(57)【要約】      （修正有）【課題】β−１，２−グルカンの製造に有用な酵素剤と、β−１，２−グルカンの製造方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるタンパク質を含んでなる１，２−β−オリゴグルカンホスホラーゼ活性を有するタンパク質であって、分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が１２５±１０ｋＤａであり、ｐＨが５．０〜８．５で安定で、６．５〜７．５が至適ｐＨであり、温度が４５℃以下で安定で、３５〜４５℃が至適温度である、ビフィドバクテリウム・スカルドビイ由来の酵素剤。酵素剤をα−グルコース−１−リン酸とグルコース及び／又はβ−１，２−グルカンとに作用させる工程を含んでなる、β−１，２−グルカンの製造方法。製造方法、前記の酵素剤以外のホスホリラーゼを併用してα−グルコース−１−リン酸を反応系に供給してもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質を含んでなる酵素剤：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質、および
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（Ａ）〜（Ｆ）の特性を有するタンパク質を含んでなる酵素剤：
（Ａ）作用：α−グルコース−１−リン酸とグルコースおよび／またはβ−１，２−グルカンとを基質とし、β−１，２−グルカンを生成する。
（Ｂ）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が１２５±１０ｋＤａである
（Ｃ）至適ｐＨ：６．５〜７．５の範囲である
（Ｄ）ｐＨ安定性：５．０〜８．５の範囲で安定である
（Ｅ）至適温度：３５〜４５℃の範囲である
（Ｆ）温度安定性：４５℃以下で安定である
【請求項３】
前記タンパク質が、ビフィドバクテリウム・スカルドビイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃａｒｄｏｖｉｉ）由来である、請求項２に記載の酵素剤。
【請求項４】
β−１，２−グルカンの製造に用いるための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素剤。
【請求項５】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを作動可能に連結してなる発現ベクターにより形質転換した宿主微生物またはビフィドバクテリウム属に属する微生物を培養する工程を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素剤の製造方法：
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と７０％以上の同一性を有し、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、および
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素剤をα−グルコース−１−リン酸とグルコースおよび／またはβ−１，２−グルカンとに作用させる工程を含んでなる、β−１，２−グルカンの製造方法。
【請求項７】
糖質の加リン酸分解によりα−グルコース−１−リン酸を生成させる工程をさらに含んでなる、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記加リン酸分解を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素剤以外のホスホリラーゼを基質糖質に作用させることにより実施する、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ホスホリラーゼが、スクロースホスホリラーゼおよびスターチホスホリラーゼからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規酵素剤およびその製造方法に関する。本発明はまた、新規酵素剤を用いたβ−１，２−グルカンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
βグルカンは、β−グルコースが（１→３）、（１→４）あるいは（１→６）などの結合形式で連結してなる多糖類であり、植物、菌類、細菌、藻類など自然界に広く分布する。βグルカンは、近年、その優れた生体調節機能や生理活性機能が報告され、その利用が注目されている。例えば、β−１，４−結合からなるセルロースは、植物の細胞壁の主成分であるβ−１，４−グルカンであり、ナノファイバーとして優れた物性を有しており、食品、医薬、化粧品などの様々な分野において利用が期待されている。また、β−１，３−結合からなるカードランは、微生物由来のβ−１，３−グルカンであり、食品においてはゲル化剤、増粘剤として利用されている。また、カードランは抗腫瘍作用を有しており、構造や分子量に依存した特性の変化が知られている。
【０００３】
上記以外のβグルカンとしてはβ−１，２−グルカンがあり、環状β−１，２−グルカンが根粒菌やＢｒｕｃｅｌｌａ属の宿主感染や浸透圧の調整に関与することが知られている。β−１，２−グルカンは希少多糖であり、物性や機能に関する報告は非常に少ないが、βグルカンとして新たな生理機能が期待される。近年、新規酵素である１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ（非特許文献１、２）が発見され、スクロースとグルコースを原資にβ−１，２−グルカンを製造する方法が報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nakajima M. et al., PLOS ONE, 9, e92353, 2014
【非特許文献２】Nakajima M. et al., SCIENTIFIC REPORTS, 7, 42671, 2017
【非特許文献３】Abe K. et al., J. Appl. Glycosci., 62, p.47-52, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、β−１，２−グルカンの製造に有用な酵素剤とその製造方法の提供を目的とする。本発明はまた、β−１，２−グルカンの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは今般、ビフィドバクテリウム・スカルドビイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃａｒｄｏｖｉｉ）由来のタンパク質が１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼであることを見出すとともに、該ホスホリラーゼの逆反応によりα−グルコース−１−リン酸（以下、「α−Ｇ１Ｐ」ということがある）およびグルコースからβ−１，２−グルカンを製造できることを確認した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００７】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］下記（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択されるタンパク質を含んでなる酵素剤：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号：１の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｅ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質、および
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質。
［２］下記の（Ａ）〜（Ｆ）の特性を有するタンパク質を含んでなる酵素剤：
（Ａ）作用：α−グルコース−１−リン酸とグルコースおよび／またはβ−１，２−グルカンとを基質とし、β−１，２−グルカンを生成する。
