(57)【要約】      （修正有）【課題】人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの脱分化したリプログラミングされた細胞から導出された細胞組成物の提供。【解決手段】内分泌細胞亜集団および非内分泌細胞亜集団を含む膵臓前駆細胞集団であって、前記細胞集団は、有効量の成長因子を含む培地中の脱分化したリプログラミング化ヒト多能性幹細胞に由来するものであり、前記成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーリガンドまたは線維芽細胞成長因子であり、前記細胞集団の少なくとも３０％が前記非内分泌細胞亜集団である、細胞集団。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された分化した細胞およびＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉細胞集団。
【請求項２】
ＥＲＲＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質がＥＧＦ成長因子またはリガンドを含む、請求項１に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
【請求項３】
ＥＧＦ成長因子またはリガンドが、ヘレグリン−１、ヘレグリン−２およびヘレグリン−３およびヘレグリン−４からなる群から選択されるヘレグリンアイソフォームを含む、請求項２に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
【請求項４】
ヘレグリンアイソフォームがヘレグリン−１およびヘレグリン−４を含む、請求項３に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
【請求項５】
リガンドヘレグリンアイソフォームがヘレグリン−４を含む、請求項３に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
【請求項６】
インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された前腸内胚葉細胞培養物をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の亜集団をｉｎ  ｖｉｖｏで成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
【請求項７】
前腸内胚葉細胞培養物をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアント、それらの誘導体およびそれらの発現ベクターからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１およびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、
ｂ．ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステップ（ａ）の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、それにより前腸内胚葉細胞を生成するステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｄ．ステップ（ｃ）の細胞亜集団をｉｎ  ｖｉｖｏで成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
非内分泌細胞がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
内分泌細胞がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞がＮＫＸ６．１をさらに発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアント、それらの誘導体およびそれらの発現ベクターからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年２月６日に出願された米国特許出願第１３／７６１，０７８号、表題ＣＥＬＬ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤ  ＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤ  ＣＥＬＬＳの優先権を主張し、それは、２０１０年４月２２日に出願された米国特許出願第１２／７６５，７１４号、表題ＣＥＬＬ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤ  ＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤ  ＣＥＬＬＳの一部継続出願であり、それは、米国特許法第１１９（ｅ）条の下で、２００９年４月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／１７１，７５９号、表題ＣＥＬＬ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＤＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＥＤ  ＲＥＰＲＯＧＲＡＭＭＥＤ  ＣＥＬＬＳの優先権を主張する非仮出願であり、それらの開示は参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、２０１３年１月２８日に作成された、ＣＹＴＨＥＲＡ０６８Ｐ１．ＴＸＴという名称のサイズが８．９２Ｋｂのファイルで提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、一般に、細胞培養物の単離、維持および使用に関する。より具体的には、本発明は、人工多能性幹細胞から導出された細胞組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
多能性細胞の重要な用途は、細胞療法でのそれらの使用である。多能性幹細胞には、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞が含まれるが、これらに限定されない。さらに他のタイプの多能性細胞が存在し、例えば、脱分化したマウスおよびヒトの幹細胞、すなわち分化した体性成体細胞は脱分化して多能性様幹細胞になる。ＥＳ細胞に類似した多能性および成長能力を有する細胞を確立するために誘導されるこれらの脱分化した細胞は、「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」、「胚性幹細胞様細胞」、「ＥＳ様細胞」またはそれらの同等物とも呼ばれる。そのような細胞は、潜在的に存続可能な代替多能性細胞である。ｉＰＳ細胞の治療的適用には、糖尿病および他の疾患を治療するための前臨床研究でこれらの細胞が安定であり、適当な安全性プロファイルを示すことを実証することが必要である。多能性状態への分化したヒト体性細胞のリプログラミングは、患者および疾患特異的幹細胞を可能にする。Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．らＣｅｌｌ、１〜１２、２００７およびＪｕ，Ｊ．らＳｃｉｅｎｃｅ  ２００７を参照されたい。ＴａｋａｈａｓｈｉらおよびＪｕらは、ｉＰＳ細胞を生成するために４つの遺伝子を成体および胎児／新生児の線維芽細胞に各々導入した：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−ｍｙｃ、Ｔａｋａｈａｓｈｉら；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８、Ｊｕら。いずれの場合にも、ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳ細胞形態、マーカー発現、長期にわたる増殖、正常な核型および多能性などの、ｈＥＳ細胞の一部の特徴を有していた。
【０００５】
ｉＰＳ細胞は関連する倫理論争なしで細胞療法に基づく再生医療を提供することができるが、ｉＰＳ細胞の分化特性、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化潜在能力および分化効率はなお不明であり、ｉＰＳ細胞のための指向性分化方法は実証されていない。したがって、ｉＰＳ細胞の詳細な分化特性および指向性分化効率を判定し、実証する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書に記載される実施形態は、多能性細胞、例えば人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの脱分化したリプログラミングされた細胞から導出された細胞組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％は胚体内胚葉細胞であり、胚体細胞は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、胚体内胚葉細胞は、それから導出される腸管または器官の細胞に分化することができる多分化能細胞である。
【０００８】
別の実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％は膵臓−十二指腸ホメオボックス因子１（ＰＤＸ１）陽性の前腸内胚葉細胞であり、ＰＤＸ１陽性の前腸内胚葉細胞は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、ＰＤＸ１陽性の前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＰＲＯＸ１およびＨＮＦ６に関して共陽性である。
【０００９】
さらなる実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％は膵臓−十二指腸ホメオボックス因子１（ＰＤＸ１）陽性の膵臓前駆細胞であり、ＰＤＸ１陽性の膵臓前駆細胞は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、ＰＤＸ１陽性の膵臓前駆細胞は、ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１に関して共陽性である。
【００１０】
さらなる別の実施形態は、ヒト細胞を含む組成物およびヒト細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物を作製する方法を提供し、ヒト細胞の少なくとも約１５％はＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３（ＮＧＮ３）陽性の内分泌先駆細胞であり、ＮＧＮ３内分泌先駆細胞は脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される。一態様では、ＮＧＮ３陽性の内分泌先駆細胞は、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４およびＮＫＸ２．２に関して共陽性である。
本明細書に記載される細胞培養組成物のさらなる実施形態は、脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された分化した細胞およびＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉細胞培養物を含む。
本明細書に記載される追加の実施形態は、インスリンを生成する方法に関する。一部のそのような実施形態では、この方法は、（ａ）脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された少なくとも前腸内胚葉細胞培養物および／または少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞培養物をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む膵臓内胚葉細胞集団を生成するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の膵臓内胚葉細胞集団またはステップ（ａ）の細胞亜集団をｉｎ  ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する、ステップとを含む。
本明細書に記載されるさらなる他の実施形態は、インスリンを生成する方法であって、（ａ）脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、（ｂ）ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステップ（ａ）の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、それにより、少なくとも前腸内胚葉細胞および／または少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を生成するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の細胞集団またはステップ（ｃ）の細胞亜集団をｉｎ  ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する、ステップとを含む方法に関する。本明細書に記載されるさらに他の実施形態は、少なくとも前腸内胚葉細胞、少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞および／または少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む集団を、ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟することが可能な細胞集団を生成することに関する。
本明細書に記載されるさらに他の実施形態は、少なくとも前腸内胚葉細胞、少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞および／または少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む集団を、ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させ、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟することが可能な細胞集団を生成することに関する。
本明細書で使用される場合、語句「少なくとも前腸内胚葉細胞」、「少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」および「少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞」は、細胞集団の細胞のいくつかまたは一部が、膵島細胞へのそれらの分化の中で、ｉＰＳＣから前腸内胚葉細胞またはそれ以上、ｉＰＳＣからＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞またはそれ以上、および／またはｉＰＳＣからＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞またはそれ以上に分化していることを意味する。
本明細書で使用される場合、細胞集団の細胞に言及するとき、語句「いくつか」および／または「一部」は、細胞集団が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９５％を超える指定された細胞型の細胞を含むことを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】脱分化したリプログラミングされた細胞、または本明細書でｉＰＳ細胞とも呼ばれる細胞の凝集懸濁培養の写真画像である。
【００１２】
【図２Ａ−Ｌ】ＯＣＴ４（図２Ａ）、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ（図２Ｂ）、ＣＥＲ１（図２Ｃ）、ＧＳＣ（図２Ｄ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ１（図２Ｆ）、ＨＮＦ６（図２Ｇ）、ＰＤＸ１（図２Ｈ）、ＰＴＦ１Ａ（図２Ｉ）、ＮＫＸ６．１（図２Ｊ）、ＮＧＮ３（図２Ｋ）およびＩＮＳ（図２Ｌ）の相対的な遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子、サイクロフィリンＧおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現の平均発現レベルに標準化される。グラフは、データセット中の最も低いデータポイントからの上方制御倍率を表す。
【００１３】
【図３Ａ−３Ｄ】（３Ａ）ＰＤＸ−１；（３Ｂ）ＮＫＸ６．１；（３Ｃ）ＰＴＦ１Ａ；および（３Ｄ）Ｄａｐｉに特異的な抗体を使用したステージ４分化からのヒトｉＰＳ細胞培養物の免疫細胞化学（ＩＣＣ）の顕微鏡写真である。
【００１４】
【図４Ａ−４Ｄ】（図４Ａ）グルカゴン、（図４Ｂ）インスリン、（図４Ｃ）ソマトスタチンおよび（図４Ｄ）Ｄａｐｉに特異的なリガンドを使用した、ステージ４分化からのｉＰＳ細胞培養の免疫細胞化学（ＩＣＣ）の写真である。
【図５Ａ−Ｂ】Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓからのＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ヒトホスホＲＴＫ抗体アレイで提供されるアレイ位置図およびアレイキーを示す図である。図５Ａの位置図は、ＲＴＫ抗体の座標または位置を示す。ＲＴＫファミリーおよび抗体のアイデンティティまたは名前は、図５Ｂのキーに記載される。したがって、現像したフィルムで観察される陽性シグナルは、図５Ａのように透明画をオーバレイし、図５ＢのＲＴＫの名前でオーバレイ（図５Ａ）の上の座標を参照することによってシグナルを同定することによって、同定することができる。
【図６Ａ−Ｄ】４つの異なる条件（実施例５に記載されるように、図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）下のｉＰＳ細胞導出膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）のＲＴＫアレイ分析を示す図である。特定のＲＴＫのチロシンリン酸化が、高強度から低強度のシグナルの同定によって観察される。ＩＧＦ  １Ｒ／ＩＲおよびＥＲＢＢ（ＥＧＦＲ）ファミリーメンバーが同定されるか、四角で囲まれる。
【図７Ａ−Ｃ】表９に示すように、実験Ｅ２３１４、Ｅ２３５６およびＥ２３８０（図７Ａ）、Ｅ２３４７（図７Ｂ）ならびにＥ２３５４（図７Ｃ）の移植されたマウスの血清中のヒトＣペプチドおよびインスリンの濃度を示すグラフである。空腹時、ならびに腹腔内グルコース投与の３０分および６０分後に、ヒトＣペプチドの血清レベルについてＰＥＣを移植したマウスを指示された移植後時点で分析した。図７Ｃで、細胞封入デバイス（Ｅｎｃａｐｔｒａ（登録商標）ＥＮ２０またはＥＮ２０、ＶｉａＣｙｔｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でＰＥＣを封入し、一部の場合には、デバイスは微穿孔を有した（ｐＥＮ２０、ＶｉａＣｙｔｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。そのようなデバイスは、米国特許第８，２７８，１０６号に記載され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【図８Ａ−８Ｂ】実験＃２３４７のＳＴＺ処置マウスの血中グルコース分析の結果を示すグラフである。図８Ａは、１３匹の各マウスの血中グルコースを示し（ヘレグリンの有る無しによるベースライン）、図８Ｂは、各処置の合わせた平均測定値を示す（ヘレグリンの有る無しによるベースライン）。ＳＴＺによる処置（０日目）の最大１４日前までにｉＰＥＣ移植片を移植した１３匹のマウスについて、同じマウスについてＳＴＺ処置の後、および移植片を外植した後の、ランダムな非絶食血中グルコースレベルの測定値を示す。ＳＴＺ処置動物は、移植片の移植から約２６週後にＳＴＺを与えられた（０日目）。移植片移植から２８週後、ＳＴＺ処置の開始からおよそ２週後に、ｉＰＥＣ移植片を外植した（取り出した）。各動物につき、非絶食血中グルコース測定値を経時的に収集した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、本明細書に含まれる本発明の好ましい実施形態および実施例の以下の詳細な説明を参照することによって容易に理解することができる。しかし、本化合物、組成物、および方法の開示および記載の前に、本発明は、特定の細胞型、特定のフィーダー細胞層、特定の条件、または特定の方法などに限定されず、それ自体変わり得ることが理解されるべきである。多数の改変および変形が当業者には明らかであろう。本明細書において使用される用語は、単に特定の実施形態を記載するためのものであり、限定的なものではないことも理解されるべきである。
【００１６】
定義
本明細書で表される数値範囲は、記載されている終点を含み、示された数値範囲の終点間の全ての整数を記載するものであることが理解されよう。
【００１７】
特に断りのない限り、本明細書で使用される用語は、当業者による従来の使用に従って理解される。また、本明細書および添付の特許請求の範囲の目的に関して、別段に特定されていない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の分量、材料の百分率または割合、反応条件を表す数、および他の数値は全て、全ての場合に「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、それに反する指示がない限り、以下の明細書および添付されている特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得られるべき所望の性質に応じて変動し得る近似値である。最低限、かつ特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとするものではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告されている有意な桁数に照らして、および通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。
【００１８】
本明細書に記載の実施形態の実施には、別段に特定されていない限り、細胞生物学、分子生物学、遺伝学、化学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法が使用される。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数形が含まれることを理解するべきである。したがって、例えば、「細胞」への言及には１つまたは複数のそのような異なる細胞が含まれ、「方法」への言及には、本明細書に記載される方法に代えて改変または置換することができる、当業者に公知である同等のステップおよび方法への言及が含まれる。
【００２０】
「細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、個々の細胞、細胞系、またはそのような細胞から導出される培養物を指す。「培養物」とは、同じまたは異なる種類の単離された細胞を含む組成物を指す。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「全能性幹細胞」という句は、卵細胞と精子細胞の融合から生成する細胞などの、生物体を構成する全ての細胞に分化する能力を有する細胞を指す。受精卵の最初の数回の分裂によって生成する細胞も全能性であり得る。これらの細胞は、胚および胚体外細胞系列に分化することができる。例えばＥＳ細胞などの多能性幹細胞は、いかなる胎児または成体の細胞型も生じ得る。しかし、これらは、胚体外組織に発達する能力を欠くので、単独では胎児または成体動物に発達することはできない。胚体外組織は、一部において、胚体外内胚葉から導出され、遠位内胚葉（ｐａｒｉｅｔａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ライヘルト膜）および近位内胚葉（ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（卵黄嚢の一部を形成する）にさらに分類することができる。遠位内胚葉および近位内胚葉はどちらも胚の発生を支持するが、それら自体は胚構造を形成しない。胚体外中胚葉および胚体外外胚葉を含めた他の胚体外組織も存在する。
【００２２】
一部の実施形態では、「多能性細胞」を、内胚葉系列、より詳細には、膵臓内胚葉型細胞に分化させるための出発材料として使用する。本明細書で使用される場合、「多能性」または「多能性細胞」またはその等価物とは、細胞培養物中で増殖することができ、かつ多分化能の性質を示す種々の系列限定的な細胞集団に分化することができる細胞を指し、例えば、多能性ＥＳ細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞はどちらも、３種の胚細胞系列のそれぞれを生じ得る。しかし、多能性細胞は、生物体全体を生成することはできない場合がある。すなわち、多能性細胞は全能性ではない。
【００２３】
ある特定の実施形態では、出発材料として使用される多能性細胞は、ｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞、さらには単為発生細胞などを含めた幹細胞である。本明細書で使用される場合、「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、単一の接合体から始まり、もはや発生した配偶子細胞以外の多能性または全能性細胞を含まない多細胞構造で終わる生物体の様々な発生ステージを指す。「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」という用語は、配偶子融合によって導出された胚に加えて、体細胞核移植によって導出された胚も指す。さらに別の実施形態では、多能性細胞は胚から導出されたまたは直接導出されたものではなく、例えば、ｉＰＳ細胞は、非多能性細胞、例えば多分化能細胞または最終分化した細胞から導出されたものである。
【００２４】
ヒト多能性幹細胞は、分化を導く遺伝子の抑制および多能性の維持を確実にするコア調節複合体を形成する転写因子Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ−２などのいくつかの転写因子および細胞表面タンパク質、ならびに糖脂質ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびケラタン硫酸抗原、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１などの細胞表面抗原が存在すると定義または特徴付けることもできる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」または「ｉＰＳＣ」という句は、非多能性細胞、一般には成体の体細胞、または、例えば線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などの最終分化した細胞から、リプログラミング因子と称される特定の遺伝子または遺伝子産物を挿入することによって人工的に調製された多能性幹細胞の一種を指す。その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、１３１：８６１−８７２（２００７）；Ｗｅｒｎｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ、４４８：３１８−３２４（２００７）；Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、４５１：１４１−１４６（２００８）を参照されたい。人工多能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞などの天然のヒト多能性幹細胞と、ある特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚葉体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、ならびに発生能および分化可能性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ）を含めた多くの点で実質的に類似している。ヒトｉＰＳ細胞により、胚の使用を伴うことなく多能性幹細胞の供給源がもたらされる。
【００２６】
ｉＰＳ細胞を生成するために様々な方法を用いることができ、それらは本明細書において下でさらに詳細に記載される。しかし、全ての方法は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇおよび任意選択でＬｉｎ−２８をコードする発現カセット、またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｋｌｆ４および任意選択でｃ−ｍｙｃをコードする発現カセット、またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ−４および任意選択でＥｓｒｒｂをコードする発現カセットなどの特定のリプログラミング因子を用いる。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じリプログラミングベクター、または異なるリプログラミングベクターの中にあってもよい。Ｏｃｔ−３／４およびＳｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３およびＳｏｘ−１５）は、その不在により誘導を不可能にする、誘導プロセスに関与する大事な転写制御因子である。Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）は八量体（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーの１つであり、多能性の維持で重要な役割をする。例えば、通常Ｏｃｔ−３／４＋の細胞、例えば割球および胚性幹細胞中のＯｃｔ−３／４の不在は、自発的な栄養芽細胞分化につながり、一方、Ｏｃｔ−３／４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化潜在能力をもたらす。さらに、「Ｏｃｔ」ファミリーの他の遺伝子、例えばＯｃｔ１およびＯｃｔ６は多能性を誘導せず、したがって、この多能性誘導プロセスはＯｃｔ−３／４に帰することができる。Ｏｃｔ−３／４に類似の多能性の維持に関連する遺伝子の別のファミリーは、Ｓｏｘファミリーである。しかし、Ｓｏｘファミリーは多能性細胞型に限定的でなく、多分化能および単能性幹細胞にも関連する。Ｓｏｘファミリーは誘導プロセスでも働くことが見出されている。上記Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６による初期研究では、Ｓｏｘ２が使用された。それ以来、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８遺伝子によってもｉＰＳ細胞が生成されている。Ｋｌｆファミリーの遺伝子（Ｋｌｆ−１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５）のＫｌｆ４は、当初はマウスｉＰＳ細胞の生成の因子として、上記Ｙａｍａｎａｋａら２００６によって同定された。本明細書において、Ｓ．ＹａｍａｎａｋａからのヒトｉＰＳ細胞は、ｈＩＰＳ細胞の細胞療法適用を探索するために使用した。しかし、上記Ｙｕら２００７は、Ｋｌｆ４が必要とされないこと、および実際ヒトｉＰＳ細胞を生成することができなかったことを報告した。Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２およびＫｌｆ５を含むＫｌｆファミリーの他のメンバーは、ｉＰＳ細胞を生成することが可能である。最後に、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃ）、がんと結びつけられているがん原遺伝子；ｃ−ｍｙｃは、マウスおよびヒトのｉＰＳ細胞の生成と結びつけられた因子であったが、上記Ｙｕら（２００７）は、ｃ−ｍｙｃがヒトｉＰＳ細胞の生成のために必要とされなかったことを報告した。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「多分化能」または「多分化能細胞」またはその等価物は、限られた数の他の特定の細胞型を生じさせることができる細胞型を指す。すなわち、多分化能細胞は１つまたは複数の胚細胞の運命に傾倒し、したがって、多能性細胞とは対照的に、３種の胚細胞系列のそれぞれ、ならびに胚体外細胞を生じさせることができない。多分化能体細胞は、多能性細胞よりも分化しているが、最終分化はしていない。したがって、多能性細胞の発生能は多分化能細胞よりも高い。体細胞をリプログラミングすることまたはｉＰＳ細胞を生じさせるために使用することができる発生能決定因子としては、これだけに限定されないが、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ＦｏｘＤ３、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｒｅｘｌ、ＺＮＦ２０６、Ｓｏｘｌ５、Ｍｙｂｌ２、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ＤＰＰＡ２、ＥＳＧ１、Ｏｔｘ２またはこれらの組合せなどの因子が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質」としては、これだけに限定されないが、ＥＲＢＢ受容体に結合する少なくとも１６種の異なるＥＧＦファミリーリガンド：ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＧまたはＡＲＥＧ（アンフィレギュリン）、およびＴＧＦ−アルファ（形質転換成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合性ＥＧＦ）、およびＥｒｅｇ（エピレギュリン））、ニューレグリン−１、−２、−３および−４（またはヘレグリン−１、−２、−３および−４などのニューグレリン（またはヘレグリン）が挙げられる。しかし、本発明では、４種のＥＲＢＢ受容体のいずれか１つまたはこれらの組合せに結合して、内因性キナーゼドメインの活性化およびその後のリン酸化を導くホモ二量体受容体複合体およびヘテロ二量体受容体複合体の形成を誘導することができる任意のリガンドが意図されている。表１１も参照されたい。
本明細書に記載されるインスリンの生成方法の一部の実施形態は、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌するインスリン生成細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで成熟することができる膵臓内胚葉細胞を動物に提供することによって、糖尿病の動物を処置するか、動物の血液中のグルコース濃度を制御することを含むことができる。
【００２８】
本明細書に記載される一態様は、適当な条件の下で培養されるときに異なる細胞系統に選択的に、および一部の態様では選択的、可逆的に発達することが可能である、多能性または先駆細胞の集団を含む。本明細書で使用される場合、「集団」という用語は、同じ識別特徴を有する複数の細胞の細胞培養物を指す。「細胞系列」という用語は、最も早期の先駆細胞から完全成熟細胞（すなわち特殊化した細胞）までの細胞型の発達の全ステージを指す。「先駆細胞」または「前駆細胞」とは、細胞分化経路内の、より成熟した細胞に分化することができる任意の細胞であってよい。そのように、先駆細胞は、多能性細胞であってもよく、部分的に分化した多分化能細胞または可逆的に分化した細胞であってもよい。「先駆細胞集団」という用語は、より成熟または分化した細胞型に発達することができる細胞の群を指す。先駆細胞集団は、多能性の細胞、幹細胞系列に制限された細胞（すなわち、外胚葉系列の全てには発達できない細胞、または、例えばニューロン系列の細胞にのみ発達することができる細胞）、および可逆的に幹細胞系列に制限された細胞を含み得る。したがって、「前駆細胞」または「先駆細胞」という用語は、「多能性細胞」または「多分化能細胞」であり得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「リプログラミング」、「リプログラミングされた」という用語またはそれと同等の用語は、培養またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、リプログラミングなしで同じ条件下でそれが有するであろう能力よりも測定可能な程度高い、少なくとも１つの新しい細胞型の後代を形成する能力を細胞に付与するプロセスを指す。本明細書に記載される特定の実施形態では、体細胞は、多能性細胞に「リプログラミングされる」。特定の態様では、十分な増殖の後に、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養において、測定可能な程度の割合の細胞が新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示するとき、体細胞はリプログラミングされている。リプログラミングなしでは、そのような体細胞は、新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示する後代を生成しないだろう。リプログラミングなしでも体細胞が新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示する後代を生成することができた場合は、これらの体細胞からの新しい多能性細胞型の表現型の特徴を提示する後代の割合は、リプログラミング前よりも測定可能な程度高い。
【００３０】
本明細書で使用される場合、語句「分化プログラミング」は、培養またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、分化リプログラミングなしで同じ条件下でそれが有するであろうよりも、新しい分化状態の少なくとも１つの新しい細胞型の後代を形成するように細胞を変化させるプロセスを指す。このプロセスには、分化、脱分化および分化転換が含まれる。したがって、本明細書で使用される場合、語句「分化」は、より特殊化していない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスを指す。対照的に、語句「脱分化」は、部分的または最終的に分化した細胞がより初期の発達段階、例えば多能性または多分化能を有する細胞に戻る細胞プロセスを指す。さらに対照的に、語句「分化転換」は、１つの分化細胞型を別の分化細胞型に転換するプロセスを指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「多能性細胞から発達する」、「多能性細胞から分化する」、「多能性細胞から成熟する」または「多能性細胞から生成する」、「多能性細胞から導出された」、「多能性細胞から分化する」という用語および等価の表現は、例えば、その開示が参照により本明細書に完全に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５５３６号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳ」に記載の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて移植されたＰＤＸ１膵臓内胚葉細胞から成熟する内分泌細胞の場合では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて多能性細胞から分化した細胞型が生成することを指す。そのような用語は全て、少なくとも２種の異なる細胞系列に分化する潜在性を有するステージから特殊化および最終分化した細胞になるまでの細胞の進行を指す。そのような用語は、本出願の目的に関して互換的に使用することができる。本明細書に記載の実施形態では、そのような分化を可逆的なものにし、したがって、多能性または少なくとも２種以上の細胞系列に分化する能力を選択的に取り戻すことができるような培養条件が意図されている。
【００３２】
「フィーダー細胞」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長し、少なくとも１種の因子を細胞培養中に分泌し、また、培養物中の別の目的の細胞の成長を支持するために使用することができる細胞培養物を指す。本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞層」は、「フィーダー細胞」という用語と互換的に使用され得る。フィーダー細胞は、培養皿の表面がフィーダー細胞で、重なり合って増幅する前の完全な層で覆われた単層を含んでもよく、細胞のクラスターを含んでよい。好ましい実施形態では、フィーダー細胞は、接着性の単層を含む。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「クラスター」、「凝集塊」または「凝集体」という用語は互換的に使用することができ、単細胞に解離していない一群の細胞を一般に指す。クラスターは、より小さいクラスターに解離することができる。この解離は本来一般的に手動である（例えば、パスツールピペットを使用する）が、他の解離手段が企図される。凝集懸濁多能性または多分化能細胞培養物は、実質的に、国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬ  ＣＥＬＬＳおよびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２３５６、表題ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ  ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  ＴＨＥＲＥＯＦに記載されている通りであり、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００３４】
同様に、多能性細胞培養物または多能性凝集懸濁培養物をフィーダー細胞の使用を伴わない規定された条件において成長させる実施形態は「フィーダーフリー」である。フィーダーフリー培養方法では、多能性細胞培養物のスケーラビリティおよび再現性が増し、例えばフィーダー細胞または他の動物を供給源とする培養物構成成分に由来する感染因子によるコンタミネーションのリスクが低下する。フィーダーフリー方法は、Ｂｏｄｎａｒらに対する米国特許第６，８００，４８０号（Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに譲渡された）にも記載されている。しかし、米国特許第６，８００，４８０号特許とは対照的に、本明細書に記載の実施形態は、多能性細胞培養物、多分化能細胞培養物または分化した細胞培養物のいずれであるかにかかわらず、フィーダーフリーであり、内在性または外因性の細胞外マトリックスをさらに含有しない；すなわち、本明細書に記載の培養物は、フィーダーフリーであるだけでなく、細胞外マトリックスフリーでもある。例えば、米国特許第６，８００，４８０号では、線維芽細胞を培養し、線維芽細胞をｉｎ  ｓｉｔｕで溶解し、次いで、溶解後に残ったものを洗浄することによって細胞外マトリックスが調製される。あるいは、米国特許第６，８００，４８０号では、コラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンから選択される単離されたマトリックス構成成分または構成成分の組合せからも細胞外マトリックスが調製され得る。本明細書に記載の実施形態では、フィーダー層または線維芽細胞層を成長させ、細胞を溶解して細胞外マトリックスを生成することによって細胞外マトリックスを生成することもなく、最初にコラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンから選択される細胞外マトリックス構成成分または細胞外マトリックス構成成分の組合せを用いて組織培養容器をコーティングする必要もない。したがって、多能性細胞、多分化能細胞および分化した細胞用の本明細書に記載の凝集懸濁培養物には、外因的に添加された細胞外マトリックスまたはマトリックス構成成分である細胞外マトリックスコーティングを生成するフィーダー層、溶解したフィーダー細胞または線維芽細胞は必要なく、参照により本明細書に完全に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＦＥＥＤＥＲ−ＦＲＥＥ  ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＭＥＤＩＡ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＨＵＭＡＮ  ＳＥＲＵＭに記載の通り、可溶性ヒト血清構成成分の使用により、フィーダー細胞またはフィーダー単層の必要性を克服し、同様に、フィーダー細胞もしくは線維芽細胞または外因的に添加された細胞外マトリックス構成成分に由来する内在性の細胞外マトリックスの必要性も克服される。
