(57)【要約】      （修正有）【課題】治療上有効な量の脂肪由来幹細胞を生成するために脂肪組織を抽出および処理するシステム、並びに脂肪由来幹細胞の作製方法。【解決手段】無菌組織入口継手と、少なくとも１つの無菌処理流体入口継手と、無菌吸引継手と、第１の抽出管に接続される少なくとも１つの無菌抽出継手とを有する第１の遠心管と、少なくとも１つの無菌処理流体入口継手と、無菌吸引継手と、第２の抽出管に接続される少なくとも１つの無菌抽出継手とを有し、前記少なくとも１つの無菌処理流体入口継手を経由して前記第１の遠心管の前記少なくとも１つの無菌抽出継手のうちの１つに可逆に接続される第２の遠心管とを備えるシステム、及び該システムに係る脂肪由来幹細胞の作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織を処理するシステムであって、
生物学的物質を収容し処理するように構成された第１の遠心管であって、無菌組織入口継手と、少なくとも１つの無菌処理流体入口継手と、無菌吸引継手と、第１の抽出管に接続される少なくとも１つの無菌抽出継手とを有する第１の遠心管と、
前記第１の遠心管から前記生物学的物質を収容し更に処理するように構成された第２の遠心管であって、少なくとも１つの無菌処理流体入口継手と、無菌吸引継手と、第２の抽出管に接続される少なくとも１つの無菌抽出継手とを有し、前記少なくとも１つの無菌処理流体入口継手を経由して前記第１の遠心管の前記少なくとも１つの無菌抽出継手のうちの１つに可逆に接続される第２の遠心管と、
を備える、システム。
【請求項２】
脂肪由来幹細胞の作製方法であって、
（ａ）吸引脂肪組織を、請求項１に記載のシステムの第１の遠心管まで無菌移送するステップと、
（ｂ）前記少なくとも一つの無菌処理流体入口継手を介して一または複数の流体を追加することによって前記遠心管内の前記吸引脂肪組織を処理するステップであって、前記吸引脂肪組織の浄化と解離のうち一または複数を含むステップと、
（ｃ）濃縮幹細胞画分を有するペレットの濃縮のため、処理済み吸引脂肪組織を収容した前記第１の遠心管を遠心分離するステップと、
（ｄ）濃縮幹細胞画分を有する前記濃縮ペレットを、請求項１に記載のシステムの前記第２の遠心管まで無菌移送するステップと、
（ｅ）前記少なくとも一つの無菌処理流体入口継手を介して一又は複数の流体を追加することによって前記第２の遠心管の前記濃縮幹細胞画分を洗浄するステップと、
（ｆ）濃縮幹細胞画分を有するペレットの濃縮のため、細胞画分を収容した前記第２の遠心管を遠心分離するステップと、
（ｇ）最初の吸引脂肪組織の幹細胞濃度よりも幹細胞が濃縮された細胞混合物を得るため、ペレットを流体に再懸濁するステップと、
を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０１１年７月８日に提出された米国仮特許出願第６１／５０５，９３６号の「脂肪由来幹細胞の作成用キット」に優先権を主張し、引用によりその明細書全文を本願に組み込む。
【０００２】
（技術分野）
本発明は概して、脂肪組織に由来する幹細胞を作製および使用するシステム、該キットを用いて獲得される脂肪由来幹細胞、該脂肪由来幹細胞の使用方法、該脂肪由来幹細胞を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
再生医療とは、身体の再生機構を通常の治癒機構の一部ではない形で用いて、あるいは通常の機構を人為的に増強させることによって、臨床的に利用することと定義できる。このプロセスの従来例の１つが骨髄移植であり、骨髄移植では、造血幹細胞と前駆細胞がドナーから採取され、正常な血液再生機構が失われた、あるいはほぼ枯渇または損傷したレシピエントに移植されることによってレシピエントの造血機能を回復させるまたは再生する。このアプローチは、複数の治療または予防目的で、様々な供給源からの非造血幹細胞にも広く適用されている。具体的には、脂肪組織を、治療または予防用途に適した多能性間葉系幹細胞のソースとして容易に利用できることが実証されている。
【０００４】
間葉系幹細胞（「ＭＳＣ」）は、骨芽細胞、収縮性細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、内皮細胞、β膵島細胞などの細胞に容易に分化させることのできる多能性幹細胞である（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２８４巻１４３ページ（１９９９）；Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ，ｅｔ  ａｌ．、「Ｂｏｎｅ」第１３巻６９ページ（１９９２）；Ｐｒｏｃｋｏｐ、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２７６巻７１ページ（１９９７））。ＭＳＣは文献では骨髄幹細胞、骨格筋幹細胞、多能性間葉間質細胞としても知られ、成人組織から分離される非造血前駆細胞であり、各種刺激に反応して軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞などの様々な間葉性由来細胞に分化する能力を保持しつつ、中立状態で生体外で幅広い増殖機能も有することを特徴とする。試験管内研究が実証するように、ＭＳＣは筋肉や（Ｗａｋｉｔａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．、「Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ」第１８巻１４１７ページ（１９９５））、ニューロン様前駆体や（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，ｅｔ  ａｌ．、「Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．」第６９巻９０８ページ（２００２）；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ，ｅｔ  ａｌ．、「Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．」第１７１巻１０９ページ（２００１））、心筋細胞や（Ｔｏｍａ，ｅｔ  ａｌ．、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」第１０５巻９３ページ（２００２）；Ｆａｋｕｄａ、「Ａｒｔｉｆ．  Ｏｒｇａｎｓ」第２５巻１８７ページ（２００１））、その他の種類の細胞に分化することができる。ＭＳＣは、胚子中胚葉から生じる身体内の複数組織（たとえば、造血細胞と結合組織）に存在する。このため、多能性細胞はこうした組織供給源のいずれからも分離し、これらの細胞種のいずれにも分化させることができる。
