(57)【要約】【課題】本発明は、多種類の遺伝子変異、特に一塩基置換若しくは点変異を、正確かつ定量的に分離及び検出する方法を提供することを目的とする。【解決手段】遺伝子変異、特に一塩基置換若しくは点変異を解析するためのASPにおいて、そのASP及びそれと対となすプライマーの少なくとも1つの5’末端に、非塩基物質を付加してPCRにより増幅し、その増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することで、増幅産物の長さが同じでも、分離検出できる。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
1種類以上のアレル特異的プライマーを用いて増幅された遺伝子増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析する際に、前記アレル特異的プライマー若しくはそれと対となすプライマーの少なくとも1つの5’末端に、非塩基物質を付加することを特徴とする、遺伝子変異を検出する方法。
【請求項２】
イオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーである請求項1に記載の検出方法。
【請求項３】
非塩基物質が、蛍光物質若しくはハプテンである請求項1又は2に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸試料中に含まれる一塩基置換若しくは点変異などの変異の特異的な検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子変異には、遺伝的に受け継がれる生殖細胞変異と後天的に一つ一つの細胞内で引き起こされる体細胞変異があるが、生殖細胞変異の中で特定の遺伝子の一塩基多型、(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)の特定の遺伝子型や体細胞変異の点変異(一塩基置換)、挿入、欠失などが、各種疾病に関連していることが報告されており、近年それらの塩基配列を同定することによって、特定の薬剤に効果が期待される患者の選別に利用されている。例えば、UGT1A1の遺伝子多型は、抗がん剤であるイリノテカンの重篤な副作用の発現のリスクを判断することに利用されている。UGT1A1の遺伝子多型検査においては、2つの塩基配列(*6、*28)を対象に、それぞれ変異を持たない野生型、野生型と変異型の両方を持つヘテロ接合体、変異型のみのホモ接合体を判別する必要がある。真性赤血球増加症の診断として用いられているJAK2遺伝子変異は、機能獲得型の後天的体細胞変異であり、エクソン14のG1849Tの点変異により、恒常的な受容体型チロシンキナーゼの活性化をもたらす。この点変異は、検出するだけでなく、量的推移が診療上有用とされることから、アレル頻度を算出することが要求される。すなわち、遺伝子多型検出と同様に、変異型及び野生型の両方を定量的に検出する必要がある。
【０００３】
核酸を短時間に精度良く分離検出できる方法として、イオン交換クロマトグラフィーが利用されている。このイオン交換クロマトグラフィーを核酸の検出に応用する利点としては、核酸の鎖長で分離できることから、例えばPCRによる増幅産物の長さを調節すれば、複数の増幅産物を一度の分離で分別及び検出することも可能となることである。この原理は、上記のような複数存在する遺伝子変異の検出への応用も理論的には可能であるが、一塩基置換や点変異のような僅か1塩基の違いを検出するためには、工夫が必要である。一塩基置換検出の場合、単純にSNP部位を挟むようにPCR用のプライマーを設計して、増幅産物を得たとしても、一塩基の違いをイオン交換クロマトグラフィーで分離するのは困難である。これに対して、特許文献1には、アレル特異プライマー(Allele Specific Primer; ASP)の5’末端に鋳型DNAと不完全相補な配列(タグ配列)を付加させることで、PCRによる増幅産物の長さを人為的に変化させて、イオン交換クロマトグラフィーにてSNPを分離検出する方法が開示されている。しかしながら、付加する塩基配列が長すぎるとプライマーとしてのTm値の変化が大きくなり、特異性が保てなくなる可能性がある。逆に短すぎると、増幅産物長の差が小さくなることでイオン交換クロマトグラフィーの分離が悪くなり、一塩基多型を正確に判定することが出来なくなることが懸念される。
【０００４】
一方、ASPの設計を、二本鎖のフォワード側及びリバース側に設計し、その対となるプライマーを、変異部位以外の適当な場所に設計することにより、2種類の大きさが異なる増幅産物を得ることで、キャピラリー電気泳動を用いて分離できることが報告されている(非特許文献1)。しかしながら、この方法では変異と関係ないプライマー同士が対となった増幅が進んでしまうことから、増幅に必要な成分が消費され、特異反応に影響する可能性がある。さらに、2組の対となるプライマーを用いていることから、ハイブリダイゼーション及び増幅の効率に差が生じやすく、アレル頻度を正確に算出するのは困難であった。さらに加えて、この方法では、2種類までの変異検出が限界であり、KRASやNRASなどのコドン12やコドン13の点変異のように、多くの種類の変異には適用することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2012/133834
