(57)【要約】【課題】ポンプを使用せずに容易に灌流培養でき、且つ、２種類以上の細胞構造体を構築可能な培養装置を提供する。【解決手段】培養装置は、培養容器と、灌流装置と、を備える培養装置であって、培養容器は、溶液を収容可能な第１のセルと、溶液を収容可能な第２のセルと、前記第１のセル及び前記第２のセルを接続する第３のセルと、溶液を収容可能であり、底面に半透膜を有する第４のセルと、を有し、第３のセルは、前記第１のセルに隣接する第１の隔壁と、前記第２のセルに隣接する第２の隔壁と、前記第１の隔壁及び前記第２の隔壁にそれぞれ対向して形成され、前記第１のセル及び前記第２のセルをそれぞれ連通する少なくとも一対の孔を含み、溶液の流路となりうる第１の孔部と、を有し、前記第４のセルが前記流路の天面に着脱可能に配置され、前記灌流装置は、支持部材と、駆動機構と、を有し、少なくとも１つの前記培養容器が前記支持部材上に配置される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器と、灌流装置と、を備える培養装置であって、
前記培養容器は、
溶液を収容可能な第１のセルと、
前記溶液を収容可能な第２のセルと、
前記第１のセル及び前記第２のセルを接続する第３のセルと、
前記溶液を収容可能であり、底面に半透膜を有する第４のセルと、
を有し、
前記第３のセルは、
前記第１のセルに隣接する第１の隔壁と、
前記第２のセルに隣接する第２の隔壁と、
前記第１の隔壁及び前記第２の隔壁にそれぞれ対向して形成され、前記第１のセル及び前記第２のセルをそれぞれ連通する少なくとも一対の孔を含み、前記溶液の流路となりうる第１の孔部と、
を有し、
前記第４のセルが前記流路の天面に着脱可能に配置され、
前記灌流装置は、支持部材と、駆動機構と、を有し、
少なくとも１つの前記培養容器が前記支持部材上に配置される培養装置。
【請求項２】
前記第１のセル、前記第２のセル及び前記第３のセルが、酸素透過性を有するポリマー材からなる請求項１に記載の培養装置。
【請求項３】
前記酸素透過性を有するポリマー材がポリジメチルシロキサンである請求項２に記載の培養装置。
【請求項４】
前記流路の内壁面上に細胞足場材を備え、前記第４のセルが前記細胞足場材を介して前記流路の天面に着脱可能に配置される請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養装置。
【請求項５】
水平面上で直交する方向をそれぞれＸ軸方向及びＹ軸方向、並びに、これらの方向と直交する方向をＺ軸方向とした場合に、
前記駆動装置は、
前記支持部材を配置する載台と、
前記載台の中央部においてＹ軸方向に沿って配置された軸部と、
前記軸部をＹ軸まわりに回動させる駆動部と、
前記駆動部を制御する制御部と、
を有し、
前記支持部材上において、前記培養容器の前記第１のセル及び前記第２のセルがＸ軸方向に対向して配置されており、
前記駆動部は、前記軸部をＹ軸まわりに回動させることで、前記載台と前記支持部材上に配置された前記培養容器とをＹ軸まわりに回動させ、
前記制御部は、前記載台のＹ軸方向の傾斜角度が−２０度以上２０度以下となり、且つ、前記載台のＹ軸方向の傾斜速度が０．１度／分以上６度／分以下となるように前記駆動部を制御する請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養装置を用いて、２種類以上の細胞構造体を構築する方法であって、
１）前記第１のセルに第１の細胞を播種して培養することで、第１の細胞構造体を形成させる工程と、
２）前記第２のセルに第２の細胞を播種して培養することで、第２の細胞構造体を形成させる工程と、
３）前記第４のセルに第３の細胞を播種して培養することで、第３の細胞構造体を形成させる工程と、
４）前記第１の細胞構造体、前記第２の細胞構造体及び前記第３の細胞構造体を、前記培養装置を用いて共培養する工程と、を備え、
前記第１の細胞構造体と、前記第２の細胞構造体とは、同一の種類であってもよく、異なる種類であってもよく、
前記第１の細胞構造体及び前記第２の細胞構造体と、前記第３の細胞構造体とは、異なる種類である方法。
【請求項７】
前記工程１）の前に、さらに、
１’）前記第３のセルの前記流路に第４の細胞を播種して培養することで、前記流路の壁面上に第４の細胞構造体を形成させる工程を備え、
前記第１の細胞構造体、前記第２の細胞構造体及び前記第３の細胞構造体と、前記第４の細胞構造体とは、異なる種類であり、
前記工程４）において、前記第１の細胞構造体、前記第２の細胞構造体、前記第３の細胞構造体及び前記第４の細胞構造体を、前記培養装置を用いて共培養する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養装置の前記培養容器内に２種類以上の細胞構造体を備えるオンチップ臓器デバイスであって、
前記第１のセル内に第１の細胞構造体を備え、
前記第２のセル内に第２の細胞構造体を備え、
前記第４のセルの前記半透膜上に第３の細胞構造体を備え、
前記第１の細胞構造体と、前記第２の細胞構造体とは、同一の種類であってもよく、異なる種類であってもよく、
前記第１の細胞構造体及び前記第２の細胞構造体と、前記第３の細胞構造体とは、異なる種類であるオンチップ臓器デバイス。
【請求項９】
さらに、前記第３のセルの前記流路の壁面上に第４の細胞構造体を備え、
前記第１の細胞構造体、前記第２の細胞構造体及び前記第３の細胞構造体と、前記第４の細胞構造体とは、異なる種類である請求項８に記載のオンチップ臓器デバイス。
【請求項１０】
前記第１の細胞構造体が心筋細胞からなり、
前記第２の細胞構造体が肝細胞からなり、
前記第３の細胞構造体が培養皮膚である請求項８又は９に記載のオンチップ臓器デバイス。
【請求項１１】
前記第４の細胞構造体が血管内皮細胞からなる請求項９又は１０に記載のオンチップ臓器デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養装置、２種類以上の細胞構造体を構築する方法及びオンチップ臓器デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬分野では動物実験の代替法として、培養細胞を用いた化学物質の薬効及び毒性のスクリーニングアッセイが広く行われている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、従来のプラスチックディッシュ上の培養細胞を用いた毒性評価では、培養細胞で確認されない毒性が、その後の動物実験又はヒト臨床試験の段階で確認される等の不一致が生じることがあった。これは、体内に入った化学物質はＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝及び排除）といった連鎖的な過程を経て、排除されるが、この過程で化学物質がより毒性の強い異種化合物に変換されることがあるためである。
【０００３】
上記問題を解決する技術として、近年、マイクロ流体技術を応用した、単一臓器モデルである「Ｏｒｇａｎ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ（組織チップ）」や複数の組織を一つのデバイス内で連結する「Ｂｏｄｙ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ（ボディ・オン・チップ）」が注目されている（例えば、非特許文献２等参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Li C-L et al., “Survival advantages of multicellular spheroids vs. monolayers of HepG2 cells in vitro.”, ONCOLOGY REPORTS, Vol.20, p1465-1471, 2008.
【非特許文献２】Huh D et al., “From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips.”, Trends Cell Biol., Vol. 21, Issue 12, p745-754, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでの組織チップ及びボディ・オン・チップでは、シリンジポンプを用いた送液方法を採用しており、チップ内に構築された血管様構造一つ一つにチューブ及びシリンジポンプを接続しなければならず、操作が煩雑であった。
また、チップ内の培地を交換するために、シリンジをその都度チップから取り外し、チップ内に培地を導入しなければならなかった。
また、チューブを介してシリンジをチップに接続するため、接続部分から雑菌が混入する虞があり、コンタミネーションのリスクが高かった。
また、これらチップを用いて灌流培養を行う場合には、送液した培地を、チップにさらにチューブに接続して戻す工程が必要となり、チップを含む装置がより複雑となり、装置の設置面積が広くなりすぎる虞があった。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ポンプを使用せずに容易に灌流培養でき、且つ、２種類以上の細胞構造体を構築可能な培養装置を提供する。前記培養装置を用いた２種類以上の細胞構造体を構築する方法及びオンチップ臓器デバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る培養装置は、培養容器と、灌流装置と、を備える培養装置であって、前記培養容器は、溶液を収容可能な第１のセルと、前記溶液を収容可能な第２のセルと、前記第１のセル及び前記第２のセルを接続する第３のセルと、前記溶液を収容可能であり、底面に半透膜を有する第４のセルと、を有し、前記第３のセルは、前記第１のセルに隣接する第１の隔壁と、前記第２のセルに隣接する第２の隔壁と、前記第１の隔壁及び前記第２の隔壁にそれぞれ対向して形成され、前記第１のセル及び前記第２のセルをそれぞれ連通する少なくとも一対の孔を含み、前記溶液の流路となりうる第１の孔部と、を有し、前記第４のセルが前記流路の天面に着脱可能に配置され、前記灌流装置は、支持部材と、駆動機構と、を有し、少なくとも１つの前記培養容器が前記支持部材上に配置される。
上記第１態様に係る培養装置において、前記第１のセル、前記第２のセル及び前記第３のセルが、酸素透過性を有するポリマー材からなってもよい。
上記第１態様に係る培養装置において、前記酸素透過性を有するポリマー材がポリジメチルシロキサンであってもよい。
上記第１態様に係る培養装置において、前記流路の内壁面上に細胞足場材を備え、前記第４のセルが前記細胞足場材を介して前記流路の天面に着脱可能に配置されてもよい。
上記第１態様に係る培養装置において、水平面上で直交する方向をそれぞれＸ軸方向及びＹ軸方向、並びに、これらの方向と直交する方向をＺ軸方向とした場合に、前記駆動装置は、前記支持部材を配置する載台と、前記載台の中央部においてＹ軸方向に沿って配置された軸部と、前記軸部をＹ軸まわりに回動させる駆動部と、前記駆動部を制御する制御部と、を有し、前記支持部材上において、前記培養容器の前記第１のセル及び前記第２のセルがＸ軸方向に対向して配置されており、前記駆動部は、前記軸部をＹ軸まわりに回動させることで、前記載台と前記支持部材上に配置された前記培養容器とをＹ軸まわりに回動させ、前記制御部は、前記載台のＹ軸方向の傾斜角度が−２０度以上２０度以下となり、且つ、前記載台のＹ軸方向の傾斜速度が０．１度／分以上６度／分以下となるように前記駆動部を制御してもよい。
【０００８】
本発明の第２態様に係る方法は、上記第１態様に係る培養装置を用いて、２種類以上の細胞構造体を構築する方法であって、
１）前記第１のセルに第１の細胞を播種して培養することで、第１の細胞構造体を形成させる工程と、
２）前記第２のセルに第２の細胞を播種して培養することで、第２の細胞構造体を形成させる工程と、
３）前記第４のセルに第３の細胞を播種して培養することで、第３の細胞構造体を形成させる工程と、
４）前記第１の細胞構造体、前記第２の細胞構造体及び前記第３の細胞構造体を、前記培養装置を用いて共培養する工程と、を備える方法であり、
前記第１の細胞構造体と、前記第２の細胞構造体とは、同一の種類であってもよく、異なる種類であってもよく、前記第１の細胞構造体及び前記第２の細胞構造体と、前記第３の細胞構造体とは、異なる種類である。
上記第２態様に係る方法は、前記工程１）の前に、さらに、
１’）前記第３のセルの前記流路に第４の細胞を播種して培養することで、前記流路の壁面上に第４の細胞構造体を形成させる工程を備える方法であり、
