(57)【要約】      （修正有）【課題】抗血液樹状細胞抗原２（ＢＤＣＡ２）抗体およびその使用の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列部分を含みＢＤＣＡ２に結合する抗体をコードする単離核酸。ヒト被験体において、形質細胞様樹状細胞の表面におけるＣＤ３２ａの発現を下方調節、免疫複合体による形質細胞様樹状細胞の刺激を阻害または形質細胞様樹状細胞の表面におけるＣＤ６２Ｌの発現を下方調節するための、上記抗体を含む組成物。組織を上記抗体と接触させるステップを含む、単離組織内の形質細胞様樹状細胞の存在を検出するための方法。【選択図】図３３
2019146567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血液樹状細胞抗原２（ＢＤＣＡ２）（配列番号１）に結合する抗体をコードする単離核酸（複数可）であって、
該抗体は、重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含み、
該抗体は、軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含む、
単離核酸（複数可）。
【請求項２】
前記ＶＨドメインが、
（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、または
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と同一である、
請求項１に記載の単離核酸（複数可）。
【請求項３】
前記抗体が重鎖を含み、該重鎖が配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離核酸（複数可）。
【請求項４】
前記ＶＬドメインが、
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、または
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と同一である、
請求項１に記載の単離核酸（複数可）。
【請求項５】
前記抗体が軽鎖を含み、該軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離核酸（複数可）。
【請求項６】
（ｉ）前記ＶＨドメインが配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、前記ＶＬドメインが配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、または
（ｉｉ）前記ＶＨドメインが配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、前記ＶＬドメインが配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、
請求項１に記載の単離核酸（複数可）。
【請求項７】
前記ＶＨドメインが配列番号２４のアミノ酸配列と同一であり、前記ＶＬドメインが配列番号２３のアミノ酸配列と同一である、請求項１に記載の単離核酸（複数可）。
【請求項８】
前記抗体が重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号４のアミノ酸配列を含み、該軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離核酸（複数可）。
【請求項９】
ヒト血液樹状細胞抗原２（ＢＤＣＡ２）（配列番号１）に結合する抗原結合断片をコードする単離核酸（複数可）であって、
該抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含み、
該抗原結合断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含む、
単離核酸（複数可）。
【請求項１０】
前記ＶＨドメインが、
（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、または
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と同一である、
請求項９に記載の核酸（複数可）。
【請求項１１】
前記ＶＬドメインが、
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、または
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と同一である、
請求項９に記載の核酸（複数可）。
【請求項１２】
（ｉ）前記ＶＨドメインが配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、前記ＶＬドメインが配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、または
（ｉｉ）前記ＶＨドメインが配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、前記ＶＬドメインが配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、
請求項９に記載の核酸（複数可）。
【請求項１３】
前記ＶＨドメインが配列番号２４のアミノ酸配列と同一であり、前記ＶＬドメインが配列番号２３のアミノ酸配列と同一である、請求項９に記載の核酸（複数可）。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の核酸（複数可）を含む発現ベクター（複数可）。
【請求項１５】
単離組織内の形質細胞様樹状細胞の存在を検出するための方法であって、該方法は、該組織を抗ＢＤＣＡ２抗体またはそのＢＤＣＡ２結合断片と接触させるステップを含み、該抗ＢＤＣＡ２抗体またはそのＢＤＣＡ２結合断片が、重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含み、
該抗体は、軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含む、
方法。
【請求項１６】
前記組織が、全身性エリテマトーデス、強皮症、斑状強皮症、関節リウマチ、乾癬、皮膚筋炎、多発性筋炎または炎症性腸疾患を有するヒト被験体に由来する皮膚生検である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織を抗ＣＤ１２３抗体と接触させるステップをさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗ＢＤＣＡ２抗体を含む、ヒト被験体において形質細胞様樹状細胞の表面におけるＣＤ３２ａの発現を下方調節するための組成物であって、
該抗ＢＤＣＡ２抗体が、重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含み、
該抗体は、軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含む、
組成物。
【請求項１９】
抗ＢＤＣＡ２抗体を含む、ヒト被験体において免疫複合体による形質細胞様樹状細胞の刺激を阻害するための組成物であって、
該抗ＢＤＣＡ２抗体が、重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含み、
該抗体は、軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含む、
組成物。
【請求項２０】
抗ＢＤＣＡ２抗体を含む、ヒト被験体において形質細胞様樹状細胞の表面におけるＣＤ６２Ｌの発現を下方調節するための組成物であって、
該抗ＢＤＣＡ２抗体が、重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含み、
該抗体は、軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含む、
組成物。
【請求項２１】
前記ＶＨドメインが、
（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、または
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と同一である、
請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗体が重鎖を含み、該重鎖が配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＶＬドメインが、
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、または
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と同一である、
請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗体が軽鎖を含み、該軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
（ｉ）前記ＶＨドメインが配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、前記ＶＬドメインが配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、または
（ｉｉ）前記ＶＨドメインが配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、前記ＶＬドメインが配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、
請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＶＨドメインが配列番号２４のアミノ酸配列と同一であり、前記ＶＬドメインが配列番号２３のアミノ酸配列と同一である、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗体が重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号４のアミノ酸配列を含み、該軽鎖が配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
抗ＢＤＣＡ２抗体およびコルチコステロイドを含む組成物であって、
該抗ＢＤＣＡ２抗体が、重鎖可変（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含み、
該抗体は、軽鎖可変（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含む、
組成物。
【請求項２９】
前記コルチコステロイドがグルココルチコイドである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記コルチコステロイドがプレドニゾンである、請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年１２月１０日に出願した米国仮出願第６１／７３５，３６２号および２０１３年２月１１日に出願した米国仮出願第６１／７６３，２７０号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
血液樹状細胞抗原２（ＢＤＣＡ２）とは、ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）上で発現するＣ型レクチン（Dzionekら、J.  Immunol.、１６５巻：６０３７〜６０４６頁（２０００年））であり、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドに応答してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）を分泌する、骨髄由来細胞の特化した集団である。ＢＤＣＡ２は、そのＣ末端における、ＩＩ型Ｃ型レクチン群に属する単一の細胞外炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）、膜貫通領域、およびシグナル伝達モチーフを保有しないそのＮ末端の短い細胞質尾部からなる。ＢＤＣＡ２は、会合する膜貫通アダプターであるＦｃεＲＩγを介して細胞内シグナルを伝達し、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）様シグナル伝達カスケードを誘導する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Dzionekら、J.  Immunol.、１６５巻：６０３７〜６０４６頁（２０００年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本開示は、少なくとも部分的に、ＢＤＣＡ２に結合する抗体の同定および特徴付けに基づく。このような抗体は、炎症性サイトカインおよびケモカインの分泌を低減または阻害しうる。本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体はまた、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、または補体介在性細胞傷害作用（ＣＤＣ）により、ｐＤＣを枯渇させることが可能でもある。加えて、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体は、ｐＤＣの表面におけるＣＤ３２ａおよび／またはＣＤ６２Ｌのレベルも下方調節しうる。さらに、本開示の抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＤＣＡ２の、ｐＤＣの細胞表面からの内部移行を媒介しうる。少なくともこれらの理由で、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体は、自己免疫状態および炎症性状態の処置または防止において有用である。本開示はまた、効果を改善するために、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体を、抗マラリア剤と組み合わせうることも示す。
【０００５】
一態様では、本開示は、ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、ヒトＢＤＣＡ２の細胞外ドメインへの結合について、ＢＩＩＢ０５９と競合する単離抗体またはその抗原結合断片を特色とする。
【０００６】
抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、ＢＤＣＡ２へとあらかじめ結合させることにより、ＢＩＩＢ０５９の、ＢＤＣＡ２への後続の結合を完全に、または部分的に阻害する場合、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、ＢＤＣＡ２への結合について、ＢＩＩＢ０５９と競合する。例えば、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、ＢＤＣＡ２へとあらかじめ結合させることにより、ＢＩＩＢ０５９の、ＢＤＣＡ２への後続の結合を完全に阻害する場合、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、ＢＤＣＡ２への結合について、ＢＩＩＢ０５９と競合する。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、ＢＤＣＡ２へとあらかじめ結合させる結果として、ＢＩＩＢ０５９の、ＢＤＣＡ２への後続の結合を、少なくとも３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％阻害する。
【０００７】
別の態様では、本開示は、ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、（ｉ）他のサイトカインおよびケモカインに加えた、Ｉ型インターフェロンおよび／もしくはＩＩＩ型インターフェロンの、形質細胞様樹状細胞からの分泌を阻害するか、または（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、形質細胞様樹状細胞の枯渇を誘導もしくは増強する、単離抗体またはその抗原結合断片を特色とする。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ｐＤＣの表面からのＣＤ３２ａおよび／またはＣＤ６２Ｌを下方調節する。いくつかの実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＤＣＡ２の、ｐＤＣの細胞表面からの内部移行を媒介する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、カニクイザルＢＤＣＡ２（配列番号７３）およびアカゲザルＢＤＣＡ２（配列番号７２）に結合する。ある種の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、Ｉ型インターフェロン、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＩＩＩ型インターフェロン、マクロファージ炎症性タンパク質１（ＭＩＰ−１）−α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ）、またはインターフェロンγ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０）の分泌または産生を阻害する。
【０００８】
上記の２つの態様のいくつかの実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は必要に応じて、以下の特色：０．５〜３μｇ／ｍＬまたは４ｎＭ〜１０ｎＭのＥＣ５０（ヒトＢＤＣＡ２）；０．５〜３μｇ／ｍＬまたは５ｎＭ〜１０ｎＭのＥＣ５０（カニクイザルＢＤＣＡ２）；７〜７．５のｐＩ；ラットＣｌｅｃ４ｂ２に結合しないか、またはヒトＢＤＣＡ２、カニクイザルＢＤＣＡ２、もしくはアカゲザルＢＤＣＡ２より小さな結合アフィニティーでラットＣｌｅｃ４ｂ２に結合すること；ＭＩＰ−１−α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０など、ケモカインの産生または分泌を阻害すること；重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３であって、重鎖ＣＤＲ１が、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列、または配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有し；重鎖ＣＤＲ２が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有し；重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有し；可変重鎖が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つをさらに含むかまたはこれらからなる。ある種の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号９１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する。ある種の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号９２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する。ある種の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号９３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号９４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、単離抗体または抗原結合断片のＥＣ５０（ヒトＢＤＣＡ２）は、４．５ｎＭ、４．６ｎＭ、４．７ｎＭ、４．８ｎＭ、４．９ｎＭ、５．０ｎＭ、５．１ｎＭ、５．２ｎＭ、５．３ｎＭ、５．４ｎＭ、または５．５ｎＭである。具体的な実施形態では、単離抗体または抗原結合断片のＥＣ５０（ヒトＢＤＣＡ２）は、４．９ｎＭである。いくつかの実施形態では、単離抗体または抗原結合断片のＥＣ５０（カニクイザルＢＤＣＡ２）は、４．０ｎＭ、４．１ｎＭ、４．２ｎＭ、４．３ｎＭ、４．４ｎＭ、４．５ｎＭ、４．６ｎＭ、４．７ｎＭ、４．８ｎＭ、４．９ｎＭ、または５．０ｎＭである。具体的な実施形態では、単離抗体または抗原結合断片のＥＣ５０（カニクイザルＢＤＣＡ２）は、４．４ｎＭである。この態様のある種の実施形態では、抗体は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を有する。ある種の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ３ドメインを含む���重鎖定常領域が、置換を含む場合、このような置換は、抗体の特性を改変する（例えば、Ｆｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能のうちの１または複数を増加または減少させる）。ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。ある種の実施形態では、抗体は、７〜１５μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１１μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１２μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。
【０００９】
別の態様では、本開示は、ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３を含む単離抗体またはその抗原結合断片を特色とする。重鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。重鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。重鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。別の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、１、２、３、または４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号８９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；１、２、３、または４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；および１、２、３、または４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む。別の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、１、２、３、または４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；１、２、３、または４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；および１、２、３、または４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む。別の態様では、抗体またはその抗原結合断片は、１、２、３、または４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；１、２、３、または４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；および１、２、３、または４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む。これらの抗体は、（ｉ）ヒトＢＤＣＡ２またはカニクイザルＢＤＣＡ２には結合するが、霊長動物より下等の系統発生種に由来するＢＤＣＡ２には有意には結合せず、かつ／または（ｉｉ）ヒトｐＤＣによる、ＴＬＲ７／ＴＬＲ９誘導Ｉ型インターフェロンおよび他のサイトカインまたはケモカインの産生を阻害し、かつ／または（ｉｉｉ）ＢＤＣＡ２の、ｐＤＣの表面からの内部移行を媒介し、かつ／または（ｉｖ）ｐＤＣの表面からのＣＤ３２ａおよび／もしくはＣＤ６２Ｌを下方調節し、かつ／または（ｖ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＡＤＣＣまたはＣＤＣにより、ｐＤＣを枯渇させる。この態様のある種の実施形態では、抗体は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を有する。
【００１０】
ある種の実施形態では、ヒトＢＤＣＡ２に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３を有する。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３を有する。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む。軽鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。軽鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。軽鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。ある種の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；軽鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；軽鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。他の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００１１】
ある種の実施形態では、ヒトＢＤＣＡ２に選択的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＴＹＴＭＳ（配列番号８）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３を含む。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列ＴＹＴＭＳ（配列番号８）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３を有する。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む。軽鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。軽鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。軽鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。ある種の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；軽鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；軽鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。他の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＴＹＴＭＳ（配列番号８）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００１２】
ある種の実施形態では、ヒトＢＤＣＡ２に選択的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹ（配列番号８９）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号８９に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＰＧＤＳＦＧ（配列番号９１）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３を含む。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹ（配列番号８９）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＰＧＤＳＦＧ（配列番号９１）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３を有する。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む。軽鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。軽鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。軽鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。ある種の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；軽鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；軽鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。他の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹ（配列番号８９）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＰＧＤＳＦＧ（配列番号９１）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００１３】
ある種の実施形態では、ヒトＢＤＣＡ２に選択的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹ（配列番号９２）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９２に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３を含む。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹ（配列番号９２）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３を有する。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む。軽鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。軽鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。軽鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。ある種の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；軽鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；軽鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。他の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹ（配列番号９２）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００１４】
ある種の実施形態では、ヒトＢＤＣＡ２に選択的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＳＴＹＴＭＳ（配列番号９０）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９０に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＷＶＡＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹ（配列番号９３）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９３に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＴＲＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡ（配列番号９４）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９４に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３を含む。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、アミノ酸配列ＳＴＹＴＭＳ（配列番号９０）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＶＡＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹ（配列番号９３）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＴＲＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡ（配列番号９４）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３を有する。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片は、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む。軽鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＤＹＤＧＤＳＹＭＮＷＹ（配列番号９５）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。軽鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＬＬＩＹＡＡＳＴＬＥ（配列番号９６）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９６に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。軽鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲ（配列番号９７）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。ある種の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１は、アミノ酸配列ＤＹＤＧＤＳＹＭＮＷＹ（配列番号９５）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；軽鎖ＣＤＲ２は、アミノ酸配列ＬＬＩＹＡＡＳＴＬＥ（配列番号９６）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９６に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなり；軽鎖ＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲ（配列番号９７）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９７に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。他の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＳＴＹＴＭＳ（配列番号９０）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＶＡＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹ（配列番号９３）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ２、アミノ酸配列ＴＲＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡ（配列番号９４）を含むかまたはこれからなる重鎖ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＤＹＤＧＤＳＹＭＮＷＹ（配列番号９５）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＬＬＩＹＡＡＳＴＬＥ（配列番号９６）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲ（配列番号９７）を含むかまたはこれからなる軽鎖ＣＤＲ３を有する。
【００１５】
上記の態様のある種の実施形態では、抗体は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を有する。ある種の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ３ドメインを含む。重鎖定常領域が、置換を含む場合、このような置換は、抗体の特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能のうちの１または複数を増加または減少させる）。ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。ある種の実施形態では、抗体は、７〜１５μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１１μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１２μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。
【００１６】
別の態様では、本開示は、ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、配列番号４０、４２、４４、４６、４９、または５２のうちのいずれか１つに示されるＶＨの重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３を含む単離抗体またはその抗原結合断片を特色とする。この態様のいくつかの実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５４、５６、または５８のうちのいずれか１つに示されるＶＬの軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、ＫａｂａｔによるＣＤＲの場合もあり、代替のＣＤＲのうちのいずれかの場合もある。ある種の実施形態では、抗体は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を有する。ある種の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ３ドメインを含む。重鎖定常領域が、置換を含む場合、このような置換は、抗体の特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能のうちの１または複数を増加または減少させる）。ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。ある種の実施形態では、抗体は、７〜１５μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１１μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１２μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。別の態様では、本開示は、ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、ＢＩＩＢ０５９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）と少なくとも８０％同一な可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、または配列番号４０、４２、４４、４６、４９、もしくは５２のうちのいずれか１つに示されるＶＨドメインを含む単離抗体またはその抗原結合断片を特色とする。これらの抗体は、（ｉ）ヒトＢＤＣＡ２またはカニクイザルＢＤＣＡ２には結合するが、霊長動物より下等の系統発生種に由来するＢＤＣＡ２には有意には結合せず、かつ／または（ｉｉ）ヒトｐＤＣによる、ＴＬＲ７／ＴＬＲ９誘導Ｉ型インターフェロンおよび他のサイトカインまたはケモカインの産生を阻害し、かつ／または（ｉｉｉ）ＢＤＣＡ２の、ｐＤＣの表面からの内部移行を媒介し、かつ／または（ｉｖ）ｐＤＣの表面からのＣＤ３２ａおよび／もしくはＣＤ６２Ｌを下方調節し、かつ／または（ｖ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＡＤＣＣまたはＣＤＣにより、ｐＤＣを枯渇させる。
【００１７】
この態様のある種の実施形態では、抗体またはその抗体断片は、ＢＩＩＢ０５９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）と少なくとも９０％同一なＶＨドメイン、または配列番号４０、４２、４４、４６、４９、もしくは５２のうちのいずれか１つに示されるＶＨドメインを含むかまたはこれらからなる。この態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗体断片は、ＢＩＩＢ０５９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）と少なくとも９５％同一なＶＨドメイン、または配列番号４０、４２、４４、４６、４９、もしくは５２のうちのいずれか１つに示されるＶＨドメインを含むかまたはこれらからなる。この態様の他の実施形態では、単離抗体または抗原結合断片のＶＨドメインは、ＢＩＩＢ０５９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）、または配列番号４０、４２、４４、４６、４９、もしくは５２のうちのいずれか１つに示されるＶＨドメインと同一である。ある種の実施形態では、重鎖は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。この態様のある種の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＢＩＩＢ０５９のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３）と少なくとも８０％同一な可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン、または配列番号５４、５６、もしくは５８のうちのいずれか１つに示されるＶＬドメインを含むかまたはこれらからなる。この態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＢＩＩＢ０５９のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３）と少なくとも９０％同一なＶＬドメイン、または配列番号５４、５６、もしくは５８のうちのいずれか１つに示されるＶＬドメインを含むかまたはこれらからなる。この態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＢＩＩＢ０５９のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３）と少なくとも９５％同一なＶＬドメイン、または配列番号５４、５６、もしくは５８のうちのいずれか１つに示されるＶＬドメインを含むかまたはこれらからなる。この態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＢＩＩＢ０５９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）と同一なＶＨドメインおよびＢＩＩＢ０５９のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３）と同一なＶＬドメインを含むかまたはこれらからなる。この態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４０、４２、４４、４６、４９、または５２のうちのいずれか１つに示されるＶＨドメインのアミノ酸配列と同一なＶＨドメイン、および配列番号５４、５６、または５８のうちのいずれか１つに示されるＶＬドメインを含むかまたはこれらからなる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる重鎖、および配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる軽鎖を含むかまたはこれらからなる。これらの実施形態は、上記の態様の全ておよびそれらの実施形態に関する。ある種の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、単鎖抗体である。他の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｓｃ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、またはダイアボディである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。
【００１８】
別の態様では、本開示は、ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、指定番号をＰＴＡ−１３４５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。この態様のある種の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、指定番号をＰＴＡ−１３４５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む。この態様のある種の実施形態では、抗体は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を有する。ある種の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ３ドメインを含む。重鎖定常領域が、置換を含む場合、このような置換は、抗体の特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能のうちの１または複数を増加または減少させる）。ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。ある種の実施形態では、抗体は、７〜１５μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１１μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１２μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。別の態様では、本開示は、ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、指定番号をＰＴＡ−１３４５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体の変異体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３であって、指定番号をＰＴＡ−１３４５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のそれぞれと比較して、１、２、または３カ所のアミノ酸置換を含む、変異体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。この態様のある種の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、指定番号をＰＴＡ−１３４５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体の変異体の軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３であって、指定番号をＰＴＡ−１３４５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のそれぞれと比較して、１、２、または３カ所のアミノ酸置換を含む、変異体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をさらに含む。この態様のある種の実施形態では、抗体は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を有する。ある種の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は��ＣＨ３ドメインを含む。重鎖定常領域が、置換を含む場合、このような置換は、抗体の特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能のうちの１または複数を増加または減少させる）。ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。ある種の実施形態では、抗体は、７〜１５μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１１μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１２μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。別の態様では、本開示は、ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、指定番号をＰＴＡ−１３４５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体の結合を交差遮断する、単離抗体またはその抗原結合断片を特色とする。ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。ある種の実施形態では、抗体は、７〜１５μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１１μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１２μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。さらに別の態様では、本開示は、指定番号をＰＴＡ−１３４５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体と同じエピトープにおいて、ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を特色とする。ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。ある種の実施形態では、抗体は、７〜１５μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１１μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１２μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。さらなる態様では、本開示は、ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、指定番号をＰＴＡ−１３４５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体のＶＨドメイ��と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、または少なくとも９８％同一なＶＨドメインを含む、単離抗体またはその抗原結合断片を特色とする。この態様のある種の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、指定番号をＰＴＡ−１３４５０としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体のＶＬドメインと、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、または少なくとも９８％同一なＶＬドメインを含む。
【００１９】
上記の５つの態様の全てでは、抗体またはその抗原結合断片はさらに、（ｉ）他のサイトカインおよびケモカインに加えた、Ｉ型インターフェロンおよび／もしくはＩＩＩ型インターフェロンの、形質細胞様樹状細胞からの分泌を阻害するか、または（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、形質細胞様樹状細胞の枯渇を誘導もしくは増強する。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体は、ｐＤＣ上のＣＤ３２ａおよび／またはＣＤ６２Ｌを下方調節する（抗ＢＤＣＡ２抗体と接触させていないｐＤＣと比べて）。ある種の実施形態では、抗体は、ＢＤＣＡ２の、ｐＤＣの表面からの内部移行を媒介する。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、カニクイザルＢＤＣＡ２（配列番号７３）およびアカゲザルＢＤＣＡ２（配列番号７２）に結合する。上記の５つの態様のある種の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、Ｉ型インターフェロン、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＩＩＩ型インターフェロン、マクロファージ炎症性タンパク質１（ＭＩＰ−１）−α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ）、またはインターフェロンγ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０）の分泌または産生を阻害する。上記の５つの態様のある種の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化抗体である。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、単鎖抗体である。上記の５つの態様の他の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｓｃ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、またはダイアボディである。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２重鎖定常領域を有する。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域とＩｇＧ４重鎖定常領域とのハイブリッドである。
【００２０】
ある種の実施形態では、本開示は、上記で記載した抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを産生する単離細胞を提供する。
【００２１】
他の実施形態では、本開示は、上記で記載した抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかと、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１０〜２５ｍＭのクエン酸塩、１００〜２００ｍＭの塩化ナトリウム、および５．５〜６．５のｐＨを含む組成物中に製剤化された、上記で記載した抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを含む。ある種の実施形態では、医薬組成物は必要に応じて、Ｔｗｅｅｎ−８０（０．０１〜０．３％、例えば、０．０３％）を含む。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および６．０のｐＨを含む組成物中に製剤化された、上記で記載した抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを含む。
【００２２】
別の態様では、本開示は、抗ＢＤＣＡ２抗体を作製するための方法を提供する。方法は、ＢＤＣＡ２抗体の重鎖および／または軽鎖を含む細胞を供給するステップと、細胞を、抗体の発現を可能とする条件下でインキュベートするステップと、抗体を単離するステップとを伴う。方法は必要に応じて、抗体を精製するステップを含む。ある種の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の実施形態では、細胞は、２９３細胞である。特定の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９である。一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖であって、配列番号４に示される配列を含むかまたはこれからなる重鎖、および配列番号３に示される配列を含むかまたはこれからなる軽鎖を有する。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＶＨ  ＣＤＲ３を含むかまたはこれらからなる。さらなる実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むかまたはこれからなるＶＬ  ＣＤＲ３を含むかまたはこれらからなる。
【００２３】
別の態様では、本開示は、組織内の形質細胞様樹状細胞の存在を検出するための方法を提供する。方法は、組織を、抗ＢＤＣＡ２抗体と接触させるステップを含む。ある種の実施形態では、組織は、全身性エリテマトーデスを有する被験体に由来する皮膚生検である。ある種の実施形態では、組織は、強皮症を有する被験体に由来する皮膚生検である。ある種の実施形態では、組織は、斑状強皮症を有する被験体に由来する皮膚生検である。ある種の実施形態では、組織は、関節リウマチを有する被験体に由来する皮膚生検である。ある種の実施形態では、組織は、乾癬を有する被験体に由来する皮膚生検である。ある種の実施形態では、組織は、皮膚筋炎を有する被験体に由来する皮膚生検である。ある種の実施形態では、組織は、多発性筋炎を有する被験体に由来する皮膚生検である。ある種の実施形態では、組織は、炎症性腸疾患を有する被験体に由来する皮膚生検である。具体的な実施形態では、全身性エリテマトーデスは、皮膚ループス、円板状ループス、またはループス腎炎である。抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、例えば、フルオロフォア（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）により標識することができる。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９である。他の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、クローン１２４Ｂ３．１３（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓ）である。ある種の実施形態では、方法は、組織を、抗ＣＤ１２３抗体と接触させるステップをさらに含む。
【００２４】
別の態様では、本開示は、それを必要とする被験体において、形質細胞様樹状細胞の死を誘導する方法を提供する。方法は、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを、被験体へと投与するか、またはＢＤＣＡ２を発現する形質細胞様樹状細胞を、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかと接触させるステップを伴う。
【００２５】
別の態様では、本開示は、それを必要とする被験体において、形質細胞様樹状細胞による炎症性サイトカインまたは炎症性ケモカインの産生を低減する方法を特色とする。方法は、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを、被験体へと投与するか、またはＢＤＣＡ２を発現する形質細胞様樹状細胞を、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかと接触させるステップを含む。ある種の実施形態では、炎症性サイトカインまたは炎症性ケモカインは、Ｉ型インターフェロン、ＩＬ−６、またはＴＮＦ−α、ＩＩＩ型インターフェロン、ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、およびＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０からなる群から選択される。
【００２６】