（Ｂ）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が１２５±１０ｋＤａである
（Ｃ）至適ｐＨ：６．５〜７．５の範囲である
（Ｄ）ｐＨ安定性：５．０〜８．５の範囲で安定である
（Ｅ）至適温度：３５〜４５℃の範囲である
（Ｆ）温度安定性：４５℃以下で安定である
［３］タンパク質が、ビフィドバクテリウム・スカルドビイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃａｒｄｏｖｉｉ）由来である、上記［２］に記載の酵素剤。
［４］β−１，２−グルカンの製造に用いるための、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の酵素剤。
［５］下記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを作動可能に連結してなる発現ベクターにより形質転換した宿主微生物またはビフィドバクテリウム属に属する微生物を培養する工程を含んでなる、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の酵素剤の製造方法：
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と７０％以上の同一性を有し、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、および
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
［６］上記［１］〜［４］のいずれかに記載の酵素剤をα−グルコース−１−リン酸とグルコースおよび／またはβ−１，２−グルカンとに作用させる工程を含んでなる、β−１，２−グルカンの製造方法。
［７］糖質の加リン酸分解によりα−グルコース−１−リン酸を生成させる工程をさらに含んでなる、上記［６］に記載の製造方法。
［８］前記加リン酸分解を、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の酵素剤以外のホスホリラーゼを基質糖質に作用させることにより実施する、上記［７］に記載の製造方法。
［９］前記ホスホリラーゼが、スクロースホスホリラーゼおよびスターチホスホリラーゼからなる群から選択される１種または２種以上である、上記［８］に記載の製造方法。
【０００８】
本発明によれば、β−１，２−グルカンの製造に有用な酵素剤が提供される。本発明の酵素剤は既存の１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼと比較して触媒反応効率が高いことから（試験例５参照）、本発明の酵素剤を利用することにより高い生産効率でβ−１，２−グルカンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、試験例１において得られたビフィドバクテリウム・スカルドビイ由来の１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２）を示した図である。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例１において得られたビフィドバクテリウム・スカルドビイ由来の１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｓｅｎｓｅ配列）（配列番号：１）を示した図である。図２Ａおよび図２Ｂは連続しており、図２Ｂは図２Ａの続きである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例１において得られたビフィドバクテリウム・スカルドビイ由来の１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼをコードするＤＮＡ配列（ｓｅｎｓｅ配列）（配列番号：１）を示した図である。図２Ａおよび図２Ｂは連続しており、図２Ｂは図２Ａの続きである。
【図３】図３は、試験例１において実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＢｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。
【図４】図４は、試験例２において実施した薄層クロマトグラフィー分析の結果を示した図である。
【図５】図５は、試験例１で調製した酵素の至適ｐＨを示した図である。
【図６】図６は、試験例１で調製した酵素のｐＨ安定性を示した図である。
【図７】図７は、試験例１で調製した酵素の至適温度を示した図である。
【図８】図８は、試験例１で調製した酵素の温度安定性を示した図である。
【図９】図９は、試験例１で調製した酵素とホスホリラーゼを組み合わせてβ−１，２−グルカンを製造した場合の生産物をＨＰＬＣにより分析した結果である。基質として１．０Ｍスクロースと０．１Ｍグルコースを用いた場合の結果である。
【図１０】図１０は、試験例１で調製した酵素とホスホリラーゼを組み合わせてβ−１，２−グルカンを製造した場合の生産物をＨＰＬＣにより分析した結果である。基質として１．０Ｍスクロースと０．５Ｍグルコースを用いた場合の結果である。
【図１１】図１１は、試験例１で調製した酵素とホスホリラーゼを組み合わせてβ−１，２−グルカンを製造した場合の生産物をＨＰＬＣにより分析した結果である。基質として１．０Ｍスクロースと１．０Ｍグルコースを用いた場合の結果である。
【発明の具体的説明】
【００１０】
＜本発明の酵素剤＞
本発明の酵素剤は、前記（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」ということがある）を含んでなるものである。
【００１１】
本発明の酵素剤が前記（ａ）のタンパク質を含む場合、本発明のタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるものであっても、配列番号：２のアミノ酸からなるものであってもよい。
【００１２】
前記（ｂ）において、「同一性」は「相同性」を含む意味で用いられる。ここで「同一性」は、例えば、比較する配列同士を適切に整列（アライメント）させたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性については、例えば、配列におけるギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730（1983））。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、具体的に、ＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990））、ＦＡＳＴＡ（Peasron et al., Methods in Enzymology 183:63-69 (1990）)、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Meth. Enzym., 164, 765 (1988））などの相同性検索ソフトウエアを使用することができる。また、同一性の算出は、例えば、前記のような公知の相同性検索プログラムを用いて行うことができ、例えば、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出することができる。
【００１３】
前記（ｂ）における同一性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。
【００１４】
前記（ｃ）において、「アミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、例えば、部位突然変異誘発法などの公知の方法により生じる程度の数のアミノ酸、または、天然に生じる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入および／または付加によって改変されたことを意味する。前記置換などにより改変されるアミノ酸の個数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに一層好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜数個、１〜３個、１〜２個または１個である。前記アミノ酸配列において、前記改変は、例えば、連続して生じてもよいし、不連続に生じてもよい。
