(57)【要約】【課題】年齢改変細胞およびプロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質を使用して年齢改変細胞を作製するための方法を提供すること。【解決手段】プロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質と接触させることにより、人工多能性幹細胞由来の細胞を含む、体細胞、幹細胞、幹細胞由来の体細胞などの若齢および／または未成熟細胞について、老化および／または成熟過程を加速化および制御することができる。本開示で記載される方法により、体細胞または幹細胞から、老齢細胞および／または成熟細胞など、年齢相応細胞を作製することができる。このような年齢改変細胞は、遅発性疾患および／または障害について研究するためのモデル系を構成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示中に記載される研究は、一部において、ＮＳＦの研究補助ＤＧＥ−１１４４４７によって資金提供された。
【０００２】
関連出願との相互参照
本ＰＣＴ国際特許出願は２０１４年４月１６日に出願され、２０１３年４月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／８１２，４６４号および２０１３年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／９０７，２６２号に対する利益を主張する。
【０００３】
本開示は一般に、遅発性障害および／または疾患を含む障害および／または疾患の処置および研究に関する。より具体的には、本開示は、臨床ならびに基礎研究のどちらにおいても使用されうる、細胞の成熟を加速化するための方法の適用に関する。１つまたは複数の経時的マーカーを呈示する細胞、およびこのようなマーカーを、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の体細胞を含む、体細胞、幹細胞、および／または幹細胞由来の体細胞などの細胞内で誘導するための方法が提供される。細胞年齢が逆転した細胞を含むこのような細胞を、プロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質で処理することにより、１つまたは複数の経時的マーカーを誘導することができ、経時的マーカーは、１つまたは複数のマーカーシグネチャーを集合的に構成する。したがって、本明細書では、障害および疾患を処置するために治療的に使用することができ、遅発性障害および／または疾患について研究するためのモデル系として使用することができる年齢相応細胞が提供される。加えて、本開示はまた、プロジェリンまたは別のプロジェリン様タンパク質と接触させることにより年齢が改変された細胞にも関する。
【背景技術】
【０００４】
本開示の背景
遅発性障害および／または疾患は、様々な生理学的系において生じうる。例えば、パーキンソン病（ＰＤ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性障害は、社会にとってますます大きな負担となりつつある。平均余命の高齢化は、現在のところ治癒不可能であり、多くの場合に処置不可能な、これらの障害を伴うと診断された個体の数を爆発的に増大させている。６０歳を超える個体の罹患人口は、２０５０年までに世界の総人口の２１．８％を占め、２０億人に達することが推定されるので、この傾向は、強まることが予測されている（Ｌｕｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、４５１巻：７１６〜７１９頁（２００８年））。
【０００５】
年齢はそれ自体、神経変性疾患の著明な危険因子であると考える研究者が多く、例えば、米国内のＡＤの症例は、２０１０年の４００万例から、２０５０年までにほぼ１４００万例へと、３倍を超えて増大することが推定されている（Ｈｅｂｅｒｔら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、８０巻（１９号）：１７７８〜８３頁（２０１３年））。ＰＤについても、今後３０年間にわたり、同様の発生率の増大が予測されている（Ｄｏｒｓｅｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６８巻：３８４〜３８６頁（２００７年））。これと並行して、ＡＤおよびＰＤなどの年齢関連障害のための治療が開発されつつあるが、その速度は極めて緩慢である。入手可能なのは、症状の緩和だけであり、処置される症状およびその有効性の持続期間のいずれについても限定されており、新規の予防法および治療法に対する必要性が浮き彫りになっている。
【０００６】
平均余命の漸進的な延長のために、パーキンソン病（ＰＤ）などの遅発性神経変性障害は、社会にとってますます大きな負担となりつつある。２０５０年までに、推定世界人口の２１．８％（約２０億人）が６０歳を超えることが推定されるので、ＰＤの発生率は、上昇し続ける可能性が高い（Ｌｕｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、４５１巻：７１６〜７１９頁（２００８年））。
【０００７】
患者由来の皮膚細胞を、多能性状態へと再プログラム化して戻し、次いで、疾患関与性の細胞型へとさらに分化させうる、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術の使用は、現在のところ難治性であるヒト障害をモデル化し、処置する潜在的な可能性のための新たな機会を提示している（Ｂｅｌｌｉｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１３巻、７１３〜７２６頁（２０１２年））。しかし、ｉＰＳＣ由来細胞により、患者が晩年まで症状を発症せず、年齢を疾患の進行にとって必要な構成要素として含意する遅発性疾患が、どのくらい良好にモデル化されうるのかについての懸念がある。
【０００８】
複数のｉＰＳＣについての研究が、ｉＰＳＣの誘導中における、特定の年齢関連特徴の喪失を裏付けている（ＦｒｅｉｊｅおよびＬｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻、７５７〜７６４頁（２０１２年）；ＭａｈｍｏｕｄｉおよびＢｒｕｎｅｔ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻、７４４〜７５６頁（２０１２年）において総説されている）。例えば、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣでは、テロメア長の延長（Ａｇａｒｗａｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：２９２〜２９６頁（２０１０年）；Ｍａｒｉｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１４１〜１５４頁（２００９年））、ミトコンドリアの適合度（Ｐｒｉｇｉｏｎｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、７２１〜７３３頁（２０１０年）；Ｓｕｈｒら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、ｅ１４０９５頁（２０１０年））、および老化マーカーの喪失（Ｌａｐａｓｓｅｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２５巻：２２４８〜２２５３頁、２０１１年）など、年齢関連特徴の変化についての証拠があることから、老齢ドナー細胞の再プログラム化中に若返りが生じることが示唆される。ｉＰＳＣにおける、それらの初代体細胞供給源と比較した、年齢関連特徴の見かけの喪失に加えて、本開示のｉＰＳ由来細胞のプロジェリンによる老化においてｉＰＳ細胞を使用することの別の利点は、結果として得られる成熟表現型である。これに対し、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ：ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）の方向付けられた分化は、成熟マーカーおよび遅発性疾患の表現型を提示する能力を欠く、未成熟で胚様の細胞型をもたらすことが公知である。実際、プロジェリン誘導性老化を施さなければ、これらの未成熟なｉＰＳＣ由来細胞は、それらの特定の細胞型の頑健な機能的特性を確立するのに、数カ月間にわたるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける成熟を要求することが多い（Ｌｉｕら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻：７６５〜７７４頁（２０１２年）；ＳａｈａおよびＪａｅｎｉｓｃｈ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、５巻：５８４〜５９５頁（２００９年））。
