(57)【要約】      （修正有）【課題】操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物、及び前記構成物を成形する方法の提供。【解決手段】構成物は１つ以上の層を含み、各層は１つ以上の肝細胞型を含み、生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために１つ以上の層が凝集する。構成物は、平面構造を作成するために細胞型が互いに近傍になるよう空間的に配置されている、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層、及び少なくとも１つの層が少なくとも１つの他の層と組成上又は構造上異なる複数の層、の少なくとも１つを有することを特徴とする。構成物のアレイ及び製造方法もさらに開示されている。組織のインビボでの送達又は体外デバイスにおける組織の利用による、１つ以上の肝臓の機能の強化又は回復のために使用される操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物がさらに開示されている。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物であって、
該構成物は、平面構造を定義する少なくとも１つの区画を備え、該区画は境界によって定義される内部を含み、該内部は実質細胞を含み、該境界は非実質細胞を含み、
細胞は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集し、
該構成物の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされ、該構成物は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にないように提供される、構成物。
【請求項２】
実質細胞は、成体の哺乳類の肝臓組織、胎児の哺乳類の肝臓組織、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞、肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞、及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞のソースの１つ以上に由来することを特徴とする、請求項１記載の構成物。
【請求項３】
非実質細胞は、血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞 、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞の１つ以上を含むことを特徴とする、請求項１記載の構成物。
【請求項４】
複数の層を含むことを特徴とする、請求項１記載の構成物。
【請求項５】
層構造を作成するために、少なくとも１つの層が少なくとも１つの他の層と組成上又は構造上異なることを特徴とする、請求項４記載の構成物。
【請求項６】
ヒトの中の１つ以上の肝機能の強化で使用するためのものであることを特徴とする、請求項１記載の構成物。
【請求項７】
損傷、疾患あるいは変性の部位での被験体における移植のためのものであることを特徴とする、請求項６記載の構成物。
【請求項８】
複数の請求項１記載の操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物であって、インビトロでのアッセイに使用するためのアレイに配置されている、構成物。
【請求項９】
創薬；薬物検査；前臨床研究；毒性試験；吸収、分布、代謝および排出試験（ＡＤＭＥ）；薬物代謝と薬物動態学試験（ＤＭＰＫ）；疾患モデリング；感染症モデリング；宿主疾患モデリング；三次元の生物学的研究；及び細胞に基づくスクリーニングの１以上で使用するためのものである、請求項８記載のアレイ。
【請求項１０】
操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物であって、
該構成物は１つ以上の層を含み、各層は１つ以上の肝細胞型を含み、生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために１つ以上の層が凝集し、該構成物は、
ａ．平面構造を作成するために細胞型が互いに近傍になるよう空間的に配置されている、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層、及び
ｂ．少なくとも１つの層が少なくとも１つの他の層と組成上又は構造上異なる、複数の層、
の少なくとも１つを有することを特徴とする、構成物。
【請求項１１】
構成物の少なくとも１つの構成成分がバイオプリントされていることを特徴とする、請求項１０記載の構成物。
【請求項１２】
使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にないことを特徴とする、請求項１０記載の構成物。
【請求項１３】
肝細胞は、成体の哺乳類の肝臓組織、胎児の哺乳類の肝臓組織、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞、肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞、及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞のソースの１つ以上に由来することを特徴とする、請求項１０記載の構成物。
【請求項１４】
血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、癌細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞の１つ以上の細胞型をさらに含むことを特徴とする、請求項１０記載の構成物。
【請求項１５】
ヒトの中の１つ以上の肝機能の強化で使用するためのものであることを特徴とする、請求項１０記載の構成物。
【請求項１６】
損傷、疾患あるいは変性の部位での被験体における移植のためのものであることを特徴とする、請求項１５記載の構成物。
【請求項１７】
複数の請求項１０記載の操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物であって、インビトロでのアッセイに使用するためのアレイに配置されている、構成物。
【請求項１８】
創薬；薬物検査；前臨床研究；毒性試験；吸収、分布、代謝および排出試験（ＡＤＭＥ）；薬物代謝と薬物動態学試験（ＤＭＰＫ）；疾患モデリング；感染症モデリング；宿主疾患モデリング；三次元の生物学的研究；及び細胞に基づくスクリーニングの１以上で使用するためのものである、請求項１７記載のアレイ。
【請求項１９】
生きている、三次元の肝臓組織構成物を成形する方法であり、該方法は、
ａ．非実質細胞を含む１つ以上のバイオインクを調製する工程； 
ｂ．実質細胞を含む１つ以上のバイオインクを調製する工程； 
ｃ．支持体上にバイオインクを堆積する工程； 及び
ｄ．生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために、堆積されたバイオインクを約１時間から約３０日までの間インキュベートする工程であって、該構成物は少なくとも１つの区画を備え、該区画は非実質細胞を含む境界で制限された、実質細胞を含む内部を含む工程、
を含む方法。
【請求項２０】
非実質細胞は、血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、癌細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞 、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞の１つ以上を含むことを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
実質細胞は、成体の哺乳類の肝臓組織、胎児の哺乳類の肝臓組織、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞、肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞、及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞のソースの１つ以上に由来することを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
構成物の少なくとも１つの構成成分がバイオプリントされていることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
構成物は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にないことを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
構成物が神経支配されていないことを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
生きている、三次元の肝臓組織構成物を成形する方法であり、該方法は、非実質細胞を含む１つ以上のバイオインク、及び実質細胞を含み、支持体上に堆積される１つ以上のバイオインクを、生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために約１時間から約３０日の間インキュベートする工程を含み、該構成物は少なくとも１つの区画を備え、該区画は非実質細胞を含む境界で制限された、実質細胞を含む内部を含む、方法。
【請求項２６】
操作した、生きている三次元の肝臓組織構成物であって、該構成物は１つ以上の層を含み、少なくとも１つの層は少なくとも２つの細胞型を含み、少なくとも２つの細胞型は実質肝細胞型及び非実質肝細胞型を含み、少なくとも２つの細胞型は平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置され、平面構造は少なくとも１つの実質肝細胞区画及び少なくとも１つの非実質肝細胞区画を含み、１つ以上の層は生きている三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集し、生きている三次元の肝臓組織構成物が少なくとも７日間のインビトロ培養で実質的に生存でき、
ａ．コレステロールを合成する；
ｂ．脂質を保存する；
ｃ．グリコーゲンを保存する；
ｄ．アルブミン、フィブリノゲン、トランスフェリン、ＣＹＰ４５０、α１−アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、グリコーゲン合成酵素、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の２つ以上を含む肝臓特異的なタンパク質を発現する；
ｅ．ホルモン、誘導物質、毒性物、薬、抗体、干渉ＲＮＡ、小型ＲＮＡ、ロックト核酸、ウイルス、細菌、寄生虫および炎症性の誘導物質の１つ以上を含む肝臓モジュレータに反応する；
ｆ．：アセトアミノフェン、アルコール、トロバフロキサシン、メトトレキセート、ジクロフェナク、トログリタゾン、バルプロ酸および塩酸アミオダロンの１つ以上を含む肝臓毒性物に反応する；
ｇ．ＢＳＥＰ、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＮＴＣＰ、ＰＧＰ、ＢＣＲＰ、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＡＢＣＢ４、ＡＴＰ８Ｂ１、多重薬剤抵抗性輸送体（ＭＤＲ）の１つ以上を含む輸送タンパク質を発現する；
ｈ．成形後に少なくともいくつかの静止した星細胞を保持する；及び、
ｉ．微小血管の構造を含む、
の内少なくとも２つの肝臓の特性を有するように提供される、肝臓組織構成物。
【請求項２７】
少なくとも１４日間のインビトロ培養で実質的に生存できることを特徴とする、請求項２６記載の肝臓組織構成物。
【請求項２８】
少なくとも２８日間のインビトロ培養で実質的に生存できることを特徴とする、請求項２７記載の肝臓組織構成物。
【請求項２９】
少なくとも４０日間のインビトロ培養で実質的に生存できることを特徴とする、請求項２８記載の肝臓組織構成物。
【請求項３０】
少なくとも２つの細胞型は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来した細胞を含むことを特徴とする、請求項２６記載の肝臓組織構成物。
【請求項３１】
少なくとも２つの細胞型は、単球またはマクロファージに由来した骨髄性細胞を含むことを特徴とする、請求項２６記載の肝臓組織構成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１３年３月１５日に出願の米国出願第１３／８４１，４３０号の一部継続出願の利益を主張し、これら各々は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
医療産業は、多くの切迫した問題に直面している。２０１２年６月時点で、１１４，６３６人の患者が、臓器移植を必要とするとして、全米臓器配分ネットワーク（ＵＮＯＳ）に登録されていた。ＵＮＯＳによると、２０１２年１月から３月の間に、たった６，８３８の移植が行われた。毎年、移植が行われる件数よりも多い患者が、ＵＮＯＳリストに加えられ、その結果、移植を待つ患者の数の純増加をもたらしている。
【０００３】
さらに、新しい医薬品化合物の研究開発費は、およそ１８億ドルである。Ｐａｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｈｏｗ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｒ＆Ｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ：ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ’ｓ  ｇｒａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ９（３）：２０３−２１４を参照されたい。創薬は、薬物が発見される及び／又は設計されるプロセスである。創薬のプロセスは、一般に少なくとも治療上の有効性に関する、候補の識別、合成、特徴づけ、スクリーニング、およびアッセイの工程を含んでいる。技術の進歩および生物系の理解にもかかわらず、創薬はまだ、新しい治療上の発見の確立が低く、長く、高価で、非能率的なプロセスである。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、再生医療と、組織および／または器官操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）の分野に関する。より具体的には、本発明は、操作した肝臓組織構成物、そのアレイおよび成型加工方法に関する。
【０００５】
１つの態様では、本明細書には、操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物が開示され、該構成物は、平面構造を定義する少なくとも１つの区画を備え、該区画は境界によって定義される内部を含み、該内部は実質細胞を含み、該境界は非実質細胞を含み、細胞は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために互いに凝集し、該構成物の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされ、該構成物は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にない。いくつかの実施形態では、構成物はさらに押出化合物を含み、該押出化合物は、バイオプリンティングに対する細胞の適合性を改善する。いくつかの実施形態では、実質細胞は次のソースの１つ以上に由来する：成体の哺乳類の肝臓組織；胎児の哺乳類の肝臓組織；肝臓由来の樹立細胞株あるいは株、胚性幹細胞（ＥＳＣ）；ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞；肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞；及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、非実質細胞は、以下の１つ以上を含む：血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞（ｂｉｌｉａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、構成物は、１つ以上の分化シグナルにさらされた幹細胞／前駆細胞を含む。さらなる実施形態では、分化シグナルは、生体力学的シグナル、可溶性シグナルおよび物理的シグナルの１つ以上を含む。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の前に１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の最中に１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の後に１つ以上の分化シグナルにさらされた。いくつかの実施形態では、構成物は１つ以上の層を含む。さらなる実施形態において、層構造を作成するために、構成物は、少なくとも１つの層が少なくとも１つの他の層と組成上又は構造上性質が異なる複数の層を含む。いくつかの実施形態では、構成物はインビトロでのアッセイで使用するためのものである。いくつかの実施形態では、構成物は以下の１以上で使用するためのものである：創薬；薬物検査；前臨床研究；毒性試験；吸収、分布、代謝および排出試験（ＡＤＭＥ）；薬物代謝と薬物動態学試験（ＤＭＰＫ）；疾患モデリング；感染症モデリング；宿主疾患モデリング；三次元の生物学的研究；及び細胞に基づくスクリーニング。いくつかの実施形態では、構成物は細胞に基づくスクリーニングで使用するためのものであり、スクリーニングは、１つ以上の感染症、肝臓繊維症（例えば硬変）、肝臓癌、肝臓脂肪症（例えば脂肪肝）、１つ以上の代謝欠損あるいは１つ以上のタンパク質欠乏症のためのものである。さらなる実施形態では、感染症はウイルス感染あるいは寄生虫感染（例えばマラリア原虫感染など）を含む。いくつかの実施形態では、構成物は長期的な組織毒性試験で使用するためのものであり、そこでは分析は、３日を超えた６��月までの期間行なわれる。いくつかの実施形態では、構成物は、ヒトの中の１つ以上の肝機能の強化で使用するためのものである。さらなる実施形態において、構成物は、損傷、疾患あるいは変性の部位での被験体における移植のためのものである。さらなる実施形態では、構成物は、１つ以上の肝機能を強化する又は回復するように設計された体外のデバイスで臨床的に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、構成物は神経支配されていない。
【０００６】
別の態様において、本明細書で開示されているのは、操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物であって、以下を含む：１つ以上の層であって、各層は１つ以上の肝細胞型を含み、１つ以上の層は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集し、以下の少なくとも１つを有することにより特徴づけられる：複数の細胞型（平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置された細胞型）を含む少なくとも１つの層；及び複数の層であって、層構造を作成するために、少なくとも１つの他の層とは組成的にあるいは構造的に異なる少なくとも１つの層。いくつかの実施形態では、構成物の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされた。いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織の層はそれぞれ、Ｘ、ＹおよびＺ軸において複数の細胞を含む。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織の層はＸ、ＹおよびＺ軸においてそれぞれ厚さが少なくとも約５０ミクロンである。さらなる実施形態では、構成物はさらに押出化合物（バイオ印刷用の細胞の適応性を改善する押出化合物）を含む。いくつかの実施形態では、構成物は、使用時に予め形成されたスキャフォールドが実質的にない。いくつかの実施形態では、実質細胞は次のソースの１つ以上に由来する：成体の哺乳類の肝臓組織；胎児の哺乳類の肝臓組織；胚性幹細胞（ＥＳＣ）；ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞；肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞；及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、構成物はさらに以下の１つ以上の細胞型を含む：  血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、癌細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、構成物は、１つ以上の分化シグナルにさらされた幹細胞／前駆細胞を含む。さらなる実施形態では、分化シグナルは、生体力学的シグナル、可溶性シグナルおよび物理的シグナルの１つ以上を含む。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の前に１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の最中に１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の後に１つ以上の分化シグナルにさらされた。いくつかの実施形態では、構成物はインビトロでのアッセイで使用するためのものである。いくつかの実施形態では、構成物は以下の１以上で使用するためのものである：創薬；薬物検査；前臨床研究；毒性試験；吸収、分布、代謝および排出試験（ＡＤＭＥ）；薬物代謝と薬物動態学試験（ＤＭＰＫ）；疾患モデリング；感染症モデリング；宿主疾患モデリング；三次元の生物学的研究；及び細胞に基づくスクリーニング。いくつかの実施形態では、構成物は細胞に基づくスクリーニングで使用するためのものであり、スクリーニングは、１つ以上の感染症、肝臓繊維症（例えば硬変）、肝臓癌、肝臓脂肪症（例えば脂肪肝）、１つ以上の代謝欠損あるいは１つ以上のタンパク質欠乏症のためのものである。さらなる実施形態で���、感染症はウイルス感染あるいは寄生虫感染（例えばマラリア原虫感染など）を含む。いくつかの実施形態では、構成物は長期的な組織毒性試験で使用するためのものであり、そこでは分析は、３日を超えた６か月までの期間行なわれる。いくつかの実施形態では、構成物は、ヒトの中の１つ以上の肝機能の強化で使用するためのものである。さらなる実施形態において、構成物は、損傷、疾患あるいは変性の部位での被験体における移植のためのものである。さらなる実施形態では、構成物は、１つ以上の肝機能を強化する又は回復するように設計された体外のデバイスで臨床的に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、構成物は神経支配されていない。
【０００７】
別の態様において、本明細書で開示されているのは、操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物であって、以下を含む：複数の層、シリンダー状のバイオインクを含む各層、実質的に平行に軸方向に整列したバイオインク、肝実質細胞を含むバイオインク；及び、随意に、シリンダー状のバイオインク中又は間に非実質細胞；並びに、随意に、シリンダー状のバイオインク中の空間（ｖｏｉｄ  ｓｐａｃｅ）。いくつかの実施形態では、構成物の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされた。さらなる実施形態では、構成物はさらに押出化合物（バイオ印刷用の細胞の適応性を改善する押出化合物）を含む。いくつかの実施形態では、実質細胞は次のソースの１つ以上に由来する：成体の哺乳類の肝臓組織；胎児の哺乳類の肝臓組織；胚性幹細胞（ＥＳＣ）；ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞；肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞；及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、非実質細胞はさらに以下の１つ以上を含む：血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態において、構成物は１つ以上の層を含む。さらなる実施形態において、層構造を作成するために、構成物は、少なくとも１つの層が少なくとも１つの他の層と組成上又は構造上異なる複数の層を含む。いくつかの実施形態では、構成物は、ヒトの中の１つ以上の肝機能の強化で使用するためのものである。さらなる実施形態において、構成物は、損傷、疾患あるいは変性の部位での被験体における移植のためのものである。さらなる実施形態では、構成物は、１つ以上の肝機能を強化する又は回復するように設計された体外の装置で臨床的に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、構成物は神経支配されていない。
【０００８】
別の態様中では、本明細書で開示されているのは、操作した、生きている三次元の肝臓組織構成物のアレイであって、各々の構成物は、次のものを含む：１つ以上の層であって、各層は１つ以上の肝細胞型を含み、１つ以上の層は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集し、以下の少なくとも１つを有することにより特徴づけられる：複数の細胞型（平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置された細胞型）を含む少なくとも１つの層；及び複数の層であって、層構造を作成するために、少なくとも１つの他の層とは組成的にあるいは構造的に異なる少なくとも１つの層。いくつかの実施形態では、構成物の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされた。さらなる実施形態では、構成物はさらに押出化合物（バイオ印刷用の細胞の適応性を改善する押出化合物）を含む。いくつかの実施形態では、各構成物は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にない。いくつかの実施形態では、実質細胞は次のソースの１つ以上に由来する：成体の哺乳類の肝臓組織；胎児の哺乳類の肝臓組織；胚性幹細胞（ＥＳＣ）；ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞；肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞；及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、構成物は、１つ以上の分化シグナルにさらされた幹細胞／前駆細胞を含む。さらなる実施形態では、分化シグナルは、生体力学的シグナル、可溶性シグナルおよび物理的シグナルの１つ以上を含む。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の前に１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の最中に１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の後に１つ以上の分化シグナルにさらされた。いくつかの実施形態では、各構成物はさらに以下の１つ以上の細胞型を含む：血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、癌細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、構成物はインビトロでのアッセイで使用するためのものである。いくつかの実施形態では、構成物は以下の１以上で使用するためのものである：創薬；薬物検査；前臨床研究；毒性試験；吸収、分布、代謝および排出試験（ＡＤＭＥ）；薬物代謝と薬物動態学試験（ＤＭＰＫ）；疾患モデリング；感染症モデリング；宿主疾患モデリング；三次元の生物学的研究；及び細胞に基づくスクリーニング。いくつかの実施形態では、構成物は細胞に基づくスクリーニングで使用するためのものであり、スクリーニングは、１つ以上の感染症、肝臓繊維症（例えば硬変）、肝臓癌、肝臓脂肪症（例えば脂肪肝）、１つ以上の代謝欠損あるいは１つ以上のタンパク質欠乏症のためのものである。さらなる実施形態では、感染症はウイルス感染あるいは寄生虫感染（例えばマラリア原虫感染など）を含む。いくつかの実施形態では、構成物は長期的な組織毒性試験で使用するためのものであり、そこでは分析は、３日を超えた６か月までの期間行なわれる。
【０００９】
別の態様中では、本明細書で開示されているのは、操作した、生きている三次元の組織構成物のアレイであって、少なくとも１つの構成物が肝臓組織構成物であり、各々の構成物は、次のものを含む：１つ以上の層であって、各層は１つ以上の肝細胞型を含み、１つ以上の層は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集し、以下の少なくとも１つを有することにより特徴づけられる：複数の細胞型（平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置された細胞型）を含む少なくとも１つの層；及び複数の層であって、層構造を作成するために、少なくとも１つの他の層とは組成的にあるいは構造的に異なる少なくとも１つの層。いくつかの実施形態では、構成物の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされた。さらなる実施形態では、肝臓組織構成物はさらに押出化合物（バイオ印刷用の細胞の適応性を改善する押出化合物）を含む。いくつかの実施形態では、各肝臓構成物は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にない。いくつかの実施形態では、実質細胞は次のソースの１つ以上に由来する：成体の哺乳類の肝臓組織；胎児の哺乳類の肝臓組織；胚性幹細胞（ＥＳＣ）；ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞；肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞；及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、各肝臓組織構成物は、１つ以上の分化シグナルにさらされた幹細胞／前駆細胞を含む。さらなる実施形態では、分化シグナルは、生体力学的シグナル、可溶性シグナルおよび物理的シグナルの１つ以上を含む。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の前に１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の最中に１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の後に１つ以上の分化シグナルにさらされた。いくつかの実施形態では、各肝臓組織構成物はさらに以下の１つ以上の細胞型を含む：血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、癌細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、アレイはインビトロでのアッセイで使用するためのものである。いくつかの実施形態では、構成物は以下の１以上で使用するためのものである：創薬；薬物検査；前臨床研究；毒性試験；吸収、分布、代謝および排出試験（ＡＤＭＥ）；薬物代謝と薬物動態学試験（ＤＭＰＫ）；疾患モデリング；感染症モデリング；宿主疾患モデリング；三次元の生物学的研究；及び細胞に基づくスクリーニング。いくつかの実施形態では、アレイは細胞に基づくスクリーニングで使用するためのものであり、スクリーニングは、１つ以上の感染症、肝臓繊維症（例えば硬変）、肝臓癌、肝臓脂肪症（例えば脂肪肝）、１つ以上の代謝欠損あるいは１つ以上のタンパク質欠乏症のためのものである。さらなる実施形態では、感染症はウイルス感染あるいは寄生虫感染（例えばマラリア原虫感染など）を含む。いくつかの実施形態では、アレイは長期的な組織毒性試験で使用するためのものであり、そこではアレイは、３日を超えた６か月までの期間行なわれる。
