(57)【要約】      （修正有）【課題】骨髄内の形質細胞の異常なクローン増殖を特徴とするＢ細胞の悪性腫瘍多発性骨髄腫（ＭＭ）に対する新規治療法を提供する。【解決手段】ＭＭ細胞上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である細胞表面糖タンパク質のＣＳ１を特異的に認識することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が開示される。また、これらのＣＡＲを発現するように遺伝子操作したＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞も開示される。したがって、本開示のＣＡＲを発現するように遺伝子操作した本開示の免疫エフェクター細胞の養子移入を含む、ＭＭを有する対象に抗腫瘍免疫をもたらすための方法もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＳ１抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達領域を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
【請求項２】
前記抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体断片または抗原結合断片である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体のＦａｂまたは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞質ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＣＡＲポリペプチドが、式：
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ；または
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＩＳＤ−ＣＳＲ
（式中、「ＳＰ」は、シグナルペプチドを表し、
「ＣＳ１」は、ＣＳ１結合領域を表し、
「ＨＧ」は、任意のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、二価のリンカーを表す）
で定義される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ＣＳ１結合領域が、ＣＳ１に特異的に結合する抗体のＦａｂまたは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードする単離核酸配列。
【請求項９】
請求項７または８に記載の単離核酸配列を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１１】
αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインがＣＳ１に結合するとき、抗腫瘍免疫を呈する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に抗腫瘍免疫をもたらすための方法であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子的に改変した有効量の免疫エフェクター細胞を前記対象に投与することを含み、前記ＣＡＲがＣＳ１抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、これにより哺乳動物において抗腫瘍免疫をもたらす、方法。
【請求項１４】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及び制御性Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体断片または抗原結合断片である請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体のＦａｂまたは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞質ドメインを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＡＲポリペプチドが、式：
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ；または
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＩＳＤ−ＣＳＲ
（式中、「ＳＰ」は、シグナルペプチドを表し、
「ＣＳ１」は、ＣＳ１結合領域を表し、
「ＨＧ」は、任意のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、二価のリンカーを表す）
で定義される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＣＳ１抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体のＦａｂまたは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年５月３日に出願された米国仮出願第６１／８１９，１４１号及び２０１３年９月１１日に出願された米国仮出願第６１／８７６，４９２号の利益を主張するものであり、これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄内の形質細胞（ＰＣ）の異常なクローン増殖を特徴とするＢ細胞の悪性腫瘍であり、２０１２年に米国内で特定されたＭＭの新規症例は２１，７００件、死亡症例は１０，７１０件と推定される（Ｓｉｅｇｅｌ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ２０１２  ６２：１０−２９）。２０１３年には、米国で２２，３５０名の個人がＭＭであると新たに診断され、全血液系腫瘍による死亡の２０％を占める１０，７１０名の人々が死亡すると推定されている。プロテアソーム阻害剤及び免疫調節剤の使用は全体的な生存率を改善しているが（Ｐａｌｕｍｂｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００９  ２３：４４９−４５６）、ＭＭは、依然として不治の悪性腫瘍（Ｐｏｄａｒ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００９  ２３：１０−２４）であり、新規治療法が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
養子細胞移入とともに用いて多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞を標的にし、殺傷することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドが本明細書にて開示される。細胞表面糖タンパク質であるＣＳ１は、骨髄腫細胞の表面に多量かつ偏在的に発現する一方で、免疫エフェクター細胞の大部分では発現レベルが極めて低い。したがって、本開示のＣＡＲポリペプチドは、ＣＳ１を発現しているＭＭ細胞に結合できる抗ＣＳ１結合要素を細胞外ドメインに含有する。他のＣＡＲと同様に、本開示のポリペプチドは、膜貫通ドメインと、免疫エフェクター細胞を活性化できる細胞内ドメインとを含み得る。たとえば、細胞内ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインと、任意で共刺激シグナル伝達領域を含み得る。
【０００４】
抗ＣＳ１結合要素は、いくつかの実施形態において、ＣＳ１に特異的に結合する抗体断片または抗原結合断片である。たとえば、抗原結合ドメインは、ＣＳ１に特異的に結合する抗体のＦａｂまたは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。抗ＣＳ１結合要素は、いくつかの実施形態において、ＣＳ１に特異的に結合するアプタマーである。たとえば、抗ＣＳ１結合要素は、ＣＳ１への結合能に基づいてランダム配列プールから選択されるペプチドアプタマーであり得る。抗ＣＳ１結合要素はまた、ＣＳ１の天然リガンドまたはＣＳ１に結合することができる変異体及び／もしくはそれらの断片であり得る。
【０００５】
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインであり、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはこれらの組み合わせの細胞質ドメインを含む。場合により、共刺激シグナル伝達領域は、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達分子及び／または共刺激分子のうちの１、２、３または４つの細胞質ドメインを含有する。
【０００６】
本開示のＣＡＲポリペプチドをコードする単離核酸配列、これらの単離核酸を含むベクター、及びこれらのベクターを含有する細胞もまた開示される。たとえば、本細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及び制御性Ｔ細胞からなる群から選択される免疫エフェクター細胞であり得る。いくつかの実施形態において、本細胞は、ＣＡＲの抗原結合ドメインがＣＳ１に結合するとき、抗腫瘍免疫を呈する。
【０００７】
多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に抗腫瘍免疫をもたらすための方法もまた開示される。本方法は、本開示のＣＳ１特異的ＣＡＲで遺伝子的に改変した有効量の免疫エフェクター細胞を対象に投与することを含む。
【０００８】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細について、添付図面及び以下の説明にて記載する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、当該説明と図面から、また特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−１Ｃ】ＣＳ１特異的ＣＡＲの作製及びＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるその発現を示す。図１Ａは、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ細胞内ドメインに連結した抗ＣＳ１  ｓｃＦｖを含有するＰｉｎｃｏ−ＣＳ１−ＣＡＲレトロウイルス構築物の概略図である。ＬＴＲは長末端反復配列、ＳＰはシグナルペプチド、ＶＨは可変Ｈ鎖、Ｌはリンカー、ＶＬは可変Ｌ鎖である。図１Ｂにおいて、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）をＣＤ３ビーズ及びＣＤ２８ビーズで活性化し、Ｐｉｎｃｏ−ＣＳ１−ＣＡＲ構築物またはＰｉｎｃｏ構築物を用いて形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞を分取し、細胞溶解物を抗ヒトＣＤ３ζ一次抗体による還元条件下で免疫ブロット分析にかけた。図１Ｃにおいて、健常ドナー由来のモック１形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ１形質導入Ｔ細胞をビオチン標識ヤギ抗マウスＦａｂ特異的抗体またはアイソタイプ適合対照抗体で染色し、次いで、ストレプトアビジン及びＣＤ３抗体染色を行った。
【図２Ａ−２Ｃ】ＣＳ１発現骨髄腫細胞株に反応して、ＣＳ１標的Ｔ細胞がモックＴ細胞よりも多くのＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を分泌することを示す。図２Ａは、骨髄腫細胞株の表面上におけるＣＳ１発現のフローサイトメトリー分析を示す。示した４つの骨髄腫細胞株をＰＥ標識抗ＣＳ１  ｍＡｂ抗体（実線）またはアイソタイプ適合対照抗体（点線）で染色した。図２Ｂ及び２Ｃは、モックまたはＣＳ１−ＣＡＲを形質導入した健常ドナーＴ細胞（２×１０５）におけるＩＦＮ−γ（図２Ｂ、ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−２（図２Ｃ、ｐｇ／ｍｌ）の分泌を示す棒グラフである。各細胞は、２４時間、単独培養（標的なし）するか、ＣＳ１を異なる量で発現する同数の骨髄腫細胞で刺激した。
【図３Ａ−３Ｄ】ＣＳ１標的Ｔ細胞が、ＣＳ１タンパク質を明確に発現している骨髄腫細胞を優先的に根絶することを示す。図３Ａにおいて、５１Ｃｒ標識したＮＣＩ−Ｈ９２９、ＩＭ９、ＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ−８２２６の骨髄腫細胞（５×１０３）をモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と記載のＥ／Ｔ比で４時間共培養し、標的溶解（５１Ｃｒ放出）を測定した。図３Ｂにおいて、モック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞における脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａ及びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９の発現を、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞と４時間共培養した後、フローサイトメトリーにより評価した。モック形質導入Ｔ細胞と比較すると、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、ＣＳ１発現ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞に反応して、脱顆粒に優れ、Ｔ細胞活性化が高かった。図３Ｃにおいて、モック形質導入Ｔ細胞及びＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を透過処理し、グランザイムＢ及びパーフォリンに特異的なｍＡｂによって細胞内染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
【図４Ａ−４Ｄ】ＭＭ細胞におけるＣＳ１の異所性過剰発現が、ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞による認識後、細胞傷害性及びサイトカイン分泌の増大を誘発することを示す。図４Ａは、ＣＳ１を過剰発現するＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＲＰＭＩ−８２２６−ＣＳ１、太い実線）または空ベクター対照のＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＲＰＭＩ−８２２６−ＰＣＤＨ、薄い実線）の表面上のＣＳ１タンパク質またはＩｇＧアイソタイプ対照（点線）に関するフローサイトメトリー染色を示す。図４Ｂは、ＲＰＭＩ−８２２６−ＣＳ１細胞及びＲＰＭＩ−８２２６−ＰＣＤＨ細胞に対するモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の細胞傷害性を示すグラフである。ＲＰＭＩ−８２２６−ＣＳ１細胞及びＲＰＭＩ−８２２６−ＰＣＤＨ細胞をモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と表示のＥ／Ｔ比で４時間インキュベートし、標準５１Ｃｒ放出アッセイを用いて特異的溶解を特定した。図４Ｃ及び４Ｄは、単独培養するか、同数のＲＰＭＩ−８２２６−ＣＳ１細胞もしくはＲＰＭＩ−８２２６−ＰＣＤＨ細胞のいずれかで刺激したモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（１×１０５）におけるＩＦＮ−γ（図４Ｃ、ｐｇ／ｍｌ）及びＩＬ−２（図４Ｄ、ｐｇ／ｍｌ）の分泌を示す棒グラフである。
【図５Ａ−５Ｄ】ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＳ１発現ヒト初代骨髄腫細胞をエクスビボで特異的に認識し、排除することを示す。図５Ａは、抗ＣＤ３ビーズ及び抗ＣＤ２８ビーズで活性化し、Ｐｉｎｃｏ−ＣＳ１−ＣＡＲ構築物またはＰｉｎｃｏ構築物（モック）を用いて形質導入し、抗マウスＦａｂ抗体及び抗ヒトＣＤ３抗体で染色したＭＭ患者由来ＰＢＭＣに関するフローサイトメトリーの結果を示す。類似データを有する患者４名のうちの１名の結果を示す。図５Ｂは、ＭＭ患者から新しく単離したＣＤ１３８＋骨髄腫細胞におけるＣＳ１タンパク質に関するフローサイトメトリー染色を示す。類似データを有する患者１０名のうちの３名の結果を示す。図５Ｃは、（Ａ）記載のＥ／Ｔ比で４時間、（Ｂ）自己由来性のモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と共培養したＣＤ１３８＋骨髄腫細胞の特異的溶解（５１Ｃｒ放出アッセイ）を示す一連のグラフである。図５Ｄは、（Ｃ）Ｅ／Ｔ比を１：１とし、インキュベーション時間を２４時間まで延長したことを除いて同様に処置した細胞によるＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図６Ａ−６Ｂ】ＣＳ１標的Ｔ細胞が、同所性ＭＭ．１Ｓ異種移植マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害し、マウス生存を延ばすことを示す。図６Ａは、記載の各群から得た代表的なＭＭ．１Ｓ腫瘍マウス５匹に関する一連の背面及び腹面の生物発光画像である。ＮＳＧマウスにルシフェラーゼを発現するＭＭ．１Ｓ細胞８×１０６個を静脈に播種した（０日）。接種から７日及び１４日後に、ＰＢＳ（プラセボ対照群）、１０×１０６個のモックＴ細胞（モック対照群）またはＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲ処置群）を各マウスに与えた。図６Ｂは、ＰＢＳ、モックＴ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したＭＭ．１Ｓ保有マウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。
【図７Ａ−７Ｅ】ＣＳ１を発現する２９３Ｔ形質転換細胞がＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞による認識及び溶解の影響を受けたことを示す。図７Ａは、２９３Ｔ親細胞がＣＳ１発現に対して陰性であったことを示す。２９３Ｔ細胞をＰＥ標識抗ＣＳ１  ｍＡb抗体（実線）またはアイソタイプ適合対照Ａｂ（点線）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図７Ｂは、ＣＳ１を過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ−ＣＳ１、太く濃い実線）または空ベクターの２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ−ＰＣＤＨ、灰色の太い実線）の表面上におけるＣＳ１タンパク質に関するフローサイトメトリー染色を示す。ＩｇＧアイソタイプで染色したＣＳ１を発現する２９３Ｔ細胞（点線）を非特異的結合対照とした。図７Ｃは、２９３Ｔ−ＣＳ１細胞及び２９３Ｔ−ＰＣＤＨ細胞に対するモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。２９３Ｔ−ＣＳ１細胞及び２９３Ｔ−ＰＣＤＨ細胞をモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と表示のＥ／Ｔ比で４時間インキュベートし、標準５１Ｃｒ放出アッセイを用いて特異的溶解を特定した。図７Ｄ及び７Ｅは、単独培養するか、２９３Ｔ−ＣＳ１細胞もしくは２９３Ｔ−ＰＣＤＨ細胞で刺激したモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌（図７Ｄ、ｐｇ／ｍｌ）またはＩＬ−２分泌（図７Ｅ、ｐｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図８Ａ−８Ｂ】ＣＤ４＋ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞及びＣＤ８＋ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方が骨髄腫細胞に反応して活性化したことを示す。図８Ａにおいて、モック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を１２時間、単独培養するか、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞及びＭＭ．１Ｓ細胞で刺激し、次に、ＣＤ３及びＣＤ８の表面発現ならびに細胞内ＩＦＮ−γをフローサイトメトリーによって評価した。プロットはＣＤ３＋リンパ球に関してゲーティングした。類似の結果を有する３つの代表的実験のうちの１つを示す。図８Ｂにおいて、モック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を４時間、単独培養するか、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞及びＭＭ．１Ｓ細胞で刺激し、ＣＤ３及びＣＤ８の表面発現ならびに脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａをフローサイトメトリーによって評価した。プロットは生存ＣＤ３＋リンパ球に関してゲーティングした。類似の結果を有する３つの代表的実験のうちの１つを示す。
【図９Ａ−９Ｂ】ＣＳ１標的Ｔ細胞が、同所性ＩＭ−９異種移植マウスモデルにおいて腫瘍成長を阻害し、マウス生存を延ばすことを示す。図９Ａは、記載の各群から得た代表的なＩＭ９腫瘍マウス５匹に関する背面及び腹面の生物発光画像である。ＮＳＧマウスにルシフェラーゼを発現するＩＭ９細胞５×１０５個をｉ．ｖ．播種した（０日）。接種から７日及び２１日後に、ＰＢＳ（プラセボ対照群）、１０×１０６個のモックＴ細胞（モック対照群）またはＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲ処置群）を各マウスに与えた。白色の十字形「＋」は、撮像時点でＭＭ疾患によって死亡したＰＢＳ処置群のマウスを示す。図９Ｂは、ＰＢＳ、モックＴ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したＩＭ９保有マウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。
