(57)【要約】【課題】乳酸生産量を増大させ、かつ残糖量を抑制することができる、乳酸の製造方法を提供すること。【解決手段】乳酸の光学純度を高める方法を開示する。本方法は、（ｉ）糖を含む培地と、乳酸生産微生物とを含み、かつ該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨである初発ｐＨを有する培養液を調製し、該微生物を培養する工程、（ii）該初発ｐＨより低いｐＨ下で該乳酸生産微生物を培養する工程、および（iii）該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨにて該乳酸生産微生物を培養する工程であって、ここで該工程（iii）のｐＨが、該初発ｐＨと同じまたは異なるｐＨである、工程を含み、該工程（ｉ）〜（iii）において、該工程（ii）は該工程（ｉ）の前または後で行われる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸の光学純度を高める方法であって、
（ｉ）糖を含む培地と、乳酸生産微生物とを含み、かつ該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨである初発ｐＨを有する培養液を調製し、該微生物を培養する工程、
（ii）該初発ｐＨより低いｐＨ下で該乳酸生産微生物を培養する工程、および
（iii）該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨにて該乳酸生産微生物を培養する工程であって、ここで該工程（iii）のｐＨが、該初発ｐＨと同じまたは異なるｐＨである、工程
を含み、
ここで該工程（ｉ）〜（iii）において、該工程（ii）が、該工程（ｉ）の前または後で行われる、
方法。
【請求項２】
前記工程（ｉ）、前記工程（ii）および前記工程（iii）をこの順に含み、
該工程（ｉ）および該工程（ii）を通して、中和することなく前記乳酸生産微生物を培養し、そして該工程（iii）において、該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨに調整しながら該乳酸生産微生物を培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｉ）において、ｐＨを前記初発ｐＨに調整しながら前記乳酸生産微生物を培養し、前記工程（ii）において、中和することなく該乳酸生産微生物を培養し、そして前記工程（iii）において、該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨにｐＨを調整しながら該乳酸生産微生物を培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記乳酸生産微生物が、乳酸菌である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記乳酸生産微生物の生育に適したｐＨが、弱酸性から中性付近であり、そして前記初発ｐＨより低いｐＨが、より酸性である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、糖化酵素をさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｉ）、工程（ii）および工程（iii）の１バッチの発酵終了後の発酵残渣が、次バッチに用いられる、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸の製造方法に関する。より詳細には、微生物を用いる発酵により乳酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、生分解性プラスチックであるポリ乳酸およびポリエステルポリオールなどの原料として、または農薬または医薬の原料として用いられ得る。
【０００３】
従来から、微生物を用いる発酵法により光学純度の高い乳酸を製造する方法が知られている。グルコースなどの糖から乳酸を生産する微生物としては、乳酸菌（例えば、ラクトバチルス属（Lactobacillus）（例えば、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）およびラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）））およびカビ（例えば、リゾプス属（Rhizopus））がよく知られている。
【０００４】
また、Ｌ−またはＤ−乳酸合成酵素遺伝子のいずれかを組み込むあるいは破壊した組換え微生物による乳酸の製造方法も知られている。遺伝子組換え宿主としては、ゲノム情報が豊富で実績が十分にある微生物を選択することが多く、酵母（特許文献１）、大腸菌（特許文献２）、乳酸菌（非特許文献１）で高光学純度の乳酸を生産させる試みがなされている。
【０００５】
乳酸菌は、高い対糖収率で乳酸発酵を行うことができるものの、栄養要求性が高い。このため、乳酸菌の発酵培地に高価な材料（例えば酵母エキスなど）を用いた場合、乳酸の製造コストが高くなるという問題がある。この問題を回避するために、コーンスティープリカー（ＣＳＬ：コーンスターチ製造工程でトウモロコシから溶出した可溶性成分と、乳酸発酵で生成した成分とを含む浸漬液を濃縮したもの）および魚タンパク質加水分解生成物を安価な栄養源として利用することが試みられている。しかし、酵母エキス以外のこれらの栄養源は、乳酸菌にとっての栄養価が優れていないため多量に添加する必要が生じてしまう、および栄養源に含まれる化合物が不純物となって乳酸精製工程に悪影響を及ぼすなどの問題がある。これらを考慮して栄養源の添加量を制限した場合には、乳酸発酵を行う菌体の活性が低いことから、十分な乳酸収量を得られず、発酵液に残存する糖が多くなり、乳酸精製工程に悪影響を及ぼす。
【０００６】
乳酸の主原料である糖質が多量に残存する場合、例えば、乳酸のエステル化に際して乳酸のカルボキシル基と糖質のヒドロキシル基との間で副反応が起こり、目的とする乳酸エステルの収率が低下する。発酵後の培養液から残存した糖質を除去するには煩雑かつ高コストな工程を経る必要があるため、残糖濃度は可能な限り低くする必要がある（特許文献３）。
【０００７】
また、発酵液のｐＨは、乳酸の生産に伴って徐々に低下する。乳酸菌など微生物の多くは酸感受性を有するため、乳酸生産を維持するためには、中和剤を用いて中和しながら発酵を進めるのが一般的である（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−１３６２９３号公報
【特許文献２】特開２００５−１０２６２５号公報
【特許文献３】特開２０１１−９２０４５号公報
