(57)【要約】      （修正有）【課題】相同組換え（遺伝子標的化）を介して染色体を改変する材料及び方法の提供。【解決手段】キサントモナス属中の植物病原細菌の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターのＲＶＤとその標的部位中のヌクレオチドとが一部の縮重を伴って１個のＲＶＤ対１個のヌクレオチドが対応していることを応用し、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ等を融合させた転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いた遺伝子標的化に関連する材料及び方法の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の遺伝物質を修飾する方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡ配列を含有する細胞を提供するステップと、
（ｂ）転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター−ＤＮＡ修飾酵素を前記細胞へ導入するステップであって、
前記ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素は、
（ｉ）二本鎖ＤＮＡを修飾することができるＤＮＡ修飾酵素ドメイン、および
（ｉｉ）組み合わせて標的ＤＮＡ配列中の特定のヌクレオチド配列と結合する複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含むＴＡＬエフェクタードメイン
を含むものであり、
前記ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素が、前記細胞またはその子孫中の前記特定のヌクレオチド配列内にあるまたはそれに隣接する前記標的ＤＮＡを修飾するように、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素を前記細胞へ導入する、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡ配列と前記核酸との間で相同組換えが起こるように、前記標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部分に相同的な配列を含む核酸を、前記細胞に提供するステップをさらに含む、方法。
【請求項３】
前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が原核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記導入ステップが、前記ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素をコードしているベクターを用いて細胞を形質移入することを含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記導入ステップが、前記ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素を前記細胞内にタンパク質として機械的に注入することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、
前記導入ステップが、前記ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素を、細菌ＩＩＩ型分泌系によってタンパク質として前記細胞内に送達することを含む、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
前記導入ステップが、前記ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素を、電気穿孔によってタンパク質として前記細胞内に導入することを含む、方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ修飾酵素ドメインがエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記エンドヌクレアーゼがＩＩ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼがＦｏｋＩである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列と結合する前記ＴＡＬエフェクタードメインが、１０個以上のＤＮＡ結合反復、より好ましくは１５個以上のＤＮＡ結合反復を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
それぞれのＤＮＡ結合反復が、前記標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する反復可変性二残基（ＲＶＤ）を含み、
それぞれのＤＮＡ結合反復が、前記標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記ＲＶＤが、
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、
ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、
ＣまたはＴを認識するためのＮ＊［ただし＊はＲＶＤの第２位置中のギャップを表す］、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＨ＊［ただし＊はＲＶＤの第２位置中のギャップを表す］、
Ｔを認識するためのＩＧ、
Ｇを認識するためのＮＫ、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、
Ｇを認識するためのＮＡ、
ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、および
Ｔを認識するためのＹＧ
のうちの１つまたは複数を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
それぞれのＤＮＡ結合反復が、前記標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、
それぞれのＤＮＡ結合反復が、前記標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記ＲＶＤが、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、
Ｇを認識するためのＮＡ、
ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、
Ｔを認識するためのＹＧ、および
Ｇを認識するためのＮＫ、
のうちの１つまたは複数、ならびに
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、
ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、
ＣまたはＴを認識するためのＮ＊［ただし＊はＲＶＤの第２位置中のギャップを表す］、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＨ＊［ただし＊はＲＶＤの第２位置中のギャップを表す］、および
Ｔを認識するためのＩＧ
のうちの１つまたは複数を含む、方法。
【請求項１８】
選択されたヌクレオチド配列に特異的なＴＡＬエフェクターをコードしている核酸を作製する方法であって、
（１）開始プラスミドをＰｓｐＸＩで直鎖状にするステップであって、
前記開始プラスミドが、選択されたヌクレオチド配列の第１ヌクレオチドに特異的な反復可変性二残基（ＲＶＤ）を有する第１のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合反復ドメインをコードしているヌクレオチド配列を含み、
第１のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合反復ドメインが、その３’末端にユニークなＰｓｐＸＩ部位を有する、ステップと、
（２）前記開始プラスミドのＰｓｐＸＩ部位内に、選択されたヌクレオチド配列の次のヌクレオチドに特異的なＲＶＤを有する１つまたは複数のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合反復ドメインをコードしているＤＮＡモジュールをライゲーションするステップであって、
前記ＤＮＡモジュールがＸｈｏＩ粘着末端を有する、ステップと、
（３）前記核酸が、前記選択されたヌクレオチド配列と結合することができるＴＡＬエフェクターをコードするまで、ステップ（１）および（２）を繰り返すステップと
を含む、方法。
【請求項１９】
、請求項１８に記載の方法であって、
ライゲーション後に、前記ＰｓｐＸＩ部位中の前記ＤＮＡモジュールの配向を決定するステップをさらに含む、方法。
【請求項２０】
ステップ（１）および（２）を１〜３０回繰り返すことを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
転写活性化因子様エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードしている核酸を作製する方法であって、
（ａ）細胞のゲノム中の第１のユニークなヌクレオチド配列を同定するステップと、
（ｂ）（ｉ）組み合わせて前記第１のユニークなヌクレオチド配列と結合する複数のＤＮＡ結合反復、および（ｉｉ）第１のヌクレオチド配列内にあるまたはそれに隣接する第２のヌクレオチド配列で二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼを含む、ＴＡＬＥＮをコードしている核酸を合成するステップであって、
それぞれのＤＮＡ結合反復が、前記標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、
それぞれのＤＮＡ結合反復が、前記標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記ＴＡＬＥＮが、以下のＲＶＤ：
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、
ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、
ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＨ＊、
Ｔを認識するためのＩＧ、
Ｇを認識するためのＮＫ、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、
Ｇを認識するためのＮＡ、
ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、および
Ｔを認識するためのＹＧ
のうちの１つまたは複数を含むステップと
を含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、
前記ＴＡＬＥＮが、以下のＲＶＤ：
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、
Ｇを認識するためのＮＡ、
ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、
Ｔを認識するためのＹＧ、および
Ｇを認識するためのＮＫ、
のうちの１つまたは複数、ならびに
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、
ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、
ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＨ＊、および
Ｔを認識するためのＩＧ
のうちの１つまたは複数を含む、方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法であって、
前記第１のヌクレオチド配列が以下の基準：
ｉ）最小で１５個の塩基の長さであり、５’から３’に配向されており、Ｔが５’末端の部位の直前にあること、
ｉｉ）第１（５’）位置にＴを有さない、または、第２位置にＡを有さないこと、
ｉｉｉ）最終（３’）位置がＴで終わり、最後から２番目の位置にＧを有さないこと、ならびに
ｉｖ）０〜６３％のＡ、１１〜６３％のＣ、０〜２５％のＧ、および２〜４２％のＴの塩基組成を有すること
のうちの少なくとも１つを満たす、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、
前記細胞のゲノム中の第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を同定するステップを含み、
前記第１および第２のヌクレオチド配列が、請求項２３に記載の基準のうちの少なくとも１つを満たしており、１５〜１８ｂｐで分離されている、方法。
【請求項２５】
前記エンドヌクレアーゼが、前記第１および第２のヌクレオチド配列の間に二本鎖切断を生じる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
エンドヌクレアーゼドメインと標的ＤＮＡに特異的なＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含むＴＡＬＥＮであって、
前記ＤＮＡ結合ドメインが複数のＤＮＡ結合反復を含み、
それぞれの反復が前記標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、
それぞれのＤＮＡ結合反復が、前記標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記ＴＡＬＥＮが、以下のＲＶＤ：
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、
ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、
ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＨ＊、
Ｔを認識するためのＩＧ、
Ｇを認識するためのＮＫ、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、
Ｇを認識するためのＮＡ、
ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、および
Ｔを認識するためのＹＧ
のうちの１つまたは複数を含むＴＡＬＥＮ。
【請求項２７】
請求項２６に記載のＴＡＬＥＮであって、
前記ＴＡＬＥＮが、以下のＲＶＤ：
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、
Ｇを認識するためのＮＡ、
ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、
Ｔを認識するためのＹＧ、および
Ｇを認識するためのＮＫ、
のうちの１つまたは複数、ならびに
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、
ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、
ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＨ＊、および
Ｔを認識するためのＩＧ
のうちの少なくとも１つまたは複数を含む、ＴＡＬＥＮ。
【請求項２８】
前記エンドヌクレアーゼドメインがＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ由来のものである、請求項２６に記載のＴＡＬＥＮ。
【請求項２９】
前記ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼがＦｏｋＩである、請求項２８に記載のＴＡＬＥＮ。
【請求項３０】
エンドヌクレアーゼドメインおよびＴＡＬエフェクタードメインを含むＴＡＬＥＮであって、
前記ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列が、配列番号３３〜配列番号５５、配列番号７２、および配列番号７３からなる群から選択される、ＴＡＬＥＮ。
【請求項３１】
動物を作製する方法であって、
遺伝子修飾を導入することが所望される標的ＤＮＡ配列を含む真核細胞を提供するステップと、
エンドヌクレアーゼドメインと前記標的ＤＮＡ配列へ結合するＴＡＬエフェクタードメインとを含むＴＡＬＥＮを用いて、前記標的ＤＮＡ配列内で二本鎖切断を生じるステップと、
前記二本鎖切断が起こった細胞またはその子孫から動物を作製するステップと
を含む、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同的な配列を含む外因性核酸を、前記細胞内に導入するステップであって、
前記導入するステップが、前記外因性核酸と前記細胞またはその子孫中の前記標的ＤＮＡ配列との間に相同組換えが起こることを可能にする条件下で行われる、ステップと、
前記相同組換えが起こった細胞またはその子孫から動物を作製するステップと
をさらに含む、方法。
【請求項３３】
前記動物が哺乳動物である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子修飾が置換、挿入、または欠失を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
植物を作製する方法であって、
事前に選択された遺伝子修飾の導入が所望される標的ＤＮＡ配列を含む植物細胞を提供するステップと、
エンドヌクレアーゼドメインと前記標的ＤＮＡ配列へ結合するＴＡＬエフェクタードメインとを含むＴＡＬＥＮを用いて、前記標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生じるステップと、
前記二本鎖切断が起こった細胞またはその子孫から植物を作製するステップと
を含む、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部分に相同的な配列を含む外因性核酸を、前記植物細胞内に導入するステップであって、前記導入するステップが、前記外因性核酸と前記細胞またはその子孫中の前記標的ＤＮＡ配列との間で相同組換えが起こることを可能にする条件下で行われる、ステップと、
前記相同組換えが起こった細胞またはその子孫から植物を作製するステップと
をさらに含む、方法。
【請求項３７】
細胞における標的化遺伝子組換えの方法であって、
選択されたＤＮＡ標的配列を標的としたＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸を前記細胞内に導入するステップと、
前記細胞内での前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの発現を誘導するステップと、
前記選択されたＤＮＡ標的配列が突然変異を示している細胞を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項３８】
前記突然変異が、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、ならびに遺伝物質の欠失および挿入の両方からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞内にドナーＤＮＡを導入するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が昆虫細胞、植物細胞、魚細胞、または哺乳動物細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
標的ＤＮＡに対して増強された標的化能力を有するＴＡＬエフェクターを作製する方法であって、前記方法は、
複数のＤＮＡ結合反復を有するＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬエフェクターをコードしている核酸を作製するステップであって、
それぞれの反復が、前記標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、
それぞれの反復が、前記標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っている、ステップを含み、
前記作製するステップが、Ａ、Ｃ、またはＧに対する特異性を有する変異第０ＤＮＡ結合反復配列をコードしている核酸を取り込ませることを含み、これにより結合部位の−１位でのＴの必要性を排除する、方法。
【請求項４２】
標的ＤＮＡに対して増強された標的化能力を有するＴＡＬエフェクターを作製する方法であって、前記方法は、
複数のＤＮＡ結合反復を有するＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬエフェクターをコードしている核酸を作製するステップであって、
それぞれの反復が、前記標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、
それぞれの反復が、標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っている、ステップ
を含み、
前記作製するステップが、Ｇに対して増強された特異性を有するＲＶＤを含有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをコードしている１つまたは複数の核酸を取り込ませることを含み、
前記ＲＶＤが、ＲＮ、Ｒ＊、ＮＧ、ＮＨ、ＫＮ、Ｋ＊、ＮＡ、ＮＴ、ＤＮ、Ｄ＊、ＮＬ、ＮＭ、ＥＮ、Ｅ＊、ＮＶ、ＮＣ、ＱＮ、Ｑ＊、ＮＲ、ＮＰ、ＨＮ、Ｈ＊、ＮＫ、ＮＹ、ＳＮ、Ｓ＊、ＮＤ、ＮＷ、ＴＮ、Ｔ＊、ＮＥ、ＮＦ、ＹＮ、Ｙ＊、およびＮＱからなる群から選択され、＊がＲＶＤの第２位置でのギャップを示す、方法。
【請求項４３】
標的ＤＮＡ配列中の少なくとも１つの塩基対を選択的に認識するポリペプチドを生成する方法であって、前記方法は、
反復ドメインを含むポリペプチドを合成するステップを含み、
前記反復ドメインが、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、
前記反復単位が、前記標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、
前記反復単位が、前記ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記超可変領域が、
（ａ）Ｃ／Ｇを認識するためのＨＤ、
（ｂ）Ａ／Ｔを認識するためのＮＩ、
（ｃ）Ｔ／Ａを認識するためのＮＧ、
（ｄ）Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃを認識するためのＮＳ、
（ｅ）Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔを認識するためのＮＮ、
（ｆ）Ｔ／Ａを認識するためのＩＧ、
（ｇ）Ｃ／Ｇを認識するためのＮ、
（ｈ）Ｃ／ＧまたはＴ／Ａを認識するためのＨＧ、
（ｉ）Ｔ／Ａを認識するためのＨ、および
（ｊ）Ｇ／Ｃを認識するためのＮＫ
からなる群から選択されるメンバーを含む、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法によって生成されたポリペプチド。
【請求項４５】
請求項４３に記載の方法によって生成されたポリペプチドのコード配列を含むＤＮＡ。
【請求項４６】
請求項４５に記載のＤＮＡと作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット。
【請求項４７】
請求項４６に記載の発現カセットを含む非ヒト宿主細胞。
【請求項４８】
請求項４６に記載の発現カセットを含む形質転換させた非ヒト生物。
【請求項４９】
ポリペプチドによってＤＮＡ配列中の塩基対を選択的に認識する方法であって、前記方法は、
反復ドメインを含むポリペプチドを構築するステップを含み、
前記反復ドメインが、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、
前記反復単位が、前記ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、
前記反復単位が、前記ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記超可変領域が、
（ａ）Ｃ／Ｇを認識するためのＨＤ、
（ｂ）Ａ／Ｔを認識するためのＮＩ、
（ｃ）Ｔ／Ａを認識するためのＮＧ、
（ｄ）Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃを認識するためのＮＳ、
（ｅ）Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔを認識するためのＮＮ、
（ｆ）Ｔ／Ａを認識するためのＩＧ、
（ｇ）Ｃ／Ｇを認識するためのＮ、
（ｈ）Ｃ／ＧまたはＴ／Ａを認識するためのＨＧ、
（ｉ）Ｔ／Ａを認識するためのＨ、および
（ｊ）Ｇ／Ｃを認識するためのＮＫ
からなる群から選択されるメンバーを含む、方法。
【請求項５０】
細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、
ポリペプチドを含有する細胞が提供され、
前記ポリペプチドが反復ドメインを含み、
前記反復ドメインが、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、
前記反復単位が、ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、
前記反復単位が、ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記超可変領域が、
（ａ）Ｃ／Ｇを認識するためのＨＤ、
（ｂ）Ａ／Ｔを認識するためのＮＩ、
（ｃ）Ｔ／Ａを認識するためのＮＧ、
（ｄ）Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃを認識するためのＮＳ、
（ｅ）Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔを認識するためのＮＮ、
（ｆ）Ｔ／Ａを認識するためのＩＧ、
（ｇ）Ｃ／Ｇを認識するためのＮ、
（ｈ）Ｃ／ＧまたはＴ／Ａを認識するためのＨＧ、
（ｉ）Ｔ／Ａを認識するためのＨ、および
（ｊ）Ｇ／Ｃを認識するためのＮＫ
からなる群から選択されるメンバーを含む、方法。
【請求項５１】
反復ドメインを含むポリペプチドであって、
前記反復ドメインが、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、
前記反復単位が、ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、
前記反復単位が、ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記超可変領域が、
（ａ）Ｃ／Ｇを認識するためのＨＤ、
（ｂ）Ａ／Ｔを認識するためのＮＩ、
（ｃ）Ｔ／Ａを認識するためのＮＧ、
（ｄ）Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃを認識するためのＮＳ、
（ｅ）Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔを認識するためのＮＮ、
（ｆ）Ｔ／Ａを認識するためのＩＧ、
（ｇ）Ｃ／Ｇを認識するためのＮ、
（ｈ）Ｃ／ＧまたはＴ／Ａを認識するためのＨＧ、
（ｉ）Ｔ／Ａを認識するためのＨ、および
（ｊ）Ｇ／Ｃを認識するためのＮＫ
からなる群から選択されるメンバーを含む、ポリペプチド。
【請求項５２】
請求項５１に記載のポリペプチドのコード配列を含むＤＮＡ。
【請求項５３】
塩基対が反復ドメインを含むポリペプチドによって特異的に認識されることができるように、標的ＤＮＡ配列上に位置する塩基対が含まれるように修飾されたＤＮＡであって、
前記反復ドメインが、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、
前記反復単位が、前記ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、
前記反復単位が、前記ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記塩基対が、超可変領域による選択的かつ決定された認識を受けるために、
（ａ）ＨＤによる認識のためのＣ／Ｇ、
（ｂ）ＮＩによる認識のためのＡ／Ｔ、
（ｃ）ＮＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｄ）ＮＳによる認識のためのＣＴまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃ、
（ｅ）ＮＮによる認識のためのＧ／ＣまたはＡ／Ｔ、
（ｆ）ＩＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｇ）Ｎによる認識のためのＣ／ＧまたはＴ／Ａ、
（ｈ）ＨＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｉ）Ｈによる認識のためのＴ／Ａ、および
（ｊ）ＮＫによる認識のためのＧ／Ｃ
からなる群から選択される、ＤＮＡ。
【請求項５４】
請求項５３に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項５５】
請求項５３に記載のＤＮＡを含む非ヒト宿主細胞。
【請求項５６】
請求項５３に記載のＤＮＡを含む形質転換された非ヒト生物。
【請求項５７】
反復ドメインを含むポリペプチドによって選択的に認識される標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡを生成する方法であって、
前記反復ドメインが、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、
前記反復単位が、前記標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、
前記反復単位が、前記標的ＤＮＡ中の１つの塩基対配列の認識を司っており、
前記方法が、前記反復単位によって認識されることができる塩基対を含むＤＮＡを合成するステップを含み、
前記塩基対が、
（ａ）ＨＤによる認識のためのＣ／Ｇ、
（ｂ）ＮＩによる認識のためのＡ／Ｔ、
（ｃ）ＮＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｄ）ＮＳによる認識のためのＣＴまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃ、
（ｅ）ＮＮによる認識のためのＧ／ＣまたはＡ／Ｔ、
（ｆ）ＩＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｇ）Ｎによる認識のためのＣ／ＧまたはＴ／Ａ、
（ｈ）ＨＧによる認識のためのＴ／Ａ、
（ｉ）Ｈによる認識のためのＴ／Ａ、および
（ｊ）ＮＫによる認識のためのＧ／Ｃ
からなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、すべてその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、２００９年１２月１０日に出願の米国仮出願第６１／２８５，３２４号、２０１０年６月７日に出願の米国仮出願第６１／３５２，１０８号、および２０１０年７月２２日に出願の米国仮出願第６１／３６６，６８５号の優先権を主張するものである。
【０００２】
政府出資の研究に関する表明
本発明は、国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって授与された助成金第０８２０８３１号および第０５０４３０４号の下の政府支援で行った。政府が本発明の特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、遺伝子標的化の方法、特に転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター配列の使用が含まれる方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
相同組換え（遺伝子標的化）を介して染色体を改変する能力は、生物学者の念願の目標であった。たとえば、植物では、遺伝子標的化は、植物遺伝子の機能の識別を助けて、作物の改善の新しい可能性を開き得る。たとえば、遺伝子標的化を用いて、代謝経路を再編成するために必要な遺伝手術を実施して、変更された油もしくは炭水化物プロフィールを有する種子、増強された栄養品質を有する食品、または疾患およびストレスに対して増加した耐性を有する植物を含めた高価値の作物を作製することが可能である。動物（たとえば哺乳動物）では、遺伝子標的化を疾患の処置に使用し得る。たとえば、遺伝子標的化は、様々な種類の突然変異が原因で欠損性である遺伝子中の補正を設計するために使用し得る。そのような遺伝子標的化の効率的な方法は、達成が困難であった。
【０００５】
キサントモナス属中の植物病原細菌のＴＡＬエフェクターは、宿主ＤＮＡと結合してエフェクターに特異的な宿主遺伝子を活性化することによって、疾患において重要な役割を果たす、または防御を始動する（たとえば、Ｇｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ、４３５：１１２２、Ｙａｎｇら（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：１０５０３、Ｋａｙら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８：６４８、Ｓｕｇｉｏら（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４：１０７２０、およびＲｏｍｅｒら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１８：６４５を参照）。特異性は、エフェクター可変性の、不完全な、典型的には３４個のアミノ酸の反復に依存する（Ｓｃｈｏｒｎａｃｋら（２００６）Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１６３：２５６）。多型は主に反復位置１２および１３に存在し、本明細書中ではこれを反復可変性二残基（ＲＶＤ、ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）と呼ぶ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＴＡＬエフェクターのＲＶＤとその標的部位中のヌクレオチドとが一部の縮重を伴って１個のＲＶＤ対１個のヌクレオチドの直接的な線形様式で対応しており、明らかなコンテキスト依存性がないことに部分的に基づく。この驚くべき発見は、新しい標的特異的ＴＡＬエフェクターの標的部位の予測を可能にするタンパク質−ＤＮＡの認識の新規機構を表す。本明細書中に記載のように、これらのタンパク質は、ゲノム操作における相同組換え（たとえば、生物燃料または植物におけるバイオ再生可能物質に有用な特色を付加または増強させるため）を促進することができる標的化キメラヌクレアーゼとして、研究および生命工学において有用であり得る。また、これらのタンパク質は、たとえば、非限定的な例として、転写因子および特に病原体（たとえばウイルス）に対する治療剤などの非常に高いレベルの特異性を要する治療的応用としても有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、（ａ）標的ＤＮＡ配列を含有する細胞を提供するステップと、（ｂ）ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素が細胞またはその子孫中の特定のヌクレオチド配列内にあるまたはそれに隣接する標的ＤＮＡを修飾するように、細胞内に、（ｉ）二本鎖ＤＮＡを修飾することができるＤＮＡ修飾酵素ドメイン、および（ｉｉ）組み合わせて標的ＤＮＡ配列中の特定のヌクレオチド配列と結合する複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含むＴＡＬエフェクタードメインを含む、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター−ＤＮＡ修飾酵素を導入するステップとを含む、細胞の遺伝物質を改変する方法を特長とする。本方法は、標的ＤＮＡ配列と核酸との間の相同組換えが起こるように、標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部分に相同的な配列を含む核酸を細胞に提供することをさらに含むことができる。細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または原核細胞であることができる。標的ＤＮＡは染色体ＤＮＡであることができる。導入ステップは、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素をコードしているベクターを用いて細胞を形質移入すること、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素を細胞内にタンパク質として機械的に注入すること、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素を細胞内にタンパク質として細菌ＩＩＩ型分泌系によって送達すること、またはＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素を細胞内にタンパク質として電気穿孔によって導入することを含むことができる。ＤＮＡ修飾酵素は、エンドヌクレアーゼ（たとえばＦｏｋＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）であることができる。