【００１０】
別の態様では、本明細書で開示されているのは、生きている、三次元の肝臓組織構成物を成形する方法であり、該方法は以下の工程を含む：非実質細胞を含む１つ以上のバイオインクを調製する工程；実質細胞を含む１つ以上のバイオインクを調製する工程；支持体上にバイオインクを堆積する工程；及び生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために、堆積されたバイオインクを約１時間から約３０日までの間インキュベートする工程であって、該構成物は少なくとも１つの区画を備え、該区画は非実質細胞を含む境界で制限された、実質細胞を含む内部を含む。いくつかの実施形態では、非実質細胞は以下の１つ以上を含む：血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、癌細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、実質細胞は次のソースの１つ以上に由来する：成体の哺乳類の肝臓組織；胎児の哺乳類の肝臓組織；胚性幹細胞（ＥＳＣ）；ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞；肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞；及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、構成物の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされた。さらなる実施形態では、構成物はさらに押出化合物（バイオ印刷用の細胞の適応性を改善する押出化合物）を含む。いくつかの実施形態では、各構成物は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にない。いくつかの実施形態では、構成物は神経支配されていない。
【００１１】
別の態様では、本明細書で開示されているのは、生きている、三次元の肝臓組織構成物を成形する方法であり、該構成物は以下の工程を含む：肝細胞を含む１つ以上のバイオインクを調製する工程；支持体上に１つ以上のバイオインクを配置する工程；及び生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために、配置されたバイオインクを約１時間から約３０日までの間インキュベートする工程であって、ここで構成物は１つ以上の層を含み、各層は１つ以上の細胞型を含み、１つ以上の層は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集する。いくつかの実施形態では、肝細胞は次のソースの１つ以上に由来する：成体の哺乳類の肝臓組織；胎児の哺乳類の肝臓組織；胚性幹細胞（ＥＳＣ）；ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞；肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞；及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、非実質細胞は以下の１つ以上を含む：血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、癌細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態において、構成物は、以下の少なくとも１つを有することで特徴付けられる：複数の細胞型（平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置された細胞型）を含む少なくとも１つの層；及び複数の層であって、層構造を作成するために、少なくとも１つの他の層とは組成的にあるいは構造的に異なる少なくとも１つの層。いくつかの実施形態では、構成物の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされた。さらなる実施形態では、構成物はさらに押出化合物（バイオ印刷用の細胞の適応性を改善する押出化合物）を含む。いくつかの実施形態では、各構成物は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にない。いくつかの実施形態では、構成物は神経支配されていない。
【００１２】
別の態様では、本明細書で開示されているのは、生きている、三次元の肝臓組織構成物を構築する方法であり、該構成物は以下の工程を含む：哺乳類の肝細胞を含む１つ以上の凝集された多細胞集合体を調製する工程；複数の細胞型（平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置された細胞型）を含む少なくとも１つの層；及び複数の層であって、層構造を作成するために、少なくとも１つの他の層とは組成的にあるいは構造的に異なる少なくとも１つの層、の少なくとも１つを形成するために、支持体上に１つ以上の凝集された多細胞集合体を堆積する工程、及び生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集することを可能にするため、１つ以上の多細胞集合体を約１時間から約３０日までの間インキュベートする工程。いくつかの実施形態では、肝細胞は次のソースの１つ以上に由来する：  成体の哺乳類の肝臓組織；  胎児の哺乳類の肝臓組織；  胚性幹細胞（ＥＳＣ）；  ＥＳＣ由来の肝細胞様細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；  ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞；  肝臓由来の成人の幹細胞／前駆細胞；  及び肝臓以外の組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、肝臓組織構成物はさらに以下の１つ以上の細胞型を含む：  血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、免疫細胞、癌細胞、クッパー細胞、星細胞、胆嚢上皮細胞（ｂｉｌｉａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、胆嚢上皮細胞様細胞、類洞内皮細胞  、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞および非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞。いくつかの実施形態では、構成物の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされた。さらなる実施形態では、構成物はさらに押出化合物（バイオ印刷用の細胞の適応性を改善する押出化合物）を含む。いくつかの実施形態では、各構成物はバイオプリント時又は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にない。いくつかの実施形態では、構成物は神経支配されていない。
【００１３】
別の態様において、本明細書中に開示されているのは、生きている、三次元の肝臓組織構成物を成形する方法であって、該方法は、支持体上に堆積された非実質細胞を含む１つ以上のバイオインク及び実質細胞を含む１つ以上のバイオインクを、生きている三次元の肝臓組織構成物を形成するために約１時間から約３０日間インキュベートする工程を含み、該構成物は少なくとも１つの区画を備え、該区画は非実質細胞を含む境界で制限された、実質細胞を含む内部を備える。
【００１４】
別の態様において、本明細書中で開示されているのは、操作した、生きている三次元の肝臓組織構成物であって、該構成物は１つ以上の層を含み、少なくとも１つの層は少なくとも２つの細胞型を含み、少なくとも２つの細胞型は実質肝細胞型及び非実質肝細胞型を含み、少なくとも２つの細胞型は平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置され、平面構造は少なくとも１つの実質肝細胞区画及び少なくとも１つの非実質肝細胞区画を含み、１つ以上の層は生きている三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集し、生きている三次元の肝臓組織構成物が少なくとも７日間のインビトロ培養で実質的に生存でき、少なくとも２つの以下の肝臓の特性を有するように提供される：コレステロールを合成する；脂質を保存する；グリコゲンを保存する；以下の２つ以上を含む肝臓特異的なタンパク質を発現する：アルブミン、フィブリノゲン、トランスフェリン、ＣＹＰ４５０、α１−アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、グリコゲン合成酵素、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子；以下の１つ以上を含む肝臓モジュレータに反応する：ホルモン、誘導物質、毒性物、薬、抗体、干渉ＲＮＡ、小型ＲＮＡ、ロックト核酸、ウイルス、細菌、寄生虫および炎症性の誘導物質；以下の１つ以上を含む肝臓毒性物に反応する：アセトアミノフェン、アルコール、トロバフロキサシン、メトトレキセート、ジクロフェナク、トログリタゾン、バルプロ酸および塩酸アミオダロン；以下の１つ以上を含む輸送タンパク質を発現する：ＢＳＥＰ、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＮＴＣＰ、ＰＧＰ、ＢＣＲＰ、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＡＢＣＢ４、ＡＴＰ８Ｂ１、多重薬剤抵抗性輸送体（ＭＤＲ）；成形後に少なくともいくつかの静止した星細胞を保持する；及び微小血管の構造を含む。いくつかの実施形態では、構成物は少なくとも１４日間のインビトロ培養で実質的に生存できる。いくつかの実施形態では、構成物は少なくとも２８日間のインビトロ培養で実質的に生存できる。さらなる実施形態では、構成物は少なくとも４０日間のインビトロ培養で実質的に生存できる。様々な実施形態では、構成物は、少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０日あるいはより長期間のインビトロ培養で実質的に生存できる。いくつかの実施形態では、構成物はバイオプリンターを使用して、完全に自動手順で生産される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの細胞型は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来した細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの細胞型は、単球またはマクロファージに由来した骨髄性細胞を含む。様々な実施形態では、構成物には少なくとも３つ、４つ、５つあるいは６つ、７つ、８つあるいは全ての肝臓特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図１】図１は天然の肝臓組織構造の限定されない典型的な実例である。
【図２】図２は、ＨｅｐａＲＧ細胞を含む、バイオプリントされた肝臓構成物の成熟と生化学的な特徴の限定されない典型的な例証である。ＨｅｐａＲＧ細胞は、周囲長箱（ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ  ｂｏｘ）の中心へ配置された後、９６時間成熟させた（Ａ−Ｃ）。バイオプリントされた肝臓構成物は、９６時間後アルブミン（Ｄ）とコレステロール（Ｅ）を生成して代謝的に活性である。デキサメタゾン処置に続いて、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ３Ａ４）活性は処置されていない対照より５倍を超えて高かった（Ｆ）。
【図３】図３は、定義された構造パターンにおけるバイオプリントされた構造の限定されない例であり（Ａ、Ｂ）、これはｉＰＳＣ−由来肝細胞を含み（Ｃ）、２次元の培養物対照と比較して操作したバイオプリント構成物において１００万の投入細胞（ｉｎｐｕｔ  ｃｅｌｌ）につき著しく高いアルブミンレベル（Ｄ）を合成した。
【図４】図４は、バイオプリントされた肝臓構成物の成熟の限定されない典型的な例証であり（Ａ）、これは非実質細胞の別々の球面（Ｂ）を含む。バイオプリントされた構成物は、追加の２４時間の培養でも融合し安定したままであった。
【図５】図５は、肝細胞の印刷プロセスにおける空間的及び時間的な制御を可能にする、共印刷された型（ｃｏ−ｐｒｉｎｔｅｄ  ｍｏｌｄ）の溶解の限定されない典型的な例証であり、結果としてｘ、ｙ及びｚ軸において定義された形状及びサイズである使用者特異的な区画が生じる。矢印は、共印刷された型が印刷後２４時間溶解した部位、及び追加の細胞投入ができる領域を示す。
【図６】図６は、操作した肝臓組織の制限しない例を描いた肉眼的のイメージであり、この場合、複数の肝細胞型及び水溶性押出化合物（例えばＰＦ−１２７）でできているバイオインクを用いた連続的な堆積機構を使用して多層肝臓組織がバイオプリントされている。（Ａ）は、バイオインクと陰性のスペースのパターン化により作成された平面構造を強調する単一の機能ユニットの概略図を示す；（Ｂ）２×１０８細胞を含むＰＦ１２７でバイオプリントされた碁盤目状の機能ユニット；（Ｃ）は溶媒の適用の２０分後の構成物を示す；及び、（Ｄ）は、構造への溶媒の適用の１６時間後の構成物、及び押出化合物の溶解を示す。平面構造の保持を時間にわたって注意する。
【図７】図７は、図６の碁盤目状の構成物中の典型的な「スポーク」を描く、碁盤目状の構成物の限定されない顕微鏡写真である。この顕微鏡写真は、多層の碁盤目状の六角形構造における連続的な堆積によってバイオプリントされ、その後１６時間培養された星細胞、内皮細胞及び皮膚の線維芽細胞のホルマリンで固定されパラフィンに埋め込まれた組織部分のヘモトキシン及びエオシン染色を示す。
【図８】図８は、異なる仕切られた肝細胞の部位（矢印によってマークされた）の融合を可能にする、共印刷された型の溶解の制限しない例である。ある時間（Ｂ；  Ｔ＝２４時間）にわたって、その部位は固体のバイオプリントされた組織へ融合する。
【図９】図９は、ＭＭＸバイオプリンターのシリンジ堆積モジュール（ＳＤＭ）を使用したバイオプリントされた共印刷された型（４％ゼラチン及び２％アルギン酸塩）の限定されない例であり、これにより構成物が生成され（Ａ）、これは印刷後７２時間で肝臓組織に融合し、成熟する（Ｂ）。この例において、バイオプリントされた組織がＨ及びＥ染色によって濃く示され（Ｃ）、増殖細胞と比較して（Ｅ）、比較的少ないＴＵＮＥＬ染色された細胞（Ｄ）に示されるように生存可能である。
【図１０】図１０は、融合した三次元肝臓組織構成物を生成するためのシリンジ堆積モジュール（ＳＤＭ）を使用してバイオプリントされた共印刷された型（Ａ；４％ゼラチン及び２％アルギン酸塩）の限定されない例である。構造の中心にある内皮のバイオインクの付加は、構成物の複雑さを増加させる（Ｂ）。Ｅ−カドヘリン（Ｃ）及びＣＤ３１（Ｄ）染色は、上皮細胞及び内皮細胞が印刷後１４４時間後にバイオプリントされた領域にわたって存在する上皮細胞及び内皮細胞を示す。ＴＵＮＥＬ染色は、１４４時間のインキュベーションに続く、操作した肝臓組織の核心内の制限された細胞死を示す（Ｅ）。
【図１１】図１１は、ヒドロゲル（４％ゼラチン：２％アルギン酸塩）を含む共印刷された型（共同成型）（Ａ）又は非実質細胞及びヒドロゲルに基づく押出化合物を含むバイオインク（Ｂ）の限定されない例である。バイオインク共同成型株（ｂｉｏ−ｉｎｋ  ｃｏ−ｍｏｌｄ  ｌｉｎｅｓ）は、ヒドロゲル押出化合物１ｍＬにつき１５０×１０６細胞を含む。共同成型構造へのＨｅｐＧ２細胞の追加及び２４時間の培養は、融合された、バイオプリントされた肝臓構造を結果としてもたらす。押出化合物の溶解は水性溶媒中で時間とともに生じる。
【図１２】図１２は、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸバイオプリンター上で２つのシリンジ堆積モジュール（ＳＤＭ）を使用した、連続的な堆積によって作り上げられた密度の高い細胞の肝臓組織の限定されない例である。４％のゼラチンと２％のアルギン酸塩を含む共同成型株は、第二のＳＤＭによるＨｅｐＧ２バイオペーストの充填が後に続く、第一のＳＤＭモジュールによって配置される。
【図１３】図１３は、層状の構造を有するバイオプリントされた新組織の限定されない例である。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）ヒドロゲルベースと共印刷のボックスはバイオプリントされ、その後肝臓上皮細胞のバイオインク（ＨｅｐＧ２細胞）を含む第一の層がバイオプリントされ、肝星細胞及び内皮細胞を含む第二の層の上に堆積された。この例で、星状：ＥＣ層は、ヒドロゲル押出化合物を含むバイオインクの連続的な堆積によってバイオプリントされた（Ａ）。成形直後の構成物全体のイメージは、２つの異なる層及びバイオインクを示す（Ｂ）。ホルマリンで固定されパラフィンに埋め込まれた構成物の部分のヘマトキシリン−エオシン染色は、その後４８時間培養され、２つの層の異なる形態学及び層状構造の確立を明らかにした。内皮細胞と肝星細胞の懸濁液がバイオプリントされた場合、ＣＤ３１陽性細胞は構成物の上部層に制限される（Ｄ）一方、ＩＧＦ−２−陽性のＨｅｐＧ２が下部層（Ｅ）でのみ見られる。
【図１４】図１４は、細胞パターニングとバイオプリントされた肝臓組織中の層状化の限定されない例である。パラフィンに埋め込まれた組織部分のヘマトキシリン−エオシン染色は、血管内皮細胞と肝星細胞を含んでいる多型の細胞集団をバイオプリントすることにより形成された連続的な新組織を明らかにした（Ａ）。ＣＤ３１に対する抗体を備えた組織部分の染色は、中心に位置するＥＣに並べられた微細血管の存在とＣＤ３１陽性のＥＣの外層を明らかにした（Ｂ）。
【図１５】図１５は、ＴＧＦ−β１を有するバイオプリントされた肝星細胞組織の刺激の制限しない例である。ＴＧＦ−β１の増加した濃度（０、１、１０、５０ｎｇ／ｍＬ）を有するバイオプリントされた肝星細胞シートのインキュベーションは、サイトカイン濃度が増加するにつれて組織派生物形成（ｔｉｓｓｕｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の増加に導く、バイオプリントされた組織の全体の観察の変化を結果的にもたらす（Ａ−Ｄ、０−５０ｎｇ／ｍＬ）。バイオプリントされた肝星細胞を含んでいる組織からの組織部分のトリクロム染色は、コラーゲン堆積の増大、構成物サイズ及び細胞密度の劇的な減少を明らかにする（Ｅ−Ｈ、０−５０ｎｇ／ｍＬ）。
【図１６】図１６は、マルチウェルフォーマットでのバイオプリンティングの限定されない例である。バイオプリントされた組織構成物はマルチウェルプレート（Ａ）又は長期間の維持及び成熟のために随意に適切なマルチウェルプレートの上に配置されるマルチウェル培養インサート（Ｂ）において生じる。ここで、組織構成物は４８−ウェルポリスチレンプレート中に（Ａ）、及び６−ウェル細胞培養インサートの多孔質膜上（Ｂ）にバイオプリントされる。
【図１７】図１７は、体外の支持体のために設計され印刷された、バイオプリントされた肝臓管状構造の限定されない例である。７０％  ＨｅｐＧ２／２５％  ＨＵＶＥＣ／５％  肝星細胞を含む４０ｍｍ長さのバイオインクシリンダーがバイオプリントされ、調節された。チャネルは除去可能な、生物学的に不活性なヒドロゲルを使用することによって構造の中心に作られる。
【図１８】図１８は、本明細書に記載されている構築方法と適合性がある平面及び層状構造の組み合わせ、及び天然の組織構造及び生物学から再生産された構造的又は空間的要素を含む、平面及び層状構造の限定されない一連の例である。典型的な構造は、血管ネットワーク（Ａ）、帯状組織（Ｂ）、小葉に分かれた組織（Ｃ）、潅流した（ｐｅｒｆｕｓｅｄ）／整列された組織（Ｄ）、固体＋液体／液体インターフェイス（Ｅ）、障壁組織（Ｆ）、及び層状構造を有する層状の組織（Ｇ）を備えた、構造上正しい組織を含む。
【図１９】図１９は、操作した肝臓組織を通って及び／又は通じての潅流を可能とするための、一定間隔で空間（仮の充填体に占有されているものとして描かれている；黒丸）を有する繰り返しの管状構造を含む体外の肝臓デバイスの限定されない略図である。
【図２０】図２０はバイオプリントされたヒト肝臓組織の限定されない例である。
【図２１】図２１は、バイオプリントされたヒト肝臓組織の組織学上の特徴を示す、一連の限定されない顕微鏡写真である；この場合、顕微鏡写真は高い組織の密度（Ａ）、ＥＣＭの生成（Ｂ）、脂質の生成（Ｃ）およびグリコゲンの生成（Ｄ）を示す。
【図２２】図２２は、バイオプリントされたヒト肝臓組織の組織学上の特徴を示す、一連の限定されない顕微鏡写真である；この場合、顕微鏡写真は、非実質ストロマに囲まれた肝細胞の部位、及び天然の肝臓組織を模倣する小葉型構造への明確な自己組織化を示す。
【図２３】図２３は、バイオプリントされたヒト肝臓組織によるアルブミン（Ａ）とコレステロール（Ｂ）の生成を示すデータの限定されない例である。
【図２４】図２４は、バイオプリントされたヒト肝臓組織によるトランスフェリン（Ａ）とフィブリノゲン（Ｂ）の生成を示すデータの限定されない例である。
【図２５】図２５は、成形から１０日後のバイオプリントされたヒト肝臓組織における胆汁酸塩に輸送するタンパク質ｍＲＮＡ対ハウスキーピング遺伝子ＲＮＡ（１８ｓＲＮＡ）の相対的な量を示すデータの限定されない例である。
【図２６】図２６は、ベラパミルによって阻害できる（Ｂ）、バイオプリントされた肝臓組織におけるリファンプシン処理による活性なＣＹＰ３Ａ４酵素の持続的な誘発（Ａ）を示すデータの限定されない例である。
【図２７】図２７は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）によって測定された、より高い用量での組織損傷が後に続く、バイオプリントされた肝臓組織におけるジクロフェナク処理によるＣＹＰ３Ａ４の誘発を示すデータの限定されない例である。
【図２８】図２８は、バイオプリントされた肝臓組織でのトロバフロキサシン対レボフロキサシンの複数回投与試験におけるアルブミンの減少（Ａ）及びＬＤＨの増加（Ｂ）を示すデータの限定されない例である。
【図２９】図２９は、バイオプリントされた肝臓組織でのメトトレキセートの複数回投与試験におけるＡＴＰで測定された生存率の減少（Ａ）、アルブミンの減少（Ｂ）及びＬＤＨの増加（Ｃ）を示すデータの限定されない例である。
【図３０】図３０は、ＣＹＰの誘発で測定された、ビタミンＤへのバイオプリントされた肝臓組織の反応を示すデータの限定されない例である。
【図３１】図３１は、クッパー細胞を含むバイオプリントされた肝臓組織におけるＩＬ−６生成によって測定された、ＬＰＳ刺激への反応を示すデータの限定されない例である。
【図３２】図３２は、クッパー細胞を含むバイオプリントされた肝臓組織におけるサイトカイン生成（ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｂ及びＴＮＦ−α）によって測定されたＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ（Ａ）及び１００μｇ／ｍｌ（Ｂ））刺激に対する用量依存的な反応を示すデータの限定されない例である。
【図３３】図３３は、約９０％の集合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）である肝臓類洞内皮細胞（ＨＳＥＣ）の単層の制限しない例である。
【図３４】図３４は、二次元の培養物におけるＩＬ−６の生成によって測定されるＬＰＳに対するＨＳＥＣ反応を示すデータの制限しない例である。
【図３５】図３５は、非実質画分にＨＳＥＣを組み入れ、融合した三次元のバイオプリントされた肝臓組織の制限しない例である。
【図３６】図３６は、冷凍して分割された（ｃｒｙｏ−ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ）三次元のバイオプリントされた肝臓組織を通った小分子浸透を描いた顕微鏡写真（ＦＩＴＣ；５倍）の制限しない例である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
多くの肝不全の患者のために、正常な細胞または組織の送達による肝臓質量の回復は部分的であっても、生存と肝機能に意味のある影響を及ぼすことができる。２０１１年のＵＮＯＳデータベースによれば、１０，０００人を超える患者が米国で肝移植を待っており、実際に移植肝臓を受け取る患者は５０％未満であった。典型的に最も重篤な患者のために予約されている移植リストに載っているよりもはるかに多くの患者が肝移植による利益を得ることができる。さらに、多くの個体が、慢性変性疾患に苦しみ、そのための移植は、現在のヘルスケアパラダイムではない。したがって、生きている、機能的な肝臓組織は、大きな臨床的価値があるだろう。分節的又は部分的な肝移植は、現在米国で慣例的に行なわれており、そこでは単一の器官は２−３の部分又は葉に分けられ、各部分は待機リストの患者に移植される。健康な肝臓組織は、成長し、並びに個体のサイズ及び代謝的な必要性に応じて便宜を図る特有の能力を有するため、部分的な量を移植するアプローチは臨床的に生存可能である。
【００１７】
さらに、第ＩＩＩ相で３５％の化合物が脱落する主な原因となっている（Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｅｓ．  ２００５  １１：３５４５）予測できない毒性によって、多くの化合物が後期臨床試験又は市場に出た後に脱落する。予測できない肝臓毒性は、心毒性及び腎毒性が後に続く、脱落する主な原因となる。したがって、よりよい系が、ヒトのインビボでの性能のより正確な予測を提供するために必要である。
【００１８】
持続不可能な研究開発費を課すことなく、革新的でコスト効率の良い新薬の数および品質を実質的に増加させる、材料、ツール、および技術が必要とされている。従って、本明細書中に記載されている発明者は、組織及び器官のエンジニアリング、インビトロアッセイ、創薬及び他の分野で利用される、肝臓組織構成物及びそのアレイ並びにこれらを製造する方法を作った。
【００１９】
肝臓組織の以前のモデルは、意図した適用に合わせるために予め形成され形作られる、三次元のスキャフォールド材料上に細胞を蒔くことによって、又は無作為な集合によって肝細胞が多細胞楕円体を形成するのを可能にすることによって（ここで細胞の球状の凝集は生じるが凝集中には方向づけられた構造はない）、操作した組織構成物を提供することに焦点を当ててきた。スキャフォールド材料上に蒔かれた細胞は、一次細胞、細胞株、操作した細胞、及び／又は幹細胞／前駆細胞であった。多能性幹細胞または前駆細胞は、利用されるときに、三次元のスキャフォールド材料上に蒔かれる前に、二次元の単層培養において分化プログラムを受けるか、あるいは最初にスキャフォールド材料上に蒔かれ、その後、分化プログラムを受けて、インサイツのまたはインビトロで、所望の組織を生成する。従来の手法は、細胞収率、構成物内の細胞の終末分化に必要とされる時間、および結果として生じる三次元構造の全体的な細胞性の点で、面倒且つ非能率的である。
【００２０】
重要なことには、以前の努力と技術は、構造において特定の位置に存在する特定の細胞型によって定義され、構成物中に数日又は数週間（４０日間まで）持続する組織区画を生成することができなかった。さらに、以前の努力と技術は、組織の寿命に寄与する、微小血管系と密着結合を含む天然様構造を示すことができなかった。本明細書に記載された技術は、構造に関する微調整を可能にし、天然の組織に類似する高度に定義された構造の生成を可能にする。さらに、本技術は、これらの構造を保持する高い細胞密度組織の構築を可能にし、それにより、組織の耐用期間を拡張する。
【００２１】
本明細書には、操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物が開示され、該構成物は、平面構造を定義する少なくとも１つの区画を備え、該区画は境界によって定義される内部を含み、該内部は実質細胞を含み、該境界は非実質細胞を含み、細胞は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために互いに凝集し、該構成物の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされて提供され、該構成物は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にない。
【００２２】
さらに本明細書で開示されているのは、特定の実施形態において、操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物であって、以下を含む：１つ以上の層であって、各層は１つ以上の肝細胞型を含み、１つ以上の層は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集し、以下の少なくとも１つを有することにより特徴づけられる：複数の細胞型（平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置された細胞型）を含む少なくとも１つの層；及び複数の層であって、層構造を作成するために、少なくとも１つの他の層とは組成的にあるいは構造的に異なる少なくとも１つの層。
【００２３】