前記第１の細胞構造体、前記第２の細胞構造体及び前記第３の細胞構造体と、前記第４の細胞構造体とは、異なる種類であり、前記工程４）において、前記第１の細胞構造体、前記第２の細胞構造体、前記第３の細胞構造体及び前記第４の細胞構造体を、前記培養装置を用いて共培養してもよい。
【０００９】
本発明の第３態様に係るオンチップ臓器デバイスは、上記第１態様に係る培養装置の前記培養容器内に２種類以上の細胞構造体を備えるオンチップ臓器デバイスであって、前記第１のセル内に第１の細胞構造体を備え、前記第２のセル内に第２の細胞構造体を備え、前記第４のセルの前記半透膜上に第３の細胞構造体を備え、前記第１の細胞構造体と、前記第２の細胞構造体とは、同一の種類であってもよく、異なる種類であってもよく、前記第１の細胞構造体及び前記第２の細胞構造体と、前記第３の細胞構造体とは、異なる種類である。
上記第３態様に係るオンチップ臓器デバイスは、さらに、前記第３のセルの前記流路の壁面上に第４の細胞構造体を備え、前記第１の細胞構造体、前記第２の細胞構造体及び前記第３の細胞構造体と、前記第４の細胞構造体とは、異なる種類であってもよい。
上記第３態様に係るオンチップ臓器デバイスにおいて、前記第１の細胞構造体が心筋細胞からなり、前記第２の細胞構造体が肝細胞からなり、前記第３の細胞構造体が培養皮膚であってもよい。
上記第３態様に係るオンチップ臓器デバイスにおいて、前記第４の細胞構造体が血管内皮細胞からなってもよい。
【発明の効果】
【００１０】
上記態様の培養装置によれば、ポンプを使用せずに容易に灌流培養でき、且つ、２種類以上の細胞構造体を構築できる。上記態様の２種類以上の細胞構造体を構築する方法は、前記培養装置を用いたものであり、容易に２種類以上の細胞構造体を構築することができる。上記態様のオンチップ臓器デバイスは、前記培養装置を含み、生体に近しい構成である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本実施形態の培養装置の一例を示す斜視図である。
【図２Ａ】本実施形態の培養装置が備える培養容器（密閉状態）の一例を示す斜視図である。
【図２Ｂ】本実施形態の培養装置が備える培養容器（開放状態）の一例を示す斜視図である。
【図３Ａ】本実施形態の培養装置が備える培養容器（第４のセル装着時）の一例を示す断面図である。
【図３Ｂ】本実施形態の培養装置が備える培養容器（第４のセル脱着時）の一例を示す断面図である。
【図３Ｃ】本実施形態の培養装置が備える培養容器（第４のセル脱着時）の一例を示す平面図である。
【図４Ａ】本実施形態の培養装置が備える灌流装置の駆動機構の一例を示す正面図である。
【図４Ｂ】本実施形態の培養装置を用いた灌流培養方法の一例を示す断面図である。
【図５】本実施形態のオンチップ臓器デバイスの一例を示す断面図である。
【図６】参考例１で製造された培養容器を上から見た画像（左）及び正面から見た画像（右）である。
【図７】参考例１で製造された培養装置を斜め上から見た画像である。
【図８】参考例２における血管様細胞構造体の作製手順を示す工程図である。
【図９】参考例２で作製された血管様細胞構造体の蛍光像である。スケールバーは５００μｍを示す。
【図１０】参考例２で作製された血管様細胞構造体を備える培養装置の灌流培養の様子を示す画像（左）及び断面図（右）である。
【図１１】参考例３におけるシーソー型灌流装置の傾斜速度と培地の流速との関係を示すグラフである。
【図１２】参考例４における培養７日目の静置培養（左）及びシーソー型灌流装置による灌流培養（右）したヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ；ＨＵＶＥＣ）の共焦点レーザー顕微鏡像である。スケールバーは２５０μｍを示す。また、矢印は灌流培養における送液方向を示す。
【図１３Ａ】参考例４における培養７日目の静置培養及びシーソー型灌流装置による灌流培養したＨＵＶＥＣの各配向角度における配向強度を示すグラフである。
【図１３Ｂ】参考例４における培養７日目の静置培養及びシーソー型灌流装置による灌流培養したＨＵＶＥＣの配向強度を比較したグラフである。
【図１４】参考例５における培養１、３及び７日目のＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＮＢ１ＲＧＢとの混合スフェロイドの共焦点レーザー顕微鏡像である。スケールバーは１ｍｍを示す。
【図１５】参考例６における混合スフェロイド存在又は非存在下で灌流培養した血管様細胞構造体を示す模式図及び位相差蛍光顕微鏡像である。スケールバーは５００μｍを示す。
【図１６Ａ】参考例７で製造された培養容器を斜め上から見た画像である。
【図１６Ｂ】参考例７で製造された培養容器を上から見た画像（上）及び細胞培養チャンバー内のマイクロウェル構造の拡大図（下）である。
【図１７】参考例７におけるヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞のスフェロイド（左）、及び、ヒト心筋細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｍｙｏｃｙｔｅｓ；ＨＣＭ）のスフェロイド（右）の位相差顕微鏡像である。スケールバーは２００μｍを示す。
【図１８】参考例８における培養皮膚の位相差顕微鏡像（左：明視野像、右：蛍光像）である。スケールバーは２００μｍを示す。
【図１９】実施例１で製造された培養容器を斜め上から見た画像である。
【図２０】実施例１における培養１及び３日目のシーソー型灌流装置を用いた灌流培養により培養容器内に構築されたＨＣＭのスフェロイド（左）、培養皮膚（中央）及びＨｅｐＧ２細胞のスフェロイド（右）を示す画像である。スケールバーは５００μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
≪培養装置≫
図１は、本実施形態の培養装置の一例を示す斜視図である。なお、図１中のＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸は、相互に直交する３軸方向を示している。
図１に示す培養装置１００は、培養容器１０と、灌流装置２０と、を備える。
培養容器１０は、溶液を収容可能な第１のセル１１と、前記溶液を収容可能な第２のセル１２と、第１のセル１１及び第２のセル１２を接続する第３のセル１３（図示せず）と、底面に半透膜を有する第４のセル１４（図示せず）と、を有する。
また、灌流装置２０は、支持部材２１と、駆動機構２２と、を有する。この駆動機構２２は、載台２２ａと、軸部２２ｂと、駆動部２２ｃと、制御部２２ｄとを有する。
図１において、複数の培養容器１０が支持部材２１上に配置される例を示したが、支持部材２１上に配置される培養容器１０の数は、１つでもよく、２つ以上の複数でもよい。
【００１３】
本実施形態の培養装置は、後述する実施例に示すように、ポンプを使用せずに溶液を送液でき、且つ、容易に灌流培養することができるものである。また、第１のセル、第２のセル、第３のセル内の流路及び第４のセルにそれぞれ細胞構造体を形成できる。そのため、本実施形態の培養装置を用いることで、後述するように、２種類以上の細胞構造体を含むオンチップ臓器デバイスを構築することができる。
なお、一般に、「灌流培養」とは、細胞を含む培養系に培地を連続的に供給するとともに、それと同量の細胞を含まない培養上清を連続的に系外へ取り出し、培養系を定常状態に保ちながら培養する方法を意味する。本実施形態の培養装置は、ポンプを用いる代わりに、後述する構成を有する灌流装置を用いて、培地を第１のセルから第２のセルへ送液した後、該溶液を第２のセルから第１のセルに再度送液するという動作を繰り返しながら、培養容器内の細胞を培養することができる。また、培地を第１のセル又は第２のセルから簡便に取り出せる。そのため、本実施形態の培養装置は、従来の組織チップ及びボディ・オン・チップよりも容易に灌流培養を行うことができる。
【００１４】
また、本明細書において、「細胞構造体」とは、複数の細胞が細胞−細胞間の結合を形成した単層細胞、多層細胞、又は、凝集細胞からなる３次元構造体を意味する。
また、本明細書において、「オンチップ臓器デバイス」とは、生体内の２種類以上の組織又は臓器の機能を再現したデバイスである。
次いで、本実施形態の培養装置の各構成について以下に詳細を説明する。
【００１５】
＜培養容器＞
図２Ａ〜図３Ｃは、本実施形態の培養装置が備える培養容器を示す図である。
具体的には、図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれ培養容器の斜視図であり、図２Ａは培養容器が密閉状態である場合を示し、図２Ｂは培養容器が開放状態である場合を示している。
また、図３Ａ及び図３Ｂは、それぞれ培養容器の断面図であり、図３Ａは第４のセル装着時を示し、図３Ｂは第４のセル脱着を示している。
また、図３Ｃは、培養容器の平面図である。
なお、図２Ａ〜図３Ｃ中のｘ軸、ｙ軸及びｚ軸は、相互に直交する３軸方向を示している。
これらの図に示すように、培養容器１０は、第１のセル１１と、第２のセル１２と、第３のセル１３と、第４のセル１４とを有する。
第１のセル１１及び第２のセル１２は、例えば同一の容積を有していてもよく、第３のセル１３は、例えば第１のセル１１及び第２のセル１２よりも小さい容積を有していてもよい。
また、第４のセル１４は、第３のセル１３内の流路Ｆ上に着脱可能に配置される。そのため、第４のセル１４は、第３のセル１３よりも小さい容積であることが好ましい。具体的には、第４のセル１４の外形容積は第３のセル１３内の容積と同一であることが好ましい。これにより、第４のセル１４を第３のセル１３内に隙間なく安定して装着することができ、コンタミネーションのリスクを軽減することができる。
【００１６】
培養容器１０において、第１のセル１１、第２のセル１２、第３のセル１３及び第４のセル１４の半透膜１４ｂ以外の部分は同一の材料で形成されていてもよく、異なる材料で形成されていてもよい。中でも、製造が容易であることから、第１のセル１１、第２のセル１２及び第３のセル１３は、同一の材料で形成されていることが好ましい。
第１のセル１１、第２のセル１２、第３のセル１３及び第４のセル１４の半透膜１４ｂ以外の部分を形成する材料としては、観察の容易性から、透光性を有するものであればよく、例えば、透明なガラス、アクリル樹脂等の各種ポリマー材等が挙げられる。中でも、酸素透過性を有するポリマー材が好ましい。特に、第１のセル１１、第２のセル１２及び第３のセル１３は、酸素透過性を有するポリマー材からなることが好ましい。
【００１７】
酸素透過性を有するポリマー材として具体的には、例えば、フッ素樹脂、シリコンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等が挙げられる。これらの材料を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。中でも、酸素透過性を有するポリマー材としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。
【００１８】
本明細書において、「酸素透過性」とは、分子状の酸素を透過し、細胞培養容器のウェル内まで到達させる性質を表している。具体的な酸素透過率としては、約１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよく、約１１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよく、約１２５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上２７５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよい。なお、「２４ｈ」は２４時間を意味し、「ａｔｍ」とは、気圧をの単位を意味する。すなわち、上記単位「ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ」は、１気圧の環境下において、２４時間で透過する酸素の１ｍ２あたりの容量（ｃｍ３）を表している。酸素透過率が上記範囲である材料からなる培養容器を使用することにより、十分な量の酸素を細胞に供給でき、細胞の生存率を高く保ちながら長期間培養することができる。また、効率よく細胞を増殖させることができる。
【００１９】
［第１のセル及び第２のセル］
