(57)【要約】      （修正有）【課題】栄養油及び／または脂質バイオ燃料を得ることに有用な、微生物から油を回収する方法の提供。【解決手段】油産生微生物から油を回収する方法であって、（ａ）前記微生物を発酵培地で培養する工程と；（ｂ）前記微生物の酵素的加水分解を引き起こす条件下で酵素と前記発酵培地中の前記微生物とを接触させる工程であって、加水分解された微生物が前記油を含む、工程と；（ｃ）前記油を含む前記加水分解微生物から、前記発酵培地の２５〜９５％の水成分を分離する工程と；（ｄ）塩の存在下及び有機溶媒の非存在下において、ステップ（ｃ）で濃縮した加水分解微生物から高温で前記油を抽出する工程であって、抽出により前記加水分解微生物から前記油を分離する、工程と（ｅ）ステップ（ｄ）の前記油を回収する工程とを含む方法。【選択図】図１
2019129835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の集団から脂質を回収する方法であって、
（ａ）微生物の破砕を引き起こす条件下で１つまたは複数の酵素と微生物の集団を接触させることと；
（ｂ）破砕した微生物を濃縮することと；
（ｃ）塩の存在下及び有機溶媒の非存在下において、破砕した微生物から高温で脂質を抽出することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記接触工程が５〜８．５のｐＨで遂行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触工程が約５０℃〜約７０℃の温度で遂行される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記接触工程が１〜２０時間遂行される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記接触工程が１〜８時間遂行される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がプロテアーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素がアルカラーゼ２．４Ｌである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素が０．００１〜０．４％の間の体積／体積の濃度である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が０．０５〜０．２％の間の体積／体積の濃度である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記接触工程が、０．０５％〜０．２％の酵素の存在下において約５５℃で１〜８時間遂行される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記接触工程が界面活性剤の非存在下において遂行される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前処理工程を更に含み、該前処理工程が前記接触工程の前に細胞を破砕することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記濃縮工程が遠心分離を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記濃縮工程が２５％〜９０％の水の除去を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記濃縮工程が８５％の水の除去を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抽出工程の間の高温が７５℃〜９５℃である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抽出工程の間の高温が８５℃である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抽出工程の間に添加される塩の濃度が１％〜５％である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抽出工程の間に添加される塩の濃度が３％〜５％である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抽出工程の間に添加される塩が硫酸ナトリウムである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抽出工程が油の存在下において遂行される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記油がココナッツ油である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抽出工程がバイオ燃料の存在下において遂行される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抽出工程が油またはバイオ燃料の非存在下において遂行される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物の集団が、藻類、菌類、細菌及び原生生物からなる群から選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記微生物の集団がＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属及びその混合物から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記微生物の集団が、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２４５として寄託されたＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の種である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記脂質がドコサヘキサエン酸を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／９１８，８８６号の利益を主張し、その全体は参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
湿式抽出法または乾式抽出法を使用して、微生物（微細藻類等）から油を回収することができる。乾式抽出法において、典型的には微生物は採取され、油の抽出の前に乾燥される。しかしながら、乾燥は高価かつエネルギー多消費型のプロセスである。また、油が多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に富むならば（例えば食品及び栄養サプリメントの適用のために）、プロセスは、乾燥に関与する高温に起因してＰＵＦＡの著しい酸化を引き起こし得る。
【０００３】
更に、典型的には微生物から油を回収する乾式抽出法は有機溶媒（ヘキサン等）により行われ、適切な油収率のために機械的細胞破砕方法とのカップリングが要求される。しかしながら、機械的破砕方法は高価かつエネルギー多消費型である一方で、有機溶媒は引火性かつ毒性があり、最終油製品から除去しなくてはならない。
【発明の概要】
【０００４】
微生物から油（すなわち脂質）を回収する、湿式の溶媒なしの方法が本明細書において提供される。方法は、例えば栄養油及び／または脂質バイオ燃料を得ることに有用である。本明細書において記述される油を回収する方法は、随意に、一体化されたバイオプロセスとして（すなわち「ワンポット」方法として）遂行され得る。
【０００５】
本明細書において記述される微生物の集団から脂質を回収する方法は、微生物の破砕を引き起こす条件下で１つまたは複数の酵素と微生物の集団を接触させることと、破砕した微生物を濃縮することと、塩の存在下及び有機溶媒の非存在下において、破砕した微生物から高温で脂質を抽出することとを含む。随意に、接触工程は発酵培地中で起こる。随意に、接触工程は、５〜８．５以内（例えば約８）のｐＨで遂行され得る。接触工程は、随意に約５０℃〜約７０℃以内の温度で遂行され得る。接触工程は包括的に１〜２０時間（例えば１〜８時間または４時間）遂行され得る。
【０００６】
随意に、接触工程において使用される酵素はプロテアーゼである。酵素は随意にアルカラーゼ２．４Ｌである。随意に、酵素は、約０．００１％〜約０．４％の体積／体積（包括的に）（例えば０．０５〜０．２の間で、または約０．０５、０．１もしくは０．２％で）の濃度である。接触工程は、随意に０．０５〜０．２％（包括的に）の酵素の存在下において５５℃で１〜８時間以内遂行することができる。例えば、接触工程は、０．１％の酵素の存在下において５５℃で４時間遂行され得る。随意に、接触工程は、０．０５％の酵素の存在下において５５℃で６時間遂行される。ｐＨは、接触工程の間に約８．０のｐＨへタイトレーションすることができる。