さらに本明細書で開示されているのは、特定の実施形態において、操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物であって、以下を含む：複数の層であって、各層はシリンダー状のバイオインクを含み、実質的に平行に軸方向に整列したバイオインク、肝実質細胞を含むバイオインク；及び、随意に、シリンダー状のバイオインク中又は間に非実質細胞；並びに、随意に、シリンダー状のバイオインク中の空間を含む。
【００２４】
さらに本明細書で開示されているのは、操作した、生きている三次元の肝臓組織構成物のアレイであって、各々の構成物は、次のものを含む：１つ以上の層であって、各層は１つ以上の肝細胞型を含み、１つ以上の層は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集し、以下の少なくとも１つを有することにより特徴づけられる：複数の細胞型（平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置された細胞型）を含む少なくとも１つの層；及び複数の層であって、層構造を作成するために、少なくとも１つの他の層とは組成的にあるいは構造的に異なる少なくとも１つの層。
【００２５】
さらに本明細書で開示されているのは、特定の実施形態において、操作した、生きている三次元の組織構成物のアレイであって、少なくとも１つの構成物が肝臓組織構成物であり、各々の構成物は、次のものを含む：１つ以上の層であって、各層は１つ以上の肝細胞型を含み、１つ以上の層は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集し、以下の少なくとも１つを有することにより特徴づけられた構成物：複数の細胞型（平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置された細胞型）を含む少なくとも１つの層；及び複数の層であって、層構造を作成するために、少なくとも１つの他の層とは組成的にあるいは構造的に異なる少なくとも１つの層。
【００２６】
さらに本明細書で開示されているのは、特定の実施形態において、生きている、三次元の肝臓組織構成物を成形する方法であり、該方法は以下の工程を含む：非実質細胞を含む１つ以上のバイオインクを調製する工程；実質細胞を含む１つ以上のバイオインクを調製する工程；支持体上にバイオインクを堆積する工程；及び生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために、堆積されたバイオインクを約１時間から約３０日までの間インキュベートする工程であって、該構成物は少なくとも１つの区画を備え、該区画は非実質細胞を含む境界で制限された、実質細胞を含む内部を含む。
【００２７】
さらに本明細書で開示されているのは、特定の実施形態において、生きている、三次元の肝臓組織構成物を成形する方法であり、該構成物は以下の工程を含む：肝細胞を含む１つ以上のバイオインクを調製する工程；支持体上に１つ以上のバイオインクを堆積する工程；及び生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために、堆積されたバイオインクを約１時間から約３０日までの間インキュベートする工程であって、ここで構成物は１つ以上の層を含み、各層は１つ以上の細胞型を含み、１つ以上の層は生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集する。
【００２８】
さらに本明細書で開示されているのは、特定の実施形態において、生きている、三次元の肝臓組織構成物を構築する方法であり、該構成物は以下の工程を含む：哺乳類の肝細胞を含む１つ以上の凝集された多細胞集合体を調製する工程；複数の細胞型（平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置された細胞型）を含む少なくとも１つの層；及び複数の層であって、層構造を作成するために、少なくとも１つの他の層とは組成的にあるいは構造的に異なる少なくとも１つの層、の少なくとも１つを形成するために、支持体上に１つ以上の凝集された多細胞集合体を堆積する工程、及び生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集することを可能にするため、１つ以上の多細胞集合体を約１時間から約３０日までの間インキュベートする工程。
【００２９】
さらに本明細書中に開示されているのは、特定の実施形態において、生きている、三次元の肝臓組織構成物を成形する方法であって、該方法は、支持体上に堆積された非実質細胞を含む１つ以上のバイオインク及び実質細胞を含む１つ以上のバイオインクを、生きている三次元の肝臓組織構成物を形成するために約１時間から約３０日間インキュベートする工程を含み、該構成物は少なくとも１つの区画を備え、該区画は非実質細胞を含む境界で制限された、実質細胞を含む内部を備える。
【００３０】
別の態様において、本明細書中で開示されているのは、操作した、生きている三次元の肝臓組織構成物であって、該構成物は１つ以上の層を含み、少なくとも１つの層は少なくとも２つの細胞型を含み、少なくとも２つの細胞型は実質肝細胞型及び非実質肝細胞型を含み、少なくとも２つの細胞型は平面構造を作成するために互いに近傍に空間的に配置され、平面構造は少なくとも１つの実質肝細胞区画及び少なくとも１つの非実質肝細胞区画を含み、１つ以上の層は生きている三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集し、生きている三次元の肝臓組織構成物が少なくとも７日間のインビトロ培養で実質的に生存でき、少なくとも２つの以下の肝臓の特性を有するように提供される：コレステロールを合成する；  
脂質を保存する；グリコゲンを保存する；以下の２つ以上を含む肝臓特異的なタンパク質を発現する：アルブミン、フィブリノゲン、トランスフェリン、ＣＹＰ４５０、α１−アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、グリコゲン合成酵素、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子；以下の１つ以上を含む肝臓モジュレータに反応する：ホルモン、誘導物質、毒性物、薬、抗体、干渉ＲＮＡ、小型ＲＮＡ、ロックト核酸、ウイルス、細菌、寄生虫および炎症性の誘導物質；以下の１つ以上を含む肝臓毒性物に反応する：アセトアミノフェン、アルコール、トロバフロキサシン、メトトレキセート、ジクロフェナク、トログリタゾン、バルプロ酸および塩酸アミオダロン；以下の１つ以上を含む輸送タンパク質を発現する：ＢＳＥＰ、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＮＴＣＰ、ＰＧＰ、ＢＣＲＰ、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＡＢＣＢ４、ＡＴＰ８Ｂ１、多重薬剤抵抗性輸送体（ＭＤＲ）；成形後に少なくともいくつかの静止した星細胞を保持する；及び、微小血管の構造を含む。
【００３１】
＜特定の定義＞
特に他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３２】
本明細書および添付の請求項に使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がはっきりと特に指示していない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば「核酸」への言及は、これらの開示及び（）を当業者が読むことによって明らかである本明細書中に記載されているタイプの１つ以上の核酸及び／又は組成物を含む。本明細書の「または」へのあらゆる言及は、特に他に明記のない限り、「及び／又は」を包含するように意図される。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「アレイ」は、複数の試験がサンプル上で行われることを可能にする、１つ以上の試験が複数のサンプル上で行われることを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された、複数の要素の関連性を含む科学的ツールを意味する。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「アッセイ」は、有機または生体のサンプル（例えば、細胞集合体、組織、臓器、有機体など）において、物質（例えば、化学物質、分子、生化学物質、タンパク質、ホルモン、または薬物など）の存在または活性を試験または測定するための手順を意味する。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「生体適合性の」は、細胞に対する損傷または毒性の危険性が限られていることを意味する。明細書および請求項で示されるように、「生体適合性のマルチウェル容器」および「生体適合性の膜」は、哺乳動物細胞に対する損傷または毒性の危険性を限定するが、その定義は、生体適合性の要素がインビボで哺乳動物へと注入され得ると示唆するまでには至らない。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「バイオインク」はバイオプリンティングでの使用のための液体、半固体あるいは固体の組成物を意味する。いくつかの実施形態では、バイオインクは細胞溶液、細胞集合体、細胞を含むゲル、多細胞体あるいは組織を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクはさらに支持体材料を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、バイオプリンティングを可能にする特定の生体力学の特性を提供する、非細胞材料をさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは押出化合物を含む。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「バイオプリンティング」は、自動化した、コンピューター支援の、三次元のプロトタイピングデバイス（例えば、バイオプリンター）と適合性のある方法を介して、細胞の三次元の、正確な堆積（例えば、細胞溶液、細胞を含有するゲル剤、細胞懸濁液、細胞濃縮液、多細胞集合体、多細胞体など）を利用することを意味する。
【００３８】
本明細書で使用されるように、「凝集する（ｃｏｈｅｒｅ）」、「凝集した（ｃｏｈｅｒｅｄ）」、および「凝集（ｃｏｈｅｓｉｏｎ）」は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、およびそれらの層に結合する細胞間の接着特性を指す。前記用語は、「融合する（ｆｕｓｅ）」、「融合した（ｆｕｓｅｄ）」、および「融合（ｆｕｓｉｏｎ）」と交換可能に使用される。
【００３９】
本明細書で使用されるように、「シリンダー状」であることはシリンダーの形態を実質的に持つことを意味する。様々な実施形態では、シリンダー状のバイオインクは、シリンダーの形態を実質的に持っており、インクリメントを含み、約９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、７０、６５あるいは６０パーセントシリンダーの形態である。さらに様々な実施形態では、シリンダー状のバイオインクは、インクリメントを含めてその長さに沿って、約９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５あるいは５０パーセントがシリンダーの形態を実質的に持っている。いくつかの実施形態では、「シリンダー状」であることは成形時にシリンダーの形態を実質的に持つことを意味する。
【００４０】
本明細書で使用されるように、「層状である」ことは、Ｚ平面における組織の全体の厚さを増加させるために２つ以上の平面層が組み合わさった多層のバイオプリントされた組織を意味する。いくつかの実施形態では、各平面層は、構造および／または組成において実質的に類似している。他の実施形態では、各平面層は、構造および／または組成において実質的に異なる。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「層」は複数の細胞の厚さがあるＸ及びＹ平面における細胞の集まりを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されている操作した肝臓組織は１つの層を含む。他の実施形態では、本明細書中に記載されている操作した肝臓組織は複数の層を含む。様々な実施形態では、層は、細胞の切れ目がない、実質的に切れ目がない又は切れ目があるシートを形成する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されている操作した肝臓組織の各層は、Ｘ、ＹおよびＺ軸においての複数の細胞を含む。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織の各層は、Ｘ、ＹおよびＺ軸において少なくとも約５０ミクロンの厚さである。
【００４２】
本明細書で使用されるように、「多層である」ことは組織の２つ以上の層で構成されることを意味し、組織層はそれぞれ１つ以上の細胞層の厚さを有する。いくつかの実施形態では、組織の層は一度にひとつずつ堆積される。他の実施形態では、多層は同時に堆積される。随意に、層はそれぞれ多数の細胞型で構成される。さらに、各層の内の多数の細胞型は、Ｘ−Ｙ平面（つまり水平面）中の空間に定義された構造中で互いの近傍に随意に堆積される。更に、空間に定義された構造がＺ平面中に続くように、Ｚ平面（つまり垂直面）中の層の付加は、いくつかの場合には、互いに近傍の層における細胞の制御された空間配置を結果として生じる。
【００４３】
本明細書で使用されるように、「多能性細胞」は、２つ以上の細胞型への分化を受けることができる細胞を指す。多能性細胞は、例えば、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、および胚性幹細胞を含む。
【００４４】
使用されるように、「実質細胞」は肝細胞あるいは肝細胞様細胞を指すが、「非実質細胞」は、肝細胞あるいは肝細胞様細胞でない肝細胞を指す。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「平面である」ことは多細胞のバイオプリントされた組織の層を意味し、複数のバイオインク組成物及び／又は空間が、組織層のＸ−Ｙ平面において実質的に互いに近傍である定義されたパターンに空間的に配置される。例えば図１８Ａ−Ｅを参照されたい。様々な実施形態中で、平面層は実質的に平面であり、例えばインクリメントを含めて約９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、７０あるいは６０パーセントであり、組織層のＸ−Ｙ平面において定義されたパターンに空間的に配置される。
【００４６】
本明細書で使用されるように、「スキャフォールド」は、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲルなどの合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリクスの層および脱細胞化組織などの非合成のスキャフォールド、および操作した組織及び／又は臓器の物理的構造にとって不可欠であり、組織及び／又は臓器の損傷／破壊なしで組織及び／又は臓器から取り除くことができない、任意の他の種類の予め形成されたスキャフォールドを指す。さらなる実施形態において、脱細胞化組織のスキャフォールドは、いかなる様式で培養細胞から生じた脱細胞化した天然の組織又は脱細胞化した細胞材料をも含む；例えば死ぬことを許可されている細胞層又は生存中に生成したＥＣＭを残したまま脱細胞化した細胞層を含む。それ故、用語「スキャフォールドがない（ｓｃａｆｆｏｌｄｌｅｓｓ）」は、スキャフォールドが、使用時に操作した組織の不可欠な部分ではなく、取り除かれたか、または操作した組織の不活性の成分として残っているかを示唆するように意図される。「スキャフォールドがない」は、「スキャフォールドのない（ｓｃａｆｆｏｌｄｆｒｅｅ）」および「予め形成されたスキャフォールドのない（ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｆｏｒｍｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と交換可能に使用される。
【００４７】
本明細書で使用されるように、「被験体」は、ヒト、ヒト以外の動物、任意の哺乳動物、または任意の脊椎動物であり得る、任意の個体を意味する。前記用語は、「患者」、「レシピエント」、および「ドナー」と交換可能である。
【００４８】
本明細書に使用されるように、「支持体」は堆積されたバイオインクを受け取ることができるあらゆる生体適合性の表面を意味する。
【００４９】
本明細書で使用されるように、「組織」は、細胞の集合体を意味する。組織の例は、限定されないが、結合組織（例えば、疎性結合組織、強靭結合組織、弾性組織、網様結合組織、および脂肪組織）、筋組織（例えば、骨格筋、平滑筋および心筋）、尿生殖器組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神経組織、および上皮組織（例えば、単層上皮および重層上皮）、外胚葉組織、内胚葉組織、または中胚葉組織の組織を含む。
【００５０】
＜組織工学＞
組織工学は、臓器の増強、修復、または置換を介して組織機能を回復、維持、または改善する生物学的代替物の開発に向けて、工学とライフサイエンスの原理を適用して組み合わせる学際的分野である。典型的な組織工学に対する基本的なアプローチは、生体適合性である且つ最終的に生体分解性である環境（例えば、スキャフォールド）に生細胞を蒔き、その後、始原細胞の個体群がさらに拡大する且つ成熟するように、この構成物をバイオリアクター内で培養し、移植後に標的組織をもたらすことである。生物学的な細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を模倣する適切なスキャフォールドによって、発達中の組織は、インビトロおよびインビボの成熟後に所望の臓器の形態および機能の両方を取り入れ得る。しかしながら、天然組織様の構造を有する十分に高い細胞密度を達成することは、スキャフォールドの全体にわたって細胞の分布および空間的配置を制御する能力が限定されるため、困難である。これらの限定によって、結果的に、機械的性質が乏しい及び／又は機能が不十分な組織または臓器がもたらされ得る。さらなる困難は、スキャフォールドの生体分解、残留ポリマーの捕捉、および製造プロセスの工業上のスケールアップに関係している。スキャフォールドがないアプローチが試みられてきた。現在のスキャフォールドがないアプローチは、いくつかの制限を受ける：
・１つ以上の層が組成上又は構造上他の層と異なる、又は各層が異なる細胞型を含む、空間的に定義される互いに近傍な配置である多層構造などの、複雑な平面及び／又は層状の構造は、天然組織様の結果を再生可能に達成するために、具体的な構造内で細胞型の明確で高分解能の配置を必要とし得る。
・尺度および幾何学的構造は、拡散及び／又は栄養供給に対する機能的な血管網のための必要条件によって限定される。
・いくつかの場合、組織の生存能力は拡散を限定し、栄養に対する細胞のアクセスを制限する制限物質によって損なわれ得る。
【００５１】
本明細書には、特定の実施形態において、操作した組織、操作した結合組織構成物、それらのアレイ、および成形の方法が開示される。本明細書に開示される組織工学の方法は、以下の利点を有する：
・細胞を含む組織および／または器官を生産することができる。・天然組織様細胞内相互作用を再び作ることで、成長、ホメオスタシス及び／又は天然組織の病原において見られる環境的条件を模倣する。
・複雑なトポロジー及び構造（例えば多層構造、セグメント、シート、チューブ、嚢等）の幅広いアレイによって生きている三次元組織を随意に向上させ、組織を成形する。
・製造の自動化した又は半自動化した手段と適合性があり、スケーラブルである。
【００５２】
バイオプリンティングは、インビトロのアッセイに有用な組織を含むマイクロスケールの組織アナログを生成する方法を改善することができる。
【００５３】
＜バイオプリンティング＞
幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織／構成物の少なくとも１つの成分およびそのアレイが、バイオプリントされた。さらなる実施形態では、バイオプリントされた構成物は、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮液、多細胞体（例えば、シリンダー、スフェロイド、リボンなど）、および随意に、三次元の送達装置（例えば、バイオプリンター）による生体適合性支持体の表面上の制限物質（例えば、ヒドロゲル及び／又は多孔質膜から成る）を含む、細胞の、三次元の、自動化された、コンピューター支援の堆積に基づいて、急速なプロトタイピング技術を利用する方法で作られる。本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態では、組織及び／又は器官に言及するために使用されるときの、用語「操作した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」は、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮液、多細胞集合体、およびそれらの層が、コンピュータースクリプトに基づくコンピューター支援のデバイス（例えば、バイオプリンター）によって、三次元構造を形成するために配置されることを意味する。さらなる実施形態では、コンピュータースクリプトは、例えば、１つ以上のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。またさらなる実施形態では、細胞又は多細胞体のバイオインクのプリンティング後の融合を介して形成される三次元の組織構造は、いくつかの場合において初期の形態形成における自己集合現象に類似する。
【００５４】
手動での配置を含む三次元構造をもたらすために、生体適合性の表面上に、細胞、バイオインク（例えば、多細胞体）、及び／又はそれらの層を配置する多くの方法が利用可能であるが、バイオプリンターなどの、自動化した、コンピューター支援の機器による位置決めが利点となっている。この技術による細胞または多細胞体の送達の利点は、細胞、多細胞集合体、及び／又は様々な組成物を有するそれらの層の、計画された又は予め決められた配向またはパターンを示す構成物をもたらすために、細胞または多細胞体の、急速で、正確で、および再生可能な配置を含む。利点はまた、細胞損傷を最小限にしながら、確かな高い細胞密度を含むこともある。肝臓の実質細胞は、剪断力及び他の生体力学的ストレスによるダメージに特に敏感である；したがって、本明細書中に記載されているバイオインク及びバイオプリンティングプロセスの併用は、図９で示すようなバイオプリンティング後の実質細胞の好ましい生存率として強調されるような、他の技術とは異なる利点を提供する。
【００５５】
幾つかの実施形態では、バイオプリンティングの方法は、連続的及び／又はほぼ連続的である。連続的なバイオプリンティング方法の限定しない例は、バイオインクの貯蔵器に接続された分注チップ（例えば、注射器、キャピラリーチューブなど）を介してバイオプリンターからバイオインク（すなわち細胞、賦形剤又は押出化合物と組み合わせた細胞又は細胞の集合体）を分注することである。さらに限定しない実施形態では、連続的なバイオプリンティング方法は、機能ユニットの繰り返しのパターンでバイオインクを分注することである。様々な実施形態では、繰り返しの機能ユニットは、例えば、円、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則な幾何学的形状を含む、任意の適切な幾何学的構造を有する。よって、異なるバイオインク及び／又は空間の空間的なパターニングを介して達成された平面構造を含む１つ以上の組織層を結果としてもたらす。さらなる実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットの繰り返しのパターンは、層を含み、複数の層は、隣接してバイオプリントされ（例えば、積み重ねられ）、層構造を有する操作した組織または器官を形成する。様々な実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の層は、隣接してバイオプリントされ（例えば、積み重ねられ）、操作した組織または臓器を形成する。さらなる実施形態において、層構造を有する組織の１つ以上の層もまた、平面構造を有する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、機能ユニットは、操作した肝臓組織を横ぎる及び／又は通る潅流を可能にする、一定の間隔で隙間又はチャネルを含む連続的な肝臓組織を形成するために水平方向及び垂直方向の次元の両方に配置された多くの融合された又は凝集したチューブ構造からなる。図１７および１９を参照されたい。
【００５７】
幾つかの実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットは、碁盤目状のパターンで繰り返す。「碁盤目状のパターン」は、重なりや間隙なく平面を満たす図の平面である。図６Ａは、図６Ｂ−Ｄ及び７において描かれた碁盤目状のパターンを作るために随意に繰り返される機能ユニットの例を示す。連続的なおよび／または碁盤目状のバイオプリンティングの利点は、限定しない例として、バイオプリントされた組織の増加した生産性を含む。他の限定されない典型的な利点は、バイオプリンターを、以前に堆積したバイオインクの要素と並べる必要性を排除することであり得る。いくつかの実施形態では、連続的なバイオプリンティングはまた、随意に注射器の機構を使用して、バイオインクの大きな貯蔵器からのより大きな組織の印刷を促進し得る。連続的なバイオプリンティングは、さらに、押出化合物、ヒドロゲル、ポリマー、バイオインク、あるいはプリンティング後にその形状をとどめることができるあらゆる印刷可能な材料を使用して、空間に定義された境界を共に印刷する、便利な方法である；ここで成形される境界は、１つ以上のバイオインクのバイオプリンティングを介して随意に満たされ、その結果空間的に定義された平面構造のモザイク組織を作成する、例えば図３Ａ、５Ａ、５Ｂ、６、８および１１に図示された態様を参照されたい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、連続的なバイオプリンティングでの方法は、印刷の高さ（ｐｒｉｎｔ  ｈｅｉｇｈｔ）、ポンプ速度、ロボット速度、またはそれらの組み合わせなどのパラメーターを、独立してまたは互いに関連させて、最適化及び／又は平衡化することを含み得る。特定の場合では、堆積のためのバイオプリンターヘッドの速度は、３ｍｍ／ｓであり、分注の高さは、第１層に関しては０．５ｍｍであり、各々の続く層に関しては、０．４ｍｍ増加した。幾つかの実施形態では、分注の高さは、バイオプリンターの分注チップの直径とほぼ等しい。限定することなく、適切及び／又は最適な分注の距離によって、結果的に物質が分注針にぴったり付く（ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）または接着することはない。様々な実施形態では、バイオプリンターの分注チップは、約２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍ、またはそれ以上の内径を有し、それらにおいてインクリメント（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）を含む。様々な実施形態において、バイオプリンターのバイオインク貯蔵器は、約．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００立方センチメートル、またはそれ以上の容積を有し、それらにおいてインクリメントを含む。いくつかの場合において、ポンプ速度は、システムにおける残留圧力の上昇が低いときに、適切及び／又は最適であり得る。いくつかの場合において、好都合なポンプ速度は、貯蔵器と分注針の断面積間の比率に依存し得、比率が大きいほど、より低いポンプ速度を必要とする。幾つかの実施形態では、適切な及び／又は最適なプリント速度によって、物質の機械的完全性に影響を与えることなく、一様な線の堆積が可能となる。
【００５９】
本明細書に開示される本発明は、ビジネス方法を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される技術および方法の速度およびスケーラビリティーは、移植のための操作した組織及び／又は臓器の作成、またはインビトロでのアッセイなどの、調査および開発のための細胞ベースのツールの作成における使用のための、産業施設及び／又は商業施設を設計、建築、かつ経営するために利用される。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織及び／又は臓器およびそれらのアレイは、例えば、バイオアッセイおよび高処理能力（Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｕｔ）の薬物スクリーニングのための、細胞アレイ（例えば、マイクロアレイまたはチップ）、組織アレイ（例えば、マイクロアレイまたはチップ）、およびキットとして、作成、保存、分配され、市場に出され、広告、および販売される。他の実施形態では、操作した組織及び／又は臓器およびそれらのアレイは、サービスとしてバイオアッセイ及び／又は薬物スクリーニングを行うために生成される且つ利用される。
【００６０】
＜操作した肝臓組織＞
図１を参照すると、天然の肝臓組織は、互いに近傍に位置する、異なる空間的にパターン化された構造で配置された複数の細胞型を含む。各肝小葉は、肝臓の操作した機能単位を構成し、形状においてはほぼ六角形である。実質細胞又は肝細胞は、小葉を囲んで補助する位置にある非実質細胞（胆管細胞、類洞内皮細胞、星細胞およびクッパー細胞）とともに小葉の大部分を構成し、門脈と胆管の間で（小葉の末梢に沿って）中心静脈に向かって広がっている。非実質細胞の位置及びにそれぞれ類洞及び胆細管に沿った血流と胆汁の流れは、肝細胞のための正常な微小環境を形成するために一緒にふるまい、よって容態及びこれらの細胞の機能に影響する。肝臓中の硬変あるいは繊維症のような様々な病理学的状態は、細胞外マトリクスの過剰生成、炎症、及び病原性サイトカイン及び成長因子の生成によって肝細胞の微小環境が崩壊し、肝臓の構造が次第に破壊されるため、重要な代謝機能の喪失をもたらす。
【００６１】
バイオプリンティングは、区画化された肝臓組織が、三次元への多細胞投入から生じることを可能にし、よって天然の組織構造及び機能を再現するための重要な要素である。小葉に分かれた組織は本明細書中に提供される実施例から生成することができ、実質細胞及び非実質細胞が互いに近傍になるように空間的に配置され、成形された組織の各層において平面構造を形成する。第一の層の構造を正確に再生産した、又は空間又はチャネルあるいは追加の生物学的要素（例えば腫瘍細胞又は病原性あるいは修復／再生プロセスに関与する生物学的又は生化学的構成要素）のような追加の特徴を導入した次の層を加えても良い。小葉のパターンに加えて、バイオプリントされた組織が生成でき、組織において特定の空間的な関係を再生させることができると理解するために、伴わせるダイアグラム（ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  ｄｉａｇｒａｍ）を使用することができ、該組織は限定されないが以下を含む：血管／実質細胞；血管／肝細胞；肝細胞／胆管；繊維症の組織／脈管構造；繊維症の組織／肝細胞；肝細胞／免疫細胞；実質細胞／非実質細胞、肝臓類洞／血液又は血液代用物。さらなる実施形態では、肝臓組織アナログは次のものを含む：肝細胞又は肝細胞様細胞、及び随意に胆管上皮細胞、並びに随意に限定されないが星細胞、内皮細胞、クッパー細胞、免疫細胞あるいは筋線維芽細胞を含む非実質細胞型。
