(57)【要約】【課題】本発明は、植物に物質を導入する方法に関する。【解決手段】本発明の方法は、以下の工程：  （１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、  （１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、  （１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、  （１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、  （１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、  （２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、ことを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
ことを含む、上記方法。
【請求項２】
植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
ことを含む、上記方法。
【請求項３】
植物組織分解酵素が、ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ類、グルクロニダーゼ、ザイモリダーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ，ガラクタナーゼ，アラビナナーゼおよびリグニン分解酵素、並びに、これらの混合物からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
植物組織分解酵素がペクチナーゼを含む、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
植物が、単子葉植物である、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
植物が、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ及びソルガムからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
植物が、トウモロコシＢ７３又はＢ７３由来のトウモロコシ品種である、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
卵細胞を、植物の卵細胞を含む組織から単離した後に、精細胞融合によって、受精卵細胞とする、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
酵素処理時間が３分以上６０分以下である、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
酵素処理後、１２０分以内に工程（２）の物質導入を行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
精細胞融合の後、１２０分以内に工程（２）の物質導入を行う、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１２】
植物組織分解酵素がペクチナーゼを含み、そして、工程（１）の酵素処理時の系におけるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬが、６０以下である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
植物組織分解酵素がペクチナーゼを含み、そして、工程（１）の酵素処理時の系におけるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬ×処理時間が、３１０以下である、請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（２）の物質導入が、ＰＥＧ法又はエレクトロポレーション法を用いて行われる、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化または胚様体化し；そして、
（４）上記カルス化または胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
ことを含む、上記方法。
【請求項１６】
植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化または胚様体化し；そして、
（４）上記カルス化または胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
ことを含む、上記方法。
【請求項１７】
請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法で得られた、物質導入植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物に物質を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物、特に単子葉植物への遺伝子組換え技術は、１９９０年代にアグロバクテリウムを利用した方法がイネ、トウモロコシで開発されたことを契機に急速に利用が普及し、現在までに様々な形質転換方法が開発されてきている。しかしながら、それらの多くは、植物組織の脱分化と再分化を経由することが必要であるが故に、種や品種間で形質転換の効率が大きく異なることが知られている。種や品種によっては形質転換の効率が低く、再現性をもって形質転換植物を得ることができない。例えば、トウモロコシにおいて育種上非常に重要な系統であるＢ７３では、再現性を持った形質転換法はいまだ開発されていない。
【０００３】
また、近年効率的にゲノム編集を行うことが可能になりつつあるが、これも作物種、品種ごとに組織培養の容易性が異なる点が、ゲノム編集効率に大きな影響を与えるため、植物におけるゲノム編集実用化の妨げとなっている。
【０００４】
一方、１９９０年代に、植物体から精細胞と卵細胞を単離し、それらを人工的に融合させる人工受精が試みられ、植物体の作出に成功している。非特許文献１には、トウモロコシの卵細胞及び精細胞を電気融合して受精卵細胞を作出し、それを植物体にまで培養する方法が記載されている。非特許文献１では卵細胞の分離に酵素の混合物（０．７５％  ペクチナーゼ（Ｓｅｒｖａ）、０．２５％  ペクトリアーゼ、０．５％  ヘミセルロース、０．５％  セルラーゼ）を用いているが、用いた酵素、特にペクチナーゼの力価が高い。また、その卵細胞を用いて作製した受精卵細胞を用いて遺伝子導入、形質転換を行った旨の記載もない。
