(57)【要約】【課題】本発明は、肝臓から肝臓以外の臓器への肝臓癌の転移の有無を診断する上で有用な、診断用データを収集する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、肝臓癌を有する被験者から採取された腫瘍細胞試料中におけるアルブミン遺伝子の発現量を測定する工程を備える、前記被験者における肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移の有無を診断するためのデータを収集する方法を提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓癌を有する被験者から採取された腫瘍細胞試料中におけるアルブミン遺伝子の発現量を測定する工程を備える、前記被験者における肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移の有無を診断するためのデータを収集する方法。
【請求項２】
前記被験者から採取された腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量と、肝臓以外の臓器への癌の転移の無い肝臓癌対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量とを比較する工程をさらに備え、前記被験者から採取された腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、前記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量よりも高い場合、前記被験者において癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が高いことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍細胞試料が循環腫瘍細胞試料であり、前記循環腫瘍細胞試料が、血液試料から得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記循環腫瘍細胞試料が、前記血液試料をフィルタで濾過し、フィルタ上に捕捉された細胞を回収することによって得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍細胞中に発現するアルブミンを含む、肝臓癌の肝臓から肝臓以外の臓器への転移の有無を診断するためのマーカー。
【請求項６】
アルブミン遺伝子を増幅するプライマーセットを備える、肝臓癌の肝臓から肝臓以外の臓器への転移診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移の有無を診断するためのデータを収集する方法、該転移の有無を診断するためのマーカー及び診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓にできる癌には、肝臓から生じる「原発性の肝臓癌」と、他の臓器から肝臓に転移した「転移性肝臓癌」とに大別される。原発性の肝臓癌は日本で年間に約４万人が発病し、近年増加傾向にある癌の一つである。原発性の肝臓癌には、肝細胞が癌になる「肝細胞癌」と、胆汁を十二指腸に流す管（胆管）の細胞が癌になる「胆管細胞癌」等があり、日本では原発性の肝臓癌のうち肝細胞癌が大部分を占める。
【０００３】
原発性肝癌の治療法としては、手術（外科的手術）、抗癌剤投与（化学療法）、免疫細胞療法、放射線療法、陽子線治療、重粒子線治療等があり、患者の状態に応じて、適切な治療法を選択することが重要である。治療法の選択において検討すべき患者の状態としては、腫瘍の数、腫瘍の大きさ、肝臓における腫瘍の広がり、腫瘍の位置、肝機能の状態、そして肝臓から他の臓器への癌の転移の有無等が挙げられる。これらの患者の状態によって、適切な治療法は異なり、治療法の選択は、患者の予後及び生存率に大きく影響する。したがって、医師が治療法を検討するにあたって、患者の状態について正確に知ることは非常に重要である。
【０００４】
肝臓癌の検査としては、超音波検査、ＣＴ及びＭＲＩ等の画像検査と腫瘍マーカー検査とを組み合わせて行うことが一般的である。必要があれば針生検等の検査が追加して行われる。
【０００５】
肝臓癌の腫瘍マーカーとしては、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＡＦＰ−Ｌ３分画等のマーカーが一般的に知られており、これらのマーカーは肝臓癌の有無を診断するためのマーカーとして用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２４３４０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、肝臓から肝臓以外の臓器への肝臓癌の転移の有無を診断する上で有用な、診断用データを収集する方法、マーカー、並びに、診断用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究した結果、驚くべきことに、肝臓癌が他の臓器へも転移している肝臓癌患者から採取した腫瘍細胞試料中において、アルブミン遺伝子の発現量が有意に高いことを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、肝臓癌を有する被験者から採取された腫瘍細胞試料中におけるアルブミン遺伝子の発現量を測定する工程を備える、前記被験者における肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移の有無を診断するためのデータを収集する方法を提供する。