【００６２】
さらに本明細書中に記載されるのは、特定の実施形態において、操作した肝臓組織は凝集された哺乳動物細胞を含み、１つ以上の哺乳動物細胞の層をさらに含み、ここで組織の少なくとも１つの要素はバイオプリントされた。いくつかの実施形態では、１つ以上の組織層は、複数の細胞型又はバイオインク型及び／又は空間がＸ−Ｙ平面における空間的に定義された位置に存在する平面構造によって特徴づけられる。いくつかの実施形態では、組織は、組織に層構造の特徴を与えるように、少なくとも１つの層が他の層と構造的に又は組成的に異なる多層である。さらなる実施形態では、層はＺ平面において類似の厚さである。またさらなる実施形態では、層はＺ平面において可変的な厚さである。さらなる実施形態では、どの単一層も厚さで１つの細胞層である。いくつかの実施形態では、組織は肝臓アナログである。さらなる実施形態では、肝臓組織アナログは次のものを含む：肝細胞又は肝細胞様細胞、及び随意に胆管上皮細胞、並びに随意に限定されないが星細胞、内皮細胞、クッパー細胞、免疫細胞あるいは筋線維芽細胞を含む非実質細胞型。いくつかの実施形態では、結果として生じる肝臓組織構成物は、ｘ、ｙおよびｚ平面において厚さが少なくとも約５０ミクロンである。
【００６３】
いくつかの実施形態において、操作した肝臓組織／構成物はバイオプリントされたものであり、その方法は本明細書に記載されている。さらなる実施形態では、操作した組織の少なくとも１つの構成要素はバイオプリントされている。まださらなる実施形態では、組織の追加の構成要素はバイオプリントされている。いくつかの実施形態では、組織は製造時あるいは使用時に、本明細書にさらに記載されているような任意の予め形成されたスキャフォールドがない。いくつかの実施形態では、バイオプリンティングを含む組織工学技術によって成形されることによる結果、本発明の組織は、有機体の一部として、生体内で発達した組織とさらに識別される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織は任意のタイプの哺乳動物細胞を含む。様々なさらなる実施形態では、操作した肝臓組織は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７の、１８、１９あるいは２０以上の細胞型を含む。いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織細胞は、互いに「凝集」あるいは「接着」している。さらなる実施形態では、凝集または接着は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、及び／又はそれらの層を結合する細胞間の接着特性を指す。
【００６５】
いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、細胞の１つ以上の層を含む。さらなる実施形態では、１つ以上の層は平面構造を有することにより特徴づけられる。またさらなる実施形態では、操作した組織の複数の層が平面の構造を有し、平面構造は層において可変である又は同じである。またさらなる実施形態では、各層の平面構造（Ｘ−Ｙ平面）は、合成組織におけるＺ平面中に追加の構造が作られるように、成形の最中Ｚ平面に整列する。いくつかの実施形態では、多層構造における１つ以上の層は、平面構造を有することでさらに特徴付けられる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、細胞の層は１枚以上のシートの細胞を含む。様々な実施形態では、細胞のシートは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個以上の細胞の厚さであり、インクリメントをそこに含む。他の様々な実施形態では、細胞のシートは約３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍ以上の厚さであり、インクリメントをそこに含む。いくつかの実施形態では、組織の層は、細胞の融合した集合体を含む。さらなる実施形態では、融合に先立ち、細胞の集合体は限定されない例として、実質的に球状、細長形状、実質的にシリンダー状及びリボン様形状に定義された形状又は構造を有する。様々な実施形態では、融合された細胞の集合体は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００μｍ以上の厚さの層を形成し、インクリメントをそこに含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の層は任意のタイプの哺乳動物細胞を含んでいる。様々なさらなる実施形態では、各層は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７の、１８、１９あるいは２０以上の細胞型を含む。いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、１つ以上の表面上の内皮細胞の１つ以上の層を含んでいる。他の実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、１つ以上の表面上の上皮細胞の１つ以上の層を含んでいる。
【００６８】
操作した肝臓組織は、様々な実施形態中で、任意の適切な大きさである。幾つかの実施形態では、バイオプリントされた肝臓組織の大きさは、時間とともに変化する。さらなる実施形態では、バイオプリントされた組織は、例えば、細胞移動、細胞死、細胞間の相互作用、収縮、または縮化の他の形態が原因で、バイオプリンティング後に縮化または収縮する。他の実施形態では、バイオプリントされた組織は、例えば、細胞移動、細胞の成長および増殖、細胞成熟、細胞の成長及び増殖、細胞外マトリクスあるいは他の天然組織の細胞生成要素の生成、細胞／組織成熟、または拡大の他の形態が原因で、バイオプリンティング後に成長または拡大する。
【００６９】
幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織の物理的な寸法は、構成物を内部に拡散するために、酸素を含む栄養素に対する能力によって限定される。様々な実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、バイオプリンティング時に、最小の寸法で、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００μｍであり、それらにおいてインクリメントを含む。様々な実施形態では、操作した肝臓組織は、バイオプリンティング時に、最小の寸法で、少なくとも約０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、または５．０ｍｍであり、それらにおいてインクリメントを含む。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、バイオプリンティング時  に、最小の寸法で、約２５μｍと約５００μｍの間である。
【００７０】
操作した肝臓組織は、様々な実施形態において、任意の適切な形状である。幾つかの実施形態では、形状は、特定の天然の組織または器官を模倣するために選択される。さらなる実施形態では、形状は、特定の病理、疾病、または疾患の状態を模倣するために選択される。幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織は、ほぼ平面の形状を有する。さらなる実施形態では、平面の組織は、限定しない例として、四角形、長方形、多角形、円形、卵形、または不規則な形状を含む、任意の適切な平面構造を有する。いくつかの実施形態では、平面構造は、特定の細胞又はバイオインク要素及び／又は空間を、Ｘ−Ｙ平面において互いに近傍に配置することで操作した肝臓組織において生じる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、格納容器の近傍の空間において組織の位置を固定するのに適切な手段によって格納容器に固定される。いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織は、１つ以上の側面で物理的な支持をし、操作した肝臓組織が占領するスペースを抑制する医療用材料によって制限される。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織は、表面に固定される。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織は、生体適合性の表面に固定される。またさらなる実施形態では、表面に固定することで複数の組織が関連づけられ、本明細書に記載されているようにアレイを形成するために空間的に配置される。いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織は、１つ以上の側面が流体流動によって引き起こされる剪断力にさらされる。さらなる実施形態において、剪断力の適用は、組織の成熟及び発達を促進する、及び／又は移動、分化、増殖、細胞外マトリクスの堆積又は組織内の細胞の内側又は外側へのタンパク質あるいは分子の輸送を促進する役目を担う。他の実施形態では、操作した肝臓組織は、１つ以上の表面上への液体の栄養素の連続的又は周期的な潅流、再循環又は撹拌にさらされる。他の実施形態では、操作した肝臓組織及びその配列は、各構成物に液体培地の連続的か周期的な再循環を提供する、マルチウェルバイオリアクターに収容される。
【００７２】
＜組織構造＞
天然の組織は、組織の細胞内及び細胞外構成要素（つまり空間、細胞外マトリクス、タンパク質の物質など）によって駆動する空間的及び構成的パターンの存在によって特徴づけられる。三次元性を達成するために合成スキャフォールドを展開させる組織工学的戦略に対する固有の難題は、天然組織の構造的及び生物学的属性を再生産できないことである。現在までに、スキャフォールド構造中に天然組織様層状又は平面構造を作る試みがなされている一方、天然組織を模倣する密度での細胞の組み込みを可能にすることは、技術的な限界によって阻まれている。バイオプリンティングは、図１８Ａ−Ｅに図示されている例に基づく、細胞を含むバイオインクの空間的に定義された堆積を通して、両方の固有の難題（平面／層状構造及び細胞密度）を克服する。いくつかの実施形態では、平面構造は多数のバイオインク製剤から作成され、これによって２つ以上の組織要素（すなわちストロマ、上皮、血管、硬骨、軟骨、柔組織的、皮質、骨髄、乳頭、小葉など）が、各組織要素／細胞集団／バイオインク製剤を、Ｘ、Ｙ及び／又はＺ平面上で互いに近傍である定義された位置に配置するような様式で成形される。いくつかの実施形態では、平面構造は空間を組込む。さらなる実施形態において、平面構造における空間は、血液、リンパ、胆汁、尿、分泌液などのような体液の少なくとも１つの要素を模倣した液体を収容する。さらなる実施形態では、空間は、随意に非接着細胞型あるいは体液由来の構成要素（例えば血球、骨髄細胞、リンパ細胞、免疫細胞、癌細胞、血小板、タンパク質など）を含んでいる。またさらなる実施形態では、体液由来の構成要の素非接着細胞型は、平面構造の細胞を含む要素に、成形前、最中又は後で導入された非空間の要素として随意に存在する。まださらなる実施形態では、非支持者の細胞の構成要素あるいは体液を派生した構成要素は、細胞間の相互作用あるいは分泌された要因に対する反応の結果平面構造内の細胞を含むスペースへ空間から補充される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、流体流動または潅流は、構造中の空間を通って随意に開始される。いくつかの実施形態では、平面構造は、組織−組織又は組織−液体インターフェイスの生成を可能にする。さらなる実施形態では、組織は、構造によって作られたインターフェイスの細胞のリアルタイムでの観察を可能にするために光学的に透明な容器の中に成形される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、組織は複数の層を含み、少なくとも１つの層が構成物中の他の層と構造的に又は組成的に異なり、よってＺ平面において層状構造が作られる。層状構造の例は、図１８Ｆで示される例によって描かれるような、基礎をなす間質組織への内皮性又は上皮性関門を備えた障壁組織を含む。いくつかの実施形態では、組織の１つ以上の層が血管又は微小血管の構成要素を組込む。さらなる実施形態では、血管又は微小血管要素の組み込みは、操作した組織の１つ以上の要素における微小血管又は偽血管ネットワークの形成をもたらす。いくつかの実施形態では、層状構造を持った組織の１つ以上の構成要素がバイオプリントされる。いくつかの実施形態では、層状構造を持った１つ以上の組織が互いに近接して成形され、組織インターフェイスを作る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、層状構造を備えた多層の操作した組織の１つ以上の層は、図１８Ｇにおいて述べられた、限定しない例に従って、平面構造も含む。いくつかの実施形態では、同じ平面構造は各層において連続しており、結果としてＸ，Ｙ及びＺ平面における連続的な構造を有する三次元組織が生じる。いくつかの実施形態では、結果として生じた三次元組織がＸ、ＹおよびＺ平面中の複雑な構造を有するように、１つ以上の層状の層の組成又は平面構造は変えられる。
【００７６】
図１８Ａに従って、特別の実施形態では、操作した肝臓組織は、血管のネットワークを持った構造上正確な組織を意味する平面構造で成形されている。この実施形態では、操作した肝臓組織は、肝細胞のような実質細胞を含む第一のバイオインクによって成形される。実質細胞の層はそれぞれ随意に任意の平面パターンを含んでいる。この実施形態では、操作した肝臓組織は、血管のネットワークを形成する内皮細胞、平滑筋細胞および繊維芽細胞のような血管関連の細胞を含む、第二のバイオインクで成形される。随意に、この構造は第１のバイオプリンティング及び血管ネットワークを確立することによって作ることができ、その後そのネットワークの周りを囲む肝臓組織を第二の工程で成形できる。
【００７７】
図１８Ｂに従って、特別の実施形態では、操作した肝臓組織は、組織の帯状接点を表わす平面構造で成形される。例えば、これは門脈周囲の部位から小葉中心付近の部位へ、肝腺房の３つの特定の領域を複製するのに使用することができる。
【００７８】
図１８Ｃに従って、特別の実施形態では、操作した肝臓組織は、小葉に分かれた組織を意味する平面構造で成形される。この実施形態では、操作した肝臓組織は、小葉を形成するために第一のバイオインクを含む肝細胞で成形される。各幾何学的な小葉は、その境界において空間的に方向づけられている構造を随意に含む。この実施形態では、操作した肝臓組織は、小葉の周りに境界を形成するためにストロマ／血管細胞を含む第二のバイオインクで成形される。
【００７９】
図１８Ｄに従って、特別の実施形態では、操作した肝臓組織は、潅流させた／配列された組織を意味する平面構造によって成形される。この実施形態では、第一の構成要素は、内腔を備えたチャネル、管あるいはチューブを形成する。この実施形態中で、第二の構成要素は、随意に同じ大きさ／形状又は異なる大きさ／形状であり、随意に１つの細胞型又は複数の細胞型を含み、及び随意にＸ、Ｙ及び／又はＺ平面上の方向づけられたパターニングによって達成される１つ以上の空間的パターンを含む組織パッチを形成する。
【００８０】
図１８Ｅに従って、特別の実施形態では、操作した肝臓組織は、固体＋液体／液体の組織インターフェイスを意味する平面構造で成形される。この実施形態では、第一のバイオインクは内腔構造の外部壁を形成し、第二のバイオインクは内腔構造の内部壁を形成し、必要であれば第三の要素は随意に細胞又は他の生物学的に適切な構成要素を含む液体である。
【００８１】
図１８Ｆに従って、特別の実施形態では、操作した肝臓組織は、障壁組織を意味する層状構造で成形される。この実施形態では、障壁層は随意に内皮又は上皮であり、間質層は内腔組織の壁および／または表面を形成し、それは多孔質メッシュ又は薄膜に基づく。
【００８２】
図１８Ｇに従って、特別の実施形態では、操作した肝臓組織は、各々平面構造を有する複数の層で成形され、層状構造を持った組織を形成するために積み重ねられる。この実施形態では、ＸとＹの軸の平面構造は、Ｚ軸を通って成形された組織への連続している。構造の特徴は、随意に切れ目のないチャネル又は細胞の区画を含んでいる。
【００８３】
＜細胞＞
本明細書には、幾つかの実施形態において、１つ以上のタイプの哺乳動物細胞を含む操作した肝臓組織（例えば肝臓アナログ）が開示される。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織は、肝細胞あるいは肝細胞様細胞を含む。またさらなる実施形態では、適切な肝細胞あるいは肝細胞様細胞は、限定されないが原発性の肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞のような細胞株、ＨｅｐａＲＧ細胞のような組織に特有の前駆細胞あるいはその組み合わせを含む。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織は胆管上皮性細胞あるいは胆管上皮性細胞様細胞を含む。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織は非実質細胞を含む。またさらなる実施形態では、適切な非実質細胞は限定されないが、血管細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、筋線維芽細胞、脂肪細胞、脂肪生成の細胞、間葉細胞、免疫細胞、クッパー細胞、星細胞、胆管上皮細胞、胆管上皮性細胞様細胞、類洞内皮細胞、肝臓由来の幹細胞／前駆細胞、非肝臓由来の幹細胞／前駆細胞、またその組み合わせを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、どんな哺乳動物細胞もが、操作した肝臓組織とそのアレイの包含に適している。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織の少なくとも１つの構成要素は接着細胞型である。さらなる実施形態において、哺乳動物細胞は、限定しない例として、肝細胞、実質細胞、非実質細胞、収縮性又は筋細胞（例えば平滑筋細胞、また筋芽細胞）、結合組織細胞（例えば繊維芽細胞）、骨髄細胞、内皮細胞、上皮細胞、血管細胞、血球、リンパ細胞、周皮細胞、中皮細胞、間質細胞、未分化細胞（例えば胚細胞、幹細胞および前駆細胞）、内胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞、外胚葉由来の細胞および組み合わせである。
【００８５】
いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織は、ヒト内皮細胞のような内皮細胞を含んでいる。いくつかの実施形態中で、適切な内皮細胞は、限定しない例として、肝臓組織、血液、血管、リンパ管、消化管の組織、尿生殖路の組織、脂肪組織、気道の組織、生殖器系の組織、骨髄及び臍の組織を含む組織に由来する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、細胞は成体の分化細胞である。さらなる実施形態では、「分化細胞」は、分離時に、例えば、平滑筋細胞、線維芽細胞、または内皮細胞と一致した、組織特異的な表現型を有する細胞であり、ここで、組織特異的な表現型（または表現型を示す可能性）は、分離時から使用時まで維持される。他の実施形態では、細胞は成体の未分化細胞である。さらなる実施形態では、「未分化細胞」は、明確な組織特異的な特性を有さない又は失くした細胞である。幾つかの実施形態では、非分化細胞は、幹細胞を含む。幾つかの実施形態では、「幹細胞」は、効能および自己複製を示す細胞である。幹細胞は、限定されないが、全能細胞、万能細胞、多能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、および前駆細胞を含む。様々な実施形態において、幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、羊膜の幹細胞、および人工多能性幹細胞であり得る。さらに他の実施形態では、細胞は、分化細胞および未分化細胞の混合物である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、実質細胞を含む操作した肝臓組織は、多能性幹細胞／前駆細胞に由来する。様々な実施形態では、実質細胞は、適切に胎児の哺乳類の肝臓組織；胚性幹細胞（ＥＳＣ）；人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；肝臓に由来した成人の幹細胞／前駆細胞；及び肝臓以外に組織に由来した成人の幹細胞／前駆細胞、に由来する。いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織は、肝臓構成物の成形において使用する前に、部分的に又は完全に内胚葉又は肝性の表現型に分化した多能性幹細胞／前駆細胞に由来する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、構成物は、１つ以上の分化シグナルにさらされた幹細胞／前駆細胞を含む。さらなる実施形態では、分化シグナルは、生体力学的シグナル、可溶性シグナル（例えば生化学的シグナル）および物理的なシグナルの１つ以上を含む。幹細胞／前駆細胞は、操作した肝臓組織の成形プロセスにおいて多くの時点で１つ以上の分化シグナルに適切にさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の前に１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の最中に１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態において、幹細胞／前駆細胞は、構成物の成形の後に１つ以上の分化シグナルにさらされた。
【００８９】
様々な実施形態において、細胞の細胞型および／またはソースは、特定の研究目標あるいは目的に基づいて、選択される、形成される、処置される、又は調整される。いくつかの実施形態では、１つ以上の特定の細胞型が、特定の疾患又は疾病の検査を促進するために、選択されている、形成される、処置される、又は調整される。いくつかの実施形態では、１つ以上の特定の細胞型が、特定の被験体の疾患あるいは疾病の検査を促進するために選択されている、形成される、処置される、又は調整される。いくつかの実施形態では、１つ以上の特定の細胞型が２人以上の別のヒトドナーに由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の特定の細胞型が特定の脊椎動物被験体に由来する。さらなる実施形態では、１つ以上の特定の細胞型が特定の哺乳動物被験体に由来する。またさらなる実施形態では、１つ以上の特定の細胞型が特定のヒト被験体に由来する。さらなる実施形態では、１つ以上の特定の細胞型が、疾患又は組織機能性に関連した特定の表現型を備えた特定の被験体に由来する。またさらなる実施形態では、被験体に特有の細胞は、生検又は組織サンプリング経由で興味のある目的組織から分離される。さらなる実施形態では、被験体に特有の細胞は、分離直後に組織を成形するために利用される。他の実施形態では、被験体に特有の細胞は、三次元組織の成形での使用に先立って生体外で操作される；ここで、操作は、以下の１つ以上を含んでいる：拡張、分化、方向づけられた分化、増殖、タンパク質または核酸への曝露、遺伝子ベクターの組み込み、遺伝子的又は非遺伝子的細胞トレーシング部分の組み込み、脱分化（すなわち人工多能性細胞又はその等価物）及び低温保存。いくつかの実施形態では、被験体に特有の細胞は標的組織以外の組織から分離される。さらなる実施形態では、被験体に特有の細胞は、標的組織中の目的の細胞型へ分化を必要である。またさらなる実施形態では、分化が必要な被験体に特有の細胞は、三次元構造を成形する前、最中又は後で分化される。
【００９０】
＜細胞を培養する方法＞
本発明の操作した肝臓組織で使用される細胞型は、当該技術分野に既知の任意の方法で適切に培養され得る。細胞および組織の培養の方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｃｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｓ；  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  （１９８７），  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載され、それらの内容は、そのような情報のための引用によって本明細書に組み込まれる。本発明と併用して使用され得る、一般的な哺乳動物の細胞培養技術、細胞株、および細胞培養系も、Ｄｏｙｌｅ，Ａ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ｂ．，Ｎｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｇ．，（ｅｄｓ．）Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｗｉｌｅｙ（１９９８）に記載され、それらの内容は、そのような情報のための引用によって本明細書に組み込まれる。
【００９１】
培養中の哺乳動物細胞のための適切な成長条件は、当該技術分野に周知である。細胞培養培地は、一般に、必須栄養素を含み、随意に、成長因子、塩、ミネラル、ビタミンなどの追加の要素を含み、これらは培養されている細胞型に従って選択され得る。特定の成分は、細胞の増殖、分化、特異タンパク質の分泌などを増強するために選択され得る。一般に、標準的な成長培地は、１−２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、子ウシ血清、  またはヒト血清、インスリン（４マイクログラム／ｍＬ）、デキサメタゾン（１．０マイクロモーラー）、アムホテリシンＢ（０．２５マイクログラム／ｍＬ）及びＧｌｕｔａｍａｘ（１．０マイクロモーラー）で補足された、４ｇ／Ｌグルコースを有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む。当該技術分野で知られているのは、インスリン（１ｇ／ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．００６７ｇ／ｌ）、トランスフェリン（０．５５ｇ／ｌ）、デキサメタゾン（１マイクロモーラー）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、アムホテリシンＢ（０．２５マイクログラム／ｍＬ）とＧｌｕｔａｍａｘ（１ｘ）で捕捉されたＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地又は様々な他の培地である。好ましくは、細胞は、細胞の起源の動物の体温で又はそれに近い温度で、１−２１％のＯ２および好ましくは３−５％のＣＯ２の大気中において無菌条件下で培養される。例えば、ヒト細胞は、好ましくは、およそ３７℃で培養される。
【００９２】
細胞はまた、所望の株（ｌｉｎｅ）に沿って細胞の分化を誘発する細胞の分化剤によって培養され得る。例えば、いくつかの実施形態中で、細胞は成長因子、サイトカインなどで随意に培養され、用語「成長因子」は、細胞によって生成され、それ自体に及び／又は様々な他の隣接する又は離れた細胞に影響を与える、タンパク質、ポリペプチド、またはサイトカインを含むポリペプチドの複合体を指す。典型的に、成長因子は、特異的なタイプの細胞の成長及び／又は分化に、発達上で、または複数の生理学的または環境上の刺激に反応してのいず  れかで、影響を与える。すべてではないが、幾つかの成長因子は、ホルモンである。典型的な成長因子は、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＡＢを含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を含む形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８などである。成長因子は、とりわけ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｄａｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８６；  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｄｅｄ．，Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０００において議論される。当業者は、本明細書に記載される  調整培地中の任意の及びすべての培養由来の成長因子が本発明の範囲内にあると理解するであろう。
【００９３】
＜バイオインクおよび多細胞集合体＞
