(57)【要約】【課題】  養細胞または培養組織の移植に際してレシピエントのＮＫ細胞の活性化により生じる免疫反応を抑制する方法を提供する。【解決手段】  移植用培養細胞または培養組織の調製方法であって、下記１）および２）から選択される１以上の工程を含む方法：１）培養組織または培養組織がレシピエントのＨＬＡ−Ｃ座の型に属するＨＬＡ−Ｃ分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないＨＬＡ−Ｃ分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる、２）移植用培養細胞または培養組織がＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性もしくは相対的に弱いＢｗ４型リガンド陽性であり、レシピエントがＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陽性である場合、ＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植用培養細胞または培養組織の調製方法であって、下記１）および２）から選択される１以上の工程を含む方法：
１）培養組織または培養組織がレシピエントのＨＬＡ−Ｃ座の型に属するＨＬＡ−Ｃ分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないＨＬＡ−Ｃ分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる、
２）移植用培養細胞または培養組織がＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性もしくは相対的に弱いＢｗ４型リガンド陽性であり、レシピエントがＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陽性である場合、ＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる。
【請求項２】
移植用培養細胞または培養組織が、幹細胞または前駆細胞から誘導されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
移植用培養細胞または培養組織が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞からインビトロで分化誘導されたものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
移植用培養細胞または培養組織が、ＨＬＡハプロタイプホモ接合性ｉＰＳ細胞から分化誘導されたものである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＨＬＡハプロタイプホモ接合性ｉＰＳ細胞が、少なくともＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−ＤＲ座についてホモ接合性ドナーの体細胞から誘導されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらにドナーのＨＬＡ−Ｃ座がホモ接合性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＨＬＡハプロタイプホモ接合性ｉＰＳ細胞が、ＨＬＡハプロタイプホモ接合性ドナーより採取された細胞から誘導されたｉＰＳ細胞がドナーのＨＬＡ情報とひも付けて保存されているｉＰＳ細胞バンクから取得されたものである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
工程１）または２）において、ＨＬＡ−Ｃ分子またはＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる工程が、目的とするＨＬＡ−Ｃ遺伝子および／またはＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ遺伝子をｉＰＳ細胞に導入し、かかる遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞を分化誘導する工程を含む、請求項４〜７いずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程１）または２）において、ＨＬＡ−Ｃ分子またはＨＬＡ−Ｂｗ４型分子を移植用細胞または組織に発現させる工程が、目的とするＨＬＡ−Ｃ遺伝子または遺伝子産物および／またはＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ遺伝子または遺伝子産物を移植用培養細胞または培養組織へ導入する工程を含む、請求項１〜７いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程１）または２）において移植用培養細胞または培養組織へ発現させるＨＬＡ−Ｃ分子またはＨＬＡ−Ｂｗ４型のＨＬＡ分子が、レシピエントの有するＨＬＡ−Ｃ分子またはＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子と同一である、請求項１〜９いずれかに記載の方法。
【請求項１１】
少なくともＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座、およびＨＬＡ−ＤＲ座のハプロタイプをホモで有するドナーから誘導され、ドナーが有していない下記（１）および（２）からなる群から選択される１以上のＨＬＡ分子：
（１）ＨＬＡ−Ｃ１型および／またはＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ分子
（２）ＨＬＡ−Ｂｗ４型のＨＬＡ-Ｂ分子
をさらに有する、ｉＰＳ細胞。
【請求項１２】
請求項１１のｉＰＳ細胞が、ドナーのＨＬＡ情報並びに導入したＨＬＡ分子の情報とひもづけて保存されたｉＰＳ細胞を含む、ｉＰＳ細胞バンク。
【請求項１３】
少なくともＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座、およびＨＬＡ−ＤＲ座のハプロタイプをホモで有し、ドナーが有していない下記（１）および（２）からなる群から選択される１以上のＨＬＡ分子：
（１）ＨＬＡ−Ｃ１型またはＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ分子
（２）ＨＬＡ−Ｂｗ４型のＨＬＡ分子
をさらに有する、培養細胞または組織。
【請求項１４】
（１）少なくともＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−ＤＲ座のハプロタイプをホモで有するＨＬＡハプロタイプホモ接合性ドナーから誘導されたｉＰＳ細胞を提供する工程、
（２−１）該ドナーのＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ１型である場合は、ＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ遺伝子を、ＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡＣ２／Ｃ２型である場合はＨＬＡ−Ｃ１型のＨＬＡ−Ｃ遺伝子をｉＰＳ細胞へ導入する工程、および／または
（２−２）該ドナーがＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陰性、または比較的弱い陽性である場合には、ＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ遺伝子をｉＰＳ細胞へ導入する工程、
（３）工程（２−１）および／または（２−２）で得られた細胞を、ドナーのＨＬＡ情報並びに導入したＨＬＡ−Ｃ遺伝子および／またはＨＬＡ遺伝子の情報とひも付けて保存する工程を含む、移植用ｉＰＳ細胞バンクの製造方法。
【請求項１５】
培養細胞または培養組織の移植に際して、下記１）および２）から選択される少なくとも１の物質を投与することを含む、拒絶反応抑制方法：
１）移植用培養細胞または培養組織がレシピエントのＨＬＡ−Ｃ座の型に属するＨＬＡ−Ｃ分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないＨＬＡ−Ｃ分子の固相化ビーズ、可溶性分子、テトラマー、または当該発現していないＨＬＡ−Ｃ分子に特異的なＮＫ細胞抑制性受容体に対する刺激型抗体、
