前記接着性幹細胞は、ＯＣＴ−４＋でもある。より特
定の実施形態では、前記接着性幹細胞は、ＯＣＴ−４＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、およ
びＣＤ４５−でもある。
【０１０２】
別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞はＯＣＴ−４＋幹細胞であり、前記接着性胎盤幹
細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されると、１つまたは複数の胚様体を産
生し、前記幹細胞は、癌細胞増殖または腫瘍成長を検出可能な程度抑制することが確認さ
れている。
【０１０３】
種々の実施形態では、前記単離された胎盤細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％
、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なく
とも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＯＣＴ−
４＋幹細胞である。上記集団の特定の実施形態では、前記幹細胞はＣＤ７３＋およびＣＤ
１０５＋である。別の特定の実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ま
たはＣＤ４５−である。別の特定の実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ２００＋である。
より特定の実施形態では、前記幹細胞は、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、Ｃ
Ｄ３４−、ＣＤ３８−、およびＣＤ４５−である。別の特定の実施形態では、前記集団は
増殖されており、例えば、少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも５回、少なくと
も１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回継代されている。
【０１０４】
上記の実施形態のいずれかの、より特定の実施形態では、接着性胎盤細胞は、ＡＢＣ−
ｐ（胎盤特異的ＡＢＣ輸送体タンパク質；例えばＡｌｌｉｋｍｅｔｓら、Ｃａｎｃｅｒ  
Ｒｅｓ．５８（２３）：５３３７〜９ページ（１９９８）を参照）を発現する。
【０１０５】
別の実施形態では、接着性胎盤幹細胞は、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ
９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２００＋、ＣＤ３４−、およびＣＤ１３３−である。別の実
施形態では、接着性胎盤幹細胞、胎盤幹細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、および単球走化性
タンパク質（ＭＣＰ−１）を構成的に分泌する。
【０１０６】
上記で参照されている胎盤幹細胞の各々は、哺乳動物胎盤から直接的に取得および単離
される胎盤幹細胞、または培養されており、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８
、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、または３０回以上継代された胎盤幹
細胞、またはそれらの組合せを含むことができる。上述した腫瘍細胞抑制性の複数の接着
性胎盤幹細胞は、約、少なくとも、または多くとも１×１０５、５×１０５、１×１０６
、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１
０９、１×１０１０、５×１０１０、または１×１０１１個以上の接着性胎盤幹細胞を含
むことができる。
【０１０７】
５．５．３．胎盤幹細胞馴化培地を含む組成物
ＰＩＮＫ細胞、胎盤灌流液、および／または胎盤灌流液、ならびに追加的な馴化培地を
含む腫瘍抑制性組成物の使用も本明細書で提供される。接着性胎盤幹細胞、胎盤灌流液細
胞、および／または胎盤中間ナチュラルキラー細胞を使用して、腫瘍細胞抑制性である馴
化培地、すなわち１つまたは複数のタイプの複数の免疫細胞に対して検出可能な腫瘍細胞
抑制効果を有する幹細胞によって分泌または排泄される１つまたは複数の生体分子を含む
培地を産生することができる。種々の実施形態では、馴化培地は、胎盤細胞（例えば、幹
細胞、胎盤灌流液細胞、ＰＩＮＫ細胞）を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８
、９、１０、１１、１２、１３または１４日以上その中で成長させた培地を含む。他の実
施形態では、馴化培地は、胎盤細胞を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０
％、８０％、９０％コンフルエンス、または１００％コンフルエンスにまでその中で成長
させた培地を含む。そのような馴化培地は、胎盤細胞または別の種類の細胞の別々の集団
の培養を支援するために使用することができる。別の実施形態では、本明細書で提供され
る馴化培地は、接着性胎盤幹細胞および非胎盤性幹細胞がその中で培養された培地を含む
。
【０１０８】
そのような馴化培地は、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、および／または胎盤中間ナチュ
ラルキラー細胞のいずれか、またはそれらの任意の組合せと混合されて、腫瘍細胞抑制性
組成物を形成することができる。ある種の実施形態では、組成物は、容積が半分未満の、
例えば容積が約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１
０％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％、またはそれら未満の馴化培地を含む。
【０１０９】
したがって、１つの実施形態では、胎盤幹細胞の培養物に由来する培地を含む組成物で
あって、前記胎盤幹細胞が、（ａ）基質に接着し、（ｂ）ＣＤ２００およびＨＬＡ−Ｇを
発現するか、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ２００を発現するか、またはＣＤ
２００およびＯＣＴ−４を発現するか、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＨＬＡ−Ｇ
を発現するか、またはＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現し、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の
集団中で、前記集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養した際に、１つまたは複数
の胚様体の形成を容易にし、あるいは、ＯＣＴ−４を発現し、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞
の集団中で、前記集団を胚様体の形成を可能にする条件下で培養した際に、１つまたは複
数の胚養体の形成を容易にし、（ｃ）腫瘍細胞または腫瘍細胞の集団の成長または増殖を
検出可能な程度抑制する組成物が本明細書で提供される。特定の実施形態では、組成物は
複数の前記胎盤幹細胞をさらに含む。別の特定の実施形態では、組成物は複数の非胎盤細
胞を含む。より特定の実施形態では、前記非胎盤細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば末梢血
造血性前駆細胞、臍帯血造血性前駆細胞、または胎盤血造血性前駆細胞などの造血性前駆
細胞を含む。非胎盤細胞は、間葉系幹細胞、例えば骨髄由来間葉系幹細胞などの他の幹細
胞も含むことができる。非胎盤細胞は、１つまたは複数のタイプの成体細胞または細胞系
でもあり得る。別の特定の実施形態では、組成物は、抗増殖剤、例えば抗ＭＩＰ−１α、
抗ＭＩＰ−１β抗体を含む。
【０１１０】
特定の実施形態では、胎盤細胞馴化培地または上清は、約１：１、約２：１、約３：１
、約４：１、約５：１の胎盤幹細胞対腫瘍細胞の比率で、複数の腫瘍細胞と共培養された
複数の胎盤幹細胞から取得される。例えば、馴化培地または上清は、約１×１０５個の胎
盤幹細胞、約１×１０６個の胎盤幹細胞、約１×１０７個の胎盤幹細胞、または約１×１
０８個以上の胎盤幹細胞を含む培養から取得することができる。別の特定の実施形態では
、馴化培地または上清は、約１×１０５〜約５×１０５個の胎盤幹細胞および約１×１０
５個の腫瘍細胞；約１×１０６〜約５×１０６個の胎盤幹細胞および約１×１０６個の腫
瘍細胞；約１×１０７〜約５×１０７個の胎盤幹細胞および約１×１０７個の腫瘍細胞；
または約１×１０８〜約５×１０８個の胎盤幹細胞および約１×１０８個の腫瘍細胞の共
培養から取得される。
【０１１１】
特定の実施形態では、７０ｋｇの個体への投与に好適な馴化培地は、約２００ｍＬの培
地中に約７０００万個の胎盤幹細胞によって馴化された上清を含む。
【０１１２】
馴化培地は、投与可能な医薬品級の製品を調製するために濃縮することができる。例え
ば、馴化培地は、水を除去することによって、例えば蒸発または凍結乾燥などによって、
約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％以
上まで濃縮することができる。特定の実施形態では、例えば、約７０００万個の胎盤幹細
胞からの２００ｍＬの馴化培地は、約１８０ｍＬ、１６０ｍＬ、１４０ｍＬ、１２０ｍＬ
、１００ｍＬ、８０ｍＬ、６０ｍＬ、４０ｍＬ、または２０ｍＬ以下に濃縮することがで
きる。馴化培地は、例えば蒸発または凍結乾燥などにより実質的に乾燥させ、例えば粉末
にすることもできる。
【０１１３】
５．６．灌流液および胎盤細胞の保存
胎盤灌流液または胎盤細胞、例えば灌流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、およびＰ
ＩＮＫ細胞は保存することができる、すなわち、長期保管を可能にする条件下または細胞
死、例えばアポトーシスもしくはネクローシスを阻害する条件下に置くことができる。
【０１１４】
胎盤灌流液は、胎盤の少なくとも一部に、例えば胎盤脈管構造に、胎盤細胞組成物を通
過させることによって産生することができる。胎盤細胞回収組成物は、灌流液内に含有さ
れている細胞を保存するように作用する１つまたは複数の化合物を含む。そのような胎盤
細胞回収組成物は、上記の５．１節に記述されており、例えば、２００６年１２月２８日
に提出された「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａ
ｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」と題する
関連米国特許出願第１１／６４８，８１２号に記載されているような、アポトーシス阻害
剤、ネクローシス阻害剤、および／または酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物で
ある。１つの実施形態では、胎盤または胎盤組織を通過させた胎盤細胞回収組成物は、下
記の５．４節に記述されている方法に有用な胎盤灌流液である。
【０１１５】
１つの実施形態では、胎盤灌流液および／または胎盤細胞は、アポトーシス阻害剤およ
び酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む胎盤細胞回収組成物に細胞を接触させることによ
り、哺乳動物、例えばヒトの分娩後胎盤から回収され、前記アポトーシス阻害剤は、アポ
トーシス阻害剤と接触させなかった幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団におけるアポ
トーシスを低減または防止するのに十分な量で十分な時間存在する。例えば、胎盤は、胎
盤細胞回収組成物で灌流することができ、胎盤細胞、例えば総有核胎盤細胞はそこから単
離される。特定の実施形態では、アポトーシス阻害剤はカスパーゼ阻害剤である。別の特
定の実施形態では、アポトーシス阻害剤はＪＮＫ阻害剤である。より特定の実施形態では
、前記ＪＮＫ阻害剤は、前記幹細胞の分化または増殖を調節しない。別の実施形態では、
胎盤細胞回収組成物は、前記アポトーシス阻害剤および前記酸素運搬ペルフルオロカーボ
ンを別々の相に含む。別の実施形態では、胎盤細胞回収組成物は、前記アポトーシス阻害
剤および前記酸素運搬ペルフルオロカーボンをエマルジョン中に含む。別の実施形態では
、胎盤細胞回収組成物は、乳化剤、例えばレシチンをさらに含む。別の実施形態では、前
記アポトーシス阻害剤および前記ペルフルオロカーボンは、胎盤細胞と接触する時には約
０℃から約２５℃の間にある。別のより特定の実施形態では、前記アポトーシス阻害剤お
よび前記ペルフルオロカーボンは、胎盤細胞と接触する時には約２℃から１０℃の間、ま
たは約２℃から約５℃の間にある。別のより特定の実施形態では、前記接触は、幹細胞の
前記集団の輸送中に実施される。別のより特定の実施形態では、前記接触は、幹細胞の前
記集団の冷凍および解凍中に実施される。
【０１１６】
別の実施形態では、胎盤灌流液および／または胎盤細胞は、灌流液および／または細胞
を、アポトーシス阻害剤および臓器保存化合物と接触させることによって回収および保存
することができ、前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触しなかった灌流
液または胎盤細胞と比較して、細胞のアポトーシスを低減または防止するのに十分な量で
十分な時間存在する。
【０１１７】
特定の実施形態では、臓器保存化合物はＵＷ溶液である（米国特許第４，７９８，８２
４号に記載されている；ＶＩＡＳＰＡＮ（登録商標）としても知られている；Ｓｏｕｔｈ
ａｒｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４９（２）：２５１〜２５７ページ（１９
９０）、またはＳｔｅｒｎらの米国特許第５，５５２，２６７号に記載の溶液も参照され
たい）。別の実施形態では、前記臓器保存組成物は、ヒドロキシエチルデンプン、ラクト
ビオン酸、ラフィノース、またはそれらの組合せである。別の実施形態では、胎盤細胞回
収組成物は、酸素運搬ペルフルオロカーボンを２つの相中にかまたはエマルジョンとして
かのいずれかでさらに含む。
【０１１８】
本方法の別の実施形態では、胎盤灌流液および／または胎盤細胞を、アポトーシス阻害
剤および酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む胎盤細胞回収組成物、臓器保存化合物、ま
たはそれらの組合せと灌流中に接触させる。別の実施形態では、胎盤細胞を、灌流により
回収した後に前記幹細胞回収化合物と接触させる。
【０１１９】
典型的には、胎盤細胞の回収、濃縮、および単離中に、低酸素および機械的ストレスに
よる細胞ストレスを最小限にするかまたは排除することが望ましい。したがって、本方法
の別の実施形態では、胎盤灌流液、胎盤細胞、または胎盤細胞の集団は、前記保存中、回
収、濃縮、または単離中に６時間未満の間低酸素状態に曝されており、低酸素性状態とは
正常血液酸素濃度未満の酸素濃度である。より特定の実施形態では、前記胎盤細胞の集団
は、前記保存中に２時間未満の間前記低酸素状態に曝される。別のより特定の実施形態で
は、前記胎盤細胞の集団は、１時間未満または３０分未満の間前記低酸素状態に曝される
か、または回収、濃縮、または単離中に低酸素状態に曝されない。別の特定の実施形態で
は、前記胎盤細胞の集団は、回収、濃縮、または単離中にせん断ストレスに曝されない。
【０１２０】
本明細書で提供される胎盤細胞は、例えば、小型容器、例えばアンプルの凍結保存培地
中で凍結保存することができる。好適な凍結保存培地は、これらに限定されないが、例え
ば増殖培地を含む培地、または細胞凍結培地、例えば市販の細胞凍結培地、例えばＣ２６
９５、Ｃ２６３９、またはＣ６０３９（Ｓｉｇｍａ社）を含む。凍結保存培地は、好まし
くは、例えば約１０％（ｖ／ｖ）の濃度でＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含む。凍
結保存培地は、追加的な作用剤、例えばメチルセルロースおよび／またはグリセロールを
含んでいてもよい。胎盤細胞は、凍結保存中は約１℃／分で冷却されるのが好ましい。好
ましい凍結保存温度は、約−８０℃〜−約１８０℃、好ましくは約−１２５℃〜約−１４
０℃である。凍結保存された胎盤細胞は、使用するための解凍に先立って液体窒素に移さ
れてもよい。幾つかの実施形態では、例えば、いったんアンプルが約−９０℃に達すると
、アンプルは液体窒素保管区域に移される。凍結保存された細胞は、好ましくは約２５℃
〜約４０℃の温度で、好ましくは約３７℃までの温度で解凍される。
【０１２１】
５．７．腫瘍細胞成長を抑制するための、胎盤灌流液、ＰＩＮＫ細胞、および混合胎盤ナ
チュラルキラー細胞の使用
胎盤灌流液、胎盤灌流液から単離された細胞、単離された混合ナチュラルキラー細胞、
または単離された胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞
を使用して、腫瘍細胞の成長、例えば増殖を抑制する方法も本明細書で提供される。
【０１２２】
１つの実施形態では、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、
腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞を、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、単離された混合ナチュ
ラルキラー細胞、および／またはＰＩＮＫ細胞と接触させることを含み、腫瘍細胞または
複数の腫瘍細胞の増殖が、胎盤灌流液、胎盤細胞、単離された混合ナチュラルキラー細胞
、および／またはＰＩＮＫ細胞と接触させなかった同じタイプの腫瘍細胞または複数の腫
瘍細胞と比較して、検出可能な程度低減される方法が本明細書で提供される。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、「接触」は、１つの実施形態では、胎盤灌流液、胎盤灌
流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば胎盤中間ナチュラルキラー細胞、および／
または単離された混合ナチュラルキラー細胞と、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞との、直
接的物理的接触、例えば細胞間接触を包含する。別の実施形態では、「接触」とは、同じ
物理的空間に存在すること、例えば胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー
細胞、例えば胎盤中間ナチュラルキラー細胞、および／または単離された混合ナチュラル
キラー細胞が、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞と同じ容器、例えば培養皿、多ウェル空間
に配置されていることを包含する。別の実施形態では、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、混
合ナチュラルキラー細胞、または胎盤中間ナチュラルキラー細胞と、腫瘍細胞または複数
の腫瘍細胞との「接触」は、例えば、胎盤灌流液または細胞、例えば胎盤灌流液細胞、混
合ナチュラルキラー細胞、または胎盤中間ナチュラルキラー細胞を、腫瘍細胞または複数
の腫瘍細胞を含む個体、例えばヒト、例えば癌患者に注射または注入することによって達
成される。
【０１２４】
ある種の実施形態では、胎盤灌流液は、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞を含む個体、例
えば癌患者に、検出可能な治療上の有益性をもたらす結果となる任意の量で使用される。
ある種の他の実施形態中では、胎盤灌流液細胞、胎盤中間ナチュラルキラー細胞、および
／または混合ナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞を含む個体に、検
出可能な治療上の有益性をもたらす結果となる任意の量で使用される。したがって、別の
実施形態では、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞
または複数の腫瘍細胞を、個体内で胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、および／または胎盤由
来中間ナチュラルキラー細胞、または複数のＰＩＮＫ細胞に接触させることを含み、前記
接触が前記個体にとって検出可能な程度にまたは明らかに治療上有益である方法が本明細
書で提供される。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、「治療上の有益性」には、これらに限定されないが、例
えば、腫瘍サイズの縮小；腫瘍増殖の軽減または休止；単位容積当たりの組織試料、例え
ば血液試料中の癌細胞数の低減；前記個体が有する特定の癌の任意の症状の臨床的改善、
個体が有する特定の癌の任意の症状の悪化の軽減または休止などが含まれる。そのような
治療上の有益性の任意のうち１つまたは複数を達成する、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、
および／またはＰＩＮＫ細胞の接触は、治療上有益であると言われる。
【０１２６】
ある種の実施形態では、胎盤灌流液細胞、例えば胎盤灌流液に由来する有核細胞、混合
ナチュラルキラー細胞、および／または胎盤中間ナチュラルキラー細胞は、腫瘍細胞また
は複数の腫瘍細胞を含む個体、例えば癌患者に、検出可能な治療上の有益性をもたらす結
果となる任意の量または数で使用される。胎盤灌流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、
および／または胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば胎盤中間ナチュラルキラー細胞は、あ
る数の細胞をそのような個体に投与することができ、例えば、前記個体には、約、少なく
とも約、または多くとも約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０
７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、ま
たは５×１０１０個の胎盤灌流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、および／またはナチ
ュラルキラー細胞を投与することができる。他の実施形態では、胎盤灌流液細胞、混合ナ
チュラルキラー細胞、および／または胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞は、ある数の細
胞をそのような個体に投与することができ、例えば、前記個体には、個体の１キログラム
当たり、約、少なくとも約、または多くとも約１×１０５、５×１０５、１×１０６、５
×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９
、１×１０１０、または５×１０１０個の胎盤灌流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、
および／またはナチュラルキラー細胞を投与することができる。胎盤灌流液細胞および／
または胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞は、胎盤灌流液細胞および／または胎盤ナチュ
ラルキラー細胞、例えば胎盤中間ナチュラルキラー細胞と、前記個体中の腫瘍細胞とのあ
る近似的な比率で、そのような個体に投与することができる。例えば、胎盤灌流液細胞お
よび／または胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば胎盤中間ナチュラルキラー細胞は、個体
中の腫瘍細胞の数に対して、約、少なくとも約、多くとも約１：１、１：１、３：１、４
：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５
：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５
：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、または１００：
１の比率で、前記個体に投与することができる。そのような個体中の腫瘍細胞の数は、例
えば、個体に由来する組織試料中、例えば血液試料または生検中などの腫瘍細胞の数を計
数することによって推定することができる。特定の実施形態では、前記計数は、例えば固
形腫瘍の場合、（１つまたは複数の）腫瘍の画像診断と組み合わせて実施され、近似的な
腫瘍容積が取得される。
【０１２７】
腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法であって、胎盤灌流液、胎
盤灌流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、および／または胎盤由来中間ナチュラルキラ
ー細胞の組合せを使用する方法が本明細書中でさらに提供される。種々の実施形態では、
腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、（１つまたは複数の）前
記腫瘍細胞を、複数の胎盤灌流液細胞またはＰＩＮＫ細胞を補充した胎盤灌流液；胎盤灌
流液または複数のＰＩＮＫ細胞を補充した胎盤灌流液細胞；胎盤灌流液および胎盤灌流液
細胞、複数のＰＩＮＫ細胞および複数の混合ナチュラルキラー細胞を補充したＰＩＮＫ細
胞；複数の混合ナチュラルキラー細胞および複数の胎盤灌流液細胞；混合ナチュラルキラ
ー細胞を補充した胎盤灌流液；または胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、混合ナチュラルキラ
ー細胞、およびＰＩＮＫ細胞のすべての組合せと接触させることを含む方法が本明細書で
提供される。
【０１２８】
１つの特定の実施形態では、例えば、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖は、複数の
胎盤灌流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、および／または複数の胎盤中間ナチュラル
キラー細胞を補充した胎盤灌流液によって抑制される。特定の実施形態では、例えば、胎
盤灌流液の各１ミリリットルは、約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、
１×１０６、または５×１０６個以上の胎盤灌流液細胞または胎盤中間ナチュラルキラー
細胞を補充している。他の特定の実施形態では、胎盤灌流液、例えば１ユニット（つまり
、単一胎盤に由来する回収物）の灌流液、または約１００、１５０、２００、２５０、３
００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８
００、８５０、９００、９５０、もしくは１０００ｍＬの灌流液は、１ミリリットル当た
り約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×
１０７、５×１０７、１×１０８、または５×１０８個以上のＰＩＮＫ細胞、混合ナチュ
ラルキラー細胞、および／または胎盤灌流液細胞を補充しているか、または１×１０４、
５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０
７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、
もしくは１×１０１１個以上のＰＩＮＫ細胞、混合ナチュラルキラー細胞、および／また
は胎盤灌流液細胞を補充している。
【０１２９】
別の特定の実施形態では、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖は、胎盤灌流液、混合
ナチュラルキラー細胞、および／または胎盤中間ナチュラルキラー細胞を補充した複数の
胎盤灌流液細胞によって抑制される。より特定の実施形態では、１ミリリットル当たり約
１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０
７、５×１０７、１×１０８、もしくは５×１０８個以上の胎盤灌流液細胞、または１×
１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、
５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１
０１０、もしくは１×１０１１個以上の胎盤灌流液細胞は、１ミリリットル当たり、約、
または少なくとも約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５
×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、もしくは５×１０８個以上のＰＩＮＫ
細胞および／または混合ナチュラルキラー細胞、または１×１０４、５×１０４、１×１
０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５
×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、もしくは１×１０１
１個以上のＰＩＮＫ細胞を補充している。他のより特定の実施形態では、１ミリリットル
当たり約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、
１×１０７、５×１０７、１×１０８、もしくは５×１０８個以上の胎盤灌流液細胞、Ｐ
ＩＮＫ細胞、および／または混合ナチュラルキラー細胞、または１×１０４、５×１０４
、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１
０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、もしくは１
×１０１１個以上の胎盤灌流液細胞は、約、または少なくとも約１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、
６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００
、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００
、８５０、９００、９５０、もしくは１０００ｍＬの灌流液、または約１ユニットの灌流
液を補充している。
【０１３０】
別の特定の実施形態では、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖は、胎盤灌流液、胎盤
灌流液細胞、および／または混合ナチュラルキラー細胞を補充した複数の胎盤中間ナチュ
ラルキラー細胞によって抑制される。より特定の実施形態では、約１×１０４、５×１０
４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×
１０８、もしくは５×１０８個以上の胎盤中間ナチュラルキラー細胞、または１×１０４
、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１
０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０
、もしくは１×１０１１個以上のＰＩＮＫ細胞は、１ミリリットル当たり約１×１０４、
５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０
７、１×１０８、もしくは５×１０８個以上の胎盤灌流液細胞および／または混合ナチュ
ラルキラー細胞、または１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６
、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１
０９、１×１０１０、５×１０１０、もしくは１×１０１１個以上の胎盤灌流液細胞およ
び／または混合ナチュラルキラー細胞を補充している。他のより特定の実施形態では、１
ミリリットル当たり約１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、
５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、もしくは５×１０８個以上の胎盤灌
流液細胞および／または混合ナチュラルキラー細胞、または１×１０４、５×１０４、１
×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８
、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、もしくは１×１
０１１個以上の胎盤中間ナチュラルキラー細胞および／または混合ナチュラルキラー細胞
は、約、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、
２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９
０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００
、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、もしく
は１０００ｍＬの灌流液、または約１ユニットの灌流液を補充している。
【０１３１】
別の実施形態では、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖は、（１つまたは複数の）腫
瘍細胞を、接着性胎盤幹細胞を補充した胎盤灌流液、灌流液細胞、ＰＩＮＫ細胞、および
／または混合ナチュラルキラー細胞と接触させることにより抑制される。特定の実施形態
では、胎盤灌流液、灌流液細胞、またはＰＩＮＫ細胞は、１ミリリットル当たり約１×１
０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５
×１０７、１×１０８、もしくは５×１０８個以上の接着性胎盤幹細胞、または１×１０
４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×
１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１
０、もしくは１×１０１１個以上の接着性胎盤幹細胞を補充している。
【０１３２】
別の実施形態では、腫瘍細胞または複数の腫瘍細胞の増殖は、（１つまたは複数の）腫
瘍細胞を、接着性胎盤幹細胞馴化培地で、例えば灌流液、灌流液細胞、混合ナチュラルキ
ラー細胞、および／またはＰＩＮＫ細胞の１ユニット当たり、または１０４、１０５、１
０６、１０７、１０８、１０９、もしくは１０１０個の細胞当たり、０．１、０．２、０
．３、０．４、０．５、０．６、０．１、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０ｍＬの幹細胞馴化培地を補充した胎盤灌流液、灌流液細胞、混合ナチュラ
ルキラー細胞、および／またはＰＩＮＫ細胞と接触させることによって抑制される。
【０１３３】
他の実施形態では、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、胎盤ナチュラルキラー細胞、例えば
ＰＩＮＫ細胞、混合ナチュラルキラー細胞、ならびにそれらを含む組合せおよび貯留物は
、最初に取得されたままで使用することができ、すなわち、灌流中に取得されたままの灌
流液、そのような灌流液から単離されたままの胎盤灌流液細胞、そのような灌流液および
一致した臍帯血に由来する混合ナチュラルキラー細胞、またはそのような灌流液からもし
くはそのような胎盤灌流液細胞から単離されたＰＩＮＫ細胞である。他の実施形態では、
胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、ＰＩＮＫ細胞、ならびにそれらの組合せおよび貯留物は、
使用前に処理される。例えば、胎盤灌流液は、胎盤から回収されたままの、未加工で未処
理の形態で使用することができる。胎盤灌流液は、例えば１つまたは複数の細胞タイプの
ネガティブ選択によって、脱水による容積の低減によって；凍結乾燥および再水和などに
よって、使用前に処理することもできる。同様に、灌流液細胞の集団は、例えば胎盤灌流
液に由来する総有核細胞のように、胎盤灌流液から最初に単離されたままで使用してもよ
く、または例えば１つまたは複数の細胞タイプ（例えば赤血球）を取り除くように処理し
てもよい。ＰＩＮＫ細胞は、例えばＣＤ５６マイクロビーズを使用して胎盤灌流液から最
初に単離されたままで使用してもよく、または例えば１つまたは複数の非キラー細胞タイ
プを取り除くように処理してもよい。
【０１３４】
別の実施形態では、（１つまたは複数の）腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、（
１つまたは複数の）腫瘍細胞を、胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、ＰＩＮＫ細胞、混合ナチ
ュラルキラー細胞、またはそれらを含む貯留物もしくは組合せと接触させることを含み、
前記胎盤灌流液、胎盤灌流液細胞、ＰＩＮＫ細胞、混合ナチュラルキラー細胞、またはそ
れらを含む貯留物もしくは組合せが、前記接触前のある期間インターロイキン２（ＩＬ−
２）と接触している方法が本明細書で提供される。ある種の実施形態では、前記期間は、
前記接触前の、約、短くとも、または長くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１
０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６
、３８、４０、４２、４４、４６、または４８である。
【０１３５】
灌流液、灌流液細胞、ＰＩＮＫ細胞、混合ナチュラルキラー細胞、またはそれらの貯留
物および／もしくは組合せは、抗癌療法の経過中の癌を有する個体に、または腫瘍細胞を
有する個体に対して一度に投与してもよく、あるいは複数回、例えば１、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２
０、２１、２２、もしくは２３時間に１回、または１、２、３、４、５、６、もしくは７
日に１回、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週間以上に１回投
与してもよい。灌流液、灌流液細胞、ＰＩＮＫ細胞、それらの貯留物および／または組合
せは、灌流液、灌流液細胞、ＰＩＮＫ細胞、それらの貯留物および／または組合せが、癌
を有する個人または腫瘍細胞を有する個人に過去に投与されたことがあるかどうかに関わ
らず投与することができる。したがって、本明細書で提供される方法は、癌を有する個人
または腫瘍細胞を有する個人に対する、胎盤灌流液、灌流液細胞、ＰＩＮＫ細胞、それら
を含む貯留物および／または組合せの任意の組合せの投与を包含する。
【０１３６】
特定の実施形態では、腫瘍細胞は血液癌細胞である。種々の特定の実施形態では、腫瘍
細胞は、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄リンパ腫（Ｃ
ＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、大腸
腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、網膜芽細胞腫細胞、大腸直腸癌細
胞、または大腸直腸腺癌細胞である。
【０１３７】
胎盤灌流液、灌流液細胞、ＰＩＮＫ細胞、混合ナチュラルキラー細胞、それらを含む貯
留物および／または組合せは、１つまたは複数の他の抗癌剤を含む抗癌治療レジメンの一
部であってもよい。そのような抗癌剤は当技術分野で周知である。灌流液、灌流液細胞、
ＰＩＮＫ細胞、それらの貯留物および／または組合せに加えて、癌を有する個体に投与で
きる具体的な抗癌剤には、これらに限定されないが、アシビシン；アクラルビシン；塩酸
アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボ
マイシン（ambomycin）；酢酸アメタントロン；アムサクリン；アナストロゾール；アン
トラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイ
シン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ビスナフィドジ
メシラート；ビセレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；
ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー（carbetim
er）；カルボプラチン；カルマスティン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴ
ール；セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害剤）；クロラムブシル；シロレマイシン（cirolemy
cin）；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシラート；シクロホスファミド
；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デ
キソルマプラチン（dexormaplatin）；デザグアニン；デザグアニンメシラート；ジアジ
コン；ドセタセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸
ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ジュアゾマイシン；エダトレキサー
ト；塩酸エフロミチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロ
ピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リ
ン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エ
トプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リ
ン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；フォストリエシン
ナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イ
ホスファミド；イルモホシン；イプロプラチン（iproplatin）；イリノテカン；塩酸イリ
ノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロ
メトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；メイ
タンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルフ
ァラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウ
ム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン
（mitogillin）；ミトマルシン；ミトマイシン；ミトスペル（mitosper）；ミトタン；塩
酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチ
ン（ormaplatin）；オキシスラン；パクリタキセル；ペグアスパルガーゼ；ペリオマイシ
ン（peliomycin）；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロ
マン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフ
ィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピュ
ーロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；サフィンゴール；塩
酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマ
イシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン（spiromustine）；スピロプラスチン
（spiroplatin）；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイ
シン；テコガランナトリウム（tecogalan sodium）；タキソテール；テガフール；塩酸テ
ロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン（teroxirone）；テストラ
クトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン
酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルク
ロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；
ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン
；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイ
ロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニ
プラチン；ジノスタチン；および塩酸ゾルビシンが含まれる。
【０１３８】
他の抗癌薬には、これらに限定されないが、２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタ
ミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；ア
デシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルト
レタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビ
シン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラフォリド；血管形
成阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリクス；抗背方化形態形成タ
ンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン剤；アンチネオプラストン；
アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子修
飾因子；アポトーシス調節因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギ
ニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１
；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシ
ン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニ
スト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−
アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサント
レン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビセレシン；ブレ
フラート；ブロピリミン；ブドチタン（budotitane）；ブチオニンスルホキシミン；カル
シポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カペシタビン；カルボキサミ
ド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡ
ＲＮ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カ
スタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロルリン；クロロキノキサリンス
ルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体
；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；
コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリ
プトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタアントラキノン
（cyclopentanthraquinone）；シクロプラタム（cycloplatam）；シペマイシン；シタラ
ビンオクホスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ（dacliximab）；
デシタビン；デヒドロジデンミンＢ（dehydrodidenmin B）；デスロレリン；デキサメタ
ゾン；デキシホスファミド（dexifosfamide）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；
ジアジコン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザ
シチジン；ジヒドロタキソール、９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；
ドセタセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドキソルビシン；ドロロ
キシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エ
デルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；
エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアン
タゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；フ
ァザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；
フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルシン；ホルフェ
ニメックス；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィ
リン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン
；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド
；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イル
モホシン；イロマスタット；イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、イミ
キモド；免疫賦活剤ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロ
ンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソル
ビシン；イポメアノール、４−；イロプラクト（iroplact）；イルソグラジン；イソベン
ガゾール；イソホモハリコンドリンＢ（isohomohalicondrin B）；イタセトロン；ジャス
プラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマ
イシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻
害因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロ
ン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖ポリアミン類似体；脂溶性二
糖ペプチド；脂溶性白金化合物；リッソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロ
メトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチ
ウムテキサフィリン；リソフィリン（lysofylline）；細胞溶解性ペプチド；マイタンシ
ン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻
害剤；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；
メチオニナーゼ（methioninase）；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン
；ミルテホシン；ミリモスチム；ミトグアゾン；ミトラクトール；ミトマイシン類似体；
ミトナフィド；ミトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン（mitotoxin fibroblast gro
wth factor-saporin）；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；エルビタ
ックス、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；モノホスホリルリピドＡ＋マイオバクテリア（my
obacterium）細胞壁ｓｋ；モピダモール；マスタード抗癌剤；ミカペルオキシドＢ；ミコ
バクテリウム細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミ
ド；ナファレリン；ナグレスチプ（nagrestip）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン
（napavin）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリド
ロン酸；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調節剤；窒素酸化物酸化防止剤；ニトル
リン（nitrullyn）；オブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；Ｏ６−ベン
ジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オ
ンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導因子；オルマプラ
チン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタ
キセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン（palauamine）；パルミトイルリゾ
キシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチ
ン；ペグアスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン
；ペントロゾール（pentrozole）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコ
ール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸
ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ（placetin A）；プラセチ
ンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金トリアミン錯体
；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビスアクリド
ン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡに基づく免疫修飾因
子；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類性；チロシン
ホスファターゼタンパク質阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリ
ン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシレート化（pyridoxylated）ヘモグロビンポリオキ
シエチレン抱合体；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓフ
ァルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤
；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイ
ム；ＲＩＩレチンアミド；ロヒツキン（rohitukine）；ロムルチド；ロキニメックス；ル
ビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィ
トールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣剤；セムスチン；老化由来阻害剤１（senesc
ence derived inhibitor 1）；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シゾフ
ィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテイト（sodium borocaptate）；酢酸フェニ
ルナトリウム；ソルベロール（solverol）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン（
sonermin）；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；ス
ポンギスタチン１；スクアラミン；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノ
シン；超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（suradista）；スラ
ミン；スワインソニン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タ
ザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（tellurapyrylium）
；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テト
ラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模
倣剤；チマルファシン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホ
ルモン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン
；トレミフェン；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；ト
リメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ
阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来増殖阻害因子；ウロ
キナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベラレソール；ベラミン
；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾー
ル；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマーが含ま
れる。
【０１３９】
５．８．免疫調節化合物によるナチュラルキラー細胞の処理
本明細書中の他所に記述されているような単離されたナチュラルキラー細胞、例えばＰ
ＩＮＫ細胞、混合ナチュラルキラー細胞は、免疫調節化合物で処理して、例えば免疫調節
化合物と接触させて、細胞の抗腫瘍活性を増強させることができる。したがって、腫瘍細
胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞傷害性を増加させる方法であって、ナチュラルキ
ラー細胞が、免疫調節化合物と接触しなかったナチュラルキラー細胞と比較して、腫瘍細
胞に対する細胞傷害性の増加を実証するのに十分な時間および濃度で、ナチュラルキラー
細胞を免疫調節化合物と接触させることを含む方法が本明細書で提供される。別の実施形
態では、ナチュラルキラー細胞におけるグランザイムＢの発現を増加させる方法であって
、ナチュラルキラー細胞が、免疫調節化合物と接触しなかったナチュラルキラー細胞と比
較して、グランザイムＢの発現増加を実証するのに十分な時間および濃度で、ナチュラル
キラー細胞を免疫調節化合物と接触させることを含む方法が本明細書で提供される。免疫
調節化合物は、下記に記述されている任意の化合物、例えばレナリドマイドまたはポマリ
ドマイドであってもよい。
【０１４０】
ナチュラルキラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞または混合ナチュラルキラー細胞の集団の
、複数の腫瘍細胞に対する細胞傷害性を増加させる方法であって、ナチュラルキラー細胞
の集団が、免疫調節化合物と接触しなかった同等数のナチュラルキラー細胞と比較して、
前記複数の腫瘍細胞に対する細胞傷害性の検出可能な程度の増加を実証するのに十分な時
間および濃度で、ナチュラルキラー細胞の集団を免疫調節化合物と接触させることを含む
方法も本明細書で提供される。別の実施形態では、ナチュラルキラー細胞の集団における
グランザイムＢの発現を増加させる方法であって、ナチュラルキラー細胞の集団が、免疫
調節化合物と接触しなかった同等数のナチュラルキラー細胞と比較して、検出可能な程度
増加した量のグランザイムＢを発現させるのに十分な時間および濃度で、ナチュラルキラ
ー細胞の集団を免疫調節化合物と接触させることを含む方法が本明細書で提供される。特
定の実施形態では、前記ナチュラルキラー細胞の集団は、胎盤灌流液細胞、例えば胎盤灌
流液に由来する総有核細胞内に含有されている。
【０１４１】
上記の実施形態の特定の実施形態では、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６＋、ＣＤ１
６−胎盤中間ナチュラルキラー細胞（ＰＩＮＫ細胞）である。上記の実施形態の別の特定
の実施形態では、ナチュラルキラー細胞は、混合ナチュラルキラー細胞、つまり一致した
胎盤灌流液および臍帯血に由来するナチュラルキラー細胞である。
【０１４２】
別の特定の実施形態では、前記免疫調節化合物と接触と接触させた前記複数のナチュラ
ルキラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞または混合ナチュラルキラー細胞は、前記免疫調節化
合物と接触しなかった同等数の前記ナチュラルキラー細胞より高いレベルでＢＡＸ、ＣＣ
Ｌ５、ＣＣＲ５、ＣＳＦ２、ＦＡＳ、ＧＵＳＢ、ＩＬ２ＲＡ、またはＴＮＦＲＳＦ１８の
うち１つまたは複数を発現する。別の特定の実施形態では、前記免疫調節化合物を接触さ
せた前記複数のナチュラルキラー細胞、例えばＰＩＮＫ細胞は、前記免疫調節化合物と接
触しなかった同等数の前記ナチュラルキラー細胞より高いレベルでＡＣＴＢ、ＢＡＸ、Ｃ
ＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＲ５、ＣＳＦ１、ＣＳＦ２、ＥＣＥ１、ＦＡＳ、ＧＮ
ＬＹ、ＧＵＳＢ、ＧＺＭＢ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＬＴＡ、ＰＲＦ
１、ＰＴＧＳ２、ＳＫＩ、およびＴＢＸ２１のうち１つまたは複数を発現する。
【０１４３】
ヒト胎盤灌流液細胞の集団、例えば胎盤灌流液に由来する総有核細胞の、複数の腫瘍細
胞に対する細胞傷害性を増加させる方法であって、胎盤灌流液細胞が、免疫調節化合物と
接触しなかった同等数の胎盤灌流液細胞と比較して、前記複数の腫瘍細胞に対する細胞傷
害性の検出可能な程度の増加を実証するのに十分な時間および濃度で、胎盤灌流液細胞を
免疫調節化合物と接触させることを含む方法も本明細書中に提供される。別の実施形態で
は、胎盤灌流液細胞の集団におけるグランザイムＢの発現を増加させる方法であって、胎
盤灌流液細胞の集団が、免疫調節化合物と接触しなかった同等数の胎盤灌流液細胞と比較
して、検出可能な程度増加した量のグランザイムＢを発現させるのに十分な時間および濃
度で、胎盤灌流液細胞の集団を免疫調節化合物と接触させることを含む方法が本明細書で
提供される。
【０１４４】
免疫調節化合物は、商業的に購入することができるか、または、本明細書中で参照され
、それらのすべてが参照により組み込まれる特許もしくは特許広報に記載の方法により調
製することができるかのいずれかである。さらに、光学的に純粋な組成物は、非対称的に
合成してもよく、または公知の分離剤もしくはキラルカラムならびに他の標準的合成有機
化学技術を使用して分離してもよい。免疫調節化合物は、ラセミ性であってもよく、立体
化学的に濃縮されていてもよく、または立体化学的に純粋であってもよく、薬学的に許容
される塩、溶媒和物、およびそのプロドラッグを包含してもよい。
【０１４５】
本明細書中で使用される場合、およびそうでないと指示されていない限り、「免疫調節
化合物」という用語は、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ誘導性単球ＩＬ−１β、およびＩＬ−１２を
著しく阻害し、ＩＬ−６産生を部分的に阻害する小有機分子を包含する。具体的な例では
、免疫調節化合物は、レナリドマイド、ポマリドマイド、またはサリドマイドである。
【０１４６】
免疫調節化合物の具体的な例には、これらに限定されないが、米国特許第５，９２９，
１１７号で開示されているものなどの置換スチレンのシアノおよびカルボキシ誘導体；１
−オキソ−２−（２，６−ジオキソ−３−フルオロピペリジン−３イル）イソインドリン
、ならびに米国特許第５，８７４，４４８号および第５，９５５，４７６号に記載されて
いるものなどの１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソ−３−フルオロピペリジン−
３−イル）イソインドリン；米国特許第５，７９８，３６８号に記載されているテトラ置
換２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイソインドリン；これら
に限定されないが、米国特許第５，６３５，５１７号、第６，４７６，０５２号、第６，
５５５，５５４号、および第６，４０３，６１３号で開示されているものを含む１−オキ
ソおよび１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインド
リン（例えば、サリドマイドの４−メチル誘導体）；米国特許第６，３８０，２３９号に
記載されているインドリン環の４位または５位で置換されている１−オキソおよび１、３
−ジオキソイソインドリン（例えば、４−（４−アミノ−１，３−ジオキソイソインドリ
ン−２−イル）−４−カルバモイル酪酸）；米国特許第６，４５８，８１０号に記載され
ている２，６−ジオキソ−３−ヒドロキシピペリジン−５−イルで２位が置換されている
イソインドリン−１−オンおよびイソインドリン−１，３−ジオン（例えば、２−（２，
６−ジオキソ−３−ヒドロキシ−５−フルオロピペリジン−５−イル）−４−アミノイソ
インドリン−１−オン）；米国特許第５，６９８，５７９号および第５，８７７，２００
号に開示されている非ポリペプチド環状アミドのクラス；アミノサリドマイドならびにア
ミノサリドマイドの類似体、加水分解産物、代謝産物、誘導体、および前駆体、ならびに
米国特許第６，２８１，２３０号および第６，３１６，４７１号に記載されているものな
どの、置換された２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）フタルイミドおよび置
換された２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイソインドール；
ならびに米国特許公開第２００３／００４５５５２Ａ１号、米国特許第７，０９１，３５
３号およびＷＯ０２／０５９１０６に記載されているものなどのイソインドール−イミド
化合物が含まれる。本明細書中で特定されている特許および特許出願の各々の全体は、参
照により本明細書中に組み込まれる。免疫調節化合物はサリドマイドを含んでいない。
【０１４７】
ある種の実施形態では、免疫調節化合物は、参照によりその全体が本明細書中に組み込
まれる米国特許第５，６３５，５１７号に記載されているような、ベンゾ環がアミノによ
り置換されている１−オキソおよび１，３ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン
−３−イル）イソインドリンである。これらの化合物は構造Ｉを有し、
【０１４８】
【化１】
2019206532.tif 000002
式中、ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、ＸおよびＹの他方はＣ＝ＯまたはＣＨ２であ
り、Ｒ２は、水素、または低級アルキル、特にメチルである。具体的な免疫調節化合物に
は、これらに限定されないが、
１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−４−アミノイソインド
リン、
１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−５−アミノイソインド
リン、
１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−６−アミノイソインド
リン、
１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−７−アミノイソインド
リン、
１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−４−アミノイソ
インドリン、および
１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−５−アミノイソ
インドリンが含まれる。
【０１４９】
他の具体的な免疫調節化合物は、その各々が参照により本明細書中に組み込まれる米国
特許第６，２８１，２３０号、第６，３１６，４７１号、第６，３３５，３４９号、およ
び第６，４７６，０５２号、ならびにＷＯ９８／０３５０２に記載されているものなどの
、置換された２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）フタルイミドおよび置換さ
れた２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイソインドールのクラ
スに属する。代表的な化合物は以下の式であり、
【０１５０】
【化２】
2019206532.tif 000003
式中、
ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、ＸおよびＹの他方はＣ＝ＯまたはＣＨ２であり、
（ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は、互いに独立して、ハロ、炭素原子が１
〜４個のアルキル、または炭素原子が１〜４個のアルコキシであるか、または（ｉｉ）Ｒ
１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の１つは−ＮＨＲ５であり、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およ
びＲ４は水素であり、
Ｒ５は、水素、または炭素原子が１〜８個のアルキルであり、
Ｒ６は、水素、炭素原子が１〜８個のアルキル、ベンジル、またはハロであり、
ＸおよびＹがＣ＝Ｏの場合、Ｒ６が水素以外ならば、（ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、および
Ｒ４の各々はフルオロであるか、または（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、もしくはＲ４の１つ
はアミノである。
このクラスを代表する化合物は、以下の式であり、
【０１５１】
【化３】
2019206532.tif 000004
式中、Ｒ１は水素またはメチルである。別の実施形態では、これらの化合物のエナンチ
オ的に純粋な形態（例えば光学的に純粋な（Ｒ）または（Ｓ）エナンチオマー）の使用が
包含される。
【０１５２】
さらに他の具体的な免疫調節化合物は、それらの各々が参照により本明細書中に組み込
まれる米国特許出願公開第２００３／００９６８４１号および第２００３／００４５５５
２号、ならびにＷＯ０２／０５９１０６に記載されているイソインドール−イミドのクラ
スに属する。代表的な化合物は、以下の式ＩＩ、
【０１５３】
【化４】
2019206532.tif 000005
ならびにそれらの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、エナンチオ
マー、ジアステレオマー、ラセミ体、および立体異性体の混合物であり、
式中、ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、他方はＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ８
）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキ
ル−（Ｃ１〜Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ２〜Ｃ５）へ
テロアリール、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｓ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル
−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）
ＯＲ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３、Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ３’、Ｃ（Ｓ）ＮＲ３
Ｒ３’、または（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、ベンジル、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、ま
たは（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニルであり、
Ｒ３およびＲ３’は、独立して、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアル
キル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（
Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル
−（Ｃ２〜Ｃ５）へテロアリール、（Ｃ０〜Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１〜Ｃ
８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、（Ｃ０〜Ｃ８）アル
キル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５、またはＣ（Ｏ）ＯＲ５であり、
Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキ
ニル、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−ＯＲ５、ベンジル、アリール、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル
−（Ｃ１〜Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、または（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ２〜Ｃ５
）へテロアリールであり、
Ｒ５は、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキ
ニル、ベンジル、アリール、または（Ｃ２〜Ｃ５）へテロアリールであり、
Ｒ６の各出現は、独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル
、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ２〜Ｃ５）へテロアリール、も
しくは（Ｃ０〜Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ５であるか、またはＲ６基は結合してヘ
テロシクロアルキル基を形成してもよく、
ｎは０または１であり、
＊はキラル炭素中心を表す。
式ＩＩの具体的な化合物では、ｎが０の場合、Ｒ１は、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキル
、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０
〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（
Ｃ２〜Ｃ５）ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル
−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）
ＯＲ５、Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ３、または（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５であり、
Ｒ２は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルであり、
Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）ア
ルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−
（Ｃ１〜Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ２〜Ｃ５）へテロ
アリール、（Ｃ５〜Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２；（Ｃ０〜Ｃ８）アルキル−ＮＨ−Ｃ
（Ｏ）Ｏ−Ｒ５；（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）
ＯＲ５、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５、またはＣ（Ｏ）ＯＲ５であり；他の
変数は同じ定義を有する。
【０１５４】
式ＩＩの他の具体的な化合物では、Ｒ２は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである。
【０１５５】
式ＩＩの他の具体的な化合物では、Ｒ１は、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルまたはベンジルで
ある。
【０１５６】
式ＩＩの他の具体的な化合物では、Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ベンジル、
ＣＨ２ＯＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、または以下の式である。
【０１５７】
【化５】
2019206532.tif 000006
【０１５８】
式ＩＩの化合物の別の実施形態では、Ｒ１は以下の式であり、
【０１５９】
【化６】
2019206532.tif 000007
式中、ＱはＯまたはＳであり、Ｒ７の各出現は、独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキ
ル、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ８）アルキ
ニル、ベンジル、アリール、ハロゲン、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ１〜Ｃ６）ヘテロ
シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ２〜Ｃ５）へテロアリール、（Ｃ０〜Ｃ
８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキ
ル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５、もしくはＣ（Ｏ）ＯＲ
５であり、または隣接するＲ７の出現は、互いに一緒になって二環式アルキルまたはアリ
ール環を形成してもよい。
【０１６０】
式ＩＩの他の具体的な化合物では、Ｒ１は、Ｃ（Ｏ）Ｒ３である。
【０１６１】
式ＩＩの他の具体的な化合物では、Ｒ３は、（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル−（Ｃ２〜Ｃ５）
−へテロアリール、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、アリール、または（Ｃ０〜Ｃ４）アルキル
−ＯＲ５である。
【０１６２】
式ＩＩの他の具体的な化合物では、へテロアリールは、ピリジル、フリル、またはチエ
ニルである。
【０１６３】
式ＩＩの他の具体的な化合物では、Ｒ１は、Ｃ（Ｏ）Ｒ４である。
【０１６４】
式ＩＩの他の具体的な化合物では、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）のＨは、（Ｃ１〜Ｃ４）アル
キル、アリール、またはベンジルで置換されていてもよい。
【０１６５】
このクラスの化合物のさらなる例には、これらに限定されないが、［２−（２，６−ジ
オキソ−ピペリジン−３−イル）−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソイ
ンドール−４−イルメチル］−アミド；（２−（２，６−ジオキソ−ピペリジン−３−イ
ル）−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イルメチル）
−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル；４−（アミノメチル）−２−（２，６−ジオ
キソ（３−ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオン；Ｎ−（２−（２，６−ジ
オキソ−ピペリジン−３−イル）−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソイ
ンドール−４イルメチル）−アセトアミド；Ｎ−｛（２−（２，６−ジオキソ（３−ピペ
リジル）−１，３−ジオキソイソインドリン−４−イル）メチル｝シクロプロピル−カル
ボキサミド；２−クロロ−Ｎ−｛（２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−１，
３−ジオキソイソインドリン−４−イル）メチル｝アセトアミド；Ｎ−（２−（２、６−
ジオキソ（３−ピペリジル）−１，３−ジオキソイソインドリン−４−イル）−３−ピリ
ジルカルボキサミド；３−｛１−オキソ−４−（ベンジルアミノ）イソインドリン−２−
イル｝ピペリジン−２，６−ジオン；２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−４
−（ベンジルアミノ）イソインドリン−１，３−ジオン；Ｎ−｛（２−（２，６−ジオキ
ソ（３−ピペリジル））−１，３−ジオキソイソインドリン−４−イル）メチル｝プロパ
ンアミド；Ｎ−｛（２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−１，３−ジオキソイ
ソインドリン−４−イル）メチル｝−３−ピリジルカルボキサミド；Ｎ−｛（２−（２，
６−ジオキソ（３−ピペリジル））−１，３−ジオキソイソインドリン−４−イル）メチ
ル｝ヘプタンアミド；Ｎ−｛（２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−１，３−
ジオキソイソインドリン−４−イル）メチル｝−２−フリルカルボキサミド；｛Ｎ−（２
−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−１，３−ジオキソイソインドリン−４−イ
ル）カルバモイル｝メチルアセテート；Ｎ−（２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル
））−１，３−ジオキソイソインドリン−４−イル）ペンタンアミド；Ｎ−（２−（２，
６−ジオキソ（３−ピペリジル））−１，３−ジオキソイソインドリン−４−イル）−２
−チエニルカルボキサミド；Ｎ−｛［２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−１
，３−ジオキソイソインドリン−４−イル］メチル｝（ブチルアミノ）カルボキサミド；
Ｎ−｛［２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−１，３−ジオキソイソインドリ
ン−４−イル］メチル｝（オクチルアミノ）カルボキサミド；およびＮ−｛［２−（２，
６−ジオキソ（３−ピペリジル））−１，３−ジオキソイソインドリン−４−イル］メチ
ル｝（ベンジルアミノ）カルボキサミドが含まれる。
【０１６６】
さらに他の具体的な免疫調節化合物は、それらの各々が参照により本明細書中に組み込
まれる米国特許出願公開第２００２／００４５６４３号、ＷＯ９８／５４１７０、および
米国特許第６，３９５，７５４号に記載されているイソインドール−イミドのクラスに属
する。代表的な化合物は、以下の式ＩＩＩ、
【０１６７】
【化７】
2019206532.tif 000008
ならびにそれらの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、エナンチ
オマー、ジアステレオマー、ラセミ体、および立体異性体の混合物であり、
式中、ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、他方はＣＨ２またはＣ＝Ｏであり、
Ｒは、ＨまたはＣＨ２ＯＣＯＲ’であり、
（ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の各々は、互いに独立して、ハロ、炭素原子が１
〜４個のアルキル、または炭素原子が１〜４個のアルコキシであるか、または（ｉｉ）Ｒ
１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の１つは、ニトロまたは−ＮＨＲ５であり、残りのＲ１、Ｒ
２、Ｒ３、またはＲ４は水素であり、
Ｒ５は、水素、または炭素原子が１〜８個のアルキルであり、
Ｒ６は、水素、炭素原子が１〜８個のアルキル、ベンゾ、クロロ、またはフルオロであ
り、
Ｒ’は、Ｒ７−ＣＨＲ１０−Ｎ（Ｒ８Ｒ９）であり、
Ｒ７は、ｍ−フェニレンもしくはｐ−フェニレン、またはｎの値が０〜４である−（Ｃ
ｎＨ２ｎ）−であり、
互いに独立して選択されるＲ８およびＲ９の各々は、水素、または炭素原子が１〜８個
のアルキルであるか、あるいは一緒に選択されるＲ８およびＲ９は、テトラメチレン、ペ
ンタメチレン、ヘキサメチレン、またはＸ１が−Ｏ−、−Ｓ−、もしくは−ＮＨ−である
−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１ＣＨ２ＣＨ２−であり、
Ｒ１０は、水素、炭素原子が１〜８個のアルキル、またはフェニルであり、
＊はキラル炭素中心を表す。
【０１６８】
他の代表的な化合物は、以下の式であり、
【０１６９】
【化８】
2019206532.tif 000009
式中、
ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、ＸおよびＹの他方はＣ＝ＯまたはＣＨ２であり、
（ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４の各々は、互いに独立して、ハロ、炭素原子が１
〜４個のアルキル、または炭素原子が１〜４個のアルコキシであるか、または（ｉｉ）Ｒ
１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の１つは、−ＮＨＲ５であり、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、お
よびＲ４は水素であり、
Ｒ５は、水素、または炭素原子が１〜８個のアルキルであり、
Ｒ６は、水素、炭素原子が１〜８個のアルキル、ベンゾ、クロロ、またはフルオロであ
り、
Ｒ７は、ｍ−フェニレンもしくはｐ−フェニレン、またはｎの値が０〜４である−（Ｃ
ｎＨ２ｎ）−であり、
互いに独立して選択されるＲ８およびＲ９の各々は、水素、または炭素原子が１〜８個
のアルキルであるか、あるいは一緒に選択されるＲ８およびＲ９は、テトラメチレン、ペ
ンタメチレン、ヘキサメチレン、またはＸ１が−Ｏ−、−Ｓ−、もしくは−ＮＨ−である
−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１ＣＨ２ＣＨ２−であり、
Ｒ１０は、水素、炭素原子が１〜８個のアルキル、またはフェニルである。
他の代表的な化合物は、以下の式であり、
【０１７０】
【化９】
2019206532.tif 000010
式中、
ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、ＸおよびＹの他方はＣ＝ＯまたはＣＨ２であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は、互いに独立して、ハロ、炭素原子が１〜４個
のアルキル、または炭素原子が１〜４個のアルコキシであるか、または（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ
２、Ｒ３、およびＲ４の１つは、ニトロまたは保護アミノであり、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ
３、およびＲ４は水素であり、
Ｒ６は、水素、炭素原子が１〜８個のアルキル、ベンゾ、クロロ、またはフルオロであ
る。
【０１７１】
他の代表的な化合物は、以下の式であり、
【０１７２】
【化１０】
2019206532.tif 000011
式中、
ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、ＸおよびＹの他方はＣ＝ＯまたはＣＨ２であり、
（ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は、互いに独立して、ハロ、炭素原子が１
〜４個のアルキル、または炭素原子が１〜４個のアルコキシであるか、または（ｉｉ）Ｒ
１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の１つは、−ＮＨＲ５であり、残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、お
よびＲ４は水素であり、
Ｒ５は、水素、炭素原子が１〜８個のアルキル、またはＲ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１
０の各々が本明細書中で定義されているようなＣＯ−Ｒ７−ＣＨ（Ｒ１０）ＮＲ８Ｒ９で
あり、
Ｒ６は、炭素原子が１〜８個のアルキル、ベンゾ、クロロ、またはフルオロである。
化合物の具体的な例は、以下の式であり、
【０１７３】
【化１１】
2019206532.tif 000012
式中、
ＸおよびＹの一方はＣ＝Ｏであり、ＸおよびＹの他方はＣ＝ＯまたはＣＨ２であり、
Ｒ６は、水素、炭素原子が１〜８個のアルキル、ベンゾ、クロロ、またはフルオロであ
り、
Ｒ７は、ｍ−フェニレン、ｐ−フェニレン、またはｎの値が０〜４である−（ＣｎＨ２
ｎ）−であり、
互いに独立して選択されるＲ８およびＲ９の各々は、水素、または炭素原子が１〜８個
のアルキルであるか、あるいは一緒に選択されるＲ８およびＲ９は、テトラメチレン、ペ
ンタメチレン、ヘキサメチレン、またはＸ１が−Ｏ−、−Ｓ−、もしくは−ＮＨ−である
−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１ＣＨ２ＣＨ２−であり、
Ｒ１０は、水素、炭素原子が１〜８個のアルキル、またはフェニルである。
【０１７４】
もっとも好ましい免疫調節化合物は、４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−
ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオンおよび３−（４−アミノ−１−オキソ
−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペリジン−２，６−ジオンである
。上記の化合物は、標準的な合成法（例えば、米国特許第５，６３５，５１７号を参照、
これは参照により本明細書中に組み込まれる）により取得することができる。上記の化合
物は、Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｗａｒｒｅｎ、ＮＪから入手可能で
ある。４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−イソインドリン
−１，３−ジオンは、以下の化学構造を有する。
【０１７５】
【化１２】
2019206532.tif 000013
化合物３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル
）−ピペリジン−２，６−ジオンは、以下の化学構造を有する。
【０１７６】
【化１３】
2019206532.tif 000014
【０１７７】
別の実施形態では、具体的な免疫調節化合物は、参照により本明細書中に組み込まれる
米国特許公開第２００５／００９６３５１Ａ１に開示されているＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ
、Ｇ、およびＨ型などの３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドー
ル−２−イル）−ピペリデン−２，６−ジオンの多形型を包含する。例えば、３−（４−
アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペリデン−２，
６−ジオンのＡ型は、非水性溶媒系から取得することができる非溶媒和性の結晶性物質で
ある。Ａ型は、およそ８、１４．５、１６、１７．５、２０．５、２４、および２６度２
θの有意なピークを含むＸ線粉末回折パターンを有し、約２７０℃の示差走査熱量測定融
解温度最大値を示す。Ａ型は、吸湿性が弱いかまたは吸湿性ではなく、これまで発見され
ている３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−
ピペリジン−２，６−ジオンの中でもっとも熱力学的に安定した無水多形型であると考え
られる。
【０１７８】
３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペ
リデン−２，６−ジオンのＢ型は、これらに限定されないが、ヘキサン、トルエン、およ
び水を含む種々の溶媒系から取得することができる半水和性の結晶性物質である。Ｂ型は
、およそ１６、１８、２２、および２７度２θの有意なピークを含むＸ線粉末回折パター
ンを有し、約１４６および２６８℃のＤＳＣ曲線から吸熱性を示し、これらは、ホットス
テージ顕微鏡実験により脱水および融解であることが特定されている。Ｂ型は、水性溶媒
系中ではＥ型に変換し、アセトンおよび他の無水系では他の型に変換することが、相互変
換研究により示されている。
【０１７９】
３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペ
リデン−２，６−ジオンのＣ型は、これに限定されないが、アセトンなどの溶媒から取得
することができる半溶媒和性の結晶性物質である。Ｃ型は、およそ１５．５および２５度
２θの有意なピークを含むＸ線粉末回折パターンを有し、約２６９℃の示差走査熱量測定
融解温度最大値を示す。Ｃ型は、約８５％ＲＨ未満では吸湿性ではないが、より高い相対
湿度ではＢ型に変換する場合がある。
【０１８０】
３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペ
リデン−２，６−ジオン）のＤ型は、アセトニトリルおよび水の混合物から調製される結
晶性の溶媒和性多形型である。Ｄ型は、およそ２７および２８度２θの有意なピークを含
むＸ線粉末回折パターンを有し、約２７０℃の示差走査熱量測定融解温度最大値を示す。
Ｄ型は、吸湿性が弱いかまたは吸湿性ではないかのいずれかであるが、より高い相対湿度
でストレスをかけられると典型的にはＢ型に変換するであろう。
【０１８１】
３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペ
リデン−２，６−ジオンのＥ型は、３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イ
ソインドール−２−イル）−ピペリデン−２，６−ジオンを水中でスラリー化させること
により、および約９：１のアセトン：水の比率を有する溶媒系で３−（４−アミノ−１−
オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペリデン−２，６−ジオンを
ゆっくりと蒸発させることにより取得することができる。Ｅ型は、およそ２０、２４．５
、および２９度２θの有意なピークを含むＸ線粉末回折パターンを有し、約２６９℃の示
差走査熱量測定融解温度最大値を示す。Ｅ型は、アセトン溶媒系中ではＣ型に変換し、Ｔ
ＨＦ溶媒系中ではＧ型に変換する場合がある。水性溶媒系中では、Ｅ型がもっとも安定し
ていると考えられる。Ｅ型に対して実施される脱溶媒和実験により、約１２５℃で約５分
間加熱すると、Ｅ型はＢ型に変換する場合があることが示されている。約１７５℃で約５
分間加熱すると、Ｂ型はＦ型に変換する場合がある。
【０１８２】
３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペ
リデン−２，６−ジオンのＦ型は、Ｅ型を脱水することにより取得することができる非溶
媒和性の結晶性物質である。Ｆ型は、およそ１９、１９．５、および２５度２θの有意な
ピークを含むＸ線粉末回折パターンを有し、約２６９℃の示差走査熱量測定融解温度最大
値を示す。
【０１８３】
３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペ
リデン−２，６−ジオンのＧ型は、Ｂ型およびＥ型を、これに限定されないが、テトラヒ
ドロフラン（ＴＨＦ）などの溶媒中でスラリー化することにより取得することができる非
溶媒和性の結晶性物質である。Ｇ型は、およそ２１、２３、および２４．５度２θの有意
なピークを含むＸ線粉末回折パターンを有し、約２６７℃の示差走査熱量測定融解温度最
大値を示す。
【０１８４】
３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペ
リデン−２，６−ジオンのＨ型は、Ｅ型を０％相対湿度に曝すことにより取得することが
できる、部分的に水和性（約０．２５モル）の結晶性物質である。Ｈ型は、およそ１５、
２６、および３１度２θの有意なピークを含むＸ線粉末回折パターンを有し、約２６９℃
の示差走査熱量測定融解温度最大値を示す。
【０１８５】
本明細書で提供される方法に使用可能な他の具体的な免疫調節化合物には、これらに限
定されないが、それらの各々が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，８７
４，４４８号および第５，９５５，４７６号に記載されているものなどの、１−オキソ−