別の態様では、本開示は、形質細胞様樹状細胞の表面におけるＣＤ３２ａの発現を下方調節する方法を特色とする。方法は、形質細胞様樹状細胞を、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体と接触させるステップを含む。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２重鎖定常領域を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域とＩｇＧ４重鎖定常領域とのハイブリッドである。ある種の実施形態では、抗体を、非グリコシル化する。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域とＩｇＧ４重鎖定常領域との非グリコシル化ハイブリッドである。
【００２７】
別の態様では、本開示は、それを必要とするヒト被験体において、形質細胞様樹状細胞の表面におけるＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）の発現を下方調節する方法を特色とする。方法は、ヒト被験体へと、有効量の、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体を投与するステップを含む。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２重鎖定常領域を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域とＩｇＧ４重鎖定常領域とのハイブリッドである。ある種の実施形態では、抗体を、非グリコシル化する。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域とＩｇＧ４重鎖定常領域との非グリコシル化ハイブリッドである。
【００２８】
別の態様では、本開示は、それを必要とするヒト被験体において、免疫複合体による形質細胞様樹状細胞の刺激を阻害する方法を特色とする。方法は、ヒト被験体へと、有効量の、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、投与により、ｐＤＣの表面におけるＣＤ３２ａのレベルが低減される。いくつかの実施形態では、被験体は、ＩＩＩ型過敏症を有する。一実施形態では、ヒト被験体は、ＳＬＥを有する。別の実施形態では、ヒト被験体は、関節リウマチを有する。さらに別の実施形態では、被験体は、シェーグレン症候群を有する。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２重鎖定常領域を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域とＩｇＧ４重鎖定常領域とのハイブリッドである。
【００２９】
別の態様では、本開示は、それを必要とするヒト被験体において、形質細胞様樹状細胞の表面におけるＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）の発現を、下方調節する（または脱落させる）方法を特色とする。方法は、ヒト被験体へと、有効量の、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体または抗原結合断片を投与するステップを含む。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体または抗原結合断片を投与することにより、１または複数のメタロプロテイナーゼのレベルを増加させる。ある種の実施形態では、ＣＤ６２Ｌの下方調節は、メタロプロテイナーゼによる切断を介して生じる。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２重鎖定常領域を有する。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。上記の５つの態様のいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域とＩｇＧ４重鎖定常領域とのハイブリッドである。
【００３０】
さらなる態様では、本開示は、それを必要とする被験体において、炎症性障害を処置する方法を特色とする。方法は、それを必要とする被験体へと、有効量の、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを投与するステップを伴う。いくつかの実施形態では、炎症性障害は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚ループス、円板状ループス、ループス腎炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性硬化症、斑状強皮症、乾癬、Ｉ型糖尿病、皮膚筋炎、多発性筋炎、およびシェーグレン病からなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、炎症性障害は、ＳＬＥである。別の特定の実施形態では、炎症性障害は、円板状ループスである。さらに別の特定の実施形態では、炎症性障害は、ループス腎炎である。別の特定の実施形態では、炎症性障害は、皮膚ループスである。ある種の実施形態では、被験体は、一般的なＳＬＥを有する。ある種の実施形態では、被験体は、中等度のＳＬＥを有する。ある種の実施形態では、被験体は、重度活動性のＣＮＳおよび／または重度活動性の腎併発を伴わない中等度のＳＬＥを有する。ある種の実施形態では、被験体は、重度活動性のＣＮＳおよび／または重度活動性の腎併発を伴う中等度のＳＬＥを有する。ある種の実施形態では、被験体は、ＳＬＥの皮膚症状（例えば、頬部発疹または円板状発疹）を有する。ある種の実施形態では、被験体は、重度のＳＬＥを有する。ある種の実施形態では、被験体は、重度活動性のＣＮＳおよび／または重度活動性の腎併発を伴わない重度のＳＬＥを有する。ある種の実施形態では、被験体は、重度活動性のＣＮＳおよび／または重度活動性の腎併発を伴う重度のＳＬＥを有する。中等度または重度のループスとは、ループスの病期分類（例えば、Guidelines  for  Referral  and  Management  of  Systemic  Lupus  Erythematosus  in  Adults、Arthritis  &  Rheumatism、４２巻（９号）：１７８５〜１７９５頁（１９９９年）；Gladman、Prognosis  and  treatment  of  systemic  lupus  erythematosus、Curr.  Opin.  Rheumatol.、８巻：４３０〜４３７頁（１９９６年）；Kalunianら、Definition,  classification,  activity  and  damage  indices、Dubois’  lupus  eyrthematosus、５版、Baltimore、Williams  and  Wilkins、１９〜３０頁（１９９７年）を参照されたい）である。
【００３１】
別の態様では、本開示は、それを必要とする被験体における自己免疫疾患を処置する方法を特色とする。方法は、それを必要とする被験体へと、有効量の、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを投与するステップを伴う。
【００３２】
方法に関する上記の態様のうちのいずれかの、ある種の実施形態では、被験体は、ヒトである。方法に関する上記の態様のうちのいずれかの、ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体または抗原結合断片を、抗マラリア剤（例えば、ヒドロキシクロロキン）、ＴＬＲ７シグナル伝達阻害剤、ＴＬＲ９シグナル伝達阻害剤、またはコルチコステロイドのうちの少なくとも１つと組み合わせて投与する。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号８、１０、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号８９、９１、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号９、９２、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号９０、９３、および９４のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号９５、９６、および９７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、少なくとも約７〜１５μｇ／ｍＬ（例えば、１０、１１、１２μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０でＣＤ３２ａに結合するＦｃ領域をさらに含む。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９である。
【００３３】
別の態様では、本開示は、抗マラリア剤（例えば、ヒドロキシクロロキン）と、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片とを含む組合せを特色とする。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号２４の重鎖ＣＤＲ（または代替のＣＤＲ）を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ（または代替のＣＤＲ）を含む。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号８、１０、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号８９、９１、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号９、９２、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号９０、９３、および９４のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号９５、９６、および９７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、少なくとも約７〜１５μｇ／ｍＬ（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０でＣＤ３２ａに結合するＦｃ領域をさらに含む。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９である。
【００３４】
別の態様では、本開示は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ９シグナル伝達の阻害剤と、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片とを含む組合せを特色とする。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号２４の重鎖ＣＤＲ（または代替のＣＤＲ）を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ（または代替のＣＤＲ）を含む。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号８、１０、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号８９、９１、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号９、９２、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号９０、９３、および９４のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号９５、９６、および９７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、少なくとも約７〜１５μｇ／ｍＬ（例えば、１０、１１、１２μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０でＣＤ３２ａに結合するＦｃ領域をさらに含む。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９である。
【００３５】
さらなる態様では、本開示は、コルチコステロイドと、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片とを含む組合せを特色とする。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号２４の重鎖ＣＤＲ（または代替のＣＤＲ）を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ（または代替のＣＤＲ）を含む。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号８、１０、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号８９、９１、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号９、９２、および１１のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号５、６、および７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、配列番号９０、９３、および９４のそれぞれに示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号９５、９６、および９７のそれぞれに示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、少なくとも約７〜１５μｇ／ｍＬ（例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４μｇ／ｍＬ）のＥＣ５０でＣＤ３２ａに結合するＦｃ領域をさらに含む。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９である。
【００３６】
別段に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験では、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料を使用しうるが、下記では、例示的な方法および材料について記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。利益相反の場合は、定義を含む本出願により管理する。材料、方法、および実施例は、例証的なものであるに過ぎず、限定的なものであることを意図するものではない。
【００３７】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかとなる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ｉ）ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、（ｉｉ）ヒトＢＤＣＡ２の細胞外ドメインへの結合について、ＢＩＩＢ０５９と競合する、単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目２）
ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、
（ｉ）形質細胞様樹状細胞からのＩ型インターフェロン、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＩＰ１０、およびＲＡＮＴＥＳの、ＴＬＲ誘導産生を阻害するか、または
（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、形質細胞様樹状細胞の枯渇を誘導もしくは増強する、
単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目３）
カニクイザルＢＤＣＡ２（配列番号７３）およびアカゲザルＢＤＣＡ２（配列番号７２）に結合する、項目１または２に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目４）
（ｉ）形質細胞様樹状細胞からのＩ型インターフェロン、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＩＰ１０、およびＲＡＮＴＥＳの、ＴＬＲ誘導産生を阻害し、
（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、形質細胞様樹状細胞の枯渇を誘導または増強する、
項目２に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目５）
（ｉ）ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３を含み、
該重鎖ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、
該重鎖ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、
該重鎖ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む、
単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目６）
前記重鎖ＣＤＲ１が、前記アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、
前記重鎖ＣＤＲ２が、前記アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、
前記重鎖ＣＤＲ３が、前記アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む、
項目５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目７）
前記重鎖ＣＤＲ１が、前記アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含み、
前記重鎖ＣＤＲ２が、前記アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含み、
前記重鎖ＣＤＲ３が、前記アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含む、
項目５に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目８）
軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含み、
該軽鎖ＣＤＲ１が、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、
該軽鎖ＣＤＲ２が、アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、
該軽鎖ＣＤＲ３が、アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）、または１、２、３、もしくは４つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、
項目５から７のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目９）
前記軽鎖ＣＤＲ１が、前記アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ２が、前記アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ３が、前記アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）、または１もしくは２つのアミノ酸位置において置換を有する、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、
項目８に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１０）
前記重鎖ＣＤＲ１が、前記アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳ（配列番号９）を含み、
前記重鎖ＣＤＲ２が、前記アミノ酸配列ＴＩＳＰＧＤＳＦＧＹＹＹＰＤＳＶＱＧ（配列番号１０）を含み、
前記重鎖ＣＤＲ３が、前記アミノ酸配列ＤＩＹＹＮＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１１）を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１が、前記アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ（配列番号５）を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ２が、前記アミノ酸配列ＡＡＳＴＬＥＳ（配列番号６）を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ３が、前記アミノ酸配列ＱＱＡＮＥＤＰＲＴ（配列番号７）を含む、
項目８に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１１）
（ｉ）ヒトＢＤＣＡ２（配列番号１）の外部ドメインに選択的に結合し、（ｉｉ）ＢＩＩＢ０５９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）と少なくとも８０％同一な可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１２）
前記ＶＨドメインが、ＢＩＩＢ０５９の前記ＶＨドメインの前記アミノ酸配列（配列番号２４）と少なくとも９０％同一である、項目１１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１３）
前記ＶＨドメインが、ＢＩＩＢ０５９の前記ＶＨドメインの前記アミノ酸配列（配列番号２４）と少なくとも９５％同一である、項目１１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１４）
前記ＶＨドメインが、ＢＩＩＢ０５９の前記ＶＨドメインの前記アミノ酸配列（配列番号２４）と同一である、項目１１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１５）
前記重鎖が、配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１６）
ＢＩＩＢ０５９のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２３）と少なくとも８０％同一な可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む、項目１１から１５のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１７）
前記ＶＨドメインが、ＢＩＩＢ０５９の前記ＶＨドメインの前記アミノ酸配列（配列番号２４）と少なくとも９０％同一であり、前記ＶＬドメインが、ＢＩＩＢ０５９の前記ＶＬドメインの前記アミノ酸配列（配列番号２３）と少なくとも９０％同一である、項目１６に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１８）
前記ＶＨドメインが、ＢＩＩＢ０５９の前記ＶＨドメインの前記アミノ酸配列（配列番号２４）と少なくとも９５％同一であり、前記ＶＬドメインが、ＢＩＩＢ０５９の前記ＶＬドメインの前記アミノ酸配列（配列番号２３）と少なくとも９５％同一である、項目１６に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１９）
前記ＶＨドメインが、ＢＩＩＢ０５９の前記ＶＨドメインの前記アミノ酸配列（配列番号２４）と同一であり、前記ＶＬドメインが、ＢＩＩＢ０５９の前記ＶＬドメインの前記アミノ酸配列（配列番号２３）と同一である、項目１６に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目２０）
前記重鎖が、配列番号４の前記アミノ酸配列を含み、前記軽鎖が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、項目１６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２１）
ヒト化抗体である、項目１から２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２２）
モノクローナル抗体である、項目１から２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２３）
単鎖抗体である、項目１から２０のいずれか一項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２４）
ポリクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｓｃ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、またはダイアボディである、項目１から２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２５）
ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する、項目１から２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２６）
前記項目のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を産生する単離細胞。
（項目２７）
項目１から２５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物。
（項目２８）
１０〜２５ｍＭのクエン酸塩、１００〜２００ｍＭの塩化ナトリウム、および５．５〜６．５のｐＨを含む組成物中に製剤化された、項目１から２５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
（項目２９）
前記抗体またはその抗原結合断片が、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および６．０のｐＨを含む組成物中に製剤化された、項目２８に記載の医薬組成物。
（項目３０）
被験体における形質細胞様樹状細胞の死を誘導する方法であって、ＢＤＣＡ２を発現する形質細胞様樹状細胞を、項目１から２５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
（項目３１）
被験体における形質細胞様樹状細胞によるＩ型インターフェロン、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＩＰ１０、およびＲＡＮＴＥＳの産生を低減する方法であって、ＢＤＣＡ２を発現する形質細胞様樹状細胞を、ある量の、項目１から２５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させるステップを含む方法。
（項目３２）
炎症性障害の処置を必要とする被験体における炎症性障害を処置する方法であって、それを必要とする該被験体へと、有効量の、項目１から２５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
（項目３３）
前記炎症性障害が、全身性エリテマトーデス、円板状ループス、ループス腎炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性硬化症（強皮症）、乾癬、Ｉ型糖尿病、皮膚筋炎、および多発性筋炎からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記炎症性障害が、全身性エリテマトーデス、円板状ループス、ループス腎炎、または皮膚ループスである、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記炎症性障害が、活動性の中枢神経系（ＣＮＳ）および／または腎併発を伴う中等度から重度のループスである、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記炎症性障害が、活動性の中枢神経系（ＣＮＳ）および／または腎併発を伴わない中等度から重度の障害である、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
自己免疫疾患の処置を必要とする被験体における自己免疫疾患を処置する方法であって、それを必要とする該被験体へと、有効量の、項目１から２５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与するステップを含む方法。
（項目３８）
前記被験体が、ヒトである、項目３０から３７のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、形質細胞様樹状細胞におけるＢＤＣＡ２シグナル伝達（Geijtenbeekら、Nature  Reviews  Immunology、９巻：４６５〜４７９頁（２００９年）を参照されたい）についての概略的描写を示す図である。
【図２】図２は、ｈｕ２４Ｆ４  Ｈｘ／Ｌ１変異体の、ヒトＢＤＣＡ２への結合を示すグラフである。
【図３】図３は、ｈｕ２４Ｆ４  Ｈｘ／Ｌ１変異体の、カニクイザルＢＤＣＡ２への結合を示すグラフである。
【図４】図４は、抗ＢＤＣＡ２軽鎖をコードするプラスミドであるｐＪＰ００９についての概略的マップである。抗ＢＤＣＡ２軽鎖の核酸配列は、ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化配列の転写制御下にある。アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼの遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子）は、マウスホスホグリセリンキナーゼ（ｍｕＰＧＫ）のプロモーターおよびポリアデニル化配列の転写制御下にある。β−ラクタマーゼの遺伝子を含む残りの配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増殖および選択のための配列である。
【図５】図５は、抗ＢＤＣＡ２重鎖をコードするプラスミドであるｐＪＰ０１０についての概略的マップである。抗ＢＤＣＡ２重鎖の核酸配列は、ｈＣＭＶ  ＩＥプロモーターおよびヒト成長ｈＧＨポリアデニル化配列の転写制御下にある。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）の遺伝子は、ＳＶ４０Ｅプロモーターおよびポリアデニル化配列の転写制御下にある。β−ラクタマーゼの遺伝子を含む残りの配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ内の増殖および選択のための配列である。
【図６】図６は、カニクイザル（Ａ）形質細胞様樹状細胞上およびヒト（Ｂ）形質細胞様樹状細胞上のＢＩＩＢ０５９の結合を示す線グラフである。カニクイザル（Ａ）またはヒト（Ｂ）全血を、氷上で、種々の濃度の、Ａｌｅｘａ６４７で標識されたＢＩＩＢ０５９抗体（丸）、またはヒトＩｇＧアイソタイプ（四角）と共にインキュベートした。データは、ＬＳＲＩＩ−４  ｃｏｌｏｒ  ＦＡＣＳマシンを使用して収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
【図７】図７は、自己会合についてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイの結果を示す線グラフである。凡例：ひし形＝ＢＩＩＢ０５９；四角＝５ｃ８；および三角＝ＬＴ１０５。
【図８】図８は、異なる条件にわたるＢＩＩＢ０５９の安定性について試験する示差走査蛍光定量法の結果を示す線グラフである。このグラフは、ｐＨの関数としての１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２５０ｍＭのスクロースによるデータを示す。
【図９】図９は、凝集に対する撹拌の効果を、ある時間にわたり示す線グラフである。凝集は、Ｔｗｅｅｎ  ８０の添加により抑制された。
【図１０】図１０は、ＡＣ１４４の、ヒト表面ＢＤＣＡ２およびカニクイザル表面ＢＤＣＡ２への直接結合を示す線グラフである。
【図１１】図１１は、Ｆｃ融合タンパク質についてのサイズ排除クロマトグラフィー解析の結果を示す一連のグラフである。
【図１２】図１２は、ＢＩＩＢ０５９のＢＤＣＡ２への結合に対するカルシウムの効果を示すグラフである。ＢＩＩＢ０５９のＢＤＣＡ２への結合は、ＥＤＴＡと比べたカルシウムの添加により増強され、約２倍高いシグナルがもたらされる。
【図１３】図１３は、Ｏｃｔｅｔによる、ＢＩＩＢ０５９の、ヒトおよびカニクイザルＢＤＣＡ２外部ドメインへの結合の結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ＢＩＩＢ０５９が、ＴＬＲ９アゴニストにより刺激されたＰＢＭＣからのＩＦＮαを強力に阻害することを示すグラフである。各記号は、独立の実験に由来するＩＣ５０を表し、縦線は、ＳＥＭを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｃは、ＢＩＩＢ０５９が、ＴＬＲ９リガンドにより刺激された全血に由来するサイトカインおよびケモカインを強力に阻害することを示す一連のグラフを提供する。図１５Ａは、健常ドナーに由来するヘパリン添加静脈血を使用するＩＦＮαの阻害を示す図である。図１５Ｂは、２例のＳＬＥ患者（上パネル）からの全血を使用するＩＦＮαの阻害を、２例の健常ドナー（下パネル）からの全血を使用する結果と比較して示す図である。図１５Ｃは、ＢＩＩＢ０５９処置が、多くのサイトカインおよびケモカインの阻害をもたらしたことを示す一連の棒グラフを提供する。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜Ｃは、ＢＩＩＢ０５９が、ＴＬＲ９リガンドにより刺激された全血に由来するサイトカインおよびケモカインを強力に阻害することを示す一連のグラフを提供する。図１５Ａは、健常ドナーに由来するヘパリン添加静脈血を使用するＩＦＮαの阻害を示す図である。図１５Ｂは、２例のＳＬＥ患者（上パネル）からの全血を使用するＩＦＮαの阻害を、２例の健常ドナー（下パネル）からの全血を使用する結果と比較して示す図である。図１５Ｃは、ＢＩＩＢ０５９処置が、多くのサイトカインおよびケモカインの阻害をもたらしたことを示す一連の棒グラフを提供する。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜Ｃは、ＢＩＩＢ０５９が、ＴＬＲ９リガンドにより刺激された全血に由来するサイトカインおよびケモカインを強力に阻害することを示す一連のグラフを提供する。図１５Ａは、健常ドナーに由来するヘパリン添加静脈血を使用するＩＦＮαの阻害を示す図である。図１５Ｂは、２例のＳＬＥ患者（上パネル）からの全血を使用するＩＦＮαの阻害を、２例の健常ドナー（下パネル）からの全血を使用する結果と比較して示す図である。図１５Ｃは、ＢＩＩＢ０５９処置が、多くのサイトカインおよびケモカインの阻害をもたらしたことを示す一連の棒グラフを提供する。
【図１６】図１６は、ＢＩＩＢ０５９により、Ｉ型インターフェロンの発現が阻害されることを示す棒グラフである。
【図１７】図１７は、ＢＤＣＡ２を、ＢＩＩＢ０５９とライゲーションすることにより、精製ｐＤＣにおけるＴＬＲ９誘導サイトカイン産生が阻害されることを示す２つの線グラフを含む図である。
【図１８】図１８は、ＢＤＣＡ２をライゲーションすることにより、ＳＬＥ血清で刺激されたｐＤＣにおけるＩＦＮ−α産生の誘導が抑制されることを示す棒グラフである。
【図１９】図１９Ａは、ＢＤＣＡ２が、ＢＩＩＢ０５９とのライゲーションの後で内部移行されることを示す線グラフである。図１９Ｂは、内部移行が、ＢＩＩＢ０５９に媒介される、ＩＦＮ−α産生の阻害に影響を及ぼさないことを示す線グラフである。
【図２０】図２０は、ＢＩＩＢ０５９の、Ｆｃγ受容体への結合を示す一連の線グラフである。
【図２１】図２１は、ヒトＣ１ｑの、濃度を増加させて（０〜１５μｇ／ｍＬ）コーティングした抗体への結合を示すＣ１ｑ  ＥＬＩＳＡの結果を提供する図である。
【図２２Ａ−Ｂ】図２２Ａ〜Ｄは、ＢＩＩＢ０５９が、ＡＤＣＣを介して細胞の死滅化を媒介することを示す一連のグラフである。ＣＨＯ細胞系（ＥＡＧ２４５６  Ｔ１Ｆ２  クローン  ３４．１６．７）を、標的細胞として使用した。ＣＨＯ細胞の表面におけるＢＤＣＡ２発現のレベルは、ＡＰＣで標識された抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（クローンＡＣ１４４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用するＦＡＣＳにより決定した。ＮＫ細胞を、エフェクター細胞として使用した。ＡＤＣＣは、製造業者の指示に従い、Ｖｙｂｒａｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して評価した。アッセイでは、５３０ｎｍにおける励起の後で、５９０ｎｍにおいて蛍光を発するレサズリンのＧ６ＰＤ依存性還元に基づき、損傷細胞に由来するＧ６ＰＤを検出する。図２２Ａにおいて示されるＡＤＣＣアッセイを、ＢＤＣＡ２発現が多いＣＨＯ細胞を使用して実施する（図２２Ｃ）一方で、図２２ＢにおけるＡＤＣＣアッセイでは、ＢＤＣＡ２発現が少ないＣＨＯ細胞を使用した（図２２Ｄ）。
【図２２Ｃ−Ｄ】図２２Ａ〜Ｄは、ＢＩＩＢ０５９が、ＡＤＣＣを介して細胞の死滅化を媒介することを示す一連のグラフである。ＣＨＯ細胞系（ＥＡＧ２４５６  Ｔ１Ｆ２  クローン  ３４．１６．７）を、標的細胞として使用した。ＣＨＯ細胞の表面におけるＢＤＣＡ２発現のレベルは、ＡＰＣで標識された抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（クローンＡＣ１４４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用するＦＡＣＳにより決定した。ＮＫ細胞を、エフェクター細胞として使用した。ＡＤＣＣは、製造業者の指示に従い、Ｖｙｂｒａｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して評価した。アッセイでは、５３０ｎｍにおける励起の後で、５９０ｎｍにおいて蛍光を発するレサズリンのＧ６ＰＤ依存性還元に基づき、損傷細胞に由来するＧ６ＰＤを検出する。図２２Ａにおいて示されるＡＤＣＣアッセイを、ＢＤＣＡ２発現が多いＣＨＯ細胞を使用して実施する（図２２Ｃ）一方で、図２２ＢにおけるＡＤＣＣアッセイでは、ＢＤＣＡ２発現が少ないＣＨＯ細胞を使用した（図２２Ｄ）。
【図２３】図２３は、ＢＩＩＢ０５９が、ＣＤＣを介して細胞の死滅化を媒介することを示す線グラフである。ＣＨＯ細胞（ＥＡＧ２４５６  Ｔ１Ｆ２  クローン  ３４．１６．７）を、９６ウェルコラーゲンブラックウェルプレート内に細胞５×１０４個で播種し、３７℃で４８時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、エフェクター機能保有抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（２４Ｆ４ＳおよびＢＩＩＢ０５９）、エフェクター機能欠損ｍＡｂ（２４Ｆ４Ｓ−Ａｇｌｙおよび２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙ）、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下で、ウサギ血清補体およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共に、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。陰性対照は、抗体を伴わずに、ＣＨＯ細胞、ウサギ血清補体、ＰＩを含有するウェルからなった。
【図２４】図２４は、カニクイザルｐＤＣ上の、ＢＩＩＢ０５９の結合（「直接的」）および競合的ＢＩＩＢ０５９〜Ａ６４７の結合（「間接的」）についてのＥＣ５０を決定するのに使用された一連のグラフである。ＢＩＩＢ０５９のｉｎ  ｖｉｖｏ注射の前に、血液を、１２例のカニクイザルから、毎週１回のべ３週間にわたり採取した。フローサイトメトリーを使用して、ｐＤＣ細胞表面における、ＢＩＩＢ０５９の、ＢＤＣＡ２への結合についてのＥＣ５０（「直接的」方法）、およびＢＩＩＢ０５９の存在下で得られるＢＤＣＡ２受容体の利用可能な量（「間接的」方法）を決定した。血液を、４０〜０．０４μｇ／ｍＬの範囲の、６点滴定量のＢＩＩＢ０５９と共にインキュベートした。フローサイトメトリーにより、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、１０ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ標識二次抗体またはＢＩＩＢ０５９〜Ａ６４７標識抗体で処置した。ＰＥのＭＦＩ（左側のｙ軸に対してグラフ化された白色の記号（ｏｐｅｎ  ｓｙｍｂｏｌ））、またはＡ６４７のＭＦＩ（右側のｙ軸に対してグラフ化された黒色の記号（ｃｌｏｓｅｄ  ｓｙｍｂｏｌ））は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（対数変換されたデータについての４パラメータ非線形回帰曲線の当てはめ）を使用してグラフ化した。この図では、１２例中４例のカニクイザルに由来する代表的なグラフを示す。
【図２５】図２５は、抗ＢＤＣＡ２抗体であるＢＩＩＢ０５９の、カニクイザル全血中のｐＤＣ上の細胞表面ＢＤＣＡ２へのプラトー結合を提示する代表的なグラフである。血液を、４０〜０．０４μｇ／ｍＬの範囲の、６点滴定量のＢＩＩＢ０５９と共にインキュベートした。フローサイトメトリーにより、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ標識二次抗体で処置した。ＰＥのＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、最大結合パーセントは、４０μｇ／ｍＬ点を１００％として使用して計算した。各線は、合計１２例のカニクイザルについて、個々の１例ずつのカニクイザルを表し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（対数変換されたデータについての４パラメータ非線形回帰曲線の当てはめ）を使用してグラフ化した。染色は、週１回のべ３週間にわたり繰り返した。破線は、１０μｇ／ｍＬの濃度のＢＩＩＢ０５９により、全てのカニクイザルについて、ＢＤＣＡ２受容体結合が飽和することを裏付ける。
【図２６Ａ】図２６Ａ〜Ｃは、媒体で処置されたカニクイザルにおける、結合ＢＩＩＢ０５９および遊離ＢＤＣＡ２の染色レベルを扱う図である。図２６Ａは、媒体で処置されたカニクイザルにおけるバックグラウンドのＰＥ染色を示す、一連のＦＡＣＳヒストグラムである。カニクイザル１、４、および１２には、時間０において、媒体対照（クエン酸ナトリウム）の単回のＩＶ注射を投与した。１時間後、全血を採取し、フローサイトメトリーにより、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（白色のヒストグラム）、またはＰＥ蛍光マイナスワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）（ＦＭＯ）対照としてのＦＡＣＳ緩衝液（黒色のヒストグラム）で処理した。図２６Ｂは、表示された時点において、媒体で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＰＥ染色についてのグラフである。ＰＥのＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。図２６Ｃは、表示された時点において、媒体で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＡ６４７染色についてのグラフである。表示された時点の各々において、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９〜Ａ６４７を、媒体で処置された３例のカニクイザルから採取された血液へと添加し、ｐＤＣ上のＡ６４７染色についてアッセイした。Ａ６４７のＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図２６Ｂ−Ｃ】図２６Ａ〜Ｃは、媒体で処置されたカニクイザルにおける、結合ＢＩＩＢ０５９および遊離ＢＤＣＡ２の染色レベルを扱う図である。図２６Ａは、媒体で処置されたカニクイザルにおけるバックグラウンドのＰＥ染色を示す、一連のＦＡＣＳヒストグラムである。カニクイザル１、４、および１２には、時間０において、媒体対照（クエン酸ナトリウム）の単回のＩＶ注射を投与した。１時間後、全血を採取し、フローサイトメトリーにより、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（白色のヒストグラム）、またはＰＥ蛍光マイナスワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）（ＦＭＯ）対照としてのＦＡＣＳ緩衝液（黒色のヒストグラム）で処理した。図２６Ｂは、表示された時点において、媒体で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＰＥ染色についてのグラフである。ＰＥのＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。図２６Ｃは、表示された時点において、媒体で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＡ６４７染色についてのグラフである。表示された時点の各々において、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９〜Ａ６４７を、媒体で処置された３例のカニクイザルから採取された血液へと添加し、ｐＤＣ上のＡ６４７染色についてアッセイした。Ａ６４７のＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図２７Ａ】図２７Ａ〜Ｃは、カニクイザルにおける、１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回投与の後、結合したＢＩＩＢ０５９およびＢＤＣＡ２受容体が、ｐＤＣ細胞表面上ではもはや得られないことを示す図である。図２７Ａは、１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９で処置されたカニクイザルにおけるＢＩＩＢ０５９染色を示す、一連のＦＡＣＳヒストグラムである。カニクイザル３、８、および１０には、時間０において、ＢＩＩＢ０５９の単回のＩＶ注射を、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。１時間後、全血を採取し、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（白色のヒストグラム）、またはＰＥ  ＦＭＯ対照としてのＦＡＣＳ緩衝液（黒色のヒストグラム）で処理した。図２７Ｂは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＰＥ染色についてのグラフである。ＰＥのＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。図２７Ｃは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＡ６４７染色についてのグラフである。表示された時点の各々において、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９〜Ａ６４７を、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液へと添加し、ｐＤＣ上のＡ６４７染色についてアッセイした。Ａ６４７のＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図２７Ｂ−Ｃ】図２７Ａ〜Ｃは、カニクイザルにおける、１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回投与の後、結合したＢＩＩＢ０５９およびＢＤＣＡ２受容体が、ｐＤＣ細胞表面上ではもはや得られないことを示す図である。図２７Ａは、１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９で処置されたカニクイザルにおけるＢＩＩＢ０５９染色を示す、一連のＦＡＣＳヒストグラムである。カニクイザル３、８、および１０には、時間０において、ＢＩＩＢ０５９の単回のＩＶ注射を、１０ｍｇ／ｋｇで投与した。１時間後、全血を採取し、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（白色のヒストグラム）、またはＰＥ  ＦＭＯ対照としてのＦＡＣＳ緩衝液（黒色のヒストグラム）で処理した。図２７Ｂは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＰＥ染色についてのグラフである。ＰＥのＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。図２７Ｃは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＡ６４７染色についてのグラフである。表示された時点の各々において、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９〜Ａ６４７を、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液へと添加し、ｐＤＣ上のＡ６４７染色についてアッセイした。Ａ６４７のＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図２８Ａ】図２８Ａ〜Ｃは、カニクイザルにおける、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回投与の後、結合したＢＩＩＢ０５９およびＢＤＣＡ２受容体が、ｐＤＣ細胞表面上ではもはや得られないことを示す図である。図２８Ａは、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９で処置されたカニクイザルにおけるＢＩＩＢ０５９染色を示す、一連のＦＡＣＳヒストグラムである。カニクイザル３、８、および１０には、時間０において、ＢＩＩＢ０５９の単回のＩＶ注射を、１ｍｇ／ｋｇで投与した。１時間後、全血を採取し、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（白色のヒストグラム）、またはＰＥ  ＦＭＯ対照としてのＦＡＣＳ緩衝液（黒色のヒストグラム）で処理した。図２８Ｂは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＰＥ染色についてのグラフである。ＰＥのＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。図２８Ｃは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＡ６４７染色についてのグラフである。表示された時点の各々において、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９〜Ａ６４７を、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液へと添加し、ｐＤＣ上のＡ６４７染色についてアッセイした。Ａ６４７のＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図２８Ｂ−Ｃ】図２８Ａ〜Ｃは、カニクイザルにおける、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回投与の後、結合したＢＩＩＢ０５９およびＢＤＣＡ２受容体が、ｐＤＣ細胞表面上ではもはや得られないことを示す図である。図２８Ａは、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９で処置されたカニクイザルにおけるＢＩＩＢ０５９染色を示す、一連のＦＡＣＳヒストグラムである。カニクイザル３、８、および１０には、時間０において、ＢＩＩＢ０５９の単回のＩＶ注射を、１ｍｇ／ｋｇで投与した。１時間後、全血を採取し、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（白色のヒストグラム）、またはＰＥ  ＦＭＯ対照としてのＦＡＣＳ緩衝液（黒色のヒストグラム）で処理した。図２８Ｂは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＰＥ染色についてのグラフである。ＰＥのＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。図２８Ｃは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＡ６４７染色についてのグラフである。表示された時点の各々において、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９〜Ａ６４７を、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液へと添加し、ｐＤＣ上のＡ６４７染色についてアッセイした。Ａ６４７のＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図２９Ａ】図２９Ａ〜Ｃは、カニクイザルにおける、０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回の皮下（ＳＣ）投与の後、結合したＢＩＩＢ０５９およびＢＤＣＡ２受容体が、ｐＤＣ細胞表面上ではもはや得られないことを示す図である。図２９Ａは、ＳＣ０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９で処置されたカニクイザルにおけるＢＩＩＢ０５９染色を示す、一連のＦＡＣＳヒストグラムである。カニクイザル４、６、および１２には、時間０において、ＢＩＩＢ０５９の単回のＳＣ注射を、０．２ｍｇ／ｋｇで投与した。１時間後、全血を採取し、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（白色のヒストグラム）、またはＰＥ  ＦＭＯ対照としてのＦＡＣＳ緩衝液（黒色のヒストグラム）で処理した。図２９Ｂは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＰＥ染色についてのグラフである。ＰＥのＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。図２９Ｃは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＡ６４７染色についてのグラフである。表示された時点の各々において、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９〜Ａ６４７を、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液へと添加し、ｐＤＣ上のＡ６４７染色についてアッセイした。Ａ６４７のＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図２９Ｂ−Ｃ】図２９Ａ〜Ｃは、カニクイザルにおける、０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回の皮下（ＳＣ）投与の後、結合したＢＩＩＢ０５９およびＢＤＣＡ２受容体が、ｐＤＣ細胞表面上ではもはや得られないことを示す図である。図２９Ａは、ＳＣ０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９で処置されたカニクイザルにおけるＢＩＩＢ０５９染色を示す、一連のＦＡＣＳヒストグラムである。カニクイザル４、６、および１２には、時間０において、ＢＩＩＢ０５９の単回のＳＣ注射を、０．２ｍｇ／ｋｇで投与した。１時間後、全血を採取し、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（白色のヒストグラム）、またはＰＥ  ＦＭＯ対照としてのＦＡＣＳ緩衝液（黒色のヒストグラム）で処理した。図２９Ｂは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＰＥ染色についてのグラフである。ＰＥのＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。図２９Ｃは、表示された時点において、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液に由来するｐＤＣ上のＡ６４７染色についてのグラフである。表示された時点の各々において、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９〜Ａ６４７を、ＢＩＩＢ０５９で処置された３例のカニクイザルから採取された血液へと添加し、ｐＤＣ上のＡ６４７染色についてアッセイした。Ａ６４７のＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図３０−１】図３０は、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９をＩＶで施されたカニクイザル、および１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９をＩＶで施されたカニクイザルについて観察されるＰＫ／ＰＤ相関を示す一連のグラフである。この図中の各グラフについて、ＢＩＩＢ０５９の血清濃度を、左側のｙ軸に対してプロットし（白色の記号）、ＢＤＣＡ２受容体の密度を、右側のｙ軸に対してプロットする（黒色の記号）。カニクイザル５において観察されるクリアランスの加速化は、ＢＩＩＢ０５９に対する免疫原性に起因する可能性があった。
【図３０−２】図３０は、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９をＩＶで施されたカニクイザル、および１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９をＩＶで施されたカニクイザルについて観察されるＰＫ／ＰＤ相関を示す一連のグラフである。この図中の各グラフについて、ＢＩＩＢ０５９の血清濃度を、左側のｙ軸に対してプロットし（白色の記号）、ＢＤＣＡ２受容体の密度を、右側のｙ軸に対してプロットする（黒色の記号）。カニクイザル５において観察されるクリアランスの加速化は、ＢＩＩＢ０５９に対する免疫原性に起因する可能性があった。
【図３０−３】図３０は、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９をＩＶで施されたカニクイザル、および１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９をＩＶで施されたカニクイザルについて観察されるＰＫ／ＰＤ相関を示す一連のグラフである。この図中の各グラフについて、ＢＩＩＢ０５９の血清濃度を、左側のｙ軸に対してプロットし（白色の記号）、ＢＤＣＡ２受容体の密度を、右側のｙ軸に対してプロットする（黒色の記号）。カニクイザル５において観察されるクリアランスの加速化は、ＢＩＩＢ０５９に対する免疫原性に起因する可能性があった。
【図３１−１】図３１は、０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９をＳＣで施されたカニクイザルについて観察されるＰＫ／ＰＤ相関を示す一連のグラフである。この図中の各グラフについて、ＢＩＩＢ０５９の血清濃度を、左側のｙ軸に対してプロットし（白色の記号）、ＢＤＣＡ２受容体の密度を、右側のｙ軸に対してプロットする（黒色の記号）。
【図３１−２】図３１は、０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９をＳＣで施されたカニクイザルについて観察されるＰＫ／ＰＤ相関を示す一連のグラフである。この図中の各グラフについて、ＢＩＩＢ０５９の血清濃度を、左側のｙ軸に対してプロットし（白色の記号）、ＢＤＣＡ２受容体の密度を、右側のｙ軸に対してプロットする（黒色の記号）。
【図３２】図３２は、ＣｐＧ−Ａ、抗ＢＤＣＡ２の存在下におけるＣｐＧ−Ａ、およびアイソタイプ対照の存在下におけるＣｐＧ−Ａで処理したｐＤＣにより産生される炎症性サイトカインおよびケモカインの濃度を測定するＥＬＩＳＡアッセイまたはマルチプレックスアッセイの結果を示す一連の棒グラフである。各バーは、試験した５例のうち代表的な健常ヒトドナーに由来する２連のウェルについての平均値および標準偏差（ＳＤ）を表す。縦線は、ＳＤを示す。
【図３３】図３３は、Ｓｍ／ＲＮＰ免疫複合体、抗ＢＤＣＡ２の存在下におけるＳｍ／ＲＮＰ免疫複合体、およびアイソタイプ対照の存在下におけるＳｍ／ＲＮＰ免疫複合体で処理したｐＤＣにより産生される炎症性サイトカインおよびケモカインの濃度を測定するＥＬＩＳＡアッセイまたはマルチプレックスアッセイの結果を示す一連の棒グラフである。各バーは、試験した５例のうち代表的な健常ヒトドナーに由来する２連のウェルについての平均値および標準偏差（ＳＤ）を表す。縦線は、ＳＤを示す。
【図３４】図３４は、Ｓｍ／ＲＮＰ  ＩＣで刺激された、健常ヒトドナーに由来するｐＤＣにおけるＩ型ＩＦＮサブタイプの転写に対するＢＩＩＢ０５９の効果を決定するｑＰＣＲアッセイの結果を示す一連の棒グラフである。各バーは、試験した３例（ｎ＝３）のうち代表的なドナーに由来する４連ウェルについての平均相対倍数変化を表し、縦線は、標準偏差（ＳＤ）を示す。