【特許文献４】特開２０１１−２６２４４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ferainら，J. Bacteriol., 1994, Vol.176, p.596-601
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、乳酸生産量を増大させ、かつ残糖量を抑制することができる、乳酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、乳酸を製造する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）糖を含む培地と、乳酸生産微生物とを含む、該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨである初発ｐＨの培養液を調製し、該微生物を培養する工程、
（ii）該初発ｐＨより低いｐＨ下で該乳酸生産微生物を培養する工程、および
（iii）該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨにて該乳酸生産微生物を培養する工程であって、ここで該工程（iii）のｐＨが、該初発ｐＨと同じまたは異なるｐＨである、工程
を含み、
ここで該工程（ii）は該工程（ｉ）の前または後である。
【００１２】
１つの実施形態では、上記工程（ｉ）、上記工程（ii）および上記工程（iii）をこの順に含み、該工程（ｉ）および該工程（ii）を通して、中和することなく前記乳酸生産微生物を培養し、そして該工程（iii）において、該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨに調整しながら該乳酸生産微生物を培養する。
【００１３】
１つの実施形態では、上記工程（ｉ）において、ｐＨを上記初発ｐＨに調整しながら上記乳酸生産微生物を培養し、上記工程（ii）において、中和することなく該乳酸生産微生物を培養し、そして上記工程（iii）において、該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨにｐＨを調整しながら該乳酸生産微生物を培養する。
【００１４】
１つの実施形態では、上記乳酸生産微生物は、乳酸菌である。
【００１５】
１つの実施形態では、上記乳酸生産微生物の生育に適したｐＨは、弱酸性から中性付近であり、そして前記初発ｐＨより低いｐＨは、より酸性である。
【００１６】
１つの実施形態では、上記培養液は、糖化酵素をさらに含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、乳酸生産量を増大させ、かつ残糖量を抑制し得る乳酸の製造方法が提供される。本発明の乳酸の製造方法は、培養液（発酵液）のｐＨを制御するという簡便な操作によって、乳酸を効率的に生産し、かつ培養液（発酵液）中に残存する糖を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】玄米からの乳酸発酵において異なる時点でｐＨ制御を開始した発酵液ｐＨの経時変化を示すグラフである。
【図２】玄米からの乳酸発酵において異なる時点でｐＨ制御を開始した発酵液上清のグルコース濃度の経時変化を示すグラフである。
【図３】発酵開始１７時間後から３０分または３時間の間、ｐＨを４．８に維持した発酵液における乳酸およびグルコースの濃度の経時変化を示すグラフである。
【図４】ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株について、培養開始から１８時間まで中和しない場合および中和した場合の、糖濃度を再調整した後に発酵を開始してからの培養中の生成乳酸およびグルコースの濃度の経時変化を示すグラフである。
【図５】ラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株について、培養開始から１８時間まで中和しない場合および中和した場合の、糖濃度を再調整した後に発酵を開始してからの培養中の生成乳酸およびグルコースの濃度の経時変化を示すグラフである。
【図６】ラクトバチルス・カゼイについて、培養開始から１８時間まで中和しない場合および中和した場合の、糖濃度を再調整した後に発酵を開始してからの培養中の生成乳酸およびグルコースの濃度の経時変化を示すグラフである。
【図７】栄養源無添加での玄米からの乳酸発酵において、発酵開始から０時間または１５時間でｐＨ制御を開始した際の、発酵液における乳酸濃度およびグルコース濃度の経時変化を示すグラフである。
【図８】残渣を菌床として繰返し利用して１０バッチの発酵を行った場合において、各バッチにつき発酵開始１５時間の時点からｐＨ６．０制御した際の発酵液における乳酸濃度およびグルコース濃度の経時変化を示すグラフである。
【図９】残渣を菌床として利用し、発酵開始１５時間の時点からｐＨ６．０制御した際の第１バッチの発酵および発酵開始０時間の時点からｐＨ６．０制御した際の第２バッチの発酵を行った場合の発酵液における乳酸濃度およびグルコース濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１０】セルロース系原料を用いて、発酵開始１５時間または０時間の時点よりｐＨ制御を行った際の、発酵液における乳酸濃度およびグルコースとキシロースの合計糖濃度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
一般に、乳酸発酵は、発酵により生成した乳酸によって、培養液中のｐＨが低下する。このため、中和しながら発酵を進めるのが一般的であるが、本発明においては、発酵による乳酸の生産過程でｐＨを意図的に低下させる。
【００２１】
本発明は、乳酸を製造する方法を提供する。この方法は、以下（ｉ）〜（iii）の工程を含む：
（ｉ）糖を含む培地と、乳酸生産微生物とを含み、かつ該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨである初発ｐＨを有する培養液を調製し、該微生物を培養する工程、
（ii）該初発ｐＨより低いｐＨ下で該乳酸生産微生物を培養する工程、および
（iii）該乳酸生産微生物の生育に適したｐＨにて該乳酸生産微生物を培養する工程。工程（ii）は、工程（ｉ）の前または後であり得る。工程（iii）のｐＨは、工程（ｉ）の初発ｐＨと同じであり得、あるいは、用いる乳酸生産微生物が生育可能な範囲である限り、異なっていてもよい。
【００２２】
本明細書中で用いる用語「乳酸生産微生物」は、グルコースなどの糖から乳酸を生産することができる（言い換えれば、乳酸発酵能を有する）任意の微生物をいう。乳酸生産微生物は、自然界に存在する微生物および遺伝子組換え微生物のいずれであってもよい。自然界に存在する微生物としては、例えば、乳酸菌およびカビ（例えば、リゾプス（Rhizopus）属）が挙げられる。