第１のセル１１及び第２のセル１２は、いずれも、溶液を収容することが可能に構成され、第３のセル１３を挟んで、例えばｙ軸方向に対向して配置される。第１のセル１１及び第２のセル１２は、後述する第１の孔部１３ｄを介して第３のセル１３と連通し、第３のセル１３に溶液を供給することができる。
第１のセル１１及び第２のセル１２は、例えばｚ軸方向に直交する開口１１ａ及び１２ａをそれぞれ含み、略直方体状又は略円柱状に構成される。この開口１１ａ及び１２ａは、図２Ａ及び図２Ｂにおいて上方側から例えば溶液を添加するために用いられる。
また、図２Ａ及び図２Ｂに示すように、第１のセル１１は、第３のセル１３に隣接する面に対向する面に、孔１１ｂと、孔１１ｂを密閉することが可能なプラグ１１ｃとを有してもよい。この孔１１ｂは、開放状態において針状部材（図示せず）を挿入させることが可能に構成される。これにより、後述するように、第３のセル１３の流路Ｆに血管様細胞構造体を構築することができる。また、孔１１ｂは、プラグ１１ｃ（図示せず）によって密閉されることにより、灌流培養時に第１のセル１１内に収容され得る溶液の漏出を防止することができる。
【００２０】
ここでいう「溶液」とは、細胞培養に用いられる液体培地であってもよいし、該培地にスクリーニング対象の薬剤や成長因子等を適宜添加したものであってもよい。
また、第１のセル１１及び第２のセル１２には、必要に応じて、培地以外の緩衝液、生理食塩水等が収容されてもよい。
【００２１】
また、第１のセル１１の底部１１ｄ及び第２のセルの底部１２ｂはそれぞれ１つ以上のウェルを備えていてもよい。２つ以上の複数のウェルを備える場合、各ウェル内に細胞を播種し、大量に培養させることができる。
ウェルの底面の形状は、平底であってもよく、Ｕ字型であってもよい。ウェルの底面の形状がＵ字型である場合、球状の細胞構造体を培養するのに好適である。
【００２２】
［第３のセル］
第３のセル１３は、第１のセル１１及び第２のセル１２を相互に接続する。第３のセル１３では、図３Ａ〜図３Ｃに示すように、底部１３ｃ上に流路Ｆを有する。図３Ｃでは、流路Ｆを１つ有する場合を例示したが、流路Ｆの数は１つでもよく、２つ以上の複数でもよい。
また、図３Ａ〜図３Ｃに示すように、第３のセル１３は、第１の隔壁１３ａと、第２の隔壁１３ｂと、底部１３ｃと、第１の孔部１３ｄとを有する。
【００２３】
第１の隔壁１３ａは、第１のセル１１に隣接する隔壁（第１のセル１１と第３のセル１３とを区画する画壁）である。
第２の隔壁１３ｂは、第２のセル１２に隣接する隔壁（第２のセル１２と第３のセル１３とを区画する画壁）である。
第１の隔壁１３ａ及び第２の隔壁１３ｂは、相互にｙ軸方向に対向している。
底部１３ｃは、灌流培養時に第３のセル１３の底部を構成する面（底面）であり、第１の隔壁１３ａ及び第２の隔壁１３ｂに連接して配置される。培養容器１０において、第３のセル１３の底部１３ｃは、第１のセル１１の底部１１ｄ及び第２のセル１２の底部１２ｂと略同一平面上に形成される。また、底部１３ｃが透光性材料により形成されることにより、光学顕微鏡や蛍光顕微鏡等による流路Ｆに存在する細胞又は送液の様子の観察が容易になる。
また、底部１３ｃは流路Ｆの底面となりうることから、平滑であることが好ましい。
また、図３Ｂに示すように、第４のセルの脱着時において、第３のセル１３は例えばｚ軸方向に直交する開口１３ｆを含み、略直方体状又は略円柱状に構成される。この開口１３ｆは、図３Ａ及び図３Ｂにおいて上方側から第４のセル１４を装着するために用いられる。
【００２４】
第１の孔部１３ｄは、第１の隔壁１３ａ及び第２の隔壁１３ｂにそれぞれｙ軸方向に対向して形成された少なくとも一対の孔１３ｄ−１及び孔１３ｄ−２を含む。孔１３ｄ−１及び孔１３ｄ−２は、第１のセル１１及び第２のセル１２とそれぞれ連通している。そのため、図３Ａ〜図３Ｃに示すように、第１の孔部１３ｄは、溶液の流路Ｆとなりうる。
図３Ｃに示すように、第１の孔部１３ｄは、培養容器１０において、複数対（例えば２対）の孔１３ｄ−１及び孔１３ｄ−２を含んでもよい。これにより、第１のセル１１及び第２のセル１２間において、１種類の溶液を複数対の孔から１つの第１の孔部１３ｄ（１本の流路Ｆ）を介して灌流することができ、効率よく、精度のよい灌流培養を行うことができる。
また、図３Ａ〜図３Ｃにおいて、第１の孔部１３ｄを１つ有する場合を例示したが、第１の孔部１３ｄを２つ以上有してもよい。これにより、第１のセル１１及び第２のセル１２間において、１種類の溶液を複数本の流路から灌流でき、効率よく、精度のよい灌流培養を行うことができる。
また、第１の孔部１３ｄは、後述する針状部材が第３のセル１３を貫通するように挿入させることが可能に構成されてもよい。
【００２５】
また、流路Ｆの内壁面上に細胞足場材を備えていてもよい。例えば、孔１１ｂから針状部材が第１の孔部１３ｄに挿入されている間に、針状部材の周囲にゲル状の細胞足場材が充填することができる。すなわち、針状部材の抜去後に、針状部材が挿入されていた領域は、細胞足場材が充填されていない空隙となる。これにより、針状部材を抜去後に形成された一対の孔１３ｄ−１及び孔１３ｄ−２間を結ぶ管状の空隙が、壁面に細胞足場材を備える流路Ｆとなりうる。なお、例えば、図３Ｃにおいては、２対の孔１３ｄ−１及び孔１３ｄ−２が含まれるため、それぞれに針状部材を挿入することで、第１の孔部１３ｄ内に２本の流路Ｆが形成される。したがって、第１のセル１１及び第２のセル１２間において、１種類の溶液を２本の流路Ｆにより灌流することができ、効率よく、精度のよい灌流培養を行うことができる。
【００２６】
（細胞足場材）
本明細書において、「細胞足場材」としては、典型的にはゲル化することが可能な細胞足場材であり、加温、化学的架橋、光架橋等により容易にゲル化する材料を用いることができる。このような細胞足場材としては、例えば、コラーゲン（I型、II型、III型、V型、XI型等）、ゼラチン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、デンプン、ポリエチレングリコール、ポリジメチルシロキサン、ポリ乳酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリグルタミン酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリアクリル酸等からなるポリマーゲル及びそれらを適宜修飾させてなるポリマーゲル等が挙げられる。
なお、流路Ｆが細胞足場材を備える場合、第４のセル１４は、細胞足場材を介して、流路の天面に着脱可能に配置される。そのため、第４のセル１４からの培地に溶解している栄養分若しくは薬剤、又は、細胞から分泌された各種生理活性物質若しくは代謝物を透過させる観点から、上記例示された材料から構成される細胞足場材は、気相中で液密性を有し、液相中で半透性を有することが好ましい。
なお、本明細書において、「半透性」とは、一定の分子量以下の分子又はイオンのみを透過可能な性質を意味し、「半透膜」とは、当該性質を有する膜である。
【００２７】
また、図３Ａ〜図３Ｃに示すように、第３のセル１３は、さらに、第２の孔部１３ｅを有してもよい。第２の孔部１３ｅは、第１の隔壁１３ａに形成され、細胞足場材を注入するための孔として構成される。図３Ｃでは、第２の孔部１３ｅを２つ有する場合を例示したが、第２の孔部１３ｅが有する孔の数は１つでもよく、２つ以上の複数でもよい。第２の孔部１３ｅが複数の孔を有している場合には、各孔とも、細胞足場材を注入することが可能であってもよく、また少なくとも一つの孔が第３のセル１３内の排気等の機能を担っていてもよい。
【００２８】
第３のセルが上記構成を有することで、第１のセル１１及び第２のセル１２の一方から他方に溶液を灌流させることができる。したがって、ポンプ等の構成を用いることなく、簡便に灌流培養することができる。
【００２９】
［第４のセル］
第４のセル１４は、溶液を収容することが可能に構成され、第３のセル１３内の流路Ｆ上に着脱可能に配置される。また、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、第４のセル１４は、第３のセル１３内において、ｚ軸方向に着脱可能に配置される。
【００３０】
また、第４のセル１４は、例えばｚ軸方向に直交する開口１４ａを含み、略直方体状又は略円柱状に構成される。なお、第４のセル１４の形状は第３のセル１３の形状と同一であることが好ましい。これにより、第４のセル１４を第３のセル１３内に隙間なく安定して装着することができ、コンタミネーションのリスクを軽減することができる。この開口１４ａは、図３Ａ及び図３Ｂにおいて上方側から例えば溶液を添加するために用いられる。
【００３１】
また、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、第４のセル１４は、底面に半透膜１４ｂと、胴部１４ｃと、を有する。また、図３Ａ及び図３Ｂに示すように第４のセル１４は、さらに、係止部１４ｄを有してもよい。これにより、第４のセル１４を第３のセル１３内に安定して装着することができ、また、第４のセル１４を第３のセル１３から容易に脱着することができる。
【００３２】
（半透膜）
本明細書中において、「半透膜」とは、気相中で液密性を有し、液相中で半透性を有する膜を意味する。半透膜１４ｂは、気相中で液密性を有するため、例えば、第４のセルの内部に培地等の液体を含んでいる場合に、気相中において、液体が漏れず、内部に保つことができる。この液密性は、半透膜上での表面張力によるものである。一方、気体を通すことができるため、内部に液体を含む場合、内部の液体は経時的に蒸発する。
また、第４のセルに用いられる半透膜は、液相中で半透性を有するため、例えば、第１のセルに第１の細胞と培地との懸濁液を添加し、第２のセルに第２の細胞と培地との懸濁液を添加し、さらに、細胞と培地との懸濁液が添加された第４のセルを、第３のセル内に装着した場合に、第４のセル内の細胞は第４のセルの外部に透過させない。一方、第１のセル又は第２のセル間で灌流する培地に溶解している栄養分又は薬剤や、第１の細胞又は第２の細胞から分泌された各種生理活性物質又は代謝物質を第３のセルの流路を介して第４のセル内部に透過させることができる。また、培地に溶解している栄養分若しくは薬剤、又は、細胞から分泌された各種生理活性物質若しくは代謝物を第４のセルの外部に透過させることができる。このため、本実施形態の培養装置を用いることで、生体内での細胞間又は組織間の相互作用を再現することができる。
【００３３】
半透膜１４ｂの材料としては、細胞毒性のないものであればよく、天然高分子化合物であってもよく、合成高分子化合物であってもよい。
【００３４】
前記天然高分子化合物としては、例えば、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分、多糖類（例えば、アルギネート、セルロース、デキストラン、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎｅ）、ポリヒアルロン酸、及びそれらの誘導体等）、キチン、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）（特に、ポリ（β−ヒドロキブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート））、ポリ（３−ヒドロキシ脂肪酸）、フィブリン、寒天、アガロース等が挙げられ、これらに限定されない。
前記セルロースには、合成により改質されたものも含み、例えば、セルロース誘導体（例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、キトサン等）等が挙げられる。より具体的なセルロース誘導体としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、セルローススルフェートナトリウム塩等が挙げられる。
前記ゲル化する細胞外マトリックス由来成分としては、例えば、コラーゲン（I型、II型、III型、V型、XI型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ゼラチン等が挙げられ、これらに限定されない。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨ等を選択し半透膜を作製することが可能である。また、原料を組み合わせることで、様々な生体内組織を模倣した半透膜を得ることができる。
【００３５】