【００１０】
肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移の有無を診断するに際して、本発明の方法によって得られたデータを有効に利用することができる。
【００１１】
上記方法は、上記被験者から採取された腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量と、肝臓以外の臓器への癌の転移の無い肝臓癌対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量とを比較する工程をさらに備え、上記被験者から採取された腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量よりも高い場合、上記被験者において癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が高いことをデータは示すことができる。
【００１２】
上記腫瘍細胞試料が循環腫瘍細胞試料であり、上記循環腫瘍細胞試料が、血液試料から得られることが好ましい。血液試料を用いることにより、被験者にとって負担の大きい手術等の処置を行うことなく、腫瘍細胞を採取できる。また、循環腫瘍細胞試料によれば、転移性肝臓癌を診断するための確度がより高いデータを収集することができる。
【００１３】
上記循環腫瘍細胞試料は、上記血液試料をフィルタで濾過し、フィルタ上に捕捉された細胞を回収することによって得られる試料であってもよい。フィルタで血液試料を濾過することにより、フィルタ上に捕捉された循環腫瘍細胞試料とフィルタを通過するその他の血液成分とを分離することができ、血液試料中に含まれる微量の循環腫瘍細胞を精製することができる。精製された循環腫瘍細胞試料によれば、得られるデータの確度がより向上する。
【００１４】
また、本発明は、腫瘍細胞中に発現するアルブミンを含む、肝臓癌の肝臓から肝臓以外の臓器への転移の有無を診断するためのマーカーを提供する。本発明のマーカーを用いることにより、確度良く、肝臓癌の転移の有無を診断することが可能となる。
【００１５】
また、本発明は、アルブミン遺伝子を増幅するプライマーセットを備える、肝臓癌の肝臓から肝臓以外の臓器への転移診断用キットを提供する。本発明の転移診断用キットを用いることにより、肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移を診断するための確度の高いデータをより簡便に収集することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、肝臓から肝臓以外の臓器への肝臓癌の転移の有無を診断する上で有用な、確度の高いデータを収集することができるため、得られたデータを利用して肝臓癌の転移を早期に発見し、適切な治療を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒｅ  Ｃｅｌｌ、ＣＴＣ）を回収するために使用し得るフィルタの模式図である。
【図２】図２は、ＣＴＣ捕捉装置の構成を示す模式図である。
【図３】図３は、実験例１により解析した、ＣＴＣ捕捉装置により捕捉した細胞中のＡＦＰ、ＧＰＣ３、アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子の発現量を示したグラフである。縦軸は発現量の相対値を対数目盛で表し、横軸は混合したヒト肝臓癌細胞株の細胞数を表す。なお、グラフにおいて、縦軸の最小値は１と表示されているが、棒グラフが示されていないサンプルでは、遺伝子発現量は検出限界以下である。
【図４】図４は、実験例２により解析した、ＣＴＣ捕捉装置により捕捉した細胞中のＡＦＰ、ＧＰＣ３、アルブミン遺伝子の発現量を患者別に示したグラフである。縦軸は発現量の相対値を対数目盛で表し、横軸はそれぞれ健常人群（グラフ中「健常人」と示す）、肝硬変患者群（「肝硬変」）、肝臓から他の臓器への転移がない肝臓癌患者群（「未転移」）、肝臓から他の臓器への転移がある肝臓癌患者群（「転移」）を表す。なお、グラフにおいて、縦軸の最小値は１と表示されているが、棒グラフが示されていないサンプルでは、遺伝子発現量は検出限界以下である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の方法について詳細に説明する。
【００１９】
本発明の肝臓癌を有する被験者における肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移の有無を診断するためのデータを収集する方法は、被験者から採取された腫瘍細胞試料中におけるアルブミン遺伝子の発現量を測定する工程を備える。本発明のデータを収集する方法は、医師による癌患者の診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。
【００２０】
本発明において、肝臓癌を有する被験者とは、肝臓にできた「原発性の肝臓癌」を有する患者を指す。上記肝臓癌には、原発性の肝臓癌のうち、肝細胞癌、胆管細胞癌、肝細胞・胆管細胞混合癌、肝細胞芽腫、未分化癌、胆管嚢胞腺癌、神経内分泌腫瘍等が含まれる。この中でも、肝細胞癌が、本発明の方法において最も有効な対象である。
