(57)【要約】      （修正有）【課題】休眠がん細胞に有効な抗がん剤の提供。【解決手段】下式（１）で表される化合物若しくはその塩を有効成分として含む、がんの治療用医薬組成物。2019019057.tif 000006［Ｒ１はメチレン基又はＣ１〜３のアルキル基で置換されたメチレン基；Ｒ２及びＲ３は夫々独立にアミノ基、モノアルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基；Ｒ４及びＲ５は各々独立にＨ、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基；Ｒ６及びＲ７は夫々独立にＨ、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基；Ｒ８及びＲ９は夫々独立にＨ、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基；ｎ及びｍは夫々独立に１〜４の整数］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2019019057.tif 000005
［式中、Ｒ１は、メチレン基、又は１又は２つの水素原子が炭素数１〜３のアルキル基で置換されたメチレン基であり、
ｎは１〜２０の整数であり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してアミノ基、炭素数１〜４のモノアルキルアミノ基、又は炭素数１〜４のジアルキルアミノ基であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基であり、
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基であり、
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基であり、
ｎ及びｍはそれぞれ独立して１〜４の整数である。］
で表される化合物若しくはその塩を有効成分として含む、がんの治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記Ｒ１は、メチレン基であり、
ｎは５〜１５の整数であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、又はアミノ基であり、
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、又はアミノ基であり、
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、又はアミノ基である、請求項1に記載のがんの治療用医薬組成物。
【請求項３】
前記式（１）で表される化合物がデカリニウムである、請求項１又は２に記載のがんの治療用医薬組成物。
【請求項４】
前記がんが、肺がんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のがんの治療用医薬組成物。
【請求項５】
低栄養状態及び低酸素濃度状態での培養において増殖が停止した休眠状態のＨ２２２８細胞株。
【請求項６】
ウシ胎児血清濃度１０％及び酸素濃度２１％で培養した場合の細胞内ＡＴＰ濃度の９０％以下の細胞内ＡＴＰ濃度である、請求項５に記載のＨ２２２８細胞株。
【請求項７】
（１）低栄養状態及び低酸素状態で培養する請求項５又は６の休眠状態Ｈ２２２８細胞株に、抗がん剤候補物質を接触させる工程、及び
（２）前記抗がん剤候補物質のＨ２２２８細胞株に対する抗がん活性を分析する工程
を含む、休眠がん細胞治療用物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記工程（２）における抗がん活性の分析が細胞内ＡＴＰ量の測定である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記請求項５又は６に記載のＨ２２２８細胞株の細胞内ＡＴＰ量を５０％以下に低下させる物質を含むがんの治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、休眠がん細胞治療用医薬組成物及び休眠がん細胞治療用物質のスクリーニング方法に関する。本発明によれば、休眠がん細胞の細胞死を誘導することができる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍内には血液が十分に供給されず低酸素かつ低栄養の領域が存在する。この領域には代謝と増殖を停止し、休眠状態の細胞が存在すると考えられている。「休眠がん細胞」は従来の化学療法又は放射線療法に高い抵抗性を示し、休眠状態のまま治療中も生き延びると考えられている。そして、治療が終了し、環境が改善すると、この休眠がん細胞が増殖を再開することが、がんの再発を引き起こす１つの原因と考えられている（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】「ネイチャー・レビューズ・キャンサー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ）」（英国）２００７年、第７巻、ｐ．８３４−８６４
