(57)【要約】【課題】  糸状細胞構造体を製造し得る新規な製造方法の提供。【解決手段】  中空糸の内腔にスフェロイドと液体培地とを充填して細胞培養を行うことを特徴とする糸状細胞構造体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空糸の内腔にスフェロイドと液体培地とを充填して細胞培養を行うことを特徴とする糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
スフェロイドおよび液体培地が内腔に充填された中空糸を液体培地中に浸漬して、細胞培養行う、請求項１に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項３】
前記スフェロイドが２種以上の細胞を含む、請求項１または２に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項４】
前記スフェロイドの直径が５０〜８００μｍである、請求項１〜３のいずれか1項に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項５】
前記中空糸の内径が５０〜１０００μｍである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項６】
前記スフェロイドの直径に対する、前記中空糸の内径の比（中空糸の内径／スフェロイドの直径）が、１／１〜２０／１である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項７】
前記中空糸の膜面が非多孔質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項８】
前記中空糸の膜面が多孔質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項９】
前記多孔質膜面の孔径が０．００１〜１０μｍである、請求項８に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項１０】
前記中空糸の膜厚が１〜２００μｍである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項１１】
中空糸がフッ素系イオン交換樹脂からなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項１２】
前記中空糸の水に対する膨潤度が１％以上である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の糸状細胞構造体の製造方法で製造された、糸状細胞構造体。
【請求項１４】
中空糸と、前記中空糸の内腔に含まれる糸状細胞構造体とを含む、糸状細胞構造体含有中空糸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状細胞構造体の製造方法、糸状細胞構造体、および、糸状細胞構造体含有中空糸に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞組織の移植による再生医療が期待される。再生医療において、従来想定される手術形態としては、細胞シートの移植が考えられる。しかし、細胞シートの移植には疾患部位に細胞シートを張り付けるために体を切り開く必要があり、患者の体力の消耗が懸念される。
手術形態をより低侵襲にするためには、内視鏡手術に適用できるような細胞組織形態が望まれる。その場合、細胞組織形態としては、細胞の組織として機能する程度の太さをもった糸状の細胞構造体が望ましい。例えば、特許文献１においては、マイクロ流体装置を用いた方法により糸状の細胞構造体の製造が試みられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１６−７７２２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の方法では、マイクロ流体装置という特殊な装置が必要で、かつ、その装置の操作（例えば、二層の流体を制御する操作）は必ずしも容易ではない。
本発明は、糸状細胞構造体を製造し得る新規な製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、糸状細胞構造体、および、糸状細胞構造体含有中空糸を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成できることを見出した。
【０００６】
（１）  中空糸の内腔にスフェロイドと液体培地とを充填して細胞培養を行うことを特徴とする糸状細胞構造体の製造方法。