【図３５】図３５Ａは、試験した１８例のうち１例の代表的な健常ヒトドナーに由来するＰＢＭＣによる、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮαの、ＢＩＩＢ０５９に媒介される用量依存的阻害を示す図である。各記号は、２連ウェルについての平均値および標準偏差（ＳＤ）を表す。図３５Ｂは、試験した１１例のうち１例の代表的なＳＬＥ患者に由来するＰＢＭＣによる、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮαの、ＢＩＩＢ０５９に媒介される用量依存的阻害を示す図である。各記号は、２連ウェルについての平均値および標準偏差（ＳＤ）を表す。図３５Ｃは、ＳＬＥ患者（ＳＬＥ）と比較した健常ヒトドナー（ＨＤ）における、ＰＢＭＣによる、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の、ＢＩＩＢ０５９による阻害についてのＩＣ５０値を示す図である。各記号は、個々のドナーを表し、縦線は、ＳＤを示す。
【図３６】図３６Ａは、試験した１２例のうち代表的な１例の全血アッセイにおける、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮαの、ＢＩＩＢ０５９に媒介される用量依存的阻害を示す図である。各記号は、２連ウェルについての平均値および標準偏差（ＳＤ）を表す。図３６Ｂは、ＰＢＭＣアッセイと比較した全血アッセイにおける、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の、ＢＩＩＢ０５９による阻害についてのＩＣ５０値を示す図である。各記号は、個々のドナーを表し、縦線は、ＳＤを示す。
【図３７】図３７は、９６ウェルプレート内のウェル１つ当たり２５０μＬの総アッセイ体積中で、健常ヒトドナーに由来するＰＢＭＣを、１μＭのＴＬＲ３リガンド（ポリＩ：Ｃ）で刺激した、および、１０μｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のＢＩＩＢ０５９で処理したことを示す図である。プレートは、３７℃および５％のＣＯ２で、一晩（１８時間）にわたりインキュベートした。ＥＬＩＳＡによりＩＦＮαレベルを評価するために、２００μＬの上清を回収した。各記号は、各処理条件で産生される平均ＩＦＮαレベルを表す。２つの独立のドナーからのデータを示す。縦線は、標準偏差（ＳＤ）を示す。
【図３８】図３８Ａは、代表的な健常ヒトドナーからの、用量依存的ＢＩＩＢ０５９媒介ＢＤＣＡ２内部移行を示す図である。丸は、ＢＩＩＢ０５９の多様な用量における、２Ｄ６染色のＭＦＩを表す。三角は、アイソタイプ対照の存在下における２Ｄ６のＭＦＩ（最大染色）を表す。ひし形は、ＦＭＯ対照のＭＦＩ（バックグラウンド染色）を表す。図３８Ｂは、健常ヒトドナーに由来する全血アッセイによる、ｐＤＣにおけるＢＩＩＢ０５９誘導ＢＤＣＡ２内部移行についてのＥＣ５０を示す図（黒色丸；ｎ＝１０ドナー）である。平均ＥＣ５０は、０．０１７±０．００５μｇ／ｍＬであった。
【図３９】図３９は、ゲートをかけたＣＤ１４−ＣＤ２０−ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１２３＋ｐＤＣの２Ｄ６−ＦＩＴＣ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値についてのグラフによる描写である。アイソタイプ（ｉｓｏ）は、最大染色を表し、２Ｄ６−ＦＩＴＣを差し引いたＦＡＣＳ染色カクテルからなるＦＭＯ（蛍光マイナスワン対照）は、バックグラウンド染色を表す。この図では、実施された４回の独立の実験のうちの代表的な実験が示される。
【図４０】図４０は、末梢血から精製し、次いで、５％のＣＯ２中４℃（左）、または５％のＣＯ２中３７℃（右）で、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９〜ＡＦ６４７（白色）と共に、１５分間にわたりインキュベートしたヒトｐＤＣについての共焦点画像である。ＢＩＩＢ０５９の細胞分布は、共焦点顕微鏡法により評価し、代表的な写真を、各条件について示す。
【図４１】図４１は、ＢＤＣＡ２の内部移行の、ＩＦＮα産生の阻害に対する効果についてのグラフによる描写である。この図は、３回の独立の実験のうちの代表である。
【図４２】図４２は、全血アッセイ（ｎ＝１０）において、ＢＩＩＢ０５９媒介ＢＤＣＡ２内部移行についてのＥＣ５０値が、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生に対する、ＢＩＩＢ０５９媒介阻害についてのＩＣ５０値と相関したことを示すグラフによる描写である。Ｒ２値は０．５７。
【図４３】図４３Ａは、ＬＡＭＰ１＋区画内でのＴＬＲ９局在化について、マンダース共局在化係数の平均値および標準偏差（ＳＤ）として表した結果を示す図である。図４３Ｂは、ＴＬＲ９＋区画内でのＢＩＩＢ０５９／ＢＤＣＡ２局在化について、マンダース共局在化係数の平均値およびＳＤとして表した結果を示す図である。図４３Ｃは、ＬＡＭＰ１＋区画内でのＢＩＩＢ０５９／ＢＤＣＡ２局在化について、マンダース共局在化係数の平均値およびＳＤとして表した結果を示す図である。各記号は、個々の細胞を表し、横線は、平均値を表し、縦線は、ＳＤを表す。
【図４４】図４４Ａは、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９で処理された全血（淡彩のヒストグラム）、１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照で処理された全血（点線）、またはＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧ−Ａで刺激された全血（実線）についての代表的な実験に由来するヒストグラムである。図４４Ｂは、全血に対するＢＩＩＢ０５９処理の効果により、ＣＤ６２Ｌの脱落が結果としてもたらされることについてのグラフによる描写（黒四角）である。白色四角は、アイソタイプによる処理（１０μｇ／ｍＬ）を表す。この図は、３回の独立の実験を代表する。
【図４５】図４５は、フローサイトメトリーによりアッセイされたＣＤ６２Ｌの表面発現についてのグラフによる描写である。ＣＤ６２Ｌ発現は、ＢＩＩＢ０５９単独の存在下で、かつ、ＧＭ６００１の濃度を増加させて（丸）測定した。白色四角は、アイソタイプで処理された対照（１０μｇ／ｍＬ）を表す。逆三角は、ＢＩＩＢ０５９で処理されたＤＭＳＯ対照を表す。この図は、２回の独立の実験を代表する。
【図４６Ａ−Ｂ−Ｃ】図４６Ａは、１例の代表的な健常ヒトドナー（ｎ＝５）に由来するｐＤＣの表面におけるＢＤＣＡ２の、ＢＩＩＢ０５９および２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙ媒介用量依存的内部移行についてのグラフによる描写である。ヒト健常ドナーに由来するｐＤＣは、２ステップの磁気ビーズ分離手順（ＭＡＣＳキット；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。ｐＤＣは、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９（丸）、または抗体の非グリコシル化形態（２４Ｆ４−Ａｇｌｙ）（四角）で処理した。また、細胞を、１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照（三角）でも処理し、３７℃で１６時間にわたりインキュベートした。次いで、ｐＤＣを、ＢＤＣＡ２およびＣＤ３２の表面発現について染色した。図４６Ｂは、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９（影付き）、またはアイソタイプ対照（点線）で処理された単離ｐＤＣ（ｎ＝５）上のＣＤ３２のレベルを示すヒストグラムである。図４６Ｃは、１０μｇ／ｍＬの非グリコシル化形態である２４Ｆ４−Ａ（影付き）、またはアイソタイプ対照（点線のヒストグラム）で処理された単離ｐＤＣ上のＣＤ３２レベルを示すヒストグラムである。実線は、染色されていない細胞（ｎ＝５）を表す。図４６Ｄは、１例の代表的な健常ヒトドナー（ｎ＝５）に由来するｐＤＣの表面におけるＣＤ３２の、ＢＩＩＢ０５９媒介用量依存的下方モジュレーションについてのグラフによる描写である。図４６Ｅは、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９（影付き）、非グリコシル化形態（破線）、またはアイソタイプ対照（点線）の存在下、４℃で１時間にわたり処理された単離ｐＤＣ上のＣＤ３２のレベルを示すヒストグラムである。インキュベーション後、ｐＤＣを、ＣＤ３２の表面発現について評価した。黒色の実線は、染色されていない細胞（ｎ＝３）を表す。図４６Ｆは、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９（影付き）、非グリコシル化形態（破線）、またはアイソタイプ対照（点線）の存在下、３７℃で１時間にわたり処理された単離ｐＤＣ上のＣＤ３２のレベルを示すヒストグラムである。インキュベーション後、ｐＤＣを、ＣＤ３２の表面発現について評価した。黒色の実線は、染色されていない細胞（ｎ＝３）を表す。
【図４６Ｄ−Ｅ−Ｆ】図４６Ａは、１例の代表的な健常ヒトドナー（ｎ＝５）に由来するｐＤＣの表面におけるＢＤＣＡ２の、ＢＩＩＢ０５９および２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙ媒介用量依存的内部移行についてのグラフによる描写である。ヒト健常ドナーに由来するｐＤＣは、２ステップの磁気ビーズ分離手順（ＭＡＣＳキット；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。ｐＤＣは、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９（丸）、または抗体の非グリコシル化形態（２４Ｆ４−Ａｇｌｙ）（四角）で処理した。また、細胞を、１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照（三角）でも処理し、３７℃で１６時間にわたりインキュベートした。次いで、ｐＤＣを、ＢＤＣＡ２およびＣＤ３２の表面発現について染色した。図４６Ｂは、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９（影付き）、またはアイソタイプ対照（点線）で処理された単離ｐＤＣ（ｎ＝５）上のＣＤ３２のレベルを示すヒストグラムである。図４６Ｃは、１０μｇ／ｍＬの非グリコシル化形態である２４Ｆ４−Ａ（影付き）、またはアイソタイプ対照（点線のヒストグラム）で処理された単離ｐＤＣ上のＣＤ３２レベルを示すヒストグラムである。実線は、染色されていない細胞（ｎ＝５）を表す。図４６Ｄは、１例の代表的な健常ヒトドナー（ｎ＝５）に由来するｐＤＣの表面におけるＣＤ３２の、ＢＩＩＢ０５９媒介用量依存的下方モジュレーションについてのグラフによる描写である。図４６Ｅは、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９（影付き）、非グリコシル化形態（破線）、またはアイソタイプ対照（点線）の存在下、４℃で１時間にわたり処理された単離ｐＤＣ上のＣＤ３２のレベルを示すヒストグラムである。インキュベーション後、ｐＤＣを、ＣＤ３２の表面発現について評価した。黒色の実線は、染色されていない細胞（ｎ＝３）を表す。図４６Ｆは、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９（影付き）、非グリコシル化形態（破線）、またはアイソタイプ対照（点線）の存在下、３７℃で１時間にわたり処理された単離ｐＤＣ上のＣＤ３２のレベルを示すヒストグラムである。インキュベーション後、ｐＤＣを、ＣＤ３２の表面発現について評価した。黒色の実線は、染色されていない細胞（ｎ＝３）を表す。
【図４７】図４７Ａは、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９（四角）、濃度を増加させた抗体の非グリコシル化形態である２４Ｆ４−Ａ（丸）、または１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照（三角）で処理された単離ｐＤＣに由来するＩＦＮαレベルについてのグラフによる描写である。ｐＤＣは、ＣｐＧ−Ａ（７５μｇ／ｍＬ）の存在下で刺激するか、または刺激しないまま放置した（逆三角）。ｐＤＣは、３７℃で１６時間にわたりインキュベートし、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮαについてアッセイした。実行された２回の実験のうちの代表的な実験が示される。図４７Ｂは、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９（四角）、濃度を増加させた抗体の非グリコシル化形態である２４Ｆ４−Ａ（丸）、１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照（三角）、または１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３２  ｍＡｂで処理された単離ｐＤＣに由来するＩＦＮαレベルについてのグラフによる描写である。Ｓｍ／ＲＮＰ免疫複合体（ＩＣ）は、ウシ胸腺に由来するＳｍ−ＲＮＰと、ＳＬＥ患者の血清から精製された抗ＲＮＰ抗体とを、無血清培地中で３０分間にわたり混合することによりあらかじめ形成した。単離細胞を、免疫複合体で刺激するか、または抗原単独で処理した（刺激せず）。細胞は、３７℃で１６時間にわたりインキュベートし、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮαについてアッセイした。実行された３回の実験のうちの代表的な図が示される。各記号は、２連のウェルについての平均値および標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図４８】図４８Ａは、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９、２４Ｆ４−Ａ、抗ＣＤ３２  ｍＡｂ（ＡＴ１０クローン）、ヒト化抗ＣＤ４０抗体、またはアイソタイプ対照の存在下で、免疫複合体により処理された単離ｐＤＣ上のＣＤ３２発現を示す棒グラフである。細胞は、３７℃で１６時間にわたりインキュベートした。ｐＤＣを、ＣＤ３２およびＣＤ４０の表面発現について染色した。図４８Ｂは、Ａから回収された上清中でＥＬＩＳＡにより測定されたＩＦＮαレベルを示す棒グラフである。代表的な図（ｎ＝３）が示される。図４８Ｃは、ｐＤＣの表面におけるＣＤ４０発現を示すヒストグラムである。点線は、細胞表面におけるＣＤ４０発現を表す。淡彩のヒストグラムは、抗ＣＤ４０抗体による処理後におけるｐＤＣ上のＣＤ４０のレベルを表す。実線は、染色されていない細胞を表す。
【図４９】図４９は、ＨＣＱの、ＢＩＩＢ０５９の効力に対する影響を示す図である。各記号は、個々の健常ヒトドナーから測定されたＩＦＮα濃度を表し、縦線は、ＳＤを示す。健常ヒトドナーに由来するＰＢＭＣは、ウェル１つ当たり２５０μＬの総アッセイ体積中の、種々の濃度の、ＢＩＩＢ０５９単独、ＨＣＱ単独、または組合せ（ＢＩＩＢ０５９＋ＨＣＱ）で処理した。ＢＩＩＢ０５９の濃度は、１０μｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの範囲にわたった。ＨＣＱの濃度は、１０μＭ〜１５６ｎＭの範囲にわたった。ウェル１つ当たり１×１０６個のＰＢＭＣ細胞を、５μＭのＴＬＲ７リガンド（Ｒ８４８）で刺激した。ＰＢＭＣを含有するプレートは、３７℃および５％のＣＯ２で、一晩（１８時間）にわたりインキュベートした。ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）において評価するために、２００μＬの上清を回収した。
【図５０】図５０は、ＨＣＱの、ＢＩＩＢ０５９の効力に対する影響を示す図である。各記号は、２例の試験した健常ドナーのうちの代表的なドナーから測定されたＩＦＮα濃度を表し、縦線は、標準偏差（ＳＤ）を示す。健常ヒトドナーまたはＳＬＥ患者のヘパリン添加静脈血に由来するＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ上の不連続勾配遠心分離により単離し、ＰＢＳ中で洗浄し、完全培養培地（３％のＦＢＳを伴うＲＰＭＩ）中で再懸濁させた。ＰＢＭＣは、ウェル１つ当たり２５０μＬの総アッセイ体積中の、種々の濃度の、ＢＩＩＢ０５９単独、ＨＣＱ単独、または組合せ（ＢＩＩＢ０５９＋ＨＣＱ）で処理した。ＢＩＩＢ０５９の濃度は、１０μｇ／ｍＬ〜０．１ｎｇ／ｍＬの範囲にわたった。ＨＣＱの濃度は、１０μＭ〜１５６ｎＭの範囲にわたった。ウェル１つ当たり１×１０６個のＰＢＭＣ細胞を、１μＭのＴＬＲ９リガンド（ＣＰＧ−Ａ）で刺激した。ＰＢＭＣを含有するプレートは、３７℃および５％のＣＯ２で、一晩（１８時間）にわたりインキュベートした。ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）において評価するために、２００μＬの上清を回収した。
【図５１】図５１は、健常カニクイザルの全血中の循環ｐＤＣパーセントの分布を、元のスケール（左パネル）および対数スケール（右パネル）で示す図である。全血を、１２例のカニクイザルから、週１回のべ４週間にわたり採取した。フローサイトメトリーを使用して、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定した。ＣＤ２０−ＣＤ１４−細胞のパーセントとしてのｐＤＣは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算した。グラフは、統計計算のためのＲ言語を使用して得た。
【図５２】図５２は、ＢＩＩＢ０５９をＩＶ注射する前の異なる時点ごとの、健常カニクイザルの全血中の循環ｐＤＣパーセント（対数スケールの）についてのグラフによる描写である。表示される時点において、全血を採取し、フローサイトメトリーにより、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定した。ｐＤＣパーセントは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、Ｒソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図５３】図５３は、ＢＩＩＢ０５９をＩＶ注射する前の異なる時点ごとの、健常カニクイザルの全血中の循環ｐＤＣパーセント（対数スケールの）のための、最終的な当てはめモデルについての描写である。異なる時点を固定係数とし、カニクイザルをランダム切片とする対数（ｐＤＣ％）値についての線形混合効果モデルは、異なる週ごとに測定されたｐＤＣ％の幾何平均値の比の間で差異を示さない（ゼロに等しい全ての時間効果についてのＦ検定に基づくｐ値は、０．６７である）。グラフおよび統計学的解析は、統計計算のためのＲ言語を使用して計算した。黒色の線は、固定切片およびカニクイザルについてのランダム切片だけを含む、最終的な当てはめモデルを示す。Ｒではｌｍｅ４パッケージを使用して、線形混合効果モデルを当てはめた。
【図５４】図５４は、カニクイザルにおけるクエン酸ナトリウム媒体、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９、または１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９のＩＶ投与の前および後の、対数スケールによる循環ｐＤＣパーセントを示す図である。時間０において、各投与群につき３例ずつのカニクイザルに投与した。表示される時点において、全血を採取し、フローサイトメトリーにより、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定した。ｐＤＣパーセントは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、Ｒソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図５５】図５５は、カニクイザルにおけるクエン酸ナトリウム媒体、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９、および１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９のＩＶ投与の前および後の、対数スケールによる循環ｐＤＣパーセントのための最終的な当てはめモデルを示す図である。投与群、１時間、６時間、および２８日間超の時間レベルについての固定係数、ならびにカニクイザルについてのランダム切片を伴う、対数（ｐＤＣ％）値についての線形混合効果モデルである。実線は、当てはめモデルを示す。Ｒではｌｍｅ４パッケージを使用して、線形混合効果モデルを当てはめた。グラフおよび統計学的解析は、統計計算のためのＲ言語を使用して計算した。
【図５６】図５６は、カニクイザルにおける、０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９のＳＣ投与の後における循環ｐＤＣパーセントを示す図である。カニクイザル４、６、および１２には、時間０において、０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回ＳＣ注射を投与した。３例のカニクイザルのうち、カニクイザル６には、前出の研究における、ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９を投与した。カニクイザル４および１２には、前出の研究における媒体を投与した。表示される時点において、全血を採取し、フローサイトメトリーにより、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定した。ｐＤＣパーセントは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、Ｒソフトウェアを使用してグラフ化した。
【図５７】図５７は、カニクイザルにおける、０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９のＳＣ投与の後における循環ｐＤＣパーセントのための最終的な当てはめモデルを示す図である。固定効果を連続時間および１時間後の時点についてのものとし、カニクイザルをランダム切片とする、対数（ｐＤＣ％）値のための線形混合効果モデルを当てはめる。実線は、当てはめモデルを示す。Ｒではｌｍｅ４パッケージを使用して、線形混合効果モデルを当てはめた。グラフおよび統計学的解析は、統計計算のためのＲ言語を使用して計算した。
【図５８】図５８は、カニクイザルＰＫ／ＰＤ実験デザインについての概略表示である。９例のカニクイザルにより、静脈内（ＩＶ）投与研究を遂行した。カニクイザルからは、示された採血スケジュールに従い、媒体、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９、または１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９のＩＶ投与の前および後において採血した。この研究を遂行した後、３例のカニクイザルには、皮下（ＳＣ）投与研究を引き続き遂行し、０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回ＳＣ注射を施した。各採血時点では、全血アッセイを実施し、カニクイザルからの全血を、完全ＲＰＭＩ  １６４０で１：４に希釈し、９６ウェル丸底組織培養プレート内の２００μｇ／ｍｌの最終濃度のＣＰＧ−Ａで刺激し、３７℃、５％のＣＯ２で、１８〜２０時間にわたりインキュベートした。培養が終了したら、刺激された全血を遠心分離して、血清を採取した。ＭｘＡバイオアッセイでは、Ａ５４９細胞を、採取された血清により、３７℃、５％のＣＯ２で、１９〜２０時間にわたり刺激して、ＭｘＡタンパク質を誘導した。２０時間後、Ａ５４９細胞を溶解させ、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、ＭｘＡタンパク質の濃度を検出した。ＩＦＮαレベル（１ｍＬ当たりの単位）は、Ａ５４９細胞を、用量を増加させたｒＩＦＮαで処理することにより作成した検量線から逆算した。
【図５９】図５９は、ＢＩＩＢ０５９の単回静脈内投与を施されたカニクイザルにおける、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の、処置前の平均値と比べた低減への傾向についてのグラフ表示である。媒体、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９、または１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回静脈内投与で処置したカニクイザルに由来する全血を、完全ＲＰＭＩ  １６４０で１：４に希釈し、９６ウェル丸底組織培養プレート内の２００μｇ／ｍｌの最終濃度のＣＰＧ−Ａ（２２１６）で刺激し、３７℃、５％のＣＯ２で、１８〜２０時間にわたりインキュベートした。培養が終了したら、刺激された全血を遠心分離して、血清を採取した。Ａ５４９細胞を、採取された血清により、３７℃、５％のＣＯ２で、１９〜２０時間にわたり刺激して、ＭｘＡタンパク質を誘導した。２０時間後、Ａ５４９細胞を溶解させ、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、ＭｘＡタンパク質の濃度を検出した。ＩＦＮαレベル（１ｍＬ当たりの単位）は、Ａ５４９細胞を、用量を増加させたｒＩＦＮαで処理することにより作成した検量線から逆算した。平均採血前ＩＦＮα濃度を、各サルについて、採血前時点（−２１、−１４、−７日目、およびＴ０）に由来する全てのＩＦＮα測定値を平均することにより計算した。次いで、ＩＦＮα％を、ＢＩＩＢ０５９の投与後１４日目までの各採血時点について、その時点におけるＩＦＮα濃度を、その動物についての採血前平均値で除し、１００で乗じることにより計算した。次いで、これらの値を、各処理群について平均した。グラフは、平均値±平均値の標準誤差を示す。グラフおよび統計学的解析は、エクセルおよびＧｒａｐｈＰａｄ  ６．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して計算した。
【図６０−１】図６０は、ＢＩＩＢ０５９で静脈内処置されたカニクイザルに由来するｅｘ  ｖｉｖｏ全血アッセイにおける、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の減少についてのグラフによる描写である。媒体（上パネル）、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９（中パネル）、または１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９（下パネル）の単回静脈内投与で処置したカニクイザルに由来する全血を、完全ＲＰＭＩ  １６４０で１：４に希釈し、９６ウェル丸底組織培養プレート内の２００μｇ／ｍｌの最終濃度のＣＰＧ−Ａ（２２１６）で刺激し、３７℃、５％のＣＯ２で、１８〜２０時間にわたりインキュベートした。培養が終了したら、刺激された全血を遠心分離して、血清を採取した。Ａ５４９細胞を、採取された血清により、３７℃、５％のＣＯ２で、１９〜２０時間にわたり刺激して、ＭｘＡタンパク質を誘導した。２０時間後、Ａ５４９細胞を溶解させ、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、ＭｘＡタンパク質の濃度を検出した。ＩＦＮαレベル（１ｍＬ当たりの単位）は、Ａ５４９細胞を、用量を増加させたｒＩＦＮαで処理することにより作成した検量線から逆算した。二元混合効果分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、計算されたＩＦＮα濃度のｌｏｇ１０値へと当てはめた。ＩＦＮα値を、各投与群内の各動物について、採血日と対比してプロットする（ｌｏｇ１０スケールで）。縦線は、採血日の、投与前、投与後３１日目まで、および投与後３１日超への群分けを示す。解析では、３１日目以降の採血日を使用しなかった。幾何平均によるＩＦＮα値についてのモデルベースの推定値は、各パネルの投与前領域内および投与後領域内の黒色の太横線により表す。グラフおよび統計学的解析は、統計計算のためのＲ言語を使用して計算した。
【図６０−２】図６０は、ＢＩＩＢ０５９で静脈内処置されたカニクイザルに由来するｅｘ  ｖｉｖｏ全血アッセイにおける、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の減少についてのグラフによる描写である。媒体（上パネル）、１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９（中パネル）、または１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９（下パネル）の単回静脈内投与で処置したカニクイザルに由来する全血を、完全ＲＰＭＩ  １６４０で１：４に希釈し、９６ウェル丸底組織培養プレート内の２００μｇ／ｍｌの最終濃度のＣＰＧ−Ａ（２２１６）で刺激し、３７℃、５％のＣＯ２で、１８〜２０時間にわたりインキュベートした。培養が終了したら、刺激された全血を遠心分離して、血清を採取した。Ａ５４９細胞を、採取された血清により、３７℃、５％のＣＯ２で、１９〜２０時間にわたり刺激して、ＭｘＡタンパク質を誘導した。２０時間後、Ａ５４９細胞を溶解させ、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、ＭｘＡタンパク質の濃度を検出した。ＩＦＮαレベル（１ｍＬ当たりの単位）は、Ａ５４９細胞を、用量を増加させたｒＩＦＮαで処理することにより作成した検量線から逆算した。二元混合効果分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、計算されたＩＦＮα濃度のｌｏｇ１０値へと当てはめた。ＩＦＮα値を、各投与群内の各動物について、採血日と対比してプロットする（ｌｏｇ１０スケールで）。縦線は、採血日の、投与前、投与後３１日目まで、および投与後３１日超への群分けを示す。解析では、３１日目以降の採血日を使用しなかった。幾何平均によるＩＦＮα値についてのモデルベースの推定値は、各パネルの投与前領域内および投与後領域内の黒色の太横線により表す。グラフおよび統計学的解析は、統計計算のためのＲ言語を使用して計算した。
【図６１】図６１は、ＢＩＩＢ０５９で皮下処置されたカニクイザルに由来するｅｘ  ｖｉｖｏ全血アッセイにおける、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の減少についてのグラフによる描写である。０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回皮下投与で処置したカニクイザルに由来する全血を、完全ＲＰＭＩ  １６４０で１：４に希釈し、９６ウェル丸底組織培養プレート内の２００μｇ／ｍｌの最終濃度のＣＰＧ−Ａ（２２１６）で刺激し、３７℃、５％のＣＯ２で、１８〜２０時間にわたりインキュベートした。培養が終了したら、刺激された全血を遠心分離して、血清を採取した。Ａ５４９細胞を、採取された血清により、３７℃、５％のＣＯ２で、１９〜２０時間にわたり刺激して、ＭｘＡタンパク質を誘導した。２０時間後、Ａ５４９細胞を溶解させ、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、ＭｘＡタンパク質の濃度を検出した。ＩＦＮαレベル（１ｍＬ当たりの単位）は、Ａ５４９細胞を、用量を増加させたｒＩＦＮαで処理することにより作成した検量線から逆算した。ランダム効果を伴う一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、計算されたＩＦＮα濃度のｌｏｇ１０値へと当てはめた。ＩＦＮα値を、各動物について、採血日と対比してプロットする（ｌｏｇ１０スケールで）。縦線は、採血日の、投与前、投与後３３日目まで、および投与後３３日超への群分けを示す。解析では、３３日目以降の採血日を使用しなかった。幾何平均によるＩＦＮα値についてのモデルベースの推定値は、各パネルの投与前領域内および投与後領域内の黒色の太横線により表す。グラフおよび統計学的解析は、統計計算のためのＲ言語を使用して計算した。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
ＢＩＩＢ０５９とは、ヒトＢＤＣＡ２に特異的に結合する例示的なモノクローナル抗体である。本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体は、ｐＤＣによる、炎症性サイトカインおよびケモカインの産生および／または分泌を阻害する。さらに、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体は、ｐＤＣの表面におけるＣＤ３２ａおよび／またはＣＤ６２Ｌのレベルを下方調節しうる。また、本開示の抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＤＣＡ２の、ｐＤＣの表面からの内部移行も媒介しうる。加えて、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣによりｐＤＣを枯渇させるのにも使用することができ、炎症性状態および自己免疫状態などの免疫障害を処置または防止するのにも使用しうる。本開示はまた、抗マラリア剤を、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体と組み合わせることにより、いずれかの薬剤単独による処置と比較した効果の改善をもたらしうることも示す。
【００４０】
ＢＤＣＡ２
ＢＤＣＡ２とは、ｐＤＣ上で特異的に発現するＩＩ型Ｃ型レクチンである。ＢＤＣＡ２は、そのＣ末端における単一の細胞外炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）、膜貫通領域、およびシグナル伝達モチーフを保有しないそのＮ末端の短い細胞質尾部からなる。ＢＤＣＡ２は、会合する膜貫通アダプターであるＦｃεＲＩγを介して細胞内シグナルを伝達する（図１を参照されたい）。抗体に媒介されるＢＤＣＡ２のライゲーションにより、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）が、ＦｃεＲＩγのリン酸化免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）へと動員される。Ｓｙｋが活性化すると、Ｂ細胞リンカー（Ｂｌｎｋ）、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、およびホスホリパーゼＣγ２（ＰＬＣγ２）の活性化がもたらされることから、Ｃａ２＋の移動がもたらされる。
【００４１】
ヒトＢＤＣＡ２タンパク質のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿５６９７０８．１）を下記に示す（膜貫通ドメインは、斜字体とし、外部ドメインには下線を付す）。
【化１】
2019146567.tif 000003
ヒトＦｃεＲＩγのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４０９７．１）を下記に示す。
【化２】
2019146567.tif 000004
【００４２】
最も類似しているラットＢＤＣＡ２相同体であるラットＣｌｅｃ４ｂ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１００５８９６）がヒトＢＤＣＡ２と共有する同一性は、５１．０％に過ぎない。これに対し、カニクイザルＢＤＣＡ２およびアカゲザルＢＤＣＡ２がヒトＢＤＣＡ２と共有する同一性は、９０．６％である。加えて、互いと同一なカニクイザルＦｃεＲＩγタンパク質配列およびアカゲザルＦｃεＲＩγタンパク質配列がヒトＦｃεＲＩγタンパク質と共有する同一性は、９８．９％である。
【００４３】
ヒトＢＤＣＡ２タンパク質、カニクイザルＢＤＣＡ２タンパク質、およびアカゲザルＢＤＣＡ２タンパク質を免疫原として使用して、抗ＢＤＣＡ２抗体を調製することができる。ヒト抗ＢＤＣＡ２抗体を調製するには、ヒトＢＤＣＡ２タンパク質を免疫原として使用することができる。次いで、抗ヒトＢＤＣＡ２抗体をスクリーニングして、本明細書で記載される特色（例えば、Ｉ型インターフェロンまたはＩＩＩ型インターフェロン、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１−α、ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５、およびＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０のうちの１または複数の産生／分泌を低減すること；ｐＤＣを枯渇させること；ＢＤＣＡ２の細胞外ドメインへの結合について、ＢＩＩＢ０５９と競合すること；ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＢＤＣＡ２の外部ドメインには選択的に結合するが、ラットＣｌｅｃ４ｂ２には結合しないこと；ヒト乾癬異種移植モデルにおいて、疾患の発症を阻害すること）のうちの１または複数を有する抗体を同定することができる。
【００４４】
抗ＢＤＣＡ２抗体
本開示は、ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＢＤＣＡ２には結合するが、ラットＣｌｅｃ４ｂ２には結合しないモノクローナル抗体であるＢＩＩＢ０５９の配列を含む。ＢＩＩＢ０５９は、霊長動物より下等の系統発生種に由来するＢＤＣＡ２に結合しないか、またはこれへの有意な結合を示さない。
【００４５】
ＢＩＩＢ０５９
ＢＩＩＢ０５９とは、形質細胞様樹状細胞の表面におけるＢＤＣＡ２を特異的に認識するヒト化ＩｇＧ１抗体である。ＢＩＩＢ０５９は、ＢＤＣＡ２に結合するマウス抗体（２４Ｆ４）から以下の通りに導出した。全長ヒトＢＤＣＡ２をコードするプラスミドを、遺伝子銃により、マウスへと注射した。このマウスに由来する脾細胞を、骨髄腫細胞へと融合させ、結果として得られたハイブリドーマは２４Ｆ４抗体を産生した。２４Ｆ４抗体を、野生型ヒトＩｇＧ１フレームワークへと操作して、完全なエフェクター機能を維持した。成熟ＢＩＩＢ０５９重鎖および成熟ＢＩＩＢ０５９軽鎖の予測アミノ酸配列を下記に示す。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、および３を、成熟ＶＬ配列および成熟ＶＨ配列のＮ末端からＣ末端の順序で示し、下線を付し、かつ、太字とした。下記に列挙される成熟重鎖（配列番号４）および成熟軽鎖（配列番号３）からなる抗体を、ＢＩＩＢ０５９と称する。
成熟ＢＩＩＢ０５９軽鎖（ＬＣ）
【化３−１】
2019146567.tif 000005
成熟ＢＩＩＢ０５９重鎖（ＨＣ）
【化３−２】
2019146567.tif 000006
ＢＩＩＢ０５９の可変軽鎖（ＶＬ）は、以下のアミノ酸配列：
【化３−３】
2019146567.tif 000007
を有する。
ＢＩＩＢ０５９の可変重鎖（ＶＨ）は、以下のアミノ酸配列：
【化３−４】
2019146567.tif 000008
を有する。
ＢＩＩ０５９のＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列を、下記に列挙する：
【化３−５】
2019146567.tif 000009
ＢＩＩ０５９のＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列を、下記に列挙する：
【化３−６】
2019146567.tif 000010
【００４６】
上記で示した通り、ＶＨ  ＣＤＲ１についての改変型Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭ  ＣＤＲ定義は、このＣＤＲについてのＫａｂａｔ定義より５アミノ酸長い。改変型Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭ  ＶＨ  ＣＤＲ１のさらなる５つのアミノ酸は、ＧＦＴＦＳ（配列番号１２）である。
【００４７】
本開示の抗ＢＤＣＡ２抗体はまた、ＢＩＩＢ０５９の「代替のＣＤＲ」も含みうる。「代替の」ＣＤＲとは、ＡｂｙｓｉｓによるＣｈｏｔｈｉａ定義、改変型Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭ  ＣＤＲ定義、または接触定義のうちのいずれか１つに従い定義されたＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を意味する。これらの代替のＣＤＲは、例えば、ＡｂＹｓｉｓデータベース（www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi）を使用することにより得ることができる。ＢＩＩＢ０５９の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の「代替の」ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を、下記の表でＫａｂａｔに従い定義されたＣＤＲと比較する。
【化３−７】
2019146567.tif 000011
【００４８】
抗ＢＤＣＡ２抗体は、Ｋａｂａｔ定義、ＡｂｙｓｉｓによるＣｈｏｔｈｉａ定義、改変型Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭ  ＣＤＲ定義、または接触定義に従う、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を包含しうる。これらの抗体は、例えば、ＣＤＲのうちの１または複数（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の中に、１、２、または３カ所の置換を有しうる。これらの抗体は、（ｉ）ヒトＢＤＣＡ２またはカニクイザルＢＤＣＡ２には結合するが、霊長動物より下等の系統発生種に由来するＢＤＣＡ２には有意には結合せず、かつ／または（ｉｉ）ヒトｐＤＣによる、ＴＬＲ７／ＴＬＲ９誘導Ｉ型インターフェロンおよび他のサイトカインまたはケモカインの産生を阻害し、かつ／または（ｉｉｉ）ＢＤＣＡ２の、ｐＤＣの表面からの内部移行を媒介し、かつ／または（ｉｖ）ｐＤＣの表面からのＣＤ３２ａおよび／もしくはＣＤ６２Ｌを下方調節し、かつ／または（ｖ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＡＤＣＣまたはＣＤＣにより、ｐＤＣを枯渇させる。
【００４９】
ヒトＩｇＧ抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含有する四量体分子である。ＢＩＩＢ０５９の各軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合（ＬＣ  Ｃｙｓ  ２１８−ＨＣ  Ｃｙｓ  ２２５）を介して、重鎖へと共有結合的に連結されており、重鎖は、２つの鎖間ジスルフィド（ＨＣ  Ｃｙｓ  ２３１−Ｃｙｓ  ２３１およびＣｙｓ  ２３４−Ｃｙｓ  ２３４）により互いと対合している。他の全てのシステインは、定常ドメインおよび可変ドメインを安定化させる分子内ジスルフィドを形成する。
【００５０】
ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含む。ある種の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ３ドメインを含む。重鎖定常領域が、置換を含む場合、このような置換は、抗体の特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能のうちの１または複数を増加または減少させる）。ある種の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。具体的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される。ある種の実施形態では、抗体は、７μｇ／ｍＬ〜１５μｇ／ｍＬのアフィニティーでＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１１μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。ある種の実施形態では、抗体は、１２μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）に結合するヒトＦｃ領域を含む。表１は、ＢＩＩＢ０５９抗体の特性のリストを提供する。
【表１−１】
2019146567.tif 000012
【表１−２】
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【００５１】
ＢＩＩＢ０５９は、抗体治療剤に適する物理化学的特性を示す。この抗体が示す凝集は、低レベルである。野生型のＩｇＧ１フレームワークは、分子内およびＢＩＩＢ０５９内に単一のＮ結合グリコシル化部位を含有し、このクラスの分子に典型的なアフィニティーでＦｃ受容体に結合する。ｐＩの計算値７．２６は、抗体としてはやや低値である。ＢＩＩＢ０５９内で検出される電荷不均一性は、ＢＩＩＢ０５９のうちのかなりの割合が、修飾を含有することを示唆する。ＢＩＩＢ０５９の精製バッチ内で検出される最大で約１０％の糖化レベルにより、この電荷不均一性が少なくとも部分的に説明される。ＢＩＩＢ０５９のフォールディングＴｍが、抗体について観察される典型的な値の下端にあるのに対し、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインのフォールディングＴｍは、完全にグリコシル化されたＩｇＧ１  ｍＡｂに典型的である。示差走査蛍光定量法および粘度測定値に基づき、ＢＩＩＢ０５９は、例えば、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中に５０ｍｇ／ｍＬで製剤化することができる。この抗体はまた、１５０〜３００ｍｇ／ｍＬ（例えば、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ）など、はるかに高濃度でも製剤化することができる。
【００５２】
ＢＩＩＢ０５９は、ＢＤＣＡ２に対する高アフィニティーを示し、天然ヒトＢＤＣＡ２にも、天然カニクイザルＢＤＣＡ２にも、同等に良好に結合する、完全ヒト化Ｆｃ機能保有ＩｇＧ１  ｍＡｂである。ＢＩＩＢ０５９は、ｐＤＣによる、全ての、ＴＬＲ９誘導Ｉ型ＩＦＮならびに他のサイトカインおよびケモカインの、強力な阻害剤である。ＢＩＩＢ０５９は、健常ヒトドナーおよびＳＬＥ患者に由来するｐＤＣによる、ＴＬＲ９誘導Ｉ型インターフェロンの阻害においても同等に強力である。ＢＩＩＢ０５９は、ｐＤＣによる、ＴＬＲ９誘導Ｉ型ＩＦＮを特異的に阻害し、異なるＴＬＲリガンドにより誘発される、他の細胞型によるＩＦＮの産生には、影響を及ぼさない。ＢＩＩＢ０５９は、ＢＤＣＡ２の、細胞表面からの急速な内部移行をもたらす。刺激されると、ＢＤＣＡ２は、それがＴＬＲ９シグナル伝達を阻害するのに必要であると考えられるエンドソーム／リソソーム区画でのＴＬＲ９と共局在化する。ＢＩＩＢ０５９は、ＣＤ６２Ｌの、ヒトｐＤＣの表面からの脱落を引き起こすことが見出されたが、これは、それらの標的臓器へのホーミングに影響を及ぼしうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）研究およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）研究は、ＢＩＩＢ０５９が、ＢＤＣＡ２を過剰発現する細胞系において、細胞枯渇活性を有しうることを示唆する。しかし、ＢＩＩＢ０５９が、ＢＤＣＡ２の、ｐＤＣの表面からの、急速かつ完全な内部移行をもたらすという事実は、ＢＩＩＢ０５９が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ｐＤＣの持続的な枯渇をもたらす可能性を低くする。ＢＩＩＢ０５９と、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）との組合せは、健常ヒトドナーに由来するＰＢＭＣによる、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生に対するさらなる阻害効果をもたらした。これらのデータは、ＨＣＱなどの抗マラリア化合物と共に投与される場合の、ＢＩＩＢ０５９の潜在的なさらなる治療的利益を強調する。
【００５３】
ＢＩＩＢ０５９などの抗体は、例えば、列挙されるアミノ酸配列をコードする合成遺伝子を調製し、発現させることにより作製することもできるか、または、ヒト生殖細胞系列遺伝子を、列挙されるアミノ酸配列をコードする遺伝子をもたらすように変異させることにより作製することもできる。さらに、この抗体および他の抗ＢＤＣＡ２抗体は、例えば、以下の方法のうちの１または複数を使用して得ることもできる。
【００５４】
抗ＢＤＣＡ２抗体を得る方法
抗体、特に、ヒト抗体を得るためには、多数の方法が利用可能である。１つの例示的な方法は、タンパク質発現ライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングするステップを含む。ファージディスプレイは、例えば、Ｕ．Ｓ．５，２２３，４０９；Smith、Science、２２８巻：１３１５〜１３１７頁（１９８５年）；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；およびＷＯ９０／０２８０９において記載されている。Ｆａｂの、ファージ上の提示は、例えば、米国特許第５，６５８，７２７号；同第５，６６７，９８８号；および同第５，８８５，７９３号において記載されている。
【００５５】
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、他の方法も、ＢＤＣＡ２結合性抗体を得るのに使用することができる。例えば、ＢＤＣＡ２タンパク質またはそのペプチドを、非ヒト動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウス、ハムスター、またはラットにおける抗原として使用することができる。加えて、ＢＤＣＡ２をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトされた細胞を、細胞表面ＢＤＣＡ２タンパク質に効果的に結合する抗体を産生する手段として、非ヒト動物へと注射することもできる。
【００５６】
一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体の産生を欠損させたマウス系統であって、ヒトＩｇ遺伝子座の大型断片を伴うマウス系統を操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を伴う、上記遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を作製および選択することができる。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Greenら、Nature  Genetics、７巻：１３〜２１頁（１９９４年）、Ｕ．Ｓ．２００３−００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６、およびＷＯ９６／３３７３５を参照されたい。
【００５７】
別の実施形態では、モノクローナル抗体を、非ヒト動物から得、次いで、改変、例えば、ヒト化または脱免疫する。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書で記載されるヒト化抗体を調製するのに使用しうる例示的なＣＤＲ移植法について記載している（Ｕ．Ｓ．５，２２５，５３９）。特定のヒト抗体のＣＤＲのうちの全部または一部を、非ヒト抗体の少なくとも一部で置きかえることができる。ＢＤＣＡ２に結合する有用なヒト化抗体に到達するには、このようなＣＤＲの結合または結合決定基に必要とされるＣＤＲを置きかえることだけが必要でありうる。
【００５８】
ヒト化抗体は、抗原への結合に直接関与していないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域に由来する同等の配列で置きかえることにより生成することができる。ヒト化抗体を生成するための一般的な方法は、Morrison,  S.  L.、Science、２２９巻：１２０２〜１２０７頁（１９８５年）、Oiら、BioTechniques、４巻：２１４頁（１９８６年）、ならびにＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ５，６９３，７６１；ＵＳ５，６９３，７６２；ＵＳ５，８５９，２０５；およびＵＳ６，４０７，２１３により提供されている。これらの方法は、重鎖または軽鎖のうちの少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、発現させるステップを含む。当業者には、このような核酸の供給源が周知であり、例えば、上記で記載した所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから得ることもでき、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子から得ることもでき、合成構築物から得ることもできる。次いで、ヒト化抗体をコードする組換えＤＮＡを、適切な発現ベクターへとクローニングすることができる。
【００５９】
ヒト生殖細胞系列の配列は、例えば、Tomlinson,  I.A.ら、J.  Mol.  Biol.、２２７巻：７７６〜７９８頁（１９９２年）；Cook,  G.  P.ら、Immunol.  Today、１６巻：２３７〜２４２頁（１９９５年）；Chothia,  D.ら、J.  Mol.  Bio.、２２７巻：７９９〜８１７頁（１９９２年）；およびTomlinsonら、EMBO  J.、１４巻：４６２８〜４６３８頁（１９９５年）において開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリーは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリー（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫによりまとめられている）を提供している。これらの配列は、ヒト配列、例えば、フレームワーク領域およびＣＤＲの供給源として使用することができる。また、例えば、米国特許第６，３００，０６４号において記載されている通り、ヒトコンセンサスフレームワーク領域も使用することができる。
【００６０】
非ヒトＢＤＣＡ２結合性抗体はまた、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において開示されている方法による、ヒトＴ細胞エピトープの特異的な欠失または「脱免疫」により改変することもできる。略述すると、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて解析することができ、これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において定義されている）を表す。潜在的なＴ細胞エピトープを検出するために、「ペプチドスレッディング」と称するコンピュータモデル化法を適用し、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７において記載されているＶＨ配列内およびＶＬ配列内に存在するモチーフについて検索することもできる。これらのモチーフは、１８の主要なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのうちのいずれかに結合し、したがって、潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変領域内の少数のアミノ酸残基を置換することにより消失させることもできるか、または、好ましくは、単一のアミノ酸置換により消失させることもできる。可能な限りにおいて、保存的置換が施される。ヒト生殖細胞系列の抗体配列内の位置に共通なアミノ酸を使用しうることが多いが、これに限らない。脱免疫変化を同定した後、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸を、変異誘発または他の合成法（例えば、デノボ合成、カセットによる置きかえなど）により構築することができる。変異誘発された可変配列は、必要に応じて、ヒト定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域またはヒトκ定常領域に融合させることができる。
【００６１】
場合によって、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体機能に重要であることが公知であるかまたは予測される残基を含む。例えば、潜在的なＴ細胞エピトープは、ＣＤＲに向く傾向があることが通例である。加えて、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体の構造および結合に重要なフレームワーク残基に生じる場合もある。これらの潜在的なエピトープを消失させる変化は、場合によって、例えば、変化を伴う鎖および変化を伴わない鎖を作製し、試験することによる、一層の精査を必要とする。可能な場合、ＣＤＲと重複する潜在的なＴ細胞エピトープは、ＣＤＲの外側における置換により消失させることができる。場合によって、ＣＤＲ内の変化が唯一の選択肢であり、したがって、この置換を有する変異体およびこの置換を伴わない変異体について試験することができる。他の場合には、潜在的なＴ細胞エピトープを除去するのに必要とされる置換は、抗体の結合に極めて重要でありうる、フレームワーク内の残基位置における置換である。これら場合には、この置換を有する変異体およびこの置換を伴わない変異体について試験する。したがって、場合によって、変異体の数種の脱免疫された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をデザインし、多様な重鎖／軽鎖の組合せについて試験して、最適な脱免疫抗体を同定する。次いで、異なる変異体の結合アフィニティーを、脱免疫の程度、特に、可変領域内に残存する潜在的なＴ細胞エピトープの数と共に考慮することにより、最終的な脱免疫抗体の選択を行うことができる。脱免疫を使用して、任意の抗体、例えば、非ヒト配列、例えば、合成抗体、マウス抗体、他の非ヒトモノクローナル抗体、またはディスプレイライブラリーから単離された抗体を含む抗体を改変することができる。
【００６２】
また、抗体をヒト化するための他の方法も使用することができる。例えば、他の方法により、抗体の三次元構造、結合決定基と三次元で近接するフレームワーク位置、および免疫原性ペプチド配列を明らかにすることもできる。例えば、ＷＯ９０／０７８６１；米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，５３０，１０１号；および同第６，４０７，２１３号；Tempestら（１９９１年）、Biotechnology、９巻：２６６〜２７１頁を参照されたい。さらに別の方法は、「ヒューマニアリング」と称し、例えば、Ｕ．Ｓ．２００５−００８６２５において記載されている。
【００６３】
抗体は、ヒトＦｃ領域、例えば、野生型のＦｃ領域または１もしくは複数の変化を含むＦｃ領域を含みうる。一実施形態では、定常領域を変化させる、例えば、変異させて、抗体の特性を改変する（例えば、Ｆｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能のうちの１または複数を増加または減少させること）。例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を、１または複数の残基、例えば、残基２３４および２３７のうちの１または複数（Ｋａｂａｔの番号付けに基づく）において変異させることができる。抗体は、重鎖のＣＨ２領域内に、エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体の結合および補体の活性化を低減するかまたは変化させる変異を有しうる。例えば、抗体は、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号において記載されている変異などの変異を有しうる。抗体はまた、当技術分野において開示されている、ＩｇＧ４のヒンジ領域内の変異など、免疫グロブリンの２つの重鎖の間のジスルフィド結合を安定化させる変異も有しうる（例えば、Angalら（１９９３年）、Mol.  Immunol.、３０巻：１０５〜０８頁）。例えば、また、Ｕ．Ｓ．２００５−００３７０００も参照されたい。
【００６４】
アフィニティー成熟
一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、例えば、変異誘発により改変して、改変抗体のプールをもたらす。次いで、機能的特性を変化させた（例えば、結合を改善するか、安定性を改善するか、抗原性を低減するか、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける安定性を増大させた）１または複数の抗体を同定するために、改変抗体を評価する。１つの実装では、ディスプレイライブラリー技術を使用して、改変抗体のプールを選択またはスクリーニングする。次いで、例えば、より高度なストリンジェンシー条件またはより競合的な結合条件および洗浄条件を使用することにより、より高アフィニティーの抗体を第２のライブラリーから同定する。また、他のスクリーニング法も使用することができる。
【００６５】
いくつかの実装では、変異誘発は、結合性界面にあることが公知であるかまたはその可能性がある領域を標的とする。例えば、同定された結合性タンパク質が抗体であれば、変異誘発を、本明細書で記載される重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域に向かわせることができる。さらに、変異誘発は、ＣＤＲの近傍であるかまたはこれに隣接するフレームワーク領域、例えば、特に、ＣＤＲ接合部から１０、５、または３アミノ酸内のフレームワーク領域にも向かわせることができる。抗体の場合はまた、例えば、段階的な改善を施すように、変異誘発を、ＣＤＲのうちの１または少数へと限定することもできる。
【００６６】