２−（２，６−ジオキソ−３−フルオロピペリジン−３イル）イソインドリンおよび１，
３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソ−３−フルオロピペリジン−３−イル）イソイン
ドリンが含まれる。代表的な化合物は、以下の式であり、
【０１８６】
【化１４】
2019206532.tif 000015
式中、Ｙは、酸素またはＨ２であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は、互いに独立して、水素、ハロ、炭素原子が１
〜４個のアルキル、炭素原子が１〜４個のアルコキシ、またはアミノである。
【０１８７】
本明細書で提供される方法に使用可能な他の具体的な免疫調節化合物には、これに限定
されないが、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，７９８，３６８号に記
載されているテトラ置換２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイ
ソインドリンが含まれる。代表的な化合物は、以下の式であり、
【０１８８】
【化１５】
2019206532.tif 000016
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は、互いに独立して、ハロ、炭素原子が１〜
４個のアルキル、または炭素原子が１〜４個のアルコキシである。
【０１８９】
本明細書で提供される方法に使用することができる他の具体的な免疫調節化合物には、
これらに限定されないが、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６，４０３，
６１３号に開示されている１−オキソおよび１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソ
ピペリジン−３−イル）イソインドリンが含まれる。代表的な化合物は、以下の式であり
、
【０１９０】
【化１６】
2019206532.tif 000017
式中、
Ｙは酸素またはＨ２であり、
第１のＲ１およびＲ２は、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキル
アミノ、シアノ、またはカルバモイルであり、第２のＲ１およびＲ２は、第１とは独立し
て、水素、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、
またはカルバモイルであり、
Ｒ３は、水素、アルキル、またはベンジルである。
化合物の具体的例は、以下の式であり、
【０１９１】
【化１７】
2019206532.tif 000018
式中、第１のＲ１およびＲ２は、ハロ、炭素原子が１〜４個のアルキル、炭素原子が１
〜４個のアルコキシ、各アルキルが１〜４個の炭素原子であるジアルキルアミノ、シアノ
、またはカルバモイルであり、
第２のＲ１およびＲ２は、第１とは独立して、水素、ハロ、炭素原子が１〜４個のアル
キル、炭素原子が１〜４個のアルコキシ、アルキルが１〜４個の炭素原子であるアルキル
アミノ、各アルキルが１〜４個の炭素原子であるジアルキルアミノ、シアノ、またはカル
バモイルであり、
Ｒ３は、水素、炭素原子が１〜４個のアルキル、またはベンジルである。具体的な例に
は、これに限定されないが、１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル
）−４−メチルイソインドリンが含まれる。
【０１９２】
本明細書で提供される方法に使用することができる他の化合物は、以下の式であり、
【０１９３】
【化１８】
2019206532.tif 000019
式中、第１のＲ１およびＲ２は、ハロ、炭素原子が１〜４個のアルキル、炭素原子が１
〜４個のアルコキシ、各アルキルが１〜４個の炭素原子であるジアルキルアミノ、シアノ
、またはカルバモイルであり、
第２のＲ１およびＲ２は、第１とは独立して、水素、ハロ、炭素原子が１〜４個のアル
キル、炭素原子が１〜４個のアルコキシ、アルキルが１〜４個の炭素原子であるアルキル
アミノ、各アルキルが１〜４個の炭素原子であるジアルキルアミノ、シアノ、またはカル
バモイルであり、
Ｒ３は、水素、炭素原子が１〜４個のアルキル、またはベンジルである。
【０１９４】
本明細書で提供される方法に使用することができる他の具体的な免疫調節化合物には、
これらに限定されないが、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第６，３８０，
２３９号および米国特許出願公開第２００６／００８４８１５号に記載されている、イン
ドリン環の４位または５位が置換されている１−オキソおよび１，３−ジオキソイソイン
ドリンが含まれる。代表的な化合物は、以下の式およびその塩であり、
【０１９５】
【化１９】
2019206532.tif 000020
式中、Ｃ＊と指定されている炭素原子はキラル中心（ｎが０でなく、Ｒ１がＲ２と同じ
ではない場合）を構成し、Ｘ１およびＸ２の一方は、アミノ、ニトロ、炭素が１〜６個の
アルキル、またはＮＨ−Ｚであり、Ｘ１またはＸ２の他方は水素であり、Ｒ１およびＲ２
の各々は、互いに独立してヒドロキシまたはＮＨ−Ｚであり、Ｒ３は水素、炭素が１〜６
個のアルキル、ハロ、またはハロアルキルであり、Ｚは、水素、アリール、炭素が１〜６
個のアルキル、ホルミル、または炭素が１〜６個のアシルであり、ｎは０、１、または２
の値を有し、Ｘ１がアミノであり、ｎが１または２である場合、Ｒ１およびＲ２は両方と
もヒドロキシではない。
【０１９６】
本明細書で提供される方法に使用することができるさらなる化合物は、以下の式であり
、
【０１９７】
【化２０】
2019206532.tif 000021
式中、Ｃ＊と指定されている炭素原子は、ｎが０でなくＲ１がＲ２ではない場合、キラ
ル中心を構成し、Ｘ１およびＸ２の一方は、アミノ、ニトロ、炭素が１〜６個のアルキル
、またはＮＨ−Ｚであり、Ｘ１またはＸ２の他方は水素であり、Ｒ１およびＲ２の各々は
、互いに独立してヒドロキシまたはＮＨ−Ｚであり、Ｒ３は、炭素が１〜６個のアルキル
、ハロ、または水素であり、Ｚは、水素、アリール、または炭素が１〜６個のアルキルも
しくはアシルであり、ｎは０、１、または２の値を有する。
【０１９８】
本明細書で提供される方法に使用することができる化合物の具体的な例には、これらに
限定されないが、それぞれ以下の構造を有する２−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−
ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−４−カルバモイル−酪酸および４−（４−アミ
ノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−４−カバモイル−酪
酸、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ、および立体異性
体が含まれる。
【０１９９】
【化２１】
2019206532.tif 000022
【０２００】
他の代表的な化合物は、以下の式およびその塩であり、
【０２０１】
【化２２】
2019206532.tif 000023
式中、Ｃ＊と指定されている炭素原子は、ｎが０でなくＲ１がＲ２ではない場合、キラ
ル中心を構成し、Ｘ１およびＸ２の一方は、アミノ、ニトロ、炭素が１〜６個のアルキル
、またはＮＨ−Ｚであり、Ｘ１またはＸ２の他方は水素であり、Ｒ１およびＲ２の各々は
、互いに独立してヒドロキシまたはＮＨ−Ｚであり、Ｒ３は、炭素が１〜６個のアルキル
、ハロ、または水素であり、Ｚは、水素、アリール、または炭素が１〜６個のアルキルも
しくはアシルであり、ｎは、０、１、または２の値を有する。
【０２０２】
具体的な例には、これらに限定されないが、それぞれ以下の構造を有する４−カルバモ
イル−４−｛４−［（フラン−２−イル−メチル）−アミノ］−１，３−ジオキソ−１，
３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル｝−酪酸、４−カルバモイル−２−｛４−［（
フラン−２−イル−メチル）−アミノ］−１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソイ
ンドール−２−イル｝−酪酸、２−｛４−［（フラン−２−イル−メチル）−アミノ］−
１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル｝−４−フェニルカル
バモイル−酪酸、および２−｛４−［（フラン−２−イル−メチル）−アミノ］−１，３
−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル｝−ペンタン二酸、ならびに
それらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ、および立体異性体が含まれる
。
【０２０３】
【化２３】
2019206532.tif 000024
【０２０４】
化合物の他の具体的な例は、以下の式であり、
【０２０５】
【化２４】
2019206532.tif 000025
式中、Ｘ１およびＸ２の一方はニトロまたはＮＨ−Ｚであり、Ｘ１またはＸ２の他方は
水素であり、
Ｒ１およびＲ２の各々は、互いに独立してヒドロキシまたはＮＨ−Ｚであり、
Ｒ３は、炭素が１〜６個のアルキル、ハロ、または水素であり、
Ｚは、水素、フェニル、炭素が１〜６個のアシル、または炭素が１〜６個のアルキルで
あり、ならびに
ｎは、０、１、または２の値を有し、
Ｘ１およびＸ２の一方がニトロでありｎが１または２である場合、Ｒ１およびＲ２は、
ヒドロキシ以外であり、ならびに
−ＣＯＲ２および−（ＣＨ２）ｎＣＯＲ１が異なる場合、Ｃ＊と指定される炭素原子は
キラル中心を構成する。他の代表的な化合物は、以下の式であり、
【０２０６】
【化２５】
2019206532.tif 000026
式中、Ｘ１およびＸ２の一方は、炭素が１〜６個のアルキルであり、
Ｒ１およびＲ２の各々は、互いに独立してヒドロキシまたはＮＨ−Ｚであり、
Ｒ３は、炭素が１〜６個のアルキル、ハロ、または水素であり、
Ｚは、水素、フェニル、炭素が１〜６個のアシル、または炭素が１〜６個のアルキルで
あり、
ｎは、０、１、または２の値を有し、および
−ＣＯＲ２および−（ＣＨ２）ｎＣＯＲ１が異なる場合、Ｃ＊と指定される炭素原子は
キラル中心を構成する。
【０２０７】
さらに他の具体的な免疫調節化合物には、これらに限定されないが、参照により本明細
書中に組み込まれる米国特許第６，４５８，８１０号に記載されている、２位が２，６−
ジオキソ−３−ヒドロキシピペリジン−５−イルで置換されているイソインドリン−１−
オンおよびイソインドリン−１，３−ジオンが含まれる。代表的な化合物は、以下の式で
あり、
【０２０８】
【化２６】
2019206532.tif 000027
式中、
＊で指定された炭素原子は、キラリティーの中心を構成し、
Ｘは、−Ｃ（Ｏ）−、または−ＣＨ２−であり、
Ｒ１は、炭素原子が１〜８個のアルキル、または−ＮＨＲ３であり、
Ｒ２は、水素、炭素原子が１〜８個のアルキル、またはハロゲンであり、
および
Ｒ３は、水素、
炭素原子が１〜８個のアルコキシ、ハロ、アミノ、または炭素原子が１〜４個のアルキ
ルアミノで置換されているかまたは置換されていない、炭素原子が１〜８個のアルキル、
炭素原子が３〜１８個のシクロアルキル、
炭素原子が１〜８個のアルキル、炭素原子が１〜８個のアルコキシ、ハロ、アミノ、ま
たは炭素原子が１〜４個のアルキルアミノで置換されているかまたは置換されていないフ
ェニル、
炭素原子が１〜８個のアルキル、炭素原子が１〜８個のアルコキシ、ハロ、アミノ、も
しくは炭素原子が１〜４個のアルキルアミノ、または−ＣＯＲ４で置換されているかまた
は置換されていないベンジル、
式中のＲ４は、水素であり、
炭素原子が１〜８個のアルコキシ、ハロ、アミノ、または炭素原子が１〜４個のアルキ
ルアミノ、炭素原子が３〜１８個のシクロアルキルで置換されているかまたは置換されて
いない、炭素原子が１〜８個のアルキル、
炭素原子が３〜１８個のシクロアルキル、
炭素原子が１〜８個のアルキル、炭素原子が１〜８個のアルコキシ、ハロ、アミノ、ま
たは炭素原子が１〜４個のアルキルアミノで置換されているかまたは置換されていないフ
ェニル、
または、炭素原子が１〜８個のアルキル、炭素原子が１〜８個のアルコキシ、ハロ、ア
ミノ、または炭素原子が１〜４個のアルキルアミノで置換されているかまたは置換されて
いないベンジルである。
【０２０９】
本明細書で提供される化合物は、商業的に購入することができるか、または本明細書中
で開示された特許もしくは特許広報に記載の方法により調製することができるかのいずれ
かである。さらに、光学的に純粋な組成物は、非対称的に合成してもよく、または公知の
分離剤もしくはキラルカラムならびに他の標準的合成有機化学技術を使用して分離しても
よい。
【０２１０】
種々の免疫調節化合物は、１つまたは複数のキラル中心を含有しており、エナンチオマ
ーのラセミ混合物またはジアステレオマーの混合物として存在してもよい。そのような化
合物の立体化学的に純粋な形態の使用、ならびにそれらの形態の混合物の使用が包含され
る。例えば、本明細書で提供される方法および組成物には、特定の免疫調節化合物の同じ
量または異なる量のエナンチオマーを含む混合物を使用することができる。これらの異性
体は、非対称的に合成してもよく、またはキラルカラムもしくはキラル分離剤などの標準
的技術を使用して分離してもよい。例えば、Ｊａｃｑｕｅｓ，Ｊ．ら、Ｅｎａｎｔｉｏｍ
ｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１）；Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ  ３３：２７２５ページ（１９７７）；Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．Ｌ．、Ｓｔｅｒ
ｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈ
ｉｌｌ、ＮＹ、１９６２）；およびＷｉｌｅｎ，Ｓ．Ｈ．、Ｔａｂｌｅｓ  ｏｆ  Ｒｅｓ
ｏｌｖｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ２６
８ページ（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ編、Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ  Ｐｒｅｓｓ
、Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ、ＩＮ、１９７２）を参照されたい。
【０２１１】
表示されている構造と、その構造に与えられた名称との間に不一致がある場合、表示さ
れている構造により重きが置かれることになることに留意すべきである。加えて、構造ま
たは構造の一部の立体化学が、例えば太線または破線で示されない場合、その構造または
構造の一部は、その立体異性体をすべて包含すると解釈されるべきである。
【０２１２】
５．９．ＰＩＮＫ細胞、ヒト胎盤灌流液、または混合ナチュラルキラー細胞の投与
ＰＩＮＫ細胞、ヒト胎盤灌流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、そのような細胞を含
む細胞の集団、またはそれらの組合せは、個体、例えば腫瘍細胞を有する個体、例えば癌
患者に、当技術分野で公知な生細胞の投与に好適な医学的に許容される任意の経路で投与
することができる。種々の実施形態では、本明細書で提供される細胞は、外科的に移植さ
れてもよく、例えばカテーテルまたは注射器により注射、注入されてもよく、またはその
他の形で修復または増強を必要とする部位へ直接的にまたは間接的に投与されてもよい。
１つの実施形態では、細胞は、個体の静脈内に投与される。別の実施形態では、細胞は、
個体の腫瘍例えば固形腫瘍の部位に投与される。個体が１つを超える部位に腫瘍を有する
特定の実施形態では、細胞は、少なくとも２つまたはすべての腫瘍部位に投与される。あ
る種の他の実施形態では、本明細書で提供される細胞またはその細胞を含む組成物は、経
口的に、経鼻的に、動脈内に、非経口的に、眼動脈的に、筋肉内に、皮下に、腹腔内に、
脳内に、脳室内に、側脳室内に、髄腔内に、大槽内に、脊髄内に、および／または脊髄周
囲に投与することができる。ある種の特定の実施形態では、細胞は、頭蓋内または脊椎内
の針および／またはカテーテルにより、ポンプデバイスを用いてまたは用いないで送達さ
れる。
【０２１３】
ＰＩＮＫ細胞、ヒト胎盤灌流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、もしくはそれらの組
合せ、またはそのような細胞を含む細胞集団は、上記細胞を含む組成物、例えばマトリッ
クス、ヒドロゲル、またはスキャフォールドなどで個体に投与することができる。
【０２１４】
１つの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、天然マトリックス、例えば羊膜材
料などの胎盤性生体材料に接種される。そのような羊膜材料は、例えば哺乳動物胎盤から
直接切り取られた羊膜；固定または熱処理された羊膜、実質的に乾燥された（つまり＜２
０％Ｈ２Ｏ）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥された絨毛膜、ならびに実質的に乾燥した羊膜
膜および絨毛膜などであり得る。胎盤幹細胞を接種することができる好ましい胎盤性生体
材料は、その開示が参照によりその全体がここに組み込まれるＨａｒｉｒｉの米国特許出
願公開第２００４／００４８７９６号に記載されている。
【０２１５】
別の実施形態では、ＰＩＮＫ細胞、ヒト胎盤灌流液細胞、混合ナチュラルキラー細胞、
もしくはそれらの組合せ、またはそのような細胞を含む細胞集団は、例えば注射に好適な
ヒドロゲル溶液に懸濁されている。そのような組成物に好適なヒドロゲルには、ＲＡＤ１
６などの自己集合性ペプチドが含まれる。１つの実施形態では、上記細胞を含むヒドロゲ
ル溶液は、例えば鋳型中で硬化させて、その中に細胞を分散させた移植用のマトリックス
を形成することが可能である。そのようなマトリックス中の細胞は、移植前に細胞が有系
分裂的に増殖されるように培養することもできる。ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イ
オン結合、または水素結合により架橋され、水分子を閉じ込めてゲルを形成する三次元開
格子構造を生成する有機ポリマー（天然または合成）であり得る。ヒドロゲル形成性物質
には、イオン的に架橋されるアルギン酸およびその塩などのポリサッカライド、ペプチド
、ポリホスファジン（polyphosphazine）、およびポリアクリレート、またはそれぞれ温
度またはｐＨによって架橋されるポリエチレン酸化物−ポリプロピレングリコールブロッ
クコポリマーなどのブロックポリマーが含まれる。幾つかの実施形態では、本発明のヒド
ロゲルまたはマトリックスは生分解性である。
【０２１６】
本発明の幾つかの実施形態では、製剤は、ｉｎ  ｓｉｔｕで重合可能なゲルを含む（例
えば、米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号；Ａｎｓｅｔｈら、Ｊ．Ｃｏｎｔ
ｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、７８（１−３）：１９９〜２０９ページ（２００２）；Ｗａｎ
ｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２４（２２）：３９６９〜８０ページ（２００３）を
参照）。
【０２１７】
幾つかの実施形態では、ポリマーは、水、緩衝食塩水、もしくは水性アルコール溶液、
またはそれらの単価イオン塩などの、荷電側鎖基を有する水溶液に少なくとも部分的に可
溶性である。陽イオンと反応することができる酸性側鎖基を有するポリマーの例は、ポリ
（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸およびメタ
クリル酸のコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）、ならびにスルホン化ポリスチレンなどのス
ルホン化ポリマーである。アクリル酸またはメタクリル酸と、ビニルエーテルモノマーま
たはポリマーとの反応によって形成される酸性側鎖基を有するコポリマーも使用すること
ができる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルフォン酸基、ハロゲン化（好ましくはフッ
化）アルコール基、フェノールのＯＨ基、および酸のＯＨ基である。
【０２１８】
本発明の胎盤幹細胞またはその共培養物は、三次元フレームワークまたはスキャフォー
ルドに接種され、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植することができる。そのようなフレームワークは
、組織形成を刺激するか、またはその他の形で本発明の実行を増強または向上させる任意
のうち１つまたは複数の増殖因子、細胞、薬物、または他の成分と組み合わせて移植する
ことができる。
【０２１９】
本発明で使用することができるスキャフォールドの例には、不織布マット、多孔性発泡
体、または自己集合性ペプチドが含まれる。不織布マットは、グリコール酸および乳酸の
合成吸収性コポリマー（例えば、ＰＧＡ／ＰＬＡ）（ＶＩＣＲＹＬ、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉ
ｎｃ．社、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）で構成された繊維を使用して形成すること
ができる。例えばポリ（ε−カプロラクトン）／ｐｏｌｙ（グリコール酸）（ＰＣＬ／Ｐ
ＧＡ）コポリマーで構成され、フリーズドライまたは凍結乾燥などの工程により形成され
る発泡体（例えば米国特許第６，３５５，６９９号を参照）も、スキャフォールドとして
使用することができる。
【０２２０】
本発明の胎盤幹細胞は、これらに限定されないが、モノ−、ジ−、トリ−、アルファ−
トリ−、ベータ−トリ−、およびテトラ−リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、フ
ルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウ
ム、マグネシウムリン酸カルシウム、ＢＩＯＧＬＡＳＳ（登録商標）などの生物学的に活
性なガラス、ならびにそれらの混合物を含む、生理学的に許容されるセラミック材料に接
種または接触させることができる。現在市販されている多孔性の生体適合性セラミック材
料には、ＳＵＲＧＩＢＯＮＥ（登録商標）（ＣａｎＭｅｄｉｃａ  Ｃｏｒｐ．社、カナダ
）、ＥＮＤＯＢＯＮ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｆｒａｎｃｅ
社、フランス）、ＣＥＲＯＳ（登録商標）（Ｍａｔｈｙｓ，ＡＧ社、Ｂｅｔｔｌａｃｈ、
スイス）、ならびにＨＥＡＬＯＳ（商標）（ＤｅＰｕｙ，Ｉｎｃ．社、Ｒａｙｎｈａｍ、
ＭＡ）およびＶＩＴＯＳＳ（登録商標）、ＲＨＡＫＯＳＳ（商標）、およびＣＯＲＴＯＳ
Ｓ（登録商標）（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ社、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐａ．）などの石灰化コラー
ゲン骨移植製品が含まれる。フレームワークは、天然および／または合成材料の混合物、
配合物、または複合体であり得る。
【０２２１】
別の実施形態では、胎盤幹細胞は、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしく
は配合物またはヒアルロン酸などの生体吸収性材料で作られている多繊維性糸で構成され
得るフェルトに接種または接触させることができる。
【０２２２】
本発明の胎盤幹細胞は、別の実施形態では、複合構造であってもよい発泡体スキャフォ
ールドに接種することができる。そのような発泡体スキャフォールドは、修復、交換、ま
たは増強しようとする体の特定の構造の一部の形態などの、有用な形態に成型することが
できる。幾つかの実施形態では、フレームワークは、細胞接着を増強するために、本発明
の細胞の接種に先立って、例えば０．１Ｍの酢酸で処理され、その後ポリリシン、ＰＢＳ
、および／またはコラーゲン中でインキュベーションされる。マトリックスの外部表面は
、細胞の接着または増殖、組織の分化を向上させるように、マトリックスを血漿コーティ
ングすることによって、または１つまたは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性
繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸塩、コ
ンドロイチン−４−硫酸塩、コンドロイチン−６−硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ケラチン
硫酸塩など）、細胞マトリックス、および／またはこれらに限定されないが、ゼラチン、
アルギン酸塩、寒天、アガロース、および植物ゴムなどのような他の物質の付加などによ
って修飾することができる。
【０２２３】
幾つかの実施形態では、スキャフォールドは、それを非血栓形成性にする物質を含むか