【非特許文献２】「キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓａｒｃｈ）」（米国）２０１５年、第７５巻、ＯＦ１−ＯＦ７
【非特許文献３】「ラング・キャンサー（Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ）」（オランダ）２０１５年、第８７巻、ｐ．８９−９５
【非特許文献４】「キャンサー・ディスカバリー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）」（米国）２０１４年、第６巻、ｐ．６６２−６７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
例えば、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を含むＡＬＫ陽性肺がんでは、クリゾチニブ又はセリチニブなどの分子標的薬による治療が有効であり、がん組織が縮小することが知られている（非特許文献３）。しかしながら、ほとんどの症例で、がんが再発することが報告されており（非特許文献４）、この原因の１つとして、休眠がん細胞の関与が考えられている。
従って、本発明の目的は、休眠がん細胞に有効な抗がん剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、休眠がん細胞に有効な抗がん剤について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、デカリニウム又はデカリニウム誘導体が休眠がん細胞を死滅させることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］下記式（１）
【化１】
2019019057.tif 000002
［式中、Ｒ１は、メチレン基、又は１又は２つの水素原子が炭素数１〜３のアルキル基で置換されたメチレン基であり、ｎは１〜２０の整数であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してアミノ基、炭素数１〜４のモノアルキルアミノ基、又は炭素数１〜４のジアルキルアミノ基であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基であり、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基であり、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基であり、ｎ及びｍはそれぞれ独立して１〜４の整数である。］で表される化合物若しくはその塩を有効成分として含む、がんの治療用医薬組成物、
［２］前記Ｒ１は、メチレン基であり、ｎは５〜１５の整数であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、又はアミノ基であり、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、又はアミノ基であり、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、又はアミノ基である、［１］に記載のがんの治療用医薬組成物、
［３］前記式（１）で表される化合物がデカリニウムである、［１］又は［２］に記載のがんの治療用医薬組成物、及び
［４］前記がんが、肺がんである、［１］〜［３］のいずれかに記載のがんの治療用医薬組成物、
［５］低栄養状態及び低酸素濃度状態での培養において増殖が停止した休眠状態のＨ２２２８細胞株、
［６］ウシ胎児血清濃度１０％及び酸素濃度２１％で培養した場合の細胞内ＡＴＰ濃度の９０％以下の細胞内ＡＴＰ濃度である、［５］に記載のＨ２２２８細胞株、
［７］（１）低栄養状態及び低酸素状態で培養する請求項５又は６の休眠状態Ｈ２２２８細胞株に、抗がん剤候補物質を接触させる工程、及び（２）前記抗がん剤候補物質のＨ２２２８細胞株に対する抗がん活性を分析する工程を含む、休眠がん細胞治療用物質のスクリーニング方法、及び
［８］前記工程（２）における抗がん活性の分析が細胞内ＡＴＰ量の測定である、［７］に記載のスクリーニング方法、
［９］前記［５］又は［６］に記載のＨ２２２８細胞株の細胞内ＡＴＰ量を５０％低下させる物質を含むがんの治療用医薬組成物、
