(57)【要約】【課題】  微細な異物が少なく舌触りが滑らかな糀調味料・糀飲料等が安価で簡便なスリ工程により短時間で得られる、低コストかつ簡便な製法を提供する。【解決手段】  糀菌を用いた糀調味料・糀飲料の製造方法であって、仕込み原料に含まれる穀物の糖化工程において、セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップを含む糀調味料・糀飲料の製造方法であって、セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップは、セリンプロテアーゼを酵素剤として添加することを含む糀調味料・糀飲料の製造方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糀菌を用いた糀調味料・糀飲料の製造方法であって、
仕込み原料に含まれる穀物の糖化工程において、セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップを含み、
セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップは、セリンプロテアーゼを酵素剤として添加することを含む、糀調味料・糀飲料の製造方法。
【請求項２】
仕込み原料に含まれる酒粕の処理工程において、セリンプロテアーゼの濃度を増加させる操作を含む糀調味料・糀飲料の製造方法。
【請求項３】
さらに、マスコロイダーによる破砕処理をすることを含み、７０メッシュでもメッシュ上に残らない甘酒ペーストを得るための破砕処理速度が、１１８ｋｇ／ｈを超える請求項１又は請求項２に記載の糀調味料・糀飲料の製造方法。
【請求項４】
水抽出液のカゼインフォーリン法によるプロテアーゼ活性測定（３０℃、ｐＨ６．０）において、酵素阻害剤による分別定量によって測定した、酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性が２０％以上２００％以下である糀もしくは糀調味料・糀飲料。
【請求項５】
酵素活性を有する若しくは失活したセリンプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼの断片を含む糀調味料・糀飲料であって、粒径０．２mm以上の水不溶性蛋白質を主要成分とする異物の量が、出願時に市販されている種麹を使用して雰囲気温度３０℃、湿度９０％以上の条件下、精白歩合９０％の酒造米の蒸米上で２日間培養して米糀を調製し、さらに総量に対する米糀量が１７％となる分量の蒸煮掛米とお湯を１．２８１の割合で加えて５０〜６０℃で一晩糖化して得られた生成物に含まれる異物の量に比べて少ない糀もしくは糀調味料・糀飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糀調味料・糀飲料、糀調味料・糀飲料の製造方法、及び、該製造方法に好適に用いられる新規の糀菌に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
米糀は、米の糖化工程において、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、酸性プロテアーゼ、酸性カルポキシペプチダーゼ等の酵素を分泌し、米に含まれる米の澱粉質や蛋白質を分解してブドウ等や各種必須アミノ酸を蓄積することが知られており、斯かる糀菌の米への作用を利用した甘酒は、優れた栄養食品の１つとして季節を問わず飲食されている。
【０００３】
甘酒は、主に米糀と米、あるいは酒粕を原料とし、作り方は、糀を使用する製造方法と酒粕を使用する方法が知られている。糀を使用する方法は、米糀と米を原料とし、米糀と適宜蒸した米を混合・発酵することで、糀の生産する酵素により米の澱粉質や蛋白質を分解することで得られる。また、酒粕を使用する方法は、湯に酒粕を溶いて加熱し、砂糖などの甘味を加える、または、これらの組合せによる方法も採用されている。
【０００４】
甘酒の製造がいずれの手法による場合でも、甘酒を飲みなれないと、米（又は米糀）や酒粕の固形分が違和感となり、敬遠される場合が多く、従来は簡単なスリ機で甘酒をすりつぶした甘酒ペーストを使用している。しかし、従来缶入り甘酒、カートカン甘酒に用いている甘酒ペーストには、水に不溶性の異物が含まれ、飲食した際にこの異物の舌触りが悪くざらつきを感じるという共通の問題がある。そこで、このざらつきを抑制するために、米糀及び／又は酒粕ペーストを一旦水に溶かしてスラリー化したのち、マスコロイダー、ホモミキサー、フレンチプレス等の機械的手法により処理することが提案されている（例えば、特許文献１、特許文献２等）。しかしながら、この方法は高価で特殊な設備が必要であり、粉砕に時間がかかるなど手間も多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−０１４７０１号公報