【００１５】
また、前記（ｃ）におけるアミノ酸の挿入としては、例えば、アミノ酸配列の内部への挿入が挙げられる。さらに、アミノ酸の付加は、例えば、アミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端への付加であっても、Ｎ末端およびＣ末端の両末端への付加であってもよい。
【００１６】
前記アミノ酸の置換は、例えば、保存的置換であってもよい。「保存的置換」は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個または複数個のアミノ酸を、別のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体に置換することを意味する。保存的置換において、置換されるアミノ酸と置換後のアミノ酸とは、例えば、性質および／または機能が類似していることが好ましい。具体的には、疎水性および親水性の指標、極性、電荷などの化学的性質、あるいは二次構造などの物理的性質が類似していることが好ましい。このように、性質および／または機能が類似するアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、当該技術分野において公知である。例えば、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ）酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００１７】
前記（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）において、「塩基配列によりコードされるアミノ酸配列」および「ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列」は、特定の塩基配列または特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドが与えられることによって、遺伝暗号（すなわち、コドン）に基づいて特定することができる。具体的には、例えば、配列番号：１の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列としては、配列番号：２のアミノ酸配列が挙げられる。
【００１８】
本発明の酵素剤が前記（ｄ）のタンパク質を含む場合、本発明のタンパク質は、配列番号：１の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるものであっても、該アミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００１９】
前記（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）において、「配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列」とは、配列番号：２のアミノ酸配列が与えられることによって、遺伝暗号（すなわち、コドン）に基づいて特定することができる。例えば、配列番号：２のアミノ酸配列を、対応するコドンに置き換えることによって塩基配列を特定することができ、具体例としては、配列番号：１の塩基配列が挙げられる。
【００２０】
前記（ｅ）において、「同一性」は「相同性」を含む意味で用いられる。ここで、「同一性」は、前記（ｂ）において述べたのと同様に、比較する配列同士を適切に整列（アライメント）させたときの同一性の程度であり、前記配列間の塩基の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性については、例えば、配列におけるギャップの存在および塩基の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983））。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、例えば、前述した、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎなどの相同性検索ソフトウエアが使用することができる。また、同一性の算出は、例えば、前記のような公知の相同性検索プログラムを用いて行うことができ、例えば、前記相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出することができる。
【００２１】
前記（ｅ）における同一性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。
【００２２】
前記（ｆ）において、「塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された」は、例えば、部位突然変異誘発法などの公知の方法により生じる程度の数の塩基（ヌクレオチド）、または、天然に生じる程度の数の塩基が、欠失、置換、挿入および／または付加によって改変されたことを意味する。前記置換などにより改変される塩基の個数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに一層好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜数個、１〜３個、１〜２個または１個である。前記欠失、挿入および／または付加された塩基配列は、特に制限されないが、例えば、配列番号：２のタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。前記欠失、挿入および／または付加される塩基は、例えば、連続する３つの塩基からなるコドンが好ましく、コドンの数は、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜数個、１〜３個、１〜２個または１個である。前記塩基配列において、前記改変は、連続して生じてもよいし、不連続に生じてもよい。
【００２３】
また、前記（ｆ）における塩基の挿入としては、例えば、塩基配列の内部への挿入が挙げられる。さらに、塩基の付加は、例えば、塩基配列の５’末端もしくは３’末端への付加であっても、５’末端および３’末端の両末端への付加であってもよい。
【００２４】
前記（ｇ）において、「ハイブリダイズする」とは、あるポリヌクレオチドが標的となるポリヌクレオチドと相補的なそれぞれの塩基同士の水素結合により二本鎖を形成することをいう。「ハイブリダイズ」は、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出することができる。ハイブリダイゼーションアッセイとしては、例えば、サザンハイブリダイゼーションアッセイ、コロニーハイブリダイゼーションアッセイなどの公知の方法が挙げられる。
【００２５】
前記（ｇ）において、「ハイブリダイズ」あるいは「ハイブリダイゼーション」は、ストリンジェントな条件下で実施することができ、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーション反応を行った後、洗浄緩衝液で洗浄することにより実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、ある塩基配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定することができ、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば、配列番号：１の塩基配列）を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)参照）。ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液（例えば、ＳＳＣ溶液）中で、塩基配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜５℃低い温度あるいはＴｍよりも０〜２℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。