２）移植用培養細胞または培養組織がＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性型もしくは相対的に弱いＢｗ４型リガンド陽性型であり、レシピエントがＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陽性型である場合にはＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子の固相化ビーズ、可溶性分子、テトラマー、またはＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子に特異的なＮＫ細胞抑制性受容体に対する刺激型抗体。
【請求項１６】
移植用培養細胞または培養組織の調製方法であって、下記１）および２）から選択される１以上の工程を含む方法：
１）移植用培養細胞または培養組織がレシピエントのＨＬＡ−Ｃ座の型に属するＨＬＡ−Ｃ分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないＨＬＡ−Ｃ分子に特異的なＮＫ細胞抑制性受容体に対する刺激型抗体を移植用培養細胞または培養組織に発現させる、
２）移植用培養細胞または培養組織がＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性型もしくは相対的に弱いＢｗ４型リガンド陽性型であり、レシピエントがＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陽性型である場合にはＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子に特異的なＮＫ細胞抑制性受容体に対する刺激型抗体を移植用培養細胞または培養組織に発現させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
培養細胞または培養組織を移植する際にレシピエントが起こす免疫反応を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄移植において、ドナー由来アロ反応性ＮＫ細胞は骨髄移植での抗腫瘍効果を発揮することが知られている (Blood. 110(1):433-40, 2007)。一方で臓器移植においてレシピエントのＮＫ細胞が移植片拒絶に関わっているかどうかは謎であった。近年、いくつかの臓器移植において、レシピエントのアロ反応性ＮＫ細胞が移植片の拒絶に関わっていることが明らかになってきた(Am. J. Transplant. 11(9):1959-64, 2011) (Transplantation. 95(8):1037-44, 2013)。これら２つの論文の内容は、アロ反応性ＮＫに移植片が拒絶されることを示唆する。また、ＮＫ細胞の反応性がホストのＨＬＡ ｃｌａｓｓＩ分子に規定されることが報告されている(J. Immunol. 179(9):5977-89, 2007)。かかる論文ではＨＬＡ−Ｃ１やＨＬＡ−Ｃ２、ＨＬＡ−Ｂｗ４分子を導入した細胞株を用いて、ＮＫ細胞の反応性が検証されている。
【０００３】
再生医療分野では、移植用組織を作成するための材料としてｉＰＳ細胞を用いる研究が隆盛であるが、現在はこれを「他家移植」の系で使うという戦略が主流になっている。ＨＬＡハプロタイプのホモ接合性（以下単にホモと表示）ドナー由来のｉＰＳ細胞から再生した組織は、そのハプロタイプを同じホモで持つ人に移植できるだけでなく、片方だけ持つ人（ハプロタイプヘテロという）にも移植が可能である。レシピエントの免疫系からすれば、移植片のもつＨＬＡ分子のセットは自分の体内に存在するものであり、免疫反応が起こりにくい、という原理である。
【０００４】
かかる原理を利用して、現在日本ではｉＰＳ細胞ストックプロジェクトが強力に推進されている。このプロジェクトでは、ＨＬＡハプロタイプホモｉＰＳ細胞が作製され、ハプロタイプとして頻度の高いものから順次ストックされる。ストックされたハプロタイプホモｉＰＳ細胞を研究機関／医療機関に配布し、広く再生医療で使用するというプロジェクトである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Blood. 110(1):433-40, 2007
【非特許文献２】Am. J. Transplant. 11(9):1959-64, 2011
【非特許文献３】Transplantation. 95(8):1037-44, 2013
【非特許文献４】J. Immunol. 179(9):5977-89, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願は培養細胞または培養組織を移植する際にレシピエントが起こす免疫反応を抑制する方法を提供することを目的とする。具体的には培養細胞または培養組織の移植に際してレシピエントのＮＫ細胞の活性化により生じる免疫反応を抑制する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願は、移植用培養細胞または培養組織の調製方法であって、下記１）および２）から選択される１以上の工程を含む方法を提供する：
移植用培養細胞または培養組織の調製方法であって、下記１）および２）から選択される１以上の工程を含む方法：
１）培養組織または培養組織がレシピエントのＨＬＡ−Ｃ座の型に属するＨＬＡ−Ｃ分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないＨＬＡ−Ｃ分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる、
２）移植用培養細胞または培養組織がＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性もしくは相対的に弱いＢｗ４型リガンド陽性であり、レシピエントがＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陽性である場合にはＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる。
【０００８】
移植用培養細胞または培養組織としては、幹細胞あるいは前駆細胞から誘導されたものが好適に用いられ、特に多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞から誘導されたものが好適に用いられる。
【０００９】
本願はさらに、少なくともＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−ＤＲ座のハプロタイプをホモで有し、ドナーが有していない下記（１）または（２）からなる群から選択される１以上のＨＬＡ分子
（１）ＨＬＡ−Ｃ１型および／またはＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ分子
（２）ＨＬＡ−Ｂｗ４型のＨＬＡ分子
をさらに有する、ｉＰＳ細胞を提供する。かかるｉＰＳ細胞は、レシピエントのＨＬＡ−Ｃ型型、およびＨＬＡ−Ｂｗ４リガンドに応じた移植用組織や細胞を製造するために好適に用いられる。
【００１０】
本願はまた、少なくともＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−ＤＲ座のハプロタイプをホモで有し、ドナーが有していない下記（１）または（２）からなる群から選択される１以上のＨＬＡ分子：
（１）ＨＬＡ−Ｃ１型またはＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ分子
（２）ＨＬＡ−Ｂｗ４型のＨＬＡ分子
をさらに有する、移植用細胞または組織を提供する。かかる細胞や組織はＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ２型のレシピエント、および／またはＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陽性のレシピエントへ移植するために好適に用いられる。
【００１１】
本願はまた、