【００２３】
「乳酸菌」とは、代謝または発酵によって糖類から乳酸を産生する細菌の総称である。乳酸菌は、主として、ビフィズス菌、エンテロコッカス菌、ラクトバチルス菌、ストレプトコッカス菌の４種に分類され得る。乳酸菌としては、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、またはリューコノストック属（Leuconostoc）に属する菌が挙げられ、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）、ストレプトコッカス・フェカーリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ラクテイス（Streptococcus lactis）、ラクトバチルス・ブルカリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・デルブルツキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・アラビノースス（Lactobacillus arabinosus）、ラクトバチルス・カウカシクス（Lactobacillus caucasicus）、ラクトバチルス・ラクテイス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・ライシュマニ（Lactobacillus Leishmanni）、ラクトバチルス・ムシカス（Lactobacillus musicus）、ラクトバチルス・サーモフィルス（Lactobacillus thermophilus）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ラクトコッカス・ラクテイス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）、およびロイコノストック・メゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）などが挙げられる。乳酸菌には、有胞子性乳酸菌もまた包含される。有胞子性乳酸菌は、有胞子性の乳酸菌の総称である。有胞子性乳酸菌としては、例えば、バチルス属（Bacillus）に属する菌が挙げられる。バチルス属に属する有胞子性乳酸菌は、耐熱性（例えば４５℃のような高熱下にて生育可能）、高い発酵速度、および広い糖資化性を有するものであり得る。バチルス属（Bacillus）に属する菌としては、例えば、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans、「スポロ乳酸菌」としても知られる）およびバチルス・リンチェニフォルマイス（Bacillus lincheniformis）が挙げられる。カビとしては、例えば、リゾプス属（Rhizopus）が挙げられ、例えば、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）が挙げられる。
【００２４】
遺伝子組換え微生物としては、例えば、Ｌ−またはＤ−乳酸合成酵素遺伝子のいずれかを組み込むあるいは破壊した組換え微生物が挙げられる。遺伝子組換え宿主としては、ゲノム情報が豊富で実績が十分にある微生物を選択することが多い。例えば、酵母、大腸菌、乳酸菌などが、遺伝子組換え宿主として用いられ得る。遺伝子組換え微生物として、例えば、ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株（Okanoら, Appl. Environ. Microbiol. 2009, Vol.75, 462-467）、およびラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株（Yoshidaら, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, Vol.92, 67-76）が挙げられる。ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株は、α−アミラーゼを分泌しグルコースからＤ−乳酸を生成する組換え株であり、ラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株は、グルコースとキシロースの両方からＤ−乳酸を生成する組換え株である。
【００２５】
乳酸発酵のために乳酸生産微生物を培養するための培地は、糖のような炭素源を主原料として含み、好ましくは液体培地である。糖としては、グルコース、キシロース、アラビノース、フルクトースのような単糖類；シュークロース、マルトース、トレハロースのような二糖類；およびデンプン、セルロース、ヘミセルロース、キシランのような多糖類；ならびに糖類を含有する糖蜜（例えば、甘藷糖蜜）などが挙げられる。生物資源に由来する糖質材料であるバイオマスもまた、糖として用いられ得る。バイオマスとしては、例えば、トウモロコシや米などのデンプン、ならびに、サトウキビ廃糖蜜のような廃糖蜜などが挙げられる。また、食糧と競合しない糖原材料としては、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンから構成されるリグノセルロース系バイオマスが挙げられる。バイオマス材料は、乳酸発酵培養に供する前に、必要に応じて、前処理（例えば、破砕処理、水熱処理、または乾燥処理）が施され得る。
【００２６】
培地はさらに、窒素原を含み得る。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、動物性ポリペプトン、植物性ポリペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、魚タンパク加水分解物、カザミノ酸、焼酎粕、油粕のようなペプチド又はアミノ酸類；アンモニア、硝酸塩のような無機窒素類；尿素などが挙げられる。安価に利用することができる点で、コーンスティープリカー、魚タンパク加水分解物、硝酸塩などが好ましい。また、必要に応じて、培地中に乳酸発酵用の培地に通常添加される、リン酸塩、硫酸マグネシウムのようなマグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩のような無機塩類；ビタミン類；ポリソルベートのような脂肪酸などを培地に添加してもよい。窒素源などの栄養を含むバイオマスを糖原材料として用いることもできる。窒素源などの栄養を含むバイオマスを糖原材料として用いる場合には、別に窒素源を添加しなくてもよく、その際に、好ましくは、発酵前にｐＨを中性付近に調整する。
【００２７】