【００３５】
好ましい実施形態では、培養方法は、動物を供給源とする産物を含まない。別の好ましい実施形態では、培養方法はゼノフリーである。さらに好ましい実施形態では、本明細書に記載の培養方法はヒト細胞治療薬の商業的な製造のための１つまたは複数の条件または要件を満たすかまたはそれを上回っていた。
【００３６】
多能性細胞の集団をある特定の補足的な成長因子の存在下でさらに培養して、異なる細胞系列であるか、またはそれに発達することになる細胞の集団を得ることができ、または、異なる細胞系列に発達することが可能になるように選択的に逆行させることができる。「補足的な成長因子」という用語は、その最も広範な文脈で使用され、多能性細胞の成長を促進するため、細胞の生存を維持するため、細胞の分化を刺激するため、および／または、細胞の分化の逆行を刺激するために有効である物質を指す。さらに、補足的な成長因子は、フィーダー細胞からその培地中に分泌される物質であってよい。そのような物質としては、これだけに限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、小分子、中和抗体、およびタンパク質が挙げられる。成長因子は、細胞の発生および維持ならびに組織の形態および機能を制御する細胞間シグナル伝達ポリペプチドも含んでよい。好ましい実施形態では、補足的な成長因子は、幹細胞因子（ｓｔｅｅｌ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）（ＳＣＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）と可溶性インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）の組合せ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される。
【００３７】
本明細書に記載の細胞を生成するためのある特定のプロセスでは、成長因子を、添加後に細胞培養物または細胞集団から除去する。例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、またはＧＤＦ−１１などの成長因子を添加し、それらを添加してから約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内または約１０日以内に除去することができる。一部の実施形態では、分化因子を細胞培養物から除去することはしない。
【００３８】
分化プロセスの効率は、これだけに限定されないが、細胞の成長条件、成長因子濃度および培養ステップのタイミングを含めたある特定のパラメータを改変することによって調整することができるので、本明細書に記載の分化手順により、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９５％超の、人工多能性細胞を含む多能性細胞から多分化能細胞または分化した細胞、例えば、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞への変換をもたらすことができる。前原条（ｐｒｅｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ）細胞または中内胚葉細胞の単離を使用するプロセスでは、実質的に純粋な前原条細胞または中内胚葉細胞集団を回収することができる。
【００３９】
多能性幹細胞から導出された様々な細胞組成物が、本明細書に記載される。一実施形態は、ｉＰＳ細胞およびそれから導出された細胞を含む。本明細書に記載される実施形態に関連するが異なるさらに他のプロセスおよび組成物は、２００３年１２月２３日に出願の米国特許仮出願第６０／５３２，００４号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００４年４月２７日に出願の米国特許仮出願第６０／５６６，２９３号、表題ＰＤＸ１  ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００４年７月９日に出願の米国特許仮出願第６０／５８６，５６６号、表題ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ  ＣＥＬＬ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００４年７月１４日に出願の米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号、表題ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ  ＣＥＬＬ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００４年１２月２３日に出願の米国特許出願第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ、および２００５年４月２６日に出願の米国特許出願第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１  ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００５年６月２３日に出願の米国特許出願第１１／１６５，３０５号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＤＥＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＦＡＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＮＧ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００５年１０月２７日に出願の米国特許仮出願第６０／７３０，９１７号、表題ＰＤＸ１−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＤＯＲＳＡＬ  ＡＮＤ  ＶＥＮＴＲＡＬ  ＦＯＲＥＧＵＴ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００５年１１月１４日に出願の米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号、表題ＭＡＲＫＥＲＳ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００６年３月２日に出願の米国特許仮出願第６０／７７８，６４９号、表題ＩＮＳＵＬＩＮ−ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００６年７月２６日に出願の米国特許仮出願第６０／８３３，６３３号、表題ＩＮＳＵＬＩＮ−ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００６年１０月１８日に出願の米国特許仮出願第６０／８５２，８７８号、表題ＥＮＲＩＣＨＭＥＮＴ  ＯＦ  ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ  ＣＥＬＬＳ，ＩＭＭＡＴＵＲＥ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＩＳＬＥＴ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＭＡＴＵＲＥ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＩＳＬＥＴ  ＣＥＬＬＳ  ＵＳＩＮＧ  ＮＣＡＭ；２００６年１０月２７日に出願の米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＤＯＲＳＡＬ  ＡＮＤ  ＶＥＮＴＲＡＬ  ＦＯＲＥＧＵＴ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ；２００７年３月２日に出願の米国特許出願第１１／６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ  ＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００７年７月５日に出願の米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題Ｍ���ＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳ；２００７年９月１３日に出願の米国特許出願第６０／９７２，１７４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＦＯＲ  ＤＩＡＢＥＴＥＳ；２００７年９月２４日に出願の米国特許出願第１１／８６０，４９４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ；２００７年１０月３日に出願の米国特許出願第６０／９７７，３４９号、表題ＣＥＬＬ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＭＡＲＫＥＲＳ  ＯＦ  ＨＵＭＡＮ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ；および２００８年４月８日に出願の米国特許出願第１２／０９９，７５９号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳ；および２００８年４月２１日を出願の米国特許出願第１２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＡＮＤ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＣＥＬＬＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＯＲＭ  ＨＵＭＡＮＥ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳに見出すことができ、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００４０】
ｈＥＳ細胞から導出された内胚葉系列細胞を生成するための一般的な方法は、上記の関連する米国特許出願、ならびにＤ’Ａｍｏｕｒら、２００５  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１５３４−４１、およびＤ’Ａｍｏｕｒら、２００６  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（１１）：１３９２−４０１に記載され、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。Ｄ’Ａｍｏｕｒらにより、５段階の分化プロトコル：ステージ１（大部分は胚体内胚葉生成がもたらされる）、ステージ２（大部分はＰＤＸ１陰性前腸内胚葉生成がもたらされる）、ステージ３（大部分はＰＤＸ１陽性前腸内胚葉生成がもたらされる）、ステージ４（大部分は膵臓内胚葉または膵臓内分泌前駆体生成がもたらされる）およびステージ５（大部分はホルモン発現内分泌細胞生成がもたらされる）が記載されている。
【００４１】
「栄養外胚葉」という用語は、ＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現が、非栄養外胚葉細胞または細胞集団におけるＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢの発現レベルと比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。
【００４２】
「胚体外内胚葉」は、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子、ＴＨＢＤ遺伝子、ＳＰＡＲＣ遺伝子、ＤＡＢ１遺伝子、またはＡＦＰ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現レベルが、非胚体外内胚葉細胞または細胞集団におけるＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＴＨＢＤ、ＳＰＡＲＣ、ＤＡＢ１、またはＡＦＰの発現レベルと比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。
【００４３】
「前原条細胞」という用語は、ＦＧＦ８マーカー遺伝子および／またはＮＯＤＡＬマーカー遺伝子の発現レベルが、ＢＲＡＣＨＵＲＹ低、ＦＧＦ４低、ＳＮＡＩ１低、ＳＯＸ１７低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。
【００４４】
「中内胚葉細胞」という用語は、ｂｒａｃｈｙｕｒｙマーカー遺伝子、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＭＩＸＬ１および／またはＷＮＴ３マーカー遺伝子の発現レベルが、ＳＯＸ１７低、ＣＸＣＲ４低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して相対的に高い多分化能細胞を指す。
【００４５】
「胚体内胚葉（ＤＥ）」という用語は、腸管または腸管から導出された器官の細胞に分化することができる多分化能内胚葉系列細胞を指す。ある特定の実施形態によると、胚体内胚葉細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞はヒト細胞である。本発明の一部の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ある特定のマーカーを発現する、またはある特定のマーカーを有意に発現することができない。一部の実施形態では、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１から選択される１種または複数種のマーカーが胚体内胚葉細胞において発現される。他の実施形態では、ＯＣＴ４、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７およびＨＮＦ４アルファから選択される１種または複数種のマーカーが胚体内胚葉細胞において発現されないまたは有意には発現されない。胚体内胚葉細胞集団およびそれを生成する方法は、米国特許出願第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ、２００４年１２月２３日出願にも記載され、それは本明細書に完全に組み込まれる。
【００４６】
さらに他の実施形態は、「ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」または「前腸内胚葉細胞」と呼ばれる細胞培養物、またはその同等物に関する。一部の実施形態では、前腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１β（ＨＮＦ１Ｂ）、ＨＮＦ４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）およびＦＯＸＡ１マーカーを発現するが、ＰＤＸ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７またはＳＯＸ１を実質的に発現しない。ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団およびその生成方法も、２００６年１０月２７日に出願の米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｄｏｒｓａｌ  ａｎｄ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｆｏｒｅｇｕｔ  ｅｎｄｏｄｅｒｍに記載され、それは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００４７】
本明細書に記載される他の実施形態は、「ＰＤＸ１陽性の背側に偏った前腸内胚葉細胞」（背側のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞）または単に「ＰＤＸ１陽性内胚葉」の細胞培養物に関する。一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、表１から選択される１つまたは複数のマーカーおよび／または表２から選択される１つまたは複数のマーカーを発現し、これらも同様に、２００６年１０月２７日に出願の関連する米国特許出願第１１／５８８，６９３号、表題ＰＤＸ１  ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＤＯＳＡＬ  ＡＮＤ  ＶＥＮＴＲＡＬ  ＦＯＲＥＧＵＴ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ、および２００５年４月２６日に出願の米国特許出願第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｄｏｄｅｒｍに記載され、これらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【表１】
2019146578.tif 000002
2019146578.tif 000003
【表２】
2019146578.tif 000004
2019146578.tif 000005
【００４８】
本明細書に記載される方法によって生成されるものなどのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、完全に分化した膵臓ホルモン分泌または内分泌細胞、例えばインスリン生成β細胞を生成するために使用することができる前駆体である。本発明の一部の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成するように、ＰＤＸ１を実質的に発現しない胚体内胚葉細胞（ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞；本明細書では胚体内胚葉とも呼ばれる）を分化させることによって生成される。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「膵臓内胚葉」、「膵臓上皮（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）」、「膵臓上皮（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」（全て「ＰＥ」と省略することができる）「膵臓前駆体」、「ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉または膵臓内胚葉細胞（「ＰＥＣ」）などのその等価物は全て、先駆または前駆膵臓細胞である。本明細書に記載のＰＥＣは、ステージ４分化（約１２〜１４日目）後の前駆細胞集団であり、少なくとも２つの主要な別個の集団：ｉ）ＮＫＸ６．１を発現するが、ＣＨＧＡを発現しない（またはＣＨＧＡ陰性、ＣＨＧＡ−）膵臓前駆細胞；およびｉｉ）ＣＨＧＡを発現する複数ホルモン性（ｐｏｌｙｈｏｒｍｏｎａｌ）内分泌細胞（ＣＨＧＡ陽性、ＣＨＧＡ＋）を含む。理論に束縛されることなく、ＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない細胞集団は、ＰＥＣのより活性かつ治療的な構成成分であると仮定され、一方、ＣＨＧＡ陽性複数ホルモン性内分泌細胞の集団はｉｎ  ｖｉｖｏでグルカゴン発現膵島細胞にさらに分化および成熟すると仮定される。それらの開示はともに参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｋｅｌｌｙら（２０１１）Ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（８）：７５０−７５６、２０１１年７月３１日オンライン出版およびＳｃｈｕｌｚら（２０１２）、Ａ  Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、ＰＬｏｓＯｎｅ  ７（５）：１−１７、ｅ３７００４を参照されたい。
さらに、時には、膵臓内胚葉細胞は、すぐ上に記載されているＰＥＣを指すのではなく、一般に少なくともステージ３およびステージ４型細胞を指して使用される。使用および意味は文脈から明らかになろう。このように多能性幹細胞、ならびに少なくともｈＥＳ細胞およびｈＩＰＳ細胞から導出される膵臓内胚葉は、他の内胚葉系の系列細胞型とは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ１、ｃＭＹＣ、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２マーカーから選択されるマーカーの発現が差次的または高いレベルであるが、膵臓内分泌細胞の特質である遺伝子、例えばＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＭＡＦＡ、ＰＣＳＫ１およびＧＬＵＴ１は実質的に発現しないことに基づいて区別される。さらに、ＮＧＮ３を発現するいくつかの「内分泌前駆細胞」は他の非膵臓構造（例えば、十二指腸）に分化することができる。一実施形態では、本明細書に記載されるＮＧＮ３発現内分泌前駆体は、成熟した膵臓系列細胞、例えば膵臓内分泌細胞に分化する。膵臓内胚葉または内分泌前駆細胞集団およびその方法は、米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ、２００７年７月５日出願、および米国特許出願第１２／１０７，０２０号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＡＮＤ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＣＥＬＬＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＯＲＭ  ＨＵＭＡＮ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ、２００８年４月２１日出願にも記載され、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「内分泌先駆細胞」は、ニューロゲニン３（ＮＥＵＲＯＧ３）を発現し、限定されずに膵島ホルモン発現細胞などの内分泌系の細胞にさらに分化することができる、胚体内胚葉系列の多分化能細胞を指す。内分泌先駆細胞は、より低い特異性で分化した胚体内胚葉系列細胞、例えばＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞と比較して、同じくらい多くの異なる細胞、組織および／または器官タイプには分化することができない。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「膵島ホルモン発現細胞」、「膵臓内分泌細胞」またはその同等物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性細胞から誘導された、複数ホルモン性または単一ホルモン性であってもよい細胞を指す。したがって、内分泌細胞は、ヒト膵島細胞の機能の少なくとも一部を有する、１つまたは複数の膵臓ホルモンを発現することができる。膵島ホルモン発現細胞は、成熟していても未熟であってもよい。未熟な膵島ホルモン発現細胞は、特定のマーカーの差次的発現に基づくか、それらの機能的能力、例えばグルコース応答性に基づいて、成熟した膵島ホルモン発現細胞から区別することができる。
【００５２】
本明細書に記載の実施形態では、限定培地、馴化培地、フィーダーフリー培地、無血清培地などを含めた多くの幹細胞培地培養物または成長環境が想定される。本明細書で使用される場合、「成長環境」または「環境」という用語またはその等価物は、未分化の幹細胞または分化した幹細胞（例えば、霊長類胚性幹細胞）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する環境である。環境の特徴は、細胞を培養する培地、および存在する場合には支持構造（例えば、固体表面上の基質など）を含む。多能性細胞を培養または維持するためおよび／または多能性細胞を分化させるための方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＵＳＥＦＵＬ  ＦＯＲ  ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＢＬＥ  ＣＥＬＬＳ、２００７年２月２３日出願；米国特許出願第１１／９９３，３９９号、表題ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦ、２００７年１２月２０日出願；および米国特許出願第１１／８７５，０５７号、表題Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ、２００７年１０月１９日出願にも記載され、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００５３】
「本質的に」または「実質的に」という用語は、ある成分または細胞が、最小または少ない量で任意の細胞凝集懸濁液タイプ、例えば本明細書に記載される懸濁液中の細胞凝集体中に存在することが、「本質的または実質的に均一」、「本質的または実質的にホモ細胞性」であること、あるいは、「本質的にｈＥＳ細胞」、「本質的または実質的に胚体内胚葉細胞」、「本質的または実質的に前腸内胚葉細胞」、「本質的または実質的にＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」、「本質的または実質的にＰＤＸ１陽性前膵臓内胚葉細胞」、「本質的または実質的にＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または前駆細胞」、「本質的または実質的にＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉端細胞」、「本質的または実質的に膵臓内分泌先駆細胞」、「本質的または実質的に膵臓内分泌細胞」等で構成されることを意味する。
【００５４】
細胞培養中または細胞集団内の細胞に関して、「を実質的に含まない」という用語は、細胞培養物または細胞集団が含まれないと特定された細胞型が、細胞培養物または細胞集団中に存在する細胞の総数の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の量で存在することを意味する。
【００５５】
細胞培養物は、含有する血清が減少しているまたは血清を実質的に含まないまたは血清を含まない培地中で成長させることができる。ある特定の培養条件下で、血清濃度は約０％（ｖ／ｖ）から約１０％（ｖ／ｖ）の範囲とすることができる。例えば、いくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％未満（ｖ／ｖ）、約２％未満（ｖ／ｖ）、約３％未満（ｖ／ｖ）、約４％未満（ｖ／ｖ）、約５％未満（ｖ／ｖ）、約６％未満（ｖ／ｖ）、約７％未満（ｖ／ｖ）、約８％未満（ｖ／ｖ）、約９％未満（ｖ／ｖ）または約１０％（ｖ／ｖ）未満であってよい。いくつかのプロセスでは、血清を用いずに、または血清代替物を用いずに前原条細胞を成長させる。さらに他のプロセスでは、Ｂ２７の存在下で前原条細胞を成長させる。そのようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）までにわたってよい。
【００５６】
さらに他のプロセスでは、Ｂ２７の存在下で未成熟膵島ホルモン発現細胞を成長させる。そのようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は約０．１％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）までの範囲であってもよく、約２０％（ｖ／ｖ）を超える濃度であってもよい。ある特定のプロセスでは、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）または約２０％（ｖ／ｖ）である。あるいは、添加するＢ２７サプリメントの濃度は、市販のＢ２７ストック溶液の強度の倍数として測定することができる。例えば、Ｂ２７はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から５０×ストック溶液として入手可能である。十分な量のこのストック溶液を十分な体積の成長培地に添加することにより、所望の量のＢ２７が補充された培地を生成する。例えば、５０×Ｂ２７ストック溶液１０ｍｌを成長培地９０ｍｌに添加することにより、５×Ｂ２７が補充された成長培地を生成することになる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１×、約０．２×、約０．３×、約０．４×、約０．５×、約０．６×、約０．７×、約０．８×、約０．９×、約１×、約１．１×、約１．２×、約１．３×、約１．４×、約１．５×、約１．６×、約１．７×、約１．８×、約１．９×、約２×、約２．５×、約３×、約３．５×、約４×、約４．５×、約５×、約６×、約７×、約８×、約９×、約１０×、約１１×、約１２×、約１３×、約１４×、約１５×、約１６×、約１７×、約１８×、約１９×、約２０×および約２０×超であってよい。
【００５７】
本明細書で使用される場合、例えば成長因子、分化因子などの「外因的に添加された」化合物とは、培養物または馴化培地に関しては、培養物または培地にすでに存在していてもよい任意の化合物または成長因子を補うために培養物または培地に添加される成長因子を指す。例えば、一部の実施形態では、細胞培養物および／または細胞集団は、外因的に添加されたレチノイドを含まない。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「レチノイド」とは、レチノール、レチナールまたはレチノイン酸ならびにこれらの化合物のいずれかの誘導体を指す。好ましい実施形態では、レチノイドはレチノイン酸である。
【００５９】
「ＦＧＦファミリー成長因子」、「線維芽細胞成長因子」または「線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー」は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２およびＦＧＦ２３からなる群から選択されるＦＧＦを意味する。一部の実施形態では、「ＦＧＦファミリー成長因子」、「線維芽細胞成長因子」または「線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー」とは、公知の線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーとの相同性および／またはそれと同様の機能を有する任意の成長因子を意味する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「発現」は、材料または物質の生成ならびに材料または物質の生成のレベルまたは量を指す。したがって、特定のマーカーの発現を決定することとは、発現されるマーカーの相対量または絶対量を検出することまたは単にマーカーが存在するかしないかを検出することを指す。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、観察または検出することができる任意の分子を指す。例えば、マーカーとしては、これだけに限定されないが、特定の遺伝子の転写物などの核酸、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質または小分子（例えば、分子量が１０，０００ａｍｕ未満の分子）を挙げることができる。
【００６２】
本明細書に記載の大多数のマーカーについて、公式のＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＨＵＧＯ）遺伝子記号が提供される。ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより開発されるそのような記号により、命名されたヒト遺伝子および遺伝子産物のそれぞれに対して特有の略語が提供される。当業者はこれらの遺伝子記号を容易に認識することができ、また、対応する独特のヒト遺伝子および／またはタンパク質配列と容易に関連付けることができる。
【００６３】
ＨＵＧＯによる名称によると、以下の遺伝子記号は次のように定義される：ＧＨＲＬ−グレリン；ＩＡＰＰ−島アミロイドポリペプチド；ＩＮＳ−インスリン；ＧＣＧ−グルカゴン；ＩＳＬ１−ＩＳＬ１転写因子；ＰＡＸ６−ペアードボックス遺伝子６；ＰＡＸ４−ペアードボックス遺伝子４；ＮＥＵＲＯＧ３−ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）；ＮＫＸ２−２−ＮＫＸ２転写因子関連遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）；ＮＫＸ６−１−ＮＫＸ６転写因子関連遺伝子座１（ＮＫＸ６．１）；ＩＰＦ１−インスリンプロモーター 因子１（ＰＤＸ１）；ＯＮＥＣＵＴ１−ワンカットドメイン、ファミリーメンバー１（ＨＮＦ６）；ＨＬＸＢ９−ホメオボックスＢ９（ＨＢ９）；ＴＣＦ２−転写因子２、肝臓（ＨＮＦ１ｂ）；ＦＯＸＡ１−フォークヘッドボックスＡ１；ＨＧＦ−肝細胞成長因子；ＩＧＦ１−インスリン様成長因子１；ＰＯＵ５Ｆ１−ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１（ＯＣＴ４）；ＮＡＮＯＧ−Ｎａｎｏｇホメオボックス；ＳＯＸ２−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２；ＣＤＨ１−カドヘリン１、１型、Ｅ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）；Ｔ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙホモログ（ＢＲＡＣＨ）；ＦＧＦ４−線維芽細胞成長因子４；ＷＮＴ３−無翅型ＭＭＴＶ組み込み部位ファミリー、メンバー３；ＳＯＸ１７−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１７；ＧＳＣ−グースコイド；ＣＥＲ１−（ケルベロス１、システインノットスーパーファミリー、ホモログ（ＣＥＲ）；ＣＸＣＲ４−ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４；ＦＧＦ１７−線維芽細胞成長因子１７；ＦＯＸＡ２−フォークヘッドボックスＡ２；ＳＯＸ７−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス７；ＳＯＸ１−ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１；ＡＦＰ−アルファ−フェトプロテイン；ＳＰＡＲＣ−分泌タンパク質、酸性、システインリッチ（オステオネクチン）；およびＴＨＢＤ−トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＮＣＡＭ−神経系細胞接着分子；ＳＹＰ−シナプトフィジン；ＺＩＣ１−Ｚｉｃファミリーメンバー１；ＮＥＦ３−神経フィラメント３（ＮＦＭ）；ＳＳＴ−ソマトスタチン；ＭＡＦＡ−ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＡ；ＭＡＦＢ−ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＢ；ＳＹＰ−シナプトフィジン；ＣＨＧＡ−クロモグラニンＡ（副甲状腺分泌型タンパク質１）。
【００６４】
非ＨＵＧＯ遺伝子記号に対応する完全遺伝子名、ならびに本明細書で使用することができる他の略記号を以下に提供する：ＳＳ−ソマトスタチン（ＳＯＭ）；ＰＰ−膵臓ポリペプチド；Ｃペプチド−接続ペプチド；Ｅｘ４−エキセンディン４；ＮＩＣ−ニコチンアミドおよびＤＡＰＴ−Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル；ＲＡ−レチノイン酸；ＲＰＭＩ−Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地；ＣＭＲＬ−Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ培地；ＦＢＳ−ウシ胎児血清；ＮＢＰ  １０−ＮＣＡＭ結合タンパク質１０；ＰＴＦ１ａ−膵臓特異的転写因子１ａ。
【００６５】
多能性細胞から種々の多分化能および／または分化した細胞への進行は、遺伝子、または遺伝子マーカーの相対的な発現量、特定の細胞の特性を、第２の遺伝子または対照遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子の発現と比較して決定することによってモニタリングすることができる。いくつかのプロセスでは、ある特定のマーカーの発現を、マーカーが存在するかしないかを検出することによって決定する。あるいは、ある特定のマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞中でマーカーが存在するレベルを測定することによって決定することができる。そのようなプロセスでは、マーカーの発現の測定は定性的であっても定量的であってもよい。マーカー遺伝子によって生成するマーカーの発現を定量化する１つの方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を使用することによるものである。Ｑ−ＰＣＲを実施する方法は当技術分野で周知である。当技術分野で公知の他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量化するために使用することができる。例えば、マーカー遺伝子の発現産物は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することによって検出することができる。
【００６６】
いくつかのプロセスでは、以下の遺伝子の高発現により、細胞のある特定の集団が示される。例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＡＦＰまたはＴＨＢＤにより胚体外内胚葉が示され、ＮＯＤＡＬおよび／またはＦＧＦ８により前原条が示され、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１および／またはＷＮＴ３により中内胚葉が示され、ＣＥＲ、ＧＳＣ、ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２により胚体内胚葉細胞が示され、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１ＢおよびＨＮＦ４Ａにより前腸内胚葉（またはＰＤＸ１陰性内胚葉）が示され、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９およびＰＲＯＸ１によりＰＤＸ１陽性内胚葉が示され、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦＡ１、ＣＰＡおよびｃＭＹＣにより膵臓上皮（ＰＥまたは膵臓前駆体）が示され、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＡＲＸおよびＮＫＸ２．２により内分泌先駆細胞が示され、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴおよびＰＰにより種々の内分泌細胞が示され、ＭＡＦＡ遺伝子発現がＭＡＦＢ遺伝子発現に対して相対的に高いことにより、インスリン分泌内分泌細胞が示され、ＭＡＦＡ遺伝子発現に対するＭＡＦＢの相対的な高発現により、グルカゴン分泌内分泌細胞が示される。
【００６７】
用語線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）は、同義である。
【００６８】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成するための方法
本明細書に記載の実施形態は、いかなる１つの型のｉＰＳ細胞にも、いかなる１つのｉＰＳ細胞の生成方法にも限定されない。種々の方法が存在するので、実施形態は限定的なものではない、またはｉＰＳ細胞の生成の効率のレベルに左右される。本明細書に記載の実施形態はｉＰＳ細胞の内胚葉系列細胞への分化およびその使用にあてはまる。
【００６９】
アデノウイルス、プラスミド、またはＣｒｅ−ｌｏｘＰ３もしくはｐｉｇｇｙ  ＢＡＣ転位を使用したリプログラミング因子の切除を使用する、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生じさせるためのウイルスによる方法、ウイルスによらない方法および非組込み型ウイルスによる方法が記載されている。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２、９４５−９４９（２００８）；Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２、９４９−９５３（２００８）；Ｋａｊｉ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５８、７７１−７７５（２００９）；Ｓｏｌｄｎｅｒ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ  １３６、９６４−９７７（２００９）；およびＷｏｌｔｊｅｎ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５８、７６６−７７０（２００９）を参照されたい。同様に、それらもまた参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｍａｃｋ，Ａ．らに対する米国特許出願公開第２０１００００３７５７号（２０１０年１月７日公開）およびＳｈｉらに対するＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３７４２９も参照されたい。しかし、これらの方法のリプログラミング効率は低く（＜０．００３％）、切除にもかかわらずベクター配列が残留する可能性があり、それにより、それらの治療への適用が限定される。例えば、上記の転写因子の宿主ゲノムへのウイルスによる組み込みおよび過剰発現は腫瘍形成に関連付けられており、導入遺伝子の発現が残留することは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を区別する潜在的な特徴である。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｓｏｌｄｅｒ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ  １３６：９６４−９７７（２００９）；Ｆｏｓｔｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：１４９１−１５００（２００５）；およびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ  １２１：４６５−４７７（２００５）を参照されたい。