本明細書には、特定の実施形態において、バイオプリントされた細胞を含む肝臓組織／構成物を含む組織、その配列、および方法が開示される。幾つかの実施形態では、細胞は、バイオプリンターからバイオインクを堆積させる又は押し出すことによってバイオプリントされる。幾つかの実施形態では、「バイオインク」は、複数の細胞を含む、液体、半固体、または固体の組成物を含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、液体または半固体の細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮液を含む。さらなる実施形態では、細胞溶液、細胞懸濁液又は細胞濃縮液は、液体又は半固体（例えば粘性）担体及び複数の細胞を含む。またさらなる実施形態では、担体は、本明細書中に記載されているような適切な細胞栄養培養液である。いくつかの実施形態では、バイオインクは、バイオプリンティングに先立って多細胞集合体へ随意に凝集した複数の細胞を含む。さらなる実施形態において、バイオインクは複数の細胞を含み、特定の平面及び／又は層状構造を生成するためにバイオプリントされ、ここで個別の細胞の凝集がバイオインク中でバイオプリンティングの前、最中及び／又は後で起こる。いくつかの実施形態では、バイオインクは１）固定された容量中の複数の細胞を集めることにより生産され；ここで、細胞の構成要素は、全容積の少なくとも約３０％と最も多くて１００％に相当する。いくつかの実施形態では、バイオインクは半固体又は固体の多細胞集合体あるいは多細胞体を含む。さらなる実施形態では、バイオインクは、１）結果的にバイオインクをもたらすために、予め決められた割合で複数の細胞または細胞集合体を生体適合性の液体またはゲルと混合することによって、および２）所望の細胞密度および粘性を有するバイオインクを生成するために、バイオインクを圧縮する（ｃｏｍｐａｃｔｉｎｇ）ことによって生成される。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、遠心分離、タンジェント流ろ過（「ＴＦＦ」）、またはそれらの組み合わせによって達成される。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、結果的に、押し出し成形できる組成物をもたらし、多細胞集合体または多細胞体の形成を可能にする。幾つかの実施形態では、「押し出し成形できる」は、ノズルまたは開口部（ｏｒｉｆｉｃｅ）（例えば、１つ以上の穴またはチューブ）を通して押し進める（ｆｏｒｃｉｎｇ）（例えば、圧力下で）ことによって形作られることが可能であることを意味する。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、適切な密度まで細胞を成長させることから結果的に生じる。バイオインクに必要な細胞密度は、使用されている細胞および生成されている組織または器官に応じて異なる。幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞は、凝集及び／又は接着される。幾つかの実施形態では、「凝集する」、「凝集した」、および「凝集」は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、及び／又はそれらの層を結合する細胞間の接着特性を指す。さらなる実施形態では、前記用語は、「融合する」、「融合した」、および「融合」と交換可能に使用される。幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、支持材、細胞培養培地、細胞外マトリクス（またはその成分）、細胞接着剤、細胞死抑制剤、抗アポトーシス性薬剤、抗酸化剤、押出化合物、およびそれらの組み合わせを含む。
【００９４】
様々な実施形態では、細胞は、任意の適切な細胞である。さらなる様々な実施形態では、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、またはそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法に使用される細胞型は、生成されている構成物または組織のタイプに依存する。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１つのタイプの細胞を含む（「均一な」又は「単型」バイオインクとも呼ばれる）。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１つを超えるタイプの細胞を含む（「異種混合」又は「多型」バイオインクとも呼ばれる）。
【００９５】
＜細胞培養培地＞
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、任意の適切な培地である。様々な実施形態では、適切な細胞培養培地は、限定しない例として、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ、Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ、Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  Ｓａｌｔｓ、オルシーバー液、Ｇｅｙ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋｒｅｂ’ｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ、Ｋｒｅｂ’ｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｕｃｋ’ｓ  Ｓａｌｉｎｅ、ダルベッコ変法イーグル培地、ダルベッコ変法イーグル培地／栄養素Ｆ−１２Ｈａｍ、栄養素混合物Ｆ−１０Ｈａｍ（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０）、培地１９９、最少必須培地イーグル、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ａｍｅｓ’Ｍｅｄｉａ、ＢＧＪｂ培地（Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｇｌａｓｃｏｗ最少必須培地（ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ変法培地、ＮＣＴＣ媒体、Ｓｗｉｍ’ｓ  Ｓ−７７培地、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ培地Ｅ、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、変更されるか又は補足される。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、アルブミン、セレン、トランスフェリン、フェチュイン、砂糖、アミノ酸、ビタミン、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、脂質、脂質担体、シクロデキストリン、またはそれらの組み合わせをさらに含む。
【００９６】
＜細胞間マトリクス＞
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞外マトリクスまたはその誘導体の１つ以上の成分をさらに含む。幾つかの実施形態では、「細胞外マトリクス」は、細胞によって生成され、細胞から細胞外空間へと輸送されるタンパク質を含み、ここで、タンパク質は、組織を一緒に保持するための支持として機能することで、引っ張り強度を提供し、及び／又は細胞シグナル伝達を促進する。細胞外マトリクス成分の例は、限定されないが、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロナート、エラスチン、およびプロテオグリカンを含む。例えば、多細胞集合体は、様々なＥＣＭタンパク質（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、及び／又はプロテオグリカン）を含み得る。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞集合体を形成するために使用される細胞ペーストに加えられ得る。細胞ペーストに加えられたＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、ヒトまたは動物源から精製され得るか、または当該技術分野に既知の組換え方法によって生成され得る。あるいは、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、細長い細胞体中の細胞によって自然に分泌され得るか、または細長い細胞体を作るために使用される細胞は、当該技術分野に公知の任意の適切な方法によって遺伝子操作され得ることで、１以上のＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体及び／又は１以上の細胞接着分子または細胞基質接着分子（例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリン、およびアドヒリン（ａｄｈｅｒｉｎｓ））の発現レベルを変化させることができる。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞集合体中の細胞の凝集を促進し得る。例えば、ゼラチン及び／又はフィブリノゲンは、細胞ペーストに適切に加えられ得、多細胞集合体を形成するために使用される。フィブリノゲンは、トロンビンを加えることによってフィブリンに転換され得る。
【００９７】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞接着を促進する薬剤をさらに含む。
【００９８】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞死（例えば、壊死、アポトーシス、または自己貪食）を阻害する薬剤をさらに含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、抗アポトーシス性薬剤をさらに含む。細胞死を阻害する薬剤は、限定されないが、小分子、抗体、ペプチド、ペプチ体（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞死を阻害する薬剤は、抗ＴＮＦ薬剤、インターロイキンの活性を阻害する薬剤、インターフェロンの活性を阻害する薬剤、ＧＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）の活性を阻害する薬剤、マクロファージ炎症タンパク質の活性を阻害する薬剤、ＴＧＦ−Ｂ（形質転換成長因子Ｂ）の活性を阻害する薬剤（図１５及び１６参照）、ＭＭＰ（マトリクスメタロプロテアーゼ）の活性を阻害する薬剤、カスパーゼの活性を阻害する薬剤、ＭＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達カスケードの活性を阻害する薬剤、Ｓｒｃキナーゼの活性を阻害する薬剤、ＪＡＫ（ヤヌス・キナーゼ）の活性を阻害する薬剤、またはそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、バイオインクは、抗酸化剤を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは酸素担体あるいは他の細胞特異的な栄養素を含む。
【００９９】
＜押出化合物＞
幾つかの実施形態では、バイオインクは、押出化合物（すなわち、バイオインクの押出特性を変更する化合物）をさらに含む。押出化合物の例は、限定されないが、ゲル、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸に基づくゲル、界面活性剤ポリオール（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７またはＰＦ−１２７）、熱応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、細胞外マトリクス成分（およびその誘導体）、コラーゲン、ゼラチン、他の生体適合性の天然または合成のポリマー、ナノファイバー、および自己集合性ナノファイバーを含む。いくつかの実施形態では、押出化合物は、物理的な手段、化学の手段、あるいは酵素的な手段によってバイオプリントした後に取り除かれる。
【０１００】
ときにゼリーとも呼ばれるゲルは、様々な方法で定義されてきた。例えば、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）は、ゲルを、液体がしみこんだ小さな無機粒子または大きな有機分子のいずれかで構成された懸濁液から成る半固体系として定義している。ゲルは、単相系または二相系を含む。単相ゲルは、分散した巨大分子と液体との間に明らかな境界が存在しないような方法で、液体全体に均一に分布される有機巨大分子から成る。幾つかの単相ゲルは、合成巨大分子（例えば、カルボマー）または天然ゴム（例えば、トラガカント）から調製される。幾つかの実施形態では、単相ゲルは、一般的に水性であるが、アルコールおよび油を用いても作成されるであろう。二相ゲルは、小さな別個の分子の網目（ｎｅｔｗｏｒｋ）から成る。
【０１０１】
ゲルはまた、疎水性ゲルまたは親水性ゲルとして分類することができる。特定の実施形態では、疎水性ゲルの基材（ｂａｓｅ）は、ポリエチレンを有する液体パラフィンまたはコロイド状シリカでゲル化された脂肪油、またはアルミニウム石鹸または亜鉛石鹸から成る。対照的に、疎水性ゲルの基材は、通常、水、グリセロール、または適切なゲル化剤（例えば、トラガカント、デンプン、セルロースの誘導体、カルボキシビニルポリマー、マグネシウム−アルミニウムシリケート）でゲル化したプロピレングリコールから成る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物またはデバイスのレオロジーは、擬プラスチック、プラスチック、チキソトロピック、またはダイラタントである。
【０１０２】
適切なヒドロゲルは、コラーゲン、ヒアルロナート、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。他の実施形態では、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（酸化エチレン）およびそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。様々な具体的な実施形態では、制限物質は、ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピルｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、シルク、ペプチドヒドロゲル、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、ヒドロゲルベースの押出化合物は、（熱応答性のゲルまたは温熱ゲル（ｔｈｅｒｍｏｇｅｌｓ）としても知られる）熱可逆性のゲルである。幾つかの実施形態では、適切な熱可逆性のヒドロゲルは、室温で液体ではない。具体的な実施形態では、適切なヒドロゲルのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、約１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約１０℃乃至約４０℃である。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約２０℃乃至約３０℃である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオインク（例えば、ヒドロゲル、１つ以上の細胞型、他の添加剤などを含む）は、室温で液体ではない。いくつかの実施形態では、適切な熱可逆性ヒドロゲルは哺乳動物の体温で液体ではない。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）が、約２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約２２℃乃至約５２℃である。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約３２℃乃至約４２℃である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されているバイオインク（例えばヒドロゲル、１つ以上の細胞型及び他の添加剤等を含む）は哺乳動物の体温で液体ではない。具体的な実施形態では、本明細書中に記載されているバイオインクのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃に、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、本明細書中に記載されているバイオインクのＴｇｅｌは、約１０℃乃至約１５℃である。別の特定の実施形態では、本明細書中に記載されているバイオインクのＴｇｅｌは、約１５℃乃至約２０℃である。別の特定の実施形態では、本明細書中に記載されているバイオインクのＴｇｅｌは、約２０℃乃至約２５℃である。別の特定の実施形態では、本明細書中に記載されているバイオインクのＴｇｅｌは、約２５℃乃至約３０℃である。別の特定の実施形態では、本明細書中に記載されているバイオインクのＴｇｅｌは、約３０℃乃至約３５℃である。別の特定の実施形態では、本明細書中に記載されているバイオインクのＴｇｅｌは、約３５℃乃至約４０℃である。別の特定の実施形態では、本明細書中に記載されているバイオインクのＴｇｅｌは、約４０℃乃至約４５℃である。別の特定の実施形態では、本明細書中に記載されているバイオインクのＴｇｅｌは、約４５℃乃至約５０℃である。
【０１０４】
ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンで構成されたポリマーは、水溶液に組み入れられると、熱可逆性のゲルを形成する。これらのポリマーは、バイオプリンター機器において維持することができる温度で、液態からゲル状態まで変化する能力を有する。液態からゲル状態の相転移は、ポリマー濃度および溶液中の成分に依存する。
【０１０５】
ポロクサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７またはＰＦ‐１２７）は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーから成る非イオン性界面活性剤である。他のポロクサマーは、１８８（Ｆ−６８グレード）、２３７（Ｆ−８７グレード）、３３８（Ｆ−１０８グレード）を含む。ポロクサマーの水溶液は、酸、アルカリ、および金属イオンの存在下で安定している。ＰＦ−１２７は、市販で入手可能な、１３，０００の平均分子量を有する、一般式Ｅ１０６  Ｐ７０  Ｅ１０６のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレントリブロックコポリマーである。このポリマーは、ポリマーのゲル化性を増強する適切な方法によってさらに精製することができる。前記ポリマーは、その親水性の割合を占める、約７０％のエチレンオキシドを含有している。前記ポリマーは、ポロクサマー  ＡＢＡ型ブロックコポリマーのシリーズの１つである。ＰＦ−１２７は、良好な可溶化能力を有し、毒性が低く、したがって、適切な押出化合物と考えられる。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、本明細書で示されるヒドロゲルおよびバイオインクの粘度は、記載される任意の手段で測定される。例えば、幾つかの実施形態では、ＬＶＤＶ‐ＩＩ＋ＣＰ  Ｃｏｎｅ  ＰｌａｔｅＶｉｓｃｏｍｅｔｅｒおよびＣｏｎｅ  Ｓｐｉｎｄｌｅ  ＣＰＥ‐４０が、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出するために使用される。他の実施形態では、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（スピンドルおよびカップ）の粘度計が、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出するために使用される。幾つかの実施形態では、本明細書で参照される粘度範囲は、室温で測定される。他の実施形態では、本明細書で参照される粘度範囲は、体温（例えば、健康なヒトの平均体温）で測定される。
【０１０７】
さらなる実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクは、約５００乃至１，０００，０００センチポアズ、約７５０乃至１，０００，０００センチポアズ；約１０００乃至１，０００，０００センチポアズ；約１０００乃至４００，０００センチポアズ；約２０００乃至１００，０００センチポアズ；約３０００乃至５０，０００センチポアズ；約４０００乃至２５，０００センチポアズ；約５０００乃至２０，０００センチポアズ；または約６０００乃至１５，０００センチポアズの間の粘度を有していることを特徴とする。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、連続的なバイオプリンティングに適した細胞および押出化合物を含む。具体的な実施形態では、バイオインクは、約１５００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７と細胞物質の混合物は、連続的なバイオプリンティングに適し得る。そのようなバイオインクは、４８時間にわたる冷たい（４℃）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の連続混合によるＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の粉末を、３０％（ｗ／ｖ）まで溶解することによって調製され得る。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７はまた、水中で溶解され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、標準の無菌の細胞培養技術を使用して、培養且つ拡大され得る。さらなる実施形態において、細胞は、例えば２００ｇでペレットにされ得、３０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７中で再懸濁され、および約１０乃至約２５℃のゲル化温度で凝固することを可能にするバイオプリンターに付けられたリザーバーへと吸引される。バイオプリンティング前のバイオインクのゲル化は随意である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を含有するバイオインクを含む、バイオインクは、液体として分注され得る。
【０１０９】
様々な実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、適切な粘度及び／又は細胞毒性の特性を有する任意の値であり得る。いくつかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７は、その適切な濃度によって、バイオプリントされたときに、その形状を保持しながら重さを支えることも可能であり得る。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％である。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７の濃度は、約３０％と約４０％の間、または約３０％と約３５％の間である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、押出化合物又は賦形剤の中で、ゼラチンの濃度は６％であり、アルギン酸塩の濃度は０．５％である。他の実施形態では、押出化合物又は賦形剤の中で、ゼラチンの濃度は４％であり、アルギン酸塩の濃度は２％である。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞構造がない成分（例えば、押出化合物など）は、使用前に取り除かれる。さらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、例えば、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸に基づくゲル、界面活性剤ポリオール、熱応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、コラーゲン、または他の生体適合性の天然または合成のポリマーである。またさらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、物理的、化学的、または酵素的な手段によって取り除かれる。幾つかの実施形態では、細胞構造がない成分の割合（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）は、使用時の細胞成分と関連したままである。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞間相互作用を増加させるように予め処理される。例えば、細胞は、バイオインクを形作る前に、細胞間相互作用を増強するために、遠心分離後に遠心管の内部で適切にインキュベートされ得る。
【０１１３】
＜典型的な細胞の比率＞
いくつかの実施形態では、バイオインクは多細胞体を含み、それはさらに非実質的な肝細胞（例えば内皮細胞、肝星細胞、クッパー細胞）を含む。さらなる実施形態では、クッパー細胞：肝星細胞：内皮細胞の比率は、任意の適切な比率である。さらなる実施形態では、クッパー細胞：肝星細胞：内皮細胞の比率は、約９０：１０：０から約１０：９０：０である。さらなる実施形態では、クッパー細胞：肝星細胞：内皮細胞の比率は、４５：４５：１０である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、バイオインクは多細胞体を含み、さらに１００：０の比率で肝細胞（例えば原発性の肝細胞、ＨｅｐＧ２あるいはＨｅｐａＲＧ）と追加の細胞型を含む。さらなる実施形態では、追加の非実質細胞型（例えば内皮細胞）に対する肝細胞の比率は、９５：５である。さらなる実施形態では、追加の非実質細胞型（例えば内皮細胞、星細胞））に対する肝細胞の比率は、５０：５０である。またさらなる実施形態では、非実質細胞（例えば内皮細胞、星細胞、クッパー細胞）に対する実質細胞の比率は、５０：３５：１０：５である。
【０１１５】
＜細胞の自己選別（Ｓｅｌｆ−ｓｏｒｔｉｎｇ）＞
幾つかの実施形態では、構成物または組織を形成するために使用される多細胞集合体は、操作した組織に含められるすべての細胞型（例えば、肝細胞、内皮細胞、肝星細胞、クッパー細胞など）を含み；このような例では、各細胞型は、肝臓組織構成物などの操作した組織を形成するために、（例えば、成熟の間に）適切な位置へと移動する。他の実施形態では、構造を形成するために使用される多細胞集合体は、操作した組織に含められるすべての細胞型より少ない細胞型を含む。幾つかの実施形態では、各タイプの細胞は、多細胞集合体または組織の領域または層内に均一に分散される。
他の実施形態では、各細胞型は、多細胞集合体または組織の領域または層内の特定の領域に局在化する。
【０１１６】
例えば、肝細胞を含む、内皮細胞、肝星細胞及びクッパー細胞を含む操作した肝臓組織の場合には、適切な比率（例えば７０：１５：１０：５）で、近接し、バイオプリントされた凝集した多型のバイオインクユニットは融合した。成熟の最中に、内皮細胞は、構成物の末梢と中心の両方へある程度まで局在化し、微小血管の構造へ組織する。いくつかの実施形態では、構成物内の細胞型の局在は、生体内又は生体外の哺乳動物組織の層状構造を模倣する。
【０１１７】
＜予め形成されたスキャフォールド＞
幾つかの実施形態では、本明細書には、操作した、移植された組織及び器官が開示され、これらは、任意の予め形成されたスキャフォールドがほぼない。さらなる実施形態では、「スキャフォールド」は、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲルなどの合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリクスの層および脱細胞化組織などの非合成のスキャフォールド、および操作した組織及び／又は臓器の物理的構造に不可欠である、および組織及び／又は器官から取り除かれない、任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドを指す。またさらなる実施形態では、脱細胞化された組織スキャフォールドは、脱細胞化された天然の組織あるいは任意の方法で培養細胞によって生成された脱細胞化された細胞形質成分を含み；例えば、生きている間生成するＥＣＭはあとにして、死ぬこと又は脱細胞化することが可能である細胞層がある。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織／構成物、およびそのアレイは、例えば、組織の形成、組織の任意の層、または組織の形状の形成のために、予め形成されたスキャフォールドを利用しない。限定しない例として、本発明の操作した組織は、ポリマースキャフォールドなどの、予め形成された合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリクス層、または任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドを利用しない。幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、組織の細胞成分は、検出可能であるが、微量または取るに足らない量のスキャフォールド、例えば、全組成物の２．０％未満、全組成物の１．０％未満、全組成物の０．５％未満、または全組成物の０．１％未満を含む。またさらなる実施形態では、微量または取るに足らない量のスキャフォールドは、組織、またはそのアレイの長期的な作用に影響を与える、またはその主要な生体機能を妨害するには不十分である。さらなる実施形態では、スキャフォールド成分は、物理的、化学的、または酵素的な方法によって、プリンティング後に取り除かれ、スキャフォールド成分がない又はほぼない、操作した組織をもたらす。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される、予め形成されたスキャフォールドのない又はほぼない操作した肝臓組織は、スキャフォールド材が最初に形成される組織工学の特定の他の方法によって発達された組織とは対照的であり、その後、細胞は、スキャフォールド上へと蒔かれ、続いて、例えば、スキャフォールドの形状を満たす及びとるために増殖する。１つの態様では、本明細書に記載されるバイオプリンティングの方法は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない、生存可能で有用な組織の生成を可能にする。別の態様では、本発明の細胞は、幾つかの実施形態において、制限物質を使用して、所望の三次元形状で保持される。制限物質は、少なくとも、制限物質が細胞及び／又は組織からの一時的なものであり及び／又は除去可能であるという事実から、スキャフォールドとは異なる。
【０１２０】
＜アレイ＞