【０００５】
脂肪組織が手頃に手に入るのが脂肪吸引手術である。事実、大量の多能性細胞を、脂肪組織からの単純な吸引、たとえば審美的処置で吸引した脂肪組織サンプルから取得することができる。本発明は特に、脂肪組織からＭＳＣを分離するシステムに関する。本明細書で使用される「脂肪組織」とは、脂肪細胞や微小血管細胞などの複数の種類の細胞を含む組織を指す。脂肪組織は幹細胞と内皮前駆細胞を含む。したがって、脂肪組織は、脂肪を貯蔵する結合組織も含めた脂肪を指す。
【０００６】
脂肪組織は幹細胞をとりわけ豊富に含むことが発見されている。このことが発見された理由の１つは、脂肪組織の主な非幹細胞成分である脂肪細胞が容易に除去できることである。ただし、当該技術において既知なシステムおよび方法によると、多能性細胞を分離する脂肪組織処理と、その結果生じる幹細胞群の増殖および（任意で）分化は、高額な専門機器および同等に高額な特殊工程を要する。ヒトの生体からの脂肪吸引で得た脂肪組織から幹細胞を繰り返し抽出するための特注装置にかかる費用のせいで、治療目的での幹細胞の豊富な媒体の使用は大病院や研究施設にとどまっている。したがって、小規模の医院やその他の専門施設での脂肪由来幹細胞治療は不可能であるか、不経済である。さらに、幹細胞由来の美容向上技術の使用も、脂肪組織から幹細胞を抽出および培養する現行のシステムおよび方法の高コストと低可用性によって阻まれている。
【０００７】
求められるのは、純粋な形態であっても、幹細胞が豊富な媒体の一部であっても、治療または美容面で有効な量の脂肪由来幹細胞を経済的かつ安全に抽出する技術とシステム、特に、特殊施設への設備投資を必要とせず、小規模な専門施設での使用に適した技術とシステムである。
【発明の概要】
【０００８】
発明者は、上述した技術に伴う課題に対処する脂肪由来幹細胞の作製のシステムと各種方法を考えつき、実現するに至った。ヒトの脂肪組織由来の細胞集団は、治療および美容用途の細胞の供給源として利用することができる。とりわけ、脂肪由来幹細胞は、純粋な形態（幹細胞のみ）または濃縮された形態（脂肪組織の生体内で発生する細胞に対して幹細胞を増強した細胞培養）のいずれかで、再生細胞により改善または回復が見込める疾病の治療を含む再生医療に使用することができる。作製した細胞集団は他の脂肪細胞や結合組織を伴わずに患者に投与してもよいし、本明細書に記載するように脂肪組織に混ぜて濃縮して投与してもよい。本発明は、脂肪組織から脂肪由来の間葉系幹細胞の精製画分を取得し、精製画分をヒトまたは動物の患者に再び投与するシステムに関する。本発明は、脂肪組織（吸引脂肪組織）を抽出し、それを処理して、０．１％以上、より一般的には０．５％以上の幹細胞を含有する処理済み吸引脂肪組織（ＰＬＡ）を生成するシステムを提供する。いくつかの実施形態によると、幹細胞を約２〜１２％含むＰＬＡを取得することができ、本発明によると、最大１００％幹細胞を含むＰＬＡが可能である。
【０００９】
本発明は、臨床環境で脂肪由来間葉系幹細胞のほぼ精製もしくは濃縮された画分を取得するシステム、ならびに、治療、構造、もしくは美容上の恩恵を助長、生成、または支援するのに必要な添加物と共に、レシピエントに直接配置される脂肪組織由来幹細胞を使用する組成物、方法、システムに関する。本発明の実施形態は、患者に再導入する治療上有効な量の脂肪由来幹細胞を生成するために脂肪組織を抽出および処理する多構成要素システムである。有益なことに、該システムは完全な手術室環境や本格的な規模の脂肪吸引を必要としないため、病院や研究所外の環境でも動作させることができる。したがって、該システムは小中規模の医院、外来患者外科センター、複数の分野を備えた病院に適する。
【００１０】
一実施形態によると、Ｍｉｎｉ−ＳｙｓｔｅｍＴＭシステムと呼ばれるシステムによって、小規模な医院や外科センターでも、治療または凍結保存（バンキング）のために患者の脂肪組織からＭＳＣを安全に抽出する手頃な価格の方法を採用することができる。該システムは、小量の脂肪サンプルを吸引脂肪組織として抽出する安全で無菌の閉工程（たとえば脂肪吸引）を実行する手段と、ＭＳＣのオンサイト処理および精製のための材料と、任意で、結果として生じる処理済み吸引脂肪組織の品質評価を支援するツールと、を備える。該システムは、研究所の技術者によって、適切な訓練で教示される簡易な方法ステップに従い動作可能である。
【００１１】
一実施形態によると、脂肪組織の処理は、閉鎖された無菌の流体／組織経路を保持するシステムにおいて実行される。これは、組織および流体成分を閉経路内で移送できる無菌容器および配管のキットを使用して達成される。一連の処理試薬（たとえば、塩水や酵素など）を無菌容器への投入用に事前に包装した形態で提供して、試薬の追加、ならびに処理の温度とタイミングの制御を簡易化することによって、オペレータの手動工程管理を合理化することができる。好適な実施形態によると、組織抽出から処理を経てレシピエントへの配置までの手順全体が単独の施設内で、実際には、本発明による施術を受ける患者の部屋でも実行される。
【００１２】
本発明の１側面によると、小量の未処理脂肪組織が患者からキットの無菌容器へと抽出される。未処理脂肪組織はキットの一または複数の無菌容器内で処理されて、成熟した脂肪細胞と結合組織をほぼ除去することによって、レシピエントの体内に配置するのに適した異種の複数の脂肪組織由来細胞を獲得する。脂肪組織の処理に必要な試薬はキットの一部として提供され、所定のスケジュールに従い一または複数の無菌容器に導入されて、所望濃度の脂肪由来幹細胞を含む処理済み吸引脂肪組織を生成する。その後、脂肪由来幹細胞、または生体内よりも幹細胞画分を豊富に含む濃縮された変形吸引脂肪組織は、その他の細胞、組織、組織断断片、またはその他の細胞の成長および／または分化のための刺激薬と組み合わせてレシピエントに配置してもよい。好適な一実施形態によると、幹細胞は、上述の添加物と共に、治療、構造、または美容上の恩恵をレシピエントにもたらすために単一の施術で幹細胞を取得したヒトへ戻される。
【００１３】
本発明の一実施形態では、患者の治療方法は、ａ）キットの構成要素として使い捨て組織除去システムを提供するステップと、ｂ）使い捨て組織除去システムを使用して、ある濃度の幹細胞を有する脂肪組織を患者から除去するステップと、ｃ）キットの一または複数の無菌容器内で脂肪組織の少なくとも一部を処理して、処理前濃度よりも高い濃度を有する幹細胞を取得するステップと、ｄ）キットの無菌容器から患者に幹細胞を投与するステップと、を含む。
【００１４】
