(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、効率よく合理的にＤ−アルギニンを産生でき、もって様々な飲食品に応用できる方法を開発することにある。【解決手段】  本発明は、乳酸菌を培養するＤ−アルギニン含有組成物の製造方法、ならびに、該方法により製造されたＤ−アルギニン含有組成物に関する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Lactococcus lactis ssp.lactis、Lactococcus lactis ssp.lactis biovar.diacetylactis、Lactococcus lactis ssp.cremoris、Lactobacillus brevisおよびLactobacillus kefirからなる群から選択される乳酸菌を培養する工程を含む、Ｄ−アルギニン含有組成物の製造方法。
【請求項２】
乳酸菌をＬ−アルギニン添加培地で培養する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｌ−アルギニン添加培地が、脱脂粉乳培地またはＭＲＳ培地である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
培養温度が、２０℃〜６０℃である、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により製造された、Ｄ−アルギニン含有組成物。
【請求項６】
神経保護用である、請求項５に記載のＤ−アルギニン含有組成物。
【請求項７】
請求項５または６に記載のＤ−アルギニン含有組成物を含有する飲食品。
【請求項８】
ヨーグルトである、請求項７に記載の飲食品。
【請求項９】
請求項１〜４に記載の製造方法によって製造されたＤ−アルギニン含有組成物からＤ−アルギニンを精製することを含む、Ｄ−アルギニンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−アルギニンを含む組成物およびその製造方法に関する。    
【背景技術】
【０００２】
自然界に存在するアミノ酸の殆どが、Ｌ−アミノ酸であり、古くから、Ｄ−アミノ酸は細菌以外の生物には存在しないと考えられていた。しかし、近年になり、細菌だけでなく、哺乳類を含む幅広い生物においてＤ−アミノ酸が存在することが確認され、ヒトの生体内においても重要な役割を有していることが明らかにされている。
【０００３】
これまでに、乳酸菌を使用したＤ−アミノ酸の製造方法が知られており、例えばＤ−ヒスチジン、Ｄ−セリン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アラニンおよびＤ−リジンを製造する方法（特許文献１〜４）や、Ｄ−アラニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸およびＤ−セリンの含有量に優れた食酢を製造する方法（特許文献５）や、ＧＡＢＡ、Ｄ−アラニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸を製造する方法が知られている（特許文献６）。
【０００４】
これまでに酵素や微生物を使用したＤ−アミノ酸の製造方法も知られている。例えば、微生物を用いてラセミ型アミノ酸中のＬ体のアミノ酸を選択的に分解し、残存するＤ−アミノ酸を分離・採取する方法や（特許文献７）、アシルアミノ酸に対しアミノアシラーゼ活性を有する酵素または微生物を作用させてＤ―アミノ酸を製造する方法が知られている（特許文献８、９）。
【０００５】
近年、Ｄ−アルギニンは、中枢神経系における高レベルのグルチコルチコイドによって誘導される神経毒性に対する神経保護作用を有することが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−４７１２１号
【特許文献２】特開２０１５−４７１２０号
【特許文献３】特開２０１５−４７１１４号
【特許文献４】特開２０１４−１９５４３３号
【特許文献５】特開２０１４−２０７８９１号
【特許文献６】特開２０１３−１６９１５８号
【特許文献７】特開平１０−８０２９７号
【特許文献８】特開平１１−１１３５９２号
【特許文献９】特開２００８−６１６４２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Drug Discov Today. 2014 May;19(5):627-36.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、食品添加物として認められているＤ−アミノ酸は、現状Ｄ−アラニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−メチオニンの４種類のみであり、この４種類もＤ体とＬ体との混合物でしか添加が許されていない。Ｄ−アルギニンは食品添加物として認められておらず、Ｌ体と混合しても添加することは出来ない。したがってＤ−アルギニンを含有する飲食品を提供するためにはＤ−アルギニンが多く含まれる天然食品や食用可能な素材を商品に添加する必要があった。