前記合成高分子化合物としては、例えば、ポリホスファゼン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド（例えば、ナイロン等）、ポリエステルアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ無水物、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート（アクリル樹脂）、ポリアルキレン（例えば、ポリエチレン等）、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール等）、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド等）、ポリアルキレンテレフタレート（例えば、ポリエチレンテレフタレート等）、ポリオルトエステル、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド等）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ吉草酸）、ポリ［ラクチド−ｃｏ−（ε−カプロラクトン）］、ポリ［グリコリド−ｃｏ−（ε−カプロラクトン）］等）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、及びこれらのコポリマー等が挙げられ、これらに限定されない。
前記ポリアクリレート（アクリル樹脂）としてより具体的には、例えば、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）等が挙げられる。
【００３６】
半透膜１４ｂは、上記例示された材料のうち１種類から構成されていてもよく、２種類以上から構成されていてもよい。また、半透膜は、天然高分子化合物又は合成高分子化合物のうちいずれかで形成されていてもよく、天然高分子化合物及び合成高分子化合物の両方から形成されていてもよい。
【００３７】
また、半透膜１４ｂは、両面が平滑な膜であってもよく、少なくとも第４のセル内部側の面に１つ以上の凹凸形状を備えていてもよい。半透膜１４ｂが第４のセル内部側の面に１つ以上の凹凸形状を備える場合、該凹凸形状の凹部をウェルとして使用することができ、各凹部内に細胞を播種して培養することができる。また、凹部の底面の形状は、平底であってもよく、Ｕ字型であってもよい。凹部の底面の形状がＵ字型である場合、球状の細胞構造体を培養するのに好適である。
【００３８】
（胴部）
なお、胴部１４ｃを形成する材料としては、観察の容易性から、透光性を有するものであればよく、例えば、透明なガラス、アクリル樹脂等の各種ポリマー材等が挙げられる。
【００３９】
第４のセル１４としては、上記半透膜及び上記胴部の材料を組み合わせて作製してもよく、市販のものをそのまま用いてもよい。市販のものとしては、例えば、Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーインサート等が挙げられる。
【００４０】
第４のセル１４が上記構成を有することで、第４のセル内に添加した培地に溶解している栄養分若しくは薬剤、又は、細胞から分泌された各種生理活性物質若しくは代謝物を、第３のセル１３の流路を介して、第１のセル又は第２のセルに送達させることができる。また、第１のセル又は第２のセル間で灌流する培地に溶解している栄養分又は薬剤や、第１の細胞又は第２の細胞から分泌された各種生理活性物質又は代謝物質を、第３のセルの流路を介して第４のセル内部に送達させることができる。このため、本実施形態の培養装置を用いることで、生体内での細胞間又は組織間の相互作用を再現することができる。
【００４１】
＜灌流装置＞
図４Ａは、本実施形態の培養装置が備える灌流装置の駆動機構の一例を示す正面図である。
また、図４Ｂは、本実施形態の培養装置を用いた灌流培養方法の一例を示す断面図である。
なお、図４Ａ及び図４Ｂ中のＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸は、相互に直交する３軸方向を示している。
これらの図に示すように、灌流装置２０は、支持部材２１と、駆動機構２２と、を有する。さらに、駆動機構２２は、載台２２ａと、軸部２２ｂと、駆動部２２ｃと、制御部２２ｄとを有する。
【００４２】
［支持部材］
培養装置１００において、支持部材２１は、複数の培養容器１０を配置するトレイ状に構成される。各培養容器１０の第１のセル１１及び第２のセル１２は、水平方向（図４ＢではＸ軸方向）に対向して配置される。
【００４３】
［駆動機構］
図４Ｂに示すように、駆動機構２２は、支持部材２１を配置する載台２２ａと、例えばＸ軸方向に沿った軸部２２ｂと、駆動部２２ｃと、制御部２２ｄとを有する。軸部２２ｂは、例えば、載台２２ａの中央部において、Ｙ軸方向に沿って配置され、載台２２ａは、駆動部２２ｃにより、軸部２２ｂを中心としてＹ軸まわりに回動することが可能に構成される。また、制御部２２ｄは、軸部２２ｂの回転角及び回転速度が適当な範囲となるように駆動部２２ｃを制御可能に構成される。このような駆動機構２２により、複数の培養容器１０をＹ軸まわりに回動させ、流路Ｆに溶液Ｌ２を灌流させることができる。
【００４４】
灌流装置２０を用いて培養容器１０内の溶液を流路Ｆに灌流させる方法としては、例えば以下のように行われる。
すなわち、まず培養容器１０を、水平状態から所定の回転角となるまでＹ軸まわりに回動させる。各培養容器１０には、第１のセル１１及び第２のセル１２の少なくとも一方に溶液Ｌ２が添加されている。上記回動により、第１のセル１１と第２のセル１２との溶液Ｌ２の液頭差が生じ、高い位置まで溶液Ｌ２が添加されている方のセルから他方のセルに対し、流路Ｆを介して溶液Ｌ２が流入する。培養容器１０が傾斜した状態を維持することにより、流路Ｆに溶液Ｌ２が継続的に灌流される。そして、鉛直方向上方に配置されていたセル内の溶液Ｌ２がなくなるまでに再び培養容器１０を回動させることで、鉛直方向上方に配置されるセルを他方のセルに切り替えることができ、継続的に流路Ｆに溶液Ｌ２を灌流させることができる。
また、例えば、培養容器１０において、第２のセル１２に溶液Ｌ２を添加し、水平状態からＹ軸を中心として時計回りに所定の回転角（例えば、「＋α度」とする）となるまで回動させて、第２のセル１２から第１のセル１１に溶液Ｌ２を移すことができる。次いで、Ｙ軸を中心として反時計回りに回動させて水平状態に戻し、さらに、該所定の回転角と同じ角度（−α度）となるまで反時計回りに回動させることで、第１のセル１１から第２のセル１２に溶液Ｌ２を移すことができる。この動作を繰り返すことで、第１のセル１１及び第２のセル１２間で溶液Ｌ２を繰り返し移動させることができる。
流路Ｆ中の流速は、例えば流路Ｆの断面積や回転角の大きさ、回転の角速度等に相関を有する。このため、主に灌流装置２０の回動に関する条件を検討することで、培養容器１０を用いた場合の流速を制御することができる。
例えば、後述の実施例に示すとおり、流路Ｆの断面積が３ｍｍ２以上４ｍｍ２以下程度であり、流路の長さが１５ｍｍ以上２０ｍｍ以下程度である場合、制御部２２ｄは、載台２２ａのＹ軸方向の傾斜角度が−２０度以上２０度以下（好ましくは、−１５度以上１５度以下）となり、且つ、載台２２ａのＹ軸方向の傾斜速度が０．１度／分以上６度／分以下となるように駆動部２２ａを制御することができる。これにより、生体内での血流等の速度と同程度の流速に制御することができる。
【００４５】
＜その他構成＞
［針状部材］
本実施形態の培養装置は、特開２０１７−１９５８４５号公報（参考文献１）に示されるように、上記培養容器及び上記灌流装置に加えて、さらに、着脱可能な針状部材を備えていてもよい。
【００４６】
針状部材は、複数の培養容器１０のうちの一の培養容器１０の第３のセル１３を貫通することが可能に構成される。具体的には、各針状部材は、一対の孔１３ｄ−１及び孔１３ｄ−２に挿入される。
針状部材は、導電性材料により形成されることが好ましく、針状部材の表面は、例えば金（Ａｕ）により形成されることがより好ましい。これにより、後述するように、表面に播種された細胞の脱離を円滑に行うことができる。
針状部材は、例えば一軸方向（例えばＺ軸方向）に延在する棒状に構成され、針状部材の横断面（延在方向に直交する断面）は、典型的には円形で構成される。当該横断面の径は、作製する血管様構造の径に応じて適宜設定することができ、例えば０．１ｍｍ以上１．０ｍｍ以下程度で構成され得る。
また、針状部材は、第３のセル１３を貫通する第１の位置と、第３のセル１３から抜去される第２の位置と、の間を移動可能に構成される。
【００４７】
［その他部材］
本実施形態の培養装置は、特開２０１７−１９５８４５号公報（参考文献１）に示されるように、上記培養容器及び上記灌流装置に加えて、さらに、容器保持部材、ホルダ、移動機構等のその他部材を備えていてもよい。これらのその他部材は、培養容器１０の第３のセル１３に細胞足場材を充填する目的で用いられる。
具体的には、容器保持部材は、複数の培養容器１０を保持するためのものである。
ホルダは、複数の針状部材それぞれを複数の培養容器１０のうち少なくとも１つの培養容器１０の第３のセル１３に貫通させることが可能に、複数の針状部材を保持するためのものである。
移動機構は、針状部材を第３のセル１３を貫通する第１の位置と、第３のセル１３から抜去される第２の位置と、の間を移動可能に、ホルダを移動させるためのものである。
【００４８】
≪２種類以上の細胞構造体を構築する方法≫
本実施形態の方法は、上記実施形態に係る培養装置を用いて、２種類以上の細胞構造体を構築する方法であって、以下の工程１）〜４）を備える方法である。
１）前記第１のセルに第１の細胞を播種して培養することで、第１の細胞構造体を形成させる工程；
２）前記第２のセルに第２の細胞を播種して培養することで、第２の細胞構造体を形成させる工程；
３）前記第４のセルに第３の細胞を播種して培養することで、第３の細胞構造体を形成させる工程；
４）前記第１の細胞構造体、前記第２の細胞構造体及び前記第３の細胞構造体を、前記培養装置を用いて共培養する工程
【００４９】
また、前記第１の細胞構造体と、前記第２の細胞構造体とは、同一の種類であってもよく、異なる種類であってもよく、前記第１の細胞構造体及び前記第２の細胞構造体と、前記第３の細胞構造体とは、異なる種類である。
【００５０】
本実施形態の方法では、上記培養装置を用いることで、該培養装置が備える培養容器内に２種類以上の細胞構造体を容易に構築することができる。得られた培養容器内に２種類以上の細胞構造体を備える培養装置は、後述するようにオンチップ臓器デバイスとして活用することができる。  
【００５１】
＜細胞＞
本実施形態の方法の各工程で用いられる細胞としては、特別な限定はなく、脊椎動物細胞であってもよく、無脊椎動物細胞であってもよい。脊椎動物細胞としては、例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、は虫類細胞、両生類細胞、魚類細胞等が挙げられる。無脊椎動物細胞としては、例えば、昆虫細胞、甲殻類細胞、軟体動物細胞、原生動物細胞等が挙げられる。中でも、脊椎動物細胞が好ましく、哺乳動物細胞がより好ましい。
【００５２】
脊椎動物細胞（特に、哺乳動物細胞）としては、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。また、これら細胞の細胞塊（スフェロイド）を用いてもよい。また、生体の正常組織又はがん組織から分離された小さな組織片を、そのまま細胞塊と同様に用いてもよい。
【００５３】
生体を構成する体細胞としては、例えば、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられ、これらに限定されない。体細胞として、より具体的には、例えば、線維芽細胞、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、表皮角化細胞（ケラチノサイト）、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、軟骨細胞、卵丘細胞、グリア細胞、神経細胞（ニューロン）、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心筋細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞等）、メラニン細胞、単核細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５４】
幹細胞とは、自己を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５５】