【０００９】
長期にわたる分化は、ヒト発生の緩慢なタイミングを反映すると考えられている。例えば、ＰＤにおいて主に影響を受ける細胞型である、ヒト中脳ドーパミン（ｍＤＡ：ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅ）ニューロンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて成熟した生理学的挙動を発生させるのに、数カ月間にわたる培養を要求し、ＰＤの動物モデルにおけるドーパミン欠損をレスキューするのに、数カ月間にわたるｉｎ  ｖｉｖｏ成熟を要求する（Ｉｓａｃｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０巻：４７７〜４８２頁（１９９７年）；Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））。さらに、発生しつつあるヒト脳についてのＢＲＡＩＮ−ｓｐａｎアトラス（ｂｒａｉｎｓｐａｎ．ｏｒｇ）に基づくと、ｈＰＳＣ由来の神経細胞による遺伝子発現データは、遅発性障害をモデル化するには早期に過ぎると考えられる段階である、妊娠初期胎児のトランスクリプトームにマッチする。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化データは、成熟または老化細胞の急速な発生を防止する、種特異的な内因性の「時計様」成熟過程により、ＰＤなどの遅発性神経変性障害のヒトｉＰＳＣベースのモデル化にとって大きな難題が提起されていることを指し示した。
【００１０】
細胞の再プログラム化中および分化中における老化および若返りの包括的な側面に取り組むときの問題は、体細胞ドナーの経時的年齢およびｉＰＳＣ派生物の対応する細胞年齢を信頼できる形で予測するマーカーの同定である。
【００１１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ヒト疾患のモデル化に有用であることが提起されている。例えば、ｉＰＳＣ技術は、家族性自律神経障害または単純ヘルペス脳炎などの早発性障害について研究するのに使用されている（Ｌｅｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３０巻：１２４４〜１２４８頁（２０１２年）；Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：４０２〜４０６頁（２００９年）；およびＬａｆａｉｌｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４９１巻：７６９〜７７３頁（２０１２年））。両方の障害についての疾患機構の発見およびハイスループットの薬物スクリーニングは、スクリーニングされた薬物候補をさらに調べうるヒトｉＰＳＣベースの疾患モデルを可能とした。
【００１２】
早発性遺伝性障害のモデル化における初期の進展にも拘らず、ｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンの胚性の性格（ＬｅｅおよびＳｔｕｄｅｒ、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７巻：２５〜２７頁（２０１０年）；ＳａｈａおよびＪａｅｎｉｓｃｈ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、５巻：５８４〜５９５頁（２００９年）；ならびにＬｉｕら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻：７６５〜７７４頁（２０１２年））を踏まえると、ｉＰＳＣベースの手法が、パーキンソン病（ＰＤ）などの遅発性障害を、どのくらい良好にモデル化しうるのかについての根本的疑問は残る。ＰＤなどの遅発性障害は、生涯の早期において、疾患のいかなる徴候も伴わずに、発症するのに数十年間を要する。実際、ｉＰＳＣ技術を使用してＰＤの遺伝性形態または散発性形態をモデル化する最新の研究は、疾患に特徴的な重度の変性病態を再現せずに、観察された表現型を示すことも、比較的微細な生化学的変化または形態的変化を提示することもない（Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４６巻：３１８〜３３１頁（２０１１年）；Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１３６巻：９６４〜９７７頁（２００９年）；Ｎｇｕｙｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、８巻：２６７〜２８０頁（２０１１年）；Ｓｅｉｂｌｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：５９７０〜５９７６頁（２０１１年）；およびＣｏｏｐｅｒら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、４巻：１４１〜１９０頁（２０１２年））。
ｉＰＳＣから分化させた細胞内の年齢を測定および操作する能力は、現在のところ解決されずに残る、多能性幹細胞研究における根本的課題を表す。細胞運命を、３つの胚葉全ての多様な派生物へと方向付けることにおいては、無視できない進展がなされているが、所与の細胞型の年齢を、要求に応じて、胚性状態から、新生児状態、成年状態、または老化状態へと切り替える技術は存在していない。これはｈｉＰＳＣ由来の成年様造血幹細胞、完全に機能的な心筋細胞、または成熟膵島を発生させることの変わらぬ不成功、ならびに遅発性疾患をモデル化するための、年齢相応および／または段階相応の老化細胞型を導出することの一般的な不可能性により例示される通り、依然として、当分野における大きな障害である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｌｕｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、４５１巻：７１６〜７１９頁（２００８年）
【非特許文献２】Ｈｅｂｅｒｔら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、８０巻（１９号）：１７７８〜８３頁（２０１３年）
【非特許文献３】Ｄｏｒｓｅｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６８巻：３８４〜３８６頁（２００７年）
【非特許文献４】Ｂｅｌｌｉｎら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１３巻、７１３〜７２６頁（２０１２年）
【非特許文献５】ＦｒｅｉｊｅおよびＬｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻、７５７〜７６４頁（２０１２年）
【非特許文献６】ＭａｈｍｏｕｄｉおよびＢｒｕｎｅｔ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻、７４４〜７５６頁（２０１２年）