（１）少なくともＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−ＤＲ座のハプロタイプをホモで有するＨＬＡハプロタイプホモ接合性ドナーから誘導されたｉＰＳ細胞を提供する工程、
（２−１）該ドナーのＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ１型である場合は、ＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ遺伝子を、ＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡＣ２／Ｃ２型である場合はＨＬＡ−Ｃ１型のＨＬＡ−Ｃ遺伝子をｉＰＳ細胞へ導入する工程、および／または
（２−２）該ドナーがＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陰性、または比較的弱い陽性である場合には、ＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ−Ｂ遺伝子をｉＰＳ細胞へ導入する工程、
（３）工程（２−１）および／または（２−２）で得られた細胞を、ドナーのＨＬＡ情報並びに導入したＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂの情報とひも付けて保存する工程を含む、ＨＬＡハプロタイプがヘテロ接合性であるレシピエント用ｉＰＳ細胞バンクの製造方法を提供する。本発明のｉＰＳ細胞バンクから、レシピエントのＨＬＡ−Ｃ座の型および／またはＨＬＡ−Ｂｗ４リガンドの有無あるいは種類に応じて最適な細胞を選択することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本願の方法によって、移植用培養細胞または組織がレシピエントのＨＬＡ−Ｃ座の型に属するＨＬＡ−Ｃ分子のいずれかを発現していない場合、および／またはＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性またはＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンドが相対的に弱い陽性である移植用培養細胞もしくは培養組織をＨＬＡ−Ｂｗ４陽性レシピエントに移植に移植する場合に起こりうるレシピエントのＮＫ細胞による移植細胞または組織の拒絶を回避しうる。
【００１３】
例えばハプロタイプホモ接合性ｉＰＳ細胞により構成されるｉＰＳ細胞バンクから取得されたｉＰＳ細胞を一方のＨＬＡが共通するヘテロＨＬＡのレシピエントへ移植する場合、ＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ２であるレシピエントへ移植することは再生医療で行われる移植の２０−３０％の頻度で生じる。再生医療の発展のためには、ホモ−ヘテロ移植は大きな推進力となるが、その際に起こりうる拒絶反応を回避できる本方法は、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】健常人hetero-1ボランティア由来NK細胞を、KIR受容体の発現により分画した図である。
【図２】homo-A由来iPS細胞から誘導したT細胞、homo-A由来iPS細胞にC*04:01:01を発現させた細胞から誘導したT細胞並びに健常人hetero-1ボランティアから誘導されたＴ細胞（auto T）に対する、健常人hetero-1ボランティア由来のNK細胞の各分画の活性を、CD107a陽性細胞の割合として示す。
【図３】図２の各細胞に対する健常人hetero-1ボランティア由来のNK細胞の細胞傷害活性を、死細胞のマーカー（Annexin V）陽性細胞の割合として示す。
【図４】homo-A由来iPS細胞から誘導した血管内皮細胞(homo-A)、homo-A由来iPS細胞にC*04:01:01を発現させた細胞から誘導した血管内皮細胞(homoA+C*04:01:01)並びに健常人hetero-1ボランティアから誘導された血管内皮細胞(auto)に対する健常人hetero-1ボランティア由来のNK細胞の各分画の活性を、CD107a陽性細胞の割合として示す。
【図５】homo-B由来iPS細胞から誘導した血管内皮細胞(homo-B)、homo-B由来iPS細胞にC*04:01:01を発現させた細胞から誘導した血管内皮細胞(homoB+HLA-C*15:02:01)に対する健常人hetero-2ボランティア由来のNK細胞の各分画の活性を、CD107a陽性細胞の割合として示す。
【図６】健常人ボランティア由来Donor-NK1から得たＮＫ細胞をHLA-Bw4型リガンド特異的抑制性受容体であるKIR3DL1とHLA-C1型リガンド特異的抑制性受容体であるKIR2DL3に対する抗体を用い、FACSにより分画した図である。
【図７】Donor-AおよびDonor-Bから単離した末梢血単核球をそれぞれ標的細胞とした場合の、Donor-NK1由来NK細胞の各分画の活性を、CD107a陽性細胞の割合として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＮＫ細胞は、抑制型受容体であるＫＩＲ(killer Immunoglobulin-like receptor)分子(以下ＫＩＲ）を有している。このＫＩＲはＨＬＡクラスＩ分子、特にＨＬＡ−Ｃの型によって自己組織であるか否かを判断する。即ち、ＫＩＲのリガンドとなるＨＬＡを発現していない移植片やＨＬＡ分子を発現しない腫瘍細胞など、抑制型受容体のリガンドを発現していない細胞を認識すると抑制機構が働かず、細胞傷害性を発揮する。レシピエントのＫＩＲレパートリーに認識されるＨＬＡ−Ｃの型をドナー組織が発現していなければ、レシピエントのＮＫ細胞は移植された細胞や移植片に対し細胞傷害活性を発揮する。
【００１６】
ヒトのＨＬＡ−Ｃ座はＨＬＡ−Ｃ１型とＨＬＡ−Ｃ２型の２種類に分けられる。ＨＬＡ−Ｃ１型はＫＩＲ２ＤＬ２および／またはＫＩＲ２ＤＬ３と結合し、ＨＬＡ−Ｃ２型はＫＩＲ２ＤＬ１と結合し、この結合によりＮＫ細胞の活性化が抑制される。即ち、ある個人がＨＬＡ−Ｃ座としてＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ１型を有している場合は、当該個人のＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＬ２および／またはＫＩＲ２ＤＬ３を発現しており、自己組織のＨＬＡ−Ｃ１がこの受容体に結合することによって、自己組織に対するＮＫ活性が抑制される。別の個人のＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ２／Ｃ２型またはＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ２型である場合は、当該個人のＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＬ１を発現しており、細胞上のＨＬＡ−Ｃ２がこの受容体に結合することによって当該細胞に対するＮＫ活性が抑制される。
【００１７】
ＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ２型を有するレシピエントは、そのＮＫ細胞上にＫＩＲ２ＤＬ１と、ＫＩＲ２ＤＬ２／ＫＩＲ２ＤＬ３の両方の受容体を発現する。一般に培養細胞あるいは培養組織の他者への移植は、ある程度ＨＬＡが共通するドナーとレシピエントの間で行われるが、ＨＬＡの完全な一致が求められるわけではない。移植用培養細胞あるいは培養組織のドナーのＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ１型、またはＨＬＡ−Ｃ２／Ｃ２型であり、レシピエントのＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ２型である場合、培養細胞もしくは培養組織の有していないＨＬＡ−Ｃ型をリガンドとするＮＫ活性抑制機構は働かず、移植された細胞若しくは組織はレシピエントのＮＫ細胞により攻撃される。
【００１８】