本発明の好適な一実施形態によると、脂肪組織を抽出および処理して治療上有効な量の脂肪由来幹細胞を生成するシステムは、脂肪組織抽出装置と、複数の吸引脂肪組織入口継手と複数の処理流体入口継手と複数のペレット抽出管とを有する変形遠心管と、を備える。脂肪組織抽出装置を使用して、ヒトからある量の脂肪組織を抽出し、吸引脂肪組織が無菌移送を介して第１の変形遠心管まで移送され、複数の処理ステップを実行して吸引脂肪組織を浄化および解離し、変形遠心管の遠心分離によって幹細胞画分が増加したペレットを取得する。ペレットは流体に再懸濁され、治療または美容目的でヒトの患者に投与される。別の実施形態によると、該システムは第１の変形遠心管と略同様の設計の第２の変形遠心管をさらに備え、第２の変形遠心管を使用して再懸濁されたペレットをさらに処理して高濃度の幹細胞を実現する。
【００１５】
本発明の別の好適な実施形態によると、脂肪由来幹細胞の作製方法は、（ａ）脂肪組織抽出装置を使用してヒトから脂肪組織を除去するステップと、（ｂ）吸引脂肪組織を、複数の吸引脂肪組織入口継手と複数の処理流体入口継手と複数のペレット抽出管とを有する変形遠心管まで無菌移送するステップと、（ｃ）複数の処理流体継手を介して一または複数の流体を追加することによって変形遠心管内の吸引脂肪組織を処理するステップであって、吸引脂肪組織の浄化と解離のうち一または複数を含むステップと、（ｄ）濃縮幹細胞画分を有するペレットの濃縮のため、処理済み吸引脂肪組織を収容した変形遠心管を遠心分離するステップと、（ｅ）最初の吸引脂肪組織の幹細胞濃度よりも幹細胞が濃縮された細胞混合物を得るため、ペレットを流体に再懸濁するステップと、（ｆ）治療または美容目的で再懸濁した細胞混合物をヒトに投与するステップと、を含む。
【００１６】
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴、利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
添付図面は本発明のいくつかの実施形態を示し、明細書と共に、実施形態による本発明の原理を説明する役割を果たす。当業者であれば、図面に示す特定の実施形態は単に例であり、本発明の範囲を限定する意図がないことを理解しているであろう。
【００１８】
【図１】本発明の好適な実施形態による脂肪組織から幹細胞を抽出する変形遠心管を示す図である。
【００１９】
【図２】本発明の好適な実施形態による新規な微粒化手段を備えた、脂肪組織から幹細胞を抽出する変形遠心管を示す図である。
【００２０】
【図３】本発明の好適な実施形態による臨床用に脂肪組織から間葉系幹細胞を作製するシステムを示す図である。
【００２１】
【図４】本発明の一実施形態による臨床用に脂肪組織から間葉系幹細胞を作製する方法の高水準工程を示す図である。
【００２２】
【図５】本発明の一実施形態による臨床用に脂肪組織から間葉系幹細胞を作製し使用する方法の詳細な工程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明者は、上述の技術が有する課題および問題に対処する、脂肪由来幹細胞の作製のシステムおよび各種方法を考えつき、実現するに至った。添付図面に示すいくつかの例示の実施形態を参照して、様々な方法を以下詳細に説明する。以下の説明では、本明細書に記載または言及する一または複数の側面および／または特徴を十分に理解してもらうため、様々な細部を具体的に説明する。
しかしながら、当業者にとっては、本明細書に記載または言及する一または複数の側面および／または特徴は、こうした具体的な細部の一部または全部を設けなくても実現し得ることは自明であろう。なお、本明細書に記載または言及する側面および／または特徴を不明瞭にしないため、周知の工程ステップおよび／または構造は詳述しない。
【００２４】
一または複数の異なる発明を本願に記載する場合がある。さらに、本願に記載の発明のうち一または複数に関して、その他多くの実施形態を記載することができる。これらの実施形態は単に例示のために提示するものである。記載の実施形態はいかなる意味でも限定することを目的としていない。本発明の一または複数は、本開示から容易に自明であるように、多数の実施形態に広く適用可能である。概して、実施形態は、当業者が一または複数の発明を実施できるように詳細に記載してあるが、その他の実施形態も利用でき、特定の発明の範囲を逸脱することなく構造、論理、ソフトウェア、電気上およびその他の変更を加えることができると理解すべきである。
したがって、当業者であれば、本発明の一または複数を様々な修正と変更を加えて実施できることを認識しているであろう。一または複数の本発明の特徴は、本開示の一部を成す一または複数の特定の実施形態または図面を参照して説明することができ、例示のため一または複数の発明の具体的な実施形態を例示する。しかしながら、このような特徴は、その特徴を説明する一または複数の特定の実施形態または図面での使用に限定されないと理解すべきである。本開示は一または複数の発明のすべての実施形態の逐語的な説明でもなければ、すべての実施形態に存在しなければならない一または複数の発明の特徴のリストアップでもない。
【００２５】
本特許出願に設けられる項の見出しと本特許出願の標題は便宜上付したものであり、本開示を限定するように解釈すべきではない。
【００２６】
相互に連絡する複数の構成要素を備えた一実施形態を記載したからといって、それらすべての構成要素が必須であるというわけではない。逆に、一または複数の発明の幅広い可能な実施形態を例示し、発明の一または複数の側面をより深く説明するため、様々な任意の構成要素を記載してもよい。同様に、工程ステップ、方法ステップ、アルゴリズムなどを順番に記載してもよいが、一般的にはそのような工程、方法、アルゴリズムは特に断りのない限り、別の順序で実行されるように構成してもよい。言い換えると、本特許出願に記載されるステップのシーケンスや順番は、それ自体、ステップがその順序で実行されることを示すものではない。記載される工程ステップは、実行可能な任意の順序で実行してもよい。さらに、いくつかのステップは、（たとえば、あるステップが別のステップの後に記載されることで）異なる時点で実行されるように記載または示唆されるとしても、同時に実行してよい。また、工程が図面で描写される場合、例示の工程に他の変形や修正が許されない、図示される工程またはそのステップが一または複数の発明にとって必須である、図示される工程が好ましい、などということを示唆するものではない。また、通常、ステップは一実施形態につき１回だけ説明するが、ステップは１回のみ行わなければならない、あるいは工程、方法、またはアルゴリズムが実行される度に１回だけ行われるという意味ではない。いくつかのステップはいくつかの実施形態または場合に省略してもよい、あるいは、いくつかのステップは所与の実施形態または場合に２回以上実行してもよい。
【００２７】
