(57)【要約】【課題】  本発明は、好中球細胞外トラップ形成促進剤および当該促進剤を含む医薬組成物を提供することを目的とする。【解決手段】  スルファサラジン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、スルファニルアミドおよび薬学的に許容可能なそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを含む、好中球細胞外トラップ形成促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルファサラジン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、スルファニルアミドおよび薬学的に許容可能なそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを含む、好中球細胞外トラップ形成促進剤。
【請求項２】
スルファサラジン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、スルファニルアミドおよび薬学的に許容可能なそれらの塩からなる群から選択される１つを含む、請求項１に記載の好中球細胞外トラップ形成促進剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の好中球細胞外トラップ形成促進剤を含む、医薬組成物。
【請求項４】
感染症治療用医薬組成物である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記感染症が、細菌、真菌、寄生虫またはウイルスによる感染症である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記感染症が、ウイルスによる感染症である、請求項４または５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
スルファサラジンまたは薬学的に許容可能なその塩を含む、感染症治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好中球細胞外トラップ形成促進剤および当該促進剤を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
好中球による新たな感染防御機構として好中球細胞外トラップ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐ（ＮＥＴ））が注目されている。ＮＥＴは、活性化好中球が、自身のクロマチンを細胞外に網状に放出し、細菌やウイルスを捕獲除去する機構である。ＮＥＴの形成は多種多様な疾患の病理に関与している。
【０００３】
ＮＥＴを形成する好中球の細胞死を、ＮＥＴｏｓｉｓと呼ぶが、ＮＥＴｏｓｉｓによって好中球が死滅すると、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を含む細胞内物質が放出され、組織傷害または再生の遅延を引き起こす可能性がある（非特許文献１参照）。例えば、糖尿病のヒトおよびマウスから得られた好中球は、ＮＥＴｏｓｉｓ感受性であるため、糖尿病マウスでは創傷治癒が遅れる（非特許文献２参照）。また、虚血性再灌流傷害を有する個体では、ＮＥＴ形成はＴＬＲシグナル伝達によって媒介され、損傷を悪化させる（非特許文献３参照）。
【０００４】
一方、ＮＥＴ形成が病理に有益な効果を有するいくつかの疾患がある。例えば、好中球は、痛風の炎症部位におけるＮＥＴ形成をもたらし、ＮＥＴの形成は、炎症性サイトカインを分解することによる炎症の解消をもたらす（非特許文献４参照）。さらに、好中球は、ウイルス核酸を認識するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８によって、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１を検出する。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の関与は、ＮＥＴ形成を誘発し、ＮＥＴ依存性ＨＩＶ−１排除をもらたらすこととなる（非特許文献５参照）。
【０００５】
このように、ＮＥＴ形成は様々な疾患に対して陽性または陰性の効果を有することができるため、ＮＥＴ形成を制御することのできる化合物はこれらの疾患の治療法に有用であることが期待されている。特に、ＮＥＴ形成の促進は、感染症に対する新たな治療法として期待されている（非特許文献６および７参照）。
【０００６】
これまで、感染症の治療には、例えば、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン（ＤＤＳ）およびスルファニルアミドが用いられていた。４，４’−ジアミノジフェニルスルホン（ＤＤＳ）は、細菌、真菌、原虫などによる感染に用いられ、特にハンセン病治療薬として用いられてきた。また、スルファニルアミドは、抗生物質として用いられてきた。このようなサルファ剤は、菌の葉酸合成を阻害することにより、抗菌作用を示すものである。
【０００７】
近年、致死性の高い感染症の世界的な流行が危惧されており、感染症に対する新たな治療法の開発が望まれている。特に、抗ウイルス薬は、感染症の撲滅に大きな役割を果たすことが期待され、ウイルスに対する新規医薬品開発への社会的ニーズが高まっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Jorch SK, Kubes P.: An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 2017 Mar 7; 23(3): 279-287.
【非特許文献２】Wong SL, Demers M, Martinod K, Gallant M, Wang Y, Goldfine AB, Kahn CR, Wagner DD.: Diabetes primes neutrophils to undergo NETosis, which impairs wound healing. Nat Med. 2015 Jul;21(7):815-9.
【非特許文献３】Huang H, Tohme S, Al-Khafaji AB, Tai S, Loughran P, Chen L, Wang S, Kim J, Billiar T, Wang Y, Tsung A.: Damage-associated molecular pattern-activated neutrophil extracellular trap exacerbates sterile inflammatory liver injury Hepatology. 2015 Aug;62(2):600-14.
【非特許文献４】Schauer C, Janko C, Munoz LE, Zhao Y, Kienhoefer D, Frey B, Lell M, Manger B, Rech J, Naschberger E, Holmdahl R, Krenn V, Harrer T, Jeremic I, Bilyy R, Schett G, Hoffmann M, Herrmann M.: Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines Nat Med. 2014 May;20(5):511-7.
【非特許文献５】Saitoh T, Komano J, Saitoh Y, Misawa T, Takahama M, Kozaki T, Uehata T, Iwasaki H, Omori H, Yamaoka S, Yamamoto N, Akira S.: Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 2012 Jul 19;12(1):109-16.
【非特許文献６】Brinkmann V, Reichard U, Goosmann C, Fauler B, Uhlemann Y, Weiss DS, Weinrauch Y, Zychlinsky A.: Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004 Mar 5;303(5663):1532-5.
【非特許文献７】Tatsuya Saitoh, Jun Komano, Yasunori Saitoh, Takuma Misawa, Michihiro Takahama, Tatsuya Kozaki, Takuya Uehata, Hidenori Iwasaki, Hiroko Omori, Shoji Yamaoka, Naoki Yamamoto, Shizuo Akira: Neutrophil Extracellular Traps Mediate a Host Defense Response to Human Immunodeficiency Virus-1. Cell Host Microbe, 2012; 19; 12 (1): 109-16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、好中球細胞外トラップ形成促進剤、および、好中球細胞外トラップ形成促進剤を含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
これまでに、多くの抗生物質や抗ウイルス薬が感染症治療薬として臨床応用されているものの、免疫細胞、特に、好中球の感染防御機構を標的とした医薬品開発はほとんど進んでいない。
本発明者らは、鋭意研究の結果、スルファサラジン（ＳＳＺ）、スルファニルアミドおよび４，４’−ジアミノジフェニルスルホン（ＤＤＳ）が、インビトロおよびインビボの双方においてＮＥＴ形成、すなわち、好中球細胞外トラップの形成を促進することを見出した。具体的には、これらの物質が、ホルボール  １２−ミリスタート  １３−アセタート(Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）)誘発性ＮＥＴｏｓｉｓを有意に促進し、また、単離されたマウスおよびヒトの好中球においてＮＥＴ形成を有意に促進した。同様に、これらの物質はインビボにおいても、ＮＥＴｏｓｉｓを誘導することによって、炎症状態下で活性化された好中球の数を減少させた。さらに、本発明者らは、ＮＥＴ形成の促進は、リン脂質の過酸化によって促進すると考えた。
スルファニルアミドおよび４，４’−ジアミノジフェニルスルホン（ＤＤＳ）は、上記のとおり、従来、感染症の治療に用いられていたが、菌および原虫の葉酸合成を阻害することによって、これらを防除するものであった。一方、スルファサラジン（ＳＳＺ）は、従来、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病など）および慢性関節リウマチの治療薬として一般的に用いられてきたものである。スルファサラジン（ＳＳＺ）、スルファニルアミドおよび４，４’−ジアミノジフェニルスルホン（ＤＤＳ）が、ＮＥＴ形成を促進することは、これまでに知られておらず、本発明者らによって初めて見出されたものである。
以上のように、本発明者らは、スルファサラジン（ＳＳＺ）、スルファニルアミドおよび４，４’−ジアミノジフェニルスルホン（ＤＤＳ）によってＮＥＴ形成を促進することによって、好中球の感染防御機構が増強されることを発見し、これら物質を、種々の感染症に対する新規の感染症治療薬として応用できる可能性を見出した。
【００１１】
本発明は、上記知見に基づくものであり、即ち：
（１）スルファサラジン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、スルファニルアミドおよび薬学的に許容可能なそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを含む、好中球細胞外トラップ形成促進剤；
（２）スルファサラジン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、スルファニルアミドおよび薬学的に許容可能なそれらの塩からなる群から選択される１つを含む、請求項１に記載の好中球細胞外トラップ形成促進剤；
（３）前記（１）または（２）に記載の好中球細胞外トラップ形成促進剤を含む、医薬組成物；
（４）感染症治療用医薬組成物である、前記（３）に記載の医薬組成物；
（５）前記感染症が、真菌、細菌、原虫およびウイルスによる感染症である、前記（４）に記載の医薬組成物；
（６）前記感染症が、ウイルスによる感染症である、前記（４）または（５）に記載の医薬組成物；
（７）スルファサラジンまたは薬学的に許容可能なその塩を含む、感染症治療用医薬組成物