に関する。
本明細書は、
［１０］前記式（１）で表される化合物又はその塩をがんの治療を必要としている対象に有効量で投与する工程を含むがんの治療方法、
［１１］がんの治療における使用のための前記式（１）で表される化合物又はその塩、
［１２］がんの治療用医薬組成物の製造のための、前記式（１）で表される化合物又はその塩の使用、及び
［１３］前記［５］又は［６］に記載のＨ２２２８細胞株の細胞内ＡＴＰ量を５０％以下に低下させる物質を添加することを特徴とする休眠がん細胞の細胞死誘導方法、
を開示する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の医薬組成物によれば、休眠がん細胞の機能を低下させ、効果的に細胞死を誘導させることができる。
本発明のＨ２２２８細胞株を用いたスクリーニング方法によれば、休眠がん細胞に対して治療効果を示す薬剤を効果的にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】Ｈ２２２８細胞が休眠状態となる代表的な、酸素濃度及びＦＢＳ濃度を示した培養条件を示したグラフである。
【図２】休眠状態のＨ２２２８細胞に対するデカリニウムの抗がん作用を示したグラフである。
【図３】Ｈ２２２８細胞にデカリニウムを作用させた場合の、細胞内ＡＴＰ濃度を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［１］医薬組成物
本発明の医薬組成物はデカリニウム若しくはデカリニウム誘導体又はそれらの塩を有効成分として含み、休眠がん細胞を治療することができる。
【０００９】
《デカリニウム及びその誘導体》
デカリニウム誘導体は、下記式（１）で表される化合物である。
【化２】
2019019057.tif 000003
Ｒ１は、メチレン基、又は１又は２つの水素原子が炭素数１〜３のアルキル基で置換されたメチレン基であり、好ましくはメチレン基である。
ｎは１〜２０の整数であり、好ましくは２〜１８の整数であり、より好ましくは５〜１５の整数であり、更に好ましくは７〜１３の整数である。
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立してアミノ基、炭素数１〜４のモノアルキルアミノ基、又は炭素数１〜４のジアルキルアミノ基であり、より好ましくはアミノ基、炭素数１〜２のモノアルキルアミノ基、又は炭素数１〜２のジアルキルアミノ基である。Ｒ２及びＲ３は異なってもよいが、好ましくは同じ基である。
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基であり、好ましくはハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、又はアミノ基である。Ｒ４及びＲ５は、異なってもよいが、好ましくは同じ基である。
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基であり、好ましくはハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、又はアミノ基である。Ｒ６及びＲ７は、異なってもよいが、好ましくは同じ基である。
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のハロアルキル基、フェニル基、又はアミノ基であり、好ましくはハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、又はアミノ基である。Ｒ８及びＲ９は、異なってもよいが、好ましくは同じ基である。
ｎ及びｍはそれぞれ独立して１〜４の整数である。ｎ及びｍは異なってもよいが、好ましくは同じ整数である。
【００１０】
デカリニウムは、下記式（２）で表される化合物である。
【化３】
2019019057.tif 000004
【００１１】
前記化合物は、酸と製薬学的に許容しうる塩を形成しうる。かかる塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸との酸付加塩、又はギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸、ピクリン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、グルタミン酸、サリチル酸等の有機酸との酸付加塩等を挙げることができる。ある態様としては塩酸塩、又はサリチル酸塩を挙げることができる。これらの塩は常法により製造できる。
【００１２】
《がん》
