(57)【要約】【課題】哺乳類被験体へ外分泌細胞を機能的に移植する方法を提供する。【解決手段】哺乳類被験体へ外分泌細胞を移植する方法であって、（１）外分泌細胞を、哺乳類被験体の消化管の粘膜下層中に移植する工程、（２）移植部位の固有粘膜層及び粘膜筋板を除去する工程、及び（３）除去部位で固有粘膜層のみを再生させる工程を含む方法。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類被験体へ外分泌細胞を移植する方法であって、
（１）外分泌細胞を、哺乳類被験体の消化管の粘膜下層中に移植する工程、
（２）移植部位の固有粘膜層及び粘膜筋板を除去する工程、及び
（３）除去部位で固有粘膜層のみを再生させる工程
を含む方法。
【請求項２】
哺乳類被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳類被験体が非ヒト哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
外分泌細胞が膵臓細胞又は肝臓細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
外分泌細胞がドナーの臓器又は組織から調製した細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
外分泌細胞がｉＰＳ細胞から誘導された細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
消化管が胃、小腸又は大腸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
電気焼灼器を使用して工程（２）を実施する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（３）で胃酸分泌抑制剤を投与する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外分泌細胞の機能的移植を利用した再生療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵外分泌不全は、膵臓の消化酵素の欠乏に起因する病態である。膵外分泌不全は、膵臓疾患（嚢胞性線維症、１型糖尿病や慢性膵炎等）、膵臓の外科的切除や、重症の急性壊死性膵炎の患者で起こる。その臨床徴候には腹部痙攣、脂肪便や栄養失調が含まれる。膵外分泌不全に起因する栄養失調は、栄養失調関連合併症や心血管系疾患の罹患リスク上昇等に関連している。
膵外分泌不全の現在の治療法は、食事療法や酵素補充療法（外因性消化酵素の経口投与）である。しかしながら、これらの治療法を患者は永続的に続ける必要があり、治療効果も限定的である。
別の治療法として細胞補充療法（ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から誘導した分化細胞の移植）が試みられている（非特許文献１〜４）。膵臓外分泌細胞の膵外分泌不全患者への移植では、移植細胞から分泌された消化酵素は消化管へ送達されて消化機能を発揮する必要がある（非特許文献５及び６）。また、分泌物の送達経路の確保は、消化酵素による移植細胞や周辺組織の自己消化を防ぐためにも必要である（非特許文献６）。
また、哺乳類の消化管から固有粘膜層及び粘膜筋板を除去すると、固有粘膜層のみが再生することが知られている（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Nature, Volume 499, pages 481-484 (2013)
【非特許文献２】Cell Stem Cell, Volume 16, pages 556-565 (2015)
【非特許文献３】Gut, Volume 66, pages 473-486 (2017)
【非特許文献４】Nature Medicine, Volume 21, pages 1364-1371 (2015)
【非特許文献５】Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology Volume 14, pages 612-628 (2017)