前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞又は生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
【００５６】
がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞であり、周囲の組織に浸潤し、又は転移を起こす悪性新生物である。がん細胞の由来となる癌としては、例えば、乳癌（例えば、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、炎症性乳癌等）、前立腺癌（例えば、ホルモン依存性前立腺癌、ホルモン非依存性前立腺癌等）、膵癌（例えば、膵管癌等）、胃癌（例えば、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌等）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫等）、結腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸癌（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸癌（例えば、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍等）、小腸癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌（例えば、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌等）、頭頚部癌、唾液腺癌、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓癌（例えば、原発性肝癌、肝外胆管癌等）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、腎盂と尿管の移行上皮癌等）、胆嚢癌、膵臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌（例、上皮性卵巣癌、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱癌、尿道癌、皮膚癌（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺癌（例えば、甲状腺髄様癌等）、副甲状腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形癌（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
また、本明細書において、「癌」とは、診断名を表す際に用いられ、「がん」とは、悪性新生物の総称を表す際に用いられる。
【００５７】
細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株としては、例えば、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５８】
本実施形態の方法において、各セルに播種される細胞の種類は、その目的に応じて適宜選択することができる。また、各セルに播種される細胞は１種類単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてよい。
【００５９】
＜培地＞
本実施形態の方法の各工程で細胞を培養するために用いられる培地としては、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地とすることができる。
【００６０】
培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、及び、膜電位の調節を助けるためのものである。
無機塩としては、特別な限定はなく、例えば、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び、重炭酸塩の形で用いられる。
一般的に、培地中の無機塩の重量オスモル濃度は、例えば２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇとすることができる。
【００６１】
炭水化物としては、特別な限定はなく、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。
一般的に、培地中の炭水化物（好ましくは、Ｄ−グルコース）の濃度としては、０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００６２】
アミノ酸としては、特別な限定はなく、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及び、それらの組み合わせ等が挙げられる。
一般的に、培地に含まれるグルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下) とすることができる。培地に含まれるグルタミン以外の各アミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下) とすることができる。アミノ酸は合成由来でもよい。
【００６３】
ビタミンとしては、特別な限定はなく、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシンアミド（ビタミンＢ３）、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ−αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）、塩化コリン、ｍｙｏ−イノシトール等が挙げられる。
【００６４】
培地は、さらに抗生物質、血清、成長因子、又は、ホルモンを含んでいてもよい。
【００６５】
抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００６６】
血清としては、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられ、これらに限定されない。
一般的に、培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下とすることができる。
【００６７】
成長因子としては、例えば、細胞増殖因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。
成長因子としてより具体的には、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ―ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＩＧＦ−１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（Ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＡＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００６８】
ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン（ハイドロコーチゾン等）等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００６９】
また、成長因子及びホルモンを含む培地添加剤として、ウシ脳下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ：ＢＰＥ）を用いてもよい。
【００７０】
培地として具体的には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ等の公知の基本培地が挙げられる。
【００７１】
また、細胞の種類に応じた市販の培地を用いてもよい。
例えば、細胞が上皮系細胞である場合、培地として具体的には、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２（クラボウ社製）、角化細胞基本培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）、角化細胞増殖培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
【００７２】
本実施形態の方法の各工程で使用される培地は、使用する細胞の種類に応じて、上記例示された培地から、適宜選択することができる。
【００７３】
＜培養条件＞
本実施形態の方法の各工程で細胞を培養する条件としては、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
培養温度としては、例えば２５℃以上４０℃以下とすることができ、例えば３０℃以上３９℃以下とすることができ、例えば３５℃以上３９℃以下とすることができる。
また、培養環境は、例えば約５％のＣＯ２条件下とすることができる。
また、上記「≪培養装置≫」の「＜灌流装置＞」に示したように、灌流装置が備える載台の傾斜角度及び傾斜速度を、制御部及び駆動部により適宜調整することで、流路Ｆにおける流速を制御しながら、灌流培養することができる。
【００７４】
＜各工程＞
次いで、本実施形態の方法の各工程について以下に説明する。
工程１）では、第１のセルに第１の細胞を播種して培養することで、第１の細胞構造体を形成させる。
工程２）では、第２のセルに第２の細胞を播種して培養することで、第２の細胞構造体を形成させる。
第１の細胞と第２の細胞とは、同一の種類のものを使用してもよく、異なる種類のものを使用してもよい。同一の種類のものを使用した場合、形成される第１の細胞構造体及び第２の細胞構造体を同一の種類とすることができる。また、異なる種類のものを使用した場合、形成される第１の細胞構造体及び第２の細胞構造体を異なる種類とすることができる。中でも、第１の細胞構造体及び第２の細胞構造体は異なる種類であることが好ましい。これにより、本実施形態の方法において、３種類の細胞構造体を構築することができる。
また、第１の細胞及び第２の細胞としては、上記細胞として例示されたものから、目的に応じて適宜選択することができ、中でも、各種臓器（例えば、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、副腎、卵巣、子宮、精巣、脳等）を構成する細胞、それらのがん細胞又はそれらの細胞株を用いることが好ましい。
また、播種する細胞数は、各セル内の大きさ又は各セルの底部のウェルの大きさに応じて、適宜調整することができる。
【００７５】
工程１）と工程２）とは、同時に行ってもよく、工程１）を先に行った後に工程２）を行ってもよい。
また、第１の細胞及び第２の細胞の種類が異なる場合に、それぞれに適した培地を用いるために、流路Ｆを遮断する仕切り等を第３のセル内に設けて各細胞を培養することもできる。
【００７６】
工程３）では、第４のセルに第３の細胞を播種して培養することで、第３の細胞構造体を形成させる。
本実施形態の方法において、第３の細胞は、上記第１の細胞及び上記第２の細胞と異なる種類のものを用いられる。すなわち、第３の細胞構造体は、上記第１の細胞構造体及び上記第２の細胞構造体と異なる種類のものとなる。これにより、少なくとも２種類以上の細胞構造体を構築することができる。
第３の細胞としては、上記細胞として例示されたものから、目的に応じて適宜選択することができ、中でも、上皮組織（例えば、被蓋上皮、腺上皮、吸収上皮、感覚上皮、呼吸上皮等）を構成する細胞、それらのがん細胞又はそれらの細胞株を用いることが好ましい。
また、播種する細胞数は、第４のセル内の大きさ又は第４のセルの底部のウェルの大きさに応じて、適宜調整することができる。
【００７７】
工程３は、工程１）及び工程２）と同時に行ってもよく、工程１）の後であって工程２）の前に行ってもよく、工程２の後に行ってもよい。
また、工程３）において、第４のセルを培養容器の第３のセル内に装着した状態で第３の細胞を培養して第３の細胞構造体が形成させてもよく、又は、第４のセルを培養容器の第３のセルから脱着した状態で個別に第３の細胞を培養して第３の細胞構造体が形成させてもよい。中でも、第４のセルを培養容器の第３のセルから脱着した状態で個別に第３の細胞を培養して第３の細胞構造体が形成させることが好ましい。第１の細胞及び第２の細胞と、第３の細胞とは種類が異なるため、使用する培地及び培養条件等も異なる可能性がある。そのため、第４のセルを培養容器の第３のセルから脱着した状態で、個別に第３の細胞を培養することで、各細胞構造体が形成されるまで、目的の各細胞構造体の形成に適した条件下で培養することができる。