【００７０】
本発明の他の実施形態では、ｉＰＳＣを生じさせるための方法はエプスタイン・バーウイルス由来のエピソームベクターを含む。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４、７９７−８０１（２００９）およびＭａｃｋ，Ａ．らに対する米国特許出願公開第２０１００００３７５７号、２０１０年１月７日公開を参照されたい。これらの方法では、癌遺伝子ＳＶ４０を含めた７種の因子の組合せを有する３つの別々のプラスミドが必要である。
【００７１】
本発明の別の実施形態では、ｉＰＳＣを生じさせるための方法は、マウス細胞およびヒト胎児細胞および新生児細胞由来のタンパク質に基づくｉＰＳＣを含む。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｚｈｏｕ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４、３８１−３８４（２００９）；およびＫｉｍ，Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４、４７２−４７６（２００９）を参照されたい。これらの方法体系は、化学的処理（例えば、Ｚｈｏｕら、２００９、上記の場合ではバルプロ酸）または多数回の処理（Ｋｉｍら、２００９、上記）を使用して実現される。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、細菌の複製開始点および抗生物質耐性遺伝子を欠くスーパーコイルＤＮＡ分子であるミニサークルベクターまたはプラスミドを使用することができる。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｃｈｅｎ、Ｚ．−Ｙ．ら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ８、４９５−５００（２００３）；Ｃｈｅｎ、Ｚ．−Ｙ．ら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １６、１２６−１３１（２００５）；およびＪｉａ，Ｆら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｎｌｉｎｅ  ７  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１０を参照されたい。これらの方法体系では、外因性サイレンシング機構の活性化が低いので、より高いトランスフェクション効率およびより長期の異所性発現でｉＰＳＣが生じる。
【００７３】
本発明のさらに別の実施形態では、糖尿病患者、ＡＬＳ、脊椎筋ジストロフィーおよびパーキンソン患者を含めた種々の疾患のヒト患者からｉＰＳ細胞を生じさせることができる。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｍａｅｈｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０６（３７）：１５７６８−７３（２００９）；Ｄｉｍｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１：１２１８−２１（２００８）；Ｅｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５７：２７７−８０（２００９）；Ｐａｒｋら、Ｃｅｌｌ  １３４：８７７−８８６（２００８）；およびＳｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  １３６：９６４−９７７を参照されたい。特定の疾患を有する患者からｈＩＰＳ細胞を生成することの少なくとも１つの利点は、導出された細胞がヒト疾患の遺伝子型および細胞応答を含有することである。現存するヒトｉＰＳ細胞株の少なくとも一部が列挙されている表３も参照されたい。この情報は、文献および例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ，ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベースから得られるものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。
本明細書に記載の組成物および方法の複数の実施形態では、これだけに限定されないが、ＣｙＴ４９、ＣｙＴ２１２、ＣｙＴ２０３、ＣｙＴ２５、（少なくとも本出願の出願時に、ＶｉａＣｙｔｅ  Ｉｎｃ．、３５５０  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ａｔｐｍｉｃｓ  Ｃｏｕｒｔ、Ｓａｎ  Ｄｅｉｇｏ  ＣＡ  ９２１２１から市販されていた）、ＢＧＯ１、ＢＧ０２およびＭＥＬ１を含めたｈＥＳＣなどのヒト多能性幹細胞、ならびにｉＰＳＣ−４８２ｃ７およびｉＰＳＣ−６０３（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、ならびにｉＰＳＣ−Ｇ４（以下「Ｇ４」）およびｉＰＳＣ−Ｂ７（以下、「Ｂ７」）（Ｓｈｉｎｙａ  Ｙａｍａｎａｋａ、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｋｙｏｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）などの人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含めた種々の分化可能な霊長類多能性幹細胞の使用が意図されており、Ｇ４およびＢ７を使用した試験は、本明細書に詳しく記載されている。ある特定のこれらのヒト多能性幹細胞はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）などの国際登録機関に登録され、ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている（例えば、ＣｙＴ４９の登録番号は００４１である）。他の入手可能な細胞株はｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙのワールドワイドウェブにも見出すことができる。さらに他の細胞株、例えば、ＢＧ０１およびＢＧＯ１ｖは、それぞれＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（ＷＩＳＣ）Ｂａｎｋの関係団体であるＷｉＣｅｌｌ（登録商標）（カタログ名、ＢＧ０１）およびＡＴＣＣ（カタログ番号ＳＣＲＣ−２００２）によって第三者に販売および配布されている。本明細書に記載の他の細胞株はＷｉＣｅｌｌ（登録商標）またはＡＴＣＣなどの生物学的リポジトリによって登録または配布されていない場合があるが、そのような細胞株は原理研究者、研究室および／または施設から直接または間接的に公に入手可能である。細胞株および試薬の公開要求は、例えば生命科学の当業者にとっては通例である。一般には、これらの細胞または材料の譲渡は、細胞株または材料の所有者と受取人の間の標準の材料譲渡契約を介する。これらの型の材料譲渡は、特に生命科学における研究環境では頻繁に生じる。実際、出願人は、ＣｙＴ４９（２００６）、ＣｙＴ２０３（２００５）、Ｃｙｔ２１２（２００９）、ＣｙＴ２５（２００２）、ＢＧ０１（２００１）、ＢＧ０２（２００１）、ＢＧ０３（２００１）およびＢＧＯｌｖ（２００４）を含めた細胞が導出され特徴付けられた時から、営利および非営利産業パートナーおよび共同研究者とのそのような契約を通じて常套的に細胞の譲渡を受けてきた。前記の一覧の各細胞株の隣の括弧内の年は、細胞株または材料が公的に入手可能かつ不死のものになった（例えば細胞バンクが作製された）年を示し、したがって、組成物を作製するためおよび本明細書に記載の方法を実施するためにこれらの細胞株が樹立された時から別の胚の破壊は実施または要求されていない。
２００６年８月、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａらは、ｈＥＳＣは単一の割球から誘導することができ、したがって胚を無傷にしておき、それらの破壊を引き起こさないことを実証した。顕微操作技術を使用して各胚から生検を実施し、十九（１９）個のＥＳ細胞様増生および二（２）個の安定したｈＥＳＣ系が得られた。これらのｈＥＳＣ系は六（６）カ月以上も未分化状態に維持することができ、正常な核型、ならびにＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｎａｎｏｇおよびアルカリ性ホスファターゼを含む多能性のマーカーの発現を示した。これらのｈＥＳＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで全て三つ（３つ）の胚性胚葉の誘導体を分化、形成すること、およびｉｎ  ｖｉｖｏでテラトーマの形で形成することができる。胚の破壊なしで新しい幹細胞系を作製するこれらの方法は、ヒト胚を使用することの倫理上の懸念に対処する。その開示が参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：４８１〜５頁、Ｅｐｕｂ  ２００６年８月２３日を参照。しかし、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａらは、誘導したｈＥＳＣ系を他のｈＥＳＣと共培養した。後に、２００８年に、Ｃｈｕｎｇ  Ｙ．らは、ｈＥＳＣとの共培養なしで単一の割球から再びｈＥＳ細胞系を得ることができた。参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｃｈｕｎｇ  Ｙ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００８、２（２）、１１３〜１１７頁を参照。したがって、本明細書に記載される組成物および方法、特に人工多能性幹細胞または遺伝的に脱分化した多能性幹細胞に関連するようなそのような組成物および方法は、ヒト胚の破壊を必要としない。
表３および表４は、それぞれ、ある特定のｉＰＳＣおよびｈＥＳＣの包括的ではない一覧であり、研究目的および／または商業目的で世界的に利用可能であり、本発明の方法および組成物での使用に適している。表３および表４の情報は、文献および例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベースから得られるものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。
本明細書に記載のヒトｉＰＳＣ（少なくともｉＰＳＣ−６０３およびｉＰＳＣ−４８２−ｃ７）はＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）により提供されたものである。
【表３】
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【００７４】
別の利点は、そのようなｈＩＰＳ細胞が免疫学的に適合した自己細胞集団であり、患者に特異的な細胞により、疾患の起源および進行を試験することが可能になることである。したがって、疾患の根本原因を理解することが可能であり、それにより、疾患に対する予防的処置および治療的処置の開発を導く洞察がもたらされ得る。
【００７５】
多能性ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞
一部の実施形態は、胚体内胚葉細胞および最終的には、これだけに限定されないが、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、内分泌先駆細胞および／または膵島ホルモン発現細胞を含めた任意の内胚葉系列由来細胞型を、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を出発材料として使用して導出するための方法を対象とする。これらのｈＥＳ細胞は、桑実胚、胚内部細胞塊または胚の生殖隆起から得られるものを起源とする細胞であってよい。ヒト胚性幹細胞は、当技術分野で公知の方法を使用して、培養物中、実質的な分化を伴わずに多能性の状態で維持することができる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号および同第６，２５１，６７１号に記載され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００７６】
いくつかのプロセスでは、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞は、フィーダー層上で維持される。そのようなプロセスでは、多能性細胞を多能性の状態で維持することを可能にする任意のフィーダー層を使用することができる。ヒト胚性幹細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）に一般に使用されるフィーダー層の１つは、マウス線維芽細胞の層である。つい最近、多能性細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）において使用するためのヒト線維芽細胞フィーダー層が開発された（その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願公開第２００２／００７２１１７号）。代替のプロセスでは、フィーダー層を使用せずに多能性細胞を維持することが可能になる。多能性細胞をフィーダーフリー条件下で維持する方法は、米国特許出願公開第２００３／０，１７５，９５６号に記載されており、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００７７】
本明細書に記載の多能性細胞は、血清を含むまたは含まない、細胞外マトリックスを含むまたは含まない、ＦＧＦを含むまたは含まない培養物中で維持することができる。いくつかの多能性細胞の維持手順では、血清代替物を使用する。多能性細胞または多分化能細胞を培養し、分化させるためのこれらおよび他の方法は、それぞれ、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、２００７年２月２３日出願、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＣＵＬＴＵＲＩＮＧ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＬ  ＣＥＬＬＳおよびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６、２００８年１０月２０日出願、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＦＥＥＤＥＲ−ＦＲＥＥ  ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＭＥＤＩＡ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＨＵＭＡＮ  ＳＥＲＵＭに記載され、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【００７８】
本明細書に記載の発明は全てのｈＥＳ細胞株、および少なくとも、表４に列挙されているものと共に有用である。この情報は、文献および例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＲｅｇｉｓｔｒｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙを含めた公的に利用可能なデータベースから得られるものである。これらのデータベースは、細胞株が利用可能になり登録が得られた時に定期的に更新されている。本出願の出願日現在、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙに掲載された２５４個のｉＰＳＣ系、および１２１１個のｈＥＳＣ系があった。以下の表４は列挙されているｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの全てを含むものではなく、潜在的に入手可能な多能性幹細胞の例である。
【表４】
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【００７９】
多能性脱分化体細胞
最近、ある特定の核リプログラミング因子を使用した試験により、多能性幹細胞または多能性様幹細胞を患者自身の体細胞から導出することが可能になった。これらの細胞は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とも称される。本発明では、Ｓｈｉｎｙａ  Ｙａｍａｎａｋａ、Ｋｙｏｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供された種々のｉＰＳ細胞株について記載されている。しかし、他のｉＰＳ細胞株、例えばＪａｍｅｓ  Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ａ１．に記載されているものは本発明によるものである。参照により本明細書に完全に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、国際公開ＷＯ２００５／８０５９８、米国特許出願公開第２００８０２３３６１０号および国際公開ＷＯ２００８／１１８８２を参照されたい。したがって、本明細書で使用される場合、「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」とは、他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞、ｐＰＳ（霊長類多能性幹）細胞、単為発生細胞などと同様の性質を有する細胞を意味する。
【００８０】
核プログラミング因子は、米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、国際公開ＷＯ２００５／８０５９８、米国特許出願公開第２００８０２３３６１０号および国際公開ＷＯ２００８／１１８８２に記載されており、卵、胚、またはＥＳ細胞を使用せずに、分化した細胞のリプログラミングを誘導するために使用される。本発明で使用され、記載されているものと同様の核リプログラミング因子を使用することによって体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を調製するための方法は特に限定されない。好ましい実施形態では、体細胞および人工多能性幹細胞が増殖し得る環境で核リプログラミング因子を体細胞と接触させる。本明細書に記載のある特定の実施形態の利点は、卵、胚、または胚性幹（ＥＳ）細胞の不在下で核リプログラミング因子を体細胞と接触させることによって人工多能性幹細胞を調製することができることである。核リプログラミング因子を使用することによって、体細胞の核をリプログラミングしてｉＰＳ細胞または「ＥＳ様細胞」を得ることができる。
【００８１】
本明細書に記載の多能性幹細胞は、ｈＥＳ細胞であるかｉＰＳ細胞であるかにかかわらず、これだけに限定されないが、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；ＡＢＣＧ２；ステージ特異的胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１）；ＳＳＥＡ−３；ＳＳＥＡ−４；ＴＲＡ−１−６０；ＴＲＡ−１−８１；Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ；ＥＲａｓ／ＥＣＡＴ５、Ｅ−カドヘリン；．β．ＩＩＩ−チューブリン；．アルファ．−平滑筋アクチン（アルファ．−ＳＭＡ）；線維芽細胞成長因子４（Ｆｇｆ４）、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、Ｄａｘ１；ジンクフィンガータンパク質２９６（Ｚｆｐ２９６）；Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（Ｎａｔ１）；（ＥＳ細胞関連転写物１（ＥＣＡＴ１）；ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２；ＥＣＡＴ３；ＥＣＡＴ６；ＥＣＡＴ７；ＥＣＡＴ８；ＥＣＡＴ９；ＥＣＡＴ１０；ＥＣＡＴ１５−１；ＥＣＡＴ１５−２；Ｆｔｈｌ１７；Ｓａｌｌ４；未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）；Ｒｅｘ１；ｐ５３；Ｇ３ＰＤＨ；ＴＥＲＴなどのテロメラーゼ；サイレントＸ染色体遺伝子；Ｄｎｍｔ３ａ；Ｄｎｍｔ３ｂ；ＴＲＩＭ２８；Ｆ−ボックス含有タンパク質１５（Ｆｂｘ１５）；Ｎａｎｏｇ／ＥＣＡＴ４；Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ４；ｃ−Ｍｙｃ；Ｅｓｒｒｂ；ＴＤＧＦ１；ＧＡＢＲＢ３；Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３；ＧＤＦ３；ＣＹＰ２５Ａ１；発生多能性関連２（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ２）（ＤＰＰＡ２）；Ｔ細胞リンパ腫ブレイクポイント１（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  １）（Ｔｃｌ１）；ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ；ＤＰＰＡ４などの任意の数の多能性細胞マーカーを発現し得る。本発明は本明細書において列挙されているマーカーに限定されず、細胞表面マーカー、抗原、ならびにＥＳＴ、ＲＮＡ（マイクロＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含む）、ＤＮＡ（遺伝子およびｃＤＮＡを含む）およびその一部を含めた他の遺伝子産物などのマーカーを包含することが理解される。
【００８２】
一実施形態では、本明細書で使用されるｉＰＳ細胞株は、以下の核リプログラミング因子遺伝子を含有する：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＳｏｘファミリー遺伝子。ある１つのｉＰＳ細胞株では、以下の３種類の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２のそれぞれが提供される。以下の３種類の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、およびＭｙｃファミリー遺伝子、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃのそれぞれの他のｉＰＳ細胞株遺伝子産物を使用した。したがって、核リプログラミング因子はＭｙｃファミリー遺伝子を含んでもよく含まなくてもよいことが理解される。
【００８３】
本明細書に記載されており、当技術分野でも公知の核リプログラミング因子は、分化した成体の体細胞からｉＰＳ細胞を生じさせるために使用することができ、また、これはリプログラミングされる体細胞の型に限定されない、すなわち、任意の種類の体細胞をリプログラミングまたは脱分化させることができる。体細胞のリプログラミングには卵および／または胚が必要ないので、ｉＰＳ細胞は哺乳動物細胞であってよく、したがって、患者または疾患に特異的な多能性幹細胞を生じさせる機会がもたらされる。
【００８４】
多能性幹細胞の凝集懸濁液
個々の細胞をポリマー足場、マトリックスおよび／またはゲルに播種することに基づく、以前に公知の組織工学の方法とは対照的に、本明細書に記載の実施形態では、多能性幹細胞から形成された細胞凝集懸濁液、単一細胞懸濁液またはそれから導出された分化した単一細胞懸濁液を使用することができる。幹細胞凝集懸濁液の処理および／または製造ならびにその細胞の分化の方法は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２，７５５およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８２，３５６に記載され、それらは参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【００８５】
一実施形態では、多能性幹細胞培養物、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞培養物の単細胞懸濁液から、多能性幹細胞凝集懸濁液を生成する方法が提供される。多能性幹細胞は線維芽細胞フィーダーで最初に培養することができるか、またはフィーダーフリーであってもよい。ｈＥＳ細胞を単離し、それらをヒトフィーダー細胞の上で培養する方法は、米国特許第７，４３２，１０４号に記載され、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「単一細胞懸濁液」という用語またはその等価物は、多能性、多分化能もしくは最終分化した単一細胞懸濁液、または多能性細胞もしくは多分化能細胞から任意の機械的手段または化学的手段によって導出された単一細胞懸濁液を指す。一次組織、付着した培養物中の細胞、および凝集体から細胞クラスターを解離させて単一細胞懸濁液を形成するためのいくつかの方法、例えば、物理的な力（細胞スクレーパー、口径が狭いピペットを通しての粉砕、細針穿刺吸引、ボルテックスによる脱凝集および細かいナイロンメッシュまたはステンレス鋼メッシュを通した強制的な濾過などの機械的解離）、酵素（例えばトリプシン、コラゲナーゼ、アキュターゼ（商標）などの酵素による解離）、またはその両方の組合せが存在する。さらに、多能性細胞、多分化能細胞または分化した細胞の単一細胞への解離を支持することができる方法および培養培地条件は、多ウェルプレートアッセイのための増殖、細胞選別、および規定された播種のために有用であり、また、培養順およびクローン増殖の自動化を可能にする。
【００８７】
他の実施形態は、分化培地、例えば作用物質、好ましくはＴＧＦβファミリーの受容体を活性化することが可能であるＴＧＦβファミリーメンバー、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１およびＮｏｄａｌを含有する分化培地に、多能性幹細胞凝集懸濁液を直接に生成する方法を提供する。内胚葉の生成のための成長因子は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５，６８６に記載され、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。分化培地で細胞凝集懸濁液を生成する方法は、同様に本明細書に記載される、多能性幹細胞培地、例えばＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２，７５５に記載されるヘレグリンをベースとしたＤＣ−ＨＡＩＦ培地に基づくＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞凝集懸濁培養物の生成を提供する他の方法から区別することができる。
【００８８】
本明細書に記載の実施形態は、多能性接着培養物から、多能性細胞を、未分化の状態での増殖を可能にする接着性成長培養条件で培養し、接着性多能性細胞培養物を単一細胞懸濁培養物に解離させ、単一細胞懸濁培養物を、単一細胞懸濁培養物を単一細胞懸濁培養物から懸濁液中の多能性由来細胞凝集体が形成されるまでの期間にわたって撹拌することによって懸濁液中のｈＥＳ由来細胞凝集体の形成を可能にする第１の分化培養条件と接触させ、それにより、懸濁液中の多能性由来細胞凝集体を生じさせることによって懸濁液中の多能性細胞凝集体を生じさせるための方法に関する。好ましい実施形態では、単一細胞懸濁培養物の撹拌は、約８０ｒｐｍ〜１６０ｒｐｍで回転させることによって実施する。本明細書に記載のある特定の他の実施形態では、多能性幹細胞の凝集、成長、増殖、増大および／または細胞塊を容易にするためにｒｈｏキナーゼ阻害剤を使用する。
【００８９】
本明細書に記載される実施形態は、未分化状態での増大を可能にする接着性成長培養条件でｈＥＳ細胞を培養し；未分化ｈＥＳ細胞をｈＥＳ細胞の分化に適する第１の分化培養条件と接触させて、接着性多能性由来細胞をもたらし；接着性のｈＥＳ由来細胞を単一細胞懸濁培養物に解離させ；単一細胞懸濁培養物が懸濁状の多能性由来細胞凝集体を形成するそのような時期まで単一細胞懸濁培養物を撹拌することによって、単一細胞懸濁培養物を、懸濁状のｈＥＳ由来細胞凝集体の形成を可能にする第２の分化培養条件と接触させ、それにより懸濁状の多能性由来細胞凝集体を生成することによって、多能性由来単一細胞懸濁液から懸濁状の多能性由来細胞凝集体を生成する方法にも関する。好ましい実施形態では、単一細胞懸濁培養物の撹拌は、約８０ｒｐｍから１６０ｒｐｍの回転によって実施される。
【００９０】
好ましい実施形態では、製造規模の懸濁培養は、細胞密度を最大にしながら細胞生存力を維持する方法として、培地の連続潅流を利用する。この関係において、培地交換は、接着細胞および懸濁凝集体に異なった影響を及ぼす流体剪断を培養物に寄与する。培地が細胞表面を接線方向に越流するので、固定された接着細胞は流体剪断応力を受ける。対照的に、凝集体は剪断力の負荷に応答して自由に転がるので、懸濁凝集体が受ける凝集体表面を横切る剪断応力はかなりより弱い。長期間の剪断応力は接着性の多能性細胞に有害であり、最適な生存および機能のために懸濁凝集形式が好ましいと予想される。したがって、多能性幹細胞および／または多能性幹細胞から導出された多分化能前駆細胞の生成のための効率的な製造プロセスの必要性、ならびに剪断速度および剪断応力に関する上記の観察された機構に基づき、本明細書に記載される実施形態は、初めて、懸濁液形式、特に細胞凝集懸濁液形式の、多能性幹細胞から導出された多能性幹細胞および／または多分化能前駆細胞の生成のための製造方法を提供する。
【００９１】
さらに別の実施形態では、ｈＥＳ細胞凝集懸濁液を、血清を実質的に含まない培地中、さらに、外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の不在下で培養した。これは、血清を含まないが、ＦＧＦなどの外因的に添加された成長因子を含有する培地中でｈＥＳ細胞を培養することが必要なＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．に対する米国特許第７，００５，２５２号とは区別される。一部の実施形態では、ｉＰＳ細胞凝集懸濁液を、血清を実質的に含まない培地中で、かつ／または、さらに、外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の不在下で培養する。
【００９２】
サイズおよび形状の両方が異なるかもしれない既知の方法によって生成される細胞凝集体と対照的に、本明細書に記載される細胞凝集体および方法はサイズおよび形状の狭い分布を有し、すなわち、細胞凝集体はサイズおよび／または形状が実質的に均一である。細胞凝集体のサイズ均一性は、分化性能および培養均一性のために重要である。基本的な物質輸送分析を凝集体に適用すると、等しい透過性を仮定する限り、大きな凝集体の中央への酸素および栄養素の拡散は、より小さい凝集体への拡散と比較して遅くなると予想される。膵臓系列細胞への凝集ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の分化は特定の成長因子の一時的適用に依存するので、異なる径の凝集体の混合物による培養物は、細胞凝集体の均一な（サイズおよび形状）培養物と比較して非同期化される可能性がある。細胞凝集体のこの混合物は異質性をもたらし、結果として分化性能が劣り、最終的に製造、規模拡大および生産に適合しない可能性がある。したがって、本明細書で使用される場合、語句「実質的に均一」または「サイズおよび形状が実質的に均一」またはその同等物は、凝集体の均一性の広がり程度を指し、約２０％以下である。別の実施形態では、凝集体の均一性の広がり程度は、約１５％、１０％または５％以下である。
【００９３】
凝集体当たりの細胞の正確な数は重要ではないが、各凝集体のサイズ（したがって、凝集体当たりの細胞の数）は酸素および栄養分が中心細胞に拡散する最大限度によって限定されること、およびこの数は細胞型およびその細胞型の栄養素の要件に応じても変動し得ることが当業者には理解されよう。細胞凝集体は、凝集体当たり最小数の細胞（例えば、２つまたは３つの細胞）を含んでもよく、凝集体当たり何百ものまたは何千もの細胞を含んでもよい。一般には、細胞凝集体は、凝集体当たり数百から数千の細胞を含む。本発明の目的上、細胞凝集体は、一般には約５０ミクロンから約６００ミクロンまでのサイズであるが、細胞型に応じて、サイズはこの範囲を下回ることも上回ることもある。一実施形態では、細胞凝集体は、約５０ミクロンから約２５０ミクロンまでのサイズ、または約７５〜２００ミクロンのサイズであり、約１００〜１５０ミクロンのサイズであることが好ましい。
【００９４】
さらに他の方法では胚様体（ＥＢ）の作製が記載されている。本明細書で使用される場合、「胚様体」、「凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｂｏｄｙ）」という用語またはその等価物は、ＥＳ細胞が単層培養物中で過成長した際、または、未定義の培地中の懸濁培養物中で維持された、または非定方向プロトコルによって多数の胚葉組織に分化した際に生じる分化した細胞および未分化の細胞の凝集体を指す。すなわち、ＥＢは、本明細書に記載の多能性幹細胞の単一細胞懸濁液から形成されることもなく、ＥＢは、多能性由来多分化能細胞の接着培養物から形成されることもない。これらの特徴単独により、本発明は胚葉体から明白に区別される。
【００９５】
分化した細胞と未分化の細胞の混合物であり、一般にはいくつかの胚葉由来の細胞からなり、ランダムな分化をたどる胚様体とは対照的に、本明細書に記載の細胞凝集体は、基本的にまたは実質的に均一な細胞であり、多能性、多分化能、二分化能、または単能性型の細胞、例えば、胚細胞、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉、膵臓内分泌細胞などの凝集体として存在する。
【００９６】
本明細書に記載される実施形態は、大規模製造に容易に適用することができるプロセスを使用して、サイズおよび形状が実質的に均一である細胞凝集体を繰り返し生成することが可能な費用効率の高い製造プロセスまたは方法を提供することによって、上記の問題に対処する。特定の一実施形態では、分化可能な細胞は、本発明の細胞培地を用いて懸濁培養で増殖させる。別の特定の実施形態では、分化可能な細胞は懸濁状態で維持および増殖することができ、すなわち、それらは未分化のままであるか、さらに分化することを阻止される。細胞培養との関連で「増殖させる」という用語は、当技術分野で使用されるように使用され、細胞の増殖および細胞数の増加、好ましくは存続可能な細胞数の増加を指す。具体的な実施形態では、約１日、すなわち約２４時間を超えて培養することによって、細胞を培養懸濁液で増殖させる。より具体的な実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７日、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８週の間培養することによって、細胞を懸濁培養で増殖させる。
【００９７】
本発明のさらに他の実施形態は、分化した多能性幹細胞培養物、例えば、上記ｄ’Ａｍｏｕｒ２００５および２００６に記載されるステージ１、２、３、４および５からの細胞を含む、本明細書に記載される多能性細胞から生成される細胞から形成される細胞凝集懸濁液を生成する方法を提供する。したがって、本明細書に記載される細胞凝集体を作製する方法はいかなる１つの多能性または多分化能細胞または細胞ステージにも限定されず、むしろ、使用方法および細胞型最適化の必要性によってどの方法が好ましいかが決定される。
【００９８】
多能性細胞、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞、および他の多能性細胞源、例えば胚性生殖または単為生殖生物細胞から導出された細胞の凝集懸濁培養物を生成するための本明細書に記載の方法は、実質的に、２００７年２月２３日に出願された表題がＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌｓであるＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２，７５５、および２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍであるＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０，５１６に記載されている通りであり、それらは参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【００９９】
本明細書に記載の方法では、例えば、Ｂｏｄｎａｒらに対するものであり、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡された米国特許第６，８００，４８０号に記載の通り最初に培養容器を細胞外マトリックスでコーティングする必要は全くない。本明細書に記載の一部の実施形態では、ｉＰＳ細胞は、他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳおよびｉＰＳ細胞が、実質的に、参照により本明細書に完全に組み込まれる２００８年１０月２０日に出願の、表題がＭｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍである米国特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０，５１６に記載されるように可溶性ヒト血清を使用して培養されるのと同じ方法で培養することができる。
【０１００】
本明細書に記載の方法では、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．に対するものであり、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）に譲渡された、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第７，００５，２５２号に記載の通り単に線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給される外因的に添加された線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は全く必要ない。
【０１０１】
多分化能および分化した細胞組成物
本明細書に記載の方法によって生成する細胞組成物は、多能性幹細胞、前原条、中内胚葉、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞を含む細胞培養物を含み、培養物中の細胞の少なくとも約５〜９０％が、生成された前原条、中内胚葉、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞である。
【０１０２】
本明細書に記載の一部の実施形態は、幹細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性細胞と、前原条、中内胚葉または胚体内胚葉などの多分化能細胞の両方、ならびに、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性膵臓内胚葉、内分泌先駆体またはＮＧＮ３／ＮＫＸ２．２共陽性内分泌先駆体、およびホルモン分泌内分泌細胞またはＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰ単独陽性内分泌細胞などの、より分化しているが、なお潜在的に多分化能である細胞を含む細胞集団および細胞培養物などの組成物に関する。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、多能性幹細胞および他の多分化能細胞または分化した細胞の混合物を含む組成物を生成することができる。一部の実施形態では、約９５の多能性細胞ごとに少なくとも約５の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が生成する。他の実施形態では、約５の多能性細胞ごとに少なくとも約９５の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が生成する。さらに、他の比の多分化能細胞または分化した細胞と多能性細胞を含む組成物が考えられる。例えば、約１，０００，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１００，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０，０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約５００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１００の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約１０の多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、約５の多能性細胞ごと、および約１までの多能性細胞ごとに少なくとも約１の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物、および約１の多能性細胞ごとに少なくとも約１，０００，０００の多分化能細胞または分化した細胞を含む組成物が考えられる。
【０１０３】
本明細書に記載の一部の実施形態は、少なくとも約５％の多分化能細胞または分化した細胞から少なくとも約９９％の多分化能細胞または分化した細胞までを含む細胞培養物または細胞集団に関する。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団は哺乳動物細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団はヒト細胞を含む。例えば、ある特定の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９９％が多分化能細胞または分化した細胞である細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞を含む細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または９９％超が多分化能細胞または分化した細胞である細胞培養物に関する。細胞培養物または細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む複数の実施形態では、細胞培養中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに上記の百分率を算出する。
【０１０４】
多能性、多分化能または分化細胞は、前原条、内胚葉系中胚葉、胚体内胚葉の細胞、ならびにそれらから導出される細胞、組織および／または器官に分化すること、またはさらに分化することが可能である。内胚葉系中胚葉細胞は、中胚葉細胞および／または胚体内胚葉細胞、ならびにこれらの系列のいずれかから導出される細胞、組織および／または器官に分化することが可能である。一部の実施形態では、前原条細胞は、内胚葉系中胚葉中間体を通して、中胚葉または胚体内胚葉系列のいずれかの最終分化細胞に変換される。例えば、そのようなプロセスは、ヒト内胚葉由来組織、例えば膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺、上皮小体、胸腺、咽頭、胆嚢および膀胱の効率的な生成のための基礎を提供することができる。重要なことに、前原条細胞および／または内胚葉系中胚葉細胞の生成は、機能的インスリン生成β細胞への多能性幹細胞の分化での初期段階である。別の例として、前原条細胞および／または内胚葉系中胚葉細胞の分化は、ヒト中胚葉由来組織、例えば血球、心血管組織、骨格組織ならびに他の構造および結合組織の効率的な生成のための基礎を提供することができる。
【０１０５】
