(57)【要約】      （修正有）【課題】げっ歯類細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞を使用して製造されることが多い治療用組換えタンパク質で懸念される、細胞のウイルス感染に起因する潜在的なウイルス汚染を軽減する方法の提供。【解決手段】タンパク質製剤を、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量の双性イオン界面活性剤と接触させることを含み（またはからなり、または本質的になり）、該量は、界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度であり、かつタンパク質の生物学的活性を阻害しない濃度である方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質を調製する方法であって、組換えタンパク質製剤を、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量の双性イオン界面活性剤と接触させることを含み、前記量は、前記界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度であり、かつ前記組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない、前記方法。
【請求項２】
細胞培養培地で、組換えタンパク質を発現する細胞を培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組換えタンパク質を精製することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
組換えタンパク質製剤を、培養ステップの間に双性イオン界面活性剤と接触させる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
組換えタンパク質製剤を、培養ステップの前または後に双性イオン界面活性剤と接触させる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
組換えタンパク質製剤を、精製ステップの間に双性イオン界面活性剤と接触させる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
臨界ミセル濃度を超える濃度は、臨界ミセル濃度の約２倍〜約１０倍である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
約４ｌｏｇを超えるエンベロープウイルスの不活化は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから１時間以内に達成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組換えタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤タンパク質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＴＮＦ阻害剤タンパク質は、エタネルセプトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
エンベロープウイルスは、げっ歯類細胞株に関連する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
エンベロープウイルスは、異種指向性マウス白血病ウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
エンベロープウイルスは、哺乳類細胞株に関連する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
エンベロープウイルスは、ブタヘルペスウイルス１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
双性イオン界面活性剤は、生態毒性であると分類されない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
双性イオン界面活性剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
組換えタンパク質製剤を溶媒と接触させることを含まない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
組換えタンパク質と、
エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量の双性イオン界面活性剤と、を含み、前記量は、前記界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度であり、かつ前記組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない、組成物。
【請求項１９】
細胞培養培地をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
臨界ミセル濃度を超える濃度は、臨界ミセル濃度の約２倍〜約１０倍である、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
約４ｌｏｇを超えるエンベロープウイルスの不活化は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから１時間以内に達成される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
組換えタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤タンパク質である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
ＴＮＦ阻害剤タンパク質は、エタネルセプトである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
エンベロープウイルスは、げっ歯類細胞株に関連する、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
エンベロープウイルスは、異種指向性マウス白血病ウイルスである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
エンベロープウイルスは、哺乳類細胞株に関連する、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
エンベロープウイルスは、ブタヘルペスウイルス１である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
双性イオン界面活性剤は、生態毒性として分類されない、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
双性イオン界面活性剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
溶媒を含まない、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
組換えタンパク質を調製する方法であって、組換えタンパク質製剤を、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量のＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）と接触させることを含み、前記量は、界面活性剤の臨界ミセル濃度の約２倍〜約１０倍の濃度であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない、前記方法。
【請求項３２】
組換えタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤タンパク質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＮＦ阻害剤タンパク質は、エタネルセプトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤タンパク質と、
双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の約２倍〜約１０倍の濃度のＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である前記界面活性剤と、を含む、組成物。
【請求項３５】
細胞培養培地をさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
ＴＮＦ阻害剤タンパク質は、エタネルセプトである、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３７】
双性イオン界面活性剤は、ＬＤＡＯである、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
精製された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤タンパク質と、
組成物の０．０５％未満の量の双性イオン界面活性剤と、を含む、組成物。
【請求項３９】
ＴＮＦ阻害剤タンパク質は、エタネルセプトである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
双性イオン界面活性剤は、ＬＤＡＯである、請求項３８または３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１８〜３０または３４〜４０のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
【請求項４２】
注射器をさらに含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
対象に組成物を投与するための説明書をさらに含む、請求項４１または４２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０１２年８月６日に出願された米国仮特許出願第６１／６８０，０３９号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明の態様および実施形態は、治療用タンパク質の製造技術の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
治療用組換えタンパク質等の生物学的製剤は、げっ歯類細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞を使用して製造されることが多い。このような生物学的製剤の製造に付随する懸念は、細胞のウイルス感染に起因する潜在的なウイルス汚染である。この懸念を軽減するための１つの方法は、ウイルスを不活化することである。
【発明の概要】
【０００４】
一般的に、非イオン性界面活性剤を用いた細胞の処理は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に存在するマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）等のエンベロープウイルスを不活化するための有効な方法である。界面活性剤との反応によって、ウイルスの宿主細胞への付着に必要とされる脂質含有ウイルスエンベロープが破壊される。その結果、ウイルスの宿主細胞への付着および侵入が阻止される。古典的な溶媒／界面活性剤（ＳＤ）ウイルス不活化システムは、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）等の有機溶媒、およびポリソルベート８０またはＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００等の非イオン性界面活性剤を用いるが、これは、タンパク質製造プロセスに悪影響を及ぼすのみならず、国によっては成分の生態毒性のために経済的および廃水の懸案事項も引き起こす。
【０００５】
本発明は、とりわけ、組換えタンパク質を調製する方法を提供し、それらの方法は、環境に優しく、費用効率の高い、タンパク質を変性しない双性イオン界面活性剤をイオンの不活化に用いる。本発明は、概して溶媒の非存在下でその臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上で使用される双性イオン界面活性剤が、例えば、治療用タンパク質（例えば、組換えタンパク質）の生物学的活性に有害な影響を及ぼすことなく、エンベロープウイルス（複数可）を効果的に不活化するという意外な発見に一部基づいている。
【０００６】
