(57)【要約】【課題】  本発明は、新規な油脂高蓄積株を提供することを目的とする。【解決手段】  油脂高蓄積株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株。
【請求項２】
前記油脂酵母が、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）である、請求項1に記載の油脂高蓄積株。
【請求項３】
受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された請求項1又は2に記載の油脂高蓄積株。
【請求項４】
前記油脂酵母が、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）である、請求項1に記載の油脂高蓄積株。
【請求項５】
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかけ、油脂高蓄積株を製造する方法。
【請求項６】
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母に、変異源エチルメタンスルホネート（EMS）処理を行い、その酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかける、請求項5に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【請求項７】
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母に、変異源UV処理を行い、その酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかける、請求項5に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【請求項８】
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母に、変異源エチルメタンスルホネート（EMS）処理を行い、その酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかけ、油脂高蓄積株を製造し、次いで、その油脂高蓄積株に変異源UV処理を行い、その酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかける、請求項5〜7のいずれか1項に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【請求項９】
前記油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属に属する酵母が、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）である、請求項5〜8のいずれか1項に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【請求項１０】
前記油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属に属する酵母が、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）CBS1807株である、請求項5〜9のいずれか1項に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【請求項１１】
受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された油脂高蓄積株を製造する、請求項5〜10のいずれか1項に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【請求項１２】
前記油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母が、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）である、請求項5〜8のいずれか1項に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【請求項１３】
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株を用いて油脂を製造する方法。
【請求項１４】
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株を圧搾し、油脂を抽出する、請求項13に記載の油脂を製造する方法。
【請求項１５】
前記油脂酵母が、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）である、請求項13又は14に記載の油脂を製造する方法。
【請求項１６】
前記油脂酵母が、受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された油脂高蓄積株である、請求項13〜15のいずれか1項に記載の油脂を製造する方法。
【請求項１７】
前記油脂酵母が、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）である、請求項13又は14に記載の油脂を製造する方法。
【請求項１８】
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株の抽出物。
【請求項１９】
前記抽出物が、圧搾抽出物である、請求項18に記載の抽出物。
【請求項２０】
前記抽出物が、油脂である、請求項18又は19に記載の抽出物。
【請求項２１】
前記油脂酵母が、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）である、請求項18〜20のいずれか1項に記載の抽出物。
【請求項２２】
前記油脂酵母が、受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された油脂高蓄積株である、請求項18〜21のいずれか1項に記載の抽出物。
【請求項２３】
前記油脂酵母が、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）である、請求項18〜20のいずれか1項に記載の抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油脂高蓄積株、油脂高蓄積株を製造する方法、油脂高蓄積株を用いて油脂を製造する方法、及び、油脂高蓄積株の抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
我々の生活に油脂は密接に関わっており、その用途は主に食用用途と工業用用途とに分類される。食用用途では調理の際にサラダ油として、また油脂原料をマーガリンやドレッシング等に加工して使用される食品加工油脂がある。工業用用途では燃料や潤滑油としてそのまま使用される他、化学変換を経てシャンプーやリンス、化粧品等の油脂化成品として使用されている。
【０００３】
主要油脂3品（大豆油、菜種油及びパーム油）の油脂の原料は主に菜種、大豆等の種子、パーム、オリーブ等の果肉を圧搾することで得られる植物油である。海外では、油脂の原料となる油糧植物を栽培することで油脂供給が可能である。一方、日本では食用油脂自給率を向上させる為に、日本に適した油脂生産システムの開発が必要である（図1）。
【０００４】
現在、油脂生産方法は油糧植物からの油脂生産に替えて、微生物を用いた油脂の生産が注目されている。本発明者等の研究グループは、酵母による油脂の発酵生産に注目している。酵母の中には糖を油脂に変換し細胞内に油脂を蓄積する油脂酵母が存在し、油脂酵母による油脂生産性は、植物や微細藻類と比較しても非常に効率が良い（表1、非特許文献1〜3）。表1は、植物及び微細藻類、油脂酵母における油脂収率の比較を表す。
【０００５】
【表１】
2019146543.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】正木和夫、家藤治幸、長沼孝文：酵母による木質系バイオマスの軽油代替燃料変換に関する研究開発、クリーンエネルギー、Vol. 19, No. 12, pp. 7-10 (2010).
【非特許文献２】菊川篤：藻類バイオ燃料、株式会社日立総合計画研究所、［online］、［平成30年2月20日検索］、インターネット＜URL：http://www.hitachi-hri.com/keyword/k070.html＞
【非特許文献３】Riesing, T.: Cultivating algae for liquid fuel production, GENI、［online］、［平成30年2月20日検索］、インターネット＜URL：http://www.geni.org/globalenergy/library/technical-articles/generation/future-fuels/permacultureactivist/cultivating-algae-for-liquid-fuel-production/index.shtml＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規な油脂高蓄積株を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明は、新規な油脂高蓄積株を製造する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明は、新規な油脂高蓄積株を用いて油脂を製造する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明は、新規な油脂高蓄積株の抽出物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、産業的な価値の高い油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株を用いて、油脂生産性（油脂合成速度、油脂変換率及び油脂含有量）を向上させる。
【００１２】
項1．
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株。
【００１３】
項2．
前記油脂酵母が、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）である、前記項1に記載の油脂高蓄積株。
【００１４】
項3．
受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された前記項1又は2に記載の油脂高蓄積株。
【００１５】
項4．
前記油脂酵母が、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）である、前記項1に記載の油脂高蓄積株。
【００１６】
項5．
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかけ、油脂高蓄積株を製造する方法。
【００１７】
項6．
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母に、変異源エチルメタンスルホネート（EMS）処理を行い、その酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかける、前記項5に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【００１８】