本明細書に記載の組成物および方法には、いくつかの有用な特徴がある。例えば、多分化能細胞、例えば、前原条細胞および／または中内胚葉細胞を含む細胞培養物および細胞集団、ならびにそのような細胞培養物および細胞集団を生成するための方法は、ヒト発生の初期をモデリングするために有用である。さらに、本明細書に記載の組成物および方法は、真性糖尿病などの病態への治療介入としても機能し得る。例えば、前原条細胞および／または中内胚葉細胞は限られた数の組織のみの供給源として機能するので、純粋な組織または細胞の型の発生において使用することができる。前原条細胞を生成するためのいくつかのプロセスでは、出発材料として使用される多能性細胞は、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞、ｈＥＧ細胞またはｉＰＳ細胞である。
【０１０６】
栄養外胚葉細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、栄養外胚葉細胞を含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する栄養外胚葉細胞集団または細胞培養物では、ＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現が、非栄養外胚葉細胞または細胞集団におけるＨＡＮＤ１、Ｅｏｍｅｓ、ＭＡＳＨ２、ＥＳＸＬ１、ＨＣＧ、ＫＲＴ１８、ＰＳＧ３、ＳＦＸＮ５、ＤＬＸ３、ＰＳＸ１、ＥＴＳ２、およびＥＲＢＢの発現レベルと比較して実質的に高い。
【０１０７】
前原条細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、前原条細胞を含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する前原条細胞集団または細胞培養物は、ＦＧＦ８マーカー遺伝子および／またはＮＯＤＡＬマーカー遺伝子を、ＢＲＡＣＨＵＲＹ低、ＦＧＦ４低、ＳＮＡＩ１低、ＳＯＸ１７低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して実質的に発現する。
【０１０８】
胚体外細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、胚体外細胞を含む組成物を生成することができる。原始内胚葉細胞、近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞は胚体外細胞である。原始内胚葉細胞は近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞を生じる。近位内胚葉細胞は、卵黄嚢の一部を形成する内胚葉細胞である。近位内胚葉細胞は、栄養分の取り込みおよび輸送の両方において機能する。遠位内胚葉細胞は、ライヘルト膜として公知の胚体外組織と近接している。遠位内胚葉細胞の役割のうちの１つは、基底膜の構成成分の生成である。まとめると、近位内胚葉細胞および遠位内胚葉細胞は、多くの場合、胚体外内胚葉と称されるものを形成する。名称に示されている通り、胚体外内胚葉細胞は発生の間に形成される胚構造を生じない。対照的に、本明細書に記載の胚体内胚葉細胞および他の内胚葉系列または膵臓の系列細胞は、胚性であるまたは胚細胞から導出されたものであり、胚発生の間に形成される腸管から導出された組織を生じる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する胚体外細胞集団または細胞培養物では、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子、ＴＨＢＤ遺伝子、ＳＰＡＲＣ遺伝子、ＤＡＢ１遺伝子、ＦＴＮＦ４ａｌｐｈａ遺伝子またはＡＦＰ遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現が、少なくとも、他の細胞型または細胞集団、例えば胚体内胚葉では発現されないＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＴＨＢＤ、ＳＰＡＲＣ、ＤＡＢ１、またはＡＦＰの発現レベルと比較して実質的に高い。
【０１０９】
中内胚葉（ｍｅｎｓｅｎｄｏｄｅｒｍ）細胞
本明細書に記載の方法を使用して、他の細胞型を実質的に含まない、中内胚葉細胞を含む組成物を生成することができる。本明細書に記載の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する中内胚葉細胞集団または細胞培養物は、ＦＧＦ４、ＳＮＡＩ１、ＭＩＸＬ１および／またはＷＮＴ３マーカー遺伝子からなる群から選択されるマーカーの発現が、ＳＯＸ１７低、ＣＸＣＲ４低、ＦＯＸＡ２低、ＳＯＸ７低およびＳＯＸ１低と比較して実質的に高い。
【０１１０】
スクリーニング方法
一部の実施形態では、スクリーニング方法を使用して、ヒト多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、前原条細胞、中内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞または膵臓前駆細胞、内分泌先駆細胞、および／または内分泌細胞などの多能性細胞、多分化能細胞および／または分化した細胞などのある特定の細胞集団を得る。次いで、細胞集団に候補分化因子をもたらす。候補分化因子をもたらす前またはそれとほぼ同時である第１の時点で、マーカーの発現を決定する。あるいは、候補分化因子をもたらした後にマーカーの発現を決定することができる。第１の時点の後であり、かつ候補分化因子を細胞集団にもたらすステップの後である第２の時点で、同じマーカーの発現を再度決定する。候補分化因子が膵臓先駆細胞の分化を促進することができるかどうかを、第１の時点におけるマーカーの発現と第２の時点におけるマーカーの発現を比較することによって決定する。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点におけるマーカーの発現と比較して増加または減少した場合、当該候補分化因子は膵臓前駆細胞の分化を促進することができることになる。
【０１１１】
本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、ヒト胚体内胚葉、ＰＤＸ−１陰性前腸内胚葉、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉、または膵臓前駆体または内分泌先駆細胞を含む細胞集団または細胞培養物を利用する。例えば、細胞集団は、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞の実質的に精製された集団であってよい。例えば、細胞集団はヒト膵臓前駆細胞の濃縮された集団であってよく、細胞集団内のヒト細胞の少なくとも約５０％〜９７％がヒト膵臓前駆細胞であり、残りは、内分泌先駆体または内分泌細胞および他の細胞型で構成される。
【０１１２】
本明細書に記載のスクリーニング方法の複数の実施形態では、細胞集団を候補（試験）分化因子と接触させる、または他のやり方で候補（試験）分化因子をもたらす。候補分化因子は、上記の細胞のいずれか、例えばヒト膵臓前駆細胞の分化を促進する潜在性を有し得る任意の分子を含んでよい。本明細書に記載の一部の実施形態では、候補分化因子は、細胞の１種または複数種の型に対する分化因子であることが分かっている分子を含む。代替の実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが分かっていない分子を含む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、ヒト膵臓前駆細胞の分化を促進することが分かっていない分子を含む。
【０１１３】
本明細書に記載されるスクリーニング方法の一部の実施形態では、候補分化因子は小分子を含む。好ましい実施形態では、小分子は約１０，０００ａｍｕ以下の分子量を有する分子である。
【０１１４】
本明細書に記載される他の実施形態では、候補分化因子は、大分子、例えばポリペプチドを含む。ポリペプチドは、限定されずに、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外基質タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキンまたは成長因子を含む、任意のポリペプチドであってもよい。好ましいポリペプチドには、成長因子が含まれる。
【０１１５】
本明細書に記載されるスクリーニング方法の一部の実施形態では、候補分化因子は、アンフィレグリン、Ｂリンパ球刺激物質、ＩＬ−１６、サイモポイエチン、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２、プレＢ細胞コロニー促進因子、内皮分化関連因子１（ＥＤＦ１）、内皮単球活性化ポリペプチドＩＩ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ナチュラルキラー細胞促進因子（ＮＫＥＦＡ）、骨形成タンパク質２、骨形成タンパク質８（骨形成タンパク質２）、骨形成タンパク質６、骨形成タンパク質７、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ＣＧＩ−１４９タンパク質（神経内分泌分化因子）、サイトカインＡ３（マクロファージ炎症タンパク１−アルファ）、グリア芽細胞腫細胞分化関連タンパク質（ＧＢＤＲ１）、肝癌由来成長因子、ニューロメディンＵ−２５先駆体、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮細胞成長因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、Ｔ細胞特異的ＲＡＮＴＥＳ先駆体、胸腺樹状細胞由来因子１、トランスフェリン、インターロイキン−１（ＩＬ１）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターロイキン−３（ＩＬ３）、インターロイキン−４（ＩＬ４）、インターロイキン−５（ＩＬ５）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−７（ＩＬ７）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、インターロイキン−９（ＩＬ９）、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ１３）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ビタミンＤ３、上皮成長因子（ＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ａＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７／ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ、β神経成長因子、アクチビンＡ、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死−α、腫瘍壊死因子−β、バースト促進活性（ＢＰＡ）、赤血球促進活性（ＥＰＡ）、ＰＧＥ２、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、ニューロトロフィン（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン４／５、線毛神経栄養因子、神経膠由来のネキシン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチルヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンホテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン、ＴＷＳ１１９、オキシトシン、バソプレシン、メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、リポトロピン、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン抑制因子、成長ホルモ���放出因子、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド１、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチリン、血管作用性小腸ペプチド、サブスタンスＰ、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシン、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤性ラクトゲン、リラキシン、アンジオテンシンＩＩ、カルシトリオール（ｃａｌｃｔｒｉｏｌ）、心房性ナトリウム利尿ペプチドおよびメラトニン、チロキシン、トリヨードサイロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾル、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフリン、ノルエピネフリン、アンドロスチエン（ａｎｄｒｏｓｔｉｅｎｅ）、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチルヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンホテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオンおよびＴＷＳ１１９からなる群から選択される１つまたは複数の成長因子を含む。
【０１１６】
本明細書に記載されるスクリーニング方法の一部の実施形態では、候補分化因子は、１つまたは複数の濃度で細胞集団に提供される。一部の実施形態では、候補分化因子は、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであるように、細胞集団に提供される。一部の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌである。さらに他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌである。好ましい実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌから約１０００μｇ／ｍｌである。
【０１１７】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるスクリーニング方法のステップは、第１の時点および第２の時点で少なくとも１つのマーカーの発現を判定することを含む。これらの実施形態のいくつかでは、第１の時点は候補分化因子を細胞集団に提供する前かほぼ同じ時期であってもよい。あるいは、一部の実施形態では、第１の時点は、候補分化因子を細胞集団に提供する後である。一部の実施形態では、第１の時点で複数のマーカーの発現が判定される。
【０１１８】
少なくとも１種のマーカーの発現を第１の時点で決定することに加えて、本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、少なくとも１種のマーカーの発現を、第１の時点の後であり、かつ細胞集団に候補分化因子をもたらした後である第２の時点で決定することが意図されている。そのような実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方で同じマーカーの発現を決定する。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方で複数種のマーカーの発現を決定する。そのような実施形態では、第１の時点と第２の時点の両方で同じ複数種のマーカーの発現を決定する。一部の実施形態では、それぞれが第１の時点の後であり、かつそれぞれが細胞集団に候補分化因子をもたらした後である複数の時点でマーカーの発現を決定する。ある特定の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲによってマーカーの発現を決定する。他の実施形態では、免疫細胞化学によってマーカーの発現を決定する。
【０１１９】
本明細書に記載のスクリーニング方法のある特定の実施形態では、第１の時点および第２の時点において発現が決定されるマーカーは、膵臓前駆細胞から膵島組織を構成する最終分化した細胞の先駆体である細胞への分化に関連するマーカーである。そのような細胞としては、未成熟膵島ホルモン発現細胞を挙げることができる。
【０１２０】
本明細書に記載のスクリーニング方法の一部の実施形態では、細胞集団に候補分化因子をもたらすステップと第２の時点におけるマーカーの発現を決定するステップの間に十分な時間を経過させることができる。細胞集団に候補分化因子をもたらすステップと第２の時点におけるマーカーの発現を決定するステップの間の十分な時間は、約１時間の短さから約１０日間の長さまでであってよい。一部の実施形態では、少なくとも１種のマーカーの発現を、細胞集団に候補分化因子をもたらした後に多数回決定する。一部の実施形態では、十分な時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、または少なくとも約８週間である。
【０１２１】
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点におけるこのマーカーの発現と比較して増加または減少したかどうかをさらに決定する。少なくとも１種のマーカーの発現の増加または減少により、候補分化因子が内分泌先駆細胞の分化を促進することができることが示される。同様に、複数種のマーカーの発現を決定する場合、第２の時点における複数種のマーカーの発現が第１の時点におけるこの複数種のマーカーの発現と比較して増加または減少したかどうかをさらに決定する。マーカーの発現の増加または減少は、第１の時点および第２の時点での細胞集団におけるマーカーの量、レベルまたは活性を測定することまたは他のやり方で評価することによって決定することができる。そのような決定は、他のマーカー、例えばハウスキーピング遺伝子発現との比較的なものであってもよく、絶対的なものであってもよい。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点と比較して増加するある特定の実施形態では、増加の量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍または少なくとも約１００倍超である。一部の実施形態では、増加の量は、２倍未満である。第２の時点におけるマーカーの発現が第１の時点と比較して減少する実施形態では、減少の量は、少なくとも約２分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約３０分の１、少なくとも約４０分の１、少なくとも約５０分の１、少なくとも約６０分の１、少なくとも約７０分の１、少なくとも約８０分の１、少なくとも約９０分の１、少なくとも約１００分の１または少なくとも約１００分の１未満である。一部の実施形態では、減少の量は２分の１を下回らない。
【０１２２】
多分化能細胞または分化した細胞の生成のモニタリング
多能性細胞から多分化能細胞、多分化能細胞から膵臓前駆体またはホルモン内分泌細胞などのさらに多分化能の細胞または分化した細胞への進行は、内分泌細胞における島ホルモンの発現およびプロインスリンからインスリンおよびＣペプチドへのプロセシングなどの、遺伝子マーカーおよび表現型マーカーを含めた特定の細胞に特有のマーカーの発現を決定することによってモニタリングすることができる。いくつかのプロセスでは、ある特定のマーカーの発現を、マーカーが存在するかしないかを検出することによって決定する。あるいは、ある特定のマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞中でマーカーが存在するレベルを測定することによって決定することができる。例えば、ある特定のプロセスでは、未成熟膵島ホルモン発現細胞に特有のマーカーの発現、ならびに多能性細胞、胚体内胚葉、前腸内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、内分泌先駆体、胚体外内胚葉、中胚葉、外胚葉、成熟膵島ホルモン発現細胞および／または他の細胞型に特有のマーカーの有意な発現の欠如を決定する。
【０１２３】
他の胚体内胚葉系列の分化の程度がより低い細胞型の生成のモニタリングに関連して記載されている通り、ブロット転写法および免疫細胞化学などの定性的技法または半定量的技法を使用して、マーカーの発現を測定することができる。あるいは、マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲなどの技法を使用することによって正確に定量化することができる。さらに、ポリペプチドレベルでは、膵島ホルモン発現細胞のマーカーの多くは分泌タンパク質であることが理解されよう。このように、ＥＬＩＳＡなどの細胞外マーカー含有量を測定するための技法を利用することができる。
【０１２４】
例えば、一実施形態では、ＰＤＸ１はＰＤＸ１陽性前腸内胚葉と関連したマーカー遺伝子である。このように、本発明の一部の実施形態では、ＰＤＸ１の発現が判定される。他の実施形態では、限定されずにＳＯＸ１７、ＨＮＦ６、ＳＯＸ９およびＰＲＯＸ１などの、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉で発現される他のマーカーの発現も判定される。ＰＤＸ１は特定の他の細胞型（すなわち、内臓内胚葉および特定の神経外胚葉）が発現することもできるので、本発明の一部の実施形態は、内臓内胚葉および／または神経外胚葉と関連したマーカー遺伝子発現の不在または実質的な不在を実証することに関する。例えば、一部の実施形態では、限定されずにＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭを含む、内臓内胚葉および／または神経細胞で発現されるマーカーの発現が判定される。
【０１２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１またはＮＦＭマーカー遺伝子を発現する細胞を実質的に含まない。特定の実施形態では、本明細書に記載されるプロセスによって生成されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、近位内胚葉、遠位内胚葉および／または神経細胞を実質的に含まない。
【０１２６】
本明細書に記載される多能性細胞（例えば、上記Ｄ’Ａｍｏｕｒら２００６に記載されるステージまたはステップ１〜５の結果として生成される細胞）の発達の進行は、発達経路に沿う各ｈＥＳ由来またはｉＰＳ由来の細胞型の特徴であるマーカーの発現を判定することによって監視することができる。一部のプロセスでは、ｈＥＳ由来またはｉＰＳ由来の細胞型の同定および特徴づけは、特定のマーカーの発現または複数のマーカーの異なる発現レベルおよびパターンによる。すなわち、１つまたは複数のマーカーの存在または不在、高発現または低発現は細胞型の特徴を表し、それを特定する。さらに、特定のマーカーは一過性の発現を有することができ、それによりそのマーカーは発達の１つのステージの間に高度に発現され、発達の別のステージでは弱く発現される。特定のマーカーの発現は、標準化または規格化された対照マーカーと比較して細胞培養物または細胞集団の細胞にそのマーカーが存在するレベルを測定することによって判定することができる。そのようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的であっても定量的であってもよい。マーカー遺伝子によって生成されるマーカーの発現を定量化する１つの方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用による。Ｑ−ＰＣＲの実施方法は、当技術分野で周知である。
【０１２７】
本発明の一部の実施形態では、マーカーの存在、不在および／または発現レベルは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって判定される。例えば、特定の遺伝子マーカー、例えばＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７、ＣＤＸ２、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＨＮＦ４アルファ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１および本明細書に記載される他のマーカーによって生成される転写産物の量は、定量的Ｑ−ＰＣＲによって判定される。
【０１２８】
他の実施形態では、免疫組織化学的検査を使用して、上記の遺伝子によって発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲを免疫組織化学的な技法またはフローサイトメトリー技法と併せて使用して、細胞型を有効かつ正確に特徴付け、同定し、目的の細胞型におけるそのようなマーカーの量および相対的割合の両方を決定することができる。一実施形態では、Ｑ−ＰＣＲにより、細胞が混在する集団を含有する細胞培養物におけるＲＮＡ発現のレベルを数量化することができる。しかし、Ｑ−ＰＣＲでは、目的のマーカーまたはタンパク質が同じ細胞で共発現されるかどうかをもたらすまたは認定することはできない。別の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲをフローサイトメトリー法と併せて使用して細胞型を特徴付け、同定する。したがって、本明細書に記載の方法と、例えば上記のものなどを組み合わせて使用することによって、内胚葉系列型細胞を含めた種々の細胞型の完全な特徴付けおよび同定を実現および実証することができる。
【０１２９】
例えば、好ましい一実施形態では、膵臓前駆体または膵臓内胚葉またはＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉は、Ｑ−ＰＣＲおよび／またはＩＣＣによって実証される通り少なくともＰＤＸ１、Ｎｋｘ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよび／またはｃＭＹＣを発現するが、そのような細胞は、ＰＤＸ１陽性発現細胞と同定されるためには、ＩＣＣによって実証される通り少なくともＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１を共発現し、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、またはＣＥＲを含めた他のマーカーを発現しない。同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで成熟ホルモン分泌膵臓細胞を適切に同定するために、例えばインスリン分泌細胞において、Ｃ−ペプチド（成熟かつ機能性のβ細胞におけるプロインスリンの適切なプロセシングの産物）およびインスリンが共発現されることがＩＣＣによって実証される。
【０１３０】
さらに、当技術分野で公知の他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量化するために使用することができる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を使用することによって検出することができる（例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー分析など）。ある特定のプロセスでは、ｈＥＳ由来細胞に特有のマーカー遺伝子の発現ならびにｈＥＳ由来細胞に特有のマーカー遺伝子の有意な発現の欠如。ｈＥＳ由来細胞型を特徴付け、同定するためのさらに別の方法は、上に示されている関連出願に記載され、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０１３１】
増幅アッセイで使用するのに適する増幅プローブ／プライマー組合せは、以下の通りである：インスリン（ＩＮＳ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０００２０７）：プライマーＡＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＡ（配列番号１）；ＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＣＡＣＡ（配列番号２）；Ｎｋｘ６．１（ＮＭ＿００６１６８）：プライマーＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＣＣＴＣＡＴＣＡ（配列番号３）；ＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号４）；Ｐｄｘ１（ＮＭ＿０００２０９）：プライマーＡＡＧＴＣＴＡＣＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＧＣＧ（配列番号５）；ＧＴＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣ（配列番号６）；Ｎｇｎ３（ＮＭ＿０２０９９９）：プライマーＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＣＴＡＴＴＣＴＴＴＴＧＣ（配列番号７）；ＧＧＴＴＧＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＴ（配列番号８）；ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３Ｂ）（ＮＭ＿０２１７８４）：プライマーＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡ（配列番号９）；ＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡＧＴＡ（配列番号１０）；グルカゴン（ＧＣＧ）（ＮＭ＿００２０５４）：プライマーＡＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＴＴ（配列番号１１）；ＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴ（配列番号１２）；ＨＮＦ６（ＮＭ＿０３０７１２）：プライマーＣＧＣＴＣＣＧＣＴＴＡＧＣＡＧＣＡＴ（配列番号１３）；ＧＴＧＴＴＧＣＣＴＣＴＡＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴ（配列番号１４）；ＨＮＦ４アルファ（ＮＭ＿０００４５７）：プライマーＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＴＣＣＡＧＡ（配列番号１５）；ＧＡＣＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧ（配列番号１６）；Ｓｏｘ１７（ＮＭ＿０２２４５４）：プライマーＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡ（配列番号１７）；ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮ（配列番号１８）；ＨＬｘＢ９（ＮＭ＿００５５１５）：プライマーＣＡＣＣＧＣＧＧＧＣＡＴＧＡＴＣ（配列番号１９）；ＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＣＧＡ（配列番号２０）；Ｎｋｘ２．２（ＮＭ＿００２５０９）：プライマーＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＣＡ（配列番号２１）；ＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＴＣＣＴ（配列番号２２）；ＰＴＦ１ａ（ＮＭ＿１７８１６１）：プライマーＧＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＧ（配列番号２３）；ＧＧＣＣＡＴＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＣＴ（配列番号２４）；ＳＳＴ（ＮＭ＿００１０４８）：プライマーＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＧＴＴＴＣ（配列番号２５）；ＴＣＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧ（配列番号２６）；ＰＡＸ６（ＮＭ＿０００２８０）：プライマーＣＣＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＡＡＡＧＧ（配列番号２７）；ＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＡＧＴＴＡ（配列番号２８）；Ｏｃｔ４プライマー：ＴＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧ（配列番号２９）；ＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＧ（配列番号３０）；ＭＩＸＬ１プライマーＣＣＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡ（配列番号３１）ＣＴＣＴＧＡＣＧＣＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧ（配列番号３２）；ＧＡＴＡ４プライマーＣＣＴＣＴＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧ（配列番号３３）ＣＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＣ��ＣＡＣＴ（配列番号３４）；ＧＳＣプライマーＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＴ（配列番号３５）ＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号３６）；ＣＥＲプライマーＡＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴ（配列番号３７）ＡＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴ（配列番号３８）；ＡＦＰプライマーＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡ（配列番号３９）ＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡ（配列番号４０）；ＳＯＸ１プライマーＡＴＧＣＡＣＣＧＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＧ（配列番号４１）ＣＴＣＡＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＧＡＧＴＴＧ（配列番号４２）；ＺＩＣ１プライマーＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＧＴＣＴＴＣ（配列番号４３）ＣＡＧＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＣＧＣＡＣＴＴ（配列番号４４）；ＮＦＭプライマーＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＡＣＡＡＣ（配列番号４５）ＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴ（配列番号４６）。他のプライマーは、ＦＧＦ１７（Ｈｓ００１８２５９９＿ｍ１）、ＶＷＦ（Ｈｓ００１６９７９５＿ｍ１）、ＣＭＫＯＲ１（Ｈｓ００６０４５６７＿ｍ１）、ＣＲＩＰ１（Ｈｓ００８３２８１６＿ｇ１）、ＦＯＸＱ１（Ｈｓ００５３６４２５＿ｓ１）、ＣＡＬＣＲ（Ｈｓ００１５６２２９＿ｍ１）およびＣＨＧＡ（Ｈｓ００１５４４４１＿ｍ１）を含め、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎを通して入手できる。
【０１３２】
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉（ステージ１〜４）の生成およびインスリン生成の要約
特定の内胚葉系列および膵臓内胚葉系列細胞の生成のための方法が本明細書で提供され、関連出願、例えば２００７年７月５日に出願の米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳの別の箇所で述べられ、それは２００７年３月２日に出願の米国特許出願第１１／６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ  ＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮの一部継続出願であり、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０１３３】
簡単に述べると、多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞に関する本発明の定方向分化法は、少なくとも４つまたは５つのステージで説明することができる。ステージ１は、多能性幹細胞からの胚体内胚葉の生成であり、約２〜５日、好ましくは２日または３日かかる。多能性幹細胞は、ＲＰＭＩ、ＴＧＦスーパーファミリーメンバー成長因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＷｎｔファミリーメンバーまたはＷｎｔ経路アクチベータ、例えばＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）、あるいはｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤、例えばＹ−２７６３２（１０μΜ）を含む培地に懸濁させ、成長、生存および増殖を増強するだけでなく細胞間接着を促進する。約２４時間後に、培地を、血清、例えば０．２％ＦＢＳなど、およびＴＧＦβスーパーファミリーメンバー成長因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８またはＧＤＦ−１１など（１００ｎｇ／ｍＬ）、あるいはｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤を含有するＲＰＭＩを含む培地と交換し、さらに２４時間（１日目）〜４８時間（２日目）置く。あるいは、アクチビン／Ｗｎｔ３ａを含む培地中に約２４時間置いた後、その後の２４時間、アクチビンを単独で含む培地（すなわち、培地はＷｎｔ３ａを含まない）で細胞を培養する。重要なことに、胚体内胚葉の生成には、低血清含有量、およびそれにより、低インスリンまたはインスリン様成長因子含有量の細胞培養条件が必要である。本明細書に完全に組み込まれるＭｃＬｅａｎら（２００７）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：２９−３８を参照されたい。ＭｃＬｅａｎらにより、ステージ１においてｈＥＳ細胞をわずか０．２μｇ／ｍＬの濃度のインスリンと接触させることは、胚体内胚葉の生成にとって有害であり得ることも示された。また別の当業者により、多能性細胞から胚体内胚葉へのステージ１分化が実質的に本明細書およびＤ’Ａｍｏｕｒら（２００５）に記載の通り改変された。例えば、少なくとも、Ａｇａｒｗａｌら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２００８）２６：１１１７−１１２７；Ｂｏｒｏｗｉａｋら、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｏｕｓｅおよびＨｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：３４８−３５８；およびＢｒｕｎｎｅｒら、Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ、（２００９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １９：１０４４−１０５６。他の内胚葉系列細胞を導出するためには胚体内胚葉の適切な分化、特定化、特徴付けおよび同定が必要である。このステージにおける胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）を共発���し、少なくともＨＮＦ４アルファ、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、またはＰＰは評価できるほどには発現しない。
【０１３４】
ステージ２はステージ１から胚体内胚葉細胞培養物をとり、懸濁培養物をＩＴＳの１：１０００希釈液中の０．２％ＦＢＳなどの低い血清レベル、２５ｎｇのＫＧＦ（またはＦＧＦ７）、あるいはＲＯＣＫ阻害剤を有するＲＰＭＩと２４時間（２日目から３日目）インキュベートして、成長、生存、増殖を増強し、細胞間接着を促進することによって、前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉を生成する。２４時間後に（３日目〜４日目）、培地を、ＴＧＦβ阻害剤を含まないが、その代わりに、細胞の成長、生存および増殖を増強するためにＲＯＣＫ阻害剤をなお含む同じ培地と交換し、さらに２４時間（４日目〜５日目）〜４８時間（６日目）置く。前腸内胚葉を適切に特定化するための重要なステップはＴＧＦβファミリー成長因子の除去である。したがって、２．５μＭのＴＧＦβ阻害剤番号４またはＴＧＦβＩ型受容体であるアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）の特異的な阻害剤である５μＭのＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ阻害剤をステージ２細胞培養物に添加することができる。ステージ２で生成した前腸内胚葉またはＰＤＸ１−陰性前腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１βおよびＨＮＦ４アルファを共発現し、胚体内胚葉、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞または内分泌先駆体ならびに単一または複数ホルモン型細胞の特質である、少なくともＳＯＸ１７およびＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）も、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、またはＰＰも評価できるほどには共発現しない。
【０１３５】