よって、本発明の種々の実施形態において、組換えタンパク質（例えば、治療用組換えタンパク質）等のタンパク質を調製する方法が本明細書に提供され、該方法は、タンパク質製剤を、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量の双性イオン界面活性剤と接触させることを含み（またはからなり、または本質的になり）、該量は、界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度であり、かつタンパク質の生物学的活性を阻害しない。本明細書で使用される場合、「接触させる」は、任意の２つ以上の成分を接触させることを意味し得る。本明細書に記載されるいずれのタンパク質も、例えば、治療用組換えタンパク質（例えば、抗体）等の治療用タンパク質であり得ることを理解されたい。したがって、本明細書に記載されるように、タンパク質を調製するいずれの方法が組換えタンパク質を調製するために使用されてもよく、またその逆も同様である。本発明の種々の態様および実施形態によるタンパク質／組換えタンパク質の非限定的な例は、本明細書の他の箇所に記載される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、方法は、細胞培養培地で、タンパク質を発現する細胞を培養することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、タンパク質を精製することをさらに含む。いくつかの実施形態において、培養ステップの間および／または培養ステップの後および／または精製ステップ（例えば、複数の精製ステップが存在する場合、該精製ステップのうちのいずれか）の間に、タンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、臨界ミセル濃度を超える濃度は、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の約２倍（２×）〜約１０×である。いくつかの実施形態において、臨界ミセル濃度を超える濃度は、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の１．５×、２×、２．５×、３×、３．５×、４×、４．５×、５×、５．５×、６×、６．５×、７×、７．５×、８×、８．５×、９×、９．５×、もしくは１０×であるか、またはそれよりも高い。いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度は、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の５０×未満、または約５０×未満である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、約４ｌｏｇを超える（＞１０４）エンベロープウイルスの不活化が達成される。いくつかの実施形態において、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、６ｌｏｇ、７ｌｏｇ、８ｌｏｇ、９ｌｏｇ、または１０ｌｏｇを超えるエンベロープウイルスの不活化が達成される。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させてから約３０分〜約２時間以内に、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、６ｌｏｇ、７ｌｏｇ、８ｌｏｇ、９ｌｏｇ、または１０ｌｏｇを超えるエンベロープウイルスの不活化が達成される。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させてから１時間以内（例えば、約４５分）に、４ｌｏｇを超えるかまたは約４ｌｏｇを超えるエンベロープウイルスの不活化が達成される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、タンパク質は組換えタンパク質である。そのような実施形態において、組換えタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤であるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ阻害剤はエタネルセプトである。本明細書に記載の方法を用いて他の組換えタンパク質を調製することができることを認識されたい。
【００１１】
いくつかの実施形態において、エンベロープウイルスは、げっ歯類細胞株に関連する。いくつかの実施形態において、エンベロープウイルスは、異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）である。いくつかの実施形態において、エンベロープウイルスは、ブタヘルペスウイルス１（ＳｕＨＶ−１）である。いくつかの実施形態において、エンベロープウイルスは、哺乳類細胞株に関連する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤は、生態毒性であると分類されないか、または環境に優しいと見なされる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である。いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤はＬＤＡＯである。ＬＤＡＯは、ドデシル（ジメチル）アミンオキシド（ＤＤＡＯ）としても知られている。
【００１４】
いくつかの実施形態において、方法は、組換えタンパク質製剤を溶媒と接触させることを含まない。いくつかの実施形態において、有機溶媒リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）は、本発明の種々の態様による方法から除外される。したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、タンパク質を調製する方法が本明細書に提供され、該方法は、タンパク質製剤を、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量の双性イオン界面活性剤と接触させることを含み（またはからなり、または本質的になり）、該量は、界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度であり、かつタンパク質の生物学的活性を阻害せず、該方法は、タンパク質製剤を、例えば、ＴｎＢＰ等の有機溶媒と接触させることを含まない。
【００１５】
いくつかの実施形態において、２つ以上の双性イオン界面活性剤の組み合わせが用いられてもよいことを認識されたい。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明は、組換えタンパク質を調製する方法を提供し、該方法は、組換えタンパク質製剤を、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量のＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）と接触することを含み（またはからなり、または本質的になり）、該量は、界面活性剤の臨界ミセル濃度の約２×〜約１０×の濃度であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない。いくつかの実施形態において、組換えタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ阻害剤はエタネルセプトである。
【００１７】
種々の他の態様において、本発明は、（ａ）生物学的に活性な組換えタンパク質と、（ｂ）エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量の双性イオン界面活性剤とを含む（またはからなる、または本質的になる）組成物を提供し、該量は、界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない。いくつかの実施形態において、組成物は、細胞培養培地を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、臨界ミセル濃度を超える濃度は、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の約２倍（２×）〜約１０×である。いくつかの実施形態において、臨界ミセル濃度を超える濃度は、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の１．５×、２×、２．５×、３×、３．５×、４×、４．５×、５×、５．５×、６×、６．５×、７×、７．５×、８×、８．５×、９×、９．５×、もしくは１０×であるか、またはそれよりも高い。いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度は、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の５０×未満、または約５０×未満である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、約４ｌｏｇを超える（＞１０４）エンベロープウイルスの不活化が達成される。いくつかの実施形態において、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、６ｌｏｇ、７ｌｏｇ、８ｌｏｇ、９ｌｏｇ、または１０ｌｏｇを超えるエンベロープウイルスの不活化が達成される。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させてから約３０分〜約２時間以内に、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、６ｌｏｇ、７ｌｏｇ、８ｌｏｇ、９ｌｏｇ、または１０ｌｏｇを超えるエンベロープウイルスの不活化が達成される。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させてから１時間以内（例えば、約４５分）に、４ｌｏｇを超えるかまたは約４ｌｏｇを超えるエンベロープウイルスの不活化が達成される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、タンパク質は組換えタンパク質である。そのような実施形態において、組換えタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤であるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ阻害剤はエタネルセプトである。他の組換えタンパク質が、本明細書に提供される組成物中に存在し得ることを認識されたい。
【００２１】
いくつかの実施形態において、エンベロープウイルスは、げっ歯類細胞株に関連する。いくつかの実施形態において、エンベロープウイルスは、異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）である。いくつかの実施形態において、エンベロープウイルスは、ブタヘルペスウイルス１（ＳｕＨＶ−１）である。いくつかの実施形態において、エンベロープウイルスは、哺乳類細胞株に関連する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤は、生態毒性であると分類されないか、または環境に優しいと見なされる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である。いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤はＬＤＡＯである。ＬＤＡＯは、ドデシル（ジメチル）アミンオキシド（ＤＤＡＯ）としても知られている。
【００２４】
いくつかの実施形態において、組成物は溶媒を含まない。いくつかの実施形態において、有機溶媒リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）は、本発明の種々の態様による組成物から除外される。したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、（ａ）生物学的に活性な組換えタンパク質と、（ｂ）エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量の双性イオン界面活性剤とを含む（またはからなる、または本質的になる）組成物が本明細書に提供され、該量は、界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害せず、該組成物は、例えば、ＴｎＢＰ等の有機溶媒を含有しない（すなわち、含まない）。いくつかの実施形態において、そのような組成物は、細胞培養培地を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの態様において、（ａ）ＴＮＦ阻害剤と、（ｂ）活性剤の臨界ミセル濃度の約２×〜約１０×の濃度のＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である双性イオン界面活性剤と、を含む（またはからなる、または本質的になる）組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の量は、組換えタンパク質の生物学的活性を阻害することなくエンベロープウイルスを不活化するのに十分な濃度である。いくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）エタネルセプトと、（ｂ）Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、細胞培養培地を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、有機溶媒を含有しない。
【００２６】
また、本発明のいくつかの態様において、（ａ）組換えタンパク質（例えば、精製された組換えタンパク質、例えば、精製された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤タンパク質）と、（ｂ）組成物の０．０５％未満の量の双性イオン界面活性剤とを含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ阻害剤はエタネルセプトである。いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤はＬＤＡＯである。いくつかの実施形態において、組成物は、有機溶媒を含有しない。
【００２７】
いくつかの態様において、組換えタンパク質を調製する方法が本明細書にさらに提供され、該方法は、組換えＴＮＦ阻害剤タンパク質製剤を、製剤の０．０１％〜０．２０％重量／体積（ｗ／ｖ）の量のＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ＬＤＡＯの量は、製剤の０．０５％〜０．１５％ｗ／ｖの量である。いくつかの実施形態において、組換えＴＮＦ阻害剤タンパク質製剤は、溶媒を含有しない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】表面張力対加えた界面活性剤の濃度のｌｏｇのグラフを示す。矢印は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）のポイントを指す。