、またはそれを非血栓形成性にする物質で処理される。これらの処理および物質は、内皮
増殖、遊走、および細胞外マトリックス沈着を増進および持続することもできる。これら
の物質および処理の例には、これらに限定されないが、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲン
などの基底膜タンパク質などの天然材料、ＥＰＴＦＥなどの合成材料、およびＰＵＲＳＰ
ＡＮ（商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｉｎｃ
．社、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．）などの分割型ポリウレタンウレアシリコンが含
まれる。スキャフォールドは、ヘパリンなどの抗血栓剤を含むこともでき、スキャフォー
ルドは、胎盤幹細胞を接種する前に、表面電荷を変更するように処理（例えば、血漿によ
るコーティング）することもできる。
【実施例１】
【０２２４】
胎盤灌流液および臍帯血からの胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の特徴付け
本実施例は、ヒト胎盤灌流液由来のナチュラルキラー細胞の単離および培養を示す。
【０２２５】
胎盤ナチュラルキラー細胞の単離。ＣＤ５６コンジュゲートマイクロビーズを用いて８
ユニットのヒト胎盤灌流液（ＨＰＰ）、および４ユニットの臍帯血（ＵＣＢ）からナチュ
ラルキラー細胞を単離した。ＰＩＮＫ細胞の単離は、磁気ビーズ選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ）によって行われた。産後の胎盤を脱血し、約２００〜約７５０ｍＬの灌
流溶液（０．９％ＮａＣｌ注射液ＵＳＰグレード（Ｃａｔ  Ｎｏ．６８２００−８０４、
ＶＷＲ）で灌流した。未処理の灌流液を回収し、処理して赤血球を除去した。ＨＰＰまた
はＵＣＢ由来の単核細胞を蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）緩衝液（ＲＰＭＩ１
６４０、フェノールレッド不含、プラス５％ＦＢＳ）で１回洗浄し、次に１５００ｒｐｍ
で６分間遠心分離した。細胞数をカウントし、２０μＬのＣＤ３マイクロビーズ（カタロ
グＮｏ．１３０−０５０−１０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含む８０μＬの緩衝液／１０７
個の全細胞に細胞ペレットを再懸濁させた。このシステムを十分に混合し、１５分間、４
〜８℃でインキュベートした。１〜２ｍＬの緩衝液／１０７個の全細胞を添加し、次に混
合物を３００ｇで１０分間遠心分離した。上清をピペットによって完全に取り除いた。５
００μＬの緩衝液に１０８個の細胞となるように細胞ペレットを再懸濁させ、磁気分離用
に調製した。ＭＩＤＩＭＡＣＳ（商標）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ
）の磁場にＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を設置し、３ｍＬの緩衝液を
用いてカラムをリンスし、細胞／マイクロビーズ懸濁液をカラムに添加した。カラムを通
過し、ナチュラルキラー細胞を含むであろう非標識ＣＤ３−細胞を２×３ｍＬの洗浄緩衝
液とともに回収した。ＣＤ３−細胞をカウントし、１回洗浄し、次にＣＤ５６マイクロビ
ーズ（Ｃａｔ＃：１３０−０５０−４０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で染色し、上述したＣＤ
３マイクロビーズ分離と同じプロトコールを用いて分離／単離した。このようにして、Ｃ
Ｄ５６＋ＣＤ３−集団を回収し、さらなる分析に備えた。ナチュラルキラー細胞の百分率
の範囲は、ＨＰＰでは３．５２〜１１．６（中央値６．０４、平均５．２２）、ＵＣＢで
は１．０６〜８．４４（中央値：３．４２、平均：４．２）であった。ＨＰＰ由来のナチ
ュラルキラー細胞のＣＤ５６マイクロビーズ選択によって、約８０％純度の集団が産生さ
れた。図１を参照されたい。全ＣＤ５６＋、ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞集団の中には
、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６−ナチュラルキラー細胞（すなわち、ＰＩＮＫ細胞）の百分率の
範囲は、ＨＰＰ由来で５６．６〜８７．２（中央値７４．２、平均６５．５）であり、Ｕ
ＣＢ由来で５３．７〜９６．６（中央値７２．８）であった。ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋ナ
チュラルキラー細胞の百分率の範囲は、ＨＰＰ由来で１２．８〜４３．３（中央値２５．
８、平均３４．５）であり、ＵＣＢで３．４〜４６．３（中央値２７．３、平均３３．４
）であった。
【０２２６】
他の実験では、ヒト血液細胞上の細胞表面抗原（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１９
、ＣＤ２０、ＣＤ３６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲ、グリコフォリンＡ）を
標的とする磁気ネガティブ選択キットを用いてナチュラルキラー細胞を単離した。ＨＰＰ
およびＵＣＢ凍結保存ユニットを解凍し、解凍培地（ＲＰＭＩ培地１６４０（カタログ＃
２２４００、Ｇｉｂｃｏ）＋２０％ウシ胎児血清−熱不活性化（カタログ＃ＳＨ３００７
０．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ））を用いて１：１に希釈し、１５００ｒｐｍで８分間遠心分
離した。上清を除去し、塩化アンモニウム処理を施し、さらに赤血球を枯渇させた；各ユ
ニットは、約３０ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０、フェノールレッド不含
、プラス５％ＦＢＳ）に再懸濁させ、次に６０ｍＬの氷冷塩化アンモニウム（カタログ＃
０７８５０、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）を添加し、溶液をボルテックスし、その後、氷上で５
分間インキュベートした。次に、単核細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、その後、１５
００ｒｐｍで８分間遠心分離した。細胞数をカウントし、ＲｏｂｏＳｅｐ緩衝液（カタロ
グ＃２０１０４、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）の１ｍｌ当たり５×１０７個の生細胞となるよう
に細胞ペレットを再懸濁させ、プラス０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡａｓｅＩ溶液（カタログ
＃０７９００、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）を細胞懸濁液に添加し、ピペットによって穏やかに
混合し、単離前に１５分間室温でインキュベートした。続けて単離する前に、４０μｍの
メッシュナイロンストレーナー（カタログ＃３５２３４０、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）でろ過
することによって細胞懸濁液から塊を取り出した。装置ＲｏｂｏＳｅｐ（カタログ＃２０
０００、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）およびプログラム「Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １９０５５  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ」（５０μＬ
／ｍＬカクテル添加、１００μＬ／ｍＬ微粒子添加、１０分と５分のインキュベーション
、１×２．５分の分離）、ならびにＥａｓｙＳｅｐネガティブ選択ヒトＮＫ細胞濃縮カク
テルおよびＥａｓｙＳｅｐ磁気微粒子を含むヒトＮＫ細胞濃縮キット（カタログ＃１９０
５５、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）によって自動的に単離する。このようにして、ＣＤ５６＋Ｃ
Ｄ３−集団を回収し、さらなる分析に備えた。
【０２２７】
ナチュラルキラー細胞の増殖。概して、ナチュラルキラー細胞を以下のように増殖した
。ナチュラルキラー細胞培養用の開始培地は、Ｙｓｓｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ  ７２（１）：２１９−２２７（１９８４）およびＬｉｔｗｉｎら、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７８（４）：１３２１−１３２６（１９９３）に報告されているプロトコ
ールの修飾に基づいて調製した。要約すると、開始培地は、ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）および１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含み、以下の最終濃度を有する試薬であ
る３５μｇ／ｍＬトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５μｇ／ｍＬイン
スリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２×１０−５Ｍエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ
−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１μｇ／ｍＬオレイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１μｇ
／ｍＬリノール酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．２μｇ／ｍＬパルミチン酸（Ｓ
ｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２．５μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
）および０．１μｇ／ｍＬフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ−Ｐ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒ
ｉｃｈ）を含む。細胞培養処置された２４ウェルプレートまたはＴフラスコに２．５×１
０５個の生細胞／ｍＬ開始培地＋２００ｉｕ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ
）でＣＤ５６＋ＣＤ３−のＮＫ細胞を再懸濁した。マイトマイシンＣ処理された同種異系
のＰＢＭＣおよびＫ５６２細胞（慢性骨髄性白血病細胞株）をともにフィーダー細胞とし
て開始培地に添加し、最終濃度を１×１０６／ｍＬにした。ＮＫ細胞を５〜６日間、３７
℃、５％ＣＯ２で培養した。５〜６日後、次に３〜４日ごとに等量の維持培地（１０％Ｆ
ＣＳ、２％ヒトＡＢ血清、抗生物質、Ｌ−グルタミンおよび４００ユニットのＩＬ−２／
ｍＬを含むＩＭＤＭ）を培養物に添加した。ＮＫ細胞を第２１日に回収した。
【０２２８】
胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の特徴付け。ドナーが合致したＨＰＰおよびＣＢを
解凍し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）で洗浄した。次
にナチュラルキラー細胞は、製造業者によって指示されるように、ＲＯＢＯＳＥＰ（登録
商標）磁気分離システム（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＣＤ
５６マイクロビーズにより濃縮された。ＣＤ５６が濃縮されたナチュラルキラー細胞集団
は、免疫表現型の特徴付けのために以下の抗体（他に指示がなければＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅ）を用いて染色された：ＰＥ−Ｃｙ−７にコンジュゲートされた抗ＣＤ５６、抗
ＣＤ３  ＡＰＣ  Ｃｙ７、抗ＣＤ１６  ＦＩＴＣ、抗ＮＫＧ２Ｄ  ＡＰＣ、抗ＮＫｐ４６
ＡＰＣ、抗ＣＤ９４  ＰＥ（Ｒ＆Ｄ）、抗ＮＫＢ１  ＰＥ、および抗ＫＩＲ−ＮＫＡＴ
２  ＰＥ。ＣＤ９４、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞前躯体においては存在し
ないか、または発現が減少していることを示すが、完全に分化したＮＫ細胞上では存在す
るマーカーである。Ｆｒｅｕｄら、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｃｒｅｔｅ  Ｓ
ｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅ
ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３（４）：１０３
３−１０４３（２００６）；ＥａｇｌｅおよびＴｒｏｗｓｄａｌｅ、「Ｐｒｏｍｉｓｃｕ
ｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＮＫＧ２Ｄ」、オンライン
で公開されたＮａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００７年８月３
日；Ｗａｌｚｅｒら、「Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ：Ｆｒｏｍ  ＣＤ３
−ＮＫｐ４６＋  ｔｏ  Ｐｏｓｔ−Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｍｅｔａ−Ａｎａｌｙｓｅｓ」、
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：３６５−３７２（２００７）を参照
されたい。表１に示されるように、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＮＫＧ２Ｄ
、ＮＫｐ４６およびＣＤ９４の発現は、ＨＰＰ由来の濃縮されたＣＤ５６＋細胞集団と臍
帯血（ＣＢ）由来のＨＬＡに合致したＣＤ５６＋細胞集団との間で有意に相違していなか
った。
【０２２９】
【表１】
2019206532.tif 000028
【実施例２】
【０２３０】
組み合わせた胎盤灌流液および臍帯血からの胎盤由来中間ナチュラルキラー細胞の特徴付
け
臍帯血および胎盤灌流（コンボ）のドナーが合致した単核細胞を混合し、ＦＡＣＳ緩衝
液（５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）で１回洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（
ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、表２に列挙された抗体を用いて免疫表現型的に特徴
付けた。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）によってデータを分析した。
【０２３１】
【表２】
2019206532.tif 000029
【０２３２】
胎盤ＮＫ細胞および末梢血（ＰＢ）ＮＫ細胞の免疫表現型的な特徴付け。ＮＫ細胞は、
２つの主なグループに分けることができる：ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞、およびＣＤ
５６＋ＣＤ１６−細胞。ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞は、豊富な細胞溶解性顆粒を有し
、ＣＤの発現が高く、したがって、抗体に依存した細胞を媒介にした細胞傷害性（ＡＤＣ
Ｃ）を発揮することができる。ＣＤ５６＋ＣＤ１６−ＮＫ細胞は、反対に、非常に少ない
細胞溶解性顆粒を有し、ＣＤ１６の発現が低いかまたはないが、活性化によりサイトカイ
ンおよびケモカインを生産することができる。個々のＮＫ細胞は、キラー免疫グロブリン
様受容体（ＫＩＲ、例えばＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ２ＤＬ２／３）、天然の細胞傷害
性受容体ＮＣＲ（例えばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６）、キラー細胞レク
チン様受容体（ＫＬＲ、例えばＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｄ）、２Ｂ４およびＣＤ２２６を含む
活性および阻害性受容体の多様なレパートリーを表示する。
【０２３３】
特異的なＮＫ受容体に対する、蛍光をコンジュゲートされたｍＡｂを用いて、胎盤ＮＫ
および末梢血ＮＫ細胞上でＦＡＣＳ分析を行った。特徴付けられた１１個のＮＫ小集団で
、１１個のＮＫ小集団のうちの７個（ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６−、ＣＤ３−ＣＤ５６
＋ＣＤ１６＋、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＫＩＲ２ＤＬ２／３＋、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４
６＋、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ３０＋、ＣＤ３−ＣＤ５６＋２Ｂ４＋およびＣＤ３−Ｃ
Ｄ５６＋ＣＤ９４＋）における細胞数は、胎盤ＮＫと末梢血ＮＫ細胞の間で有意差（ｐ＜
０．０５）を示した（６４％の相違を占める）（表３Ａ；表３Ｂおよび３Ｃも参照された
い）。
【０２３４】
表３Ａ。１６ユニットの組み合わせたドナー合致の臍帯血およびヒト胎盤灌流液（コン
ボ）ならびに１３ユニットの末梢血（ＰＢ）におけるＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の表現
型の特徴付け。２試料のｔ検定を用いて、集団の平均が胎盤および末梢血単位において等
しいかどうかを決定する。
【表３】
2019206532.tif 000030
【０２３５】
表３Ｂおよび３Ｃは、別々の実験において１６ユニットの組み合わせたドナー合致の臍
帯血およびヒト胎盤灌流液（コンボ）ならびに１３ユニットの末梢血（ＰＢ）におけるＣ
Ｄ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６−ＮＫ細胞およびＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の表
現型の特徴付けを示す。
【０２３６】
【表４】
2019206532.tif 000031
【０２３７】
【表５】
2019206532.tif 000032
【０２３８】
６０．９％の胎盤ＮＫ細胞がＣＤ５６＋ＣＤ１６−（胎盤由来中間ナチュラルキラー（
ＰＩＮＫ）細胞）であり、たった２１．４％の末梢血ＮＫ細胞がＣＤ５６＋ＣＤ１６−で
ある。２１日間の培養後、１１個のＮＫ小集団のうちの４個（ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＫＩＲ
２ＤＬ２／３＋、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４６＋、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ４４＋お
よびＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫｐ３０＋）の百分率は、胎盤ＮＫ細胞と末梢血ＮＫ細胞との
間に有意差（ｐ＜０．０５）を示した（表４）。
【０２３９】
表４。１２ユニットの組み合わせたドナー合致の臍帯血およびヒト胎盤灌流液（コンボ
）、および９ユニットの末梢血（ＰＢ）由来の２１日培養したＮＫ細胞の表現型の特徴付
け。２試料のｔ検定を用いて、集団平均がコンボユニットと末梢血ユニットにおいて等し
いかどうかを決定する。
【０２４０】
【表６】
2019206532.tif 000033
【０２４１】
さらに、分離実験では、２１日間の培養後、胎盤ＮＫ細胞および末梢血ＮＫ細胞は、ル
ミネックスアッセイによって測定されるように、特にＩＬ−８に関して固有のサイトカイ
ンプロフィールを示すことが分かった（表５）。
【０２４２】
【表７】
2019206532.tif 000034
【０２４３】
胎盤ＮＫ細胞および末梢血ＮＫ細胞のマイクロＲＮＡプロフィーリング。ＭＩＲＶＡＮ
Ａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｃａｔ＃１５６０）を用いて、単離さ
れたＮＫ細胞または増殖させたＮＫ細胞をマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）調製に供した。
ＮＫ細胞（０．５〜１．５×１０６細胞）を変性溶解緩衝液中で崩壊させた。次に、試料
を酸性フェノール＋クロロホルム抽出に供し、低分子ＲＮＡ種に関して非常に濃縮したＲ
ＮＡを単離した。１００％エタノールを添加し、試料を２５％エタノールにした。この溶
解物／エタノール混合物をガラスファイバーフィルターに通過させると、高分子ＲＮＡが
固定化され、低分子ＲＮＡ種はろ過物中に回収される。次に、ろ過物のエタノール濃度を
５５％に増加させ、混合物を第２のガラスファイバーフィルターに通過させた。この場合
、低分子ＲＮＡが固定化されるようになった。このＲＮＡを数回洗浄し、低イオン強度溶
液で溶出した。回収した低分子ＲＮＡの濃度および純度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍ
のその吸光度を測定することによって決定した。
【０２４４】
ＰＩＮＫ細胞に対して固有であることが分かったｍｉＲＮＡを表６に示す。ｈｓａ−ｍ
ｉＲ−１９９ｂと示された１つのｍｉＲＮＡは、末梢血ＮＫ細胞に対して固有であること
が分かった。
【０２４５】
表６。ｑＲＴ−ＰＣＲを介したｐｉＮＫ細胞およびＰＢ  ＮＫ細胞に関するｍｉＲＮＡプ
ロフィーリング。
【表８】
2019206532.tif 000035
【０２４６】
培養された胎盤ＮＫ細胞および培養されていないＮＫ細胞の免疫表現型の特徴付け。培
養されたＰＩＮＫ細胞の全体の特性は、広範囲の免疫表現型試験および細胞傷害性アッセ
イによって評価された。増殖させたＮＫ細胞の表現型を決定するために、ＫＩＲ、ＮＫＧ
２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４および２Ｂ４などのＮＫ受容体（ＮＫＲ）の発現を分析し
た。細胞傷害性アッセイは、ＰＫＨ２６で腫瘍細胞（Ｋ５６２細胞）を標識し、次にＰＩ
ＮＫ細胞と４時間、共培養することによって行った。第０日から第２１日まで、ＮＫＧ２
Ｄの発現は、６０．９％±４．８％から８６％±１７．４％（ｐ値は０．０２４）に増加
した；ＮＫｐ４６は、１０．５％±５．４％から８２．８％±９．０％（ｐ値は０．００
００２）に増加した；ＮＫｐ４４は、９．６％±６．５％から５１．６％±２７．５％（
ｐ値は０．０２２）に増加した；２Ｂ４は、１３．０％±７．１％から０．６５％±０．
５％（ｐ値は０．００９％）に減少した（表７）。これらの培養条件下では、ＫＩＲ３Ｄ
Ｌ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのドメイン、長鎖細胞質テール１、阻害
性受容体）およびＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのド
メイン、長鎖細胞質テール２および長鎖細胞質テール３；阻害性受容体）を含む阻害性Ｋ
ＩＲは、２１日間の増殖では影響されないままであった。発現ＮＫＲにおける変化は、Ｋ
５６２細胞に対する第２１日対第１４日での細胞溶解活性（６３％±１５％対４５％±４
％、ｐ値は０．０００４）における顕著な増加とさらに相関していた。これらの所見は、
ＮＫ細胞の細胞傷害性活性と十分に相関するＮＫ細胞の推定上のマーカーの同定へと導い
た。
【０２４７】
表７．２１日の培養前後のｐｉＮＫ細胞の表現型特徴付け。
標準偏差（Ｓｔｄｅｖ）は５人のドナーについて集団平均に関して計算した。
【０２４８】
【表９】
2019206532.tif 000036
【０２４９】
脂質系タンパク質固定化技術および線形イオントラップＬＣ／ＭＳを介した培養された
胎盤ＮＫ細胞および培養された末梢血ＮＫ細胞の膜プロテオームプロフィーリング。膜タ
ンパク質精製：２１日間培養した、組み合わせた胎盤灌流液と臍帯血細胞由来の胎盤ナチ
ュラルキラー細胞、およびＰＢ  ＮＫ細胞は、細胞溶解前に、プロテアーゼインヒビター
カクテル溶液（Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；４
−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフロリド（ＡＥＢＳＦ）、ペプスタチンＡ、
Ｅ−６４、ベスタチン、ロイペプチン、およびアプロチニンを含み、金属キレートは含ま
ない）とともに１５分間インキュベートされた。次に、界面活性剤なしに、１０ｍＭ  Ｈ