一実施形態では、変異誘発を使用して、抗体を、１または複数の生殖細胞系列の配列へとより類似させる。１つの例示的な、生殖細胞系列にする（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）方法は、単離抗体の配列と類似する（例えば、特定のデータベース内で最も類似する）１または複数の生殖細胞系列の配列を同定するステップを含みうる。次いで、変異（アミノ酸レベルにおける）を、単離抗体内に、付加的に施すこともでき、組合せで施すこともでき、これらの両方により施すこともできる。例えば、一部または全部の可能な生殖細胞系列の変異をコードする配列を含む核酸ライブラリーを作製する。次いで、例えば、単離抗体と比べて１または複数のさらなる生殖細胞系列の残基を有し、かつ、なおも有用な（例えば、機能的活性を有する）抗体を同定するために、変異抗体を評価する。一実施形態では、可能な限り多くの生殖細胞系列の残基を、単離抗体へと導入する。
【００６７】
一実施形態では、変異誘発を使用して、１または複数の生殖細胞系列の残基を、ＣＤＲ領域へと置換または挿入する。例えば、生殖細胞系列のＣＤＲ残基は、改変される可変領域と類似する（例えば、最も類似する）生殖細胞系列の配列に由来しうる。変異誘発の後、生殖細胞系列の１または複数の残基が許容されるのかどうかを決定するために、抗体の活性（例えば、結合活性または他の機能的活性）を評価することができる。同様の変異誘発を、フレームワーク領域内でも実施することができる。
【００６８】
生殖細胞系列の配列の選択は、異なる様式で実施することができる。例えば、生殖細胞系列の配列は、それが、選択性または類似性についての所定の基準、例えば、非ヒトドナー抗体と比べた、少なくともある百分率の同一性、例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％の同一性を満たす場合に選択することができる。選択は、少なくとも２、３、５、または１０の生殖細胞系列の配列を使用して実施することができる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合、類似する生殖細胞系列の配列の同定は、１つのこのような配列の選択を含みうる。ＣＤＲ３の場合、類似する生殖細胞系列の配列の同定は、１つのこのような配列の選択を含みうるが、アミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に個別に寄与する２つの生殖細胞系列の配列の使用も含みうる。他の実装では、１つまたは２つより多い生殖細胞系列の配列を使用して、例えば、コンセンサス配列を形成する。
【００６９】
２つの配列の間の「配列同一性」の計算は、以下の通りに実施する。配列を、最適な比較を目的として整列させる（例えば、最適なアライメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、相同でない配列は、比較の目的で無死することができる）。ギャップペナルティーを１２とし、ギャップ伸長ペナルティーを４とし、フレームシフトギャップペナルティーを５とする、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリング行列を伴う、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して、最適なアライメントを、最良のスコアとして決定する。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されていれば、その位置において、分子は同一である。２つの配列の間のパーセント同一性とは、配列により共有された同一な位置の数の関数である。
【００７０】
他の実施形態では、抗体は、グリコシル化パターンを変化させる（すなわち、元のグリコシル化パターンまたは天然のグリコシル化パターンから変化させる）ように改変することができる。この文脈で使用される「変化させた」とは、１もしくは複数の炭水化物部分を欠失させ、かつ／または１もしくは複数のグリコシル化部位を元の抗体に付加することを意味する。本明細書で開示される抗体へのグリコシル化部位の付加は、グリコシル化部位のコンセンサス配列を含有するように、アミノ酸配列を変化させることにより達成することができ、当技術分野では、このような技法が周知である。抗体上の炭水化物部分の数を増大させる別の手段は、グリコシドの、抗体のアミノ酸残基への、化学的カップリングまたは酵素的カップリングによる。これらの方法は、例えば、ＷＯ８７／０５３３０、ならびにAplinおよびWriston（１９８１年）、CRC  Crit.  Rev.  Biochem.、２２巻：２５９〜３０６頁において記載されている。抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、当技術分野において記載されている（Hakimuddinら（１９８７年）、Arch.  Biochem.  Biophys.、２５９巻：５２頁；Edgeら（１９８１年）、Anal.  Biochem.、１１８巻：１３１頁；およびThotakuraら（１９８７年）、Meth.  Enzymol.、１３８巻：３５０頁）通り、化学的にまたは酵素的に達成することができる。例えば、サルベージ受容体結合性エピトープを施すことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長する修飾については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【００７１】
一実施形態では、抗体は、ＢＩＩＢ０５９モノクローナル抗体のＣＤＲ配列と異なるＣＤＲ配列（例えば、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲまたはＫａｂａｔによるＣＤＲ）を有する。ＢＩＩＢ０５９モノクローナル抗体のＣＤＲ配列と異なるＣＤＲ配列は、ＣＤＲが、５〜７アミノ酸の長さである場合は、１、２、３、もしくは４カ所のアミノ酸の置換などのアミノ酸変化を含むか、またはＣＤＲが、１０アミノ酸以上の長さである場合は、ＣＤＲの配列内のアミノ酸のうちの１、２、３、４、５、６、もしくは７カ所の置換を含む。置換されたアミノ酸は、同様の電荷特徴、疎水性特徴、または立体化学的特徴を有しうる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換(複数可)は、保存的置換である。他の実施形態では、アミノ酸置換(複数可)は、非保存的置換である。このような置換は、当業者の通常の技術の範囲内にある。置換ＣＤＲを含有する抗体またはその抗体断片をスクリーニングして、本明細書で記載される特色（例えば、Ｉ型インターフェロンまたはＩＩＩ型インターフェロン、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１−α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０の産生／分泌を低減すること；ｐＤＣを枯渇させること；ＢＤＣＡ２の細胞外ドメインへの結合について、ＢＩＩＢ０５９と競合すること；ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルＢＤＣＡ２の外部ドメインには選択的に結合するが、ラットＣｌｅｃ４ｂ２には結合しないか、またはヒトＢＤＣＡ２、カニクイザルＢＤＣＡ２、もしくはアカゲザルＢＤＣＡ２に対する場合より小さな結合アフィニティーでラットＣｌｅｃ４ｂ２に結合すること；ヒト乾癬異種移植モデルにおいて、疾患の発症を阻害すること）のうちの１または複数を有する抗体を同定することができる。
【００７２】
ＣＤＲ内の場合と異なり、フレームワーク領域（ＦＲ）の構造の、より実質的な変化は、抗体の結合特性に有害な影響を及ぼすことなくなされ得る。ＦＲに対する変化は、非ヒト由来フレームワークのヒト化、または抗原の接触もしくは結合部位の安定化に重要なある種のフレームワーク残基の操作、例えば、定常領域のクラスまたはサブクラスの変化、Ｆｃ受容体の結合などのエフェクター機能を変化させうる特定のアミノ酸残基の変化（Lundら、J.  Immun.、１４７巻：２６５７〜６２頁（１９９１年）；Morganら、Immunology、８６巻：３１９〜２４頁（１９９５年））、または定常領域が由来する種の変化を含むがこれらに限定されない。
【００７３】
抗ＢＤＣＡ２抗体は、抗ＢＤＣＡ２抗体の全長抗体の形態の場合もあり、抗ＢＤＣＡ２抗体の低分子量形態（例えば、生物学的に活性な抗体断片またはミニボディ）、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、およびｓｃ（Ｆｖ）２の場合もある。本開示により包含される他の抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＶＨまたはＶＬなど、単一の可変鎖を含有する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはその生物学的に活性な断片を含む。例えば、Mollerら、J.  Biol.  Chem.、２８５巻（４９号）：３８３４８〜３８３６１頁（２０１０年）；Harmsenら、Appl.  Microbiol.  Biotechnol.、７７巻（１号）：１３〜２２頁（２００７年）；Ｕ．Ｓ．２００５／００７９５７４；およびDaviesら（１９９６年）、Protein  Eng.、９巻（６号）：５３１〜７頁を参照されたい。全抗体と同様に、ｓｄＡｂは、特異的な抗原に選択的に結合することが可能である。分子量が１２〜１５ｋＤａに過ぎないｓｄＡｂは、一般的な抗体よりはるかに小型であり、Ｆａｂ断片および単鎖可変断片よりなお小型である。
【００７４】
本明細書では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片と、１もしくは複数のその酸性変異体との混合物を含む組成物であって、例えば、酸性変異体(複数可)の量が、約８０％、７０％、６０％、６０％、５０％、４０％、３０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満である組成物が提供される。また、少なくとも１つの脱アミド化部位を含む抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を含む組成物であって、例えば、抗ＢＤＣＡ２抗体のうちの少なくとも約９０％が、脱アミド化されない（すなわち、抗体のうちで脱アミド化されるのが約１０％未満である）ように、組成物のｐＨが、約５．０〜約６．５である組成物も提供される。ある種の実施形態では、抗体のうちで脱アミド化されるのは、約５％、３％、２％、または１％未満である。ｐＨは、５．５または６．０など、５．０〜６．０でありうる。ある種の実施形態では、組成物のｐＨは、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５である。
【００７５】
「酸性変異体」とは、対象のポリペプチドの変異体であって、対象のポリペプチドよりも酸性である（例えば、カチオン交換クロマトグラフィーにより決定される場合）変異体である。酸性変異体の例は、脱アミド化変異体である。
【００７６】
ポリペプチド分子の「脱アミド化」変異体とは、元のポリペプチドの１または複数のアスパラギン残基をアスパラギン酸へと転換したポリペプチド、すなわち、中性のアミド側鎖を、全体的な酸性特徴を有する残基へと転換したポリペプチドである。
【００７７】
抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を含む組成物に言及して本明細書で使用される「混合物」という用語は、所望の抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片および１または複数のその酸性変異体の両方の存在を意味する。酸性変異体は、主に脱アミド化抗ＢＤＣＡ２抗体を含みうるが、少量の他の酸性変異体(複数可)も伴う。
【００７８】
ある種の実施形態では、脱アミド化を消失させるように変異させた抗体の結合アフィニティー（ＫＤ）、結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ＫＤ  ｏｎ）、および／または解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ＫＤ  ｏｆｆ）は、野生型抗体のＫＤ、ＫＤ  ｏｎ、および／またはＫＤ  ｏｆｆと同様であり、例えば、差異は、約５倍、２倍、１倍（１００％）、５０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満である。
【００７９】
ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片もしくはその低分子量抗体は、ｐＤＣ上のＢＤＣＡ２に結合し、ｐＤＣによる、Ｉ型およびＩＩＩ型ＩＦＮ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ならびに他の炎症性サイトカインおよびケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３、ＭＩＰ−１β／ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、およびＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０）の産生および／または分泌を阻害または低減し；かつ／あるいはＡＤＣＣもしくはＣＤＣまたはアポトーシスによりｐＤＣを枯渇させ；かつ／あるいは全身性エリテマトーデス、皮膚ループス、円板状ループス、ループス腎炎、強皮症、斑状強皮症、関節リウマチ、多発性筋炎−皮膚筋炎、乾癬、シェーグレン症候群、血管炎、およびＩ型糖尿病のうちの１もしくは複数を有するヒト患者またはそれらの動物モデルへと投与されると、症状の重症度を軽減する。一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片もしくはその低分子量抗体は、ヒト乾癬異種移植モデル（Nestleら、J.  Exp.  Med.、２０２巻（１号）：１３５〜１４３頁（２００５年））における疾患の発症を阻害する。抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片もしくはその低分子量抗体のこれらの特色は、実施例において記載されている方法に従って測定しうるほか、当技術分野で公知の他の方法により測定することもできる。
【００８０】
抗体断片
抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｃｂ、およびＦｖ）は、インタクトな抗体をタンパク質分解性消化することにより調製することができる。例えば、抗体断片は、全抗体を、パパイン、ペプシン、またはプラスミンなどの酵素で処理することにより得ることができる。全抗体をパパイン消化することにより、Ｆ（ａｂ）２断片またはＦａｂ断片が生成し、全抗体をペプシン消化することにより、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ’がもたらされ、全抗体をプラスミン消化することにより、Ｆａｃｂ断片がもたらされる。
【００８１】
代替的に、抗体断片は、組換えにより作製することもできる。例えば、対象の抗体断片をコードする核酸を構築し、発現ベクターへと導入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる。例えば、Co,  M.S.ら、J.  Immunol.、１５２巻：２９６８〜２９７６頁（１９９４年）；Better,  M.およびHorwitz,  A.H.、Methods  in  Enzymology、１７８巻：４７６〜４９６頁（１９８９年）；Plueckthun,  A.およびSkerra,  A.、Methods  in  Enzymology、１７８巻：４７６〜４９６頁（１９８９年）；Lamoyi,  E.、Methods  in  Enzymology、１２１巻：６５２〜６６３頁（１９８９年）；Rousseaux,  J.ら、Methods  in  Enzymology、（１９８９年）、１２１巻：６６３〜６６９頁（１９８９年）；およびBird,  R.E.ら、TIBTECH、９巻：１３２〜１３７頁（１９９１年）を参照されたい。抗体断片は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現させ、Ｅ．ｃｏｌｉから分泌させることができ、これにより、大量のこれらの断片の容易な産生が可能となる。抗体断片は、抗体ファージライブラリーから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ）２断片を形成することもできる（Carterら、Bio/Technology、１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年））。別の手法によれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長したＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片であって、サルベージ受容体結合性エピトープ残基を含むＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号において記載されている。
【００８２】
ミニボディ
抗ＢＤＣＡ２抗体のミニボディは、ダイアボディ、単鎖（ｓｃＦｖ）、および単鎖（Ｆｖ）２（ｓｃ（Ｆｖ）２）を含む。
【００８３】
「ダイアボディ」とは、遺伝子融合により構築される二価ミニボディである（例えば、Holliger,  P.ら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.  S.  A.、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）；ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照されたい）。ダイアボディとは、２つのポリペプチド鎖からなる二量体である。ダイアボディの各ポリペプチド鎖のＶＬドメインとＶＨドメインとは、リンカーで結合させる。リンカーを構成するアミノ酸残基の数は、２つ〜１２の間の残基（例えば、３つ〜１０の残基、または５つの残基もしくは約５つの残基）でありうる。ダイアボディ内のポリペプチドのリンカーは、ＶＬとＶＨとが互いに結合することを可能とするには短すぎることが典型的である。したがって、同じポリペプチド鎖内でコードされるＶＬおよびＶＨは、単鎖可変領域断片を形成することが可能ではないが、代わりに、異なる単鎖可変領域断片とともに二量体を形成しうる。結果として、ダイアボディは、２つの抗原結合部位を有する。
【００８４】
ｓｃＦｖとは、ＶＨとＶＬとをリンカーで連結することにより得られる単鎖ポリペプチド抗体である（例えば、Hustonら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.  S.  A.、８５巻：５８７９〜５８８３頁（１９８８年）；ならびにPlickthun、「The  Pharmacology  of  Monoclonal  Antibodies」、１１３巻、ResenburgおよびMoore編、Springer  Verlag、New  York、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい）。ＶＨとＶＬとを連結する順序は、特に限定されておらず、任意の順序で配置することができる。配置の例は、［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］、または［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］を含む。ｓｃＦｖ内のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書で記載される任意の抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片に由来しうる。
【００８５】
ｓｃ（Ｆｖ）２とは、２つのＶＨと２つのＶＬとをリンカーにより連結して、単鎖を形成するミニボディである（Hudson、ら、J.  Immunol.  Methods（１９９９年）、２３１巻：１７７〜１８９頁（１９９９年））。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、ｓｃＦｖをリンカーで接続することにより調製することができる。本発明のｓｃ（Ｆｖ）２は、好ましくは、２つのＶＨおよび２つのＶＬが、単鎖ポリペプチドのＮ末端から始めて、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ、およびＶＬ（［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］）の順序で配置された抗体を含むが、２つのＶＨおよび２つのＶＬの順序は、上記の配置に限定されず、任意の順序で配置することができる。配置の例を下記に列挙する。
【化４】
2019146567.tif 000014
通常、４つの抗体可変領域を連結する場合は、３つのリンカーが必要とされ、使用されるリンカーは、同一な場合もあり、異なる場合もある。ミニボディのＶＨ領域とＶＬ領域とを連結するリンカーについて特定の限定はない。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。約３〜２５残基（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８残基）を含む任意のいかなる単鎖ペプチドも、リンカーとして使用することができる。このようなペプチドリンカーの例は、Ser;  Gly  Ser;  Gly  Gly  Ser;  Ser  Gly  Gly;  Gly  Gly  Gly  Ser  (配列番号13);  Ser  Gly  Gly  Gly  (配列番号14);  Gly  Gly  Gly  Gly  Ser  (配列番号15);  Ser  Gly  Gly  Gly  Gly  (配列番号16);  Gly  Gly  Gly  Gly  Gly  Ser  (配列番号17);  Ser  Gly  Gly  Gly  Gly  Gly  (配列番号18);  Gly  Gly  Gly  Gly  Gly  Gly  Ser  (配列番号19);  Ser  Gly  Gly  Gly  Gly  Gly  Gly  (配列番号20);  (Gly  Gly  Gly  Gly  Ser  (配列番号21)n［配列中、ｎは、１または複数の整数である］；
および
（Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号２２）ｎ
［配列中、ｎは、１または複数の整数である］
を含む。
【００８６】
ある種の実施形態では、リンカーは、合成化合物リンカー（化学的架橋剤）である。市販されている架橋剤の例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ：Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルタータレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタータレート（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、およびビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）を含む。
【００８７】
ミニボディ内のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加、および／または挿入などの改変を含みうる。例えば、改変は、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢＩＩＢ０５９）のＣＤＲのうちの１または複数においてであり得る。ある種の実施形態では、改変は、抗ＢＤＣＡ２ミニボディのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの１または複数のＣＤＲ内の、１、２、または３カ所のアミノ酸置換を有する。このような置換は、抗ＢＤＣＡ２ミニボディの結合活性および／または機能活性を改善するようになされる。他の実施形態では、ＶＨとＶＬとを会合させたときにＢＤＣＡ２に対する結合活性および／または機能活性が存在する限りにおいて、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢＩＩＢ０５９）のＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つのアミノ酸を、欠失させることもでき、付加することもできる。
【００８８】
二重特異性抗体
二重特異性抗体とは、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＢＤＣＡ２タンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では、ＢＤＣＡ２結合部位を、別のタンパク質に対する結合部位と組み合わせることができる。二重特異性抗体は、全長抗体またはその低分子量形態（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体、ｓｃ（Ｆｖ）２二重特異性抗体、ダイアボディ二重特異性抗体）として調製することができる。
【００８９】
全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Millsteinら、Nature、３０５巻：５３７〜５３９頁（１９８３年））。異なる手法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列へと融合させる。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡを、個別の発現ベクターへと挿入し、適切な宿主細胞へと共トランスフェクトする。これにより、３つのポリペプチド断片の比率の調整においてより大きな柔軟性がもたらされる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比での発現の結果として、高収量がもたらされる場合は、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を、単一の発現ベクターへと挿入することも可能である。
【００９０】
米国特許第５，７３１，１６８号において記載されている別の手法によれば、抗体分子の対の間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大化することができる。好ましい界面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面に由来する１または複数の小型のアミノ酸側鎖を、大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置きかえる。大型のアミノ酸側鎖を、小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置きかえることにより、大型の側鎖とサイズが同一であるかまたは類似の代償的「凹部（ｃａｖｉｔｙ）」を、第２の抗体分子の界面上に作製する。これにより、ヘテロ二量体の収量を、ホモ二量体など、他の望ましくない最終生成物を上回って増加させるための機構がもたらされる。
【００９１】
二重特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方は、アビジンへとカップリングすることができ、他方は、ビオチンへとカップリングすることができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製することができる。
【００９２】
「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替の機構を提供する。断片は、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーによりＶＬへと接続されたＶＨを含む。したがって、１つの断片のＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合するように強制され、これにより、２つの抗原結合部位を形成する。
【００９３】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現させる細胞により、二価抗体より速く内部移行され（かつ／または異化され）うる。本明細書で記載される抗体は、３つ以上の抗原結合部位を伴う多価抗体（例えば、四価抗体）であって、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によりたやすく作製しうる多価抗体でありうる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含みうる。例示的な二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはこれらからなる）。多価抗体は、３〜約８つ（例えば、４つ）の抗原結合部位を含みうる（またはこれらからなることが可能である）。多価抗体は、必要に応じて、少なくとも１つのポリペプチド鎖（例えば、少なくとも２つのポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖(複数可)は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖(複数可)は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃ［配列中、ＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域のポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸スペーサーまたはペプチドスペーサーを表し、ｎは、０または１である］を含みうる。
【００９４】
コンジュゲート抗体
本明細書で開示される抗体は、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧで改変されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ＰＥＩ−ＰＥＧ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー）、ヒアルロン酸、放射性材料（例えば、９０Ｙ、１３１Ｉ）蛍光物質、発光物質、ハプテン、酵素、金属キレート剤、薬物、および毒素（例えば、カリケアマイシン（calcheamicin）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属外毒素Ａ、リシン（例えば、脱グリコシル化リシンＡ鎖））などの高分子物質を含む多様な分子に結合させたコンジュゲート抗体でありうる。
【００９５】
一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体の細胞傷害作用を改善し、その結果、それらの治療有効性を改善するため、抗体を、放射性同位元素および細胞傷害剤を含む、毒性の大きな物質とコンジュゲートさせる。これらのコンジュゲートは、毒性負荷を標的部位（すなわち、抗体により認識される抗原を発現させる細胞）へと選択的に送達しうる一方で、抗体により認識されない細胞は対象としない。毒性を最小化するために、コンジュゲートは一般に、血清半減期の短い分子に基づき操作する（したがって、マウス配列およびＩｇＧ３アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプを使用する）。
【００９６】
ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、循環中、例えば、血中、血清中、または他の組織内のその安定化および／または保持を、例えば、少なくとも１．５、２、５、１０、または５０倍改善する部分により改変する。例えば、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドなど、実質的に非抗原性のポリマーと会合させる（例えば、コンジュゲートさせる）ことができる。適切なポリマーは、重量により実質的に変化する。数平均分子量が約２００〜約３５，０００ダルトン（または約１，０００〜約１５，０００、および２，０００〜約１２，５００ダルトン）の範囲のポリマーを使用することができる。例えば、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、水溶性ポリマー、例えば、親水性のポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンとコンジュゲートさせることができる。このようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化（polyoxyethylenated）ポリオール、これらのコポリマー、およびブロックコポリマーの水溶性が維持されると仮定した場合の、これらのブロックコポリマーなどのポリアルキレンオキシドホモポリマーを含む。さらなる有用なポリマーは、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ならびにポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロックコポリマーなどのポリオキシアルキレン；ポリメタクリレート；カルボマー；ならびに分枝状または非分枝状の多糖を含む。
【００９７】
上記で記載したコンジュゲート抗体は、本明細書で記載される抗体またはその低分子量形態に対して、化学修飾を実施することにより調製することができる。当技術分野では、抗体を改変するための方法が周知である（例えば、ＵＳ５０５７３１３およびＵＳ５１５６８４０）。
【００９８】
抗体を作製する方法
抗体は、細菌細胞内または真核細胞内で作製することができる。いくつかの抗体、例えば、Ｆａｂ’は、細菌細胞内、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内で作製することができる。抗体はまた、形質転換細胞系（例えば、ＣＨＯ、２９３Ｅ、ＣＯＳ）などの真核細胞内でも作製することができる。加えて、抗体（例えば、ｓｃＦｖ’）は、Ｐｉｃｈｉａ属（例えば、Powersら、J  Immunol  Methods.、２５１巻：１２３〜３５頁（２００１年）を参照されたい）、Ｈａｎｓｅｕｌａ属、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの酵母細胞内でも発現させることができる。対象の抗体を作製するには、抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、発現ベクターへと導入し、次いで、適切な宿主細胞内で発現させる。標準的な分子生物学法を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、抗体を回収する。
【００９９】
抗体を、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させる場合、発現ベクターは、細菌細胞内のベクターの増幅を可能とする特徴を有するものとする。加えて、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、またはＸＬ１−ＢｌｕｅなどのＥ．ｃｏｌｉを、宿主として使用する場合、ベクターは、プロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Wardら、３４１巻：５４４〜５４６頁（１９８９年））、ａｒａＢプロモーター（Betterら、Science、２４０巻：１０４１〜１０４３頁（１９８８年））、またはＥ．ｃｏｌｉにおける効率的な発現を可能としうるＴ７プロモーターを有さなければならない。このようなベクターの例は、例えば、Ｍ１３シリーズのベクター、ｐＵＣシリーズのベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この発現ベクターを使用する場合、宿主は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現させるＢＬ２１であることが好ましい）を含む。発現ベクターは、抗体を分泌するためのシグナル配列を含有しうる。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムへと産生させるには、ｐｅｌＢシグナル配列（Leiら、J.  Bacteriol.、１６９巻：４３７９頁（１９８７年））を、抗体を分泌するためのシグナル配列として使用することができる。細菌による発現のためには、塩化カルシウム法または電気穿孔法を使用して、発現ベクターを細菌細胞へと導入することができる。
【０１００】
抗体を、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞内で発現させる場合、発現ベクターは、これらの細胞内の発現に必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Mulliganら、Nature、２７７巻：１０８頁（１９７９年））、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushimaら、Nucleic  Acids  Res.、１８巻：５３２２頁（１９９０年））、またはＣＭＶプロモーターを含む。免疫グロブリンまたはそのドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞内のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子などのさらなる配列も保有しうる。選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を容易とする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターを導入した宿主細胞に対して付与することが典型的である。選択マーカーを伴うベクターの例は、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３を含む。
【０１０１】
一実施形態では、抗体は、哺乳動物細胞内で産生させる。抗体を発現させるための例示的な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、KaufmanおよびSharp（１９８２年）、Mol.  Biol.、１５９巻：６０１〜６２１頁において記載されている通り、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、UrlaubおよびChasin（１９８０年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、７７巻：４２１６〜４２２０頁において記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞（例えば、２９３細胞、２９３Ｅ細胞、２９３Ｔ細胞）、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、リンパ球細胞系、例えば、ＮＳ０骨髄腫細胞およびＳＰ２細胞、ならびにトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニック哺乳動物に由来する細胞を含む。例えば、細胞は、乳腺上皮細胞である。
【０１０２】
抗体を発現させるための例示的な系では、抗ＢＤＣＡ２抗体（例えば、ＢＩＩＢ０５９）の抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介型トランスフェクションにより、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞へと導入する。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子の各々を、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント、またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなど、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来する）へと作動的に連結して、高レベルの遺伝子の転写を駆動する。組換え発現ベクターはまた、メトトレキサートによる選択／増幅を使用するベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能とするＤＨＦＲ遺伝子も保有する。選択された形質転換体の宿主細胞を培養して、抗体の重鎖および軽鎖の発現を可能とし、抗体を、培養培地から回収する。
【０１０３】
抗体はまた、トランスジェニック動物によって産生させることもできる。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号は、抗体をトランスジェニック哺乳動物の乳腺内で発現させる方法について記載している。ミルク特異的プロモーター、ならびに対象の抗体および分泌のためのシグナル配列をコードする核酸を含む導入遺伝子を構築する。このようなトランスジェニック哺乳動物の雌により産生されるミルクは、その中に分泌された対象の抗体を含む。抗体は、ミルクから精製することもでき、いくつかの適用では、直接使用することもできる。また、本明細書で記載される核酸のうちの１または複数を含む動物も提供される。
【０１０４】
本開示の抗体は、宿主細胞の内部から単離することもでき、宿主細胞の外部（培地など）から単離することもでき、実質的に純粋で均一の抗体として精製することができる。抗体を単離および精製するためには、抗体を精製するために一般に使用される単離および精製のための方法を使用することができ、いかなる特定の方法にも限定されない。抗体は、例えば、カラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、および再結晶化を適切に選択し、組み合わせることにより、単離および精製することができる。クロマトグラフィーは、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィー（Strategies  for  Protein  Purification  and  Characterization:  A  Laboratory  Course  Manual、Daniel  R.  Marshakら編、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９９６年）を含む。クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーを使用して実行することができる。アフィニティークロマトグラフィーに使用されるカラムは、プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムを含む。プロテインＡカラムを使用するカラムの例は、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。本開示はまた、これらの精製法を使用して高度に精製された抗体も含む。
【０１０５】
抗体の特徴付け
本明細書で記載される抗体のＢＤＣＡ２結合特性は、任意の標準的方法、例えば、以下の方法：ＯＣＴＥＴ（登録商標）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）解析、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素イムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のうちの１または複数により測定することができる。
【０１０６】
対象のタンパク質（抗ＢＤＣＡ２抗体）と、標的（例えば、ＢＤＣＡ２）との結合相互作用は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムを使用して解析することができる。この方法では、ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製の測定器の複数の変形物（例えば、ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＱＫｅおよびＱＫ）のうちの１つを使用して、タンパク質間相互作用、結合特異性、およびエピトープマッピングを決定する。ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムは、カスタムチップに沿って伝搬され、次いで、センサーへと戻る偏光の変化を測定することにより、リアルタイムの結合をモニタリングする容易な方法を提供する。
【０１０７】
対象のタンパク質（抗ＢＤＣＡ２抗体）と、標的（例えば、ＢＤＣＡ２）との結合相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して解析することができる。ＳＰＲまたは生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）では、生体特異的な相互作用を、相互作用物質のうちのいずれも標識せずに、リアルタイムで検出する。ＢＩＡチップの結合表面における質量の変化（結合イベントを示す）は、表面の近傍における光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）を結果としてもたらす。屈折度の変化は、生体分子間のリアルタイムの反応の指標として測定される、検出可能なシグナルを発生させる。ＳＰＲを使用するための方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Raether（１９８８年）、Surface  Plasmons、Springer  Verlag；SjolanderおよびUrbaniczky（１９９１年）、Anal.  Chem.、６３巻：２３３８〜２３４５頁；Szaboら（１９９５年）、Curr.  Opin.  Struct.  Biol.、５巻：６９９〜７０５頁；ならびにＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により提供されているオンラインリソースにおいて記載されている。ＳＰＲからの情報を使用して、生体分子の標的への結合についての平衡解離定数（Ｋｄ）ならびにＫｏｎおよびＫｏｆｆを含む反応速度パラメータについての正確で定量的な尺度を得ることができる。
【０１０８】
エピトープはまた、ＢＩＡＣＯＲＥクロマトグラフィー法（Pharmacia  BIAtechnology  Handbook、「Epitope  Mapping」、６．３．２節（１９９４年５月）；また、Johneら（１９９３年）、J.  Immunol.  Methods、１６０巻：１９１〜１９８頁も参照されたい）を使用して、ヒトＢＤＣＡ２への結合について互いに競合する、異なる抗体の能力を評価することにより直接マッピングすることもできる。
【０１０９】
酵素イムノアッセイを援用する場合、抗体を含有する試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清または精製抗体を、抗原でコーティングされたプレートへと添加する。アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄後、ｐ−ニトロフェニルホスフェートなどの酵素基質を添加し、吸光度を測定して、抗原への結合活性を評価する。
【０１１０】
抗体の評価、例えば、ウェスタンブロットおよび免疫沈降アッセイのためのさらなる一般的な指針は、Antibodies:  A  Laboratory  Manual、HarlowおよびLane編、Cold  Spring  Harbor  press（１９８８年）において見出すことができる。
【０１１１】
寄託物
マウスハイブリドーマＢＤＣＡ２−１Ｐ２４Ｆ４．１．１．１と命名された、抗ＢＤＣＡ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従い、２０１３年１月１５日において、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されており、受託番号ＰＴＡ−１３４５０を保有している。本明細書に対して交付される特許の期限が切れる以前において、要求されたときに、寄託物の状態に起因して、受託者が試料を提供することが不可能な場合、出願人らは、寄託物を置きかえる彼らの義務について承知している。出願人らはまた、その時点で寄託物が一般に入手可能となる、このような特許の交付について、ＡＴＣＣに通知する彼らの責任についても承知している。その時点に先立ち、寄託物は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４および３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２の条項に従い、Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓに入手可能となる。
【０１１２】
エフェクター機能を変化させた抗体
抗体および抗体−抗原複合体の、免疫系細胞との相互作用は、本明細書でエフェクター機能と称する様々な応答を誘発する。免疫介在性エフェクター機能は、２つの主要な機構：抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を含む。それらのいずれもが、免疫グロブリンタンパク質の定常領域に媒介されている。したがって、抗体のＦｃドメインとは、免疫エフェクター機構との相互作用を規定する部分である。
【０１１３】
ＩｇＧ抗体は、細胞表面Ｆｃγ受容体のファミリーのメンバーおよび補体系のＣ１ｑに結合することにより、免疫系のエフェクター経路を活性化させる。クラスタリングした抗体により、エフェクタータンパク質がライゲーションされると、炎症性サイトカインの放出、抗原産生の調節、エンドサイトーシス、および細胞の死滅化を含む様々な応答が誘発される。いくつかの臨床適用では、これらの応答は、モノクローナル抗体の有効性に極めて重要である。他の臨床適用では、これらの応答は、炎症および抗原保有細胞の消失など、望ましくない副作用を惹起する。したがって、本発明はさらに、エフェクター機能を変化させた、例えば、エフェクター機能を増大させるかまたは低減した、抗体を含むＢＤＣＡ２結合性タンパク質にも関する。
【０１１４】
本発明の抗ＢＤＣＡ２抗体のエフェクター機能は、多くの公知のアッセイのうちの１つを使用して決定することができる。抗ＢＤＣＡ２抗体のエフェクター機能は、第２の抗ＢＤＣＡ２抗体と比べて増大させることもでき、低減することもできる。いくつかの実施形態では、第２の抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＤＣＡ２に特異的に結合する任意の抗体でありうる。他の実施形態では、第２のＢＤＣＡ２特異的抗体は、ＢＩＩＢ０５９など、本発明の抗体のうちのいずれかでありうる。対象の抗ＢＤＣＡ２抗体が、エフェクター機能を増大させるかまたは低減するように改変された、他の実施形態では、第２の抗ＢＤＣＡ２抗体は、改変されない場合もあり、抗体の親型の場合もある。
【０１１５】
エフェクター機能は、抗体が、細胞傷害性Ｔ細胞上、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上、またはマクロファージ上のＦｃ受容体に結合することから、細胞死がもたらされる、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）と、補体カスケードの活性化を介して誘導される細胞死である補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）とを含む（Daeron、Annu.  Rev.  Immunol.、１５巻：２０３〜２３４頁（１９９７年）；WardおよびGhetie、Therapeutic  Immunol.、２巻：７７〜９４頁（１９９５年）；ならびにRavetchおよびKinet、Annu.  Rev.  Immunol.、９巻：４５７〜４９２頁（１９９１年）において総説されている）。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、当技術分野で公知の標準的アッセイ（例えば、ＷＯ０５／０１８５７２、ＷＯ０５／００３１７５、およびＵ．Ｓ．６，２４２，１９５を参照されたい）を使用して評価することができる。
【０１１６】
エフェクター機能は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、または単鎖Ｆｖなど、Ｆｃドメインを欠く抗体断片を使用することにより回避することができる。代替法は、ＦｃγＲＩには結合するが、Ｃ１ｑならびにＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩにはそれほど結合しない、ＩｇＧ４サブタイプ抗体を使用することである。また、ＩｇＧ２サブタイプも、Ｆｃ受容体への結合は低減されているが、ＦｃγＲＩＩａのアロタイプであるＨ１３１およびＣ１ｑへの著明な結合は保持する。したがって、全てのＦｃ受容体およびＣ１ｑへの結合を消失させるには、Ｆｃ配列のさらなる変化が必要とされる。
【０１１７】
ＡＤＣＣを含む、複数の抗体エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に媒介されている。特定のＦｃＲに対する抗体のアフィニティーは、抗体のＦｃおよび／または定常領域のアミノ酸配列および／または翻訳後修飾を変化させることによりモジュレートすることができ、よって、抗体に媒介されるエフェクター活性もこれによりモジュレートすることができる。
【０１１８】
ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性により定義される。ＩｇＧ抗体のＦｃ受容体は、ＦｃγＲと称し、ＩｇＥ抗体のＦｃ受容体は、ＦｃεＲと称し、ＩｇＡ抗体のＦｃ受容体は、ＦｃαＲと称するなどである。ＦｃγＲの３つのサブクラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が同定されている。ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩのいずれも、２つの種類：ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）およびＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）；ならびにＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）を有する。各ＦｃγＲのサブクラスは、２つまたは３つの遺伝子によりコードされており、代替のＲＮＡスプライシングは、複数の転写物をもたらすため、ＦｃγＲアイソフォームには広範な多様性が存在する。例えば、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、アイソフォームＩＩａ、ＩＩｂ１、ＩＩｂ２、ＩＩｂ３、およびＩＩｃを含む。
【０１１９】
ヒト抗体上およびマウス抗体上の、ＦｃγＲに対する結合部位は、残基２３３〜２３９（Kabatら、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、５版、Public  Health  Service、National  Institutes  of  Health、Bethesda、Md.（１９９１年）；Woofら、Molec.  Immunol.、２３巻：３１９〜３３０頁（１９８６年）；Duncanら、Nature、３３２巻：５６３頁（１９８８年）；CanfieldおよびMorrison、J.  Exp.  Med.、１７３巻：１４８３〜１４９１頁（１９９１年）；Chappelら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci  USA、８８巻：９０３６〜９０４０頁（１９９１年）におけるＥＵインデックスによる番号付け）からなる、いわゆる「下部ヒンジ領域」へと既にマッピングされている。残基２３３〜２３９のうち、Ｐ２３８およびＳ２３９は、結合におそらく関与していると言及されている残基中の残基である。ＦｃγＲへの結合におそらく関与している、他の既に言及されているエリアは、ヒトＦｃγＲＩに対するＧ３１６〜Ｋ３３８（ヒトＩｇＧ）（Woofら、Mol.  Immunol.、２３巻：３１９〜３３０頁（１９８６年））；ヒトＦｃγＲＩＩＩに対するＫ２７４〜Ｒ３０１（ヒトＩｇＧ１）（Sarmayら、Molec.  Immunol.、２１巻：４３〜５１頁（１９８４年））；およびヒトＦｃγＲＩＩＩに対するＹ４０７〜Ｒ４１６（ヒトＩｇＧ）（Gergelyら、Biochem.  Soc.  Trans.、１２巻：７３９〜７４３頁（１９８４年）、およびShieldsら、J  Biol  Chem、２７６巻：６５９１〜６６０４頁（２００１年）、Lazar  GAら、Proc  Natl  Acad  Sci、１０３巻：４００５〜４０１０頁（２００６年））である。ＦｃＲ結合に関与する、これらおよび他のアミノ酸残基の連なりまたは領域は、Ｉｇ−ＦｃＲ複合体の結晶構造の試験（例えば、Sondermannら、２０００年、Nature、４０６巻（６７９３号）：２６７〜７３頁；およびSondermannら、２００２年、Biochem  Soc  Trans.、３０巻（４号）：４８１〜６頁を参照されたい）により、当業者には自明でありうる。したがって、本発明の抗ＢＤＣＡ２抗体は、前述の残基のうちの１または複数の改変（必要な場合、エフェクター機能を増大または減少させる改変）を含む。
【０１２０】
モノクローナル抗体のエフェクター機能を変化させるための別の手法は、エフェクター結合相互作用に関与する、モノクローナル抗体の表面におけるアミノ酸を変異させることを含む（Lund,  J.ら（１９９１年）、J.  Immunol.、１４７巻（８号）：２６５７〜６２頁；Shields,  R.  L.ら（２００１年）、J.  Biol.  Chem.、２７６巻（９号）：６５９１〜６０４頁）。
【０１２１】