【０００５】
また、非特許文献２には、イネの雌雄配偶子（卵細胞と中心細胞）の単離方法が記載されている。具体的には植物体から胚珠を単離後、０．３Ｍマンニトール溶液中で、酵素処理（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇマンニトール溶液＋０．３％  ペクトリアーゼ  Ｙ−２３、１．５％  ペクチナーゼ、１％  セルロース、１％  ヘミセルロースで１０〜１５分処理）を行っているが、非特許文献１と同様に、酵素、特にペクチナーゼの力価が高い。さらに、対象は受精卵でなく受精前卵細胞であり、植物までの再生、植物への遺伝子導入、形質転換を行った旨の記載もない。
【０００６】
非特許文献３及び非特許文献４には、イネの雌雄配偶子の電気融合により、受精卵を作出し、それを植物体にまで培養する方法が記載されている。これら先行文献には、人工的に雌雄配偶子を融合させた受精卵細胞から植物体の誘導が可能であることが示されている。しかしながら、上記文献においても、非特許文献と同様に遺伝子導入や形質転換といった点は全く記載されておらず、受精卵を用いて形質転換が行えるかどうかは全く不明であった。なお、非特許文献３および４には、卵細胞を酵素処理することの記載もない。
【０００７】
トウモロコシ（非特許文献５、１２）、イネ（非特許文献６）、コムギ（非特許文献７）、オオムギ（非特許文献８、１０）、タバコ（非特許文献９）などの種においては、受精後の胚嚢から受精卵を採取・培養し、植物体を作出した例も知られている。その中には非特許文献５、１０のように、受精卵細胞にＤＮＡをマイクロインジェクション法により導入できることを示した報告もあるが、この方法が実用化された事実は報告されていない。また、そのほかの方法による遺伝子導入については全く知見がない。
【０００８】
植物細胞に遺伝子を導入する方法は、マイクロインジェクション法以外にポリエチレングリコール法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ法）やエレクトロポレーション法などがある。この中でもマイクロインジェクション法は細胞壁を有する細胞にも遺伝子導入が可能であり、導入対象の植物細胞の細胞壁を酵素処理等により除去する必要は特にない。しかし、一回の導入操作で一細胞しか扱えないという欠点がある。それに対しエレクトロポレーション法やＰＥＧ法、特にＰＥＧ法は、マイクロインジェクション法に比べ一回に多数の細胞を扱える利点があるが、細胞壁を酵素等により除去する過程が必要である。受精卵細胞については、細胞壁を除去する方法であって、細胞壁除去後に細胞分裂を継続し植物体に成長できるような、細胞活性を維持した状態で細胞壁を除去する方法、が不明であった。そのため、受精卵細胞について、ＰＥＧ法等の方法により遺伝子導入を行い、細胞分裂にまで至らせた報告はなされていなかった。上記報告の中でも、イネ、コムギ、オオムギの受精卵細胞は、セルラーゼ等の細胞壁を取り除く酵素を利用せずガラス針等を用いることのみによって受精卵細胞を摘出している。このような物理的手法で単離した受精卵には細胞壁が残存しており、ＰＥＧ法を適用することは困難であると推察され、事実ＰＥＧ法が適用された例も報告されていない。
【０００９】
酵素処理による細胞壁除去については、従来から細胞壁分解酵素であるセルラーゼ及びペクチナーゼ等による処理が、植物細胞のプロトプラスト化に有効であることが知られている。しかしながら、高濃度もしくは長時間に及ぶ処理は、植物細胞に害作用を与えることもある。一方、低濃度もしくは短時間による処理では細胞壁の除去が不完全で、プロトプラスト化の所望の目的が果たせない場合もある。そのため、植物において卵細胞や受精卵細胞の単離、培養が比較的に多く研究されているトウモロコシでさえ、受精卵細胞をプロトプラスト化し、ＰＥＧ法で遺伝子導入された例がなく、そのようなことが可能か否かも不明であった。
【００１０】
実際に、非特許文献５には、トウモロコシに対するごく短時間（２分間）での酵素処理によって受精卵を単離し、マイクロインジェクションによる遺伝子導入を行った旨が記載されている。また、非特許文献９では、タバコを材料に非常に弱いペクチナーゼ活性を示すマセロザイムＲ１０を用い、２段階で合計最大１時間の酵素処理が記載されている。非特許文献５および９に記載の２法のように、極めて短時間の酵素処理もしくは、非常に弱い酵素で長時間の酵素処理を行っているのは、酵素処理が受精卵細胞の活性及び発生能に負の効果をもたらすと考えられ、その影響を最小限にするためと推察される。しかし、短時間の酵素処理あるいは弱い活性を有する酵素での処理では受精卵細胞の細胞壁が完全に除去されず、ＰＥＧ法の材料としては不向きだと考えられる。そのため今まで受精卵に対しＰＥＧ法を適用した例はなく、また、ＰＥＧ法を行った受精卵細胞が分裂能を維持することができるか否かは不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kranz, E. and Lorz, H., (1993), Plant Cell 5:739-746.
【非特許文献２】Uchiumi, T. et al., (2006), Sex. Plant Reprod. 19:37-45.
【非特許文献３】Uchiumi, T. et al., (2007), Planta 226:581-589.
【非特許文献４】Okamoto, T., (2011), Methods Mol. Biol. 710:17-27.
【非特許文献５】Leduc, N. et al., (1996), Developmental Biology 177: 190-203.
【非特許文献６】Zhang, J. et al., (1999), Plant Cell Reports 19:128-132.
【非特許文献７】Kumhehn, J. et al., (1997), Plant Cell Reports 16: 663-667.
【非特許文献８】Holm, P. B. et al., (1994), The Plant Cell 6: 531-543.
【非特許文献９】Yuchi, H.E. et al., (2004), Chinese Science Bulletin 49: 810-814.
【非特許文献１０】Holm, P. B. et al., (2000), Transgenic Research 9: 21-32.
【非特許文献１１】Abiko, et al., (2013), Journal of Experimental Botany 64: 1927-1940.
【非特許文献１２】Leduc, et al., (1995), Sex Plant Reprod. 8:313-317.