【非特許文献６】World Journal of Gastroenterology, Volume 15(12), pages 1427-1430 (2009)
【非特許文献７】The Lancet, Volume 374(9699), pages 1449-1461 (2009).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、移植細胞から消化管への分泌物の送達（外分泌）を可能にする機能的な移植方法は知られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は前記課題を鋭意検討したところ、膵臓外分泌細胞を胃の粘膜下層中に移植し、移植部位の固有粘膜層及び粘膜筋板を除去し、その後、固有粘膜層のみを再生させると、移植細胞から分泌された消化酵素が胃内腔へ機能的に送達されることを見いだした。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
【０００６】
すなわち、本発明は下記〔１〕〜〔９〕に関するものである。
〔１〕哺乳類被験体へ外分泌細胞を移植する方法であって、
（１）外分泌細胞を、哺乳類被験体の消化管の粘膜下層中に移植する工程、
（２）移植部位の固有粘膜層及び粘膜筋板を除去する工程、及び
（３）除去部位で固有粘膜層のみを再生させる工程
を含む方法。
〔２〕哺乳類被験体がヒトである、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕哺乳類被験体が非ヒト哺乳類である、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕外分泌細胞が膵臓細胞又は肝臓細胞である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５〕外分泌細胞がドナーの臓器又は組織から調製した細胞である、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６〕外分泌細胞がｉＰＳ細胞から誘導された細胞である、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕消化管が胃、小腸又は大腸である、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕電気焼灼器を使用して工程（２）を実施する、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕工程（３）で胃酸分泌抑制剤を投与する、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
後述する実施例に示されるように、本発明は、移植細胞分泌物の消化管への送達を可能にする機能的移植方法を提供する。したがって、本発明は、膵外分泌不全をはじめとする外分泌機能不全の再生療法に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは細胞の移植手順の概要を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは細胞移植後の胃液採取の概要を示す。矢頭は唾液の導出を示し、矢印は胃液の採取を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは移植部位に作成した胃潰瘍の瘢痕（矢頭）を示す（スケールバー：１０ｍｍ）。
【図１Ｄ】図１Ｄは、実施例１の移植部位のヘマトキシリン・エオシン染色画像である（スケールバー：１００μｍ）。矢頭は移植細胞を示し、矢印は固有粘膜層を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、実施例１の免疫蛍光染色画像である（スケールバー：１００μｍ）。アミラーゼ及びトリプシンは膵腺房細胞マーカーであり、ＭＵＣ１は膵導管細胞マーカーである。核はHoechst 33258で染色した。