【０００７】
随意に、接触工程は通気または再循環によって起こる混合を含み得る。随意に、混合は撹拌によって起こらない。
【０００８】
接触工程は界面活性剤の非存在下において遂行され得る。随意に、微生物の集団は接触工程の前に濃縮されない。方法は前処理工程を更に含むことができ、前処理工程は接触工程の前に細胞を破砕することを含む。前処理工程は、化学的、機械的、または酵素的な細胞破砕方法を使用して遂行され得る。
【０００９】
濃縮工程は随意に遠心分離を含む。随意に、濃縮工程は、包括的に２５％〜９５％の水の除去（例えば５０％〜９５％または８５％の水の除去）を含む。
【００１０】
抽出工程の間の高温は、５５℃〜９５℃（例えば７５〜９５℃、または８５℃もしくは９０℃）であり得る。随意に、抽出工程の間に添加される塩の濃度は、１％〜５％または３％〜５％（例えば３％または５％）である。抽出工程における塩は硫酸ナトリウムであり得る。脂質の少なくとも８０％は破砕した微生物から抽出することができる。抽出工程は、油（例えばココナッツ油）もしくはバイオ燃料の存在下において遂行することができるか、または油もしくはバイオ燃料の非存在下において遂行され得る。
【００１１】
随意に、本明細書において記述される微生物の集団から脂質を抽出する方法は、低温殺菌工程を欠く。随意に、本明細書において記述される微生物の集団から脂質を抽出する方法は、乾燥工程を欠く。
【００１２】
微生物の集団は、藻類、菌類、細菌及び原生生物からなる群から選択され得る。随意に、微生物の集団は、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属またはその混合物から選択される。随意に、例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２４５として寄託されるような微生物の集団はＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の種である。
【００１３】
１つまたは複数の実施形態の詳細は以下の図面及び記述中で説明される。他の特色、目的及び利点は、記述及び図面ならびに請求項から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】４０ｍＭ（左側のバー）、１００ｍＭ（中央のバー）及び１６０ｍＭ（右側のバー）の塩酸、リン酸、硫酸、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムにより加水分解した細胞から回収された油のパーセンテージを示すグラフである。
【図２】０．２％（左側のバー）及び０．４％（右側のバー）のビスコザイム、アルカラーゼ、フレーバーザイム及びマンナウェイ酵素により酵素的に加水分解した細胞から回収された油のパーセンテージを示すグラフである。
【図３】４０ｍＭのＨ２ＳＯ４、１６０ｍＭのＨ２ＳＯ４及び０．２％（ｖ／ｖ）のアルカラーゼによる加水分解後に、洗浄されない細胞（左側バー）及び洗浄された細胞（右側バー）から回収された油のパーセンテージを示すグラフである。
【図４】５５℃で１８時間及び７０℃で４時間酵素的に加水分解した細胞から回収された油のパーセンテージを示すグラフである。
【図５】ＴＧ藻類油、バイオ燃料及びＥＥ藻類油の脂質クラスプロファイルを示すグラフである。
【図６】０．４％（ｖ／ｖ）のアルカラーゼにより５５℃で１８時間加水分解されたバイオマス飼料、５５℃で遠心分離後の濃縮した加水分解されたバイオマス、及び５５℃での遠心分離後の培地（左側から右側へ）の描写である。
【図７】図７ＡはＮａ２ＳＯ４及び９０℃加熱により処理された、濃縮した加水分解されたバイオマス飼料の描写である。図７Ｂは９０Ｃで遠心分離後の廃バイオマス（左側）及び９０℃での遠心分離後の回収された油（右側）を示す写真である。
【図８】加水分解時間の関数としての、５５℃及びｐＨ８．０での０．１％（ｖ／ｖ）のアルカラーゼによる酵素的加水分解後の細胞から回収された油のパーセンテージ及び培地中のアミノ酸濃度を示すグラフである。
【図９】加水分解時間の関数としての、５５℃及びｐＨ８．０での０．０５％（ｖ／ｖ）のアルカラーゼによる酵素的加水分解後の細胞から回収された油のパーセンテージ及び培地中のアミノ酸濃度を示すグラフである。
【図１０】ｐＨ３．５、４．５、５．５、６．５、７．５及び８．０で酵素的に加水分解された細胞から回収された油のパーセンテージを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
微生物の集団から脂質を回収する、湿式の溶媒なしの方法が本明細書において記載される。脂質を回収する方法は、微生物の破砕を引き起こす条件下で１つまたは複数の酵素と微生物の集団を接触させることと、破砕した微生物を濃縮することと、破砕した微生物から脂質を抽出することとを含む。細胞破砕は湿式である。抽出は、塩の存在下及び溶媒の非存在下において高温で遂行される。同じ容器内で微生物による油の産生及び細胞破砕を遂行して、油を随意に放出することができるので、本明細書において記述される方法は、「ワンポット」または「一体化」プロセスと称することができる。したがって、下流のプロセッシング工程（例えば油の抽出及び回収）は、上流プロセッシング工程（例えば発酵）の末端で一体化することができる。
【００１６】
Ｉ．微生物
本明細書において記述される方法は微生物の集団から脂質を回収することを含む。本明細書において記述される微生物の集団は、藻類（例えば微細藻類）、菌類（酵母が含まれる）、細菌または原生生物であり得る。随意に、微生物には、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ目のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ類、より具体的にはＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ目のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属及びＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属が含まれる。随意に、微生物の集団には、米国特許第５，３４０，５９４号及び第５，３４０，７４２（それらの全体は参照により本明細書に援用される）中で記述されているようなＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ目が含まれる。微生物は、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の種（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２４５として寄託されたＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の種（すなわちＯＮＣ−Ｔ１８）等）であり得る。
【００１７】
本明細書において記述される方法における使用のための微生物は、多様な脂質化合物を産生することができる。本明細書において使用される時、脂質という用語には、リン脂質、遊離脂肪酸、脂肪酸のエステル、トリアシルグリセロール、ステロール及びステロールエステル、カロテノイド、キサントフィル（例えばオキシカロチノイド）、炭化水素、ならびに当業者に公知の他の脂質が含まれる。
【００１８】
随意に、脂質化合物には、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸及び／または多価不飽和脂肪酸が含まれる。
【００１９】
随意に、脂質化合物には不飽和脂質が含まれる。不飽和脂質には、多価不飽和脂質（すなわち少なくとも２つの不飽和炭素−炭素結合（例えば二重結合）を含有する脂質）または高度不飽和脂質（すなわち４つ以上の不飽和炭素−炭素結合を含有する脂質）が含まれ得る。不飽和脂質の例には、オメガ−３多価不飽和脂肪酸及び／またはオメガ−６多価不飽和脂肪酸（ドコサヘキサエン酸（すなわちＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（すなわちＥＰＡ）ならびに他の天然に存在する不飽和化合物及び多価不飽和化合物等）が含まれる。
【００２０】
ＩＩ．プロセス
発酵