（２）  スフェロイドおよび液体培地が内腔に充填された中空糸を液体培地中に浸漬して、細胞培養行う、（１）に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（３）  スフェロイドが２種以上の細胞を含む、（１）または（２）に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（４）  スフェロイドの直径が５０〜８００μｍである、（１）〜（３）のいずれかに記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（５）  中空糸の内径が５０〜１０００μｍである、（１）〜（４）のいずれかに記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（６）  スフェロイドの直径に対する、中空糸の内径の比（中空糸の内径／スフェロイドの直径）が、１／１〜２０／１である、（１）〜（５）のいずれかに記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（７）  中空糸の膜面が非多孔質である、（１）〜（６）のいずれかに記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（８）  中空糸の膜面が多孔質である、（１）〜（６）のいずれかに記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（９）  多孔質膜面の孔径が０．００１〜１０μｍである、（８）に記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（１０）  中空糸の膜厚が１〜２００μｍである、（１）〜（９）のいずれかに記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（１１）  中空糸がフッ素系イオン交換樹脂からなる、（１）〜（１０）のいずれかに記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（１２）  中空糸の水に対する膨潤度が１％以上である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の糸状細胞構造体の製造方法。
（１３）  （１）〜（１２）のいずれかに記載の糸状細胞構造体の製造方法で製造された、糸状細胞構造体。
（１４）  中空糸と、中空糸の内腔に含まれる糸状細胞構造体とを含む、糸状細胞構造体含有中空糸。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、糸状細胞構造体を製造し得る新規な製造方法を提供できる。
本発明によれば、糸状細胞構造体、および、糸状細胞構造体含有中空糸を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１の培養後の中空糸の光学顕微鏡写真である。
【図２】実施例１で得られた糸状細胞構造体の光学顕微鏡写真である。
【図３】比較例１で得られた細胞の光学顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明における用語の意味は以下の通りである。
重合体における「単位」とは、単量体が重合して直接形成された、上記単量体１分子に由来する原子団と、上記原子団の一部を化学変換して得られる原子団との総称である。重合体が含む全単位に対する、それぞれの単位の含有量（質量％）は、重合体を固体核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）法により分析して求められるが、重合した各単量体の量から推算できる。
「スルホン酸型官能基」とは、−ＳＯ３Ｍ（ただし、Ｍは、水素原子、アルカリ金属カチオンまたは第４級アンモニウムカチオンである。）で表されるスルホン酸基またはスルホン酸塩基を意味する。
「カルボン酸型官能基」とは、−ＣＯＯＭ（ただし、Ｍは、水素原子、アルカリ金属カチオンまたは第４級アンモニウムカチオンである。）で表されるカルボン酸基またはカルボン酸塩基を意味する。
細胞との親和性の観点から、中空糸を事前に中和処理してカルボン酸型官能基、スルホン酸型官能基の水素原子を金属イオンに置換しておくことが望ましい。具体的には、細胞培養前に中空糸を細胞培養液に浸漬する処理が考えられる。
【００１０】
本発明の製造方法の特徴点としては、中空糸の内腔にスフェロイドおよび液体培地を充填して、細胞培養を行う点が挙げられる。まず、スフェロイドを用いる場合、中空糸内において細胞の生存率が高く、糸状細胞構造体が得られやすい。また、単細胞を用いて糸状細胞構造体を作製しようとすると単細胞すべてが互いに接着する必要があるのに対して、本発明では単細胞の塊であるスフェロイド同士が接着することで糸状細胞構造体が形成されるため、より短期間での糸状細胞構造体を作製できる。さらに、スフェロイドを中空糸に充填すると、中空糸内壁とスフェロイド間およびスフェロイド同士間にできる隙間の存在により、物質の拡散性が高くなり、栄養の供給や代謝物の排出の効率がよくなると考えられる。なお、単細胞を中空糸に充填すると、中空糸内壁と単細胞間および単細胞同士間の隙間がほとんどなく、物質の拡散性が低くなると考えられる。また単細胞に対してコラーゲンなどの足場材料とともに充填すると物質の拡散性は高くなるが細胞同士が接着するまでに時間がかかることが考えられる。また細胞によって適切な足場材料を選択する必要があるため汎用性に乏しい。
【００１１】