乳酸発酵のための培養液（本明細書中で、「乳酸発酵液」または単に「発酵液」ともいう）は、糖を含む培地と、乳酸生産微生物とを含む。乳酸発酵のための培養液は、例えば、上記のような培地に、乳酸生産微生物の菌体を添加することにより調製され得る。乳酸生産微生物は、乳酸発酵のための培養に供する前に、当該微生物が生育するのに適した培地にて前培養してもよい。
【００２８】
多糖類、または多糖類を構成成分に含むバイオマスなどが糖として用いられる場合、乳酸発酵のための培養液は、糖化酵素をさらに含み得る。糖化酵素としては、培地に含まれる糖の種類に依存するが、αアミラーゼ、βアミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼなどのアミラーゼ；エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルカナーゼなどのセルラーゼ；キシラナーゼ；プルラナーゼなどが挙げられ、これらの１つ以上を組み合わせて用いてもよい。糖化酵素の由来は特に限定されない。
【００２９】
本発明の方法における培養工程は、特に制限されることなく、通常の乳酸発酵法を用いることができる。乳酸発酵のための培養液の初発ｐＨ（乳酸発酵用に新たに調製された培地のｐＨ）は、用いる微生物の種類、培地の種類、培養条件によって異なるため、必要に応じて適宜決定され得る。初発ｐＨは、乳酸生産微生物の生育に適したｐＨ値であればよい。「乳酸生産微生物の生育に適したｐＨ値」は、用いる乳酸生産微生物の種類に依存し得るが、例えば、弱酸性から中性付近であり得、本明細書においては、「弱酸性から中性付近」のｐＨは、例えば、ｐＨ４．５〜７、好ましくは、５．５〜６．８の範囲内であり得る。「中性付近」の場合、例えば、６〜７、好ましくは６〜６．８の範囲内であり得る。
【００３０】
一般に、乳酸発酵では、発酵により生成した乳酸によって培養液のｐＨが低下（酸性化）するため、乳酸生産微生物の生育に適したｐＨ下での微生物の培養の際には、中和によってｐＨ制御を行い得る。ｐＨ制御に用いる中和剤は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の炭酸塩、アンモニウム化合物、およびこれらの混合物が挙げられる。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、アンモニア水、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどが挙げられる。中和によって得られる乳酸塩の取り扱いやすさの点で、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが好ましい。
【００３１】
本発明の方法においては、乳酸発酵過程において、初発ｐＨ（乳酸発酵用の培地のｐＨに起因し得る）より酸性のｐＨ（すなわち、より低下したｐＨ）下で、乳酸生産微生物を培養する工程を含む。より酸性のｐＨ（すなわち、より低下したｐＨ）下での培養工程は、乳酸発酵に供する前または乳酸発酵過程の間のいずれでもよい。当該より酸性の（すなわち、より低下した）ｐＨ下での培養後、乳酸生産微生物を、乳酸生産微生物の生育に適したｐＨ（当該より低下したｐＨよりも高いｐＨとなる）下でさらに培養する。
【００３２】
１つの実施形態（「第１の実施形態」ともいう）では、上記工程（ｉ）、工程（ii）および工程（iii）をこの順に含み、工程（ｉ）および工程（ii）（発酵培養初期からより酸性のｐＨでの培養まで）を通して、中和することなく乳酸生産微生物を培養し（これにより、発酵により生成した乳酸によってｐＨを低下させる）、そして工程（iii）（より酸性のｐＨでの培養後の培養）において、ｐＨを乳酸生産微生物の生育に適したｐＨ（例えば、弱酸性から中性付近）に調整しながら該乳酸生産微生物を培養する。
【００３３】
別の１つの実施形態（「第２の実施形態」ともいう）では、上記工程（ｉ）（発酵培養初期）において、ｐＨを初発ｐＨ（例えば、弱酸性から中性付近）に調整しながら乳酸生産微生物を培養し、上記工程（ii）（より酸性のｐＨでの培養）において、中和することなく乳酸生産微生物を培養し、そして上記工程（iii）（乳酸生産微生物の生育に適したｐＨでの培養）において、ｐＨを乳酸生産微生物の生育に適したｐＨ（例えば、弱酸性から中性付近）に調整しながら上記乳酸生産微生物を培養する。工程（ii）は、工程（ｉ）の前または後であり得る。工程（iii）のｐＨは、工程（ｉ）の初発ｐＨと同じであり得、あるいは、用いる乳酸生産微生物が生育可能な範囲である限り、異なっていてもよい。工程（ii）が工程（ｉ）の前である場合、工程（ｉ）および工程（iii）は、まとめて一つの工程とすることもできる。
【００３４】
培養液（発酵液）のｐＨを低下させる手段については、発酵中に菌体によって生成された乳酸の作用によって自発的に低下させてもよく（例えば、第１の実施形態および第２の実施形態における中和なしの培養）、またはなんらかの手段にて強制的に低下させてもよい（第２の実施形態）。第２の実施形態の工程（ii）においては、ｐＨは自発的に低下させても、強制的に低下させてもよい。
【００３５】
発酵液のｐＨを低下させるタイミングとしては、発酵培養の途中にｐＨ制御を停止する、または酸を添加するなどしてｐＨを低下させてもよく、あるいは、菌体を低いｐＨの培地で馴化させてもよい。低ｐＨ培地への菌体の馴化は、例えば、弱酸性から中性付近の初発ｐＨの培地に菌体を添加して開始する乳酸発酵培養にてｐＨを調節せずに単に放置する（すなわち、乳酸発酵の進行とともに培養液のｐＨを低下するにまかせることで、菌体を低ｐＨ培地に馴化させる）、または乳酸発酵培養に供する前に、より低いｐＨの培地にて菌体を前培養することによってなされ得る。また、これらの方法を組み合わせてもよい。
【００３６】
添加する酸としては、例えば、塩酸、硫酸、炭酸、リン酸、または硝酸、あるいはこれらの任意の組合せのような無機酸などが挙げられる。好ましくは塩酸である。初発ｐＨより酸性のｐＨ（またはより低下したｐＨ）は、用いる微生物の種類に依存し得るが、下記のような通常のｐＨ制御下の培養で見られ得るｐＨ低下を超えて低下したｐＨであり得、例えば、初発ｐＨより０．７以上低下したｐＨ、好ましくは、１以上低下したｐＨである。また、このようなｐＨ値は、ｐＨ３〜４．８、好ましくは、ｐＨ３．５〜４．５の範囲内であり得る。酸の添加濃度は、酸の種類に依存するが、中和を生じるのに適した濃度であればよく、例えば、０．５Ｍ〜１８Ｍ、好ましくは、１Ｍ〜６Ｍの範囲内であり得る。
【００３７】