【００２１】
本発明の方法によれば肝臓から肝臓以外の臓器への転移の有無についてのデータを収集できるため、本発明で得られたデータを、肝臓癌のステージの診断に利用することができる。すなわち、本発明で得られたデータを利用して、肝臓以外の臓器への転移の有無を確認し、他の診断所見と合わせて、ステージＩ〜ＩＶ期の診断をすることができる。なお、肝臓癌の各ステージの状態は下記表１のとおりである。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
本発明の方法において、被験者から採取された腫瘍細胞試料中におけるアルブミン遺伝子の発現量が、肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移の無い肝臓癌対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量よりも高い場合、そのデータは被験者において癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が高いことを示す。したがって、本発明の方法は、被験者から採取された腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量と、肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移の無い肝臓癌対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量とを比較する工程をさらに備えることが好ましい。上記比較する工程を備えることにより、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量よりも高い場合、そのような被験者において癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量よりも高くない場合、そのような被験者は癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。
【００２４】
上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量としては、本発明の方法を実施する際、その都度測定したデータを用いてもよいし、予め測定したデータを用いてもよい。また、上記対照者由来の腫瘍細胞試料は、上記被験者由来の腫瘍細胞試料と同じ種類の試料であり、被験者由来の腫瘍細胞試料と同様の処理が施された試料であることが好ましい。
【００２５】
上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量として、予め測定したデータを用いる場合、肝臓以外の臓器への転移の無い肝臓癌患者の集団を作り、各患者のデータを集め、その平均値、中央値又は代表値を、上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量を表す対照値として採用してもよい。場合によっては、年齢、性別、又は遺伝的背景等の特徴が異なる集団について、上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量を表す対照値を定めてもよい。
【００２６】
本明細書において、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量よりも「高い」とは、統計学的に有意な差があることをいう。被験者において癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が高いと診断する場合、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量の２倍以上であることが好ましく、５倍以上であることが好ましく、１０倍以上であることが好ましい。一方、被験者において癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が低いと診断する場合、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量の、１倍以下であることが好ましい。遺伝子の発現量として、例えばｍＲＮＡの発現量を、遺伝子の発現量とすることができる。
【００２７】
上記肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移の無い肝臓癌対照者としては、例えば、表１におけるステージＩ、ＩＩ又はＩＩＩ期の肝臓癌患者を挙げることができる。
【００２８】