【図１Ｆ】図１Ｆは、酵素活性を指標として測定した胃液中のアミラーゼ量を示す。全てのデータは平均±標準偏差で表した。*ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】図２Ａは、移植から７日後の比較例の移植部位のヘマトキシリン・エオシン染色画像である（スケールバー：５００μｍ）。矢頭は移植細胞を示し、矢印は粘膜筋板を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、移植から２１日後の比較例の移植部位のヘマトキシリン・エオシン染色画像である（スケールバー：５００μｍ）。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例２（ステージ４終了時）の免疫蛍光染色画像である（スケールバー：１００μｍ）。ＰＤＸ１及びＳＯＸ９は膵臓前駆体マーカーであり、ＮＫＸ６．１は成熟内分泌膵臓への分化に必要な因子であり、ＰＴＦ１Ａは外分泌系の膵腺房細胞の形成に貢献する因子である。核はHoechst 33258で染色した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ及びＳＯＸ９の発現に関するリアルタイム逆転写ＰＣＲ分析結果を示す。発現レベルは、ステージ５終了時（培養開始から３１日目）の値に対する倍率変化として表した。ＮＫＸ６．１及びＳＯＸ９の発現レベルは５つのサンプルより決定し、ＰＤＸ１及びＰＴＦ１Ａの発現レベルは７つのサンプルより決定した。全てのデータは平均±標準偏差で表した。*ｐ＜０．０５。**ｐ＜０．０１。Ｎ．Ｄ．：検出されず。Ｎ．Ｓ．：有意差なし。
【図３Ｃ】図３Ｃはフローサイトメトリー分析画像である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、フローサイトメトリー分析に基づくＰＤＸ１陽性細胞及びＳＯＸ９陽性細胞の割合を示す。全てのデータは平均±標準偏差で表した。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例２（ステージ５終了時）の免疫蛍光染色画像である（スケールバー：１００μｍ）。核はHoechst 33258で染色した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例２（ステージ５終了時）の免疫蛍光染色画像である（スケールバー：１００μｍ）。サイトケラチン１９（ＣＫ１９）は膵臓腺房細胞マーカーである。核はHoechst 33258で染色した。
【図４Ｃ】図４Ｃは、アミラーゼ、トリプシン及びＣＫ１９の発現に関するリアルタイム逆転写ＰＣＲ分析結果を示す。発現レベルは、ステージ５終了時（培養開始から３１日目）の値に対する倍率変化として表した。発現レベルは５つのサンプルより決定した。全てのデータは平均±標準偏差で表した。*ｐ＜０．０５。**ｐ＜０．０１。Ｎ．Ｄ．：検出されず。Ｎ．Ｓ．：有意差なし。
【図４Ｄ】図４Ｄはフローサイトメトリー分析画像である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、フローサイトメトリー分析に基づくＰＴＦ１Ａ陽性細胞、アミラーゼ陽性細胞、トリプシン陽性細胞、ＣＫ１９陽性細胞及びＮＫＸ６．１陽性細胞の割合を示す。全てのデータは平均±標準偏差で表した。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例２の移植部位のヘマトキシリン・エオシン染色画像である（スケールバー：１００μｍ）。矢頭は移植細胞を示し、矢印は固有粘膜層を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例２の移植部位の免疫蛍光染色画像である（スケールバー：１００μｍ）。ヒトミトコンドリアはヒトｉＰＳ細胞に由来する細胞の指標である。核はHoechst 33258で染色した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、酵素活性を指標として測定した胃液中のアミラーゼ量を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明を更に詳細に説明する。本発明の移植方法は、下記の工程：
（１）外分泌細胞を、哺乳類被験体の消化管の粘膜下層中に移植する工程、