培養液（発酵液）をより酸性のｐＨに維持する（すなわち、当該より酸性の発酵液に菌体を浸漬する）時間は、用いる発酵条件および微生物に依存し得るが、例えば、１０分〜１２時間、好ましくは、２０分〜６時間、より好ましくは、３０分〜３時間とし得る。中和することなく乳酸生産微生物を培養することによりｐＨを自発的に低下させる場合は、用いる発酵条件および微生物に依存し得るが、発酵培養培地にて、例えば、６時間〜２４時間まで、好ましくは、８時間〜１８時間まで、より好ましくは、１５時間〜１８時間まで、中和することなく（ｐＨ制御なしで）乳酸生産微生物を培養することでｐＨを低下し得る。例えば、乳酸生産微生物（例えば、下記実施例１の乳酸菌ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株）を初発ｐＨ５．５で培養を開始し、上記時間中和することなく（ｐＨ制御なしで）培養することで、上記のより酸性のｐＨ（例えば、ｐＨ３〜４．８、好ましくは、ｐＨ３．５〜４．５）を生じ得、そして乳酸生産量の増大と残糖量の低下との両方を達成し得る。初発ｐＨより低下した培養について、必ずしも上記の酸性ｐＨ値および時間に限定されない。
【００３８】
なお、上記の通り、乳酸発酵では、乳酸生産微生物の培養の間に、生成された乳酸に起因して培養液のｐＨが低下し得るので、（ｐＨ制御をしている場合であっても）培養の間のｐＨ値は変動し得る。本発明の方法においては、培養時のｐＨ値には、ｐＨ制御によるｐＨ変化以外で生じ得る範囲で変化するｐＨ値が包含される。一例として、培養時のｐＨ値が５．５に設定される場合、当該ｐＨ値は、例えば、５．４〜５．６を包含する。
【００３９】
培養は、回分培養、半回分培養、または連続培養のいずれであってもよい。また、糖質のみ培養中に追加する半回分培養または連続培養であってもよい。培養時間は、使用菌株、培地成分、特に糖質の量などにより異なるが、回分培養の場合、例えば、１日間〜１０日間、好ましくは、２日間〜８日間、より好ましくは、２日間〜７日間である。連続培養、半回分培養を行う場合は、培養期間はこれに限定されない。ｐＨの低下は、菌体の対数増殖期以降のタイミングで行うことが望ましい。発酵残渣を菌床として用いてもよい。例えば、１バッチ（回分）の発酵終了後、その発酵残渣に含まれる乳酸生産微生物を次バッチの発酵に再度利用してもよい。
【００４０】
発酵培養の温度は、用いる乳酸生産微生物が生育する温度および添加される酵素の作用温度などの培養条件を考慮して設定され得る。例えば、２５℃〜４５℃、または３０℃〜４０℃、または３５℃〜３７℃に設定し得るが、特に用いる乳酸生産微生物によっては、より高いまたは低い温度でもあり得る。用いる乳酸生産微生物が有胞子性乳酸菌などの耐熱性微生物の場合は、より高い温度、例えば、一般的に糖化酵素がよく作用する例えば４５℃付近の温度に設定し得る。
【００４１】
培養後の培養液から菌体を除去することにより、乳酸を、乳酸または乳酸アルカリ塩の形態で回収し得る。培養液からの乳酸の回収方法は特に制限されず、公知の方法が使用され得る。例えば、ＷＯ２００７／１１４０１７に記載の方法が挙げられる。また、イオン交換樹脂に吸着、洗浄した後、溶出する方法；硫酸添加下でアルコール（例えば、メタノール、エタノールなど）と反応させてエステルを形成させ、蒸留する方法；およびマグネシウム塩などの不溶性の乳酸塩として回収および精製する方法などが挙げられる。
【００４２】
本発明により得られた乳酸は、例えば、ポリ乳酸およびポリエステルポリオールなどの生分解性プラスチック、ならびに農薬および医薬の原料として有用である。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
（実施例１：ラクトバチルス・プランタルムによる玄米からの乳酸発酵）
（１−１：発酵開始からの種々の時点におけるｐＨ制御による乳酸発酵の影響）
破砕済みの玄米２００ｇおよびＣＳＬ（日本澱粉工業株式会社製）１０ｍＬを蒸留水に溶解し、ｐＨを５．５に合わせてから１Ｌ容量に調整し、発酵用培地を調製した。この発酵用培地１Ｌを３Ｌ容量の発酵槽（微生物用ファーメンター：EYELA社製）にて６０℃で３時間加熱し、その後最終的に３７℃で保温した。
【００４５】
他方、乳酸菌ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株を、２％（v/v）ＣＳＬおよび０．５％（w/v）可溶性デンプンを蒸留水中に含む培地において、３７℃で２０時間静置培養させておいた。
【００４６】
上記加熱滅菌した発酵用培地に、上記乳酸菌の懸濁液５０ｍＬおよび糖化酵素（グルコチーム＃２００００  ０．１ｇ、スピターゼＣＰ−４０ＦＧ  ０．１３ｇ：ともにナガセケムテックス株式会社製）を加え、発酵を開始した。３７℃、２００ｒｐｍで撹拌しながら、発酵開始から０〜１５時間の異なる時点で、５Ｎ  ＮａＯＨ（５Ｍ  ＮａＯＨ）の滴下による中和を開始した。中和開始以降は発酵液のｐＨを５．５に調整し、１４４時間まで発酵を継続した。
【００４７】
サンプリングした試料を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、回収した上清を超純水で適宜希釈した後、日立高速液体クロマトグラフ有機酸（ＢＴＢ法）分析システム（株式会社日立テクノロジーズ）により以下の条件で分析した：
カラム：ＧＬ−Ｃ６１０Ｈ−Ｓ（φ７．８×３００ｍｍ）
温度：４０℃
溶離液：３ｍＭ  過塩素酸水溶液
溶離液流量：０．５ｍｌ／分
反応液：ＢＴＢ（ブロモチモールブルー）溶液
反応液流量：０．６ｍｌ／分
検出：ＶＩＳ  ４４０ｎｍ
【００４８】
発酵液上清中の全糖濃度はフェノール・硫酸法で定量し、グルコース濃度はバイオセンサーＢＦ−５（王子計測機器株式会社製）を用いて定量し、乳酸濃度は、高速液体クロマトグラフィーで定量した。以下、これらを単に発酵液中の全糖濃度、グルコース濃度、および乳酸濃度という。
【００４９】
図１は、玄米からの乳酸発酵において異なる時点でｐＨ制御を開始した発酵液ｐＨの経時変化を示す。図中、横軸は発酵経過時間（ｈ：時間）を示し、縦軸は発酵液ｐＨ値を示す。Ｘ、白菱形、白三角、および白丸はそれぞれ、発酵開始から１５時間（１５ｈ）、８時間（８ｈ）、５時間（５ｈ）および０時間（０ｈ）の時点で、中和によるｐＨ制御を行った結果を表す。
【００５０】
図１から明らかなように、発酵開始０時間（すなわち発酵開始時）でｐＨ制御を行った場合（対照）、発酵中のｐＨは５．５に維持されていた。一方、発酵開始から５時間、８時間および１５時間で中和によるｐＨ制御を行った場合、発酵液のｐＨがそれぞれ４．２、３．８、３．６まで低下した後、中和開始以降はｐＨが５．５に維持されていることを確認できた。
【００５１】
表１は、異なる時点でｐＨ制御を開始した玄米からの乳酸発酵において、発酵１４４時間後の発酵液中の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）、中和剤の添加による希釈を考慮した初発発酵液１Ｌあたりの乳酸量（ｇ）、発酵液中に残存するグルコース濃度（ｇ／Ｌ）と全糖濃度（ｇ／Ｌ）、米のグルコース含量から算出した乳酸の対糖収率（ｇ／ｇ−グルコース）を示す。