Ｃｌ溶液を添加して細胞を溶解し、１０分間、４００ｇで遠心分離し、ペレットにし、核
を除去した。核除去後の上清を超遠心分離管に移し、Ｔ−１２７０ローターを有するＷＸ
８０超遠心分離器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｓｈｅｖｉ
ｌｌｅ、ＮＣ）で、１００，０００ｇ、１５０分間遠心分離し、膜タンパク質ペレットを
生じさせた。
【０２５０】
プロテオリポソームの生成、固定化および消化：ＮＡＮＯＸＩＳ（登録商標）緩衝液（
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）を用いて、膜タンパク質ペレット
を数回洗浄した。膜タンパク質ペレットを１．５ｍＬのＮＡＮＯＸＩＳ（登録商標）緩衝
液に懸濁させ、次にＶＩＢＲＡ−ＣＥＬＬ（商標）ＶＣ５０５超音波プロセッサー（Ｓｏ
ｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ）を用いて、２０
分間、氷上でチップ超音波処理した。プロテオリポソームの大きさは、ＦＭ１−４３色素
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で染色し、蛍光顕微鏡で視覚化する
ことによって決定した。プロテオリポソーム懸濁液のタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ
（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。次に、標準的なピペットチ
ップを用いて、プロテオリポソームをＬＰＩ（商標）フローセル（Ｎａｎｏｘｉｓ  ＡＢ
、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）上に注入し、１時間固定した。固定後、一連の
洗浄工程を行い、５μｇ／ｍＬのトリプシン（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏ
ｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉ、ＮＪ）をＬＰＩ（商標）フローセルに直接注入した。チップを一
晩、３７℃でインキュベートした。次にトリプシンペプチドをチップから溶出し、その後
、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒ
ｄ、ＭＡ）を用いて脱塩した。
【０２５１】
強力な陽イオン交換（ＳＣＸ）分画：０．１％ギ酸／水溶液中でトリプシンペプチドを
再構成し、強力な陽イオン交換（ＳＣＸ）ＴＯＰ−ＴＩＰ（商標）カラム（ＰｏｌｙＬＣ
、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）上に装填し、ピペットチップを３０μｍのポリスホエチルア
スパルトアミドＳＣＸ充填材料とともに充填した。ギ酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ２．８
（１０ｍＭ−５００ｍＭ）の段階勾配を用いて、ＳＣＸ  ＴＯＰ−ＴＩＰ（商標）からペ
プチドを溶出した。各ＳＣＸ画分を即時真空システムで乾燥し、下流のＬＣ／ＭＳ分析の
準備において、５％アセトニトリル、０．１％ギ酸を用いて再構成した。
【０２５２】
ＬＴＯ線形イオントラップＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析：各ＳＣＸ画分は、０．２ｍｍ×１５
０ｍｍの３μｍ  ２００Å  ＭＡＧＩＣ  Ｃ１８カラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓ
ｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）上で分離した。このカラムは、１８０分
の勾配（緩衝液Ａ：水、０．１％ギ酸；緩衝液Ｂ：アセトニトリル、０．１％ギ酸）を用
いて、軸脱溶媒和真空支援ナノキャピラリーエレクトロスプレイイオン化（ＡＤＶＡＮＣ
Ｅ）源（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．）に直接接続された。Ａ
ＤＶＡＮＣＥ源は、３μＬ／分という非常に高い流速で操作しながら、従来のナノＥＳＩ
に匹敵する感度に到達する。溶出されたペプチドは、各々の完全なスキャン質量スペクト
ルの後に１０回のデータに依存したＭＳ／ＭＳスキャンを使用するＬＴＱ線形イオントラ
ップ質量分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ
、ＣＡ）上で分析された。
【０２５３】
バイオインフォマティクス：各腫瘍細胞株（ＡＭＬ、ＣＭＬ）について回収された６個
の塩画分に対応する６個のＲＡＷファイルは、ＳＯＲＣＥＲＥＲ（商標）ＳＯＬＯ（商標
）ワークステーション（Ｓａｇｅ−Ｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）の
ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムの実施を用いて、ＩＰＩ  Ｈｕｍａｎ  Ｄａｔａｂａｓｅに
対して単一サーチとしてサーチされた。１．２ａｍｕのペプチド質量寛容を特定し、メチ
オニンの酸化を特異的修飾として特定し、カルバミドメチル化は静的修飾として特定され
た。トランス−プロテオミックパイプライン（ＴＰＰ）のＳｃａｆｆｏｌｄソフトウェア
実施を用いて、膜プロテオームデータをソートし、解析した。タンパク質は、ペプチド可
能性が９５％、タンパク質可能性が９５％であり、１つの固有のペプチドであると同定さ
れた場合には、分析用と考えられた。膜プロテオームデータセット間の比較は、社内で開
発されたカスタムＰｅｒｌスクリプトを用いてなされた。
【０２５４】
この分析は、末梢血ＮＫ細胞から同定された膜タンパク質に関して固有である、培養さ
れた胎盤ＮＫ細胞由来の８個の膜タンパク質の同定を示した。表８を参照されたい。さら
に、８個の膜タンパク質は、培養された胎盤ＮＫ細胞に関して固有である末梢血ＮＫ細胞
から同定された。表８を参照されたい。同定されたほんの１０個の膜タンパク質は、培養
された胎盤ＮＫ細胞と末梢血ＮＫ細胞の間で共有されることが分かった。
【０２５５】
【表１０】
2019206532.tif 000037
【実施例３】
【０２５６】
腫瘍細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞傷害性
本実施例は、胎盤中間ナチュラルキラー細胞が腫瘍細胞に対して細胞傷害性であること
を示す。ＨＰＰ由来のＰＩＮＫ細胞は、細胞傷害性アッセイにおいて示されるように、お
よびＮＫ細胞サイトカイン分泌のルミネックス分析によって、急性骨髄性白血病細胞に細
胞傷害性である。
【０２５７】
サイトカイン分泌アッセイでは、ＣＤ５６マイクロビーズが濃縮された、ＨＰＰ由来の
ＮＫ細胞は、ＫＧ−１ａ急性骨髄性白血病細胞と１：１の比率で混合された。２４時間の
インキュベーション後、上清を回収し、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦ分泌のルミネック
ス分析に供した。ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦのレベル増加は、図２に示されるように
、ＣＤ５６に富んだＨＰＰ細胞とＫＧ−１ａ細胞の２４時間のインキュベーション後に観
察された。
【０２５８】
ＰＩＮＫ細胞の細胞傷害性
ＰＩＮＫ細胞を利用する細胞傷害性アッセイでは、標的腫瘍細胞は、カルボキシフルオ
ロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。ＣＦＳＥは、細胞に無毒で
ある生体染色法であり、細胞分裂中に娘細胞間で分割される。次に、これらの細胞は、９
６ウェルのＵ底組織培養プレートに置かれ、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中
で、新鮮に単離したＣＤ５６＋ＣＤ１６−ＰＩＮＫ細胞とともに２０：１、１０：１、５
：１および１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でインキュベートされた。４時間の
インキュベーション時間後、細胞を回収し、ＣＦＳＥの存在についてフローサイトメトリ
ーによって試験した。ＮＫ細胞を含まない培養物から回収された標的細胞の数を参照とし
て使用した。細胞傷害性は、（１−ＣＦＳＥ試料／ＣＦＳＥコントロール）＊１００％と
して定義される。有意な腫瘍細胞の細胞傷害性は２０：１比で観察された。図３を参照さ
れたい。
【０２５９】
培養されたＰＩＮＫ細胞に対する腫瘍細胞の感受性
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）−放出アッセイ。ＬＤＨ−放出アッセイは、ＣＹＴＯＴＯＸ
９６（登録商標）比色分析細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ１７
８０）を用いて行った。このアッセイでは、合致したＨＰＰ／ＵＣＢ由来のＣＤ５６＋Ｃ
Ｄ１６−細胞とＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞の組合せを含む、培養されたＮＫ細胞がエフェ
クター細胞であり、腫瘍細胞が標的細胞であった。エフェクター細胞および標的細胞を９
６ウェルのＵ底組織培養プレートに置き、２％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、Ｃａｔ＃１
００−５１２）を補充した、フェノールレッド不含の１００μｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１１８３５−０３０）中で種々のエフェクター−標的（Ｅ
：Ｔ）比でインキュベートした。培養物を４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベート
した。インキュベーション後、５０μｌの上清を酵素アッセイプレートに移し、製造業者
によって与えられるようにＬＤＨ活性を検出し、吸収をＥＬＩＳＡリーダー（Ｓｙｎｅｒ
ｇｙ  ＨＴ、Ｂｉｏｔｅｋ）において４９０ｎｍで測定した。細胞傷害性の程度は、以下
の式：
細胞傷害性％＝（試料−エフェクター自然−標的自然）／（標的最大−標的自然）＊１０
０
に従って計算された。
【０２６０】
ある種の腫瘍タイプは、他の細胞よりもＮＫ細胞により反応性であり得る。培養された
ＰＩＮＫ細胞に対する腫瘍細胞の感受性を分析するために、１２種の異なる腫瘍細胞株を
ＰＩＮＫ細胞と共培養し、ＬＤＨ放出アッセイにおいて分析した。１２種の腫瘍細胞株に
は、ヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫、網膜芽腫（ＲＢ）、および多発性骨髄
腫（ＭＭ）が含まれた（表９）。ＮＫ細胞の細胞傷害性は、４時間の共培養後にＬＤＨ放
出アッセイによって測定された。
【０２６１】
【表１１】
2019206532.tif 000038
【０２６２】
１０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、培養されたＰＩＮＫ細胞の有意な細胞
傷害性が見られ、Ｋ５６２細胞（ＣＭＬ）では８８．６％±５．６％、Ｕ９３７細胞（リ
ンパ種）では８９．２％±９．８％、ＷＥＲＩ−ＲＢ−１細胞（ＲＢ）では７３．３％±
１１．８％、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＭＭ）では６１．３％±１．３％、およびＵ２６６
細胞（ＭＭ）では５７．４％±４．７％であった（表１０）。
【０２６３】
表１０．培養されたｐｉＮＫ細胞に対する腫瘍細胞の差異感受性。平均の標準誤差（Ｓ
．Ｅ．Ｍ．）を３人のドナーからの平均の細胞傷害性について計算した。
【表１２】
2019206532.tif 000039
【０２６４】
レナリドマイドおよびポマリドマイドを用いた処置によるＰＩＮＫ細胞の細胞傷害性の増
加
ＲＮＡ単離および精製。ＲＮＡＱＵＥＯＵＳ（登録商標）−４ＰＣＲキット（Ａｍｂｉ
ｏｎ、Ｃａｔ＃ＡＭ１９１４）を用いて、単離されたかまたは増殖したＮＫ細胞をＲＮＡ
調製に供した。要約すると、ＮＫ細胞（０．５〜１．５×１０６細胞）をグアニジン溶解
溶液に溶解した。次に、試料溶解物をエタノール溶液と混合し、ｍＲＮＡおよびより大き
なリボソームＲＮＡに選択的かつ定量的に結合するシリカ系フィルターに添加した；ｔＲ
ＮＡおよび５ＳリボソームＲＮＡなどの非常に小さなＲＮＡは定量的に結合しなかった。
その後、フィルターを洗浄し、残ったＤＮＡ、タンパク質、および他の汚染物を除去し、
重金属をキレートするための微量のＥＤＴＡを含むヌクレアーゼ不含の水にＲＮＡを溶出
した。シリカフィルターは、キットとともに供給されるＲＮａｓｅ不含の微量遠心管に合
う小さなカートリッジに収納された。試料溶解物、洗浄溶液、および溶出溶液は、遠心分
離または減圧により、フィルターを介して移動させた。フィルターから溶出後、キットと
ともに提供される超純粋なＤＮａｓｅ  １でＲＮＡを処理し、微量のＤＮＡを除去した。
最後に、キットにさらに提供される試薬によって、ＤＮａｓｅおよび二価陽イオンを除去
した。回収されたＲＮＡの濃度および純度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度を測
定することによって決定した。
【０２６５】
定量的リアルタイム（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析。次に、単離されたＲＮＡは、ＴＡＱＭＡ
Ｎ（登録商標）逆転写酵素試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃Ｎ８
０８０２３４）を用いたｃＤＮＡ合成のために、続くＨｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｒｒ
ａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃４３７０５７３）およびＨｕｍ
ａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｒｒａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ
＃４３８４７９２）を用いて、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  
ＳｙｓｔｅｍによってリアルタイムＰＣＲ分析のために使用することができる。
【０２６６】
レナリドマイドおよびポマリドマイドは、増加した抗癌活性および抗炎症活性を有する
サリドマイドの化学的類似体である。レナリドマイドおよびポマリドマイドがＰＩＮＫ細
胞の細胞傷害性を増加させ得るかどうかを試験するために、エクスビボで培養された（第
１９日）ＰＩＮＫ細胞をレナリドマイドおよびポマリドマイドを用いて、２４時間、前処
理し、その後、標的大腸直腸癌腫細胞株ＨＣＴ−１１６と共培養させた。レナリドマイド
処置されたＮＫ細胞は、４２．１％の細胞傷害性を示し、ポマリドマイド処理されたＮＫ
細胞は４７．４％の細胞傷害性を示したが、コントロールの未処理ＰＩＮＫ細胞は、たっ
た２４．３％の細胞傷害性を示した。
【０２６７】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）およびフローサイトメトリー分析は、ポ
マリドマイドによって引き出された、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強がグランザイムＢ（Ｇ
ＺＭＢ）遺伝子発現の増加（６０％±１．７％増加）（表１１）およびＧＺＭＢ−陽性Ｎ
Ｋ細胞の百分率の増加（２５％増加）と相関していることを示した。さらに、ＧＭ−ＣＳ
Ｆの発現は、レナリドマイド（２３２％±１．６％増加）処理およびポマリドマイド（３
９６％±０．３％増加）処理されたＰＩＮＫ細胞において増加した（表１１Ａ、１１Ｂ）
。
【０２６８】
表１１Ａ、１１Ｂ．未処理細胞と比較した、レナリドマイドおよびポマリドマイド処理
された培養ＰＩＮＫ細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。１１Ａ：列挙された遺伝子についてのレ
ナリドマイド処理およびレナリドマイド未処理の試料間の遺伝子発現の倍数変化。対応の
あるｔ検定を用いて、倍数変化がレナリドマイド処理および未処理の試料において等しい
かどうかを決定する。１１Ｂ：列挙された２５個の遺伝子について、ポマリドマイド処理
およびポマリドマイド未処理試料間の遺伝子発現の倍数変化。対応するｔ検定を用いて、
倍数変化が処理および未処理の試料において等しいかどうかを決定する。
【０２６９】
【表１３】
2019206532.tif 000040
BAX-BCL2関連Xタンパク質
CCL5-ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド5
CCR5-ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5
CSF2-コロニー刺激因子2(顆粒球-マクロファージ)
FAS-TNF受容体スーパーファミリー、メンバー6
GUSB-βグルクロニダーゼβ
IL2RA-αインターロイキン2受容体
TNFRSF18-腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー18
【０２７０】
【表１４】
2019206532.tif 000041
ACTB-β-アクチン
BAX-BCL2関連Xタンパク質
CCL2-ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド2
CCL3-ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド3
CCL5-ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド5
CCR5-ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5
CSF1-コロニー刺激因子1(マクロファージ)
CSF2-コロニー刺激因子2(顆粒球-マクロファージ)
ECE1-エンドセリン変換酵素1
FAS-TNF受容体スーパーファミリー、メンバー6
GNLY-グラニュライシン
GUSB-グルクロニダーゼ-β
GZMB-グランザイムB(グランザイム2、細胞傷害性T-リンパ球関連セリンエステラーゼ1)
IL1A-αインターロイキン1
IL2RA-インターロイキン2受容体-α
IL8-インターロイキン8
IL10-インターロイキン10
LTA-リンホトキシンα(TNFスーパーファミリー、メンバー1)
PRF1-パーフォリン1(孔形成タンパク質)
PTGS2-プロスタグランジン-エンドペルオキシドシンターゼ2(プロスタグランジンG/Hシン
ターゼおよびシクロオキシゲナーゼ)
SKI-v-ski肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ(トリ)
TBX21-T-box 21
【０２７１】
混合ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性
別々の細胞傷害性アッセイでは、ドナーが合致した臍帯血および胎盤灌流液由来の培養
されたＮＫ細胞はエフェクター細胞であり、腫瘍細胞は標的細胞であった。脂溶性脂肪族
残基により細胞の原形質膜に挿入するＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  カタロ
グ＃ＰＫＨ２６−ＧＬ）（例えば、Ｌｅｅ−ＭａｃＡｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈ．２５２（１−２）：８３−９２（２００１）を参照）で腫瘍細胞を標識し、次に９
６ウェルのＵ底組織培養プレートに入れ、１０％ＦＢＳを補充した２００μｌのＲＰＭＩ
１６４０中、種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で培養されたＮＫ細胞とともにイン
キュベートされた。培養物は、４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされた。イ
ンキュベーション後、細胞を回収し、膜不浸透性のＤＮＡ染色であるＴＯ−ＰＲＯ−３（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃Ｔ３６０５）は１μＭの最終濃度で培養物に添加され、
その後、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏを用いてＦＡＣＳ分析を行った。細胞傷害性は、全Ｐ
ＫＨ２６＋標的腫瘍細胞内の死細胞（ＰＫＨ２６＋ＴＯ−ＰＲＯ−３＋）の百分率として
表された。
【０２７２】
この細胞傷害性アッセイでは、ヒト慢性骨髄性リンパ腫（ＣＭＬ）Ｋ５６２細胞を、細
胞の原形質膜に挿入するＰＫＨ２６で標識し、９６ウェルのＵ底組織培養プレートに入れ
た。２１日間培養された胎盤（コンボ）または末梢血ＮＫ細胞は、１０％ｖ／ｖ  ＦＢＳ
を補充したＲＰＭＩ１６４０中、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比が１０：１、５：１、
２．５：１および１．２５：１でＫ５６２細胞と混合された。４時間のインキュベーショ
ン時間後、細胞を回収し、ＴＯ−ＰＲＯ−３を細胞培養物に添加し、その後、ＰＫＨ２６
およびＴＯ−ＰＲＯ−３の存在についてフローサイトメトリーを行った。細胞傷害性は、
全ＰＫＨ２６＋腫瘍標的細胞内のＰＫＨ２６＋ＴＯ−ＰＲＯ−３＋の死細胞の百分率とし
て表された。胎盤ＮＫ細胞と末梢血ＮＫ細胞の両方は、試験されたすべてのＥ：Ｔ比でＫ
５６２細胞に対する実質的な毒性を示した（図４）。Ｋ５６２細胞に対する末梢血ＮＫ細
胞よりも有意に高い、胎盤ＮＫ細胞の毒性は、１０：１と５：１の２つのＥ：Ｔ比で観察
された（図４）。
【実施例４】
【０２７３】
腫瘍細胞に対するヒト胎盤灌流液の細胞傷害性
本実施例は、ヒト胎盤灌流液細胞が腫瘍細胞に細胞傷害性であり、ＫＧ−１ａ上でＨＰ
Ｐ由来の総有核細胞（ＴＮＣ−ＨＰＰ）の細胞傷害性は、合致したＵＣＢ由来のＴＮＣの
細胞傷害性よりも高かったことを示す。ＨＰＰまたは臍帯血（ＵＣＢ）由来の総有核細胞
は、１：１、５：１、１０：１、２０：１または１００：１の比率でＫＧ−１ａ細胞と混
合された。２４時間または４８時間のインキュベーション後、細胞を回収し、ＦＡＣＳ分
析（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によってＣＦＳＥの存在
について調べた。単独で培養された腫瘍細胞をコントロールとして用いた。細胞傷害性は
、（１−ＣＦＳＥ試料／ＣＦＳＥコントロール）＊１００％として定義した。有意な細胞
傷害性は、１００：１の比で示された。図５を参照されたい。
【０２７４】
別々の実験において、ＨＰＰ由来の総有核細胞の細胞傷害性は、臍帯血由来の総有核細
胞の細胞傷害性と比較された。合致したＴＮＣ−ＨＰＰまたはＵＣＢは、０．７８：１、
１．５６：１、３．１２：１、６．２５：１、１２．５：１、２５：１、５０：１または
１００：１の比率でＫＧ−１ａ細胞と混合された。ＴＮＣ−ＨＰＰは、ＵＣＢと比較して
、すべての比率で一定により高い細胞傷害性を示した。図６を参照されたい。
【０２７５】
別の実験において、ＫＧ−１ａ細胞とインキュベーションする２４時間前、ＴＮＣ−Ｈ
ＰＰを１００Ｕ／ｍＬ、または１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で刺激し、ＲＰＭＩ培地で培
養されたＨＰＰをコントロールとして用いた。ＫＧ−１ａ細胞当たり６．２５ＮＫ細胞お
よびそれを超える比率では、ＩＬ−２は、ＴＮＣ−ＨＰＰの細胞傷害性を増加させるよう
である。図７を参照されたい。
【０２７６】
５×１０５個のＨＰＰ細胞および１×１０４個の腫瘍細胞を用いて、表１２に示される
腫瘍細胞型の幅広いアレイを使用して実験を繰り返した。
【０２７７】
【表１５】
2019206532.tif 000042
【０２７８】
２４時間または４８時間、５０：１の比率でＨＰＰ細胞および腫瘍細胞を共培養すると
、ＨＰＰ細胞は、腫瘍細胞に対して実質的な毒性を示した。両方の時間について、共培養
は、５０％を超える腫瘍細胞の死滅をもたらした。図８Ａおよび８Ｂを参照されたい。
【実施例５】
【０２７９】
腫瘍細胞への曝露中のヒト胎盤灌流液細胞によるサイトカイン産生
ＨＰＰ細胞の強力な抗白血病効果の媒介に関与する作用の一次機構を決定するために、
腫瘍細胞株と共培養されたＨＰＰ細胞のサイトカイン放出プロフィールは、多重ルミネッ
クスアッセイによって種々の時間で分析され、ＵＣＢ細胞のプロフィールと比較された。
【０２８０】
インキュベーション後に回収された上清をルミネックスアッセイに供し、ＩＦＮ−γ、
ＴＮＦ−α、およびＧＭ−ＣＳＦ（Ｃａｔ＃ＨＣＹＴＯ−６０Ｋ−０３、Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ）の濃度を決定した。これらの３つのサイトカインはＮＫ細胞傷害性と関連している
。（例えば、Ｉｍａｉら、Ｂｌｏｏｄ、２００５．１０６（１）：３７６−８３を参照さ
れたい）。また、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＦＡＳＴ  ７９００ＨＴ機器
