(57)【要約】【課題】継続的な食習慣の悪化により発症する認知機能障害に類似したモデル動物の作成方法を提供する。【解決手段】プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１を非ヒト動物に脳内投与する工程を含む、認知機能障害モデル動物の作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１を非ヒト動物に脳内投与する工程を含む、認知機能障害モデル動物の作製方法。
【請求項２】
脳内投与が脳室内投与である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
認知機能障害が、現代型の食習慣の継続により発症する認知機能障害である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
現代型の食習慣の継続により発症する認知機能障害が、視覚的認知機能及び長期記憶の障害として評価される認知機能障害である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
動物がマウスである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法により作製された認知機能障害モデル動物。
【請求項７】
請求項６記載の認知機能低下モデル動物に被検物質を投与し、認知機能の変化を観察する工程を含む、認知機能障害の予防又は治療剤の評価又は探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知機能障害のモデル動物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症の患者数及び治療等にかかるコストの増加が社会問題となっている。そのため認知症の発症メカニズムやその治療法の研究が盛んに行われているが、そのような研究の遂行には適切な症状を示しかつ簡便に作成可能な実験動物モデルが必要となる。
【０００３】
認知症発症の要因としては、脳内における毒性物質アミロイドβの産生・沈着によるという考え方や、早期からの継続的な生活習慣の悪化による脳内環境の変化によるという考え方が注目を集めている。これらを原因とする認知機能低下を再現するモデルとして、遺伝子組み換えによるアミロイドβ過剰発現動物や高脂肪・高糖質食の継続による認知機能低下誘発モデルなどが報告されているが、これらは作成に時間がかかる、維持が煩雑になるなどの問題があった。一方、簡便な操作で作成可能な認知機能障害モデル動物として、アミロイドβ、またはストレプトゾトシン、スコポラミン、サイトカイン類、抗体などを脳内へ投与する手法が報告されている（非特許文献１、２、３、特許文献１、２）。しかしながら、これら既存の手法で用いる物質は生体に通常存在しない物質であるか、もしくは内因性のものであっても生活習慣の悪化との関連が明らかでないものであるため、生活習慣の悪化により生じる認知機能障害を簡便な操作で再現することは十分に達成されていない。
【０００４】
ＰＡＩ−１（プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１）は組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）やウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）の活性を阻害してプラスミンの産生を抑えることにより、血栓溶解作用を阻害することで知られるタンパク質である。炎症応答因子としての側面もあり、肥満や動脈硬化、肝疾患などに伴って血中濃度が増大することが知られている。
【０００５】
ＰＡＩ−１と認知機能の関連については、軽度認知障害やアルツハイマー型認知症患者の血中及び脳脊髄液中のＰＡＩ−１濃度が増加していることや、アルツハイマー型認知症患者の死後脳においてＰＡＩ−１の発現が増加していることが知られている（非特許文献４、５、６）。また、認知機能障害の診断のための複数のバイオマーカーのうちのひとつにＰＡＩ−１を挙げた例も存在する（特許文献３）。しかし、これらはいずれも、認知機能障害を発症した状態における結果としてのＰＡＩ−１の変化に注目したものであり、脳内におけるＰＡＩ−１増加の原因やその影響について報告した例はない。すなわち、脳内ＰＡＩ−１の変動が認知機能に与える影響についてはこれまでに全く知られておらず、また、食事組成と脳内におけるＰＡＩ−１濃度との関連についても何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−４９１０８号公報
【特許文献２】特開２００４−１８０６５５号公報
【特許文献３】特表２０１７−５００５６２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nature Neuroscience, 2005, 8(1), 79-84
【非特許文献２】Schizophrenia Bulletin, 1999, 25(2), 201-222
【非特許文献３】Life Sciences, 2001, 68(9), 1021-1029
【非特許文献４】Experimental Gerontology, 2014, 60, 87-91
【非特許文献５】Blood Coagul Fibrinolysis. 1994, 5(2),167-171
【非特許文献６】J Cell Mol Med. 2012, 16(4), 865-876