（２）移植部位の固有粘膜層及び粘膜筋板を除去する工程、及び
（３）除去部位で固有粘膜層のみを再生させる工程
を含む。
【００１０】
〔工程（１）〕
外分泌細胞とは外分泌される物質を産生する細胞をいう。具体例としては、膵臓や肝臓に存在する外分泌細胞が挙げられる。
膵臓の外分泌細胞（外分泌腺細胞）は、消化酵素であるアミラーゼやトリプシンを含む膵液を消化管へ分泌する。
肝臓の外分泌細胞（肝細胞）は、消化酵素である胆汁酸を含む胆汁を消化管へ分泌する。
外分泌細胞のなかでは膵臓又は肝臓の外分泌細胞が好ましく、膵臓の外分泌細胞が更に好ましい。
【００１１】
ドナーの外分泌細胞はレシピエントに対して同種でも異種でもよいが、同種細胞であることが好ましい。
外分泌細胞はドナーの臓器又は組織から調製した細胞であってもよく、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から誘導した細胞であってもよい。
臓器又は組織からの調製には、当該技術分野で一般的な調製方法を使用できる。例えば、臓器又は組織を緩衝液中でハサミや剃刀を用いてミンスし、必要に応じ洗浄（リンス）や濾過を実施することで、外分泌細胞を含む懸濁液として調製できる。懸濁液は外分泌細胞以外の細胞（例えば、脂肪細胞、内分泌細胞）を含んでいてもよい。
外分泌細胞と他の細胞とは、消化酵素遺伝子発現や消化酵素分泌を指標に識別できる。
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞からの誘導には、当該技術分野で用いられている誘導法を使用できる。例えばｉＰＳ細胞からの膵臓外分泌細胞の調製には、非特許文献３及び４に記載の方法を使用できる。誘導（分化）は、消化酵素遺伝子発現や消化酵素分泌を指標に識別できる。移植に用いる調製物は外分泌細胞（分化細胞）を含む懸濁液であってよい。懸濁液は外分泌細胞以外の細胞（例えば、未分化細胞）を含んでいてもよい。なお、ｉＰＳ細胞は市場（例えば、理化学研究所バイオリソースセンター）から入手できる。
【００１２】
哺乳類被験体にはヒト及び非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、豚）が含まれるが、好ましくはヒトである。また、哺乳類被験体の性別や年齢は問わない。
【００１３】
移植に用いる外分泌細胞の形態はその外分泌機能を妨げない限り特に制限されない。具体例としては、懸濁液、外分泌細胞を含む臓器若しくは組織又はそれらの断片、カプセル化細胞（カプセルへの封入）や、体内埋め込み式デバイス（例えばインスリンポンプへの装填）等が挙げられる。これらの中では、細胞懸濁液が好ましい。細胞懸濁液は外分泌細胞以外の細胞を含んでいてもよい。
【００１４】
消化管の管腔構造は、内腔から順に固有粘膜層、粘膜筋板、粘膜下層、固有筋層、漿膜下層及び漿膜により構成される。前記の管腔構造を持つ消化管としては胃、十二指腸、空腸、回腸や大腸が挙げられる。哺乳類被験体がヒトである場合、消化管としては胃、十二指腸、空腸、回腸及び大腸が好ましい。
【００１５】
移植を実施する消化管の部位は特に制限されない。例えばヒトの胃では、任意の部位で移植を実施できる。例えばラットの胃の場合、腺胃が好ましい。
【００１６】
消化管の粘膜下層中（粘膜下層空間）へ外分泌細胞を移植する。粘膜下層は粘膜筋板と固有筋層との間に存在する。粘膜下層と他の管腔構造物とは、粘膜下層に特徴的な構造（豊富な血管構造及び粗な組織構造）を指標として、視診や触診、組織注入時の容易さ等により識別できる。
移植手段は、外分泌細胞の形態に応じて当該技術分野で一般的な手段を適宜選択できる。例えば細胞懸濁液は、注射器や内視鏡等を用いた注入により粘膜下層中へ移植できる。その他、必要に応じて哺乳類被験体を開腹して工程（１）を実施してもよい。
【００１７】
移植する外分泌細胞の量は、哺乳類被験体の状態や移植部位等に応じて適宜設定できるが、膵臓の外分泌細胞を移植する場合、例えば１×１０5〜５×１０7、好ましくは１×１０6〜５×１０6である。
【００１８】
〔工程（２）〕
通常、移植部位は他の部位よりも隆起しているので、目視や触診等で容易に識別できる。その他、移植部位の識別は移植時に行うマーキングを指標に実施してもよい。