に関する。                                                        
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新規な好中球細胞外トラップ形成促進剤、および当該好中球細胞外トラップ形成促進剤を含む感染症治療用医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、活性化好中球によるＮＥＴ形成の概略図を示す。活性化好中球は、自身のクロマチンを細胞外に網状に放出し、細菌やウイルスを捕獲除去する。
【図２（ａ）】図２（ａ）〜（ｊ）は、ＳＳＺが、ＮＥＴｏｓｉｓによって活性化好中球の細胞死を加速することを示す。  図２（ａ）は、種々の濃度の、ＰＭＡ単独（中央の図）、ならびに、ＳＳＺおよび１μＭ  ＰＭＡ（右図）で、マウス好中球を３．５時間刺激したときのデータを示す。細胞はシトックスグリーンで染色した。死細胞の割合は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を用いて、シトックスグリーン陽性の細胞数を計数することにより決定した。１つの試験において３つの試料の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, ＰＭＡ（−）およびＳＳＺ（−）と比較。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図２（ｂ）】図２（ｂ）は、ＳＳＺ処理された活性化好中球の形態素解析を示す。細胞を、１μＭ  ＰＭＡ、１ｍＭ  ＳＳＺ、または１μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺで３．５時間、インキュベートした。シトックスグリーンおよびＨｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２を用いて細胞を染色し、蛍光顕微鏡を用いて視覚化した（原寸、ｘ２０）。示すデータは、２つの独立した実験の代表である。
【図２（ｃ）】図２（ｃ）、（ｄ）は、ＳＳＺ処理された活性化好中球におけるヒストンＨ３のシトルリン化の増加を示す。マウス好中球を、種々の濃度のＰＭＡおよび／またはＳＳＺで４時間刺激した。細胞は、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ）について抗ｃｉｔＨ３ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）によって固定および染色した。図２（ｃ）では、ｃｉｔＨ３陽性細胞の数を、Ｉｍａｇａ−Ｊ  ソフトウェアを用いて計測することにより、ＮＥＴ形成した細胞の割合を決定した。１つの試験において、３つの試料の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, ＰＭＡ（−）およびＳＳＺ（−）と比較。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図２（ｄ）】図２（ｄ）では、蛍光顕微表でＮＥＴ形成を視覚化した。原寸、×２０。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図２（ｅ）】図２（ｅ）は、ＰＡＤ４インヒビター、ＧＳＫ４８４の、ＳＳＺ誘発性ＮＥＴ形成に対する影響を示す。マウス好中球を、２０μＭの存在下または非存在下で４時間、１μＭまたは１μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺで刺激した。ＮＥＴ形成は、図２（ｄ）に記載のとおり、視覚化した。原寸、×２０。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図２（ｆ）】図２（ｆ）は、種々の濃度の、イオノマイシン単独（左）または５μＭイオノマイシン＋ＳＳＺ（右）で、マウス好中球を４時間刺激したときのデータを示す。ＮＥＴ形成した細胞の割合は、図2（ｉ）に記載のとおり、抗ｃｉｔｈ３ポリクローナル抗体によって決定した。１つの試験において３つの試料の平均およびｓ．ｄ．が示される。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, ５μＭイオノマイシンと比較。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図２（ｇ）】図２（ｇ）は、マウス好中球を、５μＭイオノマイシン単独または５μＭイオノマイシン＋ＳＳＺで４時間刺激したときのデータを示す。ＮＥＴ形成は、図２（ｄ）に記載のとおり、抗ｃｉｔＨ３ポリクローナル抗体によって視覚化した。原寸、×２０。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図２（ｈ）】図２（ｈ）は、ヒト末梢好中球を、種々の濃度のＰＭＡまたは／およびＳＳＺで２．５時間刺激したときのデータを示す。細胞をシトックスグリーンで染色した。死細胞の割合は、Ｉｍａｇｅ−Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、シトックスグリーン陽性の細胞数を計数することにより決定した。１つの試験において３つの試料の平均およびｓ．ｄ．が示される。＊Ｐ＜ ０．０１, ＮＳ：有意差なし。ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。ＰＭＡ（−）（左）または０．８ｎＭ  ＰＭＡ（右）と比較。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図２（ｉ）】図２（ｉ）は、ＳＳＺ処理されたヒト活性化好中球の形態素解析を示す。ヒト好中球は、０．８ｎＭ  ＰＭＡまたは／および１ｍＭ  ＳＳＺで２．５時間刺激した。シトックスグリーンおよびＨｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２を用いて細胞を染色し、蛍光顕微鏡を用いて視覚化した。
【図２（ｊ）】図２（ｊ）は、ヒト好中球を、０．８ｎＭ  ＰＭＡ単独または０．８ｎＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺで２．５時間刺激したときのデータを示す。ＮＥＴ形成は、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ）について、抗ｃｉｔＨ３モノクローナル抗体（クローン１１−１１Ｂ−４Ｆ）で染色することにより視覚化した。図２（ｉ）および図２（ｊ）は、原寸、×２０。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図３（ａ）】図３（ａ）〜（ｄ）は、ＳＳＺがインビボでの好中球死を誘発することを示す。  図３（ａ）は、野生型マウスに、１６ｍｇのＳＳＺまたはＰＢＳを腹腔内注射したときのデータを示す。４時間または２４時間後、顕微鏡上で細胞を計数し、フローサイトメトリーを用いて分析することにより、ＣＤ４５．２＋Ｌｙ−６Ｃ−Ｌｙ−６Ｇ＋好中球の絶対数を決定した。３体のマウスの平均およびｓ．ｄ．を示す。異なる時点での、ＰＢＳ−およびＳＳＺ注射したマウスにおける細胞数の平均を比較した。ＮＳは、２つの群の間で有意差がないことを示す（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図３（ｂ）】図３（ｂ）−（ｄ）は、野生型マウスに、１ｍｇザイモザンおよび１６ｍｇＳＳＺまたはＰＢＳを腹腔内投与したときのデータを示す。４時間後、腹腔細胞を回収した。図３（ｄ）は、総細胞数（左）、および、ＣＤ４５．２＋Ｌｙ−６Ｃ−Ｌｙ−６Ｇ＋好中球数（右）を、図３（ａ）に記載のとおり計数した。図３（ｃ）では、腹腔細胞を７−ＡＡＤで染色し、死細胞（７−ＡＡＤ＋細胞）数の割合を、フローサイトメトリーを用いて決定した。値は、各群（ｂ、ｃ）あたりのマウス（６体（ＳＳＺ（−））および７体（ＳＳＺ＋））の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ ＜ ０．００５, ＊＊Ｐ ＜ ０．００１, Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ。図３（ｄ）では、上記のとおり、抗ｃｉｔＨ３ポリクローナル抗体によって腹腔細胞を視覚化した。原寸、×２０。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図３（ｃ）】図３（ｂ）−（ｄ）は、野生型マウスに、１ｍｇザイモザンおよび１６ｍｇＳＳＺまたはＰＢＳを腹腔内投与したときのデータを示す。４時間後、腹腔細胞を回収した。図３（ｄ）は、総細胞数（左）、および、ＣＤ４５．２＋Ｌｙ−６Ｃ−Ｌｙ−６Ｇ＋好中球数（右）を、図３（ａ）に記載のとおり計数した。図３（ｃ）では、腹腔細胞を７−ＡＡＤで染色し、死細胞（７−ＡＡＤ＋細胞）数の割合を、フローサイトメトリーを用いて決定した。値は、各群（ｂ、ｃ）あたりのマウス（６体（ＳＳＺ（−））および７体（ＳＳＺ＋））の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ ＜ ０．００５, ＊＊Ｐ ＜ ０．００１, Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ。図３（ｄ）では、上記のとおり、抗ｃｉｔＨ３ポリクローナル抗体によって腹腔細胞を視覚化した。原寸、×２０。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図３（ｄ）】図３（ｂ）−（ｄ）は、野生型マウスに、１ｍｇザイモザンおよび１６ｍｇＳＳＺまたはＰＢＳを腹腔内投与したときのデータを示す。４時間後、腹腔細胞を回収した。図３（ｄ）は、総細胞数（左）、および、ＣＤ４５．２＋Ｌｙ−６Ｃ−Ｌｙ−６Ｇ＋好中球数（右）を、図３（ａ）に記載のとおり計数した。図３（ｃ）では、腹腔細胞を７−ＡＡＤで染色し、死細胞（７−ＡＡＤ＋細胞）数の割合を、フローサイトメトリーを用いて決定した。値は、各群（ｂ、ｃ）あたりのマウス（６体（ＳＳＺ（−））および７体（ＳＳＺ＋））の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ ＜ ０．００５, ＊＊Ｐ ＜ ０．００１, Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ。図３（ｄ）では、上記のとおり、抗ｃｉｔＨ３ポリクローナル抗体によって腹腔細胞を視覚化した。原寸、×２０。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図４（ａ）】図４（ａ）〜（ｆ）は、ＳＳＺが活性化好中球におけるＲＯＳ産生を増進しないことを示す。図４（ａ）および（ｂ）は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼインヒビターであるＤＰＩがＮＥＴ形成に与える影響を示す。マウス好中球を、１ｍＭ  ＳＳＺおよび４０μＭ  ＤＰＩの存在下または非存在下でＰＭＡによって、３．５時間（図４（ａ））または４時間（図４（ｂ））、刺激した。  図４（ａ）では、シトックスグリーンを用いたＮＥＴ形成した細胞の割合を決定した。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０５, ＊＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図４（ｂ）】図４（ｂ）では、ＮＥＴ形成は、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ）について、抗ｃｉｔＨ３ポリクローナル抗体で染色することにより視覚化した。原寸、×２０。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図４（ｃ）】図４（ｃ）〜（ｆ）は、ＲＯＳ産生に対するＳＳＺの影響を示す。マウス好中球を、ＲＯＳインジケータであるＤＣＦＨ−ＤＡで５分間、プレインキュベートし、次いで、種々の濃度のＰＭＡおよび／またはＳＳＺ（（ｃ）および（ｄ））、または、イオノマイシンおよび／またはＳＳＡ（（ｅ）および（ｆ））で１５分間刺激した。図４（ｃ）および（ｅ）では、フローサイトメトリーによってＰＯＳ産生を分析した。図４（ｄ）および（ｆ）では、ＲＯＳ発生を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて定量化した。１つの試験において、３つの試料の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, １μＭ  ＰＭＡ（ｄ）および５μＭ  イオノマイシン（ｆ）と比較。データは３つの独立した実験の代表を示す。