本明細書において記述される微生物は当技術分野において公知の方法に従って培養することができる。例えば、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ（例えばＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の種）は、米国特許ＵＳ２００９／０１１７１９４またはＵＳ２０１２／０２４４５８４（それらの全体は参照により本明細書に援用される）中で記述される方法に従って培養することができる。微生物は増殖培地（「培養培地」としても公知）中で増殖される。多様な培地のうちの任意ものは本明細書において記述される微生物の培養における使用のために適切であり得る。随意に、培地は微生物のための様々な栄養成分（炭素源及び窒素源が含まれる）を供給する。
【００２１】
随意に、本明細書において提供される微生物は、対象となる化合物のバイオマス及び／または産生（例えば油または総脂肪酸（ＴＦＡ）の含有量）を増加させる条件下で培養される。Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ類は、典型的には例えば生理食塩水培地中で培養される。随意に、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ類は、約２．０ｇ／Ｌ〜約５０．０ｇ／Ｌの塩濃度を有する培地中で培養され得る。随意に、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ類は、約２ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌ（例えば約１８ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌ）の塩濃度を有する培地中で培養される。随意に、本明細書において記述されるＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ類は、低い塩条件において増殖させることができる。例えば、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ類は、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ（例えば約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ）の塩濃度を有する培地中で培養され得る。培養培地は随意にＮａＣｌを含む。随意に、培地は、天然または人工的な海塩及び／または人工海水を含む。
【００２２】
従来の方法と比較して、培養培地中の塩素濃度は低減させることができる（すなわちより低い量で）。培養培地は、ナトリウム源として塩化物非含有ナトリウム塩（例えば硫酸ナトリウム）を含むことができる。例えば、培養培地中の総ナトリウムの約１００％、７５％、５０％または２５％未満が、塩化ナトリウムによって供給されるように、総ナトリウムの大部分は非塩化物塩によって供給することができる。
【００２３】
随意に、培養培地は、約３ｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌまたは１２０ｍｇ／Ｌ未満の塩素濃度を有する。例えば、培養培地は、約６０ｍｇ／Ｌ〜１２０ｍｇ／Ｌ以内の塩素濃度を有する。本方法に従う使用のための適切な非塩化物ナトリウム塩の例には、ソーダ灰（炭酸ナトリウム及び酸化ナトリウムの混合物）、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及びその混合物が含まれるが、これらに限定されない。例えば米国特許第５，３４０，７４２号及び第６，６０７，９００号（その各々の全体の内容は参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【００２４】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄの培養のための培地には、多様な炭素源のうちの任意のものが含まれ得る。炭素源の例には、脂肪酸；脂質；グリセロール；トリグリセロール；炭水化物（グルコース、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、フルクトース、デキストロース、キシロース、ラクツロース、ガラクトース、マルトトリオース、マルトース、ラクトース、グリコーゲン、ゼラチン、デンプン（トウモロコシまたは小麦）、アセテート、ｍ−イノシトール（コーンスティープ液に由来する）、ガラクツロン酸（ペクチンに由来する）、Ｌ−フコース（ガラクトースに由来する）、ゲンチオビオース、グルコサミン、α−Ｄ−グルコース−１−リン酸（グルコースに由来する）、セロビオース、デキストリン、及びα−シクロデキストリン（デンプンに由来する）等）；ショ糖（糖蜜から）；ポリオール（マルチトール、エリトリトール、アドニトール及びオレイン酸（グリセロール及びツイーン８０等）等）；アミノ糖（Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＮ−アセチル−β−Ｄ−マンノサミン等）；ならびに任意の種類のバイオマスまたは廃液ストリームが含まれる。
【００２５】
随意に、培地は約５ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの濃度で炭素源を含む。培地は約１：１〜約４０：１の間のＣ：Ｎ（炭素対窒素）の比を有することができる。二相培養を使用する場合、培地は、第１の相のために約１：１〜約５：１、次いで第２の相において約１：１〜約１：ほぼ０（すなわち窒素なしまたは最小）以内のＣ：Ｎ比を有することができる。本明細書において使用される時、最小という用語は、約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、０．２％約未満、０．３％約未満、０．４％約未満、０．５％約未満、または０．１％約未満）を指す。例えば、培地中の最小の窒素は、約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、０．２％約未満、０．３％約未満、０．４％約未満、０．５％約未満、または０．１％約未満）の培地中の窒素を指すことができる。
【００２６】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ類の培養のための培地には、多様な窒素源のうちの任意のものが含まれ得る。例示的な窒素源には、アンモニウム溶液（例えばＨ２Ｏ中のＮＨ４）、アンモニウム塩またはアミン塩（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４、（ＮＨ４）３ＰＯ４、ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４ＯＯＣＨ２ＣＨ３（ＮＨ４Ａｃ））、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、魚粉、グルタミン酸ナトリウム、ダイズ抽出物、カザミノ酸及び穀物粕が含まれる。適切な培地中の窒素源の濃度は、典型的には約１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌ以内の範囲である。
【００２７】
培地は随意にリン酸塩（リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウム等）を含む。培地中の無機塩及び微量栄養素には、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、オルトバナジウム酸ナトリウム、クロム酸カリウム、モリブデン酸ナトリウム、亜セレン酸、硫酸ニッケル、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化コバルト、塩化鉄、塩化マンガン、塩化カルシウム及びＥＤＴＡが含まれ得る。ビタミン（塩酸ピリドキシン、塩酸チアミン、パントテン酸カルシウム、パラアミノ安息香酸、リボフラビン、ニコチン酸、ビオチン、葉酸及びビタミンＢ１２等）を含むことができる。
【００２８】
培地のｐＨは、酸または塩基を使用して、及び／または必要に応じて窒素源を使用して、３．０〜１０．０以内へ調整され得る。随意に、培地は４．０〜６．５のｐＨへ包括的に調整される。培地は滅菌することができる。
【００２９】
一般的には、微生物の培養のために使用される培地は液体培地である。しかしながら、微生物の培養のために使用される培地は固形培地であり得る。本明細書において論じられるような炭素源及び窒素源に加えて、固形培地は、構造的支持を提供する及び／または培地が固体形状であることを可能にする、１つまたは複数の構成要素（例えばアガーまたはアガロース）を含有することができる。
【００３０】
細胞は１日〜６０日間のいつでも培養することができる。随意に、培養は、１４日以下、１３日以下、１２日以下、１１日以下、１０日以下、９日以下、８日以下、７日以下、６日以下、５日以下、４日以下、３日以下、２日以下、または１日以下の間実行される。培養は約４℃〜約３０℃（例えば約１８℃〜約２８℃）の温度で随意に実行される。培養には、通気−振盪培養、振盪培養、静置培養、バッチ培養、準連続培養、連続培養、ローリングバッチ培養、ウェーブ培養、または同種のものが含まれ得る。培養は、従来型の撹拌発酵槽、気泡塔発酵槽（バッチ溶媒または連続培養）、ウェーブ発酵槽などを使用して遂行され得る。
