(57)【要約】【課題】シクログリシルプロリンを有効成分とするＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用の組成物の提供を課題とする。【解決手段】シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を有効成分として含有するＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を有効成分として含有するＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物。
【請求項２】
シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）として０．０００１〜１０質量％を含有する請求項１に記載のＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物を含む皮膚老化防止剤。
【請求項４】
皮膚外用剤である請求項３に記載の皮膚老化防止剤。
【請求項５】
化粧料である請求項３に記載の皮膚老化防止剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン合成を促進用組成物関する技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織は、細胞と細胞外マトリックスから構成されている。細胞外マトリックスは細胞の周囲に存在し、組織や器官に機械的な強さや柔軟性を与えるとともに、細胞が接着する足場となる。この細胞外マトリックスを構成する成分の代表的な分子は、コラーゲンである。コラーゲンは、体内の総タンパク量の約３０％を占める。
コラーゲンには様々なタイプが存在することが知られている。皮膚組織の真皮に存在するコラーゲンは、Ｉ型及びIII型コラーゲンが約９割を占め、残りはＶ型、VI型コラーゲンである。Ｖ型コラーゲンはマイナーコラーゲンであるが、近年の研究でコラーゲンが束になった構造の線維束形成に重要な機能を果たしていることが判明している。
【０００３】
近年の研究では、Ｖ型コラーゲンのα１鎖を欠損させたマウス（Ｃｏｌ５ａ１−／−）では全くコラーゲン線維を形成できず致死となることや、Ｃｏｌ５ａ１＋／−マウスでは大きさ・形の不揃いなコラーゲン線維が形成されることが明らかにされている（非特許文献１）。このことから、Ｖ型コラーゲンは、Ｉ型及びIII型コラーゲンを束ね、均一なコラーゲン線維形成に寄与していると考えられている（非特許文献２）。また、Ｖ型コラーゲンの遺伝子変異により発症するエーラス・ダンロス症候群（Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＥＤＳ）は、皮膚、関節、血管など全身的な結合組織が脆弱になる疾患であることも知られている（非特許文献３）。
また、加齢や光老化によりコラーゲンの線維束が細く脆くなること（非特許文献４）から、線維束形成にＶ型コラーゲンが重要な機能を果たしていることが考えられる。
そしてこれらの事実から、皮膚の弾力性や柔軟性を維持し或いは強化し、皮膚の老化を抑制するために、Ｉ型やIII型のコラーゲン産生を促進させるともに、Ｖ型コラーゲンの産生を促進させて、コラーゲン線維束を形成させることが、皮膚の健全な状態を維持するために重要であるということができる。すなわち、皮膚のＩ型コラーゲンやIII型コラーゲンとＶ型コラーゲンを共に増加させることによって、皮膚の老化防止が可能となる。
しかし従来の皮膚の老化抑制研究においては、皮膚コラーゲン線維束形成はあまり注目されていなかった。またＶ型コラーゲンについてもあまり注目されてこなかった。また、皮膚のＩ型コラーゲンやＶ型コラーゲンを共に増加させる物質については知られていない。
【０００４】
一方コラーゲンを加水分解し、ジペプチドの大きさにまで分解したコラーゲンペプチドの摂取は、肌の張りやつやを回復させ、老化を抑制することが知られている。そして、ヒト線維芽細胞培養中に添加した、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｐｒｏの４配列のジペプチドを主要成分として含むコラーゲンペプチドがＩ型コラーゲンの産生を増加させることが知られている（非特許文献５）。
また、これらのジペプチドが環状構造を形成したシクロジペプチドにさまざまな生理作用が見出されている。例えば抗癌・癌予防（特許文献１）、学習意欲の改善（特許文献２）、尿酸低下作用（特許文献３、４）、糖代謝改善作用（特許文献５）、ＧＬＰ−１低下作用（特許文献６）、皮膚保湿機能改善作用（特許文献７）、カロリー低減作用（特許文献８）、ＧＬＰ−２分泌促進作用（特許文献９）、レニン−アンジオテンシン系抑制作用（特許文献１０）等がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１６６９１１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／０７７７６０号
【特許文献３】国際公開第２０１５／１９４０３４号
【特許文献４】国際公開第２０１５／１９４２０５号
【特許文献５】国際公開第２０１５／１９４０７０号
【特許文献６】国際公開第２０１５／１９４４４７号
【特許文献７】特開２０１６−８４３４１号公報
【特許文献８】国際公開第２０１７／００２７６５号
【特許文献９】国際公開第２０１７／００２７８６号
【特許文献１０】国際公開第２０１７／００２８３８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】医学のあゆみ  Vol. 244 No. 6, pp515-520, 2013
【非特許文献２】Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (2006): 591-621
【非特許文献３】HUMAN MUTATION, Vol. 36, No. 5, 535-547, 2015
【非特許文献４】Invest Dermatol 88:445-515, 1987