【特許文献２】特開２００７−３１２６４８号公報
【特許文献３】特開２００６−２１１９６６号公報
【特許文献４】特開２０１０−４７６０号公報
【特許文献５】特開２００７−８２５０５号公報
【特許文献６】特開２００９−０９５２７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、上記現状に鑑み、微細な異物が少なく舌触りが滑らかな糀調味料・糀飲料等が安価で簡便なスリ工程によって短時間に得られる、低コストかつ簡便な製法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討するなかで、舌触りのざらつきの原因が粒径０．２ｍｍ以上で主要成分を蛋白質とする異物であることを見いだし、この異物の分解または生成抑制のため、種々の酵素剤を検討したところ、セリンプロテアーゼの添加によりざらつき成分が分解することを見いだした。
【０００８】
またとりわけ米糀において、セリンプロテアーゼを高産生する糀菌はこれまで知られておらず、プロテアーゼとしては酸性プロテアーゼのみを産生するものが大半である。これを支持するように、特許文献３では、親株よりも糖質分解酵素活性及び／又はタンパク質分解酵素活性が著しく上昇し、しかも酒類の醸造における実用株として有用な新規糀菌が開示されているが、ここでの「タンパク質分解酵素」は、酸性プロテアーゼ及び酸性カルボキシペプチダーゼからなる酵素群のうち１種又は２種に限定されており、セリンプロテアーゼについては何ら言及されていない。特許文献４は、実質的に糀菌に由来するヌクレオチドだけからなるベクターで形質転換された糀菌をポテトデキストロース培地及び液体培地で培養することによって、アルカリ性プロテアーゼを産生する方法が提案されているが、培地が米糀ではない。特許文献５は、形質転換された糀菌を用いてふすま培地上で蛋白質加水分解酵素を発現させた例であるが、米糀上でのセリンプロテアーゼ産生の検証はなされていない。特許文献６は、重イオンビームを照射して糀菌の育種を行い、高プロテアーゼ生産と高グルタミナーゼ生産とを両立する糀菌を得ているが、プロテアーゼ産生能は総プロテアーゼ活性の評価であり、米糀上でのセリンプロテアーゼの産生を示唆するものではない。
【０００９】
そこで、上記目的を達成するためになされた本発明の１つの側面は、糀菌を用いた糀調味料・糀飲料の製造方法であって、仕込み原料に含まれる穀物の糖化工程において、セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップを含む糀調味料・糀飲料の製造方法である。本製法により、マスコロイダー等の高価で特殊な設備を使用しなくとも、簡単なスリ機などで微細な異物が少なく舌触りが滑らかな糀調味料・糀飲料等を短時間で簡便に得ることができる。また、マスコロイダーを使用する場合でも、処理速度が大幅に短縮されるため、製造コストを削減することができる。
【００１０】
上記セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップは、上記新規の糀菌を仕込み原料に含まれる穀物に接種することを含んでいてもよい。これにより、糖化工程中に別途添加すべき酵素剤の量を低減し、望ましくは別途添加を不要とし、製造コストを削減することができる。
【００１１】
上記セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップは、セリンプロテアーゼを酵素剤として添加することを含んでいてもよい。これにより、より速く酵素反応が進行し、生産性を向上することができる。
【００１２】
上記目的を達成するためになされた本発明の他の側面は、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に属し、米糀において、セリンプロテアーゼを産生する糀菌である。本糀菌は、米糀において公知種では全く産生しないセリンプロテアーゼを産生する新規の糀菌であり、例えば、甘酒の製造過程において異物の生成を抑制でき、マスコロイダー等の特殊な機械的処理を不要とする点で有用性著しいものである。
【００１３】
上記糀菌は、雰囲気温度３０℃、湿度９０％以上で２日間培養された米糀の水抽出液のカゼインフォーリン法によるプロテアーゼ活性測定（３０℃、ｐＨ６．０）において、酵素阻害剤による分別定量によって測定した酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性が２０％以上２００％以下であることが好ましい。