【非特許文献７】Ａｇａｒｗａｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：２９２〜２９６頁（２０１０年）
【非特許文献８】Ｍａｒｉｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１４１〜１５４頁（２００９年）
【非特許文献９】Ｐｒｉｇｉｏｎｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、７２１〜７３３頁（２０１０年）
【非特許文献１０】Ｓｕｈｒら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、ｅ１４０９５頁（２０１０年）
【非特許文献１１】Ｌａｐａｓｓｅｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２５巻：２２４８〜２２５３頁、２０１１年
【非特許文献１２】Ｌｉｕら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２４巻：７６５〜７７４頁（２０１２年）
【非特許文献１３】ＳａｈａおよびＪａｅｎｉｓｃｈ、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、５巻：５８４〜５９５頁（２００９年）
【非特許文献１４】Ｉｓａｃｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０巻：４７７〜４８２頁（１９９７年）
【非特許文献１５】Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年）
【非特許文献１６】Ｌｅｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３０巻：１２４４〜１２４８頁（２０１２年）
【非特許文献１７】Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４６１巻：４０２〜４０６頁（２００９年）
【非特許文献１８】Ｌａｆａｉｌｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４９１巻：７６９〜７７３頁（２０１２年）
【非特許文献１９】ＬｅｅおよびＳｔｕｄｅｒ、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、７巻：２５〜２７頁（２０１０年）
【非特許文献２０】Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４６巻：３１８〜３３１頁（２０１１年）
【非特許文献２１】Ｓｏｌｄｎｅｒら、Ｃｅｌｌ、１３６巻：９６４〜９７７頁（２００９年）
【非特許文献２２】Ｎｇｕｙｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、８巻：２６７〜２８０頁（２０１１年）
【非特許文献２３】Ｓｅｉｂｌｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：５９７０〜５９７６頁（２０１１年）
【非特許文献２４】Ｃｏｏｐｅｒら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、４巻：１４１〜１９０頁（２０１２年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ＰＤなどの遅発性障害のｉＰＳＣモデルは、疾患の重度の変性病態を十分に反映しない。したがって、遅発性神経変性障害をモデル化する新たな方法が必要とされている。具体的には、ｉＰＳＣ技術を使用して、患者の年齢により緊密に相似する老化細胞を発生させる新たな方法は、遅発性疾患、特に変性疾患、より具体的には神経変性疾患のための有効な処置を探索するのに極めて有用であろう。
【００１５】
加えて、細胞の成熟を加速化する能力は、研究のためであれ、治療のためであれ、年齢相応細胞を迅速に供給するのに有用であろう。
【００１６】
本開示の要旨
少なくとも１つの経時的マーカーを呈示する細胞を産生するための方法であって、前記１つまたは複数の経時的マーカーが欠損した細胞を、前記少なくとも１つの経時的マーカーの産生を誘導するのに十分な量のプロジェリン様タンパク質と、前記マーカーの産生を誘導するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含む方法が開示される。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞の場合もあり、体細胞の場合もある。より特定された実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣ由来細胞でありうる。さらにより特定された実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は、ニューロンである。
【００１７】
一部の実施形態では、少なくとも１つの経時的マーカーは、年齢関連マーカー、成熟関連マーカー、および疾患関連マーカーからなる群から選択される。
【００１８】
また、少なくとも１つの経時的マーカーを呈示する細胞であって、前記マーカーが、前記少なくとも１つの経時的マーカーを誘導するのに十分な量の外因性プロジェリン様タンパク質と、前記経時的マーカーを誘導するのに十分な時間にわたり接触させることにより誘導される、細胞も開示される。
【００１９】
一部の実施形態では、外因性プロジェリン様タンパク質の量は、内因性プロジェリンの発現レベルの約１０倍〜約５０００倍、または内因性プロジェリンの発現レベルの約４０倍〜約５００倍の範囲内にある。
【００２０】
一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞、肝細胞、心臓細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、腎細胞、肺細胞、造血細胞、膵臓ベータ細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、破骨細胞、内皮細胞からなる群から選択される体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、神経前駆体、ニューロン、およびグリア細胞からなる群から選択される。
【００２１】
１．前記ＣＮＳ細胞が、中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロン細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【００２２】
２．前記少なくとも１つの経時的マーカーが、年齢関連マーカー、成熟関連マーカー、および疾患関連マーカーからなる群から選択される、請求項１４に記載の細胞。
【００２３】
３．前記少なくとも１つの経時的マーカーが、表２または表３から選択される年齢関連マーカーである、請求項１４に記載の細胞。
【００２４】
また、少なくとも１つの経時的マーカーを細胞内で誘導するのに十分な時間にわたり、ある量の内因性プロジェリン様タンパク質を発現するように改変されているＬＭＮＡ  ＲＮＡのスプライシングパターンを有する細胞も開示される。
【００２５】
一部の実施形態では、スプライシングパターンは、細胞に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、レトロウイルス、およびＤＮＡプラスミドなどのベクターをトランスフェクトすることにより改変される。
【００２６】