【００７８】
工程４）では、工程１）で形成された第１の細胞構造体、工程２）で形成された第２の細胞構造体及び工程３）で形成された第３の細胞構造体を、上記培養装置を用いて共培養する。これにより、第１の細胞構造体、第２の細胞構造体及び第３の細胞構造体間の相互作用を評価することができる。
【００７９】
また、本実施形態の方法は、上記工程１）〜工程４）に加えて、前記工程１）の前に、さらに、以下の工程１’）を備えてもよい。
１’）前記第３のセルの前記流路に第４の細胞を播種して培養することで、前記流路の壁面上に第４の細胞構造体を形成させる工程
【００８０】
また、本実施形態の方法が、工程１’）を備える場合、第３の細胞は、上記第１の細胞、上記第２の細胞及び上記第３の細胞と異なる種類のものが用いられる。すなわち、第４の細胞構造体は、上記第１の細胞構造体、上記第２の細胞構造体及び上記第３の細胞構造体と異なる種類のものとなる。これにより、少なくとも３種類の細胞構造体を構築することができる。
第４の細胞としては、上記細胞として例示されたものから、目的に応じて適宜選択することができ、中でも、血管組織を構成する細胞、それらのがん細胞又はそれらの細胞株が好ましい。
【００８１】
流路の壁面上に第４の細胞構造体を形成させる方法としては、例えば、上記「≪培養装置≫」の「［その他部材］」において記載された針状部材を用いた、公知の文献（参考文献１：特開２０１７−１９５８４５号公報）に記載の方法等が挙げられる。
針状部材が導電性を有する場合、具体的には、まず、該針状部材の表面に第４の細胞を播種する。
次いで、針状部材の表面に第４の細胞を十分に吸着させた後、該針状部材を培養容器の第３のセルを貫通するように挿入する。配置される位置としては、図３Ｂ及び図３Ｃに示す培養容器１０Ｂにおいて、針状部材（図示せず）が、第１の孔部１３ｄとＺ軸方向に対向するように配置される。
次いで、第３のセル１３内に挿入された針状部材の周囲に細胞足場材を充填する。細胞足場材を充填する場合、該細胞足場材の性状に応じて、加温、光の照射、化学反応等によりゲル化させることができる。
次いで、第３のセルの流路の壁面上に備えられた細胞足場材に、針状部材から細胞を転写する。針状部材が導電性を有する場合、電圧を印加することで、表面に吸着した細胞を第３のセルの流路の壁面上、又は、第３のセルの流路の壁面上に備えられた細胞足場材に転写することができる。電圧の大きさや時間等の条件は、細胞が生存可能な程度であればよく、例えば−１Ｖで５分間程度の電圧を印加することができる。
次いで、針状部材を培養容器１０内から抜去する。このとき、第１のセル１１及び第２のセル１２のうち少なくとも一方に培地を添加することが好ましい。これにより、針状部材の抜去時に、培養容器１０内に気泡が入る等の不具合を防止することができる。
次いで、第３のセルの流路の壁面上に備えられた細胞足場材に播種された第４の細胞を培養することで、流路の壁面上に、細胞足場材を介して、第４の細胞構造体を形成させることができる。
【００８２】
また、針状部材が導電性を有しない場合、まず、針状部材を培養容器の第３のセルを貫通するように挿入する。配置される位置としては、上記「針状部材が導電性を有する場合」と同様である。
次いで、第３のセル１３内に挿入された針状部材の周囲に細胞足場材を充填する。
細胞足場材を充填する場合、該細胞足場材の性状に応じて、加温、光の照射、化学反応等によりゲル化させることができる。
次いで、針状部材を抜去する。これにより、針状部材を抜去後に形成された一対の孔１３ｄ−１及び孔１３ｄ−２間を結ぶ管状の空隙が、壁面に細胞足場材を備える流路Ｆとなりうる。
次いで、第４の細胞の懸濁液を流路Ｆに添加する。添加後、図３Ｂ及び図３Ｃに示す培養容器１０Ｂにおいて、該培養容器１０をｙ軸まわりに回転させることで、第４の細胞をまんべんなく流路Ｆの壁面上に播種することができる。この第３のセルの流路の壁面上に備えられた細胞足場材に播種された第４の細胞を培養することで、流路の壁面上に細胞足場材を介して第４の細胞構造体を形成させることができる。
【００８３】
また、工程１’）を備える場合、上記工程４）において、第１の細胞構造体、第２の細胞構造体、第３の細胞構造体及び第４の細胞構造体を、上記培養装置を用いて共培養することができる。
【００８４】
また、本実施形態の方法は、上記工程１）〜工程４）に加えて、さらに、工程４）の後に、以下の工程５）〜６）等のその他の工程を備えてもよい。
５）共培養された第１の細胞構造体、第２の細胞構造体及び第３の構造体をそれぞれ観察する工程；
６）共培養された第１の細胞構造体、第２の細胞構造体及び第３の構造体をそれぞれ分析する工程
【００８５】
工程５）では、顕微鏡等を用いて、各細胞構造体を観察することができる。
また、工程６）では、各細胞構造体を培養装置内に備えたまま、各種染色法（例えば、免疫染色法）等を用いて、解析することができる。
【００８６】
≪オンチップ臓器デバイス≫
本実施形態のオンチップ臓器デバイスは、上記実施形態に係る培養装置の前記培養容器内に２種類以上の細胞構造体を備えるオンチップ臓器デバイスである。第１のセル内に第１の細胞構造体を備え、第２のセル内にそれぞれ第２の細胞構造体を備え、第４のセルの前記半透膜上に第３の細胞構造体を備える。
また、第１の細胞構造体と、第２の細胞構造体とは、同一の種類であってもよく、異なる種類であってもよい。中でも、第１の細胞構造体及び第２の細胞構造体は異なる種類であることが好ましい。これにより、本実施形態のオンチップ臓器デバイスは、３種類の細胞構造体を備えることができる。
また、第１の細胞構造体及び第２の細胞構造体と、第３の細胞構造体とは、異なる種類である。これにより、少なくとも２種類以上の細胞構造体を備えることができる。
また、第１の細胞構造体及び第２の細胞構造体は、上記「＜細胞＞」に例示されたいずれの細胞からなってもよい。
一方、第３の細胞構造体は、物質が吸収又は暴露される上皮組織及び表皮組織を構成する細胞からなることが好ましく、具体的には、例えば、肺、小腸、眼、粘膜等を構成する細胞からなることが好ましい。
【００８７】
図５及び後述の実施例に示すように、例えば、本実施形態のオンチップ臓器デバイスにおいて、第１の細胞構造体が心筋細胞からなり、第２の細胞構造体が肝細胞からなり、第３の細胞構造体が培養皮膚である場合、生体内での皮膚組織、心臓及び肝臓間の相互作用を再現し、評価することができる。また、例えば、第４のセル内に経皮吸収される薬剤を添加することで、該薬剤の心臓及び肝臓への毒性等の影響を評価することができる。
【００８８】
また、本実施形態のオンチップ臓器デバイスは、さらに、前記第３のセルの前記流路の壁面上に第４の細胞構造体を備えてもよい。このとき、第１の細胞構造体、第２の細胞構造体及び第３の細胞構造体と、第４の細胞構造体とは、異なる種類である。これにより、少なくとも３種類の細胞構造体を備えることができる。
第４の細胞構造体は、物質の運搬に関与する組織を構成する細胞からなることが好ましく、具体的には、例えば、血管（例えば、毛細血管、静脈、動脈等）、神経、リンパ、尿細管、胆管、汗腺、乳腺等を構成する細胞からなることが好ましい。
【００８９】
例えば、本実施形態のオンチップ臓器デバイスにおいて、第１の細胞構造体が心筋細胞からなり、第２の細胞構造体が肝細胞からなり、第３の細胞構造体が培養皮膚であり、第４の細胞構造体が血管内皮細胞からなる場合、皮膚組織、血管組織、心臓及び肝臓間の相互作用を再現し、評価することができる。また、例えば、第４のセル内に経皮吸収される薬剤を添加することで、該薬剤が皮膚から、血管を介して、心臓及び肝臓へ送達される吸収及び代謝の流れを再現でき、より生体内の環境に近しい環境で薬剤の毒性等を評価することができる。
【００９０】
＜使用用途＞
本実施形態のオンチップ臓器デバイスは、薬剤の毒性評価、新規薬剤の探索、生体内の臓器間相互作用の基礎研究、病態メカニズムの解明、再生医療用組織又は臓器の構築等の分野で好適に用いられる。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９２】
［参考例１］シーソー型送液システムを備える培養装置の開発
生体内の血管には血液が流れており、その流れによってせん断応力が細胞に負荷されている。そのため、生体内の環境を模倣するにあたって、液を送液し、せん断応力を負荷しながら細胞を培養するということが非常に重要である。そこで、まず、三次元的な足場材料であるハイドロゲル内に、血管様構造を作製し、その中を簡便に送液しながら培養できるシステムを開発した。
【００９３】
１．培養容器の製造
（１）鋳型の作製
アクリル板をレーザー加工機でカットし、アクリル樹脂用接着剤（アクリサンデー）で貼り合わせることで鋳型を作製した。
【００９４】
（２）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）溶液の調製
熱硬化性シリコーンゴム ＰＤＭＳ前駆体（信越化学社製、ＫＥ−１３００Ｔ）とＰＤＭＳ硬化剤（信越化学社製、ＣＡＴ−１３００）とを１０：１の割合でよく混ぜ合わせ、オイルポンプ（ＵＬＶＡＣ社製、Ｇ−５０ＳＡ）を用いて気泡抜きを行い、ＰＤＭＳ溶液を得た。
【００９５】
（３）培養容器の製造
（３−１）ＰＤＭＳチップの作製
次いで、（２）で調製したＰＤＭＳ溶液を（１）で作製した鋳型に流しいれ、再度オイルポンプを用いて気泡を抜いた。その後８０℃のオーブンで２時間焼成した。さらに、硬化したＰＤＭＳを鋳型から取り出し、純水に入れてオートクレーブして、ＰＤＭＳチップを得た（図６参照）。
【００９６】
（３−２）ガラスの接着
次いで、プラズマクリーナー（ＨＡＲＲＩＣＫ ＰＬＡＳＭＡ社製、ＰＬＡＳＭＡＦＬＯ）のチャンバー内にＰＤＭＳチップとカバーガラス（松浪硝子社製、Ｎｏ．１）１枚とを入れて、真空引きを行った。真空計の値が９８ｍＴｏｒｒになったところで、バルブを回し酸素を２分間導入した。その後、バルブを用いて酸素の導入量を調整し、３１５ｍＴｏｒｒ、Ｍｉｄｄｌｅ、３０秒の条件下でプラズマ処理を行った。照射完了後、チャンバーからＰＤＭＳチップとガラスとを取り出し、ＰＤＭＳチップの底面にそれぞれ１枚ずつ素早く貼り付けた。これにより、顕微鏡による経時的な観察を可能とした。
【００９７】
（３−３）コラーゲンの導入及びニードルの設置
次いで、ニードルの差込口からニードルをセル内に設置後、ピペットを用いて、中央部のハイドロゲル導入部にコラーゲンを導入した。次いで、コラーゲンがゲル化後、ニードルを引き抜くことで、培養容器を完成させた。
【００９８】
２．培養装置の製造
次いで、「１．」で製造された培養容器をシーソー型灌流装置上に配置し、培養容器とシーソー型灌流装置とを備える培養装置を完成させた（図７参照）。湿度約１００%であるインキュベーターで使用できるように、耐湿性のあるモーターを選択した。また、ケーブルの接続部がインキュベーター外に出るように設計した。これにより、２週間ほどの長期使用時にも、問題なく稼働した。
さらに、様々な条件を検討できるように、傾斜角度を−２０°以上２０°以下、傾斜速度を０．１°／分以上６°／分以下に設定できるように設計した。
【００９９】
［参考例２］シーソー型送液システムを備える培養装置内での血管様細胞構造体の作製
次いで、参考例１で製造されたシーソー型送液システムを備える培養装置を用いて、該装置内に血管様細胞構造体を作製した。
【０１００】
１．培養容器の製造
（１）鋳型の作製
参考例１の（１）と同様の方法を用いて、鋳型を作製した。
【０１０１】
（２）ＰＤＭＳ溶液の調製
参考例１の（２）と同様の方法を用いて、ＰＤＭＳ溶液を調製した。
【０１０２】
（３）培養容器の製造
（３−１）ＰＤＭＳチップの作製
参考例１の（３−１）と同様の方法を用いて、ＰＤＭＳチップを作製した。
【０１０３】
（３−２）ガラスの接着
カバーガラスを２枚用いて、ＰＤＭＳチップの上面及び底面に貼り合わせた以外は、参考例１の（３−２）と同様の方法を用いて、ＰＤＭＳチップにガラスを接着させた。次いで、培養容器をオートクレーブすることで滅菌した。
【０１０４】
２．血管様細胞構造体の構築
図８に示す手順にて血管様細胞構造体を構築した。具体的な作製方法には、以下に示すとおりである。
【０１０５】
（１）ニードルの準備
ニードルをクリーンベンチ内で７０％エタノールに５分間浸漬し、滅菌した。その後、滅菌水に５分間×３回浸漬し、洗浄した。
【０１０６】
（２）コラーゲンゲルの導入