単独の装置または物を説明する際、単独の装置または物の代わりに２つ以上の装置または物を使用してもよいことは自明である。同様に、２つ以上の装置または物を説明する際、２つ以上の装置または物の代わりに単独の装置または物を使用してもよいことは自明である。
【００２８】
装置の機能または特徴は、上記機能または特徴を有すると明示されていないその他の一または複数の装置によって具体化されてもよい。したがって、一または複数の発明のその他の実施形態は装置自体を含む必要はない。
【００２９】
本願で記載または言及する方法や機構は、明瞭化のために単数形で記載する場合がある。ただし、特定の実施形態は特に断りのない限り、方法または機構の複数の繰り返しを含む。図面内の工程の説明またはブロックは、モジュール、セグメント、または工程における具体的な論理機能またはステップを実行するための一または複数の実行可能な指示を含むコードの部分を表すと理解すべきである。順序を変えて実行することも本発明の実施形態の範囲に含まれる。たとえば、当業者によって理解されるように、略同時に、または逆の順序で、など、含まれる機能に応じて図示または記載される順序から外れて機能を実行してもよい。
【００３０】
本願に記載の特徴または特徴の組み合わせは、上記組み合わせに含まれる特徴が状況、本明細書、当業者の知識に照らし見て自明であるように、相互に相反することがない限り、本発明の範囲に含まれる。本発明を概説するため、本発明の特定の側面、利点、新規な特徴を本願において説明した。当然ながら、上記の側面、利点、または特徴はいずれも必ずしも本発明の特定の実施形態において具体化されるわけではないと理解すべきである。本発明の追加の利点と側面は以下の詳細な説明と請求項から明らかである。
【００３１】
いくつかの刊行物と特許をここで紹介した。上述の刊行物と特許はそれぞれ全文を引用により本願に組み込む。本願で引用した刊行物、特許、特許出願はすべて、個々の刊行物、特許、または特許出願が引用により全文を組み込まれるように明確かつ個別に指摘されるのと同様、引用により全文を本願に組み込む。
【００３２】
定義
本明細書で使用される「脂肪組織の単位」は脂肪組織の個々の量、または測定可能な量を指す。脂肪組織の単位は、該単位の重量および／または体積を判定することによって測定することができる。上述のデータに基づき、患者から除去した１単位の処理済み吸引脂肪組織は、細胞組成の０．１％以上が幹細胞である細胞組成を有する。本開示を参照すると、脂肪組織の単位は、患者から除去した脂肪組織の全量、または患者から除去した脂肪組織の全量よりも少ない量を指すことができる。よって、１単位の脂肪組織と別の単位の脂肪組織とを結合して、個々の単位の合計である重量または体積を有する脂肪組織の単位を形成することができる。
【００３３】
本明細書で使用される「一部」は、物質の全体量よりも少ない量を指す。小部分は５０％よりも少ない量を指し、大部分は５０％よりも多い量を指す。よって、患者から除去される脂肪組織の全体量より少ない脂肪組織の単位は、除去される脂肪組織の一部である。
【００３４】
本明細書で使用される「幹細胞」は、他の様々な種類の細胞に分化することができ、一または複数の特定の機能を備え、自己再生能力を有する多能性細胞を指す。本明細書に開示する幹細胞のいくつかは多能性としてよい。
【００３５】
本明細書で使用される「処理済み吸引脂肪組織」（ＰＬＡ）は、成長した脂肪細胞および結合組織から活性細胞成分（たとえば、幹細胞を含有する成分）を分離する処理を終えた脂肪組織を指す。通常、ＰＬＡは、脂肪組織の細胞の洗浄および分離によって得られる細胞のペレットを指す。通常、ペレットは、細胞が遠心分離機の底に集積するように細胞の懸濁液を遠心分離機にかけて得られる。
【００３６】
本明細書で使用される「予防的または治療的に有効な量」という用語は、所望の治療効果を生み出し得る医薬組成物における本発明の細胞の含有量を指す。当業者であれば、細胞数（たとえば、投与量）は、投与部位、疾病の程度、投与方法などを含むがそれらに限定されない複数の要因に応じて変動することを理解しているだろう。
造血幹細胞（レシピエントの血球形成能力の再生に使用される骨髄または臍帯血由来の幹細胞）に関する経験から判断すると、移植は閾値効果で細胞用量に依存する。よって、おそらくは、「多いほど良い」という一般原則が他の変数によって設定される限度内で適用され、採取では実現可能な限り多くの組織が回収される。本願に開示する細胞は、患者の症状や反応に応じて、治療に当たる医師またはその他の医療従事者が必要と決定する日、週、または月毎に繰り返して投与することができる。
【００３７】
「薬理上許容可能なビヒクル」という用語は、ヒトを含む動物での使用のために、連邦政府または州政府の監督機関によって認可された、あるいは米国薬局方、欧州薬局方、またはその他の一般的に認知された薬局方に記載された組成物を指す。「ビヒクル」という用語は、本発明の細胞と共に投与される希釈剤、補助剤、添加剤、または担体を指す。よって、ビヒクルは本発明の細胞と共存できなければならない。所望すれば、医薬組成物は必要に応じて、上記医薬組成物を含む細胞の治療効果を強化、制御、またはそれ以外の方法で誘導する添加物、および／または少量のｐＨ緩衝剤、張力活性剤、補助溶剤、防腐剤などの補助物質または薬理上許容可能な物質も含有することができる。また、細胞懸濁の安定化のため、金属キレート剤を添加することもできる。液体媒体中で、本発明の医薬組成物は、追加物質、たとえばアスパラギン酸やグルタミン酸などのアミノ酸の添加によってさらに安定化させることができる。
本発明の医薬組成物に使用可能な薬理上許容可能な物質は、概して当業者によって既知であり、細胞組成物の製造の際に一般的に使用されている。適切な薬理ビヒクルの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に紹介されている。本発明の医薬組成物に含有される細胞の投与に適した例示の非限定的ビヒクルは、たとえば無菌食塩水（０．９％ＮａＣｌ）やＰＢＳなどである。
【００３８】
（発明を実施するための形態）
脂肪組織から脂肪を採取し処理する装置はこれまでにも多数開発されてきたが、広範な使用を妨げる問題を一または複数抱えている。たとえば、使い難さとコストである。したがって、収量、一貫性、および／または純度の向上した活性細胞集団を迅速かつ確実に作製でき、それによって細胞の抽出後処置の必要性を低減または排除することのできる代替的アプローチが求められている。理想的には、この細胞集団は、レシピエントへの直接移植に適するように獲得される。
【００３９】