【００３１】
培養は、振盪が含まれる多様な方法のうちの１つまたは複数によってエアレーションされ得る。随意に、振盪は、約１００ｒｐｍ〜約１０００ｒｐｍ（例えば約３５０ｒｐｍ〜約６００ｒｐｍまたは約１００〜約４５０ｒｐｍ）の範囲である。随意に、培養は、バイオマス産生相の間に及び脂質産生相の間に異なる振盪スピードを使用してエアレーションされる。あるいはまたは追加で、振盪スピードは、培養容器のタイプ（例えばフラスコの形またはサイズ）に依存して変動し得る。
【００３２】
随意に、溶存酸素（ＤＯ）のレベルは、脂質産生相の間にあるよりもバイオマス産生相の間により高い。したがって、ＤＯレベルは脂質産生相の間に低減する（すなわちＤＯレベルはバイオマス産生相中の溶存酸素の量よりも少ない）。随意に、溶存酸素のレベルは飽和未満に低減される。例えば、溶存酸素のレベルは非常に低いかまたは場合によっては検出不能なレベルへ低減され得る。
【００３３】
より高い量の所望される化合物を得るために、所望される脂質の産生は、１つまたは複数の培養条件のシフトを含む方法に従って細胞を培養することによって促進され得る。随意に、細胞は最初にバイオマスを最大化する条件下で培養され、続いて１つまたは複数の培養条件は脂質産生性を支援する条件へシフトされる。シフトされる条件には、酸素濃度、Ｃ：Ｎ比、温度及びその組み合わせが含まれ得る。随意に、２ステージ培養が遂行され、第１のステージはバイオマス産生を支援し（例えば、高酸素（例えば一般的にはまたは第２のステージと比較して）、低Ｃ：Ｎ比、及び周囲温度の条件を使用して）、続いて第２のステージは脂質産生を支援する（例えば酸素は減少され、Ｃ：Ｎ比は増加され、温度は減少される）。
【００３４】
低温殺菌
随意に、もたらされたバイオマスを低温殺菌して、細胞を死滅させてバイオマス中に存在する所望されない物質を不活性化する。例えば、バイオマスを低温殺菌して、物質を分解する化合物を不活性化することができる。バイオマスは発酵培地中に存在することができるか、または低温殺菌工程のために発酵培地から単離することができる。低温殺菌工程は、バイオマス及び／または発酵培地を高温へ加熱することによって遂行することができる。例えば、バイオマス及び／または発酵培地は、約５５℃〜約１２１℃（例えば約５５℃〜約９０℃、または約６５℃〜約８０℃）の温度で加熱することができる。随意に、バイオマス及び／または発酵培地は、約４分間〜約１２０分間（例えば約３０分間〜約１２０分間、約４５分間〜約９０分間、または約５５分間〜約７５分間）で加熱することができる。低温殺菌は、当業者に公知であるような適切な加熱手段を使用して（直接的な蒸気噴射によって等）遂行することができる。
【００３５】
随意に、低温殺菌工程は遂行されない（すなわち方法は低温殺菌工程を欠く）。
【００３６】
採取及び洗浄
随意に、バイオマスは当業者に公知の方法に従って採取することができる。例えば、バイオマスは、随意に様々な従来の方法（遠心分離（例えば固体排出遠心分離機）または濾過（例えばクロスフロー濾過）等）を使用して、発酵培地から収集することができ、細胞バイオマスの収集の加速のために沈殿剤（例えばリン酸ナトリウムまたは塩化カルシウム）の使用も含むことができる。
【００３７】
随意に、バイオマスは水により洗浄される。随意に、バイオマスは約３０％の固体まで濃縮することができる。例えば、バイオマスは約５％〜約３０％の固体、約７．５％〜約１５％の固体、もしくは約１５％の固体〜約２０％の固体、または列挙された範囲内の任意のパーセンテージへ濃縮することができる。随意に、バイオマスは、約３０％以下の固体、約２９％以下の固体、約２８％以下の固体、約２７％以下の固体、約２６％以下の固体、約２５％以下の固体、約２４％以下の固体、約２３％以下の固体、約２２％以下の固体、約２１％以下の固体、約２０％以下の固体、約１９％以下の固体、約１８％以下の固体、約１７％以下の固体、約１６％以下の固体、約１５％以下の固体、約１４％以下の固体、約１３％以下の固体、約１２％以下の固体、約１１％以下の固体、約１０％以下の固体、約９％以下の固体、約８％以下の固体、約７％以下の固体、約６％以下の固体、約５％以下の固体、約４％以下の固体、約３％以下の固体、約２％以下の固体、または約１％以下の固体へ濃縮することができる。
【００３８】
加水分解
細胞の加水分解（すなわち細胞破砕）は、化学的、酵素的、及び／または機械的な方法を使用して遂行され得る。随意に、本明細書において記述される方法は乾燥工程を欠く。例えば、バイオマスは、随意に細胞加水分解の前に乾燥されない。随意に、バイオマスは、発酵が完了した後及び接触工程の前に濃縮されない。
【００３９】
細胞の加水分解のための化学的方法は細胞への酸の添加を含むことができ、本明細書において酸加水分解と称される。酸加水分解法において、バイオマスは例えば遠心分離を使用して水により洗浄され、細胞の加水分解の前に上述のように濃縮され得る。随意に、バイオマスは水により約１５％の固体へ濃縮される。
【００４０】
次いで酸は洗浄された湿潤バイオマスへ添加される。随意に、バイオマスは酸の添加の前に乾燥されない。酸加水分解工程における使用のために適切な酸には、硫酸、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硝酸、過塩素酸、及び当業者に公知であるような他の強酸が含まれる。適切な量の酸を洗浄された湿潤バイオマスへ添加して、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ（例えば約１２０ｍＭ〜約１８０ｍＭ、または約１４０ｍＭ〜約１６０ｍＭ）の最終濃度を達成することができる。硫酸は洗浄された湿潤バイオマスへ１６０ｍＭの最終濃度で添加され得る。
【００４１】
次いで水、バイオマス及び酸を含む、もたらされた混合物を、一定の期間でインキュベーションして、細胞を加水分解することができる。随意に、混合物は、約３０℃〜約２００℃の温度でインキュベーションされ得る。例えば、混合物は、約４５℃〜約１８０℃、約６０℃〜約１５０℃、または約８０℃〜約１３０℃の温度でインキュベーションされ得る。随意に、混合物は１２１℃の温度でオートクレーブ中でインキュベーションされる。混合物は、細胞の少なくとも５０％（例えば細胞の少なくとも６０％、細胞の少なくとも７０％、細胞の少なくとも８０％、細胞の少なくとも９０％、細胞の少なくとも９５％、または細胞の１００％）を加水分解するのに適切な一定の期間でインキュベーションされ得る。細胞のインキュベーションのための期間は培養温度に依存する。混合物をより高い温度でインキュベーションすることは、より速い速度で進む加水分解をもたらすことができる（すなわち加水分解のためにより短い期間が要求される）。いくつかの例において、細胞は６０℃で１時間インキュベーションされ得る。
【００４２】
上述のように、細胞加水分解（すなわち細胞破砕）は、酵素的方法を使用して遂行され得る。具体的には、微生物の集団は、微生物の破砕を引き起こす条件下で１つまたは複数の酵素と接触させることができる。随意に、酵素はプロテアーゼである。適切なプロテアーゼの例はアルカラーゼ２．４Ｌ  ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ；Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）である。随意に、細胞は酵素的加水分解の前に水により洗浄されない。随意に、微生物の集団は、酵素的加水分解の前に濃縮されない。
【００４３】
１つまたは複数の酵素と微生物を接触させる前に、発酵培地のｐＨは、随意に約５〜８．５、例えば約５．５〜８．０もしくは約６．５〜７．５、または列挙された範囲内の任意の値に調製され得る。例えば、発酵培地のｐＨは、随意に５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４または８．５へ調整され得る。ｐＨは、例えば塩基（水酸化ナトリウム（例えば１ＮのＮａＯＨ）、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムまたは水酸化カリウム等）を使用して調整され得る。発酵培地のｐＨは接触工程の間にも調整され得る。随意に、ｐＨは、接触工程の前または間に約８．０のｐＨへ調整される。
【００４４】