【図４（ｄ）】図４（ｃ）〜（ｆ）は、ＲＯＳ産生に対するＳＳＺの影響を示す。マウス好中球を、ＲＯＳインジケータであるＤＣＦＨ−ＤＡで５分間、プレインキュベートし、次いで、種々の濃度のＰＭＡおよび／またはＳＳＺ（（ｃ）および（ｄ））、または、イオノマイシンおよび／またはＳＳＡ（（ｅ）および（ｆ））で１５分間刺激した。図４（ｃ）および（ｅ）では、フローサイトメトリーによってＰＯＳ産生を分析した。図４（ｄ）および（ｆ）では、ＲＯＳ発生を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて定量化した。１つの試験において、３つの試料の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, １μＭ  ＰＭＡ（ｄ）および５μＭ  イオノマイシン（ｆ）と比較。データは３つの独立した実験の代表を示す。
【図４（ｅ）】図４（ｃ）〜（ｆ）は、ＲＯＳ産生に対するＳＳＺの影響を示す。マウス好中球を、ＲＯＳインジケータであるＤＣＦＨ−ＤＡで５分間、プレインキュベートし、次いで、種々の濃度のＰＭＡおよび／またはＳＳＺ（（ｃ）および（ｄ））、または、イオノマイシンおよび／またはＳＳＡ（（ｅ）および（ｆ））で１５分間刺激した。図４（ｃ）および（ｅ）では、フローサイトメトリーによってＰＯＳ産生を分析した。図４（ｄ）および（ｆ）では、ＲＯＳ発生を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて定量化した。１つの試験において、３つの試料の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, １μＭ  ＰＭＡ（ｄ）および５μＭ  イオノマイシン（ｆ）と比較。データは３つの独立した実験の代表を示す。
【図４（ｆ）】図４（ｃ）〜（ｆ）は、ＲＯＳ産生に対するＳＳＺの影響を示す。マウス好中球を、ＲＯＳインジケータであるＤＣＦＨ−ＤＡで５分間、プレインキュベートし、次いで、種々の濃度のＰＭＡおよび／またはＳＳＺ（（ｃ）および（ｄ））、または、イオノマイシンおよび／またはＳＳＡ（（ｅ）および（ｆ））で１５分間刺激した。図４（ｃ）および（ｅ）では、フローサイトメトリーによってＰＯＳ産生を分析した。図４（ｄ）および（ｆ）では、ＲＯＳ発生を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて定量化した。１つの試験において、３つの試料の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, １μＭ  ＰＭＡ（ｄ）および５μＭ  イオノマイシン（ｆ）と比較。データは３つの独立した実験の代表を示す。
【図５（ａ）】図５（ａ）〜（ｍ）は、脂質の過酸化が、ＳＳＺ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓに不可欠であることを示す。  図５（ａ）〜（ｄ）は、マウス好中球を、種々の濃度のＰＭＡ（（ａ）および（ｂ））またはイオノマイシン（（ｃ）および（ｄ））で、１ｍＭ  ＳＳＺの存在下または非存在下、刺激し、次いでＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙ５８１／５９１を添加したときのデータを示す。図５（ａ）および（ｃ）では、フローサイトメトリーを用いて脂質酸化の蓄積を分析した。図５（ｂ）および（ｄ）では、Ｃ１１−Ｂｏｄｉｐｙ分析の平均蛍光強度（ＭＦＩ）および、３つの試料のＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙ分析の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, １μＭ ＰＭＡ（ｂ）または５μＭイオノマイシン（ｄ）と比較。データは３つの独立した実験の代表である。
【図５（ｂ）】図５（ａ）〜（ｄ）は、マウス好中球を、種々の濃度のＰＭＡ（（ａ）および（ｂ））またはイオノマイシン（（ｃ）および（ｄ））で、１ｍＭ  ＳＳＺの存在下または非存在下、刺激し、次いでＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙ５８１／５９１を添加したときのデータを示す。図５（ａ）および（ｃ）では、フローサイトメトリーを用いて脂質酸化の蓄積を分析した。図５（ｂ）および（ｄ）では、Ｃ１１−Ｂｏｄｉｐｙ分析の平均蛍光強度（ＭＦＩ）および、３つの試料のＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙ分析の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, １μＭ ＰＭＡ（ｂ）または５μＭイオノマイシン（ｄ）と比較。データは３つの独立した実験の代表である。
【図５（ｃ）】図５（ａ）〜（ｄ）は、マウス好中球を、種々の濃度のＰＭＡ（（ａ）および（ｂ））またはイオノマイシン（（ｃ）および（ｄ））で、１ｍＭ  ＳＳＺの存在下または非存在下、刺激し、次いでＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙ５８１／５９１を添加したときのデータを示す。図５（ａ）および（ｃ）では、フローサイトメトリーを用いて脂質酸化の蓄積を分析した。図５（ｂ）および（ｄ）では、Ｃ１１−Ｂｏｄｉｐｙ分析の平均蛍光強度（ＭＦＩ）および、３つの試料のＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙ分析の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, １μＭ ＰＭＡ（ｂ）または５μＭイオノマイシン（ｄ）と比較。データは３つの独立した実験の代表である。
【図５（ｄ）】図５（ａ）〜（ｄ）は、マウス好中球を、種々の濃度のＰＭＡ（（ａ）および（ｂ））またはイオノマイシン（（ｃ）および（ｄ））で、１ｍＭ  ＳＳＺの存在下または非存在下、刺激し、次いでＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙ５８１／５９１を添加したときのデータを示す。図５（ａ）および（ｃ）では、フローサイトメトリーを用いて脂質酸化の蓄積を分析した。図５（ｂ）および（ｄ）では、Ｃ１１−Ｂｏｄｉｐｙ分析の平均蛍光強度（ＭＦＩ）および、３つの試料のＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙ分析の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, １μＭ ＰＭＡ（ｂ）または５μＭイオノマイシン（ｄ）と比較。データは３つの独立した実験の代表である。
【図５（ｅ）】図５（ｅ）および（ｆ）は、マウス好中球が、抗酸化剤（４００μＭトロロックスまたは２００μＭ  ２−ＭＥ）の存在下または非存在下で、１μＭ  ＰＭＡ単独、１μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺで１時間刺激されたときのデータを示す。脂質酸化の蓄積は上述したとおりに測定した。図５（ｆ）は、３つの試料のｓ．ｄ．と共に平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ＮＳ：有意差なし。ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。データは３つの独立した実験の代表を示す。
【図５（ｆ）】図５（ｅ）および（ｆ）は、マウス好中球が、抗酸化剤（４００μＭトロロックスまたは２００μＭ  ２−ＭＥ）の存在下または非存在下で、１μＭ  ＰＭＡ単独、１μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺで１時間刺激されたときのデータを示す。脂質酸化の蓄積は上述したとおりに測定した。図５（ｆ）は、３つの試料のｓ．ｄ．と共に平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ＮＳ：有意差なし。ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。データは３つの独立した実験の代表を示す。
【図５（ｇ）】図５（ｇ）および（ｈ）は、抗酸化剤のＳＳＺ誘発性ＮＥＴ形成に対する影響を示す。マウス好中球を、種々の濃度のトロロックスおよび２−ＭＥの存在下または非存在下、１μＭ  ＰＭＡ単独、１μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺで刺激した。図５（ｇ）では、細胞をシトックスグリーンで染色した。死細胞の割合は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を用いてシトックスグリーン陽性の細胞数を計数することにより決定した。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, １μＭ ＰＭＡ ＋ １ｍＭ ＳＳＺと比較。データは３つの独立した実験の代表を示す。図５（ｈ）では、ＤＡＰＩおよび抗体ｃｉｔＨ３抗体で染色することによりＮＥＴ形成を視覚化した。原寸、×２０。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図５（ｈ）】図５（ｇ）および（ｈ）は、抗酸化剤のＳＳＺ誘発性ＮＥＴ形成に対する影響を示す。マウス好中球を、種々の濃度のトロロックスおよび２−ＭＥの存在下または非存在下、１μＭ  ＰＭＡ単独、１μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺで刺激した。図５（ｇ）では、細胞をシトックスグリーンで染色した。死細胞の割合は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００を用いてシトックスグリーン陽性の細胞数を計数することにより決定した。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, １μＭ ＰＭＡ ＋ １ｍＭ ＳＳＺと比較。データは３つの独立した実験の代表を示す。図５（ｈ）では、ＤＡＰＩおよび抗体ｃｉｔＨ３抗体で染色することによりＮＥＴ形成を視覚化した。原寸、×２０。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図５（ｉ）】図５（ｉ）および（ｊ）は、トロロックスが、足蹠において、ヒストンＨ３のＳＳＺ誘発性シトルリン化を阻害することを示す。ＳＳＺ単独またはＳＳＺ＋トロロックスを野生型マウスの足蹠に注射した。図５（ｉ）では、４８時間後、足蹠を切除し、Ｌｙ−６Ｇ  Ａｂ、ＤＡＰＩおよび抗ｃｉｔＨ３ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）で染色した。原寸、×２０。
【図５（ｊ）】図５（ｊ）では、足蹠の膨潤を、指定の時間、測定した。３体のマウスの平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．００１, ＮＳ：有意差なし。ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, ＳＳＺを注射したマウスと比較。
【図５（ｋ）】図５（ｋ）〜（ｍ）では、４００μＭトロロックスと共に、または、トロロックスなしで、０．８μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺによって、２時間、ヒト好中球を刺激した。図５（ｋ）では、細胞を、シトックスグリーンおよびＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２で染色した。視細胞の割合は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、シトックスグリーン陽性細胞の数を計数することによって決定した。１つの試験において３つの試料の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０５, Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ。図５（ｌ）では、ＮＥＴ形成を、シトックスグリーンおよびｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２により染色することにより視覚化した。図５（ｍ）では、ＮＥＴ形成を、ＤＡＰＩおよび抗ｃｉｔＨ３抗体（ｃｌｏｎｅ １１−１１Ｂ−４Ｆ）で染色することにより視覚化した。図５（ｌ）および（ｍ）では、原寸、×２０であり、データは、３つの独立した実験の代表である。