【非特許文献５】第１５回日本抗加齢医学会総会  プログラム・抄録集  発行年月日平成２７年  ５月１２日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、コラーゲン由来のジペプチドの研究を行う過程で、ジペプチドであるグリシルプロリン（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）がジケトピペラジン構造をとって環状結合したシクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）は、ジペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏを超える強いＩ型コラーゲンとＶ型コラーゲンの両方のコラーゲン産生を促進することを見出し、本発明をなしたものである。
すなわち、本発明は、シクログリシルプロリンを有効成分とするＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用の組成物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を有効成分として含有するＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物。
（２）シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）として０．０００１〜１０質量％ を含有する（１）に記載のＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物。
（３）（１）又は（２）に記載のＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物を含む皮膚老化防止剤。
（４）皮膚外用剤である（３）に記載の皮膚老化防止剤。
（５）化粧料である（３）に記載の皮膚老化防止剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を有効成分として含有するＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物を開発した。本組成物は、皮膚外用剤として提供される。
またシクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）は皮膚老化防止剤、外用剤として効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｉ型コラーゲンの発現量を試験した結果を示すグラフである。
【図２】Ｖ型コラーゲンの発現量を試験した結果を示すグラフである。
【図３】年代別（若齢：１０代と高齢：８０代）の線維芽細胞を用いてＶ型コラーゲンの発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、シクログリシルプロリン（Ｃｙｃｌｏ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、以下「ｃＧＰ」）を有効成分として含有するＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物、皮膚老化防止剤、皮膚外用剤、化粧料である。
本発明でいう皮膚老化防止とは、老化に伴って減少する皮膚細胞のコラーゲン産生を活性化させて、皮膚の弾力性を維持するためのＩ型コラーゲン及びコラーゲン線維束の形成に重要なＶ型コラーゲンの産生を促進させてコラーゲン線維をより強固にすることをいう。
本発明の有効成分であるｃＧＰは、アミノ酸であるグリシンとプロリンがペプチド結合したジペプチドがさらにジケトピペラジン構造をとって環状結合した化合物である。
ｃＧＰは、次の一般式（１）で表すことができる。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
ｃＧＰは、アミド結合を介して二個のアミノ酸であるグリシンとプロリンの末端部分が結合している構造を有している。このため、分子末端部分に極性基であるカルボキシル基やアミノ基が露出している直鎖状ジペプチドと比較して脂溶性が高いという特徴を有する。そのため、特に皮膚外用剤として使用する場合には、直鎖状ジペプチドと比較してより高い皮膚透過性が期待できる。
【００１４】
本発明で用いるｃＧＰは、公知の方法に従って調製することができる。例えば、化学合成方法や酵素法、微生物発酵法により製造することができる。化学合成法としては、特開２００３−２５２８９６号公報に記載の方法で、直鎖状ペプチドであるグリシルプロリンを脱水及び環化させることにより合成することができる。
或いは、コラーゲンの酵素処理や熱処理によって得られるコラーゲンペプチドを、さらに加熱処理してシクログリシルプロリンを含有する処理物を製造することができる。コラーゲン又はコラーゲンペプチドを含有する溶液を熱処理して得られる処理物とは、具体的には、例えば、コラーゲンペプチドを水に２０〜５００μｇ／ｍＬの濃度で溶解させ、好ましくは８０〜１００℃の温度条件で、５分〜１２０時間、好ましくは３〜１０時間加熱して調製することができる。得られた処理物に対して、所望により、ろ過、遠心分離、濃縮、限外ろ過、凍結乾燥、粉末化等の処理を行ってもよい。
【００１５】
例えば、特許第５４５６８７６号公報に記載の方法に従って、コラーゲン分解物である直鎖トリペプチドを２５％以上含有する粉末を水に溶解し、これを９５℃で１８時間インキュベートしてコラーゲントリペプチドを環状化・脱離反応によってｃＧＰを生成させて、本発明に使用可能なシクログリシルプロリンを含む処理物を得ることができる。かくして得られる処理物を本発明の有効成分を含む組成物として用いることができる。
【００１６】
以上のようにして得られたｃＧＰは、Ｉ型及びＶ型コラーゲンの産生促進作用を有し、さらに皮膚の老化を防止する。
【００１７】
また本発明において使用するｃＧＰは、化学的に合成された化合物であっても使用可能である。また市販されているシクログリシルプロリンを一定量以上含有する組成物を購入して使用することもできる。本発明において使用可能な市販されているｃＧＰとしては、ｃＧＰを１０質量％以上含有するｃＧＰ１０（ゼライス株式会社）を例示することができる。
なおｃＧＰの含有量の分析は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行うことができる。