また、本発明においては、上記対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量を比較の基準にするのではなく、例えば、ＨｕＨ７細胞株中のアルブミン遺伝子の発現量を比較の基準とすることもできる。すなわち、本発明の方法において、被験者から採取された腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、ＨｕＨ７細胞株中のアルブミン遺伝子の発現量よりも高い場合、そのデータは被験者において癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が高いことを示す。したがって、本発明の方法は、被験者から採取された腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量と、ＨｕＨ７細胞株中のアルブミン遺伝子の発現量とを比較する工程をさらに備えてもよい。上記比較する工程を備えることにより、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記ＨｕＨ７細胞株中のアルブミン遺伝子の発現量よりも高い場合、そのような被験者において癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が高いと診断するためのデータを収集することができ、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記ＨｕＨ７細胞株中のアルブミン遺伝子の発現量よりも高くない場合、そのような被験者は癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が低いと診断するためのデータを収集することができる。
【００２９】
比較に際しては、被験者由来の腫瘍細胞試料と同様の処理を施したＨｕＨ７細胞株のアルブミン遺伝子の発現量を、該細胞株のＧＡＰＤＨ遺伝子等の内在性コントロールとなる遺伝子の発現量で除した値を、ＨｕＨ７細胞株中のアルブミン遺伝子の発現量を表す値として用いることができる。同様に、被験者由来の腫瘍細胞試料のアルブミン遺伝子の発現量を、該試料のＧＡＰＤＨ遺伝子等の内在性コントロールとなる遺伝子の発現量で除した値を、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量とすることができ、上記ＨｕＨ７細胞株中のアルブミン遺伝子の発現量と比較することができる。遺伝子の発現量として、例えばｍＲＮＡの発現量を、遺伝子の発現量とすることができる。
【００３０】
本明細書において、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記ＨｕＨ７細胞株中のアルブミン遺伝子の発現量よりも「高い」とは、統計学的に有意な差があることをいう。被験者において癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が高いと診断する場合、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記ＨｕＨ７細胞株中のアルブミン遺伝子の発現量の２倍以上であることが好ましく、５倍以上であることが好ましく、１０倍以上であることが好ましい。一方、被験者において癌が肝臓から肝臓以外の臓器に転移している可能性が低いと診断する場合、被験者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量が、上記ＨｕＨ７細胞株中のアルブミン遺伝子の発現量の、１倍以下であることが好ましい。
【００３１】
被験者から採取する腫瘍細胞試料は、被験者から採取した、胆管を含む肝臓組織、血液、胆汁、唾液、リンパ液、髄液等の組織試料又は体液試料から調製することができる。なかでも、血液試料から調製することが好ましい。血液試料を用いることにより、被験者にとって負担の大きい手術等の処置を行うことなく、腫瘍細胞を容易に採取できる。被験者からの血液の採取は、標準的な方法に従って行われ、適切な量、例えば１〜１０ｍＬの末梢血液を採取し、その後の調製の前に標準的な方法によって保存することができる。
【００３２】
血液試料に含まれる腫瘍細胞は、血液中を流れる循環腫瘍細胞である。循環腫瘍細胞試料によれば、肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移を診断するための、確度がより高いデータを収集することができる。上記循環腫瘍細胞試料は、例えば、被験者から採取した血液試料をフィルタで濾過し、フィルタ上に捕捉された細胞を回収することによって得ることができる。
【００３３】
アルブミン蛋白は血漿を構成する成分である。本発明の方法において用いる腫瘍細胞試料は、血漿由来のアルブミンによる測定への影響を避けるため、腫瘍細胞以外の血液成分、特に血漿タンパク質を含まないことが重要である。特に血液試料から腫瘍細胞試料を得る場合、腫瘍細胞試料から、腫瘍細胞以外の血液成分、すなわち血漿、赤血球、白血球及び血小板が除かれていることが好ましい。腫瘍細胞試料に血液成分が含まれないように調製するには、腫瘍細胞試料を血液試料等の体液試料から調製する場合は、後述するフィルタ等で体液試料を濾過し、腫瘍細胞のみを捕捉して調製することができる。腫瘍細胞試料を肝臓組織等の組織試料から調製する場合は、組織試料の個々の細胞を解離させ、バッファーに懸濁させることにより、同様にフィルタ等で細胞懸濁液を濾過し、腫瘍細胞のみを捕捉して調製することができる。
【００３４】
以下、図１を参照しながら、循環腫瘍細胞を回収するために使用し得るフィルタの構造について説明する。フィルタ２００は、プラスチック又は金属等の薄膜１２０に、多数の貫通孔１１０が形成されている構造を有する。
【００３５】
貫通孔１１０の開口形状は、例えば、円、楕円、正方形、長方形、角丸長方形又は多角形であることができる。循環腫瘍細胞を効率よく捕捉する観点から、開口形状は、円、長方形又は角丸長方形が好ましく、長方形又は角丸長方形がより好ましい。角丸長方形とは、長方形と、長方形の短辺と同じ長さの半径を有し長方形の２つの短辺それぞれに隣接して結合している２つの半円形と、を有する形状である。開口形状が長方形又は角丸長方形であると、貫通孔１１０が目詰まりしにくく、循環腫瘍細胞をより選択的に捕捉できる。貫通孔１１０は、図１に示すような整列配置でもよく、列毎に配置がずれた千鳥配置でもよく、任意に配置されたランダム配置であってもよい。