本発明の好適な実施形態を以下詳細に説明する。可能なかぎり、図面と明細書において同一または類似の部分には同一または類似の参照符号を付す。なお、図面は簡略的であり、等縮尺ではない。本願の開示に関連して、単に便宜上の明瞭化のために、上部、下部、左、右、上方、下方、真上、上、下、後、前などの方向を表す用語を、添付図面を参照し使用する。このような方向を表す用語は、本発明の範囲を限定するよう解釈すべきではない。
【００４０】
本願の開示は特定の例示の実施形態に言及しているが、これらの実施形態は限定のためではなく例示のために提示されると理解すべきである。例示の実施形態を説明しているが、以下の詳細な説明の目的は、添付の請求項に定義される本発明の精神と範囲に属するように、実施形態のあらゆる修正、代替物、等価物を対象とするものと解釈すべきである。本発明は、当該技術において従来使用されている様々な細胞または組織分離方法と併せて実行することができ、一般的に実行される工程ステップをほんのいくつかを、本発明を理解するのに必要なものとしてここで紹介する。
【００４１】
脂肪組織の抽出および処理システム
本発明の各種実施形態は、臨床環境で脂肪由来間葉系幹細胞の精製画分を取得するシステム３００と、治療、構造、もしくは美容上の恩恵をさらに促進、発生、または支援するのに有効な添加剤と共に脂肪組織由来の幹細胞を直接レシピエントに移植する組成物、方法、システムに関する。各種実施形態によると、本発明は、脂肪組織を抽出および処理して、患者への再導入のために治療上有効な量の脂肪由来幹細胞を生成するシステム３００を提供し、該システムは、複数の専門分野を備えた小中規模の病院に適した操作が簡単で低コストのシステムである。
【００４２】
図１に示す本発明の好適な一実施形態によると、当該技術において既知な各種付属品と併せて使用される変形遠心管１００がシステムまたはキットに備えられることで、小規模の医院のみならず外科センターでも、直接治療または凍結保存（バンキング）用に患者またはドナーの脂肪組織から容易に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を抽出する方法を手頃な価格で採用することができる。該キットは、脂肪組織の小サンプル吸引のための安全で無菌の閉工程を実行する遠心管１００とその他の各種構成要素、ＭＳＣ画分のオンサイト処理および精製のための構成要素、品質アセスメントのための構成要素、を備える。一般的に、遠心管１００を含む該キットは、以下詳述し、適切な訓練下で教示され得る簡易の方法ステップに従う研究所の技術者または類似の資格所持者によって操作可能である。
【００４３】
遠心管１００は閉鎖された無菌の流体／組織用経路を保持し、脂肪組織サンプルを収容し、所望に応じて多少濃縮された間葉系幹細胞サンプルを出力する。これは、閉経路内で流体および組織成分の移送を可能にする無菌の容器および配管キットを使用して達成される。また、一連の処理試薬（たとえば、塩水や酵素など）を遠心管１００への投入用に事前に包装した形態で提供し、試薬の追加、ならびに処理の温度とタイミングの制御を簡易化することによって、オペレータの工程管理を合理化することができる。好適な一実施形態では、組織抽出から処理を経てレシピエントへの配置までの手順全体が単一の施設内で（実際には、単独の部屋でも、たとえば好ましくは、本発明により取得したＭＳＣを使用する措置を施す患者の部屋で）実行される。
【００４４】
管１００は従来設計の本体を備え、該本体は、内部容積１６０を有し、通常は約１０ｍｌ〜５００ｍｌの様々な寸法で入手でき、図１に示す従来形状の管を使用するように装備された標準的遠心分離機に対応する（しかし、本発明では、当該技術において既知であり、遠心分離機と両立可能な任意の適切な遠心管を使用できる）。
【００４５】
一実施形態では、当該キットまたはシステムは以下の３つの主構成要素：（１）当該技術において既知な耐久的器具セットである吸引ポンプ、攪拌機、遠心分離機、小型培養器；（２）複数の使い捨て器具である吸引ニードル／カニューレ、回収バッグ、注射器、フィルタ、フラスコ、遠心管１００；（３）各種処理溶液／試薬、を備える。これらの構成要素は好ましくは、無菌状態を維持し工程を簡略化しつつ、脂肪組織の抽出および処理を促進してＭＳＣを得るため、相互に協働するように構成される。管１００には、複数の開口１１５、１２０、１２１、１２２の貫通するキャップ１５０と、キャップ１５０近傍で管１００の上部に搭載される別個の継手１１０とが設けられる（実際には当業者が認識するように、各種継手は管１００の上部に固定されつつも様々に配置することができ、継手の一部または全部がキャップ１５０を貫通してもよいし、どの継手もキャップ１５０を貫通しなくてもよい。また、事実、キャップ１５０は使用後に廃棄可能な一体化構造の管１００では任意で省略することができる）。継手１２０には、無菌継手１２５（たとえばルアーロック）を嵌合した管１２９が貫通して、管１００内の無菌状態を侵さずに各種試薬やその他の流体を、管１２９を通して導入することができる。通常、流体は、無菌注射器を使用して管１２９を介して管１００内に追加される。管１３０と１３１はそれぞれ継手１２１と１２２でキャップ１５０を貫通し、無菌継手１２６と１２７がそれぞれ設けられることで、ペレットに含まれる細胞またはその他の物質が遠心分離後に底部（管１００の下部を構成する逆円錐の先端）に集積する（遠心分離中の比較的高比重のペレットの作製は当該技術において周知である）。継手１２６と１２７はルアーロックなど、当該技術において既知であり、管１３０、１３１と注射器または管１００の底のペレットから細胞を除去する吸引力を印加することのできるその他の装置との間の無菌接続を確立するのに適した任意の種類のものとしてよい。継手１１５には、先端に無菌継手１１７を嵌合させた管１１６が貫通し、（たとえば、継手１１０を介した管１００への吸引脂肪組織の高速導入を促進するため）管１００の上部から吸引力を印加して管１００内に真空を確立することができる。継手１１０は短管またはスタブを介して継手１１１に接続され、（管１００内へ延びる他のすべての継手と同様）常に管１００内の無菌状態を維持するのに適する。通常、継手１１０は、吸引脂肪組織からＭＳＣを抽出し、おそらくは管１３０と１３１のいずれかを介して引き出すことのできるペレットへの精製または濃縮工程の最初のステップとして、吸引脂肪組織を管１００に注入するために使用される。好適な一実施形態で２つの管１３１、１３１が設けられるのは、たとえ一方の管が詰まってもペレット抽出を確保するためである。
【００４６】
図２は、本発明の一実施形態による新規な微粒化手段を備えた、脂肪組織から幹細胞を抽出する変形遠心管２００を示す。当業者によって認識されるように、管２００は管１００と酷似するが、継手１２５〜１２７に関してさらに細部を例示している。管１１６は確実に真空ポンプ２２０を終端とする（管１１６とポンプ２２０間の無菌接続の詳細は図示しないが、当該技術において周知である）。