固有粘膜層及び粘膜筋板はいずれも、粘膜下層よりも内腔側に存在している。
固有粘膜層及び粘膜筋板の除去は、当該技術分野で一般的な外科的手段により実施できる。具体的な除去手段としては電気焼灼器（内視鏡に組み込まれたものを含む）を用いた焼灼、酢酸やエタノールを用いた化学的焼灼や、冷凍装置を用いた冷却潰瘍等が挙げられ、焼灼深度の調節が容易な電気焼灼器が好ましい。
粘膜筋板と粘膜下層とは、粘膜筋板の筋組織および粘膜下層に特徴的な構造（豊富な血管構造及び粗な組織構造）を指標として、目視により識別できる。
工程（２）の実施時期は特に制限されないが、移植部位に隆起が現れているときが好ましい。隆起部には、移植細胞及び／又は移植細胞から発生した外分泌組織が存在する。
除去領域は移植部位の全体でもよく一部でもよいが、移植部位を示す隆起部の面積の半分程度を除去することが、移植細胞から発生した外分泌組織から分泌物を排出する導管（例えば、膵導管）の開口および移植細胞の保護の観点で好ましい。
【００１９】
〔工程（３）〕
哺乳類の消化管から固有粘膜層及び粘膜筋板を除去すると、固有粘膜層のみが再生することは公知である（非特許文献７）。固有粘膜層のみの再生は哺乳類被験体自体の再生能力により実施されるので、工程（３）は、特段の外的処置を施すことなく実施できる。
但し、必要により、投薬で胃酸分泌を抑制して固有粘膜層の再生を促進してもよい。胃酸分泌抑制には公知物質（例えば、ランソプラゾール（プロトンポンプ阻害剤）やH2受容体拮抗薬、ムスカリン拮抗薬、抗ガストリン薬、制酸薬、胃粘膜保護剤等）を使用できる。
固有粘膜層の再生は、潰瘍瘢痕の出現を指標として目視（例えば、内視鏡による観察）により確認できる。固有粘膜層の再生により移植細胞は保護され、その外分泌機能が発揮される。
【００２０】
移植された外分泌細胞と消化管内腔との連絡が粘膜筋板で妨げられていると、移植細胞から分泌された物質は消化管内腔へ送達されない。そのため、移植細胞は外分泌機能を発揮できず、場合によっては分泌された消化酵素により自己消化されてしまう（後記する比較例参照）。
一方、本発明に従い、移植された外分泌細胞と消化管内腔との連絡が確立すると、移植細胞から分泌された物質は消化管内腔へと送達されてその機能を発揮できるので、移植細胞は外分泌機能を発揮できる。
尚、本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、固有粘膜層の再生過程で外分泌細胞から発生した外分泌組織の導管（例えば膵導管）と固有粘膜層の開口部とが交絡することにより、外分泌細胞と消化管内腔との連絡が確立すると考えられる。
また、移植先である消化管は内視鏡で容易にアプローチできるので、移植後の経過観察や予想外の事象（腫瘍形成又は閉塞性膵炎）にも容易に対処できる。
【００２１】
次に実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
〔分析手順〕
後記する実施例及び比較例で行った分析手順は以下の通りである。
〔リアルタイム逆転写ＰＣＲ〕
RNeasy Micro Kit（QIAGEN）を用いて細胞から全ＲＮＡを単離し、ヒト膵臓全ＲＮＡ（Takara Bio USA）を用いて膵臓遺伝子発現を比較した。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）とランダムヘキサマープライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲ分析は、StepOne and StepOnePlus RealTime PCR System（Applied Biosystems）を用いて実施した。
【００２３】
〔免疫蛍光染色〕
細胞サンプルを４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、snap-freezingを用いてＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社）中に包埋した。
組織サンプルを４％パラホルムアルデヒドで４８時間固定し、パラフィン包埋処理し、予備ブロッキング前に脱パラフィンした。