ステージ３（５〜８日目）では、ステージ２から前腸内胚葉細胞培養物を取得し、１％Ｂ２７、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン、０．２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイドまたは３ｎＭのＴＴＮＰＢなどのレチノイン酸類似体、および５０ｎｇ／ｍＬのノギン中、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩにより、約２４時間（７日目）〜４８時間（８日目）にわたってＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を生成する。具体的には、出願人らは、およそ２００３年からＤＭＥＭ−高グルコースを使用しており、その時点の全ての特許および非特許開示物では、「ＤＭＥＭ−高グルコース」などの言及がなくてもＤＭＥＭ−高グルコースが使用されている。これは、一部において、Ｇｉｂｃｏなどの製造者が、例えばＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１１９６０）およびＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１０８２９）などのように、ＤＭＥＭをそのように名付けていなかったことが理由である。本出願の出願日時点で、ＧｉｂｃｏはさらなるＤＭＥＭ製品を提供しているが、従来通り、例えばＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（Ｃａｔ番号１０８２９−０１８）など、それらの高グルコースを含有するある特定のＤＭＥＭ産物に「高グルコース」と付けていないことに注目すべきである。したがって、ＤＭＥＭが記載されているそれぞれの場合に、高グルコースを含有するＤＭＥＭを意味すると推定することができ、これは、この分野における研究開発を行っている他者には明らかなことであった。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤またはｒｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＹ−２７６３２などを使用して、成長、生存、増殖を増強することおよび細胞間接着を促進することができる。ステージ３で生成したＰＤＸ１陽性前腸細胞は、ＰＤＸ１およびＨＮＦ６、ならびにＳＯＸ９およびＰＲＯＸを共発現し、上のステージ１およびステージ２に記載されている胚体内胚葉細胞もしくは前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）細胞またはＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を示すマーカーは評価できるほどには共発現しない。
【０１３６】
ステージ４（８〜１４日目）では、ステージ３から培地を取得し、それを、１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＢ２７サプリメント、それに加えて５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦおよび５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および時にはさらに５０ｎｇ／ｍＬのノギン中、ＤＭＥＭを含有する培地と交換する。再び、成長、生存、増殖を増強し、細胞間接着を促進するために、Ｙ−２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。ステージ４から生成されるＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞は、少なくともＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１、ならびにＰＴＦ１Ａを共発現し、上においてステージ１、２および３で記載される胚体内胚葉または前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）細胞の指標となるマーカーをあまり発現しない。
【０１３７】
あるいは、ステージ４からの細胞は、約１〜６日間（１５日目から２０日目）の１体積／体積％のＢ２７サプリメント中のＤＭＥＭ含有培地で、ステージ５でさらに分化させて、内分泌先駆体もしくは前駆体型の細胞および／または単一および複数ホルモン性の膵臓内分泌型の細胞をステージ４細胞から生成することができる。ステージ５から生成される内分泌先駆細胞は、少なくともＮＧＮ３およびＰＡＸ４ならびにＮｋｘ２．２を共発現し、上においてステージ１、２、３および４で記載される、胚体内胚葉または前腸内胚葉（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉もしくは前駆細胞の指標となるマーカーを感知し得るほどには発現しない。
【０１３８】
ステージ４で生成したＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉をマクロ封入デバイスにローディングし、完全に含有させ、患者に移植し、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで膵臓ホルモン分泌細胞、例えばインスリン分泌性細胞に成熟させる。ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の封入およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるインスリンの生成は、米国特許出願第１２／６１８，６５９号（‘６５９出願”）、表題「ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＬＩＮＥＡＧＥ  ＣＥＬＬＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＨＵＭＡＮ  ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ」、２００９年１１月１３日出願に詳細に記載されている。‘６５９出願は、仮特許出願第６１／１１４，８５７号、表題「ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＨＥＳ  ＣＥＬＬＳ」、２００８年１１月１４日出願；および米国特許仮出願第６１／１２１，０８４号、表題「ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＣＥＬＬＳ」、２００８年１２月９日出願の優先権を主張するものである。これらの出願の各々の開示は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０１３９】
本明細書に記載の方法、組成物およびデバイスは、現在、好ましい実施形態を表し、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。その変化および他の使用は本発明の主旨の範囲内に包含され、本開示の範囲によって定義されることが当業者には想起されよう。したがって、本明細書に開示されている発明に対して、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく様々な置換および改変を行うことができることが当業者には明らかになろう。
【０１４０】
例えば、多能性細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞から胚体内胚葉を生成するために、成長因子またはシグナル伝達タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであるアクチビンＡが使用されるが、参照により本明細書に完全に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５６８６号、表題「ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ」、２００８年６月３日出願に記載されているものなど他のＴＧＦβスーパーファミリーメンバー、例えばＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１を、胚体内胚葉を生成するために使用することができる。
【０１４１】
ステージ２のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞をステージ３のＰＤＸ１陽性前腸細胞に分化させるためにレチノイン酸（ＲＡ）を使用する。しかし、４−［（Ｅ）−２−（５、６、７、８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸（またはＴＴＮＰＢ）などの他のレチノイドまたはレチノイン酸類似体および同様の類似体（例えば、４−ＨＢＴＴＮＰＢ）を使用することができる。
【０１４２】
ノギンは、例えば、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）などのＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達タンパク質のメンバーを不活化するタンパク質である。しかし、コーディンおよびねじれ原腸形成（Ｔｗｉｓｔｅｄ  Ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）（Ｔｓｇ）などの他のＢＭＰ４阻害剤または抗ＢＭＰ中和抗体によっても、ＢＭＰとその細胞表面受容体の結合を妨げ、それにより、ＢＭＰシグナル伝達を有効に阻害することができる。あるいは、ヒトノギンの遺伝子はクローニングされ、配列決定されている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０７５，００７号を参照されたい。ノギン配列の解析により、Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤との相同性を有するカルボキシ末端領域が示され、これにより、潜在的に他のＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤がＢＭＰの阻害に関して同様の効果を有し得ることが示されている。
【０１４３】
最後に、本明細書および米国出願第１２／６１８，６５９号に記載され、参照により本明細書に完全に組み込まれているマクロ封入デバイスは、再度、単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。特に、デバイスのサイズ、デバイス内のチャンバーまたは亜区画が複数であること、またはポートが複数であること、さらにはデバイスのローディングおよび抽出の機構などのデバイス設計の変化は全て本発明の主旨の範囲内に包含される。したがって、本明細書に記載の分化方法への種々の置換および改変だけでなく、封入デバイスへの種々の置換および改変も同様に、本明細書に開示されている発明に対して、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく行うことができることが当業者には明らかになろう。
【０１４４】
胚体内胚葉の生成および組成物（ステージ１）
一部のプロセスでは、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を多能性細胞培養物に供給することによって達成される。胚体内胚葉の生成のために有益であるＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、Ｎｏｄａｌ／アクチビン、ＧＤＦ−８、−９、−１０、−１１等またはＢＭＰサブグループから選択される。一部の好ましい分化プロセスでは、成長因子は、Ｎｏｄａｌ、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１およびＢＭＰ４からなる群から選択される。さらに、成長因子Ｗｎｔ３ａ、他のＷｎｔファミリーメンバー、およびＷｎｔ経路アクチベータが胚体内胚葉細胞の生成のために有益である。ある特定の分化プロセスでは、前述の成長因子のいずれかの組合せを使用することができる。この方法および他の方法は米国特許第７，５１０．８７６号に詳細に記載され、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるためのプロセスの一部に関して、上記の成長因子は、成長因子が培養物中に、多能性細胞の少なくとも一部分から胚体内胚葉細胞への分化を促進するために十分な濃度で存在するように細胞に供給される。いくつかのプロセスでは、上記の成長因子は、細胞培養物中に少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍＬまたは約５０００ｎｇ／ｍＬ超の濃度で存在する。
【０１４６】
胚体内胚葉細胞への多能性細胞の分化のためのある特定のプロセスでは、前述の成長因子はそれらが添加された後に細胞培養物から除去される。例えば、成長因子を添加してから約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内または約１０日以内にそれらを除去することができる。好ましいプロセスでは、成長因子を添加した約４日後にそれらを除去する。
【０１４７】
本明細書に記載されるプロセスの一部の実施形態では、胚体内胚葉細胞はさらなる分化の前に濃縮、単離および／または精製される。そのような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、任意の公知の方法を使用して濃縮、単離および／または精製することができる。好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、２００４年１２月２３日に出願の米国特許出願第１１／０２１，６１８号、表題ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ、および２００５年１１月１４日に出願の米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号、表題ＭＡＲＫＥＲＳ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭに記載される方法の１つまたは複数を使用して濃縮、単離および／または精製され、その開示は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
好ましい実施形態では、ハウスキーピング遺伝子などの対照遺伝子のレベルに標準化され、比較されるとき、本明細書で生成され、記載される胚体内胚葉細胞は、比較的高いレベルのＣＥＲ、ＧＳＣ、ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７およびＦＯＸＡ２遺伝子発現を有する。
【０１４９】
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉の生成および組成物（ステージ２）
胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を生成するこれらの細胞のさらなる分化によって、膵臓分化の方向に特定化することができる。本明細書に記載される分化プロセスの一部では、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物ならびに濃縮または精製された細胞集団は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および／または濃縮された細胞集団へのさらなる分化のために使用することができる。
【０１５０】
一般的に、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団でＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達を低減、除去（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ）または取り除く（ｒｅｍｏｖｉｎｇ）ことによって、胚体内胚葉細胞はＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に分化する。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達を低減または除去することは、外部から加えられるＴＧＦβスーパーファミリー成長因子、例えばアクチビンＡを希釈するか、胚体内胚葉の細胞培養物または細胞集団から除去することによって媒介される。他の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達は、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達をブロックする化合物、例えばフォリスタチンおよび／またはノギンを胚体内胚葉細胞に供給することによって低減または除去される。一部の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達は、胚体内胚葉細胞へのヒト多能性細胞の分化の後の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日または約１０日を超える間、低減または除去することができる。
【０１５１】
一部の実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／またはヘッジホッグ経路阻害剤を胚体内胚葉細胞培養物または細胞集団に供給することによって、前腸内胚葉細胞への胚体内胚葉細胞の分化が増強される。そのような実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／またはヘッジホッグ経路阻害剤は、胚体内胚葉細胞培養物でのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去から約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日の後、または約１０日を超える日数の後に供給される。好ましい実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／またはヘッジホッグ経路阻害剤は、胚体内胚葉細胞培養物でのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去とほぼ同じ時期に供給される。
【０１５２】
好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞培養物または細胞集団に供給されるＦＧＦファミリー成長因子は、ＦＧＦ１０および／またはＦＧＦ７である。しかし、他のＦＧＦファミリー成長因子またはＦＧＦファミリー成長因子類似体もしくは模倣体をＦＧＦ１０および／またはＦＧＦ７の代わりに、またはそれに加えて供給することができることが理解される。例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、およびＦＧＦ２３までのそれらからなる群から選択されるＦＧＦファミリー成長因子を供給することができる。そのような実施形態では、ＦＧＦファミリー成長因子および／またはＦＧＦファミリー成長因子類似体もしくは模倣体は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように細胞培養物の細胞に供給される。
【０１５３】
他の好ましい実施形態では、ヘッジホッグ阻害剤は、ＫＡＡＤ−シクロパミンである。しかし、他のヘッジホッグ阻害剤を使用することができることが理解される。そのような阻害剤には、ＫＡＡＤ−シクロパミン類似体、ジェルビン、ジェルビン類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体、および当業者に公知であるヘッジホッグ経路機能の任意の他の阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。単独で、またはＦＧＦファミリー成長因子と併用されるとき、ヘッジホッグ阻害剤は少なくとも約０．０１μΜから５０μΜの濃度で供給することができる。
【０１５４】
胚体内胚葉細胞からのＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の集団の生成のための好ましいプロセスでは、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達は、胚体内胚葉へのヒト多能性細胞の実質部分の分化から約２日の間低減または除去される（例えば、下の実施例に記載される３日、４または５日分化プロトコルの後）。同じ頃に、胚体内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団に、ノギンおよびＫＡＡＤ−シクロパミン、例えば、２ｍＭのＲＡまたは３ｎＭのＴＴＮＰＢの存在下のＤＭＥＭ培地中に５０ｎｇ／ｍｌのノギンおよび０．２５μＭのＫＡＡＤ−シクロパミンを供給する。
【０１５５】
一部の実施形態では、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、レチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイドを含有する培地と細胞を接触させるか、さもなければそれを細胞に供給することによって、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞にさらに分化させることができる。一部の実施形態では、少なくとも約１ｎＭから５０μＭの濃度で存在するように、レチノイドを細胞培養物の細胞に供給する。そのような実施形態では、レチノイドは、胚体内胚葉細胞培養物でのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去から約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日の後、または約１０日を超える日数の後に細胞に供給される。好ましい実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達の低減または除去から約２〜３日後に、約０．０５μΜのＲＡから約２μΜのＲＡがＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞培養物に供給される。
【０１５６】
本明細書に記載される分化プロセスの一部では、前述の分化因子は添加された後に細胞培養物から除去される。例えば、前述の分化因子は、添加してから約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日以内に除去することができる。
【０１５７】
好ましい実施形態では、ハウスキーピング遺伝子などの対照遺伝子のレベルに標準化されるとき、本明細書で生成され、記載されるＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、比較的高いレベルのＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１ＢおよびＨＮＦ４Ａ遺伝子発現を有する。特に、ＨＮＦ４Ａ遺伝子発現レベルは、例えば胚体内胚葉培養物からのＴＧＦβスーパーファミリー成長因子シグナル伝達（例えば、アクチビン）の除去まで実質的に増加しない。
【０１５８】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の生成および組成物（ステージ３）
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞またはＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉またはそれらの等価物を生成するこれらの細胞のさらなる分化によって、膵臓分化の方向にさらに特定化することができる。本明細書に記載される分化プロセスの一部では、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物ならびに濃縮または精製された細胞集団は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および／または濃縮された細胞集団へのさらなる分化のために使用することができる。
【０１５９】
一般的に、レチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイドをＳＯＸ１７陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物に供給することによって、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞をＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化させる。分化プロセスの一部では、培養物中のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞には、ＲＡの添加の前かそれとほぼ同じ時期に線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーも供給される。好ましい線維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ−７である。別の好ましいプロセスでは、線維芽細胞成長因子は、任意の線維芽細胞成長因子、または線維芽細胞成長因子２受容体ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ））を刺激するかさもなければそれと相互作用するリガンドを含む。さらに好ましいプロセスでは、ＦＧＦファミリー成長因子は、ヘッジホッグ経路阻害剤と併用される。好ましいヘッジホッグ経路阻害剤は、ＫＡＡＤ−シクロパミンである。特に好ましい分化プロセスでは、ＲＡ存在下でのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に、ＦＧＦ−１０および／またはＫＡＡＤ−シクロパミンが供給される。ある特定のプロセスでは、ＲＡ存在下でＢＭＰ４がＦＧＦ１０および／またはＫＡＡＤ−シクロパミンとともに含まれてもよい。一部のプロセスでは、レチノイドは、ΤＧＦβスーパーファミリー成長因子のメンバーおよび／またはＣｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ培地（ＣＲＭＬ培地）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と併用される。
【０１６０】
本明細書に記載される分化プロセスの実施形態の一部に関して、レチノイドおよび／または前述の分化因子の組合せは、これらの因子がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞培養物または細胞集団の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。
【０１６１】
他のプロセスでは、ＦＧＦ−１０は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、および５０μΜまでの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞に供給される。本発明の一部の実施形態では、線維芽細胞成長因子または線維芽細胞成長因子２受容体ＩＩＩｂ（ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｂ））を刺激するかさもなければそれと相互作用するリガンドが、単独で、またはヘッジホッグ経路阻害剤と組み合わせて供給される。
【０１６２】
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の集団の生成のための好ましいプロセスでは、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の細胞培養物または濃縮された細胞集団に、ＦＧＦ−７、ＫＡＡＤ−シクロパミンおよびレチノイン酸（ＲＡ）、例えば２μΜのＲＡ存在下のＣＭＲＬ培地中の２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−７および０．２μΜのＫＡＡＤ−シクロパミンが供給される。
【０１６３】
本明細書に記載される一部のプロセスでは、ＴＧＦβシグナル伝達因子、例えばアクチビンＡおよび／またはアクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１等は、レチノイドおよび／または線維芽細胞成長因子およびヘッジホッグ阻害剤と一緒に細胞培養物に供給される。例えばそのようなプロセスでは、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢおよび／またはＧＤＦ−８および／またはＧＤＦ−１１は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌまたは少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に供給される。
【０１６４】
一部のプロセスでは、分化因子および／またはＣＲＭＬ培地は、多能性細胞からの分化の開始から約１日、２日、３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日後、または約１０日を超える日数の後に、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に供給される。好ましいプロセスでは、分化因子および／またはＣＲＭＬ培地は、多能性幹細胞からの分化の開始から約３日、または４日、または５日後にＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に供給される。
【０１６５】
本明細書に記載されるある特定のプロセスでは、前述の分化因子は添加された後に細胞培養物から除去される。例えば、前述の分化因子は、添加してから約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日または約１０日以内に除去することができる。
【０１６６】
これらおよび他の方法は、２００５年１０月２７日に出願の米国特許仮出願第６０／７３０，９１７号、表題ＰＤＸ１−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＤＯＲＳＡＬ  ＡＮＤ  ＶＥＮＴＲＡＬ  ＦＯＲＥＧＵＴ  ＥＮＤＯＤＥＲＭに詳細に記載され、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、２００５年４月２６日に出願の米国特許出願第１１／１１５，８６８号、表題ＰＤＸ１  ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＥＮＤＯＤＥＲＭに見出すことができ、その開示は参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【０１６７】
好ましい実施形態では、ハウスキーピング遺伝子などの対照遺伝子のレベルに標準化され、比較されるとき、本明細書で生成され、記載されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、比較的高いレベルのＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡおよびｃＭＹＣ遺伝子発現を有する。
【０１６８】
ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉の生成および組成物（ステージ４）
ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉または「膵臓上皮」またはより一般に膵臓前駆体の生成および組成物は、２００８年７月２日に出願の米国特許出願第１２／１６７，２２７号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳに詳細に記載され、それは米国特許第７，５３４，６０８号として２００９年５月１９日に公布された。第１２／１６７，２２７号出願は、２００７年７月５日に出願の米国特許出願第１１／７７３，９４４号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳの継続出願であり、それは２００７年３月２日に出願の米国特許出願第１１／６８１，６８７号、表題ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ  ＣＥＬＬＳ，ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥ−ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮの一部継続出願である。これらの出願の各々の開示は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
第１２／１６７，２２７号出願の実施例２２は、本明細書ステージ１〜４に記載される細胞培養条件の様々な改変を詳細に記載する。一般に、ステージ３のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉型の細胞は、１体積／体積％のＢ２７サプリメント中のＤＭＥＭに加えてノギン、または別のＢＭＰ４特異的阻害剤を含有する培地で、約１〜３日、または約１〜４日、または１〜５日、または約１〜６日の間培養される。ステージ４の終わりに、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉が生成され、その細胞はＰＤＸ１およびＮｋｘ６．１ならびにＰＴＦ１Ａを少なくとも共発現する。細胞培養物は、ステージ５の単一もしくは複数ホルモン性内分泌細胞、またはステージ１の胚体内胚葉細胞、またはステージ２のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、またはステージ３のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の指標となる細胞を認め得る程には発現しない。
【０１７０】
内分泌先駆細胞の生成および組成物（ステージ５）
本明細書に記載される一部の実施形態は、多能性細胞から開始して内分泌先駆細胞を生成する方法に関する。上記の通り、内分泌先駆細胞は、最初に多能性細胞を分化させて胚体内胚葉細胞を生成し、次に胚体内胚葉細胞をさらに分化させてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を生成することによって生成することができる。そのような実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、多分化能内分泌先駆細胞にさらに分化し、それはヒト膵島ホルモン発現細胞に分化することが可能である。
【０１７１】
一実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、内分泌先駆細胞の生成に十分な時間、レチノイン酸などのレチノイドの存在下でＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞のインキュベーションを続けることによって内分泌先駆細胞に分化する。一部の実施形態では、内分泌先駆細胞の生成に十分な時間は、細胞培養物中の細胞の一部でのＰＤＸ１マーカーの発現の後の約１時間から約１０日間である。一部の実施形態では、レチノイドは細胞培養物中に、細胞培養物中の細胞の一部でのＰＤＸ１マーカーの発現の後の約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、または約１０日を超える日数維持される。
【０１７２】
本明細書に記載される一部のプロセスでは、内分泌先駆細胞に細胞培養物または細胞集団中のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を分化させるために使用されるレチノイドの濃度は、約１ｎＭから約１００μΜである。
【０１７３】
一部の好ましい実施形態では、ヒトＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団へのガンマセクレターゼ阻害剤の供給によって、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞から膵臓内分泌先駆細胞への分化が媒介される。好ましい一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）である。
【０１７４】
他の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、分化プロセスの開始時に、例えば多能性ステージに供給され、膵島ホルモン発現細胞への分化の間ずっと細胞培養物中に残存する。さらに他の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、分化の開始の後に、しかしＰＤＸ１陽性前腸内胚葉ステージへの分化の前に加えられる。好ましい実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、ＰＤＸ１陽性内胚葉への胚体内胚葉の変換を促進する分化因子の供給と同じ頃に、細胞培養物または細胞集団に供給される。他の好ましい実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の細胞の実質的な部分がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化した後に、ガンマセクレターゼ阻害剤は細胞培養物または細胞集団に供給される。
【０１７５】
内分泌先駆細胞へのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化に関する一部の実施形態に関して、ガンマセクレターゼ阻害剤は、内分泌先駆細胞へのＰＤＸ１陽性細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、約０．０１μΜから約１０００μΜの濃度で細胞培養物または細胞集団に存在する。好ましい実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、約０．１μΜから約１００μΜの濃度で細胞培養物または細胞集団に存在する。
【０１７６】
本明細書に記載される内分泌先駆細胞を生成するプロセスのある特定の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、前に供給された１つまたは複数の分化因子が細胞培養物から除去された後に供給される。例えば、前に供給される１つまたは複数の分化因子は、ガンマセクレターゼ阻害剤の添加より約１日から１０日前、または約１０日以上前に除去することができる。他の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、前に供給されたか、ガンマセクレターゼ阻害剤と同じ頃に供給された１つまたは複数の分化因子を含む細胞培養物または細胞集団に供給される。好ましい実施形態では、前に供給されたかガンマセクレターゼ阻害剤と同じ頃に供給された分化因子としては、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１１、ＢＭＰ４および／またはＲＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
本明細書に記載の本発明の一部の実施形態では、分化する細胞培養物または細胞集団に、ガンマセレクターゼ阻害剤とほぼ同じ時間にエキセンディン４をもたらす。ある特定の実施形態では、エキセンディン４を、細胞培養物または細胞集団中に少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬから、１０００ｎｇ／ｍＬまでの濃度で存在するようにもたらす。
【０１７８】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞からの内分泌先駆細胞の生成のための好ましいプロセスでは、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団は、３μΜのＤＡＰＴおよび４０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン４が供給される。特に好ましい実施形態では、細胞はＣＭＲＬで分化する。別の特に好ましいプロセスでは、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞からの内分泌先駆細胞の生成のために、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の細胞培養物または細胞集団には、２μΜのＲＡの存在下で３μΜのＤＡＰＴおよび４０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン４が供給される。
【０１７９】
ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、内分泌先駆細胞において分化の状態に応じて様々な異なるレベルにわたって誘導されることが理解されよう。そのように、本明細書に記載の一部の実施形態では、内分泌先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現の少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍である。他の実施形態では、内分泌先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現の少なくとも約４倍、少なくとも約６倍〜１０，０００倍である。一部の実施形態では、内分泌先駆細胞または細胞集団におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、非内分泌先駆細胞または細胞集団、例えば、多能性細胞様ｉＰＳ細胞およびｈＥＳ細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、未成熟膵島ホルモン発現細胞、成熟膵島ホルモン発現細胞、胚体外内胚葉細胞、中胚葉細胞および／または外胚葉細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現よりもはるかに高い。
【０１８０】
本発明の別の実施形態は、ヒト内分泌先駆細胞などのヒト細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％においてＮＧＮ３マーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい組成物に関する。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％〜９８％においてＮＧＮ３マーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の、ＮＧＮ３の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きいヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞を考慮せずに算出する。
【０１８１】
本発明の一部の実施形態は、ヒト内分泌先駆細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％から少なくとも約９８％超までにおいてＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい組成物に関することが理解されよう。一部の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％〜ヒト細胞の９８％においてＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きい。一部の実施形態では、細胞培養物または細胞集団中の、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーの発現よりも大きいヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞を考慮せずに算出する。
【０１８２】
本発明の追加の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した哺乳動物細胞、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化したヒト細胞を含む組成物、例えば細胞培養物または細胞集団に関し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約２％では、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬおよび／またはＰＡＸ６マーカーの発現より大きい。他の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の少なくとも約５％からｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚体内胚葉から分化した細胞の９８％で、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２および／またはＰＡＸ４マーカーの発現は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬおよび／またはＰＡＸ６マーカーの発現より大きい。