微生物の集団が発酵培地中にあるときに、微生物は１つまたは複数の酵素と接触させることができる（すなわち接触工程は発酵培地中で起こる）。随意に、発酵培地は、発酵後及び接触工程の前に濃縮される。随意に、発酵培地は、発酵後及び接触工程の前に希釈される。随意に、発酵培地へ添加される酵素は約０．００１％〜約０．４％の体積／体積（ｖ／ｖ）の濃度である。例えば、発酵培地へ添加される酵素は、０．０５％（ｖ／ｖ）〜０．４％（ｖ／ｖ）、０．０５％〜０．２％（ｖ／ｖ）、または０．１％〜０．２（ｖ／ｖ）からの濃度であり得る。いくつかの実施例において、発酵培地へ添加される酵素は、０．０５％（ｖ／ｖ）、０．１％（ｖ／ｖ）、０．１５％（ｖ／ｖ）、０．２％（ｖ／ｖ）、０．２５％（ｖ／ｖ）、０．３０％（ｖ／ｖ）、０．３５％（ｖ／ｖ）または０．４％（ｖ／ｖ）の濃度である。
【００４５】
接触工程は、少なくとも約４５℃の温度で遂行され得る。随意に、接触工程は、約４５℃〜約７０℃、約５０℃〜約７０℃、約５５℃〜約７０℃、または５５℃の温度で遂行される。接触工程を適切な期間で遂行して、微生物の破砕をもたらす。例えば、接触工程は、約１時間〜約２０時間、例えば１時間〜１８時間、１時間〜６時間、４時間〜６時間、または列挙された範囲内の任意の時間枠で遂行され得る。随意に、接触工程は約４時間遂行され得る。
【００４６】
最適温度、時間、ｐＨ及び酵素濃度は具体的な酵素に依存し、与えられた酵素に適切であるように、当業者は温度、時間、ｐＨ及び酵素濃度を修飾することができるだろう。
【００４７】
随意に、接触工程は、約０．０５％（ｖ／ｖ）または約０．２％（ｖ／ｖ）の酵素のいずれかの存在下において約５５℃で約１〜６時間遂行される。例えば、接触工程は、０．１％（ｖ／ｖ）の酵素の存在下において５５℃で４時間遂行され得る。随意に、接触工程は、界面活性剤の非存在下において（すなわち界面活性剤は存在しないで）遂行される。
【００４８】
随意に、細胞破砕は、当業者に公知であるような他の化学的方法及び機械的方法を使用して遂行され得る。例えば、細胞破砕は、アルカリ加水分解、ビーズ粉砕、超音波処理、界面活性剤加水分解、溶媒抽出、急速減圧（すなわち細胞爆弾法）、もしくは高剪断機械的方法、化学物質との接触、ホモジナイゼーション、超音波、粉砕、剪断力、フレンチプレス、コールドプレス、加熱、乾燥、浸透圧衝撃、圧力振動、自己分解遺伝子の発現、またはこれらの組み合わせを使用して遂行され得る。
【００４９】
方法は前処理工程を更に含むことができ、前処理工程は接触工程の前に細胞を破砕することを含む。前処理工程は、化学的、機械的、または酵素的な細胞破砕方法を使用して遂行され得る。言いかえれば、細胞破砕は、本明細書において記述される化学的、酵素的及び／または機械的な方法のうちの２つ以上の組み合わせ（例えばビーズ粉砕と組み合わせた酵素的加水分解）を使用して遂行され得る。細胞破砕方法は、連続して（例えばビーズ粉砕に続いて酵素的加水分解）遂行され得る。随意に、化学的方法または機械的方法は第１の加水分解工程として、続いて酵素的細胞破砕は第２の加水分解工程として遂行され得る。これらの例において、１つの細胞破砕方法のみが遂行される場合に使用される酵素の量と比較して、より低量の酵素を酵素的細胞破砕工程において使用することができる。
【００５０】
濃縮
酵素的加水分解からもたらされる破砕した微生物は、発酵培地の分離及び除去によって濃縮することができ、後続の工程のために所望される濃度の破砕した微生物を提供する。随意に、破砕した微生物を遠心分離及び１つまたは複数の物質の除去によって濃縮して、所望される濃度を提供する。遠心分離が使用される場合、随意に、遠心分離は重い層及び軽い層を含む２つ以上の層を提供することができる。重い層は可溶性発酵培地構成要素及び水を含み、軽い層は破砕した微生物を脂質及び廃バイオマスの形態で含む。軽い層はある程度の水を更に含み得る。軽い層は、少なくとも脂質及びバイオマスの一部ならびに水をエマルションの形態で含み得る。
【００５１】
濃縮工程は、接触工程中に存在する１つまたは複数の物質を除去することを含む。例えば、濃縮工程は水の除去を含み得る。随意に、濃縮工程は、体積で約２５％〜約９５％の水の除去（例えば約８５％の水の除去）を含む。随意に、濃縮工程は、例えば弁を介して重い層を排出することによって、または重い層の吸引もしくはデカントによって、重い層の少なくとも一部を除去することを含む。
【００５２】
随意に、濃縮した破砕微生物は、下記の抽出工程に従って破砕した微生物から油を回収する前の一定の期間の間放置することが可能である。濃縮した破砕微生物は、２４時間まで（例えば１時間、２時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間または２４時間）放置することが可能である。
【００５３】
抽出
上述のように、脂質は、塩の存在下及び有機溶媒の非存在下において破砕した微生物から高温で抽出される。
【００５４】
抽出工程は高温で遂行され得る。本明細書において使用される時、高温は、少なくとも約５５℃の温度（例えば約５５℃〜約９５℃の温度）を指す。例えば、脂質及びバイオマスの混合物は、約６５℃以上、約７０℃以上、約７５℃以上、約８０℃以上、約８５℃以上、約９０℃以上または約９５℃以上の温度で、塩、油またはバイオ燃料と接触させることができる。
【００５５】
抽出工程は塩の存在下において遂行される。塩は例えば硫酸ナトリウムであり得る。抽出工程の間に添加される塩の濃度は、抽出混合物の体積に基づいて約１％〜約５％（ｖ／ｖ）（例えば約３％〜約５％（ｖ／ｖ））であり得る。例えば、抽出工程の間に添加される塩の濃度は、約１％、約２％、約３％、約４％または約５％であり得る。
【００５６】
脂質は、有機溶媒（例えばＣ５−Ｃ１２アルカン、塩素化Ｃ１−Ｃ６アルカン、Ｃ１−Ｃ６アルコールまたは超臨界二酸化炭素）の非存在下において、破砕した微生物から抽出される。本明細書において使用される時、有機溶媒の非存在下においてとは、破砕した微生物の重量に基づいて約０．５％未満（例えば、約０．４％未満、約０．３％未満、約０．２％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０１％未満、約０．００５％未満、または０％）の溶媒を意味する。
【００５７】
随意に、脂質は、油（例えばココナッツ油）またはバイオ燃料の添加によって破砕した微生物から抽出することができる。
【００５８】
随意に、抽出工程の間に添加される油は、栄養油（例えば栄養源に由来するかまたはそれから得られた油）であり得る。本明細書において記述される方法における使用のために適切な栄養油の例には、ココナッツ油、ヤシ油、キャノーラ油、ヒマワリ油、大豆油、トウモロコシ油、オリーブ油、サフラワー油、パーム核油、綿実油、及びその組み合わせが含まれる。アルキル化誘導体（例えばメチル化油またはエチル化油）等のそれらの油の任意の誘導体も使用することができる。
【００５９】
本明細書において使用される時、バイオ燃料は、任意の燃料、燃料添加剤、バイオマス出発材料に由来する芳香族化合物及び／または脂肪族化合物を指す。例えば、本明細書において記述される方法における使用のために適切なバイオ燃料は、植物源または藻類源に由来し得る。バイオ燃料のために適切な源の例には、藻類、トウモロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、テンサイ、ナタネ、大豆、及び同種のものが含まれる。
【００６０】
随意に、バイオ燃料は、生物源から油を採取し、油をバイオ燃料に転換することによって得ることができる。生物源から得られる油（例えば植物源及び／または藻類源から得られる油）を転換する方法は、当業者に公知である。随意に、バイオ燃料を得る方法は、油産生バイオマス（例えば藻類）を培養し、油（例えば藻類油）を抽出し、油（例えば藻類油）を転換してバイオ燃料を形成することを含み得る。随意に、油はエステル交換反応を使用してバイオ燃料に転換することができる。本明細書において使用される時、エステル交換反応は、別のアルコールによってエステルのアルコキシ基を交換するプロセスを指す。例えば、本明細書において記述される方法における使用のためのエステル交換反応プロセスは、藻類油（例えばトリグリセリド）をバイオディーゼル（例えば脂肪酸アルキルエステル及びグリセロール）へ転換することを含み得る。エステル交換反応は、従来の化学プロセス（酸触媒反応または塩基触媒反応等）の使用によって、または酵素触媒反応の使用によって遂行され得る。
【００６１】
本明細書において使用される時、有機溶媒という用語が、本明細書において、栄養油（ココナッツ油、ヤシ油、キャノーラ油、ヒマワリ油、大豆油、トウモロコシ油、オリーブ油、サフラワー油、パーム核油、綿実油、またはそのアルキル化（例えばメチル化またはエチル化）誘導体等）は含まれないと定義されるので、その用語にはバイオ燃料は含まれない。
【００６２】