５μｍの連続切片に対して免疫蛍光染色を行った。２％ロバ血清、２％ＢＳＡ及び０．２％ＮＰ−４０を含むＰＢＳを用いて、室温下で３０分間、サンプルを予備ブロッキングした。２％ロバ血清、２％ＢＳＡ及び０．１％ＮＰ−４０を含むＰＢＳを用いて一次抗体及び二次抗体を希釈した。一次抗体を４℃下で一晩適用した。ＰＢＳによる３回の洗浄後、二次抗体を室温下で６０分間適用（光からの保護あり）して一次抗体を可視化した。二次抗体Alexa Fluor 488、594及び647（Thermo Fisher Scientific）（全て１：３００に希釈)を用いて蛍光標識を実施した。ＰＢＳによる３回の洗浄後、スライドをFluoromount（Sigma-Aldrich）にマウントした。レーザー共焦点顕微鏡（オリンパス株式会社）を用いて画像を取得した。
【００２４】
〔フローサイトメトリー分析〕
細胞凝集塊を、Accumax（Innovative Cell Technologies Inc.)を用いて３７℃で１０分間解離し、ピペッティングして、細胞を分離した。ＰＢＳによる３回の洗浄後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、次いで５％ＢＳＡ及び０．２％ＮＰ−４０を含むＰＢＳを用いて予備ブロッキングした。予備ブロッキング用緩衝液で一次抗体を希釈し、６０分間適用した。ＰＢＳによる３回の洗浄後、予備ブロッキング用緩衝液で希釈した二次抗体を室温下で６０分間適用（光からの保護あり）した。二次抗体Alexa Fluor 488及び647（Thermo Fisher Scientific）（全て１：１００に希釈)を用いて蛍光標識を実施した。ＰＢＳによる３回の洗浄後、染色細胞をGallios and Kaluza software（Beckman Coulter）を使用して分析した。
【００２５】
〔統計分析〕
データは平均±標準偏差又は中央値（四分位点間距離）として示した。胃液中のアミラーゼ値はスチューデントｔ検定又は対応のあるｔ検定を用いて評価した。分化中の遺伝子発現の分析はウィルコクソン符号順位検定又はシェッフェの方法によるフリードマン検定を用いて実施した。ｐ＜０．０５を有意水準と判断した。
【００２６】
〔実施例１：ミンスしたラット膵臓のラット胃粘膜下層への同種移植〕
１．方法
移植手順の概要を図１Ａに示す。F344/Jclラット（雄、８〜１０週齢）から取り出した膵臓の左半分を、カルシウム及びマグネシウムで平衡化したハンクス液（ナカライテスク株式会社）で３回リンスし、ミンスした。得られた膵臓断片をハンクス液中に懸濁し、１層のガーゼで濾過して小断片を集めた。集めた小断片をハンクス液で３回リンスし、再懸濁して細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液は移植まで氷中で維持した。
膵臓細胞懸濁液をF344/Jclラット（雄、８〜１０週齢）（ｎ＝５）の胃粘膜下層へ移植した。２４時間の断食後、イソフルラン吸入麻酔を実施した。開腹下で胃を周辺臓器から剥離し、前胃の大彎側を１ｃｍ切開した。胃内腔を生理食塩水で洗浄後、背側腺胃の胃粘膜下層中へ細胞懸濁液２００μｌ（５×１０6細胞）を注射器で注入した。切開した胃を縫合後、胃を元の位置へ戻し、傷口を縫合した。
移植から３日後、開腹下で胃を再び切開し、移植部位を示す隆起部の面積の半分を電気焼灼器で焼灼し胃潰瘍を作成することで固有粘膜層及び粘膜筋板を除去した。切開した胃を縫合後、胃を元の位置へ戻し、傷口を縫合した。胃潰瘍作成の翌日からランソプラゾール（プロトンポンプ阻害剤）（１０ｍｇ／ｋｇ／日）をラットへ投与した。
移植から２１日後に胃液を採取した（図１Ｂ）。開腹及び胃の剥離後、食道を結紮して胃噴門部のすぐ近位で切断し、十二指腸を幽門部のすぐ遠位で結紮して、唾液及び十二指腸液の胃液への混入を防いだ。２０Ｇサーフローのアウターカテーテル（テルモ株式会社）を用いて唾液を食道の口側基部から腹腔外へと導出して腹腔の汚染を防いだ。１６Ｇサーフローのアウターカテーテルを前胃より胃内へ挿入し、洗浄液が完全に透明になるまで胃内腔を生理食塩水で洗浄した。生理食塩水の除去後、腹腔を一時的に２時間閉じて胃内腔に挿入したカテーテルから胃液を採取した。１回目の採取後、噴門洞を再び開放し、カルバコール（外分泌亢進剤）（１μｍｏｌ／ｋｇ）及びセクレチン（外分泌亢進剤）（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）を下大静脈へ注入した。再度、腹腔を一時的に閉じて、２時間後に胃液を採取した。胃液採取後、十二指腸を切断して胃を回収した。定法（長浜ライフサイエンスラボラトリー）によりアミラーゼレベルを定量した。