【０００８】
標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列と結合するＴＡＬエフェクタードメインは、１０個以上のＤＮＡ結合反復、好ましくは１５個以上のＤＮＡ結合反復を含むことができる。それぞれのＤＮＡ結合反復には、標的ＤＮＡ中の塩基対の認識配列を決定する反復可変性二残基（ＲＶＤ）が含まれることができ、それぞれのＤＮＡ結合反復は、標的ＤＮＡ中の１つの塩基対配列の認識を司っており、ＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、ＣまたはＴを認識するためのＮ＊［ただし＊はＲＶＤの第２位置中のギャップを表す］、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＨ＊［ただし＊はＲＶＤの第２位置中のギャップを表す］、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、およびＴを認識するためのＹＧのうちの１つまたは複数を含む。それぞれのＤＮＡ結合反復は、標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤ配列を含むことができ、それぞれのＤＮＡ結合反復は、標的ＤＮＡ中の１つの塩基対配列の認識を司っており、ＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、Ｔを認識するためのＹＧ、およびＧを認識するためのＮＫのうちの１つまたは複数、ならびにＣを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、ＣまたはＴを認識するためのＮ＊［ただし＊はＲＶＤの第２位置中のギャップを表す］、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＨ＊［ただし＊はＲＶＤの第２位置中のギャップを表す］、およびＴを認識するためのＩＧのうちの１つまたは複数を含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、（１）開始プラスミドをＰｓｐＸＩで直鎖状にするステップであって、開始プラスミドが、選択されたヌクレオチド配列の第１ヌクレオチドに特異的な反復可変性二残基（ＲＶＤ）を有する第１のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合反復ドメインをコードしているヌクレオチド配列を含み、第１のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合反復ドメインが、その３’末端にユニークなＰｓｐＸＩ部位を有するステップと、（２）開始プラスミドのＰｓｐＸＩ部位内に、選択されたヌクレオチド配列の次のヌクレオチド（複数可）に特異的なＲＶＤを有する１つまたは複数のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合反復ドメインをコードしている、ＸｈｏＩ粘着末端を有するＤＮＡモジュールをライゲーションするステップと、（３）核酸が選択されたヌクレオチド配列と結合することができるＴＡＬエフェクターをコードするまでステップ（１）および（２）を繰り返すステップとを含む、選択されたヌクレオチド配列に特異的なＴＡＬエフェクターをコードしている核酸を作製する方法を特長とする。本方法は、ライゲーション後に、ＰｓｐＸＩ部位中のＤＮＡモジュールの配向を決定することをさらに含むことができる。本方法は、ステップ（１）および（２）を１〜３０回繰り返すことを含むことができる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、（ａ）細胞のゲノム中の第１のヌクレオチド配列を同定するステップと、（ｂ）（ｉ）組み合わせて第１のユニークなヌクレオチド配列と結合する複数のＤＮＡ結合反復、および（ｉｉ）第１のヌクレオチド配列内にあるまたはそれに隣接する位置で二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼを含む、ＴＡＬＥＮをコードしている核酸を合成するステップであって、それぞれのＤＮＡ結合反復が、標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、かつ標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っており、ＴＡＬＥＮが、以下のＲＶＤ、すなわち、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＨ＊、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、およびＴを認識するためのＹＧのうちの１つまたは複数を含むステップとを含む、転写活性化因子様エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードしている核酸を作製する方法を特長とする。
【００１１】
ＴＡＬＥＮは、以下のＲＶＤ、すなわち、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、Ｔを認識するためのＹＧ、およびＧを認識するためのＮＫのうちの１つまたは複数、ならびにＣを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＨ＊、およびＴを認識するためのＩＧのうちの１つまたは複数を含むことができる。
【００１２】
第１のヌクレオチド配列は、以下の基準のうちの少なくとも１つを満たすことができる：ｉ）最小で１５個の塩基の長さであり、５’から３’に配向されており、Ｔが５’末端の部位の直前にあること、ｉｉ）第１（５’）位置にＴまたは第２位置にＡを有さないこと、ｉｉｉ）最終（３’）位置がＴで終わり、最後から２番目の位置にＧを有さないこと、ならびにｉｖ）０〜６３％のＡ、１１〜６３％のＣ、０〜２５％のＧ、および２〜４２％のＴの基本組成を有すること。
【００１３】
本方法は、上述の基準のうちの少なくとも１つを満たしており、１５〜１８ｂｐによって分離されている、細胞のゲノム中の第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を同定することを含むことができる。エンドヌクレアーゼは、第１および第２のヌクレオチド配列の間に二本鎖切断を生じることができる。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、ＤＮＡ結合ドメインが複数のＤＮＡ結合反復を含み、それぞれの反復が、標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、かつ標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っている、エンドヌクレアーゼドメインと標的ＤＮＡに特異的なＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含むＴＡＬＥＮであって、以下のＲＶＤ、すなわち、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＨ＊、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、およびＴを認識するためのＹＧのうちの１つまたは複数を含むＴＡＬＥＮを特長とする。ＴＡＬＥＮは、以下のＲＶＤ、すなわち、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、Ｔを認識するためのＹＧ、およびＧを認識するためのＮＫのうちの１つまたは複数、ならびにＣを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＨ＊、およびＴを認識するためのＩＧのうちの１つまたは複数を含むことができる。エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（たとえばＦｏｋＩ）からのものであることができる。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、前記ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列が、配列番号３３〜配列番号５５、配列番号７２、および配列番号７３からなる群から選択される、エンドヌクレアーゼドメインおよびＴＡＬエフェクタードメインを含むＴＡＬＥＮを特長とする。
【００１６】
また、本発明は、それ内に遺伝子改変を導入することが所望される標的ＤＮＡ配列を含む真核細胞を提供するステップと、エンドヌクレアーゼドメインと標的ＤＮＡ配列と結合するＴＡＬエフェクタードメインとを含むＴＡＬＥＮを用いて標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生じるステップと、二本鎖切断が起こった細胞またはその子孫から動物を作製するステップとを含む、動物を作製する方法も特長とする。本方法は、標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同的な配列を含む外因性核酸を、細胞内に、外因性核酸と細胞またはその子孫中の標的ＤＮＡ配列との間の相同組換えが起こることを可能にする条件下で導入するステップと、相同組換えが起こった細胞またはその子孫から動物を作製するステップとをさらに含むことができる。動物は哺乳動物であることができる。遺伝子改変は、置換、挿入、または欠失を含むことができる。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、事前に選択された遺伝子改変をそれ内に導入することが所望される標的ＤＮＡ配列を含む植物細胞を提供するステップと、エンドヌクレアーゼドメインと標的ＤＮＡ配列と結合するＴＡＬエフェクタードメインとを含むＴＡＬＥＮを用いて標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生じるステップと、二本鎖切断が起こった細胞またはその子孫から植物を作製するステップとを含む、植物を作製する方法を特長とする。本方法は、標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部分に相同的な配列を含む外因性核酸を、植物細胞内に、外因性核酸と細胞またはその子孫中の標的ＤＮＡ配列との間の相同組換えが起こることを可能にする条件下で導入するステップと、相同組換えが起こった細胞またはその子孫から植物を作製するステップとをさらに含むことができる。
【００１８】
別の態様では、本発明は、選択されたＤＮＡ標的配列を標的としたＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸を細胞内に導入するステップと、細胞内でのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの発現を誘導するステップと、選択されたＤＮＡ標的配列が突然変異を示している細胞を同定するステップとを含む、細胞における標的化遺伝子組換えの方法を特長とする。突然変異は、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、ならびに遺伝物質の欠失および挿入の両方からなる群から選択されることができる。本方法は、細胞内にドナーＤＮＡを導入することをさらに含むことができる。細胞は、昆虫細胞、植物細胞、魚細胞、または哺乳動物細胞であることができる。
【００１９】
別の態様では、本発明は、それぞれの反復が標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、かつ標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っている、複数のＤＮＡ結合反復を有するＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬエフェクターをコードしている核酸を作製するステップであって、Ａ、Ｃ、またはＧに対する特異性を有する変異第０ＤＮＡ結合反復配列をコードしている核酸を取り込ませ、したがって結合部位の−１位でのＴの必要性を排除することを含むステップを含む、標的ＤＮＡに対して増強された標的化能力を有するＴＡＬエフェクターを作製する方法を特長とする。
【００２０】
別の態様では、本発明は、それぞれの反復が標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、かつ標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っている、複数のＤＮＡ結合反復を有するＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬエフェクターをコードしている核酸を作製するステップであって、Ｇに対して増強された特異性を有するＲＶＤを含有するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをコードしている１つまたは複数の核酸を取り込ませることを含み、前記ＲＶＤが、ＲＮ、Ｒ＊、ＮＧ、ＮＨ、ＫＮ、Ｋ＊、ＮＡ、ＮＴ、ＤＮ、Ｄ＊、ＮＬ、ＮＭ、ＥＮ、Ｅ＊、ＮＶ、ＮＣ、ＱＮ、Ｑ＊、ＮＲ、ＮＰ、ＨＮ、Ｈ＊、ＮＫ、ＮＹ、ＳＮ、Ｓ＊、ＮＤ、ＮＷ、ＴＮ、Ｔ＊、ＮＥ、ＮＦ、ＹＮ、Ｙ＊、およびＮＱからなる群から選択され、＊がＲＶＤの第２位置でのギャップを示すステップを含む、標的ＤＮＡに対して増強された標的化能力を有するＴＡＬエフェクターを作製する方法を特長とする。
【００２１】
また、本発明は、反復ドメインを含むポリペプチドを合成するステップを含む、標的ＤＮＡ配列中の少なくとも１つの塩基対を選択的に認識するポリペプチドを生成する方法であって、反復ドメインが、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、反復単位が、標的ＤＮＡ中の塩基対の認識配列を決定する超可変領域を含み、かつＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、超可変領域が、（ａ）Ｃ／Ｇを認識するためのＨＤ、（ｂ）Ａ／Ｔを認識するためのＮＩ、（ｃ）Ｔ／Ａを認識するためのＮＧ、（ｄ）Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃを認識するためのＮＳ、（ｅ）Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔを認識するためのＮＮ、（ｆ）Ｔ／Ａを認識するためのＩＧ、（ｇ）Ｃ／Ｇを認識するためのＮ、（ｈ）Ｃ／ＧまたはＴ／Ａを認識するためのＨＧ、（ｉ）Ｔ／Ａを認識するためのＨ、および（ｊ）Ｇ／Ｃを認識するためのＮＫからなる群から選択されるメンバーを含む方法も特長とする。さらに、本発明は、上記方法によって生成されたポリペプチド、および上記方法によって生成されたポリペプチドのコード配列を含むＤＮＡを特長とする。また、上述のＤＮＡと作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット、および発現カセットを含む非ヒト宿主細胞も特長とされている。別の態様では、本発明は、発現カセットを含む形質転換させた非ヒト生物を特長とする。
【００２２】
さらに別の態様では、反復ドメインを含むポリペプチドを構築するステップを含む、ポリペプチドによってＤＮＡ配列中の塩基対を選択的に認識する方法であって、反復ドメインが、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、反復単位が、ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、かつＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、超可変領域が、（ａ）Ｃ／Ｇを認識するためのＨＤ、（ｂ）Ａ／Ｔを認識するためのＮＩ、（ｃ）Ｔ／Ａを認識するためのＮＧ、（ｄ）Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃを認識するためのＮＳ、（ｅ）Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔを認識するためのＮＮ、（ｆ）Ｔ／Ａを認識するためのＩＧ、（ｇ）Ｃ／Ｇを認識するためのＮ、（ｈ）Ｃ／ＧまたはＴ／Ａを認識するためのＨＧ、（ｉ）Ｔ／Ａを認識するためのＨ、および（ｊ）Ｇ／Ｃを認識するためのＮＫからなる群から選択されるメンバーを含む方法を特長とする。
【００２３】
また、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を変調させる方法であって、反復ドメインを含むポリペプチドを含有する細胞が提供され、反復ドメインが、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、反復単位が、ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、かつＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、超可変領域が、（ａ）Ｃ／Ｇを認識するためのＨＤ、（ｂ）Ａ／Ｔを認識するためのＮＩ、（ｃ）Ｔ／Ａを認識するためのＮＧ、（ｄ）Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃを認識するためのＮＳ、（ｅ）Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔを認識するためのＮＮ、（ｆ）Ｔ／Ａを認識するためのＩＧ、（ｇ）Ｃ／Ｇを認識するためのＮ、（ｈ）Ｃ／ＧまたはＴ／Ａを認識するためのＨＧ、（ｉ）Ｔ／Ａを認識するためのＨ、および（ｊ）Ｇ／Ｃを認識するためのＮＫからなる群から選択されるメンバーを含む方法を特長とする。
【００２４】
別の態様では、本発明は、反復ドメインが、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、反復単位が、ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、かつＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、超可変領域が、（ａ）Ｃ／Ｇを認識するためのＨＤ、（ｂ）Ａ／Ｔを認識するためのＮＩ、（ｃ）Ｔ／Ａを認識するためのＮＧ、（ｄ）Ｃ／ＧまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃを認識するためのＮＳ、（ｅ）Ｇ／ＣまたはＡ／Ｔを認識するためのＮＮ、（ｆ）Ｔ／Ａを認識するためのＩＧ、（ｇ）Ｃ／Ｇを認識するためのＮ、（ｈ）Ｃ／ＧまたはＴ／Ａを認識するためのＨＧ、（ｉ）Ｔ／Ａを認識するためのＨ、および（ｊ）Ｇ／Ｃを認識するためのＮＫからなる群から選択されるメンバーを含む、反復ドメインを含むポリペプチドを特長とする。また、本発明は、上述のポリペプチドのコード配列を含むＤＮＡも特長とする。
【００２５】
別の態様では、本発明は、塩基対が反復ドメインを含むポリペプチドによって特異的に認識されることができるように、標的ＤＮＡ配列上に位置する塩基対が含まれるように改変されたＤＮＡであって、反復ドメインが、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、反復単位が、ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する超可変領域を含み、かつＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、塩基対が、超可変領域による選択的かつ決定された認識を受けるために、（ａ）ＨＤによる認識のためのＣ／Ｇ、（ｂ）ＮＩによる認識のためのＡ／Ｔ、（ｃ）ＮＧによる認識のためのＴ／Ａ、（ｄ）ＮＳによる認識のためのＣＴまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃ、（ｅ）ＮＮによる認識のためのＧ／ＣまたはＡ／Ｔ、（ｆ）ＩＧによる認識のためのＴ／Ａ、（ｇ）Ｎによる認識のためのＣ／ＧまたはＴ／Ａ、（ｈ）ＨＧによる認識のためのＴ／Ａ、（ｉ）Ｈによる認識のためのＴ／Ａ、および（ｊ）ＮＫによる認識のためのＧ／Ｃからなる群から選択されるＤＮＡを特長とする。また、上述のＤＮＡを含むベクター、ＤＮＡを含む非ヒト宿主細胞、およびＤＮＡを含む形質転換させた非ヒト生物も特長とされている。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、反復ドメインを含むポリペプチドによって選択的に認識される標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡを生成する方法であって、反復ドメインが、ＴＡＬエフェクターに由来する少なくとも１つの反復単位を含み、反復単位が、標的ＤＮＡ中の塩基対の認識配列を決定する超可変領域を含み、かつ標的ＤＮＡ中の１つの塩基対配列の認識を司っており、方法が、反復単位によって認識されることができる塩基対を含むＤＮＡを合成するステップを含み、塩基対が、（ａ）ＨＤによる認識のためのＣ／Ｇ、（ｂ）ＮＩによる認識のためのＡ／Ｔ、（ｃ）ＮＧによる認識のためのＴ／Ａ、（ｄ）ＮＳによる認識のためのＣＴまたはＡ／ＴまたはＴ／ＡまたはＧ／Ｃ、（ｅ）ＮＮによる認識のためのＧ／ＣまたはＡ／Ｔ、（ｆ）ＩＧによる認識のためのＴ／Ａ、（ｇ）Ｎによる認識のためのＣ／ＧまたはＴ／Ａ、（ｈ）ＨＧによる認識のためのＴ／Ａ、（ｉ）Ｈによる認識のためのＴ／Ａ、および（ｊ）ＮＫによる認識のためのＧ／Ｃからなる群から選択される方法を特長とする。
【００２７】
別の態様では、本発明は、植物細胞の遺伝物質を改変する方法を特長とする。本方法には、（ａ）（ｉ）植物細胞中に存在する対応する標的ヌクレオチド配列に関してヌクレオチド配列中の１つまたは複数の修飾を含み、配列特異的ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の認識部位をさらに含む、修飾された標的ヌクレオチド配列を含む第１の組換え核酸、および（ｉｉ）配列特異的転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼをコードしているヌクレオチド配列を含む第２の組換え核酸を、植物細胞内に導入するステップと（ｂ）植物細胞を含有する植物を作製するステップと、（ｃ）植物またはその子孫から得られた細胞、種子、または組織を、標的ヌクレオチド配列での組換えについて分析するステップとが含まれることができる。本方法には、（ｉｉｉ）選択マーカーをコードしているヌクレオチド配列を含む第３の組換え核酸を植物細胞内に導入するステップと、植物またはその子孫が選択マーカーを発現するかどうかを決定するステップとがさらに含まれることができる。本方法には、植物またはその子孫を、選択マーカーの非存在についてスクリーニングするステップがさらに含まれることができる。選択マーカーをコードしているヌクレオチド配列は、片側または両側が植物細胞内在配列（たとえば、第２の配列特異的ヌクレアーゼの切断部位での配列）に類似または同一の配列によって隣接されていても、されていないくてもよい。選択マーカーをコードしているヌクレオチド配列は、両側が配列特異的リコンビナーゼの認識部位によって隣接されていてもよい。本方法には、植物を異系交配させるステップがさらに含まれることができ、異系交配の子孫を選択マーカーの非存在についてスクリーニングするステップを用いるまたは用いない。第１および第２の組換え核酸は、植物細胞内に同時に導入することができる。組換え核酸の一方または両方を、導入ステップの前に直鎖状にすることができる。第１および第２の組換え核酸は、同じ構築体中に存在していてよい。
【００２８】
別の態様では、本発明は、細胞の遺伝物質を改変する別の方法を特長とする。本方法には、それ内で相同組換えが起こることが所望される染色体標的ＤＮＡ配列を含有する初代細胞を提供するステップと、二本鎖ＤＮＡを切断することができるエンドヌクレアーゼドメイン、および組み合わせて細胞中の標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列と結合する複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含むＴＡＬエフェクタードメインを含む、ＴＡＬＥＮを提供するステップと、ＴＡＬＥＮが細胞中の標的ＤＮＡ配列内にあるまたはそれに隣接するヌクレオチド配列の両方の鎖を切断するように、標的ＤＮＡ配列とＴＡＬＥＮとを細胞中で接触させるステップとが含まれることができる。本方法には、標的ＤＮＡ配列と核酸との間の相同組換えが起こるように、標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同的な配列を含む核酸を提供することがさらに含まれることができる。標的ＤＮＡ配列は、細胞に内在性であることができる。細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、魚細胞、昆虫細胞もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のためにこれらの生物から誘導した細胞系、または生組織から直接採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のために確立させた初代細胞であることができる。接触ステップには、ＴＡＬＥＮのコード配列を含むベクターで細胞を形質転換させて、ＴＡＬＥＮタンパク質を細胞中で発現させること、ＴＡＬＥＮタンパク質を細胞内に機械的に注入すること、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼタンパク質を細胞内に細菌ＩＩＩ型分泌系によって送達すること、またはＴＡＬＥＮタンパク質を細胞内に電気穿孔によって導入することが含まれることができる。エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（たとえばＦｏｋＩ）からのものであることができる。標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列と結合するＴＡＬエフェクタードメインには、１０個以上のＤＮＡ結合反復、より好ましくは１５個以上のＤＮＡ結合反復が含まれることができる。細胞は任意の原核または真核生物からのものであることができる。
【００２９】
別の態様では、本発明は、特定の位置でＤＮＡを切断することができる配列特異的ＴＡＬＥＮを設計する方法を特長とする。本方法には、それ内に二本鎖切断を導入することが所望される第２のヌクレオチド配列に隣接する、第１のユニークな内在染色体ヌクレオチド配列を同定するステップと、（ａ）組み合わせて第１のユニークな内在染色体ヌクレオチド配列と結合する複数のＤＮＡ結合反復ドメイン、および（ｂ）第２のヌクレオチド配列で二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼを含む、配列特異的ＴＡＬＥＮを設計するステップとが含まれることができる。
【００３０】
また、本発明は、エンドヌクレアーゼドメインおよび特定のＤＮＡ配列に特異的なＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮも特長とする。ＴＡＬＥＮには、精製タグがさらに含まれることができる。エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（たとえばＦｏｋＩ）からのものであることができる。
【００３１】
別の態様では、本発明は、それ内に所望の核酸が導入されている、遺伝子改変した動物を作製する方法を特長とする。本方法には、それ内に核酸を導入することが所望される内在染色体標的ＤＮＡ配列を含む初代細胞を提供するステップと、エンドヌクレアーゼドメインおよび内在染色体標的ＤＮＡ配列と結合するＴＡＬエフェクタードメインを含むＴＡＬＥＮを用いて、内在染色体標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生じるステップと、内在染色体標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同的な配列を含む外因性核酸を、初代細胞内に、外因性核酸と内在染色体標的ＤＮＡとの間の相同組換えが起こることを可能にする条件下で導入するステップと、それ内で相同組換えが起こった初代細胞から動物を作製するステップとが含まれることができる。動物は哺乳動物であることができる。相同配列は、相同組換え後に遺伝子を破壊するヌクレオチド配列、相同組換え後に遺伝子を置き換えるヌクレオチド配列、相同組換え後に遺伝子内に点突然変異を導入するヌクレオチド配列、および相同組換え後に調節部位を導入するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列であることができる。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、それ内に所望の核酸が導入されている、遺伝子改変した植物を作製する方法を特長とする。本方法には、それ内に核酸を導入することが所望される内在標的ＤＮＡ配列を含む植物細胞を提供するステップと、エンドヌクレアーゼドメインおよび内在標的ヌクレオチド配列と結合するＴＡＬエフェクタードメインを含むＴＡＬＥＮを用いて、内在標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生じるステップと、内在標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同的な配列を含む外因性核酸を、植物細胞内に、外因性核酸と内在標的ＤＮＡとの間の相同組換えが起こることを可能にする条件下で導入するステップと、それ内で相同組換えが起こった植物細胞から植物を作製するステップとが含まれることができる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、細胞における標的化遺伝子組換えの方法を特長とする。本方法には、選択されたＤＮＡ標的配列を標的としたＴＡＬＥＮをコードしている核酸分子を細胞内に導入するステップと、細胞内でのＴＡＬＥＮの発現を誘導するステップと、選択されたＤＮＡ標的配列が突然変異を示している細胞を同定するステップとが含まれることができる。突然変異は、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、ならびに遺伝物質の欠失および挿入の両方からなる群から選択されることができる。本方法には、細胞内にドナーＤＮＡを導入することがさらに含まれることができる。細胞は、昆虫細胞、植物細胞、魚細胞、または哺乳動物細胞であることができる。
【００３４】
さらに別の態様では、本発明は、（１）選択されたヌクレオチド配列の第１ヌクレオチドに特異的なＲＶＤを有する第１のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合反復ドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む開始プラスミドを選択し、第１のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合反復ドメインが、その３’末端にユニークなＰｓｐＸＩ部位を有するステップと、（２）開始プラスミドをＰｓｐＸＩで直鎖状にするステップと、（３）ＰｓｐＸＩ部位内に、選択されたヌクレオチド配列の次のヌクレオチド（複数可）に特異的なＲＶＤを有する１つまたは複数のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合反復ドメインをコードしている、ＸｈｏＩ粘着末端を有するＤＮＡモジュールをライゲーションするステップと、（４）核酸が選択されたヌクレオチド配列と結合することができるＴＡＬＥＮをコードするまでステップ（２）および（３）を繰り返すステップとを含む、配列特異的ＴＡＬＥＮをコードしている核酸を作製する方法を特長とする。一部の事例では、本方法には、ステップ（３）のライゲーションの後に、ＰｓｐＸＩ部位中のＤＮＡモジュールの配向を確認することがさらに含まれることができる。
【００３５】
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用したすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する分野の技術者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものに類似または均等の方法および材料を使用して本発明を実施することができるが、適切な方法および材料が以下に記載されている。本明細書中で言及したすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体で参考として組み込まれている。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示的なものにすぎず、限定することを意図しない。