幾つかの実施形態では、本明細書には、肝臓組織／構成物を含む、操作した組織のアレイが開示される。幾つかの実施形態では、「アレイ」は、複数の試験がサンプル上で行われることを可能にする、１つ以上の試験が複数のサンプル上で行われることを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された、複数の要素の関連性を含む科学的ツールである。幾つかの実施形態では、アレイは、スクリーニングの方法および機器に適応しているか又は適合性があり、これは、高スループットのスクリーニングに関連するアレイを含む。さらなる実施形態では、アレイによって、複数の試験を同時に行うことができる。さらなる実施形態では、アレイによって、複数のサンプルを同時に試験することができる。幾つかの実施形態では、アレイは、細胞のマイクロアレイである。さらなる実施形態では、細胞のマイクロアレイは、固体担体の表面上の生細胞の多重の照合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）を可能にする研究ツールである。他の実施形態では、アレイは、組織のマイクロアレイである。さらなる実施形態では、組織のマイクロアレイは、アレイにおいて集められた複数の個別の組織または組織サンプルを含み、これによって、複数の生化学的、代謝的、分子的、または組織学的な解析の実施が可能となる。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、各々、生体適合性のマルチウェル容器のウェル中に存在する（例えば図１６を参照）。幾つかの実施形態では、各組織は、ウェルに入れられる。他の実施形態では、各組織は、ウェルへとバイオプリントされる。さらなる実施形態では、ウェルは、コーティングされる。様々なさらなる実施形態では、ウェルは、生体適合性のヒドロゲル、１つ以上のタンパク質、１つ以上の化学薬品、１つ以上のペプチド、１つ以上の抗体、および１つ以上の成長因子の１つ以上、またはそれらの組み合わせでコーティングされる。幾つかの実施形態では、ウェルは、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングされる。他の実施形態では、ウェルは、アガロースでコーティングされる。幾つかの実施形態では、各組織は、生体適合性のマルチウェル容器のウェル内の、多孔性の、生体適合性の膜上に存在する。いくつかの実施形態では、マルチウェル容器の各ウェルは２つ以上の組織を含む。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、１つ以上の側面上の生体適合性の表面によって制限される（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）。多くの方法が生体適合性の表面に組織を固定するのに適切である。様々な実施形態では、組織は生体適合性の表面に、例えば１つ以上の全ての側面に沿って、１つ以上の側面の縁でのみ、あるいは１つ以上の側面の中心でのみ、適切に固定される。様々なさらなる実施形態では、組織は、表面に統合された又は表面と関連付けられた保持具又は担体で、生体適合性表面に適切に固定される。様々なさらなる実施形態では、組織は、表面に統合された又は表面と関連付けられた１つ以上のピンチクランプ又はプラスチック製小隆起（ｐｌａｓｔｉｃ  ｎｕｂｓ）で、生体適合性表面に適切に固定される。いくつかの実施形態では、組織は、多孔質膜への細胞付着によって生体適合性の表面に適切に固定される。幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、１つ以上の側面上の生体適合性の表面によって制限されることにより、アレイ形状で保持される。またさらなる実施形態では、組織は、１、２、３、４、またはそれ以上の側面上の生体適合性の表面によって制限される。幾つかの実施形態では、生体適合性の表面は、組織または組織に接触する有機体に対する損傷または毒性の大きな危険をもたらさない任意の表面である。さらなる実施形態では、生体適合性の表面は、従来の組織培養法に適した任意の表面である。適切な生体適合性の表面は、限定しない例として、処理されたプラスチック、膜、多孔質膜、コーティングされた膜、コーティングされたプラスチック、金属、コーティングされた金属、ガラス、およびコーティングされたガラスを含み、ここで、適切なコーティングは、ヒドロゲル、ＥＣＭ成分、化学薬品、タンパク質などを含み、コーティング又は処理は細胞及び組織の生体適合性表面への接着を刺激する又は防止する手段を提供する。
【０１２３】
幾つかの実施形態では、１つ以上の側面上の生体適合性の表面に操作した組織を固定することによって、流体流動によって起こる剪断力に組織をさらすことが促進される。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、流体流動によって起こる剪断力に組織をさらされる。様々な実施形態では、操作した肝臓組織は、１、２、３あるいは４以上側面の剪断力にさらされる。さらなる実施形態では、操作した肝臓組織／構成物は、１つ以上の露出された表面上の組織と接触する液体の栄養素の再循環、潅流あるいは撹拌にさらされる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、肝臓組織／構成物を含む培養組織のアレイは、２つ以上の要素の関連を含む。様々な実施形態では、アレイは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００の要素の関連を含み、それらにおいてインクリメントを含む。さらなる実施形態では、各要素は、１つ以上の細胞、多細胞集合体、組織、臓器、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、肝臓組織／構成物を含む操作した組織のアレイは、予め決められたパターンで空間的に配置された複数の要素を含む。さらなる実施形態では、パターンは、要素の任意の適切な空間的配置である。様々な実施形態では、配置のパターンは、限定しない例として、二次元のグリッド、三次元のグリッド、１本以上の線、アーク（ａｒｃ）、または円、一連の列またはカラムなどを含む。さらなる実施形態では、パターンは、高スループットのバイオアッセイまたはスクリーニングの方法または機器との適合性のために選択される。
【０１２６】
様々な実施形態では、アレイにおいて１つ以上の組織を成形するために使用される細胞型及び／又は細胞ソースは、具体的な研究目標または目的に基づいて選択される。さらなる様々な実施形態では、アレイにおける具体的な組織は、具体的な研究目的または対象に基づいて選択される。幾つかの実施形態では、１つ以上の具体的な操作した肝臓組織は、特定の疾患または疾病の検査を促進するために、アレイに含まれる。幾つかの実施形態では、１つ以上の具体的な操作した肝臓組織は、特定の被験体の疾患または疾病の検査を促進するために、アレイに含まれる。さらなる実施形態では、アレイ内の１つ以上の具体的な操作した組織は、２以上の異なるヒトのドナーに由来する１つ以上の細胞型を用いて生成される。幾つかの実施形態では、アレイ内の各組織は、細胞型、細胞ソース、細胞の層、細胞の比率、構成の方法、サイズ、形状などに関してほぼ類似している。他の実施形態では、アレイ内の組織の１つ以上は、細胞型、細胞源、細胞の層、細胞の比率、構成の方法、サイズ、形状などに関して特有である。様々な実施形態では、アレイ内の組織の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、またはそれ以上は、インクリメントをそこに含んでおり、特有である。他の様々な実施形態では、アレイ内の組織の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、インクリメントをそこに含んでおり、特有である。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、アレイ内の各組織は、培養下で独立して維持される。さらなる実施形態では、アレイ内の各組織の培養条件は、それらが他の組織から分離され、培地または培地において可溶性である因子に取って代わる（ｅｘｃｈａｎｇｅ）ことができないような条件である。他の実施形態では、アレイ内の２つ以上の個々の組織は、可溶性因子に取って代わる。さらなる実施形態では、アレイ内の２つ以上の個々の組織の培養条件は、それらが培地および培地において可溶性である因子を他の組織と交換するような条件である。様々な実施形態では、アレイ内の組織の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、またはそれ以上は、インクリメントをそこに含んでおり、培地及び／又は可溶性の因子に取って代わる。他の様々な実施形態では、アレイ内の組織の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、インクリメントをそこに含んでおり、培地及び／又は可溶性の因子に取って代わる。
【０１２８】
＜インビトロでのアッセイ＞
幾つかの実施形態では、本明細書で開示される、操作した肝臓組織、およびそのアレイは、インビトロでのアッセイに使用される。幾つかの実施形態では、「アッセイ」は、有機サンプルまたは生体サンプル（例えば、細胞集合体、組織、臓器、有機体など）において、物質（例えば、化学物質、分子、生化学物質、薬物など）の存在または活性を試験または測定するための手順である。さらなる実施形態では、アッセイは、定性的アッセイおよび定量的アッセイを含む。またさらなる実施形態では、定量的アッセイは、サンプル中の物質の量を測定する。
【０１２９】
様々な実施形態では、操作した肝臓組織とアレイが、限定されない例として、画像に基づくアッセイ、分泌されたタンパク質の測定。マーカーの発現及びタンパク質の生成に使用される。様々な実施形態では、操作した肝臓組織およびアレイは、分子結合（放射リガンド結合を含む）、分子摂取、活性（例えば、酵素活性および受容体活性など）、遺伝子発現、タンパク質発現、受容体のアゴニズム、受容体拮抗、細胞シグナル伝達、アポトーシス、抗癌剤感受性、トランスフェクション、細胞移動、走化性、細胞の生存率、細胞増殖、安全性、有効性、代謝、毒性、および乱用傾向、の１つ以上を検出または測定するためのアッセイに使用される。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織およびそのアレイは、免疫学的アッセイに使用される。さらなる実施形態では、免疫学的アッセイは、競合的な免疫学的アッセイまたは非競合的な免疫学的アッセイである。競合的な免疫学的アッセイでは、例えば、サンプル中の抗原は、抗体と結合するために標識抗原と競合し、その後、抗体の部位に結合した標識抗原の量が測定される。（「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる）非競合的な免疫学的アッセイでは、例えば、サンプル中の抗原は、抗体の部位に結合され；続いて、標識抗体が、抗原に結合され、その後、部位上の標識抗体の量が測定される。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織およびそのアレイは、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で使用される。さらなる実施形態では、ＥＬＩＳＡは、サンプル中の抗体または抗原の存在を検出するために使用される生化学的な技術である。ＥＬＩＳＡでは、例えば、特定の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの抗体が利用される。さらなる例として、未知の量の抗原を有するサンプルは、非特異的に（表面への吸収を介して）または特異的に（「サンドイッチ」のＥＬＩＳＡにおいて同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉を介して）のいずれかで、固体担体（例えば、ポリスチレン・マイクロタイタープレート）上で不動化される。またさらなる例として、抗原が不動化された後、検出抗体が加えられ、抗原との複合物を形成する。検出抗体は、例えば、酵素に共有結合され得るか、またはバイオ結合を介して酵素に結合される第２抗体によって、それ自体が検出され得る。
【０１３２】
例えば、幾つかの実施形態では、細胞の、アレイ、マイクロアレイ、またはチップ、多細胞集合体、または組織は、薬物スクリーニングまたは創薬に使用される。さらなる実施形態では、組織の、アレイ、マイクロアレイ、またはチップは、薬物スクリーニングまたは創薬のためのキットの一部として使用される。幾つかの実施形態では、各肝臓組織／構成物は、生体適合性のマルチウェル容器のウェル内に存在し、ここで、容器は、１つ以上の自動化した薬物スクリーニングの方法及び／又は機器と適合性がある。さらなる実施形態では、自動化した薬物スクリーニングの方法及び／又は機器は、コンピューターまたはロボット支援である任意の適切な手順または機器を含む。
【０１３３】
さらなる実施形態では、薬物スクリーニングのアッセイまたは創薬のアッセイのためのアレイは、任意の治療分野に潜在的に有用な薬物を調査また開発するために使用される。またさらなる実施形態では、適切な治療分野は、限定しない例として、伝染病、血液学、腫瘍学、小児科学、心臓学、中枢神経系疾患、神経病学、消化器病学、肝臓学、泌尿器学、不妊症、眼科学、腎臓病学、整形外科、疼痛管理、精神医学、肺臓学、ワクチン、創傷治癒、生理学、薬理学、皮膚科学、遺伝子療法、毒性学、および免疫学を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、操作した肝臓組織とアレイは細胞に基づくスクリーニングで使用するためのものである。さらなる実施形態では、細胞に基づくスクリーニングは、ウイルス感染変化あるいは寄生虫感染（例えばマラリア原虫感染など）のような１つ以上の感染症のためのものである。さらなる実施形態では、細胞に基づくスクリーニングは肝臓繊維症（例えば硬変）のためのものである。さらなる実施形態では、細胞に基づくスクリーニングは肝臓癌のためのものである。さらなる実施形態では、細胞に基づくスクリーニングは肝臓脂肪症（例えば脂肪肝）のためのものである。さらなる実施形態では、細胞に基づくスクリーニングは１つ以上の代謝欠損のためのものである。さらなる実施形態では、細胞に基づくスクリーニングは１つ以上のタンパク質欠乏症のためのものである。他の実施形態では、操作した肝臓組織とアレイは、癌の発症、進行あるいは転移に関する研究で使用するためのものである。まださらなる実施形態では、操作した肝臓組織とアレイは、癌細胞、病原体を保有する（ｂｅａｒｉｎｇ）細胞、病原性細胞、免疫細胞、血液由来の細胞又は幹細胞／前駆細胞のような他の細胞型と、肝細胞及び肝臓組織を含む細胞との相互作用に関する研究のためのものである。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、構成物又はそのアレイは、抗体、哺乳動物細胞、細菌、生物学的に活性なタンパク質、ホルモン等の生物学的なものの性能の評価に使用するためのものである。幾つかの実施形態では、構成物又はそのアレイは、肝細胞の境界を作ることに対する、クッパー細胞又は星細胞からのグラム陰性又はグラム陽性抗原−刺激性シグナリングの効果を含む、クッパー細胞及び星細胞による免疫学的サンプリングを検出、定量及び研究するのに使用するためのものである。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ及びＨＣＶを含む、肝臓指向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）ウイルスの生成に、構成物あるいはそのアレイは役立つさらなる実施形態では、構成物あるいはそのアレイは、赤血球外の形態（ｅｘｏ−ｅｒｙｔｒｏｃｙｔｉｃ  ｆｏｒｍ）でのマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）（寄生虫）の生成のためのビヒクルとして使用される。またさらなる実施形態では、肝臓の構成物由来のマラリア原虫が、寄生虫の赤血球外の形態に対する効果的な治療を識別するためのインビトロアッセイの比較のために使用される。他の実施形態では、構成物あるいはそのアレイは、抗宿主抗体研究の実行を含む、Ｃ型肝炎ウイルスまたはマラリア原虫のための抗宿主治療として利用される。他の実施形態では、肝臓構成物あるいはそのアレイは、癌の発症、進行あるいは転移に関する研究に役立つ。他の実施形態では、肝臓構成物あるいはそのアレイは、構成物及び限定されないが病原体輸送細胞（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）、癌細胞、免疫細胞、血球、幹細胞／前駆細胞あるいは遺伝学的に操作した細胞を含む１つ以上の追加の細胞型を含む、哺乳動物細胞／組織間の細胞−細胞及び細胞−組織の相互作用の研究に役立つ。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、アレイは操作した肝臓組織構成物と追加の組織構成物を含む。
さらなる実施形態において、肝臓構成物は、１つ以上の表面上の追加の組織構成物と直接接触している。またさらなる実施形態では、肝臓組織は、流体経路又は一般的な流体リザーバーを介して１つ以上の追加の組織構成物又は細胞と接触している。またさらなる実施形態では、操作した肝臓組織構成物と接触する液体培地は、免疫細胞、血液由来の細胞あるいは腫瘍由来の細胞のような生きている哺乳動物細胞を含んでいる。他の実施形態では、操作した肝臓組織構成物と接触する液体培地は、細菌、ウイルス、寄生虫あるいは他の病原体を含んでいる。いくつかの実施形態では、Ｘ線あるいはｃｒｙｏ−ＥＭを含む三次元構造研究のための肝臓指向性ウイルスを繁殖させるために、操作した肝臓組織とアレイが、ビヒクルとして使われる。
【０１３７】
＜体外の支持＞
いくつかの実施形態では、操作され肝臓組織構成物は、複数の層、シリンダー状のバイオインクを含む各層、実質的に平行に軸方向に整列したバイオインク、肝実質細胞を含むバイオインク；  及び、随意に、シリンダー状のバイオインク中又は間に非実質細胞；並びに、随意に、シリンダー状のバイオインク中の空間又は潅流チャネルを含む。さらなる実施形態において、操作した肝臓組織は、必要とする被験体に体外の支援を提供するために使用される。またさらなる実施形態では、血液をろ過し、被験体の肝機能を補足するために、血液は、構成物上あるいは構成物を通って流れる。
【０１３８】
図１７に従って、特別の実施形態では、バイオプリントされた肝臓構造は、体外の支援をするために設計されている。この実施形態では、バイオプリントされた肝臓構造は、複数の実質細胞シリンダーからなる。この構造は、区画及び／又は潅流あるいは流動が達成されるところを通るチャネルを作るために、非実質細胞及び充填体も含む。
【０１３９】
図１９に従って、特別の実施形態では、バイオプリントされた肝臓構造は、操作した肝臓組織を潅流が横切る及び／又は通ることを可能にするための一定間隔の空間（仮の充填体で占められているように描かれる）とともに繰り返しの管状構造を含む体外の肝性デバイスとして使用される。
【０１４０】
＜方法＞
幾つかの実施形態において、本明細書中で開示されているのは、生きている、三次元肝臓組織構成物を構築する方法であって、該方法は、形態の中又は上に少なくとも１つの肝細胞型を含むバイオインクをバイオプリントする工程、及び生きている、三次元肝臓組織構成物中にバイオインクを融合する工程を含む。さらなる実施形態において、組織構成物はインビトロで使用するためのものである。
【０１４１】
いくつかの実施形態中で、本明細書でさらに開示されているのは、生きている、三次元の肝臓組織構成物を含む組織を構築する方法であり、以下の工程を含む：実質細胞又は非実質細胞のいずれかを含む凝集した多細胞集合体を調製する工程；支持体上に凝集した多細胞集合体を堆積する工程；及び肝臓組織構成物を凝集させ形成するために、多細胞集合体をインキュベートする工程であって、インキュベーションの期間が約１時間から約３０日までの間である工程。いくつかの実施形態では、この方法はバイオプリンティングを利用する。さらなる実施形態において、この方法は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にない、操作した肝臓組織を生成する。
【０１４２】
いくつかの実施形態中で、本明細書でさらに開示されているのは、生きている、三次元の肝臓組織を成形する方法であり、以下の工程を含む：哺乳動物細胞を含む凝集した多細胞集合体を調製する工程；支持体上に１つ以上の凝集した多細胞集合体を堆積する工程；１つ以上の凝集した多細胞集合体に、１つ以上の外部表面上の第一の哺乳動物細胞型の層、及び１つ以上の外部表面上の第二の哺乳動物細胞型の層の１つ以上を適用する工程；及び三次元の肝臓組織構成物を凝集させ形成することを可能にするために、１つ以上の多細胞集合体をインキュベートする工程であって、インキュベーションの期間が約１時間から約３０日までの間である工程。いくつかの実施形態では、この方法はバイオプリンティングを利用する。さらなる実施形態において、この方法は使用時予め形成されたスキャフォールドが実質的にない、操作した肝臓組織を生成する。
【０１４３】
いくつかの実施形態中で、本明細書でさらに開示されているのは、生きている、三次元の肝臓組織を成形する方法であり、以下の工程を含む：哺乳動物細胞を含む１つ以上の凝集した多細胞集合体を調製する工程；平面構造を形成するために細胞型が互いに近傍に空間的に配置されている、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層、及び／又は層状構造を形成するために少なくとも１つの層が少なくとも１つの他の層とは組成的に又は構造的に異なる複数の層、の１つ以上の形成するために、支持体上に１つ以上の凝集した多細胞集合体を堆積する工程；及び三次元の肝臓組織構成物を凝集させ形成することを可能にするために、１つ以上の多細胞集合体をインキュベートする工程。
【０１４４】
＜凝集した多細胞集合体を調製する工程＞
幾つかの実施形態では、この方法は、１つ以上の哺乳動物細胞型を含む凝集した多細胞集合体を調製する工程を含み、少なくとも１つの細胞の構成要素は肝細胞を意味する。幾つかの実施形態では、この方法は肝臓実質細胞を含む凝集した多細胞集合体を調製する工程を含んでいる。幾つかの実施形態では、この方法はさらに非実質細胞を含む凝集した多細胞集合体を調製する工程を含んでいる。幾つかの実施形態では、この方法は、内皮細胞、星細胞、繊維芽細胞、クッパー細胞、免疫細胞、リンパ球、癌細胞、ウイルス輸送細胞（ｖｉｒｕｓ−ｂｅａｒｉｎｇ）、病原性細胞、脂肪細胞、脂肪生成の細胞、平滑筋細胞あるいは幹細胞／前駆細胞由来の細胞の１つ以上の他の細胞型をさらに含む凝集した多細胞集合体を調製する工程を含んでいる。
【０１４５】
本明細書に記載されている特性を有する多細胞集合体を成形するには様々な方法がある。
幾つかの実施形態では、多細胞集合体は、複数の生細胞を含有している又は所望の細胞密度および粘度を有する細胞ペーストから成形される。さらなる実施形態では、細胞ペーストは、所望の形状および成熟（例えば、インキュベーション）によって形成された多細胞体へと成型される。幾つかの実施形態では、多細胞集合体の形状はその周りを囲む型又は枠の形状によって決定する。さらなる実施形態では、型又は枠は、定義された構造に自動装置によって成形される。またさらなる実施形態では、型又は枠はバイオインクからなり、肝臓由来の細胞を含んでいる。さらなる実施形態では、型又は枠は肝臓由来の非実質細胞、及び枠を満たし実質細胞を含む多細胞集合体を作るために使用されるペーストを含む。幾つかの実施形態では、多細胞集合体は実質的にシリンダー状である。他の実施形態では、多細胞集合体は六角形、正方形、立方骨、長方形、多角体である。またさらなる実施形態では、複数の多細胞集合体は、囲む型又は枠を繰り返し構造の碁盤目状のパターンで成形し、続いて又は同時に細胞ペーストで型又は枠を埋めることにより形成される。さらなる実施形態では、細長い多細胞体を形成するのに細胞が互いに接着及び／又は凝集することを可能にするために、細胞ペーストは制御された環境でインキュベートされる。他の特定の実施形態では、多細胞体は、細胞ペーストを三次元の形状中に保持するデバイスの中に複数の生きている細胞を含む細胞ペーストを成型することで生成される。さらなる実施形態では、平らな表面上で自身を支えるのに十分な凝集力を有する多細胞体を生成するために、細胞ペーストは、三次元の形状中で十分な時間保持される一方、制御された環境でインキュベートされる。
【０１４６】
様々な実施形態では、細胞ペーストは：（１）（１つ以上の細胞型の）細胞又は細胞凝集物を、細胞培養培地などの、生体適合性のゲル又は液体と、（例えば、予め決められた比率で）混合して、結果として細胞懸濁液をもたらすこと、および（２）細胞懸濁液を圧縮して、所望の細胞密度および粘度を有する細胞ペーストを生成すること、によって提供される。様々な実施形態では、圧縮は、細胞培養から結果として生じた特定の細胞懸濁液を濃縮して、細胞ペーストに必要とされる、所望の細胞濃度（密度）、粘度、および整合性を達成することなどの、多くの方法によって達成される。特定の実施形態では、細胞培養からの比較的希薄な細胞懸濁液は、型における成型を可能にするペレット中の細胞濃度を達成するために決められた時間、遠心分離にかけられる。タンジェント流ろ過（「ＴＦＦ」）は、細胞を濃縮又は圧縮する別の適切な方法である。幾つかの実施形態では、化合物は、必要とされる押出特性をもたらすために細胞懸濁液と混合される。適切な化合物は、限定しない例として、界面活性剤ポリオール、コラーゲ ン、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸系ゲル、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ナノファイバー、自己集合性ナノファイバー、ゼラチン、フィブリノゲンなどを含む。
【０１４７】
幾つかの実施形態では、細胞ペーストは、複数の生細胞を組織培養培地と混合し、生細胞を（例えば遠心分離によって）圧縮することよって生成される。１つ以上のＥＣＭ成分（又はＥＣＭ成分の誘導体）は、随意に、ＥＣＭ成分（又はＥＣＭ成分の誘導体）を含有している１つ以上の生理学的に許容可能な緩衝液を懸濁することによって、および細胞ペーストを再び形成するために遠心分離にかけられた、結果として生じる細胞懸濁液によって含まれる。
【０１４８】
幾つかの実施形態では、さらなる処理には所望される細胞ペーストの細胞密度は、細胞型によって様々である。さらなる実施形態では、細胞間の相互作用は、細胞ペーストの特性を決定し、異なる細胞型は、細胞密度と細胞間相互作用との間の異なる関連性を有するだろう。またさらなる実施形態では、細胞は、細胞ペーストを成型する前に、細胞間相互作用を増加させるために前処理される。例えば、幾つかの場合、細胞は、細胞ペーストを成型する前に、細胞間相互作用を増強するために、遠心分離後に遠心管の内部でインキュベートされる。幾つかの実施形態では、細胞ペーストは、バイオプリンティングで付随的に成型され、バイオインクを形成する互いへの個々の細胞の凝集力が、バイオプリンティングの最中に、あるいはその後に生じる。
【０１４９】
様々な実施形態では、多くの方法が、細胞ペーストを成型するために使用される。例えば、特定の実施形態では、細胞ペーストは、所望の形状を達成するために、手動で成型されるか、又は押しつけられる（例えば、濃縮／圧縮後に）。さらなる例として、細胞ペーストは、細胞ペーストを器具の内表面に一致するように成型する、マイクロピペット又はシリンジ（例えば、毛管ピペット又はガラス／プラスチックシリンジ）などの器具へと取り上げられる（例えば、吸引される）。マイクロピペット（例えば、毛管ピペット）の断面形状は、代替的に、円形、四角形、矩形、三角形 、又は他の非円形の断面形状である。幾つかの実施形態では、細胞ペーストは、プラスチック用型、金属型、又はゲル用型などの、予め形成された型へと堆積されることによって成型される。幾つかの実施形態では、遠心鋳造又は連続鋳造が、細胞ペーストを成型するために使用される。幾つかの実施形態で、バイオインクの成型はバイオプリンティングに付随的にあるいはその後に生じる。さらなる実施形態では、バイオインクの成型は、共印刷された型の結果として生じ、型はバイオプリンティングを介して随意に堆積され、型はバイオインク、押出化合物、ゲル、ヒドロゲル、合成高分子、炭水化物、タンパク質あるいは哺乳動物細胞をさらに含むバイオインクあるいはその組み合わせの１つ以上を含む。またさらなる実施形態では、共印刷された型の１つ以上の構成要素がバイオプリンティングの後に除去され、除去方法は、物理的手段、水性溶媒を備えた可溶化；化学処理；酵素処理；温度の調整のうちの１つから選択される。さらなる実施形態では、共印刷された型は、組立ての後も組織に関連付けられたままである。またさらなる実施形態では、共印刷された型の細胞の構成要素だけが、組立ての後も組織に関連付けられたままである。
【０１５０】
幾つかの実施形態では、定義された形状の多細胞集合体は、本明細書に記載される操作した肝臓組織を構築するのにも適している。球状の多細胞集合体は、限定されないが、細胞の自己集合、型の使用、および懸滴法を含む、様々な方法によって随意に生成される。さらなる実施形態では、ほぼ球状の多細胞集合体を生成する方法は、１）所望の細胞密度および粘度を有する複数の予め選択された細胞又は細胞集合体を含む細胞ペーストを提供する工程、２）細胞ペーストをシリンダー状へと操作する工程、３）シリンダーを等しいフラグメントへと切断する工程、４）随意にフラグメントを旋回シェーカー上に一晩かき集める工程、および５）随意にほぼ球状の多細胞集合体の成熟を１時間から７日間の期間可能にする工程、を含む。さらなる実施形態では、多細胞集合体は集束音法によって生成される。
【０１５１】
幾つかの実施形態では、部分的に接着及び／又は凝集した細胞ペーストは、バイオプリンティングに使用され、凝集及びバイオインク形成は主に印刷後に生じる。他の実施形態では、細胞ペーストはバイオプリンティングに先立つ第一の工程で成型される。さらなる実施形態では、細胞ペーストは、第１成型装置（例えば、毛管ピペット）から第２成型装置（例えば、型）に移され、これによって、栄養素及び／又は酸素は、細胞に提供されることが可能となるが、さらなる成熟期間の間、第２成型装置において保持される。細胞に栄養素および酸素を提供することが可能な適切な成型装置の一例は、複数の多細胞集合体（例えば、ほぼ同一な多細胞集合体）を生成するための型である。さらなる例として、そのような型は、基質への細胞の移動および内方成長に耐性があり、基質への細胞の付着に耐性のある材料で作られた、生体適合性の基質を含む。様々な実施形態では、基質は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、（ＰＴＦＥ）、 ステンレス鋼、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、ポリエチレングリコール、ガラス、金属、プラスチック、又はゲル材料（例えば、アガロース又は他のヒドロゲル）、および同様の材料から適切に作られる。幾つかの実施形態では、型はまた、（例えば、組織培養培地を型の上部に分注することによって）細胞ペーストへの組織培養培地の供給を可能にするように適切に構成される。
【０１５２】
したがって、第２成型装置が使用される実施形態では、部分的に接着及び／又は凝集した細胞ペーストは、第１成型装置（例えば、毛管ピペット）から第２成型装置（例えば、型）に移される。さらなる実施形態では、部分的に接着及び／又は凝集した細胞ペーストは、第１成型装置（例えば、毛管ピペット）によって型の溝へと移される。またさらなる実施形態では、型が制御環境においてその中に保持された細胞ペーストとともにインキュベートされることで、細胞ペースト中の細胞が互いに接着及び／又は凝集して多細胞集合体を形成する成熟期間後に、細胞の凝集は、結果として生じる多細胞集合体が器具（例えば、毛管ピペット）によって拾い上げられることを可能にするのに十分強力となり得る。またさらなる実施形態では、毛管ピペットは、適切に、多細胞集合体を三次元の構成物に自動的に配置するために操作可能な、バイオプリンター又は同様の装置のプリンターヘッドの部分である。
【０１５３】
幾つかの実施形態では、多細胞集合体の断面形状および大きさは、実質的に、多細胞集合体を製造するために使用される、第１成型装置および随意に第２成型装置の断面形状および大きさに対応し、当業者は、上に議論された、断面形状、断面積、直径、および長さを有する多細胞集合体を作り出すのに適切な、適切な断面形状、断面積、直径、および長さを有する適切な成型装置を選択することができるだろう。
【０１５４】
＜支持体上へと凝集した多細胞集合体を配置する工程＞