【０００９】
本発明者らは、Ｄ−アルギニンのもつ有用性に着目し、これをヨーグルトなどの飲食品に応用することにより、人々の健康維持、促進のために極めて有用な機能性食品などを提供できるとの観点から、Ｄ−アルギニンの製造方法について検討してきた。すなわち本発明の課題は、効率よく合理的にＤ−アルギニンを製造でき、もってヨーグルトなどの飲食品に応用できる方法を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねる中で、Ｌ−アルギニン添加培地において、所定の乳酸菌を培養することでＤ−アルギニンが産生されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下のＤ−アルギニン含有組成物の製造方法、および該製造方法で製造された組成物に関する。
［１］  Lactococcus lactis ssp.lactis、Lactococcus lactis ssp.lactis biovar.diacetylactis、Lactococcus lactis ssp.cremoris、Lactobacillus brevisおよびLactobacillus kefirからなる群から選択される乳酸菌を培養する工程を含む、Ｄ−アルギニン含有組成物の製造方法。
［２］  乳酸菌をＬ−アルギニン添加培地で培養する工程を含む、前記［１］に記載の方法。
［３］  Ｌ−アルギニン添加培地が、脱脂粉乳培地またはＭＲＳ培地である、前記［２］に記載の方法。
［４］  培養温度が、２０℃〜６０℃である、前記［１］〜［３］に記載の方法。
［５］  前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法により製造された、Ｄ−アルギニン含有組成物。
［６］  神経保護用である、前記［５］に記載のＤ−アルギニン含有組成物。
［７］  前記［５］または［６］に記載のＤ−アルギニン含有組成物を含有する飲食品。
［８］  ヨーグルトである、前記［７］に記載の飲食品。
［９］  前記［１］〜［４］に記載の製造方法によって製造されたＤ−アルギニン含有組成物からＤ−アルギニンを精製することをさらに含む、Ｄ−アルギニンの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るＤ−アルギニンの製造方法によれば、飲食品や飲食品に添加し得る食品素材として利用可能なＤ−アルギニン含有組成物を提供することができる。また、本発明の製造方法によれば、従来から使用されていた広範な乳酸菌を使用して、Ｄ−アルギニン含有組成物を提供することができる。そして、本発明に係る製造方法によれば、Ｄ−アルギニンを高濃度で含むＤ−アルギニン含有組成物が得られる。また本発明に係るＤ−アルギニン含有組成物は、食経験の豊富な乳酸菌を利用していることから、それ自体を飲食品として利用したり、食品素材として用いることにより、Ｄ−アルギニンを食品添加物として添加することなく、所望の飲食品のアルギニンを富化させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る方法に使用する乳酸菌は、微生物の分類学上の乳酸菌に限定されず、乳酸を産生する菌を全て含み、例えば、Lactococcus属、Lactobacillus属、Streptococcus属、Enterococcus属、Pediococcus属、Leuconostoc属、Bifidobacterium属に属する菌である。また本発明の一態様において、上記の菌を複数組み合わせて使用してもよい。
【００１４】
本発明の一態様において、乳酸菌は、Lactococcus lactis ssp.lactis、Lactococcus lactis ssp.lactis biovar.diacetylactis、Lactococcus lactis ssp.cremoris、Lactobacillus brevisおよびLactobacillus kefirからなる群から選択することができ、好ましくはLactococcus lactis ssp.lactisまたはLactobacillus brevis、特に好ましくはLactococcus lactis ssp.lactisである。
【００１５】
本発明に係る方法において、乳酸菌の培養は、好気条件下、および嫌気条件下のいずれの条件で行ってもよく、培養には、増殖培養や発酵などが含まれる。嫌気条件下で行う場合は、炭酸ガス等を通気しながら培養することができる。また、液体静置培養等の微好気条件下で培養することも可能である。
【００１６】