【００２６】
前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）において、「１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性」は、リン酸の存在下、β−１，２−グルカンを加リン酸分解し、α−Ｇ１Ｐを生成する酵素活性である。この加リン酸分解反応の逆反応（糖転移反応、合成反応）では、α−Ｇ１Ｐと、グルコースおよび／またはβ−１，２−グルカン（ソホロースなど）とを基質として、β−１，２−グルカンおよびリン酸を生成することができる。なお、ホスホリラーゼ活性を有するタンパク質は、一般的に加リン酸分解反応と共に逆反応を触媒することが知られている。従って、「１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質」であるか否かは、例えば、被験タンパク質を基質であるα−Ｇ１Ｐおよびソホロースに作用させ、重合度３以上のβ−１，２−グルカンや無機リン酸が生成するか否かにより判定することができる。すなわち、加リン酸分解の逆反応を触媒する活性を有するタンパク質であるか否かにより、「１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質」であるか否かを判定することができる。β−１，２−グルカンの生成の程度は、例えば、無機リン酸量やβ−１，２−グルカン量を定量することにより測定することができる。
【００２７】
本発明の酵素剤はまた、前記特性（Ａ）〜（Ｆ）を有するタンパク質（以下、「本発明の酵素タンパク質」ということがある）を含んでなるものである。前記の本発明のタンパク質は、特性（Ａ）〜（Ｆ）を有するものとすることができ、以下の本発明の酵素タンパク質の記載に従ってその内容を特定することができる。なお、本明細書においては、本発明のタンパク質および本発明の酵素タンパク質をあわせて、「本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質」ということがある。
【００２８】
特性（Ａ）に関し、本発明の酵素タンパク質は、リン酸の存在下、β−１，２−グルカンを加リン酸分解し、α−Ｇ１Ｐを生成するホスホリラーゼである。この加リン酸分解反応の逆反応により、α−Ｇ１Ｐとグルコースおよび／またはβ−１，２−グルカンを基質とし、β−１，２−グルカンを生成する。後述するように、この加リン酸分解反応の逆反応により、本発明の酵素剤はβ−１，２−グルカンを製造することができる。
【００２９】
特性（Ａ）に関し、本発明の酵素タンパク質は、α−Ｇ１Ｐをリン酸供与体とする加リン酸分解反応の逆反応において、ソホロースおよびラミナリビオースに対して基質特異性を有し、特にソホロースに対して高い基質特異性を有する。また、基質濃度を高くすることでグルコースに対しても反応を示す。
【００３０】
特性（Ｂ）に関し、本発明の酵素タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定で１２５±１０ｋＤａの分子量を有する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定は、例えば、ポリアクリルアミドゲルのゲル濃度１２．５％、定電流２０ｍＡ、タンパク質量３μｇの条件で実施することができる。
【００３１】
特性（Ｃ）に関し、本発明の酵素タンパク質の至適ｐＨは、６．５〜７．５の範囲であり、好ましくはｐＨ６．５〜７．０の範囲である。本発明の酵素タンパク質の至適ｐＨは、各種ｐＨ、３０℃、１０分間の条件で本発明の酵素タンパク質およびその基質を反応させた際に最大活性を示す本発明の酵素タンパク質の活性（例えば、β−１，２−グルカン生成活性または無機リン酸生成活性）を１００％とした場合に、８０％以上の相対活性を示すｐＨとすることができ、好ましくは９０％以上の相対活性を示すｐＨとすることができる。
【００３２】
特性（Ｄ）に関し、本発明の酵素タンパク質は、ｐＨ５．０〜８．５の範囲で安定である。本発明の酵素タンパク質のｐＨ安定性は、各種ｐＨ、４℃、２４時間の条件で本発明の酵素タンパク質を保存した後、最大残存活性を示す本発明の酵素タンパク質の残存活性（例えば、β−１，２−グルカン生成活性または無機リン酸生成活性）を１００％とした場合に、８０％以上の残存活性を示すｐＨとすることができる。
【００３３】
特性（Ｅ）に関し、本発明の酵素タンパク質の至適温度は、３５〜４５℃の範囲であり、好ましくは４０〜４５℃の範囲である。本発明の酵素タンパク質の至適温度は、各種温度、ｐＨ６．５、１０分間の条件で本発明の酵素タンパク質およびその基質を反応させた際に最大活性を示す本発明の酵素タンパク質の活性（例えば、β−１，２−グルカン生成活性または無機リン酸生成活性）を１００％とした場合に、８０％以上の相対活性を示す温度とすることができ、好ましくは９０％以上の相対活性を示す温度とすることができる。
【００３４】
特性（Ｆ）に関し、本発明の酵素タンパク質は、４５℃以下で安定である。本発明の酵素タンパク質の温度安定性は、各種温度、ｐＨ６．５、３０分間の条件で本発明の酵素タンパク質を保存した後、最大残存活性を示す本発明の酵素タンパク質の残存活性（例えば、β−１，２−グルカン生成活性または無機リン酸生成活性）を１００％とした場合に、８０％以上の残存活性を示す温度とすることができる。
【００３５】
本発明の酵素タンパク質は、ビフィドバクテリウム・スカルドビイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃａｒｄｏｖｉｉ）由来のものを用いることができる。本発明の酵素はまた、後述するように天然微生物あるいは組換え微生物から発現させたものを使用することができる。
【００３６】
本発明の酵素剤は、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質そのものでもよく、あるいは本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質に加えて他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、賦形剤、安定化剤、塩類などが挙げられる。また、その形態も特に制限はなく、液状でもよく、粉末状でもよく、担体に担持させた形態であってもよい。
【００３７】
本発明の酵素剤は、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質を有効成分とするものである。前記の通り、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼの逆反応（糖転移反応、合成反応）により、α−Ｇ１Ｐとグルコースからβ−１，２−グルカンが生成する。従って、本発明の酵素剤は、β−１，２−グルカンの製造のために用いることができる。本発明の酵素剤を用いたβ−１，２−グルカンの製造は後述する。
【００３８】
＜本発明の酵素剤の製造方法＞
本発明の酵素剤は、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質の産生能を有する天然微生物（例えば、ビフィドバクテリウム・スカルドビイなどのビフィドバクテリウム属に属する微生物）あるいは組換え微生物を培養することにより製造することができる。
【００３９】
すなわち、本発明の別の側面によれば、前記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを作動可能に連結してなる発現ベクターにより形質転換した宿主微生物を培養し、該宿主微生物および／またはその培養物から発現産物を採取する工程を含んでなる、本発明の酵素剤の製造方法が提供される。
【００４０】
本発明において「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、さらには、これらの修飾体や人工核酸が含まれるが、好ましくはＤＮＡである。また、ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。