所望の三次元構造を生成するために、多くの方法が、支持体上へと多細胞集合体を配置するのに適切である。例えば、幾つかの実施形態では、多細胞集合体は、互いに接して手動で配置されるか、ピペット、ノズル、又は針からの押出によって適所に堆積されるか、又はバイオプリンターなどの、自動化した、コンピューター支援の機器によって位置付けられる。
【０１５５】
本明細書に記載されるように、様々な実施形態では、多細胞集合体は、多くの適切な形状および大きさを有する。幾つかの実施形態では、多細胞集合体は、限定しない例として、円形、卵形、四角形、三角形、多角形、および不規則な形状を含む、幾つかの適切な断面形状のいずれかを有して細長い。さらなる実施形態では、多細胞集合体は、細長く、シリンダーの形態である。幾つかの実施形態では、細長い多細胞集合体は、類似した長さ及び／又は直径を有する。他の実施形態では、細長い多細胞集合体は、異なる長さ及び／又は直径を有する。幾つかの実施形態では、多細胞集合体は、ほぼ球状である。幾つかの実施形態では、操作した肝臓組織は、大きさがほぼ類似したほぼ球状の多細胞集合体を含む。他の実施形態では、操作した肝臓組織は、異なる大きさを有するほぼ球状の多細胞集合体を含む。幾つかの実施形態では、異なる形状および大きさの操作した肝臓組織は、様々な形状および大きさの多細胞集合体を調整することによって形成される。
【０１５６】
幾つかの実施形態では、凝集した多細胞集合体は、支持体上へと配置される。様々な実施形態では、支持体は、任意の適切な生体適合性の表面である。またさらなる実施形態では、適切な生体適合性の表面は、限定しない例として、ポリマー材料、多孔質膜、プラスチック、ガラス、金属、ヒドロゲル、およびそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、支持体は、限定しない例として、ヒドロゲル、タンパク質、化学薬品、ペプチド、抗体、成長因子、又はそれらの組み合わせを含む、生体適合性の物質でコーティングされる。１つの実施形態では、支持体は、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングされる。別の実施形態では、支持体は、アガロースでコーティングされる。１つの実施形態では、凝集した多細胞集合体は、生体適合性のマルチウェル容器のウェルに入れられる。
【０１５７】
一旦凝集した多細胞集合体の配置が完了すると、幾つかの実施形態では、組織培養培地は構成物の上部にわたって注がれる。さらなる実施形態では、組織培養培地は、多細胞体において細胞を支持するために、多細胞体間の空間に入る。
【０１５８】
＜第一の細胞型の層および／又は第二の細胞型の層を適用する工程＞
細胞の１つ以上の層を、凝集した哺乳動物細胞構成物の１つ以上の外部層上に適用するのに、多くの方法が適切である。例えば、幾つかの実施形態では、細胞の層を適用する工程は、凝集した多細胞集合体の１つ以上の表面を、懸濁液、シート、単一層又は細胞の融合した集合体でコーティングする工程を含む。様々な実施形態では、凝集した哺乳動物細胞構成物の１、２、３、４、又はそれ以上の表面がコーティングされている。
【０１５９】
幾つかの実施形態では、細胞の層を適用する工程は、融合した多細胞集合体の追加の層をバイオプリントする工程を含む。他の実施形態では、細胞の層を適用する工程は、細胞の溶液、懸濁液又は液体濃縮物をバイオプリントする工程、スプレーする工程又はインクジェットする工程を含む。さらなる実施形態では、適切な細胞懸濁液は約１×１０４から約１×１０６細胞／μｌを含む。またさらなる実施形態では、適切な細胞懸濁液は約１×１０５から約１．５×１０５細胞／μｌを含む。さらなる実施形態では、細胞の層を適用する工程は、細胞の懸濁液を凝集した哺乳動物細胞構成物の１つ以上の表面に、空間的に分配された液滴として直接分注する工程を含む。またさらなる実施形態では、細胞の層を適用する工程は、細胞の懸濁液を凝集した哺乳動物細胞構成物の１つ以上の表面に、スプレーとして直接分注する工程を含む。細胞の層は、様々な実施形態では、構築プロセス中の任意の適切な時に適用される。幾つかの実施形態では、細胞の１つ以上の層は、凝集した哺乳動物細胞構成物の１つ以上の外部層上に、バイオプリンティングの直後（例えば１０分以内）に適用される。他の実施形態では、１つ以上の層がバイオプリンティングの後（例えば１０分後）に適用される。また他の実施形態では、１つ以上の層が構成物の成熟中に適用される。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、この方法は、支持体上の細胞の層を培養する工程をさらに含む。そのような実施形態では、細胞の層を適用する工程は、いくつかの場合において、操作した肝臓組織の１つ以上の表面を、細胞の確立された培養物と直接接触するように配置する工程を含む。さらなる実施形態では、構成物は、細胞の培養された層又は細胞の単一層の上に直接バイオプリントされる。生体適合性の支持体上のどんなタイプの培養細胞層でも適切である。幾つかの実施形態では、多細胞集合体は内皮細胞の層の上にバイオプリントされる。他の実施形態では、多細胞集合体は非実質細胞の層の上にバイオプリントされる。さらなる実施形態では、細胞の層は、バイオプリントされた構成物の多細胞集合体に接着及び／又は凝集する。幾つかの実施形態では、多層構造の各層はバイオプリントされる。さらなる実施形態では、個々の層は様々な形態のバイオインクを含み、限定されないが、凝集した細胞集合体、細胞ペースト、押出化合物又は他の添加剤と組み合わせた細胞ペースト、細胞単一層及び細胞シートを含む。
【０１６１】
＜区画化された組織を成形するために使用された共印刷された型＞
幾つかの実施形態では、この方法は、非実質細胞を含む１つ以上のバイオインクを調製する工程；肝細胞又は肝細胞様細胞のような実質細胞を含む１つ以上のバイオインクを調製する工程；支持体上にバイオインクを堆積する工程；及び少なくとも１つの区画を含む、生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために、堆積されたバイオインクを約１時間から約３０日までの間インキュベートする工程であって、該区画は非実質細胞を含む境界で制限された、実質細胞を含む内部を含む工程、を含む。
【０１６２】
幾つかの実施形態では、この方法は、哺乳類の肝細胞を含む１つ以上の凝集された多細胞集合体を調製する工程；複数の細胞型（平面配位を作成するために互いに関連して空間的に配置された細胞型）を含む少なくとも１つの層；及び複数の層であって、層構造を作成するために、少なくとも１つの他の層とは組成的にあるいは構造的に異なる少なくとも１つの層、の少なくとも１つを形成するために、支持体上に１つ以上の凝集された多細胞集合体を配置する工程、及び生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために凝集することを可能にするため、１つ以上の多細胞集合体を約１時間から約３０日までの間インキュベートする工程。
【０１６３】
図２に従って、特定の実施形態では、ＨｅｐａＲＧ細胞を含む肝臓構成物は、バイオプリントされ、成熟され、生化学的に特徴づけられる。第一に、４ｍｍ×４ｍｍ×１ｍｍの寸法を備えた全周ボックス（ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ  ｂｏｘ）は、内皮細胞と肝星細胞を含むバイオインクで印刷された。第二に、ＨｅｐＲＧ細胞は全周ボックスの中心へ堆積された。その後３７℃で９６時間成熟させた。第三に、バイオプリントされた構成物の融合が印刷後２０時間で観察された。この実施形態では、バイオプリントされた肝臓構成物は、９６時間でアルブミンとコレステロールを生成して代謝的に活性であった。
【０１６４】
図３に従って、特定の実施形態では、肝臓構成物はそれぞれ押出化合物でできている非実質細胞の境界及び実質細胞の充填でバイオプリントされる。
【０１６５】
図４に従って、特定の実施形態では、肝臓構成物は内皮細胞及び肝星細胞を含む境界及び原発性の肝細胞を含む充填物、及び充填物中に内皮細胞及び肝星細胞を含む空間的に分散された球体として導入された第三の組成的成分によってバイオプリントされる。
【０１６６】
図５に従って、特定の実施形態では、肝臓構成物は細胞を含まず、充填物だけを残し陰性の空間を確立する水性溶媒（例えばＰＦ−１２７）に溶解した材料から成形された共同型（ｃｏ−ｍｏｌｄ）によってバイオプリントされる。
【０１６７】
図６に従って、特定の実施形態では、肝臓構成物は碁盤目状の機能ユニットパターンを形成するために、水溶性押出化合物（例えばＰＦ−１２７）中にカプセル化された複数の肝細胞型で構成されたバイオインクを用いた連続的な堆積技術を使用してバイオプリントされる。
【０１６８】
図８に従って、特定の実施形態では、区画化された肝臓構成物は、多細胞集合体を六角形に成型するのに使用される、細胞を含まない共印刷された型でバイオプリントされる。
この実施形態では、細胞がない材料は使用時にスキャフォールドのない組織を生成するために消える。
【０１６９】
図１０に従って、特定の実施形態では、区画化された肝臓構成物は、ＨｅｐＧ２細胞で充填される境界として使用される共同型でバイオプリントされる。
【０１７０】
図１１に従って、特定の実施形態では、細胞を含む共印刷された型は、この場合ＨｅｐＧ２細胞である実質細胞が充填物として使用され、境界としてバイオプリントされる。
【０１７１】
図１２に従って、特定の実施形態では、区画化された肝臓構成物は、高い、組織様密度を達成するために、非実質細胞境界及び実質細胞充填物を使用してバイオプリントされる。
【０１７２】
＜多細胞集合体をインキュベートする工程＞
幾つかの実施形態では、多細胞集合体はインキュベートされる。さらなる実施形態では、インキュベーションによって、多細胞集合体は、接着及び／又は凝集して、肝臓組織のような組織を形成することができる。幾つかの実施形態では、多細胞集合体は、凝集して、細胞培養環境（例えば、ペトリ皿、細胞培養フラスコ、バイオリアクターなど）において組織を形成する。さらなる実施形態では、多細胞集合体は、凝集して、多細胞集合体に含まれる細胞型の成長を促進するのに適切な条件を有する環境において組織を形成する。１つの実施形態では、多細胞集合体は、接着及び／又は凝集を促進する細胞培養培地を含有している因子及び／又はイオンの存在下で、約５％のＣＯ２を含有している湿気のある環境において、約３７℃でインキュベートされる。他の実施形態では、多細胞集合体は、０．１％から２１％のＯ２を含有している環境で維持される。
【０１７３】
インキュベーションは、様々な実施形態では、任意の適切な持続時間を有する。さらなる様々な実施形態では、インキュベーションは、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０分、又はそれ以上の持続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。さらなる様々な実施形態では、インキュベーションは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８時間、又はそれ以上の持続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。様々な実施形態では、インキュベーションは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日、又はそれ以上の持続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。いくつかの因子は、限定しない例として、細胞型、細胞型の比率、培養条件、および成長因子などの添加剤の存在を含む、組織を形成するために、多細胞集合体が凝集するのに必要な時間に影響を及ぼす。
【０１７４】
＜操作した組織の生存率を増加させるためのさらなる工程＞
幾つかの実施形態では、方法は、操作した組織の生存率を増加させるための工程をさらに含む。さらなる実施形態では、これらの工程は、制限物質の一時的又は半永久的な格子状構造（ｌａｔｔｉｃｅ）を介して組織と栄養培地との間の直接的な接触を提供する工程を含む。幾つかの実施形態では、組織は、多孔性の又は間隙のある（ｇａｐｐｅｄ）材料において制限される。栄養素に対する操作した組織の細胞の少なくとも幾つかの直接的なアクセスによって、操作した組織の生存率は増加する。
【０１７５】
さらなる実施形態では、操作した組織の生存率を増加させるための追加および随意の工程は：１）随意に、凝集した多細胞集合体を配置する前に制限物質の基層を分配する（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）工程；２）随意に、制限物質の周辺（ａ ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ ｏｆ）を分配する工程；３）定義された構造内の組織の細胞をバイオプリントする工程；および４）格子、網目、又はグリッドなどの、制限物質中の間隙を導入するパターンで発生期の組織を覆う制限物質の細長い体（例えば、シリンダー、リボンなど）を分配する工程、を含む。
【０１７６】
多くの制限物質が、本明細書に記載される方法における使用に適している。幾つかの実施形態では、ヒドロゲルは、以下を含む１つ以上の有利な特性を有する典型的な制限物質 である：非付着性、生体適合性、押し出し成形可能、バイオプリント可能、非細胞性、適切な強度、および水性条件で非水溶性。幾つかの実施形態では、適切なヒドロゲルは、天然ポリマーである。１つの実施形態では、制限物質は、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で構成される。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、Ｐｌｕｔｏｎｉｃ Ｆ−１２７、コラーゲン、ヒアルロナート、フィブリン、アルギナート 、アガロース、キトサン、ゼラチンおよびそれらの誘導体および組み合わせなどの、界面活性剤ポリオールに由来するものを含む。他の実施形態では、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（酸化エチレン）およびそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。様々な具体的な実施形態では、制限物質は、ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピルｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、シルク、又はそれらの組み合わせから選択される。
【０１７７】
幾つかの実施形態では、パターンを覆う間隙は、組織の表面のまわりに均一に又はほぼ均一に分配される。他の実施形態では、間隙は、不均一に分配され、それによって、組織の細胞は、栄養素に不均一にさらされる。不均一の実施形態では、栄養素に対する差次的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）アクセスは、随意に組織の１つ以上の特性に影響を与えるように利用される。例えば、幾つかの場合、バイオプリントされた組織の一表面上の細胞を、バイオプリントされた組織の別の表面上の細胞より速く増殖させることが望ましい。幾つかの実施形態では、栄養素への組織の様々な部分の露出は、所望のエンドポイントへの組織の発達に影響を与えるために、様々な時間で変更される。
【０１７８】
幾つかの実施形態では、制限物質は、限定されないが、バイオプリンティング直後（例えば、１０分以内）、バイオプリンティング後（例えば、１０分後）、細胞が実質的に互いに凝集する前、細胞が実質的に互いに凝集した後、細胞が細胞外マトリックスを生成する前、細胞が細胞外マトリックスを生成した後、使用の直前などを含む、任意の適切な時間に除去される。様々な実施形態では、制限物質は、任意の適切な方法によって除去される。
例えば、幾つかの実施形態では、制限物質は、切除されるか、細胞からはぎ取られるか、消化されるか、又は溶解される。
【０１７９】
幾つかの実施形態では、この方法は、操作された肝臓組織を剪断力にさらす工程をさらに含み、それは１つ以上の側面に流体流動、撹拌あるいは伝達力のある再循環によって引き起こされる。
【０１８０】
＜生物学的特性＞
本明細書に記載されているバイオプリントされた肝臓組織は、ヒト組織に類似の多細胞構造を含んでいた。天然の肝臓組織のように、バイオプリントされた肝臓組織は、特定の領域で集積され、パターン化され区画化された構造を産出する特定の細胞型（例えば、肝星細胞、肝細胞、内皮細胞など）を含んでいた。
【０１８１】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されているバイオプリントされた肝臓組織は、高い細胞密度、ＥＣＭ、脂質及びグリコーゲンの生成を含む天然の肝臓の重要な特徴を含む。図２１を参照されたい。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されているバイオプリントされた肝臓組織は、少なくとも３０％の細胞密度を有する。様々なさらなる実施形態では、本明細書に記載されているバイオプリントされた肝臓組織は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％あるいは少なくとも９０％の細胞密度を有する。様々なさらなる実施形態では、本明細書に記載されているバイオプリントされた肝臓組織は、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％あるいは約９０％の細胞密度を有する。
【０１８２】
幾つかの実施形態では、三次元のバイオプリントされた肝臓組織は、密着結合、少なくともいくつかの静止した肝星細胞の維持および微小血管の構造の発達のような組織学的特徴を含んでいる。幾つかの実施形態では、三次元のバイオプリントされた肝臓組織は、最初の成形を大きく越えて保持された区画化を含んでいる。例えば、さらなる実施形態では、三次元のバイオプリントされた肝臓組織は、少なくとも７日、少なくとも１０日、少なくとも２０日、少なくとも３０日あるいは少なくとも４０日の間続く区画化を含んでいる。様々なさらなる実施形態では、三次元のバイオプリントされた肝臓組織は、約７日、約１０日、約２０日、約３０日、あるいは約４０日の間続く区画化を含んでいる。
【０１８３】
幾つかの実施形態では、非実質細胞である「ストロマ」に囲まれた肝細胞の成形後の領域を識別することができる。図２２を参照されたい。予測しなかったことに、バイオプリントされた肝臓組織は、非常によく天然の肝臓を模倣して、小葉型構造への明白な自己組織化を実証した。観察された構造物は、長期試験（例えば低用量、反復暴露及び慢性的な病理学的疾病）を可能にして、４０日間以上の機能及び生存を支持する。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、肝臓に特有の機能は、本明細書に記載されている三次元のバイオプリントされた肝臓組織で７、１０、２０、３０、あるいは４０日間以上保持される。幾つかの実施形態では、例えば、本明細書で記載されているバイオプリントされた肝臓組織は、従来の二次元の技術における原発性の肝細胞の公表された時間的経過を大きく越えて、６週間（４２日間）以上のアルブミンの継続的な生成を実証する。図２３を参照されたい。バイオプリントされた肝臓組織は、コレステロールのような他の肝細胞因子の保持された生成も実証する。図２３を参照されたい。
【０１８５】
三次元のバイオプリントされたヒト肝臓組織は、トランスフェリン及びフィブリノゲンを含む従来の二次元的方法では達成されない、追加の適切な代謝産物の生成を示す。図２４を参照されたい。幾つかの実施形態中で、三次元のバイオプリントされたヒト肝臓は、毛細胆菅（ｂｉｌｅ  ｃａｎｉｌｉｃｕｌａｒ）形成のマーカーも示す。図２５を参照されたい。
【０１８６】
数日後に機能を失う二次元の原発性の肝細胞とは対照的に、幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている三次元の肝臓組織は、誘発がベラパミルによって阻害可能である、活性なＣＹＰ３Ａ４酵素の保持された誘発を示す。図２６を参照されたい。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されている三次元のバイオプリントされた肝臓組織は、ジクロフェナク、トロバフロキサシンおよびメトトレキセートを含む既知の肝臓毒性物に対する天然様の反応を実証する。図２７−２９を参照されたい。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されている三次元のバイオプリントされた肝臓組織は、ビタミンＤのような生理学的に適切な分子に対する天然様の反応を実証する。図３０を参照されたい。
【０１８７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されている三次元のヒト肝臓組織は、実質細胞（肝細胞）及び非実質細胞（内皮細胞（ＥＣ）及び肝星細胞（ｈＳＣ））領域によってパターン化される。さらなる実施形態では、原発性の肝細胞の代わりとして、パターン化された三次元の肝臓組織は、ｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞（ｉＰＳＣ−ＨＣ）（例えばｉＣｅｌｌ肝細胞、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）を含んでいる。ｉＰＳＣの使用は、患者及び／又は疾患特異的なインビトロ系の開発を可能にし、分離する又は繁殖することが難しい細胞を生成する手段を提供し得る。
【実施例】
【０１８８】
以下の具体的な例は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、方法はどうであれ、開示の残りを限定するものとして、解釈されるべきではない。
【０１８９】
実施例１−連続的な堆積及び碁盤目状の機能ユニット構造を使用してバイオプリントされる肝臓組織
操作した肝臓組織を、連続的な堆積機構を使用するＮｏｖｏＧｅｎ ＭＭＸ Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を利用してバイオプリントした。肝臓組織の三次元構造は、この場合、六角形の繰り返しの機能ユニットに基づいていた。バイオインクは、肝星細胞及び押出化合物（界面活性剤ポリオール−ＰＦ−１２７）にカプセル化された内皮細胞から成っていた。
【０１９０】
＜３０％ＰＦ−１２７の調製＞
３０％ＰＦ−１２７溶液（ｗ／ｗ）を、ＰＢＳを用いて作製した。ＰＦ−１２７パウダーを、４℃に維持した磁気撹拌プレートを使用して冷蔵のＰＢＳと混合した。完全溶解は約４８時間で生じた。
【０１９１】
＜細胞の調製とバイオプリンティング＞
８２％の星細胞（ＳＣ）及び１８％のヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）とヒト成人皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦａ）で構成される細胞懸濁液を、遠心分離の後、３つの細胞濃度：５０×１０６細胞／ｍｌ、１００×１０６細胞／ｍｌ、及び２００×１０６細胞／ｍＬを達成するために１５ｍＬのチューブに分離した。各細胞ペレットを３０％ＰＦ−１２７に再懸濁し、バイオプリンターで使用する３ｃｃのリザーバーへ吸引した。５１０μｍの分注チップで、カプセル化された細胞を、単一の六角形（図６Ａを参照）又は六角形の碁盤目状の配置（図６Ｂを参照）になるよう、ＰＤＭＳ基板プレート上にバイオプリントした。各構成物は約２００μＬの培地を受け取り、構成物の統合性を評価するために、室温にて２０分間インキュベートした。
【０１９２】
＜多層バイオプリンティング＞
六角形碁盤目状配列実験のために、連続する（４）層までをバイオプリントした結果、より多くの細胞形質成分が存在する、より高さが高い構造をもたらした。成形に続き、各構成物は、構成物の統合性を評価するために約２００μＬの完全培地を最初に受け取った。構成物を室温で２０分間インキュベートし、その後、２０ｍＬの完全培地に浸した。
【０１９３】
＜結果＞
１０％ウシ胎児血清を含む増殖培地（ＰＦ１２７を溶解する）で１８時間培養後、バイオプリントされた構造に含まれる細胞は、最初のデザインの幾何学的なパターニングを保持した完全な連続した組織のシートを生成するために、十分に互いに凝集した（図６Ｄを参照）。図７は、１０％中性緩衝ホルマリン中に固定化した後の、碁盤目状の構成物の単一セグメントのＨ＆Ｅ染色を示す。細胞は、生存可能で、完全で、それらの最初のプリントされた構造にとどまることが分かった。
【０１９４】
実施例２−強制的な（Ｆｏｒｃｅｄ）積層化
細胞集団（同種の又は異種の）をバイオプリンティングのために、シリンダー状のバイオインク又はプルロニックＦ−１２７（Ｌｕｔｒｏｌ，ＢＡＳＦ）の細胞懸濁液のいずれかとして調製した。要約すると、バイオインクの調製のために、細胞を組み換えヒト・トリプシン（７５μｇ／ｍＬ，Ｒｏｃｈｅ）又は０．０５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを使用して、標準的な組織培養プラスチックから遊離させた。酵素遊離に続いて、細胞を洗浄し、回収し、カウントし、所望の比率（つまり、５０：５０、肝星細胞（ｈＳＣ）：内皮細胞（ＥＣ））で組み合わせ、遠心分離によりペレットにした。その後、上清を細胞ペレットから取り除き、細胞混合物を、典型的に内径が５００μｍ又は２５０μｍの所望の直径のガラスマイクロキャピラリーへ吸引した。その後、このシリンダー状の細胞調製物を、バイオインク成熟のためのチャネルを備えた非細胞接着性ヒドロゲル材料から生成された型へ押し出した。その後、得られたシリンダー状のバイオインクを、典型的に２から２４時間の経験的に決められた時間、完全細胞培養培地で培養した。
【０１９５】
要約すると、ヒドロゲルの細胞懸濁液の調製のために、細胞を本明細書に記載される酵素を媒介としたプロトコルのいずれかを使用して、標準的な細胞培養容器から遊離させた。その後、遊離した細胞を、血清を含む培地で洗浄し、回収し、カウントし、密度が高い細胞ペレットを形成するために遠心分離した。上清を、得られた細胞ペレットから取り除き、細胞が５０から２００×１０６細胞／ｍＬ（１０から３００×１０６細胞／ｍＬの範囲）になるよう、冷蔵のＰＦ−１２７（４℃）で再懸濁した。その後、この細胞懸濁液を、ＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を利用してシリンジへ吸引した。
【０１９６】
その後、強制的な細胞パターニング、積層化又は配向性による組織構成物の成形を、バイオプリンターを使用して達成した。三次元の組織構成物のバイオプリンティングを、シリンダー状のバイオインク、水溶性ゲル剤中の細胞懸濁液又はそれらの組み合わせで行った。定義された細胞パターニング又は積層化を達成するために、適切な細胞集団の組み合わせは、バイオインク又は細胞懸濁液調製物内に含まれ、その後、細胞溶液を支持するゲル物質の溶解等の方法でバイオプリントし、その結果、堆積したバイオインク周辺に定義された細胞の積層化をもたらした（図１３を参照）。細胞パターニング、組織化又は積層化も、定義された別々の細胞集団（例えばｈＳＣ及びＥＣ）の利用及び取り込みを通して達成され、その結果、バイオプリントされた組織内の予測可能及び反復可能な細胞の組織化並びに細胞構造をもたらした（図１４を参照）。
【０１９７】
幾つかの実験において、バイオプリントされた新組織内の最終的な細胞の組織化が、成熟又は培養期間の後に観察された。構成物を標準的な実験用インキュベータ（３７度、５％ＣＯ２を供給した加湿チャンバー）の中で維持し、経時的に評価した。
【０１９８】
＜結果＞
細胞パターニング、積層化又は配置を、バイオプリンティングを使用して達成した。異種の（つまり多型の）細胞集団を含むバイオインクでのバイオプリンティングによって、若しくは高密度細胞ゲル又は細胞懸濁液のバイオインク（同種の又は異種の細胞集団）を組み合わせることによって、異なる細胞の組織化が観察された。加湿チャンバー（インキュベータ）内でのこれらの新組織構成物の成熟は、これらのバイオプリントされた新組織における異なる細胞配置、組織化及び／又は分離のさらなる確立をもたらした。
【０１９９】
例えば、ＨｅｐＧ２細胞を含むバイオプリントされたバイオインク上にＥＣ及びｈＳＣを備えるＰＦ−１２７のバイオプリンティングは、異なる細胞集団及び別々の組織形態を備えた構成物の異なる層の確立をもたらす。ｈＳＣ及びＥＣを含むバイオインク構成物の場合において、完全培地中で３日以上成熟した、バイオプリントされた構成物は、構成物のコア内の末梢及び構築された微小血管ネットワークにＥＣの異なる層を含んでいることを確認した。ＥＣの高濃縮溶液上の血管平滑筋細胞の同種の（つまり、単一型の）集団を含むバイオインクで成形されたバイオプリントされた構成物は、構成物の末梢にＥＣの異なる層を含んでいることを確認した。
【０２００】
実施例３−マルチウェルプレート
細胞集団（同種の又は異種の）を、シリンダー状のバイオインク集合体、細胞集合体の懸濁液又は細胞懸濁液／ペーストを含み、随意に押出化合物を含む、様々なバイオインクフォーマットを使用するバイオプリンティングのために調製した。要約すると、シリンダー状のバイオインクの調製のために、細胞を、組み換えヒト・トリプシン（７５μｇ／ｍＬ，Ｒｏｃｈｅ）又は０．０５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを使用して、標準的な組織培養プラスチックから遊離させた。酵素遊離に続いて、細胞を洗浄し、回収し、カウントし、所望の比率（つまり、５０：５０、肝星細胞（ｈＳＣ）：内皮細胞（ＥＣ））に組み合わせ、遠心分離によってペレットにした。その後、上清を細胞ペレットから取り除き、細胞混合物を、典型的に内径が５００μｍ又は２５０μｍの所望の直径のガラスマイクロキャピラリーへ吸引した。その後、このシリンダー状の細胞調製物を、バイオインクの成熟のためのチャネルを備えた非細胞接着性ヒドロゲル材料から生成された型へ押し出した。その後、得られたシリンダー状のバイオインクを、典型的に２から２４時間の経験的に決められた時間、完全細胞培養培地で培養した。
【０２０１】
細胞集合体の細胞懸濁液又は細胞ペーストの調製のために、本明細書に記載される細胞増殖及び遊離プロトコルを続けて行った。細胞ペレット生成時に、上清をペレットから取り除き、ペレットを特注の堆積シリンジに移した。その後、このシリンジを、細胞集合体の溶液又はペーストのマルチウェルプレートへの直接バイオプリンティングのために、バイオプリンター堆積ヘッドに封入した。
【０２０２】
その後、複製した組織構成物を、マルチウェル組織培養プレート（例えば、６−ウェル又は２４−ウェル）又はマルチウェル細胞培養インサート（つまり、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，ＢＤ）のいずれかのウェル内でバイオプリントし、それから、適切なマルチウェルプレートに配置した。バイオプリンティングに続き、三次元の構成物を、典型的に３から１４日間のある期間、適切な培地で成熟させた／調整した。成熟に続き、構成物を通例の組織学的検査と免疫組織化学的検査のために、回収し、固定化し、処理した。
【０２０３】
＜結果＞