【図２】界面活性剤とともに室温で１２０分間インキュベートした後のウイルス不活化の結果のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の種々の態様および実施形態は、エンベロープウイルスを不活化するための有効な方法として、例えば、組換えタンパク質製剤等タンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させることを企図する。そのようにすることにより、界面活性剤との反応によって脂質含有ウイルスエンベロープが破壊され、ウイルスが宿主細胞に付着および侵入（例えば、感染）することができない。本明細書に記載の方法は、例えば、ヒト等の対象に投与される治療用組換えタンパク質を調製するのに特に有利である。本発明の多くの態様および実施形態によれば、組換えタンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させることにより、潜在的に危険なエンベロープウイルス（複数可）を不活化することができる。特に、多くの双性イオン界面活性剤は、無毒性、低コストであり、タンパク質を変性させないため、多くのそのような界面活性剤の使用は、既存の方法に勝る利点を提供する。驚くべきことに、これらの環境に優しい界面活性剤は、古典的な溶媒／界面活性剤（ＳＤ）ウイルス不活化システムに使用される他の界面活性剤の濃度よりもはるかに低い濃度でウイルス不活化剤として有効である。
【００３０】
したがって、治療用タンパク質（例えば、抗体、抗原、ホルモン、酵素等の治療用組換えタンパク質）、および治療用タンパク質を含む組成物を調製する方法が、本明細書に提供される。種々の態様および実施形態において、本発明による方法は、組換えタンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、界面活性剤の量は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分である。いくつかの実施形態において、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な界面活性剤の量は、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超える濃度である。いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない。
【００３１】
本発明による方法の１つの非限定的な例は、次の通りである：（ａ）組換えタンパク質を発現する細胞を細胞培養培地にて約７℃の温度で培養し、組換えタンパク質製剤を製造する；（ｂ）組換えタンパク質製剤を周囲温度（約２５℃）まで冷却し、製剤のｐＨを約５に調整する；（ｃ）界面活性剤の臨界ミセル濃度を超えた、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な濃度で組換えタンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させる；（ｄ）組換えタンパク質を精製する。
【００３２】
本発明による方法の別の非限定的な例は、次の通りである：（ａ）組換えタンパク質を発現する細胞を細胞培養培地にて約３７℃の温度で培養し、組換えタンパク質製剤を製造する；（ｂ）組換えタンパク質製剤を周囲温度（約２５℃）まで冷却し、製剤のｐＨを約５に調整する；（ｃ）組換えタンパク質を精製する；（ｄ）精製プロセスの間（例えば、複数の精製プロセスのいずれかの前または後）に、組換えタンパク質製剤を、界面活性剤の臨界ミセル濃度を超えた、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な濃度の双性イオン界面活性剤と接触させる；（ｅ）双性イオン界面活性剤を（例えば、最後の精製ステップの間に）除去する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、タンパク質「製剤」または組換えタンパク質「製剤」は、それぞれ、非組換えタンパク質または組換えタンパク質を含有する組成物（典型的には液体）を指す。製剤は、例えば、馴化細胞培養培地（ＣＣＭ）等の他の成分を含有し得る。馴化ＣＣＭは、細胞が一定期間培養された培地である。本発明のいくつかの実施形態によれば、組換えタンパク質を調製する方法は、組換えタンパク質製剤を、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない量の双性イオン界面活性剤と接触させることを含む。そのような実施形態において、組換えタンパク質製剤は、本方法によって調製される組換えタンパク質（例えば、対象となる組換えタンパク質、例えば、エタネルセプト等の腫瘍壊死因子阻害剤）を含有することを理解されたい。本発明の種々の態様および実施形態は、組換えタンパク質を対象としているが、組換え型ではないタンパク質も、本発明の各態様および実施形態によって包含される。
【００３４】
本発明は、タンパク質精製プロセスの任意のステップを含む組換えタンパク質の調製／製造プロセスの任意のステップで、組換えタンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させることを企図すると理解されたい。タンパク質の精製方法については以下に詳述するが、親和性クロマトグラフィーおよび接線流濾過を非限定的に含む。例えば、親和性クロマトグラフィーの場合、親和性クロマトグラフィープロセスのいずれのステップで組換えタンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させてもよく、次いで、任意選択的に、結合および溶出ステップの間に除去することができる。別の例として、接線流濾過の場合、接線流濾過プロセスのいずれのステップで組換えタンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させてもよく、次いで、任意選択的に、限外濾過またはダイアフィルトレーションによって除去することができる：例えば、限外濾過およびダイアフィルトレーションは、組換えタンパク質製剤が臨界ミセル濃度未満まで希釈された場合、界面活性剤を除去することができる。したがって、組換えタンパク質製剤を臨界ミセル濃度未満まで希釈する前に、組換えタンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させてもよい。
【００３５】
双性イオン界面活性剤
双性イオン分子は、分子内の異なる位置に正電荷および負電荷を有する中性分子である。双性イオン界面活性剤（例えば、双性イオン分子を含む界面活性剤）は、ウイルスエンベロープ中に存在するタンパク質等の生体高分子を可溶化するために本明細書において使用され得る。本発明の種々の態様および実施形態に従って使用され得る双性イオン界面活性剤の例は、限定されないが、１−ドデカノイル−グリセロ−３−ホスホコリン、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸水和物、３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ピリジニオ）−１−プロパンスルホン酸、３−（ベンジルジメチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、ＡＳＢ−１４（アミドスルホベタイン−１４，３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−イリストイルアミノプロピルアンモニオ］プロパンスルホン酸）、ＡＳＢ−１４−４（４−｛Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［３−（テトラデカノイルアミノ）プロピル］アンモニオ｝ブタンスルホネート）、ＡＳＢ−１６（アミドスルホベタイン−１６）、ＡＳＢ−Ｃ８０（３−｛Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［３−（４−オクチルベンゾイルアミノ）プロピル］アンモニオ｝プロパンスルホン酸）、ＡＳＢ−Ｃ６O（４−ｎ−ヘキシルベンゾイルアミド−プロピル−ジメチルアンモニオスルホベタイン）、ＡＳＢ−Ｃ８O（４−ｎ−オクチルベンゾイルアミド−プロピル−ジメチルアンモニオスルホベタイン）、Ｃ７ＢｚＯ（３−（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシ−プロピル−ジメチルアンモニオ−スルホベタイン）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＣＨＡＰＳＯ（３−（［３−コールアミドプロピル］ジメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ＤＤＭＡＢ、ＤＤＭＡＵ、ジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホネート、ＤＭＰＳ（２，３−ジメルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム一水和物）、ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＢＢ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ドデシルグリシンベタイン）、Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン、ミルテホシン水和物、ＬＤＡＯ（ＤＤＡＯ，Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ＮＤＳＢ２１１（３−［ジメチル−（２−ヒドロキシエチル）アンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＮＤＳＢ２２１（３−（１−メチルピぺリジニオ）−１−プロパンスルホン酸）、Ｏ−（デシルホスホリル）コリン、ＰＭＡＬ（登録商標）−Ｂ−１００、ＰＭＡＬ（登録商標）−Ｃ８｛ポリ（無水マレイン酸−ａｌｔ−１−デセン）、３−（ジメチルアミノ）−１−プロピルアミン誘導体｝、ＰＭＡＬ（登録商標）−Ｃ１０｛ポリ（無水マレイン酸−ａｌｔ−１−ドデセン）、３−（ジメチルアミノ）−１−プロピルアミン誘導体｝、ＰＭＡＬ（登録商標）−Ｃ１２｛ポリ（無水マレイン酸−ａｌｔ−１−テトラデセン）、３−（ジメチルアミノ）−１−プロピルアミン誘導体｝、スルホベタイン３−８（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホン酸内塩）、スルホベタイン３−１０（３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホン酸内��）、スルホベタイン３−１２（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、スルホベタイン３−１４（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホン酸）、スルホベタイン３−１６（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホン酸）、スルホベタイン３−１８（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホン酸）、およびサーファクチンを含む。いくつかの実施形態において、ＬＤＡＯ、スルホベタイン３−１２、スルホベタイン３−１４、および／またはスルホベタイン３−１６が、エンベロープウイルスを不活化するために使用される。いくつかの実施形態において、ＬＤＡＯが、エンベロープウイルスを不活化するために使用される。
【００３６】
本明細書に記載される双性イオン界面活性剤のいずれも、使用される特定の界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上の濃度で本発明に従って使用され得る。いくつかの実施形態において、ＣＭＣを超える濃度は、界面活性剤のＣＭＣの２倍（２×）、２．５×、５×、もしくは１０×であるか、またはおよそこれらの値である。いくつかの実施形態において、界面活性剤の濃度は、界面活性剤のＣＭＣの１５×、２０×、または５０×以下である。いくつかの実施形態において、界面活性剤の濃度は、界面活性剤のＣＭＣの５×未満または２×未満である。いくつかの実施形態において、エンベロープウイルスを不活化するために使用される界面活性剤は、界面活性剤のＣＭＣの２×、５×、または１０×以下の濃度である。いくつかの実施形態において、ＬＤＡＯ、スルホベタイン３−１２、スルホベタイン３−１４、および／またはスルホベタイン３−１６（単数／複数）は、それぞれ、ＬＤＡＯ、スルホベタイン３−１２、スルホベタイン３−１４、および／またはスルホベタイン３−１６のＣＭＣの２０または約２０×以下の濃度で、エンベロープウイルスを不活化するために使用される。いくつかの実施形態において、ＬＤＡＯは、ＬＤＡＯのＣＭＣの１０×以下の濃度で、エンベロープウイルスを不活化するために使用される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、界面活性剤の濃度は、組換えタンパク質製剤の約０．０１％〜０．２％重量／体積（ｗ／ｖ）（例えば、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８．０．０９％、０．１０％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％、または０．２０％ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、界面活性剤の濃度は、タンパク質製剤の約０．０５％〜約０．１５％ｗ／ｖである。）。いくつかの実施形態において、界面活性剤の濃度は、組換えタンパク質製剤の約０．０１４％ｗ／ｖ（または０．０１４％ｗ／ｖ）である。
【００３８】