【図５（ｌ）】図５（ｋ）〜（ｍ）では、４００μＭトロロックスと共に、または、トロロックスなしで、０．８μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺによって、２時間、ヒト好中球を刺激した。図５（ｋ）では、細胞を、シトックスグリーンおよびＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２で染色した。視細胞の割合は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、シトックスグリーン陽性細胞の数を計数することによって決定した。１つの試験において３つの試料の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０５, Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ。図５（ｌ）では、ＮＥＴ形成を、シトックスグリーンおよびｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２により染色することにより視覚化した。図５（ｍ）では、ＮＥＴ形成を、ＤＡＰＩおよび抗ｃｉｔＨ３抗体（ｃｌｏｎｅ １１−１１Ｂ−４Ｆ）で染色することにより視覚化した。図５（ｌ）および（ｍ）では、原寸、×２０であり、データは、３つの独立した実験の代表である。
【図５（ｍ）】図５（ｋ）〜（ｍ）では、４００μＭトロロックスと共に、または、トロロックスなしで、０．８μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺによって、２時間、ヒト好中球を刺激した。図５（ｋ）では、細胞を、シトックスグリーンおよびＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２で染色した。視細胞の割合は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、シトックスグリーン陽性細胞の数を計数することによって決定した。１つの試験において３つの試料の平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０５, Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ。図５（ｌ）では、ＮＥＴ形成を、シトックスグリーンおよびｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２により染色することにより視覚化した。図５（ｍ）では、ＮＥＴ形成を、ＤＡＰＩおよび抗ｃｉｔＨ３抗体（ｃｌｏｎｅ １１−１１Ｂ−４Ｆ）で染色することにより視覚化した。図５（ｌ）および（ｍ）では、原寸、×２０であり、データは、３つの独立した実験の代表である。
【図６（ａ）】図６（ａ）〜（ｈ）は、ＳＳＺが、フェロトーシスのメカニズムとは異なるメカニズムでＮＥＴｏｓｉｓを促進することを示す。  図６（ａ）は、ＰＭＡ刺激マウス骨髄好中球におけるｘＣＴ  ｍＲＮＡ発現を示す。細胞を、１μＭ  ＰＭＡで、１時間、２時間または３時間刺激した。これらの細胞から総ＲＮＡを調製し、ｘＣＴ  ｍＲＮＡの発現レベルを、ｑＰＣＲを用いて決定した。発現レベルを相対量として算出し、１８ｓリボゾームＲＮＡのレベルで標準化した。結果は、ナイーブ好中球において観察された発現と比較して、ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎとして示される。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０１, ＮＳ：有意差なし。ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図６（ｂ）】図６（ｂ）は、マウス腹腔好中球におけるインビボでのｘＣＴ  ｍＲＮＡ発現を示す。１ｍｇザイモザンを野生型マウスに腹腔内投与した。４時間後、腹腔細胞を回収した。総ＲＮＡを調製し、ｘＣＴ  ｍＲＮＡ発現レベルを、ｑＰＣＴを用いて上記のとおり決定した。３体のマウスの平均およびｓ．ｄ．を示す。＊Ｐ＜ ０．０５, Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ。
【図６（ｃ）】図６（ｃ）および（ｄ）は、エラスチンは、ＮＥＴ形成を誘発しないことを示す。マウス好中球は、種々の濃度のエラスチンの存在下または非存在下、１μＭ  ＰＭＡによって刺激された。ＮＥＴ形成した細胞の割合を、ｃｉｔＨ３陽性の数を計数することにより測定し（（ｃ））、ＤＡＰＩおよびｃｉｔＨ３で染色することにより視覚化した（（ｄ））。１つの試験において３つの試料と平均値およびｓ．ｄ．が示される（ｃ）。原寸、×２０（ｄ）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図６（ｄ）】図６（ｃ）および（ｄ）は、エラスチンは、ＮＥＴ形成を誘発しないことを示す。マウス好中球は、種々の濃度のエラスチンの存在下または非存在下、１μＭ  ＰＭＡによって刺激された。ＮＥＴ形成した細胞の割合を、ｃｉｔＨ３陽性の数を計数することにより測定し（（ｃ））、ＤＡＰＩおよびｃｉｔＨ３で染色することにより視覚化した（（ｄ））。１つの試験において３つの試料と平均値およびｓ．ｄ．が示される（ｃ）。原寸、×２０（ｄ）。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図６（ｅ）】図６（ｅ）および（ｆ）では、ＮＥＴ形成が、ｘＣＴ変異好中球において観察された。ｘＣＴｍｕ／ｗｔまたはｘＣＴｍｕ／ｍｕマウスから得られた骨髄好中球を、ＳＳＺ存在下または非存在下で、ＰＭＡによって刺激した。ＮＥＴ形成した細胞の頻度を、シトックスグリーン陽性の数を計数することにより（（ｅ））またはｃｉｔＨ３陽性細胞の数を計数することにより（（ｆ））、決定した。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．が示される。＊Ｐ＜ ０．０１, ＮＳ：有意差なし。ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。データは、２つ（（ｅ））または３つ（（ｆ））の独立した実験の代表である。
【図６（ｆ）】図６（ｅ）および（ｆ）では、ＮＥＴ形成が、ｘＣＴ変異好中球において観察された。ｘＣＴｍｕ／ｗｔまたはｘＣＴｍｕ／ｍｕマウスから得られた骨髄好中球を、ＳＳＺ存在下または非存在下で、ＰＭＡによって刺激した。ＮＥＴ形成した細胞の頻度を、シトックスグリーン陽性の数を計数することにより（（ｅ））またはｃｉｔＨ３陽性細胞の数を計数することにより（（ｆ））、決定した。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．が示される。＊Ｐ＜ ０．０１, ＮＳ：有意差なし。ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。データは、２つ（（ｅ））または３つ（（ｆ））の独立した実験の代表である。
【図６（ｇ）】図６（ｇ）では、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、フェロトーシスインヒビター（デフェロキサミンおよびフェロスタチン−１）、ネクロトーシスインヒビター（ネクロスタチン−１）またはアポトーシスインヒビター（ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）の存在下または非存在下、エラスチン、ＳＳＺまたはｔＢＨＰで処理した。製造元のプロトコールに従って、ＷＳＴ−８アッセイを用いて細胞生存性を評価した。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．が示される。＊Ｐ＜ ０．０１, ＮＳ：有意差なし。ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。インヒビター（−）との比較。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図６（ｈ）】図６（ｈ）では、フェロトーシスインヒビター、ネクロトーシスインヒビターまたはアポトーシスインヒビターの存在下または非存在下、ＰＭＡおよびＳＳＺでマウス好中球を処理した。ＮＥＴ形成を（ｅ）に示すとおり、評価した。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．が示される。ＮＳ：有意差なし、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、インヒビター（−）との比較。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図７（ａ）】図７（ａ）〜（ｈ）は、ＮＥＴ誘発性化合物環での構造−活性相関を示す。  図７（ａ）は、ＳＳＺ、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）およびスルファピリジンの構造を示す。
【図７（ｂ）】図７（ｂ）および（ｃ）は、５−ＡＳＡではなくスルファピリジンが、ＮＥＴｏｓｉｓを誘発することを示す。マウス骨髄好中球を、１μＭ  ＰＭＡの存在下、３．５時間（（ｂ））または４時間（（ｃ））、種々の濃度のスルファピリジンまたは５−ＡＳＡによって、刺激した。ＮＥＴ形成した細胞の割合を、シトックスグリーン陽性細胞の数を計数することによって決定し（（ｂ））、ＮＥＴ形成を、ＤＡＰＩおよび抗ｃｉｔＨ３  Ａｂの染色によって視覚化した（（ｃ））。図７（ｂ）では、１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．が示される。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, ＰＭＡとの比較。図７（ｃ）では、原寸、×２０であり、データは、２つの独立した実験の代表である。
【図７（ｃ）】図７（ｂ）および（ｃ）は、５−ＡＳＡではなくスルファピリジンが、ＮＥＴｏｓｉｓを誘発することを示す。マウス骨髄好中球を、１μＭ  ＰＭＡの存在下、３．５時間（（ｂ））または４時間（（ｃ））、種々の濃度のスルファピリジンまたは５−ＡＳＡによって、刺激した。ＮＥＴ形成した細胞の割合を、シトックスグリーン陽性細胞の数を計数することによって決定し（（ｂ））、ＮＥＴ形成を、ＤＡＰＩおよび抗ｃｉｔＨ３  Ａｂの染色によって視覚化した（（ｃ））。図７（ｂ）では、１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．が示される。＊Ｐ＜ ０．０１, ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ, ＰＭＡとの比較。図７（ｃ）では、原寸、×２０であり、データは、２つの独立した実験の代表である。
【図７（ｄ）】図７（ｄ）〜（ｆ）では、５−ＡＳＡが、ＳＳＺ誘発性ＮＥＴｏｓｉｓを阻害したことを示す。マウス好中球を、種々の５−ＡＳＡの存在下または非存在下、１μＭ  ＰＭＡ単独、１μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺによって刺激した。ＮＥＴ形成を、シトックスグリーンを用いて（（ｄ））、または、抗ｃｉｔＨ３  Ａｂを用いて（（ｅ），（ｆ）））評価した。図７（ｄ）および（ｅ）では、１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．が示される。＊Ｐ＜ ０．０１, ＮＳ：有意差なし。ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。ＰＭＡ＋ＳＳＺの比較。図７（ｆ）では、原寸、×２０であり、データは、２つの独立した実験の代表である。
【図７（ｅ）】図７（ｄ）〜（ｆ）では、５−ＡＳＡが、ＳＳＺ誘発性ＮＥＴｏｓｉｓを阻害したことを示す。マウス好中球を、種々の５−ＡＳＡの存在下または非存在下、１μＭ  ＰＭＡ単独、１μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺによって刺激した。ＮＥＴ形成を、シトックスグリーンを用いて（（ｄ））、または、抗ｃｉｔＨ３  Ａｂを用いて（（ｅ），（ｆ）））評価した。図７（ｄ）および（ｅ）では、１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．が示される。＊Ｐ＜ ０．０１, ＮＳ：有意差なし。ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。ＰＭＡ＋ＳＳＺの比較。図７（ｆ）では、原寸、×２０であり、データは、２つの独立した実験の代表である。