【非特許文献１３】Yoo, et al.,(2007), Nat Protoc. 2(7):1565-72.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、植物に物質を導入する方法、本発明の方法によって物質が導入された植物を提供することを目的とする。
【００１３】
受精卵は本来、植物体へと成長する能力を保有した細胞であり、それゆえ、種、品種間差によって生じる培養効率の影響を受けないことが期待される。このような受精卵細胞を対象に物質の導入を行えば、現状より幅広い種、作物に形質転換及びゲノム編集が行える。本発明者らは鋭意検討の結果、受精卵細胞の活性を失わずプロトプラスト化する方法を発見し、さらには受精卵を効率よく単離する方法、単離した受精卵細胞を培養する方法を組み合わせることにより、受精卵細胞に対し物質を導入し、分裂を誘導し、形質転換が可能であることを見出し、本発明を想到した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
ことを含む、上記方法。
［態様２］
植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
ことを含む、上記方法。
［態様３］
植物組織分解酵素が、ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ類、グルクロニダーゼ、ザイモリダーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ，ガラクタナーゼ，アラビナナーゼおよびリグニン分解酵素、並びに、これらの混合物からなる群から選択される、態様１又は２に記載の方法。
［態様４］
植物組織分解酵素がペクチナーゼを含む、態様１−３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］
植物が、単子葉植物である、態様１−４のいずれか１項に記載の方法。
［態様６］
植物が、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ及びソルガムからなる群から選択される、態様５に記載の方法。
［態様７］
植物が、トウモロコシＢ７３又はＢ７３由来のトウモロコシ品種である、態様１−６のいずれか１項に記載の方法。
［態様８］
卵細胞を、植物の卵細胞を含む組織から単離した後に、精細胞融合によって、受精卵細胞とする、態様１−６のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］
酵素処理時間が３分以上６０分以下である、態様１−８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
酵素処理後、１２０分以内に工程（２）の物質導入を行う、態様９に記載の方法。
［態様１１］
精細胞融合の後、１２０分以内に工程（２）の物質導入を行う、態様８又は９に記載の方法。
［態様１２］
植物組織分解酵素がペクチナーゼを含み、そして、工程（１）の酵素処理時の系におけるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬが、６０以下である、態様９に記載の方法。
［態様１３］
植物組織分解酵素がペクチナーゼを含み、そして、工程（１）の酵素処理時の系におけるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬ×処理時間が、３１０以下である、態様１−１２のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］
工程（２）の物質導入が、ＰＥＧ法又はエレクトロポレーション法を用いて行われる、態様１−１３のいずれか１項に記載の方法。
［態様１５］
植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化または胚様体化し；そして、
（４）上記カルス化または胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
ことを含む、上記方法。
［態様１６］
植物に物質を導入する方法であって、以下の工程：
（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化または胚様体化し；そして、
（４）上記カルス化または胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
ことを含む、上記方法。
［態様１７］
態様１−１６のいずれか１項に記載の方法で得られた、物質導入植物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、従来培養困難であった植物、例えばトウモロコシＢ７３、であっても、培養、物質の導入及び形質転換を行うことが可能となった。これにより、形質転換が困難であったため有用形質を付与することできなかった植物体であっても、安定して再現性良く形質転換体を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、酵素処理後のトウモロコシ（Ｂ７３）珠心切片の透過像である。
【図２】図２は、単離されたトウモロコシ（Ｂ７３）受精卵細胞の光学顕微鏡写真である。
【図３】図３は、分裂を開始したトウモロコシ（Ｂ７３）受精卵細胞由来の胚性細胞塊の光学顕微鏡写真である。
【図４】図４は、成長した図３由来のトウモロコシ（Ｂ７３）受精卵細胞由来の胚性細胞塊の光学顕微鏡写真である。
【図５】図５は、図３及び４のトウモロコシ（Ｂ７３）の胚性細胞塊から発生したシュートの光学顕微鏡写真である。
【図６】図６は、図３−図５の胚性細胞塊から再生したトウモロコシ（Ｂ７３）受精卵細胞由来植物体である。
【図７】図７は、ＰＥＧ法によるＧＦＰ核酸導入後、分裂を開始したトウモロコシ（Ｂ７３）受精卵細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、植物に物質を導入する方法に関する。
【００１８】
本発明の方法は、以下の工程：
（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
ことを含む。
【００１９】
本発明の方法は、また、別の態様において、以下の工程：
（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する、
ことを含む。
【００２０】
本発明の方法は、また、さらに別の態様において、以下の工程：
（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、あるいは、
（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化または胚様体化し；そして、
（４）上記カルス化または胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
ことを含む。
【００２１】
本発明の方法は、また、さらに別の態様において、以下の工程：
（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことにより、酵素処理された単離受精卵細胞を取得し；そして、