項7．
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母に、変異源UV処理を行い、その酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかける、前記項5に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【００１９】
項8．
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母に、変異源エチルメタンスルホネート（EMS）処理を行い、その酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかけ、油脂高蓄積株を製造し、次いで、その油脂高蓄積株に変異源UV処理を行い、その酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかける、前記項5〜7のいずれか1項に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【００２０】
項9．
前記油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属に属する酵母が、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）である、前記項5〜8のいずれか1項に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【００２１】
項10．
前記油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属に属する酵母が、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）CBS1807株である、前記項5〜9のいずれか1項に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【００２２】
項11．
受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された油脂高蓄積株を製造する、前記項5〜10のいずれか1項に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【００２３】
項12．
前記油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母が、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）である、前記項5〜8のいずれか1項に記載の油脂高蓄積株を製造する方法。
【００２４】
項13．
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株を用いて油脂を製造する方法。
【００２５】
項14．
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株を圧搾し、油脂を抽出する、前記項13に記載の油脂を製造する方法。
【００２６】
項15．
前記油脂酵母が、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）である、前記項13又は14に記載の油脂を製造する方法。
【００２７】
項16．
前記油脂酵母が、受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された油脂高蓄積株である、前記項13〜15のいずれか1項に記載の油脂を製造する方法。
【００２８】
項17．
前記油脂酵母が、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）である、前記項13又は14に記載の油脂を製造する方法。
【００２９】
項18．
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株の抽出物。
【００３０】
項19．
前記抽出物が、圧搾抽出物である、前記項18に記載の抽出物。
【００３１】
項20．
前記抽出物が、油脂である、前記項18又は19に記載の抽出物。
【００３２】
項21．
前記油脂酵母が、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）である、前記項18〜20のいずれか1項に記載の抽出物。
【００３３】
項22．
前記油脂酵母が、受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された油脂高蓄積株である、前記項18〜21のいずれか1項に記載の抽出物。
【００３４】
項23．
前記油脂酵母が、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）である、前記項18〜20のいずれか1項に記載の抽出物。
【発明の効果】
【００３５】
本発明は、新規な油脂高蓄積株を提供することができる。
【００３６】
本発明は、新規な油脂高蓄積株を製造する方法を提供することができる。
【００３７】
本発明は、新規な油脂高蓄積株を用いて油脂を製造する方法を提供することができる。
【００３８】
本発明は、新規な油脂高蓄積株の抽出物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】日本の油脂供給の現状と対策を表す図である。
【図２】油脂酵母L. starkeyi及び油脂酵母R. toruloitesの微分干渉による顕微鏡観察の様子と電子位顕微鏡観察を表す図である。
【図３】油脂高蓄積変異株の獲得のプロセスを表す図である。
【図４】Percoll密度勾配遠心による油脂高蓄積変異株の濃縮を表す図である。
【図５】油脂酵母L. starkeyiの野生株と油脂高蓄積変異株HA15株の顕微鏡観察を表す図である。
【図６】油脂酵母L. starkeyiの野生株と油脂高蓄積変異株HA15株の顕微鏡観察を表す図である。
【図７】油脂酵母L. starkeyiの野生株と油脂高蓄積変異株HA15株の油脂生産性の比較を表す図である。
【図８】油脂酵母L. starkeyiの野生株と油脂高蓄積変異株HA15株の油脂生産性の比較を表す図である。
【図９】Percoll密度勾配遠心による油脂超高蓄積変異株の濃縮を表す図である。
【図１０】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15、油脂超高蓄積変異株UHA15-11における油脂蓄積性を表す図である。
【図１１】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15、油脂超高蓄積変異株UHA15-11における油脂蓄積性を表す図である。
【図１２】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11の油脂生産性の比較を表す図である。
【図１３】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11の油脂生産性の比較を表す図である。
【図１４】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の各株の総脂質含有量を表す図である。
【図１５】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の各株の脂質組成を表す図である。
【図１６】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15、油脂超高蓄積変異株UHA15-11における油脂蓄積性を表す図である。
【図１７】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15、油脂超高蓄積変異株UHA15-11における油脂蓄積性を表す図である。
【図１８】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11の油脂生産性の比較を表す図である。
【図１９】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11の油脂生産性の比較を表す図である。
【図２０】油脂酵母L. starkeyiの油脂合成経路図を表す図である。
【図２１】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の脂肪酸合成経路に関するACL1、ACL2、ACC1、FAS1、FAS2遺伝子の発現比較を表す図である。
【図２２】油脂酵母L. starkeyiの野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の脂肪酸合成経路に関するACL1、ACL2、ACC1、FAS1、FAS2遺伝子の発現比較を表す図である。
【図２３】油脂酵母R. toruloidesの野生株、油脂高蓄積変異株E1-11、E2-32における油脂蓄積性を表す図である。
【図２４】油脂酵母R. toruloidesの野生株、油脂高蓄積変異株E1-11、E2-32における油脂蓄積性を表す図である。
【図２５】油脂酵母R. toruloidesの野生株、油脂高蓄積変異株E1-11、E2-32の油脂生産性の比較を表す図である。
【図２６】油脂酵母R. toruloidesの野生株、油脂高蓄積変異株E1-11、E2-32の油脂生産性の比較を表す図である。
【図２７】油脂酵母R. toruloidesの野生株、油脂高蓄積変異株E1-11、E2-32の油脂生産性の比較を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、油脂高蓄積株、油脂高蓄積株を製造する方法、油脂高蓄積株を用いて油脂を製造する方法、及び、油脂高蓄積株の抽出物に関する。
【００４１】
（1）油脂高蓄積株
酵母の中には糖を油脂に変換し細胞内に油脂を蓄積する油脂酵母が存在する。油脂酵母の有用性は、その油脂生産性の高さだけではい。油脂酵母は、微細藻類の光合成や油糧植物を栽培する時と比べて広い土地を必要とせず、天候にも左右されないという利点を有する。油脂酵母は、稲わらや廃木材等の非可食バイオマス由来のグルコースやグリセロール、キシロースからの油脂生産が可能である。油脂酵母を利用することで、より効率的で持続的な油脂生産が可能である。
【００４２】
本発明は、油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株である。
【００４３】
本発明では、前記油脂酵母は、リポマイセス・スタルキー（Lipomyces starkeyi）、又はロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）であることが好ましい。
【００４４】
本発明では、前記油脂高蓄積株は、受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された油脂高蓄積株であることが好ましい。
【００４５】