種々の実施形態において、双性イオン界面活性剤は、公共廃水処理施設に廃棄される有機化学物質に関する「ＡＢＣ分類」に基づき、デンマークの廃水処理ガイド（Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ  Ｄｉｓｐｏｓａｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｎｍａｒｋ）に従ってクラスＢまたはクラスＣ界面活性剤として分類され得る。Ａ、Ｂ、およびＣ分類は次の通りである：Ａ、潜在的な不可逆的な人体への害および／または高い水生毒性のために排除／交換されるべき界面活性剤ならびに非分解性の界面活性剤；Ｂ、確実に水質基準を遵守するために、界面活性剤の濃度は特定の限度内でなければならない；Ｃ、濃度制限なく廃棄することができる界面活性剤（Ａ／Ｂに分類されない界面活性剤を含む）。いくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤は、クラスＢまたはクラスＣとして分類される。ＬＤＡＯは、クラスＣとして分類される一方で、スルホベタイン界面活性剤は、クラスＢとして分類される。
【００３９】
臨界ミセル濃度
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、モノマーが自己組織化（例えば、自発的に形成）して非共有結合凝集体になる濃度を超える界面活性剤の濃度を指すと当該技術分野において理解される（Ｒｏｓｅｎ  Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ．３ｒｄ  ｅｄ．２００４，Ｈｏｂｏｋｅｎ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；Ｈｅｌｅｎｉｕｓ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９７９，５６：７３４−４９；Ｍｕｋｅｒｊｅｅ，Ｐ．，Ｍｙｓｅｌｓ  ＫＪ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｍｉｃｅｌｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｖｏｌ．ＮＳＲＤＳ−ＮＢＳ  ３６．１９７０，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）。ＣＭＣは、狭い濃度範囲にわたって生じ得る。界面活性剤の総濃度がＣＭＣ未満である場合、界面活性剤モノマーはバルク溶液中に遊離するが、ＣＭＣを超えてより多くの界面活性剤を加えると、さらなる界面活性剤モノマーがミセルを形成する。ＣＭＣを超える濃度では、界面活性剤が、脂溶性タンパク質とともに複合体を形成し、膜タンパク質を可溶化することができる。ＣＭＣ未満では、界面活性剤は、膜タンパク質を可溶化することなく膜に分配される。界面活性剤／分子の正確な分子量がＣＭＣに影響を及ぼし、ＣＭＣは、イオン強度および温度によって変化し得る。例えば、イオン性界面活性剤の場合、ＣＭＣは、溶液のイオン強度を増加させることによって低下させることができるが、温度による影響は比較的受けにくい。非イオン性界面活性剤および双性イオン界面活性剤の場合、ＣＭＣは、イオン強度の影響を比較的受けにくいが、より低い温度では有意に上昇し得る（Ｓｃｈｉｃｋ  Ｍ．Ｊ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９６３，６７（９）：１７９６−９９；Ｑｉｎ  Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２０１１，１１５：１９９１−９８）。いくつかの物理・化学的因子も、所与の界面活性剤のＣＭＣに影響を及ぼし得る。一般的に、ＣＭＣは、界面活性剤の疎水性が増加するにつれて低下する。ＣＭＣに直接影響を与える他の特性は、疎水性基および親水性基、ならびに電解質等の溶液添加剤の特徴を含む。
【００４０】
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、表面張力測定（Ｍｉｔｔａｌ  Ｋ．Ｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，１９７２，６１（８）：１３３４−５、参照により本明細書に組み込まれる）および色素（例えば、アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸）結合実験（Ｄｅ  Ｖｅｎｄｉｔｔｉｓ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８１，１１５：２７８−２８６、参照により本明細書に組み込まれる）を含む種々の技法によって決定することができる（Ｓｃｈｉｃｋ，１９６３，Ｎｏｒｍａｎｄ＆Ｅｉｓｅｌｅ，１９９３）。一般的に、ＣＭＣの値は、界面活性剤の濃度の上昇に伴う界面活性剤溶液の特定の物理化学特性（例えば、表面張力）における変化を特徴付けることによって決定することができる。例えば、ＣＭＣは、一連の異なる表面活性剤濃度における表面張力測定値を収集することにより決定することができる。濃度の関数としての特定の表面張力曲線を作成することができる（図１）。ＣＭＣポイントは、表面張力の直線的低下の急激な変化を特徴とする。Ｇ−ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ−ｂｌｕｅＢＡＬＬＳ（商標）を使用した他の方法も市販されており、従来の色素可溶化法よりも便利であり得る。Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ  ｂｌｕｅＢＡＬＬＳ（商標）は、膜タンパク質として挙動する疎水性の青色色素でコーティングされたガラス製のボールである。一連の界面活性剤溶液にボールを加えた後、ミセルが形成された溶液中で色素の可溶化が起こる。各溶液中の色素の量は、ミセルの数に正比例する。その結果、溶液に溶解した青色染色の濃度を示唆する光学密度プロットが得られ、観察されたデータ対界面活性剤濃度のプロット上の屈折点が、その界面活性剤のＣＭＣに対応する。
【００４１】
双性イオン界面活性剤およびそれらの対応するＣＭＣの例を表１に示す。
【表１】
2019037234.tif 000002
【００４２】
本明細書で使用される場合、双性イオン界面活性剤に関連して「エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量」は、エンベロープウイルスの周囲にタンパク質のコートを形成する膜タンパク質の少なくとも一部を可溶化するのに効果的であり、それによってウイルスを溶解する、界面活性剤の臨界ミセル濃度以上の界面活性剤の量（例えば、濃度、体積、重量比）を指してもよい。いくつかの実施形態において、「エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量」は、例えば、治療用組換えタンパク質の生物学的活性に有害な影響を及ぼす（例えば、阻害する）ことなく、ウイルスのタンパク質コートを破壊および／または溶解する双性イオン界面活性剤の量である。いくつかの実施形態において、「エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量」は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の約２×〜約１５×の双性イオン界面活性剤の濃度を指す。いくつかの実施形態において、「エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量」は、ＣＭＣの１．５×、２×、２．５×、３×、２．５×、４×、４．５×、５×、５．５×、６×、６．５×、７×、７．５×、８×、８．５×、９×、９．５×、１０×、１０．５×、１１×、１１．５×、１２×、１２．５×、１３×、１３．５×、１４×、１４．５×、または１５×の双性イオン界面活性剤の濃度を指す。いくつかの実施形態において、「エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量」は、ＣＭＣの２．５×または５×の双性イオン界面活性剤の濃度を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、組換えタンパク質が、双性イオン界面活性剤と接触した後に、生物学的活性の９８％超、９５％超、９０％超、８５％超、８０％超、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、５５％、または５０％超を保持する場合、組換えタンパク質の生物学的活性が阻害されるとは見なされない。いくつかの実施形態において、組換えタンパク質が、双性イオン界面活性剤と接触した後に、生物学的活性の約９８％超（もしくは９８％超）または約９５％超（もしくは９５％超）を保持する場合、組換えタンパク質の生物学的活性は阻害されない。タンパク質活性アッセイは、当該技術分野で周知であり、その条件は、特定の組換えタンパク質に依存し得る。いずれのタンパク質活性アッセイが、本明細書に記載されるいずれの態様および／または実施形態とともに使用されてもよい。
【００４４】
本発明の種々の態様および実施形態において、方法および組成物は、溶媒、例えば、有機溶媒または無機溶媒を含まない。いくつかの実施形態において、方法および組成物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）を含まない。
【００４５】
エンベロープウイルス
多くのウイルスは、それらのタンパク質カプシドを覆うウイルスエンベロープを有する。エンベロープは、典型的には宿主細胞膜の一部（リン脂質およびタンパク質）に由来するが、いくつかのウイルス糖タンパク質を含む。機能的に、ウイルスエンベロープは、ウイルスが宿主細胞に侵入するのを助けるために用いられる。エンベロープの表面上の糖タンパク質は、宿主の膜にある受容体部位を同定して結合する役割を果たす。次いで、ウイルスエンベロープは、宿主の膜に融合し、カプシドおよびウイルスゲノムが宿主に侵入して感染できるようにする。ウイルスの脂質二重層エンベロープは、界面活性剤に対する感受性が比較的高い。本発明の種々の態様および実施形態において、エンベロープウイルスを不活化する双性イオン界面活性剤は、破壊することによって、またいくつかの実施形態においてはウイルスエンベロープを溶解することによって、本明細書に提供される。本明細書に記載されるエンベロープウイルスは、ＤＮＡウイルス（一本鎖もしくは二本鎖）、ＲＮＡウイルス、または逆転写ウイルスとして分類することができる。エンベロープウイルスの例は、限定されないが、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガウイルス、エプスタイン・バーウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス）、アレナウイルス科（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、イサウイルス、ソゴトウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器多核体ウイルス、牛疫ウイルス、イヌジステンパーウイルス）、ブニヤウイルス科（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）、アストロウイルス科（例えば、アストロウイルス）、ボルナウイルス科（例えば、ボルナ病ウイルス）、およびアルテリウイルス科（例えば、アルテリウイルス、ウマ動脈炎ウイルス）を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、組換えタンパク質の調製は、様々なサイズの攪拌タンクバイオリアクター内での単細胞懸濁液の使用を含む（Ｗｕｒｍ  Ｆ．Ｍ．（２００４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，１３９３−９８；Ｋｒｅｔｚｍｅｒ  Ｇ．（２００２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９，１３５−４２；Ｃｈｕ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２，１８０−８７、参照により本明細書に組み込まれる）。細胞は、例えば、血清および／または他の動物由来成分の非存在下において、高い細胞密度での懸濁増殖のために最適化された培地中に維持してもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、栄養添加物を加えることなく、全タンパク質製造段階の間に培養してもよい（バッチ培養）。いくつかの実施形態において、細胞生存率およびタンパク質産生を延長するために、定期的に栄養素を培養物に加えてもよい（長期培養または流加バッチ培養）。いくつかの場合において、温度を３０℃〜３３℃に低下させること、モル浸透圧濃度を上昇させること、または酪酸ナトリウムもしくはバルプロ酸等のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を添加することにより、バッチプロセスおよび流加バッチプロセスの両方においてタンパク質の生産性を向上させることができる。そのような追加ステップは、本明細書において企図される。
【００４７】
本発明の種々の態様および実施形態による細胞（組換え細胞を含む）は、限定されないが、げっ歯類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、昆虫細胞（例えば、ヨトウガ細胞）、および哺乳動物細胞（例えば、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞）を含む。
【００４８】