当技術分野では、抗体のエフェクター機能を増大させる方法が周知である（例えば、Kelleyら、Methods  Mol.  Biol.、９０１巻：２７７〜９３頁（２０１２年）；Natsumeら、Drug  Des  Devel  Ther.、３巻：７〜１６頁（２００９年）；ＵＳ８，１８８，２３１、ＵＳ７，９６０，５１２を参照されたい）。一実施形態では、ＢＤＣＡ２抗体は、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２７、２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４９、２５５、２５８、２６０、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７８、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８８、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３１３、３１７、３１８、３２０、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６および３３７［ここで、Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスの番号付けである］からなる群から選択される位置において、１、２、３、４、５、６、７カ所以上のアミノ酸置換を有する。ある種の実施形態では、ＢＤＣＡ２抗体は、Ｄ２２１Ｋ、Ｄ２２１Ｙ、Ｋ２２２Ｅ、Ｋ２２２Ｙ、Ｔ２２３Ｅ、Ｔ２２３Ｋ、Ｈ２２４Ｅ、Ｈ２２４Ｙ、Ｔ２２５Ｅ、Ｔ２２５Ｋ、Ｔ２２５Ｗ、Ｐ２２７Ｅ、Ｐ２２７Ｇ、Ｐ２２７Ｋ、Ｐ２２７Ｙ、Ｐ２２８Ｅ、Ｐ２２８Ｇ、Ｐ２２８Ｋ、Ｐ２２８Ｙ、Ｐ２３０Ａ、Ｐ２３０Ｅ、Ｐ２３０Ｇ、Ｐ２３０Ｙ、Ａ２３１Ｅ、Ａ２３１Ｇ、Ａ２３１Ｋ、Ａ２３１Ｐ、Ａ２３１Ｙ、Ｐ２３２Ｅ、Ｐ２３２Ｇ、Ｐ２３２Ｋ、Ｐ２３２Ｙ、Ｅ２３３Ａ、Ｅ２３３Ｄ、Ｅ２３３Ｆ、Ｅ２３３Ｇ、Ｅ２３３Ｈ、Ｅ２３３Ｉ、Ｅ２３３Ｋ、Ｅ２３３Ｌ、Ｅ２３３Ｍ、Ｅ２３３Ｎ、Ｅ２３３Ｑ、Ｅ２３３Ｒ、Ｅ２３３Ｓ、Ｅ２３３Ｔ、Ｅ２３３Ｖ、Ｅ２３３Ｗ、Ｅ２３３Ｙ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ｇ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｍ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｐ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｓ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｗ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｆ、Ｌ２３５Ｇ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｍ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｐ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｗ、Ｌ２３５Ｙ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｄ、Ｇ２３６Ｅ、Ｇ２３６Ｆ、Ｇ２３６Ｈ、Ｇ２３６Ｉ、Ｇ２３６Ｋ、Ｇ２３６Ｌ、Ｇ２３６Ｍ、Ｇ２３６Ｎ、Ｇ２３６Ｐ、Ｇ２３６Ｑ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ｓ、Ｇ２３６Ｔ、Ｇ２３６Ｖ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｙ、Ｇ２３７Ｄ、Ｇ２３７Ｅ、Ｇ２３７Ｆ、Ｇ２３７Ｈ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｋ、Ｇ２３７Ｌ、Ｇ２３７Ｍ、Ｇ２３７Ｎ、Ｇ２３７Ｐ、Ｇ２３７Ｑ、Ｇ２３７Ｒ、Ｇ２３７Ｓ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｖ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｙ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２３８Ｅ、Ｐ２３８Ｆ、Ｐ２３８Ｇ、Ｐ２３８Ｈ、Ｐ���３８Ｉ、Ｐ２３８Ｋ、Ｐ２３８Ｌ、Ｐ２３８Ｍ、Ｐ２３８Ｎ、Ｐ２３８Ｑ、Ｐ２３８Ｒ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ｔ、Ｐ２３８Ｖ、Ｐ２３８Ｗ、Ｐ２３８Ｙ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｇ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｉ、Ｓ２３９Ｋ、Ｓ２３９Ｌ、Ｓ２３９Ｍ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｐ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｒ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｖ、Ｓ２３９Ｗ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｔ、Ｆ２４１Ｄ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４１Ｓ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４３Ｅ、Ｆ２４３Ｈ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｑ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｋ２４６Ｄ、Ｋ２４６Ｅ、Ｋ２４６Ｈ、Ｋ２４６Ｙ、Ｐ２４７Ｇ、Ｐ２４７Ｖ、Ｄ２４９Ｈ、Ｄ２４９Ｑ、Ｄ２４９Ｙ、Ｒ２５５Ｅ、Ｒ２５５Ｙ、Ｅ２５８Ｈ、Ｅ２５８Ｓ、Ｅ２５８Ｙ、Ｔ２６０Ｄ、Ｔ２６０Ｅ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｙ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６２Ｆ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ａ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｅ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｇ、Ｖ２６４Ｈ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｎ、Ｖ２６４Ｐ、Ｖ２６４Ｑ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｋ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｍ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｐ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｒ、Ｄ２６５Ｓ、Ｄ２６５Ｔ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｗ、Ｄ２６５Ｙ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ｍ、Ｖ２６６Ｔ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｆ、Ｓ２６７Ｈ、Ｓ２６７Ｉ、Ｓ２６７Ｋ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｍ、Ｓ２６７Ｎ、Ｓ２６７Ｐ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｒ、Ｓ２６７Ｔ、Ｓ２６７Ｖ、Ｓ２６７Ｗ、Ｓ２６７Ｙ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ｇ、Ｈ２６８Ｉ、Ｈ２６８Ｋ、Ｈ２６８Ｌ、Ｈ２６８Ｍ、Ｈ２６８Ｐ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｒ、Ｈ２６８Ｔ、Ｈ２６８Ｖ、Ｈ２６８Ｗ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｇ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｉ、Ｅ２６９Ｋ、Ｅ２６９Ｌ、Ｅ２６９Ｍ、Ｅ２６９Ｎ、Ｅ２６９Ｐ、Ｅ２６９Ｒ、Ｅ２６９Ｓ、Ｅ２６９Ｔ、Ｅ２６９Ｖ、Ｅ２６９Ｗ、Ｅ２６９Ｙ、Ｄ２７０Ｆ、Ｄ２７０Ｇ、Ｄ２７０Ｈ、Ｄ２７０Ｉ、Ｄ２７０Ｌ、Ｄ２７０Ｍ、Ｄ２７０Ｐ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｒ、Ｄ２７０Ｓ、Ｄ２７０Ｔ、Ｄ２７０Ｗ、Ｄ２７０Ｙ、Ｐ２７１Ａ、Ｐ２７１Ｄ、Ｐ２７１Ｅ、Ｐ２７１Ｆ、Ｐ２７１Ｇ、Ｐ２７１Ｈ、Ｐ２７１Ｉ、Ｐ２７１Ｋ、Ｐ２７１Ｌ、Ｐ２７１Ｍ、Ｐ２７１Ｎ、Ｐ２７１Ｑ、Ｐ２７１Ｒ、Ｐ２７１Ｓ、Ｐ２７１Ｔ、Ｐ２７１Ｖ、Ｐ２７１Ｗ、Ｐ２７１Ｙ、Ｅ２７２Ｄ、Ｅ２７２Ｆ、Ｅ２７２Ｇ、Ｅ２７２Ｈ、Ｅ２７２Ｉ、Ｅ２７２Ｋ、Ｅ２７２Ｌ、Ｅ２７２Ｍ、Ｅ２７２Ｐ、Ｅ２７２Ｒ、Ｅ２７２Ｓ、Ｅ２７２Ｔ、Ｅ２７２Ｖ、Ｅ２７２Ｗ、Ｅ２７２Ｙ、Ｖ２７３Ｉ、Ｋ２７４Ｄ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｆ、Ｋ２７４Ｇ、Ｋ２７４Ｈ、Ｋ２７４Ｉ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｍ、Ｋ２７４Ｎ、Ｋ２７４Ｐ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｖ、Ｋ２７４Ｗ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｌ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｄ、Ｎ２７６Ｅ、Ｎ２７６Ｆ、Ｎ２７６Ｇ、Ｎ２７６���、Ｎ２７６Ｉ、Ｎ２７６Ｌ、Ｎ２７６Ｍ、Ｎ２７６Ｐ、Ｎ２７６Ｒ、Ｎ２７６Ｓ、Ｎ２７６Ｔ、Ｎ２７６Ｖ、Ｎ２７６Ｗ、Ｎ２７６Ｙ、Ｙ２７８Ｄ、Ｙ２７８Ｅ、Ｙ２７８Ｇ、Ｙ２７８Ｈ、Ｙ２７８Ｉ、Ｙ２７８Ｋ、Ｙ２７８Ｌ、Ｙ２７８Ｍ、Ｙ２７８Ｎ、Ｙ２７８Ｐ、Ｙ２７８Ｑ、Ｙ２７８Ｒ、Ｙ２７８Ｓ、Ｙ２７８Ｔ、Ｙ２７８Ｖ、Ｙ２７８Ｗ、Ｄ２８０Ｇ、Ｄ２８０Ｋ、Ｄ２８０Ｌ、Ｄ２８０Ｐ、Ｄ２８０Ｗ、Ｇ２８１Ｄ、Ｇ２８１Ｅ、Ｇ２８１Ｋ、Ｇ２８１Ｎ、Ｇ２８１Ｐ、Ｇ２８１Ｑ、Ｇ２８１Ｙ、Ｖ２８２Ｅ、Ｖ２８２Ｇ、Ｖ２８２Ｋ、Ｖ２８２Ｐ、Ｖ２８２Ｙ、Ｅ２８３Ｇ、Ｅ２８３Ｈ、Ｅ２８３Ｋ、Ｅ２８３Ｌ、Ｅ２８３Ｐ、Ｅ２８３Ｒ、Ｅ２８３Ｙ、Ｖ２８４Ｄ、Ｖ２８４Ｅ、Ｖ２８４Ｌ、Ｖ２８４Ｎ、Ｖ２８４Ｑ、Ｖ２８４Ｔ、Ｖ２８４Ｙ、Ｈ２８５Ｄ、Ｈ２８５Ｅ、Ｈ２８５Ｋ、Ｈ２８５Ｑ、Ｈ２８５Ｗ、Ｈ２８５Ｙ、Ｎ２８６Ｅ、Ｎ２８６Ｇ、Ｎ２８６Ｐ、Ｎ２８６Ｙ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｅ、Ｋ２８８Ｙ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｗ、Ｐ２９１Ｄ、Ｐ２９１Ｅ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｈ、Ｐ２９１Ｉ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｔ、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｔ、Ｒ２９２Ｙ、Ｅ２９３Ｆ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｈ、Ｅ２９３Ｉ、Ｅ２９３Ｌ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｎ、Ｅ２９３Ｐ、Ｅ２９３Ｒ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９３Ｖ、Ｅ２９３Ｗ、Ｅ２９３Ｙ、Ｅ２９４Ｆ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｈ、Ｅ２９４Ｉ、Ｅ２９４Ｋ、Ｅ２９４Ｌ、Ｅ２９４Ｍ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｓ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｅ２９４Ｗ、Ｅ２９４Ｙ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５Ｅ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｇ、Ｑ２９５Ｈ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｑ２９５Ｎ、Ｑ２９５Ｐ、Ｑ２９５Ｒ、Ｑ２９５Ｓ、Ｑ２９５Ｔ、Ｑ２９５Ｖ、Ｑ２９５Ｗ、Ｑ２９５Ｙ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｇ、Ｙ２９６Ｈ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｋ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｍ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｒ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｖ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ｎ２９７Ｆ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｈ、Ｎ２９７Ｉ、Ｎ２９７Ｋ、Ｎ２９７Ｌ、Ｎ２９７Ｍ、Ｎ２９７Ｐ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｒ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｔ、Ｎ２９７Ｖ、Ｎ２９７Ｗ、Ｎ２９７Ｙ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｅ、Ｓ２９８Ｆ、Ｓ２９８Ｈ、Ｓ２９８Ｉ、Ｓ２９８Ｋ、Ｓ２９８Ｍ、Ｓ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｑ、Ｓ２９８Ｒ、Ｓ２９８Ｔ、Ｓ２９８Ｗ、Ｓ２９８Ｙ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｇ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｑ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｗ、Ｔ２９９Ｙ、Ｙ３００Ａ、Ｙ３００Ｄ、Ｙ３００Ｅ、Ｙ３００Ｇ、Ｙ３００Ｈ、Ｙ３００Ｋ、Ｙ３００Ｍ、Ｙ３００Ｎ、Ｙ３００Ｐ、Ｙ３００Ｑ、Ｙ３００Ｒ、Ｙ３００Ｓ、Ｙ３００Ｔ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ｄ、Ｒ３０１Ｅ、Ｒ３０１Ｈ、Ｒ３０１Ｙ、Ｖ３０２Ｉ、Ｖ３０３Ｄ、Ｖ３０３Ｅ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｄ、Ｓ３０４Ｈ、Ｓ３０４Ｌ、Ｓ３０４Ｎ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ｅ、Ｖ３０５Ｔ、Ｖ３０５Ｙ、Ｗ３１３Ｆ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３１７Ｑ、Ｅ３１８Ｈ、Ｅ���１８Ｌ、Ｅ３１８Ｑ、Ｅ３１８Ｒ、Ｅ３１８Ｙ、Ｋ３２０Ｄ、Ｋ３２０Ｆ、Ｋ３２０Ｇ、Ｋ３２０Ｈ、Ｋ３２０Ｉ、Ｋ３２０Ｌ、Ｋ３２０Ｎ、Ｋ３２０Ｐ、Ｋ３２０Ｓ、Ｋ３２０Ｔ、Ｋ３２０Ｖ、Ｋ３２０Ｗ、Ｋ３２０Ｙ、Ｋ３２２Ｄ、Ｋ３２２Ｆ、Ｋ３２２Ｇ、Ｋ３２２Ｈ、Ｋ３２２Ｉ、Ｋ３２２Ｐ、Ｋ３２２Ｓ、Ｋ３２２Ｔ、Ｋ３２２Ｖ、Ｋ３２２Ｗ、Ｋ３２２Ｙ、Ｖ３２３Ｉ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｆ、Ｓ３２４Ｇ、Ｓ３２４Ｈ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｌ、Ｓ３２４Ｍ、Ｓ３２４Ｐ、Ｓ３２４Ｒ、Ｓ３２４Ｔ、Ｓ３２４Ｖ、Ｓ３２４Ｗ、Ｓ３２４Ｙ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ｆ、Ｎ３２５Ｇ、Ｎ３２５Ｈ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｋ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｍ、Ｎ３２５Ｐ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｒ、Ｎ３２５Ｓ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｗ、Ｎ３２５Ｙ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｌ、Ｋ３２６Ｐ、Ｋ３２６Ｔ、Ａ３２７Ｄ、Ａ３２７Ｅ、Ａ３２７Ｆ、Ａ３２７Ｈ、Ａ３２７Ｉ、Ａ３２７Ｋ、Ａ３２７Ｌ、Ａ３２７Ｍ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｐ、Ａ３２７Ｒ、Ａ３２７Ｓ、Ａ３２７Ｔ、Ａ３２７Ｖ、Ａ３２７Ｗ、Ａ３２７Ｙ、Ｌ３２８Ａ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｇ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｋ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｐ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ３２８Ｓ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｙ、Ｐ３２９Ｄ、Ｐ３２９Ｅ、Ｐ３２９Ｆ、Ｐ３２９Ｇ、Ｐ３２９Ｈ、Ｐ３２９Ｉ、Ｐ３２９Ｋ、Ｐ３２９Ｌ、Ｐ３２９Ｍ、Ｐ３２９Ｎ、Ｐ３２９Ｑ、Ｐ３２９Ｒ、Ｐ３２９Ｓ、Ｐ３２９Ｔ、Ｐ３２９Ｖ、Ｐ３２９Ｗ、Ｐ３２９Ｙ、Ａ３３０Ｅ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｇ、Ａ３３０Ｈ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｎ、Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｔ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｗ、Ａ３３０Ｙ、Ｐ３３１Ｄ、Ｐ３３１Ｆ、Ｐ３３１Ｈ、Ｐ３３１Ｉ、Ｐ３３１Ｌ、Ｐ３３１Ｍ、Ｐ３３１Ｑ、Ｐ３３１Ｒ、Ｐ３３１Ｔ、Ｐ３３１Ｖ、Ｐ３３１Ｗ、Ｐ３３１Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｆ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｋ、Ｉ３３２Ｌ、Ｉ３３２Ｍ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｐ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｒ、Ｉ３３２Ｓ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｖ、Ｉ３３２Ｗ、Ｉ３３２Ｙ、Ｅ３３３Ｆ、Ｅ３３３Ｈ、Ｅ３３３Ｉ、Ｅ３３３Ｌ、Ｅ３３３Ｍ、Ｅ３３３Ｐ、Ｅ３３３Ｔ、Ｅ３３３Ｙ、Ｋ３３４Ｆ、Ｋ３３４Ｉ、Ｋ３３
４Ｌ、Ｋ３３４Ｐ、Ｋ３３４Ｔ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｆ、Ｔ３３５Ｇ、Ｔ３３５Ｈ、Ｔ３３５Ｉ、Ｔ３３５Ｌ、Ｔ３３５Ｍ、Ｔ３３５Ｎ、Ｔ３３５Ｐ、Ｔ３３５Ｒ、Ｔ３３５Ｓ、Ｔ３３５Ｖ、Ｔ３３５Ｗ、Ｔ３３５Ｙ、Ｉ３３６Ｅ、Ｉ３３６Ｋ、Ｉ３３６Ｙ、Ｓ３３７Ｅ、Ｓ３３７ＨおよびＳ３３７Ｎ［ここで、Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスの番号付けである］からなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ以上を有する。特定の実施形態では、ＢＤＣＡ２抗体は、以下の変異：Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ  Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａおよび  Ｋ３３４Ａのうちの１つ、２つ、または３つを含む。
【０１２２】
オリゴ糖（とりわけ、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン内のアスパラギン２９７におけるＮ結合オリゴ糖）の存在は、ＦｃγＲならびにＣ１ｑへの結合に重要である。抗体のフコース含量を低減することにより、エフェクター機能が改善される（例えば、ＵＳ８，１６３，５５１を参照されたい）。ある種の実施形態では、ＢＤＣＡ２抗体は、フコシル化およびエフェクター機能を増大させるアミノ酸置換（例えば、以下の変異：Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａのうちの１つ、２つ、または３つ）が低減されている。エフェクター機能はまた、約６０〜２００ｎｇ／ｍＬ（例えば、６０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍｌ）の阻害剤濃度における、α−マンノシダーゼＩ阻害剤（例えば、キフネンシン）の存在下で、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体を調製し、発現させることによっても達成することができる。α−マンノシダーゼＩ阻害剤の存在下で発現させた抗体は主に、オリゴマンノース型のグリカンを含有し、一般に、ＡＤＣＣ活性およびＦｃγＲＩＩＩＡに対するアフィニティーを増大させるが、Ｃ１ｑへの結合を低減することを裏付ける。
【０１２３】
エフェクター機能を増大させた、本開示の抗ＢＤＣＡ２抗体は、１または複数のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合アフィニティーを、親抗ＢＤＣＡ２抗体または非変異体の抗ＢＤＣＡ２抗体と比べて増大させた抗体を含む。したがって、ＦｃＲへの結合アフィニティーを増大させた抗ＢＤＣＡ２抗体は、１または複数のＦｃ受容体に対する、親抗ＢＤＣＡ２抗体または非変異体の抗ＢＤＣＡ２抗体と比較して、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍以上の結合アフィニティーの増大を示す抗ＢＤＣＡ２抗体を含む。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を増大させた抗ＢＤＣＡ２抗体は、親抗体または非変異体の抗体と比べて、約１０倍高いアフィニティーでＦｃＲに結合する。他の実施形態では、エフェクター機能を増大させた抗ＢＤＣＡ２抗体は、親抗体または非変異体の抗体と比べて、約１５倍高いアフィニティーまたは約２０倍高いアフィニティーでＦｃＲに結合する。ＦｃＲ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ、ならびにこれらのアイソフォーム、ならびにＦｃεＲ、ＦｃμＲ、ＦｃδＲ、および／またはＦｃαＲのうちの１または複数でありうる。特定の実施形態では、エフェクター機能を増大させた抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＦｃγＲＩＩａに対する結合アフィニティーの、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍以上の増大を示す。
【０１２４】
エフェクター機能を低減するには、異なるサブタイプ配列セグメントの組合せ（例えば、ＩｇＧ２とＩｇＧ４との組合せ）を使用して、いずれのサブタイプ単独より大きな、Ｆｃγ受容体への結合の低減をもたらすことができる（Armourら、Eur.  J.  Immunol.、２９巻：２６１３〜１６２４頁（１９９９年）；Mol.  Immunol.、４０巻：５８５〜５９３頁（２００３年））。加えて、Ｎ結合グリコシル化の部位は、エフェクター機能を低減する手段として除去することができる。当技術分野では、Ｆｃ受容体サブタイプの一部または全部に対するアフィニティー（および、したがって、エフェクター機能）を変化させ、かつ／または低減した多数のＦｃ変異体が公知である。例えば、ＵＳ  ２００７／０２２４１８８；ＵＳ  ２００７／０１４８１７１；ＵＳ  ２００７／００４８３００；ＵＳ  ２００７／００４１９６６；ＵＳ  ２００７／０００９５２３；ＵＳ  ２００７／００３６７９９；ＵＳ  ２００６／０２７５２８３；ＵＳ  ２００６／０２３５２０８；ＵＳ  ２００６／０１９３８５６；ＵＳ  ２００６／０１６０９９６；ＵＳ  ２００６／０１３４１０５；ＵＳ  ２００６／００２４２９８；ＵＳ  ２００５／０２４４４０３；ＵＳ  ２００５／０２３３３８２；ＵＳ  ２００５／０２１５７６８；ＵＳ  ２００５／０１１８１７４；ＵＳ  ２００５／００５４８３２；ＵＳ  ２００４／０２２８８５６；ＵＳ  ２００４／１３２１０１；ＵＳ  ２００３／１５８３８９を参照されたい；ＵＳ  ７，１８３，３８７；ＵＳ  ６，７３７，０５６；ＵＳ  ６，５３８，１２４；ＵＳ  ６，５２８，６２４；ＵＳ  ６，１９４，５５１；ＵＳ  ５，６２４，８２１；ＵＳ  ５，６４８，２６０もまた参照されたい。
【０１２５】
エフェクター機能を低減した本発明の抗ＢＤＣＡ２抗体は、１または複数のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合アフィニティーを、親抗ＢＤＣＡ２抗体または非変異体の抗ＢＤＣＡ２抗体と比べて低減した抗体を含む。したがって、ＦｃＲへの結合アフィニティーを低減した抗ＢＤＣＡ２抗体は、１または複数のＦｃ受容体に対する、親抗ＢＤＣＡ２抗体または非変異体の抗ＢＤＣＡ２抗体と比較して、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍以上の結合アフィニティーの減少を示す抗ＢＤＣＡ２抗体を含む。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を低減した抗ＢＤＣＡ２抗体は、親抗体または非変異体の抗体と比べて、約１０分の１のアフィニティーでＦｃＲに結合する。他の実施形態では、エフェクター機能を低減させた抗ＢＤＣＡ２抗体は、親抗体または非変異体の抗体と比べて、約１５分の１のアフィニティーまたは約２０分の１のアフィニティーでＦｃＲに結合する。ＦｃＲ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ、ならびにこれらのアイソフォーム、ならびにＦｃεＲ、ＦｃμＲ、ＦｃδＲ、および／またはＦｃαＲのうちの１または複数でありうる。特定の実施形態では、エフェクター機能を低減した抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＦｃγＲＩＩａに対する結合アフィニティーの、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍以上の減少を示す。
【０１２６】
ＣＤＣでは、抗体−抗原複合体は、補体に結合する結果として、補体カスケードの活性化および膜攻撃複合体の生成をもたらす。古典的補体経路の活性化は、それらのコグネイト抗原に結合する抗体（適切なサブクラスの）への、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始され、したがって、補体カスケードの活性化は、免疫グロブリンの、Ｃ１ｑタンパク質への結合アフィニティーにより部分的に調節される。補体カスケードを活性化させるには、Ｃ１ｑが、抗原性の標的に結合した、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３のうちの少なくとも２つの分子に結合することが必要であるが、ＩｇＭでは１つの分子に結合すればよい（WardおよびGhetie、Therapeutic  Immunology、２巻：７７〜９４頁（１９９５年）、８０頁）。補体の活性化を評価するには、例えば、Gazzano-Santoroら、J.  Immunol.  Methods、２０２巻：１６３頁（１９９６年）において記載されているＣＤＣアッセイを実施することができる。
【０１２７】
ＣＨ２ドメイン上のＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、およびＬｙｓ３２２残基、同じβ鎖に近接するターン上に位置するアミノ酸残基３３１、下部ヒンジ領域内に位置するＬｙｓ２３５およびＧｌｙ２３７残基、ならびにＣＨ２ドメインのＮ末端領域内に位置する残基２３１〜２３８を含む、ＩｇＧ分子の多様な残基が、Ｃ１ｑへの結合に関与することが提起されている（例えば、Xuら、J.  Immunol.、１５０巻：１５２Ａ頁（抄録）（１９９３年）；ＷＯ９４／２９３５１；Taoら、J.  Exp.  Med.、１７８巻：６６１〜６６７頁（１９９３年）；Brekkeら、Eur.  J.  lmmunol.、２４巻：２５４２〜４７頁（１９９４年）；Burtonら；Nature、２８８巻：３３８〜３４４頁（１９８０年）；DuncanおよびWinter、Nature、３３２巻：７３８〜４０頁（１９８８年）；Idusogieら、J  Immunol、１６４巻：４１７８〜４１８４頁（２０００年）；Ｕ．Ｓ．５，６４８，２６０およびＵ．Ｓ．５，６２４，８２１を参照されたい）。
【０１２８】
Ｃ１ｑへの結合を改善した抗ＢＤＣＡ２抗体は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のアミノ酸位置３２６、３２７、３３３、および３３４［ここで、ＩｇＧ  Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスの番号付けである］のうちの１つ、２つ、３つ、または４つにおけるアミノ酸置換を含みうる。一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＩｇＧ１抗体のＣ１ｑへの結合を増大させることが公知である（Steurer  W.ら、J  Immunol.、１５５巻（３号）：１１６５〜７４頁（１９９５年））、以下のアミノ酸置換：Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓを含む。
【０１２９】
Ｃ１ｑへの結合を低減した抗ＢＤＣＡ２抗体は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のアミノ酸位置２７０、３２２、３２９、および３３１［ここで、ＩｇＧ  Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスの番号付けである］のうちの１つ、２つ、３つ、または４つにおけるアミノ酸置換を含みうる。ＩｇＧ１における例として述べると、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインのＣＯＯＨ末端領域内の２つの変異（Ｋ３２２ＡおよびＰ３２９Ａ）は、ＣＤＣ経路を活性化させず、Ｃ１ｑへの結合の、１００倍を超える減少を結果としてもたらすことが示された（ＵＳ６，２４２，１９５）。
【０１３０】
したがって、ある種の実施形態では、本発明の抗ＢＤＣＡ２抗体は、補体タンパク質への結合の、第２の抗ＢＤＣＡ２抗体と比べた増加または低減を示す。ある種の実施形態では、本発明の抗ＢＤＣＡ２抗体は、Ｃ１ｑへの結合の、第２の抗ＢＤＣＡ２抗体と比べて約１．５倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、約１０倍以上、または約１５倍以上の増大または低減を示す。
【０１３１】
したがって、本発明のある種の実施形態では、本明細書で提供される抗ＢＤＣＡ２抗体のＣＤＣ活性を増加または減少させるように、これらの残基のうちの１または複数を改変、置換、または除去することもでき、１または複数のアミノ酸残基を挿入することもできる。
【０１３２】
他のある種の実施形態では、本発明は、１または複数のＦｃＲ受容体への結合の低減を示すが、補体に結合するその能力（例えば、天然で非変異体の抗ＢＤＣＡ２抗体または親抗ＢＤＣＡ２抗体と同程度の、または、いくつかの実施形態では、これより小さな程度の）は維持する、抗ＢＤＣＡ２抗体を提供する。したがって、本発明の抗ＢＤＣＡ２抗体は、補体に結合し、これを活性化させながら、例えば、ＦｃγＲＩＩａ（例えば、血小板上で発現するＦｃγＲＩＩａ）などのＦｃＲへの結合の低減を示しうる。ＦｃγＲＩＩａ（例えば、血小板上で発現するＦｃγＲＩＩａなど）への結合を低減するかまたは結合しないが、少なくともある程度、Ｃ１ｑに結合し、補体カスケードを活性化させることが可能なこのような抗体は、血栓塞栓事象の危険性を低減しながら、おそらくは、所望のエフェクター機能は維持する。代替の実施形態では、本発明の抗ＢＤＣＡ２抗体は、１または複数のＦｃＲへの結合の低減を示すが、１または複数の他のＦｃＲに結合するその能力は維持する。例えば、ＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩ、および／またはＦｃＲＩＩＩへの結合を低減した抗体を生成する多様なアミノ酸修飾のほか、１つのＦｃＲへの結合を結果として増大させるが、別のＦｃＲへの結合は結果として減少させるアミノ酸置換についても記載している、ＵＳ２００７−０００９５２３、同２００６−０１９４２９０、同２００５−０２３３３８２、同２００４−０２２８８５６、および同２００４−０１９１２４４を参照されたい。
【０１３３】
したがって、抗ＢＤＣＡ２抗体の定常領域を伴うエフェクター機能は、定常領域の特性、および、特に、Ｆｃ領域の特性を変化させることによりモジュレートすることができる。ある種の実施形態では、エフェクター機能を増大または減少させた抗ＢＤＣＡ２抗体を、エフェクター機能を伴い、エフェクター機能を媒介する天然の定常領域またはＦｃ領域を含む、非変異体で天然の抗体または親抗体でありうる、第２の抗体と比較する。
【０１３４】
天然配列のＦｃ領域または定常領域は、天然において見出されるＦｃ領域または定常鎖領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む。好ましくは、相対的なエフェクター機能を評価するのに使用される対照分子は、試験抗体または変異体抗体と同じ型／サブタイプのＦｃ領域を含む。変異体のＦｃ領域もしくは定常領域または変化させたＦｃ領域もしくは定常領域は、少なくとも１カ所のアミノ酸修飾（例えば、翻訳後修飾、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、またはアミノ酸欠失など）のために、天然配列の重鎖領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。したがって、変異体の定常領域は、例えば、グリコシル化パターンの変化を含む、翻訳後修飾の変化を結果としてもたらす、１カ所または複数カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入を含有しうる。親抗体または親Ｆｃ領域は、例えば、エフェクター機能を変化させた、例えば、エフェクター機能を増大させた定常領域（すなわち、Ｆｃ）を構築するのに使用される、通常のエフェクター機能を有する変異体である。
【０１３５】
エフェクター機能(複数可)を変化させた（例えば、増大させた）抗体は、変異体の定常領域、Ｆｃ領域、または重鎖領域を伴う抗体を操作または作製することにより生成することができる。組換えＤＮＡ技術ならびに／または細胞培養条件および発現条件を使用して、機能および／または活性を変化させた抗体を作製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して、エフェクター機能を含む抗体機能に影響を及ぼす領域（例えば、Ｆｃ領域または定常領域など）内の１カ所または複数カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入を操作することができる。代替的に、例えば、グリコシル化パターンなど、翻訳後修飾の変化は、宿主細胞ならびに細胞培養条件および抗体が産生される発現条件を操作することにより達成することができる。
【０１３６】
本発明のある種の実施形態は、配列番号９のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１０のＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１１のＶＨ  ＣＤＲ３から選択される１もしくは複数の重鎖ＣＤＲ配列；または配列番号８のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１０のＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１１のＶＨ  ＣＤＲ３から選択される１もしくは複数の代替の重鎖ＣＤＲ配列；または配列番号８９のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９１のＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１１のＶＨ  ＣＤＲ３から選択される１もしくは複数の代替の重鎖ＣＤＲ配列；または配列番号９のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９２のＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１１のＶＨ  ＣＤＲ３から選択される１もしくは複数の代替の重鎖ＣＤＲ配列；または配列番号９０のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９３のＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号９４のＶＨ  ＣＤＲ３から選択される１もしくは複数の代替の重鎖ＣＤＲ配列を含む抗ＢＤＣＡ２抗体であって、天然Ｆｃ領域または親Ｆｃ領域と比較して、エフェクター機能の増大または低減を付与する変異体のＦｃ領域をさらに含む抗ＢＤＣＡ２抗体に関する。さらなる実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＣＤＲのうちの少なくとも２つ（または代替のＣＤＲ）を含み、他の実施形態では、該抗体は、重鎖ＣＤＲ配列のうちの３つ全て（または代替のＣＤＲ）を含む。これらの抗ＢＤＣＡ２抗体は、ｉ）他のサイトカインおよびケモカインに加えた、Ｉ型インターフェロンおよび／またはＩＩＩ型インターフェロンの、形質細胞様樹状細胞からの分泌を阻害し、かつ／または（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、形質細胞様樹状細胞の枯渇を誘導または増強する。
【０１３７】
本発明の他の実施形態は、配列番号５のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号６のＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号７のＶＬ  ＣＤＲ３から選択される１もしくは複数の軽鎖ＣＤＲ配列；または配列番号９５のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号９６のＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号９７のＶＬ  ＣＤＲ３から選択される１もしくは複数の代替の軽鎖ＣＤＲ配列を含む抗ＢＤＣＡ２抗体であって、天然Ｆｃ領域または親Ｆｃ領域と比較して、エフェクター機能の増大または低減を付与する変異体のＦｃ領域をさらに含む抗ＢＤＣＡ２抗体に関する。さらなる実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、軽鎖ＣＤＲのうちの少なくとも２つ（または代替のＣＤＲ）を含み、他の実施形態では、抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列のうちの３つ全て（または代替のＣＤＲ）を含む。これらの抗ＢＤＣＡ２抗体は、ｉ）他のサイトカインおよびケモカインに加えた、Ｉ型インターフェロンおよび／またはＩＩＩ型インターフェロンの、形質細胞様樹状細胞からの分泌を阻害し、かつ／または（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、形質細胞様樹状細胞の枯渇を誘導または増強する。
【０１３８】
本発明のさらなる実施形態では、エフェクター機能を増大させるかまたは低減した抗ＢＤＣＡ２抗体は、３つの軽鎖ＣＤＲ配列全て、または配列番号３の代替の軽鎖ＣＤＲを含み、３つの重鎖ＣＤＲ配列全て、または配列番号４の代替の重鎖ＣＤＲを含む。
【０１３９】
他の実施形態では、本発明は、配列番号２３を含むＶＬ配列を含む抗ＢＤＣＡ２抗体であって、天然Ｆｃ領域または親Ｆｃ領域と比較して、エフェクター機能の低減を付与する変異体のＦｃ領域をさらに含む抗ＢＤＣＡ２抗体に関する。さらに他の実施形態では、本発明は、配列番号２４を含むＶＨ配列を含む抗ＢＤＣＡ２抗体であって、天然Ｆｃ領域または親Ｆｃ領域と比較して、エフェクター機能の低減を付与する変異体のＦｃ領域をさらに含む抗ＢＤＣＡ２抗体に関する。
【０１４０】
当技術分野では、前述の抗ＢＤＣＡ２抗体の変異体のうちのいずれかであって、アミノ酸置換を含む変異体を生成する方法が周知である。これらの方法は、抗体または抗体のうちの少なくとも定常領域をコードする、調製されたＤＮＡ分子に対する、部位特異的（またはオリゴヌクレオチドに媒介される）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、およびカセット変異誘発による調製を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、部位特異的変異誘発が周知である（例えば、Carterら、Nucleic  Acids  Res.、１３巻：４４３１〜４４４３頁（１９８５年）、およびKunkelら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８２巻：４８８頁（１９８７年）を参照されたい）。ＰＣＲ変異誘発はまた、出発ポリペプチドのアミノ酸配列の変異体を作製するのにも適する。Higuchi、PCR  Protocols、１７７〜１８３頁（Academic  Press、１９９０年）；およびValletteら、Nuc.  Acids  Res.、１７巻：７２３〜７３３頁（１９８９年）を参照されたい。配列の変異体を調製するための別の方法であるカセット変異誘発は、Wellsら、Gene、３４巻：３１５〜３２３頁（１９８５年）により記載されている技法に基づく。
【０１４１】
グリコシル化を変化させた抗ＢＤＣＡ２抗体
異なる糖型は、薬物動態、薬力学、受容体相互作用、および組織特異的ターゲティングを含む治療剤の特性に深く影響を及ぼしうる（Graddisら、２００２年、Curr  Pharm  Biotechnol.、３巻：２８５〜２９７頁）。特に、抗体の場合、オリゴ糖構造は、抗体のエフェクター機能（例えば、ＣＤＣを誘導する、補体複合体Ｃ１への結合、およびＡＤＣＣ経路のモジュレーティングの一因となるＦｃγＲ受容体への結合）に加えて、プロテアーゼ耐性に関連する特性、ＦｃＲｎ受容体に媒介される抗体の血清半減期、食作用、および抗体フィードバックにも影響を及ぼしうる（NoseおよびWigzell、１９８３年；LeatherbarrowおよびDwek、１９８３年；Leatherbarrow  ら、１９８５年；Walkerら、１９８９年；Carterら、１９９２年、PNAS、８９巻：４２８５〜４２８９頁）。
【０１４２】
したがって、抗体のエフェクター機能をモジュレートする別の手段は、抗体定常領域のグリコシル化を変化させることを含む。グリコシル化の変化は、例えば、グリコシル化された残基の数の減少または増加、グリコシル化された残基のパターンまたは位置の変化のほか、糖構造(複数可)の変化を含む。ヒトＩｇＧ上で見出されるオリゴ糖は、それらのエフェクター機能の程度に影響を及ぼし（Raju,  T.S.、BioProcess  International、２００３年４月、４４〜５３頁）、ヒトＩｇＧオリゴ糖の微小不均一性は、ＣＤＣおよびＡＤＣＣなどの生物学的機能、多様なＦｃ受容体への結合、およびＣ１ｑタンパク質への結合に影響を及ぼしうる（Wright  A.およびMorrison  SL.、TIBTECH、１９９７年、１５巻、２６〜３２頁；Shieldsら、J  Biol  Chem.、２００１年、２７６巻（９号）：６５９１〜６０４頁；Shieldsら、J  Biol  Chem.、２００２年、２７７巻（３０号）：２６７３３〜４０頁；Shinkawaら、J  Biol  Chem.、２００３年、２７８巻（５号）：３４６６〜７３頁；Umanaら、Nat  Biotechnol.、１９９９年２月、１７巻（２号）：１７６〜８０頁）。例えば、Ｃ１ｑに結合し、補体カスケードを活性化させるＩｇＧの能力は、２つのＣＨ２ドメイン間に位置する炭水化物部分（通常Ａｓｎ２９７にアンカリングされている）の存在、非存在、または修飾に依存しうる（WardおよびGhetie、Therapeutic  Immunology、２巻：７７〜９４頁（１９９５年））。
【０１４３】
Ｆｃ含有ポリペプチド内、例えば、ＩｇＧ抗体などの抗体内のグリコシル化部位は、標準的技法により同定することができる。グリコシル化部位の同定は、実験による場合もあり、配列解析またはデータのモデル化に基づく場合もある。コンセンサスモチーフ、すなわち、多様なグリコシルトランスフェラーゼにより認識されるアミノ酸配列が記載されている。例えば、Ｎ結合グリコシル化モチーフのコンセンサスモチーフは、しばしば、ＮＸＴまたはＮＸＳ［ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸でありうる］である。また、潜在的なグリコシル化モチーフを位置特定するための複数のアルゴリズムも記載されている。したがって、抗体内またはＦｃ含有断片内の潜在的なグリコシル化部位を同定するために、例えば、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓにより提供されているウェブサイト（Ｎ結合グリコシル化部位を予測するためのＮｅｔＮＧｌｙｃサービスおよびＯ結合グリコシル化部位を予測するためのＮｅｔＯＧｌｙｃサービスを参照されたい）など、公表のデータベースを使用することにより、抗体の配列を試験する。
【０１４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究により、非グリコシル抗体のエフェクター機能の低減が確認されている。例えば、非グリコシル抗ＣＤ８抗体は、マウスにおいてＣＤ８保有細胞を枯渇させることが不可能であり（Isaacs、１９９２年、J.  Immunol.、１４８巻：３０６２頁）、非グリコシル抗ＣＤ３抗体は、マウスまたはヒトにおけるサイトカイン放出症候群を誘導しない（Boyd、１９９５年、前出；Friend、１９９９年、Transplantation、６８巻：１６３２頁）。ＢＤＣＡ２抗体の非グリコシル化形態でもまた、エフェクター機能は低減されている。
【０１４５】
重要なことは、ＣＨ２ドメイン内のグリカンの除去が、エフェクター機能に対して著明な効果を有すると考えられるのに対し、抗体の他の機能的特性および物理的特性は、変化しないままであることである。とりわけ、グリカンの除去は、血清半減期および抗原への結合に対して、ほとんどまたは全く効果を及ぼさなかったことが示されている（Nose、１９８３年、前出；Tao、１９８９年、前出；Dorai、１９９１年、前出；Hand、１９９２年、前出；Hobbs、１９９２年、Mol.  Immunol.、２９巻：９４９頁）。
【０１４６】
本発明の抗ＢＤＣＡ２抗体を、改変するかまたは変化させて、エフェクター機能(複数可)の増大または減少（第２のＢＤＣＡ２特異的抗体と比較した）を誘発することができる。抗体のグリコシル化部位を変化させるための方法は、例えば、ＵＳ６，３５０，８６１およびＵＳ５，７１４，３５０、ＷＯ０５／１８５７２およびＷＯ０５／０３１７５において記載されており、これらの方法を使用して、グリコシル化を変化させるか、グリコシル化を低減するか、またはグリコシル化のない、本発明の抗ＢＤＣＡ２抗体を作製することができる。
【０１４７】
適応
本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体を使用して、炎症性障害および自己免疫障害など、様々な免疫障害を処置または防止することができる。抗ＢＤＣＡ２抗体は、少なくとも、ｐＤＣを無効化するかもしくは枯渇させ、かつ／またはｐＤＣにより産生される炎症性サイトカインおよびケモカインを阻害し、かつ／またはＣＤ３２ａを下方調節し、かつ／または免疫複合体によるｐＤＣの刺激を阻害し、かつ／またはＣＤ６２Ｌを下方調節するかもしくはその脱落をもたらすため、このような障害を処置または防止するのに有用である。本開示の抗ＢＤＣＡ２抗体は、炎症性障害および自己免疫障害の処置における治療効果を改善するために、抗マラリア剤（例えば、ＨＣＱ）と組み合わせることができる。抗ＢＤＣＡ２抗体は、Ｉ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−αおよびＭＩＰ１−β、ＣＣＬ５、およびＩＰ−１０など、サイトカインおよびケモカインのレベルを低減するのにも使用することができる。Ｉ型ＩＦＮは、１３のＩＦＮ−αサブタイプ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−δ、およびＩＦＮ−τを含む、複数メンバーのサイトカインファミリーを構成する（Theofilopoulos、Annu.  Rev.  Immunol.、２３巻：３０７〜３６頁（２００５年））。ＩＩＩ型インターフェロンは、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２、およびＩＦＮ−λ３（また、それぞれ、ＩＬ２９、ＩＬ２８Ａ、およびＩＬ２８Ｂとも称する）と呼ばれる３つのＩＦＮ−λ分子からなる。ｐＤＣ機能を枯渇させ、かつ／または低下させることにより、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体は、中和抗体により特異的なＩＦＮサブタイプを低減しようとする処置より頑健な処置法をもたらす。加えて、抗ＢＤＣＡ２抗体による、ｐＤＣに焦点を当てた処置法は、ＩＦＮ応答の全般的遮断より選択的であり、かつ、潜在的に安全である。例えば、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体は、ｐＤＣに由来するＩ型ＩＦＮを効果的に消失させる一方で、ウイルス感染が生じた場合に必要でありうる、ＩＦＮの他の供給源は維持する。
【０１４８】
「〜を処置すること」という用語は、本明細書で記載される組成物を、統計学的に有意な程度に、または当業者に検出可能な程度に、状態、症状、もしくは障害と関連するパラメータを改善するか、または障害の進行もしくは増悪（障害により引き起こされる続発性損傷を含む）を防止するのに有効な量、様式、および／または方式で投与することを指す。
【０１４９】
本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体で処置しうる疾患または状態は、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（例えば、中等度または重度のループス）、皮膚ループス、円板状ループス、ループス腎炎、全身性硬化症（強皮症）、斑状強皮症、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、皮膚筋炎、多発性筋炎、およびＩ型糖尿病を含む。
【０１５０】
ＳＬＥとは、免疫複合体および組織結合性自己抗体により、多臓器が損傷される、慢性の自己免疫疾患である（Guidelines  for  Referral  and  Management  of  Systemic  Lupus  Erythematosus  in  Adults、Arthritis  &  Rheumatism、４２巻（９号）：１７８５〜１７９５頁（１９９９年）を参照されたい）。ＳＬＥでは、自己抗体が存在し、臨床疾患の発症に先行しうる（Arbuckleら、N.  Engl.  J.  Med.、３４９巻（１６号）：１５２６〜３３頁（２００３年））。自己抗体含有免疫複合体のＦｃ受容体を介する内部移行は、Ｉ型インターフェロンの産生をもたらし、これにより、寛容の喪失が促進され、自己免疫の悪循環が恒常化される（Meansら、Ann  N  Y  Acad  Sci.、１０６２巻：２４２〜５１頁（２００５年））。ＳＬＥは、その臨床症状、経過、予後、および遺伝特性に関して異質性である。アフリカ系米国人は、ＳＬＥに対する危険性の増大を共有し、白人患者と比較して重度であることが多い。初期には、補体欠損が、ＳＬＥの発症の危険因子として認識された。より近年では、Ｉ型インターフェロン経路と関連する遺伝子多型により、易罹患性が付与されると記載されている。例えば、抗二本鎖ＤＮＡ自己抗体および抗Ｒｏ自己抗体は、転写因子であるインターフェロン調節因子５（ＩＲＦ５）のある種のハプロタイプと関連していた。ハプロタイプからはまた、ＳＬＥ患者の血清中のＩＦＮ−αレベルが高いことも予測された（Niewoldら、Ann.  Rheum.  Dis.、７１巻（３号）：４６３〜８頁（２０１２年））。ＩＦＮ−αレベルが高いことは、ＳＬＥ患者における多臓器病変の程度の増大と相関している（Bengtssonら、Lupus、９巻（９号）：６６４〜７１頁（２０００年））。さらに、ＳＬＥでは、いわゆる「インターフェロンシグネチャー」が顕著のようである。インターフェロンシグネチャーは、インターフェロン誘導遺伝子のｍＲＮＡ発現パターンを表す。Ｉ型インターフェロンシグネチャーは、過半数のＳＬＥ患者において見出されており、疾患活動性の増大と関連している（Baechlerら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci  USA、１００巻（５号）：２６１０〜５頁（２００３年））。現在、ＩＦＮ−αモノクローナル抗体は、臨床試験（ｃｌｉｎｉｃｓ）に入っており、シファリムマブおよびロンタリズマブについてのフェーズ１の結果により、ＳＬＥ患者の全血中の、Ｉ型ＩＦＮシグネチャーの用量依存的低減が裏付けられている（McBrideら、Arthritis  Rheum.、６４巻（１１号）：３６６６〜７６頁（２０１２年）；Yaoら、Arthritis  Rheum.、（６号）：１７８５〜９６頁（２００９年））。疾患活動性および疾患重症度（例えば、中程度、重度）を評価するための、検証された指標が開発されている（例えば、Gladman、Prognosis  and  treatment  of  systemic  lupus  erythematosus、Curr.  Opin.  Rheumatol.、８巻：４３０〜４３７頁（１９９６年）；Kalunianら、Definition,  classification,  activity  and  damage  indices、Dubois’  lupus  eyrthematosus、５版、Baltimore、Williams  and  Wilkins、１９〜３０頁（１９９７年）を参照されたい）。
【０１５１】
全身性硬化症または全身性強皮症とは、全身性自己免疫疾患または強皮症のサブタイプである全身性結合組織疾患である。全身性硬化症または全身性強皮症は、皮膚内のコラーゲンの沈着を特徴とし、それほど一般的ではないが、腎臓内、心臓内、肺内、および胃内のコラーゲンの沈着を特徴とする。この疾患の女性対男性比は、４：１である。疾患の発症のピーク年齢は、３０〜５０歳の間である。
【０１５２】
乾癬とは、皮膚に影響を及ぼす自己免疫疾患である。乾癬は、免疫系が皮膚細胞を病原体と誤認した場合に生じ、皮膚細胞の成長周期を加速化させる、誤ったシグナルを送る。乾癬は、脳卒中の危険性の増大と関連しており、高血中脂質レベルを処置することにより改善をもたらすことができる。５つの型の乾癬：尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、および乾癬性紅皮症が存在する。最も一般的な形態である尋常性乾癬は一般に、表皮上部の第１層に現れる、うろこ状の斑点の赤および白の色相として認められる。しかし、皮膚徴候または皮膚症状を示さない患者もいる。
【０１５３】
関節リウマチとは、多くの組織および臓器に影響を及ぼすが、主に可撓性の関節を攻撃する、慢性の炎症性障害である。過程は、滑膜細胞の腫脹に続発する関節周囲における包の炎症応答、滑液の過剰、および滑膜内の線維性組織（パンヌス）の発生を伴う。疾患過程の病態は、関節軟骨の破壊および関節の強直をもたらすことが多い。関節リウマチはまた、肺、心臓周囲の膜（心膜）、肺膜（胸膜）、および目の白目の部分（強膜）におけるびまん性炎症ももたらす可能性があり、また、皮下組織で最も一般的な結節性病変ももたらす可能性がある。関節リウマチの原因は未知であるが、その慢性化および進行のいずれにおいても、自己免疫が中心的な役割を果たしており、ＲＡは、全身性自己免疫疾患であると考えられている。関節炎を伴う患者では、ＴＮＦαおよび他の炎症促進性サイトカインの過剰発現が観察されている（Feldmannら、Prog  Growth  Factor  Res.、４巻：２４７〜５５頁（１９９２年））。さらに、ヒトＴＮＦαを過剰発現するトランスジェニック動物は、疾患と関連する多くの特徴を伴うびらん性多発性関節炎を発症する（Kefferら、EMBO  J.、１０巻（１３号）：４０２５〜３１頁（１９９１年））。鎮痛剤および、ステロイドを含む抗炎症薬が、症状を抑制するのに使用されるが、基礎をなす免疫過程を阻害するかまたは停止させ、長期にわたる損傷を防止するには、疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）が必要である。より近年になり、抗ＴＮＦα抗体療法（リツキシマブ）が、疾患を管理するのに使用されている（Edwardsら、N.  Engl.  J.  Med.、３５０巻（２５号）：２５７２〜８１頁（２００４年））。
【０１５４】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）とは、結腸および小腸の一群の炎症性状態である。ＩＢＤの主要な型は、クローン病および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である。クローン病とＵＣとの間の主要な差異は、炎症性変化の位置および性質である：クローン病が、口腔〜肛門にわたる消化管の任意の部分に影響を及ぼしうる（飛び石病変）が、大半の症例は回腸末端において始まるのに対し、ＵＣは、結腸および直腸に限定される。重症度のレベルに応じて、ＩＢＤは、症状を制御するのに、プレドニゾン、ＴＮＦ阻害、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）、メトトレキサート、または６−メルカプトプリンなどの免疫抑制を必要としうる。より一般に、ＩＢＤの処置は、メサラジンの一形態を必要とする。
【０１５５】
皮膚筋炎（ＤＭ）とは、筋肉および皮膚の炎症を特徴とする多発性筋炎（ＰＭ）に関連する、自己免疫性結合組織疾患の一種である。ＤＭは、皮膚および筋肉に影響を及ぼすことが最も多いが、関節、食道、肺にもまた影響を及ぼし、それほど一般的ではないが、心臓にも影響を及ぼす、全身性障害である。
【０１５６】
多発性筋炎（ＰＭ）（「多くの筋肉の炎症」）とは、皮膚筋炎および封入体筋炎に関連する、慢性の筋肉炎症（炎症性ミオパチー）の一種である。
【０１５７】
Ｉ型糖尿病とは、インスリンを産生する膵臓β細胞の自己免疫性破壊から生じる糖尿病の一形態である。その後のインスリンの欠如は、血中および尿中のグルコースの増加をもたらす。古典的症状は、多尿症、多渇症、多食症、および体重の減少である。
【０１５８】
本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体による処置に適する他の疾患の例は、喘息、ベーチェット病、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、糖尿病、円板状エリテマトーデス、肺線維症、自己免疫性糸球体腎炎、膜性糸球体症、若年性関節リウマチ（若年性慢性関節炎）、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、ネフローゼ症候群、脂肪織炎、類天疱瘡、天疱瘡、紅斑性天疱瘡、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、リウマチ性多発筋痛、全身性硬化症、進行性全身性硬化症（強皮症）、斑状強皮症（限局性強皮症）、多発性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、肺線維症、レイノー現象／症候群、シェーグレン症候群、および潰瘍性大腸炎を含む。
【０１５９】
これらの障害のうちの１つの危険性があるか、これらの障害のうちの１つを伴うと診断されているか、またはこれらの障害のうちの１つを有する被験体には、抗ＢＤＣＡ２抗体を、全体的な治療効果をもたらす量で、全体的な治療効果をもたらす時間にわたり投与することができる。抗ＢＤＣＡ２抗体は、単独で投与する（単剤療法）こともでき、他の薬剤と組み合わせて投与する（組合せ療法）こともできる。一実施形態では、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体を用いる組合せ療法における使用のための薬剤は、抗マラリア剤である。一実施形態では、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体を用いる組合せ療法における使用のための薬剤は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ９シグナル伝達阻害剤である。別の実施形態では、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体を用いる組合せ療法における使用のための薬剤は、コルチコステロイドである。ある種の実施形態では、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体を用いる組合せ療法における使用のための薬剤は、抗マラリア薬および／またはキナーゼ阻害剤（例えば、ＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＡＶＩ−２９２、ＯＮＯ−ＷＧ−３０７）、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、ＪＡＫ３阻害剤、Ｔｙｋ２阻害剤）である。具体的な実施形態では、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体を用いる組合せ療法における使用のための薬剤は、ヒドロキシクロロキンである。組合せ療法のための投与量および投与回数は、例えば、相加的治療効果または相乗的治療効果をもたらす投与量および投与回数でありうる。さらに、抗ＢＤＣＡ２抗体の投与（第２の薬剤を用いるかまたは用いない）は、一次処置、例えば、第一選択処置として使用することもでき、二次処置、例えば、既に施された治療（すなわち、抗ＢＤＣＡ２抗体を用いる治療以外の治療）に対する応答が不十分な被験体のための二次処置として使用することもできる。いくつかの実施形態では、組合せ療法は、抗ＢＤＣＡ２抗体ならびに以下の薬剤：グルココルチコイド、ＮＳＡＩＤ、プレドニゾン、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、アモジアキン、ピリメタミン、プログアニル、メフロキン、ダプソン、プリマキン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、サリドマイド、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、ラパマイシン、プロスタサイクリン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、エンドセリンアンタゴニスト、スタチン、ＡＣＥ阻害剤、およびカルシウムチャネル遮断剤のうちの１または複数の使用を含む。他の実施形態では、組合せ療法は、抗ＢＤＣＡ２抗体ならびに、スルファサラジン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、ペニシラミン、トファシチニブ、およびレフルノミドのうちの任意の１または複数の使用を含む。
【０１６０】
医薬組成物
本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書で記載される障害を処置するのに被験体へと投与するための医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、薬学的に許容されるキャリアを含むことが典型的である。本明細書で使用される「薬学的に許容されるキャリア」は、生理学的に適合性の、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含みうる（例えば、Berge,  S.M.ら（１９７７年）、J.  Pharm.  Sci.、６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。
【０１６１】