ＨＰＬＣの分析条件の一例を以下に示す。
【００１８】
逆相クロマトグラフィーの分析条件
Ｃｏｌｕｍ：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
Ｅｌｕｅｎｔ：Ａ）Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ（１００／０．１）、Ｂ）Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ（５０／５０／０．１）
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：４０℃
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１ｍＬ／ｍｉｎ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：０−１５ｍｉｎｓ  ０％  Ｂ、１５  ｔｏ  ３０  ｍｉｎｓ  ９０％  Ｂ、３０  ｔｏ  ３３  ｍｉｎｓ  １００％  Ｂ、３３  ｔｏ  ３５  ｍｉｎｓ  ０％  Ｂ、３５  ｔｏ  ５０  ｍｉｎｓ  ０％  Ｂ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ  ａｔ  ２１４ｎｍ
【００１９】
サイズ排除クロマトグラフィーの分析条件
Ｃｏｌｕｍ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅ（１０ｍｍ×３００ｍｍ）
Ｅｌｕｅｎｔ：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：３０℃
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１ｍＬ／ｍｉｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ  ａｔ  ２１４ｎｍ
シクログリシルプロリンの含有量は、クロマトグラムの全面積あたりの面積比から算出できる。
【００２０】
本発明のＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物又は皮膚老化防止剤におけるｃＧＰの含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、決定されるが、特に限定されるものではないが、Ｉ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物として好ましくは０．０００１〜１０質量％、特に好ましくは０．００１〜１質量％である。
【００２１】
ｃＧＰを有効成分として含有するＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進用組成物は、医薬品・医薬部外品、化粧料として使用可能である。
なお製剤化に当たっては、賦形剤やその他の有効成分を本発明の組成物の目的を阻害しない範囲で使用することができる。具体的には、シクロデキストリン、へミセルロース、リグニン、グアーガム、コンニャクマンナン、イサゴール、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、カルボキシルメチルセルロース、ポリデキストロースなどの食物繊維や増粘剤、食用油、カルシウム、鉄、ナトリウム、亜鉛、銅、カリウム、リン、マグネシウム、ヨウ素、マンガン、セレンなどのミネラル；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸などの脂溶性又は水溶性のビタミン群、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、リン脂質、アラビアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ローカストビーンガムなどの乳化剤や分散剤、増量剤、賦形剤、保存料・酸化防止剤、風味調整剤や香料、塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、コハク酸、乳酸ナトリウムなどの呈味料、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、アジピン酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸味料、マルチトール、アスパルテームなどの低カロリー甘味料、着色剤などである。
【００２２】
本発明の組成物は、試験例に示すとおり、線維芽細胞に直接作用して、線維芽細胞においてＩ型及びＶ型コラーゲン産生促進作用を発揮する。したがって化粧品のような、外用剤として使用することが作用機構上好ましい。
化粧料は、上記のとおりＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進作用を発揮できる組成であれば、配合成分には特に大きな制限はない。また形態も、液状、クリーム状、ゲル状など様々な形態であっても問題はない。また水中油型或いは油中水型のいずれの乳化組成物であっても良い。
【００２３】
ｃＧＰを有効成分として含有する皮膚老化防止剤は、医薬品・医薬部外品、化粧料として使用可能である。
なお製剤化に当たっては、Ｉ型及びＶ型コラーゲン産生促進用の組成物と同様に、賦形剤やその他の有効成分を本発明の組成物の目的を阻害しない範囲で使用することができる。具体的には、シクロデキストリン、へミセルロース、リグニン、グアーガム、コンニャクマンナン、イサゴール、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、カルボキシルメチルセルロース、ポリデキストロースなどの食物繊維や増粘剤、食用油、カルシウム、鉄、ナトリウム、亜鉛、銅、カリウム、リン、マグネシウム、ヨウ素、マンガン、セレンなどのミネラル；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ナイアシン、葉酸、パントテン酸などの脂溶性又は水溶性のビタミン群、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、リン脂質、アラビアガム、キサンタンガム、トラガカントガム、ローカストビーンガムなどの乳化剤や分散剤、増量剤、賦形剤、保存料・酸化防止剤、香料、塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、コハク酸、乳酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、アジピン酸、フマル酸、リンゴ酸などの酸味料、マルチトール、着色剤などである。