本発明の製造方法においては、中空糸の内腔にスフェロイドと液体培地とを充填して細胞培養を行う。
本製造方法の一実施形態は、中空糸の内腔にスフェロイドおよび液体培地を充填する工程Ａと、スフェロイドが内腔に充填された中空糸を液体培地中に浸漬して、細胞培養を行う工程Ｂとを有する。
以下、工程Ａおよび工程Ｂの手順について、詳述する。
【００１２】
＜工程Ａ＞
工程Ａは、中空糸の内腔にスフェロイドおよび液体培地を充填（収容）する工程である。
以下では、まず、本工程で使用される部材および材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
【００１３】
本発明における中空糸としては、物質透過材料からなる非多孔質の膜面を有する中空糸、多孔質の膜面を有する中空糸、物質透過材料からなる多孔質の膜面を有する中空糸等が挙げられる。
物質透過材料としては、水、酸素、二酸化炭素、アンモニア等の低分子物質を透過しうる材料や、酸素イオン、ハロゲンイオン、金属イオン等の低分子イオンを透過しうる材料が挙げられる。
多孔質の膜面における孔の孔径は、スフェロイドや細胞は通過させないが、水、塩類、蛋白質などの液体培地成分は通過させる孔径であることが好ましい。孔径としては、０．００１〜１０μｍが好ましく、０．０１〜１０μｍがより好ましく、０．０１〜１μｍがより好ましい。
中空糸の内径は、糸状細胞構造体が得られやすい点で、５０〜１０００μｍが好ましく、１００〜５００μｍがより好ましい。
中空糸の膜厚（中空糸の外径と内径との差の１／２に該当）としては、糸状細胞構造体が得られやすい点で、１〜２００μｍが好ましく、１０〜１５０μｍがより好ましく、１０〜１００μｍがさらに好ましい。非多孔質膜面を有する中空糸の場合は、その膜厚は、１０〜１５０μｍであることが好ましい。
【００１４】
物質透過材料が気体に対する透過性を有する場合、その透過性は、空気に対して１０ｐｍｏｌ／ｓ／ｃｍ２以上が好ましく、６００ｐｍｏｌ／ｓ／ｃｍ２以上がより好ましい。
【００１５】
物質透過材料としては、水に対する膨潤度を有する材料が、水、塩類、蛋白質などの液体培地成分が通過する点で好ましい。中空糸の水に対する膨潤度は、細胞培養が良好に進行する点で、１％以上が好ましく、５％以上がより好ましい。中空糸の水に対する膨潤度は、２００％以下が好ましく、１００％以下がより好ましい。膨潤度が好ましい範囲の下限以上の場合、液体の透過性が高くなり、膨潤度が好ましい範囲の上限以下の場合、中空糸の取り扱い性に優れる。
中空糸の膨潤度は、以下の方法により測定する。
真空乾燥により２４時間乾燥したサンプルの重量をＡとしてサンプルを室温下でＡの重量に対して１０００倍の水中に２４時間浸漬後の質量をＢとして膨潤度＝｛（Ｂ／Ａ）−１｝×１００％と定義した。
【００１６】
中空糸を構成する材料の具体例としては、イオン交換樹脂、フッ素樹脂、セルロース系材料（例えば、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、再生セルロース）、ポリスルホン系材料（例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリメタアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアミドが挙げられる。なかでも、糸状細胞構造体が得られやすい点で、フッ素系イオン交換樹脂が好ましい。
中空糸は、１種の材料のみで構成されていてもよく、２種以上の材料で構成されていてもよい。
【００１７】
中空糸を構成する材料としては、細胞培養が良好に進行する点で、イオン交換樹脂が好ましく、糸状細胞構造体の回収しやすさの観点から、フッ素系イオン交換樹脂が好ましい。
イオン交換基の具体例としては、スルホン酸型官能基およびカルボン酸型官能基が挙げられ、本発明の効果がより優れる点から、スルホン酸型官能基が好ましい。
イオン交換樹脂のイオン交換容量は、細胞培養が良好に進行する点で、０．１〜５ミリ当量／グラム乾燥樹脂が好ましく、０．５〜３ミリ当量／グラム乾燥樹脂がより好ましい。
【００１８】
フッ素系イオン交換樹脂は、含フッ素オレフィンに基づく単位およびスルホン酸型官能基またはカルボン酸型官能基を有する単位を含む含フッ素ポリマーが好ましい。
含フッ素オレフィンとしては、例えば、分子中に１個以上のフッ素原子を有する炭素数が２〜３のフルオロオレフィンが挙げられる。フルオロオレフィンの具体例としては、テトラフルオロエチレン（以下、「ＴＦＥ」ともいう。）、クロロトリフルオロエチレン、フッ化ビニリデン、フッ化ビニル、ヘキサフルオロプロピレンが挙げられる。
含フッ素オレフィンは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
スルホン酸型官能基またはカルボン酸型官能基を有する単位としては、式（１）または式（２）で表される単位が好ましい。
式（１）    −［ＣＦ２−ＣＦ−Ｌ−（ＳＯ３Ｍ）ｎ］−
式（２）    −［ＣＦ２−ＣＦ−Ｌ−（ＣＯ２Ｍ）ｎ］−
【００２０】
Ｌは、エーテル性酸素原子を含んでいてもよいｎ＋１価のペルフルオロ炭化水素基である。