本発明の医薬組成物は、限定されるものではないが、がんの進行の抑制、又はがんの退縮を目的としても用いることができる。特には、休眠がん細胞に効果的に作用することができる。本発明の医薬組成物が効果を示すがんは、限定されるものではなく、膀胱がん、乳がん、結腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、頭頚部がん、食道がん、胆嚢がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、子宮頸部がん、甲状腺がん、前立腺がん、扁平上皮がん、皮膚がん、骨がん、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍などを挙げることができる。
【００１３】
《休眠がん細胞》
本発明の医薬組成物は、休眠がん細胞の活性を低下させることができ、好ましくは休眠がん細胞を死滅させることができる。休眠がん細胞は、腫瘍組織内に存在する低酸素環境及び／又は低栄養環境などの要因により、一時的に代謝が低下し、増殖が停止した状態にある細胞であると考えられている。従って、休眠がん細胞は、既存の抗がん剤又は放射線療法に対して抵抗性があると考えられている。しかしながら、休眠がん細胞は、低酸素環境及び／又は低栄養環境から解放されると、再増殖を開始し、がんの再発の一因となると考えられている。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、限定されるものではないが、特に休眠がん細胞に効果的に作用することができる。本発明の医薬組成物は、実施例に記載のように、非小細胞肺がん由来の休眠がん細胞に対する死滅作用を示した。
また、本発明の医薬組成物は、がんの細胞内ＡＴＰ濃度を低下させることができる。細胞内ＡＴＰ濃度を低下させることによって、がん細胞、特には休眠がん細胞の活性を低下させ、休眠がん細胞を死滅させることもできる。
【００１５】
本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００１６】
本発明の医薬組成物は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００１７】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の抗腫瘍剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明における前記有効成分をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、本発明における前記有効成分を０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
本発明の医薬組成物の別の態様としては、前記デカリニウム若しくはデカリニウム誘導体又はそれらの塩に代えて、後述の休眠状態Ｈ２２２８細胞株の細胞内ＡＴＰ量を５０％以下に低下させる物質を含むものでもよい。休眠状態Ｈ２２２８細胞株の細胞内ＡＴＰ量の低下量は、５０％以下である限りにおいて、限定されるものではないが、好ましくは、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下であり、更に好ましくは２０％以下であり、最も好ましくは１０％以下である。
【００１９】
［２］休眠状態Ｈ２２２８細胞株
Ｈ２２２８細胞株は、ヒト非小細胞肺がん由来の細胞株であり、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子を有するＡＬＫ陽性肺がんである。Ｈ２２２８細胞株は、低栄養状態及び低酸素濃度状態に置かれることにより、休眠状態となることができる。休眠状態のＨ２２２８細胞株は、休眠がん細胞のモデル細胞として用いることが可能である。
本明細書において、休眠状態とは、
（１）低栄養状態及び低酸素濃度状態で増殖が顕著に抑制されること、
（２）低栄養状態及び低酸素濃度状態で死滅しないこと、
（３）栄養状態及び酸素濃度を改善することにより活性状態に回復できること（再増殖できること）を意味する。また、休眠状態の場合、細胞代謝が低下していると考えられる。例えば、細胞内のＡＴＰ濃度が通常の栄養状態及び酸素濃度状態で培養された細胞のＡＴＰ濃度と比較して低下している。具体的には、ＦＢＳ１０％及び酸素濃度２１％で培養したＨ２２２８細胞株の細胞内ＡＴＰ濃度と比較して、低栄養状態及び低酸素濃度状態で培養した休眠状態のＨ２２２８細胞株の細胞内ＡＴＰ濃度は、９０％以下であり、ある態様では８５％以下であり、ある態様では８０％以下であり、ある態様では７５％以下である。
低栄養状態とは、Ｈ２２２８細胞株の増殖が顕著に抑制され、且つ死滅しない限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、培地へのウシ胎児血清（ＦＢＳ）の添加量が０〜５．０容量％、好ましくは０．００１〜２．０容量％、より好ましくは０．０１〜１．０容量％、更に好ましくは０．０５〜０．５容量％を含む培地を用いることにより、低栄養状態とすることができる。