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、現代型の食習慣の継続により発症する認知機能障害に類似した動物モデルの作成方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、食習慣が認知機能の低下に与える影響について検討すべく、老化促進マウスに対し、現代型の食習慣の特徴を反映する食餌として高脂肪食を継続的に摂取したところ、当該マウスの海馬においてＰＡＩ−１の発現が上昇することを見出した。そしてさらに、ＰＡＩ−１を正常マウスの脳内に投与することにより、一過性の認知機能障害を発症するマウスを作製することに成功した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の１）〜３）に係るものである。
１）プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１を非ヒト動物に脳内投与する工程を含む、認知機能障害モデル動物の作製方法。
２）１）の方法により作製された認知機能障害モデル動物。
３）２）の認知機能障害モデル動物に被検物質を投与し、認知機能の変化を観察する工程を含む、認知機能障害の予防又は治療剤の評価又は探索方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、食習慣の悪化により発症する認知機能障害に類似する動物モデルを簡便に提供することができる。この動物は、認知機能障害のメカニズムの解明や、認知機能障害を予防又は改善するための食品や医薬品の開発に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】高脂肪食を継続摂取させた老化促進マウスＳＡＭＰ８の海馬におけるＰＡＩ−１の遺伝子発現の変化を示すグラフ。
【図２】ＰＡＩ−１を脳室内に単回投与したマウスにおける新奇物体認識試験の成績の低下を示すグラフ。
【図３】ＰＡＩ−１を腹腔内に単回投与したマウスにおける新奇物体認識試験の結果を示すグラフ。
【図４】ＰＡＩ−１を脳室内に単回投与したマウスにおける海馬でのＧＬＴ−１、ＥＡＡＣ−１、Ｄｃｘの発現の低下を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において用いられる非ヒト動物の動物種としては、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどのヒト以外の哺乳類が挙げられるが、これまでに多くのデータの蓄積があるげっ歯類が好ましく、より好ましくはマウスである。具体的には、例えばＣ５７ＢＬ／６系マウス、ＤＢＡ／２系マウスなどを挙げることができる。
動物の性別、週齢、体重等については、特に制限はないが、認知機能を評価するうえでマウスであれば生後５−６週齢以上など性成熟した成体の動物を用いることが好ましい。
【００１４】
本発明の認知機能障害モデル動物は、上記の非ヒト動物にＰＡＩ−１を脳内投与することにより作製される。
ＰＡＩ−１（プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１）は、線溶系タンパク質であるプラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ、ｕＰＡ）の阻害分子である。
本発明において用いられるＰＡＩ−１は、ヒト由来のＰＡＩ−１でも非ヒト動物由来（例えばマウス由来、ラット由来）のＰＡＩ−１でもよく、また遺伝子組換え技術により発現させたＰＡＩ−１であってもよい。
例えば、非ヒト動物由来のＰＡＩ−１は、当該動物のＰＡＩ−１産生細胞（例えば、血小板、肝細胞、肝癌細胞、内皮細胞等）から精製することにより得ることができ、ヒト由来のＰＡＩ−１は、例えば、ＷＩ３８  ＶＡ１３  ２ＲＡ株（ＡＴＣＣＣＣＬ７５．１）、ＨＴ１０８０株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１２１）等の公知のヒト由来ＰＡＩ−１産生細胞株の培養上清から得ることができる。また、組換えＰＡＩ−１は、例えば遺伝子組換え技術により作製されたＰＡＩ−１を発現する大腸菌を培養することによって得ることができる。
斯かるＰＡＩ−１は、「ＰＡＩ−１，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ」（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，  Ｉｎｃ，６３７７−１００）等が市販されており、これを使用することもできる。
【００１５】
ＰＡＩ−１は、ＰＡＩ−１を生理食塩水等に溶解し、１〜５０μｇ／ｍＬの溶液として投与するのが好ましい。
投与量は、認知機能障害誘導の点から、ＰＡＩ−１として、５０ｎｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは１００ｎｇ／ｋｇ体重以上、より好ましくは１５０ｎｇ／ｋｇ体重以上であり、且つ１５００ｎｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは１０００ｎｇ／ｋｇ体重以下、より好ましくは５００ｎｇ／ｋｇ体重以下である。また、５０〜１５００ｎｇ／ｋｇ体重、好ましくは  １００〜１０００ｎｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１５０〜５００ｎｇ／ｋｇ体重である。