【図１０Ａ−１０Ｃ】ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＭＭ．１Ｓ細胞移植ＮＳＧマウスの骨髄（ＢＭ）にて存続し、増殖したことを示す。０日目にＭＭ．１Ｓ細胞８×１０６個をＮＳＧマウスに播種し、７日目にＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞１０×１０６個でマウスを処置した。２０日目に、ＤＰＢＳ溶液中のＢｒｄｕ１．５ｍｇをマウスにｉ．ｐ．注入した。翌日にマウスを屠殺し、製造業者のプロトコールに従って、ＣＤ４５及びＣＤ３ヒト特異的抗体ならびに／または抗Ｂｒｄｕ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による表面染色でＢＭ細胞を単離した。図１０Ａは、代表マウスのＢＭにおけるヒトＴ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋）のパーセンテージを示す。図１０Ｂにおいて、ゲートしたヒトＴ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋）をＩｇＧ（左パネル）または抗Ｆａｂ  Ａｂ（右パネル）で染色してＣＡＲ発現を確認した。図１０Ｃにおいて、ゲートしたヒトＴ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋）をＩｇＧ（左パネル）または抗Ｂｒｄｕ  Ａｂで染色し、Ｂｒｄｕ組込Ｔ細胞のパーセンテージを示した。
【図１１Ａ−１１Ｃ】ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、初代ＮＫ細胞及びＴ細胞に対して低い反応性を呈したことを示す。５１Ｃｒ標識ヒト初代ＮＫ細胞及びＴ細胞（５×１０３）を、モック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と記載のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で４時間共培養し、ＮＫ細胞（図１１Ａ）及びＴ細胞（図１１Ｂ）の標的溶解（５１Ｃｒ放出）を測定した。図１１Ｃは、２４時間、単独培養するか、初代ＮＫ細胞、Ｔ細胞もしくは骨髄腫細胞のいずれかで刺激したモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す棒グラフである。
【図１２】初代ＮＫ細胞またはＴ細胞が、ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞にて明らかな活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）をもたらさなかったことを示す。初代ＮＫ細胞及びＴ細胞を同数の５１Ｃｒ標識したモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と１２時間インキュベートした。次に、特異的溶解を５１Ｃｒ放出アッセイを用いて特定した。
【図１３Ａ−１３Ｃ】ＣＳ１特異的ＣＡＲの作製及びＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞におけるその発現を示す。図１３Ａは、ＣＳ１−ＣＡＲレンチウイルス構築物の概略図である。図１３Ｂは、ＣＤ３ζ特異的Ａｂを用いたＣＳ１−ＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を示す。示したデータは、類似の結果を有する３つの実験の代表である。図１３Ｃは、ＣＳ１−ＣＡＲ構築物または空ベクター（ＥＶ）を用いて形質導入し、抗ｍｙｃ抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ対照で細胞染色した後にフローサイトメトリーで分析した、ＦＡＣＳ分取ＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞の表面上におけるキメラＣＳ１  ｓｃＦｖ発現を示す。示したデータは、類似の結果を有する３つの実験の代表である。
【図１４Ａ−１４Ｄ】ＣＳ１−ＣＡＲ  ＮＫ細胞がＣＳ１−ＭＭ細胞ではなく、ＣＳ１＋ＭＭ細胞を根絶することを示す。図１４Ａは、抗ＣＳ１  ｍＡｂ抗体またはアイソタイプ適合対照抗体で細胞染色した後にフローサイトメトリーを用いた、Ｌ３６３、ＩＭ９及びＵ２６６のＭＭ細胞株の表面上におけるＣＳ１発現の特定を示す。図１４Ｂ〜１３Ｄは、標準５１Ｃｒ放出アッセイを用いた、ＩＭ９（図１４Ｂ）、Ｌ３６３（図１４Ｃ）及びＵ２６６（図１３Ｄ）の各細胞に対するモック形質導入またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入したＮＫ−９２細胞またはＮＫＬ細胞の細胞傷害活性を示す。ＮＫ−９２−ＥＶ及びＮＫＬ−ＥＶはそれぞれ空ベクター（ＥＶ）対照を形質導入したＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞を示す。ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ及びＮＫＬ−ＣＳ１−ＣＡＲはそれぞれＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞のＣＳ１−ＣＡＲ構築物による形質導入を示す。＊及び＊＊はそれぞれＰ＜０．０５及びＰ＜０．０１を示す。
【図１５Ａ−１５Ｃ】ＣＳ１＋ＭＭ細胞の認識が、対照ＮＫ細胞からの反応よりもＣＳ１−ＣＡＲ  ＮＫ細胞からの反応をより強く誘導することを示す。図１５Ａ〜１５Ｃは、同数のＩＭ９（図１５Ａ）、Ｌ３６３（図１５Ｂ）またはＵ２６６（図１５Ｃ）の各骨髄腫細胞と２４時間共培養したモック形質導入またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入したＮＫ−９２エフェクター細胞またはＮＫＬエフェクター細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す棒グラフである。ＮＫ−９２−ＥＶ及びＮＫＬ−ＥＶはそれぞれ空ベクター（ＥＶ）対照を形質導入したＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞を示す。ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ及びＮＫＬ−ＣＳ１−ＣＡＲはそれぞれＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞のＣＳ１−ＣＡＲ構築物による形質導入を示す。
【図１６Ａ−１６Ｃ】ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞の標的認識向上がＭＭ細胞上のＣＳ１発現に依存することを示す。図１６Ａは、ＣＳ１を過剰発現するＵ２６６細胞（Ｕ２６６−ＣＳ１、太い実線）または空ベクター対照のＵ２６６細胞（Ｕ２６６−ベクター、薄い実線）の表面上のＣＳ１タンパク質またはＩｇＧ対照（点線）に関するフローサイトメトリー染色を示す。図１６Ｂは、Ｕ２６６−ベクター細胞及びＵ２６６−ＣＳ１細胞に対するモック形質導入ＮＫ−９２細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞（それぞれＮＫ−９２−ＥＶ及びＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ）の細胞傷害性を示す。Ｕ２６６−ベクター細胞またはＵ２６６−ＣＳ１細胞をＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞またはＮＫ−９２−ＥＶ細胞と異なるエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で４時間インキュベートした。特異的溶解を標準５１Ｃｒ放出アッセイを用いて特定した。＊はＰ＜０．０５を示す。（ｃ）ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞またはＮＫ−９２−ＥＶ細胞を同数のＵ２６６−ベクター骨髄腫細胞またはＵ２６６−ＣＳ１骨髄腫細胞と２４時間共培養した。次に、ＥＬＩＳＡを用いたＩＦＮ−γ分泌の測定のために、上清を回収した。
【図１７Ａ−１７Ｃ】ＣＳ１−ＣＡＲ改変ＮＫ細胞の表現型の特徴を示す。図１７Ａにおいて、モック形質導入ＮＫ−９２細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞（それぞれＮＫ−９２−ＥＶ及びＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ）を４時間、単独培養するか、ＩＭ９ＭＭ細胞と培養した。ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を、対応するｍＡｂで染色後、フローサイトメトリーによって評価し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。＊はＰ＜０．０５を示す。図１７Ｂにおいて、ＮＫ−９２−ＥＶ細胞及びＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞を透過処理し、パーフォリンまたはグランザイムＢに特異的なｍＡｂによって細胞内染色し、フローサイトメトリーにより分析した。点線は、対照ＩｇＧ抗体によるＮＫ−９２−ＥＶ対照細胞の染色を示し、太い実線はパーフォリン抗体またはグランザイムＢ抗体のいずれかによるＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞の染色を表し、薄い実線はパーフォリン抗体またはグランザイムＢ抗体のいずれかによるＮＫ−９２−ＥＶ対照細胞の染色を示す。図１７Ｃは、図１７Ｂに示すヒストグラムのＭＦＩを示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図１８Ａ−１８Ｃ】ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞が初代ヒト骨髄腫細胞の殺傷を促進することを示す。図１８Ａは、ＣＳ１タンパク質またはＩｇＧアイソタイプ対照のフローサイトメトリー染色を示す。ＣＤ１３８＋初代骨髄腫細胞がＣＳ１を高発現していることが示されている。白抜きのヒストグラムと塗りつぶされたヒストグラムは、それぞれアイソタイプ適合対照抗体及び抗ＣＳ１抗体による染色を表す。示したデータは、類似の結果を有する６つの患者試料のうちの代表的な２つである。図１８Ｂは、標準５１Ｃｒ放出アッセイを用いた、類似の結果を有する６名の患者のうち３名のＣＤ１３８＋初代骨髄腫細胞に対するモック形質導入ＮＫ−９２細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞（それぞれＮＫ−９２−ＥＶ及びＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ）の細胞傷害活性を示す。Ｅ／Ｔは、エフェクター細胞／標的細胞の比を示す。＊はＰ＜０．０５を示す。図１８Ｃは、ＮＫ−９２−ＥＶ細胞またはＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞とＥ／Ｔ比５：１で２４時間共培養したＣＤ１３８＋初代骨髄腫細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す。示したデータは、類似の結果を有する３つの患者試料のうちの代表的な１つである。
【図１９Ａ−１９Ｄ】ＣＳ１−ＣＡＲ  ＮＫ細胞が、同所性ヒトＭＭ細胞のインビボ成長を抑制し、ＭＭ保有マウスの生存を延ばすことを示す。図１９Ａ（左）は、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって検出した、ＩＭ９細胞のｉ．ｖ．注入後に後肢麻痺を呈した代表マウス１匹の腰椎骨病変におけるヒトＩＭ９細胞の広範な浸潤を示す画像である。図１９Ａ（右）は、抗ヒトＣＤ１３８  ｍＡｂによるマウス腰椎骨病変の免疫組織化学染色を示す。図１９Ｂは、ＩＭ９腫瘍マウスの背面の生物発光イメージングを示す。ＮＳＧマウスに５×１０５個のルシフェラーゼ発現ＩＭ９細胞を尾静脈注入を介して播種した（０日）。接種から７日後、モック形質導入ＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２−ＥＶ）、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞（ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ）またはリン酸塩‐緩衝生理食塩水（陰性対照）でマウスを処置した。図１９Ｃは、図１９Ｂのマウス１匹当たり１秒当たりフォトン単位の定量化概要を示す棒グラフである。＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を表す。図１９Ｄは、ＮＫ−９２−ＥＶ細胞で処置したマウスと比較した、ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞で処置したＩＭ９保有マウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図２０】ＣＳ１  ＣＡＲの導入がＮＫ細胞株における実質的なアポトーシスにつながらないことを示す。モックまたはＣＳ１−ＣＡＲを形質導入したＮＫ９２細胞またはＮＫＬ細胞を７ＡＡＤ及びアネキシンＶ−Ｖ４５０で染色し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。ＮＫ−９２−ＥＶ及びＮＫＬ−ＥＶはそれぞれ空ベクター（ＥＶ）対照を形質導入したＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞を示す。ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ及びＮＫＬ−ＣＳ１−ＣＡＲはそれぞれＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞のＣＳ１−ＣＡＲ構築物による形質導入を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を特異的に認識することができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書にて開示される。また、これらのＣＡＲを発現するように遺伝子操作したＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞も開示される。したがって、本開示のＣＳ１特異的ＣＡＲを発現するように遺伝子操作した本開示の免疫エフェクター細胞の養子移入を含む、ＭＭを有する対象に抗腫瘍免疫をもたらすための方法もまた開示される。
【００１１】
ＣＳ１特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
【００１２】
ＣＡＲは、一般に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来する抗原認識ドメインを、リンパ球活性化に関係する膜貫通シグナル伝達モチーフとともに組み込むものである（Ｓａｄｅｌａｉｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３  ３：３５−４５）。細胞表面糖タンパク質であるＣＳ１は、骨髄腫細胞の表面に多量かつ偏在的に発現する（Ｈｓｉ  ＥＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  １４：２７７５−８４）。ＣＳ１は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞の一部の亜集団及び正常Ｂ細胞を含む免疫エフェクター細胞の大部分において発現量が極めて低く、骨髄細胞上ではほとんど検出されない（Ｈｓｉ  ＥＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  １４：２７７５−８４）。とりわけ、ＣＳ１は、ヒト造血幹細胞においてほとんど発現しないため（Ｈｓｉ  ＥＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  １４：２７７５−８４）、ＣＳ１を幹細胞移植に使用してＭＭを含む血液系腫瘍を治療することができる。ＭＭにおけるＣＳ１の機能は未だ完全に理解されていないが、ＣＳ１が骨髄腫細胞の接着、クローン成長及び腫瘍形成性の一因である可能性が実証されている（Ｂｅｎｓｏｎ  ＤＭ  Ｊｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２  ３０：２０１３−５；Ｔａｉ  ＹＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００９  １１３：４３０９−１８）。ヒト化ｍＡｂのエロツズマブを用いたＣＳ１の標的化は、臨床で安全であることが実証されている（Ｂｅｎｓｏｎ  ＤＭ  Ｊｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２  ３０：２０１３−５；Ｔａｉ  ＹＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００９  １１３：４３０９−１８）。前臨床試験では、この抗体が、骨髄腫細胞の骨髄間質細胞への接着を阻害し、ＮＫ細胞を介した抗体依存性細胞傷害を誘導し、ヒト骨髄腫細胞によって惹起された免疫不全マウスの異種移植腫瘍を根絶させることが示されている（Ｂｅｎｓｏｎ  ＤＭ  Ｊｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２  ３０：２０１３−５；Ｔａｉ  ＹＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００９  １１３：４３０９−１８；Ｔａｉ  ＹＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８  １１２：１３２９−３７）。したがって、免疫エフェクター細胞上で発現し、ヒト多発性骨髄腫に対する抗腫瘍活性を高めることができるＣＳ１特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が本明細書にて開示される。
【００１３】
本開示のＣＡＲは、概して、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの３つのドメインからなる。細胞外ドメインは、ＣＳ１結合領域を含み、抗原認識を担う。また、通常、ＣＡＲがグリコシル化され、免疫エフェクター細胞の細胞膜に固定されるように、シグナルペプチド（ＳＰ）を含む。細胞によって発現された膜貫通ドメイン（ＴＤ）は、その名称が示唆するように、細胞外ドメインを細胞内ドメインに連結するものであり、細胞膜内に存在する。細胞内ドメインは、抗原認識後、免疫エフェクター細胞に活性化シグナルを伝達するＣＡＲの機能部分である。たとえば、細胞内ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）と、任意で共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）を含み得る。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲは、次の式：
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ；または
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＩＳＤ−ＣＳＲ
（式中、「ＳＰ」は、シグナルペプチドを表し、
「ＣＳ１」は、ＣＳ１結合領域を表し、
「ＨＧ」は、任意のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、二価のリンカーを表す）
で定義される。
【００１５】
本開示のＣＡＲの抗原認識ドメインは、通常、ｓｃＦｖである。しかしながら、多くの代替が存在する。単純な細胞外ドメイン（たとえば、ＨＩＶ感染細胞を認識するためのＣＤ４細胞外ドメイン）及び連鎖的サイトカインなどの外来性認識要素（サイトカイン受容体を有する細胞の認識を導くもの）を有する、天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータの単鎖に由来する抗原認識ドメインが記載されている。実際、所与の標的に高親和性をもって結合するものであれば、ほぼどんなものでも抗原認識領域に用いることができる。
【００１６】
細胞内ドメインは、抗原認識（すなわちＣＳ１）後にシグナルを免疫エフェクター細胞に伝達するＣＡＲの機能部分であり、免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つを活性化させる。Ｔ細胞のエフェクター機能は、たとえば、細胞溶解活性またはサイトカイン分泌などのヘルパー活性であり得る。したがって、細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び任意の補助受容体の「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含み得る。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、全鎖を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分を用いる場合には、当該短縮部分がエフェクター機能シグナルを伝達するのであれば、そのような短縮部分を完全な鎖の代わりに用いることができる。
【００１７】
ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節し、刺激をもたらすように作用する細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例は、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものを含む。しかしながら、好ましい実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）由来である。