組換えタンパク質を発現する細胞は、細胞の増殖および複製に適した様々な温度にわたって、例えば、４℃〜４２℃で培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、約３７℃の温度で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は約３０℃〜約３３℃の温度で培養される。いくつかの実施形態において、細胞を培養した後、組換えタンパク質製剤（例えば、細胞、ＣＣＭ、および組換えタンパク質）を例えば、４℃まで冷却してから、組換えタンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させてもよい。細胞は、任意の所望の濃度の組換えタンパク質を発現させる／産生させるために必要な任意の時間培養することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、組換えタンパク質を発現する細胞が細胞培養培地（ＣＣＭ）中で培養された後、組換えタンパク質製剤のｐＨが調製される。製剤のｐＨは、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ７．５の範囲内で調整され得る。いくつかの実施形態において、組換えタンパク質製剤のｐＨは、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、または７．５に調整される。いくつかの実施形態において、組換えタンパク質製剤のｐＨは、ｐＨ５、または約ｐＨ５に調整される。いくつかの実施形態において、ｐＨは、双性イオン界面活性剤が中性になるｐＨまで調整される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、組換えタンパク質は精製される。タンパク質の精製方法は、限定されないが、抽出、沈殿および差次的可溶化、超遠心分離法、およびクロマトグラフィー法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、電荷または疎水性に基づく分離、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。
【００５１】
組換えタンパク質製剤は、いずれの温度で、いずれのｐＨで、いずれの適切な時間、およびいずれの適切な条件下で（例えば、塩、緩衝液等の存在下または非存在下）双性イオン界面活性剤と接触させてもよいことを理解されたい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、組換えタンパク質製剤は、約４℃〜約４２℃の温度（例えば、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４１℃、４１℃、または４２℃）で双性イオン界面活性剤と接触させてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、組換えタンパク質製剤は、約４℃または約２５℃の温度で双性イオン界面活性剤と接触させてもよい。
【００５３】
いくつかの実施形態において、組換えタンパク質製剤は、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ７．５のｐＨ（例えば、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、または７．５のｐＨ）で双性イオン界面活性剤と接触させてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、ｐＨは、４．５未満または７．５超であってもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態において、組換えタンパク質製剤は、約１５分（分）〜約４８時間（時間）、またはそれ以上、双性イオン界面活性剤と接触させてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、組換えタンパク質製剤は、１５分、３０分、４５分、６０分、２時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、または４８時間、双性イオン界面活性剤と接触させてもよい。
【００５５】
タンパク質／組換えタンパク質製剤
本明細書に記載されるタンパク質製剤は、（例えば、１つより多くの）例えば、組換えタンパク質（複数可）等のタンパク質（複数可）を含有し得る。種々の実施形態において、タンパク質は、治療用組換えタンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用組換えタンパク質は、不十分または異常なタンパク質に取って代わり（例えば、内分泌疾患、うっ血、血栓症、代謝酵素欠乏、肺および消化器疾患、免疫不全の治療において）、既存の生物学的経路を増強し（例えば、造血発生、生殖能力、免疫調節）、新規機能または活性を提供し（例えば、巨大分子の酵素分解、小分子代謝産物の酵素分解、うっ血、血栓症）、分子または生物体に干渉し（例えば、癌、免疫調節、移植、肺疾患、感染疾患、うっ血および血栓症、内分泌疾患において）、他の化合物またはタンパク質を送達し、有害な外来性物質から保護し、自己免疫疾患を治療し、癌を治療するか、または診断用ツールとして使用される。
【００５６】
本明細書に記載される種々の態様および実施形態とともに使用するための治療用タンパク質の例は、限定されないが、インスリン（例えば、ＨＵＭＵＬＩＮ（登録商標）、ＮＯＶＯＬＩＮ（登録商標））、ヒトインスリン吸入剤（例えば、ＥＸＵＢＥＲＡ（登録商標））、インスリンアスパルト（例えば、ＮＯＶＯＬＯＧ（登録商標））、インスリングルリジン（例えば、ＡＰＩＤＲＡ（登録商標））、インスリンリスプロ（例えば、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））、イソフェンインスリン（例えば、ＮＰＨ）、インスリンデテミル（例えば、ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標））、インスリングラルギン（例えば、ＬＡＮＴＵＳ（登録商標））、長期作用型インスリン亜鉛（例えば、ＬＥＮＴＥ（登録商標）、ＵＬＴＲＡＬＥＮＴ（登録商標））、プラムリンチド酢酸塩（例えば、ＳＹＭＬＩＮ（登録商標））、成長ホルモン（ＧＨ）、ソマトトロピン（例えば、ＧＥＮＯＴＲＯＰＩＮ（登録商標）ＨＵＭＡＴＲＯＰＥ（登録商標）、ＮＯＲＤＩＴＲＯＰＩＮ（登録商標）、ＮＵＴＲＯＰＩＮ（登録商標）、ＯＭＮＩＴＲＯＰＥ（登録商標）、ＰＲＯＴＲＯＰＩＮ（登録商標）、ＳＩＡＺＥＮ（登録商標）、ＳＥＲＯＳＴＩＭ（登録商標）、ＶＡＬＴＲＯＰＩＮ（登録商標））、メカセルミン（例えば、ＩＮＣＲＥＬＥＸ（登録商標））、メカセルミンリンファベート（例えば、ＩＰｌｅｘ）、第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＢＩＯＣＬＡＴＥ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標））、第ＩＸ因子（例えば、ＢＥＮＥＦＩＸ（登録商標））、アンチトロンビンＩＩＩ（例えば、ＴＨＲＯＭＢＡＴＥ  ＩＩＩ（登録商標））、プロテインＣ濃縮製剤（例えば、ＣＥＰＲＯＴＩＮ（登録商標））、β−グルコセレブロシダーゼ（例えば、ＣＥＲＥＺＹＭＥ（登録商標））、β−グルコセレブロシダーゼ（例えば、ＣＥＲＥＤＡＳＥ（登録商標）（プールされたヒト胎盤から精製）、アルグルコシダーゼ−χ、アロニダーゼ／χ−ｌ−イズロニダーゼ（例えば、ＡＬＤＵＲＡＺＹＭＥ（登録商標））、イデュルスルファーゼ／イズロネート−２−スルファターゼ（例えば、ＥＬＡＰＲＡＳＥ（登録商標））、ガルスルファーゼ（例えば、ＮＡＧＬＡＺＹＭＥ（登録商標））、アガルシダーゼ−β／ヒトχ−ガラクトシダーゼＡ（例えば、ＦＡＢＲＡＺＹＭＥ（登録商標））、χ−１−プロテアーゼ阻害剤（例えば、ＡＲＡＬＡＳＴ（登録商標）、ＰＲＯＬＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラクターゼ（例えば、ＬＡＣＴＡＩＤ（登録商標））、膵酵素（例えば、ＡＲＣＯ−ＬＡＳＥ（登録商標）、ＣＯＴＡＺＹＭ（登録商標）、ＣＲＥＯＮ（登録商標）、ＤＯＮＮＡＺＹＭＥ（登録商標）、ＰＡＮＣＲＥＡＳＥ（登録商標）、ＶＩＯＫＡＳ（登録商標）Ｅ、ＺＹＭＡＳＥ（登録商標））、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＧＥＮ（登録商標））、プールされた免疫グロブリン（例えば、ＯＣＴＡＧＡＭ（登録商標））、ヒトアルブミン（例えば、ＡＬＢＵＭＡＲＣ（登録商標）、ＡＬＢＵＭＩＮ（登録商標）、ＡＬＢＵＭＩＮＡＲ（登録商標）、ＡＬＢＵＲＸ（登録商標）、ＡＬＢＵＴＥＩＮ（登録商標）、ＦＬＥＸＢＵＭＩＮ（登録商��）、ＢＵＭＩＮＡＴＥ（登録商標）、ＰＬＡＳＢＵＭＩＮ（登録商標））、エリスロポエチン、エポエチン−χ（例えば、ＥＰＯＧＥＮ（登録商標）、ＰＲＯＣＲＩＴ）、ダルベポエチン−χ（例えば、ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標））、フィルラスチム（例えば、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標））、ペグフィルグラスチム（例えば、ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標））、サルグラモスチム（例えば、ＬＥＵＫＩＮＥ（登録商標））、オプレルベキン（例えば、ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標））、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（例えば、ＧＯＮＡＬ−Ｆ（登録商標）、ＦＯＬＬＩＳＴＩＭ（登録商標））、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（例えば、ＯＶＩＤＲＥＬ（登録商標））、ルトピン−χ（例えば、ＬＵＶＥＲＩＳ（登録商標））、Ｉ型αインターフェロン、インターフェロンアルファコン１、コンセンサスインターフェロン（例えば、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標））、インターフェロン−χ２ａ（ＩＦＮ  χ２ａ）（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ（登録商標））、ペグインターフェロン−χ２ａ（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））、インターフェロン−χ２ｂ（ＩＦＮ  χ２ｂ）（例えば、ＩＮＴＲＯ  Ａ（登録商標））、ペグインターフェロン−χ２ｂ（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標））、Ｉｎｔｅｒｆｒｏｎ−χ  ｎ３（ＩＦＮ  χ  ｎ３）、ａｌｆｅｒｏｎ  Ｎ、インターフェロン−β１ａ（ｒＩＦＮ−β）（例えば、ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）、ＲＥＢＩＦ（登録商標））、インターフェロン−β１ｂ（ｒＩＦＮ−β）（例えば、ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標））、インターフェロン−γ１ｂ（ＩＦＮ  γ）（例えば、ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（登録商標））、アルデスロイキン（例えば、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標））、アルテプラーゼ（例えば、ＡＣＴＩＶＡＳＥ（登録商標））、レテプラーゼ（例えば、ＲＥＴＡＶＡＳＥ（登録商標））、テネクテプラーゼ（ＴＮＫａｓｅ）、ウロキナーゼ（例えば、ＡＢＢＯＫＩＮＡＳＥ（登録商標））、第ＶＩＩａ因子（例えば、ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標））、ドロトレコギン−χ（例えば、ＸＩＧＲＩＳ（登録商標））、サケカルシトニン（例えば、ＦＯＲＴＩＣＡＬ（登録商標）、ＭＩＡＣＡＬＩＮ（登録商標））、テリパラチド（例えば、ＦＯＲＴＥＯ（登録商標））、エキセナチド（例えば、ＢＹＥＴＴＡ（登録商標））、オクトレオチド（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ）（登録商標）、ジボテルミン−χ（例えば、ＩＮＦＵＳＥ（登録商標））、組換えヒト骨形態形成タンパク質７（例えば、骨原性タンパク質１）、ヒストレリン酢酸塩（例えば、ＳＵＰＰＲＥＬＩＮ（登録商標）ＬＡ、ＶＡＮＴＡＳ（登録商標））、パリフェルミン（例えば、ＫＥＰＩＶＡＮＣＥ（登録商標））、ベカプレルミン（例えば、ＲＥＧＲＡＮＥＸ（登録商標））、トリプシン（例えば、ＧＲＡＮＵＬＥＸ（登録商標））、ネシリチド（例えば、ＮＡＴＲＥＣＯＲ（登録商標））、Ａ型ボツリヌス毒素（例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標））、Ｂ型ボツリヌス毒素（例えば、ＭＹＯＢＬＯＣＫ（登録商標））、コラゲナーゼ（例えば、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、ＳＡＮＴＹＬ（登録商標））、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ−χ（例えば、ＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（登録商���））、ヒアルロニダーゼ（例えば、ＡＭＰＨＡＤＡＳＥ（登録商標））、ヒアルロニダーゼ（例えば、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、パピン（例えば、ＡＣＣＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＰＡＮＡＦＩ（登録商標）Ｌ）、Ｌ−アスパラギナーゼ（例えば、ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ペグ−アスパラギナーゼ（例えば、ＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標））、ラスブリカーゼ（例えば、ＥＬＩＴＥＫ（登録商標））、レピルジン（例えば、ＲＥＦＬＵＤＡＮ（登録商標））、ビバリルジン（例えば、ＡＮＧＩＯＭＡＸ（登録商標））、ストレプトキナーゼ（例えば、ＳＴＲＥＰＴＡＳＥ（登録商標））、アニストレプラーゼ（例えば、ＥＭＩＮＡＳＥ（登録商標））、ベバシズマブ（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、