L. starkeyi、R. toruloides等の油脂を高蓄積する酵母（油脂酵母）は、培地中のC／N比や使用する窒素源の違いによって、その油脂生産量を変化させることが可能である。例えば、窒素源が制限され、炭素源が豊富な時（C／N比が高い時）に、油脂を高蓄積させることが可能である。これら油脂酵母では、細胞内の油脂蓄積量を63%程度まで向上させることが可能である。表2に、種々の油脂酵母とその油脂含有率の比較を表す。
【００４６】
【表２】
2019146543.tif 000003
【００４７】
L. starkeyiは、グルコースの他に、フルクトース、デンプン、非可食バイオマスのヘミセルロース由来のキシロース、マンノース等、様々な糖を油脂に変換可能なことから、幅広いバイオマスを原料とした油脂生産も可能である。
【００４８】
L. starkeyiによる油脂生産では、例えば、酒、果実ジュース等の製造時に出る食品・醸造残渣を利用することができる。例えば芋焼酎製造過程で発生する焼酎粕は、製品の2倍量の焼酎粕が発生する。この残渣には芋由来のデンプン及び繊維（セルロース）を多く含んでいる。培地に芋焼酎粕糖化液を加え、L. starkeyiを培養することで、芋焼酎残渣を原料とした油脂生産が可能である。
【００４９】
L. starkeyiは、糖を代謝し油脂に変換し、その油脂は脂肪球という形で菌体内に蓄積される。L. starkeyiは、菌体内に一つの大きな脂肪球を形成する。R. toruloidesは、複数の脂肪球を形成する（図2）。電子顕微鏡のTEM観察では脂肪球に加え、ミトコンドリアや小胞体、核が確認できる。その脂肪球内の油脂成分は、トリアシルグリセロール（TAG）及びステロールエステル（SE）であり、脂肪球の大部分をTAGが占めている。
【００５０】
TAGは、グリセロール骨格に3分子の脂肪酸がエステル結合した物質であり、結合している脂肪酸の炭素数や不飽和結合数によってその油脂の性質が決定する。例えば、不飽和脂肪酸の多いTAGは室温では液状であるが、飽和脂肪酸の多いTAGは固体となる。
【００５１】
L. starkeyiが生産する油脂の脂肪酸組成は、オレイン酸が半分以上を占め、次いでパルミチン酸となり、この2種類で約85%以上を占める（表3）。この脂肪酸組成は、一般的な植物油の脂肪酸組成と類似しているため、食用油として利用することができる。表3は、各生物が生産される油脂における脂肪酸組成の比較を表す。
【００５２】
【表３】
2019146543.tif 000004
【００５３】
オレイン酸（18：1）が豊富なオリーブ油は常温で液体であり、パルミチン酸（16：0）が豊富なパーム油は常温で固体である。
【００５４】
油脂酵母L. starkeyiを用いることで、油脂生産性を向上させることができる。油脂酵母L. starkeyiを用いることで、脂肪酸組成を改変し、高付加価値となる。近年、高度不飽和脂肪酸は、生活習慣病予防等の健康面における機能で注目を浴びている。L. starkeyiが生産する油脂には、オレイン酸（18：1）を高含有し、リノール酸（18：2）も含まれている。
【００５５】
オメガ3脂肪酸であるα-リノレン酸（18：3）の生成には、先ず、Δ9脂肪酸不飽和化酵素によってステアリン酸（18：0）のω9位に二重結合が作られオレイン酸が生成される。次に、ω6位に二重結合を作るΔ12脂肪酸不飽和化酵素によりオレイン酸からリノール酸が生成される。そしてω3位に二重結合を作るΔ15脂肪酸不飽和化酵素によりα-リノレン酸が生成される。
【００５６】
オレイン酸含量の多いL. starkeyiは、Δ12及びΔ15脂肪酸不飽和化酵素に関与する遺伝子を高発現させることで、蓄積油脂の脂肪酸組成におけるオメガ3脂肪酸を高含有させることが可能となり、付加価値を高めることができる。
【００５７】
本発明によれば、油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株から、油脂生産性（油脂合成速度、油脂変換率、油脂含有量）を向上させた油脂高蓄積株を製造することができる。
【００５８】
前記油脂酵母は、リポマイセス・スタルキー（L. starkeyi）又はロドスポリジウム・トルロイデス（R. toruloides）であることが好ましい。
【００５９】
（2）油脂高蓄積株の製造方法
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株のスクリーニング方法を記す。
【００６０】
密度勾配遠心分離法
油脂と水との密度の違いより、油脂高蓄積細胞と油脂低蓄積細胞との密度も同様に異なる。本発明の油脂高蓄積株の製造方法では、この密度の違いを利用することで、油脂高蓄積細胞と油脂低蓄積細胞との分離が可能である。ポリビニルピロリドン（PVP）でコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬（Percoll（登録商標）等）を用いて、密度勾配遠心法（超遠心）で油脂高蓄積株画分を分取し、培養し、更に密度勾配遠心分離（超遠心）という操作を繰り返すことで、油脂高蓄積株の濃縮を行うことができる。つまり、酵母（細胞）を分離することができる。
【００６１】
本発明は、油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母を、PVPでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかけ、油脂高蓄積株を製造する方法である。
【００６２】
PVPでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬は、PVPでコートされた直径 15〜30nm のケイ酸コロイド粒子（含水率23%）より成ることが好ましい。この試薬を用いて、遠心分離において効率的な密度勾配を作成することができる。この試薬は、他の密度勾配の基質と比較して粘性が低く、浸透圧が小さく細胞毒性を持たないために実験操作に適している。
【００６３】
この試薬は、細胞に対する毒性が無く、最高1.3 g／mLまでの密度勾配を作製できる。その密度勾配は、標準的混合法を用いて作製することも、アングルローターで中程度の遠心力で、この試薬を遠心し、自己形成させることができる。この試薬は、分離対象の細胞や細胞内顆粒と同じ浸透圧に調節できる。この試薬は、粘度が低いため、密度勾配を予め作製しておくと、低い遠心力（200〜1,000 gav）で、数分間のうちに細胞分離が完了する。穏和な条件で行うことができ、比較的壊れ易い細胞でも増殖能を保持することができる。この試薬は、細胞、細胞内顆粒、及び約70S以上のウイルスの分離に使用できる。
【００６４】
PVPでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬として、Percoll（GEヘルスケアの登録商標）を用いることができる。
【００６５】
Percoll（登録商標）の仕様
成分：非透析性PVPコーティングしたシリカゾル15〜30 nm
密度：1.130±0.005 g／mL
電気伝導度：1.0 mS／cm
浸透圧：＜25 mOsm／kg H2O
粘度：10±5 cP at 20℃
pH：9.0±0.5 at 20℃
【００６６】
RCF（Relative Centrifugal force、相対遠心力）
これは絶対的な力の単位ではなく、地球の重力に対して何倍の力かという相対的な値であり、単位は（g）又は（×g）と表される。RCFは次の計算式によって算出することができる。RCFは半径では比例して、回転数では2乗に比例して大きくなる。
【００６７】
RCF = 1.12×r×（rpm／1,000）2
R：半径（mm）
rpm（Revolutions (又はRotations) per minute）：1分間回転あたりの回転数
RCFは、好ましくは7,896〜11,844程度であり、より好ましくは14,038〜21,056程度であり、更に好ましくは26,540〜39,810程度である。
【００６８】
超遠心は、例えば、BECKMAN Optima LE-80K、70.1Tiローター、12,000 rpm、20 min、25℃の条件で行うことができる。このRCFは、7,896〜11,844程度である。
【００６９】
Type 70.1Ti（12×13.5 mL）を使う場合、rav（平均半径）：61.2mmを採用する。
【００７０】
12,000rpmの時、RCF = 1.12×61.2mm×（12,000rpm／1,000）2≒9,870×gとなる。
【００７１】
22,000rpmの時、RCF = 1.12×61.2mm×（22,000rpm／1,000）2≒33,175×gとなる。
【００７２】
油脂酵母リポマイセス属に属する酵母への変異処理
油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属に属する酵母への変異処理法は、紫外線(UV)照射、X線照射、γ線照射等の物理的方法や、NTG（N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）、EMS（Ethyl Methanesulfonate、エチルメタンスルホネート）、亜硝酸、ナイトロジェンマスタード、アクリジン系色素等の突然変異誘起処理（変異剤）による化学的方法を用いることができる。化学的方法は、その変異剤の溶液に、酵母を一定時間懸濁させる処理方法である。これらの変異処理法は、適宜、組み合わせて行うことができる。
【００７３】
変異処理法は、EMS処理及び／又はUV照射処理であることが好ましい。
【００７４】
本発明の油脂高蓄積株を製造する方法では、油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母に、変異源EMS処理を行い、その酵母を、PVPでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかけることが好ましい。
【００７５】
本発明の油脂高蓄積株を製造する方法では、油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母に、変異源UV処理を行い、その酵母を、PVPでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかけることが好ましい。
【００７６】
本発明の油脂高蓄積株を製造する方法では、油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母に、変異源EMS処理を行い、その酵母を、PVPでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかけ、油脂高蓄積株を製造し、次いで、その油脂高蓄積株に変異源UV処理を行い、その酵母を、ポリビニルピロリドンでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法にかけることが好ましい。
【００７７】
本発明では、特定の油脂酵母から、PVPでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬を用いた密度勾配遠心法を利用して油脂高蓄積変異株の濃縮を行い、油脂高蓄積変異株を製造（取得）することができる。
【００７８】
本発明の油脂高蓄積株を製造する方法では、前記油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属に属する酵母は、リポマイセス・スタルキー（L. starkeyi）であることが好ましい。油脂高蓄積株を製造する方法では、前記油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する酵母は、ロドスポリジウム・トルロイデス（R. toruloides）であることが好ましい。