【００１８】
Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖は、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖またはＣＤ２４７（表面抗原分子分類２４７）としても知られており、ヒトにおいては、ＣＤ２４７遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【００１９】
第一世代ＣＡＲは、典型的に、内因性ＴＣＲの主要なシグナル伝達分子であるＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインを有していた。第二世代ＣＡＲは、種々の共刺激タンパク質受容体（たとえば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）由来の細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの細胞内ドメインに付加したものであり、Ｔ細胞へのさらなるシグナルを供給する。前臨床試験では、第二世代ＣＡＲの設計がＴ細胞の抗腫瘍活性を改善することが示されている。より最近の第三世代ＣＡＲは、複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせて、さらに効力が増している。これらのＣＡＲを導入したＴ細胞は、共刺激受容体／リガンド相互作用に依存しない、増大、活性化、持続性及び腫瘍根絶効率の改善が実証されている（Ｉｍａｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００４  １８：６７６−８４；Ｍａｈｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２  ２０：７０−５）。
【００２０】
たとえば、本ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを単独で含むように、または本発明のＣＡＲに関連して有用な任意の他の望ましい細胞質ドメインと組み合わせて含むように設計することができる。たとえば、本ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部と、共刺激シグナル領域を含み得る。共刺激シグナル領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子であり、抗原に対するリンパ球の有効な反応に必要である。このような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。したがって、本ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達要素としてＣＤ２８を有するものを主に例示するが、他の共刺激要素を単独で用いることもできるし、他の共刺激シグナル伝達要素と組み合わせてもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本ＣＡＲはヒンジ配列を含む。ヒンジ配列は、抗体の柔軟性を高めるアミノ酸の短い配列である（たとえば、Ｗｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４（２）：８９−９９（２００４）を参照）。ヒンジ配列は、抗原認識部分（たとえば、抗ＣＳ１  ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジ配列は、任意の好適な分子に由来するかまたは得られる任意の好適な配列であってよい。いくつかの実施形態において、たとえば、ヒンジ配列は、ＣＤ８ａ分子またはＣＤ２８分子に由来する。
【００２２】
膜貫通ドメインは、天然源由来または合成源由来のいずれであってもよい。天然源である場合、当該ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。たとえば、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域を含む）。あるいは、合成の膜貫通ドメインであってもよく、この場合、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含む。場合により、合成膜貫通ドメインの各末端にフェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが存在する。長さが２〜１０個のアミノ酸などの短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーにより、本ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内ドメインの間の連結を形成することができる。
【００２３】
二価のリンカーは、化合物または核酸をポリヌクレオチド配列に連結するのに好適な任意の分子であってよい。ポリヌクレオチドなどの生体分子を結合させるための方法及び組成物は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００８）に開示されており、これらの技術の教示に関して、その全体を参照により組み込む。場合により、二価リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸を含む。しかしながら、本開示のドメインに直接連結するペプチド結合も含み得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本開示のＣＳ１特異的ＣＡＲは、ＳＰ、ＣＳ１、ＨＧ、ＴＭ、ＣＳＲ、ＩＳＤ及び／もしくは表１に記載するリンカー要素、または表１に記載の配列に対して少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するこれらの変異体のうち１つまたは複数を含む。
【表１−１】
2019146579.tif 000002
【表１−２】
2019146579.tif 000003
【表１−３】
2019146579.tif 000004
【表１−４】
2019146579.tif 000005
【表１−５】
2019146579.tif 000006
【００２５】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＣＳ１特異的ＣＡＲは、アミノ酸配列番号１（以下に示す）、または配列番号２８に対して少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するこれらの変異体を含む。
【００２６】
ＣＳ１−ＣＤ２８−ＣＤ３Ｚ構築物：
ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＴＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＴＭＩＡＴＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＱＫＳＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＩＴＧＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＮＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＤＰＫＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２８）。
【００２７】
核酸及びベクター
【００２８】
本開示の免疫エフェクター細胞にて本開示のＣＳ１特異的ＣＡＲを発現させる本ＣＳ１特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドベクターもまた開示される。
【００２９】
たとえば、いくつかの実施形態では、本開示のＣＳ１特異的ＣＡＲは、核酸配列番号２８（以下に示す）、または配列番号２９に対して少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するこれらの変異体によってコードされる。
【００３０】
ＰＣＤＨ−ＣＳ１−ｓｃＦｖ−ｍｙｃタグ−ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータ（ＰＣＤＨ−ＣＳ１−ＣＡＲ）構築物：
【００３１】
ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＡＴＧＡＴＴＣＡＴＣＣＴＴＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡＣＴＡＧＧＴＴＡＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＴＧＡＴＴＧＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＴＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＡＣＣＧＧＴＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＡＡ（配列番号２９）。
【００３２】
本開示のＣＡＲをコードする核酸配列及びその領域は、当該技術分野において知られている組換え法、たとえば、標準的な技法を用いて、当該遺伝子を発現している細胞に由来するライブラリーをスクリーニングすること、その遺伝子を含むことがわかっているベクターから当該遺伝子を誘導すること、またはその遺伝子を含む細胞及び組織から直接単離することなどを使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子をクローニングではなく合成によって作製することもできる。
【００３３】
ＣＡＲをコードする核酸の発現は、通常、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸をプロモーターに機能的に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を調節するのに有用な転写及び翻訳のターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含む。
【００３４】
本開示の核酸は、多数の種類のベクターにクローニングすることができる。たとえば、本核酸を、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドなどのベクターにクローニングすることができる。特に利点のあるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター及びシークエンシングベクターが含まれる。
【００３５】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に付与されてもよい。ウイルスベクターの技術は、当該技術分野においてよく知られており、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物における機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つまたは複数の選択マーカーを含有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。
【００３６】
多数のウイルスに基づいた系が哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されている。たとえば、レトロウイルスは、遺伝子送達系の簡便なプラットフォームを提供する。当該技術分野において知られている技術を用いて、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージすることができる。次に、組換えウイルスを単離し、対象の細胞にインビボまたはエクスビボのいずれかで送達することができる。
【００３７】
好適なプロモーターの一例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、当該配列と機能的に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の発現を高レベルでもたらすことができる強力な構成性プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長因子１α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、他の構成性プロモーター配列も使用することができ、限定するものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルス）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、たとえば、限定するものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターなどが含まれる。あるいは、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
その他のプロモーター要素、たとえばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。通常、これらの要素は、開始部位から３０〜１１０ｂｐの上流領域に位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流にも機能的要素を含むことが最近示されている。プロモーター要素間の間隔は、多くの場合柔軟性があり、要素が互いに逆転または移動しても、プロモーター機能は保持される。
【００３９】
ＣＡＲポリペプチドまたはその部分の発現を評価する目的で、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させる細胞集団からの発現細胞の特定及び選択を容易にするために、細胞に導入される発現ベクターには、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはその両方を含めることもできる。他の態様では、選択マーカーをＤＮＡの別個の小片上に保有させ、同時トランスフェクション手順に用いることもできる。選択マーカー遺伝子とレポーター遺伝子の両方を適切な調節配列に隣接させて、宿主細胞中での発現を可能にするようにすることができる。有用な選択マーカーには、たとえば、抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【００４０】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞の特定、及び調節配列の機能を評価するために用いられる。一般に、レポーター遺伝子は、受容体生物またはその組織中に存在しないか、発現されない遺伝子であり、その発現がある程度簡単に検出できる特性、たとえば酵素活性によって顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、受容体細胞にＤＮＡが導入された後の適切な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子または緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれ得る。好適な発現系はよく知られており、既知の手法を用いて調製してもよいし、商業的に入手してもよい。一般に、最も高レベルのレポーター遺伝子発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物がプロモーターとして特定される。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、これを用いて作用要素のプロモーターによる転写調節能を評価することができる。
【００４１】
遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は、当該技術分野にて知られている。発現ベクターに関して、当該ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、たとえば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫の細胞に容易に導入することができる。たとえば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって、宿主細胞に移入することができる。
【００４２】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当該技術分野においてよく知られている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００４３】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡベクター及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、たとえばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。
【００４４】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達担体として用いるための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜ベシクル）である。
【００４５】
非ウイルス性送達系を利用する場合、例示的な送達担体はリポソームである。別の態様では、核酸を脂質と会合させてもよい。脂質に会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入すること、リポソームの脂質二重膜内に挿入すること、リポソームとオリゴ核酸の両方と会合する連結分子を介してリポソームに付着させること、リポソーム内に捕捉すること、リポソームと複合体を形成すること、脂質を含有する溶液中に分散させること、脂質と混合すること、脂質と組み合わせること、脂質内に懸濁物として含むこと、ミセルとともに含有させるか、複合体を形成させること、または別の方法で脂質と会合させることができる。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターの会合組成物は、溶液中のいかなる特定の粒子構造にも限定されない。たとえば、二重膜構造で、ミセルとして、または「崩壊」構造を有して存在し得る。また、溶液中に単に散在していてもよく、大きさも形状も均一でないアグリゲートを場合によって形成する。脂質とは、天然脂質または合成脂質であってよい脂肪性物質のことである。たとえば、脂質には、細胞質内で天然に生じる脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する化合物類が含まれる。使用に適した脂質は、民間の供給元から得ることができる。たとえば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から入手でき、ジセチルホスファート（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から入手でき、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手でき、ジミリスチルホスファチジルグリセロールは（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から入手することができる。
【００４６】
免疫エフェクター細胞
【００４７】
本開示のＣＡＲを発現するように遺伝子操作した免疫エフェクター細胞もまた開示される。これらの細胞は、好ましくは、治療を受ける対象から取得される（すなわち、自己由来である）。しかしながら、いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞株またはドナーのエフェクター細胞（同種異系）が用いられる。免疫エフェクター細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。免疫エフェクター細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に知られている任意の様々な技術を用いて、対象から採取した血液から得ることができる。たとえば、個体の循環血液に由来する細胞をアフェレシスによって取得してよい。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、赤血球細胞を溶解し、単球を枯渇させることによって、たとえば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）密度勾配による遠心分離または対向流遠心溶出法によって、末梢血リンパ球から単離される。免疫エフェクター細胞の特定の部分集団を、陽性選択法または陰性選択法によって、さらに単離することができる。たとえば、陽性選択細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて、たとえば、所望の免疫エフェクター細胞の陽性選択に十分な時間、抗体標識ビーズとインキュベーションすることによって、免疫エフェクター細胞を単離することができる。あるいは、陰性選択細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いる陰性選択によって、免疫エフェクター細胞集合を濃縮することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本免疫エフェクター細胞は、感染症及び異物に対する生体防御に関与するあらゆる白血球を含む。たとえば、本免疫エフェクター細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、好中球、好塩基球、好酸球またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。たとえば、本免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含み得る。