およびプライマーを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行って、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およ
びＧＭ−ＣＳＦの発現を調べた。培養条件は、上述される共培養の細胞傷害性アッセイの
場合と同じであった。サイトカインの濃度は、ルミネックスアッセイを用いて決定された
。
【０２８１】
腫瘍細胞と共培養されたＨＰＰ細胞からのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＧＭ−ＣＳ
Ｆの分泌は、ＵＣＢ細胞の分泌よりも有意に高いことが分かった。１つの実験では、ＨＰ
Ｐ細胞は、１００ＵのＩＬ−２の存在または不存在において、０．７８：１、１．５６：
１、３．１２：１、６．２５：１、１２．５：１、２５：１、５０：１または１００：１
の比率でＫＧ−１ａ細胞と混合された。ＩＬ−２の不存在と比較して、ＩＬ−２の存在下
では、ＴＮＣ−ＨＰＰはＩＦＮ−γの産生が一貫して増加していることが示された。２４
時間でのＩＦＮ−γレベルは、約５〜２６倍（中央値：１６倍）に増加し；４８時間では
約３〜６５倍（中央値：２７倍）に増加することが分かり、細胞傷害性試験の結果と一致
していた。図９を参照されたい。
【０２８２】
別の実験では、ＫＧ−１ａ細胞とのインキュベーションの２４時間前、ＴＮＣ−ＨＰＰ
は１００Ｕ／ｍＬ、または１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で刺激され、ＲＰＭＩ培地で培養
されたＨＰＰをコントロールとして使用した。ＨＰＰまたは合致したＵＣＢ細胞は、ＫＧ
−１ａ細胞と共培養される前に、ＩＬ−２がある場合またはＩＬ−２がない場合で２４時
間インキュベートされた。ＩＦＮ−γの分泌は、Ｋ５６２およびＫＧ−１ａと共培養され
たＨＰＰ細胞において、４８時間で最大に増加した。ＨＰＰ細胞を１００Ｕ／ｍＬのＩＬ
−２で処理すると、２４時間および４８時間でのＫＧ−１ａに対するＨＰＰ細胞の細胞傷
害性が増加した。ＨＰＰ細胞におけるＩＦＮ−γの分泌レベルは、ＩＬ−２処理による、
合致したＵＣＢ細胞の分泌レベルよりも高かった。ＩＦＮ−γの高発現は、合致したＨＰ
ＰおよびＵＣＢ由来の細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認された。これらの結果は、Ｈ
ＰＰ細胞はＵＣＢ細胞と比較してより高い抗白血病活性を示し、この高い活性は、ＩＦＮ
−γ産生における有意な増加と関係していることを示す。
【０２８３】
一群の腫瘍細胞株との共培養中のＨＰＰ細胞における、および臍帯血細胞におけるＩＦ
Ｎ−γ産生は、上述される表１に列挙された腫瘍細胞株を用いて分析された。ＨＰＰ細胞
および腫瘍細胞は、１０４個の腫瘍細胞および５×１０５個のＨＰＰ細胞を用いて、５０
：１の比率で２４時間または４８時間共培養された。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ
３．５、Ｋ５６２、ＫＧ１、ＫＧ−１ａ、ＫＵ８１２、ＮＣ１−Ｈ１４１７、Ｕ−９３７
およびＷＥＲ１−ＲＢ−１細胞株については、２４時間の共培養でＨＰＰ細胞におけるＩ
ＦＮ−γ産生の増加は、同時間のこれらの細胞株と共培養された臍帯血細胞の増加を超え
ていた。図１０Ａを参照されたい。４８時間の共培養では、ＨＰＰ細胞におけるＩＦＮ−
γ産生の増加は、すべての腫瘍細胞株について臍帯血におけるＩＦＮ−γの産生の増加を
超えていた。図１０Ｂを参照されたい。腫瘍細胞株のうちＫ５６２細胞は、２４時間およ
び４８時間の両方でＨＰＰ細胞におけるＩＦＮ−γ産生の最大増加を誘導した。類似の結
果は、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦについて観察された。
【０２８４】
細胞周期分析によって、Ｓ期のＫＧ−１ａの百分率は、ＫＧ−１ａ細胞を単独で培養し
た場合と比較して、ＨＰＰと共培養した場合に３０％減少したことが示された。ＨＰＰの
異なる濃縮画分を用いて行ったさらなる共培養実験は、ＨＰＰの抗白血病活性がＣＤ５６
＋の高発現、ＣＤ１６の発現の欠如によって特徴付けられる固有の未成熟ナチュラルキラ
ー細胞の高濃度に非常に寄与していることを示した。
【実施例６】
【０２８５】
ヒト胎盤灌流液細胞によるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞増殖の抑制
６．６．１．材料および方法
本実施例は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス異種移植片腫瘍モデルを用いた、腫瘍細胞に対す
るｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト胎盤灌流液の有効性を示す。
【０２８６】
ＫＧ−１細胞の培養。ＫＧ−１細胞は、２０％のウシ胎児血清を補充したイスコフ変法
ダルベッコ培地（増殖培地）中に３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２および１００％湿度で
維持された。培養の培地は１日おきに交換し、細胞を毎週継代した。ＫＧ−１細胞は懸濁
物として増殖させる。したがって、培地交換または細胞継代に関しては、細胞懸濁液を遠
心管中に回収し、ＳＯＲＶＡＬＬ（登録商標）ＨＥＲＡＥＵＳ（登録商標）ローター（品
番７５００６４３４）で２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。上清を捨て、適量の細胞
ペレットが培養の継続のために増殖培地に再懸濁された。
【０２８７】
移植用のＫＧ−１細胞調製。マウスへの細胞移植に関して、上述されるように遠心分離
によって細胞を回収した。細胞ペレットを回収し、リン酸緩衝食塩水に再懸濁した。マウ
スに移植されるべき細胞の数を決定するために、細胞懸濁液のアリコートを血球計を用い
てカウントした。トリパンブルー色素を用いて、懸濁液の生存していない細胞を排除した
。
【０２８８】
移植用のＨＰＰ細胞調製。ＨＰＰの保存および解凍に関して、良好な条件下、断熱容器
中で試料を凍結させた。２００７年２月７日に解凍するまでユニットを断熱容器に保存し
た。解凍当日、ＨＰＰユニットを冷凍フリーザーから（一度につき１回）取り出し、ジッ
プトップ式のプラスチックバッグに入れた。次に、大部分が解凍するまで（小さな凍結片
はバッグ中に残る）、穏やかに撹拌しながらバッグを３７℃の水浴に置いた。その後、水
浴からバッグを取り出し、ユニットをジップトップ式のバッグから取り出し、完全に解凍
するまでユニットを穏やかに逆さにした。次に、層流フードにユニットを置き、血液バッ
グの外面を７０％エタノールを噴霧して滅菌した。滅菌したハサミで血液バッグを開封し
、滅菌したピペットによって、滅菌した５０ｍｌの円錐管（各ＨＰＰユニットについて１
つの管；各ＵＣＢユニットについて２つの管）に細胞を移した。次に、１０ｍＬの解凍緩
衝液（２．５％ヒトアルブミン、５％デキストラン４０）を穏やかに混合しながら（２．
２〜２．９分の時間をかけて）各管にゆっくり添加した。その後、各血液バッグを１０ｍ
Ｌの解凍緩衝液でリンスし、その後、５０ｍｌの円錐管にゆっくり添加した（０．７〜１
．３分の時間をかけた）。
【０２８９】
解凍後、各ユニットは、遠心分離前に水分を含んだ氷上で保存された。すべての管を１
０分（４４０×ｇ、１０℃）遠心分離し、上清を滅菌したピペットで吸引除去し、管を振
とうすることによってペレットを穏やかにバラバラにした。ビヒクル（ＰＢＳ＋１％ウシ
胎児血清）の１ｍｌアリコートを管の１つに添加し、管を穏やかに旋回して混合した。２
ｍｌピペットを用いて、内容物を２番目の管に移し、次に３番目、その後４番目の管に移
した。空の管を０．２ｍｌの希釈緩衝液で洗浄した。
【０２９０】
細胞カウントに関して、２５μｌのアリコートは、氷上で９７５μｌのビヒクルを含む
１５ｍｌの円錐管に移された。次に、赤血球は、４ｍｌの冷塩化アンモニウム溶解試薬を
添加し、氷上で１０分間インキュベートすることによって溶解させた。インキュベーショ
ン後、５ｍｌの冷ＰＢＳを各管に添加し、管を遠心分離した（１０分、４００×ｇ、１０
℃）。ＲＢＣ溶解後、生存率を評価するためのトリパンブルーを用いて、血球計によって
細胞をカウントした。カウントの結果は、希釈について補正され、次に溶解因子（０．４
６）で割って、ＲＢＣ溶解前に存在していた細胞数を予測した。
【０２９１】
ＨＰＰ用量調製について、カウント後、ビヒクルの添加によってＨＰＰ細胞を１×１０
８細胞／ｍｌに希釈した。次に、シリンジを装填するまで氷上でＨＰＰ細胞を保存した。
第１ユニットの解凍と用量調製の完了の間の時間経過は３時間未満であった。
【０２９２】
シリンジを充填する前、投与材料の５０μｌのアリコートは、上述されるようにカウン
トすることによって、投与後の検証のために確保された。投与後、残りの投与材料を投与
検証のために評価した。
【０２９３】
研究設計。第１日目、２４匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤ雄性マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、脇腹領域で５００万個の生存ＫＧ−１細胞Ｓ／Ｃを移植された
。４〜５匹のマウスが木片ベッドを備えたミクロ隔離ケージシステムに収納されるように
マウスを分離した。滅菌した齧歯類用の食餌および水を自由に与えた。腫瘍増殖について
１週間に２回、マウスを詳しくモニターした。最初の測定可能な腫瘍は第２５日に観察さ
れた。次に体重を週に１回記録し、週に２回、腫瘍の測定値をキャリパーを用いて記録し
た。移植後の第５２日に、動物を３つの別々のグループに無作為に抽出し、腫瘍体積は平
均して約３００〜３５０ｍｍ３であった。以下の表１３を参照されたい。第１のグループ
は、平均の腫瘍体積が３１２ｍｍ３である４匹のコントロールマウスからなっていた。こ
れらのマウスのうちの２匹は、それぞれ２００μｌおよび５０μｌのビヒクル溶液を静脈
内（ＩＶ）、および２回、腫瘍内（ＩＴ）に注入された。平均の腫瘍体積が３４５ｍｍ３
である第２のグループは、マウス当たり２００μｌのＨＰＰ細胞（２×１０７細胞）で静
脈内に注射された４匹のマウスからなっていた。また、最後のグループは、マウス当たり
５０μｌのＨＰＰ細胞でＩＴ注入され、平均の腫瘍体積が３３２ｍｍ３である４匹のマウ
スからなっていた。
【０２９４】
【表１６】
2019206532.tif 000043
【０２９５】
第６６日、ＨＰＰ細胞移植後の１４日に、高い腫瘍体積のために本研究を終了した。
【０２９６】
６．６．２．結果
腫瘍体積（ＴＶ）は、コントロールグループのＴＶが平均２９２１ｍｍ３に到達した第
６６日（ＨＰＰ細胞移植後の第１４日）まで測定された。研究の終わりにＩＶ処置群は平
均ＴＶが２０７６ｍｍ３であり、ＩＴグループはＴＶが２７０５ｍｍ３であった。処理後
のＴＶにおける増加％に関して、ＩＴグループは穏当に２０％阻害を示したのに対し、Ｉ
Ｖグループは、コントロールグループと比較した腫瘍増殖の３５％阻害よりも大きいこと
を示した。ＩＴグループの阻害は実証可能であった。図１１を参照されたい。
【０２９７】
均等：
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるべきではない。実
際に、記載された変更に加えて、本発明の様々な変更は、前述の説明および添付の図面か
ら当業者に明確となるであろう。このような変更は、添付された特許請求の範囲に含まれ
ることが意図される。
【０２９８】
本明細書中で引用されたすべての参考文献は、全体として参照により本明細書に組み込
まれ、ならびに、各々の個々の刊行物、特許または特許出願がすべての目的でその全体と
して参照により、具体的かつ個別に組み込まれるように指示されているのと同程度にすべ
ての目的で組み込まれる。いずれかの刊行物の引用は、出願日前のその開示を目的とし、
本発明が従来の発明のためにこのような刊行物に先行する資格がないという承認として解
釈されるべきではない。
【図１】
2019206532.tif 000044
【図２Ａ】
2019206532.tif 000045
【図２Ｂ】
2019206532.tif 000046
【図３】
2019206532.tif 000047
【図４】
2019206532.tif 000048
【図５】
2019206532.tif 000049
【図６】
2019206532.tif 000050
【図７】
2019206532.tif 000051
【図８】
2019206532.tif 000052
【図９】
2019206532.tif 000053
【図１０】
2019206532.tif 000054
【図１１】
2019206532.tif 000055
【配列表】
2019206532000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月2日(2019.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９８】
本明細書中で引用されたすべての参考文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれ、ならびに、各々の個々の刊行物、特許または特許出願がすべての目的でその全体として参照により、具体的かつ個別に組み込まれるように指示されているのと同程度にすべての目的で組み込まれる。いずれかの刊行物の引用は、出願日前のその開示を目的とし、本発明が従来の発明のためにこのような刊行物に先行する資格がないという承認として解釈されるべきではない。
本発明は次の実施態様を含む。
［１］
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、前記腫瘍細胞をヒト胎盤灌流液細胞と接触させることを含む方法。
［２］
前記腫瘍細胞が血液癌細胞である、上記［１］に記載の方法。
［３］
前記腫瘍細胞が固形癌細胞である、上記［１］に記載の方法。
［４］
前記腫瘍細胞が、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、大腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、大腸直腸癌細胞、大腸直腸腺癌細胞、または網膜芽細胞腫細胞である、上記［１］に記載の方法。
［５］
前記胎盤灌流液が、胎盤脈管構造のみを通過した灌流液である、上記［１］に記載の方法。
［６］
前記胎盤灌流液が、前記胎盤脈管構造を通過し、前記胎盤の母体側から回収される、上記［１］に記載の方法。
［７］
前記灌流液が、前記胎盤脈管構造に０．９％ＮａＣｌ溶液を通過させることによって取得される、上記［１］に記載の方法。
［８］
前記灌流液が培地を含む、上記［１］に記載の方法。
［９］
前記灌流液が、複数の赤血球を取り除くように処理されている、上記［１］に記載の方法。
［１０］
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの接触である、上記［１］に記載の方法。
［１１］
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの接触である、上記［１］に記載の方法。
［１２］
前記接触が、ヒトにおける接触である、上記［１１］に記載の方法。
［１３］
前記複数の胎盤灌流液細胞が、胎盤灌流液に由来する総有核細胞である、上記［１］に記載の方法。
［１４］
前記胎盤灌流液細胞が、少なくとも１つのタイプの細胞を取り除くように処理されている、上記［１］に記載の方法。
［１５］
前記胎盤灌流液細胞が、少なくとも１つのタイプの細胞を濃縮するように処理されている、上記［１］に記載の方法。
［１６］
前記胎盤灌流液細胞が、少なくとも約５０％のＣＤ５６+胎盤細胞を含む、上記［１］に記載の方法。
［１７］
前記ＣＤ５６+細胞が、ＣＤ５６コンジュゲートマイクロビーズによって選択される、上記［１６］に記載の方法。
［１８］
前記灌流液細胞および前記腫瘍細胞が、腫瘍細胞１個当たり約５個の灌流液細胞の比率で接触される、上記［１］に記載の方法。
［１９］
前記灌流液細胞および前記腫瘍細胞が、腫瘍細胞１個当たり約１０個の灌流液細胞の比率で接触される、上記［１］に記載の方法。
［２０］
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、前記腫瘍細胞を複数のＣＤ５６+、ＣＤ１６-胎盤中間ナチュラルキラー（ＰＩＮＫ）細胞と接触させることを含む方法。
［２１］
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる、上記［２０］に記載の方法。
［２２］
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる、上記［２０］に記載の方法。
［２３］
前記接触が、ヒトにおいて生じる、上記［２２］に記載の方法。
［２４］
前記腫瘍細胞が、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、大腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、大腸直腸癌細胞、大腸直腸腺癌細胞、または網膜芽細胞腫細胞である、上記［２０］に記載の方法。
［２５］
前記ＰＩＮＫ細胞が、マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａのうち１つまたは複数を、末梢血ナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に高いレベルで発現する、上記［２０］に記載の方法。
［２６］
免疫調節化合物と接触しなかった同等数のＰＩＮＫ細胞よりも検出可能な程度に多くのグランザイムＢを前記ＰＩＮＫ細胞が発現するのに十分な量で十分な時間、前記ＰＩＮＫ細胞を前記免疫調節化合物と接触させる、上記［２０］に記載の方法。
［２７］
前記免疫調節化合物が、レナリドマイドまたはポマリドマイドである、上記［２６］に記載の方法。
［２８］
免疫調節化合物と接触しなかった同等数のＰＩＮＫ細胞よりも検出可能な程度に大きな前記腫瘍細胞に対する細胞傷害性を前記ＰＩＮＫ細胞が示すのに十分な量で十分な時間、前記ＰＩＮＫ細胞を前記免疫調節化合物と接触させる、上記［２０］に記載の方法。
［２９］
前記免疫調節化合物が、レナリドマイドまたはポマリドマイドである、上記［２８］に記載の方法。
［３０］
前記ＰＩＮＫ細胞が、前記免疫調節化合物と接触しなかった同等数のＰＩＮＫ細胞より高いレベルで、ＢＡＸ、ＣＣＬ５、ＣＣＲ５、ＣＳＦ２、ＦＡＳ、ＧＵＳＢ、ＩＬ２ＲＡ、またはＴＮＦＲＳＦ１８のうち１つまたは複数を発現する、上記［２６］または［２６］に記載の方法。
［３１］
前記ＰＩＮＫ細胞が、前記免疫調節化合物と接触しなかった同等数のＰＩＮＫ細胞より高いレベルで、ＡＣＴＢ、ＢＡＸ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＲ５、ＣＳＦ１、ＣＳＦ２、ＥＣＥ１、ＦＡＳ、ＧＮＬＹ、ＧＵＳＢ、ＧＺＭＢ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＬＴＡ、ＰＲＦ１、ＰＴＧＳ２、ＳＫＩ、およびＴＢＸ２１のうち１つまたは複数を発現する、上記［２６］または上記［２８］に記載の方法。
［３２］
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、前記腫瘍細胞を混合ナチュラルキラー細胞と接触させることを含み、前記混合ナチュラルキラー細胞が、胎盤灌流液から単離されたナチュラルキラー細胞、および臍帯血から単離されたナチュラルキラー細胞を含み、前記臍帯血が、前記胎盤灌流液が取得された胎盤から単離される方法。
［３３］
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる、上記［３２］に記載の方法。
［３４］
前記接触が、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる、上記［３２］に記載の方法。
［３５］
前記接触が、ヒトにおいて生じる、上記［３４］に記載の方法。
［３６］
前記腫瘍細胞が、原発性腺管癌細胞、白血病細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、慢性骨髄リンパ腫（ＣＭＬ）細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞、肺癌細胞、大腸腺癌細胞、組織球性リンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、大腸直腸癌細胞、大腸直腸腺癌細胞、または網膜芽細胞腫細胞である、上記［３２］に記載の方法。
［３７］
前記混合ナチュラルキラー細胞が、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３-ＣＤ５６+ＣＤ１６-ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３-ＣＤ５６+ＣＤ１６+ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３-ＣＤ５６+ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３+ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫｐ４６+ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫｐ３０+ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３-ＣＤ５６+２Ｂ４+ナチュラルキラー細胞、または
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３-ＣＤ５６+ＣＤ９４+ナチュラルキラー細胞
を含む、上記［３２］に記載の方法。
［３８］
前記ナチュラルキラー細胞が培養されていない、上記［３７］に記載の方法。
［３９］
前記混合ナチュラルキラー細胞が、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に少数のＣＤ３-ＣＤ５６+ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３+ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫｐ４６+ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫｐ４４+ナチュラルキラー細胞、
末梢血に由来する同等数のナチュラルキラー細胞よりも検出可能な程度に多数のＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫｐ３０+ナチュラルキラー細胞を含む、上記［３２］に記載の方法。
［４０］
前記ナチュラルキラー細胞が培養されている、上記［３９］に記載の方法。
［４１］
前記ナチュラルキラー細胞が、約２１日間培養されている、上記［４０］に記載の方法。
［４２］
単離されたＣＤ５６+、ＣＤ１６-ナチュラルキラー細胞を含む組成物であって、前記ナチュラルキラー細胞が胎盤灌流液から単離され、前記ナチュラルキラー細胞が前記組成物中の細胞の少なくとも５０％を占める組成物。
［４３］
前記ナチュラルキラー細胞が、前記組成物中の細胞の少なくとも８０％を占める、上記［４２］に記載の組成物。
［４４］
前記組成物が、単離されたＣＤ５６+、ＣＤ１６+ナチュラルキラー細胞を含む、上記［４２］に記載の組成物。
［４５］
前記ＣＤ５６+、ＣＤ１６+ナチュラルキラー細胞が、前記ＣＤ５６+、ＣＤ１６-ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来する、上記［３２］に記載の組成物。
［４６］
前記ナチュラルキラー細胞が、単一の個体に由来する、上記［３０］に記載の組成物。
［４７］
前記単離されたナチュラルキラー細胞が、少なくとも２つの異なる個体に由来するナチュラルキラー細胞を含む、上記［３０］に記載の組成物。
［４８］
単離された胎盤灌流液を含む、上記［３０］に記載の組成物。
［４９］
前記胎盤灌流液が、前記ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来する、上記［３６］に記載の組成物。
［５０］
前記胎盤灌流液が、前記ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来する胎盤灌流液を含む、上記［３６］に記載の組成物。
［５１］
胎盤灌流液細胞を含む、上記［３０］に記載の組成物。
［５２］
前記胎盤灌流液細胞が、前記ナチュラルキラー細胞と同じ個体に由来する、上記［３９］に記載の組成物。
［５３］
前記胎盤灌流液細胞が、前記ナチュラルキラー細胞とは異なる個体に由来する、上記［３９］に記載の組成物。
［５４］
単離された胎盤灌流液および単離された胎盤灌流液細胞を含み、前記単離された灌流液および前記単離された胎盤灌流液細胞が異なる個体に由来する、上記［３０］に記載の組成物。
［５５］
前記胎盤灌流液が、少なくとも２つの個体に由来する胎盤灌流液を含む、上記［３６］に記載の組成物。
［５６］
前記胎盤灌流液細胞が、少なくとも２つの個体に由来する、上記［３９］に記載の組成物。
【外国語明細書】
2019206532000001.pdf