対照ラット（ｎ＝５）には、ミンスしたラット膵臓を移植しなかったことを除き、実施例１と同様の処置を施した。
【００２７】
２．結果
移植から２１日後、移植部位に胃潰瘍の瘢痕が観察された（図１Ｃ）。
移植から２１日後、粘膜下層中の移植細胞は粘膜筋板に介在されず固有粘膜層に直接に接触していた（図１Ｄ）。移植細胞はアミラーゼ及びトリプシン（いずれも膵腺房細胞マーカー）とＭＵＣ１（膵導管細胞マーカー）を発現した（図１Ｅ）。この結果は、移植細胞が生着したことを示している。
移植から２１日後に採取した胃液について、移植群ラットの胃液中のアミラーゼ量は対照ラット（移植なし）よりも多く、更にアミラーゼ量はカルバコール（外分泌亢進剤）及びセクレチン（外分泌亢進剤）の投与により著しく増加した（図１Ｆ）。この結果は、移植された膵臓外分泌細胞と胃内腔との連絡が確立され、移植細胞から分泌されたアミラーゼが固有粘膜層を通過して胃内腔へ送達されたことを示している。
【００２８】
〔比較例〕
１．方法
固有粘膜層及び粘膜筋板を除去しなかったことを除き、実施例１と同様の処置を施した（ｎ＝２）。
２．結果
移植から７日後、胃粘膜下層中に移植細胞の生着を確認した。しかしながら、移植細胞と胃内腔との接触は粘膜筋板で妨げられていた（図２Ａ）。
移植から２１日後に移植細胞は消失し、崩壊した細胞のミエリン像及び他の膜残滓が観察された（図２Ｂ）。これは、移植された膵外分泌細胞と胃内腔との連絡が粘膜筋板により妨げられたため、該細胞から分泌された消化酵素により自己消化が起きたことを示している。
【００２９】
〔実施例２：ヒトｉＰＳ細胞から誘導した膵臓細胞のラット胃粘膜下層への異種移植〕
１．方法
１−１．未分化ｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（理化学研究所）を、５ｎｇ／ｍｌ線維芽細胞増殖因子（株式会社リプロセル）を補充した霊長類ＥＳ細胞培地中、マイトマイシンＣで処理したマウス胚線維芽細胞（株式会社リプロセル）上、３７℃、加湿雰囲気（５％ＣＯ2）下で維持した。ヒトＥＳ細胞／ｉＰＳ細胞用解離溶液（株式会社リプロセル）を使用して、３〜４日毎に細胞を小細胞塊として継代した。
【００３０】
１−２．ヒトｉＰＳ細胞の三次元懸濁培養による膵臓細胞への分化
３つの培養皿（直径１０ｃｍ）から取り出したヒトｉＰＳ細胞凝集塊（約３×１０6細胞）を、１０μＭ Ｙ２７６３２（和光純薬工業株式会社）を含む３０ｍｌ ｍＴｅＳＲ１培地（Stem Cell Technologies）中に再懸濁し、３Ｄバイオリアクター（攪拌速度：５５ｒｐｍ）へ播種した。
２日間の培養後、ステージ１（培養開始から３〜６日目）では５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Sigma-Aldrich）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び４００μＭ １−チオグリセロール（Sigma-Aldrich）を含むＳｔｅｍＰｒｏ３４培地（Thermo Fisher Scientific）中で細胞凝集塊を培養し、続くステージ２〜５（培養開始から６〜３１日目）では１％ B27 Supplement（Thermo Fisher Scientific）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び４００μＭモノチオグリセロール（Sigma-Aldrich）を含む改変ＭＥＭ培地（Thermo Fisher Scientific）中で培養した。ステージ４までは細胞をバイオリアクター中で分化させ、ステージ５では細胞を非付着性プレート HydroCellプレート（株式会社セルシード）へ移した。各ステージでは下記の増殖因子及び小分子を添加した。