【００１４】
上記目的を達成するためになされた本発明の他の側面は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＡ−１０２３０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８７１）又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＡ−１１４００（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８７２）である。
【００１５】
上記目的を達成するためになされた本発明の他の側面は、仕込み原料に含まれる酒粕の処理工程において、セリンプロテアーゼの濃度を増加させる操作を含む糀調味料・糀飲料の製造方法である。本製法により、仕込み原料として米糀を使用しない場合でも、微細な異物が少なく舌触りが滑らかな糀調味料・糀飲料等を短時間で簡便に得ることができる。
【００１６】
上記目的を達成するためになされた本発明の他の側面は、米糀又は酒粕を仕込み原料として含む糀調味料・糀飲料の製造方法によって得られる糀もしくは糀調味料・糀飲料である。本構成により、舌触りが滑らかな糀調味料・糀飲料を得ることができる。
【００１７】
本発明の他の側面は、酵素活性を有する若しくは失活したセリンプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼの断片を含む糀調味料・糀飲料である。糀調味料・糀飲料内に含まれるセリンプロテアーゼが酵素活性を有するものであると、例えば、肉類、魚肉類を漬け込む用途には味、風味、旨味の浸透とともに肉質を短時間で顕著に軟らかくする効果をもたらす。一方、糀調味料・糀飲料内に含まれるセリンプロテアーゼが失活または分解したものであると、最終製品における酵素反応の進行が製品の劣化につながる用途について製品の保存性、品質保持性を向上できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、従来米糀による米の糖化工程において、糖化物中に生成していた微細な異物の生成を抑制し、舌触りのざらつきを改善した糀調味料・糀飲料が短期間で得られることから生産性を著しく向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例４において、新規の変異株ＢＡ−１１４００で製造した塩糀にハムを漬けた結果を示す写真である。
【図２】実施例４において、新規の変異株ＢＡ−１０２３０で製造した塩糀にハムを漬けた結果を示す写真である。
【図３】実施例４において、市販のＭ社製塩糀粒で製造した塩糀にハムを漬けた結果を示す写真である。
【図４】実施例４において、市販のＨ社製塩糀にハムを漬けた結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の新規糀菌は、定法に従って、１８ＳｒＤＮＡの塩基配列を決定し、既知の塩基配列と比較したところ、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）と９９％以上の相同性を示すため、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に分類される、米糀におけるセリンプロテアーゼ高生産株である。その取得方法としては、市販菌株及び分離菌株に対するスクリーニング、物理的な紫外線（ＵＶ）照射や化学的な変異剤の使用等の変異作出手段の作用が挙げられる。なかでも簡便性の観点から、市販菌株に対するスクリーニングやＵＶ照射が好ましい。例えば、アスペルギルス・オリーゼの胞子にＵＶ照射を施した後、プレート上で培養し、セリンプロテアーゼ生産能の向上した変異株を酵素分別定量によって選抜することによって本発明のセリンプロテアーゼ高生産Ａ．オリーゼの変異株が得られる。
【００２１】
上記方法で新規に分離した糀菌の１株は、下記の遺伝子解析によってアスペルギルス・オリーゼに属することが判明したものであるが、セリンプロテアーゼ生産能が著しく高くなっていることから、その変異株と同定し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＡ−１０２３０と命名、表示し、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）にＮＩＴＥ  Ｐ−０１８７１、さらにもう１株は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＢＡ−１１４００と命名、表示し、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）にＮＩＴＥ  Ｐ−０１８７２として寄託されている。