また、年齢改変細胞を候補薬物と接触させるステップと、細胞の生存、生物学的活性、形態、または構造のうちの少なくとも１つの変化を検出するステップとを含む薬物スクリーニングのための方法であって、前記年齢改変細胞が、細胞を、少なくとも１つの経時的マーカーを前記細胞内で誘導するのに十分な量の外因性プロジェリン様タンパク質と、前記マーカーを前記細胞内で誘導するのに十分な時間にわたり、接触させることにより誘導される前記少なくとも１つの経時的マーカーを呈示する、方法も開示される。一部の実施形態では、スクリーニング法は、年齢改変細胞を候補薬物と接触させるステップと、細胞の生存、生物学的活性、構造、または形態のうちの少なくとも１つの変化を検出するステップとを含み、前記年齢改変細胞は、少なくとも１つの経時的マーカーを前記細胞内で誘導するのに十分な時間にわたり、ある量の内因性プロジェリン様タンパク質を発現するように改変されているＬＭＮＡ  ＲＮＡのスプライシングパターンを有する。
【００２７】
一部の実施形態では、細胞をプロジェリン様タンパク質と接触させることにより、細胞の老化および／または成熟を加速化する。この過程を制御することにより、細胞の年齢を、遅発性疾患、とりわけ、そうしなければ十分に研究することができない疾患をモデル化するように選択することができる。
【００２８】
このようにして産生された細胞は、疾患のモデル化、薬物スクリーニング、および治療剤を含むがこれらに限定されない、様々な適用において使用することができる。
【００２９】
他の実施形態では、本開示は、年齢相応体細胞を産生するための方法であって、細胞培養物をプロジェリン様タンパク質と接触させ、この場合、前記細胞培養物が、少なくとも１つの第１の経時的マーカーシグネチャー（例えば、若齢細胞内または未成熟細胞内で見出されるシグネチャー）を有し、これにより、少なくとも１つの第２の経時的マーカーシグネチャー（例えば、老齢細胞内または成熟細胞内で見出されるシグネチャー）を呈示する年齢相応体細胞を誘導するステップを含む方法を提示する。さらなる実施形態では、本開示の方法は、年齢相応体細胞を産生するのに適用することもでき、初代体細胞をプロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質と接触させるステップを含み、この場合、初代体細胞培養物は、少なくとも１つの第１の疾患マーカーシグネチャーを有し、産生される年齢相応体細胞培養物は、少なくとも１つの第２の疾患マーカーシグネチャーを呈示する。経時的マーカーシグネチャーは、１つまたは複数の経時的マーカーを含みうる。
【００３０】
一実施形態では、ニューロン細胞は、中脳ドーパミン細胞である。一実施形態では、ニューロン細胞培養物は、ＰＡＲＫＩＮニューロン細胞培養物である。一実施形態では、ニューロン細胞培養物は、ＬＲＲＫ２ニューロン細胞である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
少なくとも１つの経時的マーカーを呈示する細胞を産生するための方法であって、該１つまたは複数の経時的マーカーが欠損した細胞を、該少なくとも１つの経時的マーカーの産生を誘導するのに十分な量のプロジェリン様タンパク質と、該マーカーの産生を誘導するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含む方法。
（項目２）
前記少なくとも１つの経時的マーカーが欠損した前記細胞が、幹細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも１つの経時的マーカーが欠損した前記細胞が、体細胞である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記体細胞が、幹細胞を１つまたは複数の分化因子と接触させるステップを含む方法により産生され、該分化因子が、該幹細胞の、該体細胞への分化を促進する、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記体細胞が、「老齢」体細胞である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記体細胞が、線維芽細胞、肝細胞、心臓細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、腎細胞、肺細胞、造血細胞、膵臓ベータ細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、破骨細胞、内皮細胞からなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ＣＮＳ細胞が、神経前駆体、ニューロン、およびグリア細胞からなる群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ＣＮＳ細胞が、中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロン細胞である、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記接触させるステップが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実行される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記プロジェリンが、ヒトプロジェリンである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記少なくとも１つの経時的マーカーが、年齢関連マーカー、成熟関連マーカー、および疾患関連マーカーからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記少なくとも１つの経時的マーカーが、表２または表３から選択される年齢関連マーカーである、項目１２に記載の誘導するための方法。
（項目１４）
少なくとも１つの経時的マーカーを呈示する細胞であって、該マーカーが、該細胞を該少なくとも１つの経時的マーカーを誘導するのに十分な量の外因性プロジェリン様タンパク質と、該マーカーを誘導するのに十分な時間にわたり接触させることにより誘導される、細胞。
（項目１５）
前記プロジェリンが、ヒトプロジェリンである、項目１４に記載の細胞。
（項目１６）
ハッチンソン−ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）に罹患していない個体から導出される、項目１４に記載の細胞。
（項目１７）
前記外因性プロジェリン様タンパク質の量が、内因性プロジェリンの発現レベルの約１０倍〜約５０００倍の範囲内にある、項目１４に記載の細胞。
（項目１８）
前記外因性プロジェリン様タンパク質の量が、内因性プロジェリンの発現レベルの約４０倍〜約５００倍の範囲内にある、項目１４に記載の細胞。
（項目１９）
外因性プロジェリン様タンパク質を恒久的に発現する、項目１４に記載の細胞。
（項目２０）
外因性プロジェリン様タンパク質を一過性に発現する、項目１４に記載の細胞。
（項目２１）
外因性プロジェリン様タンパク質をコードする改変ＲＮＡを含有する、項目１４に記載の細胞。
（項目２２）
線維芽細胞、肝細胞、心臓細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、腎細胞、肺細胞、造血細胞、膵臓ベータ細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、破骨細胞、内皮細胞からなる群から選択される体細胞である、項目１４に記載の細胞。
（項目２３）
前記ＣＮＳ細胞が、神経前駆体、ニューロン、およびグリア細胞からなる群から選択される、項目２２に記載の細胞。
（項目２４）
前記ＣＮＳ細胞が、中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロン細胞である、項目２２に記載の細胞。
（項目２５）
前記少なくとも１つの経時的マーカーが、年齢関連マーカー、成熟関連マーカー、および疾患関連マーカーからなる群から選択される、項目１４に記載の細胞。
（項目２６）
前記少なくとも１つの経時的マーカーが、表２または表３から選択される年齢関連マーカーである、項目１４に記載の細胞。
（項目２７）
少なくとも１つの経時的マーカーを細胞内で誘導するのに十分な時間にわたり、ある量の内因性プロジェリン様タンパク質を発現するように改変されているＬＭＮＡ  ＲＮＡのスプライシングパターンを有する細胞。
（項目２８）
ヒト細胞である、項目２７に記載の細胞。