低酸素濃度状態とは、Ｈ２２２８細胞株の増殖が顕著に抑制され、且つ死滅しない限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、０．０１〜５．０容量％、好ましくは０．１〜３．０容量％、より好ましくは０．５〜１．５容量％の酸素濃度を低酸素濃度状態として用いることができる。
本発明の休眠状態Ｈ２２２８細胞株は、通常の栄養状態及び酸素濃度状態で培養することにより増殖を開始する能力を保持している。すなわち、本発明の休眠状態Ｈ２２２８細胞株は、例えばＦＢＳ１０％及び２１％酸素濃度で培養することにより、増殖することができる。増殖するとは、例えば３日〜６日の培養によって２００％程度まで細胞数が増加することを意味する。
【００２０】
Ｈ２２２８細胞株は、通常１０容量％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、２１容量％の酸素濃度で培養され、細胞が増殖している。実施例においては、「１容量％酸素、及び０．２容量％ＦＢＳ」、「１容量％酸素、及び０．１容量％ＦＢＳ」、「１容量％酸素、及び０容量％ＦＢＳ」の３つの条件で、Ｈ２２２８細胞株を休眠状態となることを示している。Ｈ２２２８細胞株の細胞の状態によっては、３つの条件以外で、休眠状態となることがある。Ｈ２２２８細胞株の休眠状態は、ＦＢＳ添加量が０〜５．０容量％の範囲、及び酸素濃度が０．０１〜５．０容量％の範囲を組み合わせて、Ｈ２２２８細胞株が増殖せず、且つ死滅しない条件を決定することにより、容易に実施できる。具体的には、例えばＦＢＳ添加量の０容量％、０．０１容量％、０．１容量％、１．０容量％の４段階、及び酸素濃度の０．１容量％、０．５容量％、１容量％、又は２容量％の４段階を組み合わせて培養することにより、Ｈ２２２８細胞株が増殖せず、且つ死滅しない条件を決定することができる。
【００２１】
本明細書において、Ｈ２２２８細胞株の「増殖が顕著に抑制される」とは、例えば６日又は９日の培養によって、５０％以上の細胞数の増加がないことを意味し、好ましくは３５％以上の細胞数の増加がないことであり、より好ましくは２０％以上の細胞数の増加がないことである。なお、Ｈ２２２８細胞株のダブリングタイムは約３日であり、従って通常は３日で２００％の細胞数に増加する。増殖が顕著に抑制される期間は、限定されるものではないが、例えば３日以上であり、好ましくは６日以上であり、より好ましくは９日以上である。増殖が顕著に抑制される期間の上限は、限定されず、例えば１２か月でもよく、６か月でもよく、３カ月でもよく、１ヶ月でもよい。前記の期間にわたり、増殖が顕著に抑制されることにより、本発明のスクリーニング方法に、有用に使用することができる。
本明細書において、「死滅しない」とは、例えば６日又は９日の培養によって、５０％以上の細胞数の死滅がないことを意味する。好ましくは４０％以上の細胞数の死滅がないことであり、より好ましくは３０％以上の細胞数の死滅がないことであり、更に好ましくは２０％以上の細胞数の死滅がないことである
本明細書において、「活性状態に回復できる」とは、前記の休眠状態から、通常の培養条件（１０容量％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地、２１容量％の酸素濃度）で培養した場合に、細胞の増殖が開始することを意味する。細胞の増殖は、通常の培養条件で培養した場合に、例えば３日の培養で１．５倍以上（１５０％）、好ましくは２倍以上（２００％）に細胞数が増加すればよい。
【００２２】
［３］スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、（１）低栄養状態及び低酸素状態で培養する休眠状態Ｈ２２２８細胞株に、抗がん剤候補物質を接触させる工程、及び（２）前記抗がん剤候補物質のＨ２２２８細胞株に対する抗がん活性を分析する工程を含む。本発明のスクリーニング方法によって、休眠がん細胞に対する治療効果を示す抗がん剤候補物質をスクリーニングできる。
【００２３】
（接触工程）
本発明のスクリーニング方法における接触工程は、休眠状態のＨ２２２８細胞と、試験物質とを接触させる工程である。
試験物質は、代謝変換に関連する可能性のある物質、又はそのような物質を含むものである限りにおいて限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群、又は低分子化合物を用いることができる。また、微生物の培養上清、細胞の培養上清、生体内の体液、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。
【００２４】