【００３６】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明中に記載されている。本発明の他の特長、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ認識の暗号を示す。図１Ａは、反復領域（白い四角）および代表的な反復配列（配列番号１）を示す一般的なＴＡＬエフェクターの図であり、ＲＶＤに下線が引いてある。図１Ｂは、様々なＴＡＬエフェクターのＲＶＤおよび標的遺伝子プロモーター配列（配列番号２〜１１）の最良のパターン一致（低エントロピーのアラインメント）を示す図である。星印は、残基１３での欠失を示す。図１Ｃは、Ｂのアラインメント、およびすべてのコメプロモーターを４０個の追加のＸ．ｏｒｙｚａｅのＴＡＬエフェクターで走査することによって得られ、それぞれのエフェクターについて下流遺伝子が感染中に活性化された最良のアラインメントを保持したさらに１０個のアラインメントにおける、ＲＶＤ−ヌクレオチドの会合を示す図である。図１Ｄは、２０個のＴＡＬエフェクター標的部位の隣接ヌクレオチドの頻度を示す図である。位置は標的部位の５’末端に対するものであり、Ｎは標的部位の長さである。ロゴはＷｅｂＬｏｇｏを使用して作成した。
【図２】ＯｓＨｅｎ１がＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ株ＢＬＳ２５６のＴａｌ１ｃによって活性化されるという証拠を提供する。図２Ａは、マーカー交換突然変異体Ｍ５１、空のコスミドベクター（ｅｖ）を保有するＭ５１、ｔａｌ１ａ、ｔａｌ１ｂ、およびｔａｌ１ｃを含有するコスミドｐＩＪＦ９２を保有するＭ５１、ならびに野生型（ＷＴ）株における、ＢＬＳ２５６を接種した２４時間後のコメ葉中の、アクチン遺伝子を参照としたＯｓＨｅｎ１の相対的な転写物の存在量を示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲ結果の像である。図２Ｂは、ＸｍａｌＩ断片を含有するマーカーの救出および末端配列決定による、Ｍ５１における単一のマーカー交換突然変異のマッピングに基づいた模式図である。コスミドｐＩＪＦ９２中に含有されていたゲノム領域、救出された断片の座標、およびＢＬＳ２５６ゲノム断片の座標が示されている。
【図３】参照ＡｖｒＢｓ３のアミノ酸配列である（配列番号１２）。
【図４】参照ＡｖｒＢｓ３の核酸配列である（配列番号１３）。
【図５】ＴＡＬヌクレアーゼ発現ベクターのマップである。
【図６】標的レポータープラスミドのマップである。
【図７】ＴＡＬヌクレアーゼの模式的構造の図である。ＴＡＬのＤＮＡ結合ドメインの認識部位は大文字として表されており、一方でスペーサー配列は小文字で示されている。
【図８】ＡｖｒＢｓ３認識ドメインの１７回と半分のタンデムの反復のアミノ酸配列である（配列番号１６）。位置１２および１３の超可変アミノ酸が四角で囲まれている。
【図９】ＴＡＬの有効性を試験するための酵母アッセイのスキームを示す図である。
【図１０】ＡｖｒＢｓ３  ＴＡＬヌクレアーゼの酵母アッセイの結果をプロットするグラフである。
【図１１】単一、二重、または三重のＡｓｖＢｓ３反復モジュールおよびクローニングベクターの模式図を示す図である。
【図１２】ほとんどのＴＡＬエフェクター中の反復領域の末端に存在する単一の代表的なＴＡＬエフェクター反復（図１２Ａ）および代表的な切断された反復（図１２Ｂ）を示す。ヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸配列が示されている。Ｎは、「ＸＸ」と示すＲＶＤをコードしているヌクレオチドを表す。数字はアミノ酸の位置について与えられている。配列はｔａｌ１ｃからとったものである。
【図１３】ｔａｌ１ｃ遺伝子、および反復領域を単一の切断された反復まで縮小してｐＣＳ４８７（やはり示されている）をもたらすプロセスを示す模式図である。ＭはＭｓｃＩ部位であり、ＳはＳｐｈＩ部位である。
【図１４】ｐＣＳ４８７中の元の切断された反復の末端に翻訳的にサイレントな突然変異を導入して、ＰｓｐＸＩおよびＸｈｏＩ部位を生じ、ｐＣＳ４８９を得ることを示す模式図である。元の反復のコドン１８〜２１の配列（配列番号２１）および突然変異させた反復（配列番号２３）が示されている。コードされているアミノ酸配列（配列番号２２）は、突然変異によって変化していなかった。突然変異させたヌクレオチドを斜体にしている。
【図１５】ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＥＮＴＲ−Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中で反復領域を含まずにｔａｌ１ｃのＮおよびＣ末端のみをコードしているカナマイシン耐性プラスミドである、ｐＣＳ４８８のマップである。
【図１６】ＲＶＤ  ＮＩを有する反復をコードしているｐＣＳ４９３と命名された単一反復の開始プラスミドのマップである。ｐＣＳ４９４、ｐＣＳ４９５、およびｐＣＳ４９６と命名された３つの他のプラスミドは、それらがコードするＲＶＤ（右に示す）以外は同一であった。
【図１７】図１７Ａは、ＲＶＤ  ＮＩを有する単一反復モジュールのヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸配列を示す。５’ＸｈｏＩ適合性の付着末端、ＭｓｃＩ部位、および３’ＰｓｐＸＩ／ＸｈｏＩ適合性の付着末端に下線が引いてある。ＲＶＤおよびそれをコードしているヌクレオチドは太字である。ＨＤ、ＮＩ、およびＮＧをそれぞれコードしているＲＶＤのコード配列以外は示したものに同一である、３つの他の反復モジュールを構築した。図１７Ｂは、図１７Ａに示されている反復をコードしている配列を含有するｐＣＳ５０２と命名された単一反復モジュールのプラスミドのマップである。また、ｐＣＳ５０３、ｐＣＳ５０４、およびｐＣＳ５０５と命名されたプラスミドも作製し、これらは、それらがコードしているＲＶＤ（右に示す）以外はｐＣＳ５０２と同一である。
【図１８】図１８Ａは、ＲＶＤ  ＮＩを有する単一反復モジュールのヌクレオチドおよびコードされているアミノ酸配列を示し、ヌクレオチド置換（斜体）が、ＰｓｐＸＩ／ＸｈｏＩ部位内へのライゲーション後の５’末端でのＸｈｏＩ部位の再構成を妨げ、内部ＭｓｃＩ部位を破壊する。ＲＶＤおよびそれがコードしているヌクレオチドは太字である。ＨＤ、ＮＩ、およびＮＧをそれぞれコードしているＲＶＤのコード配列以外は同一である、３つの追加の反復モジュールを構築した。図１８Ｂは、追加の反復モジュールを単一反復モジュールのプラスミド内に順次ライゲーションさせることによってアセンブルした３回反復モジュールの模式図である。第１反復中のＭｓｃＩ部位および３’末端のＰｓｐＸＩ部位はユニークに保たれ、モジュール全体は２つのＸｈｏＩ部位によって隣接されている。
【図１９】１回、２回、および３回の反復モジュールのプラスミドの完全な組のリストである。
【図２０】任意の反復配列をｔａｌ１ｃ「主鎖」内にアセンブルして誂えのＴＡＬエフェクター遺伝子を作製するために使用できる方法中のステップを示す流れ図である。
【図２１】示されているヌクレオチド配列を標的とするＴＡＬエンドヌクレアーゼの構築における反復モジュールのアセンブリを示す模式図である。図２１Ａでは、ｐＣＳ５１９、ｐＣＳ５２４、ｐＣＳ５３７、ｐＣＳ５５１、ｐＣＳ５８３、およびｐＣＳ５２９と命名されたプラスミドからの反復モジュールを、ｐＣＳ４９３と命名された開始プラスミド中の配列に順次付加して、ｐＭＡＴ５５、ｐＭＡＴ５６、ｐＭＡＴ５７、ｐＭＡＴ５８、ｐＭＡＴ５９、およびｐＭＡＴ６０と命名されたプラスミドがもたらされる。図２１Ｂでは、ｐＣＳ５３０、ｐＣＳ５３３、ｐＣＳ５２２、およびｐＣＳ５４１と命名されたプラスミドからの反復モジュールを、ｐＭＡＴ１と命名されたプラスミド中の配列に順次付加して、ｐＭＡＴ６１、ｐＭＡＴ６２、ｐＭＡＴ６３、およびｐＭＡＴ６４と命名されたプラスミドがもたらされる。
【図２２】図２２Ａは、ＴＡＬエフェクタータンパク質の模式図である。ＢａｍＨＩ断片（Ｂによって示す）をＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合させて、ＴＡＬＥＮを作製した。ＮはＮ末端、ＮＬＳは核移行シグナル、ＢはＢａｍＨＩ部位、ＡＤは酸性活性化ドメインである。図２２Ｂは、ＴＡＬエフェクターＡｖｒＢｓ３およびＰｔｈＸｏ１を用いて構築したＴＡＬＥＮの活性をプロットするグラフである。Ａｖｒ−ＦｏｋＩはＡｖｒＢｓ３  ＴＡＬＥＮであり、Ｐｔｈ−ＦｏｋＩはＰｔｈＸｏ１  ＴＡＬＥＮであり、Ａｖｒ−ＦｏｋＩおよびＰｔｈ−ＦｏｋＩは、ＡｖｒＢｓ３およびＰｔｈＸｏ１とＦｏｋＩの触媒的に不活性な型との融合体であり（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１０５７０〜１０５７５）、ＺＦＮは、Ｚｉｆ２６８ＤＮＡ結合ドメインを含有するジンクフィンガーヌクレアーゼである（ＰｏｒｔｅｕｓおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３００：７６３）。
【図２３】参照ＰｔｈＸｏ１のアミノ酸配列である（配列番号３１）。
【図２４】参照ＰｔｈＸｏ１の核酸配列である（配列番号３２）。
【図２５】ｐＦＺ８５ベクターの図である。
【図２６】ａｖｒＢｓ３＿ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列を示す（配列番号３３）。
【図２７】ｐｔｈＸｏ１  ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列を示す（配列番号３４）。
【図２８】図２８Ａは、様々なスペーサー長を有する標的に対するＡｖｒＢｓ３およびＰｔｈＸｏ１  ＴＡＬＥＮの活性をプロットするグラフである。ＺＦＮはＺｉｆ２６８由来のジンクフィンガーヌクレアーゼである。図２８Ｂは、ヘテロ二量体ＴＡＬＥＮの活性をプロットするグラフである。ＰｔｈＸｏ１−ＦｏｋＩおよびＡｖｒＢｓ３−ＦｏｋＩ発現ベクター、ならびに頭から尾の配向で１５ｂｐによって分離されたそれぞれに対する認識部位からなる標的を有するプラスミドを含有する、酵母における活性が示されている（Ａｖｒ−ＦｏｋＩ、Ｐｔｈ−ＦｏｋＩ）。また、そのそれぞれの標的に対する、ＡｖｒＢｓ３（Ａｖｒ−ＦｏｋＩ）およびＰｔｈＸｏ１（Ｐｔｈ−ＦｏｋＩ）ＴＡＬＥＮの個々の活性ならびにＺｉｆ２６８（ＺＦＮ）の活性も、参照のために示されている。陰性対照として、Ａｖｒ−ＦｏｋＩ、Ｐｔｈ−ＦｏｋＩに対する標的部位プラスミドのみを有する酵母培養物を、ＬａｃＺ活性についてアッセイした（（−）として示す）。
【図２９】図２９Ａは、個々の誂えのＴＡＬＥＮのＲＶＤ配列およびそのそれぞれのＤＮＡ認識配列を示す表である。図２９Ｂは、誂えのＴＡＬＥＮの活性をプロットするグラフである。（−）は標的部位プラスミドのみの陰性対照であり、ＺＦＮはジンクフィンガーヌクレアーゼ陽性対照である。
【図３０】２０個の標的およびＴＡＬエフェクターの対の末端のヌクレオチドおよびＲＶＤの頻度の描写である。
【図３１】Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングシステムの模式図である［Ｅｎｇｌｅｒら（２００８）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、３：ｅ３６４７、およびＥｎｇｌｅｒら（２００９）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、４：ｅ５５５３］。
【図３２】本明細書中に記載のＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング手法を使用した、誂えのＴＡＬエフェクター反復をコードしているアレイをアセンブリおよびクローニングするための５８個のプラスミドの組を示す。Ｔｅｔは、プラスミド選択のマーカーであるテトラサイクリン耐性遺伝子であり、ｓｐｅｃは、プラスミド選択のマーカーであるスペクチノマイシン耐性遺伝子であり、ａｍｐは、プラスミド選択のマーカーであるアンピシリン耐性遺伝子である。
【図３３】図３２に示されているプラスミドの組を使用したＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ手法によって誂えのＴＡＬエフェクター反復をコードしているアレイをアセンブリおよびクローニングするための方法の模式図である。例示目的のために、自由裁量による反復アレイのアセンブリが示されている。ｓｐｅｃは、プラスミド選択のマーカーであるスペクチノマイシン耐性遺伝子であり、ａｍｐは、プラスミド選択のマーカーであるアンピシリン耐性遺伝子である。
【図３４】本明細書中の実施例９に記載のように作製したＴＡＬＥＮのアミノ酸配列を示す。図３４Ａはテロメラーゼ−ＴＡＬＥＮ１２４であり、図３４Ｂはｇｒｉｄｌｏｃｋ−ＴＡＬＥＮ１０５であり、図３４Ｃはａｄｈｌ−ＴＡＬＥＮ５８であり、図３４Ｄはａｄｈｌ−ＴＡＬＥＮ６３であり、図３４Ｅはａｄｈｌ−ＴＡＬＥＮ６８であり、図３４Ｆはａｄｈｌ−ＴＡＬＥＮ７３であり、図３４Ｇはａｄｈｌ−ＴＡＬＥＮ８９であり、図３４Ｈはｇｒｉｄｌｏｃｋ−ＴＡＬＥＮ１０６であり、図３４Ｉはａｄｈｌ−ＴＡＬＥＮ６４であり、図３４Ｊはａｄｈｌ−ＴＡＬＥＮ６９であり、図３４Ｋはａｄｈｌ−ＴＡＬＥＮ７４であり、図３４Ｌはｔｔ４−ＴＡＬＥＮ９０であり、図３４Ｍはテロメラーゼ−ＴＡＬＥＮ１２１であり、図３４Ｎはテロメラーゼ−ＴＡＬＥＮ１２６であり、図３４Ｏはｇｒｉｄｌｏｃｋ−ＴＡＬＥＮ１０７であり、図３４Ｐはｇｒｉｄｌｏｃｋ−ＴＡＬＥＮ１１７であり、図３４Ｑはテロメラーゼ−ＴＡＬＥＮ１３１であり、図３４Ｒはテロメラーゼ−ＴＡＬＥＮ１３６であり、図３４Ｓはａｄｈｌ−ＴＡＬＥＮ６０であり、図３４Ｔはｔｔ４−ＴＡＬＥＮ８５であり、図３４Ｕはｇｒｉｄｌｏｃｋ−ＴＡＬＥＮ１０２である。
【図３５】増加していく長さの誂えのＴＡＬＥＮ単量体（９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、または１８量体）を使用した酵母アッセイによって測定したＴＡＬＥＮ活性プロットするグラフである。示したように、ＴＡＬＥＮはシロイヌナズナおよびゼブラフィッシュの遺伝子に対して標的化した。
【図３６】図３６Ａは、２つのＴＡＬＥＮ対によって標的化されているシロイヌナズナＡＤＨ１遺伝子からの２つの異なるＤＮＡ標的配列を示す図である。図３６Ｂは、シロイヌナズナＡＤＨ１遺伝子を標的とする機能的ＴＡＬＥＮ対の酵母アッセイデータプロットするグラフである。
【図３７】図３７Ａは、シロイヌナズナのプロトプラスト中のＴＡＬＥＮ誘導性突然変異を検出するために使用した制限エンドヌクレアーゼアッセイの模式図である。図３７Ｂは、制限エンドヌクレアーゼアッセイにおける未消化のＤＮＡからの９個のクローンの配列を示す。クローンのうちの６個が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって導入された突然変異を有する。
【図３８】図３８Ａは、いくつかの系統学的に明白に異なるＴＡＬエフェクター、すなわち、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｒｄｎｅｒｉからのＡｖｒＨａｈ１、Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａからのＡｖｒＢｓ３、Ｘ．ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅからのＰｔｈＸｏ１、Ｘ．ｃｉｔｒｉからのＰｔｈＡ、およびＸ．ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａからのＴａｌ１ｃの第０反復配列を示す。多型位置が四角で囲まれている。図３８Ｂは、ＰｔｈＸｏ１の第０および第１反復を示す模式図である。「第０」反復は第１反復の直前にあり、３５％の同一性を示し、同様の予測された二次構造を有する。第１反復のＲＶＤおよび第０反復の候補の類似残基に下線が引いてある。＊はギャップであり、Ｈはヘリックスであり、Ｅは伸長である。構造はＪＰｒｅｄを使用して予測した（Ｃｏｌｅら（２００８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３６：Ｗ１９７〜Ｗ２０１）。
【図３９】示したようにＶ５でタグ付けしたＴＡＬエフェクタータンパク質ＡｖｒＢｓ３、ＰｔｈＸｏ１、およびＴａｌ１ｃをコードしているプラスミドで形質移入したヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞から単離した全タンパク質の、マウス−抗Ｖ５抗体を使用した免疫検出後のウエスタンブロットを示す。免疫標識したアクチンがそれぞれのレーンの等価なローディングの対照として示されている。
【図４０】図４０Ａは、ＴＡＬＥＮ  ＨＰＲＴ−３２５４−１７のアミノ酸配列を示し、図４０Ｂは、ＴＡＬＥＮ  ＨＰＲＴ−３２８６−２０ｒのアミノ酸配列を示す。
【図４１】図４１Ａは、ヒト染色体ＨＰＲＴ遺伝子中のＴＡＬＥＮ標的部位を示す模式図である。ＨＰＲＴ−３２５４−１７およびＨＰＲＴ−３２８６−２０ｒ  ＴＡＬＥＮの結合部位、これらの部位の間のスペーサー中のＢｐｕ１０Ｉ部位、ならびに領域を増幅するためのプライマー部位が示されている。下の座標は、コード配列の第１ヌクレオチドからの距離を塩基対で示している。図４１Ｂは、ＴＡＬＥＮで処理したおよび処理していない細胞から単離したゲノムＤＮＡを鋳型として使用した、図４１Ａに示されている領域のＰＣＲ増幅産物のＢｐｕ１０Ｉ消化の結果を示す。増幅の前にゲノムＤＮＡをＢｐｕ１０Ｉで消化した。ＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウムを使用して可視化した。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本特許出願は、ＴＡＬエフェクターによって媒介される配列特異的ＤＮＡ認識に関する材料および方法を提供する。本明細書中に記載のように、ＴＡＬエフェクターの一次アミノ酸配列が、それらが結合するヌクレオチド配列を指示する。本発明者らは、ＴＡＬエフェクターのアミノ酸配列とそのＤＮＡ標的配列との間の関係性は直接的であり、それにより、ＴＡＬエフェクターの標的部位の予測が可能となり、また、特定のヌクレオチド配列と結合するようにＴＡＬエフェクターを誂えることも可能となることを見い出した。そのような予測および誂えは、様々な目的のために利用することができる。一例では、特定のＴＡＬエフェクター配列をエンドヌクレアーゼ配列と融合させて、特定のＤＮＡ配列に対するエンドヌクレアーゼの標的化、続いて標的配列でまたはその付近でのＤＮＡの切断を可能にすることができる。ＤＮＡ中の切断（すなわち二本鎖切断）は、相同組換えの頻度を劇的に増加させる可能性がある。したがって、特定の標的ＤＮＡ配列に対して高い度合の配列類似度を有する配列を保有するＤＮＡ構築体と組み合わせて、ＴＡＬＥＮを使用して、高い精度および効率で複雑なゲノム中の部位特異的突然変異誘発すること、すなわち、遺伝子機能をノックアウトもしくは変更すること、または遺伝子もしくは他の配列を付加することを促進することができる。
【００３９】
したがって、本明細書中で提供されている主題には、とりわけ、遺伝子改変した生物（それだけには限定されないが、植物、真菌、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、線虫、ゼブラフィッシュ、マウス、他の哺乳動物およびヒトが含まれる）を作製するための材料および方法が含まれる。そのような方法には、たとえば、細胞をいくつかの組換え核酸で形質移入することが含まれることができる。たとえば、細胞（たとえば真核細胞）を、細胞内に見つかる対応する標的ヌクレオチド配列と比較して変更が含まれるドナーヌクレオチド配列を含有する第１の組換え核酸構築体、およびＴＡＬヌクレアーゼをコードしている第２の組換え核酸構築体で形質転換させることができる。一部の実施形態では、細胞を、選択マーカーをコードしている第３の組換え核酸構築体でも形質転換させることができる。ドナー核酸構築体からの核酸配列は、本明細書中に記載の形質転換細胞のゲノム内に取り込まれることができる。たとえば、本明細書中に記載の方法を使用して生成した植物細胞を成長させて、変更されたドナーヌクレオチド配列がそのゲノム内に取り込まれた植物を生成することができる。そのような植物からの種子を使用して、たとえば、改変されていない植物と比較して変更された成長特徴（たとえば、様々な生物的および非生物的なストレスに対する耐性または寛容の増加）、変更された外見（たとえば、変更された色または高さ）、あるいは変更された組成（たとえば、炭素、窒素、油、タンパク質、炭水化物（たとえば糖もしくはデンプン）、アミノ酸、脂肪酸、または二次代謝物のレベルの増加または減少）などの表現型を有する植物を生成することができる。
【００４０】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
単離した核酸およびポリペプチドが本明細書中で提供されている。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、互換性があるように使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（たとえば化学合成）ＤＮＡ、および核酸類似体を含有するＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含めた、ＲＮＡおよびＤＮＡをどちらもいう。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができる。核酸は二本鎖または一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンスの一本鎖）であることができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離したＤＮＡ、任意の配列の単離したＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー、ならびに核酸類似体が含まれる。
【００４１】
本発明のポリペプチド（非限定的な例としてＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素など）は、たとえば前記ポリペプチドをコードしているベクターを使用することによってまたはポリペプチド自体として、送達ベクターを超音波穿孔もしくは電気穿孔またはこれらの技法の派生法などの任意の細胞透過処理技法と関連または組み合わせて使用することによって、細胞中に導入することができる。
【００４２】
核酸に言及する場合、本明細書中で使用する「単離した」とは、ゲノム中で核酸の片側または両側に通常隣接している核酸を含めた、ゲノム、たとえば植物ゲノム中に存在する他の核酸から分離されている核酸をいう。また、核酸に関して本明細書中で使用する用語「単離した」には、任意の天然に存在しない配列も含まれる。これは、そのような天然に存在しない配列は自然には見つからず、したがって天然に存在するゲノム中のすぐ近くに近接する配列を有さないからである。
【００４３】
単離した核酸は、たとえばＤＮＡ分子であることができるが、ただし、天然に存在するゲノム中でそのＤＮＡ分子のすぐ近くに隣接して通常見つかる核酸配列のうちの１つが除去されているまたは非存在である。したがって、単離した核酸には、それだけには限定されないが、他の配列から独立して別の分子として存在するＤＮＡ分子（たとえば、化学合成核酸、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）、およびベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（たとえば、パラレトロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に取り込まれているＤＮＡが含まれる。さらに、単離した核酸には、ハイブリッドまたは融合核酸の一部であるＤＮＡ分子などの組換え核酸が含まれることができる。数百から数百万個の他の核酸と共に、たとえば、ｃＤＮＡライブラリもしくはゲノムライブラリ内、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含有するゲルスライス内に存在する核酸は、単離した核酸とみなされるべきでない。
【００４４】
核酸は、たとえば化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製することができる。ＰＣＲとは、標的核酸が増幅される手順または技法をいう。ＰＣＲを使用して、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡからの配列を含めた、ＤＮＡおよびＲＮＡからの特定の配列を増幅することができる。様々なＰＣＲ方法は、たとえば、ＰＣＲプライマー：実験室の手引き（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５に記載されている。一般に、対象の領域の末端またはそれを越える配列情報を用いて、増幅する鋳型の逆の鎖と配列が同一または類似のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。また、部位特異的なヌクレオチド配列修飾を鋳型核酸内に導入することができる様々なＰＣＲ戦略も利用可能である。
【００４５】
また、単離した核酸は、突然変異誘発によっても得ることができる。たとえば、ドナー核酸配列を、ＰＣＲによるオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発を含めた標準の技法を使用して突然変異させることができる。分子生物学の手短なプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第８章、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９２を参照されたい。
【００４６】
本明細書中で使用する用語「ポリペプチド」とは、翻訳後修飾（たとえばリン酸化またはグリコシル化）にかかわらず、２つ以上のサブユニットのアミノ酸の化合物をいう。サブユニットは、ペプチド結合またはたとえばエステルもしくはエーテル結合などの他の結合によって連結され得る。用語「アミノ酸」とは、Ｄ／Ｌ光学異性体を含めた天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸のいずれかをいう。
【００４７】
ポリペプチドに関して「単離した」または「精製した」とは、ポリペプチドが、自然においてそれと共に通常見つかる細胞成分（たとえば、他のポリペプチド、脂質、炭水化物、および核酸）からある程度分離されていることを意味する。精製したポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主バンドを与えることができる。精製したポリペプチドは、少なくとも約７５％純粋（たとえば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％純粋）であることができる。精製したポリペプチドは、たとえば、天然源から抽出することによって、化学合成によって、または宿主細胞もしくはトランスジェニック植物中での組換え産生によって得ることができ、たとえば、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製することができる。精製の程度は、それだけには限定されないが、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高性能液体クロマトグラフィーを含めた任意の適切な方法を使用して測定することができる。
【００４８】
組換え構築体
また、組換え核酸構築体（たとえばベクター）も本明細書中で提供されている。「ベクター」とは、それ内に別のＤＮＡセグメントを挿入して、挿入したセグメントを複製させ得る、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。一般に、ベクターは、適当な制御要素と会合している場合に複製が可能である。適切なベクター主鎖には、たとえば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣなどの、当分野でルーチン的に使用されているものが含まれる。用語「ベクター」には、クローニングおよび発現ベクター、ならびにウイルスベクターおよび組込みベクターが含まれる。「発現ベクター」とは、１つまたは複数の発現制御配列が含まれるベクターであり、「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。適切な発現ベクターには、それだけには限定されないが、たとえば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスベクターが含まれる。数々のベクターおよび発現系がＮｏｖａｇｅｎ（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）などの企業から市販されている。
【００４９】
用語「調節領域」、「制御要素」、および「発現制御配列」とは、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写物またはポリペプチド産物の安定性および／または移動度に影響を与えるヌクレオチド配列をいう。調節領域には、それだけには限定されないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、プロモーター制御要素、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、ならびに分泌シグナル、核移行配列（ＮＬＳ）およびプロテアーゼ切断部位などのコード配列内に存在することができる他の調節領域が含まれる。
【００５０】
本明細書中で使用する「作動可能に連結された」とは、発現制御配列が対象のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝子構築体内に取り込まれていることを意味する。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をＲＮＡへと転写することができる場合に、細胞中の発現制御配列と「作動可能に連結」されているかつその「制御下」にあり、ｍＲＮＡの場合は、その後に、コード配列によってコードされているタンパク質へと翻訳されることができる。したがって、調節領域は、修飾された標的核酸をそれ内で発現させることが所望される植物細胞、植物、または植物組織中での転写を変調させる、たとえば、調節する、促進するまたは駆動することができる。
【００５１】
プロモーターとは、転写が開始される点の典型的には１００個以内のヌクレオチド上流（一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位付近）の、ＤＮＡ分子の領域から構成される発現制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質を認識および結合して、転写を開始および変調させることに関与している。コード配列をプロモーターの制御下にするためには、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位をプロモーターの１〜約５０個のヌクレオチド下流に配置することが典型的には必要である。しかし、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００個と多数のヌクレオチド上流、または転写開始部位の約２，０００個のヌクレオチド上流に配置することができる。プロモーターは、典型的には少なくともコア（基底）プロモーターを含む。また、プロモーターには、上流要素などの少なくとも１つの制御要素も含まれ得る。そのような要素には、上流活性化領域（ＵＡＲ）および任意選択で合成上流要素などのポリヌクレオチドの転写に影響を与える他のＤＮＡ配列が含まれる。
【００５２】
含めるプロモーターの選択肢は、それだけには限定されないが、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および細胞または組織特異性を含めたいくつかの要因に依存する。たとえば、それぞれ特定の組織、器官、および細胞種中でのみまたは優勢に転写を与える組織、器官および細胞に特異的なプロモーターを使用することができる。一部の実施形態では、茎、柔組織、基本分裂組織、維管束、形成層、師部、皮層、茎頂分裂組織、側枝分裂組織、根端分裂組織、側根分裂組織、葉原基、葉肉、または葉表皮などの植物組織に特異的なプロモーターが適切な調節領域である可能性がある。一部の実施形態では、種子に本質的に特異的なプロモーター（「種子に優先的なプロモーター」）が有用な可能性がある。種子に特異的なプロモーターは、種子の発生中に、胚乳および子葉組織中で作動可能に連結された核酸の転写を促進することができる。あるいは、構成的プロモーターは、植物の発生の全体にわたって、植物のほとんどまたはすべての組織中で作動可能に連結された核酸の転写を促進することができる。他のプロモーターのクラスには、それだけには限定されないが、化学薬品、発生刺激、または環境刺激などの外部刺激に応答して転写を与えるプロモーターなどの誘導性プロモーターが含まれる。
【００５３】
基底プロモーターとは、転写開始に必要な転写複合体のアセンブリに必要な最小限の配列である。基底プロモーターには、しばしば、転写開始部位から約１５〜約３５個のヌクレオチド上流に位置し得る「ＴＡＴＡボックス」要素が含まれる。また、基底プロモーターには、転写開始部位から約４０〜約２００個のヌクレオチド、典型的には約６０〜約１２０個のヌクレオチド上流に位置することができる「ＣＣＡＡＴボックス」要素（典型的には配列ＣＣＡＡＴ）および／またはＧＧＧＣＧ配列も含まれ得る。
【００５４】
本明細書中で提供されている核酸構築体中に含まれることができるプロモーターの非限定的な例には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ転写開始領域、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡに由来する１’または２’プロモーター、Ｂｕｓｋ（（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１１：１２８５〜１２９５）によって記載されているトウモロコシの葉に特異的な遺伝子からのプロモーター、トウモロコシおよび他の種からのｋｎｌ関連遺伝子、ならびにトウモロコシユビキチン−１プロモーターなどの様々な植物遺伝子からの転写開始領域が含まれる。
【００５５】
５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが翻訳されず、転写開始部位と翻訳開始コドンとの間に位置し、＋１ヌクレオチドが含まれ得る。３’ＵＴＲは、翻訳終結コドンと転写終端との間に位置することができる。ＵＴＲは、増加したｍＲＮＡメッセージの安定性または減弱した翻訳などの特定の機能を有する場合がある。３’ＵＴＲの例には、それだけには限定されないが、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が含まれる。また、コード領域の３’末端のポリアデニル化領域もコード配列と作動可能に連結されていることができる。ポリアデニル化領域は、天然遺伝子、様々な他の植物遺伝子、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴ−ＤＮＡに由来することができる。
【００５６】
また、本明細書中で提供されているベクターには、たとえば、複製起点および／または足場付着領域（ＳＡＲ）も含まれることができる。さらに、発現ベクターには、発現されたポリペプチドの操作または検出（たとえば精製もしくは局在化）を促進するように設計されたタグ配列が含まれることができる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素、またはＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、コネチカット州Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ）配列などのタグ配列は、典型的には、コードされているポリペプチドとの融合体として発現される。そのようなタグは、カルボキシルまたはアミノ末端のどちらかを含めた、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。