セツキシマブ（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（例えば、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、アレムツズマブ（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、リツキシマブ（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、トラスツズマブ（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、アバタセプト（例えば、ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））、アナキンラ（例えば、ＡＮＴＲＩＬ（登録商標）、ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標））、アダリムマブ（例えば、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、エタネルセプト（例えば、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、インフリキシマブ（例えば、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、アレファセプト（例えば、ＡＭＥＶＩＶＥ（登録商標））、エファリズマブ（例えば、ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標））、ナタリズマブ（例えば、ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標））、エクリズマブ（例えば、ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標））、抗胸腺細胞グロブリン（例えば、ＴＨＹＭＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（登録商標））、バシリキシマブ（例えば、ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））、ダクリズマブ（例えば、ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））、ムロモナブ−ＣＤ３（例えば、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ（登録商標）、ＯＫＴ３）、オマリズマブ（例えば、ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））、パリビズマブ（例えば、ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、エンフビルチド（例えば、ＦＵＺＥＯＮ（登録商標））、アブシキシマブ（例えば、ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））、ペグビソマント（例えば、ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標））、ガラガラヘビ多価免疫Ｆａｂ（例えば、ＣＲＯＦＡＢ（登録商標））、ジゴキシン抗血清（例えば、ＤＩＧＩＦＡＢ（登録商標））、ラニビズマブ（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、デニロイキンジフチトクス（例えば、ＯＮＴＡＫ（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（例えば、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（例えば、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ならびにトシツモマブおよびＩ−トシツモマブ（例えば、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）Ｉ−１３１）を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、治療用組換えタンパク質は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ阻害剤はエタネルセプトである。
【００５８】
組成物
（ａ）タンパク質（例えば、組換えタンパク質）と、（ｂ）エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつタンパク質の生物学的活性を阻害しない量の双性イオン界面活性剤とを含み得る組成物が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、細胞培養培地を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、溶媒を含有しない（すなわち、含まない）。しかし、いくつかの実施形態において、組成物は、微量の溶媒を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）を含まない。
【００５９】
一態様において、本発明は、（ａ）組換えタンパク質と、（ｂ）界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度の双性イオン界面活性剤とを含む組成物を提供し、該濃度は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、細胞培養培地を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、溶媒を含まない。いくつかの実施形態において、組成物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）を含まない。
【００６０】
別の態様において、本発明は、（ａ）組換えタンパク質と、（ｂ）活性剤の臨界ミセル濃度の約２倍（２×）〜約１０×の濃度の双性イオン界面活性剤とを含む組成物を提供する。本態様のいくつかの実施形態において、濃度は、臨界ミセル濃度の５０×、４０×、３０×、２０×、もしくは１０×（またはおよそこれらの値）未満である。本態様のいくつかの実施形態において、濃度は、臨界ミセル濃度の約１０×未満である。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、細胞培養培地を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、溶媒を含まない。いくつかの実施形態において、組成物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）を含まない。
【００６１】
さらに別の態様において、本発明は、（ａ）組換えタンパク質と、（ｂ）界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度の双性イオン界面活性剤とを含む組成物を提供し、該濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤エンベロープウイルスと接触させてから１時間以内に約４ｌｏｇを超える（＞１０４）エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから１時間以内に、３ｌｏｇ超、４ｌｏｇ超、５ｌｏｇ超、６ｌｏｇ超、７ｌｏｇ超、８ｌｏｇ超、９ｌｏｇ超、または１０ｌｏｇ超（またはおよそこれらの値）のエンベロープウイルスの不活化を達成するのに十分である。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから２時間以内に、３ｌｏｇ超、４ｌｏｇ超、５ｌｏｇ超、６ｌｏｇ超、７ｌｏｇ超、８ｌｏｇ超、９ｌｏｇ超、または１０ｌｏｇ超（またはおよそこれらの値）のエンベロープウイルスの不活化を達成するのに十分である。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから３時間以内に、３ｌｏｇ超、４ｌｏｇ超、５ｌｏｇ超、６ｌｏｇ超、７ｌｏｇ超、８ｌｏｇ超、９ｌｏｇ超、または１０ｌｏｇ超（またはおよそこれらの値）のエンベロープウイルスの不活化を達成するのに十分である。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから４時間以内に、３ｌｏｇ超、４ｌｏｇ超、５ｌｏｇ超、６ｌｏｇ超、７ｌｏｇ超、８ｌｏｇ超、９ｌｏｇ超、または１０ｌｏｇ超（またはおよそこれらの値）のエンベロープウイルスの不活化を達成するのに十分である。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから５時間以内に、３ｌｏｇ超、４ｌｏｇ超、５ｌｏｇ超、６ｌｏｇ超、７ｌｏｇ超、８ｌｏｇ超、９ｌｏｇ超、または１０ｌｏｇ超（またはおよそこれらの値）のエンベロープウイルスの不活化を達成するのに十分である。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、細胞培養培地を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、溶媒を含まない。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）を含まない。
【００６２】
さらに別の態様において、本発明は、（ａ）細胞培養培地と、（ｂ）組換え腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤と、（ｃ）界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度の双性イオン界面活性剤とを含む組成物を提供し、該濃度は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつ組換えＴＮＦ阻害剤の生物学的活性を阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤はＬＤＡＯである。本態様のいくつかの実施形態において、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の約２Ｘ（または２Ｘ）〜約１０Ｘ（または１０Ｘ）である。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、溶媒を含まない。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）を含まない。
【００６３】
さらなる態様において、本発明は、（ａ）細胞培養培地と、（ｂ）エタネルセプトと、（ｃ）界面活性剤の限界ミセル濃度を超える濃度の双性イオン界面活性剤とを含む組成物を提供し、該濃度は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつエタネルセプトの生物学的活性を阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤はＬＤＡＯである。本態様のいくつかの実施形態において、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の約２Ｘ（または２Ｘ）〜約１０Ｘ（または１０Ｘ）である。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、溶媒を含まない。いくつかの実施形態において、組成物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）を含まない。
【００６４】
別の態様において、本発明は、（ａ）細胞培養培地と、（ｂ）組換えタンパク質と、（ｃ）界面活性剤の限界ミセル濃度を超える濃度のＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である双性イオン界面活性剤と、を含む組成物を提供し、該濃度は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、生物学的に活性な組換えタンパク質はエタネルセプトである。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、溶媒を含まない。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）を含まない。
【００６５】
さらに別の態様において、本発明は、（ａ）組換えタンパク質と、（ｂ）界面活性剤の限界ミセル濃度を超える濃度の双性イオン界面活性剤とを含む組成物を提供し、該濃度は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害せず、組成物は溶媒を含まない。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、リン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）を含まない。いくつかの実施形態において、組成物は、細胞培養培地を含む。
【００６６】
方法
タンパク質（例えば、組換えタンパク質）を調製する方法もまた、本明細書に提供される。該方法は、タンパク質製剤（例えば、組換えタンパク質製剤）を、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量の双性イオン界面活性剤と接触させることを含んでもよく、該量は、界面活性剤の臨界ミセル濃度を超える濃度であり、かつタンパク質の生物学的活性を阻害しない。
【００６７】
一態様において、本発明は、組換えタンパク質を調製する方法を提供し、該方法は、組換えタンパク質製剤を、界面活性剤の限界ミセル濃度を超える濃度の双性イオン界面活性剤と接触させることを含み、該濃度は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤を溶媒と接触させることを含まない。本態様のいくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤をリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）と接触させることを含まない。