【００１６】
投与回数は、単回でも十分であるが、１日以上の間隔をあけて２回以上の投与を行ってもよい。
投与方法は、脳内投与であればよいが、好ましくは脳室内投与である。脳室内投与としては、例えば左右の側脳室への投与が挙げられる。
【００１７】
投与後１日以内で認知機能の低下が認められる。したがって、本発明の認知機能低下モデル動物は、ＰＡＩ−１投与後１週間以内、好ましくは３日以内、より好ましくは１日以内に認知機能の評価を開始するのが好ましい。
マウスにおける認知機能の低下は、後記実施例に示すように、新しいものを好むマウスの習性を利用した、物体に関する視覚的記憶の評価系である新奇物体認識試験（Curr Protoc Neurosci., 69, 8.31.1-8.31.17）の保持試行における新奇物体の探索率の低下により判断することができ、探索率が低下したマウスは視覚的認知機能及び長期記憶が障害されていると判定することができる。
【００１８】
斯くして作製された動物は、上記のように視覚的認知機能及び長期記憶が障害され（図２）、また、脳内のグルタミン酸トランスポーターであるＧＬＴ−１やＥＡＡＣ−１、新生神経マーカーであるＤｃｘの発現の有意な低下が見られることから（図４）、海馬におけるグルタミン酸濃度の異常や神経新生の抑制を通じて認知機能障害が引き起こされたものと考えられる。
参考例１で示すように、ＰＡＩ−１の脳内発現の増加は、現代型の食習慣を想定した高脂肪食（（４５ｋｃａｌ％脂肪（ラード使用） 、リサーチダイエット（Ｄ１２４５１ ）））の継続摂取によって齎されることから、斯かるＰＡＩ−１の脳内投与によって認知機能障害が誘発された動物は、高脂肪食の継続摂取のような現代型の食習慣により発症する認知機能障害のモデルとなり得ると考えられる。
ここで、「認知機能」とは、記憶、学習、理解、判断、思考、言語、計算などを含む脳機能を言うが、好ましくは、記憶力、学習力、理解力、判断力及び思考力である。
【００１９】
本発明の方法により作製された認知機能障害モデル動物は、認知機能障害の発症メカニズムの解明や認知機能障害の予防又は治療法の研究、例えば認知機能障害の予防又は治療剤の評価又は探索に用いることができる。
本発明のモデル動物を用いた認知機能障害の予防又は治療剤の評価又は探索は、モデル動物に対して被検物質を経口投与又は非経口投与し、認知機能の変化、例えば上述の新奇物体認識試験における新奇物体の探索率の変化などの治療効果を観察することにより行うことができる。
尚、認知機能障害の予防法の研究は、モデル動物の作製に際し、予め被検物質を投与しておき、その後にＰＡＩ−１を脳内に投与し、認知機能の変化を観察することによっても可能である。
【実施例】
【００２０】
参考例１  現代型の食習慣による脳内ＰＡＩ−１の増加
試験には（株）日本ＳＬＣより購入した加齢促進、記憶学習障害モデルマウスのＳＡＭＰ８マウス（雄、開始時２か月齢）及び対照として同月齢の正常加齢マウスＳＡＭＲ１マウスを用いた。マウスは室温２２±２℃、湿度５５±１０％、照明１２時間サイクル（７：００ａ．ｍ．−７：００ｐ．ｍ．）で飼育し、飲料水は自由摂取とした。
【００２１】
動物は以下の３群に分けた。
１：ＳＡＭＲ１  対照食群（ＳＡＭＲ１）
２：ＳＡＭＰ８  対照食群（ＳＡＭＰ８  ｃｏｎｔｒｏｌ）
３：ＳＡＭＰ８  高脂肪食群（ＳＡＭＰ８  ＨＦ）
【００２２】
ＳＡＭＲ１、ＳＡＭＰ８  ｃｏｎｔｒｏｌには対照食（１０ｋｃａｌ％脂肪、リサーチダイエット（Ｄ１２４５０Ｈ）、組成表（表１））を、ＳＡＭＰ８  ＨＦには高脂肪食（４５ｋｃａｌ％脂肪（ラード使用）、リサーチダイエット（Ｄ１２４５１）、組成表（表１））をそれぞれ１、４または８か月間摂取させた。期間中、餌及び水は自由摂取とした。摂取期間終了後、イソフルランによる深麻酔下、ヘパリン（５  Ｕ／ｍＬ）含有ＰＢＳにて潅流した脳を摘出した。海馬を分離しＲＮＡ分解阻害液（ＲＮＡｌａｔｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，  Ａｍｂｉｏｎ）に浸漬し、使用まで−８０°Ｃで保存した。凍結した海馬は室温にて溶解後、ビーズホモジナイザーにて破砕し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出、ｃＤＮＡを作成してＲＴ−ＰＣＲにより海馬における遺伝子発現解析を実施した。ＲＮｅａｓｙ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡはＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて作成した。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、このｃＤＮＡサンプルにおける各種遺伝子の定量的ＰＣＲを行った。プライマー及びプローブはＴａｑｍａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用し、あらかじめデザインされたものを購入した。解析にはＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。結果は内部標準遺伝子として用いたＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量によって補正した相対値で評価した。
【００２３】
【表１】
2019129765.tif 000002
【００２４】