エーテル性酸素原子は、ペルフルオロ炭化水素基中のＣＦ側末端に位置していても、炭素原子−炭素原子間に位置していてもよい。
ｎ＋１価のペルフルオロ炭化水素基中に炭素数は、１以上が好ましく、２以上がより好ましく、２０以下が好ましく、１０以下がより好ましい。
【００２１】
Ｌとしては、エーテル性酸素原子を含んでいてもよいｎ＋１価のペルフルオロ脂肪族炭化水素基が好ましく、ｎ＝１の態様である、エーテル性酸素原子を含んでいてもよい２価のペルフルオロアルキレン基、または、ｎ＝２の態様である、エーテル性酸素原子を含んでいてもよい３価のペルフルオロ脂肪族炭化水素基がより好ましい。
上記２価のペルフルオロアルキレン基は、直鎖状および分岐鎖状のいずれであってもよい。
【００２２】
Ｍは、水素原子、アルカリ金属カチオンまたは第４級アンモニウムカチオンである。
ｎは、１または２である。
【００２３】
含フッ素ポリマーは、含フッ素オレフィンに基づく単位、並びに、スルホン酸型官能基またはカルボン酸型官能基を有する単位以外の単位を含んでいてもよい。
他の単位の具体例としては、ＣＦ２＝ＣＦＲｆ５（ただし、Ｒｆ５は炭素数２〜１０のペルフルオロアルキル基である。）に基づく単位、ＣＦ２＝ＣＦ−ＯＲｆ６（ただし、Ｒｆ６は炭素数１〜１０のペルフルオロアルキル基である。）に基づく単位、ＣＦ２＝ＣＦＯ（ＣＦ２）ｖＣＦ＝ＣＦ２（ただし、ｖは１〜３の整数である。）に基づく単位等が挙げられる。
他の単位の含有量は、イオン交換性能の維持の点から、含フッ素ポリマー中の全単位に対して、３０質量％以下が好ましい。
【００２４】
中空糸の材料としては、ＴＦＥに基づく単位と、式（１）で表されるスルホン酸型官能基または式（２）で表されるカルボン酸型官能基を有する単位とを含む含フッ素ポリマーからなるフッ素系イオン交換樹脂が好ましく、ＴＦＥに基づく単位および式（１）で表されるスルホン酸型官能基を有する単位を含む含フッ素ポリマーからなるフッ素系イオン交換樹脂がより好ましい。
【００２５】
スフェロイドとは、細胞が多数凝集して細胞塊を形成し、３次元状態を形成しているものをいう。スフェロイドの形状は、通常、球形に近い。
スフェロイドの直径としては、取り扱い性が良好で、細胞培養が良好に進行する点で、５０〜８００μｍが好ましく、５０〜５００μｍがより好ましく、７０〜４００μｍがさらに好ましい。
スフェロイドの直径は、光学顕微鏡によってスフェロイドを観察することにより求められる。なお、スフェロイドの形状が真円状でない場合は、長径を直径とする。
なお、スフェロイドの直径に対する、中空糸の内径の比（中空糸の内径／スフェロイドの直径）は、細胞培養が良好に進行する点で、１／１〜２０／１が好ましく、１．１／１〜１５／１がより好ましい。
【００２６】
スフェロイドを構成する細胞の種類としては、ヒトを含む哺乳動物の細胞が挙げられ、例えば、体細胞、その前駆細胞、およびそれらの混合細胞が挙げられる。細胞の具体例としては、内皮細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、歯髄幹細胞、心筋細胞、心臓壁細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、肝前駆細胞、間葉系細胞、膵島細胞、軟骨細胞、上皮細胞が挙げられる。
スフェロイドは、１種の細胞のみで構成されていても、２種以上の細胞で構成されていてもよい。特に、２種以上の細胞を含むスフェロイドを用いると、２種以上の細胞を含む糸状細胞構造体を容易に製造できる。
【００２７】
スフェロイドの形成方法としては、例えば、（１）Non-adhesive surface細胞培養法、（２）Hanging drop細胞培養法、（３）Micromolding techniquesの利用、（４）Rotary細胞培養法が挙げられる。
上記（１）は、浮遊培養法とも称され、非接着性の底面を持つ培養プレートを用いて細胞を培養し、培地中で浮遊する細胞同士を接着させて、スフェロイドを形成する方法である。
上記（２）は、微量細胞懸濁液をカバーガラス等に滴下し、このカバーガラス等を反転してできる液滴中でスフェロイドを形成させる方法である。
上記（３）は、均一なサイズのマイクロウェルが多数並んだアレイ（スフェロイドアレイ）を用い、各ウェル中で細胞を培養する方法である。上記アレイの具体例としては、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（スフェロイド形成培養用容器、ＩＷＡＫＩ社製容器）やＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（スフェロイド形成培養用容器、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製容器）、Ｅｌｐｌａｓｉａ（スフェロイド形成培養用容器、クラレ社製容器）が挙げられる。
上記（４）は、培地を含む細胞培養チャンバーを回転させながら大量の細胞を培養して、スフェロイドを形成する方法である。
【００２８】
液体培地は、通常用いられる細胞培養培地から、培養する細胞に応じて適宜選択できる。細胞培養培地の具体例としては、ダルベッコ改変イーグル培地、ＭＥＭ−α、ＲＰＭＩ１６４０が挙げられる。