（項目２９）
プロジェリンの発現が、恒久的である、項目２７に記載の細胞。
（項目３０）
プロジェリンの発現が、一過性である、項目２７に記載の細胞。
（項目３１）
前記スプライシングパターンが、前記細胞にベクターをトランスフェクトすることにより改変される、項目２７に記載の細胞。
（項目３２）
前記ベクターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、レトロウイルス、およびＤＮＡプラスミドからなる群から選択される、項目３１に記載の細胞。
（項目３３）
前記プロジェリン様タンパク質が、前記細胞に対して外因性である、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記外因性プロジェリン様タンパク質を、前記細胞に導入されたポリヌクレオチドにより発現させる、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記プロジェリン様タンパク質が、前記細胞に対して内因性である、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記内因性プロジェリン様タンパク質を、前記細胞のＬＭＮＡ  ＲＮＡのスプライシングパターンを改変することにより発現させる、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
年齢改変細胞を候補薬物と接触させるステップと、該細胞の生存、生物学的活性、形態、または構造のうちの少なくとも１つの変化を検出するステップとを含む薬物スクリーニングのための方法であって、該年齢改変細胞が、該細胞を、少なくとも１つの経時的マーカーを該細胞内で誘導するのに十分な量の外因性プロジェリン様タンパク質と、十分な時間にわたり接触させることにより誘導される該少なくとも１つの経時的マーカーを呈示する、方法。
（項目３８）
年齢改変細胞を候補薬物と接触させるステップと、該細胞の生存、生物学的活性、構造、または形態のうちの少なくとも１つの変化を検出するステップとを含む薬物スクリーニングのための方法であって、該年齢改変細胞が、少なくとも１つの経時的マーカーを該細胞内で誘導するのに十分な時間にわたり、ある量の内因性プロジェリン様タンパク質を発現するように改変されているＬＭＮＡ  ＲＮＡのスプライシングパターンを有する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本開示の一部の実施形態についての例示的な概略図を提示する図である。（Ａ）老齢ドナーに由来する初代線維芽細胞内で見出された年齢関連マーカーのセットが、ｉＰＳＣへの再プログラム化中に失われ、ｉＰＳＣを、線維芽細胞様細胞またはｍＤＡニューロンへと分化させても再び得られないことを示す図である。結果として、再プログラム化／分化パラダイムは、ドナー年齢に関わらず、「若齢」表現型を伴う細胞を発生させる。しかし、年齢関連マーカーは、プロジェリンを過剰発現させると再確立することができ、ｉＰＳＣ由来の「老齢」細胞をもたらすことができる。（Ｂ）ＰＤ患者に由来するｉＰＳＣと、見かけ上の健常ドナーに由来するｉＰＳＣとは、それらの遺伝子型の差異にも拘らず、表現型では同一であると考えられることを示す図である。ｍＤＡニューロンへと分化させると、ＰＤ細胞と対照細胞との間で観察されるのは、わずかな差異（疾患シグネチャーを伴わない／軽微な疾患シグネチャー）だけである。しかし、プロジェリンの過剰発現は、ｍＤＡの老化様シグネチャーを誘発し、ＰＤ  ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内の、遺伝子型と表現型との間の相互作用を要求する、複数の疾患関連表現型を顕在化させる（疾患シグネチャーの増強）。
【００３２】
【図２】図２は、老齢ドナーの線維芽細胞が、多能性状態への再プログラム化後に、年齢関連マーカーを失うことを示す例示的なデータを提示する図である。（Ａ）８２歳のドナーに由来する老齢の線維芽細胞と比較した、１１歳のドナーに由来する若齢の線維芽細胞における、核ラミナ（ラミンＡ／Ｃ）、ラミンＡ関連タンパク質（ＬＡＰ２α）、および末梢ヘテロクロマチン（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ＨＰ１γ）を同定するマーカーについての免疫細胞化学を示す図である。百分率は、フォールディングした核形態を伴う細胞および／またはブレブ形成した核形態を伴う細胞の比率を指し示す。（Ｂ）（Ａ）で描示されたマーカーの定量化により、選択された年齢関連マーカーの、若齢ドナーの線維芽細胞と、老齢ドナーの線維芽細胞とを層別化する能力、および老齢ドナーの線維芽細胞の、早老であるＨＧＰＳ患者の線維芽細胞との類似性が裏付けられることを示す図である。データは、継代をマッチさせた単一の線維芽細胞系に由来する細胞１００個についての、相対蛍光強度の度数分布としてプロットする。ａ．ｕ．：任意単位。（Ｃ）ＨＧＰＳ患者の線維芽細胞と同様に、老齢ドナーの線維芽細胞は、若齢ドナーの線維芽細胞より、ＤＮＡ損傷（γＨ２ＡＸ免疫細胞化学により測定される）のレベルが高く、ミトコンドリア内の反応性酸素分子種（ＲＯＳ；スーパーオキシドインジケーターであるＭｉｔｏＳＯＸを使用するフローサイトメトリーにより測定される）のレベルも高いことを示す図である。ｎ＝３回にわたる独立の実験である。（Ｄ）若齢ドナーの線維芽細胞および老齢ドナーの線維芽細胞に由来する、継代１０代目（Ｐ１０）のｉＰＳＣ内の年齢関連マーカーについての免疫細胞化学を示す図である。（Ｅ）（Ｄ）における染色の定量化により、老齢ドナー由来のｉＰＳＣが、再プログラム化を通して、年齢関連マーカーを保持することの不可能性（ＨＧＰＳ由来ｉＰＳＣと同様である）が指し示される図である。各々細胞のｎ＝３００個ずつ（３つの独立のｉＰＳＣクローンに由来する細胞１００個ずつ）。（Ｆ）再プログラム化すると、ＤＮＡ損傷レベルおよびミトコンドリア内のスーパーオキシドレベルがリセットされることを示す図である。ｎ＝３つの独立のクローンである。ｎ．ｓ．：有意差なし；コルモゴロフ−スミルノフ検定（ＢおよびＥ）またはスチューデントのｔ検定（ＣおよびＦ）により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：５０μｍ（Ａ）、１００μｍ（Ｃ）である。
【００３３】
【図３】図３は、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞が、分化後に年齢関連マーカーを再び得ないことを示す例示的なデータを提示する図である。（Ａ）年齢関連マーカーについての免疫細胞化学を示す図である。百分率は、フォールディングした核形態を伴う細胞および／またはブレブ形成した核形態を伴う細胞の比率を指し示す。（Ｂ）（Ａ）で示されたマーカーの定量化により、若齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞と、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞との間で、年齢様表現型を再確立するＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞と比較した高度の重複が指し示される図である。（Ｃ）ＤＮＡ損傷（左）およびミトコンドリア内のスーパーオキシド（右）の解析により、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞が、「若齢」様状態へとリセットされたことがさらに示される図である。ｎ．ｓ．：有意差なし；コルモゴロフ−スミルノフ検定（Ｂ）またはスチューデントのｔ検定（Ｃ）による、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。異なる時点において実施された、独立のｉＰＳＣクローンの、ｎ＝３回にわたる分化である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：５０μｍである。
【００３４】