本発明に係る方法において、Ｌ−アルギニン添加培地は、Ｌ−アルギニンを添加した微生物用培地や、Ｌ−アルギニンを含有する微生物用培地に限定されず、乳酸菌の培養において生育環境を提供する任意の媒体を含み、例えば、発酵乳の製造に使用するＬ−アルギニンを含有する原料乳や、Ｌ−アルギニンを含有する発酵乳などであってよい。本発明の一態様において、Ｌ−アルギニン添加培地は、脱脂粉乳培地またはＭＲＳ培地でよく、好ましくは、脱脂粉乳培地である。
【００１７】
本発明に係る方法において、培養温度は、乳酸菌の培養が可能な温度範囲であればよく、例えば１０℃〜６０℃であり、好ましくは２０℃〜６０℃であり、さらに好ましくは２０℃〜４５℃であり、特に好ましくは、２５℃〜４５℃である。
【００１８】
本発明に係るＤ−アルギニン含有組成物は、例えば、Ｄ−アルギニンを含有する乳酸菌培養液などとして得ることができ、ヨーグルトやチーズ、菓子、清涼飲料水、乳酸菌飲料、乳飲料などの飲食品、食品組成物、飲料組成物、サプリメント、医薬品、流動食、口腔化粧料などの各種製品の原料や、Ｄ−アルギニンを富化するための添加物として用いることができる。また、本発明に係るＤ−アルギニン含有組成物は、かかる組成物自体を、例えば、Ｄ−アルギニンを含有するヨーグルトまたはチーズなどの飲食品、食品組成物、飲料組成物、サプリメント、医薬品、口腔化粧料などとして用いることができる。また、本発明に係る方法によって得られたＤ−アルギニン含有組成物は、例えば、神経保護用として用いることができる。
さらに本発明は、一態様において、例えば、Ｄ−アルギニンを含有する乳酸菌培養液などをさらに精製して、Ｄ−アルギニンを得ることもできる。
【００１９】
本発明に係る方法において、Ｄ−アルギニン含有組成物からＤ−アルギニンを精製する方法としては、通常知られている精製方法を採用することができ、たとえば、イオン交換、ゲルろ過、逆相等の各種クロマトグラフィー、塩析、晶析、溶媒沈殿などの方法が挙げられる。
【００２０】
以下、実施例に基づいて、本発明を具体的に説明する。なお、この実施例は、本発明を限定するものではない。
【００２１】
実施例で使用した微生物について、株名にJCMと記載された菌株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室から入手した基準株である。株名にNCIMBと記載された菌株は、英国NCIMB研究所(National Collection of Industrial and Marine Bacteria)から入手した基準株である。
Lactococcus lactis ssp. lactis OLS3789株は、2012年7月18日付け（原寄託日）で独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号NITE BP-1387の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
Lactococcus lactis ssp. lactis OLS3818株は、2012年7月18日付け（原寄託日）で独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号NITE BP-1389の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
Lactococcus lactis ssp. lactis OLS3301株は、2007年10月4日付け（原寄託日）で独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号NITE BP-432の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
Lactococcus lactis ssp.lactis biovar.diacetylactis OLS3022株は、1989年9月12日付け（原寄託日）で独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号FERM BP-2805の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
Lactococcus lactis ssp. lactis OLS3797株は、2012年7月18日付け（原寄託日）で独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号NITE BP-1388の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