【００４９】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別することができる。これらは、胸腺で成熟するためにＴ細胞と呼ばれる（ただし、扁桃腺で成熟するものもある）。Ｔ細胞には、それぞれ異なる機能を持つ複数の亜集団がある。
【００５０】
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、免疫過程において他の白血球を支援し、Ｂ細胞の形質細胞及びメモリーＢ細胞への成熟、ならびに傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化などを行う。これらの細胞は、その表面上にＣＤ４糖タンパク質を発現していることから、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現される、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介したペプチド抗原が提示されると、活性化する。活性化すると、速やかに分化し、能動免疫応答を調節または支援するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌して異なる種類の免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨを含む複数の亜集団の１つに分化することができる。
【００５１】
傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与している。これらの細胞は、その表面でＣＤ８糖タンパク質を発現していることから、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面上に提示されるＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原に結合することによって、標的を認識する。ＣＤ８＋細胞は、ＩＬ−１０、アデノシン及び制御性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を介して、自己免疫疾患を防止するアネルギー状態へと不活性化する。
【００５２】
メモリーＴ細胞は、感染症が治癒した後も長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞の亜集団の１つである。再び同種抗原に曝露すると、迅速に大量のエフェクターＴ細胞に増大し、過去の感染症に対する「記憶」を有する免疫系を提供する。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであってよい。メモリーＴ細胞は、通常、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【００５３】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、以前はサプレッサーＴ細胞として知られており、免疫寛容の維持に極めて重要である。主な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫を遮断して免疫応答を終了に向かわせること、及び胸腺におけるネガティブ選択過程を免れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇには、内在性Ｔｒｅｇ細胞と適応性Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要分類が記載されている。
【００５４】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と混同しないこと）は、適応免疫系と先天性免疫系の橋渡しをする。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を認識する通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子によって提示される糖脂質抗原を認識する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞の混合物を含む。他の実施形態において、Ｔ細胞は、細胞表面発現に基づいて、１つまたは複数の部分集合に濃縮される。たとえば、場合により、Ｔは、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、α鎖及びβ鎖の代わりに１つのγ鎖と１つのδ鎖とを有する別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つγδＴ細胞を含む。
【００５６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−大形顆粒リンパ球であり、ウイルス感染形質転換細胞を殺傷することができ、先天性免疫系の重要な細胞亜集団を構成する（Ｇｏｄｆｒｅｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２０１２  ５３：１６６６−１６７６）。細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は、事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞に対する細胞傷害を開始し、ＭＨＣ−Ｉ陰性細胞も根絶することができる（Ｎａｒｎｉ−Ｍａｎｃｉｎｅｌｌｉ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１  ２３：４２７−４３１）。ＮＫ細胞は、サイトカインストーム（Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１０  １８：８４３−８５１）、腫瘍崩壊症候群（Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１  ３６５：７２５−７３３）及び対標的の腫瘍外効果を回避し得るので、より安全なエフェクター細胞である。ＮＫ細胞が癌細胞の殺し屋としての周知の役割を有しており、ＭＭの進行にはＮＫ細胞の減少が重大であることが広く実証されていたが（Ｇｏｄｆｒｅｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２０１２  ５３：１６６６−１６７６；Ｆａｕｒｉａｔ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００６  ２０：７３２−７３３）、ＮＫ細胞媒介性抗ＭＭ活性を高められ得る手段は、本開示のＣＡＲ以前では、広く検討されてこなかった。
【００５７】
治療方法
【００５８】
本開示のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、ＭＭ細胞に対する抗腫瘍免疫応答を誘発することができる。本開示のＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞によって誘発された抗腫瘍免疫応答は、能動免疫応答でも受動免疫応答でもあり得る。さらに、ＣＡＲにより媒介される免疫応答は、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞がＣＳ１に特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法アプローチの一部となり得る。
【００５９】
キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の養子移入は、有望な抗癌治療である。患者の免疫エフェクター細胞の採取後、その細胞を本開示のＣＳ１特異的ＣＡＲを発現するように遺伝子組み換えし、患者に輸注することができる。
【００６０】
本開示のＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、単独で投与してもよいし、希釈剤と組み合わせて、かつ／またはＩＬ−２、ＩＬ−１５もしくは他のサイトカインなどの他の成分もしくは細胞集団と組み合わせて医薬組成物として投与してもよい。簡潔に述べれば、医薬組成物は、本明細書にて記載される標的細胞集団を、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。当該組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸、酸化防止剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、補助剤（たとえば、水酸化アルミニウム）、ならびに保存剤を含み得る。本開示の方法に使用される組成物は、いくつかの実施形態では、静脈内投与用に製剤化される。医薬組成物は、ＭＭの治療に適した任意の方法で投与され得る。適切な用量は臨床試験によって決定され得るが、投与量及び投与回数は患者の状態及び患者の疾患の重症度などの因子によって決定される。
【００６１】
「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍に有効な量」、「腫瘍抑制に有効な量」または「治療量」が示される場合、本発明の組成物の正確な投与量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、及び状態の個々の相違を考慮して、医師によって決定され得る。一般には、本明細書に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、たとえば１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重など（これらの範囲のすべての整数値を含む）の用量で投与することができると言える。Ｔ細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与することもできる。免疫療法において広く知られている注入技術を用いることによって細胞を投与することができる（たとえば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８参照）。特定の患者に対する最適な用量及び治療レジームは、医学分野の当業者であれば、疾患の徴候について患者を観察し、それに応じて治療を調節することによって、容易に決定することができる。
【００６２】
ある実施形態において、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、その後、再び採血し（またはアフェレシスを行い）、取得したＴ細胞を本発明に従って活性化させ、これらの活性化させ増大させたＴ細胞を患者に再輸注することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に複数回実施することができる。ある実施形態において、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採取血液からＴ細胞を活性化することができる。ある実施形態において、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃまたは１００ｃｃの採取血液からＴ細胞を活性化する。この複数回の採血／複数回の再輸注プロトコールを用いると、Ｔ細胞のある特定の集団の選別に役立ち得る。
【００６３】
本開示の組成物の投与は、注入、輸液または移植を含む任意の簡便な方法で実施することができる。本明細書に記載される組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注入により、または腹腔内に投与することができる。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、皮内注入または皮下注入によって患者に投与される。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、ｉ．ｖ．注入によって投与される。本組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注入してもよい。
【００６４】
ある実施形態において、本開示のＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、限定するものではないが、サリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブ及びレナリドミドを含む、任意の様々な関連治療法とともに（たとえば、その前に、同時にまたはその後に）患者に投与される。さらなる実施形態において、本ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、たとえば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート及びＦＫ５０６、抗体、またはＣＡＭ  ＰＡＴＨなどの他の免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体または他の抗体治療、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び放射線治療と組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態において、本ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法薬、外部ビーム照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを用いるＴ細胞除去療法とともに（たとえば、その前、同時またはその後に）、患者に投与される。別の実施形態において、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、たとえばリツキサンなどのＢ細胞除去治療の後に投与される。たとえば、いくつかの実施形態において、対象は、高用量の化学療法に続いて末梢血幹細胞移植を行う標準治療を受け得る。ある実施形態において、対象は、移植後、本発明の増大させた免疫細胞の輸注を受ける。さらなる実施形態において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。
【００６５】
定義
【００６６】
「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸残基を表す略称、文字、符号または単語の並びを指す。本明細書にて使用するアミノ酸の略称は、従来のアミノ酸に関する１つの文字コードであり、Ａ：アラニン、Ｂ：アスパラギンまたはアスパラギン酸、Ｃ：システイン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｅ：グルタメート、グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイシン、Ｋ：リシン、Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ：アスパラギン、Ｐ：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：トレオニン、Ｖ：バリン、Ｗ：トリプトファン、Ｙ：チロシン、Ｚ：グルタミンまたはグルタミン酸で表される。
【００６７】
「抗体」という用語は、標的抗原に選択的に結合する天然または合成の抗体を指す。この用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を包含する。完全な免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、標的抗原に選択的に結合する、これらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマー、及び免疫グロブリン分子のヒト型またはヒト化型も包含される。
【００６８】
「アプタマー」という用語は、特定の標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子を指す。これらの分子は、一般に、ランダム配列プールから選択される。選択されたアプタマーは、特有の三次構造に適合し、高い親和性及び特異性で標的分子を認識することができる。「核酸アプタマー」は、その立体構造を介して標的分子に結合するＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴ核酸であり、これにより、当該分子の機能を阻害または抑制する。核酸アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの組み合わせによって構成され得る。「ペプチドアプタマー」は、一定のスカフォールドタンパク質内に挿入される可変ペプチド配列との組み合わせタンパク質分子である。ペプチドアプタマーの特定は、通常、ストリンジェントな酵母ツーハイブリッド条件下で実施され、選択されたペプチドアプタマーが細胞内環境下で安定して発現し、正確に折りたたまれる確率が高まる。
【００６９】
「担体」という用語は、ある化合物または組成物と組み合わせたときに、その化合物または組成物の調製、保管、投与、送達、有効性、選択性または任意の他の特徴を、意図する用途または目的のために、助長または容易にする化合物、組成物、物質または構造体を意味する。たとえば、担体は、活性成分のあらゆる劣化を最小限に抑え、対象におけるあらゆる有害な副作用を最小限に抑えるように選択され得る。
【００７０】
「キメラ分子」という用語は、天然状態では別個に存在する２つまたはそれ以上の分子を連結することによって作製された単一分子を指す。単一のキメラ分子は、その構成分子すべての所望の機能性を有する。キメラ分子の１つの種類は、融合タンパク質である。
【００７１】
「融合タンパク質」という用語は、１つのポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成されたペプチド結合を介した２以上のポリペプチドの連結によって形成されるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、構成要素のポリペプチドの化学的結合によって形成することもできるし、単一の連続した融合タンパク質をコードする核酸配列から単一のポリペプチドとして発現させることもできる。単鎖の融合タンパク質は、単一の連続したポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、２つの遺伝子をインフレームで連結して単一の核酸にし、次いで、適切な宿主細胞中で融合タンパク質が産生される条件下にて核酸を発現させる、分子生物学における従来技術を使用して調製することができる。
【００７２】
「同一性」という用語は、２つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性を指す。同一性は、比較のためにアライメントされ得る各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較配列中の位置が同一塩基によって占められている場合、当該分子は、その位置において同一である。核酸配列間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、核酸配列の共有する位置にて、ヌクレオチドが同一である数または一致する数に相関する。２つの配列間の同一性は、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として利用可能であり、たとえばデフォルト設定で使用することができるＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含めた種々のアライメントアルゴリズム及び／またはプログラムを使用して算出することができる。たとえば、本明細書に記載される特定のポリペプチドに対して、少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、好ましくは実質的に同一の機能を呈するポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。特に指示がない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰを用いる場合、類似性の割合はＢＬＡＳＴＰポジティブスコアに基づき、配列同一性の割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、同一である高スコア配列ペア中の合計残基の数及び割合を示し、ＢＬＡＳＴＰ「ポジティブ」は、アライメントスコアが正の値であり、互いに類似している残基の数及び割合を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列に対するこうした程度の同一性もしくは類似性、または任意の中間の程度の同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列が企図され、本開示に包含される。類似ポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝コードを用いて推定され、従来の手段、特に、そのアミノ酸配列を遺伝コードを用いて逆翻訳することによって得ることができる。
【００７３】
「核酸」という用語は、１つのヌクレオチドの３’位と別のヌクレオチドの５’末端がリン酸基により連結した単一のヌクレオチドまたは２つ以上のヌクレオチドを含む天然または合成の分子を指す。核酸は、長さによって限定されないため、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。
【００７４】
「機能的に連結した」という用語は、ある核酸配列と別の核酸配列との機能的関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写部位、翻訳終止部位及び他のシグナル配列が、他の配列に機能的に連結した核酸配列の例である。たとえば、ＤＮＡの転写調節要素への機能的な連結は、当該ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによって、当該ＤＮＡの転写がそのプロモーターから開始されるようなＤＮＡとプロモーターとの物理的及び機能的関係を指す。
【００７５】