【図４】図４は、プロジェリンの過剰発現により、健常ドナーに由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞の年齢関連変化が、ドナー年齢に関わらず誘導されることを示す例示的なデータを提示する図である。（Ａ）改変ＲＮＡを、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞へと、４日目における解析の前に、３日間連続でトランスフェクトしたことを示す図である。（Ｂ）ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内の、プロジェリンの過剰発現（ＧＦＰ−プロジェリン）により、核局在化ＧＦＰ（核−ＧＦＰ：ｎｕｃｌｅａｒ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ＧＦＰ）対照の過剰発現では観察されなかった、核形態の変化（ＧＦＰにより見られる）、ラミナ関連タンパク質（ＬＡＰ２α）の発現、ＤＮＡ損傷のレベル（γＨ２ＡＸ）、およびクロマチンの組織化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３；ＨＰ１γ）が引き起こされることを示す図である。百分率は、フォールディングした核形態を伴う細胞および／またはブレブ形成した核形態を伴う細胞の比率を指し示す。（Ｃ）（Ｂ）で示されたデータの定量化を示す図である。度数分布プロットは、独立のｉＰＳＣクローンから導出された、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞の、３回にわたる独立のＲＮＡトランスフェクションに由来する細胞１００個の蛍光強度を表す。（Ｄ）ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターであるＭｉｔｏＳＯＸについてのフローサイトメトリー解析により、プロジェリンの過剰発現を伴うミトコンドリアの機能不全の劇的な増大が示唆されることを示す図である。独立のｉＰＳＣクローンから導出された、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞の、ｎ＝３回にわたる独立のＲＮＡトランスフェクションである。コルモゴロフ−スミルノフ検定（ＬＡＰ２α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ＨＰ１γ）またはスチューデントのｔ検定（γＨ２ＡＸ、ＭｉｔｏＳＯＸ）による、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：２５μｍである。
【００３５】
【図５】図５は、線維芽細胞およびｉＰＳＣの特徴付けを示す例示的なデータを提示する図である。多様な年齢のドナーに由来する複数の初代線維芽細胞系にわたる年齢関連マーカーの評価が提示される。多能性の誘導が図式化され、結果として得られるｉＰＳＣクローンの特徴付けが示される。（Ａ）異なる年齢のドナーに由来する線維芽細胞の年齢関連変化を裏付けるマーカーについての免疫細胞化学解析の定量化を示す図である。若齢：全例１１歳、中間齢：３１〜５５歳、老齢：７１〜８２歳、ＨＧＰＳ（ハッチンソン−ギルフォード早老症候群）：３〜１４歳とする。年齢群１つ当たりｎ＝３例の独立のドナーである。さらなる線維芽細胞系情報については、表Ｓ１を参照されたい。（Ｂ）若齢ドナー（１１歳）線維芽細胞内、老齢ドナー（８２歳）線維芽細胞内、およびＨＧＰＳ患者（１４歳）線維芽細胞内の、各ＬＭＮＡアイソフォームについての定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図である。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。ｎ＝３代にわたる連続継代である。（Ｃ）再プログラム化についての時系列図である。ＨＧＰＳ患者の線維芽細胞は、プロジェリンの代謝回転を増大させ、これにより、プロジェリン誘導性の表現型の、再プログラム化効率に対する負の影響（Ｃａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３巻：８９〜５８頁（２０１１年））を低減するのに、ラパマイシン処理を要求した。ＯＳＫＭ：ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣ；ＭＥＦ：マウス胚性線維芽細胞；ＶＰＡ：バルプロ酸とする。（Ｄ）２つの代表的なｉＰＳＣクローンにより、多能性マーカーであるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４の、Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と同様の発現のほか、継代１０代目まで、残留センダイウイルスの発現の徴候が見られないことも裏付けられたことを示す図である。（Ｅ）多能性表面マーカー（ＳＳＥＡ４、上）および線維芽細胞（ＨＬＡ−ＡＢＣ、下）表面マーカーについての、ｉＰＳＣのフローサイトメトリー解析を示す図である。ドナー１例当たり２つずつの代表的なｉＰＳＣクローンのほか、ドナーの線維芽細胞も、Ｈ９  ｈＥＳＣと比較した。（Ｆ）ｉＰＳＣクローンの、三次元的胚様体（ＥＢ）構造への自発的分化により、ｉＰＳＣクローンが、３つの胚葉（内胚葉：ＧＡＴＡ４、ＡＦＰ；中胚葉：ＲＵＮＸ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ；外胚葉：ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ）のマーカーを上方調節する潜在的可能性が裏付けられることを示す図である。画像は、単一のｉＰＳＣクローンから導出された代表的なＥＢについて描示する。（Ｇ）見かけ上の健常若齢ドナーおよび老齢ドナーに由来する線維芽細胞内またはｉＰＳＣ内には存在しなかった、１８２４Ｃ＞Ｔヘテロ接合性突然変異の、再プログラム化を通した、ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ内の維持を示すシークエンシング結果を示す図である。ｎ．ｓ．：有意差なし；多重比較についてのダネット検定を伴うＡＮＯＶＡにより、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：２００μｍである。
【００３６】
【図６】図６は、ｉＰＳＣの、線維芽細胞様細胞への分化および改変ＲＮＡを使用するプロジェリンの過剰発現により、年齢関連マーカーの出現が引き起こされることを示す例示的なデータを提示する図である。（ＡおよびＢ）ｉＰＳＣを、血清含有培地中で、３０日間にわたり、線維芽細胞様細胞へと分化させ（Ａ）、線維芽細胞マーカーであるＣＤ１３およびＨＬＡ−ＡＢＣの、ｉＰＳＣと比較して高レベルの発現（赤色ボックス）について、フローサイトメトリーで分取した（Ｂ）。（Ｃ）分取後におけるｉＰＳＣ由来の線維芽細胞により、線維芽細胞様形態および免疫細胞化学によるビメンチンの発現は提示されたが、ネスチン（神経マーカー）の発現は提示されなかったことを示す図である。（Ｄ）ラミンＡ転写物およびプロジェリン転写物についてのＲＴ−ＰＣＲにより、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞（ｉＰＳＣ線維芽細胞）内の、ドナーの線維芽細胞内で観察されるのと同様のレベルまでの上方調節が示された図である。（Ｅ）改変ＲＮＡは、対照としての核局在化緑色蛍光タンパク質（核−ＧＦＰ：）またはＧＦＰへと融合させたプロジェリン（ＧＦＰ−プロジェリン）を発現させるようにデザインしたことを示す図である。ジェネリック５’ＵＴＲおよびジェネリック３’ＵＴＲのほか、ポリ（Ａ）テールおよび５’キャップ構造の付加により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写反応を容易とした（Ｍａｎｄａｌら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ、８巻：５６８〜５８２頁（２０１３年）；Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７巻：６１８〜６３０頁（２０１０年））。