バイオプリントされた組織を、マルチウェル培養プレート又はマルチウェル培養インサート内で成形に成功した後、マルチウェルプレートに挿入した。このアプローチは、同一又は特有の培養条件を生成するために、随意に培養され処置される複製したバイオプリントされた組織の生成を可能にする。このアプローチは、バイオプリンティングのプロセス処理能力及びサンプル生成の著しい増大をもたらす（図１６を参照）。
【０２０４】
実施例４−バイオプリントされた新組織の刺激
適切な異種の（つまり、多型の）細胞集団を含むシリンダー状のバイオインクを調製した。細胞の生理学的に適切な集団（例えば、肝星細胞（ｈＳＣ）及びヒト大動脈内皮細胞（ＥＣ））を、適切なバイオインクを生成するために特定の割合で組み合わせた。細胞を標準的な実験条件下で維持し、増殖させた。また、細胞を、細胞と同じ業者から購入した培地、又は特定の細胞型のための標準的な細胞培養の実行の助けとなる主要な文献に記載されている典型的な構成物を含む培地のいずれかの培地において培養した。バイオインク調製のための細胞処理は下記の通りだった：要約すると、細胞を、カチオンを含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することにより標準的な組織培養プラスチックから遊離させ、その後、０．１−０．０５％のトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にさらした。その後、遊離した細胞を、刺激アッセイ又は実施されている実験のために、血清含有培地で洗浄し、回収し、カウントし、適切な比率で組み合わせ、そして遠心分離によってペレットにした。その後、上清を細胞ペレットから取り除き、細胞ペレットをガラスマイクロキャピラリーへ吸引し、その後、約１５から２０分間、完全培地に浸した。その後、このシリンダー状のバイオインク構造を、直線チャネルを含む非細胞接着性ヒドロゲルの型へ押し出し、２から１８時間保持した。その後、ｈＳＣ及びＥＣを含むシリンダー状のバイオインクを、バイオプリントされた組織構成物を成形するために使用し、加湿チャンバー内で維持及び／又は成熟させた。組織セグメントを、１．２５ｍｍ×８ｍｍ×０．２５ｍｍ（Ｗ×Ｌ×Ｈ）の最初の寸法で成形した。バイオプリンティング後の成熟期の間、幾つかの構成物を、組織特異的な反応を誘発させるために、サイトカインＴＧＦ−β１にさらした（図１５参照）。
【０２０５】
上部表面に制限された、同質の（つまり、単一の）細胞層を要求する組織構成物のために、適切な細胞型を含む第２の細胞調製物を利用した。典型的に、血管内皮細胞又は小型の気道上皮細胞（それぞれ、血管壁及びヒト肺組織モデル用）を、高濃縮細胞懸濁液中で調製した。要約すると、細胞を、上記に記載される様に遊離させ、回収し、数え、遠心分離によってペレットにした。上清を取り除き、細胞ペレットを少量の完全培地で再懸濁し、１×１０５細胞／μＬの高濃縮細胞ペレットを得た。その後、この細胞懸濁液を、使用する時まで４℃で保存した。
【０２０６】
その後、バイオプリントされた新組織を、血清含有完全細胞培養培地に浸し、成熟のために、５％ＣＯ２を補った標準的な加湿チャンバーに配置した。その後、バイオプリントされた新組織を、あらかじめ決めた期間培養し、適切なサイトカインで刺激し、標準的な組織学的検査及び免疫組織化学的検査のために、ホルマリン固定し、回収し、処理した。バイオプリントされた組織の、限定されないが、組織形態、細胞組織、細胞外マトリックス生成、細胞増殖、細胞生存率及び構成物の統合性等の特性を評価した。
【０２０７】
適切な刺激への直接及び持続性のある細胞アクセスを提供するために、培養培地へのサイトカインの直接添加及び追加されたタンパク質と共にバイオプリントされた組織を培養することでサイトカイン刺激を行った。用量反応実験を、実験のサイトカインのＥＤ５０に依存して、典型的に、０．１から１００ｎｇ／ｍＬの範囲の用量で行った。サイトカイン刺激が４８時間を超えて行われる実験のために、４８時間毎に培地を交換し、新しいサイトカインを添加した。
【０２０８】
＜結果＞
細胞の生理学的に適切な集団を含むバイオプリントされた新組織を、二次元のインビトロシステムでの細胞反応を誘発させるために以前に実証されたサイトカインで刺激することに成功した。バイオプリントされた三次元の組織構成物で観察された反応は用量依存的であり、バイオプリントされた構成物内の細胞に特有であることを観察した（例えば、図１５を参照）。
【０２０９】
実施例５−連続的な堆積による共同成型された機能的な肝臓組織微小構造のバイオプリンティング
＜３０％ＰＦ−１２７の調製＞
３０％ＰＦ−１２７溶液（ｗ／ｗ）はＰＢＳを使用して作製した。ＰＦ−１２７パウダーを、４℃に維持した磁気撹拌プレートを使用して、冷蔵のＰＢＳと混合した。完全溶解は約４８時間で生じた。
【０２１０】
＜細胞調製並びに型及び充填剤の共印刷＞
バイオプリンターを使用して、５１０μｍの分注チップによって３ｃｃのリザーバーに３ｍＬのＰＦ−１２７溶液を吸引し、３０％ＰＦ−１２７溶液を、単一の六角形の形状へと６ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌ上にバイオプリントし、６回続けて積層した。
【０２１１】
７．８×１０７個の肝細胞（ＨｅｐＧ２）で構成される細胞懸濁液を、細胞ペーストを作成するために６分間、１０００ｇにて遠心分離した。三角形の型の各々を満たすため、５μＬの細胞ペーストを５１０μｍの針を通して押し出した（図５Ａを参照）。六角形の型を、１５分間室温にてインキュベートした。３ｍＬの培地（１０％ＦＢＳ並びに１Ｘペニシリン、ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを補ったＤＭＥＭ）を、上記のＴｒａｎｓｗｅｌｌのウェルに加え、続けて３７℃及び５％ＣＯ２にてインキュベーションした。４５分以内に、ＰＦ−１２７の型は培地中に溶解し、細胞及び空間の平面の構造を形成する、成形された肝性の完全なバイオインクが残った（図５Ｂを参照）。培地から、残ったＰＦ−１２７を取り除くために、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを３ｍＬの培地を含む新しいウェルへ移し、２時間インキュベートした。これを６時間にわたって、合計９ｍＬの培地交換のために、さらに２回繰り返した。
【０２１２】
ＰＦ−１２７の型の溶解によって形成された空間を満たすために、６時間後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを、培地を含まない新しいウェルに移し、９０％のヒト大動脈内皮細胞及び１０％の肝星細胞の比率の２×１０６細胞個の細胞懸濁液を分注した。肝性構成物を室温にて１５分間インキュベートした。１５分のインキュベーション後、８５％の培地（肝性及び星細胞を維持するための、１０％ＦＢＳ並びに１Ｘペニシリン、ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを補ったＤＭＥＭ）及び１５％のＭ１９９（ヒト大動脈内皮細胞を維持するための、２％ＬＳＧＳ、１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ並びに１Ｘペニシリン、ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを補った）の比率を含む４ｍＬの培地があった。構成物を、内皮細胞を含む組織の介在を備えた肝実質細胞の小葉状の（三角形状の）配置を含む平面の構造を備える切れ目のない構成物を形成するために、４８時間、３７℃及び５％のＣＯ２にてインキュベートした。
【０２１３】
実施例６−機能的な肝臓組織のバイオプリンティング及び特徴づけ
＜細胞培養＞
低温保存原発性のヒト肝細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、メーカーのプロトコルに従って精製し、ペニシリン１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、ストレプトマイシン０．２５μｇ／ｍｌ及びアンフォテリシン８５μｇ／ｍｌ（１ＸＰ／Ｓ／Ａ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補った肝細胞維持培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でインキュベートした。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）及び肝星細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）をバイオプリントされた組織の非実質細胞構成物に利用し、メーカーのインストラクションに従って増殖させた。ＨＵＶＥＣをＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）中で、及び肝星細胞を１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリン１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、ストレプトマイシン０．２５μｇ／ｍｌ及びアンフォテリシン８５μｇ／ｍｌ（１ＸＰ／Ｓ／Ａ；Ｃｏｒｎｉｎｇ）を供給したＤＭＥＭ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、成長させた。
【０２１４】
＜誘導アッセイで利用した化学製品＞
次の試薬をＳｉｇｍａから購入した：リファンピシン、ジクロフェナク、ベラパミル、５−（及び６）−カルボキシ−２’，７’ジクロロフルオレセインジアセテート及びビタミンＤ３。
【０２１５】
＜バイオインクの調製＞
バイオインクを本明細書に記載されるプロトコル及び技術に基づいて調製した。細胞を含むヒドロゲルの調製のために、ＮｏｖｏＧｅｌ２．０（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，  Ｉｎｃ．）をメーカーのインストラクションに従って調整し、非実質細胞集団をバイオプリンティング前に組み込んだ。
【０２１６】
＜バイオプリンティング＞
全ての組織は、標準的なＯｒｇａｎｏｖｏバイオプリンティングプロトコル及びＮｏｖｏＧｅｎ  ＭＭＸ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ又はそれらの変更を含むものに使用する、標準的な組織培養ウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）の膜上に直接成形した。バイオプリントされた肝臓組織は、Ｎｏｖｏｇｅｌ  ２．０中に非実質細胞（肝星細胞、ＨＵＶＥＣ）を含む、境界を含んでいた。境界は、内部を含む区画を定義した。区画の内部を、原発性の肝細胞を含む細胞ペーストで満たした。バイオプリントされた肝臓組織は、さらにＮｏｖｏｇｅｌ  １．０を含む堀（ｍｏａｔ）を含んでいた。図２０はバイオプリントされたヒト肝臓組織の特定の例を示す。実験の間、バイオプリントされた肝臓組織を、これらの膜上で維持した。構成物を、９０％の原発性の肝細胞培地及び１０％のＥＧＭ−２の混合物を６００μｌ含む培地で毎日培地交換し、３７℃、５％ＣＯ２を補った加湿雰囲気条件下でインキュベートした。使用済みの培地を分泌された要素の分析のために回収し、肝臓組織をエンドポイント分析（例えば、遺伝子発現、組織学的検査、組織生存率など）のために回収した。
【０２１７】
＜分泌されたタンパク質の検出＞
使用済みの培地を集め、−８０℃で保存し、その後、以下の肝臓代謝物のために、市販のＥＬＩＳＡキットによって分析した：アルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、フィブリノゲン（ＧｅｎＷａｙ  Ｌａｂｓ）及びトランスフェリン（ＧｅｎＷａｙ  Ｌａｂｓ）。コレステロール生合成を、蛍光定量的に定量した（Ｃａｙｍａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を、市販の試薬（Ａｂｃａｍ）で比色定量的に測定した。
【０２１８】
＜転写プロファイリングのためのＲＮＡ単離及びｃＤＮＡの合成＞
大量のＲＮＡを、メーカーのインストラクションによってＱｕｉｃｋ−ＲＮＡ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ（Ｚｙｍｏ）を用いて、三次元の肝臓構成物から抽出した。ＲＮＡを、分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ  ６４０）を用いて定量した。投入量（ｉｎｐｕｔ）２μｇのＲＮＡを、メーカーのインストラクション（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ）に従って、個々のｃＤＮＡ合成のＳｍａｒｔＳｃｒｉｂｅ反応で利用した。ＴａｑＭａｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プローブ並びにＦＡＭで標識化されたＣＹＰ３Ａ４及びＶＩＣで標識化された１８Ｓのためのプライマー対を、メーカーのガイドライン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＵＮＧで利用した。転写増幅産物を、Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出した。
【０２１９】
＜組織学的分析：肝臓組織のパラフィン調製＞
肝臓構成物を、室温で２４時間、２％パラホルムアルデヒド溶液（ＰＢＳ中に、２％パラホルムアルデヒド、１０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭスクロース）で、インサイチュで固定化した。２４時間後、固定溶液を取り除き、７０％エタノールで置換した。付着したＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜を備えた構成物を、プラスチック生検の型中で４５℃の液体ＨｉｓｔｏＧｅｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ，Ｌｏｄｉ，ＣＡ，ｃａｔａｌｏｇ＃ＥＭＨＧＥＣＳ）に浸し、これは室温での凝固を可能にした。その後、埋め込まれた肝臓構成物を備えたＨｉｓｔｏＧｅｌブロックを、パラフィン包埋のために組織プロセッサーを使用して処理した。パラフィンの浸潤に続き、肝臓構成物をパラフィンの型に埋め込み、５μｍの横断切片（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を、回転式ミクロトーム（Ｊｕｎｇ  Ｂｉｏｃｕｔ  ２０３５，Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して作製した。ヘマトキシリン−エオシン染色のため、スライドは、キシレン中でワックスを取り除き（ｄｅｗａｘｅｄ）、１００％、９５％、７０％及び５０％のエタノールを通して再水和させ、蒸留水中ですすいだ。スライドを、Ｇｉｌｌ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  （Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に浸した。蒸留水でのすすぎに続いて、スライドを、０．２％ｖ／ｖの水酸化アンモニウムに一時的に浸した。蒸留水ですすいだ後、スライドを水性のエオシン溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ）に浸した。その後、スライドを、エタノール勾配を通して脱水し、キシレン中で取り除き、樹脂の封入剤（ｒｅｓｉｎｏｕｓ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）（ＣｙｔｏＳｅａｌ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に封入した。
【０２２０】
過ヨウ素酸シッフ染色を、メーカーのインストラクション（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に従って行った。
【０２２１】
免疫組織学的分析のために、スライドを、キシレン中でワックスを取り除き、蒸留水中での最終洗浄前に、１００、９５、７０及び５０％のエタノールに連続してそれらを浸すことにより再水和させた。標準的な電子レンジを使用して、溶液及びスライドを半沸騰（ｓｕｂｂｏｉｌ）に熱し、再水和したセクションをｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸ナトリウム中で熱による抗原賦活化（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）にさらし、続けて３０分間緩やかに冷却した。その後、スライドを、１時間、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中の１０％ヤギ血清でブロックし、続けて４℃で一晩、１次抗体でインキュベーションした。以下の１次抗体を利用した：ウサギ抗Ｅ−カドヘリン（Ａｂｃａｍ；１：５０）；マウス抗アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；１：２００）；ウサギ抗デスミン（Ａｂｃａｍ；１：２００）；マウス抗ＣＤ３１（Ａｂｃａｍ；１：２５）。その後、セクションを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を備えたＴＢＳで３回洗浄し、ＴＢＳで１：２００に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８標識２次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とインキュベートした。その後、セクションを、ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、蒸留水ですすぎ、ＤＡＰＩ含有封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で封入した。
【０２２２】
＜凍結切片用の構成物の調製＞
肝臓構成物をＤＰＢＳで一度すすぎ、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に浸し、急速凍結した。その後、肝臓構成物を含む凍結ブロックを、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｃｒｙｏｃｕｔ  １８００，  Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で５μｍに切り分けた。切り分けられたスライドを、−２０℃の液体アセトンでスナップ固定（ｓｎａｐ  ｆｉｘｅｄ）し、それは室温で２０分間風乾させた。Ｏｉｌ  ＲｅｄＯ染色のため、スライドを蒸留水で再水和させ、６０％イソプロパノールに２分間浸した。スライドを、室温で１５分間、６０％イソプロパノール中の０．３％ｗ／ｖのＯｉｌ  ＲｅｄＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色し、続けて、６０％イソプロパノールで１分間すすいだ。対比染色するために、スライドをＧｉｌｌ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎに一時的に浸した。スライドを蒸留水ですすぎ、水性溶媒（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＭａｓｔｅｒＴｅｃｈ）で封入した。
【０２２３】
＜顕微鏡観察＞
Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳ及びＯｉｌ  ＲｅｄＯ染色したスライドを、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して可視化した。画像を、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ２  ｃａｍｅｒａ及びＳｐｏｔ  ５．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＩ）で得た。蛍光染色したスライドを、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ顕微鏡で可視化し、画像を、Ｚｅｉｓｓ  ＩＣＭ−１  ｃａｍｅｒａ及びＺｅｎ  Ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅで得た。
【０２２４】
＜Ｓ９画分の調製＞
培地を三次元の肝臓構成物から吸引し、１Ｘプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）を補った４００μｌのリン酸緩衝食塩水（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を構成物に添加し、続けて、−８０℃で凍結させた。構成物を解凍し、ＴｉｓｓｕＲｕｐｔｏｒ（Ｑｉａｇｅｎ）及びディスポーザブルチップを利用して、９０秒間３０００ｒｐｍ、続けて９０秒間の休止、続けて９０秒間３０００ｒｐｍにて均質化した。均質化した上清を、２０分間４℃で、２０，０００Ｘｇで遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、続けてタンパク質を定量した。
【０２２５】
＜タンパク質の定量＞
タンパク質の定量を、標準物質としてウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を備えたブラッドフォードアッセイ（Ｓｉｇｍａ）を利用して達成した。
【０２２６】
＜ＣＹＰ３Ａ４アッセイ＞
Ｓ９画分をタンパク質含有量により基準化し、メーカーのプロトコルに従ってルシフェリン−ＩＰＡアッセイ（ＣＹＰ  ＰｒｏＧｌｏ；Ｐｒｏｍｅｇａ）に利用し、発光を、プレートリーダ（Ｐｏｌａｓｔａｒ，ＢＭＧ）を利用して読み取った。
【０２２７】
＜統計＞
分散分析及びスチューデントｔ検定での統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで実行した。
【０２２８】
＜結果＞
バイオプリントされた肝臓組織は、ヒト組織に似ている多細胞構造を含んでいた。天然の肝臓組織のように、バイオプリントされた肝臓組織は特定の領域で豊富な特定の細胞型（例えば、肝星細胞、肝細胞、内皮細胞など）を含んでおり、パターン化された、区画化された構造をもたらした。
【０２２９】
バイオプリントされた肝臓組織の組織学的特徴は、高い細胞密度並びにＥＣＭ、脂質及びグリコーゲンの生成を含む、天然の肝臓の重要な特徴を示す。図２１（印刷後７日目）を参照。三次元のバイオプリントされた肝臓組織は、密着結合（Ｅ−カドヘリン、アルブミン及びＤＡＰＩの視覚化によって観察された）並びに静止した星細胞及び微小血管系（デスミン、ＣＤ３１及びＤＡＰＩの視覚化によって観察された）を含む、興味深い組織学的特徴を実証した。三次元のバイオプリントされた肝臓組織は、最初の成形を大きく過ぎても、継続した区画化を実証した。成形から２１日後、非実質細胞の「ストロマ」に囲まれた肝細胞の領域を確認した。図２２を参照。予想外に、バイオプリントされた肝臓組織は、厳密に天然の肝臓を模倣している小葉型構造への明かな自己組織化を実証した。
【０２３０】
観察された構造は、長期試験（例えば、低用量、反復曝露及び慢性的病理学的疾病）を可能にし、４０日間以上の機能及び生存を支持する。肝臓特有の機能は三次元のバイオプリントされた肝臓組織（原発性の肝細胞）中で４０日間以上維持される。バイオプリントされた肝臓組織は、従来の二次元の技術における原発性の肝細胞の公表された時間的経過を大きく過ぎて、６週間（４２日間）以上のアルブミンの継続的な生成を実証した。図２３を参照。バイオプリントされた肝臓組織は、さらにコレステロールのような他の肝細胞の要素の生成も維持していることを実証した。図２３を参照。
【０２３１】
三次元のバイオプリントされたヒト肝臓組織は、トランスフェリン及びフィブリノゲンを含む、既存の二次元の方法論では達成されていないさらに適切な代謝産物の生成を示す。図２４を参照。
【０２３２】
三次元のバイオプリントされたヒト肝臓は、さらに毛細胆管形成のマーカーを示す。胆汁酸塩排出タンパク質（ＢＳＥＰ）は肝細胞の毛細胆管膜内にある膜タンパク質である。ＢＳＥＰの主な機能は、非結合及び結合の胆汁酸と胆汁酸塩を肝細胞から除去することである。さらに、ＢＳＥＰの発現は天然の組織内で極性を示す。ＢＳＥＰ（ＢＳＥＰタンパク質用のＩＨＣ染色）、アルブミン及びＤＡＰＩの組織学的な可視化は、ＢＳＥＰがアルブミンを生成する肝細胞中に存在することを実証する。図２５は、印刷１０日後に、２つのバイオプリントされた肝臓組織のＢＳＥＰのｍＲＮＡ対ハウスキーピング遺伝子ＲＮＡ（１８ｓ  ＲＮＡ）の相対的な量の計算を示す。検出できるレベルのＢＳＥＰは組織学的な知見を支持する。
【０２３３】
数日後に機能を失う二次元の原発性の肝細胞とは対照的に、バイオプリントされた三次元の肝臓組織構成物は、活性型のＣＹＰ３Ａ４酵素の継続的な誘導能を示す（ベラパミルによって阻害可能）。図２６を参照。
【０２３４】
三次元のバイオプリントされた肝臓組織は、ジクロフェナク、トロバフロキサシン及びメトトレキセートを含む既知の肝臓毒性物に対する天然様の反応を実証する。図２７は、ジクロフェナクの中程度の用量でのＣＹＰ３Ａ４の誘導を示し、続いて、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）によって測定されるような高用量での損傷を示す。図２８は、トロバフロキサシン対レボフロキサシンの複数回投与研究（４日にわたるｎ＝３及び２の用量）で見られたアルブミンの減少及びＬＤＨの増大を示す。トロバフロキサシンの効果は、臨床Ｃｍａｘ（〜４μＭ）のより近傍で見られた。これは従来の二次元の原発性の肝細胞培養物と対照的であり、ここでは、ＬＤＨの誘導は見られない。図２９は、メトトレキセートの複数回投与研究（７日間、一日の投与量がｎ＝３）で見られた生存率（ＡＴＰ−Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏによって測定された）及びアルブミンの減少並びにＬＤＨの増大を示す。
【０２３５】
三次元のバイオプリントされた肝臓組織は、ビタミンＤのような生理的に適切な分子に対する天然様の反応を実証する。ビタミンＤは体内のホメオスタシスの維持に重要である。ビタミンＤは食事の摂取を通して得ること、又は皮膚内の細胞によって合成されることができる。肝臓は、骨形成／維持にとって重要な代謝産物へ及び腎臓によって排泄することができる形態へビタミンＤを処理する。ビタミンＤは、さらに肝臓でのＣＹＰ３Ａ４の発現を刺激し、薬のバイオアベイラビリティーに潜在的に影響を与えることができる。１、５及び１０μＭのビタミンＤで処置されたバイオプリントされた３Ｄの肝臓組織の転写プロファイリングを行った。ＣＹＰ３Ａ４転写物の相対的な発現の測定を行った。図３０は、ＣＹＰ３Ａ４活性が、５及び１０μＭのビタミンＤ処置によって、それぞれ、〜７倍及び４倍に刺激されたことを示す。
【０２３６】
実施例７−クッパー細胞を組み込む機能的な肝臓組織のバイオプリンティング
クッパー細胞の組み込みは、Ｏｒｇａｎｏｖｏの３Ｄの肝臓組織の免疫学的側面の研究を可能にする。クッパー細胞を、生理学的に適切な割合でバイオプリントされた肝臓構成物内に組み込んだ。構成物は、ＬＰＳ刺激（ＬＰＳ：Ｅ．ｃｏｌｉ０１２７：Ｂ８；Ｓｉｇｍａ）に対して用量依存的に反応する。図３１を参照。クッパー細胞を、生理学的に適切な割合（〜１２％）で肝臓構成物へバイオプリントした。構成物はＬＰＳ刺激に対して用量依存的に反応する。ＩＬ−１０及びＴＮＦ−αはサイトカインに対抗している。ＩＬ−１０の発現は、ＴＮＦ−αの発現を減少させる。これはバイオプリントされた３Ｄの肝臓組織内で観察され、ＬＰＳの１００μｇ／ｍｌ用量で最も著しい。図３２を参照。
【０２３７】
実施例８−肝臓類洞内皮細胞を組み込む機能的な肝臓組織のバイオプリンティング
肝臓類洞内皮細胞の組み込みは、三次元のバイオプリントされた肝臓組織の免疫学的側面の研究を可能にする。肝臓類洞内皮細胞（ＨＳＥＣ）は天然の肝臓内皮細胞集団である。図３３は、ＨＳＥＣの二次元の単一層を示す。これらの細胞は、免疫学的応答のための細胞シグナリングを含む特徴的な特性を有する。ＨＳＥＣは、図３４に実証される、２Ｄ培養中でのＩＬ−６の生成により、ＬＰＳに反応する。対照的に、ＬＰＳによって刺激された時、ＨＵＶＥＣは検出できる量のＩＬ−６を生成しない。バイオプリンティング処理に組み入れられた時、ＨＳＥＣは融合した３Ｄの肝臓組織を生成する。図３５は、ＨＳＥＣを備えた、融合した三次元の肝臓組織を示す。この組織を生産するために、肝臓類洞内皮細胞の組織を非実質細胞の画分に組み込み、融合構造を生成する。
【０２３８】
実施例９−低分子浸透  
低分子が三次元のバイオプリントされた肝臓組織の全体にわたって浸透することができるかどうか決定するために、実験を行った。５−（及び６）−カルボキシ−２’，７’ジクロロフルオレセインジアセテートを、２４時間、１μＭで３Ｄの肝臓組織の培地に供給した。構成物を１ｍｌのＨＢＳＳバッファーですすぎ、洗浄バッファーを吸引した。この処理を３回繰り返した。ＯＣＴ包埋溶液を添加し、構成物を急速凍結し、凍結切片とした。５ミクロンのセクションを、４９５ｎｍの励起光で、ＦＩＴＣチャネルで可視化した。５−（及び６）−カルボキシ−２’，７’ ジクロロフルオレセインジアセテート分子の蛍光構成物は、この波長で励起する。このセクションは構成物内で約１５０ミクロンであり、蛍光標識化合物はくまなく観察された。５−（及び６）−カルボキシ−２’，７’ジクロロフルオレセインジアセテートの式量は５２９．２８である。図３６は、低分子浸透を実証する、５倍での３Ｄの肝臓組織凍結切片のＦＩＴＣイメージングを示す。
【０２３９】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されているが、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白となるであろう。多数の変更、変化、及び置換が、本発明から逸脱することなく、当業者によってここで想到されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に適切に利用されることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月18日(2018.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作した、生きている、三次元の肝臓組織構成物であって、
該構成物は１つ以上の層を含み、切れ目がない細胞のシートで形成される各層は１つ以上の肝細胞型を含み、生きている、三次元の肝臓組織構成物を形成するために１つ以上の層が凝集し、
該構成物は、
平面構造を作成するために細胞型が互いに近傍になるよう空間的に配置されている、複数の細胞型を含む少なくとも１つの層、及び
少なくとも１つの層が少なくとも１つの他の層と組成上又は構造上異なる、複数の層、
の少なくとも１つを有し、
該構成物は、使用時予め形成されたスキャフォールド及び、付着性の制限物質が実質的にないことを特徴とする、構成物。
【外国語明細書】
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