（２）得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入し；
（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化または胚様体化し；そして、
（４）上記カルス化または胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、
ことを含む。
【００２２】
植物
植物の種類は特に限定されるものではない。双子葉植物および単子葉植物のいずれでもよく、好ましくは単子葉植物である。さらに好ましくは、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、ライムギ等であり、最も好ましくは、トウモロコシ、コムギ、イネである。
【００２３】
本発明の方法は、限定されるわけではないが、特に、「難培養」とされる植物あるいは品種に用いることが可能である。「難培養」とは、培養が困難、具体的には、例えば、植物体から単離された細胞の培養が困難、脱分化等の処理によるカルスの形成や、カルスからの植物体への再分化が困難である、ことを意味する。
【００２４】
一般的に双子葉植物よりも単子葉植物の方が培養困難だが、「難培養」の植物は、例えば、大豆、インゲンマメ、トウガラシ等を含む。難培養品種とは、同じ種の一般的な研究用品種（トウモロコシならＡ１８８など）と比べ、培養が困難である品種を意味する、例えば、トウモロコシのＢ７３およびＢ７３を由来に持つトウモロコシのエリート品種、コムギのエリート品種（例えばＡＣ  ＢａｒｒｉｅやＴＡＭなど）、オオムギのＧｏｌｄｅｎＰｒｏｍｉｓｅとＩｇｒｉ以外の品種、ソルガムの２９６Ｂ、Ｃ４０１、ＳＡ２８１、Ｐ８９８０１２、Ｐｉｏｎｅｅｒ  ８５０５、Ｔｘ４３０以外の品種などが挙げられる。
【００２５】
受精卵細胞
本発明において、物質を導入する細胞は、接合子、即ち、受精卵細胞であることが好ましい。受精卵細胞は、植物の胚嚢を含む組織から単離される受精した卵細胞である、即ち、植物体の段階で受粉・受精させ、該植物体から単離した受精卵細胞、であってもよい。あるいは、受粉・受精前の植物体から卵細胞および精細胞を単離したのち、それらを融合させて受精卵細胞を作出および取得してもよい。即ち、酵素処理された単離受精卵細胞は、
（１−ｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離し、その後、当該受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、
（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
（１−ｉｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理すると同時に、酵素処理された受精卵細胞を単離する、
（１−ｉｖ）植物体から卵細胞および精細胞を単離し、それらを融合することで受精卵を作出し、その後、当該受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する、あるいは、
（１−ｖ）植物の卵細胞を含む組織を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理し、次いで、酵素処理された卵細胞を単離、さらに、単離した精細胞と融合させる、
ことのいずれによって取得されうる。
【００２６】
適切な浸透圧の溶液中において胚嚢を含む組織例えば胚珠を切断し、その切断面から出て来た（受精）卵細胞を顕微鏡下においてガラスキャピラリー等を用いて単離することができる。なお、この場合、酵素処理は単離した（受精）卵細胞に対し酵素溶液で一定時間処理することで酵素処理された受精卵を得る。
【００２７】
あるいは、酵素溶液で胚珠を一定時間処理した後に、例えば、ガラス針等を用いて顕微鏡下において珠心等の組織を解剖し摘出、単離することもできる。この場合、その後の酵素処理を行うことなく酵素処理（受精）卵が得られる。なお、単離した卵細胞と精細胞の融合によって受精卵を得る場合の酵素処理は、卵細胞単離の前、同時あるいは精細胞との融合後のいずれの段階であってもよい。
【００２８】
酵素処理
本発明の方法は、植物の（受精）卵細胞を含む組織から、（受精）卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理することを特徴とする。酵素処理は、（受精）卵細胞を組織から単離する前、単離と同時、あるいは、単離の後、のいずれの時期に行っても良い。
【００２９】
（ｉ）酵素の種類
植物の細胞壁は、セルロースからなる基本骨格が他の多糖やタンパク質からなる基質（マトリックス、基質ゲル）の中に埋め込まれている。基質を構成する多糖は、伝統的に熱水や酸性緩衝液で抽出されるペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）と、アルカリに可溶な成分であるヘミセルロース（ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）に分けられているが、最近ではマトリックス多糖（ｍａｔｒｉｘ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）としてまとめられることが多い。
【００３０】
多くの被子植物の細胞壁はタイプＩと呼称され、セルロースとキシログルカンが多く、ペクチン、アラビノキシラン、グルコマンナン、ガラクトグルコマンナンなどが含まれる。一方、単子葉類の一部（イネ目）の細胞壁はタイプＩＩと呼称され、セルロースとキシラン（グルクロノアラビノキシラン）、１，３−１，４−β−Ｄ−グルカンが多く、ペクチンやキシログルカンが少ない。またタイプＩの細胞壁では、構造タンパク質（エクステンシンなど）が大きな役割を果たしているが、タイプＩＩ細胞壁ではタンパク質含量が低く、フェノール酸（フェルラ酸など）の架橋がその代わりを果たしている。
【００３１】
本発明の方法に用いる酵素は、植物組織分解酵素であれば、特に限定されない。「植物組織分解酵素」とは、植物組織および細胞周辺のペクチン、セルロース、ヘミセルロース、そのほかのマトリックス多糖、リン脂質、タンパク質等に直接あるいは間接的に作用して分解する酵素の総称である。例えば、非限定的に、プロトプラスト調製用酵素、細胞膜を分解するフォスフォリパーゼ、組織分解に役立つと考えられているタンナーゼ、イネなどタイプＩＩ細胞壁に含まれる成分を分解するフェルラ酸エステラーゼ、プロテアーゼ等が含まれる。特に、植物細胞の細胞壁を溶解してプロトプラストを調製するために使用される、種々のプロトプラスト調製用酵素が使用されうる。
【００３２】
例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ類（ヘミセルラーゼとは、一般的にヘミセルロースを加水分解する酵素の総称を指す）、グルクロニダーゼ、ザイモリダーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ，ガラクタナーゼ，アラビナナーゼおよびリグニン分解酵素、あるいは、これらの混合物（これら酵素群のうち２種以上の混合物）が含まれる。ペクチナーゼは、例えば、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼおよびペクチンエステラーゼを含む。本明細書において、特に言及しない場合、ペクチナーゼの力価は、これらの３種類の酵素の力価を足したものを意味する。