【００２２】
遺伝子解析の方法及び結果を以下に示す。
（１）染色体ＤＮＡの取得
サブロー培地（グルコース４．０％、ポリペプトン１．０％、ｐＨ５．６）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、アスペルギルス・オリーゼＢＡ−１０２３０又はアスペルギルス・オリーゼＢＡ−１１４００を植菌した。２５℃で４日間振盪培養した後、Ｎｏ．２ろ紙でろ過して菌体を回収した。液体窒素で菌体を凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕し、ＤＮＡ抽出用緩衝液（５．０％ＳＤＳ、０．１Ｍ、ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１５ｍｌを加えゆっくり振盪して溶解した。遠心分離（５，０００ｒｐｍ、６ｍｉｎ、ｒｔ．）により上清を得、フェノール／クロロホルム抽出を３回、エーテル抽出を２回行い、エーテルを蒸発させた後、３Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、エタノール２５ｍｌを加え、−３０℃で３０分放置した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）により染色体ＤＮＡを回収し、７０％エタノールにて洗浄した後、ＴＥ４００μｌに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液にＲＮａｓｅ１０μｌ（０．１３２Ｕ）を加え、３７℃で１時間ＲＮａｓｅ処理した後、プロテイナーゼＫを５μｌ（０．６Ｕ）加え、５０℃で１時間処理した。フェノール／クロロホルム抽出（２回）、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出（１回）を行った後、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した。７０％エタノール溶液により洗浄した後、エタノールを除去し、ＴＥ２００μｌに溶解した。
（２）１８ＳｒＤＮＡ遺伝子断片の増幅
Ｐ１    ５‘−ＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号：１）
Ｐ２    ５‘−ＡＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣ−３’（配列番号：２）
前述の方法で得られた染色体ＤＮＡ  を鋳型ＤＮＡ  としてＰ１プライマーとＰ２プライマーの組み合わせでＰＣＲ反応を２５サイクル行った。得られたＤＮＡ断片の塩基配列「配列番号：３」（配列番号：ＢＡ−１０２３０の１８ＳｒＤＮＡ塩基配列）、及び「配列番号：４」（配列番号：ＢＡ−１１４００の１８ＳｒＤＮＡ塩基配列）を決定した。
「配列番号：３」、「配列番号：４」に示した塩基配列を既知の塩基配列データーベースと比較したところ、いずれもアスペルギルス・オリーゼの１８ＳｒＤＮＡ塩基配列と９９％以上の相同性を示したため、本菌株をアスペルギルス・オリーゼと同定した。
【００２３】
本発明の新規糀菌は、雰囲気温度３０℃、湿度９０％以上の条件下で２日間培養された米糀の水抽出液のカゼインフォーリン法によるプロテアーゼ活性測定（３０℃、ｐＨ６．０）において、酵素阻害剤による分別定量によって測定した酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性が２０％以上２００％以下であるものが好ましい。活性のより好ましい下限は、３５％、より好ましい上限は、１８０％以下、１５０％以下、又は、１２０％以下である。ここで活性とは、タンパク質分解酵素活性であり、３０℃で１分間にチロシン１μｇに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を１単位として米糀１ｇあたりとして算出される数値である。
【００２４】
本発明の糀菌は、甘酒の他、清酒、焼酎、みりん、米味噌、塩糀等の酵母によるアルコール発酵を伴う又は伴わない糀飲料・糀調味料の製造用途に幅広く使用することができる。
【００２５】
以下、仕込み原料が米である場合の本発明の糀調味料・糀飲料の製造方法について説明するが、大麦、小麦、小豆、蕎麦、粟、稗、トウモロコシ等の他の穀物の場合も同様である。なお、本明細書において「仕込み原料」は、糀原料及び掛原料を含む概念である。
【００２６】