次いで、（３−３）で準備したニードルをハイドロゲル導入部に挿入した。次いで、ハイドロゲル導入部にコラーゲンゲルを導入し、１５分間インキュベートした。
【０１０７】
（３）細胞播種及びニードルの引き抜き
次いで、流路の片側に３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／３０μＬの細胞懸濁液を滴下し、反対側からニードルを引き抜くことで流路内にＧＦＰ発現ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ；ＨＵＶＥＣ）（ＡＮＧＩＯ−ＰＲＯＴＥＯＭＩＥ社より購入）の懸濁液を導入した。１５分後に培養容器を逆さにして、流路内の全面に細胞が接着するようにして、血管様細胞構造体を構築した。
【０１０８】
３．シーソー型灌流装置を用いた培養装置による培養
（１）培地の送液
次いで、培養容器の培地リザーバー内に２ｍＬの血管内皮細胞用増殖培地（Ｌｏｎｚａ社製、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−２）を入れ、培養容器をシーソー型灌流装置（傾斜角度：１５度）に載せることで、コラーゲンゲル内の血管様細胞構造体中に培地を繰り返し送液して１日間培養した。
【０１０９】
（２）蛍光観察
培養後、位相差蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、ＩＸ−７１）を用いて、ＧＦＰ発現ＨＵＶＥＣを観察した。結果を図９に示す。図９において、スケールバーは５００μｍを示す。
【０１１０】
図９から、培養容器内のコラーゲンゲル中に、細胞が密に覆った血管様細胞構造体を構築できたことが確認された。
また、この培養容器は、ハイドロゲル導入部の両端に培地リザーバーを備えるため、シーソー型灌流装置上に培養容器を設置することで、血管様細胞構造体に培地を繰り返し送液できることが確かめられた（図１０参照）。
【０１１１】
［参考例３］シーソー型灌流装置の傾斜速度及び送液速度の検証
次いで、シーソー型灌流装置の傾斜速度と、培地が実際に血管様細胞構造体を流れる速度の関係を調べた。
【０１１２】
１．培養容器の製造
参考例２と同様の方法を用いて、培養容器を製造した。
【０１１３】
２．血管様細胞構造体の構築
ＧＦＰ発現ＨＵＶＥＣ（ＡＮＧＩＯ−ＰＲＯＴＥＯＭＩＥ社より購入）の代わりに、ＨＵＶＥＣ（ＬＯＮＺＡ社より購入）を用いた以外は、参考例２の「２．」と同様の方法を用いて、血管様細胞構造体を構築した。血管様細胞構造体の内径は５００μｍであった。
【０１１４】
３．シーソー型灌流装置を用いた培養装置による培養
（１）培地の送液
次いで、培養容器の片側の培地リザーバーに１ｍＬの血管内皮細胞用増殖培地（Ｌｏｎｚａ社製、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−２）を入れ、培養容器をシーソー型灌流装置に載せた。次いで、シーソー型灌流装置を１５度になるまで傾斜させた。
【０１１５】
（２）送液速度の計算
次いで、１５度まで傾いた後に、培地を入れたのとは反対側の培地リザーバーに流れてきた培地を回収し、その液量を測定した。次いで、液量を傾斜に要した時間（分）で割ることで、１分あたり流路に流れた培地の流速を求めた。傾斜速度を変えて、同様に１５度まで傾斜させて、それぞれ培地の流速を求めた。結果を図１１に示す。
【０１１６】
図１１から、血管様細胞構造体内を流れる培地の流速は、シーソー型灌流装置の傾斜速度に比例した。このことから、シーソー型灌流装置の傾斜速度を変更することで、培地の流速を自在にコントロール可能であることがわかった。
また、培地の流速は、シーソー型灌流装置のどの場所にデバイスを置いても同じであった。これより、一度に多くのデバイスを、同じ流速の条件下で培養できることがわかった。
【０１１７】
［参考例４］灌流培養による細胞への影響の確認
次いで、シーソー型灌流装置を用いた灌流培養による細胞への影響を確認した。
【０１１８】
１．培養容器の製造
参考例２と同様の方法を用いて、培養容器を製造した。
【０１１９】
２．血管様細胞構造体の構築
ＧＦＰ発現ＨＵＶＥＣ（ＡＮＧＩＯ−ＰＲＯＴＥＯＭＩＥ社より購入）の代わりに、ＨＵＶＥＣ（ＬＯＮＺＡ社より購入）を用いた以外は、参考例２の「２．」と同様の方法を用いて、血管様細胞構造体を構築した。血管様細胞構造体の内径は５００μｍであった。
【０１２０】
３．シーソー型灌流装置を用いた培養装置による培養
（１）培地の送液
次いで、培養容器の培地リザーバー内に２ｍＬの血管内皮細胞用増殖培地（Ｌｏｎｚａ社製、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−２）を入れ、培養容器をシーソー型灌流装置（傾斜角度：１５度、傾斜速度：０．２度／分）に載せることで、コラーゲンゲル内の血管様細胞構造体中に培地を繰り返し送液して７日間培養した。また、対照として、同様の培養容器を用いた７日間静置培養した。
【０１２１】
（２）細胞の観察及び画像解析
培養７日目に、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製、ＰＡＳＣＡＬ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて細胞を観察し、画像を取得した。取得した画像の画素及びサイズを調整し、移動平均法により二値化処理を行った。次いで、画像解析ソフト（Ｎ２Ｋ−Ｐｒｏ）により高速フーリエ変換（ｆａｓｔ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ；ＦＦＴ）を行い、取得した画像にフーリエ変換を適用した。結果を図１２に示す。図１２中、スケールバーは２５０μｍを示す。また、Ｄ７は培養７日目であることを意味する。また、矢印は灌流培養における送液方向を意味する。
【０１２２】
（３）配向角度及び配向強度の算出
取得したフーリエ変換画像から配向角度と配向強度を算出した。その際、フーリエ変換画像で、Ｘ軸正方向を０°として、反時計回りの角度（度）に対する平均振幅を計算した。結果を図１３Ａ（各配向角度における配向強度を示すグラフ）及び図１３Ｂ（配向強度を示すグラフ）に示す。
【０１２３】
図１２から、７日間灌流培養することで、細胞が送液方向に配向することが確かめられた。
また、図１３Ａ及び図１３Ｂから、静置培養と比較して灌流培養の際は、配向強度が約１．５倍になった。
これらのことから、間接的であるが、灌流培養によって細胞間接着が強固になり、安定した血管様再構造体が得られたと推察された。
【０１２４】
［参考例５］市販の９６Ｕウェルプレートを用いたがん細胞による血管新生の評価
１．混合スフェロイドの作製
ヒト乳腺癌由来細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）の細胞数とヒト新生児皮膚線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢの（理化学研究所細胞バンクより入手）細胞数とが１０：１になるように細胞懸濁液を混合し、細胞非接着の９６Ｕウェルプレート（住友ベークライト社製、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ９６  Ｕ  ｐｌａｔｅ）に、１ウェル当たり２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるよう播種した。その後２日に１度培地交換をし、１週間培養した。培地の組成は、Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  １６０４Ｈ（ＣｅＬＬｅｃｔ  Ｇｏｌｄ社製）及びＰｅｎｉｃｉｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ２６２５２−９４（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社製）を含有する（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社製）である。培養１、３及び７日目に共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製、ＰＡＳＣＡＬ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて細胞を観察した。結果を図１４に示す。図１４において、スケールバーは１ｍｍを示す。また、「Ｄ１」は培養１日目、「Ｄ３」は培養３日目、「Ｄ７」は培養７日目であることを意味する。
【０１２５】
図１４から、培養１日目では細胞が集まっただけだったが、培養によって細胞が徐々に凝集していき、培養７日目には密に細胞が凝集したスフェロイドを形成した。また、作製したスフェロイドは細胞密度が高かった。また、直径1ｍｍ程度のスフェロイドを作製することができた。拡散による酸素や栄養素の供給は２００μｍ程度までしかできないということが知られており、ここで作製したスフェロイドは、非常に大きいため、内部の細胞が低酸素誘導因子−１α（Ｈｙｐｏｘｉａ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｆａｃｔｏｒ−１α；ＨＩＦ−１α）を発現していることが示唆された。これにより、血管新生促進因子の分泌量が増加したものと考えられた。
【０１２６】
［参考例６］培養装置を用いたがん細胞による血管新生の評価
１．培養容器の製造
参考例２と同様の方法を用いて、培養容器を製造した。
【０１２７】
２．混合スフェロイドの作製
参考例５の「１．」と同様の方法を用いて、混合スフェロイドを作製した。
【０１２８】
３．血管様細胞構造体の構築
（１）ニードルの準備
ニードルをクリーンベンチ内で７０％エタノールに５分間浸漬し、滅菌した。その後、滅菌水に５分間×３回浸漬し、洗浄した。
【０１２９】
（２）コラーゲンゲルの導入
次いで、「２．」で作製した混合スフェロイドを回収し、上澄み液を除去した後、コラーゲンゲルに包埋した。次いで、（３−３）で準備したニードルをハイドロゲル導入部に挿入した。次いで、混合スフェロイド包埋したコラーゲンゲルをハイドロゲル導入部に導入し、１５分間インキュベートした。対照として、混合スフェロイドを包埋していないコラーゲンゲルを導入したものも準備した。
【０１３０】
（３）細胞播種及びニードルの引き抜き
次いで、流路の片側に３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／３０μＬの細胞懸濁液を滴下し、反対側からニードルを引き抜くことで流路内にＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ社より購入）の懸濁液を導入した。１５分後に培養容器を逆さにして、流路内の全面に細胞が接着するようにして、血管様細胞構造体を構築した。
【０１３１】
４．シーソー型灌流装置を用いた培養装置による培養
（１）培地の送液
次いで、培養容器の培地リザーバー内に２ｍＬの血管内皮細胞用増殖培地（Ｌｏｎｚａ社製、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−２）を入れ、培養容器をシーソー型灌流装置（傾斜角度：１５度、流速：１０μＬ／分）に載せることで、コラーゲンゲル内の血管様細胞構造体中に培地を繰り返し送液して３日間培養した。
【０１３２】
（２）アクチン染色及び核染色
次いで、アクチン染色試薬であるローダミンファロイジン（Ｓｉｇｍａ社製）及び核染色液であるＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）（Ｓｉｇｍａ社製）をそれぞれ培地に混合して送液して、ハイドロゲル導入部内の細胞を染色した。染色後、位相差蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、ＩＸ−７１）を用いて観察した。結果を図１５（真ん中）に示す。図１５において、スケールバーは５００μｍを示す。また、図１５の左側の図及び画像は、混合スフェロイド存在下で灌流培養した血管様細胞構造体である。右側の図及び画像は、混合スフェロイド非存在下で灌流培養した血管様細胞構造体である。いずれの画像も正面から見たものである。また、「Ｄ３」は培養３日目を意味する。
【０１３３】
（３）デキストランの送液