真空ポンプは、吸引脂肪組織から隔離したＭＳＣ用携帯キットの１部品として設けられ、予め管１１６に無菌接続されている。あるいはより一般的には、真空ポンプは吸引脂肪組織からのＭＳＣの抽出工程中に必要に応じて管１１６に接続してもよい。概して、本発明の目的は、脂肪組織の分解と細胞の洗浄（細胞を損傷させずに）を、特殊器具を使用することなく効率的に行えるように、管１００に入る際に吸引脂肪組織の高速分解を促進することである。したがって、いくつかの実施形態によると、複数の孔２１１を備えたターボまたはスクリーン２１０を設けることができ、吸引脂肪組織は継手１１０を通じて管１００に入る際に該孔を通過しなければならない。孔２１１の存在は、管に入る吸引脂肪組織の少なくとも一部を占める脂肪組織の塊の分解を助ける。なお、吸引脂肪組織は、ポンプ２２０または管１１６を介したその他の吸引手段により提供される真空を利用して、あるいは継手１１０を介した（たとえばプランジャ型の注射器での）直接注入によって管１００内に引き込むことができる。いずれにせよ、継手１１０、次いで孔２１１を強制的に通過させられる際、吸引脂肪組織は細胞および組織断片の小滴または小塊に分解されて、さらに容易に洗浄される、あるいは本願の他の箇所に記載する方法によって（たとえば図４を参照）処理される。
【００４７】
図３は、本発明の一実施形態による臨床用に脂肪組織から間葉系幹細胞を作製するシステム３００を示す。本実施形態によると、上述するような各種構成要素を備えたキットが提供されて、患者３０１から脂肪組織を抽出することができる（ただし、本実施形態では、システム３００を使用して患者ドナー以外も脂肪組織を提供することができる）。上述したように、脂肪組織は当該技術において既知な多くの方法で取得することができる。図３に示す例示の実施形態によると、システム３００は、患者３０１から脂肪組織を取得する際に使用される注射器３０２と無菌シールバッグ３０３とを備える。注射器３０２は、通常は１〜数百ミリリットルの様々な量の脂肪組織を手動吸引で回収するのに適した、従来技術において既知な任意の従来の種類の物を使ってよい。システム３００による各種キットは、超音波室３０５など、脂肪組織を解離させる一または複数の手段を備えてよい。脂肪組織は無菌バッグ３０３内に保持されたまま超音波室３０５に配置する、あるいは図示するように無菌管を介して超音波室３０５を通過させることができる。通常、システム３００は少なくとも１つの中型（約１００ミリリットル）変形遠心管３１０（図１および２を参照して上述したような遠心管）を備える。脂肪組織は、管３１０の内側領域３４０〜３４１に真空３５０を印加する、あるいは無菌管を介して注射器から注入することによって管３１０に導入することができる。通常、吸引脂肪組織は複数の孔２１１を開けたターボまたはスクリーン２１０を通過し、この孔は上述したように、進入する脂肪組織サンプルを、管３１０内での効率的処理により適した小滴へと分解するのを助ける役目を果たす。いったん吸引脂肪組織サンプルが管３１０内に配置されると、複数の洗浄剤３２０または試薬３２１（たとえば、組織解離を促進する試薬）を、一または複数の無菌継手（図１および２に示すような継手、たとえば継手１２５）を介してシステム３００のキットの一部として設けられる無菌容器から注入してもよい。上述したとおり、管３１０は遠心分離機内で使用しやすいように構成され（システム３００のキットの一部として設けてもよいし、システム３００を使用する場所に配置される標準的デスクトップ型またはその他の遠心分離機であってもよい。遠心分離機は従来技術において既知であり、一般的に広範な医療施設で利用できる）、これにより管３１０内の吸引脂肪組織は、たとえば幹細胞を他の細胞または組織画分から分離するために容易に遠心分離機にかけることができる。通常、管３１０には一または複数の継手３３０、３３１が設けられて、管３１０の円錐部３４０の先端で、分離された幹細胞またはペレットに含まれるその他の細胞や物質を除去する。このような継手３３０、３３１の例を図１および２に示す（すなわち、管１３０と１３１からそれぞれペレット化された物質を引き出す継手１２６、１２７）。いくつかの実施形態によると、管３１０内で（洗浄、解離、遠心分離のいずれかにより）処理された吸引脂肪組織が患者３０１に直接投与される。他の実施形態によると、システム３００は、管３１０からの除去後に吸引脂肪組織をさらに処理するのに使用可能な第２のより小型の管３６０を備えてもよい。たとえば、幾分濃縮した吸引脂肪組織（すなわち、最初に患者またはドナー３０１から採取されたときよりも幹細胞画分が豊富な処理済み吸引脂肪組織）を管３６０に注入してもよい（または真空３５０により引き込んでもよい）。管３６０の容積はたとえば１０〜２０ミリリットルである（ただし、管３１０以上の容積を含め、その他の容積を利用してもよく、図示または記載する相対的寸法は単に例示であり、治療プロトコルによって必要な管寸法は異なるため、限定的に解釈すべきではない）。したがって、図３に示すシステム３００は例示であり、キット内の様々な装置を図示している。これらの装置は、単一の治療での使用に適したキットにおいて、必要に応じて使用される無菌容器内の各種試薬および洗浄剤と共に構成されるものであり、該治療において吸引脂肪組織が患者３０１から採取され、キットとして提供されるシステム３００の構成要素から成る携帯型の連続無菌環境下で処理され、幹細胞の培養および分化を必要とすることなく同一または別の患者３０１に投与される。いくつかの実施形態では、当該技術において既知な方法によって、システム３００を用いて取得した幹細胞画分を分化し、たとえば、本発明により取得した間葉系幹細胞から分化可能な前駆骨細胞またはその他の前駆細胞種を取得し、培養することが望ましいと考えられる。
【００４８】
脂肪組織の抽出および処理方法
本願に開示する方法を実行する際、患者３０１に投与する予定の細胞（間葉系幹細胞など）は脂肪組織から取得してもよい。脂肪組織は当業者にとって既知な各種方法により取得することができる。たとえば、脂肪組織は陰圧式脂肪吸引、超音波脂肪吸引、脂肪組織切除によって患者から除去することができる。また、これらの手技は、脂肪組織切除と陰圧式脂肪吸引の組み合わせなどの手技の組み合わせであってもよい。組織またはその断片は患者への再移植を予定されるため、脂肪組織は、細胞組成能力を保持し、バクテリアおよび／またはウィルスなどの伝染性有機物による組織汚染の可能性が最も少ない方法で回収されるべきである。したがって、組織抽出は好ましくは汚染を最小化する無菌または殺菌状態で実行すべきである。
【００４９】