【図７（ｆ）】図７（ｄ）〜（ｆ）では、５−ＡＳＡが、ＳＳＺ誘発性ＮＥＴｏｓｉｓを阻害したことを示す。マウス好中球を、種々の５−ＡＳＡの存在下または非存在下、１μＭ  ＰＭＡ単独、１μＭ  ＰＭＡ＋１ｍＭ  ＳＳＺによって刺激した。ＮＥＴ形成を、シトックスグリーンを用いて（（ｄ））、または、抗ｃｉｔＨ３  Ａｂを用いて（（ｅ），（ｆ）））評価した。図７（ｄ）および（ｅ）では、１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．が示される。＊Ｐ＜ ０．０１, ＮＳ：有意差なし。ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。ＰＭＡ＋ＳＳＺの比較。図７（ｆ）では、原寸、×２０であり、データは、２つの独立した実験の代表である。
【図７（ｇ）】図７（ｇ）では、マウス好中球を、種々の濃度のスルファニルアミドおよびＤＤＳの存在下、３．５時間刺激した。ＮＥＴ形成した細胞の割合は、シトックスグリーンを用いて測定した。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．が示される。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図７（ｈ）】図７（ｈ）では、マウス好中球を、１ｍＭ  スルファニルアミド、１００μＭ  ＤＤＳの存在下、１μＭ  ＰＭＡによって１時間刺激した後、Ｃ１１−Ｂｏｄｉｐｙ５８１／５９１を添加し、脂質酸化の蓄積を分析した。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図８（ａ）】図８（ａ）および（ｂ）では、マウス好中球を、種々の濃度のＳＳＺの存在下または非存在下、４時間インキュベートした。  図８（ａ）では、ＳＳＺ処理した好中球の細胞死のフローサイトメトリー分析を示す。死細胞は、７−ＡＡＤおよびアネキシンＶによる二重ラベリングを用いて、フローサイトメトリーによって検出した。プロットの数は、７−ＡＡＤおよびアネキシンＶ陽性細胞の頻度を示す。
【図８（ｂ）】図８（ｂ）では、死細胞の割合を、ＳＳＺ処理の４時間後に、７−ＡＡＤおよび／またはアネキシンＶ陽性細胞の割合の合計を用いて定量化した。１つの実験において、３つのウェルの平均値およびｓ．ｄ．を示す。データは、２つの独立した実験の代表である。
【図８（ｃ）】図８（ｃ）は、マウス好中球が種々の濃度のＳＳＺ単独で４時間処理されたときのデータを示す。細胞は、シトックスグリーンで染色された。死細胞の割合は、シトックスグリーン陽性細胞の数を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ２０００を用いて計数することによって決定した。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．を示す。
【図９】図９は、ＳＳＺおよびエラスチンが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞における細胞死を誘発することを示す。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、種々の濃度のＳＳＺまたはエラスチンで処理された。細胞生存性を、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８を用い、製造元のプロトコールに従って評価した。１つの試験において３つの試料の平均値およびｓ．ｄ．を示す。データは、３つの独立した実験の代表である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明は、好中球細胞外トラップ形成促進剤（以下、「ＮＥＴ形成促進剤」とも称する。）および感染症治療用医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明の第一の態様は、ＮＥＴ形成促進剤であり、当該ＮＥＴ形成促進剤は、スルファサラジン（以下、「ＳＳＺ」とも称する。）、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン（以下、「ＤＤＳ」とも称する。）、スルファニルアミドおよび薬学的に許容可能なそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを含むものである。本発明のＮＥＴ形成促進剤は、好ましくは、スルファサラジン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、スルファニルアミドおよび薬学的に許容可能なそれらの塩からなる群から選択される１つを含む。すなわち、本発明のＮＥＴ形成促進剤は、これらの化合物のうちの１つを単独で含んでもよく、また、これらの化合物のうちの複数を組み合わせて含んでもよい。
【化１】
2019019109.tif 000002
【００１６】
これらの化合物は、当該分野で既知の合成方法に従って合成したものであっても、市販のものであってもよい。
【００１７】
本発明者らは、スルファサラジン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホンおよびスルファニルアミドが、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を促進することを見出した。具体的には、本発明者らは、活性化された好中球に、これら化合物を添加することにより、添加しない活性化好中球（対象の活性化好中球）と比較して、細胞外クロマチントラップ形成を促進することを見出した。
【００１８】
上記化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で、ＮＥＴ形成促進剤に含まれていてもよい。このような薬学的に許容可能な塩は、上記化合物と無毒な塩を形成する塩基とにより形成されるものである。具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００１９】
ここで、「ＮＥＴ形成促進剤」の語は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を促進する物質を意味し、具体的には、活性化された好中球に、それを添加することにより、添加しない活性化好中球（対象の活性化好中球）と比較して、細胞外クロマチントラップを増進する物質を意味する。例えば、対象の活性化好中球に対して、ＮＥＴ形成を２００％増進する物質を意味する。好ましくは、対象の活性化好中球に対して、ＮＥＴ形成を３００％、より好ましくは、４００％、さらに好ましくは、５００％増進する物質を意味する。
【００２０】
ＮＥＴ形成の検出は当該分野で既知の方法によって行われる。ＮＥＴ形成は、例えば、下記実施例に記載の方法で検出することができる。具体的には、ＮＥＴ形成を起こした好中球を室温で１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％正常ヤギ血清、ウシ血清アルブミンおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０を補充したＨＢＳＳ中でブロッキングのために１時間インキュベートし、次いで、細胞をウサギ抗ヒストンＨ３（シトルリンＲ２＋Ｒ８＋Ｒ１７）（ｃｉｔＨ３）抗体（Ａｂｃａｍ）でインキュベートした後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合した抗ウサギＩｇＧ抗体でインキュベートする。そして、ＤＮＡを、ＤＡＰＩ（同仁堂）を用いて標識し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７１０）下で細胞を観察し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いてｃｉｔＨ３陽性細胞の数を測定することにより、ＮＥＴｏｓｉｓを起こす細胞の頻度を定量することができる。
その他、例えば、特表２０１０−５０５０９９に記載の方法や、Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them. J. Vis. Exp. (36), e1724, doi:10.3791/1724 (2010)に記載の方法に従って、検出することもできる。
【００２１】
本発明の第二の側面は、上記ＮＥＴ形成促進剤を含む医薬組成物に関する。
【００２２】
また、本発明の第三の側面は、好中球細胞外トラップの形成を促進するための医薬組成物であって、スルファサラジン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、スルファニルアミドおよび薬学的に許容可能なそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを含む、前記医薬組成物に関する。
【００２３】
上記の本発明の第二の側面及び第三の側面の医薬組成物は、好ましくは、感染症治療用の医薬組成物である。
【００２４】
また、本発明の第四の側面は、スルファサラジンまたは薬学的に許容可能なその塩を含む感染症治療用の医薬組成物に関する。
【００２５】
以下において、本発明の第二の側面、第三の側面及び第四の側面の医薬組成物をまとめて「本発明の医薬組成物」と総称する。
【００２６】
ここで、「感染症」には、細菌、真菌、寄生虫（原虫および蠕虫）、ウイルス等の病原体が宿主の体内に侵入することで引き起こされる疾患をいう。ここで、宿主としては、ヒトを含む哺乳動物の他、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などが挙げられる。哺乳類には、例えば、ラット、マウス、ハムスター、サルおよびヒトが含まれる。
【００２７】
また、感染症に関して使用される「治療」の語には、感染症を治療することに加え、感染症を抑制または軽減することを含むものとする。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、薬学上許容される添加剤、例えば、希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、補助剤、界面活性剤、崩壊剤、潤沢剤等を更に含んでもよい。本発明の医薬組成物は、上記化合物または薬学的に許容可能なそれらの塩と、先述の添加剤とを混合することによって調製することができる。
【００２９】
上記医薬組成物の投与経路は、治療に最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与または非経口投与であってよい。非経口投与としては、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、腹腔内投与等が挙げられる。
上記医薬組成物の投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、散剤、顆粒剤等、当該分野で公知の投与形態が挙げられる。
【００３０】
本発明によれば、感染症によって活性化好中球においてＮＥＴ形成を促進し、宿主における感染防御機構を増強することができる。このことから、本発明のＮＴＥ形成促進剤および当該促進剤を含む医薬組成物は、感染症に対する新たな治療法を提供することが期待される。
【００３１】
以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
動物及びヒトドナー由来の末梢血
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＣＬＥＡ  ＪＡＰＡＮより購入した。ｘＣＴｍｕ／ｍｕマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）は本発明者らの研究室で以前、作製したものである（参考文献１）。マウスを用いた実験は全て、東京薬科大学および動物実験委員会（Ｌ１６−１４）により承認されており、適用可能なガイドラインおよび規則に則って行われた。健康なヒトドナー由来の末梢血の使用については、ヒト倫理委員会（１５−２１）によって承認されている。
【００３３】
試薬
用いた試薬は、以下の製造元から購入した。
Deferoxamine, ferrostatin-1, erastin, sulfasalazine (SSZ), zymosan, diphenyleneiodonium chloride (DPI), 4,4'-diaminodiphenyl sulfone (DDS) : Sigma. 