「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、１つのアミノ酸のカルボキシル基が別のアミノ酸のアルファアミノ基に連結した２以上のアミノ酸を含む天然または合成の分子を指すために同じ意味で用いられる。
【００７６】
「薬学的に許容可能な」という用語は、適切な医学的良識の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、妥当な利益／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織との接触に使用するのに適した化合物、物質、組成物及び／または剤形を指す。
【００７７】
「タンパク質ドメイン」という用語は、構造的完全性を示すタンパク質の一部、タンパク質の複数の部分、またはタンパク質全体を指す。この決定は、タンパク質の一部、タンパク質の複数の部分またはタンパク質全体のアミノ酸組成物に基づき得る。
【００７８】
「スペーサー」は、本明細書にて使用する場合、融合タンパク質を含有するタンパク質を連結するペプチドを指す。一般に、スペーサーは、タンパク質を連結すること、またはタンパク質間の最小間隔もしくは他の空間関係を保持すること以外の特定の生物活性を有していない。しかしながら、分子の折り畳み、実効電荷または疎水性などの分子のある特性に影響を与えるように、スペーサーの構成アミノ酸を選択することができる。
【００７９】
本明細書にて使用するとき、「特異的に結合する」という用語は、ポリペプチド（抗体を含む）または受容体に関する場合、タンパク質及び他の生物学的製剤の異種集団において、タンパク質またはポリペプチドまたは受容体の存在を決定づける結合反応を指す。したがって、特定のリガンドまたは抗体は、指定条件下（たとえば、抗体の場合のイムノアッセイ条件下）で、その特定の「標的」に「特異的に結合する」（たとえば、抗体は内皮細胞抗原に特異的に結合する）が、試料中に存在する他のタンパク質、またはリガンドもしくは抗体が生物中で接触し得る他のタンパク質に有意な量で結合しない。一般に、第２の分子に「特異的に結合する」第１の分子は、当該第２の分子との親和定数（Ｋａ）が約１０５Ｍ−１よりも大きい（たとえば、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、及び１０１２Ｍ−１以上）。
【００８０】
「特異的に送達する」という用語は、本明細書にて使用する場合、ある分子が、特定の標的分子またはマーカーを有する細胞または組織と優先的に会合し、当該標的分子を欠く細胞または組織には会合しないことを指す。当然のことながら、分子と非標的である細胞または組織との間には、ある程度の非特異的相互作用が生じ得ることが認識される。しかしながら、特異的送達は、標的分子の特異的認識によって媒介されるので、区別することができる。通常、特異的送達により、送達した分子と標的分子を有する細胞との間の会合が、送達した分子と標的分子を欠く細胞との会合よりもはるかに強くなる。
【００８１】
「対象」という用語は、投与または治療の標的となるあらゆる個体を指す。対象は、脊椎動物、たとえば哺乳動物であり得る。したがって、対象は、ヒト患者または獣医学上の患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、たとえば内科医の治療を受けている対象を指す。
【００８２】
「治療的に有効な」という用語は、使用する組成物の量が疾患または障害の１つまたは複数の原因または症状を改善するのに十分な量であることを指す。かかる改善は、低減または変化のみを要し、必ずしも排除を必要としない。
【００８３】
「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、核酸、たとえば発現ベクターを受容細胞に導入することを意味し、核酸を当該細胞の染色体ＤＮＡに導入することを含む。
【００８４】
「治療」という用語は、疾患、病的状態または障害の治癒、改善、安定化または予防を目的にした患者の医療的管理を指す。本用語は、積極的治療、すなわち、疾患、病的状態または障害を改善することに特化した治療を包含し、また、原因治療、すなわち、関連する疾患、病的状態または障害の原因を除去することを対象にした治療も包含する。加えて、本用語は、緩和治療、すなわち、疾患、病的状態または障害の治癒よりも症状の軽減のために設計された治療、予防的治療、すなわち、関連する疾患、病的状態もしくは障害の発症を最小限に抑えること、または部分的もしくは完全に阻害することを対象にした治療、支持治療、すなわち、関連する疾患、病的状態または障害の改善を対象にした別の特定療法を補完するために採用される治療を包含する。
【００８５】
「変異体」という用語は、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換（すなわち、縮重変異体）、アミノ酸をコードする各コドン（すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡ）のゆらぎ位置内の置換、ペプチドのＣ末端に付加されたアミノ酸、または参照配列に対して６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するペプチドを有するアミノ酸配列またはペプチド配列を指す。
【００８６】
「ベクター」という用語は、ベクター配列が連結した別の核酸を、ある細胞中に輸送できる核酸配列を指す。「発現ベクター」という用語は、細胞による発現に好適な形態（たとえば、転写調節要素に連結した形態）で遺伝子構築物を含有する、あらゆるベクター（たとえば、プラスミド、コスミドまたはファージ染色体）を包含する。
【００８７】
本発明の多くの実施形態について説明してきた。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲を逸脱せずに種々の修正を行うことができることは理解されるだろう。したがって、他の実施形態は、以下の請求の範囲内である。
【実施例】
【００８８】
実施例１：ＣＳ１を標的にしたＴ細胞の遺伝子組換えは、骨髄腫細胞の根絶を促進する。
【００８９】
本研究において、ＣＤ２８−ＣＤ３ζシグナル伝達部分を含有するＣＳ１特異的ＣＡＲを発現するようにＴ細胞を操作した。これにより、ＣＳ１に依存して生じるＣＳ１発現骨髄腫細胞に対する応答において、ＣＳ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞がサイトカイン放出及び細胞傷害性の促進をもたらすことが実証された。さらに、同所性ＭＭ異種移植マウスモデルでは、ＣＳ１標的Ｔ細胞がヒト骨髄腫細胞を効率的に根絶し、マウスの生存率を有意に延ばした。総合すると、これらのデータにより、ＣＳ１特異的ＣＡＲを備えたＴ細胞を用いる養子療法が再発性ＭＭに対する有望な戦略であることが示唆される。
【００９０】
材料及び方法
【００９１】
細胞培養
【００９２】
ヒト多発性骨髄腫細胞株ＩＭ９、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ−８２２６を米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から取得し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。２９３Ｔ及びフェニックスパッケージング細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。健常ドナー及び多発性骨髄腫患者から得たヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）密度勾配遠心分離によって単離し、プラスチック接着法によって単球を枯渇させた。ヒト抗ＣＤ１３８ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ及び磁気使用細胞分取（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を製造業者の説明書に従って用いて、患者の骨髄穿刺液から初代ＣＤ１３８＋骨髄腫細胞を陽性選択した。インフォームドコンセントは、オハイオ州立大学治験審査委員会の承認を受けたプロトコールに従って、骨髄腫患者から取得した。
【００９３】
マウス
【００９４】
６〜８週齢のオスのＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ−２Ｒｇａｍｍａ  ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから取得した。ＭＭ疾患進行についてマウスを頻繁に観察し、後肢麻痺、無気力または明らかな体重減少の症状を伴う瀕死状態になったときに屠殺した。すべての動物研究は、オハイオ州立大学動物実験委員会の承認を受けた。
【００９５】
ＣＳ１特異的ＣＡＲレトロウイルス構築物の作製
【００９６】
ハイブリドーマ細胞株Ｌｕｃ９０から抗ＣＳ１ｓｃＦｖを得た。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域のコードドメイン配列を個別に増幅し、リンカーを用いてオーバーラップＰＣＲ反応により再結合した。ＶＨ−リンカー−ＶＬ断片をＣＤ２８−ＣＤ３ζ部分とインフレームになるよう組み合わせた。次に、抗ＣＳ１−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ断片全体をＰｉｎｃｏと呼ばれるレトロウイルスベクター（Ｙｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００６  ２４：５７５−９０；Ｂｅｃｋｎｅｌｌ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５  ２９６：１１５−２３）に連結し、Ｐｉｎｃｏ−ＣＳ１−ＣＡＲ構築物を作製した。
【００９７】
Ｔリンパ球のレトロウイルス形質導入
【００９８】
Ｐｉｎｃｏ構築物またはＰｉｎｃｏ−ＣＳ１−ＣＡＲ構築物と４８時間一過性にトランスフェクトしたフェニックスパッケージング細胞からレトロウイルス上清を先に記載された通り採取した（Ｂｅｃｋｎｅｌｌ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５  ２９６（１−２）：１１５−１２３；Ｙｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００６  ２４（５）：５７５−５９０）。ＰＢＭＣを１０％  ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、ヒトＴ細胞活性剤ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヒト組換えインターロイキン−２（ＩＬ−２、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．）１５０ＩＵ／ｍＬで２日間刺激した。次に、細胞を感染上清液中に再懸濁し、ＲＥＴＲＯＮＥＣＴＩＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をコートした非組織培養処理６ウェルプレートに製造業者のプロトコールに従って加えた。この感染工程を２日目にもう１回繰り返した。次に、細胞を組織培養処置フラスコに移し、１５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で維持した。Ｐｉｎｃｏベクターによってコードされた細胞表面上のＧＦＰマーカーの発現に基づいて、形質導入したＴ細胞をＦＡＣＳＡＲＩＡ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。
【００９９】
フローサイトメトリー分析
【０１００】
細胞上のＣＳ１−ＣＡＲ発現を検出するために、形質導入したＴ細胞を４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳで洗浄し、ビオチン標識ヤギ抗マウス（Ｆａｂ）２ポリクローナル抗体またはアイソタイプコントロールである正常ポリクローナルヤギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とインキュベートした。次に、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）及びＶ４５０標識抗ＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を染色した。骨髄腫細胞の表面上のＣＳ１の発現を特定するために、フィコエリトリン（ＰＥ）標識マウス抗ＣＳ１  ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＡＰＣ標識マウス抗ＣＤ１３８  ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で細胞を染色した。抗体染色をＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いてモニターした。データ分析をＦＬＯＷＪＯソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて実施した。
【０１０１】
免疫ブロット法
【０１０２】
細胞をレムリ緩衝液中で溶解した。溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。この膜を、マウス抗ヒトＣＤ３ζ  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、次にセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体でプローブした。高感度化学発光試薬を用いて、抗体結合を明らかにした（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１０３】
ＣＳ１を安定的に発現するＲＰＭＩ−８２２６細胞の作製
【０１０４】
完全長ヒトＣＳ１コード配列をＩＭ９  ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＰＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ（ＰＣＤＨ，Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と呼ばれるレンチウイルスベクターに挿入して、ＰＣＤＨ−ＣＳ１を得た。レンチウイルスを作製するために、２９３Ｔ細胞をＰＣＤＨ−ＣＳ１プラスミドまたはＰＣＤＨ空ベクタープラスミドと、パッケージングプラスミドｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ及びｐＣＭＶ−ｄｒ９とともにリン酸カルシウムトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてコトランスフェクトした。次に、レンチウイルス上清を回収し、先に公表されたプロトコールを用いてＲＰＭＩ−８２２６細胞を感染させるために使用した（Ｂｅｃｋｎｅｌｌ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５  ２９６（１−２）：１１５−１２３；Ｙｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００６  ２４（５）：５７５−５９０）。
【０１０５】
細胞傷害性アッセイ
【０１０６】
標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを先の記載の通りに実施した（Ｙｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１０  １１５：２７４−８１）。簡潔に述べれば、標的細胞を５１Ｃｒで標識し、９６ウェルＶ底プレートの各ウェルで３７℃にて４時間、様々なエフェクター／標的の比（Ｅ／Ｔ）で、Ｔ細胞と共培養した。上清を回収し、これを液体シンチレーションカクテル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有シンチレーションバイアルに移し、５１Ｃｒの放出をＴＯＰＣＯＵＮＴカウンター（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）上で測定した。完全培地または１％ＳＤＳ中でインキュベートした標的細胞を用いて、５１Ｃｒの自然放出または最大放出を特定した。特異的溶解のパーセンテージを次の標準式を用いて算出した。
１００×（実験放出ｃｐｍ−自然放出ｃｐｍ）／（最大放出ｃｐｍ−自然放出ｃｐｍ）
【０１０７】
サイトカイン放出アッセイ
【０１０８】
標的細胞と同数のエフェクター細胞とを９６ウェルＶ底プレートで３７℃にて２４時間共培養した。細胞を含まない上清を回収し、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍの対応するＥＬＩＳＡキットを製造業者のプロトコールに従って用いて、ＩＦＮ−ｇ及びインターロイキン（ＩＬ）−２の分泌についてＥＬＩＳＡにより評価した。
【０１０９】
ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ
【０１１０】
ＣＤ１０７ａアッセイをいくつかの修正を加えて先の記載の通りに実施した（Ｈｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１３  １２１：４６６３−７１）。簡潔に述べれば、ＭＭ標的細胞（２．５×１０５）と同数のエフェクター細胞とを、９６ウェルＶ底プレートで各ウェル０．２ｍＬで共培養した。対照細胞は、標的細胞なしでインキュベートしたモック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ−形質導入Ｔ細胞のいずれかである。モネンシン１ｍＬ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した抗ＣＤ１０７ａ抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ抗体を加え、３７℃にて４時間インキュベートした。細胞をＰＥ標識ＣＤ６９抗体及びＶ４５０標識ＣＤ３抗体でさらに染色し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
【０１１１】
グランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内染色
【０１１２】
モック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を洗浄し、Ｖ４５０標識抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂで染色した。その後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を固定して透過処理し、ＡＰＣ標識抗グランザイムＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＰＣ標識抗パーフォリン抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはマウスＡＰＣ標識アイソタイプ抗体で標識して、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０１１３】
ＭＭ保有マウスのインビボ処置及び生物発光イメージング
【０１１４】
発光ルシフェラーゼを発現するＰｉｎｃｏ−ｐＧＬ３−ｌｕｃ／ＧＦＰウイルスを用いてＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞及びＩＭ９骨髄腫細胞にレトロウイルス形質導入を行い、ＧＦＰ陽性細胞を前述の方法を用いて分取し、ＭＭ．１Ｓ−ＧＬ３細胞とＩＭ９−ＧＬ３細胞をそれぞれ得た。オスのＮＳＧマウスにＰＢＳ４００μＬ中のＭＭ．１Ｓ−ＧＬ３細胞８×１０６個またはＩＭ９−ＧＬ３細胞５×１０５個を０日に尾静脈を介して静脈内注入し、同所性異種移植ＭＭモデルを確立した。７日、１４日（ＭＭ．１Ｓ）または２１日（ＩＭ−９）目で、ＰＢＳ４００ｍＬ中のエフェクター細胞、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞またはモック形質導入対照細胞１０×１０６個をマウスに尾静脈を介して静脈内投与した。ＭＭ細胞接種から５週間後、マウスにＤルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重；Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を腹腔内注入し、イソフルランで麻酔をかけ、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを備えるＩｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して画像化した。
【０１１５】
統計分析
【０１１６】
正規分布であれば、独立スチューデントｔ検定を用いて、一連のエンドポイントについて２つの独立群を比較した。３つ以上の独立群を比較する場合は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いた。生存データに関しては、カプランマイヤー曲線をプロットし、ログランク検定を用いて比較した。検定はすべて両側検定とした。多重比較については、Ｐ値をボンフェローニ法を用いて調整した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であるとみなす。
【０１１７】
結果
【０１１８】
ＣＳ１特異的ＣＡＲを発現する初代Ｔ細胞の作製
【０１１９】