同様の問題は、ドナーがＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性の場合にも生じ得る。ＨＬＡ−Ｂの一部もＮＫ細胞の抑制性受容体のリガンドとして働いており、ＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンドと呼ばれている。ＨＬＡ−Ａの一部などもＢｗ４リガンドとして働くとされているが、抑制性レセプターを刺激する力が弱いとされる。従って、ＨＬＡ−Ｃとは独立して、ＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性または比較的弱い陽性であるドナー由来の培養細胞や培養組織をＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陽性レシピエントに移植する場合には、ＮＫ細胞による攻撃が起こる。
【００１９】
即ち、ＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陽性のレシピエントはそのＮＫ細胞上にＫＩＲ３ＤＬ１の受容体を発現する。かかるレシピエントにＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性または相対的に弱いＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陽性のｉＰＳ細胞から誘導された細胞もしくは組織を移植する場合、ＨＬＡ−Ｂｗ４型をリガンドとするＮＫ活性抑制機構が働かず、移植された細胞若しくは組織はレシピエントのＮＫ細胞により攻撃され、ＮＫ細胞による拒絶が生じる。
【００２０】
ここで、「ＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド」とされるＨＬＡ分子は、「B*07:36, B*08:02, B*08:03, B*15:13, B*15:16, B*15:17, B*15:23, B*15:24, B*40:13, B*40:19, B*47:01」が知られている。「相対的に弱いＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陽性」のＨＬＡ分子とは、「A*23:01, A*24: 01, A*25: 01」が例示され、上記ＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンドを発現せず、「相対的に弱いＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド」のみ発現する場合をいう。「ＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド」陰性のＨＬＡ−Ｂ分子としては、「B*27:08, B*27:12, B*37:03N, B*44:09, B*44:15, B*47:02, B*47:03, B*51:50, B*53:05」が例示される。
【００２１】
本願の一の態様においては、移植用培養細胞または培養組織がレシピエントのＨＬＡ−Ｃ座の型に属するＨＬＡ−Ｃ分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないＨＬＡ−Ｃ分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる。
例えばドナーのＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ１型である場合にはＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ分子を、ドナーのＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ２／Ｃ２型である場合にはＨＬＡ−Ｃ１型のＨＬＡ−Ｃ分子を発現させる。ドナーが有していないＨＬＡ−Ｃ型を発現させることによって、レシピエントのＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ２型である場合にレシピエントのＮＫ細胞上の、ＨＬＡ−Ｃ１型を認識する受容体、およびＨＬＡ−Ｃ２型を認識する受容体の両方に移植細胞または組織上のＨＬＡ−Ｃ分子が結合し、移植細胞または組織に対するレシピエントのＮＫ細胞に起因する拒絶を回避または低減することができる。
【００２２】
本発明の別の態様においては、培養細胞または培養組織がＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性、または相対的に弱いＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陽性である場合には、ＨＬＡ−Ｂｗ４型のＨＬＡ分子を発現させる。培養細胞または培養組織が有していないＨＬＡ−Ｂｗ4型リガンドを発現させることによって、レシピエントがＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陽性であっても、レシピエントのＮＫ細胞上のＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンドを認識する受容体に移植細胞または組織上のＨＬＡ−Ｂｗ４が結合し、移植細胞または組織に対するレシピエントのＮＫ細胞に起因する拒絶を回避または低減することができる。
【００２３】
本願の方法にて用いられる移植用培養細胞または培養組織は、レシピエントへ移植されるための培養細胞または培養組織をいう。好適には培養細胞または培養組織は幹細胞もしくは前駆細胞から誘導されたものである。
【００２４】
幹細胞としては、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）および多能性幹細胞が例示される。多能性幹細胞は、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能を併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などが例示される。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞が好適に用いられ、より好ましくはｉＰＳ細胞が用いられる。
前駆細胞としては、多能造血前駆細胞、T前駆細胞、単球、赤芽球、巨核芽球、骨芽細胞、神経前駆細胞、肝前駆細胞などの組織前駆細胞が例示される。
【００２５】
より好適には、移植用培養細胞または培養組織は、ハプロタイプホモ接合性ドナーの体細胞から誘導されたハプロタイプホモ接合性ｉＰＳ細胞から分化誘導されたものである。
【００２６】
本願の方法において用いられるハプロタイプホモ接合性ｉＰＳ細胞としては、少なくともＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−ＤＲＢ座の３座がホモ接合性であることが確認されたドナーから誘導されたｉＰＳ細胞であればよい。好ましくはＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座、ＨＬＡ−ＤＲＢ座およびＨＬＡ−Ｃ座の４座がホモ接合性であることが確認されたドナーから誘導されたｉＰＳ細胞が用いられる。ｉＰＳ細胞は特定の初期化因子を、体細胞に作用させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性を有する体細胞由来の人工の幹細胞であり、その製造方法は公知である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。
【００２７】
ＨＬＡホモ接合体の細胞を持つ健康なボランティア（ＨＬＡホモドナー）の体細胞、例えば血液細胞や皮膚細胞からｉＰＳ細胞を誘導し、これを予めストックする、再生医療用ｉＰＳ細胞ストック事業が京都大学医学部にて行われており、例えばかかる事業によりストックされたｉＰＳ細胞を用いることができる。
【００２８】
あるいは、ｉＰＳ細胞としては、ＨＬＡホモドナー由来のＴ細胞から誘導されたＴ−ｉＰＳ細胞であってもよい。ヒトＴ細胞由来のｉＰＳ細胞であるＴ-ｉＰＳ細胞は例えばＷＯ２０１３／１７６１９７の記載に基づき製造することができる。
【００２９】