また、これらの液体培地に対しては、必要に応じて、血清、各種ビタミン、各種抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン）などの細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。
なお、液体培地には、水が含まれる場合が多い。一般的に、液体培地は、栄養分を水に溶解させて得られる。
【００２９】
中空糸の内腔にスフェロイドを充填する方法としては、スフェロイドを含む液体培地を中空糸の内腔に充填する方法が挙げられる。充填操作は、スフェロイドを含む液体培地に圧力を加えることにより中空糸内に送る方法や、シリンジ等を用いて中空糸内に充填する方法が挙げられる。
また、スフェロイドを充填する前に、中空糸中の内腔を液体培地、細胞保存液、バッファーで満たしてもよい。
なお、通常、使用される中空糸の一端は封止され、他端は開口している。
【００３０】
＜工程Ｂ＞
工程Ｂは、工程Ａで得られたスフェロイドおよび液体培地が内腔に充填された中空糸（以後、「特定中空糸」ともいう。）を液体培地中に浸漬して、細胞培養を行う工程である。本工程を実施することにより、中空糸の内腔で細胞培養が進行し、スフェロイド間が連結し、糸状の細胞構造体が製造される。
以下では、まず、本工程で使用される材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
【００３１】
液体培地としては、工程Ａで用いられる液体培地が挙げられる。
【００３２】
本工程では、特定中空糸を液体培地中に浸漬して、細胞培養を行う。液体培地中に特定中空糸が浸漬された際には、中空糸の膜を介して液体培地および気体が特定中空糸の内部に供給される。
【００３３】
細胞の培養条件は、細胞の種類に応じて適宜最適な条件を選択できる。例えば、培養温度は、通常、約３０〜４０℃程度の場合が多く、約３７℃が好ましい。培養は、例えば、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われ、ＣＯ２濃度は、例えば２〜５％である。培養時間は、例えば、１〜１０日間である。
なお、気体を供給しながら、細胞培養を行ってもよい。供給される気体の具体例としては、酸素、窒素、一酸化窒素、二酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、硫化水素が挙げられる。
【００３４】
上記工程Ｂによって、中空糸の内腔に糸状細胞構造体が製造される。
製造された糸状細胞構造体は、中空糸内の圧力を加えることにより、中空糸内より押し出して、回収できる。
糸状細胞構造体とは、アスペクト比が３以上の細胞構造体を意図する。糸状細胞構造体のアスペクト比は、５以上が好ましく、１０以上がより好ましい。
なお、上記アスペクト比の算出方法は以下の通りである。
光学顕微鏡にて被観察物である細胞構造体を観察し、細胞構造体に外接する平行二直線のうち、平行二直線間距離が最大となるように選ばれる平行二直線間の距離を長径とし、長径を与える平行二直線に直交し且つ細胞構造体に外接する平行二直線のうち、平行二直線間距離が最大となるように選ばれる平行二直線間距離を短径とした場合に、長径および矩径を算出して、アスペクト比（長径／矩形）を求める。
糸状細胞構造体の長径は、各種用途への応用の点から、１５０μｍ以上が好ましく、１０００μｍ以上がより好ましい。
【００３５】
なお、上記実施態様では工程Ａを実施する手順について述べたが、本発明においては、スフェロイドが内腔に充填された中空糸を別途購入して、上記工程Ｂを実施してもよい。
また、上記実施態様では工程Ａの際に中空糸にスフェロイドおよび液体培地を充填する手順について述べたが、本発明においては中空糸の内腔で細胞培養が実施できればよく、例えば、内腔にスフェロイドは含まれるが、液体培地は含まない中空糸を用意して、得られた中空糸を液体培地中に浸漬して、中空糸の膜を介して、液体培地を中空糸の内腔に供給して、中空糸の内腔にスフェロイドと液体培地とが充填された状況を作り出し、細胞培養を行う方法であってもよい。つまり、スフェロイドが内腔に充填された中空糸を液体培地中に浸漬して、細胞培養を行う方法であってもよい。
【００３６】
製造された糸状細胞構造体は種々の用途に適用可能であり、例えば、疾患部位への移植手術など再生医療分野の治療、組織状態での薬効試験などの創薬研究、糸状細胞構造体を巻いたり配列させたりすることによる３次元組織形成などが挙げられる。
本発明の糸状細胞構造の製造方法による製造過程で、糸状細胞構造体を内腔内に有する中空糸が得られる。言い換えれば、中空糸と、中空糸の内腔に含まれる糸状細胞構造体とを含む、糸状細胞構造体含有中空糸が得られる。該中空糸は、そのままの形状で細胞輸送容器としても使用できる。従来、細胞シートの輸送では輸送中にシートの剥離がおきて使用できなくなる課題があった。中空糸内は周りに壁が存在するため剥離したとしても糸状細胞構造が維持され、輸送安定性が高い。
また、人工すい臓のように細胞組織の分泌物を中空糸壁から徐放させる治療法などに用いることもできる。
【実施例】
【００３７】