接触工程における細胞と試験物質との接触のタイミング、すなわち、試験物質の添加の時期は、特に限定されるものではなく、Ｈ２２２８細胞株を休眠状態にする時、すなわち低栄養状態及び低酸素濃度状態で培養を開始する時期でもよい。また、低栄養状態及び低酸素濃度状態の培養を開始した時期より後に試験物質を添加してもよい。
例えば、Ｈ２２２８細胞株に試験物質を添加する場合、限定されるものでないが、低栄養状態及び低酸素濃度状態での培養開始時〜培養開始１４日後程度に添加してもよく、好ましくは培養開始３〜９日後である。
【００２５】
試験物質の濃度も、適宜決定することができるが、試験物質が休眠がん細胞に対する抗がん作用を発揮する最適濃度があると考えられるため、何段階かに希釈して試験することが好ましい。
【００２６】
（分析工程）
本発明における分析工程において、前記抗がん剤候補物質のＨ２２２８細胞株に対する抗がん活性を分析する。
抗がん活性の分析は、抗がん剤候補物質のＨ２２２８細胞株に対する抗がん作用が判定できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えばＨ２２２８細胞の生存率の解析、Ｈ２２２８細胞の細胞内ＡＴＰ濃度の解析などを挙げることができる。
例えば、Ｈ２２２８細胞株の細胞内ＡＴＰ濃度を、陰性コントロールのＨ２２２８細胞の細胞内ＡＴＰ濃度と比較して、５０％以下に低下させる抗がん剤候補物質を抗がん作用を示すと判定することができる。抗がん剤候補物質による細胞内ＡＴＰ濃度の低下は、限定されるものではないが、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下であり、更に好ましくは２０％以下であり、最も好ましくは１０％以下である。
また、Ｈ２２２８細胞株の生存率を、陰性コントロールのＨ２２２８細胞の生存率と比較して、５０％以下に低下させる抗がん剤候補物質を抗がん作用を示すと判定することができる。抗がん剤候補物質による生存率の低下は、限定されるものではないが、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下であり、更に好ましくは２０％以下であり、最も好ましくは１０％以下である。
【００２７】
［４］治療方法
本発明のがんの治療用医薬組成物は、がんの治療方法に用いることができる。本発明のがんの治療方法は、デカリニウム若しくはデカリニウム誘導体又はそれらの塩を、がんの治療を必要としている対象に有効量投与することを特徴とするものである。
前記デカリニウム若しくはデカリニウム誘導体又はそれらの塩の投与経路、投与量、及び投与間隔などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
【００２８】
［５］がんの治療における使用のためのデカリニウム若しくはデカリニウム誘導体及びそれらの塩
前記がんの治療用医薬組成物は、がんの治療方法において用いることができる。従って、本発明のデカリニウム若しくはデカリニウム誘導体及びそれらの塩は、がんの治療方法における使用のためのものである。
前記デカリニウム若しくはデカリニウム誘導体及びそれらの塩の治療における使用量などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
【００２９】
［６］がんの治療用医薬組成物の製造のためにデカリニウム若しくはデカリニウム誘導体及びそれらの塩の使用
前記デカリニウム若しくはデカリニウム誘導体及びそれらの塩は、がんの治療用医薬の製造のために用いることができる。従って、本発明の使用は、デカリニウム若しくはデカリニウム誘導体及びそれらの塩の、がんの治療用医薬の製造のための使用である。
前記がんの治療用医薬組成物におけるデカリニウム及びそれらの塩の含有量などは、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
【００３０】
《作用》
デカリニウムが休眠がん細胞に対して抗がん活性を示す機構は、詳細には解明されていないが、以下のように考えられる。しかしながら、本発明は、以下の記載によって限定されるものではない。
デカリニウムは、細胞内のＡＴＰを減少させることができる。特に休眠状態に誘導されたがん細胞に対して、低い濃度で細胞内のＡＴＰを減少させることができる。休眠がん細胞は、増殖している細胞と比較して細胞内ＡＴＰ濃度が減少しているが、デカリニウム若しくはデカリニウム誘導体は、減少したＡＴＰ濃度を更に低下させることによって、効果的に細胞死を誘導できると考えられる。また、このＡＴＰ濃度を低下させる活性は、肺がんの休眠がん細胞のみでなく、他のがんの休眠がん細胞においても見られる現象であり、多種のがんの休眠がん細胞に有効であると考えられる。