【００７９】
本発明の油脂高蓄積株を製造する方法では、前記油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属に属する酵母は、リポマイセス・スタルキー（L. starkeyi）CBS1807株であることが好ましい。油脂酵母L. starkeyiCBS1807株を変異源EMS処理した酵母（細胞群）から密度勾配遠心により油脂高蓄積細胞の濃縮を行い、油脂高蓄積変異株の単離を行うことで、油脂高蓄積変異株HA(High accumulation)を製造（取得）することができる。油脂高蓄積変異株HAは、通常の油脂酵母に比べて、油脂生産性が向上している。
【００８０】
本発明の油脂高蓄積株を製造する方法では、その油脂酵母L. starkeyiから獲得した油脂高蓄積変異株HAを、更に変異源UV処理し、この酵母（細胞群）から密度勾配遠心により油脂高蓄積細胞の濃縮を行い、油脂超高蓄積変異株の単離を行うことで、油脂超高蓄積変異株UHA(Ultra-high accumulation)を製造（取得）することができる。
【００８１】
本発明の油脂高蓄積株を製造する方法で製造する油脂高蓄積株は、一例として、受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された油脂高蓄積株である。
【００８２】
本発明の油脂高蓄積株を製造する方法では、油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属するロドスポリジウム・トルロイデス（R. toruloides）においても、同様に密度勾配遠心法を利用して油脂高蓄積変異株の濃縮を行い、油脂高蓄積変異株を製造（取得）することができる。
【００８３】
（3）油脂高蓄積株を用いる油脂の製造方法
本発明は、油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株を用いて油脂を製造する方法である。
【００８４】
本発明の油脂を製造する方法では、油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株を圧搾し、油脂を抽出することが好ましい。
【００８５】
本発明の油脂を製造する方法では、前記油脂酵母が、リポマイセス・スタルキー（L. starkeyi）であることが好ましい。本発明の油脂を製造する方法では、前記油脂酵母が、ロドスポリジウム・トルロイデス（R. toruloides）であることが好ましい。
【００８６】
本発明の油脂を製造する方法では、用いる油脂酵母は、一例として、受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された油脂高蓄積株である。
【００８７】
（4）油脂高蓄積株の抽出物
本発明は、油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属又は油脂酵母ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する油脂高蓄積株の抽出物である。
【００８８】
本発明では、抽出物は圧搾抽出物であることが好ましい。
【００８９】
本発明では、抽出物は油脂であることが好ましい。
【００９０】
本発明では、抽出物を製造する為に用いる前記油脂酵母はリポマイセス・スタルキー（L. starkeyi）であることが好ましい。本発明では、抽出物を製造する為に用いる油脂酵母はロドスポリジウム・トルロイデス（R. toruloides）であることが好ましい。
【００９１】
本発明では、抽出物を製造する為に用いる油脂酵母は、一例として、受託番号：NITE P-02611によって独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託された油脂高蓄積株であることが好ましい。
【００９２】
L. starkeyiは、糖を代謝し油脂に変換し、その油脂は脂肪球という形で菌体内に蓄積される。L. starkeyiは、菌体内に一つの大きな脂肪球を形成する。R. toruloidesは、複数の脂肪球を形成する。その脂肪球内の油脂成分は、トリアシルグリセロール（TAG）及びステロールエステル（SE）であり、脂肪球の大部分をTAGが占めている。
【００９３】
L. starkeyiが生産する油脂の脂肪酸組成は、オレイン酸が半分以上を占め、次いでパルミチン酸となり、この2種類で約85%以上を占めている。この脂肪酸組成は、一般的な植物油の脂肪酸組成と類似しているため、食用油として利用することができる。
【００９４】
L. starkeyiを用いることで、油脂生産性を向上させることができる。油脂酵母L. starkeyiを用いることで、脂肪酸組成を改変し、高付加価値となる。L. starkeyiが生産する油脂には、オレイン酸（18：1）を高含有し、リノール酸（18：2）も含まれている。
【００９５】
オレイン酸含量の多いL. starkeyiは、Δ12及びΔ15脂肪酸不飽和化酵素に関与する遺伝子を高発現させることで、蓄積油脂の脂肪酸組成におけるオメガ3脂肪酸を高含有させることが可能となり、付加価値を高めることができる。
【００９６】
（5）NITE P-02611菌株
上記方法で得られる具体的な菌株として、例えば独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NMPD)に、受託番号：NITE P-02611として寄託されている油脂酵母リポマイセス（Lipomyces）属に属する菌株を使用することができる。
【００９７】
NPMDへの特許手続上の微生物の寄託
識別表示：UHA15-11
受領番号：NITE AP-02611
（受領証の通知日：2018年1月15日、通知番号：2017-0662）
受託番号：NITE P-02611
（受託証の通知日：2018年2月23日、通知番号：2017-0662）
【００９８】
NITE P-02611は、前記の通り、リポマイセス・スタルキー（L. starkeyi）CBS1807に、変異処理を行い、密度勾配遠心法によるスクリーニング法で製造（取得）したものである。本発明の微生物NITE P-02611菌株の詳細を示す。
【００９９】
NITE P-02611菌株
微生物の種類  酵母
微生物の表示  識別表示：UHA15-11
分類学上の位置  Lipomyces starkeyi
科学的性質  胞形態：細長い卵形、コロニー：クリーム色
原産地  分離源：CBS1807の変異株
培養条件
培地名：YPD培地の組成
Bacto peptone（Difco） 20 g、Yeast extract（Difco） 10 g
Glucose（Wako） 20 g、蒸留水 1 L
培地のpH（滅菌前）：6.6
滅菌温度・時間：121℃、10分
培養温度：30℃
培養期間：96〜120時間
培養方法：好気、振とう培養
長期保存の為の条件：凍結（-80℃）、保護剤の組成：15%グリセロール
生存確認試験の為の条件：凍結の場合、融解温度：4℃
【０１００】
本発明では、油脂酵母L. starkeyiCBS1807株を、変異源EMS処理した酵母（細胞群）から密度勾配遠心により油脂高蓄積細胞の濃縮を行い、油脂高蓄積変異株の単離を行い、油脂高蓄積変異株HA（High accumulation）15の獲得に成功した。この油脂高蓄積変異株HAは、油脂酵母L. starkeyiCBS1807株に比べて、油脂生産性が向上している。
【０１０１】
本発明では、更に、その獲得した油脂高蓄積変異株HA15を、変異源UV処理した酵母（細胞群）から密度勾配遠心により油脂高蓄積細胞の濃縮を行い、油脂超高蓄積変異株の単離を行い、油脂超高蓄積変異株UHA（Ultra-high accumulation）15-11の獲得に成功した。
【０１０２】
この油脂超高蓄積変異株UHA15-11が、NITE P-02611菌株である。
【０１０３】
L. starkeyiから製造（取得）したNITE P-02611菌株は、油脂生産性（油脂合成速度、油脂変換率及び油脂含有量）が向上しており、産業的な価値の高い。
【実施例】
【０１０４】
以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。
【０１０５】
（1）油脂高蓄積株の製造（取得）
野生株L. starkeyi CBS1807株に、変異源エチルメタンスルホネート（Ethyl Methanesulfonate、EMS）を利用して変異導入した。
【０１０６】
油脂と水との密度の違いより、油脂高蓄積細胞と油脂低蓄積細胞との密度も同様に異なる。この密度の違いを利用することで、油脂高蓄積細胞と油脂低蓄積細胞とを分離した。ポリビニルピロリドン（PVP）でコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬として、Percoll（登録商標）を用いて、密度勾配遠心法により油脂高蓄積株画分を分取し、培養し、更に密度勾配遠心分離という操作を繰り返すことで油脂高蓄積株の濃縮を行った。
【０１０７】
野生株L. starkeyi CBS1807株のEMS処理による変異誘発
1．試験管にYPD培地を3 mL加え、そこにストックプレートから野生株L. starkeyi CBS1807株を植菌し、30℃で2日間振とう培養した（前々培養）。
【０１０８】
2．回収した前々培養液を菌体数が1.0×107／mLになるようにL字試験管にYPD培地、10 mLスケールで24時間振とう培養した（前培養）。
【０１０９】
3．回収した前培養液を菌体数が1.0×107／mLになるようにL字試験管にYPD培地、10 mLスケールで24時間振とう培養した（本培養）。
【０１１０】
4．本培養液を全量15 mLチューブに移し、2,270×g、5 min遠心して上清を除いた。
【０１１１】
5．リン酸ナトリウムバッファー10 mLで2回洗浄した。
【０１１２】
6．洗浄した菌体をリン酸ナトリウムバッファー10 mLで懸濁した。
【０１１３】
7．電気的検知帯方式粒度分布測定装置CDA-1000（シスメックス株式会社）を用いて懸濁液の菌体数を測定した。
【０１１４】
8．新しい15 mLチューブに2.0×108 cells分の懸濁液を加えた。
【０１１５】
9．リン酸ナトリウムバッファーで9,660μLまでメスアップした。
【０１１６】
10．処理側にはEMSを340μL加え、コントロールにはリン酸ナトリウムバッファーを340μL加えた。
【０１１７】
11．30℃で30 min振とう処理した。
【０１１８】
12．5,000×gで2 min遠心し、チューブを傾け、その上清を捨て、更に5,000×gで2 min遠心し、上清をきれいに除いた。
【０１１９】
13．5 %チオ硫酸ナトリウム1 mLで2回洗浄した。
【０１２０】
14．YPD培地1 mLで1回洗浄した。
【０１２１】
15．洗浄後の菌体をYPD培地1 mLで懸濁した。
【０１２２】
Percoll試薬を用いた密度勾配遠心法による油脂高蓄積株の濃縮（分離方法）
1．前記野生株L. starkeyi CBS1807株のEMS処理による変異誘発の操作15の懸濁液をSG2%培地で1回洗浄した。
【０１２３】
2．洗浄後の菌体をSG2%培地1 mLで懸濁した。
【０１２４】