【０１８３】
本明細書に記載のプロセスを使用して、他の細胞型を実質的に含まない、内分泌先駆細胞を含む組成物を生成することができる。本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する内分泌先駆細胞集団または細胞培養物は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成する細胞培養物の内分泌先駆細胞集団は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、ＭＡＦＡ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＨＲＬ、および／またはＰＡＸ６マーカーを有意に発現する細胞を実質的に含まない。
【０１８４】
本発明の一実施形態では、マーカーの発現に基づく内分泌先駆細胞の記述は、高ＮＧＮ３、高ＮＫＸ２．２、高ＰＡＸ４、低ＡＦＰ、低ＳＯＸ７、低ＳＯＸ１、低ＺＩＣ１、低ＮＦＭ、低ＭＡＦＡ；低ＳＹＰ；低ＣＨＧＡ；低ＩＮＳ、低ＧＣＧ、低ＳＳＴ、低ＧＨＲＬおよび／または低ＰＡＸ６である。
【０１８５】
未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成
本明細書に記載される実施形態は、多能性細胞から開始して未熟な膵島ホルモン発現細胞を生成する方法に関する。上記の通り、未熟な膵島ホルモン発現細胞は、最初に多能性細胞を分化させて胚体内胚葉細胞を生成し、胚体内胚葉細胞を分化させて前腸内胚葉細胞を生成し、前腸内胚葉を分化させてＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を生成し、次にＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞をさらに分化させて内分泌先駆細胞を生成することによって生成することができる。一部の実施形態では、内分泌先駆細胞を未熟な膵島ホルモン発現細胞にさらに分化させることによって、そのプロセスを継続する。
【０１８６】
本発明の一部の実施形態では、細胞がＮＧＮ３を実質的に発現することを停止し、ＰＡＸ６の発現を開始するのに十分な時間、および細胞が少なくとも１つの膵島細胞ホルモンを発現する能力を有するように、ガンマセクレターゼ阻害剤との内分泌先駆細胞の培養物のインキュベーションを続けることによって、内分泌先駆細胞から未熟な膵島ホルモン発現細胞への分化が進行する。一部の実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、内分泌先駆細胞の誘導の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日後、または約１０日以上後に除去される。好ましい一実施形態では、ガンマセクレターゼ阻害剤は、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）である。
【０１８７】
本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のためのある特定のプロセスは、ヒト内分泌先駆細胞を含む細胞培養物または細胞集団への、ニコチンアミド、エキセンディン４、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）からなる群から選択される１つまたは複数の因子の供給によって媒介される。一部の実施形態では、上記の因子の全４つは、一緒に供給される。一部の実施形態では、上記の因子の１つまたは複数は、内分泌先駆細胞の分化の前に細胞培養物に供給され、内分泌先駆細胞への細胞培養物中の細胞の少なくとも一部の分化の間、細胞培養物に残存する。他の実施形態では、上記の因子の１つまたは複数は内分泌先駆細胞への細胞の実質的な部分の分化時かその頃に細胞培養物に供給され、細胞の少なくとも実質的な部分が未熟な膵島ホルモン発現細胞に分化するまで細胞培養物に残存する。本発明の一部の実施形態では、上記の因子の１つまたは複数は、分化プロセスの開始時に、例えば多能性細胞ステージに供給され、未熟な膵島ホルモン発現細胞への分化の間ずっと細胞培養物中に残存する。
【０１８８】
本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のための一部のプロセスでは、ニコチンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチン酸が、未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の実施形態では、ニコチンアミドは、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約０．５ｍＭから１０００ｍＭの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。
【０１８９】
本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のための他のプロセスでは、エキセンディン４が未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の実施形態では、エキセンディン４は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。
【０１９０】
本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のためのさらに他のプロセスでは、ＨＧＦが未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の実施形態では、ＨＧＦは、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。
【０１９１】
本明細書に開示される未熟な膵島ホルモン発現細胞の生成のためのさらに他のプロセスでは、ＩＧＦ１が未熟な膵島ホルモン発現細胞への内分泌先駆細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように細胞に供給される。一部の実施形態では、ＩＧＦ１は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、細胞培養物または細胞集団に存在する。
【０１９２】
本明細書に記載の未成熟膵島ホルモン発現細胞を生成するためのプロセスのある特定の実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種を、前に供給された１種または複数種の分化因子を細胞培養物から除去した後に供給する。他の実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種を、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種よりも前に供給された、またはほぼ同時に供給された１種または複数種の分化因子を含む細胞培養物または細胞集団に供給する。好ましい実施形態では、ニコチンアミド、エキセンディン４、ＨＧＦおよびＩＧＦ１のうちの１種または複数種よりも前に供給される、またはほぼ同時に供給される分化因子としては、これだけに限定されないが、ＤＡＰＴ、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４および／またはＲＡが挙げられる。
【０１９３】
本発明の別の実施形態は、ヒト未成熟膵島ホルモン発現細胞などのヒト細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物であって、ヒト細胞の少なくとも約２％においてＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、および／またはＣ−ペプチドマーカーの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よりも大きい組成物に関する。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約５％において、ヒト細胞の少なくとも約１０％〜ヒト細胞の９５％においてまたはヒト細胞の少なくとも約９８％においてＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰ、および／またはＣ−ペプチドマーカーの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現よりも大きい。
【０１９４】
一部の実施形態では、ＭＡＦＢ、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ２．２、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ、ＰＤＸ１、ＨＢ９、ＧＨＲＬ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ  ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰおよび／またはＣペプチドの発現がＮＧＮ３、ＭＡＦＡ、ＭＯＸ１、ＣＥＲ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１および／またはＮＦＭマーカーの発現より大きい場合、細胞培養物または集団中のヒト細胞の百分率は、フィーダー細胞に関係なく計算される。
【０１９５】
本発明のある特定の実施形態では、未成熟膵島ホルモン発現細胞を含む細胞培養物および／または細胞集団は、グレリン、インスリン、ソマトスタチンおよび／またはグルカゴンから選択される、１種または複数種の分泌されたホルモンを含む培地も含む。他の実施形態では、培地は、Ｃ−ペプチドを含む。好ましい実施形態では、培地中の１種または複数種の分泌されたホルモンまたはＣ−ペプチドの濃度は、細胞内ＤＮＡ１μｇ当たり少なくとも約１ｐｍｏｌのグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたはＣ−ペプチドから、細胞内ＤＮＡ１μｇ当たり少なくとも約１０００ピコモル（ｐｍｏｌ）のグレリン、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたはＣ−ペプチドまでの範囲である。
【０１９６】
インスリンをｉｎ  ｖｉｖｏで生成させる方法
一部の実施形態では、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏで導出された膵臓前駆細胞またはＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉型細胞またはその等価物を哺乳動物対象に移植する。これらの方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１５５３６号、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳ」に詳しく記載され、それは参照により本明細書に完全に組み込まれる。好ましい実施形態では、哺乳動物対象はヒト対象である。特に好ましい対象は、生理的に高い血中グルコース濃度に応答して十分なレベルのインスリンを生成する対象の能力が限定される状態を有すると同定された対象である。任意の特定の哺乳動物種についての生理的に高い血中グルコースレベルを構成する血中グルコースレベルの範囲は、当業者には容易に決定することができる。認識される疾患または状態をもたらすいかなる持続的な血中グルコースレベルも、生理的に高い血中グルコースレベルとみなされる。
【０１９７】
本発明のさらなる実施形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ多能性幹細胞またはその後代、例えば、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉もしくは膵臓前駆細胞、ＮＧＮ３陽性内分泌先駆体などの内分泌先駆体などの多分化能細胞、またはインスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｉｓｔａｔｉｎ）分泌細胞、グレリン分泌細胞、もしくは膵臓ポリペプチド分泌細胞などの機能的な分化したホルモン分泌細胞から導出されるｉｎ  ｖｉｖｏインスリン分泌細胞に関する。上記の最終分化した細胞または多分化能細胞のいずれも、宿主、または哺乳動物に移植し、宿主血中グルコースレベルに応答してインスリンを分泌する細胞などの生理的に機能的なホルモン分泌細胞に成熟させることができる。好ましい実施形態では、細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで奇形腫を形成せず、そのように形成された場合には、移植の領域に局在したままであり、容易に切除または除去することができる。特に好ましい実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化プロセスの間、または哺乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏで移植された際、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能的な島に成熟および発達する際に、いかなる核型異常も含有しない。
【０１９８】
さらに、本明細書に記載の実施形態は、工学的に操作されたまたは遺伝子組換えされた、多能性細胞、ヒトｉＰＳ細胞などの多能性細胞から本明細書において提供される説明に基づいて導出された多分化能細胞または分化した細胞に関するが、ｉＰＳ細胞では、ｈＥＳ細胞およびｈＥＳ由来細胞と同様の生理機能および遺伝子マーカーの発現プロファイルが実証されるので、ｉＰＳ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにおける同様の生理的特性を有することが予測される。
【０１９９】
膵臓前駆体を封入する方法
一部の実施形態では、本明細書に記載の多能性細胞、多分化能細胞および分化した細胞組成物を生物学的および／または非生物学的機械デバイスに封入することができ、封入されたデバイスにより、細胞組成物が宿主から分離および／または隔離される。
【０２００】
封入の方法は、２００８年１１月１４日に出願の米国特許出願第６１／１１４，８５７号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＰＲＯＧＥＮＩＴＯＲＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＨＥＳ  ＣＥＬＬＳ、および２００８年１２月１２日に出願の米国特許出願第６１／１２１，０８６号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＣＥＬＬＳに詳細に記載され、それらは参照により完全に本明細書に組み込まれ、半透膜、例えばＴｈｅｒａｃｙｔｅ（商標）またはＧｏｒｅデバイスを使用する膵臓内胚葉細胞の封入を記載する。
【０２０１】
一実施形態では、ｈＥＳ由来の細胞は、生体適合性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して封入される。ＰＥＧをベースとした封入は、米国特許第７，４２７，４１５号、表題ＩＭＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＥＤ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ；米国特許第６，９１１，２２７号、表題ＧＥＬＳ  ＦＯＲ  ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ；および米国特許第６，９１１，２２７号、第５，５２９，９１４号、第５，８０１，０３３号、第６，２５８，８７０号、表題ＧＥＬＳ  ＦＯＲ  ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＡＴＥＲＩＡＬＳでさらに詳細に記載され、それらは参照により完全に本明細書に組み込まれ、ポリエチレングリコールを使用する細胞凝集体のコンフォーマルコーティングを記載する。
【０２０２】
一実施形態では、封入デバイスは、多能性由来細胞、例えば、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉もしくは前駆細胞、ＮＧＮ３陽性内分泌先駆体などの内分泌先駆体、または、インスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、グレリン分泌細胞、もしくは膵臓ポリペプチド分泌細胞などの機能的な分化したホルモン分泌細胞を、移植された細胞集団が通過するのを防ぎ、それらをデバイス内に保持すると同時に、ある特定の分泌されたポリペプチド、例えばインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、膵臓ポリペプチドなどの通過を可能にする半透膜の中に含有する。あるいは、デバイスは血管化膜などの複数の膜を有する。
【０２０３】
ヒト多能性幹細胞、例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を増強および促進するための作用物質の使用
膜を介した細胞外シグナルの伝達により細胞調節に影響を及ぼし、今度はそれにより、細胞内の生化学的な経路をモジュレートすることができる。タンパク質のリン酸化は、細胞内シグナルが分子から分子へ伝搬され、最終的に細胞の応答がもたらされる１つの経過を表すものである。これらのシグナルトランスダクションカスケードは、高度に調節されており、多くの場合、多くのプロテインキナーゼおよびホスファターゼが存在することによって証明されるように、重複している。ヒトにおいて、タンパク質チロシンキナーゼは、糖尿病、がんを含めた多くの病態の進行において重要な役割を有することが分かっていることが報告されており、また、多種多様な先天性の症候群に関連付けられている。セリントレオニンキナーゼ、例えばＲｈｏキナーゼは、阻害された場合に、糖尿病、がん、および種々の炎症性心血管障害およびＡＩＤＳを含めたヒト疾患の治療と関連し得る酵素のクラスである。現在までに同定されている大多数の阻害剤は、ＡＴＰ結合部位で作用する。そのようなＡＴＰ競合阻害剤は、ＡＴＰ結合部位のあまり保存されていない領域を標的とするそれらの能力による選択性が実証されている。
【０２０４】
低分子ＧＴＰ結合性タンパク質のＲｈｏキナーゼファミリーは、ＲｈｏＡ〜ＥおよびＲｈｏＧ、Ｒａｃ１およびＲａｃ２、Ｃｄｃ４２、およびＴＣ１０を含む少なくとも１０種のメンバーを含む。阻害剤は、多くの場合、ＲＯＫ阻害剤もしくはＲＯＣＫ阻害剤またはＲｈｏキナーゼ阻害剤と称され、これらは、本明細書では互換的に使用される。ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣのエフェクタードメインは同じアミノ酸配列を有し、同様の細胞内標的を有すると思われる。ＲｈｏキナーゼはＲｈｏの最初の下流メディエーターとして作動し、２つのアイソフォーム：α（ＲＯＣＫ２）およびβ（ＲＯＣＫ１）として存在する。Ｒｈｏキナーゼファミリータンパク質は、それらのＮ末端ドメイン内に触媒（キナーゼ）ドメインを有し、その中央部分にコイルドコイルドメインを有し、それらのＣ末端領域内に推定プレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインを有する。ＲＯＣＫのＲｈｏ結合性ドメインはコイルドコイルドメインのＣ末端部分に局在し、ＧＴＰと結合した形態のＲｈｏとの結合により、キナーゼ活性の増強がもたらされる。Ｒｈｏ／Ｒｈｏキナーゼ媒介性経路は、アンジオテンシンＩＩ、セロトニン、トロンビン、エンドセリン−１、ノルエピネフリン、血小板由来成長因子、ＡＴＰ／ＡＤＰおよび細胞外ヌクレオチド、およびウロテンシンＩＩなどの多くのアゴニストによって開始されるシグナルトランスダクションにおいて重要な役割を果たす。Ｒｈｏキナーゼは、その標的エフェクター／基質のモジュレーションを通じて、平滑筋収縮、アクチン細胞骨格組織化、細胞の接着および運動性ならびに遺伝子発現などの種々の細胞機能において重要な役割を果たす。動脈硬化症の発病と関連すると認知されているいくつもの細胞機能の媒介においてＲｈｏキナーゼタンパク質が果たす役割により、これらのキナーゼの阻害剤も種々の動脈硬化性心血管疾患を治療または予防するために有用であり得、また、内皮収縮に関与する。
【０２０５】
一部の実施形態では、これだけに限定されないが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２、ファスジル（ＨＡ１０７７とも称される）、Ｈ−１１５２ＰおよびＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレン；Ｇｉｂｃｏ）、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１（米国特許第５，４７８，８３８号に記載され、それは参照により本明細書に完全に組み込まれる）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ｓｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアントおよびその発現ベクターなどの、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を促進し、かつ／または支持する作用物質を種々の細胞培養培地条件に添加する。さらに、ＲＯＣＫ阻害剤として他の低分子化合物が公知であるので、そのような化合物またはその誘導体も本発明において使用することができる（例えば、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号および同第２００３００８７９１９、ならびに国際特許公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号および同第２００４／０３９７９６号を参照されたい）。
【０２０６】
本発明では、１種または２種またはそれ以上のＲＯＣＫ阻害剤の組合せも使用することができる。これらの作用物質は、一部において、解離したｈＥＳ細胞、ｉＰＳまたは分化した細胞培養物、例えば、胚体内胚葉、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、膵臓上皮、膵臓前駆体集団、内分泌前駆体および集団などの再会合を促進することによって機能する。同様に、作用物質は、細胞解離が行われない場合にも機能し得る。ヒト多能性幹細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増大は、細胞が懸濁液中の細胞凝集体から生成したものであるか、または接着プレート培養物（細胞外マトリックスの構成成分を含みまたは含まずに、血清を含みまたは含まずに、線維芽細胞フィーダーを含みまたは含まずに、ＦＧＦを含みまたは含まずに、アクチビンを含みまたは含まずに）から生成したものであるかとは独立して実現された。これらの細胞集団の生存率の増加により、セルソーターを使用する精製系が容易になり、改善され、したがって、細胞の回収の改善が可能になる。Ｙ２７６３２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤の使用により、解離した単一細胞の段階的な継代の間、または低温保存からのそれらの生存が促進されることにより、分化した細胞型の増幅も可能になり得る。Ｙ２７６３２などのＲｈｏキナーゼ阻害剤はヒト多能性幹細胞（例えばｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞）およびそれが分化した細胞に対して試験されてきたが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、他の細胞型、例えば、一般に、これだけに限定されないが、腸、肺、胸腺、腎臓ならびに網膜色素上皮と同様の神経系細胞型を含めた上皮細胞に適用することができる。
【０２０７】
細胞培養培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、その濃度により所望の効果が実現される、例えば、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増強、増加、および／または促進が実現される限りは、下記の実施例に記載されているものに限定されない。種々のＲＯＣＫ阻害剤を種々の条件下で最適化することが必要な場合があることが当業者には理解されよう。例えば、Ｙ−２７６３２を使用する場合、好ましい濃度は、約０．０１〜約１０００μＭ、より好ましくは約０．１〜約１００μＭ、なおより好ましくは約１．０〜約５０μＭ、最も好ましくは約５〜２０μＭの範囲であり得る。ファスジル／ＨＡ１０７７を使用する場合、上述のＹ−２７６３２濃度の約２倍または３倍で使用することができる。Ｈ−１１５２を使用する場合、上述のＹ−２７６３２濃度の量のおよその分数、例えば、約１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０または１／６０で使用することができる。使用するＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、一部において、阻害剤の生物活性および効力ならびにそれが使用される条件に左右される。
【０２０８】
ＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理する時間および期間は、成長、生存、増殖（細胞集団）および細胞間接着の増強、増加、および／または促進などの所望の効果に応じて限定される場合もされない場合もある。しかし、ＲＯＣＫ阻害剤の添加は、実施例７によりよく記載されている通り、驚くべき様式で分化にも影響を及ぼし得る。下記の実施例には、約１２時間、２４時間、４８時間、またはそれ以上にわたって処理されたヒト多能性幹細胞培養物および／または分化した細胞培養物が記載されている。
【０２０９】
ＲＯＣＫ阻害剤を用いて処理されるヒト多能性幹細胞培養物の密度も同様に、それが、細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着の増強、増加、および／または促進などの所望の効果が実現される密度である限りは限定されない。播種される細胞の細胞密度は、これだけに限定されないが、接着培養物または懸濁培養物の使用、使用する細胞培養培地の特定のレシピ、成長条件および培養細胞の意図された使用を含めた種々の因子に応じて調整することができる。細胞培養物の密度の例としては、これだけに限定されないが、１ｍｌ当たり細胞０．０１×１０５個、１ｍｌ当たり細胞０．０５×１０５個、１ｍｌ当たり細胞０．１×１０５個、１ｍｌ当たり細胞０．５×１０５個、１ｍｌ当たり細胞１．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞１．２×１０５個、１ｍｌ当たり細胞１．４×１０５個、１ｍｌ当たり細胞１．６×１０５個、１ｍｌ当たり細胞１．８×１０５個、１ｍｌ当たり細胞２．０×１０５、１ｍｌ当たり細胞３．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞４．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞５．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞６．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞７．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞８．０×１０５個、１ｍｌ当たり細胞９．０×１０５個、または１ｍｌ当たり細胞１０．０×１０５個、またはそれ以上、例えば、１ｍＬ細胞５×１０７個まで、またはそれ以上、または間の任意の値が挙げられ、良好な細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を伴って培養された。
【０２１０】
ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質の使用
さらに別の実施形態では、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質は、成長因子のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーを含み、本明細書に記載されている。本明細書で使用される場合、「ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー」またはその等価物とは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＦ−β３、ＧＤＦ−１５、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−３、ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−７、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンβＣ、βΕ、βΑおよびβΒ、ＢＭＰ−１４、ＧＤＦ−１４、ＭＩＳ、インヒビンアルファ、Ｌｅｆｔｙ１、Ｌｅｆｔｙ２、ＧＤＮＦ、ニュールツリン（Ｎｅｕｒｔｅｕｒｉｎ）、パーセフィンおよびアルテミンなどのサブファミリーを含めた３０種を超える構造的に関連するタンパク質を指す。Ｃｈａｎｇら（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．２３（６）：７８７−８２３を参照されたい。
【０２１１】
ＴＧＦβファミリーメンバーは、ＴＧＦβファミリーメンバーに応答して細胞の性質の変化を伝達する、または他のやり方で引き起こすことに関与するポリペプチドまたは相互作用の１種または複数種を刺激する化合物であるＴＧＦβシグナル伝達経路活性化因子によって置き換えること、またはそれと併せて使用することができる。ＴＧＦβシグナル伝達経路はＴＧＦβファミリーメンバー自体を含む。ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーは、ＩＩ型およびＩ型セリン−トレオニンキナーゼ受容体およびＳｍａｄとして公知の細胞内エフェクターを通じたシグナル伝達によってシグナルを核に伝達する。これらの受容体は、協同的に作用してリガンドに結合し、シグナルを伝達するＩ型受容体およびＩＩ型受容体として公知の２つのサブファミリーに入る（Ａｔｔｉｓａｎｏら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６（３）、１０６６−１０７３（１９９６））。リガンドはＩ型受容体およびＩＩ受容体の細胞表面に結合し、リン酸化によるＩ型受容体の活性化を促進する。この活性化された複合体が今度は細胞内Ｓｍａｄを活性化し、それが転写を調節する多サブユニット複合体に集合する。ＴＧＦベータスーパーファミリーのメンバーは、２つのシグナル伝達サブグループ：ＴＧＦβ／アクチビンと機能的に関連するもの、およびＢＭＰ／ＧＤＦサブファミリーと関連するものに分けられる。大部分のＴＧＦβリガンドは、最初にＩＩ型受容体に結合し、次いで、このリガンド／ＩＩ型受容体複合体がＩ型受容体を動員またはリン酸化すると考えられている（Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｌ  Ｓ、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １５：３１０−３２５（１９９４）；Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ：Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１、１６９−１７８（２０００））。ＩＩ型受容体キナーゼは、Ｉ型受容体キナーゼをリン酸化および活性化することにより、次いで、Ｓｍａｄタンパク質をリン酸化および活性化する。ＴＧＦβ／アクチビンリガンドはＴＧＦβおよびアクチビンＩＩ型受容体に結合し、このアクチビン型経路を通じてＳｍａｄ−２、Ｓｍａｄ−３、ＮｏｄａｌおよびＬｅｆｔｙシグナルを活性化することができる。ＢＭＰ／ＧＤＦリガンドはＢＭＰ  ＩＩ型受容体に結合し、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８を活性化することができる。Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒら、Ｃｅｌｌ  ９５、７３７−７４０（１９９８）を参照されたい。リガンド刺激の際、Ｓｍａｄは核内に移動し、転写複合体の構成成分として機能する。
【０２１２】
ＴＧＦβシグナル伝達は、種々の機構を通じて正におよび負に調節される。陽性調節では、シグナルが生物学的活性のために十分なレベルまで増幅される。ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドがＩＩ型受容体に結合し、これによりＩ型受容体が動員およびリン酸化される。次いで、Ｉ型受容体により、受容体により調節されるＳＭＡＤ（Ｒ−ＳＭＡＤ、例えばＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、およびＳＭＡＤ８）がリン酸化され、そこで共通のメディエーターＳｍａｄまたはｃｏ−ＳＭＡＤに結合することができる。Ｒ−ＳＭＡＤ／ｃｏＳＭＡＤ複合体は核内に蓄積され、そこで転写因子としての機能を果たし、標的遺伝子発現の調節に関与する。例えば、成長分化因子としては１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、および１５が挙げられる。また、好ましい一実施形態では、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１はＴＧＦβファミリーメンバーであり、同様にＴＧＦβシグナル伝達経路活性化因子（陽性調節）でもあり、ＡｃｔＲＩＩ受容体の細胞外リガンド結合性ドメイン部分に結合し、次いでＡｃｔＲＩと複合体を形成し、それによりＳｍａｄ７負の制御因子の阻害およびＳｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体のリン酸化を導くことによって作用する。Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ３複合体はＳｍａｄ４と会合して特定の遺伝子の発現を調節する。
【０２１３】
ＴＧＦβシグナル伝達の負の調節は、細胞外、膜、細胞質および核レベルで起こる。ＴＧＦβによって開始されるシグナル伝達を抑圧するために、シグナル伝達を妨害することができる。これは、ＴＧＦβ受容体およびＳＭＡＤタンパク質相互作用をブロックするかそれと競合するタンパク質などの、ＴＧＦβ受容体（複数可）とＳＭＡＤタンパク質の間の相互作用と拮抗またはそれを阻止する、当技術分野で公知である任意の手段によって達成することができる。あるいは、シグナル伝達経路に沿うシグナル伝達を阻止するために、当技術分野で公知である任意の手段によって、ＴＧＦβ受容体またはＳＭＡＤタンパク質の転写または翻訳を変化させることができる。様々なＴＧＦβメンバータンパク質の正および負の調節は、下の因子のいくつかのより詳細な記載によってさらに例示される。
【０２１４】
任意の作用物質の使用と同様に、細胞培養培地中の任意のＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの濃度は、その濃度により、例えばＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーが活性化されることなどの所望の効果を実現することができる限りは、下記の実施例に記載されているものに限定されない。例えば、アクチビン、例えば、アクチビンＡおよび／またはアクチビンＢ、またはＧＤＦ８およびＧＤＦ−１１を使用する場合、好ましい濃度は、約１０〜約３００ｎＭ、より好ましくは約５０〜約２００ｎＭ、なおより好ましくは約７５〜約１５０ｎＭ、最も好ましくは約１００〜１２５ｎＭの範囲であり得る。当業者は、任意の濃度を容易に試験することができ、当技術分野における標準の技法を使用して、そのような濃度の有効性を決定すること、例えば、任意の細胞型について遺伝子マーカー（ｇｅｎｅ  ｍａｋｅｒ）パネルの発現および非発現を決定することによって分化を評価することができる。
【０２１５】
ヒト多能性幹細胞を分化させるために使用されるこれらおよび他の成長因子は、２００８年６月３日に出願の米国特許出願第１２／１３２，４３７号、表題ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＤＥＦＩＮＩＴＩＶＥ  ＥＮＤＯＤＥＲＭでさらに詳細に記載され、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
本発明を一般に記載したが、本明細書において提供される、単に例示するためのものであり、限定するものではないある特定の実施例を参照することにより、さらなる理解を得ることができる。
【実施例】
【０２１７】
上述のものが本発明の好ましい実施形態に関連すること、および本発明の範囲を逸脱しないでそこに多数の変更を加えることができることも理解するべきである。本発明は以下の実施例でさらに例示されるが、それらはその範囲に制限を加えるものと決して解釈されてはならない。逆に、様々な他の実施形態、改変形およびその同等物を用いることができることを明らかに理解するべきであり、それらは、本明細書の説明を読んだ後ならば、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲を逸脱しないで、当業者が思いつくことができる。
【０２１８】
（実施例１）
胚体内胚葉および内胚葉中間体を経た膵臓の前駆体および内分泌細胞へのヒトｉＰＳ細胞の分化
膵臓前駆体、内分泌前駆体およびホルモン発現内分泌細胞などの膵臓細胞型の集団を生成するために、約２週（または１４日）にわたる四（４）ステージ手順を使用して、懸濁凝集体でヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を分化させた。本明細書で用いたヒトｉＰＳ細胞系は、Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ、京都大学、日本およびＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（ＣＤＩ）によって提供された。
【０２１９】
本明細書に記載されるｉＰＳ細胞は、Ｓｈｉｎｙａ  Ｙａｍａｎａｋａによって最初に、その後ＣＤＩによって提供された。未分化ｉＰＳ細胞は、２０％ノックアウト血清代替物を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２において、有糸分裂不活性化マウス胚線維芽細胞上で、または好ましくはフィーダーフリー（線維芽細胞フィーダー細胞層なし）で増殖させた。アキュターゼを使用して未分化ｉＰＳ細胞を単細胞に解離させることによって分化を開始し、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。細胞は、１：５０００希釈のインスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈｏキナーゼまたはＲＯＣＫ阻害剤、Ｙ−２７６３２を１０μΜで含有するＲＰＭＩ＋０．２体積／体積％ＦＢＳに、１ミリリットルにつき細胞数１，０００，０００〜２，０００，０００で再懸濁させ、回転プラットホームの上に置いた超低付着６ウェルプレートに入れ、約１００ｒｐｍで回転させた。培養物は、分化プロセスの残りの間、培地を毎日交換し、１００ｒｐｍで回転させた。ｉＰＳＣの成長、継代および増殖は、実質的に米国特許第７，９６１，４０２号および第８，２１１、６９９号に記載されている通りであり、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０２２０】
多能性細胞、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞、および多能性細胞から導出された細胞の凝集懸濁培養物を生成するための本明細書に記載の方法は、実質的に、２００７年２月２３日に出願された表題がＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌｓであるＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５、および２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍであるＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６に記載されている通りであり、それらは参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０２２１】
本明細書に記載される方法は、例えば、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに帰属する、Ｂｏｄｎａｒらへの米国特許第６，８００，４８０号に記載のように、培養容器を細胞外マトリクスで先ずコーティングすることによって促進することができる。他の多能性幹細胞、例えばｈＥＳおよびｉＰＳ細胞を培養するための他の方法と同様に、この方法は、実質的に２００８年１０月２０日に出願された表題がＭｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍである、参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０５１６に記載されるように、可溶性ヒト血清を使用して培養することができる。
【０２２２】
本明細書に記載される方法は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷＡＲＦ）に帰属する、参照により本明細書に完全に組み込まれるＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．への米国特許第７，００５，２５２号に記載されるように、線維芽細胞フィーダー層だけ以外の供給源から供給される、外部から加えられた線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）によって促進することができる。
【０２２３】
回転の最初の約２４時間の間に、互いに付着した単細胞は細胞凝集体を形成し、ＲＮＡの単離と分析のために十分な細胞試料をとった。細胞凝集体は、直径が約６０ミクロンから１２０ミクロンであった。ｉＰＳ細胞試料を回転プラットホームに置いてから約１日（または２４時間）後に、培養に、１：５０００希釈のＩＴＳ、アクチビンＡ（１００〜２００ｎｇ／ｍＬ）、およびＷｎｔ３ａ（５０〜１００ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ＋０．２体積／体積％ＦＢＳを約１日間（０日目から１日目まで）、およびさらに１日間、またはＷｎｔ３ａのないこと以外は同じ培地を（１日目から２日目）与えた。ＲＮＡの単離および分析のために毎日の細胞試料をとった。２日間の分化の後、培養物に、１：１０００希釈のＩＴＳ、ＫＧＦ（またはＦＧＦ７、２５ｎｇ／ｍＬ）およびＴＧＦβ阻害剤ｎｏ．４（２．５μＭ）を含有するＲＰＭＩ＋０．２体積／体積％ＦＢＳを１日間（または２４時間、２日目から３日目まで）与えた。次の２日間（３日目から５日目）、ＴＧＦβ阻害剤を培地から除いたこと以外は同じ成長因子カクテル培地をｉＰＳ細胞凝集懸濁液に与えた。再び、このステージ（ステージ２または５日目）の終わりに、ＲＮＡ単離のために細胞試料をとった。ステージ３（５日目から８日目）については、ＴＴＮＰＢ［４−［Ｅ−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸］（３ｎＭ）、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５μΜ）およびノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ＋１体積／体積％Ｂ２７サプリメントに細胞培養培地を代えた。再び、このステージ（ステージ３または８日目）の終わりに、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。ステージ４（８日目から１４日目）については、ノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ＋１体積／体積％Ｂ２７サプリメントに培地を代えた。再び、ステージ４（または１４日目）の終わりに、ＲＮＡの単離と分析のために細胞試料をとった。