随意に、破砕した微生物からの脂質の抽出に使用される油またはバイオ燃料は、抽出された脂質から後続して除去されない。抽出された油の後続の分画（添加される油またはバイオ燃料は油画分のうちのただ１つと共にとどまる）は、抽出された脂質から油またはバイオ燃料を除去するとは判断されない。例えば、回収後に、本明細書において記述される油は、本明細書において記述される製品のうちの１つもしくは複数のとしての使用のために他の油と組み合わせることができるか、または本明細書において記述される製品のうちの１つもしくは複数の中に取り込むことができる。それらの他の油または製品（バイオ燃料等）のうちの任意の１つは、回収プロセスの結論後に回収された油との組み合わせに対する代替として、またはそれに加えて、抽出工程の間に脂質及びバイオマスの混合物へ添加され得る。抽出工程の間に他の油を添加することは、使用済みバイオマスから脂質の解乳化及び分離を支援することができる。
【００６３】
バイオマスから脂質を分離する有機溶媒抽出に依存する従来の方法において、回収後に脂質から有機溶媒を除去しなければならないが、典型的には少なくとも微量の溶媒が後に残される。本明細書において記述される方法において、しかしながら、随意に、抽出工程の間に添加される油またはバイオ燃料が最終製品として使用されるかまたは最終製品の中に取り込まれる場合、そのうちの約８０％を超えるものが回収された油中にとどまる。すなわち、随意に、抽出工程の間に添加される油またはバイオ燃料のうちの約２０％未満が、最終製品としての使用または最終製品の中への取り込みの前に、回収された油から除去される。例えば、随意に、抽出工程の間に添加される油またはバイオ燃料のうちの約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、または０％は、最終製品としての使用または最終製品の中への取り込みの前に、回収された油から除去される。
【００６４】
破砕した微生物またはバイオマスは、破砕した微生物またはバイオマスからの脂質の抽出に適切な一定の期間で塩、油及び／またはバイオ燃料と混合することができる。例えば、塩、油及び／または破砕した微生物もしくはバイオマスは、約１０分間以上、２０分間以上、３０分間以上、４０分間以上、５０分間以上、１時間以上、または２時間以上混合することができる。続いて、脂質は、溶液を遠心分離することによって混合物の残りの構成要素から分離することができる。
【００６５】
随意に、微生物によって理論的に産生された脂質のうちの少なくとも６５％は、この方法を使用して破砕した微生物から抽出される（すなわち、方法は少なくとも約６５％の収率を提供する）。例えば、破砕した微生物から抽出された脂質の収率は、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％であり得る。
【００６６】
あるいは、抽出工程は油またはバイオ燃料の非存在下において遂行され得る。例えば、脂質は機械的方法を使用して抽出することができる。加水分解されたバイオマス及び微生物は遠心分離することができ、脂質は構成要素の残りから分離することができる。遠心分離による油の分離は、バイオマスエマルションへ硫酸ナトリウムを添加する工程を随意に含み得る。随意に、遠心分離は本明細書において記述されるような高温（例えば約５５℃以上、約８０℃等）で遂行され得る。随意に、脂質は遠心分離された材料の上部層中に含有され、例えば吸引またはデカントによって他の材料から取り出すことができる。
【００６７】
随意に、微生物によって産生された脂質のうちの少なくとも約６５％は、この方法を使用して破砕した微生物から抽出される（すなわち、方法は少なくとも６５％の収率を提供する）。例えば、破砕した微生物から抽出された脂質の収率は、産生された総量のうちの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％である。
【００６８】
ＩＩＩ．製品
本明細書において記述される方法に従って産生された多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）（例えばＤＨＡ、ＥＰＡ）及び他の脂質は、例えばそれらの生物学的特性または栄養特性を利用して、任意の多様な適用において利用することができる。随意に、化合物は、医薬品、栄養油（例えば栄養油サプリメント）、食品サプリメント、動物用飼料添加剤、化粧品、バイオ燃料、及び同種のものにおいて使用することができる。本明細書において記述される方法に従って産生された脂質は、他の化合物の産生における中間体としても使用することができる。随意に、本明細書において記述される方法に従って産生された脂質は、最終製品（例えば食品または飼料のサプリメント、乳児用調合乳、医薬品、燃料（例えばバイオ燃料）など）の中へ取り込むことができる。
【００６９】
本明細書において記述される脂質が取り込まれ得る適切な食品または飼料サプリメントには、飲料（牛乳、水、スポーツドリンク、エナジードリンク、茶及びジュース等）；糖菓（ゼリー及びビスケット等）；脂肪を含有する食品及び飲料（乳製品等）；加工食品製品（軟質の米（または粥）等）；乳児用調合乳；朝食用シリアル；または同種のものが含まれる。随意に、１つまたは複数の産生された脂質は、食品サプリメント（例えばマルチビタミン剤等）の中へ取り込むことができる。随意に、本明細書において記述される方法に従って産生された脂質を、食物サプリメント中に含めることができ、随意に食品または飼料の構成要素（例えば食品サプリメント）の中へ直接取り込むことができる。
【００７０】
本明細書において記述される方法によって産生された脂質が取り込まれ得る飼料原料の例には、ペットフード（キャットフード；ドッグフード及び同種のもの；観賞魚、養殖魚または甲殻類のための飼料など等）；農場で飼育される動物（家畜及び水産養殖において飼育される魚類または甲殻類が含まれる）のための飼料が含まれる。本明細書において記述される方法に従って産生された脂質が取り込まれ得る食品または飼料材料は、好ましくは意図されるレシピエントである生物体へ快いものである。この食品または飼料材料は、食品材料について現在公知の任意の物理的特性（例えば固体、液体、軟質）を有し得る。
【００７１】
随意に、産生された化合物（例えばＰＵＦＡ）のうちの１つまたは複数を医薬品の中へ取り込むことができる。かかる医薬品の例には、様々なタイプの錠剤、カプセル、飲用薬剤などが含まれる。随意に、医薬品は局所適用のために適切である。投薬量形状には、例えばカプセル、油、粒子、細粒、散剤、錠剤、丸薬、トローチ剤、または同種のものが含まれ得る。
【００７２】
随意に、産生された化合物のうちの１つまたは複数は、バイオ燃料として使用することができるか、またはバイオ燃料の中に取り込むことができる。例えば、バイオ燃料は、産生された化合物のうちの１つまたは複数をエステル交換反応することによって産生することができる。バイオ燃料は、産生された油の塩基触媒エステル交換反応、油の酸触媒エステル交換反応、または油のその脂肪酸次いでバイオ燃料への転換によって産生することができる。
【００７３】
本明細書において記述される方法に従って産生された脂質を、多様な薬剤の任意のものとの組み合わせによって本明細書において記述されるような製品の中へ取り込むことができる。例えば、かかる化合物は１つまたは複数の結合剤または充填剤と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、製品は、１つまたは複数のキレート剤、色素、塩、界面活性剤、保湿剤、粘度調整剤、増粘剤、皮膚軟化剤、香料、防腐剤など、及びその組み合わせを含むことができる。
【００７４】
以下の実施例は、本明細書において記載される方法及び組成物の特定の態様を更に例示することを意図し、特許請求の範囲を限定するようには意図されない。
【実施例】
【００７５】
実施例１。低温殺菌、採取及び洗浄、ならびに化学的加水分解
低温殺菌
Ｔ１８バイオマスを６０℃で１時間撹拌しながら加熱して細胞を低温殺菌した。
【００７６】
採取及び洗浄
低温殺菌されたＴ１８バイオマスを周囲温度で２０分間４１５０ｒｐｍで遠心分離して、細胞ペーストから最終培地を分離した。培地を除去し、同等の質量の水を細胞ペーストへ添加して細胞を洗浄した。細胞ペースト−水混合物を１分間振盪し、再遠心分離し、水相を除去した。
【００７７】
化学的加水分解
水洗浄Ｔ１８細胞ペーストを水により１５０ｇ／Ｌへ調整した。サブサンプル（１０ｍＬ）を取り出し、５０ｍＬ遠心分離チューブへ添加した。各々のサブサンプルを表１に従って最終濃度へ酸または塩基により処理した。混合物を１２１℃で１５分間オートクレーブして細胞を加水分解した。加水分解後に、サンプルをヘキサン抽出して、回収された油のパーセンテージを物質収支によって決定した（図１）。１６０ｍＭのＨＣｌ及びＨ２ＳＯ４による加水分解は８５％を超える油回収をもたらした。
【表１】
2019129835.tif 000003
【００７８】
実施例２。酵素的加水分解