以下に、実施例および比較例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００３８】
＜製造例１＞
ＴＦＥとＣＦ２＝ＣＦＯＣＦ２ＣＦ２ＳＯ２Ｆを共重合させて、イオン交換容量１．１ミリ当量／グラム乾燥樹脂のパーフルオロ系イオン交換樹脂の前駆体を得、これを、押し出し機とドーナツ状ダイを用いて２３０℃で押し出し成形し、中空糸を得た。光学顕微鏡で観察した結果、中空糸の外径は６５０μｍ、内径は４５０μｍであった。この中空糸を、３０質量％のジメチルスルホキシドと１１質量％の水酸化カリウムを含む水溶液中に６０℃で３０分間浸漬し、末端基をＳＯ３Ｋとした後、１規定の硫酸水溶液中に５０℃で３０分間浸漬して末端基をＳＯ３Ｈとした。次いで、この中空糸を８０℃の恒温槽内で３０分乾燥し全長１０ｃｍの中空糸１を得た。この中空糸は、物質透過材料からなる非多孔質の膜面を有する中空糸である。
【００３９】
＜実施例１＞
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞“ＭＳＣ”（タカラ社製、Ｃ−１２９７７）をＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２（タカラ社製）を用いて増殖させた後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理して、単一細胞状態に分散したＭＳＣを得た。
【００４０】
次に、上記で作製した細胞数２，８００，０００個のＭＳＣをＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＩＷＡＫＩ社製、♯４０２０−９００）に播種して、２日間培養することにより、スフェロイドを作製した。
スフェロイドの直径は、１００μｍであった。
【００４１】
次に、ＥＸＳＰＨＥＲＥからスフェロイドを回収して、シリンジを用いて、得られたスフェロイドが分散した液体培地Ｘを中空糸の内腔に導入して、中空糸の内腔にスフェロイドを充填した後、中空糸を液体培地Ｘ中に浸漬して、２日間培養を行った。培養時の温度は３７℃であった。
なお、上記中空糸としては、中空糸１をＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２（タカラ社製）に３時間程度浸漬したものを用いた。この中空糸の膨潤度は１６％であった。
上記液体培地Ｘとしては、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２（タカラ社製）を用いた。
【００４２】
培養後、得られた中空糸を光学顕微鏡で観察したところ、糸状細胞構造体が観察された（図１参照）。
次に、シリンジを用いて中空糸内部に圧力をかけて、中空糸から糸状細胞構造体を押し出した（図２）。得られた糸状細胞構造体のアスペクト比は、およそ５であった。
【００４３】
中空糸から押し出した糸状細胞構造体を、ＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ社製）を用いて染色したところ、糸状細胞構造体全体がＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭで染色された生細胞であった。
【００４４】
＜実施例２＞
ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞（ｈｉＰＳ−ＣＭ，ｐｕｒｉｔｙ＝９６％）を、手順に従って作製した。
【００４５】
＜心筋分化培地の調製＞
培地は全て当日に調製し、使用前に３７℃のウォーターバスで１０分間以上温めた。
分化誘導に用いる基礎培地としては、「ＳｔｅｍＰｒｏ−３４」（Thermo Fisher Scientific社製、製品番号：10639-011）に、ペニシリン／ストレプトマイシン混合剤「Pen/Strep（10U/L）」（Thermo Fisher Scientific社製、製品番号：15140-122）を最終濃度１％となるように、Ｌ−グルタミン（Thermo Fisher Scientific社製、製品番号：25030-081）を最終濃度１％となるように、トランスフェリン「holo-Transferrin human」（Sigma社製、製品番号：T0665-100MG）を最終濃度０．５％となるように、アスコルビン酸（Sigma社製、製品番号：A92902-100MG）を最終濃度３．９×１０−５％となるように、ＭＴＧ（モノチオグリセロール）（Sigma社製、製品番号：M6145-25ML）を最終濃度０．３％となるように、それぞれ添加した改変培地（ｍＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地）を用いた。アスコルビン酸は、使用直前に解凍したものを添加した。
【００４６】
ＥＢ（胚様体）形成培地としては、ｍＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地に、ＢＭＰ４を最終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるように、Ｙ−２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を１０μＭとなるように、それぞれ添加した培地を用いた。