抗ＣＳ１  ｓｃＦｖ、ＣＤ８分子のヒンジ領域及び膜貫通領域、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達部分、ならびにＣＤ３ζ分子の細胞質構成要素からなる、ＣＳ１特異的ＣＡＲ（Ｐｉｎｃｏ−ＣＳ１−ＣＡＲ）をコードするＰｉｎｃｏレトロウイルスベクターを構築した（図１Ａ）。健常ドナー由来の抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体活性化初代Ｔ細胞にＣＳ１−ＣＡＲまたは空ベクター（モック）をコードするレトロウイルス粒子を用いて形質導入し、レトロウイルス構築物によってコードされたＧＦＰの発現について分取した。ＣＳ１−ＣＡＲが問題なく導入されたかどうかを特定するために、分取細胞を溶解し、抗ＣＤ３ζ  ｍＡｂを用いて免疫ブロット法にかけた。図１Ｂに示すように、内因性ＣＤ３ζタンパク質のみ発現したモック形質導入Ｔ細胞とは対照的に、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、天然ＣＤ３ζに加えて、キメラＣＳ１−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ融合タンパク質を予想した大きさで発現した。ＣＳ１−ＣＡＲの細胞表面上の発現は、形質導入Ｔ細胞を、抗ＣＳ１のｓｃＦｖ部分を認識するヤギ抗マウスＦａｂ抗体を用いて染色することによって明らかにしたところ、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の７０．３％にｓｃＦＶの発現が検出されたのに対し、モック形質導入Ｔ細胞上の発現はほとんど検出されなかった（図１Ｃ）。
【０１２０】
ＣＳ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＣＳ１＋骨髄腫細胞株の認識
【０１２１】
ＣＳ１の表面発現を、一般に用いられる４つの骨髄腫細胞株であるＮＣＩ−Ｈ９２９、ＩＭ９、ＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ−８２２６でフローサイトメトリーにより評価し、これにより、ＣＳ１タンパク質の発現がこれらの細胞株で一様でなく、ＲＰＭＩ−８２２６細胞のＣＳ１発現が最小であり、ＲＰＭＩ−８２２６細胞よりもＮＣＩ−Ｈ９２９、ＩＭ９及びＭＭ．１Ｓの各細胞における発現のほうがはるかに高いことがわかった（図２Ａ）。陰性対照に関して、形質転換したヒト腎臓細胞株である２９３Ｔ細胞はＣＳ１をその表面に発現しなかった（図７Ａ）。ＣＳ１を内因的に発現した骨髄腫細胞の認識に関するＣＳ１−ＣＡＲＴ細胞の機能を特定するために、各骨髄腫細胞株の存在下または非存在下で、モック形質導入Ｔ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞から得た上清におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。モック形質導入Ｔ細胞及びＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、それぞれ単独では、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２をごく少量しか産出しなかったが（図２Ｂ及びＣ）、ＣＳ１を高発現するＮＣＩ−Ｈ９２９細胞及びＩＭ９細胞に曝露すると、有意に大きい量のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の各タンパク質がＣＳ１−ＣＡＲＴ細胞によって分泌された一方で、モックＴ細胞では分泌されなかった。また、ＣＳ１を高発現するＭＭ．１Ｓ細胞に応答して、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞がモック形質導入Ｔ細胞よりも多くの量のＩＦＮ−γを産出したのに対して（図２Ｂ）、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、理由はわからないが、この細胞株による、モック形質導入Ｔ細胞よりも多量のＩＬ−２の分泌を誘発しなかった（図２Ｃ）。加えて、対応するモック形質導入Ｔ細胞の亜群と比較すると、ＣＤ４＋（ＣＤ８−）及びＣＤ８＋ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方がＮＣＩ−Ｈ９２９細胞またはＭＭ．１Ｓ細胞に応答したＩＦＮ−ｇの分泌増加を示した（図８Ａ）。ＣＳ１発現の極めて低いＲＰＭＩ−８２２６細胞については、モック形質導入Ｔ細胞及びＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の両方でＩＦＮ−ｇ及びＩＬ−２の産生がバックグラウンドに匹敵するほど少量であった。（図２Ｂ及びＣ）。これらの結果は、モック形質導入Ｔ細胞と比較して、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞が内因性ＣＳ１発現の高いＭＭ細胞をより特異的に認識することができ、これらのＭＭ細胞を認識した後、より活性化することを示唆している。
【０１２２】
ＣＳ１特異的ＣＡＲによって誘発された骨髄腫細胞に対するインビトロ細胞傷害能
【０１２３】
ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＣＳ１＋骨髄腫細胞の認識向上がより効果的な腫瘍細胞の溶解をもたらすことができるかどうかを特定するために、標準４時間クロム５１放出アッセイを実施した。ＣＳ１を高発現するＮＣＩ−Ｈ９２９、ＩＭ９及びＭＭ．１Ｓの各細胞は、２０：１というＥ／Ｔ比の高さでも、モック形質導入Ｔ細胞を介した殺傷に耐性があったが、これらの細胞は、試験したすべてのＥ：Ｔ比で、ＣＳ１−ＣＡＲＴ細胞によって効果的に溶解された（図３Ａの左３つ）。しかしながら、モック形質導入Ｔ細胞と比較すると、ＣＳ１の発現量が低いＲＰＭＩ−８２２６細胞の細胞溶解活性は、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞との共培養後、わずかに増大しただけであった（図３Ａの右１つ）。Ｔ細胞の脱顆粒及び活性化について、モック形質導入Ｔ細胞及びＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ及びＣＤ６９の発現を、前述のように、サイトカイン放出及び細胞溶解活性に関してＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞における強い反応を誘発させたＮＣＩ−Ｈ９２９骨髄腫細胞と共にまたは含めずにインキュベーションした後に評価することによってさらに特定した。サイトカイン放出及び細胞溶解活性に関する前述のデータと一致して、モックＴ細胞よりもＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞において、可動性ＣＤ１０７ａ及び活性化マーカーであるＣＤ６９の同時表面発現の上方制御によって裏付けされる、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞に応答したより多くの脱顆粒及び活性化が生じた（図３Ｂ）。
【０１２４】
さらに、対応するモック形質導入Ｔ細胞の亜群と比較すると、ＣＤ４＋（ＣＤ８−）ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ８＋ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方が、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞またはＭＭ．１Ｓ細胞によって刺激した場合、脱顆粒の増加を呈した（図８Ｂ）。加えて、細胞内染色法を用いると、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、モック形質導入Ｔ細胞と比較して、標的細胞の不存在下であっても、有意に高い量のグランザイムＢを発現したがパーフォリンは発現しなかった（図３Ｃ及びＤ）。これは、主にグランザイムＢがＣＳ１標的Ｔ細胞の細胞溶解活性をもたらすことに関与している可能性を示唆している。この結果は複合ＣＤ２８−ＣＤ３ζシグナル伝達部分を含む癌胎児性抗原特異性ＣＡＲを移植したＴ細胞が、未改変Ｔ細胞と比較して、グランザイムＢの上昇をもたらしたとする過去の報告と一致するものである（Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７  ６７：２２６５−７３）。
【０１２５】
標的細胞におけるＣＳ１の強制過剰発現は、ＣＳ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞による認識及び殺傷を向上させる。
【０１２６】
ＣＳ１を高発現する骨髄腫細胞によって刺激した場合のＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン放出及び細胞傷害活性に関する著しい強力な反応は、ＣＳ１発現が内因的に低い骨髄腫細胞におけるＣＳ１の異所発現がサイトカイン放出及び細胞溶解の増加を誘発し得るかどうかという調査を促すものであった。この目的のために、内因性ＣＳ１発現量の低いＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫細胞にヒトＣＳ１またはモック形質導入対照としてＰＣＤＨ空ベクターをコードするレンチウイルスを用いて形質導入した。形質導入効率をレンチウイルスによってコードされたＧＦＰタンパク質の検出によってモニターしたところ、フローサイトメトリー分析によるＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは９０％超であった。形質導入細胞の表面をＰＥ標識抗ＣＳ１抗体で染色することによって、ＣＳ１の過剰発現を確認した（図４Ａ）。クロム５１放出アッセイでは、強制ＣＳ１発現により、ＲＰＭＩ−８２２６細胞がＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞による溶解を受けやすくなる程度がモック形質導入Ｔ細胞とは対照的に認識できるほど増大することが示された（図４Ｂ）。次に、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２の産生をＥＬＩＳＡによって評価した場合、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、モック形質導入Ｔ細胞と比較すると、ＣＳ１を過剰発現するＲＰＭＩ−８２２６細胞に反応して、有意に高い量のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２を産生した。一方、ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞を空ベクター改変ＲＰＭＩ−８２２６細胞と共培養した場合では、ＩＦＮ−γ分泌の増加はごく普通であり、ＩＬ−２分泌に変化はなかった（図４Ｃ及びＤ）。同様に、形質転換細胞株であるＣＳ１−２９３ＴにおけるＣＳ１の過剰発現でも、ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカイン放出及び細胞溶解の上昇が誘発された（図７Ｂ〜７Ｄ）。これは、他の腫瘍抗原を標的にするＣＡＲ  Ｔ細胞に関する他の報告と一致する（Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓ  ２０１３  １６：１２３−３１；Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１０  １２０：３９５３−６８）。これらの結果により、ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的細胞の認識及び殺傷の増加がＣＳ１依存的に生じたことが裏付けられた。
【０１２７】
自己由来性ＣＳ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞による初代骨髄腫細胞の認識及び殺傷の改善
【０１２８】
より臨床的な関連においてＣＳ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の作用を検討するために、ＣＳ１−ＣＡＲを形質導入した自己由来性Ｔ細胞が、骨髄腫を有する患者から新しく単離した腫瘍細胞を効果的に認識し、殺傷できるかどうかを調査した。健常ドナー由来のＴ細胞と同様に、再発性骨髄腫を有する患者のＴ細胞が良好に増大し、レトロウイルス感染によるＣＳ１−ＣＡＲを発現するように操作したところ、フローサイトメトリーで特定したＴ細胞の６０．７％が抗マウスＦａｂ及び抗ヒトＣＤ３抗体による陽性染色を示した（図５Ａ）。患者由来の初代ＣＤ１３８＋骨髄腫細胞を陽性磁気選択を用いて単離し、フローサイトメトリーを用いて初代骨髄腫細胞のＣＳ１の表面発現が一様に陽性であることを観察した（図５Ｂ）。クロム５１放出アッセイによって、患者由来骨髄腫細胞が、自己由来性モック形質導入Ｔ細胞による溶解に高い耐性がある一方で、自己由来性ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞からは、低い（２．５：１）（Ｅ／Ｔ）比であっても、影響を受けることが認められた（図５Ｃ）。細胞傷害性のこれらの結果と一致して、自己由来性ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、自己由来性モック形質導入Ｔ細胞と比較すると、骨髄腫細胞に反応して、有意に高い量のＩＦＮ−γを産生した（図５Ｄ）。これらの結果は、ＣＳ１−ＣＡＲを備えるＴ細胞が骨髄腫細胞を自己由来性環境のエクスビボで効果的に認識し根絶することができることを裏付けるものである。
【０１２９】
ＣＳ１標的Ｔ細胞は、同所性異種移植骨髄腫モデルにおけるインビボ腫瘍成長を抑制し、腫瘍マウスの生存を延ばす。
【０１３０】
ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療可能性をＭＭ．１Ｓ移植ＮＳＧマウスモデルで評価した。ＭＭ．１Ｓ細胞の静脈内注入は、骨髄及び骨への移植が可能なため、ヒトＭＭを近似的に再現する多病巣性骨病変の安定した確立と同じく、ＭＭのマウス異種移植モデルを確立するために広く用いられている（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ  ＣＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００４  ５：２２１−３０；Ｒｕｎｎｅｌｓ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ  ２０１１  １６：０１１００６）。腫瘍成長のモニタリングを容易にするため、ＭＭ．１Ｓ細胞をレトロウイルス感染によりＧＦＰと発光ルシフェラーゼの両方を発現するように遺伝子操作し、ＧＦＰ＋細胞を分取し、腫瘍成長を引き起こすためにＮＳＧマウスに静脈移植した。次に、これらのマウスにモック形質導入Ｔ細胞、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞またはＰＢＳを静脈注入した。過去の報告と一致して（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ  ＣＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００４  ５：２２１−３０；Ｒｕｎｎｅｌｓ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ  ２０１１  １６：０１１００６）、ＩＶＩＳを用いた生物発光イメージングでは、ＰＢＳ処置群のＭＭ．１Ｓ保有ＮＳＧマウスが頭骨、椎骨、骨盤及び大腿骨に播種性腫瘍病変を発症し（図６Ａ）、マウスの大部分が腫瘍細胞接種から５週間後に後肢麻痺を呈した。ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入により、生物発光イメージングによって決定された通り、腫瘍量が顕著に減少し、ＭＭ．１Ｓ保有ＮＳＧマウスの全体的な生存が伸びたのに対して、モック感染Ｔ細胞の注入では、効果的な腫瘍根絶もマウスの生存改善ももたらされなかった（図６Ａ及びＢ）。
【０１３１】
ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ抗ＭＭ能力をさらに確認するために、ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の効果をＩＭ９移植ＮＳＧマウスモデルを用いて評価した。ＭＭ．１Ｓを用いて示されたデータと同様のデータが認められた。生物発光イメージングにより、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を注入すると、ＩＭ９保有マウスで確立された腫瘍を効果的に根絶できたのに対し、モック形質導入Ｔ細胞の注入では、腫瘍量が減少しなかったことが示された（図９Ａ）。最初の処置から４４日後、ＣＳ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入を受けたＩＭ９保有マウスでは１００％の生存率が認められたのに対し、モックＴ細胞及びＰＢＳを受けた対照マウスではそれぞれ生存率がたったの２８．６％及び１６．７％であった（図９Ｂ）。
【０１３２】
実施例２：ＣＳ１特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で遺伝子操作したナチュラルキラー細胞は、ヒト多発性骨髄腫に対する抗腫瘍活性をインビトロ及びインビボで向上させる。
【０１３３】
本研究では、ＣＳ１特異的であり、ＣＤ２８−ＣＤ３ζ共刺激シグナル伝達ドメインを組み込んだＣＡＲを発現するようにヒトＮＫ細胞を遺伝子操作した。これらの細胞の抗ＭＭ作用をインビトロ及びＭＭのインビボ同所性異種移植マウスモデルで評価した。この結果から、ＣＳ１−ＣＡＲの発現により、インビトロとインビボの両方で、ＣＳ１発現ＭＭ細胞を特異的かつ効率的に根絶するようにＮＫ細胞を改変でき、この根絶がＣＳ１依存性であることが示された。このデータは、難治性ＭＭまたは再発性ＭＭを有する患者を治療する手段として、本ＣＡＲ戦略が効果的なＮＫ細胞免疫療法の開発に適していることを示唆するものである。加えて、ＣＡＲ  ＮＫ細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞とは対照的に、同種異系ＮＫ細胞源の使用が可能であり、移植片対宿主病を発症する可能性が少なく、またその抑制に役立ち得る（Ｏｌｓｏｎ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１０  １１５：４２９３−４３０１）。さらに、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の不適合により、細胞傷害性の作用も増大する（Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  ２９５：２０９７−２１００）。
【０１３４】
材料及び方法
【０１３５】
細胞培養
【０１３６】
ヒト多発性骨髄腫細胞株Ｌ３６３（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＩＭ９  ［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ］及びＵ２６６（ＡＴＣＣ）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中に維持した。ヒトＩＬ−２依存性ＮＫ細胞株ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ）及びＮＫＬを２０％ＦＢＳ及びｒｈＩＬ−２  １５０ＩＵ／ｍＬ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中に維持した。２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）及びフェニックスパッケージング細胞株を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中に維持した。ＥＡＳＹＳＥＰヒト全血及び骨髄ＣＤ１３８陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を製造業者のプロトコールに従って用いて、ＭＭ患者の骨髄穿刺液から初代ＣＤ１３８＋ＭＭ細胞を単離した。すべてのヒト研究は、オハイオ州立大学治験審査委員会の承認を受けた。
【０１３７】
マウス
【０１３８】
６〜８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ｓｚＪ（ＮＳＧ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から取得した。すべての動物研究は、オハイオ州立大学動物実験委員会の承認を受けた。ＭＭ疾患進行に関してマウスを頻繁に観察し、後肢麻痺、無気力及び明らかな体重減少の症状を伴う瀕死状態になったときに屠殺した。
【０１３９】
抗ＣＳ１ＣＡＲレンチウイルス構築物の作製
【０１４０】
ハイブリドーマ細胞株Ｌｕｃ９０から増幅したＣＳ１−ｓｃＦｖ断片にＭｙｃタグをコードする配列をＣＳ１−ＶＬコード配列のすぐ後に融合させた。融合したＤＮＡ配列をレトロウイルスベクターから切り出したＣＤ２８−ＣＤ３ζに組み込んだ。ＣＳ１−ｓｃＦｖ−ｍｙｃタグ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ断片全体をＰＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ（ＰＣＤＨ，Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）と称するレンチウイルスベクターに連結し、ＰＣＤＨ−ＣＳ１−ｓｃＦｖ−ｍｙｃタグ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ（ＰＣＤＨ−ＣＳ１−ＣＡＲ）構築物を作製した。
【０１４１】
レンチウイルス作製及びＮＫ細胞の形質導入
【０１４２】