固体糀を使用する場合、仕込み原料に対して任意に施される前処理工程と、蒸米を得るための蒸し工程と、糖化工程とを含む。
【００２７】
前処理工程には、米の焙炒工程、精白工程、浸漬工程等が含まれる。焙炒工程は、任意であるが、精白前又は精白後の穀物原料のいずれにおいて行ってもよい。精白工程において、精米歩合等は任意であるが、通常、４０％〜９０％の範囲とする。
【００２８】
蒸し工程には、１００℃以下での無圧蒸、１００℃を越える温度での加圧蒸のいずれを採用することもできる。
【００２９】
糖化工程は、蒸し工程で得られた蒸米に糀菌を接種して米糀を得る第１の段階と、米糀に対して掛原料及び／若しくは塩並びにお湯、焼酎若しくは醸造用アルコールを添加し所定時間、所定温度で維持する第２の段階とを含む。第２の段階において、アミラーゼ製剤を添加する場合もある。本明細書において、「糖化工程」とは、仕込み原料に含まれる穀物中の澱粉をブドウ糖まで分解する一連の工程を意味する。したがって、「糖化工程」は、澱粉をブドウ糖まで至らないまでもある程度小さく分解する意味で当業者に使用される「液化」を含む概念である。
【００３０】
第１の段階で使用する糀菌としては、従来公知の糀菌、本発明の上記糀菌、その他の変異、スクリーニング又は遺伝子組み換え技術により得られた糀菌のいずれであってもよいが、好ましくは、上述した新規糀菌を接種することでセリンプロテアーゼの分泌を増大させ、セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップを含む。
【００３１】
第２の段階で使用する掛米としては、一般の酒造米のほか、もち米、低グルテリン米を使用することもできる。精米歩合等は任意であるが、通常、４０％〜９０％の範囲である。予め蒸きょう法や焙炒法によって殺菌と澱粉成分の糊化をしておくことが好ましい。なお、所定温度は、通常５０℃〜６５℃、所定時間は、５時間以上で通常一晩放置とされるが特に限定されず、製品によっては室温で長期熟成（１ヶ月〜１年）される。第２の段階において、別途用意したα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼからなる群より選択される１種又は２種以上のアミラーゼを補助的に添加してもよい。
【００３２】
第２の段階において、別途用意した市販のセリンプロテアーゼを添加し、セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップを含んでいてもよい。第２の段階で使用するセリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えば、サブチリシン、サーミターゼ、プロテイナーゼＫ、ランチビオティックペプチダーゼケキシン等のサブチリシン様（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｌｉｋｅ）セリンプロテアーゼ；トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、エラスターゼ等のキモトリプシン様（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ）セリンプロテアーゼが挙げられる。これらのセリンプロテアーゼは、いかなる菌に由来するものであってもよい。
【００３３】
第１の段階及び第２の段階においてセリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップは、択一的ではなく、併用することも許容される。また、本明細書において、「セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加」することには、菌体外においてセリンプロテアーゼが予め所定量存在する状態からセリンプロテアーゼを有意量増加させることのみならず、セリンプロテアーゼが実質的に存在しない濃度ゼロの状態からセリンプロテアーゼを増加させることも含まれる。
【００３４】
セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させる他の手法としては、第１の段階又は第２の段階において、またはその後工程として、菌体を破砕することによって菌体内に蓄積されたセリンプロテアーゼを菌体外に放出することを含んでいてもよい。
【００３５】