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), sulfapyridine, 5-aminosalicylic acid (5-ASA), sulfanilamide：和光純薬工業株式会社、
Necrostatin-1： FOCUS Biomolecules、
2-mercaptoethanol：MP Biomedicals、
z-VAD-fmk：Peptide institute、
Trolox：東京化成工業株式会社、
GSK484：Cayman chemicals、
イオノマイシン：Merck Millipore。
【００３４】
モノクローナル抗体の作製
抗ヒストンＨ３（シトルリンＲ２＋Ｒ８＋Ｒ１７）抗体を作製するために、ウィスターラットの足蹠に、アジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ; ＴｉｔｅｒＭａｘ）中で乳化したヒトヒストンＨ３（シトルリンＲ２＋Ｒ８＋Ｒ１７）（２−２０:Ａ（ｃｉｔ）ＲＴＫＱＴＡ（ｃｉｔ）ＲＫＳＴＧＧＫＡＰ（ｃｉｔ）ＲＫＱ）由来のペプチドを皮下接種した。脾細胞を、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＮＳＯｂｃｌ２骨髄腫細胞（参考文献２）と融合した。ハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）および５％ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ）を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で選択した。ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡで試験し、ヒトヒストンＨ３（シトルリンＲ２＋Ｒ８＋Ｒ１７）ペプチドを特異的に検出するが、ヒト非シトルリン化ヒストンＨ３ペプチドは検出しないモノクローナル抗体を得た（１１−１１Ｂ−４Ｆ）。ＩｇＧ画分をプロテインＧアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し、ＰＢＳへの緩衝液交換を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。抗体は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造元の推奨に従ってビオチン化した。なお、上記ハイブリドーマ株は独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に１１−１１Ｂ−４Ｆの名称で２０１７年７月２０日付けで寄託され、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２５１５が付与されている。
【００３５】
マウスおよびヒトの好中球の単離
マウス好中球を得るため、骨髄細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＷＴ、変異マウスの大腿骨および脛骨から単離した。骨髄細胞をＦｃブロッカー（２．４Ｇ２; Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でインキュベートし、ビオチン化抗Ｌｙ−６Ｇ（ＲＢ６−８Ｃ５; Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体で染色した。次にそれらを抗ビオチン−マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でインキュベートした。Ｌｙ−６Ｇｈｉｇｈ細胞を、磁気ソーティングを用いて濃縮した。単離された好中球の純度は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｖｅｒｓｅ; ＢＤ）を用いて評価した場合に９５％以上であった。
ヒト好中球を得るために、ヘパリンを用いて健康な成人ボランティアから末梢血を採取した。赤血球を、ＨｅｔａＳｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）沈降法を用いて製造元のプロトコールに従って除去した。次いで、細胞をＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄し、さらに７５％、６５％、および５５％の密度を有する層からなる不連続なＰｅｒｃｏｌｌ ＰＬＵＳ（ＧＥ−へルスケア）勾配上で分画した。混合物を１２０ｘｇで１０分間遠心分離した後、６５％の層と７５％の層との界面を集め、ＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄した。すべての手順は室温で行った。この調製物は、フローサイトメトリー分析により９５％を超えるＣＤ１５＋ ＣＤ１６+シグレック−８−好中球を含有していた。トリパンブルー排除アッセイによれば、細胞生存率は＞９８％であった。
【００３６】
細胞および細胞培養
ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＷＡＫＯ）中、３７度、５％ＣＯ２、９５％湿度で維持した。
【００３７】
インビトロ細胞死アッセイ
単離された好中球におけるＳＳＺ誘発性アポトーシスおよびネクローシスを検出するために、１．４×１０4個のマウス好中球をＳＳＺによりインキュベートした。４時間又は１２時間後、細胞をＦＩＴＣ−アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。次いで、ＢＤ ＦＡＣＳｖｅｒｓｅを用いてフローサイトメトリー分析を行った。
単離されたマウスまたはヒト好中球のＮＥＴｏｓｉｓを評価するために、４×１０5個の好中球を３５ｍｍのポリ−Ｌ−リシン被覆ガラス底皿（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）に播種し、ＰＭＡおよび／またはＳＳＺで、２または３時間刺激した。次いで、ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ（０．５μＭ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および／またはＨｏｅｃｈｅｓｔ ３３３４２（１μｇ／ ｍｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を細胞に添加した。３０分後、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＩｍａｇｅ−Ｊ  ソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して、シトックスグリーン陽性細胞の数を計数することにより、ＮＥＴｏｓｉｓの頻度を測定し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７１０、Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて形態素解析を行った。
マウス好中球におけるヒストンＨ３のシトルリン化を検出するために、４×１０５細胞を３５ｍｍポリ−Ｌ−リシン被覆ガラス底皿（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）に播種し、ＰＭＡ、イオノマイシンおよび／またはＳＳＺで４時間刺激した。次いで、細胞を室温で１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％正常ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ）、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）および０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０を補充したＨＢＳＳ中でブロッキングのために１時間インキュベートした。次いで、細胞をウサギ抗ヒストンＨ３（シトルリンＲ２＋Ｒ８＋Ｒ１７）（ｃｉｔＨ３）抗体（Ａｂｃａｍ）でインキュベートし、次にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合した抗ウサギＩｇＧ抗体でインキュベートした。ＤＮＡを、ＤＡＰＩ（同仁堂）を用いて標識した。本発明者らは、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７１０）下で細胞を観察し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いてｃｉｔＨ３陽性細胞の数を測定することにより、ＮＥＴｏｓｉｓを起こす細胞の頻度を定量した。
ヒト好中球におけるヒストンＨ３シトルリン化の量を検出するために、４×１０５個の細胞を３５ｍｍポリ−Ｌ−リシン被覆ガラス底皿（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）に播種し、ＰＭＡで２．５時間刺激した。細胞を固定し、ブロックし、次いでビオチニル化抗ｃｉｔＨ３ Ａｂ（１１−１１Ｂ−４Ｆ）、次いでＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂ）と結合したストレプトアビジンによりインキュベートした。上述のようにして、ＮＥＴｏｓｉｓを受けている細胞の頻度を定量した。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞の生存率を評価するために、フェロプトーシスインヒビター（例えば、デフェロキサミンまたはフェロスタチン−１）、ネクロトーシスインヒビター（ネクロスタチン−１）またはアポトーシスインヒビター（ｚ）の存在下でｔＢＨＰ、エラスチンまたはＳＳＺでインキュベートした（ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）。１２時間後、製造元の方法に従ってＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて細胞生存率を測定した。
【００３８】
インビボでの好中球細胞死の検出
末梢血または腹腔内の好中球の数を決定するために、マウスに１６ｍｇＳＳＺおよび／または１ｍｇのザイモサンを腹腔内注射した。４時間または２４時間後、末梢血細胞または腹腔細胞を採取し、Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて赤血球溶解を行い、白血球を得た。
ＰＥ結合抗Ｌｙ６Ｃ、ＰＥ−Ｃｙ７結合抗ＣＤ４５．２、ＡＰＣ−Ｃｙ７結合抗Ｌｙ６Ｇ抗体および７−ＡＡＤで白血球を染色した。ＣＤ４５．２＋Ｌｙ−６Ｃ−Ｌｙ−６Ｇ＋好中球の絶対数および死細胞（７−ＡＡＤ＋細胞）のパーセンテージは、血球計算器を用いて顕微鏡で関連細胞を計数することにより、および、ＢＤ ＦＡＣＳｖｅｒｓｅ上でフローサイトメトリーを用いて細胞数を分析することによって決定した。マウス足蹠の好中球におけるヒストンＨ３のシトルリン化を検出するために、マウスに、トロロックスとともに、また、トロロックスなしでＳＳＺを皮下注射した。４８時間後、足蹠を切除し、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ）に包埋し、冷却ヘキサン中で凍結させた。薄片を、Ｋａｗａｍｏｔｏのフィルム法（参考文献３）（Ｌｅｉｃａ）を使用して作製した。５μｍ厚さの凍結切片を調製し、これを風乾し、１００％エタノールおよび４％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）と結合した抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて、まずＡｌｅｘａ６４７結合抗Ｌｙ６Ｇで、および、ウサギ抗ｃｉｔＨ３抗体（Ａｂｃａｍ）で切片を染色した。ＤＮＡはＤＡＰＩを用いて標識化し、経口顕微鏡下で細胞を観察した。
【００３９】
細胞内ＲＯＳ発生および脂質酸化の検出
細胞内でのＲＯＳの発生を検出するため、１．４ｘ１０４個のマウス好中球を、Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液中（ＨＢＳＳ（＋））、３７℃で１５分間、１０μＭ  ＤＣＦＨ−ＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下、インキュベートし、ＳＳＺの存在下または非存在下、３７℃でＰＭＡまたはイオノマイシンを用いて刺激した。ＢＤ ＦＡＣＳｖｅｒｓｅを用いて、フローサイトメトリー分析を行った。
脂質酸化を検出するため、１．４ｘ１０４個のマウス好中球を、丸底の９６ウェルプレートに播種し、ＳＳＺまたはサルファ剤の存在下、ＰＭＡまたはイオノマイシンで刺激した。６０分後、２μＭのＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙ５８１／５９１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、３０分間、細胞に添加した。ＢＤ ＦＡＣＳｖｅｒｓｅを用いて、フローサイトメトリー分析を行った。
【００４０】
定量ＲＴ−ＰＣＴ