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Takei H, Morishita S, Araki M, Edahiro Y, Sunami Y, Hironaka Y, Noda N, Sekiguchi Y, Tsuneda S, Ohsaka A, Komatsu N. Detection of MPLW515L/K mutations and determination of allele frequencies with a single-tube PCR assay. PLoS One. 2014 Aug 21;9(8):e104958.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記のような従来の課題を鑑みて、多種類の遺伝子変異、特に一塩基置換若しくは点変異を、正確かつ定量的に分離及び検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するための手段として、遺伝子変異、特に一塩基置換若しくは点変異を解析するためのASPにおいて、そのASP及びそれと対となすプライマーの少なくとも1つの5’末端に、非塩基物質を付加してPCRにより増幅し、その増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することで、増幅産物の長さが同じでも、分離検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下の〔1〕〜〔3〕の構成からなる。
〔1〕1種類以上、例えば1種類、例えば2種類、例えば3種類、例えば4種類、例えば5種類、例えば6種類、例えば7種類、例えば8種類、例えば9種類、例えば10種類、例えば11種類、例えば12種類、例えば13種類、例えば14種類、例えば15種類、例えば16種類、例えば17種類、例えば18種類、例えば19種類、例えば20種類、のアレル特異的プライマーを用いて増幅された遺伝子増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析する際に、前記アレル特異的プライマー若しくはそれと対となすプライマーの少なくとも1つの5’末端に、非塩基物質を付加することを特徴とする、遺伝子変異を検出する方法。
〔2〕イオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーである上記〔1〕に記載の検出方法。
〔3〕非塩基物質が、蛍光物質若しくはハプテンである上記〔1〕又は〔2〕に記載の検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
一塩基置換若しくは点変異を解析するためのASPでは、増幅産物の長さが同じ、若しくは配列によっては、1〜2塩基程度異なることはあるが、一般にイオン交換クロマトグラフィーでの分離検出は困難である。
【００１０】
これに対して、ASP及びそれと対となすプライマーの少なくとも1つの5’末端に、非塩基物質を付加してPCRにより増幅すると、その増幅産物に1つ若しくは2つの非塩基物質が標識されていることになる。この僅かな標識物の物性並びに個数の違いにより、増幅産物のイオン強度が微妙に変化し、イオン交換クロマトグラフィーでの溶出位置が変化し、この特性を用いて増幅産物の分離検出することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明で用いられるアレル特異的プライマーは、その遺伝子多型や遺伝子変異の塩基配列に対して特異的に結合できるプライマーであればよく、一塩基置換だけでなく、挿入や欠失変異を含む塩基配列などに特異的で、かつ本発明による分離に適用できるものであれば特に制限なく利用可能である。
【００１２】
本発明に用いられる非塩基物質としては、それが付加されたアレル特異的プライマーを用いて増幅された遺伝子増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析する場合に、溶出パターンが変化するものであれば特に制限はなく、例えば、ハプテンや蛍光色素があげられる。ハプテンとしては、プライマーの修飾として良く用いられるジゴキシゲニン(DIG)などを、蛍光色素としては、Alexa Fluorシリーズ、Cyシリーズ、ATTOシリーズ、DYシリーズ、DyLightシリーズ、FAM、TAMRAなどを用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1は、3つの蛍光標識プライマー(配列番号3、7及び8)による増幅産物の溶出ピークを重ね書きした結果を示す。
【図２】図2は、非塩基性物質付加ASPを用いたUGT1A1遺伝子の*6多型部位からの増幅産物の分離及び検出を示す。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１５】
[実施例1]非塩基物質付加ASPを用いたUGT1A1遺伝子の*6多型部位からの増幅産物