【０２２４】
分化中の様々なマーカー遺伝子の遺伝子発現を測定するために、リアルタイムＰＣＲを実施した。特異的マーカーまたは遺伝子の遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、サイクロフィリンＧおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）発現の平均発現レベルに先ず標準化した。次に標準化した相対的な遺伝子発現は、未分化ｉＰＳ細胞での発現レベルに対して棒グラフに表示され、したがって様々な分化マーカーの上方制御倍率を表す。ＯＣＴ４については、遺伝子発現は、データセットの最低の試料（１４日目）を設定するために標準化され、したがって分化中の下方制御倍率を表す。
【０２２５】
図２Ａ〜Ｌは、未分化ｉＰＳ細胞中の同じ遺伝子の発現レベルと比較した、同定された遺伝子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｃｅｒ１、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３およびＩＮＳ）の相対的な遺伝子発現を示す棒グラフである。遺伝子の発現レベルをハウスキーピング遺伝子（対照）のセットに標準化し、２つの異なる時点での遺伝子発現レベルを比較することにより、その遺伝子または発現マーカーに上方制御か下方制御があることが示された。ＯＣＴ４（図２Ａ）については、遺伝子発現を標準化し、最低レベルの発現の試料を１に設定した（１４日目）。したがって、図２Ａによって示されるように、ＯＣＴ４の相対的な発現レベルは、分化中（Ｘ軸、ステージ０から４、または０日目から１４日目）の下方制御倍率（ｙ軸）を表す。
【０２２６】
図２Ａに示すように、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）は未分化ｉＰＳ細胞において高レベルで発現され、その後分化中（０日目から１４日目）は下方制御を示す。１４日目までには、ＯＣＴ４発現レベルは未分化細胞で観察される発現レベルから３０００倍を超えて減少した。対照的に、最初の２日間（１日目および２日目）中にｂｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、図２Ｂ）発現の一過性の上方制御があった。ｂｒａｃｈｙｕｒｙの一過性の上方制御は、アクチビンＡおよびｗｎｔ３ａの適用による多能性／ｉＰＳ細胞の内胚葉系中胚葉へ誘導された分化の結果であった。３日目のステージ１の終わりまでのＣＥＲ１、ＧＳＣおよびＦＯＸＡ２の上方制御によって示されるように（図２Ｃ〜Ｅ）、内胚葉系中胚葉はアクチビンＡへの連続曝露によって２日目および３日目の間に胚体内胚葉にさらに分化した。分化の６日目までのＦＯＸＡ１の上方制御、ＦＯＸＡ２発現の維持ならびにＣＥＲ１およびＧＳＣの下方制御によって示されるように（図２Ｃ〜Ｆ）、ステージ２の間に、胚体内胚葉は腸管内胚葉に分化するようにさらに誘導された。８日目までのＨＮＦ６およびＰＤＸ１の上方制御によって示されるように（図２Ｇ〜Ｈ）、ステージ３の間、レチノイド、シクロパミンおよびノギンへの曝露の結果、腸管内胚葉は後部前腸／ＰＤＸ１発現内胚葉に分化するようにさらに誘導された。１４日目までのＰＴＦ１Ａ、ＮＫＸ６−１、ＮＧＮ３およびＩＮＳの上方制御によって示されるように（図２Ｉ〜Ｌ）、ステージ４の間、ＫＧＦおよびＥＧＦへの曝露の結果、後部前腸／ＰＤＸ１発現内胚葉は、膵臓前駆体、内分泌前駆体およびホルモン発現内分泌細胞に分化するようにさらに誘導された。
【０２２７】
（実施例２）
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、ｉＰＳ細胞の成長、生存、増殖および細胞間接着を促進する
様々なｈＥＳおよびｉＰＳ細胞系を分化させる方法は、実質的にここで、および実施例１に記載される通りである。分化の間の成長、生存、増殖および細胞間接着を増強および促進するために、ステージ１、２、３、４および５について記載される培養条件に加えて、アポトーシス阻害剤および／またはＲｈｏキナーゼもしくはＲＯＣＫ阻害剤を培地に加えた。一般的に約１０μΜのＲｈｏキナーゼ阻害剤、例えばＹ−２７６３２を、各ステージで細胞培養に加えた。あるいは、少なくともステージ１および２、ならびにステージ４および５、またはその任意の組合せでＲｈｏキナーゼ阻害剤を加えた。分化したｉＰＳ懸濁液（凝集体）細胞培養の形態および遺伝子マーカー発現プロファイルは、ｈＥＳ細胞から導出された懸濁細胞培養のそれに実質的に類似する。
【０２２８】
図３および４は、それぞれステージ４と５からのｉＰＳ細胞培養の免疫細胞化学（ＩＣＣ）を示す。図３は、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性細胞など、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉（膵臓上皮または膵臓前駆体とも呼ばれる）の特徴を示す典型的な遺伝子マーカーを発現する、ステージ４からの細胞凝集体を示す。図３に示されていないが、ステージ４細胞は、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）などのステージ５細胞の特色をより示すホルモン分泌タンパク質または遺伝子マーカーを発現しない。図４は、ステージ５からのホルモン発現細胞の細胞凝集体を示す。これらのＩＣＣ結果は、ＱＰＣＲを使用してさらに確認された。しかし、ＱＰＣＲは試料または細胞培養で発現されるＲＮＡの全レベルの全集団研究であるので、それは任意の１つの細胞が複数のマーカーを発現することを確定的に示すことができない。
【０２２９】
（実施例３）
ｉＰＳ導出膵臓前駆体の封入
現在まで、ｉＰＳ細胞の生成方法およびｉＰＳ細胞の生成のための供給源が報告されている。しかし、特定の疾患、例えば糖尿病を治療するための細胞療法での潜在的使用のための、任意の機能性分化細胞への任意のｉＰＳ細胞の分化に関する十分な記載はない。
【０２３０】
ヒトｉＰＳ細胞から導出されたステージ４のＰＤＸ１陽性の膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞培養が、グルコース感受性インスリン分泌細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで発達および成熟することが完全に可能かどうか判定するために、実質的に実施例１および２に記載のような膵臓前駆体集団を、参照により本明細書に完全に組み込まれる２００９年１１月１３日に出願された米国特許出願１２／６１８，６５９、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＬＩＮＥＡＧＥ  ＣＥＬＬＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＨＵＭＡＮ  ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ；ならびに米国特許第７，５３４，６０８号および第７，６９５，９６５号、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＨＯＲＭＯＮＥＳに記載のものに実質的に類似のマクロ封入デバイスに加えた。簡潔には、実質的に約３×１０６細胞数を有する、５−１０−２０μＬの重力沈降細胞懸濁凝集体を各デバイスに加えた。
【０２３１】
次に、哺乳動物、例えば免疫不全ＳＣＩＤ／Ｂｇマウスへの移植のためにデバイス内の封入細胞を調製したが、ラット、ブタ、サルまたはヒト患者などのより大きな動物に移植することができる。封入細胞を移植する方法およびデバイスは、実質的に、ＧＥＬＦＯＡＭマトリックスに移植されて精巣上体の脂肪パッド（ＥＦＰ）の下に移植される膵臓前駆細胞等、米国特許出願第１２／６１８，６５９号、米国特許第７，５３４，６０８号および第７，６９５，９６５号に記載される通りである。
【０２３２】
これらの研究で免疫抑制は必要でなかったが、デバイス内の前駆体が完全に成熟してグルコース応答性になるまで、最初の中間期間の間特定の哺乳動物のために免疫抑制が必要とされることがある。一部の哺乳動物では、免疫抑制レジメンは約１、２、３、４、５、６週間以上であってもよく、哺乳動物次第である。
【０２３３】
移植された細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで分化させ、さらに成熟させた。移植された細胞が例えば天然に存在するベータ細胞のように正常な生理機能を有するかどうか判定するために、ヒトＣペプチドのレベルの検査によってヒトインスリンのレベルを判定する。ヒトＣペプチドはヒトプロインスリンから切断または処理され、したがって、内因性マウスＣペプチドでなくヒトＣペプチドの特異的検出は、インスリン分泌が移植された（外因性）細胞から導出されたことを示す。移植片を有する動物は、それらへのアルギニンまたはグルコース、好ましくはグルコースのボーラス注射によって、２、３または４週ごとにヒトＣペプチドのレベルを検査する。その後成熟したベータ細胞（分化した多能性ｉＰＳ細胞から導出された）は、天然に存在するか内因性のベータ細胞と同様に生理的に機能的で、グルコース応答性であるはずである。一般的に、５０ｐＭまたは平均基礎（閾値）レベルを上回るヒトＣペプチドの量が、移植された前駆体からの今ではベータ細胞の機能の指標である。
【０２３４】
参照により本明細書に完全に組み込まれるＫｒｏｏｎら（２００８）、前掲、米国特許出願１２／６１８，６５９、米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号および第７，９９３，９２０号に記載のものと同様に、ｈＩＰＳ細胞から導出された封入膵臓前駆体は、天然に存在する島のそれと同様の内分泌、腺房および管細胞を有する、機能性の膵島クラスターに成熟することが期待される。また、移植前のｈＩＰＳ細胞から導出された精製または濃縮された膵臓前駆体も、機能性の膵島に成熟および発達し、ｉｎ  ｖｉｖｏでインスリンを生成することが予想される。様々な分化した細胞集団を精製、濃縮するための特定の実施形態は、２００８年４月８日に出願された米国特許出願１２／１０７，０２０、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＡＮＤ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＣＥＬＬＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＨＥＳ  ＣＥＬＬＳ、現在の米国特許第８，３３８，１７０号にさらに詳細に記載され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。凍結保存されたｈＩＰＳ細胞から導出された膵臓前駆体は、移植の前に解凍し、培養に適合させることができ、その結果、ｉｎ  ｖｉｖｏで成熟してインスリンを生成することができることがさらに予想される。ｈＩＰＳ細胞から導出された移植された膵臓前駆体を有する糖尿病誘導動物では、低血糖を改善することができる。
【０２３５】
要約すると、マクロ封入デバイス中のｈＩＰＳ細胞から導出された完全封入膵臓前駆細胞は、生理的に機能的な膵島に成熟し、ｉｎ  ｖｉｖｏでグルコースに応答してインスリンを生成することが予想される。
【０２３６】
（実施例４）
膵臓前駆体およびホルモン分泌細胞組成物
それぞれ表５ａ、５ｂおよび６に示すように、フローサイトメトリーを用いて、分化したｈＩＰＳ細胞集団を、ＰＤＸ１陽性の膵臓内胚葉または膵臓前駆細胞（ステージ４）；および内分泌または内分泌先駆細胞（ステージ５）の含有量について分析した。表５ｂは表５ａのそれと同じデータセットであるが、比較のために表９のそれと同様に提示する。全体のＰＤＸ１＋およびＮＫＸ６．１＋数はＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋／ＣＨＧＡ−細胞集団（表５ａの第５列）のそれと重複するので、表５ａ集団は互いと重複する、例えば全細胞数は１００％を超える。表５ｂはＰＤＸ１＋だけおよび三重陰性（残留）データを含み、それは表５ａでは示されない。ｉｎ  ｖｉｖｏ機能を判定するために、これらのｉＰＥＣ移植片の特定のもの、ならびに実質的に類似の処方を使用する他のものを動物に移植したが、ヒト血清Ｃペプチドのレベルはどの潜在的治療目的のためにも十分に安定的でなかった（データは示さず）。示す値は、所与の集団に属する全細胞の百分率である。懸濁細胞凝集体中にある膵臓前駆体（ＮＫＸ６．１（＋）／ＰＤＸ１（＋）／クロモグラニンＡ（−））の数およびＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１−／ＣＨＧＡ−の非常に小さい集団は、ｈＥＳ細胞から導出された膵臓前駆細胞懸濁凝集体で観察されたものと一致し、２００８年１１月４日に出願された米国特許出願１２／２６４，７６０、表題ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＡＧＧＲＥＧＡＴＥ  ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  ＴＨＥＲＥＯＦに記載され、参照により本明細書に完全に組み込まれる通り、ＥＳＣステージで凝集した。内分泌物および／または内分泌先駆細胞のレベルも、参照により本明細書に完全に組み込まれる２００８年４月８日に出願された米国特許出願１２／１０７，０２０、表題ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＡＮＤ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＥＮＤＯＤＥＲＭ  ＣＥＬＬＳ  ＤＥＲＩＶＥＤ  ＦＲＯＭ  ＨＥＳ  ＣＥＬＬＳ中のｈＥＳ由来の細胞培養物で得られたものと実質的に一致していた。ｈＥＳ由来の細胞の懸濁凝集体と同様に、分化の特定のステージ（例えば、ステージ４）で培地中の異なる成長因子の濃度を変化させることは、膵臓内胚葉、内分泌、ＰＤＸ１陽性の内胚葉または非膵臓細胞型の特定の集団を増加および／または減少させるはずである。
【表５】
2019146578.tif 000019
【表６】
2019146578.tif 000020
【０２３７】
（実施例５）
ＰＥＣ受容体チロシンキナーゼ
上記の方法は、上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）をもとにした下の表７に記載されるものと実質的に同じである。本明細書に記載されるこれらおよび他の方法は、それらの開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許第７，９６４，４０２号；第８，２１１，６９９号；第８，３３４，１３８号；第８，００８，０７号；および第８，１５３，４２９号等の、出願人の多くの特許および非特許公開文書に見出すことができる。
【表７】
2019146578.tif 000021
【０２３８】
動物に移植されたｉＰＳ細胞および膵臓前駆体に上の方法を適用したとき、同じ方法をｈＥＳＣおよびｈＥＳ導出膵臓前駆体に適用したときと比較して、出願人は同じく安定した（ｒｏｂｕｓｔ）ｉｎ  ｖｉｖｏ機能を一貫して得たとは限らない。ｉＰＳ細胞がｈＥＳＣの形態および遺伝子発現パターンを有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚様体およびｉｎ  ｖｉｖｏでテラトーマを形成することができるヒト多能性幹細胞であり、それらが３つの胚葉全てからの細胞を形成することができることを示していることを考慮すると、これは意外であった。少なくとも、例えば上記の、Ｙｕら（２００７）；米国特許出願公開第２００９／００４７２６３号、国際特許出願公開ＷＯ２００５／８０５９８；米国特許出願公開第２００８／０２３３６１０号；および国際特許出願公開ＷＯ２００８／１１８８２、を参照。これらの参考文献は、ｉＰＳ細胞がＥＳＣの定義基準を満たすことを記載する。したがって、完全に機能性のグルコース応答性細胞にｉｎ  ｖｉｖｏでさらに成熟および発達する、ｈＥＳから導出された膵臓前駆細胞を与えるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化プロトコルにおいて、ｉＰＳ細胞がＥＳＣの代用となることができることが予想される。しかし、上の方法を使用する一貫しないｉｎ  ｖｉｖｏ機能データを考慮し、出願人は、膵臓前駆体および／または膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）、すなわち、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣで一貫して観察されているｉｎ  ｖｉｖｏ機能の実質的に類似の安定したレベルを提供することが可能であるｈｉＰＳＣ（または「ｉＰＥＣ」）からのステージ４由来の細胞に特異的である分化培地の処方を探索しようと努めた。
【０２３９】
出願人は、ＰＥＣに存在する内分泌（ＣＨＧＡ＋細胞）細胞が複数ホルモン性内分泌細胞であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞を有する島を生成するＰＥＣ中の細胞の亜集団でないことを前に報告した。上記Ｋｅｌｌｙら（２０１１）を参照されたい。むしろ、それは、非内分泌細胞集団（ＣＨＧＡ−細胞）、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能性の島を実際に生成するＰＥＣであると考えられている、ＮＫＸ６．１およびＰＤＸ−１を共発現するものである。したがって、出願人は、内分泌および非内分泌亜集団の相対比をモジュレートするか、変化させるか、シフトすることが、後のｉｎ  ｖｉｖｏ機能に影響を及ぼすかどうかを探索した。
【０２４０】
ｈＥＳＣで受容体−リガンドシグナル伝達を解読する以前の努力は、自己複製を促進する成長因子の同定に成功を収め、規定の培地培養条件の開発を可能にした。上記Ｗａｎｇら（２００７）を参照されたい。Ｗａｎｇらは、ＥＲＢＢ３に結合してＥＲＢＢ２との二量体化を誘導し、その場面でｈＥＳＣの自己複製に影響を及ぼすリガンドとしてヘレグリン−１βを同定した。ＥＲＢＢは受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、ＲＴＫは、成長因子および他の細胞外シグナル伝達分子の受容体として作用する、広く発現される膜貫通タンパク質である。リガンド結合の結果、それらは細胞質テール中の特定の残基でチロシンリン酸化を受け、ＲＴＫ媒介シグナル伝達に関与する他のタンパク質基質の結合のためのシグナル伝達カスケードを始動する。細胞の生存、増殖および運動性の調節を含むいくつかの発達過程におけるＲＴＫ機能、およびがん形成でのそれらの役割は文書で十分に立証されている。ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体は、発達中の胎児のヒト膵臓全体で発現されることも知られていたが、特定のＥＲＢＢ受容体およびそれらのリガンドの特異的役割は知られていない。Ｍａｒｉ−Ａｎｎｅ  Ｈｕｏｔａｒｉら（２００２）ＥＲＲＢ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３（１１）：４４３７〜４４４６頁を参照されたい。
【０２４１】
上記Ｗａｎｇら（２００７）によって実証される胎児のヒト膵臓での多能性幹細胞の自己複製およびそれらの発現、ならびにヒト胎児膵臓でのＥＲＢＢ  ＲＴＫ発現でのＥＲＢＢ  ＲＴＫシグナル伝達の役割のために、次に出願人は、分化の間のＰＥＣ特定化、または自己複製の促進による増殖、または生理的に機能する島ホルモン分泌細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏ成熟を促進するいくつかの他の未知の機構を向上させる可能性がある受容体およびリガンドを同定する努力の中で、ｈＥＳＣから導出されたｉｎ  ｖｉｔｒｏの膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）でＲＴＫの潜在的な活性化の調査に取りかかった。以下の変更を除いて実質的に表８に記載のように、分化凝集体の懸濁液でＰＥＣを生成した。
【０２４２】
ＲＴＫブロット分析のために、４つのＰＥＣ試料を生成した。ｄｂ−Ｎ５０  Ｋ５０  Ｅ５０でのＰＥＣ凝集体の「定常状態」試料を、ステージ４の終わり（またはｄ１３）に収集した。「絶食させた」試料は、ｄｂ（ＤＭＥＭ高グルコースまたは０．５×Ｂ−２７サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加したＤＭＥＭ高グルコース）培地だけ（成長因子なし）を与え、ｄ１３に収集した、ｄ１２ＰＥＣ凝集体を表した。２つの「パルス投与」試料は、ｄ１２にｄｂ培地を与えてそこで培養し、次にｄ１３に、収集する前に１５分間、ｄｂ−Ｋ５０  Ｅ５０培地または２％ＦＢＳ含有ｄｂ培地のいずれかを与えた。そのような条件は、ステージ４条件で活性であったＲＴＫの検出、ならびにＫＧＦ、ＥＧＦおよびインスリン（Ｂ２７サプリメントに存在する）または血清のパルス投与でどのような応答を導き出すことができるか検出することを意図した。血清パルス投与は、ＰＥＣに存在し、本ステージ４条件で活性化することができるが刺激されないＲＴＫを潜在的に同定する、広域な成長因子刺激を意図した。
【０２４３】
ＲＴＫ分析は、事実上前掲のＷａｎｇら（２００７）で前に記載される通りに実施した。簡潔には、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）ヒトホスホＲＴＫ抗体アレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｙｔｅｍｓ）を、製造業者の指示通りに使用した。１％ＮＰ−４０、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、および１０μｇ／ｍＬロイペプチンでタンパク質溶解物を調製した。５００μｇの新鮮なタンパク質溶解物を、４２個の抗ＲＴＫ抗体および５つの陰性対照抗体のための重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）スポット、ならびに８つの抗ホスホチロシン陽性対照スポットの点在するニトロセルロース膜と一晩インキュベートした（図５Ａ）。配列された抗体はリン酸化および非リン酸化ＲＴＫの細胞外ドメインを捕捉し、結合したホスホＲＴＫは、化学発光を使用して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた汎抗ホスホチロシン抗体で検出される。ＲＴＫアレイレイアウトについては図５を、ならびにアレイ中のＲＴＫの一覧については下の表８を参照されたい。
【表８】
2019146578.tif 000022
【０２４４】
ＲＴＫブロットの分析（図６Ａ）は、ｈＥＳＣで以前に観察されたものと同様に、インスリン受容体およびＩＧＦ１受容体（それぞれＩＲ、ＩＧＦ１Ｒ）が全ての条件でリン酸化され、活性化されたことを示した。上記Ｗａｎｇら（２００７）を参照されたい。ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ１としても知られる）は定常状態条件でリン酸化されたが、それはステージ４培地中のＥＧＦの存在を考慮すると予想されていたことである。実際、ＥＲＢＢ２の低レベルのリン酸化が、定常状態および絶食条件の両方で検出された。ＥＧＦＲおよびＥＲＢＢ２の両方のリン酸化は各パルス投与条件で上昇し、リガンドのパルス投与に応答する活性化を検出するアッセイの能力を確認した。リン酸化されたＶＥＧＦＲ３も全ての条件で検出され、パルス投与試料で上昇した。このことは、ＰＥＣが内因性ＶＥＧＦＲ３リガンドを生成することを示唆し、可能性のある候補はＶＥＧＦ−ＣおよびＤであった。血清パルス投与は、低レベルのＥＲＢＢ３リン酸化を含め、さらなる受容体を活性化するようであった。リン酸化ＥＲＢＢ２／３の検出は、ヘレグリン様ＥＧＦファミリーメンバーがＰＥＣでシグナル伝達を活性化することができることを示唆する。ＴＩＥ−２は２つのアンギオポエチン受容体の１つであり、血清に応答して低いレベルでリン酸化されるようであった。アンギオポエチン１およびアンギオポエチン４はＴｉｅ−２のリガンドを活性化することが公知であるが、アンギオポエチン２およびアンギオポエチン３は、場面依存性競合的アンタゴニストとして機能する。ＨＧＦ受容体（ＨＧＦＲ）も血清パルス投与に応答してリン酸化され、肝細胞成長因子もＰＥＣでシグナル伝達を導き出すことができることを示唆した。最後に、エフリンＢ２  ＲＴＫ（ＥＰＨＢ２）の低レベルのリン酸化が検出されたが、エフリン／Ｅｐｈシグナル伝達は膜結合細胞間シグナル伝達系であり、ＰＥＣ分化で容易に活用されるようではない。興味深いことに、ＥＲＢＢ４はリン酸化されなかった。したがって、ＲＴＫ分析は、ＰＥＣでリン酸化されるか、または異なる条件、例えば血清に応答してリン酸化することができるいくつかの受容体を鮮明にした。これらの結果は、いくつかの可溶性リガンドがＰＥＣでＲＴＫシグナル伝達を導き出すことができ、細胞の増殖、分化および／または特定化に潜在的に影響を与え、したがって、機能性の膵島への後のｉｎ  ｖｉｖｏ成熟に潜在的に影響を及ぼすことができることを示唆する。
【０２４５】
（実施例６）
ヘレグリンおよびＦＧＦ２成長因子は、ｈＥＳＣ組成物から導出されたＰＥＣに影響を及ぼす
上の実施例５に記載のように特定の条件下で特定のＲＴＫが活性化（またはリン酸化）されることを実証したＲＴＫ分析を考慮し、また、少なくともＥＲＢＢ２およびＥＲＢＢ３がＰＥＣで活性化される（ステージ１〜４から１３日間の分化後に）ようであったので、出願人はステージ３および４の細胞に適用したときのヘレグリンの影響を判定しようと努めた。
【０２４６】
ヘレグリンおよびＦＧＦを使用して予備研究を実施した。これらの研究の特定のものに、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２が含まれた。これらの予備研究は、１０ｎｇ／ｍＬヘレグリン−１β（Ｗａｎｇら（２００７）に開示されるのと同じ濃度およびヘレグリン異性体）によるステージ１での１日間の多能性幹細胞の処置は、ヘレグリン−１β（Ｈｒｇ１β）のない懸濁培養でのｈＥＳ導出細胞凝集体の凝集体サイズと比較して、懸濁培養でｈＥＳ導出細胞凝集体の細胞凝集体サイズを増加させた。細胞凝集体サイズの増加は、動物での後の移植および機能検査のためにより大きな細胞量をもたらす点で有利である。さらに、Ｈｒｇ１βがステージ３で１０ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬに増加したとき、凝集体ディスクサイズが増加した。この結果は、ＦＧＦ２の不在下での培養と比較して５０ｎｇ／ｍＬの別の成長因子、ＦＧＦ２がステージ３で使用されたときも観察された。細胞凝集体サイズの増加は、ステージ３培養をＦＧＦ２曝露にさらなる日数、例えば２日間と比較して３日間の５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２に曝露させたときも観察された。
【０２４７】
表９は、ステージ３および／またはステージ４にＨｒｇ１βおよびＦＧＦ２で処置したＰＥＣ細胞のフローサイトメトリー分析の要約を提供する。内分泌細胞はＣＨＧＡ陽性（またはＣＨＧＡ＋）細胞と表し、非内分泌細胞はＣＨＧＡ陰性（またはＣＨＧＡ−）細胞と表す。内分泌物（ＣＨＧＡ＋）および非内分泌細胞（ＣＨＧＡ−）は、他のマーカーで陽性に染色することができ、例えばＰＤＸ１および／またはＮＫＸ６．１に陽性に染色される。試験したマーカーのいずれにも染色しない細胞は、三重陰性細胞または残留細胞（ＣＨＧＡ−／ＮＫＸ６．１−／ＰＤＸ１）と表す。
【表９】
2019146578.tif 000023
【０２４８】
細胞凝集体サイズの増加がＰＥＣ亜集団に影響を及ぼすかどうか判定するために、ＰＥＣ集団の組成物をフローサイトメトリーによって分析した。細胞を分化するためにＨｒｇ１βおよびＦＧＦ２が使用されなかった対照培養と比較して、ＰＥＣ非内分泌亜集団（ＣＨＧＡ−）は、ステージ３で１０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの添加により５４．０１％から６１．２％に増加し、ステージ３で５０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの添加により５４．０１％から６４．２％に増加した。内分泌亜集団（ＣＨＧＡ＋）は、１０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βの処置であまり影響を受けなかったが、５０ｎｇ／ｍＬでよりそうであった。一方、残留細胞の相対レベルは減少し、５０ｎｇ／ｍＬのＨｒｇ１βでより減少した。したがって、Ｈｒｇ１β処置による細胞凝集体サイズの増加は、内分泌および残留亜集団と比較して非内分泌亜集団の増加に大部分帰された。
【０２４９】
ステージ３培養でのＦＧＦ２の影響も同様であったが、Ｈｒｇ１βのそれよりさらに顕著であった。例えば、ＰＥＣ非内分泌亜集団（ＣＨＧＡ−）は、Ｈｒｇ１βでそうであったように増加した。これらの培養でのＦＧＦ２の主要な影響は、内分泌亜集団の実質的な減少であった。ある場合には、これらの細胞は、３日間の処置でほとんど検出不能であった（３２．９％から０．３３％）。したがって、ＦＧＦ２で処置した培養の細胞凝集体サイズの増加は、非内分泌、一部の場合には残留細胞亜集団の増加（ステージ３の３日間で１３．１％から２２．７％）に大部分帰された。
【０２５０】
したがって、ヘレグリンおよび／またはＦＧＦ２は、ＰＥＣ集団での細胞の特定化において役割を果たすようである。多能性幹細胞との関連で使用されるとき、ヘレグリン単独で細胞再生において役割を果たすと上記のＷａｎｇら（２００７）が報告したことを考慮すると、これは意外である。
【０２５１】
（実施例７）
ヘレグリンによるｉＰＳ由来の細胞培養物の処置によってＰＥＣのｉｎ  ｖｉｖｏ移植片機能を向上させる方法
ｉＰＥＣを生成するためにｉＰＳＣに適用したときの表７による方法は、動物で安定したｉｎ  ｖｉｖｏ機能を提供しなかったので、出願人はｉＰＥＣ生成のための他の方法を探索した。表７に示す標準方法の変更としては、限定されずに以下のものが挙げられる：任意のｉＰＳＣの継代回数の最適化；ＢＭＰシグナル伝達のレベルをモジュレートすること；増大および分化の間のｉＰＳＣ懸濁凝集パラメータをモジュレートすること（例えばせん断力、回転速度等）；成長因子、例えばＷｎｔ、アクチビンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の濃度、使用時期および使用期間の最適化；ならびに、分化プロトコルの１から４の様々なステージでの、細胞の量、増殖、分化、生存等を向上させるための候補としての他の成長因子による処置（例えばＥＲＢＢリガンド）。ステージ１〜４の間のｉＰＳＣの分化方法をどのように最適化することができるか判断するために、これらの多くの反復実験を単独で、または組合せで検証した。そのような最適化された分化方法は、移植したときに、ｈＥＳＣについて観察および報告されたものに類似した安定したグルコース応答性インスリン分泌細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでもたらしたｉＰＥＣ集団を生成する。下の表１０は、後にｉｎ  ｖｉｖｏでグルコース応答性島細胞に成熟するｉＰＥＣにｉＰＳＣを分化させることが実証された、ヘレグリンの有る無しのベースライン条件を記載する。ベースライン条件は、ヘレグリンがステージ３および４で加えられたこと以外、本明細書の実施例１、２および５ならびに表７に記載されるものに類似していた。３０ｎｇ／ｍＬのΗｒｇ１βを使用したが、１０ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬの濃度、または５０ｎｇ／ｍＬを超える濃度でさえも適する。さらに、実施例２に記載の通り、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙー２７６３２の添加が分化培養で維持された。
【表１０】
2019146578.tif 000024
【０２５２】
ステージ３および４の細胞亜集団に及ぼすヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の添加の影響を判定するために、ｉＰＥＣ集団をフローサイトメトリーによって分析した。表１１は、表１０に示す配合、ならびにアクチビン濃度を２００ｎｇ／ｍＬに増加させることによって改変した配合を使用した、様々なｉＰＥＣ集団のフローサイトメトリー分析の要約を提供する。さらに、表１１は、各セットの実験（ヘレグリンの有る無しのベースライン）で用いた一般的な条件、およびｉＰＥＣ集団中の細胞型（内分泌、非内分泌、ＰＤＸ１だけおよび三重陰性または残留細胞亜集団）の相対的百分率を示す。表１１は、各実験で生成された細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ機能に関するデータも開示する。
【表１１】
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【０２５３】
特定の条件において、ＰＥＣ（ｈＥＳＣ、Ｅ２３５４）およびｉＰＥＣ（Ｅ２３１４、Ｅ２３４４、Ｅ２３４７）集団中の細胞亜集団の比は変化した。例えば、時には、ベースライン（ヘレグリンなし）条件と比較して、内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞の百分率は減少し、非内分泌細胞（ＣＨＧＡ−／ＮＫＸ６．１＋／ＰＤＸ１＋）の百分率は増加した。ヘレグリンがこれらのＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団中の非内分泌細胞と比較した内分泌細胞の割合の変化の原因となるようであったが、実験＃２３８０（Ｅ２３８０）では、ヘレグリンの添加によって内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞のレベルは減少せずに増加した。
【０２５４】
ＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団の構成の変化がｉｎ  ｖｉｖｏ機能に影響を及ぼしたかどうかを判定するために、表１１に記載される大部分の実験からのＰＥＣおよびｉＰＥＣ移植片を、実質的に本明細書ならびに上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）およびＫｒｏｏｎら（２００８）、および上記の米国特許第７，５３４，６０８号；第７，６９５，９６５号；第７，９９３，９２０号および第８，２７８，１０６号を含む出願人の他の特許および非特許出版物に前述の通り、マウスに移植した。簡潔には、ＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団を生分解性の半透過性細胞封入デバイスに全て封入し、そのいくつかは微穿孔を含んでいた。デバイスは出願人によって製造され、２００９年１１月１３日に出願された米国特許第８，２７８，１０６号、表題ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＣＥＬＬＳ  ＦＲＯＭ  ＨＵＭＡＮ  ＰＬＵＲＩＰＯＴＥＮＴ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳで詳細に記載され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを、移植の約５６日後から実施した。グルコース投与の前（空腹時）、およびグルコース投与の３０分後および／または６０分後の組合せで血液を収集した。グルコース投与に応答した血清中のヒトＣペプチド濃度を測定することによって、移植片機能を評価した。
【０２５５】
血清に放出されるヒトＣペプチドの量は、放出されるインスリンの量の指標となる。ＣペプチドはプロインスリンおよびプレプロインスリンのＡおよびＢ鎖を接続または連結する短い３１アミノ酸ペプチドであり、機能性ベータまたはインスリン分泌細胞によって分泌される。上記Ｋｒｏｏｎら（２００８）および他によって前述される通り、ヒトＣペプチドの測定は、移植細胞による新規生成インスリンの放出の評価に適当である。したがって、これらの動物の血清中のヒトＣペプチドのレベルは、成熟したＰＥＣおよびｉＰＥＣ移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ機能の尺度である。ヒトＣペプチドは、移植後少なくとも８週までに血清で検出された。追加の数週の移植および絶食により、グルコース刺激Ｃペプチドレベルは増加し、Ｃペプチドのピークレベルはグルコース投与の６０分後から３０分後にシフトし、それは、インスリン細胞の成熟に従う、グルコース投与へのより速い応答の指標となる。機能を示すことができなかったか、不良な健康状態のために屠殺された少数のマウスがいた。しかし、これらのマウスはさもなければ高機能を示した動物のコホート中にあり、したがって、移植細胞が分化して機能する能力がないということよりも移植の失敗を示唆した。
【０２５６】
図７Ａ〜Ｃは、Ｅ２３４４以外の表１１に示す実験の全てについての、グルコース投与後の血清中のヒトＣペプチドレベルを示す。図７Ａ〜Ｃは、ベースライン対照と比較して、ヘレグリン処置からもたらされた移植片が血清中ヒトＣペプチドのより高いレベルを一般に有したことを示す。例えば、図７Ａでは実験２３８０において、ヘレグリンなしで調製したもの（ベースライン）と比較して、ヘレグリン処置からもたらされた移植片の約５倍の増加（グルコース投与の６０分後に９３３ｐＭ：２００ｐＭ）がある。実験２３５４（図７Ｃ）はベースライン対照と比較してヘレグリン処置からもたらされた移植片で血清Ｃペプチドのより高いレベルを示さないので、ヘレグリンは、ｈＥＳＣから生成されるＰＥＣにより少ない影響を及ぼすようである。さらに、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣ（ＣｙＴ２０３）とｉＰＳＣから導出されたｉＰＥＣを比較すると、ｉＰＥＣ移植片は、ＰＥＣ移植片と同等の機能をｉｎ  ｖｉｖｏで有する（例えば、図７Ａおよび図７Ｂ（ｉＰＳＣ移植片）を図７Ｃ（ＣｙＴ２０３  ｈＥＳＣ）と比較する）。このように、ｉＰＥＣ移植片は、ＰＥＣ移植片と同じくらい頑強である。さらに、内分泌および非内分泌亜集団で同じシフトを有しなかったＥ２３８０からのｉＰＥＣも優れた機能を示したので、ｉＰＥＣ集団のいくつか（例えばＥ２３１４、Ｅ２３４７およびＥ２３５４）に影響を及ぼすように見えた、内分泌細胞対非内分泌細胞の相対比は、ｉｎ  ｖｉｖｏ機能に影響を及ぼさないようであった（図７Ａ〜Ｃを参照）。
【０２５７】
グルコース刺激インスリン分泌を試験することに加えて、宿主動物のベータ細胞を破壊した場合に、ｈＥＳＣから導出されたＰＥＣによって維持される正常血糖と同様の正常血糖をそれらが単独で維持することができるかどうか判定するために、成熟したｉＰＥＣ移植片を試験した。これは、ヒトベータ細胞と比較してマウスベータ細胞に対してより強い細胞毒性を示すベータ細胞毒素、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を使用して、移植されたマウスのベータ細胞を破壊することを必要とした。ＳＴＺ処置の前後に各マウスについて、ランダムな非絶食血中グルコースを測定した。ＳＴＺ処置から１３日目のｉＰＥＣ移植片の外植の結果、高血糖が再開した（血中グルコースの急騰を記す）が、それは内因性マウス膵臓ではなくｉＰＥＣ移植片による血糖症の制御を実証する（図８Ａおよび図８Ｂを参照する）。
【０２５８】
さらに、分化のステージ１〜４の間にヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤が与えられたときに、相乗効果があるようであった（表１０を参照する）。例えば、ｒｈｏキナーゼ阻害剤なしでステージ３および４でヘレグリンによって処置したｉＰＳＣは、目にみえて劣る細胞量をもたらし、移植を不可能にした。ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の相乗効果のさらなる傍証が、実験のいくつか、例えばＥ２３５６、Ｅ２３８０で明白であったが、そこではｒｈｏキナーゼ阻害剤単独によるベースライン条件は、ｒｈｏキナーゼ阻害剤とヘレグリンによる移植片と同じくらい安定的には機能しなかった（図７ＡおよびＢを参照）。ヘレグリン単独の添加が提供した細胞量は移植に不十分であり、ｒｈｏキナーゼ阻害剤単独の添加（ベースライン条件）は不良なｉｎ  ｖｉｖｏ機能を有したので、ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤による処置は相加的でなかったようである。このように、ヘレグリンだけまたはｒｈｏキナーゼ阻害剤だけの提供は、２つを組み合わせた合計の影響に実質的に同等でない。すなわち、単独ではいずれもｉｎ  ｖｉｖｏで安定したグルコース応答性をもたらさないが、組み合わせるとそれらはｈＥＳ由来の細胞のそれと同等のグルコース応答性をもたらす。したがって、ヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤の両方の提供は、それらの組み合わせた影響が各々別々の影響の合計より大きいので相乗的であるようであった。すなわち、ｒｈｏキナーゼ阻害剤およびヘレグリンで処置したｉＰＥＣはｉｎ  ｖｉｖｏで成熟してグルコース刺激インスリン分泌を示し、糖尿病マウスモデルで正常血糖を維持することができた（図７Ａ〜Ｂおよび図８Ａ〜Ｂを参照されたい）。
【０２５９】
ＥＲＢＢ機能性は、リガンド結合、受容体二量体化および受容体輸送を必要とする。各過程での変動は、受容体およびそれらが制御する下流シグナルの差次的調節をもたらす場合がある。例えば、異なるＥＲＢＢリガンドはＥＲＢＢ受容体に異なる親和性で結合し、それによってＥＲＢＢ二量体構成体のパターンおよび動態力学を変化させる。表１２は、リガンドおよび受容体結合複合体の多くの可能な異なる組合せを示す。この系の複雑性に関するレビューは、Ｏｄａら（２００５）Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｍａｐ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．、１（２００５）およびＬａｚｚａｒａら（２００９）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＥＲＢＢ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１５（４）：７１７〜７２５頁によって提供され、その開示は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【表１２】
2019146578.tif 000026
【０２６０】
Ｈｕｏｔａｒｉらは、ニューレグリン−４がグルカゴン（アルファ）細胞を代償にしてソマトスタチン（デルタ）細胞の数を増加させることによって内分泌細胞亜集団の相対レベルをモジュレートすることができること、およびニューレグリン−４は、内分泌（例えば、β−インスリン、α−グルカゴン、δ−ソマトスタチン、ＰＰ−膵臓ポリペプチド）細胞に対する外分泌（例えば、アミラーゼ）細胞の比に影響を及ぼさないことを示唆した。しかし、これらの研究は、Ｅ１２．５日目のマウスから得られたホールマウント器官組織培養の上でニューレグリン−４をインキュベートすることによって実施された。これらのマウス外植細胞集団は、本明細書に記載されるステージ３（例えばＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）および／またはステージ４（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞集団よりさらに分化していた。ニューレグリン−４はＥＲＢＢ４  ＲＴＫだけに結合するので、ホールマウントマウス培養物の内分泌亜集団だけをこの関係においてニューレグリン−４によってモジュレートすることができる。したがって、Ｈｒｇ１はＥＲＢＢ３に結合してＥＲＢＢ２／３の二量体化を誘導することが既に示されているので、本明細書に記載されるように、異なるＥＲＢＢリガンド、例えばＨｒｇ１によるステージ３（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）および／またはステージ４（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）細胞の処置が、Ｈｕｏｔａｒｉにおけるように相対的な内分泌亜集団をモジュレートするとは予想され得ない。しかし、図６に示すようにＰＥＣでのＥＲＢＢ２および３の低レベルの発現のために、ステージ３および４型の細胞が低いレベルか高いレベルのＥＲＢＢ２および３を発現してＨｒｇ１に結合するかどうかは不明であった。