図４は、本発明の一実施形態による臨床用に脂肪組織から間葉系幹細胞を作製する方法の高水準工程４００を示す図である。この実施形態によると、ステップ４０１で、使い捨て組織除去システムとして、処理幹細胞が豊富な脂肪吸引を得るための無菌キットの部品（たとえば、注射器３０２）が提供される。次に、ステップ４０２で、技術者、医師、またはその他の専門家が患者（またはドナー）から、当初の幹細胞（特にＭＳＣ）濃度を有する脂肪組織を除去する。陰圧式脂肪吸引術の場合、脂肪組織は、患者３０１の脂肪組織堆積部またはその近傍にカニューレを挿入し、脂肪組織を吸引装置内へ吸引することによって回収することができる。一実施形態によると、小型カニューレを注射器３０２に接続し、人力で脂肪組織を吸引してもよい。注射器３０２または類似の装置の使用は、小〜中程度の量の脂肪組織（たとえば、０．１ｍｌ〜数百ミリリットルの脂肪組織）を採取するのに望ましい。
【００５０】
陰圧式脂肪吸引は、組織を回収する際に幹細胞の損傷の可能性が最も低い低侵襲性の方法であるため、患者３０１から脂肪組織を除去するのに望ましい。さらに、当業界における脂肪吸引術の普及のおかげで、ドナーまたは患者から相当量の脂肪組織を除去する確実で安全な技術が開発されている。好適な実施形態によると、該システムは、以後の処理のために脂肪組織を無菌シールバッグに抽出できる使い捨て吸引システムを含む。好ましくは、該システムは小型注射器３０２などの比較的小さな装置を採用することで、全身麻酔ではなく局所麻酔のみ（または麻酔無し）で脂肪吸引を実行できるという利点をさらに備える。
【００５１】
患者から除去した脂肪組織は、以後の処理のために無菌容器（無菌シールバッグ３０３など）に回収してもよい。本明細書に記載するように、一実施形態では、幹細胞および／または内皮前駆細胞を含む処理済み脂肪組織細胞集団の製造のために組織を回収するための専用装置が設計される。好適な一実施形態によると、該装置は、患者から脂肪組織を無菌シールバッグ３０３に抽出する使い捨て吸引システムである。別の実施形態によると、該装置は、抽出手順を実行する医師が組織回収のために通常使用する任意の従来の装置であってもよい。
【００５２】
ふつうはごく少量の脂肪組織しか必要とされないため、本発明の有用性は多量の脂肪組織を有する個人に限定されない。回収される組織の量は、ドナーの体容積指数、アクセス可能な脂肪組織採取部位の可用性、付随する薬物治療や症状（抗凝血剤療法など）、脂肪組織回収の臨床目的などを含むがそれらに限定されない多数の変数に依存する。さらに、吸引脂肪組織内の幹細胞濃度は個人によって大きく変動するため、特定量の幹細胞を要するとき、特定の所望量を得るのにより多いまたは少ない量の脂肪組織が必要となる場合がある。たとえば、細身の人から抽出する組織内の幹細胞濃度は肥満体のドナーに比べて高いことが多い（肥満体の人の場合、脂肪組織中の脂肪含有量が多いという希釈効果を反映している）。
【００５３】
ヒトの脂肪組織を取得する好適な方法は、当該技術において既知の切除または脂肪吸引術である。本発明の多能性細胞は、脂肪組織の取得方法に関係なく、最初に切除または抽出される脂肪組織内に存在する。その後、脂肪組織を処理して幹細胞の分離／濃縮を促進することができる。たとえば、多能性細胞は、回収した脂肪組織をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの生理的に適合する溶液で洗浄することによって取得してよい。通常、洗浄ステップは、脂肪組織サンプルのＰＢＳでの洗滌、サンプルの攪拌、サンプル内の組織の定着から成る。洗浄に加えて、脂肪組織を解離させてもよい。解離は酵素分解（たとえば、トリプシン処理）によって行うことができる。
酵素処理に代えて、または酵素処理と併せて、機械的攪拌、音波または超音波エネルギー、または熱エネルギーなどのその他の解離方法を使用してもよい。その後、細胞を遠心分離機にかけ、結果として生じる（多能性細胞を含む）ペレットを適切な溶液（たとえば、ＰＢＳ）に懸濁後、さらに処理してもよい。
【００５４】
ステップ４０３では、ステップ４０２で取得した脂肪組織の少なくとも一部を（たとえば上述したように）処理して高濃度の幹細胞を取得し、ステップ４０４では、処理した幹細胞を、システム３００のキットに設けることができる、あるいは医療施設で利用することができる無菌容器から患者３０１に投与してよい。再懸濁ペレット内の多能性細胞は、（たとえば、磁気ビーズを用いる選別、蛍光活性化細胞選別機／ＦＡＣＳ、磁気活性化細胞選別機／ＭＡＣＳ、または親和分離法などによる）細胞選別、細胞分別、粒度、密度、分子性、形態、免疫組織を含むがそれらに限定されない方法で、再懸濁ペレット内のその他の細胞から分離させることができる。いくつかの免疫学的な細胞隔離方法では、多能性細胞は、細胞表面のエピトープに結合する抗体またはその他の特異的結合タンパク質を使用して、正の選択により取得することができる。上記方法では、細胞が接着する抗体からの細胞回収は、当業者によって既知なように適切な緩衝剤で１回以上洗浄することによって実行することができる。もしくは、多能性細胞は負の選択により隔離してもよい。本発明の各種実施形態によると、幹細胞回収キットは、吸引脂肪組織サンプル内の幹細胞の分離または濃縮を促進する無菌容器および／または試薬を備えていてもよい。多能性細胞の存在は好ましくは、たとえば細胞表面マーカおよび／または当該技術において既知な計数技術を用いて再導入前に判定される。
【００５５】
通常、本発明のシステム３００を用いて取得される多能性細胞は、増殖または分化させずに患者に導入（または再導入）される。しかしながら、いくつかの実施形態によると、多能性細胞は生体外で増殖および／または分化させてもよい。すなわち、隔離後、多能性細胞は培養基に保持して増殖させてもよい。多能性細胞は、当該技術において既知な方法によって所望の細胞種に分化（または表現型的に変化）させてもよい。使用される細胞に応じて、媒体および／または媒体補助剤の濃度を変更または調節することは当業者の技術の範囲に含まれる。別の実施形態によると、本発明の多能性細胞は、当該技術において既知なように、血清が血清アルブミンと、血清トランスフェリンと、セレンと、インシュリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むがそれらに限定されない組換えタンパク質と、の組み合わせによって置き換えられる組成物の培養基で増殖させてもよい。本発明の多能性細胞集団の保持条件は、細胞を未分化の形で維持させる一または複数の細胞因子も含んでよい。
【００５６】
多能性細胞の分化が望まれる場合、一または複数の追加物質を培養基に追加して特定の所望する表現型の変化を生じさせてもよい。上記物質は、一または複数の細胞内信号伝達経路の活性剤（たとえば、分裂活性化タンパクキナーゼとＳＭＡＤ）、転写因子の活性剤（たとえば、ｓｏｘ９、Ｌ−ｓｏｘ５、Ｌ−ｓｏｘ６）、細胞外基質タンパク質の生成および相互作用の活性剤（たとえば、コラーゲンＩＩ、アグリカン、軟骨オリゴマー基質タンパク質）、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、環境因子（たとえば、酸素分圧）などを含んでよい。