【００４１】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、「配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列」とは、配列番号：２のアミノ酸配列が与えられることによって、遺伝暗号（すなわち、コドン）に基づいて特定することができる。例えば、配列番号：２のアミノ酸配列を、対応するコドンに置き換えることによって塩基配列を特定することができ、具体例としては、配列番号：１の塩基配列が挙げられる。
【００４２】
前記（ｉｉ）において、「同一性」は「相同性」を含む意味で用いられる。ここで、「同一性」は、前記（ｂ）において述べたのと同様に、比較する配列同士を適切に整列（アライメント）させたときの同一性の程度であり、前記配列間の塩基の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性については、例えば、配列におけるギャップの存在および塩基の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983））。アライメントや同一性の算出は、前記（ｅ）についての記載内容に従って実施することができる。
【００４３】
前記（ｉｉ）における同一性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。
【００４４】
前記（ｉｉｉ）において、「塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された」は、例えば、部位突然変異誘発法などの公知の方法により生じる程度の数の塩基（ヌクレオチド）、または、天然に生じる程度の数の塩基が、欠失、置換、挿入および／または付加によって改変されたことを意味する。前記置換などにより改変される塩基の個数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに一層好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜数個、１〜３個、１〜２個または１個である。前記欠失、挿入および／または付加された塩基配列は、特に制限されないが、例えば、配列番号：２のタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。前記欠失、挿入および／または付加される塩基は、例えば、連続する３つの塩基からなるコドンが好ましく、コドンの数は、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜６個、特に好ましくは１〜数個、１〜３個、１〜２個または１個である。前記塩基配列において、前記改変は、連続して生じてもよいし、不連続に生じてもよい。
【００４５】
また、前記（ｉｉｉ）における塩基の挿入としては、例えば、塩基配列の内部への挿入が挙げられる。さらに、塩基の付加は、例えば、塩基配列の５’末端もしくは３’末端への付加であっても、５’末端および３’末端の両末端への付加であってもよい。
【００４６】
前記（ｉｖ）において、「ハイブリダイズする」とは、あるポリヌクレオチドが標的となるポリヌクレオチドと相補的なそれぞれの塩基同士の水素結合により二本鎖を形成することをいう。「ハイブリダイズ」は、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出することができる。ハイブリダイゼーションアッセイとしては、例えば、サザンハイブリダイゼーションアッセイ、コロニーハイブリダイゼーションアッセイなどの公知の方法が挙げられる。
【００４７】
前記（ｉｖ）において、「ハイブリダイズ」あるいは「ハイブリダイゼーション」は、ストリンジェントな条件下で実施することができ、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーション反応を行った後、洗浄緩衝液で洗浄することにより実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」でのハイブリダイゼーションは、前記（ｇ）についての記載内容に従って実施することができる。
【００４８】
前記（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、「１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性」は、リン酸の存在下、β−１，２−グルカンを加リン酸分解し、α−Ｇ１Ｐを生成する酵素活性である。この加リン酸分解反応の逆反応（糖転移反応、合成反応）では、α−Ｇ１Ｐと、グルコースおよび／またはβ−１，２−グルカン（ソホロースなど）とを基質として、β−１，２−グルカンおよびリン酸を生成することができる。なお、ホスホリラーゼ活性を有するタンパク質は、一般的に加リン酸分解反応と共に逆反応を触媒することが知られている。従って、「１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質」であるか否かは、例えば、前記と同様に、被験タンパク質を基質であるα−Ｇ１Ｐおよびソホロースに作用させ、重合度３以上のβ−１，２−グルカンや無機リン酸が生成するか否かにより判定することができる。すなわち、加リン酸分解の逆反応を触媒する活性を有するタンパク質であるか否かにより、「１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ活性を有するタンパク質」であるか否かを判定することができる。β−１，２−グルカンの生成の程度は、例えば、無機リン酸量やβ−１，２−グルカン量を定量することにより測定することができる。
【００４９】
本発明の酵素剤を、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質の産生能を有する組換え微生物を用いて製造する場合、該組換え微生物としては、前記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを作動可能に連結してなる発現ベクターにより形質転換した宿主微生物が挙げられる。前記発現ベクターとしては、例えば、大腸菌や枯草菌などの宿主微生物への導入に適したベクターを選択することができ、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＵＣ１８、ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ３２ａ、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＪＥＸＯＰＴ２（特開２００９−１７８４１号公報参照）、ｐＨＴ０１、ｐＨＴ４３などのプラスミドベクターが挙げられる。これらのうち、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質を大腸菌で発現させる場合には、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＵＣ１８、ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ３２ａ、ｐＣｏｌｄＩおよびｐＧＥＸ−４Ｔが好ましく、枯草菌で発現させる場合には、ｐＪＥＸＯＰＴ２、ｐＨＴ０１およびｐＨＴ４３が好ましい。また、発現ベクターへのポリヌクレオチドの連結は、常法に従って実施することができる。
【００５０】
このようにして得られる発現ベクターは、大腸菌、枯草菌をはじめとする宿主微生物に導入し、組換え微生物（すなわち、形質転換体）を得ることができる。宿主微生物への導入は、常法に従って実施することができる。また、前記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などによりベクターを使用せずに宿主微生物に導入し、組換え微生物を得ることもできる。
【００５１】