製造元の指示に従って、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを好中球から抽出した。相補的ＤＮＡは、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲマスターキット（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて合成した。相補的ＤＮＡに対して、ｑＰＣＲを、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。反応は、リアルタイムＰＣＲシステム（ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。発現レベルは、１８ｓリボソームＲＮＡに対して標準化され、別段の記載がない限り、ナイーブ対照に対してもｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎとして表示される。
ｘＣＴ（ＳＬＣ７ａ１１）には、以下のＰＣＲプライマー:
ｘＣＴ−Ｆ：5'AGAGCATCACCATCGTCAGA3'
ｘＣＴ−Ｒ：5'GATTCATGTCCACAAGCACAC3'
を用いた。
１８ｓリボソームＲＮＡには、以下のプライマー：
１８ｓリボソームＲＮＡ−Ｆ：5'CGGACAGGATTGACAGATTG3'
１８ｓリボソームＲＮＡ−Ｒ：5'CAAATCGCTCCACCAACTAA3'
を用いた。
【００４１】
統計的解析
対になった、および対になっていない両側スチューデントｔ検定およびマンホイットニーＵ検定を用いて２つの群を比較した。ワンウェイおよびツーウェイＡＮＯＶＡを使用して複数の群を比較した。全ての統計分析は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアを用いて行った。
【００４２】
＜ＮＥＴｏｓｉｓによる活性化された好中球の細胞死の促進＞
活性化されたマウス好中球におけるＮＥＴ増強活性に関し、いくつかの細胞死関連化合物をスクリーニングした。マウス骨髄好中球は、ＮＥＴｏｓｉｓおよびＮＥＴ形成にＰＭＡ（５μＭ以上）を必要とし、一方、低用量のＰＭＡ（１μＭ）はＮＥＴ形成を誘導せずに好中球を活性化した（図２ａ）。
ＳＳＺは、１μＭのＰＭＡで活性化された好中球において、用量依存的に細胞死を促進した。一方、マウス好中球を１ｍＭ ＳＳＺ単独で４時間処理した場合には、細胞死を起こさなかった。好中球におけるＳＳＺの２４時間処理はアポトーシスを誘導することが報告されている（参考文献４）。なお、短時間処理した場合、未処理のマウス好中球に対するＳＳＺの殺細胞効果はないことを示していた（図８ａ〜ｃ）。
形態学的分析からは、ＰＭＡ及びＳＳＺで処理した死んだ好中球が、染色体ＤＮＡを細胞外空間に放出すること（これはＮＥＴの特異的特徴である）が示された（図２ｂ）。
ＮＥＴｏｓｉｓは、ヒストンＨ３のシトルリン化を伴う（参考文献５）。抗シトルリン化ヒストンＨ３抗体を用いて免疫組織化学分析を行ったところ、低用量のＰＭＡ単独およびＳＳＺ単独ではシトルリン化を誘導しなかったが、ＳＳＺおよび低用量のＰＭＡの処置はヒストンＨ３シトルリン化を受けた死亡好中球の数を増加させた（図２ｃ、ｄ）。シトルリン化は、観察された細胞死がＮＥＴｏｓｉｓに起因することを確認するＰＡＤ４阻害剤であるＧＳＫ４８４を添加することによって阻害された（図２ｅ）。
また、ＮＥＴｏｓｉｓの別の誘導因子であるイオノマイシンを用いて活性化された好中球に対するＳＳＺの効果を評価した。抗シトルリン化ヒストンＨ３抗体による免疫組織化学分析によって、イオノマイシンが用量依存的にＮＥＴｏｓｉｓを誘発し（図２ｆ、左）、ＳＳＺが、低用量（５μｇ）のイオノマイシンの存在下でインキュベートした好中球においてＮＥＴｏｓｉｓを増強したことが示された（図２ｆ、右および図２ｇ）。以上より、ＳＳＺがマウス好中球におけるＮＥＴｏｓｉｓを加速させることを確認した。
次にＳＳＺのヒト好中球に対する影響を検討した。ヒト好中球は、マウス好中球に比べてＰＭＡに対してより敏感に反応した。例えば、３．２ｎＭという低用量のＰＭＡは単独で、ヒト好中球においてＮＥＴｏｓｉｓを誘導した（図２ｈ、左）。一方で、好中球を０．８ｎＭのＰＭＡで前処理した場合、ＳＳＺは用量依存的にＮＥＴｏｓｉｓを増強した（図２ｈ、右、図２ｉおよび図２ｊ）。
これらの結果から、ＳＳＺがマウスおよびヒト活性化好中球におけるＮＥＴｏｓｉｓを増強することが示された。
【００４３】
＜ＮＥＴｏｓｉｓを介したインビボでの好中球の細胞死誘発＞
次に、インビボでの好中球の細胞死にＳＳＺが与える影響を調べた。
ＳＳＺは、腹腔内投与でナイーブマウスに注入した場合、血液中の好中球の数は減少しなかった。このことは、ＳＳＺが生理的環境下で好中球に対して殺細胞作用を示さないことを示唆する（図３ａ）。
続いて、活性化した好中球に対するＳＳＺの影響を調べた。
マウスにザイモザンを腹腔投与した直後に、ＳＳＺを投与するか、または、ＳＳＺを投与しなかった。図３ｂに示すとおり、ザイモザンのみの投与の４時間後には、相当数の免疫細胞、特に好中球が、腹腔内に蓄積した。一方、ＳＳＺと共に投与した場合には、好中球の数は劇的に減少した。さらに、ザイモザンとＳＳＺとを両方投与したマウスでは、湿潤細胞内における７−ＡＡＤ陽性の死細胞の割合が劇的に高かった。ザイモザンとＳＳＺを投与したマウスにおいて、腹腔の好中球の一部は、抗シトルリン化ヒストンＨ３抗体に免疫反応を示した。このことは、好中球はインビボでＮＥＴｏｓｉｓを起こしていることを示す（図３ｄ）。これらのデータは、ＳＳＺがインビボで好中球の細胞死および増進したＮＥＴ形成を引き起こしていることを示唆する。
【００４４】
＜活性化好中球におけるＲＯＳ産生＞
以下で説明するとおり、ＳＳＺは活性化した好中球においてＲＯＳ産生を増進しないことが示された。
ＰＭＡ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓには反応性酸素種（ＲＯＳ）産生が必要とされる(参考文献６）。ＳＳＺによってＮＥＴｏｓｉｓが加速されるメカニズムを探るため、ＳＳＺが好中球におけるＲＯＳ産生に影響を与えるかどうかを調べた。
まず、ＮＡＤＨオキシダーゼ阻害剤であるジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）のＮＥＴｏｓｉｓに対する影響を評価した。図４ａおよびｂに示すとおり、ＤＰＩは、高用量のＰＭＡまたは低用量ＰＭＡとＳＳＺとの組み合わせによって誘発されたＮＥＴｏｓｉｓを阻害した。これらの結果は、観察されたＳＳＺ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓ加速に、ＮＡＤＨオキシダーゼ誘発性のＲＯＳ産生が必要であることを示す。さらに、この結果は、ＳＳＺが好中球においてＲＯＳ産生を増進し得ることを示唆する。
続いて、ＤＣＦＨ−ＤＡを使用して産生されたＲＯＳの量を測定した。ＰＭＡは、用量依存的にＲＯＳ産生を刺激した（図４ｃ、ｄ）。しかしながら、予想に反して、ＳＳＺは、低用量のＰＭＡを投与した好中球ではＲＯＳ産生を増進せず、むしろ、１ｍＭ  ＳＳＺは、活性化好中球においてＲＯＳ産生を減少させた（図４ｃ、ｄ）。これらの結果は、ＳＳＺ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓの加速には、ＮＡＤＨオキシダーゼの活性化が必要であること、また、ＳＳＺは、活性化好中球における産生ＲＯＳの量を増加させないことを示している。
更に、イオノマイシン処理された好中球におけるＲＯＳ産生に与えるＳＳＺの影響を調べ、ＳＳＺはこれらの条件ではＲＯＳ産生を増進せず、むしろ低減することを見出した（図４ｅ、ｆ）。
【００４５】
＜加速された脂質酸化とＳＳＺ誘発性ＮＥＴｏｓｉｓとの関係＞
次いで、活性化された好中球におけるＳＳＺ関連応答に対するＳＳＺの効果を評価した。その結果、ＳＳＺが好中球内で脂質酸化を加速したことを見出した。
脂質酸化は、Ｃ１１−Ｂｏｄｉｐｙ５８１／５９１染料を用いて測定した。当該染料は、酸化されると赤色から緑色への蛍光シフトを示す。図５ａおよびｂに示すとおり、ＰＭＡは用量依存的に脂質酸化を増加させる。低用量（１μＭ）のＰＭＡは、酸化されたＣ１１−Ｂｏｄｉｐｙの若干の増加を誘発し、ＳＳＺは、低用量のＰＭＡで事前に処理された好中球において脂質酸化を劇的に加速した（図５ａ，ｂ）。
また、ＳＳＺが低用量（５μＭ）のイノマイシンで処理された活性化好中球においても脂質酸化を増加させることを見出した（図５ｃ、ｄ）。ＳＳＺによるこの脂質過酸化は、２−ＭＥによっては阻害されなかったが、ビタミンＥの類似体であるトロロックスによって阻害れた。トロロックスは、脂質酸化に対する抗酸化物質として機能する（図５ｅ，ｆ）。これらの結果と整合して、２−ＭＥではなく、トロロックスが、効果的かつ用量依存的に、低用量ＰＭＡおよびＳＳＺ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓを抑制した（図５ｆ、ｇ）。
次に、インビボでのＳＳＺ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓに対するトロロックスの阻害効果を測定した。皮下注射の場合、ＳＳＺは、局所で炎症性反応およびＬｙ−６Ｇ＋好中球集積を引き起こした（図５ｉ）。集積した好中球の一部は、抗シトルリン化ヒストンＨ３抗体に対して免疫反応性であった（図５ｉ）。このことは、これらがＮＥＴｏｓｉｓを受けていたことを示す。この急性の炎症は、これらのマウスの足蹠の一時的な膨張をもたらした（図５ｊ）。しかしながら、トロロックスとＳＳＺの共投与は、好中球の集積には影響を与えなかったが、シトルリン化ヒストンＨ３陽性好中球の数を相当数減少させた（図５ｉ）。結果的に、トロロックス注入は、これらのマウスの足蹠の膨張を有意に改善した（図５ｊ）。
最後に、ヒト好中球におけるＮＥＴｏｓｉｓに対するトロロックスの影響を評価した。マウス好中球において観察された結果と同様に、トロロックスは、ほぼ完全に、低用量ＰＭＡおよびＳＳＺ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓを阻害した（図５ｋ、ｌ、ｍ）。
これらの結果は、ＳＳＺが、脂質酸化が加速することによって、活性化好中球におけるＮＥＴｏｓｉｓが増進したことを示す。
【００４６】
＜ＳＳＺのＮＥＴｏｓｉｓ増強メカニズム＞
以下で説明するとおり、ＳＳＺは、フェロトーシスとは異なるメカニズムでＮＥＴｏｓｉｓを増強することが示された。
ＳＳＺは、がん細胞において、ｘＣＴの機能を阻害することによって、フェロトーシスを誘導することが報告されている（参考文献７および参考文献８）。ｘＣＴは、種々の細胞に発現し、シスチンを細胞内に輸送することによって細胞内グルタチオンレベルの維持に重要な役割を果たしている。従って、ｘＣＴを阻害することで、グルタチオンを細胞で枯渇させるが、これによって、酸化ストレスに応答して細胞の脆弱性が増す。事実、ｘＣＴ転写物の発現レベルは、インビボでＰＭＡ（図６ａ）またはインビボでザイモザン（図６ｂ）により刺激された好中球で増加した。
これらの結果に従って、ＳＳＺ誘発性ＮＥＴｏｓｉｓの加速にｘＣＴが関与するか否かについて調べた。これらの実験において、まず、ｘＣＴの阻害により作用するフェロトーシスの別の誘発物質であるエラスチンのＮＥＴｏｓｉｓに対する効果を調べた。
図９に示すとおり、１μＭ未満のエラスチンは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において細胞死を誘発することができる一方で、１２時間で細胞のすべてを死滅させるのには２００μＭのＳＳＺが必要であった。このことは、エラスチンがＮＩＨ３Ｔ３細胞における非常に強力なフェロトーシスの誘発物質であることを示す。しかしながら、エラスチンは、低用量のＰＭＡで処理されたマウス好中球ではＮＥＴｏｓｉｓを加速することができなかった（図６ｃ、ｄ）。
次いで、ｘＣＴ変異マウス（参考文献１）から得られたｘＣＴ欠損好中球に対するＳＳＺの効果を分析した。これらのマウスでは、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）により、ｘＣＴ遺伝子において機能喪失型変異をもたらした。これらのマウスから得られた胎児線維芽細胞および骨髄由来マクロファージは、２−ＭＥなしではインビトロでは、生存も増殖もしなかった。
これらのマウスから調製された好中球において、ｓｙｔｏｘ  ｇｒｅｅｎを用いて、ＰＭＡ単独でＮＥＴｏｓｉｓを評価した。その結果、ＷＴとｘＣＴ変異好中球とでは、ＰＭＡ単独で誘発されたＮＥＴｏｓｉｓの効率において差がないことが示された（図６ｅ）。
さらに、活性化されたｘＣＴ変異好中球は、ＷＴからのものに比較して、この刺激に若干耐性があるが、ＳＳＺは活性化されたｘＣＴ変異好中球においてＮＥＴｏｓｉｓを加速した（図６ｅ）。
また、抗ｃｉｔＨ３ Ａｂを用いてＰＭＡ＋ＳＳＺによってＮＥＴｏｓｉｓを評価し、ＳＳＺが、活性化されたｘＣＴ変異好中球と、ＷＴマウスから得られたものとにおいて、同程度ＮＥＴｏｓｉｓを加速することを見出した（図６ｆ）。ｘＣＴは、活性化した好中球におけるＳＳＺによるＮＥＴｏｓｉｓの加速には影響しないため、これらの結果は明らかに、ｘＣＴがＳＳＺの標的ではないことを示している。
酸化した脂質の発生は、別の細胞死様式であるフェロトーシスにも関与しており、このことは、ある細胞死シグナリングメカニズムが、ＳＳＺ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓおよびフェロトーシスの間で共有されている可能性を示唆する。