【００４７】
中胚葉ステージの分化誘導培地（中胚葉形成用培地）としては、ｍＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地に、ＢＭＰ４を最終濃度２０ｎｇ／ｍＬとなるように、ｂＦＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように、アクチビンＡを最終濃度１２ｎｇ／ｍＬとなるように、それぞれ添加した培地を用いた。
【００４８】
心前駆細胞ステージの分化誘導培地（心前駆細胞形成用培地）としては、ｍＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地に、ＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように、ＩＷＰ４を最終濃度２．５μＭとなるように、それぞれ添加した培地を用いた。
【００４９】
心筋成熟ステージの分化誘導培地（心筋成熟細胞形成用培地）としては、ｍＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地に、ＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように、ｂＦＧＦを最終濃度５ｎｇ／ｍＬとなるように、それぞれ添加した培地を用いた。
【００５０】
＜心筋細胞の作製手順＞
ｉＰＳ細胞から心筋細胞へ分化させたスフェロイドを形成させた。ｉＰＳ細胞からの心筋分化は、Lei Yangらの方法（Nature，2008，vol.453，p.524-528）を改良して行った。「分化Ｘ日目」とは、シングルセル化したｉＰＳ細胞の細胞懸濁液をスフェロイド形成用培養容器に播いた時点からの経過日数を意味する。
【００５１】
＜胚葉体形成＞
８０〜１００％コンフルエントに達したｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株（ｉＰＳアカデミア社製）を、Ｔ２５Ｆｌａｓｋ（ＡＧＣテクノグラス社製）ひとつ当たり２．５ｍＬのＤＰＢＳで洗浄した後、２．５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔを加え、４分間３７℃でインキュベートした後にＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔを吸引除去した。次いで、Ｔ２５Ｆｌａｓｋひとつ当たり２．５ｍＬのＥＢ形成培地を加え、セルスクレーパーでｉＰＳ細胞を剥し、２〜５回ピペッティングしてｉＰＳ細胞をシングルセル化した。得られたｉＰＳ細胞の懸濁液を、遠心処理（１００×ｇ、４分間）し、上清を除去した後、ＥＢ形成培地を加え、ＴＣ２０（登録商標）全自動セルカウンター（Bio-Rad社製）で細胞数を測定した（粒径：８〜３０μｍ）。
【００５２】
調製したｉＰＳ細胞の細胞懸濁液を、スフェロイド形成用培養容器の「EZSPHERE 100mmDish」（ＡＧＣテクノグラス社製、製品番号：4020-900）（以下、「EZSPHERE #4020-900」という。）に、ディッシュ当たり、３×１０６細胞、培地量１０ｍＬとなるよう分注した。ｉＰＳ細胞を播いたディッシュを、タテヨコに揺らして、細胞をディッシュ内に均等に分散させた後、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で２４時間静置した。
【００５３】
＜中胚葉分化フェーズ＞
ｉＰＳ細胞を播いてから２４時間±２時間の間に、各ディッシュに、既に添加したＥＢ形成培地と等量の中胚葉形成用培地を添加し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で３日間インキュベートした。
【００５４】
＜心前駆細胞分化フェーズ＞
中胚葉分化フェーズ後（分化４日目）、各ディッシュからスフェロイドを崩さない様に優しく培地ごと１５ｍＬ容または５０ｍＬ容のチューブに移した。次いで、スフェロイドを沈殿させるため、該チューブを３７℃で２〜１０分間静置した後、注意深く培地上清を除去した。該チューブ内のスフェロイドに、ＩＭＤＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）培地を加え、遠心処理（５０×ｇ、３分間、室温）した後、注意深く上清を除去した。その後、該チューブに、２０ｍＬの心前駆細胞形成用培地を加え、100mm低接着ディッシュ「EZ-bindshut II」（ＡＧＣテクノグラス社製、製品番号：4020-800LP）（以下、「EZSPHERE #4020-800LP」という。）に移し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で２日間インキュベートした。
【００５５】
＜スフェロイドの再凝集＞