【００３３】
好ましくは、植物組織分解酵素はペクチナーゼを含む。ペクチナーゼ単独であっても、あるいは、ペクチナーゼと上記記載の群から選ばれる別の一種以上の酵素を含んでもよい。好ましくは、セルラーゼおよびペクチナーゼである。
【００３４】
ペクチナーゼは、ペクチンを分解する酵素反応系を触媒する酵素群の総称である。（ａ）ペクチン又はポリガラクツロン酸のα-１，４結合を加水分解するポリガラクツロナーゼ、（ｂ）脱離反応により主鎖を分解するペクチンリアーゼとポリガラクツロン酸リアーゼ、（ｃ）ペクチンのメチルエステルを加水分解するペクチンメチルエステラーゼに分類されている。ペクチナーゼは、植物の組織における個々の細胞同士の結合部（中層）に作用し、組織を単細胞にまでバラバラにする作用がある酵素であり、特に植物細胞を破壊せずに遊離させるマセレーションや植物細胞工学上重要な酵素である。ペクチナーゼとしては、例えば、商品名マセロザイムＲ１０（商標）（Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ）（ヤクルト本社製）等のポリガラクツロナーゼを含むもの、ペクトリアーゼＹ２３（Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ  Ｙ２３）（盛進製薬製）、及びペクチナーゼ（Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ製）等のペクチンリアーゼを含むものがある。好ましくはマセロザイムＲ１０とペクトリアーゼＹ２３の混合使用、もしくはペクチナーゼＹ２３の単独使用等があげられる。
【００３５】
セルラーゼは、植物の細胞壁成分であるセルロースのβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素である。セルラーゼとしては、例えば、商品名セルラーゼ・オノズカＲＳ（商標）（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ＯｎｏｚｕｋａＲＳ）（ヤクルト本社製）、セルラーゼ・オノズカＲ１０（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ＯｎｏｚｕｋａＲ１０）（ヤクルト本社製）、ドリセラーゼ（Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ）（協和発酵製）等が用いられる。好ましくは、セルラーゼ・オノズカＲＳ（商標）及びセルラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）でさらに好ましくはセルラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）である。
【００３６】
（ｉｉ）酵素の力価（Ｕｎｉｔ）
本発明の方法において、植物の受精卵細胞を処理する植物組織分解酵素は「低力価条件」で用いる。
【００３７】
「低力価条件」とは、植物組織を分解するために各酵素を用いる際に一般に使用する条件よりも、より酵素が機能しない条件（本発明においては分解酵素であるため、対象物質を分解する酵素活性が低い条件）、具体的には、短い処理時間、および／又は、低い酵素濃度（低い酵素活性：低Ｕｎｉｔ／ｍＬ）、を意味する。特には、通常のプロトプラスト調製条件よりも短い処理時間、および／又は、低い濃度が好ましい。「低力価条件」に相当する条件は、用いる酵素の種類、植物の種類等によって、適宜変更しうる。
【００３８】
本明細書の実施例において、今まで植物組織における細胞間の結合に作用すると考えられてきたペクチナーゼが、単細胞である受精卵の単離のみならずその後の植物体までの再生能に大きな影響を与えることが見出された。受精卵細胞を酵素処理する際の酵素溶液に含まれるペクチナーゼ濃度が低いとき、単離した受精卵細胞が植物体まで再生できる、或いは／並びに、核酸導入が可能である、ことが見出された。特に、トウモロコシＢ７３において、酵素溶液に含まれるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬが６０以下であり、そして、Ｕｎｉｔ／ｍＬ×時間が３１０以下である場合に、胚性細胞塊が取得できることが確認できた。
【００３９】
よって、本発明において、植物組織分解酵素がペクチナーゼの場合、そして、工程（１）の酵素処理時の系におけるペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬは、非限定的に、好ましくは６０以下、４０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、１以下である。酵素溶液のＵｎｉｔ／ｍＬが６０以上である場合には、卵細胞へのダメージが起きるため、好ましくない。Ｕｎｉｔ／ｍＬの下限は特に限定されない。好ましくは、０．１以上、０．２以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．６５以上である。Ｕｎｉｔ／ｍＬ×時間は、好ましくは３１０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１００以下、５０以下、３０以下である。Ｕｎｉｔ／ｍＬ×時間の下限は特に限定されない。好ましくは、１以上、２以上、３以上、３．３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上である。
【００４０】
（ｉｉｉ）酵素処理の時間
酵素処理の時間は、非限定的に、好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上である。好ましくは６０分以下、５０分以下、４５分以下である。より好ましくは、３分以上６０分以下、５分以上５０分以下、５分以上４５分以下である。
【００４１】
濃い（高Ｕｎｉｔ／ｍＬである）酵素液で短時間処理の場合、個体による酵素処理結果の差異が生じ好ましくない。これは具体的には、例えば、（受精）卵細胞の単離のために最初に植物の胚嚢を含む子房または胚珠の一部をカミソリ等で切り出すが、切端（機械的処理の場合は、例えば胚珠を押す等の処理により切端より（受精）卵細胞を押し出すことが可能である）から（受精）卵細胞までの距離はその胚珠により様々である。特に、切端から（受精）卵細胞までの距離が遠い場合、酵素液が浸透して（受精）卵細胞に接するまでに時間がかかる。このようなタイムロスにより、濃い酵素液で短時間処理を行う場合、実際に（受精）卵細胞を酵素処理している時間は短くなるため、胚珠ごとに酵素処理の効き目が異なり、いわゆるムラになる。ほとんど酵素処理されていないような胚珠由来の（受精）卵は、物質導入が上手くいかず、結果として（薄い酵素濃度×長時間処理と比べると）形質転換効率は落ちる。
【００４２】