3．L字試験管にSG2%培地6 mLと2の懸濁液を加え、30℃で培養した（前々培養）。
【０１２５】
4．200 mLバッフルフラスコにS培地を75 mL加え、菌体数が1.25×106／mLになるように前々培養液を加え、30℃、160 rpmで24時間培養した（前培養）。
【０１２６】
5．200 mLバッフルフラスコにS培地を75 mL加え、菌体数が1.25×106／mLになるように前培養液を加え、30℃、160 rpmで2日間培養した（本培養）。
【０１２７】
6．2日間培養後、サンプルを適宜希釈し、電気的検知帯方式粒度分布測定装置CDA-1000（シスメックス株式会社）を用いて菌体数を測定した。
【０１２８】
7．新しい15 mLチューブに菌体数1.0×109 cells分の懸濁液を分取した。
【０１２９】
8．3,000 rpm、1 min、常温で遠心し、上清を除いた。
【０１３０】
9．1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を500μL加え懸濁した。
【０１３１】
10．前記9の懸濁液全量を1.5 mLチューブに移し、1×PBSで1 mLにメスアップした。
【０１３２】
11．超遠心用チューブにPercoll試薬（PVPでコートされたケイ酸コロイド粒子より成る試薬）を8 mL入れ、前記10の懸濁液全量を加え、懸濁した。
【０１３３】
12．天秤を用いて、1×PBSでバランスを合わせた。
【０１３４】
13．超遠心した。
BECKMAN Optima LE-80K、70.1Tiローター、12,000 rpm (9,870×g)、
20 min、25℃
【０１３５】
14．超遠心後、ピペットマン（P200）で上から1.5 mL×2層分、分取した。
【０１３６】
15．分取した菌体を7.5 mLの1×PBSで洗浄した。
【０１３７】
16．洗浄した菌体をSG2%培地で1回洗浄した。
【０１３８】
17．洗浄した菌体をSG2%培地1 mLに懸濁した。
【０１３９】
18．L字試験管にSG2%培地6 mLと前記17の懸濁液を加え、30℃で培養した（前々培養）。
【０１４０】
以下に濃縮系の概略図を示す。
【０１４１】
【化１】
2019146543.tif 000005
【０１４２】
【表４】
2019146543.tif 000006
【０１４３】
【表５】
2019146543.tif 000007
【０１４４】
上記方法により得られた濃縮画分をプレートに撒き、油脂高蓄積変異候補株としてコロニー単離を行った。その後、油脂高蓄積変異候補株を50 mLチューブで培養した。
【０１４５】
油脂高蓄積変異候補株を、油脂染色蛍光試薬Nile red（蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーによる細胞内脂肪滴検出の生体染色試薬）を利用して、候補株の油脂蓄積をフローサイトメトリーにより解析し、更に顕微鏡観察で脂肪球の大きさを確認することで、油脂高蓄積変異株を選抜した（図3）。
【０１４６】
得られた油脂高蓄積変異株を培養し、経時的に菌体濁度、乾燥菌体重量、細胞数、油脂生産量、残グルコース量を測定した。同時に顕微鏡観察も実施した。
【０１４７】
結果と考察
EMS処理をして変異を誘発させた変異株群を培養し、Percoll試薬を用いた密度勾配遠心法（Percoll密度勾配遠心法）により、油脂高蓄積画分を分取した。この画分を培養し、Percoll密度勾配遠心法による分画を繰り返すことにより、油脂高蓄積変異候補株を含むと考えられる画分を獲得した（図4）。
【０１４８】
図4には、Percoll分離前の本培養液のフローサイトメトリー解析結果を示した。縦に入っている線はコントロールのヒストグラムのピークを基準に引いている。EMSサンプルのヒストグラムがコントロールのそれと比較してどれほど右にシフトしているかの基準線である。 
【０１４９】
得られた画分溶液をプレートに撒き、シングルコロニー単離を行い、70株の油脂高蓄積変異候補株を得た。
【０１５０】
70株の油脂生産性について、（1）油脂染色蛍光試薬Nile redで候補株を染色し、フォローサイトメトリーによりその油脂生産性を評価、（2）顕微鏡で直接油脂の生産性を評価の2段階のスクリーニングを実施した。
【０１５１】
野生株と比較して油脂生産性の高い油脂高蓄積変異株HA（High accumulation）15株の獲得に成功した。
【０１５２】
野生株と油脂高蓄積変異株HA15株の油脂生産性比較
図5及び6に、30℃で培養した際の野生株と油脂高蓄積変異株HA15株の顕微鏡観察結果を示した。
【０１５３】
いずれの株も培養0日目から既に小さな脂肪球を持っていた。
【０１５４】
培養1日目では、その脂肪球が培養0日目よりも大きくなっており、油脂を蓄積し始めていることが確認できる。
【０１５５】
培養2日目には、その脂肪球は3〜5μm程にまで大きくなった。
【０１５６】
培養3日目から野生株と油脂高蓄積変異株の脂肪球の大きさに顕著な違いが見え始め、油脂高蓄積変異株HA15株細胞内の脂肪球は、野生株細胞内の脂肪球より直径が大きいことが確認でき、その脂肪球の直径は10μm程度であった。また、油脂高蓄積変異株HA15株は菌体の粒子径も大きく10μm以上であった。
【０１５７】
また、培養が進むにつれ、小さな脂肪球が多数観察されるようになった。これらは細胞内に蓄積した油脂の分解が起こっていると考えられる。
【０１５８】
図7及び8に、30℃で培養した際の野生株と油脂高蓄積変異株HA15の菌体濁度、細胞濃度、細胞の平均粒子径、残グルコース量、乾燥菌体重量、培地あたりのTAG量、細胞あたりのTAG量、TAG変換率、TAG含有率の経時的変化を示した。
【０１５９】
グルコース濃度5%のS培地で30℃、150 rpmで9日間培養を行い、24時間毎に（A）菌体濁度、（B）細胞濃度、（C）細胞の平均粒子径、（D）残グルコース量、（E）乾燥菌体重量、（F）培地あたりのTAG量、（G）細胞あたりのTAG量、（H）TAG変換率（%）、（I）TAG含有率（%）を測定した。
【０１６０】
菌体あたりのTAG量（mg／108 cells）は、培地あたりのTAG量（g／L）／細胞濃度(cells／mL)、TAG変換率は、培地あたりのTAG量（g／L）/消費グルコース量（g／L）×100、TAG含有率（%）は培地あたりのTAG量（g／L）/乾燥菌体重量（g／L）×100の計算式から算出した。
【０１６１】
また、結果は独立した3回の実験の平均±標準誤差で示した。
【０１６２】
双方の株において菌体濁度OD660は培養4日目まで同程度に上昇していき、その後一定となった（図7（A））。
【０１６３】
細胞濃度は双方の株において培養1日目以降大きな変化がなくなり、一定となった（図7（B））。即ち、それぞれの菌株の主な増殖期間は培養開始1日目までであった。細胞濃度は、HA15株の方が低く、野生株の0.78倍であった（図7（B））。即ち、HA15株は野生株と比較して、細胞分裂速度が遅い。
【０１６４】
双方の株の細胞の平均粒子径は、培養0日目から5日目にかけて徐々に大きくなり、それ以降はわずかに小さくなっていった（図7（C））。HA15株は培養4日目以降の細胞の粒子径が野生株よりも大きく、この粒子径の大きさの違いは顕微鏡観察においても確認できた（図7（C））。
【０１６５】
グルコースの消費については、野生株が培養6日目で培地中の全てのグルコースを消費したのに対し、油脂高蓄積変異株HA15株は培養4日目で培地中のグルコース濃度が0 g／Lとなり、野生株よりおよそ2日速く培地中の全てのグルコースを消費した（図7（D））。
【０１６６】
双方の株において、乾燥菌体重量は培養2日目までは同程度に増加したが、培養3日目以降に油脂高蓄積変異株と野生株の間で差が生じた（図7（E））。
【０１６７】
培地あたりのTAG量は、油脂高蓄積変異株HA15株は培養を通して野生株よりも高い値を示した（図7（F））。最大のTAG量を示した培養4日目においては、HA15株は野生株の1.8倍であった。油脂高蓄積変異株HA15株のTAG量は、培養5日目以降で減少傾向にあるが、これは、油脂高蓄積変異株HA15株は培養4日目には培地中のグルコースを全て消費し、TAGを生産する炭素源がなく、蓄積したTAGをエネルギー源として生育しているためであると考えられる。
【０１６８】
図8（G）に細胞あたりのTAG量を示した。このグラフでは油脂高蓄積変異株HA15株の油脂高蓄積能力の高さがより明確になっている。HA15株は野生株よりも細胞増殖能力が低下したのにも関わらず、 細胞あたりのTAG量は野生株を上回っているため、グルコースが生育のためでなく、TAG合成に優先的に利用されていることが予想される（図8（G））。HA15株は、培地あたりのTAG 量は野生株の1.8 倍（培養4日目）であったのに対し、細胞あたりのTAG量は野生株の2倍（培養4日目）にまで増加した。
【０１６９】
培地あたりのTAG 量や細胞あたりのTAG量と同様に、TAG変換率及びTAG含有率においても油脂高蓄積変異株HA15株は野生株よりも高い値を示した（図8（H）、図8（I））。
【０１７０】
HA15株は、培地あたりのTAG量、細胞あたりのTAG量、TAG変換率、TAG含有率の項目において、全て最も高い値を示しており、油脂蓄積能力が高い株であるということが考えられる。
【０１７１】
表6に、培養4日目における野生株及び油脂高蓄積変異株HA15株のTAG生産性を比較した結果を示した。この時の100 gのグルコースから生産される全バイオマス（TAGを含む）量及びTAG量に着目した。表6は、培養4日目における野生株及び油脂高蓄積変異株におけるTAG生産性の比較を表す。
【０１７２】
【表６】
2019146543.tif 000008
【０１７３】
対糖全バイオマス収率は、乾燥菌体重量（g／L）／消費糖量（g／L）×100、対糖TAG収率は培地あたりのTAG量（g／L）／消費糖量（g／L）×100の計算式から算出した。取得した油脂高蓄積変異株HA15株と野生株の全バイオマス収率がほとんど同じにも関わらずTAG収率は野生株よりも高い。
【０１７４】
培養4日目では、100 gのグルコースから生産される全バイオマス量（対糖全バイオマス収率）は、野生株と油脂高蓄積変異株HA15株ではほとんど違いはない。しかし、100 gのグルコースから生産されるTAG量（対糖TAG収率）においては、油脂高蓄積変異株HA15株は、野生株の1.5倍であった。
【０１７５】
即ち、取得した油脂高蓄積変異株HA15株は野生株と対糖全バイオマス収率がほとんど同じにも関わらず対糖TAG収率は野生株よりも高いことから、グルコースをより優先的にTAG合成に利用しているためにTAGを高蓄積したと考えられる。
【０１７６】
油脂高蓄積変異株HA15株のTAG 生産性は野生株よりも向上したが、油脂高蓄積変異株HA15株はTAGを構成する脂肪酸組成にも変化がみられた（表7）。表7は、培養4日目の野生株及び油脂高蓄積変異株における脂肪酸組成の比較を表す。
【０１７７】
【表７】
2019146543.tif 000009
【０１７８】
グルコース濃度5%のS培地で30℃、150 rpmで培養し、培養4日目の凍結乾燥した菌体を脂肪酸組成分析に使用した。結果は独立した3回の実験の平均値を示した。 
【０１７９】
野生株の脂肪酸組成は、パルミチン酸（C16:0）が42.17%、オレイン酸（C18:1）が55.08%であり、この2種類で全体の97.25%を占めていた。
【０１８０】