【００５７】
「送達ベクター」または「複数の送達ベクター」とは、本発明において、本発明に必要な薬剤／化合物および分子（タンパク質または核酸）を細胞と接触させるまたは細胞内もしくは細胞内区画内に送達するために使用することができる、任意の送達ベクターを意図する。これには、それだけには限定されないが、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル（超音波造影剤）、ナノ粒子、乳濁液または他の適切な転移ベクターが含まれる。これらの送達ベクターは、分子、化合物、巨大分子（遺伝子、タンパク質）、またはプラスミド、Ｄｉａｔｏｓによって開発されたペプチドなどの他のベクターの送達を可能にする。これらの事例では、送達ベクターは分子担体である。また、「送達ベクター」または「複数の送達ベクター」とは、形質移入を行うための送達方法も意図する。
【００５８】
用語「ベクター」または「複数のベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。本発明における「ベクター」には、それだけには限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成の核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子が含まれる。好ましいベクターは、自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／またはそれらが連結されている核酸の発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適切なベクターが当業者に知られており、市販されている。
【００５９】
ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（たとえばアデノ関連ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（たとえばインフルエンザウイルス）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ラブドウイルス（たとえば狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（たとえば麻疹およびセンダイ）、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびに、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（たとえば、１および２型単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（たとえば、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘）を含めた二本鎖ＤＮＡウイルスが含まれる。他のウイルスには、たとえば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血症肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプマウイルスが含まれる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．、レトロウイルス科：ウイルスおよびその複製（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、基礎ウイルス学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第３版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）。
【００６０】
「レンチウイルスベクター」とは、その比較的大きなパッケージング能力、低下した免疫原性および広い範囲の様々な細胞種を高い効率で安定に形質導入するその能力が理由で遺伝子送達に非常に有望な、ＨＩＶ系のレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、産生細胞内への３つ（パッケージング、エンベロープおよび転移）以上のプラスミドの一過的な形質移入の後に作製される。ＨＩＶと同様、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面上の受容体との相互作用を介して標的細胞に進入する。進入の際、ウイルスＲＮＡは、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は二本鎖の直鎖状ウイルスＤＮＡであり、これは、感染した細胞のＤＮＡ中へのウイルス組込みの基質である。前記レンチウイルスベクターは、「非組込み」または「組込み」であることができる。
【００６１】
「組込みレンチウイルスベクター（またはＬＶ）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれることができるベクターを意味する。
【００６２】
逆に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはＮＩＬＶ）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用によって標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【００６３】
好ましいベクターの一種は、エピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、自律複製および／またはそれらが連結されている核酸の発現が可能なものである。それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ぶ。本発明によるベクターは、それだけには限定されないが、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工）、バキュロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成のＤＮＡからなり得る直鎖状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を含む。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、多くの場合は「プラスミド」の形態であり、これは一般に、そのベクター形態では染色体と結合していない環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。多数の適切なベクターが当業者に知られている。ベクターは、選択マーカー、たとえば、真核細胞培養物用のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミン合成酵素、およびヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、出芽酵母用のＴＲＰ１、大腸菌中のテトラサイクリン、リファンピシンまたはアンピシリン耐性を含むことができる。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターであり、対象のポリペプチドをコードしている配列は、前記ポリペプチドの産生または合成を可能にするために適切な転写および翻訳制御要素の制御下に置かれる。したがって、前記ポリヌクレオチドは発現カセット中に含まれる。より具体的には、ベクターは、複製起点、前記コードしているポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位（ゲノムＤＮＡを使用する場合）、ポリアデニル化部位および転写終結部位を含む。また、これは、エンハンサーまたはサイレンサー要素も含むことができる。プロモーターの選択は、ポリペプチドを発現させる細胞に依存する。適切なプロモーターには、組織特異的および／または誘導性プロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例は、増加した重金属レベルによって誘導される真核メタロチオニンプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）に応答して誘導される原核ｌａｃＺプロモーターおよび増加した温度によって誘導される真核熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、α−抗トリプシンプロテアーゼ、ヒト界面活性化因子（ＳＰ）ＡおよびＢタンパク質、β−カゼインならびに酸性ホエータンパク質遺伝子である。
【００６４】
誘導性プロモーターは、病原体またはストレス、より好ましくは低温、熱、ＵＶ光、または高イオン濃度などのストレスによって誘導され得る（Ｐｏｔｅｎｚａら（２００４）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、４０：１〜２２に総説）。誘導性プロモーターは化合物によって誘導され得る［Ｍｏｏｒｅら（２００６）、Ｐａｄｉｄａｍ（２００３）、（Ｗａｎｇら（２００３）、ならびに（ＺｕｏおよびＣｈｕａ（２０００）に総説］。
【００６５】
送達ベクターおよびベクターは、超音波穿孔もしくは電気穿孔またはこれらの技法の派生法などの任意の細胞透過処理技法と関連させるまたは組み合わせることができる。
【００６６】
複数の調節領域、たとえば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、および誘導性要素が組換えポリヌクレオチド中に存在し得ることを理解されよう。
【００６７】
組換え核酸構築体には、細胞（たとえば植物細胞または動物細胞）の形質転換に適したベクター内に挿入されたポリヌクレオチド配列が含まれることができる。組換えベクターは、たとえば標準の組換えＤＮＡ技法を使用して作製することができる（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒを参照）。
【００６８】
本明細書中に記載の組換え核酸配列は、非正統的な（すなわち、ランダム、非相同的、非部位特異的）組換えによって細胞のゲノム内に組み込まれることができるか、または、本明細書中に記載の組換え核酸配列は、相同組換えによって細胞のゲノム内に組み込まれるように適応させることができる。相同組換えによる組込みのために適応させた核酸配列は、両側が内在標的ヌクレオチド配列に類似または同一の配列で隣接されており、これは、内在標的ヌクレオチド配列を含有するゲノム中の特定の部位（複数可）での組換え核酸の組込みを促進する。また、相同組換えによる組込みのために適応させた核酸配列には、配列特異的ヌクレアーゼの認識部位も含まれることができる。あるいは、配列特異的ヌクレアーゼの認識部位は、形質転換させる細胞のゲノム中に位置することができる。以下に記載のドナー核酸配列は、典型的には、相同組換えによる組込みのために適応せる。
【００６９】
また、一部の実施形態では、選択マーカーをコードしている核酸も相同組換えによる組み込のために適応させることができ、したがって、両側が植物ゲノム内の内在配列（たとえば、配列特異的ヌクレアーゼの切断部位での内在配列）と類似または同一の配列で隣接されていることができる。また、一部の事例では、選択マーカーのコード配列を含有する核酸には、配列特異的ヌクレアーゼの認識部位も含まれることができる。これらの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼの認識部位は、ドナー核酸配列内に含有されるものと同じまたは異なることができる（すなわち、ドナー核酸配列と同じヌクレアーゼによって認識される、またはドナー核酸配列とは異なるヌクレアーゼによって認識されることができる）。
【００７０】
一部の事例では、組換え核酸配列は、部位特異的な組換えによって細胞のゲノム内に組み込まれるように適応させることができる。本明細書中で使用する「部位特異的な」組換えとは、組換え核酸中の配列とゲノム中の配列との間の相同性によってではなく、特定の核酸配列を認識してこれらの部位間のＤＮＡ鎖の相互交換を触媒するリコンビナーゼ酵素の作用によって、核酸配列がゲノム内の特定の部位（複数可）に対して標的化されている場合に起こる組換えをいう。したがって、部位特異的な組換えとは、２つの定義されたヌクレオチド配列の酵素媒介性の切断およびライゲーションをいう。たとえばＣｒｅ−ｌｏｘ系またはＦＬＰ−ＦＲＴ系を含めた、任意の適切な部位特異的な組換え系を使用することができる。そのような実施形態では、ドナーヌクレオチド配列およびヌクレアーゼをコードしている配列、ならびに一部の事例では選択マーカー配列に加えて、リコンビナーゼ酵素をコードしている核酸を細胞内に導入し得る。たとえば米国特許第４，９５９，３１７号を参照されたい。
【００７１】
配列特異的エンドヌクレアーゼ
配列特異的ヌクレアーゼおよび配列特異的エンドヌクレアーゼをコードしている組換え核酸が本明細書中で提供されている。配列特異的エンドヌクレアーゼには、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインが含まれることができる。したがって、そのような配列特異的エンドヌクレアーゼをコードしている核酸には、ヌクレアーゼからのヌクレオチド配列と連結された配列特異的ＴＡＬエフェクターからのヌクレオチド配列が含まれることができる。
【００７２】
ＴＡＬエフェクターとは、病原体によって植物細胞内に注入され、ここで核へと移動して転写因子として機能して特定の植物遺伝子を活性化する、植物病原細菌のタンパク質である。ＴＡＬエフェクターの一次アミノ酸配列が、それが結合するヌクレオチド配列指示する。したがって、ＴＡＬエフェクターの標的部位を予測することができ、また、ＴＡＬエフェクターは、本明細書中に記載のように、特定のヌクレオチド配列と結合させる目的で操作設計および作製することもできる。
【００７３】
ＴＡＬエフェクターをコードしている核酸配列には、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの一部分、典型的にはＦｏｋＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼからの非特異的な切断ドメインをコードしている配列が融合している（Ｋｉｍら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１１５６〜１１６０）。他の有用なエンドヌクレアーゼには、たとえば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、およびＡｌｗＩが含まれ得る。一部のエンドヌクレアーゼ（たとえばＦｏｋＩ）が二量体としてのみ機能することは、ＴＡＬエフェクターの標的特異性を増強させる際に利用することができる。たとえば、一部の事例では、それぞれのＦｏｋＩ単量体を、異なるＤＮＡ標的配列を認識するＴＡＬエフェクター配列と融合させることができ、２つの認識部位が近く近接している場合にのみ、不活性な単量体が一体となって機能的な酵素を生じる。ヌクレアーゼを活性化させるためにＤＮＡ結合を必要とすることによって、高度に部位特異的な制限酵素を作製することができる。
【００７４】
本明細書中で提供されている配列特異的ＴＡＬＥＮは、細胞中に存在する事前に選択された標的ヌクレオチド配列内の特定の配列を認識することができる。したがって、一部の実施形態では、標的ヌクレオチド配列をヌクレアーゼ認識部位について走査することができ、標的配列に基づいて特定のヌクレアーゼを選択することができる。他の事例では、特定の細胞配列を標的とするようにＴＡＬＥＮを操作することができる。所望のＴＡＬＥＮをコードしているヌクレオチド配列を任意の適切な発現ベクター内に挿入することができ、１つまたは複数の発現制御配列と連結させることができる。たとえば、ヌクレアーゼのコード配列は、形質転換させる植物種中でエンドヌクレアーゼの構成的発現をもたらすプロモーター配列と作動可能に連結されていることができる。あるいは、エンドヌクレアーゼのコード配列は、条件的発現（たとえば特定の栄養条件下での発現）をもたらすプロモーター配列と作動可能に連結されていることができる。たとえば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを構成的発現に使用することができる。他の構成的プロモーターには、それだけには限定されないが、ノパリン合成酵素プロモーター、ユビキチンプロモーター、およびアクチンプロモーターが含まれる。一部の実施形態では、人工エストロゲン誘導性プロモーターを条件的発現に使用することができ、植物がエストロゲンに曝露された際に高レベルの転写を達成することができる。使用することができる他の条件的プロモーターには、たとえば、熱誘導性熱ショック遺伝子プロモーター、およびリブロースビスリン酸カルボキシラーゼの大サブユニットをコードしている遺伝子からのものなどの光調節性プロモーターが含まれる。
【００７５】
治療目的には、本発明のＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素および薬学的に許容される賦形剤を治療上有効な量で投与する。そのような組合せは、投与した量が生理的に有意である場合に、「治療上有効な量」で投与されたという。薬剤は、その存在がレシピエントの生理学の検出可能な変化をもたらす場合に、生理的に有意である。本コンテキストでは、薬剤は、その存在が標的疾患の１つまたは複数の症状の重篤度の減少および病変または異常のゲノム補正をもたらす場合に、生理的に有意である。標的化ＤＮＡおよび／またはＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素をコードしている核酸を含むベクターは、様々な方法（たとえば、注入、直接取り込み、噴出性照射、リポソーム、電気穿孔）によって細胞内に導入することができる。ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素は、発現ベクターを使用して細胞内で安定にまたは一過的に発現させることができる。真核細胞中での発現の技法は当業者に周知である。（ヒト遺伝学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）：第１２章「遺伝子治療のベクター（Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」および第１３章「遺伝子治療の送達系（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」を参照）。
【００７６】
本発明のさらなる一態様では、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素は実質的に非免疫原性である、すなわち、有害な免疫学的応答をわずかしかまたはまったく生じない。この種の有害な免疫学的反応を寛解させるまたは排除するための様々な方法を、本発明に従って使用することができる。好ましい実施形態では、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素はＮ−ホルミルメチオニンを実質的に含まない。望まない免疫学的反応を回避するための別の方法は、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素をポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）またはポリプロピレングリコール（「ＰＰＧ」）（好ましくは５００〜２０，０００ダルトンの平均分子量（ＭＷ）のもの）とコンジュゲートさせることである。たとえばＤａｖｉｓら（ＵＳ４，１７９，３３７号）によって記載されている、ＰＥＧまたはＰＰＧとのコンジュゲーションは、抗ウイルス活性を有する、非免疫原性の生理的に活性のある水溶性のＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素のコンジュゲートを提供することができる。やはりポリエチレン−ポリプロピレングリコールのコポリマーを使用した類似の方法が、Ｓａｉｆｅｒら（ＵＳ５，００６，３３３号）に記載されている。
【００７７】
ドナーベクター
また、ドナーヌクレオチド配列を含めた組換え核酸も、本明細書中で提供されている。ドナーヌクレオチド配列には、形質転換させる細胞のゲノム内に内在的に見つかる事前に選択された標的ヌクレオチド配列に関して１つまたは複数の修飾（すなわち、置換、欠失、または挿入）を有する変異体配列が含まれることができる（本明細書中で「修飾された標的ヌクレオチド配列」とも呼ばれる）。ドナー核酸内の変異体配列は、典型的には、両側が細胞内の内在標的ヌクレオチド配列と類似または同一の配列で隣接されている。隣接配列は任意の適切な長さを有することができ、典型的には、少なくとも５０個のヌクレオチドの長さである（たとえば、少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも７５個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、少なくとも２００個のヌクレオチド、少なくとも２５０個のヌクレオチド、少なくとも３００個のヌクレオチド、少なくとも５００個のヌクレオチド、少なくとも７５０個のヌクレオチド、少なくとも１０００個のヌクレオチド、約５０〜約５０００個のヌクレオチド、約１００〜２５００個のヌクレオチド、約１００〜約１０００個のヌクレオチド、約１００〜５００個のヌクレオチド、約２００〜約５００個のヌクレオチド、または約２５０〜４００個のヌクレオチド）。したがって、相同組換えは、生じる細胞のゲノムが、たとえば同じ遺伝子からの内在配列のコンテキスト内の変異体配列を含有するように、組換えドナー核酸構築体と変異体配列の両側の内在標的との間で起こることができる。ドナーヌクレオチド配列は、ゲノム内の任意の適切な配列を標的とするように作製することができる。たとえば、植物では、ドナーヌクレオチド配列は、脂質生合成遺伝子、炭水化物生合成遺伝子、種子貯蔵タンパク質遺伝子、疾患もしくは害虫耐性遺伝子、ストレス寛容遺伝子、乾燥寛容遺伝子、または抗栄養因子を産生する遺伝子を標的とすることができる。さらに、ドナーヌクレオチド配列は、本明細書中に記載の配列特異的ヌクレアーゼの認識部位を含有する。
【００７８】
選択マーカー
本明細書中で提供されている方法の一部には、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーをコードしている第３の組換え核酸の使用が含まれる。選択可能な特色をもたらすポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、１つまたは複数の発現制御配列を含有する発現ベクター内に取り込ませることができる。たとえば、発現ベクターには、形質転換させる植物細胞中で構成的発現をもたらすプロモーター配列と作動可能に連結された選択マーカーをコードしている配列が含まれることができる。適切な選択マーカーには、それだけには限定されないが、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、アンピシリン、もしくはハイグロマイシンなどの抗生物質、またはグルホシネート、クロロスルフロン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）、もしくはホスフィノスリシンなどの除草剤に対する耐性を与えるポリペプチドが含まれることができる。
【００７９】
たとえば、植物で使用するための実施形態では、選択マーカーは、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素などの成長点または分裂組織を阻害する除草剤に対する耐性を与えることができる。この突然変異ＡＬＳおよびＡＨＡＳ酵素の分類コード中の例示的なポリペプチドは、たとえば、米国特許第５，７６７，３６６号および第５，９２８，９３７号に記載されている。米国特許第４，７６１，３７３号および第５，０１３，６５９号は、様々なイミダゾリノンまたはスルホンアミド除草剤に耐性の植物に向けられている。米国特許第４，９７５，３７４号は、ＧＳを阻害することが知られている除草剤、たとえばホスフィノスリシンおよびメチオニンスルホキシミンによる阻害に耐性の突然変異グルタミン合成酵素（ＧＳ）をコードしている遺伝子を含有する植物細胞および植物に関する。米国特許第５，１６２，６０２号は、シクロヘキサンジオンおよびアリールオキシフェノキシプロパン酸除草剤による阻害に耐性の植物を開示している。耐性は、変更されたアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）によって与えられる。
【００８０】
また、グリフォセート（商品名Ｒｏｕｎｄｕｐ（登録商標）の下で販売）に耐性のポリペプチドも、植物における使用に適している。たとえば、米国特許第４，９４０，８３５号および第４，７６９，０６１号を参照されたい。米国特許第５，５５４，７９８号は、トランスジェニックグリフォセート耐性トウモロコシ植物を開示しており、耐性は変更された５−エノールピルビル−３−ホスホシキメート（ＥＰＳＰ）合成酵素によって与えられる。そのようなポリペプチドは、それだけには限定されないが、トリメチルスフホニウム塩、イソプロピルアミン塩、ナトリウム塩、カリウム塩およびアンモニウム塩などのグリフォセート塩を含めた、グリフォセート除草組成物に対する耐性を与えることができる。たとえば、米国特許第６，４５１，７３５号および第６，４５１，７３２号を参照されたい。
【００８１】
また、グルホシネートアンモニウムまたはホスフィノスリシンなどのホスホノ化合物、ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソンに耐性のポリペプチドも適切である。たとえば、欧州公開第０  ２４２  ２４６号、ならびに米国特許第５，８７９，９０３号、第５，２７６，２６８号、および第５，５６１，２３６号を参照されたい。
【００８２】
他の除草剤には、トリアジンおよびベンゾニトリル（ニトリラーゼ）などの光合成を阻害するものが含まれる。たとえば米国特許第４，８１０，６４８号を参照されたい。他の除草剤には、２，２−ジクロロプロピオン酸、セトキシジム、ハロキシホップ、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ｓ−トリアジン除草剤およびブロモキシニルが含まれる。また、プロトックス（ｐｒｏｔｏｘ）酵素に対する耐性を与える除草剤も適している。たとえば、米国特許公開第２００１００１６９５６号および米国特許第６，０８４，１５５号を参照されたい。
【００８３】
一部の実施形態では、選択マーカーをコードしている組換え核酸は、部位特異的な組換えによって細胞（たとえば植物細胞または動物細胞）のゲノム内に組み込ませるために適応させることができる。たとえば、選択マーカーをコードしている配列は、たとえばＣｒｅまたはＦＬＰなどのリコンビナーゼの認識配列によって隣接されていることができる。他の実施形態では、選択マーカーをコードしている組換え核酸は、相同組換えによる植物ゲノム内への組込みのために適応させることができる。そのような核酸では、選択マーカーをコードしている配列は、それ内に組換え核酸を導入する植物細胞のゲノム中に見つかる内在ヌクレオチド配列と類似または同一の配列によって隣接されていることができる。内在配列のうちの少なくとも１つが配列特異的ヌクレアーゼの切断部位にあることができる。また、選択マーカーをコードしている核酸は、配列特異的ヌクレアーゼの認識部位も含有することができる。ヌクレアーゼは、ドナーヌクレオチド配列に対して標的化されているものと同じ配列特異的ヌクレアーゼ、またはドナーヌクレオチド配列に対して標的化されているものとは異なる配列特異的ヌクレアーゼであることができる。さらに他の実施形態では、選択マーカーをコードしている組換え核酸は、非正統的な組換えによる植物細胞のゲノム内への組込みのために適応させることができる。そのような核酸は、典型的には、本明細書中に記載の相同的または部位特異的な組換えのために適応させた核酸内に含有される隣接配列およびヌクレアーゼ認識部位を欠く。
【００８４】
方法
本明細書中で提供されている構築体のうちの１つまたは複数を使用して、遺伝子改変した生物（たとえば植物または動物）が作製されるように、細胞を形質転換させることができるおよび／またはＤＮＡ修飾酵素を細胞内に導入することができる。したがって、本明細書中に記載の核酸および／またはポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｄｅｓ）を含有する遺伝子改変した生物および細胞も提供される。一部の実施形態では、形質転換細胞は、組換え核酸構築体がそのゲノム内に組み込まれている、すなわち安定に形質転換させることができる。安定に形質転換させた細胞は、典型的には、導入された核酸配列を各細胞分裂で保持する。構築体は、形質転換細胞に内在性のヌクレオチド配列が、内在配列に対応する配列を含有するが内在配列に関して１つまたは複数の修飾を含有する構築体によって置き換えられるように、相同的な様式で組み込まれることができる。そのような修飾された内在配列を含有する植物または動物は本明細書中で「遺伝子改変した生物」（ＧＭＯ）と呼び得るが、修飾された内在配列は導入遺伝子とみなされないことに留意されたい。また、構築体は、形質転換細胞のゲノム内にランダムに組み込まれるように、非正統的な様式で組み込まれることもできる。
【００８５】
あるいは、構築体がそのゲノム内に組み込まれないように、細胞を一過的に形質転換させることができる。たとえば、ＴＡＬＥＮのコード配列が発現されるが、ベクターがゲノム中に安定に組み込まれていないように、ＴＡＬＥＮのコード配列を含有するプラスミドベクターを細胞内に導入することができる。一過的に形質転換させた細胞は、典型的には、導入された核酸が十分な回数の細胞分裂の後に娘細胞中で検出できないように、導入された核酸構築体の一部またはすべてを各それぞれの細胞分裂で失う。それにもかかわらず、ＴＡＬＥＮのコード配列の発現は、ドナー配列と内在標的配列との間の相同組換えを達成するために十分である。一過的に形質転換させたおよび安定に形質転換させた細胞はどちらも本明細書中に記載の方法において有用な可能性がある。
【００８６】
特に遺伝子改変した植物細胞に関して、本明細書中に記載の方法で使用する細胞は、全植物の一部または全体を構成することができる。そのような植物は、検討中の種に適した様式で、成長チャンバ、温室、または畑のいずれかで成長させることができる。遺伝子改変した植物は、特定の目的、たとえば、組換え核酸を他の系に導入する、組換え核酸を他の種に転移させる、または他の望ましい特色をさらに選択するために所望されるように、育種することができる。あるいは、遺伝子改変した植物は、そのような技法を受け入れられる種では栄養繁殖させることができる。子孫には特定の植物または植物系の子孫が含まれる。本発明の植物の子孫には、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６および続く世代の植物上で形成された種子、またはＢＣ１、ＢＣ２、ＢＣ３、および続く世代の植物上で形成された種子、またはＦ１ＢＣ１、Ｆ１ＢＣ２、Ｆ１ＢＣ３、および続く世代の植物上で形成された種子が含まれる。遺伝子改変した植物によって生成された種子を成長させ、その後、自家受粉（または異系交配および自家受粉）させて、核酸構築体にホモ接合性の種子を得ることができる。
【００８７】
遺伝子改変した細胞（たとえば植物細胞または動物細胞）は、所望する場合は、懸濁培養、または組織もしくは器官培養中で成長させることができる。本明細書中で提供されている方法の目的のために、固体および／または液体の組織培養技法を使用することができる。固体培地を使用する場合、細胞を培地上に直接置くことができるか、またはフィルターフィルム上に置き、その後それを培地と接触させることができる。液体培地を使用する場合、細胞を浮遊装置、たとえば液体培地と接触する多孔性の膜上に置くことができる。固体培地は、典型的には、液体培地から、寒天を加えることによって作製する。たとえば、固体培地は、寒天および適切な濃度のオーキシン、たとえば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、および適切な濃度のサイトカイニン、たとえばキネチンを含有する、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（ＭＳ）培地であることができる。
【００８８】
細胞は、１個の組換え核酸構築体または複数（たとえば、２、３、４、もしくは５個）の組換え核酸構築体で形質転換させることができる。複数の構築体を利用する場合は、これらは同時にまたは順次形質転換させることができる。多種多様の種を形質転換させる技法が当分野で知られている。本明細書中に記載のポリヌクレオチドおよび／または組換えベクターは、電気穿孔、微量注入、および微粒子銃方法を含めたいくつかの知られている方法のうちの任意のものを使用して、宿主のゲノム内に導入することができる。あるいは、ポリヌクレオチドまたはベクターを適切なＴ−ＤＮＡ隣接領域と組み合わせて、慣用のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクター内に導入することができる。無害化（ｄｉｓａｒｍｉｎｇ）およびバイナリーベクターの使用を含めた、そのようなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに媒介される形質転換技法は当分野で周知である。他の遺伝子移入および形質転換技法には、カルシウムまたはＰＥＧによるプロトプラストの形質転換、電気穿孔に媒介される裸ＤＮＡの取り込み、リポソームに媒介される形質移入、電気穿孔、ウイルスベクターに媒介される形質転換、および微粒子銃が含まれる（たとえば、米国特許第５，５３８，８８０号、第５，２０４，２５３号、第５，５９１，６１６号、および第６，３２９，５７１号を参照）。植物細胞または組織培養物を形質転換のレシピエント組織として使用する場合は、当業者に知られている技法を使用して、形質転換させた培養物から植物を再生することができる。
【００８９】
一部の実施形態では、ＤＮＡ修飾酵素（たとえばＴＡＬＥＮ）を細胞内に直接導入することができる。たとえば、機械的注入、細菌ＩＩＩ型分泌系による送達、電気穿孔、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに媒介される転移によって、ポリペプチドを細胞内に導入することができる。たとえば、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＶｉｒＢ／Ｄ４輸送系、および核タンパク質Ｔ複合体の植物細胞への転移を媒介するためのその使用に関する記述には、Ｖｅｒｇｕｎｓｔら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０：９７９〜９８２を参照されたい。
【００９０】
さらに植物に関して、本明細書中に記載のポリヌクレオチド、ベクターおよびポリペプチドは、ベニバナ、アルファルファ、ダイズ、コーヒー、アマランス、ナタネ（高エルカ酸およびアブラナ）、ピーナッツまたはヒマワリなどの双子葉植物、およびアブラヤシ、サトウキビ、バナナ、スーダングラス、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、カラスムギ、コメ、アワ、またはソルガムなどの単子葉植物を含めた、いくつかの単子葉および双子葉の植物および植物細胞系内に導入することができる。また、モミおよびマツなどの裸子植物も適切である。
【００９１】