これに対し、薄い酵素液で長時間処理の場合、切端から（受精）卵の距離が多少異なっていても、酵素液が十分（受精）卵まで浸透する時間がとれるため、酵素処理が十分に行われる。よって、胚珠ごとの酵素処理の程度にムラが低くなり、結果として形質転換効率の向上につながる。よって、一定時間以上処理を行うことは重要である。また、長時間処理も受精卵の細胞活性を低下させることにつながるため、好ましくない。
【００４３】
プロトプラストの調製の場合には、一般に長時間（４時間以上）を要する。本発明の酵素処理はプロトプラスト調製のよりも明らかに短時間で行う。
【００４４】
（ｉｖ）酵素処理のその他の条件
酵素処理を行う際、浸透圧を調整するのが好ましい。浸透圧の調整方法は特に限定されないが、例えば、オスモライトの添加により行われる。具体的には、多価アルコールや、アミノ酸などの添加により行われる。好ましくは多価アルコールの添加であり、非限定的に、好ましくはマンニトール、マルトース、グルコース、ソルビトール、ラフィノース、トレハロースやオリゴ糖などを利用できる。
【００４５】
好ましい浸透圧は、用いる植物の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、イネでは下限を３８０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ以上とすることが好ましく、３９０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ以上とすることがより好ましく、４００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を４７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ以下とすることが好ましく、４６０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ以下とすることがより好ましく、４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ以下とすることがさらに好ましい。トウモロコシでは、下限を６００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ以上とすることが好ましく、６３０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を７００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ以下とすることが好ましく、６８０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ以下とすることがさらに好ましい。
【００４６】
ｐＨは、プロトプラストが製造できるｐＨ範囲であれば特に制限はない。ｐＨ５．０以上７．０以下が好ましい。
【００４７】
酵素処理を行う温度については、使用する酵素により適宜設定することが可能である。ただし１０℃未満の条件では、期待される酵素活性が十分に得られない酵素が多いので、１０℃以上が好ましい。
【００４８】
物質の導入
本発明の植物に物質を導入する方法は、得られた酵素処理された単離受精卵細胞に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する工程（工程（２））を含む。
【００４９】
本発明において、植物に導入される物質は、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される。核酸は特に限定されず、ＲＮＡ、ＤＮＡ、両者の結合体、混合物であってもよい。好ましくはベクターのような環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＲＮＡまたは直鎖ＲＮＡである。使用される形質転換方法に応じた任意の長さのものを使用可能である。例えば、ＰＥＧ法を用いる場合、核酸の長さは、好ましくは１００ｋｂ以下、より好ましくは、５０ｋｂ以下である。さらに好ましくは３０ｋｂ以下、もっとも好ましくは２０ｋｂ以下である。
【００５０】
ゲノム編集のためのＣａｓ９ヌクレアーゼ等ヌクレアーゼや、修飾酵素、抗体等のタンパク質も導入しうる。タンパク質の大きさは、非限定的に、好ましくは分子量３００ｋＤａ以下、より好ましくは、２００ｋＤａ以下である。
【００５１】
ペプチドは、決まった順番で様々なアミノ酸が、アミド結合（「ペプチド結合」ともいう）つながった分子の総称で、一般にタンパク質よりも長さが短い。好ましくは、１００ａ．ａ．以下、より好ましくは、５０ａ．ａ．以下である。
【００５２】
２種類以上の核酸、タンパク質及びペプチドを導入してもよい。核酸とタンパク質など異なる種の物質を導入してもよい。
【００５３】
物質を植物に導入する方法は、植物に所望の物質を導入することのできる公知の方法ならば特に限定されず、植物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法などの物理化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）あるいはアグロバクテリウム法などの生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）を好ましく用いることができる。本発明の方法は、植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理することを特徴とする。よって、物質を導入する工程に用いる方法は、植物の細胞壁が酵素により分解された状態（プロトプラスト）を用いる方法が好ましい。好ましくは、ＰＥＧ法又はエレクトロポレーション法であり、最も好ましくはＰＥＧ法である。
【００５４】
ＰＥＧ法とは、プロトプラストにポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）を作用させて、ＤＮＡを植物細胞内部に取り込ませる。このＤＮＡ取り込みの仕組みはまだ良く分かっていない。ＰＥＧ法については、例えば、非特許文献１３などに記載されているように、公知のプロトコールに従って実施することができる。
【００５５】
エレクトロポレーション法は、細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、細胞懸濁液中のＤＮＡを細胞内部に送り込むことで、形質転換する方法である。植物細胞を材料とする場合には、細胞壁を分解除去したプロトプラストを用いるのが一般的である。しかし、細胞壁を有する細胞を用いて形質転換をすることも可能であり、これはエレクトロインジェクション法と呼ばれている。エレクトロポレーション法やエレクトロインジェクション法では、２種類以上のＤＮＡを懸濁液中に溶解し植物細胞存在下で電気パルスをかけることにより、共形質転換を行うことができる。
【００５６】
卵細胞は、受精前は通常の体細胞とは異なる状態の細胞壁を有し、卵細胞と精細胞とが融合するとはじめて完全な細胞壁が形成される。細胞壁が形成されると物質導入処理を行うために細胞壁を除去する必要がある。よって、卵細胞の単離時に酵素処理を行い、その後受精あるいは細胞融合を行う場合は、受精あるいは細胞融合後速やかに物質導入操作を行い、物質導入操作は細胞壁の形成完了前に行うことが好ましい。一般に、受精から２０分程度で細胞壁の形成が始まり、約２時間程度でその形成が完了するとされているため、２時間（１２０分）以内に物質導入を行うことが好ましい。また、受精卵細胞を胚珠等から単離する際に酵素を用いる場合も、単離後速やかに物質導入操作を行うことが好ましい。