【００５７】
図５は、本発明の好適な実施形態による臨床用に脂肪組織から間葉系幹細胞を作製して使用する方法の詳細な工程５００を示す図である。本実施形態によると、ステップ５０１で、脂肪組織がドナーまたは患者３０１から除去される。ステップ５０２で、吸引脂肪組織が真空３５０によって変形遠心管３１０に注入または導入される。任意のステップ５０３で、抽出された吸引脂肪組織は、ＰＢＳなどの当該技術において既知な洗浄剤で洗浄してもよい。任意のステップ５０４で、以後の処理を簡易化するため、吸引脂肪組織を解離して、脂肪組織と細胞塊に分解させてもよい。ステップ５０５で、細胞または吸引脂肪組織は遠心分離機にかけ、比重の異なる細胞および組織画分に分離させてもよい。たとえば、適切に作製された吸引脂肪組織の場合、ＭＳＣは、管３１０の円錐３４０の先端でペレット状に形成し、軽量の細胞または組織断片から感知できるほど解離させることができる。多くの場合、ステップ５０５で生成されたペレットは、（ステップ５０１でドナーまたは患者から抽出されたときに吸引脂肪組織に存在する幹細胞の濃度と比較して）わずかに高い幹細胞濃度を有することができ、さらなる濃縮が望ましいこともある。ステップ５０６で、幹細胞の豊富なペレットは以後の処理のために（ステップ５０２〜５０５の反復も含む）適切な溶液中に再度懸濁される。任意のステップ５０７で、当該技術において既知な技法によって幹細胞を他の細胞画分からさらに分離させてもよい。再懸濁ペレット内の多能性細胞は、（たとえば、磁気ビーズを用いる選別、蛍光活性化細胞選別機／ＦＡＣＳ、磁気活性化細胞選別機／ＭＡＣＳ、または親和分離法などによる）細胞選別、細胞分別、粒度、密度、分子性、形態、免疫組織を含むがそれらに限定されない方法で、再懸濁ペレット内のその他の細胞から分離させることができる。いくつかの免疫学的な細胞隔離方法では、多能性細胞は、細胞表面のエピトープに結合する抗体またはその他の特異的結合タンパク質を使用して、正の選択により取得することができる。上記方法では、細胞が接着する抗体からの細胞回収は、当業者によって既知なように適切な緩衝剤で１回以上洗浄することによって実行することができる。もしくは、多能性細胞は負の選択により隔離してもよい。ステップ５０８で、処理済み吸引脂肪組織サンプル内の幹細胞濃度は、当該技術において既知な手段を用いて判定してよい。多能性細胞の存在は好ましくは、たとえば細胞表面マーカおよび／または当該技術において既知な計数技術を用いて再導入前に判定される。ステップ５０９では、ステップ５０８で判定された濃度の少なくとも部分的に基づき、吸引脂肪組織をさらに処理して濃縮する（すなわち、幹細胞の濃度を高くする）か否かを判定してもよく、濃縮すると判定された場合、ステップ５０２〜５０８のうち一または複数を反復することで、さらに処理を実行することができる。任意のステップ５１０で、当該技術において確立された手法によって、幹細胞を培養し、より多くの量の幹細胞を取得してもよい。同様に、ステップ５１１（ステップ５１０の前でも後でも、あるいは同時に実行してもよい）で、当該技術において既知な手法を用いて、多能性幹細胞を１種以上の前駆細胞種に分化させてもよい。最後に、ステップ５１２で、ステップ５０１〜５１１を参照して上述したように抽出および処理された幹細胞または前駆細胞を、１人以上の患者３０１に投与してもよいし、あるいは後の治療、美容、またはその他の用途での使用のために保管してもよい。
【００５８】
脂肪由来幹細胞の再導入手段
患者への安全かつ効率的な投与に適した形で幹細胞を提供するため、本発明のシステム３００によるキットを使用して、適量の適切なビヒクルと共に、好ましくは精製した形態で予防的または治療的に有効な量の本発明の間葉系幹細胞を含有する医薬組成物を生成することができる。
【００５９】
本発明の各種実施形態による治療を受ける患者は、脂肪組織または脂肪組織由来の幹細胞を採用するその他の治療とは異なる濃度の幹細胞を受け入れてもよい。したがって、患者から除去される脂肪組織は、患者に投与される幹細胞の濃度を変更するように処理してもよい。本発明の好適な実施形態では、患者は、脂肪組織移植やその他類似の幹細胞に基づく治療における一般的な幹細胞濃度よりも高い濃度の幹細胞を受け入れる。この濃縮幹細胞は、成熟した脂肪細胞および結合組織がほぼ存在しない脂肪由来幹細胞および／または内皮前駆細胞を含む組成物で投与してよい、あるいは他の例では、幹細胞を増量した脂肪組織を含む組成物で投与してよい。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、具体的に選択される投与の形態に応じて策定してもよい。たとえば、医薬組成物は、治療の必要な対象に注入される懸濁液などの液体状に作製してよい。例示的な（非限定的な）例では、本発明の医薬組成物は、食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはその他の適当な薬理上許容可能な担体といった薬理上許容可能なビヒクルを含む無菌懸濁液で、好ましくは静脈、腹膜、皮膚などを介して人などの対象に投与される。
【００６１】
本発明によると、必要とする対象への医薬組成物の投与は従来手段を使用して実行することができる。特定の一実施形態によると、医薬組成物は、注射器、カテーテル、トロカール、カニューレなどの装置を用いて皮下投与してよい。いずれにせよ、本発明の医薬組成物は当業者にとって既知な任意の適切な器具、器械、装置を用いて投与してよい。好適な実施形態によると、医薬組成物を投与する装置は上述のキットの一部として提供される、あるいは医薬組成物を対象へ汚染なく移送できるように上述のキットに合わせて改良される。
【００６２】
上記の本発明の好適な実施形態は例示と説明のために提示したもので、本発明を網羅する、あるいはまさに開示する形態に限定することを目的としていない。本発明の原理と実際的適用について最適に説明することによって、当業者が各種実施形態と企図される特定用途に適した様々な修正とで本発明を理解し得るように、多数の実施形態を選択し説明した。本発明の範囲は請求項とその等価物によって定義されると意図される。
【００６３】
当業者であれば、上述の各種実施形態の広範な修正が可能であることを理解しているであろう。よって、本発明は請求項とその均等物によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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