油脂高蓄積変異株HA15株においても、パルミチン酸（C16:0）とオレイン酸（C18:1）の2種類で全体のおよそ97%を占めており、野生株と同様の組成であった。しかしHA15株のパルミチン酸含量は50.81%、オレイン酸含量は47.14%であり、このHA15株は野生株と比較してパルミチン酸が約8%増加し、オレイン酸が約8%減少していた。即ち、油脂高蓄積変異株HA15株は炭素鎖長の短い脂肪酸の割合が増加していた。
【０１８１】
（2）油脂超高蓄積株の製造（取得）
前記実験（1）で獲得したHA15 株（EMS処理済み）に対して、UV照射による突然変異誘発を行った。その後、その変異処理菌体を、HA15株を取得した時と同様に、Percoll試薬を用いた密度勾配遠心法により、油脂高蓄積変異株の濃縮を行った。
【０１８２】
油脂高蓄積変異株L. starkeyi HA15 株のUV処理による変異誘発
1．試験管にYPD培地を3 mL加え、そこにストックプレートから油脂高蓄積変異株L. starkeyi HA15株を植菌し、30℃で2日間振とう培養した（前培養）。
【０１８３】
2．回収した前培養液を菌体数が1.0×107／mLになるように植菌し、に7 mL YPD培地が入ったL字試験管で24時間培養した（本培養）。
【０１８４】
3．本培養液を全量15 mLチューブに移し、2,270×gで5分遠心して上清を除いた。
【０１８５】
4．7 mLの1×PBSで菌体を洗浄した。
【０１８６】
5．7 mLの1×PBSで菌体を懸濁した。
【０１８７】
6．電気的検知帯方式粒度分布測定装置CDA-1000（シスメックス株式会社）を用いて懸濁液の菌体数を測定した。
【０１８８】
7．菌体数が1.0×107 cells／mLになるように1×PBSで希釈し、無菌シャーレに10 mL分注した。
【０１８９】
8．UV管からの距離が25 cmになるように菌体溶液を広げたシャーレを設置し、50秒間UV を照射した。
【０１９０】
Pecoll 試薬を用いた密度勾配遠心による油脂超高蓄積株の濃縮（分離方法）
1．前記実験（1）のPercoll試薬を用いた密度勾配遠心法による油脂高蓄積株の濃縮（分離方法）において、油脂高蓄積変異株L. starkeyi HA15 株のUV処理による変異誘発の操作8の菌体を SG 培地（グリセロール濃度 2%）で1回洗浄した。
【０１９１】
2．1 mLのSG培地（グリセロール濃度 2%）で菌体を懸濁した。
【０１９２】
3．L字試験管に6 mLのSG 培地（グリセロール濃度 2%）と前記2の懸濁液を加え、30℃で培養した（前々培養）。
【０１９３】
4．回収した前々培養を菌体数が1.25×106／mLになるように200 mLバッフルフラスコにS培地（グルコール濃度 5%）、75 mLスケールで植菌し、30℃、160 rpmで24時間培養した（前培養）。
【０１９４】
5．回収した前培養液を菌体数が1.25×106／mLになるように200 mLバッフルフラスコにS培地（グルコール濃度 5%）、75 mLスケールで植菌し、30℃、160 rpmで培養した（本培養）。
【０１９５】
6．培養2日目にバッフルを回収し、菌体をセルパック（シスメックス株式会社）で適宜希釈し、CDA-1000（シスメックス株式会社）を用いて菌体数を測定した。
【０１９６】
7．新しい 15 mL チューブに菌体数1.0×109 cells分の懸濁液を分取した。
【０１９７】
8．2,270×g、5 min、常温で遠心し上清を除いた。
【０１９８】
9．1×PBSを1 mL加え懸濁した。
【０１９９】
10．前記7 の懸濁液全量を1.5 mLチューブに移し、2,270×g、5 min、常温で遠心し上清を除いた。
【０２００】
11．1×PBSを1 mL加え懸濁した。
【０２０１】
12．超遠心用チューブに Percoll試薬を8 mL入れ、前記9の懸濁液全量を加えた。
【０２０２】
13．天秤を用いて1×PBSでバランスを合わせ、転倒混和した。
【０２０３】
14．超遠心した。
BECKMAN Optima LE-80K、70.1Tiローター、22,000 rpm（33,175×g）、
20 min、25℃、Slow Accel、No Brake
【０２０４】
15．超遠心後、PERISTA PUMP（ATTO）を用いて上層からおよそ 3 mL分取した。
【０２０５】
16．分取した菌体を5培量の1×PBSで洗浄した。
【０２０６】
17．洗浄した菌体をSG（グリセロール濃度 2%）培地で 1回洗浄した。
【０２０７】
18．洗浄した菌体をSG培地（グリセロール濃度 2%）1 mLに懸濁した。
【０２０８】
19．L 字試験管にSG培地（グリセロール濃度 2%）6 mL と前記18の懸濁液を加え、30℃で培養した（前々培養）。
【０２０９】
コロニー単離後は50 mLチューブを用いた培養を行い顕微鏡観察による評価をした一次スクリーニング、200 mLバッフルフラスコを用いた培養を行い、細胞濃度やTAG量等の測定をすることによって評価した二次スクリーニングによる選抜を行った。
【０２１０】
この二段階のスクリーニングを通過した株で、特に油脂蓄積性が高かった油脂超高蓄積変異株UHA (Ultra-high accumulation)15-11においては、生育やTAG生産性、糖消費速度などの詳細な特徴を捉えるための表現型解析を行った。
【０２１１】
結果と考察
HA15株をUV処理して変異を誘発させた変異株群を培養し、実験で述べたPercoll密度勾配遠心法により、油脂超高蓄積画分を分取した。
【０２１２】
油脂超高蓄積変異株を濃縮していく際には、以下の三点に注目して行った。
【０２１３】
一点目に、超遠心後に形成された菌体層の様子である。Percoll 試薬を用いた密度勾配遠心法による油脂超高蓄積変異株の濃縮は、上層に浮上してきているわずかな細胞を分取し、その後培養して増殖させている。そのため油脂超高蓄積変異株が濃縮されると油脂を高蓄積した細胞の割合が多くなることから、遠心後は変異導入していないコントロール (HA15 株) よりもUV 処理サンプルにおいて上層に浮上してくる細胞が多くなることが予想される。
【０２１４】
二点目に Flow cytometry（FACS）解析した際に得られるヒストグラムである。Percoll による遠心分離をする前に細胞を Nile red 染色し FACS 解析することで、油脂を高蓄積した細胞の割合がコントロールと比較してどのように変化しているか確認した。
【０２１５】
FACS のヒストグラムは、縦軸が細胞数、横軸が蛍光強度を示しているため、油脂高蓄積変異株が濃縮された際に得られるヒストグラムはコントロールよりも右にシフトすると考えられる。
【０２１６】
FACS(fluorescence activated cell sorting)：蛍光抗体で染色した細胞を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって細胞表面にある抗原量を定量的に測定することのできる機器
【０２１７】
三点目に、顕微鏡観察で実際に油脂の蓄積状態を確認した。
【０２１８】
以上の三点を指標として、油脂超高蓄積変異株の濃縮を行い、油脂超高蓄積変異候補株を含む画分を獲得した（図9）。
【０２１９】
得られた画分溶液をプレートに撒き、シングルコロニー単離を行い、得られたコロニーの中からランダムに96株の油脂超高蓄積変異候補株を得た。
【０２２０】
96株の油脂生産性について、（1）顕微鏡による油脂蓄積性、（2）TAG量の測定のスクリーニングを行った。
【０２２１】
HA15株と比較して、油脂生産性の高い油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の獲得に成功した。また、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株取得に利用したPercoll密度勾配遠心による濃縮条件は、油脂高蓄積変異株HA15株の場合の条件と異なり、表8のように条件を変更したため、高確率で取得することが可能になった。表8は、濃縮条件と取得された油脂高蓄積候補株数の比較を表す。
【０２２２】
【表８】
2019146543.tif 000010
【０２２３】
野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の表現型解析
野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の培養を行い、細胞増殖力やTAG生産性を比較した。
【０２２４】
図10及び11は、夫々の株の顕微鏡観察結果を示した。
【０２２５】
野生株や HA15 株は、培養1日目では脂肪球を持っている細胞はほとんど存在しないが、新たに取得した油脂超高蓄積変異株UHA15-11株においては培養1日目からほとんどの細胞が顕微鏡で観察可能な大きさの脂肪球を持っていた。これらは培養0日目においても脂肪球が観察されることから、前培養の時点で既に油脂蓄積が開始していることが考えられる。
【０２２６】
培養が2日、3日と進むにつれ脂肪球は大きくなり、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の油脂蓄積性は野生株やHA15株よりも高いことは明らかである。
【０２２７】
細胞内の脂肪球が最も大きい時期は培養4日目もしくは5日目であり、それ以降は培養が進むにつれ脂肪球が小さくなっている様子が観察された。これは培地中のグルコース枯渇後の蓄積油脂のエネルギー利用のための油脂分解が起こっていると考えられる。
【０２２８】
図12及び13には、30℃で培養した際の菌体濁度、細胞濃度、細胞の平均粒子径、残グルコース量、乾燥菌体重量、pH、培地あたりのTAG量、細胞あたりのTAG量、TAG変換率、TAG含有率の経時的変化を示した。
【０２２９】
グルコース濃度5%のS培地で30℃、150 rpmで10日間培養を行い、24時間毎に（A）菌体濁度、（B）細胞濃度、（C）細胞の平均粒子径、（D）残グルコース量、（E）乾燥菌体重量、（F）pH、（G）培地あたりのTAG量、（H）細胞あたりのTAG量を測定した。
【０２３０】
結果は独立した3回の実験の平均±標準誤差で示した。
【０２３１】
菌体濁度は全ての株においてほぼ同程度に増加していったが、培養 4 日目からわずかに差が生じ始めた。UHA15-11株の菌体濁度は培養4日目以降の増加はみられなかったが、野生株およびHA15株はその後も緩やかに増加していきUHA15-11株を上回った（図12（A））。
【０２３２】
細胞濃度は野生株が最も高く、次いでHA15株であり、新たに取得した油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の細胞増殖力は低下した（図12（B））。UHA15-11株の細胞濃度は、培養5日目においてはHA15株の0.8倍の細胞濃度であった。全ての株において培養0〜2日の期間の細胞濃度の増加率が大きく、培養2〜5日の期間に緩やかに増加し、培養5日目以降はほとんど変化がない。つまり最終的な細胞濃度に違いはあるものの、それぞれの株の細胞増殖に要する期間は同じである。
【０２３３】
細胞の平均粒子径は、UHA15-11株が培養を通してHA15株を上回っていた（図12（C））。また、平均粒子径の大きさと脂肪球の大きさには相関が見られた（図12）。
【０２３４】
グルコースの消費については、培養1日目までは全ての株においてほぼ同程度であったが、培養2日目からグルコースの消費速度に差が生じ始めた。最終的に野生株は培養10日目、HA15株は培養5日目に全てのグルコースを消費したのに対し、UHA15-11株は培養4日目にはほぼ全てのグルコースを消費した（図12（D））。このグルコース消費速度の上昇は、油脂蓄積速度や細胞増殖速度の上昇に繋がることが予想され、取得変異株においては、油脂蓄積速度の向上に大きな影響を与えていると考えられる。