本願の方法のある態様において、ＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ１型またはＨＬＡ−Ｃ２／Ｃ２型であるドナー由来の移植用培養細胞または培養組織に、ドナーが有していない方のＨＬＡ−Ｃ１型またはＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ分子を発現させる。ＨＬＡ−Ｃ１型またはＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ分子としては、レシピエントが有しているＨＬＡ−Ｃ分子と必ずしも同一でなくともよく、ドナーが有していない方のＨＬＡ−Ｃ１またはＨＬＡ−Ｃ２型であればよい。好ましくは、レシピエントが有しているＨＬＡ−Ｃ分子と同一のＨＬＡ−Ｃ分子を発現させる。
【００３０】
本発明の方法のある態様において、移植用培養細胞または培養組織がＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性または相対的に弱い陽性である場合には、移植用培養細胞または培養組織にＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンドを発現させる。ＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンドとしては、ＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンドに対するＮＫ細胞上の受容体に相対的強い親和性を有するＨＬＡ−Ｂｗ４であればよい。好ましくはレシピエントが有しているＨＬＡ−Ｂｗ４型と同一のＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンドを発現させる。
【００３１】
ドナー由来の幹細胞や前駆細胞から所望の培養細胞または培養組織を分化誘導するにあたり、元の細胞のＨＬＡ型はそのまま維持される。本願の方法の一態様においては、分化誘導された培養細胞または培養組織に上記所望のＨＬＡ分子を発現させる。幹細胞や前駆細胞から移植に用いるために細胞または組織を分化誘導する方法は、公知の方法のいずれを採用してもよい。
【００３２】
幹細胞あるいは前駆細胞から分化誘導される細胞または組織に所望のＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４を発現させるには、ＮＫ細胞上の抑制性受容体が発現させたＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４を認識できるような状態とすればよく、恒久的な発現であっても一過性の発現であっても良い。ＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４を細胞または組織に発現させるには、目的とするＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４の遺伝子または遺伝子産物を細胞と接触させればよい。
【００３３】
ひとつの例として、ＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４タンパク質を細胞へ振りかける、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）とＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４タンパク質の融合、マイクロインジェクションなどの手法によって分化誘導された培養細胞もしくは培養組織へ導入してもよい。
【００３４】
あるいは、所望のＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４をコードするＤＮＡを、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって培養細胞または培養組織に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322:949-953, 2008）。ベクターには、導入遺伝子が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、培養細胞または培養組織へ一旦導入して作用させた後、導入したＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合するＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。
【００３５】
ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。分解を抑制するため、５−メチルシチジンおよびpseudouridine(TriLink Biotechnologies)を取り込ませたＲＮＡを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
【００３６】
好適には、培養細胞または培養組織はｉＰＳ細胞から分化誘導されたものを用いる。ｉＰＳ細胞を種々の細胞や組織へ分化誘導することができることは良く知られていることである。例えばＥＳ細胞で報告されている分化誘導法（例えば、神経幹細胞への分化誘導法としては、特開２００２−２９１４６９、膵幹様細胞への分化誘導法としては、特開２００４−１２１１６５、造血細胞への分化誘導法としては、特表２００３−５０５００６、胚葉体の形成による分化誘導法としては、特表２００３−５２３７６６に記載の方法等）を利用して、ｉＰＳ細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。また、ｉＰＳ細胞から網膜色素上皮細胞シートの製造方法（ＷＯ２０１２／１１５２４４）、免疫細胞の誘導方法（ＷＯ２０１６／０１０１４８、ＷＯ２０１６／０１０１５３、ＷＯ２０１６／０１０１５４、ＷＯ２０１６／０１０１５５）など新たな誘導方法が提案されている。本願の方法において、ｉＰＳ細胞から目的とする細胞や組織に分化誘導する方法は限定的でなく、公知の方法のいずれを用いてもよい。
【００３７】
所望のＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４を幹細胞、例えばｉＰＳ細胞に導入した後、当該ｉＰＳ細胞を所望の細胞または組織へと分化誘導してもよい。ｉＰＳ細胞へＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４を導入する場合、ＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４の遺伝子を、レンチウイルスやレトロウイルスなどによってゲノムへ組み込むことが例示される。ゲノムに組み込まれたＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４は分化誘導後もそのまま維持され、ｉＰＳ細胞からの分化誘導によって得られる細胞へと引き継がれる。
【００３８】
ある態様において所望の細胞または組織へと分化誘導された細胞は、ｉＰＳ細胞由来のＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ１またはＨＬＡ−Ｃ２／Ｃ２型に加えて、もう一方のＨＬＡ−Ｃ型を発現する。ＨＬＡ−Ｃ１型およびＨＬＡ−Ｃ２型の両方のタイプのＨＬＡ−Ｃ型を発現することから、ＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ２のレシピエントへ当該細胞もしくは組織を移植した場合、ＨＬＡ−Ｃ１型およびＨＬＡ−Ｃ２型の両方のＨＬＡ−Ｃ型に対するレシピエントＮＫ細胞の抑制性受容体へこれらのＨＬＡ−Ｃ分子が結合し、レシピエントのＮＫ細胞の活性化が回避される。
【００３９】
ある態様において所望の細胞または組織へと分化誘導された細胞は、ｉＰＳ細胞由来のＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子を有していない場合であっても、ＨＬＡ−Ｂｗ４型分子を発現する。ＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陽性のレシピエントへ当該細胞もしくは組織を移植した場合、発現させたＨＬＡ−Ｂｗ４型分子に対するレシピエントＮＫ細胞抑制性受容体へかかるＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンドが結合し、レシピエントのＮＫ細胞の活性化が回避される。
【００４０】
本願はまた、