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【００３１】
１−３．ｉＰＳ細胞由来膵臓細胞のラット胃への移植
ステージ５で得られた細胞スフェロイドを、ステージ５で使用した培地中に再懸濁して細胞懸濁液（約５×１０6細胞／２００μｌ）を得た。細胞懸濁液は移植まで氷中で維持した。この細胞懸濁液２００μｌをF344/rnuラット（雄、８〜１０週齢）（ｎ＝４）への移植に用いたことを除き、実施例１と同様の処置を実施した。
２．結果
２−１．ｉＰＳ細胞の膵臓前駆細胞への分化
免疫蛍光染色によれば、ステージ４の最終日（１６日目）に細胞凝集塊中の多数の細胞が核内でＰＤＸ１及びＳＯＸ９（いずれも膵臓前駆体マーカー）を発現したが、ＮＫＸ６．１（成熟内分泌膵臓への分化に必要な因子）及びＰＴＦ１Ａ（外分泌系の膵腺房細胞の形成に貢献する因子）は発現しなかった（図３Ａ）。
リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析においても、ステージ４の最終日にＰＤＸ１及びＳＯＸ９のｍＲＮＡ発現が明瞭に観察されたが、ＮＫＸ６．１及びＰＴＦ１ＡのｍＲＮＡ発現は有意に上方制御されなかった（図３Ｂ）。
フローサイトメトリー分析によれば、ステージ４の最終日におけるＰＤＸ１陽性細胞及びＳＯＸ９陽性細胞の割合はそれぞれ９１．３±２．４％及び９８．０±０．８％であった（図３Ｃ及び図３Ｄ）。
これらの結果は、ヒトｉＰＳ細胞が初期膵臓前駆細胞へ分化したことを示している。
【００３２】
２−３．ｉＰＳ細胞の膵臓外分泌細胞への分化
リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析によれば、ステージ５の最終日（培養開始から３１日目）に、ＰＤＸ１のｍＲＮＡ発現は有意に下方制御されたが、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ１Ａ及びＳＯＸ９は顕著に発現した。これは、１６日目の膵臓前駆細胞が膵臓細胞へと更に分化したことを示唆している。
免疫蛍光染色においても、ステージ５の最終日にＰＴＦ１Ａ発現が細胞凝集塊中の多くの細胞で明瞭に観察された（図４Ａ）。ＮＫＸ６．１発現は少数の内分泌系列細胞で観察されたが、ＰＤＸ１陽性細胞は僅かであった（図４Ａ）。更に培養細胞はアミラーゼ及びトリプシン（いずれも膵腺房細胞マーカー）とサイトケラチン１９（ＣＫ１９）（膵臓腺房細胞マーカー）を発現した（図４Ｂ）。リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析によれば、アミラーゼ及びトリプシンのｍＲＮＡ発現は有意に上方制御されたが、ＣＫ１９のｍＲＮＡ発現は有意な上昇を示さなかった（図４Ｃ）。
フローサイトメトリー分析によれば、ＰＴＦ１Ａ陽性細胞、アミラーゼ陽性細胞、トリプシン陽性細胞、ＣＫ１９陽性細胞及びＮＫＸ６．１陽性細胞の割合は、それぞれ６９．１±１７．８％、６４．９±１５．９％、３９．６±１０．８％、１４．８±５．６％及び１８．０±７．３％であった（図４Ｄ及び図４Ｅ）。
これらの結果は、ヒトｉＰＳ細胞が、主に外分泌及び管系列の膵臓細胞へ分化したことを示している。
【００３３】
２−４．ｉＰＳ細胞由来膵臓外分泌細胞のラット胃への移植
移植から２１日後、粘膜下層中で観察された膵腺房様組織（移植細胞）は、粘膜筋板による干渉なく固有粘膜層に直接付着していた（図５Ａ）。
免疫蛍光染色では、移植組織中に、ｉＰＳ細胞由来のヒトミトコンドリアと共に、ＣＫ１９、アミラーゼ及びトリプシンの発現が観察された（図５Ｂ）。この結果は、移植された膵臓外分泌細胞と胃内腔との連絡が確立されたことで分泌消化酵素による自己消化が起こらず、移植細胞が生着したことを示している。４頭の移植ラットのうち３頭で移植細胞の生着が観察された。更に２頭の移植ラットで胃液中のアミラーゼ量が上昇した（図５Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は再生療法に利用できる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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