【０２３５】
また、UHA15-11株の乾燥菌体重量は培養3日目からHA15株を上回っており、その差が最も大きかったのは培養 4 日目で、約1.2倍である（図12（E））。この乾燥菌体重量の増加は、蓄積 TAG 量の増加や細胞質量の増加に関係していると考えられ、特に取得油脂超高蓄積変異株においては、蓄積TAG量の増加の依存度が大きいと考えられる。
【０２３６】
図12（F）には培地のpHの経時的変化を示した。L. starkeyiはTCAサイクルで合成したクエン酸を細胞質中に放出するが、油脂高蓄積変異株はそのクエン酸を野生株より効率的に利用することで脂肪酸合成量が向上することが考えられる。つまり、油脂高蓄積変異株は野生株よりも培地中のクエン酸量が減少し、それにより培地のpHが野生株よりも高くなることが予想された。しかし、実際の測定結果では全ての株で培養3日目までに2.6程度まで急速に低下し、株間の違いはみられなかった。
【０２３７】
培地あたりのTAG量において、培養2〜4日目のUHA15-11株はHA15株よりも増加し、培養4日目にHA15株の約1.3倍を示した（図13（G））。
【０２３８】
細胞あたりのTAG量において、培養2〜4日目のUHA15-11株はHA15株よりも増加し、培養4日目にHA15株の約1.4倍を示した（図13（H））。
【０２３９】
（3）HA15 株、UHA15-11株の油脂特性解析
野生株に加え、前記実験（1）及び（2）で獲得したHA15株、UHA15-11株の油脂特性解析を行った。培養3日目又は4日目の油脂蓄積期における夫々の細胞の油脂特性（総脂質、脂質組成、トリアシルグリセロールの脂肪酸組成、ステロールエステル含量）を解析した。
【０２４０】
結果と考察
野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の油脂特性解析
総脂質含有量
図14は各株の総脂質含有量を示す。油脂高蓄積変異株HA15株は、野生株（WT）と比較して約1.47倍、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株は野生株（WT）と比較して約1.80倍、総脂質含量が高かった。
【０２４１】
脂質組成
図15は各株の脂質組成（リン脂質、糖脂質、中性脂質）を示す。各株の間で、糖脂質の量はほとんど変わらなかった。油脂高蓄積変異株HA15株は、野生株と比較してリン脂質量が減少し、中性脂質量が大きく増加していた。また、その傾向は、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株において特に顕著であった。
【０２４２】
油脂超高蓄積変異株UHA15-11株は、産業的有用な脂質の中性脂質が大きく増加していたため、産業上有用な変異株であることが明らかとなった。
【０２４３】
トリアシルグリセロールの脂肪酸組成
表9は、各株のトリアシルグリセロールの脂肪酸組成を示す。油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株は、野生株と比較して、長鎖で不飽和化された脂肪酸の割合が多かった。
【０２４４】
表9は、各株の主要な油脂脂肪酸組成（%）を表す。
【０２４５】
【表９】
2019146543.tif 000011
【０２４６】
ステロールエステル
野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の脂質中には、ステロールエステルは検出されなかった。
【０２４７】
（4）油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の油脂生産性
前記実験（2）で実施した表現型解析の培地条件を、糖濃度5%から7%にし、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の油脂生産性の特徴について解析した。
【０２４８】
結果と考察
野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の表現型解析（グルコース7%）
グルコースを7%含有する培地において、野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の培養を行い、細胞増殖力やTAG生産性を比較した。
【０２４９】
図16及び17は、夫々の株の顕微鏡観察結果を示した。
【０２５０】
油脂超高蓄積変異株UHA15-11株は、野生株やHA15株と異なり、培養1日目で、顕微鏡ではっきりと確認可能な程度の大きさの脂肪球を有していた。また、培養0日目においても脂肪球が観察されたことから、前培養の時点で既に油脂蓄積が開始していることが考えられた。培養が2日、3日と進むにつれ、脂肪球は大きくなり、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の油脂蓄積性は野生株やHA15株よりも高いことは明らかである。
【０２５１】
油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の細胞内の脂肪球が最も大きい時期は、培地中の糖が枯渇する前後の培養4日目もしくは5日目であり、それ以降は培養が進むにつれ脂肪球が小さくなっている様子が観察された。これは培地中のグルコース枯渇後の蓄積油脂のエネルギー利用のための油脂分解が起こっていると考えられる。
【０２５２】
図18及び19には、細胞濃度、細胞の平均粒子径、培地pH、残グルコース量、乾燥菌体重量、pH、培地あたりのTAG量、細胞あたりのTAG量、TAG変換率、TAG含有率の経時的変化を示した。
【０２５３】
グルコース濃度7%のS培地で30℃、150 rpmで8日間培養を行い、24時間毎に（A）細胞濃度、（B）細胞の平均粒子径、（C）pH、（D）残グルコース量、（E）乾燥菌体重量、（F）培地あたりのTAG量、（G）細胞あたりのTAG量、（H）TAG変換率、（I）TAG含油率量を測定した。
【０２５４】
結果は独立した3回の実験の平均±標準誤差で示した。
【０２５５】
細胞濃度は野生株が最も高く、次いでHA15株であり、新たに取得した油脂超高蓄積変異株UHA15-11 株の細胞増殖力は低下した（図18（A））。
【０２５６】
細胞の平均粒子径は、UHA15-11株が培養を通して大きくHA15株を上回っていた（図18（B））。
【０２５７】
また、平均粒子径の大きさと脂肪球の大きさには相関が見られた。培地中のpHは、どの株も同様に培養開始1日目に約pH 2付近まで酸性側に偏り、その後、培養最終日まで一定であった。培地pHの酸性側へのシフトは糖を資化して生産された有機酸が培地中に排出されたためであると考えられる（図18（C））。
【０２５８】
それぞれの株のグルコースの消費速度は、培養1日目までは全ての株においてほぼ同程度であったが、培養2日目からグルコースの消費速度に差が生じ始めた。最終的に油脂超高蓄積変異株UHA15-11株は5日目、油脂高蓄積変異株HA15株は培養8日目に全てのグルコースを消費した（図18（D））。このグルコース消費速度の上昇は、油脂蓄積速度や細胞増殖速度の上昇に繋がることが予想され、取得変異株においては、油脂蓄積速度の向上に大きな影響を与えていると考えられる。
【０２５９】
また、UHA15-11株の乾燥菌体重量は培養2日目からHA15株を上回っており、その差が最も大きかったのは培養4日目で、HA15株の約1.42倍、野生株の約1.67倍であった（図18（E））。この乾燥菌体重量の増加は、蓄積TAG量の増加や細胞質量の増加に関係していると考えられ、特に油脂超高蓄積変異株UHA15-11株においては、蓄積TAG量の増加の依存度が大きいと考えられる。
【０２６０】
UHA15-11 株の培地あたりのTAG量は、培養1日目以降、HA15株を大きく上回り、培養4日目にはHA15株の約2.11倍を示した（図18（F））。
【０２６１】
細胞あたりのTAG量においては、更にその油脂生産性の違いは明確になり、培養4日目のUHA15-11株の細胞あたりのTAG量は、HA15株の約2.23倍、野生株の約4.63倍を示した（図19（G））。
【０２６２】
また、UHA15-11株の培養4日目のTAG変換率は約20%であり、HA15株の約13.7%、野生株の約10.3%を大きく上回った（図19（H））。
【０２６３】
さらにUHA15-11株の培養4日目のTAG含有率は約65%であり、HA15株の約43.6%、野生株の約33.2%を大きく上回った（図19（I））。
【０２６４】
以上の結果は、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株は大きく油脂生産性が向上した優秀な油脂生産株であることを示している。
【０２６５】
（5）油脂合成経路で重要な脂肪酸合成経路に関与する遺伝子発現の解析
前記実験（4）で培養した野生株、油脂高蓄積変異株HA15株、油脂超高蓄積変異株UHA15-11株の油脂合成経路で重要な脂肪酸合成経路に関与する遺伝子の発現ついて詳細に解析した。
【０２６６】
結果と考察
TCAサイクルで合成されたクエン酸は、ミトコンドリアから細胞質に放出され、ATP-citrate lyase（Acl1p／Acl2p）によりオキサロ酢酸とアセチルCoAに変換される。オキサロ酢酸はその後リンゴ酸を経てピルビン酸に変換される。
【０２６７】
この時にピルビン酸と同時に生産されるNADPHは、脂肪酸の炭素鎖を伸長させるためにfatty acid synthase（Fas1p／Fas2p）に利用されるため、TAG合成における重要な補酵素である。脂肪酸合成の際には、アセチルCoAがacetyl-CoA carboxylase（Acc1p）によりマロニルCoAに変換される。その後、Fas1p／Fas2pによる脂肪酸の伸長が行われる（図20）。
【０２６８】
野生株と比較して、油脂蓄積変異株のACL1、ACL2、ACC1、FAS1、FAS2遺伝子はいずれも培養初期に高発現し、その後は培養1日目を境に減少するという発現様式を示した。
【０２６９】
油脂超高蓄積変異株UHA15-11株における培養1日目のこれら遺伝子の発現は、野生株と油脂高蓄積変異株HA15よりも高発現していた（図21及び22）。
【０２７０】
特にUHA15-11株のACL1、ACL2、ACC1遺伝子の発現は、野生株、HA15のそれらの遺伝子と比較して発現量の差が最も大きく、約2倍の発現量であった（図21及び22）。
【０２７１】
ACL1、ACL2、ACC1、FAS1、FAS2遺伝子の高発現は、アシルCoA量の増加に繋がり、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール-3-リン酸、リゾホスファチジン酸、DAGへのアシル基の供給体制が強化され、TAGも高蓄積したと考えられる（図20）。
【０２７２】
（6）油脂酵母R. toruloidesの油脂高蓄積株の製造（取得）
油脂酵母R. toruloidesにおいても、前記実験（1）と同様にEMSにより突然変異を誘発させ、前記実験（2）と同様にPercoll試薬を用いた密度勾配遠心法を利用して油脂高蓄積変異株の濃縮を行い、油脂高蓄積変異株を取得した。
【０２７３】
野生株R. toruloidesのEMS処理による変異誘発