【００３６】
貫通孔１１０の孔径は、捕捉対象である循環腫瘍細胞の直径に応じて設定され、貫通孔１１０の孔径は、５μｍ〜１５μｍであることが好ましく、６μｍ〜１２μｍであることがより好ましく、７μｍ〜１０μｍであることがさらに好ましい。なお、本明細書において貫通孔１１０の孔径（単に「フィルタの孔径」ともいう。）とは、貫通孔１１０を通過できる球の直径の最大値をいう。例えば、開口形状が長方形の場合、その貫通孔１１０の孔径はその長方形の短辺の長さである。開口形状が多角形の場合には、貫通孔１１０の孔径はその多角形の内接円の直径となる。開口形状が長方形又は角丸長方形の場合、循環腫瘍細胞が貫通孔１１０に捕捉された状態であっても、貫通孔１１０において開口形状の長軸方向に隙間ができる。この隙間を通して夾雑細胞が通過できるため、フィルタ２００の目詰まりを防止することができる。
【００３７】
フィルタ２００の開口率は、フィルタ２００の強度とフィルタ２００の目詰まり防止とのバランスを保つ観点から、５〜５０％であることが好ましく、１０〜４０％であることがより好ましく、１０〜３０％であることがさらに好ましい。なお、本明細書において、開口率とは、フィルタ２００全体の面積に対する貫通孔１１０が占める面積をいう。
【００３８】
フィルタ２００の厚みは、フィルタ２００の強度とフィルタ２００の目詰まり防止とのバランスを保つ観点から、３μｍ〜５０μｍであることが好ましく、５μｍ〜４０μｍであることがより好ましく、５μｍ〜３０μｍであることがさらに好ましい。
【００３９】
フィルタ２００は金属からなることが好ましい。金属は加工性に優れるため、フィルタ２００の加工精度を高めることができ、循環腫瘍細胞の捕捉率をさらに向上させることができる。また、金属はその他の材料と比べて剛直であるため、外部から力が加わった場合でも、そのサイズ及び形状が維持される。このため、夾雑細胞が貫通孔１１０よりやや大きくても、フィルタ２００は変形せず、夾雑細胞が変形して貫通孔１１０を通過することができ、循環腫瘍細胞をより選択的に捕捉できる。
【００４０】
金属としては、例えば、ニッケル、銀、パラジウム、銅、イリジウム、ルテニウム、クロム及びこれらの合金が挙げられる。パラジウム及びイリジウムは酸化還元電位が高く、難溶性で特性が良好だが、高価である。ニッケルは水素よりも酸化還元電位が低いため、溶解しやすいが、安価である。銀及びパラジウムは貴金属であり、パラジウム及びイリジウムに比べると安価である。
【００４１】
フィルタ２００の作製方法は、特に限定されないが、例えば、次のように作製することができる。まず、基板上の、後にフィルタ２００の貫通孔１１０となる位置にフォトレジストを配置し、この基板に、フィルタ２００となる金属のめっきを施すことで、貫通孔１１０を有する金属層（薄膜１２０）を基板上に形成する。その後、金属層から基板及びフォトレジストを除去することで、フィルタ２００が得られる。基板としては、例えば、表面に銅めっきが施されたものを用いることができる。銅は、薬液による化学的溶解で容易に除去可能であり、フォトレジストとの密着力も優れているため、基板の材料として好ましい。
【００４２】
循環腫瘍細胞及び夾雑細胞を含有する液体を濾過する方法及び濾過に用いる装置は特に限定されないが、例えば、後述するＣＴＣ捕捉装置を用いることができる。循環腫瘍細胞へのダメージを最小限に抑える観点、夾雑細胞を押し出す観点及びフィルタ２００の目詰まりを防止する観点から、フィルタ２００を通液させる流速を制御することが好ましい。通液時の流速は、５０μＬ／分〜３０００μＬ／分が好ましく、１００μＬ／分〜１０００μＬ／分がより好ましく、２００μＬ／分〜６００μＬ／分がさらに好ましい。
【００４３】
循環腫瘍細胞を捕捉後、捕捉した循環腫瘍細胞を回収して、循環腫瘍細胞を含有する液体を得ることができる。循環腫瘍細胞の回収方法としては、例えば、逆洗、マイクロマニピュレーション及びピペッティングが挙げられる。逆洗とは、フィルタの、細胞が捕捉された面とは反対の面から液を流し、フィルタ上に捕捉された細胞を取ることをいう。マイクロマニピュレーションとは、ピコピペットを用いて細胞１つ１つをフィルタ上から回収することをいう。ピペッティングとは、フィルタ上の液体を、マイクロピペットを用いて混合し、フィルタ上に捕捉された細胞をはがし取ることをいう。
【００４４】
（ＣＴＣ捕捉装置）
以下、本発明において使用する循環腫瘍細胞試料の調製に用いることができる、ＣＴＣ捕捉装置について、図２を参照しながら説明する。図２に示すＣＴＣ捕捉装置１００は、被検液となるサンプル（血液サンプル等）をフィルタによって濾過することで、サンプル中に含まれる循環腫瘍細胞を捕捉する装置である。
【００４５】
ＣＴＣ捕捉装置１００には、フィルタを内部に備えるフィルタユニット１、フィルタユニット１に処理液を供給する処理液流路３、フィルタユニット１にサンプルを供給するサンプル流路４が設けられている。
【００４６】
処理液流路３の上流側には、それぞれ異なる処理液が入った複数の処理液収納容器５が設けられている。処理液収納容器５に投入される処理液としては、例えば、フィルタに捕捉された循環腫瘍細胞等を洗浄するための洗浄液が挙げられる。各処理液収納容器５にはそれぞれ軟質チューブが挿入されて個別の処理液流路６を形成している。これらの流路は選択バルブ８に接続されており、選択バルブ８を回転させることにより処理液流路３に接続する処理液が選択される。