したがって、本明細書中に記載の方法は、たとえば、Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ、Ｉｌｌｉｃｉａｌｅｓ、Ｌａｕｒａｌｅｓ、Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ、Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ、Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ、Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ、Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ、Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ、Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ、Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ、Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ、Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ、Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ、Ｂａｔａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ、Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ、Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ、Ｔｈｅａｌｅｓ、Ｍａｌｖａｌｅｓ、Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ、Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ、Ｖｉｏｌａｌｅｓ、Ｓａｌｉｃａｌｅｓ、Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ、Ｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ、Ｅｂｅｎａｌｅｓ、Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ、Ｒｏｓａｌｅｓ、Ｆａｂａｌｅｓ、Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ、Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ、Ｍｙｒｔａｌｅｓ、Ｃｏｒｎａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ、Ｓａｎｔａｌｅｓ、Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ、Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ、Ｒｈａｍｎａｌｅｓ、Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ、Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ、Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ、Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ、Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ、Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ、Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ、Ｌａｍｉａｌｅｓ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ、Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ、Ｒｕｂｉａｌｅｓ、Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ、およびＡｓｔｅｒａｌｅｓの目に属する双子葉植物を用いて利用することができる。また、本明細書中に記載の方法は、Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ、Ｎａｊａｄａｌｅｓ、Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ、Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ、Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ、Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ、Ｐｏａｌｅｓ、Ｊｕｎｃａｌｅｓ、Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ、Ｔｙｐｈａｌｅｓ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ、Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ、Ａｒｅｃａｌｅｓ、Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ、Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ、Ａｒａｌｅｓ、Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ、およびＯｒｃｈｉｄａｌｅｓの目に属するものなどの単子葉植物を用いて、または裸子植物類に属する植物、たとえば、Ｐｉｎａｌｅｓ、Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ、ＣｙｃａｄａｌｅｓおよびＧｎｅｔａｌｅｓを用いても利用することができる。
【００９２】
本方法は、双子葉植物の属であるＡｔｒｏｐａ、Ａｌｓｅｏｄａｐｈｎｅ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｂｅｉｌｓｃｈｍｉｅｄｉａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃｏｃｃｕｌｕｓ、Ｃｒｏｔｏｎ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｃｏｃｏｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｄｕｇｕｅｔｉａ、Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ、Ｆｉｃｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｌａｕｃｉｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｉｔｓｅａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｍａｌｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｌｅａ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐａｐａｖｅｒ、Ｐｅｒｓｅａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｔａｃｉａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｙｒｕｓ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｉｎｏｍｅｎｉｕｍ、Ｓｔｅｐｈａｎｉａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｎｃａ、Ｖｉｔｉｓ、およびＶｉｇｎａ、単子葉植物の属であるＡｌｌｉｕｍ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ、Ａｒａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｖｅｎａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｅｓｔｕｌｏｌｉｕｍ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｌｅｍｎａ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｍｕｓａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、およびＺｅａ、または裸子植物の属であるＡｂｉｅｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ、Ｐｉｃｅａ、Ｐｉｎｕｓ、およびＰｓｅｕｄｏｔｓｕｇａからの種を含めた、幅広い範囲の植物種にわたって使用することができる。
【００９３】
形質転換細胞、カルス、組織、または植物は、操作された細胞を、特定の特色または活性、たとえばマーカー遺伝子または抗生物質耐性遺伝子によってコードされているものについて選択またはスクリーニングすることによって、同定および単離することができる。そのようなスクリーニングおよび選択方法は当業者には周知である。さらに、物理的および生化学的方法を使用して形質転換体を同定することができる。これらには、ポリヌクレオチドを検出するためのサザン分析およびＰＣＲ増幅、ＲＮＡ転写物を検出するためのノーザンブロット、Ｓ１  ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長、またはＲＴ−ＰＣＲ増幅、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ、ならびにポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、および酵素連結免疫アッセイが含まれる。また、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などの他の技法も、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために使用することができる。言及した技法のすべてを行う方法は周知である。植物細胞内に安定に取り込まれたポリヌクレオチドは、たとえば標準の育種技法を使用して他の植物内に導入することができる。
【００９４】
本発明のコンテキストでは、「真核細胞」とは、真菌、酵母、植物もしくは動物細胞、または以下に記載し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のために確立させた生物に由来する細胞系をいう。より好ましくは、真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａの属のものであることができる。より好ましくは、真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉの種のものであることができる。
【００９５】
本発明では、植物は、Ａｒａｂｉｄｏｓｐｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｏｒｙｚａ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｚｅａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｃｉｔｒｕｌｌｉｓ、Ｃｉｔｒｕｓ、またはＳｏｒｇｈｕｍの属のものであることができる。より好ましくは、植物は、Ａｒａｂｉｄｏｓｐｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｃｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｌｉｖａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ、Ｏｒｙｚａ  ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｄｕｒｕｍ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓａｔｉｖｕｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ、Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ、Ｃｉｔｒｕｓ  ｍａｘｉｍａ、Ｃｉｔｒｕｓ  ｍｅｄｉｃａ、またはＣｉｔｒｕｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａの種のものであることができる。
【００９６】
本発明では、動物細胞は、Ｈｏｍｏ、Ｒａｔｔｕｓ、Ｍｕｓ、Ｓｕｓ、Ｂｏｓ、Ｄａｎｉｏ、Ｃａｎｉｓ、Ｆｅｌｉｓ、Ｅｑｕｕｓ、Ｓａｌｍｏ、Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、Ｇａｌｌｕｓ、Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓの属のものであることができる。より好ましくは、動物細胞は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ、Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ、Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ、Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、またはＭｅｌｅａｇｒｉｓ  ｇａｌｌｏｐａｖｏの種のものであることができる。動物細胞は、非限定的な例としてＳａｌｍｏ  ｓａｌａｒ、硬骨魚またはブラフィッシュの種からの魚細胞であることができる。また、本発明における動物細胞は、非限定的な例としてキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）からの昆虫細胞であることもできる。また、動物細胞は、非限定的な例としてエレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からの寄生虫細胞であることもできる。
【００９７】
本発明では、細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、魚細胞、昆虫細胞もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のためにこれらの生物から誘導した細胞系、または生組織から直接採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のために確立させた初代細胞であることができる。非限定的な例として、細胞系は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃａｃｏ２細胞、Ｕ２−ＯＳ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＤＧ４４細胞、Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞、ＭＲＣ５細胞、ＩＭＲ９０細胞、ジャーカット細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＨＣＴ−１１６細胞、Ｈｕ−ｈ７細胞、Ｈｕｖｅｃ細胞、Ｍｏｌｔ  ４細胞からなる群から選択されることができる。
【００９８】
これらの細胞系はすべて、本発明の方法によって改変して、対象の遺伝子またはタンパク質を産生、発現、定量、検出、研究するための細胞系モデルを提供することができる。また、これらのモデルを使用して、非限定的な例として化学薬品、生物燃料、治療剤および農学などの様々な分野における研究および生成において、対象の生物活性のある分子をスクリーニングすることもできる。
【００９９】
また、本発明は、たとえば、細胞内の遺伝物質を変更するため、遺伝子発現を変調させるため、およびたとえば抗ウイルス治療において病原性配列を標的とするために、ＴＡＬエフェクター内の配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを利用する方法も提供する。たとえば、一部の実施形態では、本発明は、細胞遺伝物質を改変する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法には、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含有するポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードしている核酸を、細胞内に導入することが含まれる。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ修飾酵素（たとえばエンドヌクレアーゼ）の全体または一部分と融合させることができる。一部の実施形態では、本方法には、２つ以上の組換え核酸を細胞内に導入することが含まれる。第１の組換え核酸は、細胞中に見つかる対応する事前に選択された標的ヌクレオチド配列に関して１つまたは複数の修飾（すなわち、置換、欠失、または挿入）が含まれる、ドナーヌクレオチド配列を含有する。ドナーヌクレオチド配列は、内在配列またはその一部分がドナー配列またはその一部分で置き換えられているように、内在標的ヌクレオチド配列との相同組換えを受けることができる。標的ヌクレオチド配列には、典型的には配列特異的ＴＡＬＥＮの認識部位が含まれる。一部の事例では、標的ヌクレオチド配列には、２つ以上の明白に異なるＴＡＬＥＮの認識部位（たとえば、明白に異なるＤＮＡ配列結合特異性を有するＴＡＬＥＮを使用できるように、明白に異なる２つの向かい合った標的配列）が含まれることができる。そのような事例では、ＤＮＡ切断の特異性は、１つのみの標的配列（または同じ標的配列の複数コピー）を使用する事例と比較して増加している場合がある。
【０１００】
第２の組換え核酸は、標的ヌクレオチド配列中の認識部位と結合する配列特異的ＴＡＬＥＮをコードしているヌクレオチド配列を含有する。一部の事例では、ドナーヌクレオチド配列および配列特異的ヌクレアーゼをコードしているヌクレオチド配列は、同じ核酸構築体中に含有されることができる。あるいは、ドナーヌクレオチド配列およびＴＡＬＥＮのコード配列は、別々の構築体中に含有されることができるか、または、ＴＡＬＥＮポリペプチドを生成して細胞内に直接導入することができる。
【０１０１】
一部の実施形態では、選択マーカーをコードしているヌクレオチド配列を含有する第３の組換え核酸も使用し得る。第２および第３の組換え核酸は、内在配列との組換えを受け、したがって細胞のゲノム内に組み込まれ得る。これらの組換え事象は非正統的（すなわちランダム）であることができるか、または、これらは相同組換えもしくは部位特異的な組換えによって起こることができる。組換え核酸は、細胞内に同時にまたは順次形質転換させることができ、形質転換の前に直鎖状にすることができる。
【０１０２】
細胞が植物細胞である場合は、本明細書中で提供されている方法には、形質転換細胞を含有する植物を作製するステップ、植物の子孫を作製するステップ、選択マーカー（含めた場合）を発現する植物を選択またはスクリーニングするステップ、選択された植物の子孫を作製するステップ、および植物（たとえば、組織、種子、前駆細胞、もしくは全植物）または植物の子孫を標的ヌクレオチド配列での組換えについて試験するステップなどのステップがさらに含まれることができる。一部の事例では、本方法には、選択された植物を異系交配させて選択マーカーを除去すること、および／または選択されたもしくは異系交配させた植物を配列特異的ヌクレアーゼの非存在についてスクリーニングすることが含まれることができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、本発明は、細胞、たとえば、原核細胞、動物細胞、または植物細胞の遺伝物質を改変する方法を提供する。本方法には、細胞中に存在する対応する標的ヌクレオチド配列に関してヌクレオチド配列中に１つまたは複数の修飾が含まれる修飾された標的ヌクレオチド配列と、配列特異的ＴＡＬＥＮの認識部位とを含有する第１の組換え核酸、および配列特異的ＴＡＬＥＮをコードしているヌクレオチド配列を含有する第２の組換え核酸を、細胞内に導入することが含まれることができる。細胞が植物細胞である場合は、細胞を含有する植物を作製することができ、植物（またはその子孫）から得られた細胞、種子、または組織を、標的ヌクレオチド配列での組換えについて分析することができる。第１および第２の組換え核酸を同時にまたは連続的に細胞内に形質転換させることができ、一方または両方を形質転換の前に直鎖状にし得る。一部の事例では、第１および第２の組換え核酸は同じ構築体中に存在することができる。
【０１０４】
一部の事例では、本方法には、選択マーカーをコードしているヌクレオチド配列を含有する第３の組換え核酸を細胞内に導入すること、および細胞、細胞から作製した生物、またはその子孫が選択マーカーを発現するかどうかを決定することも含まれることができる。本方法には、さらに、細胞、生物またはその子孫を選択マーカーの非存在についてスクリーニングすることが含まれることができる。選択マーカーをコードしているヌクレオチド配列は、その両側が、第２の配列特異的ヌクレアーゼの切断部位で細胞に内在性のヌクレオチド配列と類似もしくは同一のヌクレオチド配列によって、または配列特異的リコンビナーゼの認識部位によって隣接されていてもいなくてもよい。一部の事例では、本方法には、生物を異系交配させるステップも含まれることができる。異系交配の子孫は、選択マーカーの非存在についてスクリーニングすることができる。
【０１０５】
また、本発明は、それ内で相同組換えが起こることが所望される標的ＤＮＡ配列、たとえば、染色体、ミトコンドリア、または葉緑体の配列を含有する細胞を提供するステップと、ＤＮＡ修飾酵素ドメイン（たとえばエンドヌクレアーゼドメイン）および組み合わせて標的ＤＮＡ配列内の特定のヌクレオチド配列と結合する複数のＴＡＬエフェクター反復を有するＴＡＬエフェクタードメインを含有するＴＡＬＥＮを提供するステップと、標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同的な配列を含有する核酸を提供するステップと、細胞中の標的ＤＮＡ配列内にあるまたはそれに隣接するヌクレオチド配列の両方の鎖が切断されるように、細胞中の標的ＤＮＡ配列をＴＡＬエンドヌクレアーゼと接触させるステップとを含む、細胞（たとえば植物細胞または動物細胞）の遺伝物質を改変する方法も提供する。そのような切断は、標的ＤＮＡ配列での相同組換えの頻度を増強させることができる。標的ＤＮＡ配列は細胞に内在性であることができる。本方法には、ＴＡＬエンドヌクレアーゼをコードしているｃＤＮＡを含有するベクターを細胞内に導入すること、およびＴＡＬエンドヌクレアーゼタンパク質を細胞中で発現させることが含まれることができる。一部の事例では、ＴＡＬエンドヌクレアーゼタンパク質自体を、たとえば、機械的注入、細菌ＩＩＩ型分泌系による送達、電気穿孔、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに媒介される転移によって、細胞内に導入することができる。
【０１０６】
本明細書中に記載の方法は、様々な状況において使用することができる。たとえば、農業では、本明細書中に記載の方法は、以前に組み込んだ導入遺伝子（たとえば除草剤耐性の導入遺伝子）を植物の系、変種、またはハイブリッドから除去するために使用できる、標的部位での相同組換えを促進するために有用である。また、本明細書中に記載の方法を使用して、遺伝子によってコードされている酵素が除草剤耐性を与えるように内在遺伝子を改変することもでき、その例は、改変された酵素がグリフォセート除草剤に対する耐性を与えるような、内在性５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸（ＥＰＳＰ）合成酵素遺伝子の改変である。別の例として、本明細書中に記載の方法は、植物または哺乳動物の代謝経路（たとえば脂肪酸生合成）中の１つまたは複数の内在遺伝子の調節領域での相同組換えを、そのような遺伝子の発現が所望の様式で改変されているように促進するために有用である。本明細書中に記載の方法は、動物（たとえばラットまたはマウス）において、非限定的な例として、細胞表面マーカーをコードしているものなどの代謝および内部シグナル伝達経路に関与している１つまたは複数の対象の内在遺伝子、特定の疾患に連関していると同定されている遺伝子、ならびに動物細胞の特定の表現型を司っていることが知られている任意の遺伝子の相同組換えを促進するために有用である。
【０１０７】
また、本発明は、特定のＤＮＡ配列（たとえば、特定の位置でＤＮＡを切断することができるＴＡＬＥＮ）と相互作用することができる配列特異的ＴＡＬエフェクターを設計する方法も提供する。本方法には、ＴＡＬエフェクターが結合することが所望される標的ヌクレオチド配列（たとえば、内在染色体配列、ミトコンドリアＤＮＡ配列、または葉緑体ＤＮＡ配列）（たとえば、それ内に二本鎖切断を導入することが所望される第２のヌクレオチド配列に隣接する配列）を同定すること、および組み合わせて標的配列と結合する複数のＤＮＡ結合反復を含有する配列特異的ＴＡＬエフェクターを設計することが含まれることができる。本明細書中に記載のように、ＴＡＬエフェクターには、それらがＤＮＡと相互作用する特異性を決定するいくつかの不完全な反復が含まれる。それぞれの反復は、反復の残基１２および１３での特定のジアミノ酸配列に応じて、単一の塩基と結合する。したがって、ＴＡＬエフェクター内の反復を操作することによって（たとえば、標準の技法または本明細書中に記載の技法を使用）、特定のＤＮＡ部位を標的化することができる。そのような操作したＴＡＬエフェクターは、たとえば、特定のＤＮＡ配列を標的とした転写因子として使用することができる。一般的なＴＡＬエフェクターの図が図１Ａに示されており、反復領域は白い四角によって示されており、代表的な反復配列（配列番号１）中のＲＶＤに下線が引いてある。
【０１０８】
ＲＶＤおよびその対応する標的ヌクレオチドの例が表１Ａに示されている（ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０７９４３０号も参照）。
【表１】
2019146582.tif 000002
【０１０９】
他のＲＶＤおよびその対応する標的ヌクレオチドが表１Ｂに示されている。
【表２】
2019146582.tif 000003
【０１１０】
配列特異的なＤＮＡ切断が所望される場合は、たとえば、配列特異的ＴＡＬＥＮを、（ａ）組み合わせて内在染色体ヌクレオチド配列と結合する複数のＤＮＡ結合反復ドメイン、および（ｂ）第２のヌクレオチド配列で二本鎖切断を生じるエンドヌクレアーゼを含有するように設計することができる。そのような配列特異的なＤＮＡ切断は、本明細書中に記載のように、相同組換えを増強させるために有用な可能性がある。ＴＡＬＥＮの他の使用には、たとえばウイルスに対する治療剤としての使用が含まれる。ＴＡＬＥＮは、特定のウイルス配列を標的とする、ウイルスＤＮＡを切断するおよび病原性を低下または消失させるために操作することができる。
【０１１１】
本明細書中で提供されている材料および方法を使用して、特定の遺伝子の配列を標的化された様式で改変することができる。遺伝子は、操作したＴＡＬエフェクターの標的とすることができる複数の配列を含有し得る。しかし、本明細書中に記載のように、特定の標的配列がより有効に標的化され得る。たとえば、実施例９に記載のように、特定の特徴を有する配列は、ＴＡＬエフェクターによってより有効に標的化され得る。したがって、本明細書中で提供されている方法には、特定の基準を満たしている標的配列を同定することが含まれることができる。これらには、ｉ）１５個の塩基の最小の長さかつ５’から３’の配向を有しており、Ｔが５’末端の部位の直前にある、ｉｉ）第１（５’）位置にＴまたは第２位置にＡを有さない、ｉｉｉ）最終（３’）位置がＴで終わり、最後から２番目の位置にＧを有さない、ならびにｉｖ）０〜６３％のＡ、１１〜６３％のＣ、０〜２５％のＧ、および２〜４２％のＴの基本組成を有する配列が含まれる。
【０１１２】
本明細書中に記載のＴＡＬＥＮは一般に二量体として働くため、本明細書中で提供されている方法の一部の実施形態には、上述の基準のうちの少なくとも１つを満たしており、１５〜１８ｂｐによって分離されている、細胞中の第１のゲノムヌクレオチド配列および第２のゲノムヌクレオチド配列を同定することが含まれることができる。一部の事例では、１つのＴＡＬＥＮポリペプチドがそれぞれのヌクレオチド配列と結合することができ、ＴＡＬＥＮ中に含有されるエンドヌクレアーゼが１５〜１８ｂｐのスペーサー内を切断することができる。
【０１１３】
また、本発明は、それ内に所望の核酸が導入されている、遺伝子改変した動物を作製する方法も提供する。そのような方法には、それ内に核酸を導入することが所望される内在染色体標的ＤＮＡ配列を含有する細胞を得るステップと、細胞内にＴＡＬＥＮを導入して内在染色体標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生じるステップと、内在染色体標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同的な配列を含有する外因性核酸を、細胞内に、外因性核酸と内在染色体標的ＤＮＡとの間の相同組換えが起こることを可能にする条件下で導入するステップと、それ内で相同組換えが起こった初代細胞から動物を作製するステップとが含まれることができる。相同的な核酸には、たとえば、相同組換え後に遺伝子を破壊するヌクレオチド配列、相同組換え後に遺伝子を置き換えるヌクレオチド配列、相同組換え後に遺伝子内に点突然変異を導入するヌクレオチド配列、または相同組換え後に調節部位を導入するヌクレオチド配列が含まれることができる。
【０１１４】
また、本明細書中で提供されている方法を使用して、それ内に所望の核酸が導入されている、遺伝子改変した植物を作製することもできる。そのような方法には、それ内に核酸を導入することが所望される内在標的ＤＮＡ配列を含有する植物細胞を得るステップと、ＴＡＬＥＮを導入して内在標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生じるステップと、内在標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同的な配列を含有する外因性核酸を、植物細胞内に、外因性核酸と内在標的ＤＮＡとの間の相同組換えが起こることを可能にする条件下で導入するステップと、それ内で相同組換えが起こった植物細胞から植物を作製するステップとが含まれることができる。
【０１１５】
本明細書中で提供されているＴＡＬＥＮに促進される相同組換え方法によって作製された細胞中のＤＮＡは、そのような方法を経ていない細胞と比較して改変されており、改変されたＤＮＡを含有する細胞は「遺伝子改変した」と呼ばれる。しかし、そのような改変は相同組換えを含み、導入遺伝子のランダム組込みを含まないため、そのような細胞を含有する生物は調節目的のＧＭＯとみなされない場合があることに留意されたい。したがって、遺伝子改変を生じるために本明細書中に記載のＴＡＬＥＮに促進される方法を使用することは、たとえば、標準の調節手順ならびにその関連する時間および費用を回避し得るという点で、有利であり得る。
【０１１６】
本明細書中で提供されている標的化遺伝子組換えの他の方法には、選択されたＤＮＡ標的配列を標的としたＴＡＬＥＮをコードしている核酸分子を細胞（たとえば、植物細胞、昆虫細胞、硬骨魚細胞、または動物細胞）内に導入するステップと、細胞内でのＴＡＬＥＮの発現を誘導するステップと、選択されたＤＮＡ標的配列が突然変異（たとえば、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、または遺伝物質の欠失および挿入両方）を示している組換え細胞を同定するステップとが含まれることができる。また、ドナーＤＮＡを細胞内に導入することもできる。
【０１１７】
一部の実施形態では、単量体ＴＡＬＥＮを使用することができる。本明細書中に記載のＴＡＬＥＮは、典型的には、２つのＴＡＬエフェクタードメインがそれぞれＦｏｋＩ制限酵素の触媒ドメインと融合しており、それぞれの生じるＴＡＬＥＮのＤＮＡ認識部位がスペーサー配列によって分離されており、それぞれのＴＡＬＥＮ単量体と認識部位との結合によりＦｏｋＩが二量体化してスペーサー内に二本鎖切断を生じることが可能となるように、スペーサーを有する二連認識部位にわたる二量体として機能する（たとえばＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６：１５０１を参照）。単量体ＴＡＬＥＮも構築することができるが、単一のＴＡＬエフェクターと、機能するために二量体化を必要としないヌクレアーゼとが融合しているようにする。たとえば、１つのそのようなヌクレアーゼは、２つの単量体が単一のポリペプチドとして発現される、ＦｏｋＩの単鎖変異体である（Ｍｉｎｃｚｕｋら（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３６：３９２６〜３９３８）。また、他の天然に存在するまたは操作した単量体ヌクレアーゼもこの役割を果たすことができる。単量体ＴＡＬＥＮに使用されるＤＮＡ認識ドメインは、天然に存在するＴＡＬエフェクターに由来することができる。あるいは、ＤＮＡ認識ドメインは、特定のＤＮＡ標的を認識するように操作することができる。操作した単鎖ＴＡＬＥＮは、１つの操作したＤＮＡ認識ドメインしか必要としないため、構築および配置がより容易であり得る。
【０１１８】
一部の実施形態では、二量体ＤＮＡ配列特異的ヌクレアーゼは、２つの異なるＤＮＡ結合ドメイン（たとえば、１個のＴＡＬエフェクター結合ドメインおよび別の種類の分子からの１個の結合ドメイン）を使用して作製することができる。上述のように、本明細書中に記載のＴＡＬＥＮは、典型的には、スペーサーを有する二連認識部位にわたる二量体として機能する。このヌクレアーゼ構造は、たとえば１個のＴＡＬＥＮ単量体および１個のジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体から作製した標的特異的なヌクレアーゼにも使用することができる。そのような事例では、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体のＤＮＡ認識部位は、適切な長さのスペーサーによって分離されていることができる。２つの単量体の結合により、ＦｏｋＩが二量体化してスペーサー配列内に二本鎖切断を生じることを可能にすることができる。また、ホメオドメイン、ｍｙｂ反復またはロイシンジッパーなどのジンクフィンガー以外のＤＮＡ結合ドメインも、ＦｏｋＩと融合させて、機能的ヌクレアーゼを作製するためのＴＡＬＥＮ単量体とのパートナーとして役割を果たすことができる。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクターを使用して、他のタンパク質ドメイン（たとえば非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）を特定のヌクレオチド配列に対して標的化させることができる。たとえば、ＴＡＬエフェクターは、それだけには限定されないが、ＤＮＡ相互作用酵素（たとえば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポサーゼ、もしくはリガーゼ）、転写活性化因子もしくはリプレッサー、またはヒストンなどの他のタンパク質と相互作用するもしくはそれを修飾するタンパク質からのタンパク質ドメインと連結されていることができる。そのようなＴＡＬエフェクター融合体の応用には、たとえば、後成的調節要素を作製または改変すること、ＤＮＡ中に部位特異的な挿入、欠失、または修復を行うこと、遺伝子発現を制御すること、およびクロマチン構造を改変することが含まれる。