次いで、蛍光標識デキストラン（分子量３０００、Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）  ３０００ＭＷ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含む培地を数分間送液し、その後に、位相差蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、ＩＸ−７１）を用いて観察した。結果を図１５（下）に示す。
【０１３４】
図１５から、培養３日目において、がん細胞の混合スフェロイドを包埋すると、包埋してない場合と比べて血管新生が促進されることが確かめられた。これは、がん細胞が血管新生促進因子を分泌したためであると考えられる。
また、デキストランを送液すると、がん細胞を包埋した場合は、包埋してない場合と比較して血管様細胞構造体外へのデキストランの漏れ出しが確認された。このことからも血管新生が促進されたことが示唆された。
【０１３５】
［参考例７］培養装置を用いた薬剤評価デバイスの作製
薬剤を評価していく上で臓器間の相互作用を考慮して目的の臓器の評価を行うことは非常に重要である。そこで、培養装置を用いて、生体と同じような臓器間の相互作用が評価できる薬剤評価デバイスの作製を目指した。
【０１３６】
１．培養容器の製造
図１６Ａ及び図１６Ｂは、参考例６で製造した培養容器を示す画像である。図１６Ａ及び図１６Ｂに示すサイズ及びマイクロウェル構造となるように鋳型を設計し、ガラスを接着しなかったこと以外は、参考例２と同様の方法を用いて、培養容器を製造した。製造された培養容器は、チャンバー部分にマイクロウェル構造（φ５００μｍ、５００ウェル）を備えることで細胞の凝集体（スフェロイド）を形成できる設計とした。このマイクロウェル構造は両サイドに備えられており、この両サイドのチャンバーに異なる細胞を播種することで、二つの臓器間の相互作用を評価できる。
【０１３７】
２．細胞培養
（１）細胞の播種
次いで、「１．」で製造された培養容器の各チャンバーに、ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞（理研セルバンクより入手）（左側のチャンバー）及びヒト心筋細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｍｙｏｃｙｔｅｓ；ＨＣＭ）（タカラバイオ社より購入）（右側のチャンバー）を播種して、培養した。細胞密度はどちらも２．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬずつ播種し、１ウェルあたり５００ｃｅｌｌｓになるようにした。培養容器をシーソー型灌流装置（傾斜角度：１５度、流速：１０μＬ／分）に載せることで、培地を各チャンバー内に送液して３日間培養した。また、位相差蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、ＩＸ−７１）を用いて、３日間、経過観察を行った。結果を図１７に示す。図１７において、スケールバーは２００μｍを示す。
【０１３８】
図１７から、いずれも培養３日以内にウェル内でスフェロイドを形成することが示された。
【０１３９】
［参考例８］セルカルチャーインサートを用いた培養皮膚の作製
１．培養皮膚の作製
（１）ヒト皮膚線維芽細胞の準備
まず、０．３％コラーゲン（ｃｅｌｌ  ｍａｔｒｉｘ社製）、ハム培地及び再構成緩衝液を８：１：１の比で混合したコラーゲン溶液を調製した。次いで、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ＮＨＤＦ）（Ｊ−ＴＥＣ社より購入）を２．５×１０４Ｃｅｌｌｓ懸濁して細胞懸濁液を調製した。
【０１４０】
（２）ＮＨＤＦの播種及びコラーゲンのゲル化
次いで、（１）で調製された細胞懸濁液４００μＬをセルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に添加して、コラーゲンをゲル化させた。
【０１４１】
（３）角化細胞（ケラチノサイト）の播種
次いで、ＮＨＤＦを含むゲル化させたコラーゲンの層の上に１．０×１０５ｃｅｌｌｓの角化細胞（ケラチノサイト）（Ａｎｇｉｏｐｒｐｔｅｍｉｅ社より購入）を含む細胞懸濁液２００μＬを添加した。インサート外にはＮＨＤＦ培地をインサート内の液面と同じになるように入れて、２日間培養した。
【０１４２】
（４）気液界面培養
次いで、２日後、インサート内の培地を取り除き、気液界面培養を行った。なお、インサート外にはＮＨＤＦ培地と上皮細胞培養培地（ＫＧ−２、カネボウ社製）とを１：１で混合したものを１ｍＬ入れた。この状態で、７日間培養して培養皮膚を作製した。
【０１４３】
２．切片の作製
培養７日後、培養皮膚を取り出して、２０％ホルマリンに１日浸漬することで組織の固定を行った。次いで、１０％、２０％、３０％スクロース溶液に１時間ずつ浸してスクロース置換を行った。次いで、スクロース置換した切片をＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ内に包埋した。次いで、クライオミクロトームを用いて切片を作製した。
【０１４４】
３．ヘマトキシリン−エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  Ｅｏｓｉｎ；ＨＥ）染色
次いで、「２．」で得られた切片を用いて、以下の手順でＨＥ染色を行った。その後、位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図１８（左）に示す。図１８において、スケールバーは２００μｍを示す。
（１）キシレンに３０分間浸漬×２回
（２）１００％エタノールに５分間浸漬×２回
（３）９０％エタノールに５分間浸漬×１回
（４）７０％エタノールに５分間浸漬×１回
（５）蒸留水に３分間浸漬×１回
（６）ヘマトキシリン染色液に３分間浸漬×１回
（７）流水で１３分間洗浄×１回
（８）エオシンＹに４分間浸漬×１回
（９）９０％エタノールに３０秒間浸漬×１回
（１０）９０％エタノールに１分間浸漬×１回
（１１）１００％エタノールに１分間浸漬×１回
（１２）１００％エタノールに５分間浸漬×２回
（１３）キシレンに３０分間浸漬×２回
（１４）マウントクイック（商品名）（大道産業株式会社製）含有キシレン溶液で封入
【０１４５】
３．免疫抗体染色
次いで、「２．」で得られた切片を用いて、以下の手順で免疫抗体染色を行った。その後、位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図１８（右）に示す。図１８において、スケールバーは２００μｍを示す。
（１）ＰＢＳに５分間浸漬×２回
（２）５％スキムミルク含有Ｄ−ＰＢＳ溶液で３０分間ブロッキング
（３）２０μｇ／ｍＬの１次抗体含有Ｄ−ＰＢＳで一晩１次抗体反応
なお、１次抗体として、抗フィラグリン抗体（アブカム社製）及び抗サイトケラチン１５抗体（以下、「ＣＫ１５」と略記する場合がある）（アブカム社製）を用いた。
（４）ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）に１０分間浸漬×３回
（５）２次抗体含有Ｄ−ＰＢＳで６０分間２次抗体反応
なお、２次抗体として、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（アブカム社製）を用いた。
（６）ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有）に１０分間浸漬×３回
（７）１０ｎｇ／ｍＬのＤＡＰＩ含有ＰＢＳ溶液で９分間核染色
（８）ＰＢＳに５分間浸漬×２回
【０１４６】
図１８から、上皮層と真皮層とがセルカルチャーインサート上で形成されていることが確認された。特に、免疫染色で抗体として用いたＣＫ１５は皮膚においては基底膜において発現するタンパク質であり、基底膜は上皮の１番下に位置する。図１８の右側の蛍光像から、基底膜が染まっていることが観察された。これにより作製した培養皮膚はｉｎ  ｖｉｖｏと類似した構造を有しているということが確認された。
【０１４７】
［実施例１］
１．培養容器の製造
図１９は、実施例１で製造された培養容器を示す画像である。図１９に示す構造となるように鋳型を設計し、ガラスを接着しなかったこと以外は、参考例２と同様の方法を用いて、培養容器を製造した。図１９に示すように、この培養容器は、流路の中央部分に層状組織を培養が可能なセルカルチャーインサートを組み込める仕様に設計した。また、インサートが自在に取り外し可能な設計にしたため、層状組織が分化するまでは個別で培養が行うことができる。また、培養容器の流路は、直径２ｍｍの円柱状（断面積３．１４ｍｍ２）であり、長さを１８ｍｍとなるように設計した。
【０１４８】
２．各細胞構造体の作製
（１）スフェロイドの作製
「１．」で製造した培養容器の各マイクロウェルチャンバーに、ＨｅｐＧ２細胞（右側のチャンバー）及びＨＣＭ（左側のチャンバー）を播種した。細胞密度はどちらも２．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬずつ播種し、１ウェルあたり５００ｃｅｌｌｓになるようにした。培養容器をシーソー型灌流装置（傾斜角度：１５度、流速：１０μＬ／分）に載せることで、培地を各チャンバー内に送液して３日間培養した。
【０１４９】
（２）培養皮膚の作製
次いで、セルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に３．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのケラチノサイトを含む細胞懸濁液を添加して、２日間培養して培養皮膚を作製した。
【０１５０】
（３）細胞構造体の共培養
次いで、（１）でスフェロイドが作製された培養容器に、培養皮膚が作製されたセルカルチャーインサートを挿入した。培養容器をシーソー型灌流装置（傾斜角度：１５度、流速：１０μＬ／分）に載せることで、培地を各チャンバー及びセルカルチャーインサート内に送液して３日間共培養した。また、位相差蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、ＩＸ−７１）を用いて、３日間、経過観察を行った。結果を図２０に示す。図２０において、スケールバーは５００μｍを示す。また、「Ｄ１」は培養１日目、「Ｄ３」は培養３日目であることを意味する。
【０１５１】
図２０から、少なくとも３日間は、培養容器内で３種類の細胞構造体が生存した状態で培養できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本実施形態の培養装置によれば、ポンプを使用せずに容易に灌流培養でき、且つ、２種類以上の細胞構造体を構築できる。また、本実施形態のオンチップ臓器デバイスは、薬剤の毒性評価、新規薬剤の探索、生体内の臓器間相互作用の基礎研究、病態メカニズムの解明、再生医療用組織又は臓器の構築等の分野で好適に用いられる。
【符号の説明】
【０１５３】
１０：培養容器
１０Ａ：培養容器（第４のセル装着時）
１０Ｂ：培養容器（第４のセル脱着時）
１１：第１のセル
１１ａ：（第１のセルの）開口
１１ｂ：孔
１１ｃ：プラグ
１１ｄ：底部
１２：第２のセル
１２ａ：（第２のセルの）開口
１２ｂ：底部
１３：第３のセル
１３ａ：第１の隔壁
１３ｂ：第２の隔壁
１３ｃ：底部
１３ｄ：第１の孔部
１３ｄ−１：孔
１３ｄ−２：孔
１３ｅ：第２の孔部
１３ｅ−１：孔
１３ｅ−２：孔
１３ｆ：（第３のセルの）開口
１４：第４のセル
１４ａ：（第４のセルの）開口
１４ｂ：半透膜
１４ｃ：胴部
１４ｄ：係止部
２０：灌流装置
２１：支持部材
２２：駆動機構
２２ａ：載台
２２ｂ：軸部
２２ｃ：駆動部（モーター）
２２ｄ：制御部
Ｆ：流路
Ｌ２：溶液
【図１】
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【図２Ａ】
2019146548.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2019146548.tif 000009
【図４Ｂ】
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【図５】
2019146548.tif 000011
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2019146548.tif 000020
【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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