【００４７】
サンプル流路４には、リザーバー１０が接続されており、サンプルはこのリザーバー１０に供給される。フィルタユニット１には、処理液及びサンプルのいずれか一方を供給する構成となっており、処理液及びサンプルのうちいずれの液体を供給するかの制御は流路３，４のそれぞれに取り付けられたピンチバルブ１２，１３によって切り替える。
【００４８】
処理液及びサンプルの供給は、フィルタユニット１の下流に設けられたペリスタルティックポンプ１４によって吸引することで行われる。サンプル又は処理液は、処理液流路３又はサンプル流路４の内部を流れてフィルタユニット１に供給され、その後廃液タンク１６に流れ込む。サンプル中の循環腫瘍細胞は、フィルタユニット１内の流路上に設けられたフィルタによって捕捉される。このようにして得られた循環腫瘍細胞を、上述の逆洗、マイクロマニピュレーション及びピペッティング等の方法により回収し、循環腫瘍細胞試料として、本発明の方法に用いることができる。
【００４９】
（アルブミン遺伝子）
本発明において発現量を測定するアルブミン遺伝子は、特に血清アルブミン遺伝子であることが好ましく、特にヒト血清アルブミン遺伝子であることが好ましい。ヒト血清アルブミンは、血漿の主要な蛋白構成成分であり、この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持する機能を有する。上述のように、本発明においては、血漿由来のアルブミンによる測定への影響を避けるため、測定に用いられる腫瘍細胞試料には血漿由来のアルブミンが含まれないように調製することが好ましい。
【００５０】
循環腫瘍細胞試料は、アルブミン遺伝子の発現量の測定の前に、適宜、細胞破砕、細胞溶解又はこれらを組み合わせて、ｍＲＮＡ等の核酸を溶出させる等の前処理を行うことができる。核酸を可能な限り傷つけることなく、細胞から溶出させて発現量を測定する観点からは、細胞溶解液を用いることが好ましい。細胞溶解液として、哺乳動物細胞の溶解に用いることができる公知の細胞溶解液を用いることができる。なお、生体試料から核酸を抽出し、調製する方法は公知であり、種々の市販の試薬又はキットを用いて調製してもよい。例えば、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いることができる。
【００５１】
発現量を測定するアルブミン遺伝子の遺伝子配列は、公知のヒト血清アルブミン遺伝子の配列と同一または相同なＤＮＡ配列とすることができる。該ＤＮＡは染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡである。染色体ＤＮＡはヒト血清アルブミン遺伝子を含有する遺伝子ライブラリーから分離することができ、ｃＤＮＡは逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法等の公知の方法を用いて、ヒト血清アルブミンを産生できる細胞から得られたｍＲＮＡから調製することができる。
【００５２】
遺伝子の発現量の測定は、公知の方法により行うことができる。例えば、核酸の増幅に基づく方法により行うことができ、例えば、定量ＰＣＲにより遺伝子発現量の測定を行うことができる。定量ＰＣＲによれば、目的のアルブミン遺伝子を増幅するプライマーを用いて、ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡの増幅を行い、増幅したｃＤＮＡ量を測定することにより、試料中のアルブミン遺伝子の発現量を測定することができる。定量ＰＣＲとして、公知の方法を利用することができ、例えば、エンドポイントＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等を利用することができる。プライマーによる増幅前に、前処理として、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの精製及び予備増幅を行うことができる。また、ＰＣＲ増幅によらず、公知の方法によりｍＲＮＡを増幅してｍＲＮＡ量を定量することにより、試料中のアルブミン遺伝子の発現量を測定してもよい。
【００５３】
定量においては、サイズ分画（例えばゲル電気泳動法）、ＳＹＢＲグリーン法（インターカレーター法）及び蛍光プローブ法（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、サイクリングプローブを用いたハイブリダイゼーション法）等の公知の方法を適用でき、シグナル強度に基づいて、濃度既知の標準試料と比べることにより定量することができる。
【００５４】
上述のプローブ及びプライマーは、公知の技術を用いて合成及び標識することができる。プローブ又はプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成法に従い、自動合成機を用いて、化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製のために、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動又は陰イオン交換ＨＰＬＣ等を用いることができる。アルブミン遺伝子を増幅するプライマーとして、市販のものを用いてもよい。