【０１２０】
一部の実施形態では、標的配列のスペーサーは、ＴＡＬＥＮの特異性および活性を変調させるために選択または変動させることができる。スペーサーを有する二連認識部位にわたる二量体として機能するＴＡＬＥＮの、本明細書中に提示した結果は、ＴＡＬＥＮが様々なスペーサー長にわたって機能することができ、ＴＡＬＥＮの活性がスペーサー長に伴って変動することを実証している。たとえば以下の実施例６を参照されたい。スペーサー長の柔軟性は、高い特異性で特定の配列（たとえばゲノム中のもの）を標的化するようにスペーサー長を選択できることを示している。さらに、様々なスペーサー長で観察される活性の変動は、所望のレベルのＴＡＬＥＮ活性を達成するためにスペーサー長を選択できることを示している。
【０１２１】
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮ活性は、ＤＮＡ結合ドメイン（複数可）内の反復の数および組成を変動させることによって変調させることができる。たとえば、本明細書中の実施例７に記載のように、ＰｔｈＸｏ１に基づくＴＡＬＥＮはＡｖｒＢｓ３に基づくＴＡＬＥＮよりも高い活性を示した。ＰｔｈＸｏ１は、その反復の数およびＲＶＤ組成がどちらもＡｖｒＢｓ３とは異なる。さらに、これらのタンパク質の天然に存在するＤＮＡ認識部位は、その多様性が、ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ（上記）によって記載されているＴＡＬエフェクターＤＮＡ暗号に基づいて予測されたそのそれぞれの認識配列とは異なる。さらに、いくつかの同じ長さ（１２個のＲＶＤ）であるが異なるＲＶＤ組成を有する誂えのＴＡＬＥＮは、その活性が異なっており、１３個のＲＶＤの誂えのＴＡＬＥＮは、１２個のＲＶＤの誂えのＴＡＬＥＮよりも高い活性を有していた。したがって、ＴＡＬＥＮは、対象のＤＮＡ配列を認識するように操作できるだけでなく、（１）活性を変調させるために反復の数を変動させることができる、（２）様々なレベルの活性を達成するために様々な結合部位を選択することができる、ならびに（３）ＴＡＬＥＮ活性を変調させるためにＲＶＤの組成および標的部位に対するその当てはめ（暗号に従う）を変動させることができる。
【０１２２】
ＴＡＬＥＮがヘテロ二量体である場合、たとえば、それぞれＴＡＬエフェクタードメインおよびＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインが含まれる２つの異なる単量体を有する場合、ＲＶＤは、２つのＴＡＬエフェクタードメインのそれぞれ中で等しい数で見つけることができるか、または、それぞれのドメインは異なる数のＲＶＤを示すことができる。たとえば、合計２２個のＲＶＤがＤＮＡを特定のヘテロ二量体ＴＡＬＥＮと結合させるために使用されている場合は、２つのＴＡＬエフェクタードメインのそれぞれ中で１１個の反復を見つけることができるか、あるいは、２つのＴＡＬエフェクタードメインのうちの一方で１０個の反復および他方中で１２個を見つけることができる。また、本発明には、単量体として機能するＤＮＡ修飾酵素ドメインを有するＴＡＬＥＮも包含される。この場合、単量体酵素と融合している単一のＴＡＬエフェクタードメイン中ですべてのＲＶＤを見つけることができる。この場合、効率的な結合にするためには、ＲＶＤの数が等価な二量体ＴＡＬＥＮ中で見つかるであろうＲＶＤの合計数に等しくなければならない。たとえば、２つの異なるＴＡＬエフェクタードメイン上に１０個の反復を有する代わりに（二量体ＴＡＬＥＮの場合のように）、単一のＴＡＬエフェクタードメイン中に２０個の反復を有する（単量体ＴＡＬＥＮの場合のように）。
【０１２３】
本発明のさらなる態様では、二量体または単量体ＴＡＬＥＮ内の反復の合計数は少なくとも１４である。本発明の別のさらなる態様では、二量体または単量体ＴＡＬＥＮ内の反復の合計数は少なくとも２０である。本発明の別のさらなる態様では、二量体または単量体ＴＡＬＥＮ内の反復の合計数は少なくとも２４である。本発明の別のさらなる態様では、二量体または単量体ＴＡＬＥＮ内の反復の合計数は少なくとも３０である。
【０１２４】
また、本特許出願は、標的ＤＮＡに対して増強された標的化能力を有するＴＡＬエフェクタータンパク質を作製する方法も提供する。本方法には、たとえば、それぞれのＤＮＡ結合反復が標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含有し、かつ標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っている、複数のＤＮＡ結合反復を有するＤＮＡ結合ドメインを有するＴＡＬエフェクターをコードしている核酸を作製することが含まれることができる。以下の実施例１２に記載のように、結合部位の−１位でのＴの必要性を緩めることで、操作したＴＡＬエフェクタータンパク質の標的化能力を増強させ得る。したがって、ＴＡＬエフェクターをコードしている核酸の作製には、Ａ、Ｃ、またはＧに対する特異性を有する変異第０ＤＮＡ結合反復配列をコードしている核酸を取り込ませ、したがって結合部位の−１位でのＴの必要性を排除することが含まれることができる。
【０１２５】
さらに、標的ＤＮＡに対して増強された標的化能力を有するＴＡＬエフェクターを作製する方法が本明細書中で提供されている。そのような方法には、それぞれの反復が標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含有する、複数のＤＮＡ結合反復を有するＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬエフェクターをコードしている核酸を作製することが含まれることができる。以下の実施例１２に記載のように、ＮＮ（Ｇを認識する最も一般的なＲＶＤ）の特異性は一般に弱く、コンテキストに伴って変動する場合があるように見えるが、特定のＲＶＤはＧに対して増強された特異性を有し得る。したがって、本明細書中で提供されている方法には、Ｇに対してより頑強な特異性を有し得る代替のＲＶＤを使用することが含まれることができる。たとえば、ＲＮ、Ｒ＊、ＮＧ、ＮＨ、ＫＮ、Ｋ＊、ＮＡ、ＮＴ、ＤＮ、Ｄ＊、ＮＬ、ＮＭ、ＥＮ、Ｅ＊、ＮＶ、ＮＣ、ＱＮ、Ｑ＊、ＮＲ、ＮＰ、ＨＮ、Ｈ＊、ＮＫ、ＮＹ、ＳＮ、Ｓ＊、ＮＤ、ＮＷ、ＴＮ、Ｔ＊、ＮＥ、ＮＦ、ＹＮ、Ｙ＊、およびＮＱからなる群から選択される１つまたは複数のＲＶＤを使用することができ、星印はＲＶＤの第２位置でのギャップを示す。
【０１２６】
製品
また、本発明は、たとえば、ＴＡＬＥＮをコードしている核酸分子、ＴＡＬＥＮポリペプチド、そのような核酸分子もしくはポリペプチドを含有する組成物、またはＴＡＬエンドヌクレアーゼを操作した細胞系を含有する製品も提供する。そのような物品は、たとえば、研究ツールとして、または治療的に使用することができる。
【０１２７】
一部の実施形態では、製品には、本明細書中で提供されている方法を使用して作製した植物からの種子が含まれることができる。種子は、当分野で知られている手段を使用して調整し、当分野で周知の梱包材料を使用して梱包して、製品を調製することができる。種子の梱包は、ラベル、たとえば、梱包材料に固定されたタグもしくはラベル、梱包材料上に印刷されたラベルまたは梱包内に挿入されたラベルを有することができる。ラベルは、梱包内に含有された種子が遺伝子改変した植物の作物を生じることができることを示すことができ、改変していない植物に対して遺伝子改変によって変更されている特色を記載することができる。
【０１２８】
他の定義
ポリペプチド配列中のアミノ酸残基またはサブユニットは、本明細書中で一文字のコードに従って命名されており、たとえば、ＱはＧｌｎまたはグルタミン残基を意味し、ＲはＡｒｇまたはアルギニン残基を意味し、ＤはＡｓｐまたはアスパラギン酸残基を意味する。
【０１２９】
アミノ酸置換とは、１個のアミノ酸残基を別のもので置き換えることを意味し、たとえば、ペプチド配列中のアルギニン残基をグルタミン残基で置き換えることはアミノ酸置換である。
【０１３０】
ヌクレオチドは以下のように命名されている：一文字のコードがヌクレオシドの塩基を命名するために使用されている：ａはアデニンであり、ｔはチミンであり、ｃはシトシンであり、ｇはグアニンである。縮重ヌクレオチドには、ｒはｇまたはａ（プリンヌクレオチド）を表し、ｋはｇまたはｔを表し、ｓはｇまたはｃを表し、ｗはａまたはｔを表し、ｍはａまたはｃを表し、ｙはｔまたはｃ（ピリミジンヌクレオチド）を表し、ｄはｇ、ａまたはｔを表し、ｖはｇ、ａまたはｃを表し、ｂはｇ、ｔまたはｃを表し、ｈはａ、ｔまたはｃを表し、ｎはｇ、ａ、ｔまたはｃを表す。
【０１３１】
用語「ＤＮＡ修飾酵素」とは、ＤＮＡ修飾のレベルが何であれ（切断、共有的相互作用、水媒介性の相互作用・・・）、細胞の遺伝物質を改変することができる任意のタンパク質をいう。ＤＮＡ相互作用タンパク質（たとえば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポサーゼ、またはリガーゼ）、転写活性化因子またはリプレッサー、ヒストンなどの他のタンパク質、およびヌクレアーゼが、「ＤＮＡ修飾酵素」の意味に含まれることを意図する。ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素内に含まれている場合、ＤＮＡ修飾酵素はＤＮＡ修飾酵素ドメインと呼ばれる。
【０１３２】
用語「ヌクレアーゼ」には、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼが含まれることを意図する。
【０１３３】
用語「エンドヌクレアーゼ」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる、任意の野生型または変異体酵素をいう。エンドヌクレアーゼの非限定的な例には、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、およびＡｌｗＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが含まれる。また、エンドヌクレアーゼは、典型的には約１２〜４５個の塩基対（ｂｐ）の長さ、より好ましくは１４〜４５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を有する場合は、レアカッターエンドヌクレアーゼも含む。レアカッターエンドヌクレアーゼは、定義された座位でのＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによって、ＨＲを有意に増加させる（Ｒｏｕｅｔ、Ｓｍｉｈら、１９９４、Ｒｏｕｅｔ、Ｓｍｉｈら、１９９４、Ｃｈｏｕｌｉｋａ、Ｐｅｒｒｉｎら、１９９５、ＰｉｎｇｏｕｄおよびＳｉｌｖａ、２００７）。レアカッターエンドヌクレアーゼは、たとえば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＰａｑｕｅｓおよびＤｕｃｈａｔｅａｕ、２００７）、操作したジンクフィンガードメインとＦｏｋＩなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合から生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（ＰｏｒｔｅｕｓおよびＣａｒｒｏｌｌ、２００５）、または化学エンドヌクレアーゼ（Ｅｉｓｅｎｓｃｈｍｉｄｔ、Ｌａｎｉｏら、２００５、Ａｒｉｍｏｎｄｏ、Ｔｈｏｍａｓら、２００６、Ｓｉｍｏｎ、Ｃａｎｎａｔａら、２００８）であることができる。化学エンドヌクレアーゼでは、化学またはペプチド切断剤は、特定の標的配列を認識する核酸のポリマーまたは別のＤＮＡのどちらかとコンジュゲートされており、したがって、切断活性を特定の配列を標的とする。また、化学エンドヌクレアーゼには、特定のＤＮＡ配列と結合することが知られている、オルトフェナントロリンのコンジュゲートなどの合成ヌクレアーゼ、ＤＮＡ切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）も包含される（ＫａｌｉｓｈおよびＧｌａｚｅｒ、２００５）。そのような化学エンドヌクレアーゼが本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」中に含まれる。そのようなエンドヌクレアーゼの例には、Ｉ−Ｓｃｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｈｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｒｅ  Ｉ、Ｉ−Ｃｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｃｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｌｉ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉ、Ｉ−Ｓｃｅ  ＩＩ、Ｉ−Ｓｃｅ  ＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−Ｃｉｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｃｔｒ  Ｉ、ＰＩ−Ａａｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｂｓｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｈａ  Ｉ、ＰＩ−Ｄｒａ  Ｉ、ＰＩ−Ｍａｖ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｃｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｆｌ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇａ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｇｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｉｎ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｋａ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｌｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｓｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｓｍ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｈ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｔｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｘｅ  Ｉ、ＰＩ−Ｎｐｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｆｕ  Ｉ、ＰＩ−Ｒｍａ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｐｂ  Ｉ、ＰＩ−Ｓｓｐ  Ｉ、ＰＩ−Ｆａｃ  Ｉ、ＰＩ−Ｍｊａ  Ｉ、ＰＩ−Ｐｈｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔａｇ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｈｙ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｋｏ  Ｉ、ＰＩ−Ｔｓｐ  Ｉ、Ｉ−ＭｓｏＩが含まれる。
【０１３４】
本発明によるエンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の一部であることができる。
【０１３５】
「ＴＡＬＥＮ」とは、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意図し、両方のドメインの融合が「単量体ＴＡＬＥＮ」をもたらす。一部の単量体ＴＡＬＥＮはそれ自体で機能的な場合があり、他のものは別の単量体ＴＡＬＥＮとの二量体化を必要とする。二量体化は、両方の単量体ＴＡＬＥＮが同一である場合にホモ二量体ＴＡＬＥＮをもたらす可能性があるか、または、単量体ＴＡＬＥＮが異なる場合にヘテロ二量体ＴＡＬＥＮをもたらす可能性がある。２つの単量体ＴＡＬＥＮは、たとえば、そのＲＶＤの数が異なるおよび／または少なくとも１つのＲＶＤの内容（すなわちアミノ酸配列）が異なる場合に、異なる。「ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素」とは、転写活性化因子様エフェクター結合ドメインおよびＤＮＡ修飾酵素ドメインを含むタンパク質を意図する。
【０１３６】
「変異体」とは、「変異体」タンパク質、すなわち、自然には天然に存在せず、遺伝子操作またはランダム突然変異誘発によって得られるタンパク質、すなわち操作したタンパク質を意図する。この変異体タンパク質は、たとえば、野生型の天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基を異なるアミノ酸で置換することによって得ることができる。前記置換（複数可）は、たとえば部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発によって導入することができる。
【０１３７】
「細胞」または「複数の細胞」とは、任意の原核または真核の、生細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のためにこれらの生物から誘導した細胞系、動物もしくは植物起源の初代細胞を意図する。
【０１３８】
「初代細胞」または「複数の初代細胞」とは、非常に少ない回数の集団倍加しか受けておらず、したがって、連続的な腫瘍原性細胞または人工的に不死化した細胞系と比較してそれらが由来する組織の主な機能的構成要素および特徴をより表している、生組織から直接採取（すなわち生検材料）し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長のために確立させた細胞を意図する。したがって、これらの細胞は、それらが指すｉｎ  ｖｉｖｏ状態に対するより価値のあるモデルを表す。
【０１３９】
「相同的」とは、配列間の相同組換えをもたらすために十分な別の配列との同一性を有する、より具体的には、少なくとも９５％の同一性、好ましくは９７％の同一性、より好ましくは９９％を有する配列を意図する。
【０１４０】
「同一性」とは、２つの核酸分子またはポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、比較の目的のためにアラインメントし得るそれぞれの配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較した配列中の位置が同じ塩基によって占有されている場合は、分子はその位置で同一である。核酸またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の度合は、核酸配列によって共有される位置での同一または一致するヌクレオチドの数の関数である。たとえば初期設定で使用することができるＧＣＧ配列解析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）の一部として利用可能なＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴを含めた、様々なアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用して、２つの配列間の同一性を計算し得る。
【０１４１】
「突然変異」とは、ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ、遺伝子）またはポリペプチド配列中の１つまたは複数のヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図する。前記突然変異は、遺伝子またはその調節配列のコード配列に影響を与える場合がある。また、これは、ゲノム配列の構造またはコードされているｍＲＮＡの構造／安定性にも影響を与え得る。
【０１４２】
「遺伝子」とは、染色体に沿って直線的に配置されているＤＮＡのセグメントからなり、特定のタンパク質またはタンパク質のセグメントをコードしている、遺伝の基本単位を意味する。遺伝子には、典型的には、プロモーター、５’非翻訳領域、１つまたは複数のコード配列（エクソン）、任意選択でイントロン、３’非翻訳領域が含まれる。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサーおよび／またはサイレンサーをさらに含み得る。
【０１４３】
用語「対象の遺伝子」とは、既知または推定上の遺伝子産物をコードしている任意のヌクレオチド配列をいう。
【０１４４】
本明細書中で使用する用語「座位」とは、染色体上のＤＮＡ配列（たとえば遺伝子のもの）の特定の物理的位置である。用語「座位」とは、通常、染色体上の標的配列の特定の物理的位置をいう。
【０１４５】
「融合タンパク質」とは、元は別々のタンパク質をコードしている２つ以上の遺伝子を結合させることからなる当分野の周知のプロセスの結果を意図し、前記「融合遺伝子」の翻訳の結果、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドがもたらされる。
【０１４６】
「触媒ドメイン」とは、酵素の活性部位を含有する、酵素のタンパク質ドメインまたはモジュールを意図する。活性部位とは、基質の触媒作用がそこで起こる、前記酵素の部分を意図する。酵素だけでなくその触媒ドメインは、それらが触媒する反応に従って分類および命名される。酵素番号（ＥＣ番号）とは、それらが触媒する化学反応に基づく、酵素の数値分類スキームである（ワールドワイドウェブｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／）。本発明の範囲では、任意の触媒ドメインをパートナーとして使用し、ＴＡＬエフェクタードメインと融合させてキメラ融合タンパク質を作製して、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素をもたらすことができる。そのような触媒ドメインの非限定的な例は、ＭｍｅＩ、ＥｓａＳＳＩＩ、ＣｓｔＭＩ、ＮｕｃＡ、ＥｎｄＡ大腸菌、ＮｕｃＭ、ＥｎｄＡ肺炎連鎖球菌、ＳＮａｓｅ黄色ブドウ球菌、ＳＮａｓｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ、ＳＮａｓｅフレクスナー赤痢菌、枯草菌ｙｎｃＢ、エンドデオキシリボヌクレアーゼＩ腸内細菌ファージＴ７、ＥｎｄｏＧウシ、ｔｔＳｍｒ  ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ｍｕｔＳ、Ｍｅｔｎａｓｅの切断ドメインのものであることができる。
【０１４７】
別段に指定しない限りは、本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養物、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣用技術を用い、これらは十分に当分野の技術範囲内にある。そのような技法は文献中で完全に説明されている。たとえば、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ａｕｓｕｂｅｌ、２０００、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｓｏｎ  Ｉｎｃ、米国議会図書館、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、米国特許第４，６８３，１９５号、核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＨａｒｒｉｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）、転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）、動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）、固定細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ、分子クローニングの実用的な指針（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８４）、シリーズ酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（ＡｂｅｌｓｏｎおよびＳｉｍｏｎ編集長、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、特に第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）ならびに第１８５巻、「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（Ｇｏｅｄｄｅｌ編）、哺乳動物細胞の遺伝子転移ベクター（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ）（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、細胞および分子生物学における免疫化学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）、実験免疫学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第Ｉ〜ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）、ならびにマウス胚の操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ）、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８６）を参照されたい。
【０１４８】
本発明の上記明細書は、任意の当業者による本発明の作製および使用が可能となるようにそれを作製および使用する様式およびプロセスを提供し、この可能にすることは、元の説明の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために特に提供されている。
【０１４９】
上記で使用するように、語句「からなる群から選択される」、「から選択される」などには、指定した物質の混合物が含まれる。
【０１５０】
数値の限界または範囲が本明細書中に記述されている場合は、端点が含まれる。また、数値の限界または範囲内のすべての値および部分範囲は、明確に書き出されている場合と同様に具体的に含まれる。
【０１５１】
上記説明は、当業者が本発明を作製および使用することを可能にするために提供されており、特定の応用およびその要件のコンテキストで提供されている。好ましい実施形態への様々な改変は当業者に容易に明らかであり、本明細書中に定義した一般的な原理は、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、他の実施形態および応用に適用し得る。したがって、本発明は、示されている実施形態に限定されず、本明細書中に開示した原理および特長と一貫性のある最も広い範囲に従うことを意図する。
【０１５２】
本発明を一般に説明したが、さらなる理解は、例示の目的でのみ本明細書中で提供されている特定の具体的な実施例を参照して得ることができ、本発明は、別段に指定しない限りは特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定しない、以下の実施例中にさらに記載されている。
【実施例】
【０１５３】
【実施例１】
【０１５４】
暗号がＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ認識を支配する
ＴＡＬ標的部位中のＲＶＤと近接したヌクレオチドとの間に１対１の直線的な対応が存在するかどうかを決定するために、１０個のＴＡＬエフェクターのそれぞれの既知の標的遺伝子の予測されたプロモーター領域（すなわち注釈付けされた翻訳開始部位の直前の１，０００ｂｐ）を、ＴＡＬエフェクターのＲＶＤ配列を用いて、ＲＶＤ−ヌクレオチドの会合においてエントロピー（ランダム性）を最小限にしたアラインメントについて走査した。以下の式を使用してエントロピーを定量し、Ｒは、エフェクターのＲＶＤの組であり、Ｄは、４個のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の組であり、ｆｉ，ｊは、第ｉ番目のＲＶＤが第ｊ番目のヌクレオチドと会合する観察された頻度を表す：
【化１】
2019146582.tif 000004
【０１５５】
複数の低エントロピー部位がそれぞれのプロモーター中に存在していた。しかし、エフェクターＡｖｒＢｓ３では、１つのみが活性化に十分かつ必要であると以前に同定された５４ｂｐのｕｐａ２０プロモーター断片にマッピングされ、これは、ＡｖｒＢｓ３によって直接活性化された遺伝子に一般的なＵＰＡボックスと一致した（Ｋａｙら、上記）。また、エフェクターＰｔｈＸｏ１およびＡｖｒＸａ２７では、１つの部位のみが、そのそれぞれの標的であるＯｓ８Ｎ３およびＸａ２７の活性化された対立遺伝子と活性化されなかった対立遺伝子との間の多型にそれぞれ重複していた。これら３つの部位でのアラインメントにわたってＲＶＤ−ヌクレオチドの会合は一貫していたため、残りのアラインメントをこれらの会合に基づいて選択し、その結果、１対のＴＡＬエフェクター−標的あたり正確に１つの部位がもたらされた（図１Ｂおよび表２）。それぞれの部位にはＴが先行している（図１Ｄ）。
【０１５６】
ＲＶＤ−ヌクレオチドの会合によって与えられた特異性を評価するために、最初に、１０個の最小限のエントロピーのＴＡＬエフェクター−標的部位のアラインメントにわたって観察されたすべてのＲＶＤ−ヌクレオチドの会合の頻度に基づいて重量マトリックスを作成した（図１Ｂ）。その後、重量マトリックスを使用して、コメ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｐｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ  ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ（Ｏｓａ１、リリース６．０、ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ）におけるそれぞれの非冗長遺伝子モデルの翻訳開始に先行する１，０００ｂｐのプロモーター領域を、コメの病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅの５個のＴＡＬエフェクター（ＡｖｒＸａ２７、ＰｔｈＸｏ１、ＰｔｈＸｏ６、ＰｔｈＸｏ７、およびＴａｌ１ｃ）に対する最良の一致について走査した。ＡｖｒＸａ２７には、Ｘａ２７（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＹ９８６４９２）の上流の配列を含めた。この上流配列はＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ中には存在しない。観察された会合頻度は９０％で重み付けされ、残りの１０％はすべての可能な会合の頻度に均等に分布していた。アラインメントは重量マトリックススコア（ｙ軸）を使用して順位付けし、図１ＢのＲＶＤ−ヌクレオチドの会合頻度に由来する頻度スコアの負の対数としてとった。したがって、スコアが低ければ低いほど、一致はより良好である。ＰｔｈＸｏ１、ＰｔｈＸｏ６、ＰｔｈＸｏ７、およびＴａｌ１ｃでは、実験的に同定した標的遺伝子が最良またはほぼ最良の一致であった。より良好な一致には、Ｔが先行していなかったか、標的を同定するために使用したマイクロアレイ上に表されていなかったか、またはイントロンおよびＥＳＴの証拠を欠いていなかった。既知の標的に対する逆相補プロモーター配列の走査は、順方向の部位よりも良好なスコアのアラインメントを与えなかった。この結果は、ＴＡＬエフェクターがプラス鎖と結合することを暗示しているのではなく、これらがプラス鎖に対して順方向の配向で機能することを示している。５個目のエフェクターＡｖｒＸａ２７の既知の標的は疾患耐性遺伝子Ｘａ２７である（Ｇｕら、上記）。この一致の順位（５，３６８）がより低いことは、較正したまたは最近および最適以下の宿主の適応を反映している可能性がある。より良好なスコアの部位は、病因についてＡｖｒＸａ２７によって標的化されている遺伝子を含む可能性が高い。
【０１５７】
重量マトリックスを再度使用して、すべてのコメプロモーターを４０個の追加のＸ．ｏｒｙｚａｅのＴＡＬエフェクターで走査し、公的マイクロアレイデータ（ＰＬＥＸｄｂ．ｏｒｇ、受託ＯＳ３）に基づいて感染中に下流遺伝子が活性化された最良のアラインメントのものを保持することによって、１０個の追加のアラインメントが得られた（表３）。初期の組と同様、Ｔがそれぞれの部位に先行しており、どの逆鎖の部位もより良好なスコアではなかった。合計２０個のアラインメントのＲＶＤ−ヌクレオチドの会合頻度が図１Ｃに示されている。これらは、驚くべきほど単純な暗号を構成している。
【０１５８】
２０個のＴＡＬエフェクターヌクレオチドのアラインメントの拡張組中のＲＶＤ−ヌクレオチドの頻度を使用して新しい重量マトリックスを作成し、コンピュータスクリプトをＰｙｔｈｏｎ  ｖ２．５（ｗｗｗ．ｐｙｔｈｏｎ．ｏｒｇ）によって書いた。スクリプトは、観察されたｖｓ．観察されていないＲＶＤ−ヌクレオチドの会合についてユーザ定義可能な重量因子を用いて、特定のＴＡＬエフェクターとの一致についてＤＮＡ配列の任意のコレクションを走査するために使用することができる。ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ（上記）を参照されたい。
【０１５９】
暗号中にはある程度の縮重が存在する。強力な会合は結合親和性のほとんどを占めるアンカーを表している場合があり、弱い会合は柔軟性の測度を提供する。あるいは、隣接効果が関与している場合がある。後者の可能性は、ＲＶＤの両側に条件付けられたすべてのＲＶＤのヌクレオチド会合頻度を決定し、それらを観察された全頻度と比較することによって、言い換えれば、ＲＶＤ−ヌクレオチドの対合を左または右に隣接するＲＶＤに従って選別し、そのようにして選別されたそれぞれの対の相対的頻度をその対の全体的な頻度と比較することによって調査した。隣接するものによって選別したＲＶＤ−ヌクレオチドの会合の頻度は観察された全頻度から顕著に逸脱せず、これは、会合がコンテキスト非依存性であることを示唆している。
【０１６０】