また、デカリニウム若しくはデカリニウム誘導体の休眠がん細胞に対する抗がん活性は、前記化合物が２つのキノリン骨格を有すること、２つのキノリン骨格の間の一定の距離を有すること（Ｒ１の基が存在していること）、及びキノリン骨格にアミノ基、モノアルキルアミノ基、又はジアルキルアミノ基が結合していることによって発揮されると推定される。キノリン骨格の２つの窒素により２価の脂溶性カチオンの性質を示し、細胞内のミトコンドリアに集積すると推定される。そして、前記の特性を有することにより、ＡＴＰ産生を低下させ、休眠がん細胞に対して抗がん活性を示すと考えられる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
《実施例１》
本実施例では、休眠がん細胞の作製を試みた。
ヒト結腸がんＨＣＴ１１６細胞株、マウス結腸がんＣｏｌｏｎ−２６細胞株、ヒト肺がんＡ５４９細胞株、ヒト腎細胞がんＲＣＣ４細胞株、ヒト膵がんＳＵＩＴ−２細胞株、ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株、ヒト肺がんＨ２２２８細胞株、ヒト前立腺がんＰＣ−３細胞株を用いて、細胞を低栄養状態、及び耐酸素濃度状態で培養し、休眠状態を誘導できるかを検討した。休眠状態の指標として、（１）低栄養状態及び低酸素濃度状態で増殖しないこと、（２）低栄養状態及び低酸素濃度状態で死滅しないこと、及び（３）栄養状態及び酸素濃度を改善することにより再増殖できることを用いた。
各細胞の培養培地に、ウシ胎児血清を数段階に希釈して添加し、数段階の酸素濃度で培養を行った。培養６日後、及び９日後に細胞数を測定し、細胞の増殖及び死滅を確認した。更に、細胞ごとに、細胞が増殖せず、且つ死滅しない可能性のあるウシ胎児血清濃度及び酸素濃度を選択し、その付近のウシ胎児血清濃度及び酸素濃度を細かく設定して、実験を行った。そして、細胞が増殖せず、且つ死滅しない培養条件を確認し、９日後に、通常の培養条件に戻し、更に培養した。
その結果、ヒト肺がんＨ２２２８細胞株において、低栄養状態及び低酸素濃度状態で、細胞が増殖せず、且つ死滅しないことが確認でき、そして通常の培養条件に戻すことによって、細胞が再増殖できることが確認された。
図１に、休眠状態となる代表的な培養条件を示す。例えば１容量％酸素濃度、０．２容量％ＦＢＳ；１容量％酸素濃度、０．１容量％ＦＢＳ；又は１容量％酸素濃度、０容量％ＦＢＳの条件で、培養することで増殖が停止し、９日目に通常の培養条件に戻した時に再増殖することが可能な、休眠状態導入可能なＨ２２２８細胞を得ることができた。Ｈ２２２８細胞以外の細胞では、低栄養状態及び低酸素濃度でも増殖し、又は死滅が起きた。また、通常の培養条件に戻した時に、再増殖しない細胞もあった。
【００３３】
《実施例２》
本実施例では、実施例１で作製した休眠状態Ｈ２２２８細胞株を用いて、抗がん剤候補物質のスクリーニングを行った。
ＲＰＭＩ１６４０培地に１０容量％のＦＢＳを添加し、２１容量％の酸素濃度で培養したＨ２２２８細胞株と、ＲＰＭＩ１６４０培地に０．１容量％のＦＢＳを添加し、１容量％の酸素濃度で培養して休眠状態に導入したＨ２２２８細胞株を準備した。抗がん剤候補物質を培地に添加し、１次スクリーニングを行った。効果の見られた抗がん剤候補物質について２次スクリーニングを行った。抗がん剤候補物質を５０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．２５、０．１、０．０１μＭに希釈し、ＥＣ５０を計算した。
図２に示すように、デカリニウムは、休眠状態のＨ２２２８細胞に対して０．２４μＭのＥＣ５０を示した。一方通常状態のＨ２２２８細胞に対しては０．９７μＭのＥＣ５０を示し、休眠がん細胞に対して、特に優れた抗がん作用を示した。
【００３４】
《実施例３》
本実施例では、デカリニウムの細胞内ＡＴＰ量に対する影響を測定した。
ＲＰＭＩ１６４０培地に１０容量％のＦＢＳを添加し、２１容量％の酸素濃度で培養したＨ２２２８細胞株と、ＲＰＭＩ１６４０培地に０．１容量％のＦＢＳを添加し、１容量％の酸素濃度で培養して休眠状態に導入したＨ２２２８細胞株を準備した。培地中に０．２μＭまたは０．５μＭとなるようにデカリニウムを加え、３日後に細胞内ＡＴＰ量を測定した。
図３に示すように、デカリニウムはＨ２２２８細胞の細胞内ＡＴＰ量を低下させ、特に休眠状態のＨ２２２８細胞の細胞内ＡＴＰ量は２．４ａｍｏｌ（１細胞あたり）まで低下した。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の医薬組成物は、多種のがんに対する抗がん剤として、使用することができる。特に休眠がん細胞に効果的に作用するため、がんの再発を抑えることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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