【００１６】
ヒトUGT1A1遺伝子の*6アレル(211G>A)で、ミスマッチ塩基を一箇所無味入れた当該アレルを特異的に増幅できるASP(配列番号1)及びそのリバースプライマー(配列番号12)を用意し(シグマアルドリッジ株式会社へ委託)、さらにASPの5’末端に、非塩基物質を修飾したプライマーを別に用意した(配列番号2は、サーモフィッシャー株式会社へ委託、配列番号8は、ユーロフィンジェノミクス株式会社へ委託、配列番号4及び6は、Integrated DNA Technologies MBL株式会社へ委託、それ以外は、シグマアルドリッジ株式会社へ委託)。配列番号、プライマー配列、オリゴヌクレオチドの長さ(bp)、非塩基物質の種類、並びに、非塩基物質の励起波長及び蛍光波長(nm)を表1に示す。
【表１】
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【００１７】
・試薬、増幅条件及びイオン交換クロマトグラフィー条件
【００１８】
以下の試薬を含む25μLの反応溶液を調製し、CFX96(バイオラッド社)にて2ステップのアレル特異的PCRによる増幅を行った。この検討では、UGT1A1遺伝子*6のアレルがホモ接合体の人から採取した精製DNAを用いた。
【表２】
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【００１９】
その結果を表3に示す。すべての増幅産物の鎖長は117bpとなるが、未標識増幅産物と比較して、各種非塩基物質が標識されたプライマーを用いて増幅された産物のイオン交換クロマトグラフィーでの溶出時間は、早まったり遅延したりと様々なパターンを示す興味深い知見が得られた。その中から、特に溶出時間の変化が大きかった3つの蛍光標識プライマー(配列番号3、7及び8)による増幅産物の溶出ピークを重ね書きした結果を図1に示す。この結果は、同じ部位にいくつかパターンがある遺伝子多型や遺伝子変異を特定するための特異的なプライマー毎に、標識する非塩基物質を変化させることによって、仮にその増幅産物の鎖長が同一になる場合においても、一回のイオン交換クロマトグラフィー分離において、複数変異のマルチプレックス解析が可能であることを支持するものである。
【表３】
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【００２０】
[実施例2]非塩基性物質付加ASPを用いたUGT1A1遺伝子の*6多型部位からの増幅産物の分離及び検出
【００２１】
*6アレル検出用のプライマーは、実施例1に記載の配列番号3を用いた。一方、*6多型部位における野生型検出用のプライマーは、実施例1に記載の配列番号1と同様に、非標識でミスマッチ塩基を一箇所に導入して野生型を特異的に増幅できるASP(配列番号13)を別に用意した。この検討では、UGT1A1遺伝子*6の遺伝子多型部位が、野生型、*6アレルのヘテロ接合体及びホモ接合体の人から採取した精製DNAを用いた。
【００２２】
配列番号13
5’-GTTGTACATCAGAGACGAA-3’
【００２３】
・試薬、増幅条件及びイオン交換クロマトグラフィー条件
【００２４】
以下の試薬を含む25μLの反応溶液を調製し、CFX96(バイオラッド社)にて2ステップのアレル特異的PCRによる増幅を行った。
【表４】
2019129706.tif 000006
【００２５】
その結果を図2に示す。*6アレルのヘテロ接合体である検体1では、未標識増幅産物の溶出位置(溶出時間8.6分付近)とFAM標識増幅産物の溶出位置(溶出時間9.2分)に2つの溶出ピークを認め、*6アレルのホモ接合体である検体2では、FAM標識増幅産物の溶出位置にのみ溶出ピークを認め、野生型である検体3では、未標識増幅産物の溶出位置のみ溶出ピークを認めたことから、UGT1A1遺伝子の*6多型部位の遺伝子型が容易かつ正確に判別することが可能であることがわかった。
【００２６】
上記の知見を踏まえると、複数のASPにイオン交換クロマトグラフィーによる溶出時間が変化する複数の非塩基物質を付加し、さらにそれと対となすプライマーにも非塩基物質を付加することによって、様々な溶出時間を調整することが可能となる。さらに、非塩基物質に、蛍光色素を用いることによって、蛍光波長がクロストークしないものを選択することで、溶出時間に差が無くとも、検出する波長で判別することも可能となる。
【００２７】
増幅産物の検出方法としては、増幅反応した試薬をそのままイオン交換クロマトグラフィーで分離する方法以外に、複数の増幅試薬を別々に準備し、その混合液をイオン交換クロマトグラフィーで分離する方法も可能である。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
従って、本発明によれば、従来法では困難であった複数の遺伝子多型の遺伝子型や一塩基置換を、容易にかつ正確に検出でき、近年需要が高まってきている遺伝子検査のマルチプレックス化に対応可能な方法が提供される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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