２０個の標的部位に隣接する配列によって−１のＴ以外の保存的なヌクレオチドは明らかとならなかったが、この部位に続いてＣが富み、全体的にＧが乏しい傾向にある（図１Ｄ）。いくつかの例外を除いて、部位は注釈付けされた転写開始の６０ｂｐ以内上流に始まり、翻訳開始に８７ｂｐより近いものはない（表２および表３）。ＲＶＤ／ヌクレオチドの会合を支配するさらなる規則は、実施例４および５に記載されている。
【０１６１】
これらの結果を考慮して、ゲノム中のＴＡＬエフェクター標的の予測および標的の新規構築が現在可能である。部位を予測する能力は、疾患に重要な宿主遺伝子の同定をはかどらせる。標的を構築する能力は、保存的または複数のＴＡＬエフェクターに応答性の、耐久性のある耐性遺伝子の設計に期待される。また、本明細書中に記載のように、自由裁量による遺伝子の活性化のためにＴＡＬエフェクターを誂えること、またはＤＮＡ修飾のためにの融合タンパク質を標的化することも可能である。
【表３】
2019146582.tif 000005
【表４】
2019146582.tif 000006
【実施例２】
【０１６２】
ＴＡＬＥＮは酵母中で機能できる
プラスミドの構築：ＴＡＬエフェクター、ＡｖｒＢｓ３のタンパク質コード配列は、プラスミドをＢａｍＨＩで消化することから得られた。主に反復ドメインをコードしているＤＮＡ断片をＳｐｈＩで切り出した。ＡｖｒＢｓ３のアミノ酸配列はＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｐ１４７２７および配列番号１２の下（図３）、核酸配列は受託番号Ｘ１６１３０配列番号１３の下（図４）で見つけることができる。図４中、ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩ部位は太字で下線が引かれている。ＡｖｒＢｓ３のＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩ断片を、ヌクレアーゼ発現ベクターｐＤＷ１７８９＿ＴＡＬ（図５）内に、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをコードしている配列に隣接してクローニングした。ＡｖｒＢｓ３標的部位を標的レポータープラスミド内にクローニングするために、１８ｂｐのスペーサー配列をその間に含んで逆配向に配置された２つのＡｖｒＢｓ３認識部位を含有する２つの相補的ＤＮＡオリゴを、５’および３’末端でそれぞれＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩのオーバーハングを有するように合成した。６、９、１２および１５ｂｐのスペーサー長を用いて、認識部位を有する他のレポータープラスミドを作製した。アニーリングさせたＤＮＡオリゴをレポータープラスミドｐＣＰ５内にクローニングし（図６）、これをＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで消化した。
【０１６３】
酵母アッセイ：標的レポータープラスミドを酵母株ＹＰＨ４９９（ＭＡＴ  ａ株）内に形質転換させ、形質転換体を、トリプトファンを欠く合成完全培地（ＳＣ−Ｗ）上で選択した。ＴＡＬＥＮ発現プラスミドをＹＰＨ５００（ＭＡＴ  α株）内に形質転換させ、形質転換体を、ヒスチジンを欠くＳＣ培地（ＳＣ−Ｈ）上にプレートした。標的レポータープラスミドを保有する酵母コロニーおよびＴＡＬＥＮ発現プラスミドを保有するコロニーを、終夜、３０℃で、それぞれ液体ＳＣ−ＷおよびＳＣ−Ｈ培地中で培養した。培養物を同じＯＤ６００に調節し、それぞれの２００μｌを２００μｌのＹＰＤ培地に混ぜた。混合物を３０℃で４時間インキュベーションして、２種類の酵母株を接合させた。混合培養物を遠心沈殿させ、５ｍｌのＳＣ−Ｗ−Ｈ培地中に３０Ｃで終夜、またはＯＤ６００が０．５〜１の範囲に達成するまで再懸濁させた。細胞を収穫し、定量的β−ガラクトシダーゼアッセイを記載のように行った（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ、４５９：４４２〜４４５）。
【０１６４】
結果：ＴＡＬ−ＦｏｋＩ融合体は、ＴＡＬのＤＮＡ認識ドメインおよび非特異的なＦｏｋＩ  ＤＮＡ切断ドメインからなる部位特異的なヌクレアーゼである。ＴＡＬのＤＮＡ認識ドメインは、様々なＤＮＡ配列と結合するように操作することができる。本明細書中の実施例１に記載のように、ＤＮＡ結合ドメインの新規クラスであるＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識特異性が解読されている。具体的には、ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ配列を認識および結合することができる様々な数のタンデムの３４個のアミノ酸の反復を含有する。反復のアミノ酸配列は、反復の位置１２および１３での２つの隣接する高度に可変性の残基以外は保存的である。これらの位置は一緒になって、ＤＮＡ結合部位中の個々のヌクレオチドを１つの反復対１個のヌクレオチドで指定する。ＴＡＬＥＮの構造は図７に例示されている。ＴＡＬＥＮは二量体として機能し、それぞれの単量体は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからの非特異的な切断ドメインと融合した、操作されたＴＡＬのＤＮＡ認識反復から構成される。ＤＮＡ認識反復は、対象のゲノム内の標的ＤＮＡ配列と結合するように操作することができる。ＴＡＬヌクレアーゼ単量体は、スペーサー配列によって分離されている２つのＤＮＡ半分部位のうちの１つと結合する。この間隔が、ＦｏｋＩ単量体が二量体化して、半分部位の間のスペーサー配列中に二本鎖ＤＮＡの切断（ＤＳＢ）を生じることを可能にする。
【０１６５】
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ認識ドメインの潜在性を調査するために、ネイティブＴＡＬエフェクターが、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインと融合した場合にヌクレアーゼとして機能できるかどうかを決定するための実験を実施した。ＴＡＬヌクレアーゼ発現構築体および標的レポーター構築体を使用することによって、酵母に基づくアッセイを実施した。図５に例示されているように、ヌクレアーゼ発現構築体の主鎖は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインおよび酵母ＴＥＦ１プロモーターの制御下のＮ末端核移行シグナル（ＮＬＳ）を含有する。様々なＴＡＬエフェクターのクローニングを促進するために、いくつかの制限部位がＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとＮＬＳモチーフとの間に位置している。図６に示されているように、標的レポーター構築体は、コード配列の１２５ｂｐの重複を有する破壊されたｌａｃＺレポーター遺伝子を有する。重複は、ＵＲＡ３遺伝子およびＴＡＬのＤＮＡ結合ドメインによって認識される標的配列（２つの半分部位およびスペーサー配列から構成される）に隣接する。ＴＡＬＥＮが標的部位と結合してＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じる場合、そのような切断は、酵母では、重複するｌａｃＺ配列間の相同組換えによって、一本鎖アニーリングによって主に修復される（Ｈａｂｅｒ（１９９５）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、１７：６０９）。組換えは機能的ｌａｃＺ遺伝子の再構成およびＵＲＡ３の損失（５−フルオロオロト酸耐性を与える）をもたらす。ｌａｃＺ酵素活性を決定することによってＴＡＬＥＮの相対的切断活性を測定した。
【０１６６】
これらの研究では、配列番号１６（図８）に記載のように中央ヌクレアーゼ反復領域を有していたネイティブＴＡＬエフェクター、ＡｖｒＢｓ３を、ヌクレアーゼ発現ベクター内にクローニングし、１８ｂｐのスペーサー配列を有するＡｖｒＢｓ３標的部位（逆配向に配置された２つの結合部位）を標的レポーターベクター内にクローニングした。酵母アッセイは、図９に示されており上述されているスキームを使用して行った。結果は、ＡｖｒＢｓ３ヌクレアーゼプラスミドおよび標的レポータープラスミドの両方で形質転換させた酵母細胞からのｌａｃＺ活性が、標的レポータープラスミドのみを含有していた対照酵母細胞よりも有意に高かった（１５．８倍高い）ことを示した（図１０）。反復ドメインを主にコードしているＳｐｈＩ断片のみで作製したヌクレアーゼ融合体では、活性は観察されなかった。これは、ＤＮＡ結合ドメイン以外の配列がＴＡＬＥＮ活性に必要であることを示した。また、６および９ｂｐのスペーサー長を有するレポータープラスミドも活性を示すことに失敗し、これは、２つの結合部位間の間隔がＦｏｋＩを二量体化させるために重要であることを示している。これらのデータは、ＡｖｒＢｓ３  ＴＡＬヌクレアーゼが、酵母中のその同族標的配列を切断する部位特異的なヌクレアーゼとして機能できることを示している。
【実施例３】
【０１６７】
誂えたＴＡＬＥＮのための、ＴＡＬエフェクター反復のモジュールアセンブリ
それぞれが異なるヌクレオチドを指定する４つの個々のＴＡＬエフェクター反復のそれぞれの、１０２個の塩基対に対応する相補的オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングし、個々にならびにすべての順列の２回および３回の反復の組合せで高コピーの細菌クローニングベクター内にクローニングして、標準の制限消化およびライゲーション技法を使用して４個の単一、１６個の二重、および６４個の三重反復モジュールを得た（たとえば図１１に例示）。所望のＴＡＬエフェクターのコード配列は、適切なモジュールを、特徴的な最後の半反復以外の中央反復領域を欠くｔａｌ１ｃ遺伝子の切断された形態を含有するＧａｔｅｗａｙ−ｒｅａｄｙ高コピー細菌クローニングベクター内に順次導入することによってアセンブルする。たとえば、１８回反復のＴＡＬエフェクターのコード配列は、５個の三重モジュールおよび１個の二重モジュールを切断されたｔａｌ１ｃベクター内に順次導入することによってアセンブルすることができる。
【実施例４】
【０１６８】
ＴＡＬエフェクター反復のモジュールアセンブリのためのシステム
誂えのＴＡＬエフェクターをコードしている遺伝子を作製するためのプラスミドおよび方法を開発した。本明細書中に記載のように、ＴＡＬエフェクターの機能的特異性は反復中のＲＶＤによって決定され、反復およびタンパク質中の他の箇所中の他の多型は稀であり、機能的特異性に関して重要でない。したがって、自由裁量によるＴＡＬエフェクター遺伝子の反復領域を所望のＲＶＤを含有する反復で置き換えることによって、誂えのＴＡＬエフェクター遺伝子を作製した。ＲＶＤの外の反復配列はコンセンサス配列に一致した（以下を参照）。ＴＡＬエフェクター反復をコードしているＤＮＡ断片を、１回、２回、または３回の反復をコードしているモジュール内に順次アセンブルし、元の反復が除去されたＴＡＬエフェクター遺伝子内にモジュールをクローニングした。最後の（半）反復を例外として、それぞれのコードされている反復は、配列ＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＸＸＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧを有していた（配列番号１８、図１２Ａ）。最後の（半）反復は配列ＬＴＰＤＱＶＶＡＩＡＳＸＸＧＧＫＱＡＬＥＳを有していた（配列番号２０、図１２Ｂ）。どちらの配列でも、「ＸＸ」はＲＶＤの位置を示す。モジュール反復中で使用したＲＶＤは、それぞれＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴとの結合を指定するＮＩ、ＨＤ、ＮＮ、およびＮＧであった。以下に記載の実験では、その反復が除去されたＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ株ＢＬＳ２５６のｔａｌ１ｃ遺伝子を、誂えのＴＡＬエフェクター遺伝子を構築するための「主鎖」として使用した。
【０１６９】
本明細書中に記載の方法には、（１）単一反復の開始プラスミドの作製、（２）単一反復モジュールのプラスミドの作製、（３）複数反復モジュールの作製、（４）１回、２回、および３回の反復モジュールのプラスミドの完全な組の作製、ならびに（５）誂えのＴＡＬエフェクターのコード配列のアセンブリの５個の構成要素が含まれていた。
【０１７０】
単一反復の開始プラスミドを作製するために、第１反復の最初の部分および最後の切断された反復の最後の部分以外の反復領域全体を除去するためにｔａｌ１ｃ遺伝子をＭｓｃＩで消化し、再度ライゲーションさせて、ｐＣＳ４８７と命名されたプラスミドがもたらされた（図１３）。生じる遺伝子はＲＶＤ  ＮＩをコードしており、ほとんどのＴＡＬエフェクター遺伝子と同様、反復領域に隣接していた２つのＳｐｈＩ部位を含有していた。この遺伝子はＸｈｏＩ部位を含有していなかった。
【０１７１】
次に、翻訳的にサイレントな突然変異をｐＣＳ４８７内に導入して、コドン１９および２０を中心とするユニークなＸｈｏＩ部位が包含される、ユニークなＰｓｐＸＩ部位を作製した。突然変異は、どちらもアミノ酸配列ＡＬＥＳ（配列番号２２）をコードしているコドン１８〜２１の元のおよび変更されたヌクレオチド配列（それぞれ配列番号２１および配列番号２３）を示す、図１４に示されている。生じるプラスミドはｐＣＳ４８９と命名された。
【０１７２】
さらなる突然変異誘発によって、ＲＶＤ  ＨＤ、ＮＮ、およびＮＧを用いて３つのさらなる構築体を作製して、それぞれｐＣＳ４９０、ｐＣＳ４９１、およびｐＣＳ４９２と命名されたプラスミドを作製した。修飾された反復領域を包含するＳｐｈＩ断片を、ｐＣＳ４８９、ｐＣＳ４９０、ｐＣＳ４９１、およびｐＣＳ４９２から、ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐＥＮＴＲ−Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中で反復領域を含まずにｔａｌ１ｃのＮおよびＣ末端部分のみをコードしたｐＣＳ４８８と命名されたカナマイシン耐性プラスミド（図１５）に移した。この転移は、それぞれｐＣＳ４９３（図１６）、ｐＣＳ４９４、ｐＣＳ４９５、およびｐＣＳ４９６と命名された単一反復の開始プラスミドをもたらした。切断された反復中のＰｓｐＸＩ／ＸｈｏＩ部位はこれらのプラスミド中でユニークに保たれた。ｐＣＳ４８８およびその誘導体のそれぞれ中のＴＡＬエフェクター遺伝子には、原核生物および真核生物中での効率的な翻訳のためにそれぞれシャイン−ダルガノおよびコザック配列が先行していた。
【０１７３】
その後、単一反復モジュールのプラスミドを構築した。４つの選択されたＲＶＤ（ＮＩ、ＨＤ、ＮＮ、およびＮＧ）のそれぞれについて１個のプラスミドを作製した。それぞれのプラスミドは、ＰｓｐＸＩ部位内にライゲーションした際にＸｈｏＩを再構成したがＰｓｐＸＩ部位を再構成しなかった５’適合性の付着末端、ならびにＸｈｏＩおよびＰｓｐＸＩ部位をどちらも再構成した３’適合性の付着末端を有していた。プラスミドは、アニーリングしたオーバーハングを有する合成の相補的オリゴヌクレオチド（図１７Ａ）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−のＰｓｐＸＩ／ＸｈｏＩ部位内にクローニングすることによって作製し、それぞれｐＣＳ５０２（図１７Ｂ）、ｐＣＳ５０３、ｐＣＳ５０４、およびｐＣＳ５０５と命名されたプラスミドがもたらされた。それぞれのプラスミドは、ユニークな再構成されたＰｓｐＸＩ部位での単一反復モジュールの３’末端の追加の反復の導入、または再構成されたＸｈｏＩ部位を使用した反復モジュールの切り出しを可能とした。
【０１７４】
ＮＩ、ＨＤ、ＮＮ、およびＮＧについてそれぞれ１個の追加の単一反復モジュールを作製した。それぞれは、ＰｓｐＸＩ部位内にライゲーションした際にＰｓｐＸＩまたはＸｈｏＩ部位を再構成しなかった５’適合性の付着末端、ＸｈｏＩおよびＰｓｐＸＩ部位をどちらも再構成した３’適合性の付着末端、ならびに内部ＭｓｃＩ部位を破壊した翻訳的にサイレントなヌクレオチド置換を有していた（図１８Ａ）。これらのモジュールは、オーバーハングを有する合成の相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって作製した。これらの追加の単一反復モジュールのうちの任意のものを単一反復モジュールのプラスミド（ｐＣＳ５０２、ｐＣＳ５０３、ｐＣＳ５０４、またはｐＣＳ５０５）のユニークなＰｓｐＸＩ／ＸｈｏＩ部位内にライゲーションすることで、５’接合部で新しいＸｈｏＩ部位はもたらされなかったが、ユニークな３’ＰｓｐＸＩ／ＸｈｏＩ部位の再建がもたられ、それにより、生じるプラスミドをＰｓｐＸＩで切断することによってさらなる追加の反復を導入するために直鎖状にできる。このプロセスの繰返しにより、複数反復を含有するモジュールがもたらされた（図１８Ｂ）。さらに、ＸｈｏＩを使用してそれぞれの複数反復モジュール全体を切り出すことができる。ＭｓｃＩ部位は追加の単一反復モジュール中で破壊されていたため、第１反復中のＭｓｃＩ部位はユニークに保たれ、続く複数反復モジュールのサブクローニングの際に配向を確認するために有用であった。
【０１７５】
追加の単一反復モジュールを単一反復モジュールのプラスミド内に繰り返してクローニングして、単一反復モジュールのプラスミドと共に、すべての可能な１回、２回、および３回の反復モジュールの完全な組を作製し、ｐＣＳ５０２〜ｐＣＳ５８５と命名された合計８４個のプラスミドとした（図１９）。３回より多くの反復（たとえば、４、５、６、７、８、９、１０、または１０回より多くの反復）を含有するモジュールは同じ様式で作製される。
【０１７６】
その後、誂えのＴＡＬエフェクター遺伝子を作製するために任意の反復の配列をｔａｌ１ｃ「主鎖」内にアセンブルするための方法が考案された。本方法には以下のステップが含まれ、これは図２０にも示されている：
（１）第１の所望の反復を有する単一反復の開始プラスミド（それぞれＲＶＤ  ＮＩ、ＨＤ、ＮＮ、またはＮＧをコードしているｐＣＳ４９３、ｐＣＳ４９４、ｐＣＳ４９５、またはｐＣＳ４９５）を選択するステップ、
（２）プラスミドをＰｓｐＸＩで直鎖状にするステップ、
（３）ＸｈｏＩを使用して次の反復（複数可）のモジュールを適切なモジュールプラスミド（ｐＣＳ５０２〜ｐＣＳ５８５）から単離するステップ、
（４）ライゲーションするステップ、
（５）ＭｓｃＩで消化することによって配向を確認し、ベクターに基づくプライマーを使用して配列を３’末端から確認するステップ、および
（６）すべての反復がアセンブルされるまでステップ２〜５を繰り返すステップ。
【実施例５】
【０１７７】
ＴＡＬＥＮのモジュールアセンブリ用プラスミドのライブラリ
本明細書中に記載のＴＡＬＥＮ反復のアセンブリ（たとえば図２０に示したステップを使用）は、増加していく数の反復を含有する数々の中間体プラスミドをもたらす。これらのプラスミドのそれぞれは、ＴＡＬＥＮのモジュールアセンブリ用プラスミド（ｐＭＡＴ）のライブラリが作製されるように保管されている。たとえば、図２１Ａおよび２１Ｂは、示されているヌクレオチド配列を標的とするＴＡＬエンドヌクレアーゼの構築における反復モジュールのアセンブリを示す。図２１Ａでは、ｐＣＳ５１９、ｐＣＳ５２４、ｐＣＳ５３７、ｐＣＳ５５１、ｐＣＳ５８３、およびｐＣＳ５２９と命名されたプラスミドからの反復モジュールを、ｐＣＳ４９３と命名された開始プラスミド中の配列に順次付加して、ｐＭＡＴ５５、ｐＭＡＴ５６、ｐＭＡＴ５７、ｐＭＡＴ５８、ｐＭＡＴ５９、およびｐＭＡＴ６０と命名されたプラスミドがもたらされる。図２１Ｂでは、ｐＣＳ５３０、ｐＣＳ５３３、ｐＣＳ５２２、およびｐＣＳ５４１と命名されたプラスミドからの反復モジュールを、ｐＭＡＴ１と命名されたプラスミド中の配列に順次付加して、ｐＭＡＴ６１、ｐＭＡＴ６２、ｐＭＡＴ６３、およびｐＭＡＴ６４と命名されたプラスミドがもたらされる。
【実施例６】
【０１７８】
誂えたＴＡＬＥＮの作製および試験
実施例４および５に記載のシステムを使用して、ＴＡＬのＤＮＡ認識ドメインを使用して特定のＤＮＡ標的を認識および切断するＴＡＬＥＮを作製した（図２２Ａ）。ＴＡＬＥＮの機能を評価するために、ＬａｃＺ活性がＤＮＡ切断の指標として役割を果たす酵母アッセイを適応させた（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、上記）。このアッセイでは、標的プラスミドおよびＴＡＬＥＮ発現プラスミドを接合によって同じ細胞中で一緒にした。標的プラスミドは、コード配列の１２５ｂｐの重複を有するｌａｃＺレポーター遺伝子有する。重複は、所定のＴＡＬＥＮによって認識される標的部位に隣接する。二本鎖ＤＮＡの切断が標的部位で起こる際、これが重複した配列間の一本鎖のアニーリングによって修復され、それにより、機能的なｌａｃＺ遺伝子が作製され、その発現は定量可能な読取値を提供する標準のβ−ガラクトシダーゼアッセイによって測定することができる（図２２Ａ）。このアッセイは、ＮＨＥＪによって染色体の突然変異を生じる、または高等真核生物において遺伝子編集のために相同組換えを刺激する、ＺＦＮの能力の良好な予測子であることが実証されている（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、上記、およびＺｈａｎｇら（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０７：１２０２８〜１２０３３）。
【０１７９】
２つの十分に特徴づけられたＴＡＬエフェクター、すなわち、コショウの病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａからのＡｖｒＢｓ３およびコメの病原体Ｘ．ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．ｏｒｙｚａｅからのＰｔｈＸｏ１を使用した（Ｂｏｎａｓら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２１８：１２７〜１３６、およびＹａｎｇら（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：１０５０３〜１０５０８）。ＡｖｒＢｓ３のアミノ酸配列はＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｐ１４７２７および配列番号１２の下（図３）、核酸配列は受託番号Ｘ１６１３０および配列番号１３の下（図４）で見つけることができる。ＰｔｈＸｏ１のアミノ酸配列はＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＣＤ５８２４３および配列番号３１の下（図２３）、核酸配列は受託番号ＣＰ０００９６７、遺伝子ＩＤ６３０５１２８、および配列番号３２の下（図２４）で見つけることができる。ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＣＤ５８２４３の下のＰｔｈＸｏ１のアミノ酸配列は、開始コドンの誤った注釈付けが原因で、Ｎ末端で切断されている。完全な配列は図２３中に提示されている。
【０１８０】
ＡｖｒＢｓ３およびＰｔｈＸｏ１の反復ドメインはどちらも保存的なＳｐｈＩ断片内に完全にコードされている（図４および２４）。また、どちらのＴＡＬエフェクターコード遺伝子も、反復ドメインのコード配列ならびにその前の２８７個のアミノ酸およびその後の２３１個のアミノ酸を包含するＢａｍＨＩ制限断片を有する（図４および２４、図２２Ａも参照）。ＢａｍＨＩ断片からはＴＡＬエフェクター転写活性化ドメインが欠けている。ＳｐｈＩ断片およびＢａｍＨＩ断片はどちらも、ヌクレアーゼ発現ベクターｐＦＺ８５中に存在するＦｏｋＩをコードしているＤＮＡ断片と融合させた（図２５）。ＦｏｋＩヌクレアーゼとＡｖｒＢｓ３およびＰｔｈＸｏ１によってコードされているＢａｍＨＩ断片との間の融合タンパク質を図２６および２７、配列番号３３および３４に示す。
【０１８１】
ＦｏｋＩ単量体は切断のために二量体化しなければならないが、２つのＤＮＡ認識部位間の適切なスペーサー長は不明確であった。ジンクフィンガーアレイが４〜７個のアミノ酸のリンカーによってＦｏｋＩから分離されているＺＦＮでは、２つの認識部位の間の典型的なスペーサーは５〜７ｂｐである（Ｈａｎｄｅｌら（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１７：１０４〜１１１）。たとえば、本明細書中で使用したＢａｍＨＩ  ＴＡＬＥＮ構築体中では２３５個のアミノ酸が反復ドメインをＦｏｋＩから分離しているため、ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩ構築体の両方で様々なスペーサー長（６、９、１２、１５、および１８ｂｐ）を使用した。陽性対照としては、マウス転写因子Ｚｉｆ２６８（ＰｏｒｔｅｕｓおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３００：７６３）に由来するＤＮＡ結合ドメインを有する良好に特徴づけられているジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した。陰性対照としては、ＴＡＬエフェクタードメインを触媒的に不活性なＦｏｋＩ変異体と融合させたか、または非同族ＤＮＡ標的に対して試験した。
【０１８２】
２００μｌの終夜培養物中の、ＴＡＬＥＮ発現または標的プラスミドのどちらかを含有する一倍体細胞種を、ＹＰＤ培地中、３０℃で接合させた。４時間後、ＹＰＤ培地を５ｍｌの選択培地で置き換え、終夜、３０℃でインキュベーションした。接合した培養物を溶解し、ＯＮＰＧ基質を加え、９６ウェルプレートリーダーを使用して吸光度を４１５ｎｍで読み取った（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、上記）。β−ガラクトシダーゼレベルを基質切断速度の関数として計算した。１５ｂｐのスペーサーが２つの認識部位を分離している標的レポーター構築体で得られた結果が図２２Ｂに示されている。主に反復アレイをコードしたＳｐｈＩ断片に由来するすべてのヌクレアーゼ発現構築体は、活性を示すことに失敗し、これは、機能には反復アレイ中のものに追加のアミノ酸配列が必要であることを示している（図２２Ｂ）。しかし、ＢａｍＨＩ断片に由来するＡｖｒＢｓ３およびＰｔｈＸｏ１  ＴＡＬＥＮの両方で頑強な活性が観察された（図２２Ｂ）。ＰｔｈＸｏ１  ＴＡＬＥＮの活性はＺＦＮ陽性対照のものに近かった。活性は機能的ＦｏｋＩドメインを必要とし、所定のＴＡＬＥＮによって認識されるＤＮＡ標的に特異的であった。
【０１８３】
また、ＦｏｋＩが最も効率的に二量体化することを可能にするスペーサー長を同定するために、ＴＡＬエフェクター結合部位間の様々な距離（１２〜３０ｂｐの１１個の長さの変異体）を試験するための実験も実施した（図２８Ａ）。どちらの酵素も、一方は１５ｂｐ、他方は２１ｂｐ（ＡｖｒＢｓ３）または２４ｂｐ（ＰｔｈＸｏ１）のどちらかである、２つのスペーサー長の最適条件を示した。ＰｔｈＸｏ１では、１３ｂｐ以上のすべての試験したスペーサー長で活性が観察された。しかし、ＡｖｒＢｓ３の一部のスペーサー長では活性を示されず、スペーサー長が特定のＴＡＬＥＮに重要であることが示唆された。
【０１８４】
上記実験は、スペーサーの両側に反対方向で配置した２つの同一の認識配列と結合するホモ二量体ＴＡＬＥＮの活性を試験した。そのような回文部位はゲノム標的中で自然に起こる可能性が低いため、ＴＡＬＥＮがヘテロ二量体として機能できるかどうかを試験するための実験を実施した。ＡｖｒＢｓ３およびＰｔｈＸｏ１の認識部位を頭から尾部の配向で１５ｂｐのスペーサーの両側に配置した。そのそれぞれの標的に対するＡｖｒＢｓ３およびＰｔｈＸｏ１  ＴＡＬＥＮの個々の活性ならびにＺｉｆ２６８の活性を対照として測定した。陰性対照として、ヘテロ二量体部位の標的部位プラスミドのみを有する酵母培養物をＬａｃＺ活性についてアッセイした。生じるヘテロ二量体ＴＡＬＥＮの活性は、２つのホモ二量体酵素で観察された活性の平均に近かった（図２８Ｂ）。
【０１８５】
自由裁量による染色体配列に対するＴＡＬＥＮを標的とするように反復ドメインをアセンブルできるかどうかを試験するために、以前にＺＦＮを用いた突然変異誘発の標的とされていた２つの遺伝子、すなわちシロイヌナズナからのＡＤＨ１およびゼブラフィッシュからのｇｒｉｄｌｏｃｋを選択した（Ｆｏｌｅｙら（２００９）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、４：ｅ４３４８、およびＺｈａｎｇら、上記）。５’のＴによって先行されており、ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ（上記）によって同定されたＴＡＬエフェクター結合部位に類似のヌクレオチド組成を有する、コード領域中の１２〜１３ｂｐの配列の検索を行った。ＡＤＨ１およびｇｒｉｄｌｏｃｋでは、そのような部位は平均して７〜９ｂｐごとに存在した。４個の１２ｂｐの部位がＡＤＨ１中で選択され（染色体遺伝子配列の位置３６０、４０８、９２８、および９７５）、１個の１３ｂｐの部位がｇｒｉｄｌｏｃｋ中で選択された（染色体遺伝子配列の位置２３５６、図２９Ａ）。ネイティブＴＡＬエフェクターからの最も豊富なＲＶＤ（ＡにはＮＩ、ＣにはＨＤ、ＧにはＮＮ、およびＴにはＮＧ）を使用して、これらの標的を認識するようにＴＡＬエフェクター反復ドメインを構築した。誂えのＴＡＬＥＮを構築するために、実施例４および５に記載のように、これらのＲＶＤを有する反復を個々に合成し、１回、２回、または３回の反復のモジュール内にアセンブルした。これらのモジュールを、元の反復が除去されたｔａｌ１ｃ遺伝子の誘導体内に順次ライゲーションさせ（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、上記）、これらの操作したＴＡＬエフェクターからのＢａｍＨＩ断片を、ｐＦＺ８５中のＦｏｋＩの触媒ドメインをコードしている配列と融合させた（図２５）。シロイヌナズナからのＡＤＨ１およびゼブラフィッシュのｇｒｉｄｌｏｃｋ遺伝子を標的とした５個の誂えのＴＡＬＥＮを作製した。
【０１８６】
生じる誂えのＴＡＬＥＮは、酵母アッセイにおいてホモ二量体ＴＡＬＥＮとして（すなわち、同一のＤＮＡ結合部位が１６〜１８ｂｐのスペーサーの両側に逆の配向で重複していた）試験したが、天然に存在するＤＮＡ標的での切断を指示するためにはヘテロ二量体ＴＡＬＥＮを構築しなければならないことに留意されたい。スペーサー長は、次の隣接する（かつ向かい合う）候補部位の３’末端から、１５ｂｐに最も近い距離に基づいて選択した。１６ｂｐのスペーサーをＡＤＨ１−３６０−１２、ＡＤＨ１−４０８−１２ｒに使用し、１８ｂｐのスペーサーをＡＤＨ１−９２８−１２、ＡＤＨ１−９７５−１２ｒ、およびｇｒｉｄｌｏｃｋ−２３５６−１３ｒに使用した。酵母アッセイは上述のように行った。
【０１８７】
頑強なヌクレアーゼ活性がＡＤＨ１−３６０−１２およびｇｒｉｄｌｏｃｋ−２３５６−１３ｒ  ＴＡＬＥＮで観察された（図２９Ｂ）。ＡＤＨ１−９２８−１２  ＴＡＬＥＮは控えめな活性を有していたが、それでも陰性対照より有意に高かった。陽性結果を与えたそれぞれのＴＡＬＥＮについて、ヌクレアーゼ活性は同族標的に特異的であった。これらの結果は、新規の機能的なＴＡＬＥＮを誂えた反復ドメインのアセンブリによって作製できることを示している。
【実施例７】
【０１８８】
天然に存在する標的およびＴＡＬエフェクターの対はヌクレオチドおよびＲＶＤの組成の全体的および位置的な偏りを示す
ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ（上記）によって分析した２０個の対合した標的およびＴＡＬエフェクターを、全体的な組成の偏りおよびヌクレオチドまたはＲＶＤ頻度に対する位置効果について評価した。部位（プラス鎖上）は一般にＡおよびＣに富み、Ｇに乏しいことが観察された。平均パーセントＡは３１±１６％であった（１単位の標準偏差）。平均パーセントＣは３７±１３％であった。平均パーセントＧは９±８％であり、平均パーセントＴは２２±１０％であった。アラインメントは長さが変動するため、位置効果の分析はそれぞれの末端上の５個の位置に限定された。驚くべきことに、位置１および３でＡが有利およびＴが不利であり、位置Ｎおよび場合によっては位置２でＴが有利である、標的配列中の偏りが明らかであった。Ｇは位置Ｎ−１で特に稀であった。この偏りはエフェクター中の一致するＲＶＤによって反映されており、位置１および３にはＮＩが最も一般的であり、位置１にはＮＧが存在せず、位置Ｎにはほぼ必ずＮＧが存在し、位置Ｎ−１にはＮＮは稀である（図３０）。
【実施例８】
【０１８９】
誂えのＴＡＬエフェクター反復アレイを迅速にアセンブリおよびクローニングするための方法および試薬
Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング方法［Ｅｎｇｌｅｒら（２００８）、上記、およびＥｎｇｌｅｒら（２００９）、上記］は、その認識部位の外側で切断して、複数のＤＮＡ断片を同時に規則的にライゲーションさせるための誂えのオーバーハングを作製する、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（たとえばＢｓａＩ）の能力を用いる。この方法を使用して、単一の反応で、いくつかのＤＮＡ断片を特定の順序でアレイへと融合させ、所望のデスティネーションベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）内にクローニングすることができる（図３１）。
【０１９０】
誂えのＴＡＬエフェクター反復をコードしているアレイをアセンブルするための方法および試薬をＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅシステムに基づいて開発した。ＢｓａＩ部位がＴＡＬエフェクター反復のコード配列の両側に位置している場合は、切断により４ｂｐのオーバーハングによって隣接される反復断片が放出される。切断部位は配列特異的でないため、互い違いにずらす（ｓｔａｇｇｅｒｉｎｇ）ことによって、規則的な相補的オーバーハング（粘着末端）を有する反復クローンを放出させることができ、複数反復アレイの規則的なアセンブリが可能になる。
【０１９１】
５８個のプラスミドのライブラリ（図３２Ａおよび３２Ｂ）を作製して、１０個までの反復単位の「サブアレイ」への同時アセンブリ、次いでこれらのサブアレイのうちの１、２、または３個および最終的な切断された反復の、完全な誂えのアレイへの同時アセンブリを可能にした。組中のそれぞれの断片が４つの最も一般的なＲＶＤであるＨＤ、ＮＧ、ＮＩ、およびＮＮのうちの異なる１つを有する反復モジュールをコードしている、４個の断片の１０個のずらし型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）の組を合成し、テトラサイクリン耐性遺伝子を保有するベクター内にクローニングして、合計４０個のプラスミドとした。それぞれの断片が４つの最も一般的なＲＶＤのうちの異なる１つをコードしている、２０個のアミノ酸の末端切断されたＴＡＬエフェクター反復をコードしたさらに４個の断片を合成し、スペクチノマイシン耐性遺伝子を保有する異なるベクター内にクローニングしてさらに４個のプラスミドを得て、「最終反復プラスミド」と命名した、図３２Ａ）。ずらし型の組中のすべての断片は、ＢｓａＩでの切断にって適切な順序でのアセンブリを可能にする様々な粘着末端を有する断片が放出されるように、ベクター中でＢｓａＩ部位によって隣接されている。すなわち、反復モジュール１の断片の３’末端でのオーバーハングは反復モジュール２の断片の５’末端でのオーバーハングにのみ相補的であり、反復モジュール２の３’末端でのオーバーハングは反復モジュール３の５’末端でのオーバーハングにのみ相補的であり、以下同様である。最終反復プラスミド中の断片は、異なるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ、Ｅｓｐ３Ｉの部位によって隣接されている。以下に記載の１４個の追加のプラスミドを、アセンブルされたサブアレイを受けるためのデスティネーションベクターとして構築した。