なお、Budapest Notification No. 282 (http://www.wipo.int/treaties/en/notifications/budapest/treaty_budapest_282.html)に記載される通り、独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）が独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＡＩＳＴ−ＩＰＯＤ）より特許微生物寄託業務を承継したため、上記のとおり前記菌株は全て独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
【実施例】
【００２２】
［例１］  
［乳酸菌のＤ−アルギニン生産能の検証］
表１に記載のLactobacillus、Lactococcusの基準株を、ＭＲＳ培地で賦活し、かかる培養液が１％となるように、１％Ｌ−Ａｒｇ含有ＭＲＳ培地に接種し、１６時間、静置状態にて好気培養した。培養温度は、３０℃または３７℃で行なった。次いで、これらの培養液を回収し、１％イソプロパノールで希釈し、遠心分離（２０６３０×g、４℃、５分）し、上清をフィルター濾過（０．２μｍ  ＰＶＤＦ）した。濾過した培養液を、表２に記載の条件でＨＰＬＣに供し、それぞれの培地中に含まれるＤ−アルギニンの濃度を測定した。各菌株のＤ−アルギニン生産量を表１に示す。
【００２３】
【表１】
2019129758.tif 000002
【００２４】
【表２】
2019129758.tif 000003
【００２５】
表１に示した通り、Lactobacillus brevis JCM1059T、Lactococcus lactis ssp. cremoris JCM16167T、Lactobacillus kefir JCM5818T、Lactococcus lactis ssp. lactis JCM5805TにＤ−アルギニンを生産する能力があることを確認した。そこで、Lactococcus lactis ssp.lactisおよびLactobacillus brevisについて、株数を増やしてＤ−アルギニン生産能を検証した。
【００２６】
［例２］
［Lactobacillus brevisおよび各種Lactococcus lactis sspのＤ−アルギニンの生産能の検証］
塩酸でｐＨを調整したＬ−Ａｒｇの水溶液を、１０％還元脱脂粉乳（脱脂粉乳培地）もしくはＭＲＳ培地にＬ−Ａｒｇの終濃度が２％になるよう添加し、１０％還元脱脂乳は９５℃で３分間、ＭＲＳ培地は１２１℃で１５分間殺菌した。Lactobacillus brevisおよびLactococcus lactis sspのＭＲＳ賦活培養液２ｍｌを８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収し、上記培地４ｍｌに接種した。Lactobacillus brevisは３７℃で１６時間、Lactococcus lactis sspは３０℃で８時間、静置状態において好気培養した。表３および表４に、Lactobacillus brevisおよびLactococcus lactis sspのＭＲＳ培地および脱脂粉乳培地におけるＤ−アルギニン生産量を示す。
【００２７】
【表３】
2019129758.tif 000004
【００２８】
【表４】
2019129758.tif 000005
【００２９】
表３および表４より、ＭＲＳ培地および脱脂粉乳培地で培養した場合、Lactobacillus brevis、Lactococcus lactis sspにおいて、Ｄ−アルギニンの十分な生産が確認された。
【００３０】
［例３］
［Lactococcus lactis ssp. lactisのＤ−アルギニン生産能への温度および培養時間の影響］
Lactococcus lactis ssp. lactisに関して、Ｄ−アルギニンの生産に適した培養温度および時間を検証した。
【００３１】
塩酸でｐＨを調整したＬ−Ａｒｇの水溶液を、１０％還元脱脂乳（脱脂粉乳培地）にＬ−Ａｒｇの終濃度が２％になるよう添加し、９５℃で３分間殺菌した。Lactococcus lactis ssp.lactisであるOLS3789、OLS3797、OLS3818株のＭＲＳ賦活培養液２５ｍｌを８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収し、上記培地５０ｍｌに接種した。培養温度は１０℃から６０℃まで５℃刻みに設定し、培養時間は４時間および８時間として、静置状態において好気培養した。表５に各培養温度におけるＤ−アルギニン生産量を示す。
【００３２】
【表５】
2019129758.tif 000006
【００３３】
表５より、Ｄ−アルギニンの生産に適した温度は、３０〜４０℃であり、６０℃以上の温度では生産されないことが分かった。また、培養時間が長いほど、Ｄ−アルギニン濃度も高くなる傾向が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、Ｄ−アルギニン含有組成物の製造方法および該方法により製造されたＤ−アルギニン含有組成物を提供する。