【００５２】
【表１】
2019146596.tif 000002
【００５３】
発酵開始０時間（対照）では、乳酸濃度は１１４．９ｇ／Ｌと比較的高い値に達したものの、発酵後の上清には高濃度の糖が残存した。ｐＨ制御を５時間後に開始した場合、乳酸濃度は１２５．０ｇ／Ｌと対照よりも高い値を示したが、残糖濃度も高い値を示した。一方、ｐＨ制御を８および１５時間後に開始した場合、対照よりも乳酸濃度、乳酸量および対糖収率が高く、さらに残糖濃度は低い値を示した。
【００５４】
図２は、玄米からの乳酸発酵において異なる時点でｐＨ制御を開始した発酵液中のグルコース濃度の経時変化を示す。図中、横軸は発酵経過時間（ｈ：時間）を示し、縦軸は発酵液上清のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）を示す。Ｘ、白菱形、白三角、および白丸はそれぞれ、発酵開始から１５時間（１５ｈ）、８時間（８ｈ）、５時間（５ｈ）および０時間（０ｈ）の時点でｐＨ制御を行った結果を表す。
【００５５】
図２から明らかなように、いずれも発酵初期（発酵開始から２４時間程度まで）に、酵素による糖化で生じたグルコースが高い濃度で存在した。発酵開始０時間でｐＨ制御を行った場合（対照）および発酵開始５時間後にｐＨ制御を開始した場合には、グルコースの消費速度が小さく、発酵後期（発酵７２時間以降）になっても高い濃度のグルコースが残存した。発酵開始８および１５時間後にｐＨ制御を開始した場合、発酵初期に生じたグルコースは、ｐＨ制御開始以降に速やかに消費され、発酵７２時間以降には極めて低い残存グルコース濃度となった。
【００５６】
これらのことから、発酵により生じた乳酸によって発酵液のｐＨを減少させ、その後、中和を開始して乳酸発酵に適するｐＨ（例えば５．５）に設定することで、菌体の糖消費速度が向上し、乳酸収量も増加するものと考えられた。ｐＨ制御を５時間後に開始した場合に残糖濃度が高くなった原因としては、発酵開始５時間での菌体密度が低く、中和開始以降から増殖した菌体の性質が発酵結果に影響したものと思われる。
【００５７】
（１−２：発酵開始からの種々の時点におけるｐＨ制御による乳酸発酵の影響）
続いて、菌体の糖消費速度が有意に向上するｐＨ値の上限および該ｐＨで菌体を浸漬する所要時間を調べた。まず中和を伴う乳酸発酵（ｐＨ５．５に制御）を行い、発酵開始（菌体添加）１７時間後に６Ｎ塩酸（６Ｍ塩酸）を添加して強制的にｐＨを４．８まで減少させた。撹拌を継続しながら、このｐＨ値に発酵液を一定時間（３０分から３時間）維持した（すなわち該ｐＨの発酵液に菌体を浸漬した）。その後、中和を再開して発酵液のｐＨを５．５に調整しながら１４４時間まで発酵を継続した。
【００５８】
図３は、発酵開始１７時間後から３０分または３時間の間、ｐＨを４．８に維持した発酵液における乳酸およびグルコースの濃度の経時変化を示す。図中、横軸は発酵経過時間（ｈ：時間）を示し、縦軸は発酵液中の乳酸またはグルコースの濃度（ｇ／Ｌ）を示す。四角は発酵液中の乳酸濃度を表し、丸は発酵液中のグルコース濃度を表し、白記号はｐＨ４．８に３０分間維持した場合の結果であり、黒記号はｐＨ４．８に３時間維持した場合の結果である。
【００５９】
図３に示すように、３０分および３時間の間、ｐＨ４．８の発酵液に菌体を浸漬した（ｐＨ４．８に発酵液を維持した）場合、いずれも発酵１４４時間後の残存グルコース濃度が低く、高い乳酸濃度を得ることができた。
【００６０】
（実施例２：種々の菌体を用いたモデル糖液からの乳酸発酵）
本実施例では、菌株の種類がどのように影響を及ぼすかを調べるため、モデル糖液を用いた実験を行った。ここでは、ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株、ラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株、およびラクトバチルス・カゼイについて調べた。
【００６１】
各種乳酸菌は、発酵に供する前に、２％（v/v）ＣＳＬおよび０．５％（w/v）基質（ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株およびラクトバチルス・カゼイについてはグルコースのみ；ラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株についてはグルコースとキシロースとを等量混合）を蒸留水中に含む培地にて、３７℃で２０時間静置培養させ、菌懸濁液とした。
【００６２】
乳酸菌ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株およびラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株について行った手順は以下のとおりである。
【００６３】
４％（v/v）ＣＳＬおよび２％（w/v）基質を蒸留水中に含むｐＨ５．５の培地を９００ｍＬ調製し、３Ｌ容量の発酵槽（微生物用ファーメンター：EYELA社製）にて６０℃で３時間殺菌した後、３７℃に保温した。これに菌懸濁液を４５ｍＬ加え、３７℃、２００ｒｐｍで撹拌しながら培養を行った。培養開始直後から中和を行わずに、１８時間まで培養を継続した。培養１８時間後に１００ｍＬの糖液（基質と同じ糖）を加え、発酵槽内の液の全糖濃度が約５％（w/v）（すなわち、５％（w/v）グルコース単独、あるいは各２．５％（w/v）のグルコースおよびキシロース）になるように再調整し、その後、５Ｎ ＮａＯＨで発酵槽内の液のｐＨを初発ｐＨ値の５．５に制御しながら培養を再開した。
【００６４】
ラクトバチルス・カゼイについては、初発ｐＨを６．０とし、培養温度を３０℃としたこと以外は、上記と同様に培養を行った。
【００６５】
各種乳酸菌について、対照実験では、培養開始直後より５Ｎ  ＮａＯＨで中和することで、培養中のｐＨを初発のｐＨ値（５．５または６．０）に維持したこと以外は、同様に行った。
【００６６】
図４〜６は、各種乳酸菌について、培養開始から１８時間まで中和しない場合および中和した場合の、培養１８時間後に糖濃度を再調整した後に発酵を開始してからの液培養中の生成乳酸およびグルコースの濃度の経時変化を示す（図４、ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株；図５、ラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株；および図６、ラクトバチルス・カゼイ）。図４〜６中、横軸は発酵経過時間（ｈ：時間）を示し、縦軸は発酵液中の生成乳酸またはグルコースの濃度（ｇ／Ｌ）を示す。四角は発酵液中に生成した乳酸濃度を表し、丸は発酵液中のグルコース濃度を表し、白記号は対照（培養直後からｐＨを調整した）の結果であり、黒記号は低ｐＨ期あり（培養直後から１８時間まで中和を行わない）の結果である。生成乳酸の濃度は、測定した発酵液中の乳酸濃度から発酵開始直後（糖濃度再調整時）の乳酸濃度を引いた濃度の値として表した。