【０１９２】
第１のデスティネーションベクター、プラスミドｐＦＵＳ  Ａは、２１回以下の反復（最後の切断された反復を数える）の最終アレイへとアセンブルする、第１の１０回反復サブアレイを受けるために構築した。ｐＦＵＳ  Ａは、ＢｓａＩによる切断によって、片側で第１反復モジュールの５’末端でのオーバーハングに相補的なオーバーハングが作製され、反対側で第１０反復モジュールの３’末端でのオーバーハングに相補的なオーバーハングが作製されるように構築した。そのような最終アレイへとアセンブルする１０回以下の反復の第２のサブアレイを受けるために、デスティネーションベクタープラスミドｐＦＵＳ＿Ｂ１、ｐＦＵＳ＿Ｂ２、ｐＦＵＳ＿Ｂ３、ｐＦＵＳ＿Ｂ４、ｐＦＵＳ＿Ｂ５、ｐＦＵＳ＿Ｂ６、ｐＦＵＳ＿Ｂ７、ｐＦＵＳ＿Ｂ８、ｐＦＵＳ＿Ｂ９、およびｐＦＵＳ＿Ｂ１０を構築し、これらは、ＢｓａＩによって切断された際に、それぞれ第１反復モジュールの５’末端および対応する符番した位置の反復モジュールの３’末端でのオーバーハングに相補的なオーバーハングを有する（たとえば、サブアレイの３’末端のｐＦＵＳ＿Ｂ６のオーバーハングは、位置６の４回反復モジュール断片のオーバーハングに一致する）。ｐＦＵＳ＿ＡおよびｐＦＵＳ＿Ｂシリーズのプラスミド中にクローニングしたアレイは、ベクター中でＥｓｐ３Ｉ部位によって隣接されており、Ｅｓｐ３Ｉを用いた消化によって放出された際、アレイは、反復領域を欠いたＴＡＬＥＮをコードしているデスティネーションベクターｐＴＡＬ内に最終の切断された反復断片と共にそれらが順番にライゲーションされることを可能にする、ユニークな相補的なオーバーハングを有する。Ｅｓｐ３Ｉを用いた切断が、第１の１０回反復サブアレイの５’末端でのオーバーハングに相補的な一端でのオーバーハングおよび最終の切断された反復断片の３’末端でのオーバーハングに相補的な他端でのオーバーハングのおかげで正しい位置および正しい配向での反復アレイの挿入を可能にするように、ｐＴＡＬを構築した（図３３）。
【０１９３】
２２〜３１回反復の最終アレイへとアセンブルする第１および第２の１０回反復サブアレイを受けるために、最終の２つのデスティネーションベクタープラスミド、ｐＦＵＳ＿Ａ３０ＡおよびｐＦＵＳ＿Ａ３０Ｂを構築した。アレイをｐＦＵＳ＿Ｂベクターからの第３のアレイおよびＥｓｐ３Ｉを用いた消化によって同様に放出された最終反復プラスミドからの最終の切断された反復断片と共に順番にｐＴＡＬ内にライゲーションさせることができるよう、Ｅｓｐ３Ｉを用いた消化により適切な相補的オーバーハングを有するアレイが放出されるように、ｐＦＵＳ＿Ａ３０ＡおよびｐＦＵＳ＿Ａ３０Ｂを構築した（図３２）。
【０１９４】
すべてのデスティネーションベクターはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ部位間にクローニングされたＬａｃＺ遺伝子を有しており、組換えのブルー−ホワイトスクリーニングを可能にする。アンピシリン耐性の遺伝子を保有するｐＴＡＬ以外は、すべてのデスティネーションベクターがスペクチノマイシン耐性の遺伝子を保有する。
【０１９５】
これらの試薬を使用して誂えのＴＡＬエフェクター反復アレイを迅速に構築するために、以下の方法を確立した。第１のステップでは、１０回以下の反復の必要なサブアレイの適切な個々のＲＶＤモジュールプラスミドを、適切なデスティネーションベクターと、１本のチューブ中で混合する。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＢｓａＩエンドヌクレアーゼを加え、反応を、ＰＣＲ機械中で、２つの酵素のそれぞれの最適温度である３７℃で５分間および１６℃で１０分間、１０サイクルの間インキュベーションする。その後、ｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによるより短い不完全なアレイのクローニングを防止するために、反応混合物をＰＬＡＳＭＩＤ−ＳＡＦＥ（商標）ヌクレアーゼで処理してすべての直鎖状ｄｓＤＮＡ断片を加水分解し、その後、混合物を使用して化学的にコンピテントな大腸菌細胞を形質転換させる。生じる組換えプラスミドを単離し、正しい構築体を確認する。その後、第２のステップでは、第１のステップからの確認されたプラスミドを適切な最終反復プラスミドおよびｐＴＡＬと混合し、消化およびライゲーション反応サイクルを第１のステップと同様に実施する。最後に、反応生成物を大腸菌内に導入し、完全長の最終アレイ構築体を単離および確認する。このプロトコルは、１人の人によって１週間以内に完了することができる。
【０１９６】
表４Ａ中のＴＡＬＥＮ８５、１０２および１１７、ならびに以下の実施例１４に記載のＴＡＬＥＮ  ＨＰＲＴ−３２５４−１７およびＨＰＲＴ−３２８６−２０ｒの発現構築体を、本実施例中に記載の方法および試薬を使用して作製した。
【０１９７】
ｐＴＡＬ中にクローニングした反復アレイは、反復領域に隣接する保存的なＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して、他のＴＡＬエフェクター遺伝子のコンテキスト内に容易にサブクローニングされる。
【実施例９】
【０１９８】
誂えのＴＡＬＥＮのデータは「規則」およびＲＶＤの数と活性との間の相関について初期の支持を示す
実施例６は、ユニークなＤＮＡ配列を認識できるようにＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインを操作するために実施した実験を記載している。記載のように、これらの誂えのＴＡＬＥＮは、シロイヌナズナＡＤＨ１およびゼブラフィッシュｇｒｉｄｌｏｃｋ遺伝子中の部位を認識した。これらの遺伝子だけでなく、シロイヌナズナからのＴＴ４遺伝子、およびゼブラフィッシュからのテロメラーゼ中の部位を認識するように、追加の誂えのＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを操作した（Ｆｏｌｅｙら、上記、およびＺｈａｎｇら、上記）。これらの誂えのＴＡＬＥＮは、実施例３、４および８に記載の方法を使用して作製した。誂えのＴＡＬＥＮの操作において、観察された組成的および位置的な偏りは、設計原理または「規則」として適応した。最初に、５’のＴによって先行されており、少なくとも１５ｂｐの長さであり、上述の平均と一貫性のあるヌクレオチド組成を有するコード領域中の配列の検索を実施した。具体的には、０〜６３％のＡ、１１〜６３％のＣ、０〜２５％のＧ、および２〜４２％のＴを有する部位のみを選択した。そのような部位は平均して７〜９ｂｐごとに存在した。その後、上述の観察された位置的な偏りに順応した部位を選択した。操作したＴＡＬＥＮの結合によりＦｏｋＩの二量体化が可能となるように、この組から、１５〜１９ｂｐの長さであり、１５〜１８ｂｐによって分離されている、それぞれの遺伝子中の結合部位の２つの対を同定した。モジュールアセンブリ方法（実施例３および４）は、部分的な長さの構築体を生じた。
【０１９９】
それぞれが９回以上の反復のアレイを有する、１６個のヌクレオチドの配列を標的とするように設計された合計２１個の中間体および完全長のＴＡＬＥＮ。これらのＴＡＬＥＮのアミノ酸配列は図３４Ａ〜３４Ｕ（配列番号３５〜５５）に提供されている。これら２１個のＴＡＬＥＮを、実施例２および６に記載の酵母アッセイを使用して、ＤＮＡを切断するその能力について試験した。活性データは図３５に示されており、表４Ａに要約されている。
【０２００】
中間の部分的な長さのＴＡＬＥＮの一部は、ヌクレオチド組成および末端Ｔの規則を破っている標的に対応する。表４Ａは、長さ、これら２つの規則への順応、およびＺＦＮ２６８と比較した活性を、それぞれのＴＡＬＥＮについて示す。結果は、ＲＶＤアレイの長さを増加させることで生じるＴＡＬＥＮの活性が増加するという大きな傾向を明らかにしている。これは、ＤＮＡ標的がｉｎ  ｖｉｖｏで認識可能となる前に必要な最小数のＲＶＤが存在することを示唆している。さらに、規則の順応が重要であると考えられる。検出可能な活性を示さない６個のＴＡＬＥＮのうち、２つが標的の組成の規則に違反しており、２つがＮＧで終わっておらず、別の１つが両方の規則を破っていた（１つが両方の規則に従っていた）。ＺＦＮ２６８の２５％未満の活性を有する８個のＴＡＬＥＮのうちの３個が規則の一方に違反しており、ＺＦＮ２６８の２５〜５０％の活性を有する４個のＴＡＬＥＮのうちの１個がＮＧで終わるＲＶＤ配列を有していなかった。ＺＦＮ２６８の５０％以上の活性を有するＴＡＬＥＮはすべての規則に従っており、同じ長さのＴＡＬＥＮでは、規則を破ったものは従順なアレイよりも一般に低い活性を有していたことに留意されたい。長さに関する全体的な傾向に一致して、規則を破らなかった中間体でも、対応する完全長のＴＡＬＥＮの方がより高い活性を有していた（表４Ａおよび図３５）。同じ標的に対するＴＡＬＥＮ長の相違が原因であるスペーサー長の変動が、この観察に寄与した可能性があるが、スペーサー長のある程度の範囲は耐容される（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、上記）。
【０２０１】
データ中のある程度の複雑さが明らかであった。たとえば、活性は同じ長さの従順なＴＡＬＥＮ間で変動しており、一部の短いアレイは中等度に高い活性を有しており、一部の長い従順なアレイは活性が少ないまたはなかった（表４Ｂ）。それにもかかわらず、提供された結果は、１）一般により多数の反復がより高い活性をもたらす、および２）組成および位置的な偏りの規則の順応が活性に重要であるという結論を支持している。したがって、以下の設計原理を導いた。
【０２０２】
・ＴＡＬエフェクター結合部位は、最小で１５個の塩基の長さであり、５’から３’に配向されており、Ｔが５’末端の部位の直前にあるように設計される。
・部位は第１（５’）位置にＴまたは第２位置にＡを有し得ない。
・部位はＴ（３’）で終わらなければならず、最後から２番目の位置にＧを有し得ない。
・部位の基本組成は指定した範囲内（平均±２単位の標準偏差）でなければならない：Ａは０〜６３％、Ｃは１１〜６３％、Ｇは０〜２５％、およびＴは２〜４２％。
【表５】
2019146582.tif 000007
【表６】
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【実施例１０】
【０２０３】
ヘテロ二量体ＴＡＬＥＮ対は酵母アッセイにおいてその意図する天然に存在する標的配列を切断する
実施例２、６および９のデータは、新規標的ＤＮＡ配列を認識するように誂えのＴＡＬＥＮを操作できることを実証している。ホモ二量体標的部位を認識した個々のＴＡＬＥＮ単量体を使用して、誂えのＴＡＬＥＮの酵母活性データを集めた。すなわち、ＴＡＬＥＮの標的配列を１５〜１８ｂｐのスペーサー両側に逆の配向で重複させた。しかし、内在染色体配列の切断は、一般に、２つの異なる誂えのＴＡＬＥＮがスペーサーの両側の２つの異なる配列を認識することを必要とする。実施例６に記載のように、この能力は、一緒にしたＡｖｒＢｓ３およびＰｔｈＸｏ１  ＴＡＬＥＮについて、酵母アッセイにおいて、対応するキメラ標的部位を使用して実証した。本発明者らは、２つの異なる誂えのＴＡＬＥＮが天然に存在するＤＮＡ配列を認識および切断することができるかどうかを試験した。実施例２に記載の酵母アッセイを使用して、シロイヌナズナＡＤＨ１遺伝子中の２つの異なる標的配列を切断するように設計された誂えのＴＡＬＥＮを、これらの標的に対する活性についてアッセイした。標的部位および対応するＴＡＬＥＮのＤＮＡ配列は図３６Ａに示されている。ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列は図３４に提供されている。酵母アッセイで得られたベータ−ガラクトシダーゼ活性は、図３６Ｂに示されているグラフ中にプロットされている。ＴＡＬＥＮのその天然に存在する標的配列に対する活性は陰性対照よりも有意に高く、これは、内在標的ＤＮＡ配列を認識および切断するためにＴＡＬＥＮを設計できることを示している。
【実施例１１】
【０２０４】
ＴＡＬＥＮはシロイヌナズナ中のネイティブ遺伝子を切断し、不正確な非相同末端結合によって突然変異を導入する
シロイヌナズナＡＤＨ１遺伝子中の標的配列を認識するように設計された活性ＴＡＬＥＮ対のうちの１つを、染色体ＤＮＡを結合、切断および突然変異させることができるかどうかを決定するために試験した。この対（ｐＴＡＬＥＮ６９および７４）を含む個々のＡＤＨ１  ＴＡＬＥＮのそれぞれを、ＴＡＬＥＮを構成的な３５Ｓプロモーターの制御下に置く植物発現ベクターｐＦＺ１４内にクローニングした（Ｚｈａｎｇら、上記）。その後、生じる構築体を、シロイヌナズナのプロトプラスト内に電気穿孔によって導入した。４８時間後、ゲノムＤＮＡを単離し、Ｔｔｈ１１１ｌで消化した。Ｔｔｈ１１１ｌ切断部位は２つのＴＡＬＥＮ認識部位の間のスペーサー配列中に位置する（図３７Ａ）。ＴＡＬＥＮによる染色体ＤＮＡの切断は、不正確な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって突然変異を導入することが予想され、これはＴｔｈ１１１ｌによる切断の失敗をもたらす。その後、ＴＡＬＥＮ認識部位を包含する３７５ｂｐの断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を再度Ｔｔｈ１１１ｌで消化して、ＴＡＬＥＮに媒介されるＮＨＥＪによって改変されなかった残りのゲノムＤＮＡのほとんどを除去する。その後、消化産物をアガロースゲル上に流す。未切断のＰＣＲ産物が観察され、そのような未切断のＰＣＲ産物は、内在標的配列でのヌクレアーゼ活性（この事例ではＴＡＬＥＮ活性）の指標である（Ｚｈａｎｇら、上記）。未切断のＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって分析した。９個の独立したクローンの配列決定により、６個がＮＨＥＪによって導入された突然変異を保有していたことが明らかとなった（図３７Ｂ）。したがって、ＴＡＬＥＮは、内在染色体座位を切断し、ＤＮＡ二本鎖切断および突然変異を導入する。
【実施例１２】
【０２０５】
標的化能力の増強
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ暗号の中核では、４つの最も一般的なＲＶＤは、会合頻度に基づいて４個のヌクレオチドに対して見かけ上１対１の特異性を有する。これは、ＨＤ、ＮＧ、およびＮＩで顕著にそうであるが、ＮＮではその度合がより低い（図１Ｃ）。ＮＮは最も頻繁にはＧと会合するが、ほぼ同じように一般的にＡと、時折ＣまたはＴと会合する。１３個のＲＶＤ配列中の４つの位置にＮＮを有するランダムにアセンブルされたＴＡＬエフェクターでは、人工標的中のすべての対応する位置にＧを持つことで最良の活性が得られた（Ｂｏｃｈら（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２６：１５０９〜１５１２）。Ａは活性を減少させたが消失させず、ＣおよびＴは検出可能な活性を排除した。ＮＮである２４個のＲＶＤのエフェクターＰｔｈＸｏ１の結合部位中の第１位置のみでＧをＣ、Ｔ、またはＡで置換した場合に、活性の劇的な損失が観察された（Ｒｏｍｅｒら（２０１０）Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．、１８７：１０４８〜１０５７）。しかし、これは、はるかにより短いＡｖｒＨａｈ１（１４個のＲＶＤ）がＡとアラインメントするＮＮで始まり、２３個のＲＶＤのエフェクターＰｔｈＸｏ６が位置４〜６にそれぞれＡとアラインメントするＮＮを連続して３個有するが、これらのタンパク質はどちらの活性が高いという観察と対照的であった（Ｓｃｈｏｒｎａｃｋら（２００８）Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．、１７９：５４６〜５５６、およびＲｏｍｅｒら、上記を参照）。したがって、Ｇに対するＮＮの特異性は一般に弱いと考えられ、コンテキストに伴って変動する場合がある。
【０２０６】
チミンがＴＡＬエフェクター標的部位の直前にあるという観察された不変性は、いくつかのエフェクターの要件である［Ｂｏｃｈら、上記、Ｒｏｍｅｒら、上記、およびＲｏｍｅｒら（２００９）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５０：１６９７〜１７１２］。高度に保存的な、ＴＡＬエフェクター中の反復領域の直前のアミノ酸配列は（図３８Ａ）、アミノ酸配列および予測された二次構造のどちらにおいても、反復と顕著な類似度を共有する（図３８ＢおよびＢｏｄｇａｎｏｖｅら（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．、１３：３９４〜４０１）。「第０」反復と呼ばれるこの配列が、結合部位の−１位にＴが必要であること根拠であり、ＲＶＤに類似の位置中の残基（図３８Ｂ）がヌクレオチドを指定するという仮説が立てられた。
【０２０７】
これらの発見に基づいて、Ｇに対して高い特異性を有する反復を取り込ませることによって、および−１でのＴの必要性を緩めることによって、操作したＴＡＬエフェクタータンパク質の標的化能力を増強できると仮説が立てられた。ＮＮが表示するよりも頑強なＧに対する特異性について新規かつ稀なＲＶＤを試験するため、および第０反復のＲＶＤに類似の残基を一般的なＲＶＤで置き換えるための実験を開始した。
【０２０８】
Ｇに対する頑強な特異性のための新規かつ稀なＲＶＤ：上記開示したモジュール（たとえば実施例４を参照）では、４つのヌクレオチド塩基（それぞれＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）との結合を指定するために４つの特定のＲＶＤ（ＮＩ、ＨＤ、ＮＮ、およびＮＧ）を使用した。他のＲＶＤを含有する反復も有用で有り得、これらはＮＩ、ＨＤ、ＮＮ、およびＮＧと比較して４つの塩基に対して増加した特異性および／または親和性を有し得る。Ｇに対する特異性を改善させることに向けては、新規かつ稀なＲＶＤをコードしているいくつかの反復を構築した。稀なＲＶＤ  ＮＫ、ＨＮ、およびＮＡはＧと会合し、これは、Ｎが残基のうちの一方または他方として重要であり得ることを示唆している（図１Ｃ）。したがって、表５に示されているＲＶＤを有する反復をコードしている幅広い誘導体の組を構築した。左の列は、位置１２に極性アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、またはＹ）および位置１３にＮを有するＲＶＤを記載している。右の列は、ＲＶＤの第１位置のＮと第２位置の１７個の他のアミノ酸のうちの任意のもの（Ｇ、Ｌ、Ｖ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｔ、Ｍ、Ｃ、Ｐ、Ｙ、Ｗ、またはＦ）との組合せを記載している。Ｎを含まないより高い特異性の可能性を考慮するために、位置１２に極性アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、またはＹ）および位置１３にギャップ（＊）を用いた反復も作製した（中央の列）。
【０２０９】
新規人工ＲＶＤは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける、ＧＵＳもしくは二重ルシフェラーゼレポーターに基づくＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに媒介される一過性発現アッセイなどの、ＴＡＬエフェクターの転写活性化活性のための定量的レポーター遺伝子に基づくアッセイ、または上述の出芽酵母におけるｌａｃＺレポーターに基づくＴＡＬＥＮアッセイにおいて、機能について試験する（たとえば実施例２を参照）。試験するＲＶＤを含有する反復モジュールを、測定可能かつ亜飽和レベルの活性を有するＴＡＬエフェクターまたはＴＡＬＥＮ内に取り込ませ、生じるタンパク質を、対応する位置での４個すべてのヌクレオチドの統合順列を用いて、ＤＮＡ標的の組に対する活性の相違について試験する。特に、植物体内および酵母アッセイにおいて最小限活性であり、３個の追加の反復でミスマッチに応答性であるＰｔｈＸｏ１変異体（複数可）から始めて、新規かつ稀な反復のそれぞれを含有するＴＡＬＥＮを（同価の３つ組で）、対応する位置のそれぞれにＧを有する標的に対してｉｎ  ｖｉｖｏで試験する。増加した活性を示す任意のものについて、これらの位置で他のヌクレオチドに入れ替えた標的を用いてアッセイを繰り返して、特異性を確認する。
【表７】
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【０２１０】
位置−１でのＴの特異性を緩めるための、第０反復のＲＶＤに類似の位置の一般的なＲＶＤ置換：二次構造の予測および第０反復と反復コンセンサス配列とのアラインメントは、第０反復中のＫＲ＊（星印はギャップを示す）によって占有される位置がＲＶＤに類似であり、−１でＴを指定する残基であったことを示唆した。ＫＲをＨＤ、ＮＧ、ＮＩ、およびＮＮで置換し、別にＲ＊を置換した、ＰｔｈＸｏ１の変異体を、上述のＴａｌ１ｃ「主鎖」構築体中で構築した。植物体内および酵母アッセイにおいて、−１位に対応するヌクレオチド、すなわちそれぞれＣ、Ｔ、Ａ、およびＧを有する標的を使用して、これらの変異体の活性を野生型エフェクターと比較する。第０反復の位置１１のＫがコンセンサス反復配列の位置１１の残基のＳで置換されている、ＰｔｈＸｏ１のさらなる変異体を構築する。また、この置換と、コンセンサス反復配列の位置１６の残基であるＫでの第０反復の位置１５のＶの置換との組合せを有する他の変異体を構築する（表６）。ＴＡＬエフェクター活性のための近位のＴＡＴＡボックスを含め得る。さらに、−１のＴがＴＡＴＡボックスの一部であるように見えるＡｖｒＢｓ３とは異なり、ＰｔｈＸｏ１結合部位に最も近いＴＡＴＡボックスは４６ｂｐ下流であり、−１での修飾によって乱されないため、ＰｔｈＸｏ１はこの実験に有用である。
【０２１１】
上記修飾が、Ｇに対する標的化の増強またはＴ以外のヌクレオチドによって先行される配列を標的化する能力の増加をもたらさない場合は、より包括的な人工ＲＶＤの組をＧ特異性について試験し、また、一般的なＲＶＤ以外の置換を第０反復について試験する。
【表８】
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【実施例１３】
【０２１２】
新規の予測されたヌクレオチド特異的ＲＶＤ
表１Ａおよび１Ｂに記載されたＲＶＤをＲＶＤ中の第２アミノ酸残基（すなわち、全体的な反復中の１３番目）によって群分けした場合に、ＲＶＤの第１位置のアミノ酸とは無関係に、そのアミノ酸とＲＶＤによって指定されるヌクレオチド（複数可）とのほぼ完璧な相関が存在したことが観察された（表７）。したがって、ギャップ（星印によって示す）で終わるＲＶＤはＣもしくはＴ、またはＴを指定し、Ｄで終わるＲＶＤはＣを指定し、Ｇで終わるＲＶＤはＴを指定し、Ｎで終わるＲＶＤはＧもしくはＡ、またはＧを指定する。また、ＲＶＤの位置１のアミノ酸はＨ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、またはＹのいずれかであったことも観察された。これらの観察は、ＲＶＤの特異性は、第１位置の残基がＨ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、またはＹであるかに依存せずに、第２位置の残基によって決定されることを示唆した。したがって、第２位置で観察された残基を第１位置の残基Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｎ、またはＹと組み合わせるいくつかの新規（すなわち未だ観察されていない）ＲＶＤについて、特異性を予測した。したがって、Ｉ＊、Ｓ＊、およびＹ＊はＣもしくはＴ、またはＴを指定すると予測され、ＩＤ、ＳＤ、およびＹＤはＣを指定すると予測され、ＳＧはＴを指定すると予測され、ＩＮおよびＹＮはＧもしくはＡ、またはＧを指定すると予測された。また、第２位置のＫは１つの事例しかなかったが、観察されたＮＫの特異性に基づいて、ＨＫ、ＩＫ、ＳＫ、およびＹＫはＧを指定すると予測された。
【０２１３】
これらの新規ＲＶＤを、実施例２および１１に記載の定量的ＴＡＬエフェクターおよびＴＡＬＥＮ活性アッセイにおいて機能および特異性について試験し、既存のＲＶＤと比較した。
【表９】
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【実施例１４】
【０２１４】
誂えのＴＡＬＥＮは動物細胞において内在標的を切断し、不正確な非相同末端結合によって突然変異を導入する
ＴＡＬＥＮを動物細胞における標的化突然変異誘発に使用できるかどうかを試験するために、最初に、ＴＡＬエフェクターＡｖｒＢｓ３、ＰｔｈＸｏ１、およびＴａｌ１ｃの発現をヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞中で試験した。ＡｖｒＢｓ３、ＰｔｈＸｏ１、およびＴａｌ１ｃをコードしている遺伝子からストップコドンを除去し、遺伝子を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）内に、タンパク質の免疫検出のためのＶ５エピトープをコードしているそのベクター中の下流配列とインフレームでサブクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＤＥＳＴは、ＴＡＬエフェクター遺伝子を構成的ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に置く。生じるプラスミドを個々に用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質移入し、２４時間後、全タンパク質をそれぞれの形質移入した細胞のバッチから単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティングおよびマウス抗Ｖ５抗体を使用した免疫標識に供した。標識されたタンパク質は、ヤギ抗マウス抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼのコンジュゲートを用いて、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅａｔ  Ｐｉｃｏ化学発光キット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して検出した。等価なローディングは、アクチンの免疫標識および検出によって確認した。それぞれのＴＡＬエフェクタータンパク質は、明らかな分解なしに、検出可能に発現された（図３９）。
【０２１５】
次に、内在性ヒトＨＰＲＴ遺伝子中の配列を標的とするために、実施例９に記載のように一対のＴＡＬＥＮを設計し、ＨＰＲＴ−３２５４−１７およびＨＰＲＴ−３２８６−２０ｒと命名した（図４０Ａおよび図４０Ｂ）。Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングに基づく方法および実施例８に記載の試薬を使用して、ＨＰＲＴ−３２５４−１７をコードしているプラスミドｐＴＡＬＥＮ１４１およびＨＰＲＴ−３２８６−２０ｒをコードしているプラスミドｐＴＡＬＥＮ１４２を構築した。その後、ＴＡＬＥＮ遺伝子を、それらを構成的ＣＭＶプロモーターの制御下に置く哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内にサブクローニングし、プラスミドｐＴＡＬＥＮ１４１ＭおよびｐＴＡＬＥＮ１４２Ｍが得られた。その後、ｐＴＡＬＥＮ１４１ＭおよびｐＴＡＬＥＮ１４２Ｍの両方を一緒に用いて、ならびに別に陰性対照としてｐＣＤＮＡ３．１（−）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質移入した。７２時間後、ゲノムＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼＢｐｕ１０Ｉで消化した。Ｂｐｕ１０Ｉ部位は、ＨＰＲＴ中でＨＰＲＴ−３２５４−１７およびＨＰＲＴ−３２８６−２０ｒの結合部位を分離するスペーサー内に存在する（図４１Ａ）。Ｂｐｕ１０Ｉ消化に次いで、ＰＣＲを使用して、ＴＡＬＥＮで処理した試料および対照試料の両方からのＴＡＬＥＮ標的部位にまたがる２４４ｂｐの断片を増幅した。予想された断片がどちらの試料からも増幅され、ゲノムＤＮＡのＢｐｕ１０Ｉ消化が不完全であったことを示す。しかし、続くＢｐｕ１０Ｉを用いたＰＣＲ産物の消化は、対照試料から増幅された産物の完全な切断をもたらしたが、ＴＡＬＥＮで処理した試料からの産物の不完全な切断をもたらした（図４１Ｂ）。ＴＡＬＥＮで処理した試料中の切断耐性ＰＣＲ産物の存在は、ＨＰＲＴ中の意図する標的での、ＴＡＬＥＮに媒介される二本鎖切断の非相同末端結合による不完全な修復の結果、内在性Ｂｐｕ１０Ｉ部位がｉｎ  ｖｉｖｏで突然変異したことの証拠を提供する。したがって、ＴＡＬＥＮは、哺乳動物細胞における標的化突然変異誘発に使用することができる。
【０２１６】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示し、限定しないことを意図することを理解されたい。他の態様、利点、および改変が以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３４Ｇ】
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【図３４Ｈ】
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【図３４Ｉ】
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【図３４Ｊ】
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【図３４Ｋ】
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【図３４Ｌ】
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【図３４Ｍ】
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【図３４Ｎ】
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【図３４Ｏ】
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【図３４Ｐ】
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【図３４Ｑ】
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【図３４Ｒ】
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【図３４Ｓ】
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【図３４Ｔ】
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【図３４Ｕ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月17日(2019.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする組換え核酸発現ベクターであって、
プロモーター配列と作動可能に連結された、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に連結された配列特異的ＴＡＬエフェクターをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記ベクターはプラスミドである、
組換え核酸発現ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載の組換え核酸発現ベクターであって、
前記ヌクレアーゼがＩＩ型制限エンドヌクレアーゼである、
組換え核酸発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の組換え核酸発現ベクターであって、
前記ヌクレアーゼがＦｏｋＩである、
組換え核酸発現ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の組換え核酸発現ベクターであって、
前記配列特異的ＴＡＬエフェクターをコードするヌクレオチド配列が、特定のＤＮＡ配列を認識し、これに結合できる、位置１２および１３の超可変残基を有する複数のタンデムの反復をコードする、
組換え核酸発現ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の組換え核酸発現ベクターであって、
前記反復は、ＡｖｒＢｓ３の中心領域から選択され、配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、３４個のアミノ酸の反復である、
組換え核酸発現ベクター。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え核酸発現ベクターであって、
前記配列特異的ＴＡＬエフェクターをコードするヌクレオチド配列は、特徴的な最後の半反復以外の中央反復領域を欠くｔａｌ遺伝子の切断された形態を含有するＧａｔｅｗａｙ−ｒｅａｄｙ高コピー細菌クローニングベクター内に適切な反復を順次導入することによってアセンブルされる、
組換え核酸発現ベクター。
【請求項７】
配列特異的なエンドヌクレアーゼメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはタンパク質を作製する方法であって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換え核酸を転写する、または転写および翻訳するステップを含む、
方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって取得可能な配列特異的エンドヌクレアーゼｍＲＮＡであって、
前記組換え核酸によってコードされるヌクレアーゼがＦｏｋＩである、
配列特異的エンドヌクレアーゼｍＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換え核酸、または請求項７の方法によって作製されたｍＲＮＡを含む治療用組成物。
【請求項１０】
ウイルス性疾患の治療において使用するための、請求項９に記載の治療用組成物。
【請求項１１】
細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的化遺伝子組換えの方法であって、
（ａ）選択されたＤＮＡ標的配列を標的としたＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸または請求項８に記載のｍＲＮＡを単離された細胞内に導入するステップ、
（ｂ）前記細胞内での前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの発現を誘導するステップ、および
（ｃ）前記選択されたＤＮＡ標的配列が突然変異を示している細胞を同定するステップ、
を含む、
方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
ステップｃ）における前記突然変異は、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、または遺伝物質の欠失および遺伝物質の挿入の両方からなる群から選択される、
方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の方法であって、
前記細胞は、昆虫細胞、植物細胞、魚細胞または哺乳動物細胞である、
方法。
【外国語明細書】
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