医薬製剤化は、十分に確立された技術分野であり、例えば、Gennaro（編）、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、２０版、Lippincott,  Williams  &  Wilkins（２０００年）（ISBN:0683306472）；Anselら、Pharmaceutical  Dosage  Forms  and  Drug  Delivery  Systems、７版、Lippincott  Williams  &  Wilkins  Publishers（１９９９年）（ISBN:0683305727）；およびKibbe（編）、Handbook  of  Pharmaceutical  Excipients  American  Pharmaceutical  Association、３版（２０００年）（ISBN:091733096X）においてさらに記載されている。
【０１６２】
医薬組成物は、様々な形態でありうる。これらは、例えば、液体溶液（例えば、注射溶液および注入溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、および坐剤など、液体剤形、半固体剤形、および固体剤形を含む。好ましい形態は、意図される投与方式および治療適用に依存しうる。本明細書で記載される薬剤のための組成物は、注射溶液または注入溶液の形態であることが典型的である。
【０１６３】
一実施形態では、本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、一塩基性リン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ−８０、および安定化剤などの賦形剤材料と共に製剤化する。本明細書で記載される抗ＢＤＣＡ２抗体は、例えば、適切な濃度の緩衝溶液中で提供し、２〜８℃で保管することができる。他のいくつかの実施形態では、組成物のｐＨは、約５．８〜６．６の間（例えば、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６）である。
【０１６４】
医薬組成物はまた、製剤化されたときの、ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片の凝集を低減する剤も含みうる。凝集低減剤の例は、メチオニン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グリシン、およびグルタミン酸からなる群から選択される１または複数のアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、製剤へと、約０．５ｍＭ〜約１４５ｍＭ（例えば、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ）の濃度まで添加することができる。医薬組成物はまた、糖（例えば、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、もしくはキシリトール）および／または等張性調節剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、もしくはソルビトール）および／または界面活性剤（例えば、ポリソルベート−２０もしくはポリソルベート−８０）も含みうる。
【０１６５】
このような組成物は、非経口方式（例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、または筋内注射）で投与することができる。一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片の組成物を皮下投与する。一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片の組成物を静脈内投与する。本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口投与された」という語句は、通例注射による、腸内投与および局所投与以外の投与方式を意味し、限定せずに述べると、静脈内注射および静脈内注入、筋内注射および筋内注入、動脈内注射および動脈内注入、髄腔内注射および髄腔内注入、包内注射および包内注入、眼窩内注射および眼窩内注入、心内注射および心内注入、皮内注射および皮内注入、腹腔内注射および腹腔内注入、経気管注射および経気管注入、皮下注射および皮下注入、表皮下注射および表皮下注入、関節内注射および関節内注入、被膜下注射および被膜下注入、くも膜下注射およびくも膜下注入、脊髄内注射および脊髄内注入、硬膜外注射および硬膜外注入、ならびに胸骨内（intrasternal）注射および胸骨内注入を含む。
【０１６６】
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度での安定的な保管に適する他の秩序だった構造として製剤化することができる。滅菌注射溶液は、本明細書で記載されている薬剤を、適切な溶媒中に必要とされる量で、必要とされるとおり、上記で列挙した成分のうちの１つまたはこれらの組合せと共に組み込んだ後で、濾過滅菌にかけることにより調製することができる。一般に、分散液は、本明細書で記載されている薬剤を、基礎分散媒および上記で列挙した成分に由来する、必要とされる他の成分を含有する滅菌媒体へと組み込むことにより調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、本明細書で記載される薬剤に任意のさらなる所望の成分を加えた粉末を、あらかじめ滅菌濾過されたその溶液から得る、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合は必要とされる粒子サイズを維持することにより、界面活性剤を使用することにより維持することができる。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含ませることによりもたらすことができる。
【０１６７】
ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、埋没物（ｉｍｐｌａｎｔ）およびマイクロカプセル化された送達系を含む制御放出製剤など、化合物を急速な放出に対して保護するキャリアと共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生体分解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法は、特許されているか、または一般に公知である。例えば、Sustained  and  Controlled  Release  Drug  Delivery  Systems、J.R.  Robinson編、Marcel  Dekker,  Inc.、New  York（１９７８年）を参照されたい。
【０１６８】
一実施形態では、医薬製剤は、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＢＩＩＢ０５９）を、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬ（例えば、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含み、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および必要に応じて、Ｔｗｅｅｎ−８０（０．０１〜０．１％、例えば、０．０３％、０．０５％、または０．７％）と共に製剤化する。製剤のｐＨは、５．５〜７．５の間（例えば、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．３）でありうる。
【０１６９】
投与
抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、被験体、例えば、それを必要とする被験体、例えば、ヒト被験体へと、様々な方法で投与することができる。多くの適用では、投与経路は、静脈内（ＩＶ）注射もしくはＩＶ注入、皮下（ＳＣ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射、または筋内注射のうちの１つである。また、関節内送達を使用することも可能である。また、非経口投与の他の方式も使用することができる。このような方式の例は、動脈内注射、髄腔内注射、包内注射、眼窩内注射、心内注射、皮内注射、経気管注射、表皮下注射、関節内注射、被膜下注射、くも膜下注射、脊髄内注射、および硬膜外注射、および胸骨内注射を含む。場合によって、投与は、経口投与でありうる。
【０１７０】
抗体またはその抗原結合断片の投与経路および／または投与方式はまた、個々の場合に応じて、例えば、腫瘍を視覚化するために、例えば、断層撮影を使用して、例えば、被験体をモニタリングすることにより調整することもできる。
【０１７１】
抗体またはその抗原結合断片は、固定用量で投与することもでき、ｍｇ／ｋｇ単位の用量で投与することもできる。用量はまた、抗ＢＤＣＡ２抗体に対する抗体の産生を低減または回避するように選択することもできる。投与レジメンは、所望の応答、例えば、治療的応答または組合せ治療効果をもたらすように調整する。一般に、被験体に、薬剤を、バイオアベイラブルな量で施すような抗ＢＤＣＡ２抗体（および、必要に応じて、第２の薬剤）の用量を使用することができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与することができる。他の用量もまた、使用することができる。具体的な実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体による処置を必要とする被験体に、抗体を、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。
【０１７２】
組成物は、約１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍｌまたは約１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍｌまたは約５０〜２５０ｍｇ／ｍＬまたは約１００〜１５０ｍｇ／ｍｌまたは約１００〜２５０ｍｇ／ｍｌの抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を含みうる。
【０１７３】
ある種の実施形態では、組成物中の抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、主に、単量体形態にある、例えば、少なくとも約９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９８．５％、または９９％は、単量体形態にある。ある種の抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片の組成物が含む、例えば、Ａ２８０ｎｍにおけるＵＶにより検出される凝集物は、約５、４、３、２、１、０．５、０．３、または０．１％未満でありうる。ある種の抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片の組成物が含む、例えば、Ａ２８０ｎｍにおけるＵＶにより検出される断片は、約５、４、３、２、１、０．５、０．３、０．２、または０．１％未満である。
【０１７４】
本明細書で使用される投与量単位形態または「固定用量」とは、処置される被験体のための単位投与量として適する物理的に個別の単位を指す。各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を、必要とされる医薬キャリアと会合させ、必要に応じて、他の薬剤と会合させて含有する。単回投与を施す場合もあり、複数回投与を施す場合もある。代替的に、または加えて、抗体は、連続注入を介して投与することができる。
【０１７５】
ある用量の抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、例えば、少なくとも２用量、３用量、５用量、１０用量以上を包含するのに十分な期間（処置コース）にわたる周期的間隔で、例えば、毎日１もしくは２回、または１週間に約１〜４回、または好ましくは毎週、隔週（２週間ごと）、３週間ごと、毎月、例えば、約１〜１２週間の間、好ましくは２〜８週間の間、より好ましくは約３〜７週間の間にわたり、なおより好ましくは約４、５、または６週間にわたり投与することができる。被験体を効果的に処置するのに必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼしうる因子は、例えば、疾患または障害の重症度、製剤、送達経路、既往の処置、被験体の全般的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む。さらに、治療有効量の化合物による被験体の処置は、単回の処置を含む場合もあり、好ましくは、一連の処置を含む場合もある。
【０１７６】
被験体に、本明細書で記載される免疫障害を発症する危険性がある場合は、抗体を、免疫障害の完全な発症の前に、例えば、予防的措置として投与することができる。このような予防的処置の持続期間は、抗体の単回投与の場合もあり、処置を持続する（例えば、複数回投与の）場合もある。例えば、障害の危険性があるか、または障害に対する素因を有する被験体を、数日間、数週間、数カ月間、なおまたは数年間にわたり抗体で処置して、障害が発生するかまたは劇症化することを防止することができる。
【０１７７】
医薬組成物は、「治療有効量」の、本明細書で記載される薬剤を含みうる。このような有効量は、投与された薬剤の効果に基づき決定するか、または、複数の薬剤を使用する場合は、薬剤の組合せ効果に基づき決定することができる。治療有効量の薬剤はまた、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答、例えば、少なくとも１つの障害パラメータの改善または障害の少なくとも１つの症状の改善を誘発する化合物の能力などの因子に従っても変化しうる。治療有効量はまた、組成物の任意の毒性または有害作用が、治療的に有益な効果により凌駕される量でもある。
【０１７８】
ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、約１ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ（例えば、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で皮下投与する。一実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で皮下投与する。別の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、約１ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬの濃度で静脈内投与する。特定の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で静脈内投与する。
【０１７９】
治療のためのデバイスおよびキット
抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物は、医療デバイスを用いて投与することができる。デバイスは、携帯可能性、室温保管、および、緊急状況下で、例えば、訓練されていない被験体が、または医療施設および他の医療設備から離れた現場での緊急職員が使用しうるような使用の容易さなどの特色を有してデザインすることができる。デバイスは、例えば、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を含む医薬調製物を保管するための１または複数のハウジングを含むことが可能であり、１または複数の単位用量の抗体を送達するように構成することができる。デバイスはさらに、第２の薬剤、例えば、化学療法剤を、抗ＢＤＣＡ２抗体もしくはその抗原結合断片もまた含む単一の医薬組成物として投与するように構成することもでき、２つの個別の医薬組成物として投与するように構成することもできる。
【０１８０】
医薬組成物は、シリンジにより投与することができる。医薬組成物はまた、ＵＳ５，３９９，１６３；同５，３８３，８５１；同５，３１２，３３５；同５，０６４，４１３；同４，９４１，８８０；同４，７９０，８２４；または同４，５９６，５５６において開示されているデバイスなど、無針皮下注射デバイスによって投与することもできる。周知の埋没物およびモジュールの例は、医薬を制御速度で投薬するための植込み式マイクロ注入ポンプについて開示するＵＳ４，４８７，６０３；皮膚を介して医薬を投与するための治療デバイスについて開示するＵＳ４，４８６，１９４；医薬を正確な注入速度で送達するための医薬注入ポンプについて開示するＵＳ４，４４７，２３３；持続的な薬物送達のための、流量可変型植込み式注入装置について開示するＵＳ４，４４７，２２４；マルチチャンバー型区画を有する浸透圧型薬物送達系について開示するＵＳ４，４３９，１９６；および浸透圧型薬物送達系について開示するＵＳ４，４７５，１９６を含む。他の多くのデバイス、埋没物、送達系、およびモジュールもまた公知である。
【０１８１】
抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、キットにより提供することができる。一実施形態では、キットは、（ａ）抗ＢＤＣＡ２抗体を含む組成物を含有する容器と、必要に応じて、（ｂ）情報資料とを含む。情報資料は、記述的な場合もあり、指示的な場合もあり、販売促進的な場合もあり、本明細書で記載される方法および／または治療的利益のための薬剤の使用に関する他の資料の場合もある。
【０１８２】
ある実施形態では、キットはまた、本明細書で記載される障害を処置するための第２の薬剤（例えば、ＢＴＫ阻害剤、抗マラリア剤、グルココルチコイド、ＮＳＡＩＤ、プレドニゾン、ヒドロキシクロロキン、アモジアキン、ピリメタミン、プログアニル、スルホンアミド、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アルテミシニンおよび誘導体、ハロファントリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、シクロホスファミド、スルファサラジン、またはレフルノミド）も含む。例えば、キットは、抗ＢＤＣＡ２抗体を含む組成物を含有する第１の容器と、第２の薬剤を含む第２の容器とを含む。
【０１８３】
キットの情報資料は、その形態において制約されない。一実施形態では、情報資料は、化合物の生成、化合物の分子量、濃度、有効期限についての情報、バッチまたは製造場所についての情報などを含みうる。一実施形態では、情報資料は、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片を、例えば、適切な用量、剤形、または投与方式（例えば、本明細書で記載される用量、剤形、または投与方式）で投与して、本明細書で記載される免疫障害を有しているかまたはその危険性がある被験体を処置する方法に関する。情報は、印刷されたテキスト、コンピュータで読取り可能な資料、ビデオ録画、もしくは音声録音、または、例えば、インターネット上の実質的な資料へのリンクもしくはアドレスを提供する情報を含む様々なフォーマットで提供することができる。
【０１８４】
抗体に加えて、キット内の組成物は、溶媒もしくは緩衝液、安定化剤、または保存剤など、他の成分も含みうる。抗体は、任意の形態、例えば、好ましくは実質的に純粋で、かつ／または滅菌の液体形態、乾燥形態、または凍結乾燥形態で提供することができる。薬剤を液体溶液により提供する場合、液体溶液は、水溶液であることが好ましい。薬剤を乾燥形態として提供する場合、再構成は一般に、適切な溶媒の添加による。溶媒、例えば、滅菌水または滅菌緩衝液を、必要に応じて、キットにより提供することもできる。
【０１８５】
キットは、薬剤を含有する１または複数の組成物のための１または複数の容器を含みうる。いくつかの実施形態では、キットは、組成物および情報資料のための個別の容器、仕切り、または区画を含有する。例えば、組成物は、ボトル内、バイアル内、またはシリンジ内に含有させることが可能であり、情報資料は、プラスチック製のスリーブ内またはパケット内に含有させることが可能である。他の実施形態では、キットの個別のエレメントを、単一の仕切りのない容器内に含有させる。例えば、組成物を、ラベルの形態で情報資料を添付したボトル内、バイアル内、またはシリンジ内に含有させる。いくつかの実施形態では、キットは、各々が薬剤の１または複数の単位剤形（例えば、本明細書で記載される剤形）を含有する複数の個別容器（例えば、パック）を含む。容器は、組合せ単位投与量、例えば、抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片および第２の薬剤の両方を、例えば、所望の比で含む単位を含みうる。例えば、キットは、例えば、各々が単一の組合せ単位用量を含有する、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、ブリスターパック、または医療デバイスを含む。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、水分の変化または蒸発に対して不透過性）、および／または遮光性でありうる。
【０１８６】
キットは必要に応じて、組成物の投与に適するデバイス、例えば、シリンジまたは他の適切な送達デバイスを含む。デバイスは、薬剤の一方または両方を事前に充填して提供することもでき、空ではあるが充填に適する状態であってもよい。
【０１８７】
診断的使用
抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片は、ＢＤＣＡ２の存在をｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、組織、生検などの生物学的試料）で検出するための診断的方法において使用することもでき、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、被験体におけるｉｎ  ｖｉｖｏイメージング）で検出するための診断的方法において使用することもできる。例えば、ヒト抗ＢＤＣＡ２抗体または実効的なヒト抗ＢＤＣＡ２抗体を、被験体へと投与して、被験体内のＢＤＣＡ２を検出することができる。例えば、抗体は、例えば、ＭＲＩで検出可能な標識または放射性標識で標識することができる。被験体は、検出可能な標識を検出するための手段を使用して評価することができる。例えば、被験体をスキャンして、被験体内の抗体の局在化を評価することができる。例えば、被験体は、例えば、ＮＭＲまたは他の断層撮影手段によりイメージングする。
【０１８８】
診断的イメージングに有用な標識の例は、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈなどの放射性標識、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、ポジトロン放射断層撮影法（「ＰＥＴ」）スキャナーにより検出可能なポジトロン放射同位元素、ルシフェリンなどの化学発光物質、およびペルオキシダーゼまたはホスファターゼなどの酵素的マーカーを含む。また、ショートレンジの検出プローブにより検出可能な同位元素などのショートレンジの放射体も援用することができる。タンパク質リガンドは、公知の技法を使用して、このような試薬で標識することができる。例えば、抗体の放射性標識に関する技法についての、WenselおよびMeares（１９８３年）、Radioimmunoimaging  and  Radioimmunotherapy、Elsevier、New  York；ならびにColcherら（１９８６年）、Meth.  Enzymol.、１２１巻：８０２〜８１６頁を参照されたい。
【０１８９】
被験体は、例えば、ガンマカメラまたは放射断層撮影を使用する放射性核種走査など、公知の技法を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて「イメージング」することができる。例えば、A.R.  Bradwellら、「Developments  in  Antibody  Imaging」、Monoclonal  Antibodies  for  Cancer  Detection  and  Therapy、R.W.  Baldwinら（編）、６５〜８５頁（Academic  Press、１９８５年）を参照されたい。代替的に、放射性標識（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ）がポジトロンを放射する場合には、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに設置された、Ｐｅｔ  ＶＩなどと命名されたポジトロン放射体軸横断断層撮影法（ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓａｘｉａｌ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）スキャナーも使用することができる。
【０１９０】
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）とは、ＮＭＲを使用して生きている被験体の内部の特色を視覚化するものであり、予後診断、診断、処置、および手術に有用である。ＭＲＩは、放射性トレーサー化合物なしで使用することができ、明らかな利益がある。いくつかのＭＲＩ法は、ＥＰ０５０２８１４Ａにまとめられている。一般に、異なる環境内の水のプロトンの緩和時間定数Ｔ１およびＴ２に関する差異を使用して、画像を生成する。しかし、これらの差異は、鮮明な高解像度の画像をもたらすには不十分でありうる。
【０１９１】
これらの緩和時間定数の差異は、造影剤により増強することができる。このような造影剤の例は、いくつかの磁性剤、常磁性剤（Ｔ１を主に変化させる）、および強磁性剤または超常磁性剤（Ｔ２応答を主に変化させる）を含む。キレート剤（例えば、ＥＤＴＡキレート剤、ＤＴＰＡキレート剤、およびＮＴＡキレート剤）を使用して、いくつかの常磁性物質（例えば、Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋、Ｇｄ３＋）を結合させる（かつ、その毒性を軽減する）ことができる。他の剤は、例えば、直径が１０μｍ〜約１０ｎｍ未満の粒子の形態でありうる。粒子は、強磁性特性、抗強磁性特性、または超常磁性特性を有しうる。粒子は、例えば、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−Ｆｅ２Ｏ３、フェライト、および遷移元素の他の磁性鉱物化合物を含みうる。磁性粒子は、非磁性材料を伴う１または複数の磁性結晶および非磁性材料を伴わない１または複数の磁性結晶を含みうる。非磁性材料は、合成ポリマーまたは天然ポリマー（例えば、セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプンなど）を含みうる。
【０１９２】
抗ＢＤＣＡ２抗体またはその抗原結合断片はまた、（ｉ）天然で豊富に存在するフッ素原子の実質的に全てが、１９Ｆ同位元素であり、したがって、実質的に全てのフッ素含有化合物がＮＭＲ活性であり、（ｉｉ）無水トリフルオロ酢酸など、多くの化学的に活性の多フッ素化化合物が比較的廉価で市販されており、（ｉｉｉ）ヘモグロビン代用物として酸素を運ぶのに活用される過フッ素化ポリエーテルなど、多くのフッ素化化合物が、ヒトにおける使用のために、医学的に許容可能であることが見出される限りにおいて、ＮＭＲ活性１９Ｆ原子または複数のこのような原子を含有する表示基で標識することもできる。このようなインキュベーション時間を経た後、Pykett（１９８２年）、Scientific  American、２４６巻：７８〜８８頁により記載されている装置のうちの１つなどの装置を使用して、全身ＭＲＩを実行して、ＢＤＣＡ２の分布を位置特定し、イメージングする。
【０１９３】
別の態様では、本開示は、試料（例えば、血清、血漿、組織、生検などの生物学的試料）中のＢＤＣＡ２の存在を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出するための方法を提供する。対象の方法を使用して、障害、例えば、自己免疫障害（例えば、ＳＬＥ）を診断することもでき、試料中のｐＤＣレベルを検出することもできる。方法は、（ｉ）試料または対照試料を、抗ＢＤＣＡ２抗体と接触させるステップと、（ｉｉ）例えば、抗ＢＤＣＡ２抗体とＢＤＣＡ２との間の複合体の形成を検出することにより、または抗体もしくはＢＤＣＡ２の存在を検出することにより、試料を、ＢＤＣＡ２の存在について評価するステップとを含む。例えば、抗体を、例えば、支持体上に固定化することができ、抗原の、支持体上の保持を検出し、かつ／またはこの逆を検出する。使用される抗体は、例えば、フルオロフォアにより標識することができる。対照試料を含めることができる。陽性対照は、評価される疾患または障害を有することが知られている試料であることが可能であり、陰性対照は、評価される疾患または障害を有さない被験体に由来する試料でありうる。試料中の複合体の形成の、対照試料と比べて統計学的に有意な変化は、試料中のＢＤＣＡ２の存在を示しうる。一般に、抗ＢＤＣＡ２抗体を、蛍光偏光、顕微鏡法、ＥＬＩＳＡ、遠心分離、クロマトグラフィー、および細胞分取（例えば、蛍光活性化細胞分取）を含む適用において使用することができる。ある種の実施形態では、抗ＢＤＣＡ２抗体は、ＢＩＩＢ０５９またはＤｅｎｄｒｉｔｉｃｓクローン１２４Ｂ３．１３である。いくつかの実施形態では、方法は、抗ＣＤ１２３抗体により組織試料を免疫染色するステップをさらに包含する。組織試料は、例えば、自己免疫状態、例えば、ＳＬＥを有するヒト患者に由来する皮膚生検でありうる。
【０１９４】
以下は、本発明の実施の実施例である。これらは、いかなる形でも、本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。
【実施例】
【０１９５】
以下の実施例は、特許請求される本発明をよりよく例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。具体的な材料が言及される程度において、単に例示を目的とするものであり、本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、発明能力の行使を伴わず、かつ、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物質を開発することができる。
【０１９６】
（実施例１）
マウス抗ＢＤＣＡ２抗体の重鎖および軽鎖のクローニング
２４Ｆ４マウスハイブリドーマ（ＩｇＧ１、κ）は、全長ヒトＢＤＣＡ２  ｃＤＮＡおよびＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡを共発現させる哺乳動物用の発現ベクターである、プラスミドｐＥＡＧ２４５６を用いての遺伝子銃により免疫したＢａｌｂ／ｃマウスから導出した。（実施例１７を参照されたい）。
【０１９７】
製造業者の推奨プロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキットを使用して、２４Ｆ４マウスハイブリドーマ細胞に由来する細胞内全ＲＮＡを調製した。プライミングのためにランダムヘキサマーを使用する、製造業者の推奨プロトコールに従い、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを使用して、ＲＴ−ＰＣＲにより、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、細胞内全ＲＮＡからクローニングした。
【０１９８】
インタクトなシグナル配列を伴うマウス免疫グロブリン可変ドメインをＰＣＲ増幅するために、複数のマウス免疫グロブリン遺伝子ファミリーのシグナル配列とハイブリダイズする縮重フォワードプライマーのカクテルと、Current  Protocols  in  Immunology（Wiley  and  Sons、１９９９年）において記載されているマウス定常ドメインの５’端に特異的な単一のバックプライマーとを使用した。２４Ｆ４重鎖可変ドメインは、以下のプライマー：5'  ACT  AGT  CGA  CAT  GRA  CTT  TGG  GYT  CAG  CTT  GRT  TT  3'（Ｒ＝Ａ／Ｇ、かつ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）（配列番号２５）および5'    AGG  TCT  AGA  AYC  TCC  ACA  CAC  AGG  RRC  CAG  TGG  ATA  GAC  3'（Ｒ＝Ａ／Ｇ、かつ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）（配列番号２６）により増幅した。そのシグナル配列を伴う２４Ｆ４軽鎖可変ドメインは、以下のプライマー：5'      ACT  AGT  CGA  CAT  GGA  GWC  AGA  CAC  ACT  CCT  GYT  ATG  GGT  3'（Ｗ＝Ａ／Ｔ、かつ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）（配列番号２７）および5'  GCG  TCT  AGA  ACT  GGA  TGG  TGG  GAG  ATG  GA  3'（配列番号２８）により増幅した。
【０１９９】
製造業者の推奨プロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して、ＰＣＲ産物をゲル精製した。精製されたＰＣＲ産物を、製造業者の推奨プロトコールに従い、それらのＴＯＰＯクローニングキットを使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターへとサブクローニングした。複数の独立のサブクローンに由来する（ｐＹＬ６４７と命名された重鎖クローンおよびｐＹＬ６５１と命名された軽鎖クローンに由来する）インサートを配列決定して、コンセンサス配列を確立した。
【０２００】
クローン間の配列の変動は、プライマーの縮重位置と一致した。可変ドメイン配列についてのＢＬＡＳＴ解析により、それらの免疫グロブリンの実体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が確認された。推定成熟軽鎖および成熟重鎖のＮ末端配列は、Ｅｄｍａｎ分解データに由来する真正の２４Ｆ４鎖のＮ末端配列とマッチする。クローニングされたＢａｌｂ／ｃ  ＩｇＧ１の重鎖ｃＤＮＡおよびκ軽鎖ｃＤＮＡから推定される定常ドメイン配列を、推定成熟可変ドメイン配列へと付加することによりアセンブルされた仮説的配列から推定されるインタクトな質量は、質量分析により決定される、精製ハイブリドーマに由来する２４Ｆ４のインタクトな質量と一致した。
【０２０１】
マウス２４Ｆ４重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、マウス亜群ＩＩＩ（Ｄ）のメンバーである。ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、およびＣＤＲ  Ｈ３にこの順で下線を付した、マウス２４Ｆ４成熟重鎖可変ドメインの配列を下記に示す：
【化５】
2019146567.tif 000015
マウス２４Ｆ４軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、マウスκ亜群ＩＩＩのメンバーである。ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３にこの順で下線を付した、マウス２４Ｆ４成熟軽鎖可変ドメインの配列を下記に示す：
【化６】
2019146567.tif 000016
対合しないシステインは、上記のマウス２４Ｆ４  ＶＬ配列のＣＤＲＬ３内の残基９５に存在する（Ｋａｂａｔによる命名法では、このＣｙｓは、残基９１である）。
【０２０２】
（実施例２）
マウス２４Ｆ４抗体のキメラ化
マウス２４Ｆ４可変ドメインをコードするｃＤＮＡを使用して、ｍｕ２４Ｆ４可変領域を、ヒトＩｇＧ１およびヒトκ定常領域へと連結したマウス−ヒトキメラ体（ｃｈ２４Ｆ４）を発現させるためのベクターを構築した。
まず、ＰＣＲにより可変ドメインを操作して、５’側Ｋｏｚａｋ配列を付加して、ヒト配列および新たな制限部位を、ヒト免疫グロブリン定常ドメインへと融合させるためのＦＲ４／定常ドメイン接合部に導入した。結果として得られるプラスミド内の可変領域ｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。プラスミドであるｐＹＬ６４７内の重鎖可変ドメインは、ＰＣＲのための鋳型として、プライマー5'    GAT  CCG  CGG  CCG  CAC  CAT  GGA  CTT  TGG  GTT  CAG  CTT  G  3'（配列番号３１）（ＮｏｔＩ部位およびＫｏｚａｋ配列を付加する）および5'    GAT  GGG  CCC  TTG  GTG  GAA  GCT  GCA  GAG  ACA  GTG  ACC  AGA  G  3'（配列番号３２）（ＦＲ４／定常ドメイン接合部におけるヒトＩｇＧ１  ＣＨ１配列およびＡｐａＩ部位を付加する）と共に使用し、０．４５ｋｂの断片を増幅し、これを精製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩＴＯＰＯクローニングベクターへとサブクローニングすることから、ｐＹＬ６６８を生成した。重鎖キメラ体を構築するために、２４Ｆ４重鎖可変ドメイン構築物であるｐＹＬ６６８に由来する０．４５ｋｂのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片と、ｐＥＡＧ１３２５（配列が確認されたｈｕＩｇＧ１重鎖定常ドメインｃＤＮＡ（ＩｇＧ１のＣ末端リシン残基を遺伝学的に除去した）を含有するプラスミド）に由来する０．９８ｋｂのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片とを、発現ベクターであるｐＶ９０（その中の異種遺伝子の発現は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターおよびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより制御され、それはｄｈｆｒ選択マーカーを保有する；米国特許第７，４９４，８０５号を参照されたい）のベクター骨格へとサブクローニングして、発現ベクターであるｐＹＬ６７２を作製した。結果として得られるプラスミドであるｐＹＬ６７２内の重鎖ｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。ｐＹＬ６７２によりコードされる、推定成熟ｃｈ２４Ｆ４−ｈｕＩｇＧ１重鎖タンパク質配列を、下記に示す：
【化７】
2019146567.tif 000017
また、ｃｈ２４Ｆ４の、エフェクター機能が小さい非グリコシル形態も、２４Ｆ４重鎖可変ドメイン構築物であるｐＹＬ６６８に由来する、０．４５ｋｂのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片と、ｐＥＡＧ２４１２（ＩｇＧ１のＣ末端リシン残基を遺伝学的に除去した、配列が確認されたＳ２２８Ｐ／Ｎ２９９Ｑ  ｈｕＩｇＧ４／ＩｇＧ１ハイブリッドの重鎖定常ドメインｃＤＮＡを含有するプラスミド）に由来する０．９８ｋｂのＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片とを、発現ベクターであるｐＶ９０のベクター骨格へとサブクローニングし、プラスミドであるｐＹＬ６７０を生成することにより構築した。結果として得られるプラスミドであるｐＹＬ６７０内の重鎖ｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。ｐＹＬ６７０によりコードされる、推定成熟ａｇｌｙ  ｃｈ２４Ｆ４−ｈｕＩｇＧ４／Ｇ１ハイブリッド重鎖タンパク質配列を、下記に示す：
【化８】
2019146567.tif 000018
プラスミドであるｐＹＬ６５１内のκ軽鎖可変ドメインは、ＰＣＲのための鋳型として、プライマー5'  GAT  CCG  CGG  CCG  CCA  CCA  TGG  AGA  CAG  ACA  CAC  TCC  TG  3'（配列番号３５）（５’側ＮｏｔＩ部位およびＫｏｚａｋ配列を付加する）および5'  CCA  CCG  TAC  GTT  TGA  TTT  CCA  GCT  TGG  TGC  3'（配列番号３６）（ＦＲ４／定常ドメイン接合部におけるヒトκ定常ドメイン配列および３’側のＢｓｉＷＩ部位を付加する）と共に使用し、０．４ｋｂの断片を増幅し、これを精製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩＴＯＰＯクローニングベクターへとサブクローニングすることから、ｐＹＬ６６９を生成した。プラスミドであるｐＹＬ６６９内の可変領域ｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。軽鎖キメラ体を構築するために、ｐＹＬ６６９に由来する０．４ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｉＷＩ軽鎖可変ドメイン断片と、プラスミドであるｐＥＡＧ１５７２（配列が確認されたヒトκ軽鎖定常ドメインｃＤＮＡを含有する）に由来する０．３４ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＢａｍＨＩ断片とを、ｐＶ１００（その中の異種遺伝子の発現は、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターおよびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより制御され、それはネオマイシン選択マーカーを保有する）のベクター骨格へとサブクローニングして、発現ベクターであるｐＹＬ６７１を作製した。結果として得られるプラスミドであるｐＹＬ６７１内の軽鎖ｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。ｐＹＬ６７１によりコードされる、推定成熟ｃｈ２４Ｆ４−ヒトκ軽鎖タンパク質配列を、下記に示す：
【化９】
2019146567.tif 000019
【０２０３】
発現ベクター（ｃｈ２４Ｆ４重鎖ベクターであるｐＹＬ６７０またはｐＹＬ６７２およびｃｈ２４Ｆ４軽鎖ベクターであるｐＹＬ６７１）を、２９３−ＥＢＮＡ細胞へと共トランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を、抗体の分泌および特異性について試験した（空ベクター（および分子クローニングされた非関与ｍＡｂベクター）をトランスフェクトされた細胞を対照として用いた）。馴化培地についてのウェスタンブロット解析（抗ヒト重鎖抗体および抗ヒト軽鎖抗体により発色される）により、ｃｈ２４Ｆ４をトランスフェクトされた細胞は、重鎖および軽鎖を合成し、効率的に分泌させることが示された。表面ヒトＢＤＣＡ２への直接的なＦＡＣＳ結合により、ｃｈ２４Ｆ４の特異性が確認された。希釈滴定ＦＡＣＳアッセイにより、ｃｈ２４Ｆ４の両方の変異体の結合についてのＥＣ５０は、マウス２４Ｆ４  ｍＡｂの、表面において発現したヒトＢＤＣＡ２への直接結合によるＥＣ５０と同等であった。ｐＹＬ６７２／ｐＹＬ６７１およびｐＹＬ６７０／ｐＹＬ６７１のそれぞれを伴う共トランスフェクションにより、ｃｈ２４Ｆ４−ｈｕＩｇＧ１  κｍＡｂおよびａｇｌｙ  ｃｈ２４Ｆ４−ｈｕＩｇＧ４／Ｇ１ハイブリッド  κｍＡｂを分泌する安定的なＣＨＯ細胞系を作製した。
【０２０４】
（実施例３）
キメラ２４Ｆ４抗体のＣＤＲＬ３内の対合しないシステイン残基の除去
露出したＣＤＲ内の、対合しないシステインは、産物の不均一性または不安定性をもたらしうるので、ｃｈ２４Ｆ４の変異体であるＣ９５ＳおよびＣ９５Ｔを、ｃｈ２４Ｆ４軽鎖の発現ベクタープラスミドであるｐＹＬ６７１を鋳型として使用する、部位特異的変異誘発により構築した。
【０２０５】
部位特異的変異誘発は、製造業者の推奨プロトコールに従い、Ａｇｉｌｅｎｔ製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ変異誘発キットを使用して実施した。Ｃ９５Ｓ変異体は、変異誘発プライマー5'    GCA  ACC  TAT  TAC  TGT  CAA  CAA  AGT  AAT  GAG  GAT  CCT  CGG  AC  3'（配列番号３８）および新たなＨｉｎｃＩＩ部位を導入したその逆相補体を使用し、プラスミドであるｐＥＡＧ２６７８を作製して構築した。Ｃ９５Ｔ変異体は、変異誘発プライマー5'    CAA  CCT  ATT  ACT  GTC  AGC  AAA  CTA  ATG  AAG  ATC  CTC  GGA  CGT  TCG  3'（配列番号３９）およびＢａｍＨＩ部位を除去したその逆相補体を使用し、プラスミドであるｐＥＡＧ２６７９を作製して構築した。変異させたプラスミドは、導入された制限部位の変化についてスクリーニングすることにより同定した。結果として得られるプラスミド内の全長軽鎖ｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。野生型のｃｈ２４Ｆ４ならびにＣ９５Ｓ変異体ｍＡｂおよびＣ９５Ｔ変異体ｍＡｂは、ｐＹＬ６７２およびｐＹＬ６７１、ｐＥＡＧ２６７８またはｐＥＡＧ２６７９の共トランスフェクションにより、２９３Ｅ細胞内で一過性に発現させた。馴化培地は、トランスフェクションの２日後に採取した。両方の変異体の力価（Ｏｃｔｅｔにより、抗ヒトＦｃチップ上でアッセイされた）も、野生型ｃｈ２４Ｆ４の力価と同様であり、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥのウェスタンブロットは、野生型ｃｈ２４Ｆ４  ｍＡｂと比べて、粗大な凝集または明らかなクリッピングを示さなかった。ＦＡＣＳによる表面ＢＤＣＡ２上の直接結合は、Ｃ９５Ｓ変異体による結合についての見かけのＥＣ５０が、野生型ｃｈ２４Ｆ４の見かけのＥＣ５０と同等であるのに対し、Ｃ９５Ｔ変異体の結合についてのＥＣ５０は、数分の１であることを示した。ｃｈ２４Ｆ４およびＣ９５変異体ｍＡｂを含有する馴化培地を、Ｏｃｔｅｔにより、ヒトＢＤＣＡ２外部ドメインへの結合についてアッセイした。一過性にトランスフェクトされた細胞に由来する馴化培地に由来する抗体を、抗ヒトＦｃチップへと結合させ、次いで、単量体のｈｕＢＤＣＡ２に、Ｏｃｔｅｔチップ上を流動させて、結合および解離について試験した。野生型ｃｈ２４Ｆ４およびＣ９５Ｓ変異体についての、Ｏｃｔｅｔによる結合反応速度および解離反応速度は同等であったが、Ｃ９５Ｔ変異体の解離速度は、野生型ｃｈ２４Ｆ４の解離速度より速かった。これらの結果に基づき、Ｃ９５Ｓを、ヒト化２４Ｆ４軽鎖ＣＤＲＬ３へと組み込んだ。
【０２０６】
（実施例４）
例示的なヒト化２４Ｆ４重鎖およびヒト化２４Ｆ４軽鎖
７つのヒト化（ｈｕ）２４Ｆ４重鎖（ｈｕＩＧＨＶ３−２１＊０１フレームワーク／２４Ｆ４  ＶＨ  ＣＤＲ）およびそれらの対応するＤＮＡ配列の例を下記に示す。各重鎖内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３には、その順に下線を付す。フレームワークの復帰変異は、小文字の太字体で示す。マウス２４Ｆ４に由来するＣＤＲ残基に対する変化は、ＣＤＲ配列内に影を付すことにより示す。可変重鎖のＣＤＲ１（ＣＤＲ  Ｈ１）を、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従い定義するが、これは、Ｋａｂａｔ定義より５アミノ酸長く、ＣＤＲ  Ｈ１内の斜字体の残基により、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ  Ｈ１を形成する、さらなる５つのアミノ酸（すなわち、ＧＦＴＦＳ（配列番号１２））を確認する。可変重鎖ドメインの最Ｎ末端のアミノ酸（すなわち、変化形であるＨ０内、Ｈ１内、Ｈ２内、およびＨ３内のグルタミン酸、ならびに変化形であるＨ４内、Ｈ５内、およびＨ６内のアスパラギン酸）は、抗原に直接接触し、結合アフィニティーに影響を及ぼし得る。Ｋａｂａｔによる４９位の埋もれた残基は、重鎖（変化形であるＨ０、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３におけるセリン；ならびに変化形であるＨ４、Ｈ５、およびＨ６におけるアラニン）のＣＤＲ２のコンフォメーションに影響を及ぼしうる。Ｋａｂａｔによる９３位の残基は、重鎖−軽鎖間対合（変化形であるＨ０、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３におけるアラニン；ならびに変化形であるＨ４、Ｈ５、およびＨ６におけるトレオニン）に対する効果を及ぼしうる。マウス２４Ｆ４のＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、およびＣＤＲ  Ｈ３と異なるＣＤＲ  Ｈ１領域、ＣＤＲ  Ｈ２領域、およびＣＤＲ  Ｈ３領域におけるアミノ酸残基に影を付す。
【化１０−１】
2019146567.tif 000020
【化１０−２】
2019146567.tif 000021
変化形であるＨ０〜Ｈ６のアミノ酸配列のアライメントを下記に示す：
【化１１】
2019146567.tif 000022
【０２０７】
３つのヒト化２４Ｆ４軽鎖（ｈｕＩＧＫＶ１−１３＊０２フレームワーク／２４Ｆ４  ＶＬ  ＣＤＲ）およびそれらの対応するＤＮＡ配列の例を下記に示す。各軽鎖内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３には、その順に下線を付す。全ての軽鎖におけるＣｙｓ９１を置換したＳｅｒ９１（Ｋａｂａｔの番号付けに従う）を強調する。可変軽鎖ドメインの最Ｎ末端のアミノ酸（すなわち、変化形であるＬ０内のアラニン、ならびに変化形であるＬ１およびＬ２内のアスパラギン酸）は、抗原に直接接触し、結合アフィニティーに影響を及ぼし得る。フレームワークの復帰変異は、小文字の太字体で示す。第１の変化形（Ｌ０）の含有する復帰変異は最も少なく、第３の変化形（Ｌ２）の含有する復帰変異は、最も多い（すなわち、「ヒト化」が最小限である）。
【化１２】
2019146567.tif 000023
変化形であるＬ０〜Ｌ２のアミノ酸配列のアライメントを下記に示す：
【化１３】
2019146567.tif 000024
【０２０８】
上記のヒト化ＶＨアミノ酸配列およびヒト化ＶＬアミノ酸配列は、潜在的なＮ結合グリコシル化部位またはＡｓｎ−Ｇｌｙ脱アミド化部位を含有しない。生殖細胞系列の配列では、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのいずれにおけるメチオニンも観察されており、表面に露出していないので、メチオニン酸化の危険性は最小限であると考えられる。
【０２０９】
タンパク質の溶解度は、それらのｐＩと相関しうる。デザインされた構築物のｐＩは、Bjellqvistら（Electrophoresis、１４巻：１０２３〜３１頁（１９９３年）；Electrophoresis、１５巻：５２９〜３９頁（１９９４年））におけるアミノ酸のｐＫを使用して計算した。下記に示す値は、ヒトＩｇＧ１重鎖を使用して計算した。ヒト化抗体の各々のｐＩは、７を著明に上回り、したがって、中性のｐＨにおいて著明な陽性電荷を有することが期待される。表中の各数値は、完全組合せ抗体の計算されたｐＩ値であり、括弧内に正味の電荷を記す。
分子                ｐＩの計算値（正味の電荷）
キメラ２４Ｆ４      ６．９４  （−２）
ヒト化Ｈ４Ｌ１      ７．２６  （０）
【０２１０】
（実施例５）
Ｈｘ／Ｌ１のＢＤＣＡ２への結合
ｈｕ２４Ｆ４重鎖およびｈｕ２４Ｆ４軽鎖の２１の可能な変異体の全て（実施例４において記載されている）ならびにｃｈ２４Ｆ４は、重鎖プラスミドと軽鎖プラスミドとの共トランスフェクションにより、２９３Ｅ細胞内で一過性に発現させた。ｈｕ２４Ｆ４の全ての変化形は、ｃｈ２４Ｆ４の力価（Ｏｃｔｅｔの抗ヒトＦｃチップへの結合による、馴化培地中のｍＡｂの定量化により決定される）を超える力価でアセンブルし、分泌させた。キメラ２４Ｆ４  ｍＡｂおよびヒト化２４Ｆ４  ｍＡｂについての非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のウェスタンブロットは、ｃｈ２４Ｆ４と比べて、粗大な凝集または明らかなクリッピングの証拠を示さなかった。
【０２１１】
馴化培地は、全長ＢＤＣＡ２とＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡ（ヒトまたはカニクイザル）とを共発現させる（関連する発現ベクターは、ヒトＢＤＣＡ２／ＦｃεＲＩγがｐＥＡＧ２４５６であり、カニクイザルＢＤＣＡ２／ＦｃεＲＩγがｐＥＡＧ２６６８である）、安定的にトランスフェクトされたＤＧ４４  ＣＨＯ細胞についての直接結合ＦＡＣＳによりアッセイした。表面ヒトＢＤＣＡ２または表面カニクイザルＢＤＣＡ２への直接結合では、ｈｕ２４Ｆ４変異体のＨ０シリーズ、Ｈ１シリーズ、およびＨ２シリーズについて、結合の完全な喪失が観察され、ｈｕ２４Ｆ４変異体のＨ３シリーズについて、結合アフィニティーの有意な喪失が観察され、ｈｕ２４Ｆ４変異体のＨ４およびＨ５のいずれのシリーズについても、アフィニティーの良好な保持が観察され、ｈｕ２４Ｆ４変異体のＨ６シリーズについて、結合の中程度の喪失が観察された（図２および３）。直接結合ＦＡＣＳ解析における力価および見かけのＥＣ５０値に基づき、Ｈ４／Ｌ１およびＨ５／Ｌ１を、ｈｕ２４Ｆ４の「最良の」変異体と決定した。
【０２１２】
ｃｈ２４Ｆ４および全てのｈｕ２４Ｆ４変異体ｍＡｂを含有する馴化培地を、ヒトＢＤＣＡ２外部ドメインへの結合について、Ｏｃｔｅｔによりアッセイした。単量体のｈｕＢＤＣＡ２外部ドメインは、タンパク質分解性切断により、精製ｍｕＩｇＧ２ａ  Ｆｃ−ｈｕＢＤＣＡ２融合タンパク質（関連するプラスミド：ｐＥＡＧ２４２３）から調製した。一過性にトランスフェクトされた細胞に由来する馴化培地に由来する抗体を、抗ヒトＦｃチップへと結合させ、次いで、単量体のｈｕＢＤＣＡ２を、Ｏｃｔｅｔチップ上を流動させて、結合および解離について試験した。ｈｕ２４Ｆ４変異体のＨ４およびＨ５のシリーズは、ｈｕＢＤＣＡ２に対する最良のアフィニティーを示した。
【数２】
2019146567.tif 000025
【０２１３】
（実施例６）
ｈｕ２４Ｆ４のアフィニティーの増強
【０２１４】
２４Ｆ４の変化形であるＬ１のＣＤＲ  Ｌ３の対合しないシステイン位置における置換（ｈｕ２４Ｆ４軽鎖の発現ベクターであるｐＹＬ７４０内のＣ９５Ｓ）により、ｈｕ２４Ｆ４のアフィニティーを増強する可能性を調べるため、変化形であるいくつかのＬ１変異体を、部位特異的変異誘発により構築した。対合しないシステインへの復帰変異、すなわち、Ｓ９５Ｃは、プラスミドであるｐＹＬ７４９をもたらす部位特異的変異誘発により構築した。変異体であるＳ９５Ｔ、Ｓ９５Ａ、およびＳ９５Ｖは、プラスミドであるｐＹＬ７５０、ｐＹＬ７５１、およびｐＹＬ７５２のそれぞれをもたらす部位特異的変異誘発により構築した。結果として得られるプラスミド内の全長軽鎖ｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。Ｃ９５変異体であるｈｕ２４Ｆ４  ｍＡｂは、ｈｕ２４Ｆ４  Ｈ４重鎖のｐＹＬ７４６プラスミドまたはｈｕ２４Ｆ４  Ｈ５重鎖のｐＹＬ７４７プラスミドの、ｈｕ２４Ｆ４  Ｌ１変異体軽鎖内のＣ９５ＳのｐＹＬ７４０プラスミド、Ｓ９５ＣのｐＹＬ７４９プラスミド、Ｓ９５ＴのｐＹＬ７５０プラスミド、Ｓ９５ＡのｐＹＬ７５１プラスミド、またはＳ９５ＶのｐＹＬ７５２プラスミドとの共トランスフェクションにより、２９３Ｅ細胞内で一過性に発現させた。馴化培地は、トランスフェクションの２日後に採取した。全ての変異体の力価（Ｏｃｔｅｔにより、抗ヒトＦｃチップ上でアッセイされた）は同様であり、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥのウェスタンブロットは、粗大な凝集または明らかなクリッピングを示さなかった。Ｃ９５変異体ｍＡｂを含有する馴化培地を、ヒトＢＤＣＡ２外部ドメインへの結合について、Ｏｃｔｅｔによりアッセイした。一過性にトランスフェクトされた細胞に由来する馴化培地に由来する抗体を、抗ヒトＦｃチップへと結合させ、次いで、単量体のｈｕＢＤＣＡ２を、Ｏｃｔｅｔチップ上に流動させて、結合および解離について試験した。Ｃ９５Ａ変異体の解離速度が最も遅かった。
【数３】
2019146567.tif 000026
【０２１５】
これらの結果に基づき、見かけの解離速度が最も遅いｈｕ２４Ｆ４  Ｈ４／Ｌ１  Ｃ９５Ｔ変異体およびＨ４／Ｌ１  Ｃ９５Ａ変異体ならびにＨ５／Ｌ１  Ｃ９５Ｔ変異体およびＨ５／Ｌ１  Ｃ９５Ａ変異体のための、安定的なＣＨＯ細胞系を作製した。精製ｈｕ２４Ｆ４  ｍＡｂのために、Ｏｃｔｅｔ結合研究を繰り返した。ｈｕ２４Ｆ４  Ｈ４／Ｌ１  Ｃ９５Ａ変異体を、最有力候補変異体として選択した。プラスミドであるｐＹＬ７４６（ｈｕ２４Ｆ４  Ｈ４重鎖）およびｐＹＬ７５１（ｈｕ２４Ｆ４  Ｌ１軽鎖）の配列は、ＣＨＯ産生細胞系を生成するための発現ベクターの再コードおよび構築のために使用した。
【０２１６】
ｐＹＬ７５１によりコードされる、推定成熟ｈｕ２４Ｆ４  Ｌ１  Ｃ９５Ａ軽鎖のアミノ酸配列を下記に示す（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、およびＣＤＲ  Ｌ３に下線を付す）：
【化１４】
2019146567.tif 000027
【０２１７】
ｐＹＬ７４６によりコードされる、推定成熟ｈｕ２４Ｆ４  Ｈ４−ｈｕＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列を下記に示す（ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、およびＣＤＲ  Ｈ３に下線を付す）：
【化１５】
2019146567.tif 000028
【０２１８】
上記で列挙した成熟重鎖（配列番号４）および成熟軽鎖（配列番号３）からなる抗体を、ＢＩＩＢ０５９と称する。
【０２１９】
（実施例７）
重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の再コード
発現を潜在的に改善するため、アミノ酸配列を変化させずに、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子のヌクレオチド配列を再コードさせた。抗ＢＤＣＡ２軽鎖遺伝子の改変ＤＮＡ配列を下記に示す。アミノ酸１〜２４０は、軽鎖配列を含有する。アミノ酸１〜２２（小文字のヌクレオチド）は、天然軽鎖シグナルペプチドを含有する。成熟Ｎ末端は、アミノ酸２３（Ｄ）で始まる。
【化１６】
2019146567.tif 000029
【０２２０】
抗ＢＤＣＡ２重鎖遺伝子の改変ＤＮＡ配列を下記に示す。アミノ酸１〜４７０は、重鎖配列を含有する。アミノ酸１〜１９（小文字のヌクレオチド）は、天然重鎖シグナルペプチドを含有する。成熟Ｎ末端は、アミノ酸２０（Ｄ）で始まる。
【化１７−１】
2019146567.tif 000030
【化１７−２】
2019146567.tif 000031
【化１７−３】
2019146567.tif 000032
【０２２１】
（実施例８）
発現カセットおよび発現ベクター
重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を切り出し、個別の発現ベクターへとライゲーションした。各遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化配列の転写制御下にある。
【０２２２】
軽鎖を発現させるプラスミドであるｐＪＰ００９はまた、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ｍｕＰＧＫ）初期プロモーター配列およびｍｕＰＧＫポリアデニル化配列を含有するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）のための発現カセットも含有する（図４）。重鎖を発現させるプラスミドであるｐＪＰ０１０はまた、選択マーカーおよびメトトレキサート増幅マーカーとして使用した、ｄｈｆｒ遺伝子のための発現カセットも含有する。プラスミドｐＪＰ００９およびｐＪＰ０１０の鍵となる特色を下記にまとめる。
【数４】
2019146567.tif 000033
【０２２３】
略号：ヒトサイトメガロウイルス前初期（ｈＣＭＶ  ＩＥ）、サルウイルス４０初期（ＳＶ４０Ｅ、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ｍｕＰＧＫ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８耐性）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリンに対する耐性のための細菌遺伝子（β−ラクタマーゼ）。
【０２２４】
プラスミドｐＪＰ００９の完全ヌクレオチド配列を下記に示す。３つのオープンリーディングフレームは、２４Ｆ４軽鎖、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびβ−ラクタマーゼである。
【化１８−１】
2019146567.tif 000034
【化１８−２】
2019146567.tif 000035
【化１８−３】
2019146567.tif 000036
【化１８−４】
2019146567.tif 000037
【０２２５】
プラスミドｐＪＰ０１０の完全ヌクレオチド配列（図５）を下記に示す。３つのオープンリーディングフレームは、２４Ｆ４重鎖、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ、およびβ−ラクタマーゼである。
【化１９−１】
2019146567.tif 000038
【化１９−２】
2019146567.tif 000039
【化１９−３】
2019146567.tif 000040
【化１９−４】
2019146567.tif 000041
【０２２６】
（実施例９）
細胞系の構築
使用した宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）欠損宿主細胞系である、ＣＨＯ−ＤＧ４４であった。ＤＧ４４宿主細胞バンクについて試験し、使用前に、外来作用物質の存在について陰性であることを見出した。抗ＢＤＣＡ２を発現する細胞系を構築するために、ＤＧ４４宿主（ＣＥＲ−００−０５−０１）を使用した。
【０２２７】