上記糖化工程により得られた物に含まれる酵素は、適宜加熱処理や失活物質の添加によって失活させることができる。セリンプロテアーゼを添加した場合は、基本的に加熱により失活させるが、活性を維持することを排除するものではない。上記新規糀菌により生産されたセリンプロテアーゼを含むプロテアーゼ群は、製品用途に応じて、活性を維持する選択肢と、失活させる選択肢とがある。例えば、製品が甘酒である場合は、その特性上失活させることが好ましい。一方、製品が塩糀や米みそである場合は、失活させてもよいし、肉類、ハム類、魚肉類等を漬け込んだときに味、風味、旨味の浸透とともに酵素が肉質を軟らかくすることに寄与しうる点で、最終製品に酵素を残すという選択肢も十分考えられる。
【００３６】
以上では、仕込み原料として米（米糀）を使用する場合について説明したが、仕込み原料として米（米糀）を使用しない場合、例えば、酒粕を使用する場合でもセリンプロテアーゼの濃度を増加させ、その活性の至適ｐＨ、至適温度に調整することによって、同様の効果を得ることができる。但し、マスコロイダー等の機械的処理を併用することが好ましい。
【００３７】
本発明の製造方法により得られた糀調味料、糀飲料の製品形態としては特に限定されず、例えば、凍結乾燥品、ペースト、スラリー、顆粒、粉末、液体等様々な形態をとり得、これらの製品形態とするために、従来公知の加工法を採用しうる。
【００３８】
セリンプロテアーゼ活性を有する糀調味料・糀飲料もまた、本発明の一側面である。セリンプロテアーゼとしては、上述した製造方法において添加したセリンプロテアーゼやスクリーニング株由来又は変異株由来のセリンプロテアーゼと同一である必要はなく、例えば、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来アルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来アルカリプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ属由来アルカリプロテアーゼ等のいずれであってもよい。
【００３９】
上記酵素活性を有するセリンプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼの断片は、少なくとも外部から添加したか又は菌株が産生したことが判別できる程度に有意量含まれていることが好ましく、雰囲気温度３０℃、湿度９０％以上の条件下で２日間培養された米糀の水抽出液のカゼインフォーリン法によるプロテアーゼ活性測定（３０℃、ｐＨ６．０）において、酵素阻害剤による分別定量によって測定したセリンプロテアーゼ活性で、１Ｕ／ｇ以上含まれていることが好ましい。製品中に残存するセリンプロテアーゼまたはその断片の分離検出方法としては特に限定されないが、例えば、酵素活性、又は、ウエスタンブロッティング法等を採用することができる。
【００４０】
本発明の糀調味料・糀飲料には、甘酒の他、清酒、塩糀、みりん、みりん風調味料、米味噌等の米由来の糀調味料・糀飲料が含まれる。
【実施例】
【００４１】
（セリンプロテアーゼ高産生株のスクリーニングによる選抜）
市販種糀及びイチビキ分離株（土壌、米等自然界より分離）約２００株をＰＤＡ平板培地に塗沫し、生育した糀菌を９０％精米の米を用いた固体培養（３０〜３５℃で２日間）に供した。得られた米糀１０ｇを水５０ｍｌで室温３時間抽出濾過後、その上清０．４ｍｌ相当を酵素阻害剤による分別定量法に供し、セリンプロテアーゼ高産生株を選択した。
【００４２】
（セリンプロテアーゼ高産生変異株の作出）
上記スクリーニングで得られたセリンプロテアーゼ高生産株の胞子懸濁液を調製し、常法に従ってＵＶ照射（１５Ｗ殺菌灯下、７分、致死率９５％）を行い、変異を誘発させた。ＵＶ処理した胞子懸濁液をＰＤＡ平板培地に塗沫し、生育した候補株をＰＤＡ斜面培地に釣菌して３０℃、３日間培養した。得られた変異株を９０％精米の米を用いた固体培養（３０〜３５℃で２日間）に供した。得られた米糀１０ｇを水５０ｍｌで室温３時間抽出濾過後、その上清０．４ｍｌ相当を酵素阻害剤による分別定量法に供し、セリンプロテアーゼ高産生変異株を選択した。
【００４３】
（酵素分別法による各酵素活性の測定と相対活性の計算）
以上のスクリーニングまたは突然変異法により得られたセリンプロテアーゼ高産生株の米糀における酵素活性の評価は以下の手順で行った。
上記で得られた粗酵素液０．４ｍｌに対して、各種阻害剤溶液０．１ｍｌを終濃度０．１ｍＭになるように加え、室温で１０分間放置した。１０分後、予め、３０℃に保温しておいたｐＨ６．０に調整した２％ミルクカゼイン溶液１．０ｍｌを加え、３０℃で２０分反応させた。０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液２．５ｍｌを加えて反応を停止させ、室温で１０分間放置した。１０分後、Ｎｏ．６ろ紙でろ過してろ液を得、ろ液０．５ｍｌに対して０．４Ｍ炭酸ナトリウム溶液２．５ｍｌとＦｏｌｉｎ試薬（１Ｎ）０．５ｍｌを加えてよく混和し、室温で１０分間放置した後、マイクロプレートリーダー（テカン社製サンライズレインボー）を用いて６６０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４４】