（１）少なくともＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−ＤＲＢ座がホモ接合性であるＨＬＡハプロタイプホモ接合性ドナーから誘導されたｉＰＳ細胞を提供する工程、
（２−１）該ドナーのＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ１型である場合は、ＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ遺伝子を、ＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡＣ２／Ｃ２型である場合はＨＬＡ−Ｃ１型のＨＬＡ−Ｃ遺伝子をｉＰＳ細胞へ導入する工程、および／または
（２−２）該ドナーがＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陰性、または比較的弱い陽性である場合には、ＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ−Ｂ遺伝子をｉＰＳ細胞へ導入する工程、
（３）工程（２−１）および／または（２−２）で得られた細胞を、ドナーのＨＬＡ情報並びに導入したＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４の情報とひも付けて保存する工程を含む、ＨＬＡハプロタイプがヘテロ接合性であるレシピエント用ｉＰＳ細胞バンクの製造方法を提供する。本方法において、好ましくはドナーのＨＬＡ−Ｃ座もホモ接合性である。
【００４１】
本願のｉＰＳ細胞バンクは単独で運用するのではなく、ＨＬＡハプロタイプホモ接合性ドナー由来のｉＰＳ細胞バンクと合わせて運用するのが好ましい。本願のｉＰＳ細胞バンクはレシピエントのＨＬＡ−Ｃ型およびＨＬＡ−Ｂｗ４リガンドに応じた移植用組織や細胞を製造するために好適に用いられる。
即ち、ＨＬＡハプロタイプホモ接合性ドナーから誘導されたｉＰＳ細胞に加えて、
（１）該ドナーのＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡ−Ｃ１／Ｃ１型である場合は、ＨＬＡ−Ｃ２型のＨＬＡ−Ｃ遺伝子を、ＨＬＡ−Ｃ座がＨＬＡＣ２／Ｃ２型である場合はＨＬＡ−Ｃ１型のＨＬＡ−Ｃ遺伝子をさらに含むｉＰＳ細胞、および／または
（２）該ドナーがＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陰性、または比較的弱い陽性である場合には、ＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ−Ｂ遺伝子さらに含むｉＰＳ細胞
がドナーのＨＬＡ情報並びに導入したＨＬＡ−Ｃおよび／またはＨＬＡ−Ｂｗ４の情報とひも付けて保存されたｉＰＳ細胞バンクが提供される。
【００４２】
本願はまた、移植用培養細胞または培養組織をレシピエントに投与する場合に、ＮＫ細胞の活性化を抑制する物質を当該細胞または組織とともに投与することを含む、レシピエントＮＫ細胞の活性化抑制方法を提供する。「ここでＮＫ細胞の活性化を抑制する物質」とは、移植用培養細胞または培養組織が発現しておらず、レシピエントが発現しているＨＬＡ−Ｃ分子および／またはＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子の固相化ビーズ、可溶性分子、テトラマー、またはそれぞれのリガンドに対する抑制性受容体（ＫＩＲ）に対する刺激型抗体が例示される。
【００４３】
可溶性ＨＬＡ分子は、膜貫通部分の切断、抗体分子のＦｃ部分との融合、テトラマー化等によって得ることができる。これらのＮＫ細胞の活性化を抑制する物質は、移植用細胞または組織を投与する際の媒体に添加しても、投与前あるいは後にレシピエントに投与してもよい。
【００４４】
さらに本願は、  移植用培養細胞または培養組織の調製方法であって、下記１）および２）から選択される１以上の工程を含む方法を提供する：
１）移植用培養細胞または培養組織がレシピエントのＨＬＡ−Ｃ座の型に属するＨＬＡ−Ｃ分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないＨＬＡ−Ｃ分子に特異的なＮＫ細胞抑制性受容体に対する刺激型抗体を移植用培養細胞または培養組織に発現させる、
２）移植用培養細胞または培養組織がＨＬＡ−Ｂｗ４型リガンド陰性型もしくは相対的に弱いＢｗ４型リガンド陽性型であり、レシピエントがＨＬＡ−Ｂｗ４リガンド陽性型である場合にはＨＬＡ−Ｂｗ４型ＨＬＡ分子に特異的なＮＫ細胞抑制性受容体に対する刺激型抗体を移植用培養細胞または培養組織に発現させる。
【実施例】
【００４５】
以下、本願を実施例により更に詳細に説明する。本願発明は実施例によりいかなる意味においても規定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
１）再生Ｔ細胞の調製
健常人ＨＬＡハプロタイプホモ接合性ドナーｈｏｍｏ−ＡのＴ細胞よりｉＰＳ細胞を樹立した（Ｔ−ｉＰＳ細胞）。得られたｉＰＳ細胞からＣＤ８シングルポジティブ細胞を誘導した（再生Ｔ細胞）。また、ｈｏｍｏ−Ａのハプロタイプと一方が共通する健常人ハプロタイプヘテロ接合性ドナーｈｅｔｅｒｏ−１のＴ細胞より同様にｉＰＳ細胞を樹立し、ｉＰＳ細胞からＣＤ８シングルポジティブ細胞を誘導した。Ｔ細胞からｉＰＳ細胞（Ｔ−ｉＰＳ細胞）を誘導した。得られたＴ−ｉＰＳからＣＤ８シングルポジティブ細胞を誘導した（再生Ｔ細胞）。Ｔ細胞からのｉＰＳ細胞の誘導はＷＯ２０１６／０１０１５３５に記載の方法に基づいて行った。ｈｏｍｏ−Ａおよびｈｅｔｅｒｏ−１のハプロタイプを表１に示す。ＨＬＡ−Ｃの１４：０３、１２：０２はＣ１型、０４：０１、１５：０２はＣ２型に分類される。したがって、ｈｏｍｏ−ＡはＨＬＡ−ＣがＣ１／Ｃ１型、ｈｅｔｅｒｏ−１はＣ１／Ｃ２型である。
【００４７】
【表１】
2019004702.tif 000002
【００４８】
Ｔ−ｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化誘導
使用した培地は下記である。
【表２】
2019004702.tif 000003
＊ペニシリン／ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン１００００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００００μｇ／ｍＬからなり、それぞれの最終濃度を１００Ｕ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬとした。
【００４９】
【表３】
2019004702.tif 000004
＊ペニシリン／ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン１００００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００００μｇ／ｍＬからなり、それぞれの最終濃度を１００Ｕ／ｍＬおよび  １００μｇ／ｍＬとした。
【００５０】
ＯＰ９細胞の準備
０．１％ゼラチン／ＰＢＳ溶液６ｍｌを１０ｃｍ培養ディッシュに入れ、３７℃で３０分以上静置した。コンフルエントになったＯＰ９細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で剥がし、１／４相当量をゼラチンコートした１０ｃｍ培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを１０ｍｌとなるように加えた。
４日後に播種したＯＰ９細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを１０ｍｌ加え、全量が２０ｍｌとなるようにした。
【００５１】
ｉＰＳ細胞からの血球前駆細胞誘導
共培養に使用するＯＰ９細胞の培地を吸引し、新しいmedium Aに交換した。またｉＰＳ細胞培養ディッシュの培地も同様に吸引し、新しいmedium Aを１０ｍｌ加えた。EZ-passageローラーでｉＰＳ細胞塊を切った。カットしたｉＰＳ細胞塊を２００ｕｌピペットマンでピペッティングすることで浮遊させ、目視でおおよそ６００個のｉＰＳ細胞塊をＯＰ９細胞上に播種した。
【００５２】
ｉＰＳ細胞１クローンあたり３枚以上のディッシュを用い、継代するときには細胞を一度一つに合わせてから同じ枚数に再分配することでディッシュ間のばらつきを減らした。