【００２４】
本発明の皮膚老化防止剤は、Ｉ型及びＶ型コラーゲン産生促進作用によってコラーゲン線維束を形成させ、加齢や光老化によって低下した皮膚の柔軟性を回復させ、或いは加齢や光による皮膚老化の進行を防止する。したがって化粧品のような、外用剤として使用することが作用機構上好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下に試験例を示し、本発明をさらに説明する。
＜試験例１：Ｉ型、Ｖ型コラーゲン産生促進試験＞
１．試験用細胞の播種と試験用サンプルの添加
正常ヒト線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＮＨＤＦ）をＤ−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で培養し、１２  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように播種した。
細胞がコンフルエントになったことを確認し、ＰＢＳ（−）で洗浄し、ＦＢＳ  ｆｒｅｅ  Ｄ−ＭＥＭに試験サンプルとして、比較対照のジペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ：ＧＰ（富士フイルム和光純薬株式会社））、及びｃＧＰ（ＢＡＣＨＥＭ）を、それぞれ１ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、これを１ｍＬ添加した。
【００２６】
２．ＲＮＡの回収
試験用サンプル添加後３時間、又は６時間後に細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、ＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社）を５００μＬ／ｗｅｌｌ添加し溶解後、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。
【００２７】
３．Ｉ型及びＶ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量の測定
全ＲＮＡを回収後、「５ｘ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘＰｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ」（タカラバイオ株式会社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量５００ｎｇを逆転写反応させた後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを含んだＰＣＲ酵素「ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑII」（タカラバイオ株式会社）、Ｃｏｌ１ａ１・Ｃｏｌ５ａ１プライマー、Ｅａｓｙ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ（タカラバイオ株式会社）を用いて１０倍希釈したｃＤＮＡ、滅菌精製水を混合しｔｏｔａｌ  ２０μＬに調整し、ＰＣＲ反応液を作成した。
作成したＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応装置Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈに入れ常法に従ってＰＣＲ増幅反応を行った。
【００２８】
測定に用いたプライマー配列は次のとおりである。
col1a1 PCR Forward Primer:
GCTTGGTCCACTTGCTTGAAGA（配列番号１）
col1a1 PCR Reverse Primer:
GAGCATTGCCTTTGATTGCTG（配列番号２）
col5a1 PCR Forward Primer:
TCCCTGACAAGAAGTCCGAAGG（配列番号３）
col5a1 PCR Reverse Primer:
CGTCCACATAGGAGAGCAGTTTC（配列番号４）
【００２９】
４．結果
測定結果を図１及び図２に示す。
なお測定結果は、試験試料無添加（ｃｏｎｔｒｏｌ）ウエルの測定結果を１とした相対値で示した。Ｉ型コラーゲン（ｃｏｌ１ａ１）の発現量は、試験試料添加６時間後の結果を示した。また、Ｖ型コラーゲン（ｃｏｌ５ａ１）の発現量は、試験試料添加３時間後の結果を示した。
【００３０】
線維芽細胞にＧＰ（０．１％）、ｃＧＰ（０．１％）を添加したところＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）発現量は、コントロールに比べｃＧＰ（０．１％）添加によって約１．４倍増加した。またＶ型コラーゲン（Ｃｏｌ５ａ１）発現量もコントロールに比べ約１．４倍産生促進されていた。これらの結果から、ｃＧＰが強いＩ型及びＶ型コラーゲンの産生促進作用を有することが確認された。
【００３１】
＜試験例２：若齢者及び高齢者の細胞におけるＶ型コラーゲン産生能測定＞
年代別（若齢：１０代と高齢：８０代）の線維芽細胞を用いてＶ型コラーゲンの発現量をリアルタイムＰＣＲにて確認した。
高齢では若齢よりＶ型コラーゲンの発現量が低い傾向であることがわかった（図３参照）。
このことから、老化に伴いＶ型コラーゲンが減少する為、Ｖ型コラーゲンの発現を高めることは皮膚老化防止に繋がると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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