【０２６１】
さらに、異なる場面で、出願人はＨｒｇ１がＥＲＲＢ２／３に結合して、多能性幹細胞の自己複製を促進したことを記載していた（Ｗａｎｇら（２００７）を参照する）。Ｈｒｇ１がステージ３および４の場面で同じ能力で作用することができる可能性があるが、出願人はＰＥＣの生成のための大部分の細胞増大が多能性幹細胞ステージ（ステージ０）で起こることを以前に記載した。ステージ０の間、ｈＥＳＣは約二（２）週の間成長、継代および増殖させられる。したがって、細胞増殖または細胞増殖をもたらす自己複製のほとんどは、ステージ１〜４の間には起こらない。上記Ｓｃｈｕｌｚら（２０１２）を参照されたい。さらに、ＥＲＲＢ２／３がステージ３および４の間に存在すると仮定すると、誘導される分化に影響を与えるのと反対に多能性幹細胞と同様の効果（自己複製）をヘレグリンが有すると予想し得る。そうすると、機能の差は、場面に、すなわち多能性幹細胞か、内胚葉または膵臓系列の細胞型かに依存するようである。
【０２６２】
要約すると、前腸内胚葉（ステージ３）およびＰＤＸ１発現膵臓内胚葉細胞（ステージ３の終わりおよびステージ４）へのヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの提供は、移植されたときにｉｎ  ｖｉｖｏで成熟してグルコース応答性インスリン分泌細胞に発達するＰＥＣおよびｉＰＥＣ集団を生成した（図７および８を参照する）。ヘレグリンまたはヘレグリンおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤のそのような使用は、ここで初めて報告された。そのような使用および影響は、特許または非特許文献で前に記載されたものからは認識できない。
【０２６３】
本明細書に記載されるＱ−ＰＣＲ結果は免疫細胞化学（ＩＣＣ）によってさらに確認することができ、当業者が容易に実施することができることが理解される。
【０２６４】
本明細書に記載される方法、組成物およびデバイスは、現在好ましい実施形態の代表であり、例示的であり、本発明の範囲を限定することを意図していない。当業者は、本発明の精神に包含され、開示の範囲によって規定される、それへの変更および他の使用を思いつくであろう。したがって、本発明の範囲および精神を逸脱しない範囲で、様々な置換および改変を本明細書に開示される本発明に加えることができることは、当業者には明らかであろう。
【０２６５】
下の請求項およびこの開示全体において、語句「から事実上なる」は、語句の後に掲載される任意の要素を含むことを意味し、掲載される要素について開示で特定される活性または作用に干渉しないか寄与しない他の要素に限定される。したがって、語句「から事実上なる」は、掲載される要素は必要とされるか必須であるが、他の要素は任意選択であり、掲載される要素の活性か作用にそれらが影響を及ぼすかどうかによって存在しても存在しなくてもよいことを示す。さらに、数値、例えば量、濃度、百分率、割合または範囲が列挙される実施形態では、言及される値は、「少なくとも約」その数値、「約」その数値、または「少なくとも」その数値であってもよいことが理解される。
【０２６６】
実施形態
実施形態１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉細胞培養物。
実施形態２．膵臓内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態１に記載の細胞培養物。
実施形態３．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触している、実施形態１または２に記載の細胞培養物。
実施形態４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態３に記載の細胞培養物。
実施形態５．膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞および複数ホルモン性内分泌細胞を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態６．膵臓前駆細胞がＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施形態５に記載の細胞培養物。
実施形態７．複数ホルモン性内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態５に記載の細胞培養物。
実施形態８．膵臓内胚葉細胞がＣＨＧＡ陽性およびＣＨＧＡ陰性細胞を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態９．膵臓内胚葉細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１０．膵臓内胚葉細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性細胞である、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１１．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４である、実施形態３に記載の細胞培養物。
実施形態１２．線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１３．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態１２に記載の細胞培養物。
実施形態１４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦＧＦと接触している、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１５．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１６．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の細胞培養物。
実施形態１７．ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉集団。
実施形態１８．膵臓内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態１７に記載の細胞集団。
実施形態１９．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞である、実施形態１８に記載の細胞集団。
実施形態２０．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触している、実施形態１７〜１９のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２１．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態２０に記載の細胞集団。
実施形態２２．膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞および複数ホルモン性内分泌細胞を含む、実施形態１７〜２１のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２３．膵臓前駆細胞がＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施形態２２に記載の細胞集団。
実施形態２４．複数ホルモン性内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態２２に記載の細胞集団。
実施形態２５．膵臓内胚葉細胞がＣＨＧＡ陽性およびＣＨＧＡ陰性細胞を含む、実施形態１７〜２４のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２６．膵臓内胚葉細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形態１７〜２５のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２７．膵臓内胚葉細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態１７〜２６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２８．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４である、実施形態２０に記載の細胞集団。
実施形態２９．細胞培養物が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態１７〜２８のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３０．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態２９に記載の細胞集団。
実施形態３１．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦＧＦと接触している、実施形態１７〜３０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３２．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１７〜３０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３３．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態１７〜２０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触しているヒト膵臓内胚葉細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞集団。
実施形態３５．膵臓内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態３４に記載の細胞集団。
実施形態３６．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞である、実施形態３５に記載の細胞集団。
実施形態３７．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態３４〜３６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３８．膵臓内胚葉細胞が膵臓前駆細胞および複数ホルモン性内分泌細胞を含む、実施形態３４〜３７のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態３９．膵臓前駆細胞がＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施形態３８に記載の細胞集団。
実施形態４０．複数ホルモン性内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態３８に記載の細胞集団。
実施形態４１．膵臓内胚葉細胞がＣＨＧＡ陽性およびＣＨＧＡ陰性細胞を含む、実施形態３４〜４０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４２．膵臓内胚葉細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形態３４〜４１のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４３．膵臓内胚葉細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態３４〜４２のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４である、実施形態３４〜３６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４５．ヒト膵臓内胚葉細胞が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態３４〜４４のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４６．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態４５に記載の細胞集団。
実施形態４７．ヒト膵臓内胚葉細胞がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦＧＦと接触している、実施形態３４〜４６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４８．ヒト膵臓内胚葉細胞がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態３４〜４７のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態４９．ヒト膵臓内胚葉細胞がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態３４〜４８のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態５０．インスリンを生成する方法であって、
ａ．前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより膵臓内胚葉を含む細胞集団を生成するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の膵臓内胚葉をｉｎ  ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態５１．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、内分泌および非内分泌亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の亜集団をｉｎ  ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態５２．インスリンを生成する方法であって、
ａ．膵臓内胚葉細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップ
を含む方法。
実施形態５３．膵臓内胚葉細胞が前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させることによって作製される、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態５０〜５２および５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５．前腸内胚葉細胞が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）とさらに接触している、実施形態５０〜５２および５３〜５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．前腸内胚葉細胞がｒｈｏキナーゼ阻害剤とさらに接触している、実施形態５０〜５２および５３〜５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８．前腸内胚葉細胞がｒｈｏキナーゼ阻害剤およびＦＧＦとさらに接触している、実施形態５０〜５２および５３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、そのドミナントネガティブバリアント、誘導体および発現ベクターからなる群から選択される、実施形態５７〜５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６およびＹ−３０１４１およびそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態５７〜５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１．Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジルおよびＨ−１１５２Ｐ、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態５７〜６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２．膵臓内胚葉が内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む、実施形態５０に記載の方法。
実施形態６３．内分泌細胞亜集団がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．非内分泌細胞亜集団がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）である、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６５．非内分泌細胞亜集団がＮＫＸ６．１を発現する、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６６．膵臓内胚葉の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性である、実施形態５０に記載の方法。
実施形態６７．膵臓内胚葉の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態５０に記載の方法。
実施形態６８．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、
ｂ．ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステップ（ａ）の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、それにより前腸内胚葉細胞を生成するステップと、
ｃ．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより、内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｄ．（ｃ）の細胞集団をｉｎ  ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態６９．非内分泌細胞がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞である、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０．内分泌細胞がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、実施形態６８〜６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７１．ＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞がＮＫＸ６．１を発現する、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７２．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させる、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７３．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＦＧＦと接触させる、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７４．（ｂ）の前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤およびＦＧＦと接触させる、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７５．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、そのドミナントネガティブバリアント、誘導体および発現ベクターからなる群から選択される、実施形態７２〜７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６．内分泌細胞と比較して膵臓内胚葉細胞集団中の非内分泌細胞の比率を増加させる方法であって、
前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより膵臓内胚葉細胞集団中の非内分泌細胞の比率を増加させるステップを含む方法。
実施形態７７．前腸内胚葉細胞をＦＧＦと接触させる、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させる、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７９．前腸内胚葉細胞をＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤とさらに接触させる、実施形態７６に記載の方法。
実施形態８０．移植された膵臓内胚葉のグルコース応答性を向上させる方法であって、
前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより膵臓内胚葉を含む細胞集団を生成するステップと、
膵臓内胚葉をｉｎ  ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞が、前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させることなく作製した膵臓内胚葉から導出されたインスリン分泌細胞よりもよくインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態８１．膵臓内胚葉細胞が脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２．インスリンを生成する方法であって、（ａ）生細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させるステップと、（ｂ）ステップａの最後に細胞を移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップとを含む方法。
実施形態８３．生細胞が前腸内胚葉またはＰＤＸ１陰性前腸内胚葉である、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４．生細胞が脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出される、実施形態８２〜８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５．内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団。
実施形態８６．内分泌および非内分泌細胞亜集団が多能性細胞から導出される、実施形態８５に記載の細胞集団。
実施形態８７．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞である、実施形態８６に記載の細胞集団。
実施形態８８．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質が、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＴＧＦ−アルファ（トランスフォーミング成長因子−アルファ）、Ｂｔｃ（ベータセルリン）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ）、Ｅｒｅｇ（エピレグリン）、ニューレグリンまたはヘレグリンである、実施形態８５〜８７のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態８９．非内分泌細胞はＮＫＸ６．１を発現するがＣＨＧＡを発現しない、実施形態８５〜８８のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９０．内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、実施形態８５〜８９のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９１．細胞の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性細胞である、実施形態８５〜９０のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９２．細胞の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態８５〜９１のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９３．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がヘレグリン−４である、実施形態８５〜９２のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９４．細胞培養物が線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触している、実施形態８５〜９３のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９５．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態９４に記載の細胞集団。
実施形態９６．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびＦＧＦと接触している、実施形態８５〜９５のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９７．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質およびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態８５〜９６のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９８．細胞培養物がＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質、ＦＧＦおよびｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触している、実施形態８５〜９７のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態９９．インスリンを生成する方法であって、（ａ）脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、（ｂ）ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステップ（ａ）の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、それにより、少なくとも前腸内胚葉または少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を生成するステップと、（ｃ）（ｂ）の細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより、内分泌および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、（ｄ）（ｃ）の細胞集団をｉｎ  ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップとを含む方法。
実施形態１００．インスリンを生成する方法であって、（ａ）ＰＤＸ１陽性細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させるステップと、（ｂ）（ａ）の細胞集団をｉｎ  ｖｉｖｏで移植し、成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップとを含む方法。
実施形態１０１．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がステップａ、ｂまたはｃで加えられる、実施形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０２．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がステップａ、ｂおよびｃで加えられる、実施形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０３．ｒｈｏキナーゼ阻害剤がステップａおよびｂで加えられる、実施形態６８または９９〜１００のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０４．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がステップａまたはｃで加えられる、実施形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０５．ＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質がステップａおよびｃで加えられる、実施形態６８または９９に記載の方法。
実施形態１０６．ｉｎ  ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟することが可能な細胞集団を生成する方法であって、少なくとも前腸内胚葉、少なくともＰＤＸ１陰性前腸内胚葉の集団、または少なくともＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞の集団を、ＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでグルコース応答性インスリン分泌細胞に成熟することが可能な細胞集団を生成するステップを含む方法。
実施形態１０７．膵臓内胚葉を生成する方法であって、
ａ．前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢチロシンキナーゼ受容体活性化作用物質と接触させ、それにより膵臓内胚葉を含む細胞集団を生成するステップ
を含む方法。
実施形態１０８．前腸内胚葉細胞を線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触させることをさらに含む、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１０９．ＦＧＦがＦＧＦ−７である、実施形態１０８に記載の方法。
実施形態１１０．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含む、実施形態１０７〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１１．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤およびＦＧＦと接触させることをさらに含む、実施形態１０７〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１２．膵臓内胚葉の少なくとも３０％はＣＨＧＡ陰性である、実施形態１０７〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１３．膵臓内胚葉の少なくとも５０％はＰＤＸ１陽性である、実施形態１０７〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１４．前腸内胚葉細胞が多能性細胞から導出される、実施形態５０、７６、１０７〜１１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１５．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞である、実施形態５０、７６、１０７〜１１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１６．多能性細胞がヒト胚性幹細胞または脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞である、実施形態１に記載の細胞培養物。
実施形態１１７．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された分化した細胞およびＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１１８．ＥＲＲＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質がＥＧＦ成長因子またはリガンドを含む、実施形態１１７に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１１９．ＥＧＦ成長因子またはリガンドが、ヘレグリン−１、ヘレグリン−２およびヘレグリン−３およびヘレグリン−４からなる群から選択されるヘレグリンアイソフォームを含む、実施形態１１８に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１２０．ヘレグリンアイソフォームがヘレグリン−１およびヘレグリン−４を含む、実施形態１１９に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１２１．リガンドヘレグリンアイソフォームがヘレグリン−４を含む、実施形態１１９に記載の膵臓内胚葉細胞集団。
実施形態１２２．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞から導出された前腸内胚葉細胞培養物をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の亜集団をｉｎ  ｖｉｖｏで成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌する、ステップと
を含む方法。
実施形態１２３．前腸内胚葉細胞培養物をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含む、実施形態１２２に記載の方法。
実施形態１２４．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアント、それらの誘導体およびそれらの発現ベクターからなる群から選択される、実施形態１２３に記載の方法。
実施形態１２５．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１およびそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態１２３に記載の方法。
実施形態１２６．Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７．インスリンを生成する方法であって、
ａ．脱分化した遺伝的にリプログラミングされた細胞を、ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を含む第１の培地とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、
ｂ．ＴＧＦβ受容体ファミリーメンバーを活性化する作用物質を欠く第２の培地でステップ（ａ）の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、それにより前腸内胚葉細胞を生成するステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の前腸内胚葉細胞をＥＲＢＢ受容体チロシンキナーゼ活性化作用物質と接触させ、それにより、内分泌細胞および非内分泌細胞亜集団を含む細胞集団を生成するステップと、
ｄ．ステップ（ｃ）の細胞亜集団をｉｎ  ｖｉｖｏで成熟させ、それによりインスリン分泌細胞を得るステップであって、インスリン分泌細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを分泌するステップと
を含む方法。
実施形態１２８．非内分泌細胞がＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞である、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１２９．内分泌細胞がＣＨＧＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞である、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１３０．ＣＨＧＡ陰性（ＣＨＧＡ−）細胞がＮＫＸ６．１をさらに発現する、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１３１．前腸内胚葉細胞をｒｈｏキナーゼ阻害剤と接触させることをさらに含む、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１３２．ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、ファスジル、Ｈ−１１５２Ｐ、Ｗｆ−５３６、Ｙ−３０１４１、ＲＯＣＫのアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸、競合的ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害性抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、ドミナントネガティブバリアント、それらの誘導体およびそれらの発現ベクターからなる群から選択される、実施形態１３１に記載の方法。
【図１】
2019146578.tif 000027
【図２Ａ−Ｂ】
2019146578.tif 000028
【図２Ｃ−Ｄ】
2019146578.tif 000029
【図２Ｅ−Ｆ】
2019146578.tif 000030
【図２Ｇ−Ｈ】
2019146578.tif 000031
【図２Ｉ−Ｊ】
2019146578.tif 000032
【図２Ｋ−Ｌ】
2019146578.tif 000033
【図３】
2019146578.tif 000034
【図４】
2019146578.tif 000035
【図５】
2019146578.tif 000036
【図６】
2019146578.tif 000037
【図７Ａ】
2019146578.tif 000038
【図７Ｂ】
2019146578.tif 000039
【図７Ｃ】
2019146578.tif 000040
【図８Ａ】
2019146578.tif 000041
【図８Ｂ】
2019146578.tif 000042
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月16日(2019.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内分泌細胞亜集団および非内分泌細胞亜集団を含む膵臓前駆細胞集団であって、
前記細胞集団は、有効量の成長因子を含む培地中の脱分化したリプログラミング化ヒト多能性幹細胞に由来するものであり、
前記成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーリガンドまたは線維芽細胞成長因子であり、
前記細胞集団の少なくとも３０％が前記非内分泌細胞亜集団である、
細胞集団。
【請求項２】
前記非内分泌細胞亜集団はＮＫＸ６．１を発現するがクロモグラニンＡは発現せず、前記内分泌細胞亜集団はクロモグラニンＡを発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記ＥＧＦファミリーリガンドが、ヘレグリンアイソフォームを含む、請求項１または２に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記へレグリンアイソフォームが、ヘレグリン−１β、ヘレグリン−１、ヘレグリン−２、ヘレグリン−３またはヘレグリン−４を含む、請求項３に記載の細胞集団。
【請求項５】
前記膵臓前駆細胞集団が、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項６】
前記膵臓前駆細胞集団が封入されており、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植することができるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項７】
移植された前記膵臓前駆細胞集団はｉｎ  ｖｉｖｏでインスリン生成細胞に成熟する、請求項６に記載の細胞集団。
【請求項８】
前記膵臓前駆細胞集団は半透膜を含む半透過性デバイスに封入されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項９】
前記半透過性デバイスは少なくとも１つの細胞封入チャンバーを含む、請求項８に記載の細胞集団。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの細胞封入チャンバーは少なくとも１つのシールを含む、請求項９に記載の細胞集団。
【請求項１１】
前記半透過性デバイスは穿孔性半透膜を含む、請求項８に記載の細胞集団。
【請求項１２】
前記脱分化したリプログラミング化ヒト多能性幹細胞は人工多能性幹細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項１３】
前記膵臓前駆細胞集団は、シールされた端、細胞封入チャンバー、および前記細胞封入チャンバー内の仕切りシールを含むデバイスに封入されており、前記細胞封入チャンバー内の前記仕切りシールは前記チャンバーの表面積を増加させない、請求項１〜６および１２のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項１４】
前記線維芽細胞成長因子はＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２またはＦＧＦ２３を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項１５】
前記膵臓前駆細胞集団は半透膜を含むデバイスに封入されており、前記半透膜は合成材料を含み、前記合成材料はポリスルホン（ＰＳＦ）、ナノファイバーマット、ポリイミド、テトラフルオロエチレン／ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリアクリロニトリル、ポリエーテルスルホン、アクリル樹脂、セルロースアセテート、セルロースナイトレート、ポリアミド、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）である、請求項１〜６、１２、および１４のいずれか１項に記載の細胞集団。
【外国語明細書】
2019146578000001.pdf