【００５５】
（肝臓癌の転移の診断マーカー）
上述のように、被験者から採取された腫瘍細胞試料中におけるアルブミン遺伝子の発現量は、肝臓から肝臓以外の臓器への癌の転移の無い肝臓癌対照者由来の腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現量よりも有意に高いため、腫瘍細胞中アルブミンは、肝臓癌の肝臓以外の臓器への転移を診断するためのマーカーとして使用することができる。すなわち、本発明は、腫瘍細胞中に発現するアルブミンを含む、肝臓癌の肝臓から肝臓以外の臓器への転移を診断するためのマーカーを提供する。
【００５６】
（診断用キット）
本発明は、肝臓癌を有する患者における、肝臓から肝臓以外の臓器への肝臓癌の転移の診断に用いることが可能なキットを提供し、該キットは、アルブミン遺伝子を増幅するプライマーセットを備える。該プライマーセットは、ＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅に用いることができる少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマーであることが好ましい。例えば、該プライマーセットとして、アルブミンｍＲＮＡ又は相補配列の少なくとも一部とハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを挙げることができる。
【００５７】
キットにはさらに、一般に診断キットに用いられる、担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、プローブ等の成分の他、試料の分析及び被験者における肝臓癌の転移の診断において、使用者の手引きとなる取扱説明書等の添付文書を含むことができる。
【実施例】
【００５８】
（フィルタの作製）
以下の方法により、ＣＴＣを捕捉するための金属フィルタを作製した。
感光性樹脂組成物（ＰＨＯＴＥＣ  ＲＤ−１２２５：厚さ２５μｍ、日立化成株式会社製）を６ｍｍ角の基板（ＭＣＬ−Ｅ６７９Ｆ：表面にピーラブル銅箔を貼り合わせた基板、日立化業株式会社製）の片面にロールでラミネートした。ラミネート条件はロール温度９０℃、圧力０．３ＭＰａ、コンベア速度２．０ｍ／分で行った。
【００５９】
次に、ガラスマスクを基板のフォトレジストラミネート面に静置した。ガラスマスクとして、光透過部が、同一の方向を向いた複数の角丸長方形であり、長軸及び短軸方向に一定のピッチで整列しているガラスマスクを使用した。具体的には、ガラスマスクの光透過部は、形状が角丸長方形、サイズが８×１００μｍ、光透過部間のピッチが短軸７５μｍ及び長軸１６０μｍであった。
【００６０】
続いて、６００ｍｍＨｇ以下の真空下において、ガラスマスクを載置した基板上部から紫外線照射装置によって露光量３０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射した。
【００６１】
次に、１．０％炭酸ナトリウム水溶液で現像を行い、基板上に角丸長方形のフォトレジストが垂直に立ったフォトレジスト層を形成した。このフォトレジスト層付き基板の銅露出部分に対し、ｐＨ４．５及び温度５５℃になるように調整したニッケルめっき液中で、約２０分間めっきを行い、約１８μｍのめっき層を形成した。ニッケルめっき液の組成を表２に示す。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
次に、得られたニッケルめっき層を、基板表面のピーラブル銅箔と共に基板から剥離した。その後、薬液（メックブライトＳＦ−５４２０Ｂ、メック株式会社）を用いて、温度４０℃で約１２０分間、攪拌処理することにより、ニッケルめっき層とピーラブル銅箔の複合体からピーラブル銅箔を化学的溶解して除去し、金属フィルタとなる自立膜（６ｍｍ×６ｍｍ）を取り出した。
【００６４】
最後に、自立膜内に残ったフォトレジストを温度６０℃で約４０分間、レジスト剥離液（Ｐ３  Ｐｏｌｅｖｅ、Ｈｅｎｋｅｌ製）中での超音波処理によって除去し、微細貫通孔を有する金属フィルタを作製した。作製した金属フィルタは、十分な精度の貫通孔を有し、シワ・折れ・キズ・カール等のダメージがなかった。
【００６５】
次に、酸性脱脂液（Ｚ−２００、ワールドメタル製）に金属フィルタを、４０℃で３分間浸漬し、金属フィルタ上の有機物の除去を行った。
【００６６】
水洗後、非シアン系の無電解Ａｕめっき液であるＨＧＳ−１００（日立化成株式会社製）から金供給源である亜硫酸金を抜いた液により、８０℃１０分間の条件で置換金めっき前処理を行った。
【００６７】
次に、非シアン系の置換型無電解Ａｕめっき液であるＨＧＳ−１００（日立化成株式会社製）に８０℃２０分間浸漬し、置換金めっきを行った。
【００６８】
水洗後、非シアン系の還元型無電解Ａｕめっき液であるＨＧＳ−５４００（日立化成株式会社製）に６５℃１０分間浸漬し、還元金めっきを行った。水洗後乾燥を行い、最終的な金属フィルタを得た。
【００６９】
得られた金属フィルタは、６ｍｍ×６ｍｍ中に８μｍ×１００μｍの孔を３０００個有し、１８μｍの厚さを有し、表面が金メッキされた、ニッケルをベースとする金属フィルタであった。作製した金属フィルタは、図１に示す金属フィルタ２００のような形状であった。
【００７０】
（実験例１）