本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質を生成する組換え微生物および天然微生物は、当該微生物の培養に適した培地において培養することができる。使用する培地は、微生物が生育でき、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質を産生しうる栄養培地であれば特に限定されず、合成培地および天然培地のいずれでもよい。また、時間、温度などの培養条件は、培養する微生物に適した条件を適宜選択することができる。
【００５２】
本発明の酵素剤の製造方法では、組換え微生物または天然微生物を培養した後、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質を採取する工程を含んでいてもよい。本発明の酵素剤の製造方法では、例えば、天然微生物あるいは組換え微生物を培養した後、溶菌剤、界面活性剤、超音波破砕またはビーズショッカーなどを用いて菌体細胞を破砕し、そのままもしくは不溶性画分を分離したものを粗酵素液とすることができる。本発明においては、粗酵素液をそのまま用いても、濃縮してから用いてもよい。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトンおよびアルコール沈殿法、平膜、中空膜法などを採用することができる。
【００５３】
本発明の酵素剤は、上記のように、粗酵素液をそのまままたは濃縮して用いることができるものの、必要に応じてカラムクロマトグラフィーなどにより分離・精製したものを利用することができる。例えば、培養液の上清または破砕処理物についてアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することにより、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質を、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素として得ることができる。
【００５４】
本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質が組換えタンパク質である場合には、組換え微生物の種類によっては酵素が菌体内に蓄積したり、培養液に蓄積したりすることがある。このような場合にも、前記のように、菌体またはその培養物をそのまま使用してもよいが、必要に応じて、細胞を破砕したものを用いてもよい。
【００５５】
＜β−１，２−グルカンの製造方法＞
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の酵素剤をα−Ｇ１Ｐとグルコースおよび／またはβ−１，２−グルカンとに作用させる工程を含んでなる、β−１，２−グルカンの製造方法が提供される。
【００５６】
本発明の酵素剤を、α−Ｇ１Ｐとグルコース（あるいはソホロースなどのβ−１，２−グルカン）に作用させると、１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ反応の逆反応によりα−Ｇ１Ｐのグルコース残基がグルコース（あるいはβ−１，２−グルカン）に転移し、結果としてβ−１，２−グルカンが生成する。生成したβ−１，２−グルカンに更にα−Ｇ１Ｐのグルコース残基が転移することで、β−１，２−グルカンが伸長していく。１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ反応の逆反応、すなわち、β−１，２−グルカンの生成反応の反応条件は、本発明の酵素剤の有効成分であるタンパク質の特性（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）に基づいて決定することができる。本発明においては、例えば、０．０５〜１．０Ｍ α−Ｇ１Ｐおよび０．１〜１．０Ｍ グルコースを含む反応水溶液（ｐＨ５．０〜８．０）を調製し、反応溶液に対し終濃度０．０１〜０．２ｍｇ／ｍＬ（基質固形分１ｇ当たり１０〜２５０Ｕ）の本発明の酵素剤を添加し、３０〜５０℃で２〜７２時間保持することでβ−１，２−グルカンを生成させることができる。
【００５７】
本発明のβ−１，２−グルカンの製造方法においては、本発明の酵素剤をα−Ｇ１Ｐとグルコースおよび／またはβ−１，２−グルカンとを含む糖質水溶液に作用させてもよい。該糖質水溶液はα−Ｇ１Ｐ並びにグルコースおよび／またはβ−１，２−グルカン以外の糖質を含んでいてもよく、例えば、フルクトースを含んでいてもよい。また、後述する本発明の酵素剤以外のホスホリラーゼの基質であるスクロース、デンプンなどの糖質を含んでいてもよい。
【００５８】
本発明においては、所望のβ−１，２−グルカンが得られた後、必要に応じて酵素の失活処理、濾過・脱色・脱臭・脱塩などの精製処理および／または濃縮処理を行うことができる。これらの処理は常法に従って実施することができる。得られたβ−１，２−グルカンは、適宜濃縮して液状品としてもよく、噴霧乾燥などにより粉末品としてもよい。さらに、膜分画・樹脂分画などの分画処理や微生物による資化処理などによって残存した原料・副産物を除去したり特定重合度のものを分取したりしてもよい。
【００５９】
本発明のβ−１，２−グルカンの製造方法においては、糖質の加リン酸分解によりα−Ｇ１Ｐを生成させる工程をさらに含んでいてもよい。上記加リン酸分解反応は、本発明の酵素剤以外のホスホリラーゼにより実施することができる。本発明のβ−１，２−グルカンの製造方法において、本発明の酵素剤に加えて本発明の酵素剤以外のホスホリラーゼを使用した場合、本発明の酵素剤以外のホスホリラーゼの加リン酸分解反応によりα−Ｇ１Ｐが供給され、生成したα−Ｇ１Ｐと、グルコース（あるいはβ−１，２−グルカン）に対して本発明の酵素剤が作用して、β−１，２−グルカンを製造することができる。この態様では、原料としてα−Ｇ１Ｐを添加することなく、反応系においてα−Ｇ１Ｐを供給しつつβ−１，２−グルカンを製造することができる点で有利である。
【００６０】
上記加リン酸分解反応を触媒するホスホリラーゼとしては、例えば、スクロースを基質とするスクロースホスホリラーゼ、デンプンを基質とするスターチホスホリラーゼが挙げられ、市販の酵素製剤を用いることができる。また、上記ホスホリラーゼの基質として用いられるスクロース、デンプンなどの糖質についても特に制限はなく、純品や各種混合物を用いることができる。α−Ｇ１Ｐの入手性やコストを考慮すると、安価で安定かつ大量に入手可能なα−Ｇ１Ｐ供給用基質およびグルコースを原料としてβ−１，２−グルカンを製造する本発明の製造方法は、工業生産上大きなメリットを有するといえる。
【００６１】
また、本発明のβ−１，２−グルカンの製造方法において、例えば、スクロースとグルコースを基質とし、本発明の酵素剤およびスクロースホスホリラーゼを用いてβ−１，２−グルカンを製造する場合、後記実施例に示される通り、スクロースとグルコースの基質濃度比を変化させることで得られる反応生成物の重合度が変化するため、基質濃度比を調整することで所望の重合度のβ−１，２−グルカンを製造することができる。具体的には、スクロースのグルコースに対する濃度比を高くすることで重合度の高いβ−１，２−グルカンを製造することができ、スクロースのグルコースに対する濃度比を低くする（すなわち、グルコースのスクロースに対する濃度比を高くする）ことで重合度の低いβ−１，２−グルカンを製造することができる。
【００６２】
本発明の酵素剤とスクロースホスホリラーゼを併用する場合の製造条件は使用する酵素の性質などに基づいて適宜調整することができる。例えば、α−Ｇ１Ｐ供給用基質０．２〜１．０Ｍおよびグルコース０．１〜１．０Ｍの水溶液を５０〜１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）を用いて調製し、終濃度０．０１〜０．２ｍｇ/ｍｌの本発明の酵素剤および終濃度０．０１〜０．２ｍｇ／ｍｌのα−Ｇ１Ｐ供給用ホスホリラーゼを添加し、３０〜５０℃に２〜１６８時間保持することでβ−１，２−グルカンを製造することができる。所望のβ−１，２−グルカン（β−１，２−グルカン含有組成物）が得られた後、必要に応じて酵素を失活させ、更に常法により濾過、脱色、脱臭、脱塩などの精製処理や濃縮処理を行うことができる。得られたβ−１，２−グルカンは、前記と同様の処理を行うことができる。
【実施例】
【００６３】
以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００６４】