再コードさせた抗ＢＤＣＡ２の軽鎖および重鎖のそれぞれを発現させるプラスミドであるｐＪＰ００９およびｐＪＰ０１０を、電気穿孔により宿主細胞系へとトランスフェクトした。αヌクレオシドを欠損させた培地を使用して、ｄｈｆｒを発現させるトランスフェクト体の細胞を選択した。上記で記載したαＭＥＭヌクレオシド非含有培地中の選択の後、蛍光活性化細胞分取とＧｅｎｅｔｉｘ  Ｃｌｏｎｅｐｉｘ  ＦＬ測定器（ＣＥＲ−００−０９−０３）との組合せを使用して、トランスフェクトされたプールを、発現の高度な細胞系について富化した。ＣｌｏｎｅＰｉｘ  ＦＬにより単離された細胞コロニーを、半固体培地から９６ウェルプレートへと採取した。個々のウェルを増殖させ、生産性を評価した。特徴付けのための材料を生成するための、１０Ｌのバイオリアクター内で成長させるために、振とうフラスコによる流加培養解析において最高の力価を示す細胞系（＃４９）を、研究用動物発酵（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）へと移した。
【０２２８】
初回の細胞系スクリーニングをした後、増幅のために、最高の産生細胞系を選択した。最高の細胞系を、メトトレキサート（ＭＴＸ）増幅にかけた。ウェル１つ当たりの細胞０．５個の理論的密度の限界希釈を使用して、増幅されたプールを、３８４ウェルプレートへとサブクローニングした。Ｃｅｌｌａｖｉｓｔａ測定器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）を使用して、３８４ウェルプレートの個々のウェルを、ウェル１つ当たり単一の細胞の存在についてイメージングし、クローン性であることを検証した。
【０２２９】
スケールダウン流加培養振とうフラスコおよび産物品質解析に基づき、増幅が最良の４つのクローン細胞系を選択した。バイオリアクター内で評価したこれらの増幅が最良の４つの細胞系から、プレマスター細胞バンク（Ｐｒｅ−ＭＣＢ）を作製した。バイオリアクターでの性能および産物品質解析に基づき、１つの最有力のサブクローンを選択した。最有力の細胞系のＰｒｅ−ＭＣＢバイアルを、マスター細胞バンク生成のための製造へと移した。
【０２３０】
（実施例１０）
抗ＢＤＣＡ２抗体であるＢＩＩＢ０５９の翻訳後修飾
ａ）酸化
抗ＢＤＣＡ２であるＢＩＩＢ０５９抗体を、エンドＬｙｓＣペプチドマッピングにかけたところ、重鎖のＭｅｔ−２５７、Ｍｅｔ−４３３、およびＴｒｐ−１６３は、酸化を受けやすい部位であることが明らかになった。レベルは、４〜７％の範囲にわたった。実験データは、酸化の大半は、試料調製に関連することを示す。
ｂ）脱アミド化
ＢＩＩＢ０５９抗体のエンドＬｙｓＣペプチドマップ解析により、重鎖内のＡｓｎ−３８９、Ａｓｎ−３９４、およびＡｓｎ−３９５の各々のうちの約２．５％が、脱アミド化され（脱アミド化とスクシンイミド形成との組合せ）、重鎖内のＡｓｎ−３２０のうちの約２．５％が脱アミド化された（スクシンイミド形態で）ことが示された。軽鎖内のＡｓｐ−３２およびＡｓｐ−３４についてのスクシンイミド形態の総量は、約３％であった。軽鎖内のＡｓｐ−３２およびＡｓｐ−３４の組合せによる異性体化は、約５％であった。酸化と同様、これらの修飾のうちの一部は、試料調製に関連しうる。
ｃ）糖化
糖化とは、タンパク質上のアミノ基の、培養培地の成分であるグルコースとの反応により引き起こされる非酵素的修飾である。糖化は、タンパク質内で日常的に検出され、レベルは、細胞培養条件に応じて広範に変化する。ＢＩＩＢ０５９抗体では、非還元タンパク質のインタクト質量解析により測定される糖化のレベルは、約１０％であった。ペプチドマッピング解析では、軽鎖のＬｙｓ−１０７における約０．４６％の糖化、軽鎖のＬｙｓ−１０３における０．２８％の糖化、およびＯ結合重鎖のＬｙｓ−２９５における約０．２％の糖化が明らかとなった。
ｄ）グリコシル化
ＢＩＩＢ０５９の検出可能なＯ結合グリコシル化は認められなかった。
ｅ）他の修飾（例えば、ヒドロキシリシンなど）
解析により、ＢＩＩＢ０５９抗体の重鎖のうちの＜１％が、非グリコシル形態にあることが示された。解析は、抗体内のＡｓｎからＳｅｒへの置換を示さず、抗体内で、未知の修飾または変異が、≧１％のレベルで認められることもなかった。
【０２３１】
（実施例１１）
ＢＩＩＢ０５９の、形質細胞様樹状細胞の細胞表面への直接的な結合
フローサイトメトリーによる全血アッセイを開発して、ＢＩＩＢ０５９の、ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）またはカニクイザルｐＤＣ上のＢＤＣＡ２への結合を評価した。カニクイザル末梢血（Ｔｏｘｉｋｏｎ，Ｉｎｃ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）またはヒト末梢血（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）を、ヘパリンナトリウムを伴う回収試験管内に回収し、室温で維持した。ｐＤＣを同定するためのＦＡＣＳ染色用抗体カクテルを、各全血アリコートへと添加し、ＣＤ２０抗体、ＣＤ１４抗体、ＣＤ１２３抗体、およびＨＬＡ−ＤＲ抗体を取り込ませた。Ａｌｅｘａ６４７で標識されたＢＩＩＢ０５９（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ、ロット番号１７０７３−０５７）、またはＡｌｅｘａ６４７で標識されたｈＩｇＧアイソタイプ対照を、ＦＡＣＳ染色カクテルへと、０〜４０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。血液を、光から保護された氷上で、３０分間にわたりインキュベートした。３０分間後、各々５００μＬずつの全血アリコート（カニクイザル）または各々１００μＬずつの全血アリコート（ヒト）を、１倍濃度のＥａｓｙ  Ｌｙｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１０ｍＬ（カニクイザル）または２ｍＬ（ヒト）で処理し、３７℃で少なくとも１時間にわたりインキュベートした。室温で１０〜１５分間にわたるインキュベーションの後、試料を、１４００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離した。上清をデカントし、白血球（ＷＢＣ）のペレットだけを残した。各ＷＢＣペレットを、５ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中に１％のＢＳＡ＋０．００２％のアジ化Ｎａ＋１ｍＭのＣａＣｌ２＋１ｍＭのＭｇＣｌ２）で洗浄し、１４００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離した。上清をデカントし、各ＷＢＣペレットを、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、９６ウェル丸底プレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へと移した。プレートを、１４００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離した。上清をプレートから放出し、各ＷＢＣペレットを、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。プレートを、１４００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離し、上清をプレートから放出した。洗浄の後（上記の通り）、ＷＢＣを、ＰＢＳ中の１％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）２００μＬ中に再懸濁させ、光から保護して、４℃で一晩にわたり固定した。フローサイトメトリー解析の直前に、６０ミクロンのナイロンメッシュフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＷＢＣを濾過した。次いで、各ペレットを、新規の９６ウェル丸底プレートへと移し、１４００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離した。各ＷＢＣペレットを、２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、蛍光強度を、ＬＳＲＩＩ  ４カラーＦＡＣＳマシン上で測定した。単色補正は、抗マウスＩｇ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅビーズセット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して収集した。解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。ＢＩＩＢ０５９は、カニクイザル細胞およびヒト細胞に、１〜２μｇ／ｍＬ（７〜１３ｎＭ）のＥＣ５０値で同様に結合した（図６）。
【０２３２】
（実施例１２）
ＢＩＩＢ０５９の自己会合の評価
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイとは、ヒトＦｃＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）ＧＳＴに結合する、グルタチオンドナーおよびアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を活用する、ホモジニアス近接アッセイである。多様な濃度の試験抗体をこの混合物に添加した。抗体のＦｃＲＩＩａへの結合は、一価であるので、シグナルを生成するための方法は、ドナービーズおよびアクセプタービーズの両方が抗体を結合させ、次いで会合して、ビーズを２００ｎｍ以内に近づけ、一重項酸素の生成および結果としての光の発光を可能とする場合に限られる。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）測定器により検出される発光のレベルは、自己会合の程度に比例する。
【０２３３】
図７は、ＢＩＩＢ０５９についてのＡｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎの結果を、５ｃ８（陰性対照）およびＬＴ１０５（強力な自己会合を伴う陽性対照）と比較して示す。
【０２３４】
（実施例１３）
ＢＩＩＢ０５９の非特異的結合の評価
交差相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ：ｃｒｏｓｓ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）とは、ｍＡｂ候補の粘着性について予備評価するためのハイスループット法（Jacobsら、Pharm  Res.、２７巻（１号）：６５〜７１頁（２０１０年））である。この方法では、バルクのポリクローナルヒトＩｇＧを、ＮＨＳ活性化クロマトグラフィー樹脂へと化学的にカップリングさせる。次いで、非誘導体化カラム上およびＩｇＧ誘導体化カラム上のＢＩＩＢ０５９の保持時間を、挙動が良好なｍＡｂおよび挙動が不良なｍＡｂの対照パネルと比較した。この方法では、ＢＩＩＢ０５９は、その短い保持時間および小さなＫ’値により証明される通り、非特異的結合の証拠を示さなかった。
【数５】
2019146567.tif 000042
【０２３５】
（実施例１４）
ＢＩＩＢ０５９の安定性の評価
示差走査蛍光測定を使用して、ＢＩＩＢ０５９の安定性を、緩衝液条件の範囲にわたり、初期研究用処方について試験した。タンパク質のアンフォールディングを、１０倍濃度（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの在庫表示の１０００倍濃度に基づく）の最終濃度でＳＹＰＲＯオレンジフルオロフォアを補充した５０μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）中の１０μｇのタンパク質を使用して、９６ウェルフォーマットのＭｘ３００５ｐリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上でモニタリングした。試料を、１℃／分で、２５℃から９５℃へと加熱し、１℃ごとに３回ずつ蛍光強度を測定した。蛍光強度は、温度の関数としてプロットした。Ｔｍは、負の導関数（Ｍｘ３００５ｐソフトウェアにおける「−Ｒ’（Ｔ）」）を取り、導関数プロットの極小値を選択することにより、これらの曲線から導出した。２０ｍＭクエン酸ナトリウムの基礎緩衝液を使用したところ、ｐＨは、５．０〜７．５で変化し、ＮａＣｌ濃度およびスクロース濃度は、５０〜２５０ｍＭで変化した。
【０２３６】
安定性は、これらの緩衝範囲を通して同様であった。図８は、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２５０ｍＭのスクロースによるデータを、ｐＨの関数として示す。研究用遠心分離濃縮器を使用して、スクロースにより高濃度に到達することは困難であるために、スクロースではなく、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を、研究用処方として選択した。
【０２３７】
（実施例１５）
ＢＩＩＢ０５９の撹拌安定性の評価
体積０．２ｍＬのＢＩＩＢ０５９  ｍＡｂ溶液を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に１ｍｇ／ｍＬで、６００ｒｐｍに設定したＬａｂ−Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓモデル４６２６  Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｓｈａｋｅｒを使用して、２ｍＬのガラス製バイアル（Ｗａｔｅｒｓ；ＷＡＴ２７０９４６Ｃ）内、室温で、反転振とうにかけた。凝集は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６４０分光光度計を使用して、３２０ｎｍにおける濁度の増加をモニタリングすることにより評価した。ＢＩＩＢ０５９は、時間に依存する凝集を示した。通常、野生型のヒトＩｇＧ１抗体は、これらの撹拌条件下では凝集しない。図９に示す通り、一般的な製剤賦形剤である、０．０３％のＴｗｅｅｎ  ８０を添加することにより、凝集は完全に抑制された。撹拌により誘導される凝集は、場合によって、高度にｐＨ依存的でありうる。非グリコシルＩｇＧ４／ＩｇＧ１は、ＢＩＩＢ０５９より急速でより広範な凝集を示した。また、非グリコシルＩｇＧ４／ＩｇＧ１の凝集も、Ｔｗｅｅｎ  ８０を添加することにより抑制された。
【０２３８】
（実施例１６）
ＢＩＩＢ０５９の粘度の評価
ＢＩＩＢ０５９試料の安定性および粘度を、１５０ｍｇ／ｍＬ以上の高濃度で測定して、皮下投与のための生成物の潜在的な開発を裏付けた。ＢＩＩＢ０５９の溶液を、超遠心分離濃縮管（ｕｌｔｒａ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ｔｕｂｅ）内で遠心分離して、体積を縮減し、達成された濃度を、ＵＶスキャンにより決定した。安定性は、２〜８℃で１週間および２週間にわたり保管した後で、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した。２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６、１５０ｍＭのＮａＣｌによる緩衝液中に、２００ｍｇ／ｍＬを超えるタンパク質濃度が、少量のタンパク質に対してたやすく達成され、２〜８℃で２週間後においても、凝集物は、低量にとどまった（０．６８％）。粘度は、Ｖｉｓｃｏｐｒｏ  ２０００測定器（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を使用して測定した。クエン酸塩／食塩緩衝液中に１５０ｍｇ／ｍＬのときの粘度は、８ｃＰに過ぎなかった。これらの結果は、高濃度のＢＩＩＢ０５９処方が達成可能であることを裏付ける。
【０２３９】
（実施例１７）
ヒトＢＤＣＡ２遺伝子のクローニング
全長ヒトＢＤＣＡ２（ｈｕＢＤＣＡ２）のｃＤＮＡを、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ４ＴＯＰＯクローニングベクター内にサブクローニングし、このプラスミドをｐＥＡＧ２３６７と命名した。ＤＮＡ配列決定により、そのｃＤＮＡは、参照のＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿１３０４４１における全長ヒトＢＤＣＡ２のｃＤＮＡと同一であることが確認された。ｐＥＡＧ２４２０によりコードされるｈｕＢＤＣＡ２の全長オープンリーディングフレームを下記に示し、ＴＭ−ＨＭＭにより予測される膜貫通ドメインに下線を付す：
【化２０】
2019146567.tif 000043
【０２４０】
Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４０９７内の参照配列と同一な、ｐＥＡＧ２４１３によりコードされるｈｕＦｃεＲＩγ全長オープンリーディングフレームを、下記に示す：
【化２１】
2019146567.tif 000044
【０２４１】
ヒトＢＤＣＡ２  ｃＤＮＡおよびヒトＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡの両方を、タンデムの転写単位で共発現させるＣＨＯ発現ベクターは、ｐＥＡＧ２４１３に由来する２．１１ｋｂのＳｐｅＩ断片を、ｐＥＡＧ２４２０の、ホスファターゼ処理された線状化６．７１ｋｂのＳｐｅＩベクター骨格へとサブクローニングすることにより構築する結果として、ｐＥＡＧ２４５６と命名された「ユニベクター」をもたらした。ｐＥＡＧ２４２０内のヒトＢＤＣＡ２  ｃＤＮＡおよびＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡを配列確認した。ＢＤＣＡ２  ｃＤＮＡおよびＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡを安定的に共発現させる、安定的なＣＨＯ細胞系は、ｐＥＡＧ２４５６によるトランスフェクションにより作製した。
【０２４２】
（実施例１８）
カニクイザルＢＤＣＡ２遺伝子およびアカゲザルＢＤＣＡ２遺伝子のクローニング
ｐＥＡＧ２３８４およびｐＥＡＧ２３８３内で観察されるＳＮＰ形態のうちの１つによりコードされる、推定マカクザルＢＤＣＡ２のオープンリーディングフレームを下記に示す。下記では、このＳＮＰ形態を、カニクイザルＢＤＣＡ２のＥ７３  ＳＮＰ形態と称する。アカゲザルでも、カニクイザルＢＤＣＡ２のＥ７３  ＳＮＰ形態と同一な単一の配列が観察された。
【化２２】
2019146567.tif 000045
【０２４３】
カニクイザルＢＤＣＡ２の第２のＳＮＰ形態では、上記で強調した残基７３（ＧＡＡ＝Ｇｌｕ、Ｅ）が、リシン（ＡＡＡ＝Ｌｙｓ、Ｋ）である。この第２のＳＮＰ形態を、カニクイザルＢＤＣＡ２のＫ７３  ＳＮＰ形態と称する。ヒトＢＤＣＡ２では、残基７３は、グルタミン酸である。９０．６％の同一性を共有する、ヒトＢＤＣＡ２配列（上）と、マカクザルＢＤＣＡ２配列（下）との、ギャップ処理されたアライメントを、下記に示す。潜在的なＮ結合グリコシル化部位に影を付す。マカクザルＢＤＣＡ２は、ヒトにおいて存在する１つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位を欠く（ヒトの１３７〜１３９におけるＮＳＳ対マカクザルにおけるＮＳＡ）。
【化２３】
2019146567.tif 000046
【０２４４】
コンセンサスのカニクイザルＦｃεＲＩγオープンリーディングフレームを下記に示す：
【化２４】
2019146567.tif 000047
【０２４５】
カニクイザルＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＭ＿００１１１５５８５において記載されている、予測されるアカゲザルｃＤＮＡの配列（ゲノムの短い読取りに基づく）、およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈの科学者により、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４８５８１６として寄託されたカニクイザル配列との完全なマッチ配列である。カニクイザルＦｃεＲＩγタンパク質配列がヒトＦｃεＲＩγタンパク質と共有する同一性は、９８．９％であり、単一の保存的置換だけで異なる。ヒトＦｃεＲＩγ（上）と、カニクイザルＦｃεＲＩγ（下）との間のアライメントを下記に示す：
【化２５】
2019146567.tif 000048
【０２４６】
ＢＤＣＡ２  ｃＤＮＡおよびＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡの両方のカニクイザルＥ７３  ＳＮＰ形態をタンデムの転写単位で共発現させるＣＨＯ発現ベクターは、ｐＣＮ６５２に由来する２．１１ｋｂのＳｐｅＩ断片を、ｐＣＮ６５４の、ホスファターゼ処理された線状化６．７２ｋｂのＳｐｅＩベクター骨格へとサブクローニングすることにより構築する結果として、ｐＥＡＧ２６６８と命名された「ユニベクター」をもたらした。ｐＥＡＧ２６６８内のカニクイザルＢＤＣＡ２  ｃＤＮＡおよびＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡを配列確認した。ＢＤＣＡ２  ｃＤＮＡおよびＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡを安定的に共発現させる、安定的なＣＨＯ細胞系は、ｐＥＡＧ２６６８によるトランスフェクションにより作製した。
【０２４７】
（実施例１９）
ヒトＢＤＣＡ２とカニクイザルＢＤＣＡ２との交差反応性
カニクイザルＥ７３／Ｋ７３  ＢＤＣＡ２  ＳＮＰが、抗ＢＤＣＡ２抗体の結合に影響を及ぼしたのかどうかを決定するために、２９３Ｅ細胞に、ＥＧＦＰレポーターを保有する発現ベクター（ｐＥＡＧ１４５８）ならびにＢＤＣＡ２  ｃＤＮＡおよびＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡを保有する発現ベクター（ヒトＢＤＣＡ２：ｐＥＡＧ２４２０およびヒトＦｃεＲＩγ：ｐＥＡＧ２４１３；カニクイザルＥ７３  ＢＤＣＡ２：ｐＣＮ６５２またはカニクイザルＫ７３  ＢＤＣＡ２：ｐＣＮ６５６およびカニクイザルＦｃεＲＩγ：ｐＣＮ６５２）を、１：１：１のモル比で共トランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を採取し、直接結合希釈滴定ＦＡＣＳにおいて、ＰＥ結合体化Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗ヒトＢＤＣＡ２  ＡＣ１４４  ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；型番１３０−０９０−５１１）で染色し、緑色のＥＧＦＰ陽性細胞に対してゲートをかけた。図１０は、ＡＣ１４４の、ヒト表面ＢＤＣＡ２およびカニクイザル表面ＢＤＣＡ２への直接結合を示す。
【０２４８】
見かけのＥＣ５０は、ヒトＢＤＣＡ２ならびにカニクイザルＢＤＣＡ２のＥ７３  ＳＮＰ形態およびＫ７３  ＳＮＰ形態の両方について本質的に同等である。この結果を踏まえ、ヒトＢＤＣＡ２／ＦｃεＲＩγ発現ベクターであるｐＥＡＧ２４５６およびカニクイザルＥ７３  ＳＮＰ  ＢＤＣＡ２／ＦｃεＲＩγ発現ベクターであるｐＥＡＧ２６６８を使用して、全長表面ＢＤＣＡ２のための安定的なＣＨＯトランスフェクト体を生成した。これらの細胞系を、ヒト／カニクイザル交差反応性の抗ＢＤＣＡ２抗体のトリアージに使用した。
【０２４９】
（実施例２０）
ヒトおよびカニクイザルＢＤＣＡ２外部ドメインのＦｃ融合構築物
ヒトおよびカニクイザルＢＤＣＡ２  ＥＣＤの５つのＦｃ融合構築物を操作した。構築物のうちの３つでは、ＢＤＣＡ２を、Ｇ４Ｓリンカー配列を介して、ヒトＩｇＧ１ヒンジおよびヒトＩｇＧ１  ＦｃのＣ末端へと結合させた。構築物のうちの２つでは、Ｇ４Ｓリンカーを、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位であるＥＮＬＹＦＱＣで置きかえた。
【０２５０】
ＢＤＣＡ２は、ＩＩ型膜タンパク質（Ｃ末端は、細胞の外側にある）であるので、可溶性Ｆｃ融合タンパク質のデザインは、ＢＤＣＡ２のＣ末端外部ドメイン（ヒトＢＤＣＡ２では、残基４５〜２１３）を、操作されたＩｇＧ  ＦｃのＣ末端へと付加することを伴い、その分泌は、インフレームのマウスκ軽鎖シグナル配列により駆動された。全長ｈｕＢＤＣＡ２構築物であるｐＥＡＧ２３６７は、ＰＣＲのための鋳型として、プライマー5'    CAG  TGT  CTG  TTT  CAC  TCC  CGG  GGG  TGG  CGG  TGG  TAG  CAA  TTT  TAT  GTA  TAG  C  3'（配列番号７４）（５’側ＸｍａＩ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）およびＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを、ｈｕＢＤＣＡ２外部ドメインの５’末端の直前に付加する）および5'    CCA  GGG  AGA  ATA  GGA  TCC  TTA  TAT  GTA  GAT  CTT  3'（配列番号７５）（３’側のＢａｍＨＩ部位を、ｈｕＢＤＣＡ２ターミネーターの直後に付加する）と共に使用した。０．５６ｋｂのＰＣＲ産物を精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩＴＯＰＯクローニングベクターへとサブクローニングし、ｐＥＡＧ２４１７を作製し、そのインサートのｃＤＮＡ配列を確認した。ｐＥＡＧ２４１７に由来する、０．５３ｋｂのＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ｐＥＡＧ１３９７に由来する、０．７５ｋｂのＮｏｔＩ−ＸｍａＩ断片（その分泌が、インフレームの操作されたマウスκ軽鎖シグナル配列により駆動される、操作されたｈｕＩｇＧ１  Ｆｃを保有する）とを、発現ベクターであるｐＶ９０に由来する、１．８９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩベクター骨格断片および４．１７ｋｂのＸｂａＩ−ＮｏｔＩベクター骨格断片によりライゲーションし、ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ−ｈｕＢＤＣＡ２融合タンパク質の発現ベクターであるｐＥＡＧ２４２１を作製し、そのｃＤＮＡインサート配列を確認した。ｐＥＡＧ２４２１によりコードされる、推定オープンリーディングフレームを、下記に示す：
【化２６】
2019146567.tif 000049
κ軽鎖シグナル配列：上記の残基１〜１９（斜字体）
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ：上記の残基２０〜２５０
Ｇ４Ｓリンカー：上記の残基２５１〜２５５（太字体）
ｈｕＢＤＣＡ２外部ドメイン：上記の残基２５６〜４２４（下線を付した）。
【０２５１】
ｍｕＩｇＧ２ａ  Ｆｃ−ｈｕＢＤＣＡ２融合タンパク質のための発現ベクターを構築するために、ｐＥＡＧ２４１７に由来する、０．５３ｋｂのＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ｐＥＡＧ１４４２に由来する、０．７５ｋｂのＮｏｔＩ−ＸｍａＩ断片（その分泌が、インフレームの操作されたマウスκ軽鎖シグナル配列により駆動される、操作されたマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃを保有する）とを、発現ベクターであるｐＶ９０に由来する、１．８９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩベクター骨格断片および４．１７ｋｂのＸｂａＩ−ＮｏｔＩベクター骨格断片によりライゲーションし、ｐＥＡＧ２４２３を作製し、そのｃＤＮＡインサート配列を確認した。ｐＥＡＧ２４２３によりコードされる、推定オープンリーディングフレームを、下記に示す：
【化２７】
2019146567.tif 000050
κ軽鎖シグナル配列：上記の残基１〜１９（斜字体）
マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ：上記の残基２０〜２５１Ｇ４Ｓリンカー：上記の残基２５２〜２５６（太字体）
ｈｕＢＤＣＡ２外部ドメイン：上記の残基２５７〜４２５（下線を付した）。
【０２５２】
Ｆｃ−ｈｕＢＤＣＡ２融合タンパク質を産生する、安定的なＣＨＯ細胞系を、発現ベクターであるｐＥＡＧ２４２１およびｐＥＡＧ２４２３によるトランスフェクションにより作製した。これらの融合タンパク質を、候補をスクリーニングする間の、抗体トリアージのためのＥＬＩＳＡアッセイおよびＯｃｔｅｔ結合アッセイにおいて使用した。
【０２５３】
カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＢＤＣＡ２を操作して、Ｆｃ融合タンパク質を作製するために、構築物ｐＣＮ６４８内のカニクイザルＢＤＣＡ２の全長Ｅ７３  ＳＮＰ変異体を、プライマー5'  CTC  TGT  GTC  TGT  TTC  ACT  CCC  GGG  GGT  GGC  GGT  GGT  AGC  AAT  TTT  ATG  TAT  AGC  3'（配列番号７８）およびその逆相補体による部位特異的変異誘発にかけて、５’側ＸｍａＩ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）およびＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを、ｈｕＢＤＣＡ２外部ドメインの５’端の直前に付加することから、構築物であるｐＥＡＧ２６７５を作製し、そのｃＤＮＡインサート配列を確認した。ｍｕＩｇＧ２ａ  Ｆｃ−カニクイザルＢＤＣＡ２融合タンパク質のための発現ベクターを構築するために、ｐＥＡＧ２６７５に由来する、０．５３ｋｂのＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ｐＥＡＧ１４４２に由来する、０．７５ｋｂのＮｏｔＩ−ＸｍａＩ断片（その分泌が、インフレームの操作されたマウスκ軽鎖シグナル配列により駆動される、操作されたマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃを保有する）とを、発現ベクターであるｐＶ９０に由来する、１．８９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩベクター骨格断片および４．１７ｋｂのＸｂａＩ−ＮｏｔＩベクター骨格断片によりライゲーションし、ｐＥＡＧ２６７７を作製し、そのｃＤＮＡインサート配列を確認した。ｐＥＡＧ２６７７によりコードされる、推定オープンリーディングフレームを、下記に示す：
【化２８】
2019146567.tif 000051
κ軽鎖シグナル配列：上記の残基１〜１９（斜字体）
マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ：上記の残基２０〜２５１
Ｇ４Ｓリンカー：上記の残基２５２〜２５６（太字体）
カニクイザルＢＤＣＡ２外部ドメイン：上記の残基２５７〜４２４（下線を付した）。
【０２５４】
Ｆｃ−カニクイザルＢＤＣＡ２融合タンパク質を産生する、安定的なＣＨＯ細胞系を、発現ベクターであるｐＥＡＧ２６７７によるトランスフェクションにより作製した。
【０２５５】
ｍｕＩｇＧ２ａ  Ｆｃ−ＢＤＣＡ２融合タンパク質を、限定タンパク質分解にかけて、単量体のＢＤＣＡ２外部ドメインタンパク質を単離した。組換え可溶性ＢＤＣＡ２外部ドメインの単離を容易とするため、新たなＦｃ融合構築物を構築し、そのＦｃのＣ末端と、ＢＤＣＡ２外部ドメインのＮ末端との間に、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を挿入した。ＦｃのＣ末端へと融合させるための５’側ＸｍａＩ部位（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）に続いて、ＢＤＣＡ２配列の残基４５へと融合させたインフレームのＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＧ）、およびＢＤＣＡ２のターミネーターに続く３’側ＢａｍＨＩ部位を伴う、操作されたヒトまたはカニクイザルＢＤＣＡ２外部ドメインを保有するＳｙｎｇｅｎｅをデザインし、それらの独自のｐＵＣ５７−ａｍｐクローニングベクター内のＸｍａＩ−ＢａｍＨＩインサートとしてのＧｅｎｅＷｉｚにより送達した。操作されたＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ  ＴＥＶ−ＢＤＣＡ２外部ドメインｃＤＮＡ構築物であるｐＥＡＧ２９１７（ヒト）内およびｐＥＡＧ２９１８（カニクイザル）内のインサートの配列を確認した。ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ−ＴＥＶ−ＢＤＣＡ２融合タンパク質のための、ｐＶ９０−ＩＲＥＳ−ｄｈｆｒベースのＣＨＯ発現ベクターを構築するために、ｐＥＡＧ１３９７の０．７５ｋｂのＮｏｔＩ−ＸｍａＩ断片、およびｐＥＡＧ２９１７またはｐＥＡＧ２９１８のいずれかに由来する０．５４ｋｂのＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＸＪＣ１９４の５．４ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩベクター骨格断片へとサブクローニングすることから、ｐＥＡＧ２９３７（Ｆｃ−ｈｕＢＤＣＡ２）またはｐＥＡＧ２９３８（Ｆｃ−カニクイザルＢＤＣＡ２）を作製した。ｐＥＡＧ２９３７内およびｐＥＡＧ２９３８内のインサートｃＤＮＡを配列確認した。安定的なＣＨＯ細胞系を、ｐＥＡＧ２９３７およびｐＥＡＧ２９３８によるトランスフェクションにより生成した。ｐＥＡＧ２９３７によりコードされる、ｈｕＦｃ−ＴＥＶ−ｈｕＢＤＣＡ２融合タンパク質の推定オープンリーディングフレームを、下記に示す：
【化２９】
2019146567.tif 000052
κ軽鎖シグナル配列：上記の残基１〜１９（斜字体）
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ：上記の残基２０〜２５０
ＴＥＶ切断部位：上記の残基２５１〜２５７（太字体）
ｈｕＢＤＣＡ２外部ドメイン：上記の残基２５８〜４２６。
【０２５６】
ｐＥＡＧ２９３８によりコードされる、ｈｕＦｃ−ＴＥＶ−カニクイザルＢＤＣＡ２融合タンパク質の推定オープンリーディングフレームを、下記に示す：
【化３０】
2019146567.tif 000053
κ軽鎖シグナル配列：上記の残基１〜１９（斜字体）
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ：上記の残基２０〜２５０
ＴＥＶ切断部位：上記の残基２５１〜２５７（太字体）
カニクイザルＢＤＣＡ２外部ドメイン：上記の残基２５８〜４２５（下線を付した）。
【０２５７】
（実施例２１）
ＢＩＩＢ０５９のＢＤＣＡ２−Ｆｃ融合タンパク質への結合
溶液中のｈｕＢＤＣＡ２−Ｆｃに結合するＢＩＩＢ０５９の能力を、ＳＥＣにより評価した（図１１）。単独で解析したところ、ＢＩＩＢ０５９（上パネル）およびｈｕＢＤＣＡ２（中パネル）は、約１５０ｋＤａの分子質量を伴う単一の鋭利なピークとして溶出した。ＢＩＩＢ０５９とｈｕＢＤＣＡ２−Ｆｃとを併せて混合し、解析した（下パネル）ところ、クロマトグラムのより前の位置におけるそれらの溶出から明らかな通り、ＢＩＩＢ０５９およびｈｕＢＤＣＡ２−Ｆｃの、＞５５０ｋＤａというより大きな質量へのシフトが見られた。溶出ピークの不均一性はおそらく、ＢＩＩＩＢ０５９およびＢＤＣＡ２−Ｆｃの両方とも、各々が２つの結合部位を含有し、その結果、化学量論が異なるＢＩＩＢ０５９およびＢＤＣＡ２の多数の複合体が形成されるという事実により引き起こされる。
【０２５８】
カニクイザルＢＤＣＡ２  ＥＣＤの、ＢＩＩＢ０５９への結合を、ＳＥＣによってもまた評価したところ、より大きな分子質量複合体への定量的シフトが同様にもたらされた。
【０２５９】
（実施例２２）
カルシウムは、ＢＩＩＢ０５９の、ＢＤＣＡ２への結合を増強する
カルシウムまたはＥＤＴＡの存在下における、ＢＩＩＢ０５９の、マウスＦｃへと融合させたヒトＢＤＣＡ２（ｈｕＢＤＣＡ２−ｍｕＦｃ）への結合を、Ｏｃｔｅｔ結合アッセイにおいて研究した。ｈｕＢＤＣＡ２−ｍｕＦｃタンパク質を、抗マウスＦｃバイオセンサー上で捕捉した後、ＢＩＩＢ０５９の会合ステップおよび解離ステップを行った。全てのステップは、１０ｍＭのＣａＣｌ２または１０ｍＭのＥＤＴＡのいずれかを含有する、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０、および０．００１％のアジド中で行った。
【０２６０】
図１２は、ＢＩＩＢ０５９の結合が、ＥＤＴＡと比べたカルシウムの添加により増強され、約２倍のシグナルをもたらすことを示す。会合速度および解離速度のいずれも、カルシウムの影響を受けた。
【０２６１】
（実施例２３）
結合の測定
Ｏｃｔｅｔを使用して、ＢＩＩＢ０５９の、ＢＤＣＡ２−Ｆｃ融合タンパク質およびＢＤＣＡ２  ＥＣＤへの結合をモニタリングした。図１３は、ＢＩＩＢ０５９を、２０μｇ／ｍＬの濃度で、抗ヒトＦｃ  Ｏｃｔｅｔチップへとロードした、Ｏｃｔｅｔ実験を示す。会合ステップのために、ヒトＢＤＣＡ２  ＥＣＤおよびカニクイザルＢＤＣＡ２  ＥＣＤを、２μｇ／ｍＬの濃度で添加した。この実験のための緩衝液は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０および０．００１％のアジドであった。これらの条件下で、ＢＩＩＢ０５９の、ヒトＢＤＣＡ２  ＥＣＤへの結合と、カニクイザルＢＤＣＡ２  ＥＣＤへの結合とは、同等であった。
【０２６２】
（実施例２４）
ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の阻害についての、ＢＩＩＢ０５９のＩＣ５０値を決定するＰＢＭＣアッセイ
ＢＤＣＡ２とのライゲーションはＢＣＲ様シグナル伝達カスケードを活性化させることが示されており、これにより、ＴＬＲリガンドに応答してＩ型ＩＦＮおよび他のサイトカインを産生するｐＤＣの能力を強力に抑制する（Cao  W.ら、PLoS  Biol.、５巻（１０号）：ｅ２４８頁（２００７年））。ＰＢＭＣによる、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の阻害を、スクリーニングのための初代細胞アッセイとして使用した。
【０２６３】
健常ドナーのヘパリン添加静脈血に由来するＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ上の不連続勾配遠心分離により単離し、ＰＢＳ中で洗浄し、完全培養培地（３％ＦＢＳを伴うＲＰＭＩ）中で再懸濁させた。ウェル１つ当たり１×１０６個の細胞を播種し、ウェル１つ当たり２００μＬの総アッセイ体積中に１０μｇ／ｍＬ〜１ｐｇ／ｍＬの範囲の、ＢＩＩＢ０５９および２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙ（ＢＩＩＢ０５９のＦｃの無能化変化形）またはアイソタイプ対照ｍＡｂの存在下で、１０μｇ／ｍＬのＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ２２１６）により刺激した。プレートは、３７℃で一晩（１８時間）にわたりインキュベートし、ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）において評価するために、上清を回収した。製造業者のプロトコールに従い、アッセイを実施した。ＢＩＩＢ０５９および２４Ｆ４Ａ  ａｇｌｙの力価を試験して、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の阻害についてのＩＣ５０を決定した。のべ１２回の独立の実験により、平均ＩＣ５０を０．００１μｇ／ｍＬとするＢＩＩＢ０５９がもたらされた。非グリコシル化ｍＡｂは、それほど強力ではなく、平均ＩＣ５０を０．００７μｇ／ｍＬを有した（図１４）。
【０２６４】
また、生理学的に関連するリガンド、すなわち、ＳＬＥを伴う患者に由来する血清による刺激の後におけるＩＦＮα産生を阻害する抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂの能力についても試験した。ＳＬＥ血清は、ＴＬＲ９を刺激する、抗ＤＮＡ自己抗体と免疫刺激性低メチル化ＤＮＡとの複合体を介して、Ｉ型ＩＦＮを誘導すると考えられている。ＰＢＭＣを、ＳＬＥ患者に由来する血清（Ｄｒ．Ｇｒｅｇｇ  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、ＮＹＵから提供された）で刺激し、１／５の最終希釈率で使用した。ＢＩＩＢ０５９と１アミノ酸残基異なる、抗体２４Ｆ４Ｓ  Ｈ４／Ｌ１Ｃ９５Ｓは、ＳＬＥ血清で刺激されたｐＤＣからのＩＦＮα産生を完全に阻害した（図１８）。
【０２６５】
（実施例２５）
全血アッセイにおける、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生
ＢＩＩＢ０５９の活性はまた、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の全血アッセイでも評価した。
【０２６６】
全血は、健常ドナーのヘパリン添加静脈血から採取した。ＢＩＩＢ０５９および２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙの用量は、ウェル１つ当たり２００μｌの総アッセイ体積中に１０μｇ／ｍＬ〜１ｐｇ／ｍＬの範囲にわたった。ＣｐＧ−Ａは、全血中のＩＦＮα産生を刺激するのに最適であると決定される、２００μｇ／ｍＬで添加した。プレートは、３７℃で１８時間にわたりインキュベートし、上清は、ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）における使用のために回収した。製造業者のプロトコールに従い、アッセイを実施した。図１５Ａに、実施された６回の独立の実験のうちの代表的な実験を示す。全血中のＴＬＲ９誘導ＩＦＮαアッセイにおけるＢＩＩＢ０５９の阻害効力は、ＰＢＭＣアッセイにおいて認められる効力と同様であった。ｐＤＣ由来サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＬ−６）の阻害に加えて、ＢＩＩＢ０５９処置はまた、多くのサイトカインおよびケモカインの阻害ももたらした（図１５Ｃ）。
【０２６７】
以下の実験を実施して、ＢＩＩＢ０５９が、ＳＬＥ患者に由来する全血においても、健常ボランティアに由来する全血と同様に、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生を阻害しうるのかどうかを決定した。この目的で、２例のＳＬＥ患者または２例の健常対照に由来する全血を、１０μｇ／ｍｌのＢＩＩＢ０５９の存在下で、２００μｇ／ｍｌのＣｐＧＡにより刺激し、ＩＦＮα産生は、ＥＬＩＳＡにより評価した。具体的に、２例のＳＬＥ患者または２例の健常ドナーに由来する全血は、一晩にわたる配送を介して、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＬＬＣにより提供された。着荷したら、血液を、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９またはアイソタイプ対照で処理し、２００μｇ／ｍＬのＣｐＧ−Ａにより刺激し、９６ウェルプレートにまいた。プレートは、３７℃で１８時間にわたりインキュベートし、上清は、ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）における使用のために回収した。製造業者のプロトコールに従い、アッセイを実施した。
【０２６８】
図１５Ｂに示す通り、ＢＩＩＢ０５９は、ＳＬＥ患者に由来する全血中でも、健常ボランティアと比較して同様の効力を示した。
【０２６９】
（実施例２６）
ＢＩＩＢ０５９を媒介するＩ型インターフェロンの阻害の評価
ＢＩＩＢ０５９の阻害活性はまた、合成ＴＬＲアゴニスト（ＣｐＧ−Ａ）またはより生理学的な刺激（ＳＬＥ血清）により刺激された精製ｐＤＣを使用しても確認した。また、他のｐＤＣに由来するサイトカイン（ＩＬ−６）に対するＢＤＣＡ２架橋結合の阻害効果も決定した。定性的ポリメラーゼ連鎖反応およびＥＬＩＳＡなどの様々な手法を使用して、ＢＩＩＢ０５９活性を確認した。
【０２７０】
ａ）Ｑ−ＰＣＲ
ヒトには、１３のＩＦＮαサブタイプおよびＩＦＮβの単一のメンバーが存在する。ＴＬＲ９アゴニストによる刺激は、大半のＩ型ＩＦＮの上方調節を結果としてもたらす（Ito  T.ら、Blood、１０７巻（６号）：２４２３〜３１頁（２００６年））。個々のＩ型ＩＦＮ遺伝子の阻害は、定性的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）アッセイを使用して評価した。
【０２７１】
ｐＤＣは、２ステップの磁気ビーズ分離手順（ＭＡＣＳキット；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して精製した。ウェル１つ当たり５×１０４個のｐＤＣを、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９または１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照の存在下または非存在下において、５μＭのＣＰＧ−Ａで刺激した。総アッセイ体積は、ウェル１つ当たり２００μｌとした。プレートは、３７℃で１８時間にわたりインキュベートし、ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、細胞から抽出し、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、さらに精製した。全てのプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．から購入した。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、オリゴヌクレオチド検量線と比較することにより、各試料について、相対転写物量を決定し、対照（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。
【０２７２】
ＢＩＩＢ０５９による処理は、試験した全てのＩ型ＩＦＮの転写を阻害し、これにより、抗ＢＤＣＡ２抗体であるクローンＡＣ１４４を使用する前出のデータが総括された（Cao  W.ら、PLoS  Biol.、５巻（１０号）：ｅ２４８頁（２００７年））。
【０２７３】
ｂ）ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを使用して、ＢＩＩＢ０５９の、ｐＤＣサイトカインの阻害に対する効果について、タンパク質レベルで試験した。ウェル１つ当たり５×１０４個の精製ｐＤＣを、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９または１０μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照の存在下または非存在下において、５μＭのＣＰＧ−Ａで刺激した。図１７に、３例の試験した健常ドナーのうちの代表的なドナーから測定される、分泌したＩＦＮαおよびＩＬ−６の量を示す。
【０２７４】
ＢＤＣＡ２を、ＢＩＩＢ０５９とライゲーションすることにより、ＩＦＮα産生が強力に阻害され、ＣｐＧ−Ａ刺激により誘導されるＩＬ−６の産生が大幅に低減された。
【０２７５】
（実施例２７）
ＢＩＩＢ０５９に媒介される受容体の内部移行
ＢＤＣＡ２を、抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（クローンＡＣ１４４、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）とライゲーションすることにより、受容体の内部移行が急速に誘導されることが示されている（Dzionek  A.ら、J.  Immunol.、１６５巻（１１号）：６０３７〜４６頁（２０００年））。以下の実験は、ＢＩＩＢ０５９に媒介されるＢＤＣＡ２の内部移行の反応速度を決定することを対象とした。
【０２７６】
ヒト全血を、３７℃で、示される期間にわたり、１０、１、０．１、または０．０１μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９またはアイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ）により処理し、次いで、ＦＩＴＣで標識された非交差遮断型抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（クローン２Ｄ６）、抗ＨＬＡＤＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ１４、および抗ＣＤ２０と共に、４℃で３０分間にわたりインキュベートした。赤血球（ＲＢＣ）は、１倍濃度のＥａｓｙ−ｌｙｓｅ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して溶解させ、残存する細胞を固定した。図１９Ａに、ゲートをかけたＣＤ１４−ＣＤ２０−ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１２３＋ｐＤＣについての２Ｄ６−ＦＩＴＣ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す。ＦＭＯ（蛍光マイナスワン対照）は、２Ｄ６−ＦＩＴＣを差し引いたＦＡＣＳ染色カクテルからなった。この図中のデータは、実施された３回の独立の実験のうちの代表的な実験である。
【０２７７】
図１９Ａに示す通り、１μｇ／ｍｌのＢＩＩＢ０５９と共にインキュベートしたところ、ＦＩＴＣで標識された２Ｄ６染色の強度は急速に低下し、３７℃でのインキュベーションの１時間以内に、バックグラウンドレベルに到達した。１０分の１のＢＩＩＢ０５９濃度（０．１μｇ／ｍｌ）で、エンドサイトーシスの反応速度に影響が及び、エンドサイトーシスを、２時間遅延させた。これは、ＢＩＩＢ０５９とライゲーションすると、ＢＤＣＡ２が、用量依存的反応速度で内部移行されることを裏付ける。
【０２７８】
以下の実験は、ＢＩＩＢ０５９に媒介される受容体の内部移行が、ＩＦＮ阻害に影響を及ぼすのかどうかを確認するために実行した。全血を、健常ドナーのヘパリン添加静脈血から回収し、ＢＩＩＢ０５９（受容体の内部移行を可能とするために）またはアイソタイプ（ｉｓｏｔｏｐｅ）と共に、示される持続期間にわたりプレインキュベートした。プレインキュベーション後の各時点において、細胞を、２００μｇ／ｍＬのＣｐＧＡでチャレンジし、３７℃でさらに１８時間にわたりインキュベートした。ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）における使用のために、上清を回収した。製造業者のプロトコールに従い、アッセイを実施した。図１９Ｂは、実施された３回の独立の実験のうちの代表的な実験である。図１９Ｂに示す通り、９時間後、刺激前の、ＢＩＩＢ０５９を伴うプレインキュベーション（最大の内部移行に対応する）は、ＩＦＮ阻害に影響を及ぼさなかったことから、ＢＤＣＡ２のエンドサイトーシスと、ＴＬＲ９の阻害とが、潜在的に関連していることが示唆された。この仮説について試験するために、ＩＦＮ阻害を媒介することが不可能な抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂを使用し、内部移行の欠如を裏付けた。加えて、本発明者らは、二価結合が、抗ＢＤＣＡ２抗体に媒介されるＩＦＮ阻害に必要であることも既に示した。実際、Ｆａｂ断片は、内部移行もＩＦＮ阻害ももたらさなかった。まとめると、これらのデータは、ＢＤＣＡ２に媒介されるＴＬＲ９阻害が、エンドサイトーシスおよびＴＬＲ９を含有するエンドソーム区画への局在化を必要とする可能性を提起する。この仮説は、ＢＩＩＢ０５９のライゲーションの後における、ＢＤＣＡ２の内部移行および細胞における輸送を追跡する、生体イメージングを使用して試験することができる。
【０２７９】
（実施例２８）
抗体のエフェクター機能
ＢＩＩＢ０５９のＦｃドメインは、完全にグリコシル化されたヒトＩｇＧ１であり、細胞のＦｃγ受容体および補体のいずれに対しても結合能を有し、抗原依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の両方を介する、細胞エフェクター免疫細胞応答の誘導能を有する。ＢＩＩＢ０５９の、Ｆｃ受容体への結合を確認するために、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ由来の増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ）（ＡＬＰＨＡ）技術を使用して、相対結合アフィニティーを測定した（図２０）。アッセイは、試験抗体の段階希釈物を、９６ウェルプレート内、４℃で一晩にわたり、受容体−ＧＳＴ融合タンパク質および抗ＧＳＴアクセプタービーズと共にインキュベートする、競合的フォーマットで実施した。また、ストレプトアビジンドナービーズおよびビオチニル化野生型ＩｇＧ１も、個別の試験管内で、４℃で一晩にわたりインキュベートし、次いで、翌日、アッセイプレートに添加した。プレートは、静かに振とうしながら、室温で２時間にわたりインキュベートし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により読み取った。相対結合アフィニティーを決定するために、データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータ曲線の当てはめに対してプロットして、ＩＣ５０値を計算した。ＦｃγＲＩ：０．０３μｇ／ｍＬ、ＦｃγＲＩＩａ：１１μｇ／ｍＬ、ＦｃγＲＩＩｂ：１７μｇ／ｍＬ、およびＦｃγＲＩＩＩａ：３μｇ／ｍＬに対するＢＩＩＢ０５９のＩＣ５０値を計算した。これらの値は、このアッセイにおける他のヒトＩｇＧ１抗体について観察される値と一致する。また、カニクイザル研究において使用した、２４Ｆ４の、エフェクター機能が小さいＧ４Ｐ／Ｇ１  ａｇｌｙについてのＩＣ５０値も決定した。予測される通り、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、およびＦｃγＲＩＩＩａに対する結合は、検出されず、ＦｃγＲＩへの結合は、１００倍低減された。アッセイでは、ＩｇＧ１  ＷＴフレームワークおよびＧ４Ｐ／Ｇ１  ａｇｌｙフレームワークのいずれにも、５ｃ８抗体を比較物（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）として含ませた。
【０２８０】
（実施例２９）
補体結合
抗体による標的のコーティングは、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを介する、強力な死滅化機構を媒介することが示されている。抗体のこれらのエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域により媒介される。この実験は、ＥＬＩＳＡによりＢＩＩＢ０５９のＣ１ｑへの結合について試験することにより、補体を動員するＢＩＩＢ０５９の能力について試験することを対象とした。
【０２８１】
Ｃ１ｑ結合アッセイは、Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレートを使用して、９６ウェルＥＬＩＳＡフォーマットで実行した。２〜８℃で一晩にわたり、１５μｇ／ｍＬに始まる、ＰＢＳ中に３倍の希釈系列の試験抗体をコーティングし、次いでウェルを、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、０．１Ｍのリン酸Ｎａ、ｐＨ７．２、０．１ＭのＮａＣｌ、０．１％のゼラチン、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０  ２００μｌでブロッキングした。その後、ブロッキング／希釈緩衝液中で希釈された、ウェル１つ当たり５０μｌの２μｇ／ｍＬの、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のヒトＣ１ｑ（Ａ０９９）を添加し、室温で２時間にわたりインキュベートした。吸引および上記の通りに洗浄した後、ブロッキング／希釈緩衝液中で８，０００倍に希釈された、ウェル１つ当たり５０μｌのニワトリＩｇＹ抗ヒトＣ１ｑ（ＳｉｇｍａのヒトＣ１ｑ：Ｃ０６６０を使用する、Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃによる注文生産）を添加した。室温で１．５時間にわたるインキュベーションの後、ウェルを吸引し、上記の通りに洗浄した。次いで、ブロッキング／希釈液中で５，０００倍まで希釈されたロバＦ（ａｂ’）２抗ニワトリＩｇＹ  ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；７０３−０３０−１５５）を、ウェル１つ当たり５０μｌで添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。吸引および上記の通りに洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ基質（０．１Ｍの酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液、ｐＨ４．９中に４２０μＭのＴＭＢ、０．００４％のＨ２Ｏ２）を添加し、２分間にわたりインキュベートしてから、１００μｌの２Ｎ硫酸で停止させた。Ｓｏｆｔｍａｘ  ＰＲＯ測定器で、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取り、Ｓｏｆｔｍａｘソフトウェアを使用して、４パラメータの当てはめにより、相対結合アフィニティー（Ｃ値）を決定した。
【０２８２】
図２１は、ＢＩＩＢ０５９が、Ｃ１ｑに結合することが可能であるのに対し、２４Ｆ４Ａ  ＩｇＧ４．Ｐ／ＩｇＧ１  ａｇｌｙは、Ｃ１ｑへの結合を本質的に欠くことを示す。
【０２８３】
（実施例３０）
細胞枯渇研究
ＢＩＩＢ０５９は、ＢＤＣＡ２とのライゲーションの後、Ｉ型ＩＦＮおよびＩＬ−６の産生を強力に阻害する。これらの実験を実行して、そのアゴニスト活性に加えて、その機能的Ｆｃによって、ＢＩＩＢ０５９により、ＢＤＣＡ２を保有するｐＤＣを枯渇させうるのかどうかも評価した。ＢＩＩＢ０５９の細胞傷害効力を調べるために、ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイにおけるその活性について試験した。
【０２８４】
ａ）ＡＤＣＣアッセイ
ＡＤＣＣとは、免疫系のエフェクター細胞が、その表面受容体に抗体が結合した標的細胞を活発に溶解させる機構である（図２２）。
【０２８５】
ＣＨＯ細胞系（ＥＡＧ２４５６  Ｔ１Ｆ２  クローン  ３４．１６．７）を標的細胞として使用した。ＣＨＯ細胞の表面におけるＢＤＣＡ２の発現レベルは、ＡＰＣで標識された抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（クローンＡＣ１４４、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用するＦＡＣＳにより決定した。ＮＫ細胞を、エフェクター細胞として使用し、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する陰性選択により、全血から分離した。室温で２０分間にわたる、カクテルを伴うインキュベーションの後、ＮＫ細胞を、ｆｉｃｏｌｌ上の不連続勾配遠心分離により単離した。ＣＨＯ細胞およびヒトＮＫ細胞を、５：１（ＮＫ：ＣＨＯ）の比で播種した。エフェクター機能保有抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（２４Ｆ４ＳおよびＢＩＩＢ０５９）、Ｆｃの無能化ｍＡｂ（２４Ｆ４Ｓ−Ａｇｌｙおよび２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙ）、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下、３７℃で４時間にわたりインキュベートした。陰性対照は、抗体を伴わずに、ＣＨＯ細胞およびＮＫ細胞を含有するウェルからなった。Ｔｘ−１００で溶解させたＮＫ細胞およびＣＨＯ細胞は、最大死滅化を決定するのに使用した。ＡＤＣＣは、製造業者の指示に従い、Ｖｙｂｒａｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して評価した。アッセイでは、５３０ｎｍにおける励起の後で、５９０ｎｍにおいて蛍光を発するレサズリンのＧ６ＰＤ依存性還元に基づき、損傷細胞に由来するＧ６ＰＤを検出する。図２２のパネルＡで示されるＡＤＣＣアッセイを、ＢＤＣＡ２発現が多いＣＨＯ細胞を使用して実施する（パネルＣ）一方で、図２２のパネルＢにおけるＡＤＣＣアッセイでは、ＢＤＣＡ２発現が少ないＣＨＯ細胞を使用した（パネルＤ）。
【０２８６】
２４Ｆ４Ｓは、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘによる溶解と同様に、ＢＤＣＡ２を保有するＣＨＯ細胞の１００％の死滅化をもたらした。予測される通り、ｍＡｂの非グリコシル化変化形（２４Ｆ４Ｓ−ａｇｌｙ）は、ＡＤＣＣをもたらさなかった（図２２Ａ）。２４Ｆ４Ｓと比較したところ、ＢＩＩＢ０５９のＡＤＣＣ活性は同一であった（図２２Ｂ）。死滅化効率がＣＨＯ細胞上のＢＤＣＡ２発現のレベルと相関したことは注目に値する（図２２Ｃおよび図２２Ｄ）。
【０２８７】
ｂ）ＣＤＣアッセイ
補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）では、Ｃ１ｑが抗体に結合することで、補体カスケードが作動し、細胞溶解をもたらす（図２３）。実施例２９の節において示される通り、ＢＩＩＢ０５９は、補体成分Ｃ１ｑに効率的に結合しうる。この実験は、ＢＩＩＢ０５９は、ＣＤＣを媒介しうることを確認するために実施した。
【０２８８】