ヒト肝臓癌由来の細胞株である、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５を、それぞれ別の培養フラスコに入れて、二酸化炭素インキュベーター内で、３７℃で培養した。各培養フラスコに、濃度０．２５％のトリプシンＥＤＴＡを添加し、フラスコに張り付いた培養細胞をフラスコから剥離した。剥離した細胞を血球計算盤及び位相差顕微鏡を用いて計数した後、それぞれ１０個、１００個又は１０００個の細胞を、培地を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、各サンプル溶液を調製した。調製した各サンプル溶液について、以下の分析を行った。健常人１名から全血を採血し、ＥＤＴＡ−２Ｋ添加採血管に各１本あたり３ｍＬ入れた。この新鮮血液に、上記細胞数の細胞を含むサンプル溶液を添加した。この血液とサンプル溶液の混合液を、上述したフィルタを備えるＣＴＣ捕捉装置に供し、ＣＴＣ捕捉装置にて、ヒト肝臓癌由来の細胞株をフィルタ上に捕捉し、洗浄液にて洗浄した。ＣＴＣ捕捉装置のフィルタユニットから取り出したフィルタを、細胞溶解液５００μＬが予め入ったディッシュに入れ、フィルタに捕捉されている細胞を溶解した。ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙによりＲＮＡを精製し、精製されたＲＮＡからＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡをＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＴａｑＭａｎ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔを用いてプレアンプリフィケーションにより増幅し、増幅産物に対して、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＴａｑＭａｎＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＡＦＰ、ＧＰＣ３、アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子の発現量を解析した。リアルタイムＰＣＲに用いた各遺伝子のプライマーセットは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のものを用いた。プライマーセットの品名コードは、それぞれ、ＡＦＰ：ＩＤ  Ｈｓ００１７３４９０  ｍ１、ＧＰＣ３：ＩＤ  Ｈｓ０１０１８９３６  ｍ１、ＡＬＢ：ＩＤ  Ｈｓ００６０９４１１  ｍ１である。図３に各細胞株における各遺伝子の発現量を示す。ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７細胞株では、細胞数依存的にＡＦＰ、ＧＰＣ３、アルブミン遺伝子の発現量の増加を認め、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株では、細胞数依存的にＧＰＣ３、アルブミン遺伝子の発現量の増加を認めた。
【００７１】
（実験例２）
健常人群、肝硬変患者群、肝臓から他の臓器への転移のない未転移の肝臓癌患者（ステージＩ〜ＩＩＩ）群、肝臓から他の臓器への転移のある肝臓癌患者（ステージＩＶ）群の各群５名から採血した全血を、ＥＤＴＡ−２Ｋ添加採血管に入れた。これらの新鮮血液をそれぞれ３ｍＬずつ、上述したフィルタを備えるＣＴＣ捕捉装置に供し、ＣＴＣ捕捉装置にて、細胞をフィルタ上に捕捉し、洗浄液にて洗浄した。ＣＴＣ捕捉装置のフィルタユニットから取り出したフィルタを、細胞溶解液５００μＬが予め入ったディッシュに入れ、フィルタに捕捉されている細胞を溶解した。実験例１と同様にして、ＲＮＡを精製し、精製されたＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡをプレアンプリフィケーションとして増幅した。増幅産物に対して、リアルタイムＰＣＲを行い、ＡＦＰ、ＧＰＣ３、アルブミン遺伝子の発現量を解析した。図４に、各群の捕捉した細胞における各遺伝子の発現量を示す。健常人群、肝硬変患者群及び未転移の肝臓癌患者群では、ＡＦＰ、ＧＰＣ３及びアルブミン遺伝子の有意な発現が認められなかった。一方、肝臓から他の臓器への転移のある肝臓癌患者群では、ＡＦＰ及びＧＬＰ３遺伝子については有意な発現が認められなかったが、アルブミン遺伝子については有意な発現が確認された。
【００７２】
実験例２の結果は、腫瘍細胞試料中のアルブミン遺伝子の発現を指標として、肝臓癌の肝臓から他の臓器への転移の有無を診断できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によって得られたデータを利用することにより、肝臓癌の転移を早期に発見し、適切な治療方針の決定を行うことが可能となる。
【符号の説明】
【００７４】
１…フィルタユニット、３、６…処理液流路、４…サンプル流路、５…処理液収納容器、８…選択バルブ、１０…リザーバー、１２，１３…ピンチバルブ、１４…ペリスタポンプ、１６…廃液タンク、４８…制御部、４９…選択バルブドライバ、５０…バルブドライバ、５１…ポンプドライバ、１００…ＣＴＣ捕捉装置、１１０…貫通孔、１２０…薄膜、２００…フィルタ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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