【００６７】
ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株では、図４に示されるように、培養初期のｐＨを低下させた場合、グルコースの消費速度が速く、乳酸の生成も促進された。低ｐＨ期ありと対照との間の培養１８時間後の糖濃度がやや高いことは、操作上の誤差によるものであった。このような糖濃度の差異を考慮しても、低ｐＨ期ありの場合において、グルコースの消費速度は促進されており、また、乳酸濃度も高められていると判断できた。すなわち、出発糖濃度（培養１８時間後の糖濃度）を対照と同じ濃度に換算しても、低ｐＨ期ありの場合に、高められた生成乳酸量が観察された。
【００６８】
ラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株のようなキシロース資化能を付与した株でも、図５に示されるように、培養初期のｐＨを低下させた場合、グルコースの消費速度が速く、生成乳酸濃度も高くなった。
【００６９】
ラクトバチルス・カゼイでも、図６に示されるように、培養初期のｐＨを低下させた方がグルコースの消費速度が速く、生成乳酸濃度も高くなった。
【００７０】
以上のように、用いた種々の菌体のいずれにおいても、培養初期のｐＨを低下させた方がグルコースの消費速度が速く、生成乳酸濃度も高くなることが確認することができた。
【００７１】
（実施例３：栄養源無添加でのｐＨ制御による乳酸発酵の影響）
破砕済みの玄米２００ｇを蒸留水に溶解し、１Ｌ容量に調整したものを３Ｌ容量の発酵槽（微生物用ファーメンター：EYELA社製）にて６０℃で３時間加熱し、その後最終的に３７℃で保温し、発酵用培地を得た。
【００７２】
他方、乳酸菌ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株を、２％（v/v）ＣＳＬおよび０．５％（w/v）可溶性デンプンを蒸留水中に含む培地において、３７℃で２０時間静置培養させた後、８，０００Ｇで５分間遠心分離にて集菌し、０．８５％生理食塩水に懸濁した。
【００７３】
上記加熱滅菌した発酵用培地に、上記乳酸菌の懸濁液５０ｍＬおよび糖化酵素（グルコチーム＃２００００  ０．１ｇ、スピターゼＣＰ−４０ＦＧ  ０．１３ｇ：ともにナガセケムテックス株式会社製）を加え、発酵を開始した。３７℃、２００ｒｐｍで撹拌しながら、発酵開始から０時間または１５時間で５Ｎ  ＮａＯＨ（５Ｍ  ＮａＯＨ）の滴下による中和を開始した。中和開始以降は発酵液のｐＨを６．０に調整し、１４４時間まで発酵を継続した。
【００７４】
図７は、栄養源無添加での玄米からの乳酸発酵において、発酵開始から０時間または１５時間でｐＨ制御を開始した際の、発酵液における乳酸およびグルコースの濃度の経時変化を示す。図中、横軸は発酵経過時間（ｈ：時間）を示し、縦軸は発酵液中の乳酸またはグルコースの濃度（ｇ／Ｌ）を示す。四角は発酵液中の乳酸濃度を表し、丸は発酵液中のグルコース濃度を表し、白記号は発酵開始１５時間（１５ｈ）、黒記号は０時間（０ｈ）の時点でｐＨ制御を行った結果を示す。
【００７５】
以下の表２は、栄養源無添加での玄米からの乳酸発酵において、発酵開始から０時間または１５時間でｐＨ制御を開始した際の発酵１４４時間後の結果を示す。左から順に、発酵液中の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）、中和剤の添加による希釈を考慮した初発発酵液１Ｌあたりの乳酸量ＡＬＡ（ｇ）、米のグルコース含量から算出した乳酸の対糖収率ＹＬＡ／Ｇｌｃ（ｇ／ｇ−グルコース）、発酵液中に残存するグルコース濃度（ｇ／Ｌ）と全糖濃度（ｇ／Ｌ）、およびＤ−乳酸の光学純度（％ｅｅ）を示す。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
図７から明らかなように、発酵開始０時間でｐＨ制御を行った場合（対照）、グルコースの消費速度が小さく、発酵後期（発酵７２時間以降）になっても高い濃度のグルコースが残存していたが、１５時間後にｐＨ制御を開始した場合、発酵初期に生じたグルコースは、ｐＨ制御開始以降に速やかに消費され、発酵７２時間以降には極めて低い残存グルコース濃度となった。また、グルコースが多く消費された分、乳酸の生成量が上積みされていた。
【００７８】
さらに表２に示すように、発酵開始１５時間でｐＨ制御を行った場合は、発酵開始０時間でｐＨ制御を行った場合（対照）よりも、乳酸濃度、乳酸量、光学純度および対糖収率が高く、残糖濃度は低い値を示しており、発酵液の品質が著しく向上した。
【００７９】
（実施例４：発酵残渣を繰り返し利用したｐＨ制御による乳酸発酵の影響）
破砕済みの玄米２００ｇを蒸留水に溶解し、１Ｌ容量に調整したものを３Ｌ容量の発酵槽（微生物用ファーメンター：EYELA社製）にて６０℃で３時間加熱し、その後最終的に３７℃で保温し、発酵用培地を得た。
【００８０】
他方、乳酸菌ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株を、２％（v/v）ＣＳＬおよび０．５％（w/v）可溶性デンプンを蒸留水中に含む培地において、３７℃で２０時間静置培養させた後、８，０００Ｇで５分間遠心分離にて集菌し、０．８５％（w/v）生理食塩水に懸濁した。
【００８１】
上記加熱滅菌した発酵用培地に、上記乳酸菌の懸濁液５０ｍＬおよび糖化酵素（グルコチーム＃２００００  ０．３ｇ、スピターゼＣＰ−４０ＦＧ  ０．３９ｇ：ともにナガセケムテックス株式会社製）を加え、発酵を開始した。３７℃、２００ｒｐｍで撹拌しながら、発酵開始から１５時間で５Ｎ  ＮａＯＨ（５Ｍ  ＮａＯＨ）の滴下による中和を開始した。中和開始以降は発酵液のｐＨを６．０に調整し、９６時間まで発酵を継続した。この発酵を１バッチとした。
【００８２】
１バッチの発酵終了後、乳酸発酵液をストレーナーに通過させ、通過した発酵液を回収し、これを１２，０００Ｇで１０分間遠心分離し、４０〜７８ｇ（湿重量）の沈殿物（発酵残渣）を得た。この発酵残渣は乳酸菌を含んだ。この発酵残渣を上記のように加熱殺菌した別の発酵用培地に菌床として添加した。同時に糖化酵素（グルコチーム＃２００００  ０．３ｇ、スピターゼＣＰ−４０ＦＧ  ０．３９ｇ：ともにナガセケムテックス株式会社製）を加え、次バッチの発酵を開始した。同様にして、発酵を１０バッチまで繰り返した。全バッチとも、発酵開始から１５時間で５Ｎ  ＮａＯＨ（５Ｍ  ＮａＯＨ）の滴下による中和を開始した。
【００８３】