解析の結果を図１に示す。高脂肪食摂取群において、ＰＡＩ−１の発現に有意な増加が見られた。
以上の結果から、現代型の食習慣に相当する高脂肪食の継続摂取は、海馬におけるＰＡＩ−１の遺伝子発現の増加を引き起こすことが判明した。
【００２５】
実施例１  脳室内ＰＡＩ−１単回投与による認知機能低下モデルマウスの作製
脳室内投与の前日に、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄、１０−１１週齢）を縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ４０ｃｍのプラスチック製ケージに入れ、１０分間環境に馴化させた（馴化試行）。翌日、Ｈｕｍａｎ  ＰＡＩ−１（ＰＡＩ−１，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ，６３７７−１００））を生理食塩水に２ｎｇ／μＬまたは１０ｎｇ／μＬで溶解し、マウスの右側脳室内にいずれかを１μＬずつ投与した（８４．４ｎｇ／ｋｇ体重または４２２ｎｇ／ｋｇ体重）。対照群に対しては、同量の生理食塩水を投与した。投与の３時間後に同じ物体（Ａ１及びＡ２）を設置したケージ内にマウスを入れ、５分間の行動をビデオに記録した（訓練試行）。翌日、１つの物体のみ新しい物体（Ｂ）に換え、再度マウスをケージに入れ、５分間の行動をビデオに記録した（保持試行）。記録した動画を使用し、訓練試行、保持試行中のマウスの各物体への接触回数（物体を鼻先でつついた回数）を探索回数としてカウンターを用い計測した。物体への総探索回数に対する各物体への探索回数の割合を算出した。
【００２６】
新奇物体認識試験の結果を図２に示す。対照群と比較して、２ｎｇ（８４．４ｎｇ／ｋｇ体重）のＰＡＩ−１投与群では保持試行における新奇物体の探索率に低下傾向が見られ（ｐ＝０．０９６）、１０ｎｇ（４２２ｎｇ／ｋｇ体重）のＰＡＩ−１投与群では有意な低下が見られた（ｐ＜０．０１）。このことから、ＰＡＩ−１の脳室内投与はマウスの視覚的認知機能及び長期記憶を障害することが判明した。
【００２７】
ＰＡＩ−１の脳室内投与から４日後に脳を摘出し、ＲＴ−ＰＣＲにて海馬における遺伝子発現解析を実施した。ＲＮｅａｓｙ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡはＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて作成した。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、このｃＤＮＡサンプルにおける各種遺伝子の定量的ＰＣＲを行った。プライマー及びプローブはＴａｑｍａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用し、あらかじめデザインされたものを購入した。解析にはＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。結果は内部標準遺伝子として用いたＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量によって補正した相対値で評価した。
解析の結果を図４に示す。ＰＡＩ−１脳室内投与群において、グルタミン酸トランスポーターであるＧＬＴ−１やＥＡＡＣ１、新生神経マーカーであるＤｃｘの発現の有意な低下が見られた。
【００２８】
以上の結果から、脳室内ＰＡＩ−１投与は海馬におけるグルタミン酸濃度の異常や神経新生の抑制を通じて認知機能の低下を引き起こすことが判明した。
【００２９】
比較例１  腹腔内ＰＡＩ−１単回投与による認知機能への影響の評価
腹腔内投与の前日に、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄、１０−１１週齢）を縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ４０ｃｍのプラスチック製ケージに入れ、１０分間環境に馴化させた（馴化試行）。翌日、Ｈｕｍａｎ  ＰＡＩ−１（ＰＡＩ−１，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ，６３７７−１００））を生理食塩水に０．１μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬで溶解し、マウスの腹腔内にいずれかを２．５ｍＬ／ｋｇ体重ずつ投与した。対照群に対しては、同量の生理食塩水を投与した。投与の３時間後に同じ物体（Ａ１及びＡ２）を設置したケージ内にマウスを入れ、５分間の行動をビデオに記録した（訓練試行）。翌日、１つの物体のみ新しい物体（Ｂ）に換え、再度マウスをケージに入れ、５分間の行動をビデオに記録した（保持試行）。記録した動画を使用し、訓練試行、保持試行中のマウスの各物体への接触回数（物体を鼻先でつついた回数）を探索回数としてカウンターを用い計測した。物体への総探索回数に対する各物体への探索回数の割合を算出した。
【００３０】
新奇物体認識試験の結果を図３に示す。対照群と比較して、いずれのＰＡＩ−１投与群においても成績の低下は見られなかった。このことから、ＰＡＩ−１の腹腔内投与はマウスの視覚的認知機能及び長期記憶に影響しないことが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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