【００５７】
よって、物質導入を行うまでの時間は、好ましくは、酵素処理後１２０分以内、６０分以内、４０分以内、２０分以内である。あるいは、酵素処理後に精細胞融合を行う場合は、物質導入を行うまでの時間は、好ましくは、細胞融合後１２０分以内、６０分以内、４０分以内、２０分以内である。
【００５８】
カルスまたは胚様体（細胞塊）化・再分化
本発明の、植物に物質を導入する方法は、物質を導入する工程（工程（２））の後に、さらに、（３）物質を導入した受精卵細胞をカルス化または胚様体化し；そして、
（４）上記カルス化または胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、ことを含んでもよい。
【００５９】
工程（３）のカルス化または胚様体化工程、および工程（４）の再分化工程は特に限定されず、受精卵細胞から植物体を再生するための公知の方法を利用することが可能である。
【００６０】
カルス化または胚様体化工程において、得られた物質導入受精卵細胞を培養して、胚様体又はカルスを形成させる。受精卵細胞を分裂誘導し細胞増殖させ、カルス又は胚様体を形成させる工程は、植物によって最適条件が異なるため特に限定されないが、Ｆｅｅｄｅｒ細胞を加えた、ナースカルチャー法が好ましい。例えば、次のように行うことができる。
【００６１】
液体培地での培養：培地に物質導入受精卵細胞を移し、一晩静置した後、穏やかに振とう培養する。振とう速度は、３０〜５０ｒｐｍが好ましく、３５〜４５ｒｐｍがより好ましい。培養の温度は、２４〜２８℃が好ましく、２５〜２７℃がより好ましい。培養は暗下で行うことが好ましい。この時、培地にはフィーダー細胞を加え共培養（ナースカルチャー法）を行うことが好ましい。この培養期間は、４〜１４日が好ましく、５〜１０日がより好ましい。
【００６２】
培地：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸などのオーキシンを添加した、液体のＭＳ培地（Ｔ．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．，１５，４７３（１９６２））、Ｂ５培地（Ｏ．Ｌ．Ｇａｍｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０，１５１−１５８（１９６８））、Ｎ６培地（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．  Ｓｉｎｉｃａ，１８，６５９−６６８（１９７５））等である。
【００６３】
培地にはインドール−３−酢酸、２，４−Ｄやダイカンバ等のオーキシン類が添加されることが好ましい。オーキシンの添加濃度は、０．１〜３．０ｍｇ／Ｌが挙げられるが、０．１〜０．３ｍｇ／Ｌが好ましく、０．１５〜０．２５ｍｇ／Ｌがより好ましい。
【００６４】
フィーダー細胞：公知のフィーダー細胞を用いることが可能である。例えば、イネ浮遊細胞培養物（Ｌｉｎｅ  Ｏｃ、理研バイオリソースセンター製）や、トウモロコシのナース細胞（Ｍｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、非形態形成型細胞培養物（ｎｏｎｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ：Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）などが挙げられる。
【００６５】
この工程によって、培養開始から４〜１４日後、直径５０〜２００μｍ程度の球状の胚様体が形成される。
【００６６】
再分化工程も公知の再分化工程に従い実施することができる。例えば、一例として、以下のように行うことが可能である。
【００６７】
培養：球状の胚様体を、フィーダー細胞を加えていない前記培地に移し、さらに１０〜１４日程度培養する。その後、オーキシンを添加しない任意の培地、例えばＭＳ培地に入れて培養し植物体を形成させる。この際、培養は光を照射して行うことが好ましく、光は、例えば、５０〜１８０μｍｏｌ／ｍ２・秒が好ましく、７０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２・ｓｅｃがより好ましい。
【００６８】
培地：例えばＭＳ培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地であって、アガロース、寒天やゲランガム、ゲルライト等を使用した固体培地。
【００６９】
物質導入植物
本発明はさらに、本発明の方法によって得られた、物質導入植物も含む。本発明以前は、特に「難培養」とされる植物や品種について、物質導入植物を得ることは困難あるいは不可能であった。本発明により、このような植物、品種についても簡便な方法で効率良く物質導入植物を得ることが可能になった。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７１】
実施例１  トウモロコシの受精卵細胞の単離
温室内で育成したトウモロコシ（品種：Ｂ７３）の交配適期の雌穂の柱頭に、トウモロコシの雄穂から採取した花粉を受粉させた。交配時間は午前１０時３０分前後に行った。交配後雌穂をパラフィン紙でできた袋で覆い、他の花粉が飛来するのを防止した。
【００７２】
交配後２４時間経過した雌穂の胚珠から、胚嚢を含む珠心切片を摘出し、３．５ｃｍプラスチックシャーレ中の１ｍＬの１０％マンニトール溶液（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ）に入れた。３．５ｃｍプラスチックシャーレに、酵素混合液０．５ｍＬを入れ、１．５ｍＬ酵素溶液とし、５−４５分間室温で放置した。酵素については、以下のものを用いた。セルラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、マセロザイム（ヤクルト本社製）、ペクトリアーゼ（盛進製薬製）を用い、表１に記載の各濃度になるように７．５％  マンニトール溶液（４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ）に溶解した。なお、すべての画分においてセルラーゼは１％とした。
【００７３】
後述の表１に記載した各時間で処理した後、酵素溶液をピペットで除去し、１０％マンニトール液で２度洗浄し、酵素処理した珠心切片を１．５ｍＬの同濃度のマンニトール溶液中に入れ単離作業に供した。
【００７４】
単離は、２本のガラス針を用い行った。片方のガラス針で珠心切片を固定し動かないようにし、もう一方のガラス針で、受精卵細胞が存在すると推定される領域の組織を掻き出すことにより受精卵細胞を単離した。領域の推定は、受精が行われると、２個存在する助細胞のうち花粉管が侵入した方が変性し、暗褐色化するのでそれを目印とした。単離した受精卵細胞は、マイクロピペットを用いカバーグラス上の液滴中に移動した。
【００７５】
なお、カバーグラス上の液滴は以下の方法で作成した。
【００７６】