図８は、残渣を菌床として繰返し利用して１０バッチの発酵を行った場合において、各バッチにつき発酵開始１５時間の時点からｐＨ６．０制御した際の発酵液における乳酸とグルコース濃度の経時変化を示す。図中、横軸は発酵経過時間（ｈ：時間）を示し、縦軸は発酵液中の乳酸またはグルコースの濃度（ｇ／Ｌ）を示す。また、黒四角は発酵液中の乳酸濃度を表し、白丸は発酵液中のグルコース濃度を表す。
【００８４】
図８に示されるように、長期間、発酵残渣を菌床として繰返し利用することができ、かつ残糖の少ない良好な発酵液を安定して得られることを確認できた。
【００８５】
（実施例５：発酵残渣を利用したｐＨ制御による乳酸発酵の影響）
破砕済みの玄米２００ｇを蒸留水に溶解し、１Ｌ容量に調整したものを３Ｌ容量の発酵槽（微生物用ファーメンター：EYELA社製）にて６０℃で３時間加熱し、その後最終的に３７℃で保温し、発酵用培地を得た。
【００８６】
他方、乳酸菌ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株を、２％（v/v）ＣＳＬおよび０．５％（w/v）可溶性デンプンを蒸留水中に含む培地において、３７℃で２０時間静置培養させた後、８，０００Ｇで５分間遠心分離にて集菌し、０．８５％（w/v）生理食塩水に懸濁した。
【００８７】
上記加熱滅菌した発酵用培地に、上記乳酸菌の懸濁液５０ｍＬおよび糖化酵素（グルコチーム＃２００００  ０．３ｇ、スピターゼＣＰ−４０ＦＧ  ０．３９ｇ：ともにナガセケムテックス株式会社製）を加え、発酵を開始した。３７℃、２００ｒｐｍで撹拌しながら、発酵開始から１５時間で５Ｎ  ＮａＯＨ（５Ｍ  ＮａＯＨ）の滴下による中和を開始した。中和開始以降は発酵液のｐＨを６．０に調整し、９６時間まで発酵を継続した（第１バッチの発酵）。
【００８８】
１バッチの発酵終了後、乳酸発酵液をストレーナーに通過させ、通過した発酵液を回収し、これを１２，０００Ｇで１０分間遠心分離し、４０〜７８ｇ（湿重量）の沈殿物（発酵残渣）を得た。この発酵残渣は乳酸菌を含んだ。この発酵残渣を上記のように加熱殺菌した別の発酵用培地に菌床として添加した。同時に糖化酵素（グルコチーム＃２００００  ０．３ｇ、スピターゼＣＰ−４０ＦＧ  ０．３９ｇ：ともにナガセケムテックス株式会社製）を加え、次バッチ（第２バッチ）の発酵を開始した。但し、この第２バッチの発酵では、発酵開始から０時間で５Ｎ  ＮａＯＨ（５Ｍ  ＮａＯＨ）の滴下による中和を開始した。
【００８９】
図９は、残渣を菌床として利用し、発酵開始１５時間の時点からｐＨ６．０制御した際の第１バッチの発酵および発酵開始０時間の時点からｐＨ６．０制御した際の第２バッチの発酵を行った場合における発酵液における乳酸とグルコース濃度の経時変化を示す。図中、横軸は発酵経過時間（ｈ：時間）を示し、縦軸は発酵液中の乳酸またはグルコースの濃度（ｇ／Ｌ）を示す。黒四角は発酵液中の乳酸濃度を表し、白丸は発酵液中のグルコース濃度を表す。
【００９０】
図９に示されるように、発酵開始１５時間の時点からｐＨ６．０制御した第１バッチの発酵に比較して、発酵開始から０時間の時点からｐＨ６．０制御した第２バッチの発酵では、発酵液中の残糖が多く、乳酸濃度の低下が見られた。
【００９１】
（実施例６：セルロース系原料でのｐＨ制御による乳酸発酵の影響）
広葉樹パルプ（粉末）１５ｇおよびバーレックス（三和酒類株式会社製）６ｍＬを蒸留水に溶解し、ｐＨを５．５に合わせてから１００ｍＬ容量に調整し、発酵用培地を調製した。この発酵用培地１００ｍＬを２００ｍＬ容量の発酵槽（セパラブルフラスコ）に移して１２１℃、１５分オートクレーブにて滅菌し、その後最終的に３７℃で保温した。
【００９２】
他方、乳酸菌ラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株を、６％（v/v）バーレックス、０．４％（w/v）グルコースおよび０．１％（w/v）キシロースを蒸留水中に含む培地において、３７℃にて静置培養させ、菌懸濁液とした。
【００９３】
上記加熱滅菌した発酵用培地に、上記乳酸菌の懸濁液５ｍＬおよび糖化酵素（Ｃｔｅｃ２：ノボザイムズ社製）を２．５５ｍＬ加え、発酵を開始した。３７℃下にて撹拌しながら、ｐＨ６．０に微調整後、発酵開始から１５時間の時点で、５Ｎ  ＮａＯＨ（５Ｍ  ＮａＯＨ）の滴下による中和を開始した。中和開始以降は発酵液のｐＨを６．０に調整（エイブル株式会社製のｐＨコントローラーを使用）し、１６１時間まで発酵を継続した。
【００９４】
対照実験として、同様に上記加熱滅菌した発酵用培地に、上記乳酸菌の懸濁液５ｍＬおよび糖化酵素（Ｃｔｅｃ２：ノボザイムズ社製）を２．５５ｍＬ加え、発酵を開始した。３７℃下にて撹拌し、発酵開始時点から、５Ｎ  ＮａＯＨ（５Ｍ  ＮａＯＨ）の滴下により発酵液のｐＨを５．５に調整（エイブル株式会社製のｐＨコントローラーを使用）し、１６５時間まで発酵を継続した。
【００９５】
図１０には、セルロース系原料を用いて、発酵開始１５時間または０時間の時点よりｐＨ制御を行った際の、発酵液における乳酸濃度およびグルコースとキシロースの合計糖濃度の経時変化を示す。図中、横軸は発酵経過時間（ｈ：時間）を示し、縦軸は発酵液中の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）またはグルコースとキシロースの合計の糖濃度（ｇ／Ｌ）を示す。四角は発酵液中の乳酸濃度を表し、丸は発酵液中の糖（グルコースおよびキシロースの合計糖）濃度を表し、白記号は発酵開始１５時間（１５ｈ）、黒記号は０時間（０ｈ）の時点でｐＨ制御を行った結果を示す。
【００９６】
図１０で明らかなように、発酵開始０時間でｐＨ制御を行った場合（対照）、糖の消費速度が小さく、発酵後期（発酵７２時間以降）になっても高い濃度の糖が残存していたが、１５時間後にｐＨ制御を開始した場合、発酵初期に生じた糖は、ｐＨ制御開始以降に速やかに消費され、発酵７２時間以降には極めて低い残存糖濃度となった。また、糖が多く消費された分、乳酸の生成量が上積みされていた。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明によれば、乳酸発酵の過程において培養液（発酵液）のｐＨを制御するという簡便なプロセスで、乳酸を効率的に生産することができる。さらに、培養液（発酵液）中に残存する糖を減らすことができるので、乳酸精製工程が容易になり、また、乳酸エステルを得る場合においても、乳酸エステル収率が改善される。本発明により達成され得る乳酸の生産向上および残糖の低下により、乳酸を原料とするポリ乳酸およびポリエステルポリオール、ならびに農薬または医薬の製造効率の向上およびコストの削減につながる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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