【００６８】
別の態様において、本発明は、組換えタンパク質を調製する方法を提供し、該方法は、組換えタンパク質製剤を、界面活性剤の臨界ミセル濃度の約２倍（２×）〜約１０×の濃度の双性イオン界面活性剤と接触させることを含む。本態様のいくつかの実施形態において、濃度は、臨界ミセル濃度の５０×、４０×、３０×、２０×、もしくは１０×（またはおよそこれらの値）未満である。本態様のいくつかの実施形態において、濃度は、臨界ミセル濃度の１０×未満である。本態様のいくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤を溶媒と接触させることを含まない。本態様のいくつかの実施形態において、組成物は、タンパク質製剤をリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）と接触させることを含む。
【００６９】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換えタンパク質を調製する方法を提供し、該方法は、組換えタンパク質製剤を、界面活性剤の限界ミセル濃度を超える濃度の双性イオン界面活性剤と接触させることを含み、該濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤エンベロープウイルスと接触させてから１時間以内に約４ｌｏｇを超える（＞１０４）エンベロープウイルスの不活化するのに十分であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから１時間以内に、３ｌｏｇ超、４ｌｏｇ超、５ｌｏｇ超、６ｌｏｇ超、７ｌｏｇ超、８ｌｏｇ超、９ｌｏｇ超、または１０ｌｏｇ超（またはおよそこれらの値）のエンベロープウイルスの不活化を達成するのに十分である。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから２時間以内に、３ｌｏｇ超、４ｌｏｇ超、５ｌｏｇ超、６ｌｏｇ超、７ｌｏｇ超、８ｌｏｇ超、９ｌｏｇ超、または１０ｌｏｇ超（またはおよそこれらの値）のエンベロープウイルスの不活化を達成するのに十分である。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから３時間以内に、３ｌｏｇ超、４ｌｏｇ超、５ｌｏｇ超、６ｌｏｇ超、７ｌｏｇ超、８ｌｏｇ超、９ｌｏｇ超、または１０ｌｏｇ超（またはおよそこれらの値）のエンベロープウイルスの不活化を達成するのに十分である。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから４時間以内に、３ｌｏｇ超、４ｌｏｇ超、５ｌｏｇ超、６ｌｏｇ超、７ｌｏｇ超、８ｌｏｇ超、９ｌｏｇ超、または１０ｌｏｇ超（またはおよそこれらの値）のエンベロープウイルスの不活化を達成するのに十分である。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから５時間以内に、３ｌｏｇ超、４ｌｏｇ超、５ｌｏｇ超、６ｌｏｇ超、７ｌｏｇ超、８ｌｏｇ超、９ｌｏｇ超、または１０ｌｏｇ超（またはおよそこれらの値）のエンベロープウイルスの不活化を達成するのに十分である。ウイルスのｌｏｇ不活化を計算することは、当該技術分野で周知である。本態様のいくつかの実施形態において、該方法は、タンパク質製剤を溶媒と接触させることを含まない。いくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤をリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）と接触させることを含まない。
【００７０】
さらに別の態様において、本発明は、組換え腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤を調製する方法を提供し、該方法は、組換えタンパク質製剤を、界面活性剤の限界ミセル濃度を超える濃度の双性イオン界面活性剤と接触させることを含み、該濃度は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつ組換えＴＮＦ阻害剤の生物学的活性を阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤はＬＤＡＯである。本態様のいくつかの実施形態において、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の約２×（または２×）〜約１０×（または１０×）である。本態様のいくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤を溶媒と接触させることを含まない。いくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤をリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）と接触させることを含まない。
【００７１】
さらなる態様において、本発明は、エタネルセプトを調製する方法を提供し、該方法は、エタネルセプト製剤を、界面活性剤の限界ミセル濃度を超える濃度の双性イオン界面活性剤と接触させることを含み、該濃度は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつエタネルセプトの生物学的活性を阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、双性イオン界面活性剤はＬＤＡＯである。本態様のいくつかの実施形態において、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な双性イオン界面活性剤の濃度は、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度の約２×（または２×）〜約１０×（または１０×）である。本態様のいくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤を溶媒と接触させることを含まない。いくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤をリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）と接触させることを含まない。
【００７２】
別の態様において、本発明は、組換えタンパク質を調製する方法を提供し、該方法は、組換えタンパク質製剤を、界面活性剤の限界ミセル濃度を超える濃度のＮ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である双性イオン界面活性剤と接触させることを含み、該濃度は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害しない。本態様のいくつかの実施形態において、生物学的に活性な組換えタンパク質はエタネルセプトである。本態様のいくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤を溶媒と接触させることを含まない。いくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤をリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）と接触させることを含まない。
【００７３】
さらに別の態様において、本発明は、組換えタンパク質を調製する方法を提供し、該方法は、組換えタンパク質製剤を、界面活性剤の限界ミセル濃度を超える濃度の双性イオン界面活性剤と接触させることを含み、該濃度は、エンベロープウイルスを不活化するのに十分であり、かつ組換えタンパク質の生物学的活性を阻害せず、該方法は、タンパク質製剤を溶媒と接触させることを含まない。本態様のいくつかの実施形態において、方法は、タンパク質製剤をリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ）と接触させることを含まない。
【００７４】
本発明の種々の態様および実施形態のいずれにおいても、組換えタンパク質製剤は、微量の双性イオン界面活性剤を含有し得る。例えば、いくつかの場合において、組換えタンパク質製剤は、たとえ精製された後であっても、検出不能な量の双性イオン界面活性剤を含有し得る。他の実施形態において、組換えタンパク質製剤は、約０．０５％もしくは０．０５％未満、約０．０１％もしくは０．０１％未満、約０．００５％もしくは０．００５％未満、または約０．００１％もしくは０．００１％未満の双性イオン界面活性剤を含有し得る。
【００７５】
特定の実施形態において、双性イオン界面活性剤は、例えば、微生物の増殖を防止または阻害するための保存剤として、組換えタンパク質製剤中に存在してもよい。そのような実施形態において、タンパク質精製の前、タンパク質精製の間、および／またはタンパク質精製の後に、組換えタンパク質製剤を双性イオン界面活性剤と接触させてもよい。
【００７６】
キット
本発明の種々の態様において、本明細書に記載される成分のうちのいずれか１つと、１つ以上の容器（例えば、プラスチックまたはガラス容器）内に充填された１つ以上の成分とを含む、それらからなる、または本質的になるキットが、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、キットは、対象（例えば、ヒト）に組成物を送達するための注射器または他の手段を含む。いくつかの実施形態において、キットは、対象に組成物を投与するための説明書（または説明書を入手するための指示）を含む。
【００７７】
本発明の態様および実施形態を、非限定的な例を用いて以下にさらに記載する。
実施例
【実施例１】
【００７８】
その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満の界面活性剤は、モノマー形態で存在し、細胞膜に結合する。一旦、界面活性剤のＣＭＣに達すると、その界面活性剤は、自己組織化して細胞膜と相互作用してミセルを形成し、細胞を溶解する。エンベロープウイルスは、界面活性剤によって溶解され得る脂質二重層のコートを含有する。一旦、ウイルスのコートが溶解すると、ウイルスは細胞に感染することができず、したがって不活化される。この理論を確認するために、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）を使用して試験を行った。３つの異なる抗体を使用して、周囲温度で１〜２×ＣＭＣ（０．０２％ｗ／ｗ）のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）を用いてウイルス不活化試験を行った。ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）は、様々な分子長の混合物であるため、ＣＭＣは、水中２５℃で０．０１〜０．０２％ｗ／ｗの範囲を有する。この試験の結果は、上記理論を裏付けるものであり、＞４ｌｏｇのＸＭｕＬＶ不活化が４５分以内に達成されることを示した。また、これらのウイルス不活化試験の１つの間に、ＣＭＣ未満では、界面活性剤はエンベロープウイルスの不活化に有効ではないことも示された。０．２５〜０．５×ＣＭＣ（０．００６％ｗ／ｗ）ではウイルスの不活化は観察されなかった。
【００７９】
本明細書に記載される界面活性剤を１５，０００リットルの細胞培養規模で経済的に使用することができるかどうかを確認するために、これらの費用を評価した。膜タンパク質を可溶化するために使用される界面活性剤のほとんどは、研究目的で製造されるため、高額であり、１５，０００リットル規模では法外な費用がかかる。
【００８０】
また、この界面活性剤が、デンマークの廃水処理ガイドの下でどのように分類されるかを確認するためにもこれらを評価した。デンマークのガイドラインは、上述のように、公共廃水処理施設に廃棄される有機化学物質に関する「ＡＢＣ分類」に基づいている。クラスＢおよびＣの界面活性剤のみを、ウイルスクリアランス試験において評価した。
【００８１】
ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）は、組換えタンパク質を調製するために溶媒と一緒に使用することができる：しかしながら、これはデンマークでは生態毒性の高い試薬として分類されており、生物学的生産プロセスに使用する場合、廃水のための特別な処理を必要とする。強力な、生態毒性を示す試薬／溶媒系の代替として、５つの穏やかで環境に優しい界面活性剤を同定し、ウイルス不活化の有効性について評価した。５つの界面活性剤を表２に示す。これらの非イオン性および双性イオン性の界面活性剤は、現在の欧州（デンマーク）および米国における公共廃水処理施設への廃棄に関するガイドラインを満たしており、費用効率が高く、穏やかでタンパク質を変性しない界面活性剤であるため、タンパク質の生物活性に影響を及ぼすとは考えられない。
【００８２】
【表２】
2019037234.tif 000003
【００８３】
ウイルス不活化試験の開始前に、界面活性剤が生成物の生物活性に与える有害な影響を評価した。エタネルセプト（本明細書において組換えタンパク質製剤と称される）を含有する馴化細胞培養培地（ＣＣＭ）に界面活性剤を個別に加え、界面活性剤の１０×ＣＭＣで２時間、周囲温度でインキュベートした。各組換えタンパク質製剤をＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＳＵＲＥ（商標）およびＰＨＥＮＹＬ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）上で精製し、タンパク質の凝集体およびミスフォールディングを減少させた。製剤緩衝液を使用して限外濾過およびダイアフィルトレーションを行った。精製した組換えタンパク質を腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）バイオアッセイにおいて試験したところ、５つの界面活性剤の各々に曝露されたときにエタネルセプトの生物学的活性が保持されたことが示された。