本条件での各種プロテアーゼ活性は、下記のように定義した。
（１）総プロテアーゼ活性：阻害剤溶液に水を用い、上記操作を行い、１分間にチロシン１μｇに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を１単位として評価した。
（２）酸性プロテアーゼ活性：阻害剤溶液にペプスタチンＡを用い、上記操作を行い、総プロテアーゼ活性と比較して、ペプスタチンＡにより阻害を受けるたんぱく質分解活性を１分間にチロシン１μｇに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を１単位として評価した。
（３）セリンプロテアーゼ活性：阻害剤溶液にフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を用い、上記操作を行い、総プロテアーゼ活性と比較して、ＰＭＳＦにより阻害を受けるたんぱく質分解活性を１分間にチロシン１μｇに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を１単位として評価した。
（４）セリンプロテアーゼ活性の酸性プロテアーゼ活性に対する相対活性は、上記セリンプロテアーゼ活性÷酸性プロテアーゼ活性×１００（％）で算出した。
【００４５】
（実施例１：甘酒の製造）
精米歩合９０％で精米することにより得られた精白米を常法に従って、洗米し、水に２０時間浸漬し、１時間水切りした後、３０分間無圧蒸によって蒸煮した。得られた蒸米２００ｇに予め用意しておいた市販の種糀を接種し、雰囲気温度３０℃、湿度９０％以上の条件下で２日間培養し、得られた米糀１５０ｇに上記と同様に蒸煮した掛米４１０ｇ、お湯３２０ｇ、アミラーゼ製剤０．５ｇ、市販のセリンプロテアーゼ（商品名：オリエンターゼ２２ＢＦ、ＨＢＩ社製）０．４ｇを添加して５０〜６０℃で一晩糖化させた。得られた糖化物をみそスリ機（スクリュー押出式、通し孔径０．４ｍｍ）にかけ、その後８５℃で加熱処理を施すことで甘酒ペーストを得た。得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。
【００４６】
（実施例２：甘酒の製造）
予め製造しておいたアスペルギルス・オリーゼ変異株ＢＡ−１０２３０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８７１）を含む種糀を接種したほかは実施例１と同様の手順で甘酒ペーストを得た。得られた米糀の酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性は５５．１％であり、得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。同様に、アスペルギルス・オリーゼ変異株ＢＡ−１１４００（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８７２）を含む種糀を接種した他は実施例１と同様の手順で甘酒ペーストを得た。得られた米糀の酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性は５４．８％であり、得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。
【００４７】
（参考例：甘酒の製造）
上記実施例１で得られた米糀をさらに培養を継続し、４日間培養した。その結果得られた米糀は緑色の胞子が着生し、甘酒としての商品価値はなくなってしまったが、その酸性プロテアーゼとセリンプロテアーゼの相対活性はＢＡ−１０２３０で１９５％、ＢＡ−１１４００で１８６％とセリンプロテアーゼの相対活性が大幅に増大した。得られた米糀を使用して作成した甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。上記麹菌変異株にさらに変異を導入し、胞子着生し難くする、胞子の色を白色化する、又は、生育速度を早くすることで、相対活性にして２００％近い変異株を実用に供し得ることが示唆された。
【００４８】
（比較例１：甘酒の製造）
市販のセリンプロテアーゼに代えて酸性プロテアーゼ（商品名：オリエンターゼＡＹ、ＨＢＩ社製）を添加したほかは実施例１と同様にして甘酒ペーストを得た。得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、依然として舌触りのざらつきが感じられ、異物の存在が確認された。