そこで、いくつかの細胞死阻害剤の、細胞死の各タイプに対する影響を比較することによって、フェロトーシスに関与するメカニズムとＳＳＺ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓに関与するメカニズムとの違いを検証した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、エラスチンまたはＳＳＺ誘発性フェロトーシスは、デフェロキサミンまたはフェロスタチン−１によって効果的に阻害され、その一方、ネクロスタチン−１やｚ−ＶＡＤは、フェロトーシスの阻害効果がなかった（図６ｇ）。デフェロキサミンおよびフェロスタチン−１もまた、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシダーゼ（ｔＢＨＰ）誘発性フェロトーシス様細胞死を阻害した。一方、デフェロキサミンは、ＰＭＡ＋ＳＳＺ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓを阻害しなかった（図６ｈ）。高用量（２．５μＭ）のフェロスタチン−１だけが部分的にｍＰＭＡ＋ＳＳＺによるＮＥＴｏｓｉｓを阻害したが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるフェロトーシスの場合と比較して、効果的ではなかった（図６ｈ）。
総合すると、これらのデータは、脂質酸化が、ＳＳＺ誘発性ＮＥＴｏｓｉｓおよびフェロトーシスの細胞死シグナルに関与する一方、これらの２つの細胞死の経路における酸化脂質の生成やその役割は異なる可能性を示している。
【００４７】
＜ＮＥＴ誘発性化合物間での構造−活性相関＞
結腸における細菌性アゾレダクターゼによって、ＳＳＺが、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）およびスルファピリジンに変換されることが広く報告されている（参考文献９）（図７ａ）。５−ＡＳＡは、ＳＳＺの抗炎症活性に寄与し、スルファピリジンは、副作用の一部の原因になりうると考えられている（参考文献１０）。そのため、これらのＳＳＺ代謝物のＮＥＴｏｓｉｓに対する効果を調べた。図７ｂおよびｃに示すとおり、効果はＳＳＺと比較して非常に弱いが、スルファピリジンは、ＰＭＡ誘発性ＮＥＴｏｓｉｓを増強する。これに対し、５−ＡＳＡはＮＥＴｏｓｉｓを誘発しない。さらに興味使いことに、５−ＡＳＡは、ＰＭＡおよびＳＳＺ誘発性のＮＥＴｏｓｉｓを、用量依存的に阻害した（図７ｄ，ｅおよびｆ）。これらの結果は、経口投与された場合に、ＳＳＺ誘発性顆粒球減少症の発生が非常に低いままであることの理由を支持する可能性がある。
【００４８】
ＳＳＺの構造−活性相関をさらに明らかにするために、スルファニルアミドおよび４，４’−ジアミノジフェニルスルホン（ＤＤＳ）のＮＥＴｏｓｉｓ増強活性について試験した。スルファニルアミドおよびＤＤＳはＮＥＴｏｓｉｓ増強活性を有することを見出した（図７ｇ）ＤＤＳは、スルファニルアミドよりも一桁低い用量で同様のＮＥＴｏｓｉｓ増強活性を示した（図７ｇ）。ＮＥＴｏｓｉｓ誘発性化合物はまた、ＮＥＴｏｓｉｓ増強活性のレベルに従って、ＰＭＡ処理された好中球における脂質酸化を加速した（図７ｈ）。これらの結果は、スルファニルアミドおよびＤＤＳが、ＳＳＺと同じ様式でＮＥＴｏｓｉｓを誘発するという見解を支持するものである。
【００４９】
＜考察＞
発明者らは、ＳＳＺにより、活性化好中球におけるリン脂質酸化が加速され、その結果、ＮＥＴｏｓｉｓが増強されることを示した。これらの知見は、昨今のフェロトーシスの研究と併せて、特定のタイプの細胞死の実行あるいは制御因子としての酸化リン脂質の役割にヒントを与えるものである。フェロトーシスの場合、グルタミン酸や、Ｘｃ−シスチントランスポータシステムを阻害する他の低分子が、ＧＳＨ枯渇を生じさせ、細胞の抗酸化能力を喪失させ、ＲＯＳに応答した細胞の脆弱性をもたらすことが報告されている（参考文献１１）。酸化脂質の減少に関与するユニークな細胞酵素であるＧＰＸ４を阻害する低分子もまた、フェロトーシスを誘発し、このことは、脂質酸化が、この種の細胞死に重要な役割を果たしていることを示す。本発明者らは、当初、ＳＳＺは、ｘＣＴの機能を阻害することによって脂質過酸化を増加させると考えていた。というのも、これが、フェロトーシスの基礎であると考えられているメカニズムであるためである。しかしながら、ＳＳＺは、酸化脂質の蓄積を促進し、その結果、ｘＣＴ非依存的にＮＥＴｏｓｉｓを誘発すると結論付けた。さらに、本発明者らのデータは、フェロトーシス阻害剤が、ＳＳＺ誘発性ＮＥＴｏｓｉｓに影響を与えないことを示した。この知見は、ＳＳＺ誘発性ＮＥＴｏｓｉｓが、フェロトーシスに関与する細胞死のプロセスと区別されるという考えを支持するものである。ただし、両者の細胞死のタイプは共に、脂質酸化に関与する。この時点で、脂質酸化を誘発するのにＳＳＺが標的とする分子や、ＮＥＴｏｓｉｓの次の誘発は知られていない。一つの可能性は、ＳＳＺが、この分子の、酸化リン脂質を低減する能力を阻害することである。代わりに、ＳＳＺは、脂質酸化に関与する未確認の分子を積極的に調節する可能性もある。いずれの場合においても、ＳＳＺの標的分子を特定することによって、ＮＥＴｏｓｉｓおよびＮＥＴ形成の調節の基礎となる分子パラダイムの特性決定を促進することが予測される。
結論として、本発明者らは、ＳＳＺが、脂質酸化を加速することによって、ＮＥＴｏｓｉｓが増進されることを示した。ＳＳＺおよびその関連化合物の構造と活性との関係は、脂質酸化を加速することによる可能性のあるＮＥＴ誘発活性を有する化合物の開発を可能にするであろう。リン脂質の過酸化は、ＮＥＴ形成を加速する重要なメカニズムである。これらの知見は、ＮＥＴ調節化合物の開発の理解を拡大するものである。
【００５０】
参考文献
１）Nabeyama A, Kurita A, Asano K, Miyake Y, Yasuda T, Miura I, Nishitai G, Arakawa S, Shimizu S, Wakana S, Yoshida H, Tanaka M.: xCT deficiency accelerates chemically induced tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Apr 6;107(14):6436-41. 
２）Ray S, Diamond B.: Generation of a fusion partner to sample the repertoire of splenic B cells destined for apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Jun 7;91(12):5548-51.
３）Kawamoto T, Shimizu M.: A method for preparing 2- to 50-micron-thick fresh-frozen sections of large samples and undecalcified hard tissues. Histochem Cell Biol. 2000 May;113(5):331-9.
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９）Gionchetti P, Calabrese C, Tambasco R, Brugnera R, Straforini G, Liguori G, Fornarini GS, Riso D, Campieri M, Rizzello F.: Role of conventional therapies in the era of biological treatment in Crohn's disease. World J Gastroenterol. 2011 Apr 14;17(14):1797-806.
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１１）Yang WS, Stockwell BR.: Ferroptosis: Death by Lipid Peroxidation. Trends Cell Biol. 2016 Mar;26(3):165-76. 
【図１】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図２（ｃ）】
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【図２（ｄ）】
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【図２（ｅ）】
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【図２（ｆ）】
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【図２（ｇ）】
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【図２（ｈ）】
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【図２（ｉ）】
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【図２（ｊ）】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図３（ｄ）】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図４（ｃ）】
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【図４（ｄ）】
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【図４（ｅ）】
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【図４（ｆ）】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図５（ｃ）】
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【図５（ｄ）】
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【図５（ｅ）】
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【図５（ｆ）】
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【図５（ｇ）】
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【図５（ｈ）】
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【図５（ｉ）】
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【図５（ｊ）】
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【図５（ｋ）】
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【図５（ｌ）】
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【図５（ｍ）】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図６（ｃ）】
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【図６（ｄ）】
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【図６（ｅ）】
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【図６（ｆ）】
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【図６（ｇ）】
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【図６（ｈ）】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【図７（ｃ）】
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【図７（ｄ）】
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【図７（ｅ）】
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【図７（ｆ）】
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【図７（ｇ）】
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【図７（ｈ）】
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【図８（ａ）】
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【図８（ｂ）】
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【図８（ｃ）】
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【図９】
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【配列表】
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