1．-80℃に保存していたR. toruloidesをYPD固体培地に塗布し、30℃で4日間培養した（前培養）。
【０２７４】
2．上記のYPD プレートから菌体を白金耳で掻き取り、10 mLのYPD培地が入ったL字試験管に植菌し、48時間振とう培養した（本培養）。
【０２７５】
3．本培養液を全量15 mLチューブに移し、2,270×g、5 min遠心して上清を除いた。
【０２７６】
4．リン酸ナトリウムバッファー10 mLで2回洗浄した。
【０２７７】
5．洗浄した菌体をリン酸ナトリウムバッファー10 mLで懸濁した。
【０２７８】
6．電気的検知帯方式粒度分布測定装置CDA-1000（シスメックス株式会社）を用いて懸濁液の菌体数を測定した。
【０２７９】
7．2.0×108 cells分の菌体を1.5 mLチューブに集菌し、3,000×g、5分遠心し、上清を捨て、リン酸ナトリウムバッファー1 mLに再懸濁した。
【０２８０】
8．処理側にはEMSを30μL加え、コントロールにはリン酸ナトリウムバッファーを30μL加えた。
【０２８１】
9．30℃で60 min振とう処理した。
【０２８２】
10．5,000×gで2 min遠心し、チューブを傾け、上清を捨て、更に5,000×gで2 min遠心し、上清を除いた。
【０２８３】
11．5 %チオ硫酸ナトリウム1 mLで2回洗浄した。
【０２８４】
12．菌体を1×PBSで1 mLで1回洗浄した。
【０２８５】
13．洗浄後の菌体を1×PBS 1 mLで懸濁した。
【０２８６】
Percoll 濃縮（分離方法）
1．変異処理した菌体群に2% Glucose YPD+Amp+Str培地 9 mLを入れ（全量 10 mL）、30℃で2日間振とう培養した（前々培養）。
【０２８７】
2．前々培養液の菌体数を1.0×107 cells／mLになるように集菌し、LS10培地で洗浄した。懸濁液をLS 10+Amp+Str培地 50 mL（バッフルフラスコ）に植菌し、30℃で1日間培養した（前培養）。
【０２８８】
3．前培養液の菌体数を1.0×107 cells／mLになるように集菌し、懸濁液をLS 10培地 50 mL（バッフルフラスコ）に植菌し、30℃で2日間培養した（本培養）。
【０２８９】
4．4 日間培養後、菌体数を測定した。
【０２９０】
5．1.0×109 cells／mLになるように集菌し、1×PBS(-)で3回洗浄した。
【０２９１】
6．超遠心した。
Percoll 9 mLとPercollマーカーの入った超遠心チューブに培養液100μL入れ、よく振り混ぜ超遠心をかけた。
22,000 rpm、20 min、ACCEL：SLOW、DECEL：NOブレーキ
【０２９２】
7．遠心後、PERISTA PUMPを用いてPercollマーカーより上層を15 mLチューブに分取した。
【０２９３】
8．分取した層が入った15 mLチューブを2,270×g、10分で遠心し上清を捨て、1×PBS(-)を加え懸濁し、2,270×g、10分で遠心した。
【０２９４】
9．上清を捨て、2% Glucose YPD培地1 mLで懸濁し、2,270×g、10分で遠心し、上清を捨て、2% Glucose YPD 培地1 mLで再懸濁した。
【０２９５】
10．2% Glucose YPD+Amp+Str 培地 9 mLと懸濁液1 mLを加え、30℃で3日間振とう培養した（前々培養）。
【０２９６】
11．培養液を100μL分取し3,000×g、5分遠心し、上清を捨て、無菌水及び1×PBS(-)100μLで洗浄した。
【０２９７】
12．2.5×106 cells／mLになるように洗浄した培養液を分取し、1×PBS(-) 1 mLを加えたサンプルをフローサイトメトリーで解析した。
【０２９８】
13．前記10 の操作後、前記2.に戻り培養を繰り返すことで濃縮を行った。
【０２９９】
【表１０】
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【０３００】
蒸留水で溶解後、オートクレーブ121℃、10分。
【０３０１】
アンピシリン、ストレプトマイシンを100μL／mLになるように加えた。
【０３０２】
【表１１】
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【０３０３】
濃縮画分からコロニーを単離し、顕微鏡観察を指標とした一次スクリーニング、細胞あたりの油脂含有量を指標とした二次スクリーニングを行い、油脂高蓄積株E1-11、E2-32の2株を取得した。
【０３０４】
500 mLバッフルフラスコ、200 mLスケールでの野生株及び油脂高蓄積変異株E1-11、E2-32の経時的培養を行った。
【０３０５】
図23及び24に、油脂酵母R. toruloidesの野生株、油脂高蓄積変異株E1-11、E2-32の顕微鏡観察結果を示した。
【０３０６】
顕微鏡観察結果より、いずれの株も培養0日目から小さな脂肪球が確認できた。
【０３０７】
培養1日目ではその脂肪球は若干大きくなっているが、株間での大きな違いは見られなかった。
【０３０８】
培養2日目には、脂肪球が大きくなり油脂を蓄積していることが観察された。この時点で野生株よりも油脂高蓄積変異株の方が、脂肪球が若干大きく、違いが見え始めた。
【０３０９】
培養が3日、4日と進むにつれ、野生株と油脂高蓄積変異株の脂肪球の大きさの差は顕著になり、特に培養 4 日目において蓄積性の差が大きかった。
【０３１０】
培養5日目においては、油脂高蓄積変異株では大きな脂肪球のまわりに小さな脂肪球が観察され、分解が始まっていることが考えられた。
【０３１１】
野生株では、培養 5日目においても4日目に比べ脂肪球が大きくなっており、分解はまだ見られなかったが、培養6日目には、野生株でも小さな脂肪球が確認され始め、全ての株で分解が確認された。
【０３１２】
培養7日目では更に分解が進んでいることが確認できた。
【０３１３】
以上のことから、油脂高蓄積変異株は油脂蓄積、分解時期が野生株よりも早いことが考えられる。
【０３１４】
図25及び26には油脂酵母R. toruloidesの野生株、油脂高蓄積変異株E1-11、E2-32の細胞濃度、菌体濁度、平均粒子径、pH、残グルコース量、細胞あたりの消費グルコース量、乾燥菌体重量の経時的変化を示した。
【０３１５】
グルコース濃度10%のLS10培地で30℃、120 rpmで7日間培養を行い、24時間毎に（A）細胞濃度、（B）菌体濁度、（C）平均粒子径、（D）pH、（E）残グルコース量、（F）細胞あたりの消費グルコース量、（G）乾燥菌体重量を測定した。
【０３１６】
結果は独立した3回の実験の平均±標準誤差で示した。
【０３１７】
細胞濃度は、全ての株において培養2日目まで急激に上昇し、その後4日目まで緩やかに上昇した後、一定になる傾向にあった（図25（A））。野生株と油脂高蓄積変異株を比較すると、培養1日目までは同程度であったが、2日目以降、油脂高蓄積変異株は細胞濃度が低く、野生株の約0.7倍であった。
【０３１８】
菌体濁度は、全ての株で同程度であり、培養4日目まで上昇し、その後一定となった（図25（B））。
【０３１９】
平均粒子径においては、油脂高蓄積変異株が野生株よりも大きい傾向にあった（図25（C））。E1-11では培養0日目から野生株よりも若干大きく、2日目、3日目はほぼ一定となり、その後徐々に大きくなっていった。E2-32では培養を通して大きくなる傾向にあった。
【０３２０】
pHについては、培養1日目で3.7程度に低下し、その後はわずかに上昇するものの、培養を通してほぼ一定で、株間の差はみられなかった（図25（D））。
【０３２１】
残グルコース量（グルコース量の消費）については、培養5日目において全ての株で培地中の全グルコースを消費した（図26（E））。全ての株において培養3日目までは消費速度は一定であったが、油脂高蓄積変異株は、培養3日目から4日目にかけて消費速度が速くなった。
【０３２２】
一方で、細胞あたりの消費グルコース量をみると、油脂高蓄積変異株の方が培養を通して消費速度が速いことがわかる（図26（F））。このことから、一つの細胞が資化するグルコース量は、変異株の方が多いということが言える。
【０３２３】
乾燥菌体重量は、全ての株で培養3日目まで同程度に増加したが、培養4日目において油脂高蓄積変異株が野生株よりも若干上回った（図26（G））。その後、培養5日目には野生株も油脂高蓄積変異株と同程度まで上昇し、その後一定になった。
【０３２４】
次に各株の油脂生産性の比較を図27に示した。
【０３２５】
グルコース濃度10%のLS10培地で30℃、120 rpmで7日間培養を行い、24時間毎に（A）培地あたりのTAG量、（B）細胞あたりのTAG量を測定した。
【０３２６】
結果は独立した3回の実験の平均±標準誤差で示した。
【０３２７】
培地あたりのTAG量は、培養4日目において油脂高蓄積株2株が野生株よりも若干多かったが、野生株、油脂高蓄積株ともに培養を通してほぼ同程度であった（図27（A））。
【０３２８】
油脂高蓄積株は細胞濃度が野生株よりも低いにもかかわらず、培地あたりのTAG量が野生株と同程度であることから（図27（A））、油脂蓄積性が高いことがわかる。油脂高蓄積株では培養5日目が最も高く、その後減少傾向にあった。
【０３２９】
これは、油脂高蓄積株は培養5日目には培地中のグルコースを全て消費しきり（図26（E））、炭素源がなくなったことでTAGを生産できなくなり、蓄積した TAG をエネルギー源としているためであると考えられる。このことから、油脂高蓄積株は、分解関連遺伝子の発現が早く、TAG 分解が野生株よりも早いことが予想される。
【０３３０】
細胞あたりのTAG量については、培養4日目において大きく差が出はじめ、E1-11では、野生株の約1.4倍、E2-32では約1.6倍であった（図27（B））。また、野生株では、培養4日目までほぼ一定速度で油脂蓄積する傾向である一方、油脂高蓄積株は、培養3日目から4日目にかけて急激に油脂蓄積速度が上がる傾向にあった。
【０３３１】
このことから、油脂高蓄積株では、この時期に油脂合成に関与する遺伝子の高発現が予想される。
【０３３２】
油脂高蓄積変異株のTAG生産性の向上を確認することができたが、次に各株の脂肪酸組成を評価するため、培養4日目の抽出油を用いて脂肪酸解析を行った（表12）。表12は、油脂高蓄積変異株の脂肪酸組成解析を表す。
【０３３３】
【表１２】
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【０３３４】
脂肪酸の内訳は、野生株では、パルミチン酸が29.6%、オレイン酸が56.4%であり、この2種類の脂肪酸で約86%を占めていた。
【０３３５】
変異株においては、E1-11でパルミチン酸が26.8%、オレイン酸が59.1%で全体の約86%であり、E2-32では、パルミチン酸が25.9%、オレイン酸が58.9%で全体の約 85%という結果であった。
【０３３６】
全脂肪酸のうち、パルミチン酸とオレイン酸の2種類の脂肪酸で占める割合は、野生株と油脂高蓄積変異株とで同様であったが、油脂高蓄積変異株では野生株と比較してパルミチン酸含量が約4%減少、オレイン酸含量が約3%増加した。
【０３３７】
これら結果から、変異株は野生株よりも、脂肪酸の伸長、不飽和化が進んでいることが考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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