【００８４】
次いで、ウイルスクリアランス試験を行い、５つの界面活性剤の各々が異種指向性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）を不活化する能力を評価した。組換え産物であるエタネルセプトは、内在性レトロウイルスまたはレトロウイルス様粒子を内部に有し得る、十分に特徴付けられたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に発現される。ＸＭｕＬＶは、組換えタンパク質製剤中に存在することが疑われるウイルスまたはウイルス様粒子に対して同様の物理的および化学的特性（同じ属または科）を有する特異的モデルを意味する。ブタヘルペスウイルス−１（ＳｕＨＶ−１）も、ウイルスクリアランス試験に使用される。ＳｕＨＶ−１は、非特異的モデルウイルスであると見なされる−これは、げっ歯類細胞株に対する内在性ウイルスではない。非特異的モデルウイルスは、ウイルスを不活化するための方法のロバスト性を特徴付けるために使用することができる。非特異的モデルウイルス（複数可）の特徴は、エンベロープ／無エンベロープ、サイズ、化学的抵抗性、およびゲノム（ＲＮＡ／ＤＮＡ）等の様々な物理的および化学的特性を包含する。医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）のガイドラインによれば、非特異的モデルウイルスを選択する場合、物理的および／または化学的処理に対して著しい耐性を示すウイルスを優先するべきである。そのようなウイルスを使用して得られたデータは、一般的なウイルスを除去および／または不活化するための本明細書に記載の方法の有効性に関する有用な情報を提供する（表３を参照）。化学的処理に対して中程度の耐性を示す大きな（１２０〜２００ｎｍ）エンベロープＤＮＡウイルスであるＳｕＨＶ−１を、ＬＤＡＯおよびＳｕｌｆｌｏｂｅｔａｉｎｅ３−１６がウイルスを不活化する有効性を評価するための非特異的モデルとして選択した。
【００８５】
【表３】
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【００８６】
１０×ＣＭＣの界面活性剤およびＸＭｕＬＶ（５％Ｖ／Ｖ）を、組換えタンパク質エタネルセプトのためのＣＣＭに室温で添加した。１２０分の期間にわたる種々の時点でサンプルを採取し、ＸＭｕＬＶの感染力を測定した。４つの双性イオン界面活性剤がＸＭｕＬＶを＞４ｌｏｇ不活化した一方で、非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ−３５は、ウイルスを不活化しなかった。その結果を表４および図２に示す。
【表４】
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【００８７】
２．５×および５×ＣＭＣのスルホベタイン−１６について、ならびに３×および１０×ＣＭＣのＬＤＡＯについて、さらなるＸＭｕＬＶ不活化試験を４℃で行った（表５）。温度が低下すると、ＣＭＣ値は若干増加する。ウイルス膜のコートを破壊して不活化するために、界面活性剤の濃度を上昇させる必要があるかもしれない。
【００８８】
【表５】
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【実施例２】
【００８９】
エタネルセプトのための３×ＣＭＣのＬＤＡＯについて、実施例１で上述したように、さらなるＸＭｕＬＶおよびＳｕＨＶ−１不活化試験を４℃で行った。その結果を表６に示す。
【００９０】
【表６】
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【実施例３】
【００９１】
組換えＴＮＦ阻害剤タンパク質のための３×ＣＭＣのＬＤＡＯについて、実施例１で上述したように、さらなるＸＭｕＬＶおよびＳｕＨＶ−１不活化試験を４℃で行った。その結果を表７に示す。
【００９２】
【表７】
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【００９３】
均等物および範囲
当業者であれば、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される具体的な手順に対する多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記明細書に限定されることを企図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される。
【００９４】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」等の冠詞は、反対の指示がない限り、または内容からそうではないことが明白でない限り、１つまたは１つより多くを意味し得る。群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、反対の指示がない限り、または内容からそうではないことが明白でない限り、群のメンバーの１つ、１つより多く、または全てが、所与の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、または関連する場合に、満たされると考えられる。本発明は、群のメンバーの正確に１つが、所与の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、または関連する実施形態を含む。本発明は、群のメンバーの１つ以上または全てが、所与の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、または関連する実施形態を含む。
【００９５】
さらに、本発明は、列挙される請求項のうちの１つ以上からの１つ以上の限度、要素、節、および説明的用語が、別の請求項に導入される、全ての変形例、組み合わせ、および順列を包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項が、基本となる同じ請求項に従属する任意の他の請求項に見出される１つ以上の限度を含むように変更されてもよい。
【００９６】
要素が、例えば、マーカッシュ群形式において、リストとして提示される場合、その要素の各下位群もまた開示され、任意の要素（複数可）が群から除去され得ることを理解されたい。一般的に、本発明または本発明の態様（単数／複数）が、特定の要素、特徴等を含むと見なされる場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴等からなるか、または本質的になることを理解されたい。簡略化の目的で、これらの実施形態は、本明細書においてこのように具体的には記載されていない。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることが企図され、追加の要素またはステップの包含を許容することに留意されたい。
【００９７】
範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別途指示のない限り、または内容および当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、内容が明らかにそうではないと指示しない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態において、いずれか特定の値、または記載される範囲内の下位範囲をとることができることを理解されたい。
【００９８】
「約」または「およその」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し、それは値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に、一部依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における実践当たりの１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。代替として、「約」は、所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。代替として、該用語は、ある値の１桁以内、例えば、５倍以内、または２倍以内を意味し得る。本明細書および特許請求の範囲に特定の値が記載される場合、別途記載のない限り、「約」という用語は、特定の値の許容誤差範囲内を意味すると想定されるべきである。
【００９９】
さらに、先行技術の範囲内に属する本発明のいずれか特定の実施形態が、請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることも理解されたい。そのような実施形態は当業者に既知であると見なされるため、それらは、たとえ除外することが本明細書に明示的に記載されていなくても除外され得る。先行技術の存在と関連しているかどうかにかかわらず、任意の理由のために、本発明の方法のいずれか特定の実施形態を１つ以上の請求項から除外することができる。
【０１００】
上記の特許、特許出願、および参考文献の各々は、特に、本明細書において参照された教示のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月8日(2018.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質を調製する方法であって、組換えタンパク質製剤を、エンベロープウイルスを不活化するのに十分な量の双性イオン界面活性剤と接触させることを含み、ここで該双性イオン界面活性剤が、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１２）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１４）、またはＮ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（スルホベタイン３−１６）である、前記方法。
【請求項２】
双性イオン界面活性剤の量が、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の２倍〜２０倍の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
双性イオン界面活性剤の量が、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の２倍〜１５倍の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
双性イオン界面活性剤の量が、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の２倍〜１０倍の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
双性イオン界面活性剤の量が、双性イオン界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の約３倍または約１０倍の濃度である、請求項１に記載の方法
【請求項６】
細胞培養培地で、組換えタンパク質を発現する細胞を培養して、組換え型タンパク質を形成することをさらに含む、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
組換えタンパク質を精製することを更に含む、請求項１−６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
組換えタンパク質製剤を、培養ステップの前、間、または後に双性イオン界面活性剤と接触させるか、または、該組換えタンパク質製剤を、精製ステップの間に接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
組換えタンパク質製剤を、培養ステップの後に双性イオン界面活性剤と接触させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
約４ｌｏｇを超えるエンベロープウイルスの不活化は、双性イオン界面活性剤を組換えタンパク質製剤と接触させてから１時間以内に達成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
組換えタンパク質が、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤タンパク質である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＮＦ阻害剤タンパク質は、エタネルセプトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
エンベロープウイルスが、げっ歯類細胞株または哺乳類細胞株に関連する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
エンベロープウイルスは、異種指向性マウス白血病ウイルスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
エンベロープウイルスは、ブタヘルペスウイルス１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
組換えタンパク質製剤を溶媒と接触させることを含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
双性イオン界面活性剤が、ＬＤＡＯである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
双性イオン界面活性剤が、スルホベタイン３−１２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
双性イオンの界面活性剤が、スルホベタイン３−１４である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
双性イオン界面活性剤が、スルホベタイン３−１６である、請求項１に記載の方法。
【外国語明細書】
2019037234000001.pdf