【００５３】
Ｄａｙ  １  （培地交換）
ｉＰＳ細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し、培地を新しいmedium A  ２０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ  ５  （培地半量交換）
半量分の培地を新しいmedium A  １０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ  ９    （培地交換）
半量分の培地を新しいmedium A  １０ｍｌに交換した。
Ｄａｙ  １３  （誘導した中胚葉細胞をＯＰ９細胞上からＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上へ移しかえる）
培地を吸引し、ＨＢＳＳ（＋Ｍｇ＋Ｃａ）で細胞表面上の培地を洗い流した。その後２５０Ｕ  collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca)溶液１０ｍｌを加え、３７℃で４５分間培養した。
Collagenase溶液を吸引し、ＰＢＳ（−）１０ｍｌで洗い流した。その後５ｍｌの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃で２０分培養した。培養後、細胞が膜状に剥がれてくるので、ピペッティングにより物理的に細かくし、接着細胞同士を離した。
【００５４】
ここに新しいmedium Aを２０ｍｌ加え、さらに３７℃で４５分間培養した。培養後、浮遊細胞を含む上清を、１００μｍのメッシュを通して回収した。４℃、１２００ｒｐｍで７分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。このうち１／１０をＦＡＣＳ解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールした場合、元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。
【００５５】
得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４３抗体を用いてＦＡＣＳ解析した。ＣＤ３４ｌｏｗＣＤ４３＋細胞分画に十分な細胞数が確認できたことから、造血前駆細胞が誘導されていると確認した。
【００５６】
血球前駆細胞からのＴ細胞分化誘導
次いで細胞をＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。この工程において、ＣＤ３４ｌｏｗＣＤ４３＋細胞分画の細胞のソーティングは行わなかった。この分画をソーティングした場合、得られる細胞数が減少してしまうことやソーティングによる細胞へのダメージから、ソーティングしなかった場合に比べてＴ細胞への分化誘導効率が落ちることがある。
【００５７】
培養期間中に分化段階を確認するためにＦＡＣＳ解析を行うが、全ての期間において培養中に死細胞が多くみられる。そのためＦＡＣＳ解析時にはＰＩ（Propidium Iodide）、７−ＡＡＤなどを用い、死細胞除去したうえで解析を行った。
【００５８】
Ｄａｙ  １６  （細胞の継代）
ＯＰ９細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、１００μｍのメッシュを通して５０ｍｌコニカルチューブに回収した。４℃、１２００ｒｐｍで７分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種した。
【００５９】
Ｄａｙ  ２３  （細胞の継代）：血液細胞コロニーが見え始めた。
ＯＰ９細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、１００μｍのメッシュを通して５０ｍｌコニカルチューブに回収した。４℃、１２００ｒｐｍで７分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。
【００６０】
Ｄａｙ  ３６  ：ＣＤ４＋８＋ＤＰ細胞の刺激．
ＤＰ細胞をＣＤ８陽性細胞へと分化誘導するために、ＤＰ細胞をＣＤ４マイクロビーズによって単離し、medium Bに抗ＣＤ３抗体（５０ｎｇ／μｌ）とＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を加えたもので刺激した。
【００６１】
Ｄａｙ  ４３  ：ＣＤ８陽性細胞の確認
細胞ＦＡＣＳにより解析し、ＣＤ８シングルポジティブ細胞（ＣＤ８ＳＰ）の生成を確認した。
【００６２】
３）ｈｏｍｏ−Ａ  Ｔ−ｉＰＳ細胞へのＨＬＡ−Ｃ２型遺伝子の導入
ｈｏｍｏ−Ａ  Ｔ−ｉＰＳ細胞にｈｅｔｅｒｏ−１のＨＬＡ−Ｃ２遺伝子であるＨＬＡ−Ｃ＊０４：０１：０１遺伝子をレンチウイルスによって導入した。遺伝子導入にはレンチウイルベクターＣＳ−ＵｂＣ−ＲｆＡ−ＩＲＥＳ−Ｖｅｎｕｓを用い、以下の遺伝子を理化学研究所  （ＢＲＣ）より入手し、導入した。
【００６３】
Lenti-X 293T細胞にリポフェクションで上述のプラスミドを導入し、その培養上清をレンチウイルスベクターとして使用した。0.5×TrypLE selectでiPS細胞を回収し、5×104のiPS細胞を上述したレンチウイルスベクターを含む培養上清1mlで再懸濁し、スピンインフェクション (800g, 1.5時間, 32℃)をおこなった。感染させたiPS細胞を培養し、シングルセルコロニーを得た。遺伝子が導入されていることは蛍光タンパクVenusの発現によって確認した。
上記２）の方法にて、得られたiPS細胞をＣＤ８シングルポジティブ細胞へと誘導した細胞を調製した(homo-A CD8SP+C*04:01:01)。
【００６４】
４）NK細胞の画分
hetero-1ドナーより、ＮＫ細胞を常法により分取した。ＮＫ細胞をHLA-C1特異的抑制性受容体であるKIR 2DL3とHLA-C2特異的抑制性受容体であるKIR 2DL1に対する抗体を用い、FACSにより分類した。図１に示すように、R1〜R4の４つの分画に分けられた。
【００６５】
５）再生T細胞に対するNK細胞活性化試験
１）で得られたhomo-A由来TiPS細胞から再生されたＴ細胞（homo-A CD8SP）、hetero-1由来TiPS細胞から再生されたT細胞（autoTiPS)、並びにhomo-A由来TiPS細胞のゲノムへHLA-C２型遺伝子を導入したT細胞（homo-A CD8SP+C*04:01:01）に対する、hetero-1のＮＫ細胞の反応を調べた。各細胞を標的細胞とし、標的細胞とNK細胞を1 : 1で混合した後、12時間後にCD107aの発現上昇をFACSで検出した。図１に示すR1〜R4各分画にそれぞれにおけるCD107aの発現上昇を解析したところ、R2、R3の分画でauto iPS由来CD8SP細胞に対し、homo-A iPS細胞由来CD8SP細胞で有意にCD107aの発現上昇が認められ、ＮＫ細胞活性があることが確認された。
【００６６】
また、homo-A iPS細胞にhetero-1のHLA-C2遺伝子であるHLA-C*04:01:01遺伝子をレンチウイルスによって導入したiPS細胞由来再生T細胞 (homo-A CD8SP (+C*04:01:01))に対しては、HLA-C2を導入していないhomo-Aにおいて認められたNK細胞の反応は有意に抑制された。このことから、ハプロタイプホモのドナーより誘導した再生T細胞はハプロタイプヘテロかつHLA-CがC1/C2タイプのNK細胞に免疫反応を惹起させることが示された。また、その反応は自己のHLA-C2遺伝子を発現させることによって抑制できることが示された。結果を図２に示す。
【００６７】
６）ＮＫ細胞による標的細胞の傷害活性
標的細胞として、homo-A CD8SP、autoTiPSおよびhomo-A CD8SP+C*04:01:01の再生T細胞を用いた。ＮＫ細胞と再生Ｔ細胞の比を2:1、8:1で6時間培養し、死細胞の割合をAnnexinＶ陽性細胞の割合で評価した。特異的細胞傷害 (specific lysis)は (% sample lysis with effector - % basal lysis without effector) / (100 - % basal lysis without effector ) ×100で算出した。結果を図３に示す。
【００６８】