１）カバーガラスの周囲を、５％ジクロロメチルシランを含む１，１，１−トリクロロエタン溶液に浸し、乾燥させる；
２）当該カバーガラス中央部分に０．２−０．３ｍＬのミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ−ｔｅｓｔｅｄ  Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、１００１２７９２７０）を載せる；そして、
３）当該ミネラルオイル内に１〜２μＬの１０％マンニトール液（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ）をマイクロピペットで挿入する。
【００７７】
実施例２  胚様体（胚性細胞塊）の取得
０．２ｍＬの受精細胞用培地を用意した。受精細胞用培地は、改変型Ｎ６Ｚ培地（Ｋｕｍｌｅｈｎ  Ｊ．ｅｔ．ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔａ  ２０５：３２７−３３３）に以下の改変を加えたもの；２ｇ／Ｌ  ＣＨＵ（Ｎ６）  ｂａｓａｌ  ｓａｌｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ（シグマアルドリッチ社製）、０．０２５ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｍｇ／Ｌ  レチノール、０．０１ｍｇ／Ｌ  カルシフェロール、０．０１ｍｇ／Ｌビオチン、１ｍｇ／Ｌ  チアミン・Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／Ｌ  ニコチン酸、１ｍｇ／Ｌ  ピリドキシン・ＨＣｌ、１ｍｇ／Ｌ  塩化コリン、１ｍｇ／Ｌ  Ｃａ−パントテン酸、０．２ｍｇ／Ｌ  リボフラビン、０．２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、０．０２ｍｇ／Ｌ  コバラミン、０．０２ｍｇ／Ｌ  ｐ−アミノ安息香酸、０．４ｍｇ／Ｌ  葉酸、２ｍｇ／Ｌ  アスコルビン酸、４０ｍｇ／Ｌ  リンゴ酸、４０ｍｇ／Ｌ  クエン酸、４０ｍｇ／Ｌ  フマル酸、２０ｍｇ／Ｌ  Ｎａ−ピルビン酸、１，０００ｍｇ／Ｌ  グルタミン、及び２５０ｍｇ／Ｌ  カゼイン加水分解物、１００ｍｇ／Ｌ  ミオイノシトール。浸透圧はグルコースで４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏに調整（ｐＨ５．７）し作成した。作成した受精細胞用培地を直径１２ｍｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＣＭインサート（ミリポア社製）内に入れ、２ｍＬの培地の入った３．５ｃｍプラスチックシャーレの中に入れた。さらに、４０〜６０μＬのイネ浮遊細胞培養物（Ｌｉｎｅ  Ｏｃ、理研バイオリソースセンター製）をフィーダー細胞としてシャーレに加えた。
【００７８】
洗浄・滅菌したミクロキャピラリーを用い、単離した受精卵細胞を新鮮な１０％マンニトール液滴（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ）中に投入し、その後、受精細胞用培地の入ったＣＭインサート内のメンブレン上に移した。
【００７９】
受精卵細胞は、暗所に２６℃で１日間静置したのち、２０日間振盪培養した。
【００８０】
培養後の胚様体（胚性細胞塊）の形成結果を表１に記載する。酵素の力価、特にペクチナーゼのＵｎｉｔ／ｍＬ、Ｕｎｉｔ／ｍＬ×時間、が高い区分（試験区８−１０）では胚様体が得られなかったが、Ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｕｎｉｔ／ｍＬ×時間が低い区分（試験区１−７）では胚様体を得ることができた。ただし、試験区７の胚様体は、他の区と比べ少し生育が劣った。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
実施例３  植物体の再生
実施例１および２で得られた胚様体（胚性細胞塊）について、再分化培地（改変したＭＳ培地；ＭＳ塩、ＭＳビタミン、１００ｍｇ／Ｌ  ミオイノシトール、２ｇ／Ｌ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、３０ｇ／Ｌ  スクロース、３０ｇ／Ｌ  ソルビトール、０．２ｍｇ／Ｌ  ｌ−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、１ｍｇ／Ｌ  カイネチン及び０．３％  Ｇｅｌｒｉｔｅ）に移した。培養は３０℃で持続的に光照射しながら、１２〜３０日間行った。その結果、植物体を得ることができた（図６）。この結果より、培養が最も困難と言われているトウモロコシのＢ７３でも、細胞からの培養、植物体の再生が可能であることが示された。
【００８３】
実施例４  受精卵への核酸導入
植物としてトウモロコシ（品種：Ｂ７３）を用い、酵素溶液濃度を１％セルラーゼ、０．３％マセロザイム、０．０５％ペクトリアーゼ、処理時間を１５分にする以外は実施例１と同様に受精卵の単離を行った。
【００８４】
核酸導入処理を行った受精卵細胞は、実施例３と同様に受精細胞用培地に移し、暗所で静置培養した。ＰＥＧ処理から１２-１６時間後に、受精卵細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰの蛍光の有無で導入した核酸の発現状況及び細胞の分裂状況を確認した。
その結果を図７に示す。核酸導入処理を行った受精卵は、確かにＧＦＰによる発光が観察されたため、核酸導入が確認できた。さらに、分裂を開始したことを確認できた。
【００８５】
実施例５  核酸導入受精卵細胞からの植物体再生
実施例４で得られた核酸導入受精卵細胞を、実施例２および３のとおり胚様体（胚性細胞塊）取得、植物体の再生を行う。
【００８６】
実施例６  イネの卵細胞の取得
イネの穂から得た未開花の花を解体して子房と葯を採取した。３ｍＬの６％マンニトール溶液（３７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ）が入った３．５ｃｍプラスチックシャーレの中に子房と葯を入れた。
【００８７】
新しい３．５ｃｍプラスチックシャーレ中の３ｍＬの６％マンニトール溶液（３７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  Ｈ２Ｏ）に柱頭を除去した子房を沈めて、シャーレの底でレーザーブレード（フェザー安全カミソリ（株）、ＦＡ−１０）により子房の下部を切断した。顕微鏡観察により切断部から出てくる卵細胞を確認し、ミクロキャピラリーで卵細胞を単離した。３０〜４０個の子房からおよそ１０〜１５個の卵細胞が得られた。各卵細胞の直径は４０〜５０μｍであった。
【００８８】
得られた未受精卵細胞に、単離された精細胞を融合させることで受精卵を作出する。その後、受精卵細胞を、植物組織分解酵素を含む酵素溶液で低力価条件処理する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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