水洗浄Ｔ１８細胞ペーストを水により２２０ｇ／Ｌへ調整した。ｐＨを１ＮのＮａＯＨにより７．５へ調整した。サブサンプル（１０ｍＬ）を取り出し、５０ｍＬ遠心分離チューブへ添加した。各々のサブサンプルを表２に従って酵素により処理した。混合物を５０℃で２２時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。加水分解後に、サンプルをヘキサン抽出して、回収された油のパーセンテージを物質収支によって決定した（図２）。アルカラーゼ単独または別の酵素と組み合わせた加水分解は８５％を超える油回収をもたらした。
【表２】
2019129835.tif 000004
【００７９】
実施例３。酸加水分解及び酵素的加水分解、洗浄の効果
低温殺菌非洗浄Ｔ１８バイオマス（１０ｍＬ）のサブサンプルを５０ｍＬ遠心分離チューブへ添加した。対照を水洗浄し、水で１７０ｇ／Ｌへ調整し、５０ｍＬ遠心分離チューブの中へサブサンプルをとった。各々のサブサンプルを表３に従って酸または酵素により処理した。酸加水分解サンプルを１２１℃で１５分間オートクレーブして細胞を加水分解した。酵素的に加水分解したサンプルを１ＮのＮａＯＨによりｐＨ７．５へ調整し、５０℃で２６時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。酸加水分解または酵素的加水分解後に、サンプルをヘキサン抽出して、回収された油のパーセンテージを物質収支によって決定した（図３）。洗浄した油の回収に同等な洗浄していない油の回収は、０．２％のアルカラーゼ加水分解で達成された。
【表３】
2019129835.tif 000005
【００８０】
実施例４。酵素的加水分解、温度／時間の効果
水洗浄Ｔ１８細胞ペーストを水により２１０ｇ／Ｌへ調整した。ｐＨを１ＮのＮａＯＨにより７．５へ調整した。サブサンプル（１０ｍＬ）を５０ｍＬ遠心分離チューブの中へ添加した。各々のサブサンプルを０．２％のｖ／ｖアルカラーゼにより処理した。混合物を７０℃で４時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。対照を５５℃で１８時間振盪ながらインキュベーションした。加水分解後に、サンプルをヘキサン抽出して、回収された油のパーセンテージを物質収支によって決定した（図４）。７０℃へ温度を増加させることによって、５５℃で１８時間の加水分解に同等な油の回収は、４時間で達成された。
【００８１】
実施例５。酵素的加水分解、バイオ燃料による抽出
水洗浄Ｔ１８細胞ペーストを水により２００ｇ／Ｌへ調整し、ｐＨを１ＮのＮａＯＨにより７．５へ調整した。サブサンプル（１０ｍＬ）を取り出し、５０ｍＬ遠心分離チューブへ添加した。各々のサブサンプルを０．２％のｖ／ｖアルカラーゼにより処理した。混合物を５５℃で１８時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。加水分解後に、各々のサブサンプルを表５に従ってバイオ燃料により抽出し、油のパーセンテージを物質収支によって決定し、純粋な油の脂質クラスプロファイルに基づかせた（図５及び表５）。１：０．４（湿潤バイオマス：バイオ燃料）による抽出は、脂質クラスプロファイルに基づいて、８５％を超える油回収をもたらした。トリグリセリド（ＴＧ）藻類油をエチル化し（ＥＥ）、親ＴＧ油に加えて、油抽出のために使用した（表６）。湿潤バイオマス：ＥＥ藻類油のすべての比は、脂質クラスプロファイルに基づいて、８５％を超える油回収をもたらした。
【表４】
2019129835.tif 000006
【表５】
2019129835.tif 000007
【００８２】
実施例６。酵素的加水分解、溶媒なしの油抽出
２００ｍＬの２２４ｇ／Ｌの固形物濃度（１５９ｇ／Ｌのバイオマス濃度）の洗浄されないＴ１８バイオマスを、５５℃へ加熱し、１ＮのＮａＯＨによりｐＨ８へ調整した。サンプルを０．４％（ｖ／ｖ）のアルカラーゼにより処理し、５５℃で１８時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。加水分解後に、サンプルを４０℃で２０分間４６００ｒｐｍで遠心分離して、濃縮した加水分解されたバイオマスから培地を分離した。培地の８５％を除去した。水の除去後に、残りのサンプルを４０℃で２０分間４６００ｒｐｍで遠心分離して、廃バイオマスから油を分離した。油を回収し、回収された油の％を物質収支によって決定した。加水分解後の水の濃度を低減させることによって、９０％を超える油回収は、溶媒なしの油抽出によって達成された。
【００８３】
実施例７。溶媒なしの油抽出、大スケール
１５１，４００ｋｇの１１１ｇ／Ｌのバイオマス濃度の洗浄されないＴ１８バイオマスを、５５℃へ加熱し、５０ＮのＮａＯＨによりｐＨ８へ調整した。６０６Ｌのアルカラーゼを添加し、ｐＨを８へ戻すように調整し、混合物を２つの容器の間で再循環させて、加水分解のために５５℃で１８時間混合した。加水分解後に、ブロスの重量は１６０，４００ｋｇであった。加水分解されたバイオマスを遠心分離のために５５℃で保持して、濃縮した加水分解されたバイオマスから培地を分離した（図６）。１３４，４００ｋｇの培地を除去し、２６，０００ｋｇの濃縮した加水分解されたバイオマスを回収した。濃縮した加水分解されたバイオマスを１３００ｋｇのＮａ２ＳＯ４により処理し、９０℃で混合ながら加熱し、その後遠心分離して廃バイオマスから油を分離した（図７）。７６０６ｋｇの油は８２％の合計の油回収で回収された。回収された油の過酸化物価（ＰＶ）及び酸価（ＡＶ）は、それぞれ０．４ｍｅｑ／ｋｇ及び０．３８ｍｇ  ＫＯＨ／ｇであった。
【００８４】
実施例８。至適化された酵素濃度／時間（０．１％酵素）
１４３ｇ／Ｌのバイオマス濃度の洗浄されないＴ１８バイオマスを、５５℃へ加熱し、１ＮのＮａＯＨによりｐＨ８．０へ調整した。２５ｍＬサブサンプルを５０ｍＬ遠心分離チューブの中へ取り出した。各々のサブサンプルを表７に従って処理した。混合物を５５℃で振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。加水分解後に、サンプルを１００℃の槽中に２０分間置いて酵素を失活させた。酵素の失活後に、サンプルを４０℃で２０分間４６００ｒｐｍで遠心分離して、濃縮した加水分解されたバイオマスから培地を分離した。培地のおよそ８０％を除去した。培地を０．２５μｍフィルターを介して通過させ、加水分解度をｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）法によって決定した（Ｓｐｅｌｌｍａｎ，Ｄ．，ＭｃＥｖｏｙ，Ｅ．，Ｏ’Ｃｕｉｎｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｆｉｔｚ，  Ｇ．Ｒ．Ｊ．２００３．Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｅｘｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＢＳ，  ＯＰＡ  ａｎｄ  ｐＨ  ｓｔａｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１３：４４７−４５３）。表７を参照されたい。
【００８５】
濃縮した加水分解されたバイオマスを５％（ｗ／ｖ）のＮａ２ＳＯ４により処理し、７０℃で６０分間振盪しながら加熱した。処理後に、サンプルを４０℃で２０分間４６００ｒｐｍで遠心分離して、廃バイオマスから油を分離した。油を回収し、回収された油の％を物質収支によって決定した（図８）。０．１％のアルカラーゼによる加水分解は４時間後に完了した。
【表６】
2019129835.tif 000008
【００８６】
実施例９：至適化された酵素濃度／時間（０．０５％酵素）
１４３ｇ／Ｌのバイオマス濃度の洗浄されないＴ１８バイオマスを、５５℃へ加熱し、１ＮのＮａＯＨによりｐＨ８．０へ調整した。２５ｍＬサブサンプルを５０ｍＬ遠心分離チューブの中へ取り出した。各々のサブサンプルを表８に従って処理した。混合物を５５℃で振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。加水分解後に、サンプルを１００℃の槽中に２０分間置いて酵素を失活させた。酵素の失活後に、サンプルを４０℃で２０分間４６００ｒｐｍで遠心分離して、濃縮した加水分解されたバイオマスから培地を分離した。培地のおよそ８０％を除去した。培地を０．２５μｍフィルターを介して通過させ、加水分解度をＯＰＡ法によって決定した（表Ｂ）。
【００８７】
濃縮した加水分解されたバイオマスを５％（ｗ／ｖ）のＮａ２ＳＯ４により処理し、７０℃で６０分間振盪しながら加熱した。処理後に、サンプルを４０℃で２０分間４６００ｒｐｍで遠心分離して、廃バイオマスから油を分離した。油を回収し、回収された油の％を物質収支によって決定した（図９）。０．０５％のアルカラーゼによる加水分解は６時間後に完了した。
【表７】
2019129835.tif 000009
【００８８】
実施例１０。酵素的加水分解、低ｐＨ