（Ｆ）トランス遺伝子の発現についてのウェスタンブロット解析を示す図である。ｎ：核−ＧＦＰ；ｐ：ＧＦＰ−プロジェリンとする。ラミンＡ／Ｃ抗体（Ｎ−１８）を使用する検出についての解析により、プロジェリンの過剰発現は、ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内で観察される内因性プロジェリンレベルより高レベルを誘導することが明らかにされた（矢印）。（Ｇ）Ｑ−ＦＩＳＨによる、テロメア長および２キロベース（ｋｂ）未満のテロメアの百分率の定量化を示す図である。ｎ＝４連のウェルである。（Ｈ）老化マーカーである老化活性化ベータ−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）の、初代線維芽細胞から、プロジェリンを過剰発現させる、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞への全ての段階における評価を示す図である。ｎ＝２連のウェルである。ｎ．ｓ．：有意差なし；スチューデントのｔ検定により、＊ｐ＜０．０５である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：２００μｍである。
【００３７】
【図７】図７は、プロジェリンの過剰発現により、若齢ドナーおよび老齢ドナーの両方に由来するｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン内の線維芽細胞年齢関連シグネチャーのサブセットが誘導されることを示す例示的なデータを提示する図である。（Ａ）改変ＲＮＡを、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンへと、６日目における解析の前に、５日間連続でトランスフェクトしたことを示す図である。（Ｂ）トランス遺伝子の発現についてのウェスタンブロット解析を示す図である。１００ｋＤａにおけるＧＦＰバンドが、ＧＦＰプロジェリン融合タンパク質を表示するのに対し、２７ｋＤａにおけるＧＦＰバンドは、核−ＧＦＰトランス遺伝子を表す。トランス遺伝子を含む全てのラミンＡアイソフォームは、単一の抗体により認識された。プロジェリンの過剰発現レベルは、内因性ラミンＡレベルを超えることに注意されたい（矢印）。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、検出可能レベルのプロジェリンタンパク質を、内因的には発現させないと考えられる。ｎ：核−ＧＦＰ；ｐ：ＧＦＰ−プロジェリンとする。（Ｃ）プロジェリンの過剰発現により、若齢ドナー由来のｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンおよび老齢ドナー由来のｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンのいずれにおいても、核のフォールディングおよびブレブ形成（ラミンＢ２により見られる、ピンク色）が増強され、ＤＮＡ損傷の蓄積が増大する（γＨ２ＡＸ）ことを示す図である。百分率は、核のフォールディングおよび／またはブレブ形成が増強された細胞の比率、または＞３つの肥大したγＨ２ＡＸ病巣を伴う細胞の比率を指し示す。（Ｄ）ミトコンドリア内のスーパーオキシドレベル（ＭｉｔｏＳＯＸ）についてのフローサイトメトリー解析により、プロジェリンの過剰発現を伴うミトコンドリアの機能不全の増大が裏付けられることを示す図である。独立のｉＰＳＣクローンから導出された、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの、ｎ＝３回にわたる独立のＲＮＡトランスフェクションである。（Ｅ）ＬＡＰ２α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、およびＨＰ１γについての免疫細胞化学の定量化により、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内で観察される表現型と異なり、ＧＦＰ−プロジェリンをトランスフェクトされたｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン、または核−ＧＦＰをトランスフェクトされたｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンの間では差異が示されないことを示す図である（図３を参照されたい）。蛍光強度は、核−ＧＦＰ処理細胞内で観察される強度に照らして正規化した。スチューデントのｔ検定により、＊ｐ＜０．０５（Ｄ）である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：１０μｍ（Ｃ、下）、２５μｍ（Ｃ、上）である。
【００３８】
【図８】図８は、ｉＰＳＣの、ｍＤＡニューロンへの分化を示す例示的なデータを提示する図である。ｍＤＡニューロンをｉＰＳＣから導出するためのプロトコールを、分化過程の多様な段階において結果として得られる細胞の、免疫細胞化学による特徴付けと共に提示する。（Ａ）ｍＤＡニューロンをｉＰＳＣから導出するための分化プロトコールについての図式的例示である。Ｍｉｔ．Ｃ：マイトマイシンＣとする。（Ｂ）分化の１３日目における、ＦＯＸＡ２（赤色）、ＬＭＸ１Ａ（緑色）、およびＯＣＴ４（ピンク色）についての免疫細胞化学を示す図である。（Ｃ）最終日である３０日目の再播種の１日後におけるマイトマイシンＣ処理が、残りの増殖細胞（有糸分裂後のニューロンは影響を受けなかった）を消失させる一助となったことを示す図である。（ＤおよびＥ）免疫細胞化学（Ｄ）および定量化（Ｅ）により、分化の７０日目における残りの細胞のうちのほぼ１００％が、有糸分裂後ニューロン（ＴＵＪ１＋／Ｋｉ６７−）であり、これらのニューロンのうちの８０％超が、ｍＤＡ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２＋／ＴＨ＋）を発現させたことが裏付けられる図である。既に報告されている通り（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））、ＴＨ＋ニューロンのうちの約４０％はまた、成熟度の大きなｍＤＡマーカーであるＮＵＲＲ１も発現させる。独立のｉＰＳＣクローンの、ｎ＝少なくとも３つの独立の分化である。（Ｆ）ｍＤＡニューロンの分化中におけるラミンＡおよびラミンＢ２についての免疫細胞化学は、核フォールディングの開始と同様のタイミングで、ラミンＡアイソフォームの内因性の上方調節を示す。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：５０μｍである。
【００３９】
【図９】図９は、プロジェリンの過剰発現後における、包括的な「年齢」マーカープロファイル（５−ｍＣ解析、５−ｈｍＣ解析、およびＲＮＡ−Ｓｅｑ解析）についての例示的なデータを提示する図である。年齢をマッチさせた線維芽細胞およびｉＰＳＣに由来する５−ｍＣメチル化シグネチャー（Ａ）および５−ｈｍＣメチル化シグネチャー（Ｂ）についての階層的クラスタリングは、線維芽細胞とｉＰＳＣとの間で、明らかな分離を示し、年齢による下位分類を伴う。パネルＣは、プロジェリンを発現させるｉＰＳＣ−ｍＤＡについての階層的クラスタリングを示し、マッチさせたＧＦＰ対照が、顕著に異なる年齢関連トランスクリプトームプロファイルを指し示す図である。パネルＤおよびＥは、初代線維芽細胞と対比したｉＰＳＣ内の、５−ｍＣおよび５−ｈｍＣの示差的なメチル化についてのゲノムワイドの図解であって、ｉＰＳＣ内のメチル化の増大を指し示す図解を示す。
【００４０】
【図１０】図１０は、プロジェリンに誘導される核変化の可逆性を示す例示的なデータを提示する図である。パネルは、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）誘導性線維芽細胞系（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１０巻、４５２〜４５９頁（２００８年））内の、プロジェリンに誘導される核形態の変化が、ドキシサイクリンの再添加後１０日間以内に逆転されることを示す。