hetero-1のNK細胞はhomo-A由来再生T細胞を傷害したが、homo-A iPS細胞にhetero-1のHLA-C2遺伝子であるHLA-C*04:01:01遺伝子をレンチウイルスによって導入したiPS細胞由来再生T細胞 (homo-A CD8SP (+C*04:01:01))に対するhetero-1のNK細胞の細胞傷害活性は有意に抑制された。かかる結果より、HLA-C1/C1を有するハプロタイプホモのドナーより誘導した再生T細胞はHLA-C1/C2のハプロタイプヘテロのレシピエントのNK細胞に傷害されること、また、その細胞傷害活性はレシピエントの有するHLA-C2遺伝子を再生T細胞へ発現させることによって抑制できることが示された。
【実施例２】
【００６９】
１) iPS細胞から血管内皮細胞の誘導
表１に示すハプロタイプホモ接合性ドナーhomo-A由来のｉＰＳ細胞ならびにハプロタイプへテロのドナーhetero-1由来のｉＰＳ細胞を調製した。また、実施例１の３）に示すhomo-A由来ｉＰＳ細胞ゲノムへHLA-C*04:01:01を導入したｉＰＳ細胞を調製した。かかるｉＰＳ細胞を血管内皮細胞へと誘導した。
【００７０】
培地の組成を下記に記す
【表４】
2019004702.tif 000005
【００７１】
Day 0
0.5×TrypLE selectで細胞を回収し、ラミニン511でコートした6 wellプレートに2×105/wellで再播種した後、100% confluentになるまでStem Fitで4日培養した。
Day4
b-FGF (4ng/ml)入りStem Fitにmatrigel (1/60希釈) を加えた培地5mlで培地交換。
Day5
分化誘導培地 (+10ng/ml BMP4, 10ng/ml b-FGF, Matrigel 1/60希釈)５ｍｌで培地交換。
Day8, 10, 11
分化誘導培地 (+100ng/ml VEGF) 5mlで培地交換。
Day 13 (細胞の回収)
PBS 5mlでwashし、Accumax 1ml加え、37℃, 15分incubation。細胞を回収した。5mM EDTA 5%FBS/PBS 500μlで再懸濁し、α-CD31 Absとα-VE-Cadherin Absを0.5μl/100万細胞の割合で加え、RT 30minインキュベーションした。5mM EDTA 5%FBS/PBS 10mlでwashし、FACS AriaでCD31+VE-Cadherin+細胞をソーティングした。得られた血管内皮細胞（再生血管内皮細胞）は使用するまで-80℃のフリーザーで保存した。
【００７２】
２）再生血管内皮細胞に対するNK細胞活性化試験
実施例１と同様にしてHLAハプロタイプホモのドナーから誘導されたｉＰＳ細胞から分化誘導した再生血管内皮細胞を対象にヘテロのNK細胞が反応性を示すかどうかを評価した。結果を図４に示す。
【００７３】
実施例１と同様、再生血管内皮細胞とhetero-1のNK細胞を1 : 1で共培養し、12時間後にCD107aの発現上昇を解析した。その結果、hetero-1のNK細胞のＲ２およびＲ３画分はhomo-Aから誘導した再生血管内皮細胞に対し有意に活性化を示した。この結果から再生T細胞だけでなく、様々な組織細胞に対し、C1/C2をともに持つハプロタイプヘテロのNK細胞が反応性を示し得ることが裏付けられた。また、homo-A iPS細胞にhetero-1のHLA-C2遺伝子であるHLA-C*04:01:01遺伝子をレンチウイルスによって導入したiPS細胞由来再生血管内皮細胞 (homo-A 血管内皮 (+C*04:01:01))に対するhetero-1のNK細胞の反応は有意に抑制された。従って、再生血管内皮細胞においてもHLA-C2を導入することが有効であることが示された。
【実施例３】
【００７４】
Ｃ１／Ｃ２をともに持つハプロタイプヘテロのＮＫ細胞がＣ１遺伝子のみを持つハプロタイプホモの再生細胞に反応性を示す現象が、普遍的な現象であるかどうかを検証した。標的細胞として、日本人に最頻のハプロタイプのホモ接合性であるhomo-B (454E2株、理化学研究所より入手) を使用した。homo-Bとハプロタイプの一方を共有するヘテロ接合性で、HLA-CがC1/C2タイプであるhetero-2を選定し、NK細胞提供者とした。また、homo-B iPS細胞へ、HLA-C2遺伝子HLA-C*15:02:01を実施例1と同じ方法にて導入した。導入した遺伝子は理化学研究所より入手した。
【００７５】
【表５】
2019004702.tif 000006
【００７６】
homo-B iPS細胞より再生血管内皮細胞を誘導し、実施例１と同様にNK細胞の活性化試験を行った。結果を図５に示す。homo-B由来の血管内皮細胞によってhetero-2のNK細胞は活性化されたが、homo-B iPS細胞にhetero-2のHLA-C2遺伝子であるHLA-C*15:02:01遺伝子をレンチウイルスによって導入したiPS細胞由来再生血管内皮細胞ではこの活性化反応は有意に抑制された。従って、ＨＬＡハプロタイプホモのｉＰＳ細胞にＨＬＡ−Ｃ２遺伝子を導入することが有効であることが示された。
【実施例４】
【００７７】
健常人ボランティアであるＤｏｎｏｒ−ＮＫ１より、ＮＫ細胞を常法により分取した。Ｄｏｎｏｒ−ＮＫ１並びに健常人ボランティアであるＤｏｎｏｒ−ＡとＤｏｎｏｒ−Ｂから末梢血単核球を採取した。Ｄｏｎｏｒ−ＮＫ１、Ｄｏｎｏｒ−Ａ、Ｄｏｎｏｒ−Ｂの３名のＨＬＡ型を表６に示す。
【００７８】
【表６】
2019004702.tif 000007
【００７９】
本実施例で用いた３名のドナーのＨＬＡ−Ｃは全てＣ１型であり、ＨＬＡ−Ｃ型についてのミスマッチは存在しない。Ｄｏｎｏｒ−ＮＫ１のＨＬＡ−ＢはＢｗ４型であり、ＨＬＡ−Ｂ４４０３はＮＫ細胞に発現する抑制性受容体にリガンドとしてシグナルを送る力が強いとされる。Ｄｏｎｏｒ−ＡおよびＤｏｎｏｒ−ＢのＨＬＡ−ＢはＢｗ４型ではない。Ｄｏｎｏｒ−ＢのＨＬＡ−Ａ−２４０２は相対的に弱いＢｗ４リガンドであることが知られている。
【００８０】
Ｄｏｎｏｒ−ＮＫ１から得たＮＫ細胞をＨＬＡ−Ｂｗ４特異的抑制性受容体であるＫＩＲ３ＤＬ１とＨＬＡ−Ｃ１特異的抑制性受容体であるＫＩＲ２ＤＬ３に対する抗体を用い、ＦＡＣＳにより分類した。図６に示すように、Ｒ１〜Ｒ４の４つの分画に分けられた。
【００８１】
Ｄｏｎｏｒ−ＮＫ１、Ｄｏｎｏｒ−ＡおよびＤｏｎｏｒ−Ｂから単離した末梢血単核球をそれぞれ標的細胞として、ＮＫ細胞活性化試験を行った。各細胞を標的細胞とし、標的細胞とＮＫ細胞をＩＬ−２  １０００単位／ｍｌの存在下で１：１で混合した後、６時間培養した。培養後にＣＤ１０７ａの発現量をＦＡＣＳで検出して、これをＮＫ細胞活性化の指標とした。ＮＫ細胞を図６の４つの分画に分け、それぞれにおいてＣＤ１０７ａの発現上昇を解析した。ＣＤ１０７ａの発現量がＤｏｎｏｒ−ＮＫ１から単離したＰＢＭＣ（ａｕｔｏ）と共培養した場合の発現量と比して上昇した場合、ＮＫ細胞が活性化されたと認定した。結果を図７に示す。
【００８２】
まず強いＢｗ４リガンドをもつＤｏｎｏｒ−ＮＫ１より単離したＮＫ細胞がＢｗ４リガンドを持たないＤｏｎｏｒ−ＡのＰＢＭＣに反応性を示すかどうかを検証した。ＨＬＡ−Ｂ４４０３はＮＫ細胞に発現する抑制性受容体にリガンドとしてシグナルを送る力が強いとされる。
【００８３】
Ｒ２およびＲ３の分画で、Ｄｏｎｏｒ−Ａ細胞由来ＰＢＭＣにおいてａｕｔｏ  ＰＢＭＣ（Ｄｏｎｏｒ−ＮＫ１由来ＰＢＭＣ）での発現量と比べて有意な上昇が認められた。この結果はＢｗ４リガンド陰性の組織または細胞を陽性のレシピエントに移植する場合に拒絶反応が起こりうることを示すものである。
【００８４】
次に強いＢｗ４リガンドをもつＤｏｎｏｒ−ＮＫ１より単離したＮＫ細胞が相対的に弱いＢｗ４リガンドであるＨＬＡ−Ａ−２４０２をもつＤｏｎｏｒ−ＢのＰＢＭＣに反応性を示すかどうかを検証した。Ｄｏｎｏｒ−Ａの場合と同じようにＲ２およびＲ３の分画で、Ｄｏｎｏｒ−Ｂ細胞由来ＰＢＭＣと共培養した場合に有意にＣＤ１０７ａの発現上昇が認められた。この結果はＢｗ４リガンドを発現している再生組織であってもそれが相対的に弱いものであれば、強いＢｗ４リガンド陽性のレシピエントに移植する場合に拒絶反応が起こりうることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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