ＶＳＶＧ偽型レンチウイルス上清を作製するために、ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した２９３Ｔ細胞を、ＰＣＤＨ−ＣＳ１−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζまたはＰＣＤＨ対照ベクター（空ベクターによるモック感染のウイルスを作製するため）と、パッケージング構築物であるｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ及びｐＣＭＶ−ｄｒ９とともにリン酸カルシウムトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いてコトランスフェクトした。２４時間後、ＤＭＥＭ培地を２０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地と置き換えた。トランスフェクションから４８時間後、レンチウイルスを含む馴化培養液を回収し、０．４５μｍのフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｏｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で濾過し、細胞片を除去した。ウイルス感染を、ポリブレン８μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）及びｒｈＩＬ−２  ４５０ＩＵ／ｍＬを含有するレンチウイルス上清液を総容量２ｍＬで、２×１０６個のＮＫ−９２細胞またはＮＫＬ細胞を用いて６ウェルプレートで実施した。細胞を１，８００ｒｐｍ、３２℃、４５分間遠心分離にかけ、次にプレートを３７℃にて２時間インキュベーター内に置いた。同日に２回目の感染を繰返し、翌日さらにもう１回繰り返した。３回目の形質導入後、細胞を２０％ＦＢＳ及びｒｈＩＬ−２  １５０ＩＵ／ｍＬを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中に３７℃で維持した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた細胞分取を２回行うことにより、形質導入したＮＫ細胞を濃縮した。ＰＣＤＨベクターにコードされた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）表面マーカーの発現に基づいて陽性細胞を選択した。
【０１４３】
ＣＳ１を安定的に発現するＵ２６６細胞株の作製
【０１４４】
ＰＣＲによってＩＭ９細胞から単離したｃＤＮＡからヒトＣＳ１コード配列を増幅し、次に、ＰＣＤＨレンチウイルスベクターにサブクローニングしてＰＣＤＨ−ＣＳ１構築物を作製した。レンチウイルスの作製及びＵ２６６細胞の感染は、上記の方法を用いて実施した。次に、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＧＦＰ陽性細胞を分取した。
【０１４５】
免疫ブロット法分析
【０１４６】
細胞をＰＢＳで洗浄し、レムリ緩衝液中で直接溶解した。４％〜１５％密度勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で溶解物を電気泳動的に分離し、ニトロセルロース膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に転写した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中５％ミルクでこの膜をブロックした。マウス抗ヒトＣＤ３ζ鎖モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳ中５％ミルクで１：１，０００に希釈して、この抗体溶液を加え、膜と一晩反応させた。次に、Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳ中でこの膜を３回洗浄した。ＨＲＰ標識二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳ中５％ミルクで１：５，０００に希釈し、膜に加え、１時間静置した。再度、Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳ中でこの膜を４回洗浄し、高感度化学発光試薬（ＥＣＬ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１分間加えた。次に、ブロットを種々の時間でフィルムに露光し、適切な露光画像を作製した。
【０１４７】
フローサイトメトリー
【０１４８】
ＣＳ１−ＣＡＲの表面発現を分析するために、形質導入したＮＫ細胞の単一の細胞懸濁液を抗ＭｙｃタグマウスｍＡｂ９Ｅ１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次に、ＰＥ標識ラット抗マウスＩｇＧ１二次抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＥ標識マウス抗ＣＳ１  ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＡＰＣ標識マウス抗ＣＤ１３８  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した後、ＢＤ  ＬＳＲＩＩアナライザーを用いるＦＡＣＳ分析により骨髄腫細胞上のＣＳ１及びＣＤ１３８の表面発現を調べた。データ分析をＦＬＯＷＪＯソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
【０１４９】
細胞傷害性アッセイ
【０１５０】
ＮＫ細胞を介した溶解を検出するために、ＭＭ標的細胞を１００ｍＣｉのクロム５１（５１Ｃｒ）で１．５時間標識し、通常ＲＰＭＩ培地で４回洗浄し、１００μｌ容量の９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートで１ウェル当たり５，０００細胞の濃度に調節した。ＦＡＣＳで濃縮したモック形質導入ＮＫ細胞またはＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ細胞を様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で各３ウェルに１００μｌ容量で加えた。３７℃で４時間のインキュベーション後、５１Ｃｒの放出をＴＯＰＣＯＵＮＴカウンター（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）で測定できるように、１００μｌの上清を各ウェルから回収し、液体シンチレーションカクテル（Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を含有するシンチレーションバイアルに移した。最大５１Ｃｒ放出を求めるために、標的細胞上清をＳＤＳ１００μｌとインキュベートした。特異的溶解のパーセンテージを次の標準式を用いて算出した。
１００×（実験放出ｃｐｍ−自然放出ｃｐｍ）／（最大放出ｃｐｍ−自然放出ｃｐｍ）
【０１５１】
インターフェロン−γ放出アッセイ
【０１５２】
骨髄腫標的細胞をＮＫエフェクター細胞と９６ウェルＶ底プレートで２４時間共培養した。全部で、２．５×１０５個の骨髄腫細胞株細胞または１．０×１０５初代骨髄腫細胞をそれぞれ２．５×１０５個または５．０×１０５個のＮＫ細胞とインキュベートした。細胞を含まない上清を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）のキットを製造業者のプロトコールに従って用いて、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の分泌について酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により評価した。各図に示すデータは、類似の結果を有する３つの代表的実験のうちの１つの３ウェルの平均値を表す。
【０１５３】
同所性ＭＭマウスモデル及びＭＭ保有マウスのインビボ処置及び生物発光イメージング
【０１５４】
先に記載の通り、発光ルシフェラーゼを発現するＰｉｎｃｏ−ｐＧＬ３−ｌｕｃ／ＧＦＰウイルスを用いてＩＭ９細胞にレトロウイルス形質導入を行った（Ｈｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１３  １２１：４６６３−４６７１）。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＧＦＰ陽性細胞を分取し、これを「ＩＭ９−Ｌｕｃ」細胞と名付けた。次に、６〜８週齢のオスのＮＳＧマウスにリン酸塩‐緩衝生理食塩水４００μｌ中のＩＭ９−Ｌｕｃ  ＭＭ細胞０．５×１０６個を０日に尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注入し、同所性異種移植ＭＭモデルを確立した。７日目から、マウスにリン酸塩‐緩衝生理食塩水４００μｌ中のエフェクター細胞、すなわちＣＳ１−ＣＡＲ  ＮＫ−９２細胞またはモック形質導入対照細胞５×１０６個を５日毎に１回ｉ．ｖ．注入した（合計５回）。ＩＭ９−Ｌｕｃ接種から４週間後、マウスにＤルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重；Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注入し、イソフルランで麻酔をかけ、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を備えるＩｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ−１００，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して画像化した。
【０１５５】
免疫組織化学分析
【０１５６】
脊椎骨を１０％リン酸緩衝ホルマリンで固定し、飽和ＥＤＴＡで脱灰してから、パラフィンに包埋した。組織学的検査のために、５μ厚の切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。この切片を、マウス抗ヒトＣＤ１３８  ｍＡｂ（１：５０希釈；Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）でヒトＭＭ細胞を特定するために、通常の免疫組織化学的染色手順に従って免疫染色した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを二次抗体として用い、続いてペルオキシダーゼ酵素反応を行った。
【０１５７】
統計
【０１５８】
正規分布であれば、独立スチューデントｔ検定を使用して、一連のエンドポイントについて２つの独立群を比較した。３つ以上の独立群を比較する場合は、一元配置ＡＮＯＶＡを用いた。インビボ生物発光強度などの非正規分布のエンドポイントについては、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して、ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ〜ＮＫ−９２−ＥＶ及びリン酸塩‐緩衝生理食塩水の各群の中央値を比較した。生存データに関しては、カプランマイヤー曲線をプロットし、ログランク検定を用いて比較した。検定はすべて両側検定である。多重比較については、Ｐ値をボンフェローニ法によって調整した。０．０５未満のＰ値は統計的に有意であるとみなす。
【０１５９】
結果
【０１６０】
ＣＳ１−ＣＡＲを発現するＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ  ＮＫ細胞の作製
【０１６１】
シグナルペプチド（ＳＰ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー、軽鎖可変領域（ＶＬ）、Ｍｙｃタグ、ヒンジ、ＣＤ２８及びＣＤ３ζを順に含有する、ＰＣＤＨレンチウイルスベクター骨格を有する特異性ＣＳ１−ＣＡＲ構築物を作製した（図１３Ａ）。ＮＫ−９２細胞株及びＮＫＬ  ＮＫ細胞株にＣＡＲ構築物を用いて形質導入し、次に、ベクターによって発現されるマーカーであるＧＦＰの発現によって分取した。分取細胞のウェスタンブロット法により、対照ベクターではなく、ＣＡＲ構築物を用いて形質導入したＮＫ−９２及びＮＫＬ細胞株でのＣＤ３ζを含有するキメラＣＳ１−ｓｃＦｖ受容体の発現によって裏付けられた通り、ＣＳ１−ＣＡＲが良好に導入され、発現されたことが示された（図１３Ｂ）。さらに、抗Ｍｙｃ  Ａｂの表面染色後のフローサイトメトリー分析では、ＣＳ１−ＣＡＲ構築物を用いて形質導入したＮＫ−９２細胞とＮＫＬ細胞の両方の表面上にてＣＳ１−ＣＡＲが発現されたことが示された（図１３Ｃ）。
【０１６２】
ＣＳ１−ＣＡＲ改変ＮＫ細胞は、モック形質導入ＮＫ細胞と比較して、インビトロでＣＳ１＋ＭＭ細胞をより効率的に根絶するが、ＣＳ１−は根絶しない。
【０１６３】
ＣＳ１−ＣＡＲ  ＮＫ細胞の作製後、この細胞がＣＳ１−ＭＭ細胞よりもＣＳ１＋ＭＭ細胞を多く選択的に殺傷するかどうかを決定した。この目的のために、まず、ＩＭ９及びＬ３６３ＭＭの細胞株がその表面にＣＳ１タンパク質を恒常的に発現していることが確認されたが、Ｕ２６６ＭＭ細胞におけるＣＳ１の発現はほとんどなかった（図１４Ａ）。次に、４時間クロム５１放出アッセイでは、モック形質導入ＮＫ−９２細胞と比較すると、ＣＳ１−ＣＡＲを用いて形質導入したＮＫ−９２細胞のＣＳ１＋ＩＭ９及びＬ３６３の各細胞を殺傷する能力が有意に向上したことが示された（図１４Ｂ及び１４Ｃ、左パネル）。ＣＳ１−ＣＡＲを用いて形質導入したＮＫＬ細胞を用いて繰り返した実験でも、同様のデータが観察された（図１４Ｂ及び１４Ｃ、右パネル）。しかしながら、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入及びモック形質導入したＮＫ−９２細胞またはＮＫＬ細胞は両方ともＣＳ１Ｕ２６６骨髄腫細胞に対する細胞傷害性が同様に低かった（図１４Ｄ）。加えて、ＣＳ１−ＣＡＲの強制発現は、フローサイトメトリーを使用した７ＡＡＤ／Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色の分析によって決定された通り（図２０）、ＮＫ−９２細胞またはＮＫＬ細胞における明確なアポトーシスを誘導しなかった。これは、ＣＳ１−ＣＡＲ発現がＮＫ−９２細胞またはＮＫＬ細胞自体に対する細胞傷害性をもたらさなかったことを示唆している。同様に、精製した初代ヒトＮＫ細胞におけるＣＳ１−ＣＡＲ発現は、ＣＳ１＋ＩＭ９骨髄腫細胞に対する細胞傷害性を増大させた。
【０１６４】
ＣＳ１＋ＭＭ細胞に曝露した後のＣＳ１−ＣＡＲ改変ＮＫ細胞は、モック形質導入ＮＫ細胞よりも多くのＩＦＮ−γを分泌する。
【０１６５】
ＣＡＲ構築物に含めたＣＤ２８共刺激分子のシグナル伝達ドメインは、ＭＭ細胞の表面上のＣＳ１抗原によるＣＳ１  ｓｃＦｖの認識後の活性化を促進することができる。したがって、このシグナル伝達ドメインの含有物は、ＮＫ細胞を活性化する能力を有し得、より高い細胞傷害性を有するだけでなく、より多くのＩＦＮ−γを産生し、後者は、腫瘍監視ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞及びマクロファージの活性化にとっても重要である（Ｍａｒｔｉｎ−Ｆｏｎｔｅｃｈａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４  ５：１２６０−１２６５；Ｔｕ  ＳＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１  ７１：４２４７−４２５９；Ｍａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２００３  ６０：２３３４−２３４６）。この点を試験するために、ＣＳ１−ＣＡＲ改変または対照操作エフェクターＮＫ細胞を、単独で培養するか、ＩＭ９及びＬ３６３のＭＭ細胞株を含むＣＳ１＋骨髄腫細胞と共培養した。２４時間後、ＩＦＮ−γ産生をＥＬＩＳＡで測定した。図１５に示すように、ＣＳ１−ＣＡＲ改変した及びモック形質導入したＮＫ−９２細胞またはＮＫＬ細胞は両方とも、単独でインキュベートした場合、ＩＦＮ−γの自然産生が少ないかわずかな量であった。ＣＳ１−ＭＭ腫瘍細胞（ＩＭ９またはＬ３６３）との共培養は、ＣＳ１−ＣＡＲ及びモックを形質導入したＮＫ−９２細胞株またはＮＫＬ細胞株におけるＩＦＮ−γを誘発したが、モック形質導入ＮＫ−９２（図１５Ａ及び１５Ｂ、左パネル）またはＮＫＬ細胞（図１５Ａ及び１５Ｂ、右パネル）よりもＣＡＲ改変ＮＫ−９２細胞またはＮＫＬ細胞によって産生されたＩＦＮ−γのほうが有意に高かった。ＣＳ１−ＭＭ細胞株であるＵ２６６と共培養した場合、モック形質導入及びＣＳ１−ＣＡＲ形質導入したＮＫ−９２細胞は両方とも、Ｕ２６６細胞と共培養しなかった細胞よりも多くのＩＦＮ−γを産生したが、形質導入ＮＫＬ細胞では認められなかった（図１５Ｃ）。これは、ＮＫ−９２細胞上のＮＫ細胞受容体とＵ２６６細胞上のそのリガンドとの間の特有の相互作用がＮＫ−９２細胞によるＣＳ１依存性ＩＦＮ−γ産生を誘導する可能性を示唆している。さらに、ＣＳ１−ＣＡＲを形質導入したＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞は、Ｕ２６６細胞と共培養した場合、モックを形質導入したＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞よりも多くのＩＦＮ−γを産生しなかった（図１５Ｃ）。これらの結果は、前述の細胞傷害性データと一致するものであり、総合すれば、ＣＳ１−ＣＡＲによる改変が、ＣＳ１−骨髄腫細胞ではなくＣＳ１＋骨髄腫細胞に応答した細胞傷害性及びＩＦＮ−γ産生の両方に関してＮＫ細胞のエフェクター機能を劇的に向上することを示している。
【０１６６】
Ｕ２６６細胞における強制ＣＳ１発現により、ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞の細胞傷害性及びＩＦＮ−γ産生が増大する。
【０１６７】
次に、ＣＳ１−ＣＡＲ  ＮＫ細胞のこの改善活性がＭＭ細胞上のＣＳ１抗原発現に依存するものであるかどうかを調べた。ＣＳ１−ＣＡＲ付与ＮＫ−９２細胞を導入すると、ＣＳ１−Ｕ２６６骨髄腫細胞ではなく、ＣＳ１＋骨髄腫細胞に反応して、細胞傷害活性が増加し、ＩＦＮ−ｇ産生が増大するという上述の観察結果は、Ｕ２６６細胞上のＣＳ１過剰発現がＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞に対するＵ２６６細胞の反応性を変えるのに十分であるかという調査を促すものであった。この目的のために、レンチウイルス感染によりＣＳ１をＵ２６６細胞上に異所的に発現させた。フローサイトメトリー分析により、ＣＳ１タンパク質がＵ２６６−ＣＳ１細胞表面上に良好に発現したことが確認された（図１６Ａ）。クロム５１放出アッセイでは、モック形質導入ＮＫ−９２細胞と比較して、ＣＳ１を過剰発現するＵ２６６細胞に対するＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞の細胞傷害活性が有意に増加したことが示された（図１６Ｂ）。同様に、モック形質導入ＮＫ−９２細胞を含む並行共培養と比較して、ＣＳ１を過剰発現するＵ２６６細胞と共培養したＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞は、有意に高い量のＩＦＮ−ｇを分泌した（図１６Ｃ）。しかしながら、図１４Ｄ及び１５Ｃのデータと一致して、空ベクター対照を用いて形質導入したＵ２６６細胞とインキュベートした場合、ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞とモック形質導入ＮＫ−９２細胞との間には、細胞傷害性及びＩＦＮ−γ分泌における差はなかった（図１６Ｂ及び１６Ｃ）。これらの結果により、ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞による骨髄腫細胞の認識及び殺傷の向上がＣＳ１依存的に生じることが示唆された。
【０１６８】
ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞の表現型の特徴
【０１６９】
次に、ＣＳ１特異的ＣＡＲの発現がＮＫ細胞の表現型を変えることができるかどうかについて調べた。ＩＭ９骨髄腫細胞の存在下または非存在下にて培養した後、フローサイトメトリーを用いて、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入及びモック形質導入したＮＫ−９２細胞の表面上の抗原発現を比較した。図１７Ａに示すように、ＩＭ９細胞の存在下または非存在下での培養にかかわらず、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｄを含むＮＫ細胞受容体の発現におけるＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞とモック形質導入ＮＫ−９２細胞では差がなかった。ＮＫ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９２８及びＨＬＡ−ＤＲ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８４  １５９：９９３−１００８；Ｓｐｉｔｓ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００７  ２６：１１−１６）の発現も評価した。ＩＭ９細胞の認識により、モック形質導入ＮＫ−９２細胞上のＣＤ６９発現は誘導されなかったが、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞の表面上のＣＤ６９発現については、多くはないが有意な増加がもたらされた（図１７Ａ）。興味深いことに、ＩＭ９細胞と共培養すると、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞とモック形質導入ＮＫ−９２細胞の両方に、ＨＬＡ−ＤＲ発現の劇的な増加が生じた。ＩＭ９標的細胞の非存在下において、ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞とモック形質導入ＮＫ−９２細胞との間にＨＬＡ−ＤＲ発現における明確な差はなかったが、ＩＭ９細胞で刺激すると、モック形質導入ＮＫ−９２細胞よりもＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞において、ＨＬＡ−ＤＲ発現が有意に高くなった。したがって、ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞上に発現した活性化マーカー、特にＨＬＡ−ＤＲの増加は、ＣＳ１＋ＭＭ細胞に曝露した際のこれらの細胞による細胞傷害性及びＩＦＮ−γ産生の増加に関連して生じたものと思われる。細胞内染色を使用すると、モック形質導入ＮＫ細胞と比較して、ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞は、ＭＭ腫瘍細胞が存在しない場合であっても、パーフォリン及びグランザイムＢの発現量が有意に高かった（図１７Ｂ及び１７Ｃ）。これは、ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるグランザイムＢの発現増加に関する過去の報告（Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７  ６７：２２６５−２２７３）と一致し、またパーフォリン及びグランザイムＢの発現がＮＫ細胞の細胞傷害活性と概して相関関係にあるという事実（Ｋｒｚｅｗｓｋｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２  ３：３３５）とも一致する。