種々の微生物について新規酵素探索を検討し、機能既知のタンパク質の配列と比較して相同性の低い配列としてビフィドバクテリウム・スカルドビイ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃａｒｄｏｖｉｉ）由来の仮想タンパク質（米国、ＮＣＢＩの登録ＩＤ情報：ＢＡＱ３２５２１．１）を選出し、以下の試験例の通りその機能を解析した。当該仮想タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２および図１に、塩基配列を配列番号：１および図２に示した。
【００６５】
試験例１：酵素の調製
以下の通り、ビフィドバクテリウム・スカルドビイ由来のタンパク質（以下、「ＢＳＧＰ」と略称する）を調製した。
【００６６】
ビフィドバクテリウム・スカルドビイ（ＪＣＭ１２４８９；国立研究開発法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室から入手）を変法ＧＡＭ培地（日水製薬株式会社）に植菌して、３７℃、嫌気条件下で数日培養した。培養後、ゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲ法を実施し、ＢＳＧＰのＤＮＡ配列を増幅した。ＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー：GAAGGAGATATACATATGTCCAACGCTGCAGAC（配列番号：３）およびリバースプライマー：GTGGTGGTGGTGGTGGCGTACTCGCGGCGCCGT（配列番号：４）を用いた。また、ベクターとしてｐＥＴ２１ｂ（メルク株式会社）を用い、これを鋳型としてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー：CACCACCACCACCACCAC（配列番号：５）およびリバースプライマー：ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAA（配列番号：６）を用いた。いずれの場合も、ＰＣＲ法は、９６℃１分を１サイクル、９８℃１０秒  ５５℃１５秒  ７２℃３５秒を３５サイクル、７２℃５分を１サイクルの条件にて行った。次いで、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて、ＢＳＧＰのＤＮＡ配列をｐＥＴ２１ｂにクローニングした。ＰＣＲ法に用いたプライマーはＢＳＧＰのＣ末端側にＨｉｓタグ配列を付加する設計で作製した。
【００６７】
次いで、該クローニングプラスミドにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（プロメガ株式会社）を形質転換し、ＬＢ培地にて３７℃で培養した。濁度（ＯＤ６６０）が０．４〜０．６になった時点でイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導を行い、１５℃で一晩培養した。培養後、菌体を回収して、菌体破砕緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．５）に懸濁した。該菌体懸濁液に対して、超音波破砕および遠心を行い、遠心上清を粗酵素液とした。該粗酵素液を、Ｎｉカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社）に供して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis）により精製ＢＳＧＰが得られたことを確認した（図３）。またＢｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより精製ＢＳＧＰは一量体であることを確認した（図３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるポリアクリルアミドゲル（１２．５％）はｅ・パジェル（アトー株式会社）を使用した。また、測定に当たってタンパク質は３μｇを供し、電気泳動は２０ｍＡの定電流で行った。Ｂｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおけるポリアクリルアミドゲル（５〜２０％）はＥｘｔｒａ ＰＡＧＥ Ｏｎｅ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（ナカライテスク株式会社）を使用した。また、測定に当たってタンパク質は２．５μｇを供し、電気泳動は１５ｍＡの定電流で行った。
【００６８】
試験例２：基質のスクリーニング
２０ｍＭのドナー（α−グルコース−１−リン酸（α−Ｇ１Ｐ））水溶液２０μＬ、２０ｍＭの各種アクセプター水溶液２０μＬ、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）５μＬおよび試験例１で得られた精製ＢＳＧＰ溶液を２倍希釈した溶液５μＬを混合し、３７℃で一晩反応させた。
【００６９】
得られた反応液を薄層クロマトグラフィー分析（展開溶媒：２−プロパノール：酢酸エチル：酢酸：水＝２：２：１：１）した結果を図４に示した。図４の通り、ソホロース（Ｎｏ．６）およびラミナリビオース（Ｎｏ．７）をアクセプターとして用いたサンプルにおいて伸長反応が確認された。ソホロースへの反応性が高いことから、ＢＳＧＰは１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼである可能性が高いと考えられた。
【００７０】
試験例３：反応生成物のＮＭＲおよびＭＳ解析
α−Ｇ１Ｐ １４．４ｍｇとソホロース６．９ｍｇを２００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５） １０μＬと超純水 ８６．８μＬの混合液に溶解した後に、ＢＳＧＰを３．２μＬ添加し、４０℃で２時間反応させた。８０℃で１０分保持することで反応を停止させた。α−Ｇ１Ｐとソホロースを基質としてＢＳＧＰを反応させ、得られた反応生成物中の三糖と推定される画分をＨＰＬＣ法にて分取した。ＨＰＬＣ法の分析条件は以下の通りであった。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Ｕｌｔｒｏｎ  Ｐ−８０Ｓの２連（φ８×５００ｍｍ、信和化工社製）
カラム温度：５０℃
溶離液：脱気超純水
流速：０．５ｍＬ／分
検出器：示差屈折計
打ち込み量：５０μＬ
分析時間：６０分
【００７１】
ＨＰＬＣ法により得られた分取サンプルについて、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量分析（ＭＳ）による解析を実施した。核磁気共鳴スペクトルは、核磁気共鳴分光計（ブルカー社）を用いて測定した。また、質量分析は、質量分析計を用いて測定した。その結果、当該三糖はβ−１，２結合で繋がった三糖であることが判明した（データ省略）。
【００７２】
以上の試験結果から、配列番号：２のアミノ酸配列を有するＢＳＧＰは、１，２―β―オリゴグルカンホスホリラーゼであると同定した。なお、当該アミノ酸配列と既知の１，２―β―オリゴグルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列の配列同一性は、既知酵素１（非特許文献１のＬｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ由来の１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ）に対して３４％、既知酵素２（非特許文献２のＬａｃｈｎｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来の１，２−β−オリゴグルカンホスホリラーゼ）に対して３７％であった。
【００７３】
試験例４：酵素の特性分析（１）
ａ）活性測定