【００４９】
（比較例２：甘酒の製造）
市販のセリンプロテアーゼに代えてメタルプロテアーゼ（商品名：ヌクレイシン、ＨＢＩ社製）を添加したほかは実施例１と同様にして甘酒ペーストを得た。得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、依然として舌触りのざらつきが感じられ、異物の存在が確認された。
【００５０】
（比較例３：甘酒の製造）
市販のセリンプロテアーゼを加えなかったほかは実施例１と同様にして甘酒を得た。得られた甘酒をマスコロイダー（機種：スーパーマスコロイダーＭＫＣＡ６−２Ｊα、砥石：ＭＫ  Ｅ）（クリアランス：軽接より−１００μｍ、回転砥石の回転速度：１，８００ｒｐｍ）で破砕処理した。この手法によって７０メッシュでもメッシュ上に残らない甘酒ペーストを得るための破砕処理速度は、１１８ｋｇ／ｈであり、実施例１の手法で同水準のものを生産するための処理速度は２９６ｋｇ／ｈであり、本発明を用いることで摩砕処理速度は、およそ３倍に向上した。
【００５１】
（実施例３：塩糀の製造手順）
精米歩合９０％で精米することにより得られた精白米を常法に従って、洗米し、水に２０時間浸漬し、１時間水切りした後、３０分間無圧蒸によって蒸煮した。得られた蒸米４ｋｇに予め用意しておいたアスペルギルス・オリーゼ変異株ＢＡ−１０２３０（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８７１）又はアスペルギルス・オリーゼ変異株ＢＡ−１１４００（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８７２）を含む種糀をそれぞれ接種し、雰囲気温度３０℃、湿度９０％以上の条件下で２日間培養し、得られた米糀４５０ｇに、お湯５５０ｇと食塩１１１ｇを添加して３０℃で１週間熟成させた。得られた塩糀は、色、味、香りとも通常の塩糀と遜色なかった。得られた塩糀中のプロテアーゼ活性を分別定量したところ、酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性はそれぞれ５４．１％、５０．２％であった。
比較として、市販の塩糀（Ｈ社製、Ｍ社製）を同様に測定したが、セリンプロテアーゼ活性は認められなかった（相対活性１０％未満）。
【００５２】
（実施例４：ハムの分解実験手順）
結着材にでんぷんを使用しないスライスハム（伊藤ハム社製）４つ切りにし、５枚１組（２５ｇ）として、これに実施例３で得た塩糀５ｇを加えて５℃で２日間漬け込んだ。比較として市販の塩糀（Ｈ社製、Ｍ社製）を用いて、同様にスライスハムの漬け込みを行った。
その結果、写真に示すように、実施例３で得たセリンプロテアーゼを含む塩糀で漬け込んだスライスハムはボロボロになるまで分解されていたが、酸性プロテアーゼ活性は同程度のＨ社製の塩糀も酸性プロテアーゼが半量程度のＭ社製塩糀のいずれも、スライスハムの顕著な分解は起こらなかった。
【００５３】
（実施例５：豚ロース肉の漬け込み実験）
厚さ１ｃｍにカットした豚ロース肉（約１００ｇ）に対して実施例３で得られた塩糀又は市販の塩糀２０ｇを袋に入れ、よく混ぜて肉と馴染ませた後、密封して５℃で３時間漬け込みを行った。３時間後、布巾で豚肉をはさんで軽く押して水気と塩糀を軽く拭い取った。その後、肉を袋に入れ替え、密封後、７５℃の水槽中で３０分間加熱した。加熱したロース肉を巾１．５ｃｍにカットし、柔らかさを比較した。その結果、下記の通り、実施例３で得られた塩糀で漬けた豚ロース肉は明らかに市販の塩糀で漬けたものよりも柔らかいと評価された。やわらかさの評価は、すべての試料を盲検化した後、パネラー１０名による官能評価により行い、柔らかさの基準を７段階で評価し、各パネラーの点数の平均値で比較した。なお、評価点数は７点に近いほど、柔らかいことを示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
以上、本発明の実施例について説明したが、本発明はこれらの実施例に限られるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲内においてさらに種々の形態で実施することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、糀調味料・糀飲料の製造やこれらを用いた肉、魚肉、野菜等の漬け製品の製造等に特に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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