【０１７０】
ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞は、ＮＫ耐性初代ＭＭ細胞をエクスビボでより効果的に認識し殺傷する。
【０１７１】
結果をより臨床的に関連付けるために、ＣＳ１−ＣＡＲ改変ＮＫ−９２細胞が初代ＭＭ細胞をエクスビボで認識したときに細胞溶解活性及びＩＦＮ−γ産生を増大させるかどうかについて調べた。フローサイトメトリーを用いて、ＭＭ患者に由来する初代ＣＤ１３８＋磁気ビーズ選択ＭＭ細胞上のＣＳ１表面発現を評価した（図１８Ａ）。ＣＤ１３８磁気ビーズ精製ＭＭ患者細胞上のＣＳ１タンパク質の発現が高かったことが示されている過去の報告と一致して（Ｈｓｉ  ＥＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８  １４：２７７５−２７８４；Ｔａｉ  ＹＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８  １１２：１３２９−１３３７）、ＣＳ１タンパク質は、確かに、初代ＭＭ細胞の表面上に一様に発現した（図１８Ａ）。クロム５１放出アッセイにより、ＭＭ患者から新しく単離した初代骨髄腫細胞は、Ｅ：Ｔ比が４０：１及び２０：１という高比率であっても、ＮＫ−９２細胞を介した溶解に高い耐性を示したが、この耐性は、初代骨髄腫細胞の根絶に劇的な増加をもたらしたＮＫ−９２細胞のＣＳ１−ＣＡＲ発現によって部分的に克服され得る（図１８Ｂ）。また、細胞傷害性の結果と一致して、初代骨髄腫細胞と２４時間共培養した後のＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞は、モック形質導入ＮＫ−９２細胞よりも有意に高い量のＩＦＮ−γを分泌した（図１８Ｃ）。
【０１７２】
ＣＳ１−ＣＡＲ形質導入ＮＫ−９２細胞は、同所性異種移植ＭＭモデルにおけるＭＭ腫瘍成長を阻害し、腫瘍マウスの生存を延ばす。
【０１７３】
ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞の治療適用の可能性をさらに検討するために、ＩＭ９異種移植ＮＳＧマウスにおける抗腫瘍活性を調べた。ＩＭ９細胞に発光ルシフェラーゼを発現するウイルスでレトロウイルス形質導入することにより、発光ルシフェラーゼを発現するＩＭ９細胞株（ＩＭ９−Ｌｕｃ）を作製し、ＧＦＰ細胞分取を行った。完全長の発光ルシフェラーゼｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認した。典型的な骨髄腫細胞と同様に、ＩＭ９−Ｌｕｃ細胞はその表面にＣＤ１３８タンパク質を発現した。過去の報告（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００  ６０：３２２５−３２３１）と一致して、ＩＭ９−Ｌｕｃ保有ＮＳＧマウスは、後肢麻痺及び運動失調によって表される播種性疾患を示した。後肢麻痺を示すマウスの脊椎骨の組織学検査では、骨組織内に多数の腫瘍細胞及び溶骨性病変の存在が認められた（図１９Ａ、左）。ヒト特異的抗ＣＤ１３８抗体を用いた免疫組織化学染色で、腫瘍細胞の存在をさらに確認した（図１９Ａ、右）。生物発光イメージングを用いて、ＩＭ９−Ｌｕｃの腫瘍成長をモニターした。図１９Ｂ及び１９Ｃに示す通り、またインビトロ細胞傷害性データと一致して、モック形質導入対照細胞を後に注入したマウスと比較して、ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞を代わりに後に投与したマウスでは、ＩＭ９−Ｌｕｃ腫瘍が有意に抑制された。さらに、ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞で処置すると、モック形質導入ＮＫ−９２対照細胞で処置したマウスと比較して、ＩＭ９−Ｌｕｃ腫瘍を有するマウスの生存が有意に伸びた（図１９Ｄ）。注目すべき点は、ＮＫ−９２−ＣＳ１−ＣＡＲ細胞またはモック形質導入ＮＫ−９２細胞を同様に投与した場合、ＩＭ９−Ｌｕｃ細胞のｉ．ｖ．注入がなくても、マウスは播種性疾患を発症せず、死に至らなかったことである。
【０１７４】
特段の記載がない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本開示の発明が属する技術分野の当業者によって共通に解釈されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用した刊行物及び当該刊行物が引用した資料を参照により特に組み込む。
【０１７５】
当業者であれば、通常の実験を用いるだけで、本明細書に記載された本発明の具体的な実施形態の等価物を数多く認識しまたは確認できるであろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
2019146579.tif 000007
【図１Ｂ】
2019146579.tif 000008
【図１Ｃ】
2019146579.tif 000009
【図２Ａ】
2019146579.tif 000010
【図２Ｂ】
2019146579.tif 000011
【図２Ｃ】
2019146579.tif 000012
【図３Ａ】
2019146579.tif 000013
【図３Ｂ】
2019146579.tif 000014
【図３Ｃ】
2019146579.tif 000015
【図３Ｄ】
2019146579.tif 000016
【図４Ａ】
2019146579.tif 000017
【図４Ｂ】
2019146579.tif 000018
【図４Ｃ】
2019146579.tif 000019
【図４Ｄ】
2019146579.tif 000020
【図５Ａ】
2019146579.tif 000021
【図５Ｂ】
2019146579.tif 000022
【図５Ｃ】
2019146579.tif 000023
【図５Ｄ】
2019146579.tif 000024
【図６Ａ】
2019146579.tif 000025
【図６Ｂ】
2019146579.tif 000026
【図７Ａ】
2019146579.tif 000027
【図７Ｂ】
2019146579.tif 000028
【図７Ｃ】
2019146579.tif 000029
【図７Ｄ】
2019146579.tif 000030
【図７Ｅ】
2019146579.tif 000031
【図８Ａ】
2019146579.tif 000032
【図８Ｂ】
2019146579.tif 000033
【図９Ａ】
2019146579.tif 000034
【図９Ｂ】
2019146579.tif 000035
【図１０Ａ】
2019146579.tif 000036
【図１０Ｂ】
2019146579.tif 000037
【図１０Ｃ】
2019146579.tif 000038
【図１１Ａ】
2019146579.tif 000039
【図１１Ｂ】
2019146579.tif 000040
【図１１Ｃ】
2019146579.tif 000041
【図１２】
2019146579.tif 000042
【図１３Ａ】
2019146579.tif 000043
【図１３Ｂ】
2019146579.tif 000044
【図１３Ｃ】
2019146579.tif 000045
【図１４Ａ】
2019146579.tif 000046
【図１４Ｂ】
2019146579.tif 000047
【図１４Ｃ】
2019146579.tif 000048
【図１４Ｄ】
2019146579.tif 000049
【図１５Ａ】
2019146579.tif 000050
【図１５Ｂ】
2019146579.tif 000051
【図１５Ｃ】
2019146579.tif 000052
【図１６Ａ】
2019146579.tif 000053
【図１６Ｂ】
2019146579.tif 000054
【図１６Ｃ】
2019146579.tif 000055
【図１７Ａ】
2019146579.tif 000056
【図１７Ｂ】
2019146579.tif 000057
【図１７Ｃ】
2019146579.tif 000058
【図１８Ａ】
2019146579.tif 000059
【図１８Ｂ】
2019146579.tif 000060
【図１８Ｃ】
2019146579.tif 000061
【図１９Ａ】
2019146579.tif 000062
【図１９Ｂ】
2019146579.tif 000063
【図１９Ｃ】
2019146579.tif 000064
【図１９Ｄ】
2019146579.tif 000065
【図２０】
2019146579.tif 000066
【配列表】
2019146579000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月20日(2019.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
本発明の多くの実施形態について説明してきた。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲を逸脱せずに種々の修正を行うことができることは理解されるだろう。したがって、他の実施形態は、以下の請求の範囲内である。
本発明の実施形態は例えば下記実施形態１〜２０を含む。
実施形態１：
ＣＳ１抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達領域を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
実施形態２：
前記抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体断片又は抗原結合断片である、実施形態１に記載のポリペプチド。
実施形態３：
前記抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体のＦａｂ又は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態２に記載のポリペプチド。
実施形態４：
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞質ドメインを含む、実施形態１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態５：
前記ＣＡＲポリペプチドが、式：
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ；又は
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＩＳＤ−ＣＳＲ
（式中、「ＳＰ」は、シグナルペプチドを表し、
「ＣＳ１」は、ＣＳ１結合領域を表し、
「ＨＧ」は、任意のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、二価のリンカーを表す）
で定義される、実施形態１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態６：
前記ＣＳ１結合領域が、ＣＳ１に特異的に結合する抗体のＦａｂ又は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態７：
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
実施形態８：
実施形態１〜７のいずれかに記載の組換えポリペプチドをコードする単離核酸配列。
実施形態９：
実施形態７又は８に記載の単離核酸配列を含むベクター。
実施形態１０：
実施形態９に記載のベクターを含む細胞。
実施形態１１：
αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１０に記載の細胞。
実施形態１２：
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインがＣＳ１に結合するとき、抗腫瘍免疫を呈する、実施形態１１に記載の細胞。
実施形態１３：
多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に抗腫瘍免疫をもたらすための方法であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子的に改変した有効量の免疫エフェクター細胞を前記対象に投与することを含み、前記ＣＡＲがＣＳ１抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、これにより哺乳動物において抗腫瘍免疫をもたらす、方法。
実施形態１４：
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及び制御性Ｔ細胞からなる群から選択される、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５：
前記抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体断片又は抗原結合断片である実施形態１３又は１４に記載の方法。
実施形態１６：
前記抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体のＦａｂ又は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７：
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞質ドメインを含む、実施形態１３〜１６のいずれかに記載の方法。
実施形態１８：
前記ＣＡＲポリペプチドが、式：
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ；又は
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＩＳＤ−ＣＳＲ
（式中、「ＳＰ」は、シグナルペプチドを表し、
「ＣＳ１」は、ＣＳ１結合領域を表し、
「ＨＧ」は、任意のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、二価のリンカーを表す）
で定義される、実施形態１３〜１７のいずれかに記載の方法。
実施形態１９：
前記抗ＣＳ１抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体のＦａｂ又は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態１３〜１８のいずれかに記載の方法。
実施形態２０：
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１３〜１９のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＳ１抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達領域を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体の、１つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる、ポリペプチド。
【請求項２】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８及び４−１ＢＢからなる群から選択される共刺激分子の細胞質ドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＣＡＲポリペプチドが、式：
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ
（式中、「ＳＰ」は、シグナルペプチドを表し、
「ＣＳ１」は、ＣＳ１抗原結合ドメインを表し、
「ＨＧ」は、任意のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、二価のリンカーを表す）
で定義される、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、配列番号１９、又は配列番号１９に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、配列番号１７、又は配列番号１７に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２８、又は配列番号２８に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸配列。
【請求項９】
配列番号１８、又は配列番号１８に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項８に記載の単離核酸配列。
【請求項１０】
配列番号２９、又は配列番号２９に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項８に記載の単離核酸配列。
【請求項１１】
前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、配列番号２０、又は配列番号２０に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、配列番号２１、又は配列番号２１に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のポリペプチドをコードする単離核酸配列。
【請求項１４】
請求項８〜１０及び１３のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む単離細胞。
【請求項１６】
Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の単離細胞。
【請求項１７】
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインがＣＳ１に結合するとき、抗腫瘍免疫を呈する、請求項１５又は１６に記載の単離細胞。
【請求項１８】
多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する対象に抗腫瘍免疫をもたらすための剤であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを発現するように遺伝子的に改変した免疫エフェクター細胞を有効成分として含有し、前記ＣＡＲポリペプチドがＣＳ１抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、剤。
【請求項１９】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の剤。
【請求項２０】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８及び４−１ＢＢからなる群から選択される共刺激分子の細胞質ドメインを含む、請求項１８又は１９に記載の剤。
【請求項２１】
前記共刺激分子がＣＤ２８である、請求項２０に記載の剤。
【請求項２２】
前記共刺激分子が４−１ＢＢである、請求項２０に記載の剤。
【請求項２３】
前記ＣＡＲポリペプチドが、式：
ＳＰ−ＣＳ１−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ
（式中、「ＳＰ」は、シグナルペプチドを表し、
「ＣＳ１」は、ＣＳ１抗原結合ドメインを表し、
「ＨＧ」は、任意のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、二価のリンカーを表す）
で定義される、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の剤。
【請求項２４】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の剤。
【請求項２５】
前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、配列番号１９、又は配列番号１９に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の剤。
【請求項２６】
前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、配列番号１７、又は配列番号１７に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の剤。
【請求項２７】
前記ＣＡＲポリペプチドが、配列番号２８、又は配列番号２８に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の剤。
【請求項２８】
前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、ＣＳ１に特異的に結合する抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の剤。
【請求項２９】
前記ＣＳ１抗原結合ドメインが配列番号１７からなる、請求項２８に記載の剤。
【請求項３０】
前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、配列番号２０、又は配列番号２０に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の剤。
【請求項３１】
前記ＣＳ１抗原結合ドメインが、配列番号２１、又は配列番号２１に対して少なくとも６５％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の剤。
【請求項３２】
前記対象がヒトである、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の剤。
【外国語明細書】
2019146579000001.pdf