１５０ｍＬの洗浄されないＴ１８のサブサンプルを２５０ｍＬビーカーへ取り出した。各々のサブサンプルを１ＭのＨＣｌまたはＮａＯＨにより処理して、表９に従って所望されるｐＨへ調整した。各々のｐＨ条件の３０ｍＬのサブサンプルを５０ｍＬ遠心分離チューブへ取り出した。各々のサブサンプルを０．５％のｖ／ｖアルカラーゼにより処理した。混合物を５５℃で１６時間振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。加水分解後に、サンプルを４０℃で２０分間４６００ｒｐｍで遠心分離して、濃縮した加水分解されたバイオマスから培地を分離した。およそ６０％の培地を除去した。濃縮した加水分解されたバイオマスを５％（ｗ／ｖ）のＮａ２ＳＯ４により処理し、７０℃で６０分間振盪しながら加熱して、廃バイオマスから油を分離した。油を回収し、溶媒なしに回収された油の％を物質収支によって決定した。図１０。同等な油回収はｐＨ５．５及び８で達成された。
【表８】
2019129835.tif 000010
【００８９】
実施例１１。酵素的加水分解、代替酵素
３０ｍＬの洗浄されないＴ１８バイオマスのサブサンプルを５０ｍＬ遠心分離チューブへ取り出した。各々のサブサンプルを、０．５％（ｖ／ｖ）の酵素により及び表９に従って処理した。混合物を５５℃で振盪しながらインキュベーションして細胞を加水分解した。加水分解後に、サンプルを４０℃で２０分間４６００ｒｐｍで遠心分離して、濃縮した加水分解されたバイオマスから培地を分離した。およそ５０％の培地を除去した。濃縮した加水分解されたバイオマスを５％（ｗ／ｖ）のＮａ２ＳＯ４により処理し、７０℃で６０分間振盪しながら加熱した。処理後に、サンプルをヘキサン抽出して、物質収支によって回収された油の％を決定した。代替の酵素は加水分解についてアルカラーゼほど効率的であるとは同定されなかったが、必要であるならば、アルカラーゼの代わりに、選択された酵素（プロテアーゼ『Ｍ』、Ｓａｖｉｎａｓｅ  Ｕｌｔｒａ、Ｂｌａｚｅ  Ｅｖｉｔｙ、またはポーラーザイム（Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ））を使用できるだろう。
【表９】
2019129835.tif 000011
【００９０】
実施例１２。機械的加水分解
１８０ｇ／Ｌのバイオマス濃度の洗浄されないＴ１８バイオマスサンプルを、０．６〜０．８ｍｍの酸化ジルコニウム粉砕媒体（８０％（ｖ／ｖ）のビーズ体積）をロードした３００ｍＬのＤｙｎｏ−Ｍｉｌｌ  Ｍｕｌｔｉ  Ｌａｂステンレス鋼チャンバーの中へ供給した。連続モードにおいて、ビーズ粉砕機を、１０ｍ／秒のインペラーチップ速度及び８０ｍＬ／分間の供給フロー率で操作した。部分的に破砕したバイオマススラリーのサブサンプルを、第２の通過のために破砕チャンバーを介して戻して通過させた。バイオマススラリーを４０℃で２０分間４６００ｒｐｍで遠心分離して、廃バイオマスから油を分離した。油を回収し、回収された油の％を物質収支によって決定した。１つの通過及び２つの通過は７０％の油回収をもたらした。
【００９１】
添付の請求項の組成物及び方法は、本明細書において記述される具体的な組成物及び方法によって範囲を限定されず、それらは請求項の少数の態様の例証として意図され、機能的に等価な任意の組成物及び方法はこの開示の範囲内である。本明細書において示され記述されるものに加えて組成物及び方法の様々な修飾は、添付の請求項の範囲内に入ることが意図される。更に、特定の代表的な組成物、方法、ならびにこれらの組成物及び方法の態様のみが具体的に記述されているが、他の組成物及び方法、ならびに組成物及び方法の様々な特色の組み合わせは、具体的に列挙されなかったとしても、添付の請求項の範囲内に入ることが意図される。したがって、工程、要素、構成要素または成分の組み合わせは、本明細書において明示的に述べることができるが、明瞭に明示されなかったとしても、工程、要素、構成要素及び成分の他のすべての組み合わせが含まれる。
【図１】
2019129835.tif 000012
【図２】
2019129835.tif 000013
【図３】
2019129835.tif 000014
【図４】
2019129835.tif 000015
【図５】
2019129835.tif 000016
【図６】
2019129835.tif 000017
【図７】
2019129835.tif 000018
【図８】
2019129835.tif 000019
【図９】
2019129835.tif 000020
【図１０】
2019129835.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月15日(2019.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
油産生微生物から油を回収する方法であって、
（ａ）前記微生物を発酵培地で培養する工程と；
（ｂ）前記微生物の酵素的加水分解を引き起こす条件下で酵素と前記発酵培地中の前記微生物とを接触させる工程であって、加水分解された微生物が前記油を含む、工程と；
（ｃ）前記油を含む前記加水分解微生物から、前記発酵培地の２５〜９５％の水成分を分離する工程と；
（ｄ）塩の存在下及び有機溶媒の非存在下において、ステップ（ｃ）で濃縮した加水分解微生物から高温で前記油を抽出する工程であって、抽出により前記加水分解微生物から前記油を分離する、工程と
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記油を回収する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記接触工程の前に、細胞破砕のための前処理工程を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触工程が、０．００１〜０．４％の酵素存在下で、１〜２０時間、約５５℃で遂行される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記接触工程が５〜８．５のｐＨで遂行される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記接触工程が約５０℃〜約７０℃の温度で遂行される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記接触工程が１〜８時間遂行される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素がプロテアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抽出工程の間の前記高温が７５℃〜９５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出工程の間に添加される塩の濃度が１％〜５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物の集団が、藻類、菌類、細菌及び原生生物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物の集団がＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属及びその混合物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物の集団が、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２４５として寄託されたＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質がドコサヘキサエン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記水成分の８０〜９０％が、前記油を含む前記加水分解微生物から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記接触工程が、０．０５％〜１％の酵素存在下で遂行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触工程がｐＨ８．０で遂行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抽出工程の間の前記高温が８５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抽出工程の間に添加される塩の濃度が４％〜５％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記油の少なくとも８０％が回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記油の少なくとも９０％が回収される、請求項１に記載の方法。
【外国語明細書】
2019129835000001.pdf