心前駆細胞分化フェーズ後（分化６日目）、各ディッシュからスフェロイドを培地ごと５０ｍＬ容チューブに回収し、スフェロイドを沈殿させるため、該チューブを３７℃で２〜１０分間静置した後、注意深く培地上清を除去した。該チューブ内のスフェロイドに、ＤＰＢＳを加え、遠心処理（５０×ｇ、３分間、室温）した後、注意深く上清を除去した。その後、該チューブに、細胞分散液（Ａｃｃｕｔａｓｅ）を加え、３７℃で８分間インキュベートした。該チューブは、このインキュベート時間中、４分毎にボルテックスミキサーで揺らした。インキュベート後、該チューブを１〜２分間静置して、大きな塊を沈殿させ、小さく分散した細胞だけを回収した（１回目の細胞懸濁液）。沈殿した大きな塊に対して、該細胞分散液を添加して同様の操作を繰り返して細胞をばらばらにした後、小さく分散した細胞だけを回収し（２回目の細胞懸濁液）、１回目の細胞懸濁液と混合した後、当量の心筋成熟細胞形成用培地を加えて遠心処理（２００×ｇ、４分間）し、上清を除去した。次いで、沈殿した細胞に適量の心筋成熟細胞形成用培地を加えて、ＴＣ２０（登録商標）全自動セルカウンター（Bio-Rad社製）で細胞数を測定した（粒径：８〜３０μｍ）
【００５６】
＜心筋成熟フェーズ＞
得られた細胞懸濁液を、心筋成熟細胞形成用培地を用いて、３．４×１０５細胞／ｍＬに調製した。各細胞懸濁液を、スフェロイド形成用培養容器の「EZSPHERE １００mmDish」（ＡＧＣテクノグラス社製、特注品）（以下、「EZSPHERE #4020-903」という。）に、ディッシュ当たり１８ｍＬずつ分注した。該ディッシュを、タテヨコに５回ずつ揺らして、細胞をディッシュ内に均等に分散させた後、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で８日間インキュベートし、心筋成熟細胞のスフェロイドを得た。インキュベート中、２〜３日毎に、同じ組成の培地で半量培地交換を行った。培地交換は、ディッシュを１５〜３０°位傾けて、培地をゆっくりと９ｍＬ除いた後、新しい培地を９ｍＬ、ゆっくりと加えることにより行った。分化１４日目まで培養した。
【００５７】
＜心筋細胞のシングルセル分散＞
心筋成熟フェーズ後の細胞を（分化１４日目）スフェロイドの再凝集と同様にして、シングルセル分散した。だだし、分散液にはAccumax : 0.05% Trypsin/EDTA= 1 : 3で混合したものを使用した。
【００５８】
液体培地中において、上記で作製した心筋細胞と、別途用意した正常ヒト心室線維芽細胞（ＮＨＣＦ，ＬＯＮＺＡ）とを、心筋細胞：正常ヒト心室線維芽細胞＝７５：２５の比で混合して、混合細胞を得た。
なお、液体培地としては、ＦＢＳ（ＭＰ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を最終濃度１０％、ペニシリン−ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を最終濃度１０Ｕ／ｍＬとなるように添加したＤ−ＭＥＭ（ナカライテスク社製）を用いた。なお、以後、この液体培地を、液体培地Ｙともいう。
【００５９】
次に、上記で作製した混合細胞をＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＩＷＡＫＩ社製、♯４０００−９００）に播種して、１日培養することにより、スフェロイドを作製した。
スフェロイドの直径は、約２００μｍであった。
【００６０】
次に、ＥＺＳＰＨＥＲＥからスフェロイドを回収して、シリンジを用いて、得られたスフェロイドが分散した液体培地Ｙを中空糸の内腔に導入して、中空糸の内腔にスフェロイドを充填した後、中空糸を液体培地Ｙ中に浸漬して、５日間培養を行った。培養時の温度は３７℃であった。
上記中空糸としては、中空糸１を液体培地Ｙに２４時間浸漬したものを用いた。この中空糸の膨潤度は１６％であった。
培養後、得られた中空糸を光学顕微鏡で観察したところ、糸状細胞構造体が観察され、長さ方向に収縮運動していた。
次に、シリンジを用いて中空糸内部に圧力をかけて、中空糸から糸状細胞構造体を押し出した。得られた糸状細胞構造体のアスペクト比は、およそ５であった。得られた糸状細胞構造体は長さ方向に収縮運動していた。
【００６１】
＜比較例１＞
中空糸としてガラスキャピラリー外径0.8×内径0.4ｍｍ（富士理化工業株式会社）を用い、かつ、スフェロイドを中空糸の内腔に充填する操作の代わりに単一細胞状態に分散したＭＳＣを直接中空糸の内腔に充填する操作を実施した以外は、上記実施例１と同様の手順により、中空糸内の細胞の培養を行った。
培養後の中空糸の内腔に含まれる細胞を押し出したところ、糸状細胞構造体は得られなかった（図３参照）。
中空糸から押し出した細胞群を、ＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ社製）を用いて染色したところ、細胞群全体がＥｔｈＤ−ＩＩＩで染色された死細胞であった。
【００６２】
なお、本研究は国立研究開発法人日本医療研究開発機構（ＡＭＥＤ）の再生医療実現拠点ネットワークプログラムの支援を受けて行われた。
【図１】
2019146510.tif 000002
【図２】
2019146510.tif 000003
【図３】
2019146510.tif 000004