安定的なＣＨＯ−ＢＤＣＡ２／ＦｃεＲＩγトランスフェクト体の細胞（ＥＡＧ２４５６  Ｔ１Ｆ２  クローン  ３４．１６．７）を、９６ウェルコラーゲンブラックウェルプレート内に細胞５×１０４個で播種し、３７℃で４８時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、エフェクター機能保有抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（２４Ｆ４ＳおよびＢＩＩＢ０５９）、エフェクター機能欠損ｍＡｂ（２４Ｆ４Ｓ−Ａｇｌｙおよび２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙ）、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下で、ウサギ血清補体およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共に、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。陰性対照は、抗体を伴わずに、ＣＨＯ細胞、ウサギ血清補体、およびＰＩを含有するウェルからなった。Ｔ−１００ｘで溶解させたＮＫ細胞およびＣＨＯ細胞は、最大死滅化を決定するのに使用した。プレートは、Ｃｙｔｏｆｌｏｕｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅプレートリーダー（ｅｘ５３０／ｅｍ６４５）を使用して読み取った。抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（ＢＩＩＢ０５９および２４Ｆ４Ｓ）は、Ｔｒｉｔｏｎによる溶解と同様に、ＣＤＣによる細胞の死滅化をもたらした。予測される通り、エフェクター欠損非グリコシル化ｍＡｂ（２４Ｆ４Ｓ−Ａｇｌｙおよび２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙ）は、ＣＤＣを媒介しなかった（図２３）。その機能的ＩｇＧ１  Ｆｃ領域により、ＢＩＩＢ０５９は、ＢＤＣＡ２を保有するｐＤＣを枯渇させる潜在力を有する。ＢＩＩＢ０５９は、ＢＤＣＡ２を過剰発現する細胞において細胞傷害活性を及ぼすことが可能であるが、ＢＩＩＢ０５９のライゲーションの後における、急速で、持続的で、ほぼ完全な受容体の内部移行に起因して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの枯渇はないと予測される。
【０２８９】
（実施例３１）
ラットＢＤＣＡ２相同体のクローニングおよびＢＩＩＢ０５９による結合についてのスクリーニング
ヒトＢＤＣＡ２のｃＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩデータベース内のラット配列に対して、ＢＬＡＳＴにかけたところ、最も近縁の相同体は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１００５８９６において記載されている、ラットＣｌｅｃ４ｂ２である。最有力のｈｕ２４Ｆ４  Ｈ４／Ｌ１  Ｃ９５Ａ  ｍＡｂが、ヒトＢＤＣＡ２のラット相同体への結合が可能であるのかどうかを決定するために、ｃＤＮＡをクローニングし、ラットＣｌｅｃ４ｂ２およびラットＦｃεＲＩγのための発現ベクターを構築した。全長ラットＣｌｅｃ４ｂ２タンパク質配列がヒトＢＤＣＡ２と共有する同一性は、５１．０％に過ぎない。ヒトＢＤＣＡ２（上）とラットＣｌｅｃ４ｂ２（下）との、ギャップ処理されたアライメントを下記に示す：
【化３１】
2019146567.tif 000054
【０２９０】
ラットＣｌｅｃ４ｂ２は、プライマー５’GAC  CTT  CTG  AAT  ATA  TGC  GGC  CGC  CAT  GAT  GCA  GGA  AAA  AC  3'（配列番号８３）（５’側のＮｏｔＩ部位およびＫｏｚａｋ配列を、Ｃｌｅｃ４ｂ２のイニシエーターであるメチオニンの直前に付加する）および5'    CCC  ACA  GCC  ATG  GAG  GAC  AGG  ATC  CTC  ATA  AGT  ATA  TTT  TC  3'（配列番号８４）（３’側のＢａｍＨＩ部位を、Ｃｌｅｃ４ｂ２ターミネーターの直後に付加する）を伴うＲＴ−ＰＣＲにより、ラット脾臓の第１鎖ｃＤＮＡからクローニングした。０．６４ｋｂのＲＴ−ＰＣＲ産物を精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１ＴＯＰＯクローニングベクターへとサブクローニングし、構築物ｐＣＮ８１５を作製し、そのインサートを配列決定した。部位特異的変異誘発は、鋳型であるｐＣＮ８１５上で、プライマー5'    CAG  GAT  TTC  ATC  AAC  GGA  ATC  CTA  GAC  ACT  CGT  TGG  G  3'（配列番号８５）およびＰＣＲエラーを補正するためのその逆相補体により実施し、構築物であるｐＣＮ８２２を結果としてもたらし、そのＣｌｅｃ４ｂ２の推定タンパク質配列が、ＮＭ＿００１００５８９６におけるタンパク質配列と同一であることを確認した。ラットＣｌｅｃ４ｂ２全長ｃＤＮＡのための哺乳動物用発現ベクターは、ｐＣＮ８２２に由来する、０．６４ｋｂのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を、発現ベクターであるｐＶ９０に由来する、１．８９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩベクター骨格断片および４．１７ｋｂのＸｂａＩ−ＮｏｔＩベクター骨格断片とライゲーションすることにより構築して、発現ベクターであるｐＣＮ８３４を作製し、そのｃＤＮＡインサート配列を確認した。
【０２９１】
ラットＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１３１００１において記載されている。ラットＦｃεＲＩγタンパク質配列がヒトＦｃεＲＩγと共有する同一性は、９０．７％である：ヒトＦｃεＲＩγタンパク質配列（上）とラットＦｃεＲＩγタンパク質配列（下）とのアライメントを下記に示す：
【化３２】
2019146567.tif 000055
【０２９２】
ラットＦｃεＲＩγ  ｃＤＮＡは、プライマー5'    CCC  AGC  GCT  GCA  GCC  CGC  GGC  CGC  CAT  GAT  CCC  AGC  GGT  3'（配列番号８７）（ＮｏｔＩ部位およびＫｏｚａｋ配列を、ＦｃεＲＩγのイニシエーターであるメチオニンの直前に付加する）および5'    GAA  CAC  GTG  TTG  GGA  TCC  TAT  TGG  GGT  GGT  TTC  TC  3'（配列番号８８）（３’側のＢａｍＨＩ部位を、ＦｃεＲＩγターミネーターの直後に付加する）を伴うＲＴ−ＰＣＲにより、ラット脾臓の第１鎖ｃＤＮＡからクローニングした。０．２７ｋｂのＲＴ−ＰＣＲ産物を精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１ＴＯＰＯクローニングベクターへとサブクローニングし、構築物ｐＣＮ８１６を作製し、そのインサートを配列決定し、そのインサートが、ＮＭ＿００１１３１００１におけるインサートと同一であることを確認した。ｐＣＮ８１６に由来する、０．２７ｋｂのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＢＨＳ１０３に由来する、０．６６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩベクター骨格断片および４．１６ｋｂのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩベクター骨格断片とライゲーションして、哺乳動物発現ベクターであるｐＣＮ８４４を構築し、そのラットＦｃεＲＩγｃＤＮＡインサート配列を確認した。
【０２９３】
最有力のｈｕ２４Ｆ４  Ｈ４／Ｌ１  Ｃ９５Ａ  ｍＡｂが、表面ラットＣｌｅｃ４ｂ２への結合が可能であるのかどうかを決定するために、２９３Ｅ細胞に、ＥＧＦＰレポーター発現ベクター（ｐＥＡＧ１４５８）、およびヒトＢＤＣＡ２／ＦｃεＲＩγベクター（ｐＥＡＧ２４２０およびｐＥＡＧ２４１３）、またはラットＣｌｅｃ４ｂ２／ＦｃεＲＩγベクター（ｐＣＮ８３４およびｐＣＮ８４４）のいずれかを、１：１：１のモル比で、一過性に共トランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を採取し、希釈滴定直接結合ＦＡＣＳアッセイ（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｄｉｒｅｃｔ  ＦＡＣＳ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）において、最有力のｈｕ２４Ｆ４  Ｈ４／Ｌ１  Ｃ９５Ａ  ｍＡｂで染色し、生存ＥＧＦＰ陽性細胞に対してゲートをかけた。ｈｕ２４Ｆ４の、表面ヒトＢＤＣＡ２への高アフィニティー結合が観察されたが、表面ラットＣｌｅｃ４ｂ２への結合は、検出されなかった。これにより、ｈｕ２４Ｆ４は、ヒトＢＤＣＡ２の最も近縁のラット相同体に対する交差反応性を有さないことが示される。
【０２９４】
（実施例３２）
ＢＩＩＢ０５９の、健常カニクイザルへの投与は、おそらく内部移行を介して、ＢＤＣＡ２の、形質細胞様樹状細胞表面からの喪失を結果としてもたらす
ＢＩＩＢ０５９を、カニクイザルへと投与したときに、ＢＤＣＡ２の表面レベルが変化したのかどうかを評価するために、２つのアッセイを使用した。いわゆる「直接的」方法である、第１のアッセイでは、抗ヒトＰＥで標識された二次抗体による、表面結合ＢＩＩＢ０５９を検出する。ＢＤＣＡ２に対する非交差遮断型抗体を使用して、総ＢＤＣＡ２を検出することが理想的であるが、このような抗体は存在しない。したがって、いわゆる「間接的」方法である、第２のアッセイでは、Ａ６４７とコンジュゲートさせたＢＩＩＢ０５９を添加することにより、占有されていないＢＤＣＡ２を検出する。
【０２９５】
任意の試験品を投与する前に、各カニクイザルについて、ＢＩＩＢ０５９のｐＤＣへの結合についての最大平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、３つの異なる時点（ＢＩＩＢ０５９の単回の注射前である、−３、−２、および−１週目）において確立した。各時点において、滴定量の、標識されていないＢＩＩＢ０５９（４０〜０．０４μｇ／ｍＬの最終濃度）を、血液のアリコートへと添加し、ＢＩＩＢ０５９を、ＰＥで標識された二次抗体を使用して検出するか（「直接的」方法）、または遊離ＢＤＣＡ２を、ＢＩＩＢ０５９−Ａ６４７により評価した（「間接的」方法）。最大値は、各アッセイのプラトー状態における値から得た（図２４および２５）。値を評価することにより、各カニクイザルについての最大ＭＦＩのゆらぎは極めてわずかであるが、カニクイザル間の変動は大きいと明らかになったことから、カニクイザルにおけるｐＤＣ上のＢＤＣＡ２密度は変動性であることが示された（表２）。
【表２】
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【０２９６】
全血を、１２例のカニクイザルから、週に１回のべ３週間にわたり採取した。血液を、多様な濃度のヒトＩｇＧ１であるＢＩＩＢ０５９（０．０４〜４０ｕｇ／ｍＬ、６点曲線、１：４倍の希釈物）と共にインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ標識二次抗体で処理して、ＢＩＩＢ０５９の、ｐＤＣ上のＢＤＣＡ２受容体への結合を検出した。ＰＥのＭＦＩは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアによりＥＣ５０曲線を作成した。
【０２９７】
予測される通り、媒体の投与後、ＢＩＩＢ０５９は、見出されず、ＢＩＩＢ０５９−Ａ６４７（１０μｇ／ｍｌ）の結合により評価される通り、ＢＤＣＡ２レベルの有意な変化も見出されなかった（図２６）。
【０２９８】
ＢＩＩＢ０５９を、１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇで静脈内（ＩＶ）投与した後、ＢＩＩＢ０５９注射の１時間後という早期であってもなお、ＢＩＩＢ０５９は、表面上で検出されなかった（図２７および２８）。また、ＢＩＩＢ０５９−Ａ６４７の欠如により評価される通り、３８日間を通して、カニクイザル５を除く全ての処置されたカニクイザルについて、遊離ＢＤＣＡ２はなかった；このカニクイザルにおける血清濃度は、１０日目に急速に降下したが、ＢＩＩＢ０５９に対して発生した免疫原性に起因する可能性があった。
【０２９９】
低用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）のＢＩＩＢ０５９を皮下投与した後、ＢＩＩＢ０５９は、短時間はｐＤＣの表面上で観察された（１時間後における；６時間後までに消失した）。同じ時点（１時間）において、ある程度の遊離ＢＤＣＡ２が観察された（ベースラインＭＦＩの１３％、７４％、７２％）。ここでもまた、研究の残りを通して、薬物は検出されず、ＢＩＩＢ０５９の注射後１４日目まで、遊離ＢＤＣＡ２受容体は検出されなかった（図２９）。
【０３００】
全てのカニクイザルにおいて、遊離ＢＤＣＡ２の再出現は、血清中の薬物レベルの、１μｇ／ｍｌを下回る降下と一致した（図３０および３１）。したがって、１μｇ／ｍｌが、全ての表面ＢＤＣＡ２の内部移行を媒介するのに必要とされるＢＩＩＢ０５９の最低濃度であると考えられる。
【０３０１】
表３は、カニクイザル全血におけるＢＩＩＢ０５９とライゲーションされたときの、ｐＤＣ上のＢＤＣＡ２受容体の内部移行についてのＥＣ１０、ＥＣ５０、およびＥＣ９０をまとめる。４パラメータによる当てはめを使用する、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより、ＥＣ１０−５０−９０曲線を生成した。
【数６】
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【０３０２】
まとめると、この実施例において記載されている実験は、ＢＩＩＢ０５９の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける高用量（１０および１ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ投与により、利用可能なＢＤＣＡ２および結合薬物の両方の、細胞表面からの急速な消失がもたらされることを示し、これにより、受容体の内部移行が示唆される。低用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）のＢＩＩＢ０５９の皮下投与は、ｐＤＣ表面におけるＢＩＩＢ０５９のごく一過性の（１時間における）検出を結果としてもたらした。ｐＤＣ細胞表面上では、６時間までに、ＢＩＩＢ０５９は、検出可能でなくなった。細胞表面における、利用可能なＢＤＣＡ２の再出現は、薬物への曝露が、１μｇ／ｍＬを下回って低下したときに生じた。
【０３０３】
（実施例３３）
ＢＩＩＢ０５９は、全ての種類のＩ型ＩＦＮに加えて、炎症促進性メディエーターも阻害する
ＢＤＣＡ２のライゲーションは、ＴＬＲリガンドに応答してＩ型ＩＦＮを産生するｐＤＣの能力を抑制する（図１６を参照されたい）。抗ＢＤＣＡ２ｍＡｂであるＢＩＩＢ０５９の阻害活性を確認するため、健常ヒトドナーに由来する精製ｐＤＣを、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９またはアイソタイプ対照ｍＡｂの存在下で、合成のＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧ−Ａにより刺激した。具体的には、ヒト健常ドナーに由来するｐＤＣは、２ステップの磁気ビーズ分離手順（ＭＡＣＳキット；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。ウェル１つ当たり５×１０４個の精製ヒトｐＤＣを、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９（ＣｐＧ−Ａ＋ＢＩＩＢ０５９）、またはアイソタイプ対照（ＣｐＧ−Ａ＋Ｉｓｏ）のいずれかの存在下で、非処理（培地）のまま放置するか、または１μＭのＴＬＲ９リガンド（ＣＰＧ−Ａ）により刺激した。ｐＤＣを含有するプレートは、３７℃で１８時間にわたりインキュベートし、炎症性サイトカインおよびケモカインの濃度を測定するＥＬＩＳＡアッセイまたはマルチプレックスアッセイにおける使用のために、上清を回収した。これらの実験は、ＢＩＩＢ０５９が、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮαならびにＴＮＦαおよびＩＬ−６など、他のｐＤＣに由来するサイトカインのほか、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５など、ＴＬＲ−９誘導ケモカインを強力に阻害することを示した（図３２）。
【０３０４】
また、生理学的に関連するリガンドである免疫複合体による刺激の後における、ＩＦＮαおよび炎症促進性メディエーターの産生を阻害するＢＩＩＢ０５９の能力も調べた。具体的には、Ｓｍ／ＲＮＰ免疫複合体（ＩＣ）は、ウシ胸腺に由来するｓｍ−ＲＮＰと、ＳＬＥ患者の血清から精製された抗ＲＮＰ抗体とを、無血清培地中で１時間にわたり混合することによりあらかじめ形成した。ヒト健常ドナーに由来するｐＤＣは、２ステップの磁気ビーズ分離手順（ＭＡＣＳキット；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。ウェル１つ当たり５×１０４個のｐＤＣを、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９（ＩＣ＋ＢＩＩＢ０５９）、またはアイソタイプ対照（ＩＣ＋Ｉｓｏ）のいずれかの存在下で、非処理（培地）のまま放置するか、またはあらかじめ形成されたＳｍ／ＲＮＰ  ＩＣにより刺激した。ｐＤＣを含有するプレートは、３７℃で１８時間にわたりインキュベートし、炎症性サイトカインおよびケモカインの濃度を測定するＥＬＩＳＡアッセイまたはマルチプレックスアッセイにおける使用のために、上清を回収した。これらの研究は、ＢＩＩＢ０５９は、Ｓｍ／ＲＮＰ免疫複合体により誘導されるＩＦＮαならびにＴＮＦαおよびＩＬ−６など、他のｐＤＣに由来するサイトカインを強力に阻害することを示した。ＢＩＩＢ０５９は、ＣＣＬ３およびＣＣＬ４など、Ｓｍ／ＲＮＰ免疫複合体により誘導されるケモカインも阻害した（図３３）。
【０３０５】
（実施例３４）
ＢＩＩＢ０５９は、精製ヒトｐＤＣによる、Ｉ型ＩＦＮサブタイプのＳｍ／ＲＮＰ  ＩＣ誘導転写を阻害する
ヒトには、１３のＩＦＮαサブタイプおよびＩＦＮβの単一のメンバーが存在する。ＢＩＩＢ０５９の、Ｓｍ／ＲＮＰ  ＩＣで刺激された、健常ヒトドナーに由来するｐＤＣにおけるＩ型ＩＦＮサブタイプの転写に対する効果は、定性的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アッセイを使用して評価した。
【０３０６】
Ｓｍ／ＲＮＰ免疫複合体（ＩＣ）は、ウシ胸腺に由来するｓｍ−ＲＮＰと、ＳＬＥ患者の血清から精製された抗ＲＮＰ抗体とを、無血清培地中で３０分間にわたり混合することによりあらかじめ形成した。ヒト健常ドナーに由来するｐＤＣは、２ステップの磁気ビーズ分離手順（ＭＡＣＳキット；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。ウェル１つ当たり７．５×１０５個の精製ヒトｐＤＣを、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９（ＩＣ＋ＢＩＩＢ０５９）、またはアイソタイプ対照（ＩＣ＋Ｉｓｏ）のいずれかの存在下で、非処理（培地）のまま放置するか、またはあらかじめ形成されたＳｍ／ＲＮＰ  ＩＣにより刺激した。ｐＤＣを含有するプレートは、３７℃および５％のＣＯ２で１６時間にわたりインキュベートした。ｐＤＣ細胞を回収し、ｑＰＣＲ反応において評価するために、ｐＤＣに由来するＲＮＡを単離した。
【０３０７】
この実験は、ＢＩＩＢ０５９による処理が、試験した全てのＩ型ＩＦＮサブタイプの転写物レベルを阻害することを示した（図３４）。
【０３０８】
（実施例３５）
ＢＩＩＢ０５９は、健常ドナーおよびＳＬＥ患者に由来するヒトＰＢＭＣによる、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生を阻害する
ｐＤＣは、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９による刺激に応答する、ＩＦＮの主要な産生体である。ｐＤＣは、他の任意の細胞型よりも１，０００倍多くのＩＦＮを産生しうる。この実験は、ｐＤＣの単離の必要なしで、ＢＩＩＢ０５９により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養物における、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生を阻害し得たかどうかを調べる。健常ヒトドナーまたはＳＬＥ患者に由来するＰＢＭＣを、１または５μＭのＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧ−Ａ）で刺激し、ウェル１つ当たり２５０μＬの総アッセイ体積中に１０μｇ／ｍＬ〜２ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のＢＩＩＢ０５９で処理した。プレートは、３７℃および５％のＣＯ２で、一晩（１８時間）にわたりインキュベートした。ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて評価するために、上清を回収した。
【０３０９】
この実験は、ＢＩＩＢ０５９が、健常ドナーに由来するＰＢＭＣによる、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生を、０．０４±０．０５μｇ／ｍＬの平均ＩＣ５０で阻害することを示した（図３５Ａおよび３５Ｃ）。ＢＩＩＢ０５９は、ＳＬＥ患者に由来するＰＢＭＣによる、ＴＬＲ誘導ＩＦＮα産生の阻害においても、平均ＩＣ５０を０．０３±０．０１μｇ／ｍＬとする同様の効力を示した（図３５Ｂおよび３５Ｃ）。
【０３１０】
（実施例３６）
ＢＩＩＢ０５９は、ＴＬＲ９リガンドにより刺激される、全血中のＩＦＮα産生を阻害する
ＢＩＩＢ０５９の活性はまた、全血アッセイ（ＷＢＡ）においても評価した。健常ヒトドナーに由来する全血を、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９の存在下で、ＴＬＲ９リガンドにより刺激し、阻害のＩＣ５０を、各個別のドナーについて計算した。具体的には、健常ヒトドナーに由来する全血を、ウェル１つ当たり２００μｌの総アッセイ体積中に１０μｇ／ｍＬ〜２ｎｇ／ｍＬの範囲で濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９またはアイソタイプ対照と共にインキュベートした。ＣｐＧ−Ａは、全血中のＩＦＮα産生を刺激するのに最適であると決定される、７５μｇ／ｍＬで添加した（白色四角）。プレートは、３７℃で１８時間にわたりインキュベートし、ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）における使用のために、上清を回収した。
【０３１１】
ＢＩＩＢ０５９は、全血アッセイにおいて、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の用量依存的阻害を示し、ＰＢＭＣ培養物で認められたたものと同様のＩＣ５０を示した（図３６）。
【０３１２】
（実施例３７）
ＢＩＩＢ０５９は、健常ヒトドナーに由来するヒトＰＢＭＣによる、ＴＬＲ３誘導ＩＦＮα産生を阻害しない
この実験は、異なるＴＬＲリガンドにより誘発される他の細胞型が、ＢＩＩＢ０５９の存在下でもなお、Ｉ型ＩＦＮをやはり産生することが可能であるのかどうかを決定するために実施した。ＴＬＲ３は、ｐＤＣ内で発現せず、したがって、ＴＬＲ３リガンドは、ｐＤＣによるＩＦＮ産生を誘導しない。ヒト健常ドナーに由来するＰＢＭＣを、主に単球によるＩ型ＩＦＮ産生を強力に誘導しうるＴＬＲ３リガンドであるポリ：ＩＣで刺激した。具体的には、健常ヒトドナーに由来するＰＢＭＣを、１μＭのＴＬＲ３リガンド（ポリＩ：Ｃ）で刺激し、９６ウェルプレート内のウェル１つ当たり２５０μＬの総アッセイ体積中に１０μｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のＢＩＩＢ０５９で処理した。プレートは、３７℃および５％のＣＯ２で、一晩（１８時間）にわたりインキュベートした。ＥＬＩＳＡによりＩＦＮαレベルを評価するために、２００μＬの上清を回収した。図３７に示す通り、ＢＩＩＢ０５９は、健常ヒトドナーに由来するＰＢＭＣによる、ＴＬＲ３誘導ＩＦＮα産生に影響を及ぼさなかった。
【０３１３】
まとめると、実施例３３〜３７は、ＢＩＩＢ０５９は、精製ｐＤＣ培養物、ＰＢＭＣ培養物、および全血培養物による、ＴＬＲ９刺激Ｉ型インターフェロンを強力に阻害しうることを示す。ＢＩＩＢ０５９は、健常ヒトドナーおよびＳＬＥ患者に由来するｐＤＣによる、ＴＬＲ９誘導Ｉ型インターフェロンの阻害においても同等に強力である。Ｉ型ＩＦＮの阻害に加えて、ＢＩＩＢ０５９は、他のｐＤＣ由来サイトカインおよびケモカインの産生も阻害しうる。ＢＩＩＢ０５９は、ｐＤＣによる、ＴＬＲ９誘導Ｉ型ＩＦＮを特異的に阻害するが、異なるＴＬＲリガンドにより誘発される、他の細胞型によるＩＦＮ産生には、影響を及ぼさない。したがって、本明細書で提供されるｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、ｐＤＣによる、ＴＬＲ７／９誘導Ｉ型ＩＦＮ産生に対するその特異性に加えて、ＢＩＩＢ０５９の薬理学的活性および効力も裏付ける。
【０３１４】
（実施例３８）
ＢＩＩＢ０５９は、ヒトｐＤＣにおけるＢＤＣＡ２の内部移行を媒介する
ＢＩＩＢ０５９は、ＢＤＣＡ２の内部移行を誘導するのかどうかを決定するために、１０例の健常ヒトドナーに由来するヒト全血を、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９と共に、３７℃で１６時間にわたりインキュベートした。残存する細胞表面ＢＤＣＡ２は、ＦＩＴＣで標識された非交差遮断型抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（クローン２Ｄ６）を使用して検出した。
【０３１５】
具体的には、１０例の健常ヒトドナーに由来する全血を、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９または１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照抗体と共に、３７℃および５％のＣＯ２で１６時間にわたりインキュベートし、次いで、４℃で３０分間にわたり、ＦＩＴＣで標識された非交差遮断型抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（クローン２Ｄ６）、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＤ１２３、抗ＣＤ１４、および抗ＣＤ２０と共にインキュベートした。次いで、全血を、４℃で３０分間にわたり、以下のｍＡｂ：ＦＩＴＣで標識された非交差遮断型抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（クローン２Ｄ６）、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂ、抗ＣＤ１２３  ｍＡｂ、抗ＣＤ１４  ｍＡｂ、および抗ＣＤ２０  ｍＡｂを含む５０μＬの染色溶液と共にインキュベートした。赤血球（ＲＢＣ）は、１倍濃度の溶解／固定緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して溶解させた。
図３８に示す通り、ＢＩＩＢ０５９は、ＦＩＴＣで標識された２Ｄ６染色の強度の用量依存的減少を、０．０１７±０．００５μｇ／ｍＬの平均ＥＣ５０でもたらした。
【０３１６】
（実施例３９）
ＢＩＩＢ０５９とライゲーションすると、ＢＤＣＡ２は、急速に内部移行される
ＢＩＩＢ０５９により誘導されるＢＤＣＡ２内部移行の反応速度を決定するために、ヒト全血を、異なる濃度のＢＩＩＢ０５９と共に、３７℃で多様な期間にわたりインキュベートした。具体的には、全血を、１０、１、０．１、もしくは０．０１μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９またはアイソタイプ対照抗体（１０μｇ／ｍｌ）により、３７℃で示される期間にわたり処理した。次いで、全血を、４℃で３０分間にわたり、以下のｍＡｂ：ＦＩＴＣで標識された非交差遮断型抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂ（クローン２Ｄ６）、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂ、抗ＣＤ１２３  ｍＡｂ、抗ＣＤ１４  ｍＡｂ、および抗ＣＤ２０  ｍＡｂを含む５０μＬの染色溶液と共にインキュベートした。赤血球（ＲＢＣ）は、１倍濃度の溶解／固定緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して溶解させ、固定させた。図３９に示す通り、１μｇ／ｍｌのＢＩＩＢ０５９と共にインキュベートしたところ、ＦＩＴＣで標識された２Ｄ６染色の強度は急速に低下し、インキュベーションから１時間以内に、バックグラウンドレベルに到達した。ＢＩＩＢ０５９濃度を１０分の１（０．１μｇ／ｍｌ）とするインキュベーションにより、ＢＤＣＡ２の内部移行は２時間遅延した。このデータは、ＢＤＣＡ２内部移行の速度が、ＢＩＩＢ０５９の用量に依存することを示す。
【０３１７】
（実施例４０）
ＢＩＩＢ０５９は、ヒト形質細胞様樹状細胞におけるＢＤＣＡ２の内部移行を誘導する
ＢＩＩＢ０５９とのライゲーションの後におけるＢＤＣＡ２の内部移行を視覚化するために、精製ｐＤＣを、Ａ６４７で標識されたＢＩＩＢ０５９と共にインキュベートし、共焦点顕微鏡法により解析した。予測される通り、ＢＤＣＡ２は、４℃で、ｐＤＣの細胞表面上に局在化した。３７℃の短いインキュベーションの後、ＢＤＣＡ２は、細胞内で明確に検出された（図４０）。
【０３１８】
（実施例４１）
内部移行は、ＢＩＩＢ０５９に媒介される、ＩＦＮ−α産生の阻害を変化させない
この実験では、ＢＤＣＡ２の内部移行が、ｐＤＣによる、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生を阻害するＢＩＩＢ０５９の能力を変化させるのかどうかについて調べた。細胞を、ＢＩＩＢ０５９と共に、３７℃で、最大のＢＤＣＡ２内部移行に対応する多様な期間にわたりプレインキュベートし、次いで、ＴＬＲ９リガンドにより、さらなる１８時間にわたり刺激した。具体的には、全血を、健常ドナーのヘパリン添加静脈血から回収し、ＢＩＩＢ０５９またはアイソタイプ対照抗体と共に、表示される持続期間にわたりプレインキュベートした。プレインキュベーション後の各時点において、細胞を、２００μｇ／ｍＬのＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧ−Ａ）で刺激し、３７℃でさらに１８時間にわたりインキュベートした。ＩＦＮα  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）における使用のために、上清を回収した。図４１に示す通り、ＢＩＩＢ０５９を伴うプレインキュベーション（最長で９時間）は、健常ヒトドナーに由来する全血アッセイにおける、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生を阻害するＢＩＩＢ０５９の能力を変化させなかった。これらのデータは、ＢＤＣＡ２の内部移行は、ＴＬＲ９シグナル伝達の阻害に必要とされうることを示唆する。
【０３１９】
（実施例４２）
ｐＤＣにおけるＢＩＩＢ０５９に媒介されるＢＤＣＡ２の内部移行についてのＥＣ５０は、全血アッセイにおいて、ｐＤＣによる、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生と、ＢＩＩＢ０５９に媒介される阻害についてのＩＣ５０とが相関する
【０３２０】
ＢＤＣＡ２の内部移行と、ＴＬＲ９シグナル伝達の阻害との間の関連をさらに調査するため、ＢＩＩＢ０５９に媒介される、ｐＤＣ上のＢＤＣＡ２の内部移行の効力と、ｐＤＣによる、ＴＬＲ媒介ＩＦＮα産生の阻害とを、１０例の健常ヒトドナーにおいて比較した。
【０３２１】
ＢＩＩＢ０５９に媒介されるＢＤＣＡ２の内部移行を評価するため、全血を、ＢＩＩＢ０５９と共に、１６時間にわたりインキュベートした。次いで、全血を回収し、溶解させ、ＢＤＣＡ２発現を、ＦＩＴＣ結合体化非交差遮断型抗体である２Ｄ６を使用するフローサイトメトリーにより評価した。ＢＩＩＢ０５９に媒介される、ｐＤＣによる、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の阻害を評価するため、全血を、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９と共に、１６時間にわたり、ＴＬＲ９リガンドの存在下でインキュベートした。上清を採取し、ＩＦＮαについて、ＥＬＩＳＡにより評価した。ＢＩＩＢ０５９に媒介されるＢＤＣＡ２の内部移行についてのＥＣ５０は、０．０２μｇ／ｍＬであった。ＢＩＩＢ０５９に媒介される、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮαの阻害についてのＩＣ５０は、０．０７μｇ／ｍＬであった。ＢＩＩＢ０５９に媒介されるＢＤＣＡ２の内部移行についてのＥＣ５０と、ＢＩＩＢ０５９によるＩＦＮαの阻害についてのＩＣ５０との相関を、０．５７のＲ二乗値により観察した（図４２）。
【０３２２】
（実施例４３）
ＴＬＲ９の活性化は、ＢＤＣＡ２の、ＴＬＲ９とのおよびリソソームマーカーであるＬＡＭＰ１との共局在化を誘導する
ＢＩＩＢ０５９に媒介されるＴＬＲ９阻害が、ＢＤＣＡ２の、ＴＬＲ９を含有するエンドソーム／リソソーム区画への内部移行および局在化を必要とするという仮説について試験するために、共焦点顕微鏡法を使用して、ＢＩＩＢ０５９のライゲーションの後におけるＢＤＣＡ２の細胞内分布を追跡した。精製されたヒトｐＤＣを、７日間にわたり培養し、Ａ６４７で標識されたＢＩＩＢ０５９と共に、３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。インキュベーションのうちの最後の１０分間の間に、細胞を、１μＭのＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧ−Ａで処理するか、または非処理のまま放置した。細胞を、ＴＬＲ９に対する蛍光標識抗体および後期エンドソーム／リソソームマーカーであるＬＡＭＰ１で染色し、共焦点顕微鏡法により解析した。
【０３２３】
ＴＬＲ９の、ＬＡＭＰ１との共局在化の増加により証明される通り、ＴＬＲ９は、ＴＬＲ９リガンドによる刺激の後で、後期エンドソーム／リソソーム区画へと動員された（図４３）。ＴＬＲ９の刺激はまた、ＴＬＲ９およびＬＡＭＰ１と共局在化するＢＤＣＡ２画分も有意に増加させた。これらの結果は、ＢＩＩＢ０５９は、ＢＤＣＡ２に結合すると、活性化ＴＬＲ９が存在する細胞内区画へと優先的に局在化することを示唆する。
【０３２４】
まとめると、実施例３８〜４３は、ＢＤＣＡ２に対するヒト化モノクローナル抗体であるＢＩＩＢ０５９は、ＢＤＣＡ２に結合し、その内部移行をもたらすことを示す。刺激されると、ＢＤＣＡ２は、エンドソーム／リソソーム区画でＴＬＲ９と共局在化し、そこで、ＴＬＲ９シグナル伝達の阻害を媒介する。これらのデータは、ＢＤＣＡ２の内部移行が、ｐＤＣによる、ＴＬＲ９誘導炎症促進性メディエーターの阻害を媒介するのに必要なステップであることを示唆する。
【０３２５】
（実施例４４）
ＢＩＩＢ０５９の、ＣＤ６２Ｌレベルに対する効果
循環ｐＤＣは、高レベルのＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）を発現させ、高内皮細静脈（ＨＥＶ）含有リンパ系組織へとホーミングする。ＰＮＡｄとは、ＨＥＶ上で構成的に発現し、ＣＤ６２Ｌ発現細胞の、組織化されたリンパ系組織へのホーミングを媒介するＣＤ６２Ｌに対するリガンドである。ＰＮＡｄは、皮膚エリテマトーデス病変内の皮膚内皮細胞により発現することが見出された。それらのＣＤ６２Ｌ発現のために、ｐＤＣは、ＰＮＡｄを発現させる炎症性末梢組織へと動員されうる。
【０３２６】
ＢＩＩＢ０５９が、ヒトｐＤＣの表面におけるＣＤ６２Ｌの発現に影響を及ぼすのかどうかを決定するために、全血を、刺激なしで、種々の濃度のＢＩＩＢ０５９により、３７℃で１時間にわたり処理した。具体的には、健常ヒトドナーに由来する全血を、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９により、３７℃および５％のＣＯ２で１時間にわたり処理した。ＣＤ６２ＬのＭＦＩは、ＣＤ１４−、ＣＤ２０−、ＨＬＡ−ＤＲ＋、およびＣＤ１２３＋により定義されるとおりのｐＤＣにゲートをかけることにより決定した。
【０３２７】
フローサイトメトリーにより評価される通り、ＢＩＩＢ０５９は、ヒトｐＤＣの表面におけるＣＤ６２Ｌ発現の、用量依存的減少を引き起こした（図４４）。ｐＤＣの、ＴＬＲリガンドによる刺激は、ＣＤ６２Ｌの発現に影響を及ぼさなかった（図４４Ａ）。
【０３２８】
（実施例４５）
ＰＢＭＣの、ＧＭ６００１による処理は、ヒトｐＤＣの表面からの、ＢＩＩＢ０５９に媒介されるＣＤ６２Ｌの脱落を阻害する
メタロプロテイナーゼは、免疫細胞の表面からのＣＤ６２Ｌの脱落を誘導することが公知である。メタロプロテイナーゼが、ＢＩＩＢ０５９に媒介される、表面ＣＤ６２Ｌの減少に関与するのかどうかを調べるために、ＰＢＭＣを、健常ヒトドナーから調製し、ＧＭ６００１（メタロプロテイナーゼ阻害剤）で、３７℃および５％のＣＯ２で３０分間にわたり前処理した後、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９を、１時間にわたり添加した。ＣＤ６２Ｌの表面発現は、フローサイトメトリーによりアッセイした。ＧＭ６００１は、ＢＩＩＢ０５９に媒介される、ＣＤ６２Ｌの下方モジュレーションを、用量依存的に阻害した（図４５）。これらのデータは、ＢＩＩＢ０５９が、ＣＤ６２Ｌの脱落を、メタロプロテイナーゼ依存的に誘導することを示唆する。
【０３２９】
まとめると、実施例４４および４５は、ＢＩＩＢ０５９が、ヒトｐＤＣの表面におけるＣＤ６２Ｌの発現を減少させることを示す。ＢＩＩＢ０５９に媒介される、ＣＤ６２Ｌの下方モジュレーションが、メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＧＭ６００１）により阻害されることから、ＢＩＩＢ０５９が、少なくとも部分的に、メタロプロテイナーゼの活性化を介して、ＣＤ６２Ｌの、ヒトｐＤＣの表面からの脱落を誘導することが示される。したがって、ＢＩＩＢ０５９処置は、ＳＬＥにおける、ｐＤＣの、標的臓器への輸送を低減または防止することが期待される。
【０３３０】
（実施例４６）
免疫複合体に媒介される、形質細胞様樹状細胞によるＩＦＮ産生に対する、ＢＩＩＢ０５９のＦｃ領域の影響
Ｆｃγ受容体ＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）とは、ＩｇＧに低アフィニティーで結合する、細胞表面タンパク質である。ヒト形質細胞様樹状細胞は、ＣＤ３２ａである、Ｆｃγ受容体ＩＩＡをもっぱら発現させる。ｐＤＣの、免疫複合体による刺激は、ＣＤ３２に依存することが示されている。免疫複合体は、ＣＤ３２により内部移行され、エンドソームのＴＬＲ７／９を刺激して、ｐＤＣによるＩＦＮ産生を誘導する。
【０３３１】
ＢＩＩＢ０５９の、ＣＤ３２ａ表面発現に対する効果を決定するために、単離ｐＤＣを、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９、または抗体の非グリコシル化形態である２４Ｆ４−Ａにより処理し、３７℃で１６時間にわたりインキュベートした。次いで、ｐＤＣを、ＦＩＴＣで標識されたＢＤＣＡ２およびＰＥで標識された抗ＣＤ３２（クローンＡＴ１０）で染色し、ＢＤＣＡ２およびＣＤ３２の表面発現を、フローサイトメトリーにより評価した。ＢＩＩＢ０５９およびａｇｌｙ変化形である２４Ｆ４−Ａは、ＢＤＣＡ２の内部移行を誘導するそれらの能力において、同等に強力であった（図４６Ａ）。ＣＤ３２の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の、用量依存的減少により示される、ｐＤＣの細胞表面におけるＣＤ３２の下方モジュレーションを誘導することが可能なのは、ＢＩＩＢ０５９だけであった（図４６Ｂ〜Ｄ）。エフェクター機能保有アイソタイプ（ｉｓｔｏｙｐｅ）対照による処理は、ＣＤ３２の表面レベルに対して効果を及ぼさなかった（図４６）。これらのデータは、ＢＩＩＢ０５９に媒介される、ｐＤＣの表面におけるＣＤ３２ａレベルの下方モジュレーションが、ＢＩＩＢ０５９のＦｃ領域の結合に特異的であることを示す。
【０３３２】
ＢＩＩＢ０５９のＦｃ領域の結合が、ＦＩＴＣで標識された抗ＣＤ３２  ｍＡｂにより認識されるＣＤ３２のエピトープを単に遮蔽するわけではないことを確認するために、ｐＤＣを、１０μｇ／ｍＬのＢＩＩＢ０５９により、４℃または３７℃で１時間にわたり処理し、次いで、標識された抗ＣＤ３２で染色した。図４６Ｅに示す通り、４℃でのＢＩＩＢ０５９による処理が、ＣＤ３２のＭＦＩを低下させなかったことから、ＢＩＩＢ０５９による処理は、標識された抗ＣＤ３２  ｍＡｂの結合に干渉しないことが示される。ＣＤ３２ａの下方モジュレーションが、３７℃でＢＩＩＢ０５９と共にインキュベートしたときに限り生じたという事実は、ＣＤ３２ａが、ｐＤＣの細胞表面から失われた可能性があることを示唆する。
【０３３３】
ＢＩＩＢ０５９によるＣＤ３２ａの下方モジュレーションが、生物学的影響を及ぼすのかどうかを決定するために、ｐＤＣを、濃度を増加させたＢＩＩＢ０５９、または非グリコシル化形態である２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙの存在下でインキュベートし、免疫複合体または合成のＴＬＲ９リガンド（ＣＰＧ−Ａ）で刺激した。予測される通り、ＢＩＩＢ０５９と、２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙとは、ＣＤ３２非依存性の、ｐＤＣによる、ＣＰＧ−Ａ誘導ＩＦＮαを阻害するそれらの能力では識別不可能であった（図４７Ａ）。ｐＤＣを免疫複合体で刺激したところ、ＢＩＩＢ０５９と２４Ｆ４Ａ−ａｇｌｙとの間では、効力の明確な隔たりがあった。ＢＩＩＢ０５９は、免疫複合体により誘導されるＩＦＮαを、２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙによる１．４μｇ／ｍＬのＩＣ５０と比較して、０．０４のＩＣ５０で阻害した（図４７Ｂ）。これらのデータは、ＢＩＩＢ０５９が、その機能的Ｆｃのために、ＣＤ３２ａを下方モジュレートし、したがって、免疫複合体によるｐＤＣの刺激を阻害することを示す。
【０３３４】
ＣＤ３２ａの下方モジュレーションが、ＢＩＩＢ０５９に固有であることを確認するため、本発明者らは、完全ヒト化抗ＣＤ４０抗体の、ＣＤ３２レベルと、免疫複合体に媒介される、ｐＤＣによるＩＦＮα産生とに対する効果を調べた。ＣＤ４０とは、ｐＤＣ上で発現する細胞表面タンパク質である。完全に機能的なＦｃを伴う抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０に結合し、かつ、ｐＤＣの表面のＣＤ３２に結合する能力を有する。抗ＣＤ４０  ｍＡｂによる処理は、ＣＤ３２の表面発現に対して効果を及ぼさず、免疫複合体で刺激されたｐＤＣからのＩＦＮα産生に対しても有意な効果を及ぼさなかった（図４８ＡおよびＢ）。抗ＣＤ４０  ｍＡｂの結合は、抗ＣＤ４０で処理された細胞における、ＣＤ４０への最大の結合を裏付けることにより確認した（図４８Ｃ）。
【０３３５】
既に示した通り、ＢＤＣＡ２を、ＢＩＩＢ０５９または非グリコシル化形態である２４Ｆ４Ａ−Ａｇｌｙとライゲーションすることにより、受容体の内部移行と、ｐＤＣによる、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮαの阻害とがもたらされる。この研究において、本発明者らは、ＢＩＩＢ０５９が、ｐＤＣ上のＣＤ３２ａの下方モジュレーションと、ｐＤＣによる、免疫複合体刺激ＩＦＮα産生の阻害とを、Ｆｃ依存的に引き起こすことを示す。ＢＩＩＢ０５９により誘発される、ＣＤ３２ａの下方モジュレーションは、単にｐＤＣ上で発現する細胞表面分子に結合することが可能な機能的Ｆｃを有する任意の抗体から生じるわけではない。この研究は、有効性の増強をもたらす、そのＦａｂ’２領域およびＦｃ領域の両方を介して、ｐＤＣ応答を低下させうる、エフェクター機能保有抗ＢＤＣＡ２  ｍＡｂの、新規の治療的潜在能力を強調する。
【０３３６】
（実施例４７）
ＢＩＩＢ０５９の、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）との相互作用
ＳＬＥの処置では、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）などの抗マラリア剤が使用されてきた。ＨＣＱで処置されたＳＬＥ患者に由来するｐＤＣは、ＴＬＲ７リガンドおよびＴＬＲ９リガンドで刺激したときにＩＦＮαを産生する能力を低下させた。ＢＩＩＢ０５９およびＨＣＱのいずれも、ＴＬＲ７／９により誘導される、ｐＤＣにおけるＩＦＮαに影響を及ぼすので、ＢＩＩＢ０５９の効果とＨＣＱの効果とが冗長性でありうるのかどうかを調べた。
【０３３７】
この問題に取り組むため、ヒトＰＢＭＣを、健常ドナーに由来する血液から調製し、種々の濃度の、ＢＩＩＢ０５９単独、ＨＣＱ単独、またはＨＣＱと組み合わせたＢＩＩＢ０５９の存在下で、ＴＬＲ７リガンドまたはＴＬＲ９リガンドのいずれかにより刺激した。１８時間後に上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮαについてアッセイした。ＨＣＱの添加は、ＢＩＩＢ０５９の効力を増大させ、健常ヒトドナーに由来するＰＢＭＣによる、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生に対するさらなる阻害効果をもたらした。これらのデータは、ＢＩＩＢ０５９の活性とＨＣＱの活性とが冗長性ではなく、ＨＣＱなどの抗マラリア化合物と共に投与される場合の、ＢＩＩＢ０５９のさらなる治療的利益を強調することを裏付ける。
【０３３８】
（実施例４８）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ＢＩＩＢ０５９の、ＢＤＣＡ２を発現するｐＤＣに対する効果
この研究の目的は、ＢＩＩＢ０５９の、カニクイザルへの投与が、末梢血中のｐＤＣの枯渇を媒介するのかどうかを決定することであった。
【０３３９】
４回分のＢＩＩＢ０５９投与前採血物を、毎週の間隔で、１２例のカニクイザルから回収して、ベースラインのｐＤＣ頻度を、各動物について確立した（表３）。
【表３】
2019146567.tif 000058
【０３４０】
全血を、１２例のカニクイザルから、週１回のべ４週間にわたり採取した。フローサイトメトリーを使用して、ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定した。ＣＤ２０−ＣＤ１４−細胞のパーセントとしてのｐＤＣは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより計算した。
【０３４１】
全ての統計学的解析では、ｐＤＣ頻度を対数変換して、歪度を低減した（図５１）。図５１の左側のパネルにおけるｐＤＣ頻度の元の分布は、大きく右側に歪んでいた。しかし、対数変換の後、変換されたｐＤＣ頻度の分布（図５１、右パネル）は、ほぼ正規分布に従った。これらの対数変換データは、全ての統計学的解析法に使用した。図５２は、ｐＤＣレベルを、各カニクイザルについて、ＩＶ注射前の４つの時点にわたり、対数スケールで示す。固定係数としての４つの時点およびカニクイザルについてのランダム切片を伴う線形混合効果モデルを使用して、本発明者らは、全てのサルについてのｐＤＣ百分率の幾何平均が、４つの投与前時点にわたり等しいことを結論付けた（図５３、Ｆ検定に基づく時間についてのｐ値：０．６７）。この解析により、循環ｐＤＣの百分率の幾何平均は、カニクイザルについて、ある時間にわたり、比較的安定であることが示された。
【０３４２】
これら１２例のカニクイザルのうちの９例を、３つの群（群１つ当たり３例ずつ）へと分け、各群内で等しいＢＤＣＡ２密度およびｐＤＣパーセントの表示を含むように無作為化した。カニクイザルには、媒体（クエン酸ナトリウム）、１０ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９、または１ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９のうちのいずれかの単一静脈内注射を施した。フローサイトメトリーを使用して、全血中の循環ｐＤＣを、ＣＤ２０−ＣＤ１４−ＣＤ１２３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋として同定し、各時点におけるｐＤＣ頻度（対数スケールで）を、Ｒソフトウェアによりグラフ化した（図５４）。カニクイザルについてのランダム切片ならびに投与群および期間：１時間、６時間、１〜２７日間、および２８日間超についての固定効果を使用して、線形混合効果モデルを、対数（ｐＤＣ）頻度へと当てはめた。ｐＤＣが、異なる期間において、異なる投与群の間で変化したのかどうかを評価するために、予備モデルにはまた、投与群および異なる期間についての相互作用項も組み入れた。０に等しい全ての相互作用項を検定するためのＦ検定に基づくｐ値は、０．８１であり、これは、ｐＤＣの変化については、異なる投与群の間で差異がないことを示す。よって、最終的な当てはめモデルには、期間の係数および投与群の係数についての統計学的に有意な効果だけを組み入れた（表４）。
【０３４３】
表4:単回の静脈内BIIB059注射または媒体注射の後の時点についての、モデルの当てはめによる推定値
【０３４４】
カニクイザルにおけるクエン酸ナトリウム媒体、1mg/kgのBIIB059、または10mg/kgのBIIB059のIV投与の前および後における、対数スケールによる循環pDCパーセントについての、カニクイザルについてのランダム切片と、投与群ならびに1時間、6時間、および28日間超の時点レベルについての固定係数とを使用する、線形混合効果モデルを使用する、固定効果の推定値
【表４】
2019146567.tif 000059
【０３４５】
固定係数についてのパラメータ推定値を指数化して、それらを、ＢＩＩＢ０５９投与前と比較した、これらの期間におけるｐＤＣ頻度の比として解釈した。ＩＶ注射の１時間後におけるｐＤＣ頻度を、投与前におけるｐＤＣ頻度と比較したところ、総じて、比は、有意に１未満であった（９５％ＣＩ：０．４３〜０．７７、ｐ値：０．０００３）。ＩＶ注射の６時間後におけるｐＤＣ頻度を、投与前におけるｐＤＣ頻度と比較したところ、比は、有意に１を超えた（９５％ＣＩ：１．１８〜２．１２、ｐ値：０．００３）。ＩＶ注射の１〜２８日後におけるｐＤＣ頻度を、投与前におけるｐＤＣ頻度と比較したところ、比は、１と有意に異ならなかった。ＩＶ注射後の２８日後におけるｐＤＣ頻度を、投与前におけるｐＤＣ頻度と比較したところ、比は、有意に１未満であった（９５％ＣＩ：０．５５〜０．７０、ｐ値：＜０．０００１）。最終的な当てはめモデルを、図５５にプロットした。結果から、ＩＶ注射の１時間後に、カニクイザルのｉｎ  ｖｉｖｏにおける循環ｐＤＣの有意な枯渇があり、６時間後に、循環ｐＤＣの有意な増加があり、２８日後に、有意な循環ｐＤＣの枯渇があるが、時間全体にわたるｐＤＣパーセントの変化は、全ての処置群について同じであることが明らかになった。
【０３４６】
加えて、ＩＶ研究時点の完了後、これらのカニクイザルのうちの３例（４、６、および１２）に、０．２ｍｇ／ｋｇのＢＩＩＢ０５９の単回皮下投与を施して、循環ｐＤＣ頻度に対する低用量の効果を評価した。各時点におけるｐＤＣ頻度（対数スケールで）を、Ｒソフトウェアによりグラフ化した（図５６）。線形混合効果モデルは、固定係数としての連続時間および１時間の時点、ならびにランダム切片としてのカニクイザルを使用して当てはめた。結果を、表５に示す。
【０３４７】
表5:単回の皮下BIIB059注射の後の時点についての、モデルの当てはめによる推定値
カニクイザルにおける0.2mg/kgのBIIB059の単回皮下注射の前および後における、対数スケールによる循環pDCパーセントについての、固定係数としての連続時間および1時間の時点、ならびにランダム切片としてのカニクイザルを使用する、線形混合効果モデルを使用する、固定効果の推定値
【表５】
2019146567.tif 000060
【０３４８】
前出の結果と同様、本発明者らは、ＩＶ注射の１時間後に、カニクイザルのｉｎ  ｖｉｖｏにおける循環ｐＤＣの有意な枯渇（９５％ＣＩ：０．３４〜０．５５、ｐ値＜０．０００１）を観察したが、３例のカニクイザルについてのｐＤＣ％の幾何平均は、時間が延長されるにつれて、着実に増加した（９５％ＣＩ：１日当たり１．００〜１．０３倍の変化、ｐ値＜０．０００１）。当てはめモデルを、図５７にプロットした。
【０３４９】
結論として述べると、これらのデータは、試験用量で投与された場合に、ＢＩＩＢ０５９が、カニクイザルの血液中の、ｐＤＣの持続的な枯渇を媒介しないことを示す。これは、ＢＤＣＡ２の内部移行に起因する可能性がある。
【０３５０】
（実施例４９）
ＢＩＩＢ０５９のカニクイザルへの投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏの全血アッセイにおける、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮα産生の阻害を結果としてもたらす
この研究の目的は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてカニクイザルへと投与された場合のＢＩＩＢ０５９が、ｅｘ  ｖｉｖｏの全血アッセイ（ＷＢＡ）において、ＴＬＲ９による刺激に応答して、ＩＦＮαの産生を変化させうるのかどうかを決定することであった。
【０３５１】
静脈内投与経路および皮下投与経路を、図５８に概括される実験計画に従い、ＭｘＡバイオアッセイを使用して測定される、ＩＦＮαの誘導に影響を及ぼすそれらの能力について評価した。ＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧ−Ａ）が、全ての時点にわたり、全てのカニクイザルの全血培養物中で、測定可能量のＩＦＮαを誘導したのに対し、対照の、ＰＢＳで処理された培養物中では、ＩＦＮαは検出されなかった（データは示さない）。
【０３５２】
静脈内投与されたカニクイザルでは、処理後のＩＦＮα値を、各動物についての投与前平均値の百分率として計算した。この時点以後、１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＩＢ０５９群については全血アッセイを実施しなかったので、１４日目以降の採血についてのデータは、解析から除外した。１ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＩＢ０５９投与群および１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＩＢ０５９投与群における薬物投与の数日後において、ＩＦＮα％の、投与前平均値と比べた低減への傾向が、媒体群と比較して観察された（図５９）。
【０３５３】
二元混合効果分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、データについてのより包括的な解析を実施して、ＩＶ研究における各投与群についての平均ＩＦＮαおよび投与前と対比した投与後の差異を推定した。投与後最初の２４時間におけるデータは、末梢血形質細胞様樹状細胞百分率において減少が観察されたために除外した。投与後３１日目以降の採血についてのデータは、この時期に観察されるＢＤＣＡ２発現の復帰のために、解析から除外した。媒体投与群では、投与前のＩＦＮαの幾何平均は、１ｍＬ当たり３６２単位（Ｕ／ｍＬ）であり、投与後のＩＦＮαの幾何平均は、３１４Ｕ／ｍＬであり、１ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与前の幾何平均は、３９９Ｕ／ｍＬであり、投与後の幾何平均は、２３７Ｕ／ｍＬであり、１０ｍｇ／ｋｇ群では、投与前のＩＦＮαの幾何平均は、２１１Ｕ／ｍＬであり、投与後のＩＦＮαの幾何平均は、１０２Ｕ／ｍＬであった（図４）。平均ｌｏｇ１０  ＩＦＮαの投与後−投与前の差異は、媒体群が−０．０６１（ｐ＝０．５１１）であり、１ｍｇ／ｋｇ群が−０．２２６（ｐ＝０．０１６）であり、１０ｍｇ／ｋｇ群が−０．３１７（ｐ＝０．００４）であった。常用対数の真数変換（ａｎｔｉ−ｌｏｇ１０  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の後、これらの結果から、媒体群の、投与前と比較した投与後のＩＦＮα濃度は、１０−０．０６１＝８７％（９５％ＣＩ：５７％〜１３３％）であり、１ｍｇ／ｋｇ群の、投与前と比較した投与後のＩＦＮ濃度は、１０−０．２２６＝５９％（９５％ＣＩ：３９％〜９１％）であり、１０ｍｇ／ｋｇ群の、投与前と比較した投与後のＩＦＮ濃度は、１０−０．３１７＝４８％（９５％ＣＩ：２９％〜７９％）であることが明らかになった（図６０）。
【０３５４】
皮下投与されたカニクイザルコホートでは、ランダム効果を伴う一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、全群についての平均ＩＦＮαおよび投与前と対比した投与後の差異を推定した。投与後最初の２４時間におけるデータは、末梢血形質細胞様樹状細胞百分率において減少が観察されたために除外した。投与後３３日目以降の採血についてのデータは、この時期に観察されるＢＤＣＡ２発現の回復のために、解析から除外した。皮下投与群では、投与前のＩＦＮαの幾何平均は、１２４３Ｕ／ｍＬであり、投与後のＩＦＮαの幾何平均は、８１２Ｕ／ｍＬであり、６５％の投与後／投与前比をもたらした。平均ｌｏｇ１０の投与後−投与前の差異は、−０．１８５（ｐ＝０．０５９）であると推定され、これは、常用対数の真数変換の後、投与前幾何平均の１０−０．１８５＝６５％に対応し、この効果についての９５％ＣＩは、４１％〜１０２％である（図６１）。
【０３５５】
実験では、ごく少数のカニクイザルを使用したので、各サルについて決定されるＩＦＮα濃度は、その群の結果に高度に影響を及ぼす。静脈内研究における動物の差異に起因する変動の比率は、変動性全体の６９％であり、残りは主に、カニクイザルの中の時点間の差異に起因し（２６％）、少量がアッセイにおける変動源に起因した（＜６％）。カニクイザル間の変動は、カニクイザルの中の時点間の変動よりはるかに大きいことから、この実験には、より多くの採血時点を追加するよりも、カニクイザルを追加することにより、研究の検定力が増大することが示唆される。皮下研究におけるカニクイザルの差異に起因する変動の比率は、変動性全体の４５％であった。残りは大半が、カニクイザルの中の時点間の差異に起因し、わずかな量がアッセイにおける変動源に起因した（＜２％）。
【０３５６】
カニクイザル全体にわたり観察される変動性およびカニクイザルの中で観察される変動性は、カニクイザルの生理学的状態のゆらぎ、血液の細胞組成のゆらぎ、細胞の分子組成のゆらぎ、および機能アッセイの精度のゆらぎを含むいくつかの因子に起因しうる。
【０３５７】
ある時間にわたる、各動物における形質細胞様樹状細胞百分率には、ある程度のゆらぎがあるが、血液中のｐＤＣ％は、ＢＩＩＢ０５９による処置の影響を受けず（Ｒｓｃｈ−２０１３−０４６を参照されたい）、ＩＦＮα産生との一貫した相関を示さなかった。加えて、ＢＤＣＡ２の、細胞表面からの、急速かつ持続的な喪失も、ＢＩＩＢ０５９のＩＶ投与およびＳＣ投与の後におけるｐＤＣにおいて観察されたことから、高レベルの受容体占有が示唆される（Ｒｓｃｈ−２０１３−０４３を参照されたい）。カニクイザルに由来するｐＤＣの、ＴＬＲ９による刺激に対する応答性の、高レベルの変動性を考慮しても、ＢＩＩＢ０５９の静脈内投与および皮下投与の後では、ＩＦＮα応答の低下への傾向があり、１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与群における最大の低減に、０．２ｍｇ／ｋｇのＳＣ群が続き、次いで、１ｍｇ／ｋｇのＩＶ群が続いた。
【０３５８】
結論として述べると、カニクイザルへとｉｎ  ｖｉｖｏで投与した場合のＢＩＩＢ０５９は、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＷＢＡにおいて、ＴＬＲ９誘導ＩＦＮ産生の阻害への傾向を示した。
【０３５９】
他の実施形態
その詳細な記載と共に、本発明について記載してきたが、前出の記載は例示することを意図するものであり、付属の特許請求の範囲の範囲により定義される、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。他の態様、利点、および改変も、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
2019146567.tif 000061
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ−Ｂ】
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【図２２Ｃ−Ｄ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ−Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ−Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ−Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ−Ｃ】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ−Ｂ−Ｃ】
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【図４６Ｄ−Ｅ−Ｆ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０−１】
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【図６０−２】
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【図６１】
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【配列表】
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