５０ｍＭ α−Ｇ１Ｐ １０μＬ、５０ｍＭ ソホロース １０μＬ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）２０μＬからなる混合液に試験例１で調製したＢＳＧＰ（３．２〜１０．５μｇ／ｍＬ）を１０μＬ添加し、３０℃、１０分間保持した。これにモリブデン試薬（１８．７５ｍＭ 七モリブデン酸六アンモニウム四水和物、１２５ｍＭ 酢酸亜鉛、ｐＨ５．０）を５００μＬ添加して反応を停止させた。次いで、発色試薬（１０％ アスコルビン酸、ｐＨ５．０）を１２５μＬ添加し、３０℃、１０分間保持した後に吸光度（Ａ８５０）を測定して、反応によって生じた無機リン酸量を求めた。検量線作製には、ＫＨ２ＰＯ４（０〜１ｍＭ）を用いた。酵素活性単位１Ｕは、上記条件において反応１分間に１μｍｏｌの無機リン酸を生成する酵素量と定義した。
【００７４】
ｂ）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
至適ｐＨは、ｐＨ４．０〜１０．０における酵素活性を測定して求めた。具体的には、５０ｍＭ α−Ｇ１Ｐ１０μＬ、５０ｍＭ ソホロース１０μＬ、１００ｍＭ各ｐＨの緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５：フタル酸水素カリウム−ＮａＯＨ、ｐＨ５．５〜７．０：ＭＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．０〜８．５：ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ８．５〜９．０：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０〜１０．０：グリシン−ＮａＯＨ）２０μＬからなる混合液に、６．３μｇ／ｍＬのＢＳＧＰを１０μＬ添加し、３０℃、１０分間保持して酵素反応を進行させた。ＢＳＧＰの希釈には希釈緩衝液（２５ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、ＢＳＡ １ｍｇ／ｍＬ）を用いた。これにモリブデン試薬を５００μＬ添加して反応を停止させた。次いで、発色試薬を１２５μＬ添加し、３０℃、１０分間保持した後に吸光度（Ａ８５０）を測定して、反応によって生じた無機リン酸量を求めた。酵素活性は、生成した無機リン量に基づき前記ａ）の方法に従って算出した。最大活性を示す酵素活性を１００％とした場合の相対活性を図５に示す。
【００７５】
ｐＨ安定性は、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＧＰを５０ｍＭ濃度の各ｐＨの緩衝液で４℃、２４時間インキュベートした後に、希釈緩衝液にて６．７μｇ／ｍＬに希釈して酵素活性を測定することにより求めた。酵素活性の測定は、前記ａ）の方法に従って行った。最大残存活性を示す酵素活性を１００％とした場合の相対活性（残存活性）を図６に示す。
【００７６】
分析の結果、ＢＳＧＰの至適ｐＨは６．５〜７．５であり（図５）、ｐＨ５．０〜８．５において安定であった（図６）。
【００７７】
ｃ）至適温度および温度安定性
至適温度は、２５〜６０℃における酵素活性を測定して求めた。具体的には、５０ｍＭ α−Ｇ１Ｐ１０μＬ、５０ｍＭ ソホロース１０μＬ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）２０μＬからなる混合液に６．１μｇ／ｍＬ ＢＳＧＰを１０μＬ添加し、２５〜６０℃で１０分間保持して酵素反応を進行させた。これにモリブデン試薬を５００μＬ添加して反応を停止させた。次いで、発色試薬を１２５μＬ添加し、３０℃、１０分間保持した後に吸光度（Ａ８５０）を測定して、反応によって生じた無機リン酸量を求めた。酵素活性は、生成した無機リン量に基づき前記ａ）の方法に従って算出した。最大活性を示す酵素活性を１００％とした場合の相対活性を図７に示す。
【００７８】
温度安定性は、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＧＰを２５ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）で２５〜６０℃、３０分間インキュベートした後、４℃に冷却して、希釈緩衝液にて６．７μｇ／ｍＬに希釈して酵素活性を測定することにより求めた。酵素活性の測定は、前記ａ）の方法に従って行った。最大残存活性を示す酵素活性を１００％とした場合の相対活性（残存活性）を図８に示す。
【００７９】
分析の結果、ＢＳＧＰの至適温度は３５〜４５℃であり（図７）、４５℃以下で安定であった（図８）。
【００８０】
試験例５：酵素の特性分析（２）
ａ）基質特異性
５０ｍＭ α−Ｇ１Ｐ  １０μＬ、５０ｍＭ 各種糖質（Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｎ―アセチルグルコサミン、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、スクロース、ラクトース）１０μＬ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）２０μＬからなる混合液に１０．５μｇ／ｍＬ  ＢＳＧＰ（試験例１で調製）を１０μＬ添加し、３０℃、１０分間保持した後に吸光度（Ａ８５０）を測定して、反応によって生じた無機リン酸量を求め、酵素活性を決定した。
【００８１】
結果は表１に示される通りであった。ＢＳＧＰはソホロースに対して高い基質特異性を示した。
【表１】
2019129716.tif 000002
【００８２】
ｂ）見かけの反応速度定数
５０ｍＭ α−Ｇ１Ｐ１０μＬ、２．５〜２０ｍＭ ソホロース１０μＬ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）２０μＬからなる混合液に３．２μｇ／ｍＬ ＢＳＧＰを１０μＬ添加し、３０℃、１０分保持した後に吸光度（Ａ８５０）を測定して、反応によって生じた無機リン酸量を求めた。次いで、ＧｒａＦｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ７．０．３（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて、各濃度における反応速度について非線形近似を行い、ミカエリスメンテン式に適応させることで、反応速度定数を算出した。
【００８３】
結果は表２に示される通りであった。
【表２】
2019129716.tif 000003
【００８４】
ＢＳＧＰの触媒効率を示すｋｃａｔ／Ｋｍの値は４０．５Ｓ−１・ｍＭ−１であり、既知酵素１（非特許文献１）の１１±１Ｓ−１・ｍＭ−１と比較して４倍程度高く、既知酵素２（非特許文献２）の７．３±０．６Ｓ−１・ｍＭ−１と比較して６倍程度高い値であった。
【００８５】
試験例６：ホスホリラーゼを組み合わせたβ−１，２−グルカンの製造
１．０Ｍ スクロースと０．１〜１．０Ｍ グルコースを１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。該基質溶液１ｍＬに１９ｍｇ／ｍＬ ＢＳＧＰ（試験例１で調製）と１７ｍｇ／ｍＬスクロースホスホリラーゼ（Ｓｉｇｍａ社）を１０μＬずつ加え、３０℃で反応させた。反応７日目でサンプリングを行い、超純水で１０倍希釈した後に、１０分間煮沸することで反応を停止させた。その後、下記条件でＨＰＬＣ分析を行い、反応生成物の重合度分布を確認した。
【００８６】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＫ０２  ＡＳ
カラム温度：８０℃
溶離液：超純水
流速：０．７ｍＬ／分
検出器：示差屈折計（ＲＩ）
打ち込み量：５０μＬ（Ｂｒｉｘ１．０に希釈）
分析時間：１２０分
【００８７】
ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを図９〜１１に示した。図から明らかな通り、スクロース１．０Ｍに対しグルコース０．１Ｍの濃度比で反応させたサンプルは保持時間が短い高重合度のβ−１，２−グルカンが主に検出されたのに対し（図９）、グルコースの濃度比が高まるにつれて保持時間の長い低重合度のβ−１，２−グルカンの生成量が増加した（図１０および１１）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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