【００４１】
【図１１】図１１は、老化ヒト脳組織内のラミンＡおよびプロジェリンの発現を示す例示的なデータを提示する図である。パネルＡは、ラミンＡおよびプロジェリンのいずれもが、老化個体から得られた大脳皮質組織内のｍＲＮＡ発現レベルの上昇を示すことを裏付ける図である。パネルＢは、４４および８２歳の２例のドナーのそれぞれから得られたラミンＡ／ＣおよびＭＡＰ２についての免疫蛍光による、パラフィン包埋されたヒト大脳皮質組織内の核膜の視覚化およびニューロンの同定について描示する図である。矢印は、ＭＡＰ２陽性ニューロンの例を指し示す。パネルＣは、可溶性トリメチル化Ｈ３Ｋ９についてのウェスタンブロット解析（左パネル）であって、ラミンＡおよびプロジェリンの上方調節と同様のタイミングによるヘテロクロマチン組織化の劇的な変化を指し示すウェスタンブロット解析を示す図である。これらの変化は、右パネルにより裏付けられる通り、ヘテロクロマチンの、年齢に応じた不溶性のヘテロクロマチン性病巣への再組織化を反映しうる。
【００４２】
【図１２】図１２は、プロジェリンの過剰発現により、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンにおけるニューロンの老化と符合する特徴が誘発されることを示す例示的なデータを提示する図である。（Ａ）汎ニューロンマーカーであるＴＵＪ１についての免疫細胞化学により、確立されたニューロンネットワークが、７０日目において、プロジェリンを過剰発現させるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンでは失われるが、核−ＧＦＰを過剰発現させるｉＰＳＣ由来ニューロンでは失われないことが示される図である。（Ｂ）ＭＡＰ２についての免疫細胞化学により、若齢ドナーおよび老齢ドナーの両方に由来する全てではない（挿入図）が大半のｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン内の、プロジェリンの過剰発現後における、無傷の樹状突起の長さの縮減が明らかにされることを示す図である。度数分布は、３回にわたる独立のＲＮＡトランスフェクション（核が非アポトーシス性の細胞に限り５０個ずつ）による、樹状突起長の全測定値を提示する。（Ｃ）ＲＮＡ−ｓｅｑ遺伝子発現データについての主成分分析により、再プログラム化により誘導される年齢のリセットであって、若齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンと、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンとの高度な類似性を結果としてもたらす、年齢のリセットがさらに確証されることを示す図である。プロジェリンの過剰発現により、ｍＤＡニューロンの同様の変化であって、ドナー年齢に依存しない変化が誘導される。（Ｄ）プロジェリン処理において、対照の核−ＧＦＰで処理された若齢ドナーによるｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン（緑色）および老齢ドナーによるｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン（青色）と比較して上方調節された上位２０の遺伝子（左）および下方調節された上位２０の遺伝子（右）を示す図である。遺伝子を、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンによりランク付けする。赤色は、特徴付けされていない遺伝子を表示し、橙色は、非コードＲＮＡを表示する。点線は、有意性についての閾値を指し示す。（Ｅ）有意に示差的に発現する転写物であって、コード転写物、非コード転写物、または特徴付けされていない転写物である、転写物の比率を表す円グラフである。コルモゴロフ−スミルノフ検定により、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。スケールバー：２００μｍ（Ａ）、５０μｍ（Ｂ）である。
【００４３】
【図１３ＡＢＣ】図１３は、プロジェリンの過剰発現により、神経変性様表現型が誘導されることを示す例示的なデータを提示する図である。プロジェリンの過剰発現後におけるｍＤＡニューロンマーカーの特徴付けを提示することから、プロジェリンは、急性毒性を誘導しないことが論じられる。ベン図により、プロジェリン誘導性老化シグネチャーとして規定された重複する示差的発現遺伝子について描示し、著明な遺伝子オントロジータームを列挙する。（ＡおよびＢ）ＮＵＲＲ１＋  ｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロンの百分率（Ａ）およびＴＨのタンパク質発現レベル（Ｂ）は、トランスフェクションを経ても不変のままであったことから、プロジェリンの過剰発現は、鍵となるｍＤＡニューロンのタンパク質（急性毒性の典型的な徴候）を下方調節しないことが指し示される図である。（Ｃ）各色の円により、２つの群の間で示差的に発現する遺伝子の数（倍数変化±２、ｐ＜０．０５）を指し示すベン図である。黒色の円は、さらに解析された重複する「老化シグネチャー」を指し示す。（Ｄ）核−ＧＦＰで処理されたｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内またはＧＦＰ−プロジェリンで処理されたｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内で濃縮される、著明な遺伝子オントロジータームを示す図（左〜右）である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。
【図１３Ｄ】図１３は、プロジェリンの過剰発現により、神経変性様表現型が誘導されることを示す例示的なデータを提示する図である。プロジェリンの過剰発現後におけるｍＤＡニューロンマーカーの特徴付けを提示することから、プロジェリンは、急性毒性を誘導しないことが論じられる。ベン図により、プロジェリン誘導性老化シグネチャーとして規定された重複する示差的発現遺伝子について描示し、著明な遺伝子オントロジータームを列挙する。（ＡおよびＢ）ＮＵＲＲ１＋  ｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロンの百分率（Ａ）およびＴＨのタンパク質発現レベル（Ｂ）は、トランスフェクションを経ても不変のままであったことから、プロジェリンの過剰発現は、鍵となるｍＤＡニューロンのタンパク質（急性毒性の典型的な徴候）を下方調節しないことが指し示される図である。（Ｃ）各色の円により、２つの群の間で示差的に発現する遺伝子の数（倍数変化±２、ｐ＜０．０５）を指し示すベン図である。黒色の円は、さらに解析された重複する「老化シグネチャー」を指し示す。（Ｄ）核−ＧＦＰで処理されたｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内またはＧＦＰ−プロジェリンで処理されたｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内で濃縮される、著明な遺伝子オントロジータームを示す図（左〜右）である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。
【００４４】
【図１４】図１４は、プロジェリンの過剰発現が、遺伝性ＰＤについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉＰＳＣベースのモデルにおいて、疾患特異的表現型を顕在化させることを示す例示的なデータを提示する図である。（ＡおよびＢ）ＮＵＲＲ１＋細胞の定量化（Ａ）およびＴＨタンパク質レベルについてのウェスタンブロット解析（Ｂ）では、ＧＦＰ−プロジェリン改変ＲＮＡのトランスフェクションに応じた著明な差異が明らかにならないことを示す図である。ｎ：核−ＧＦＰ；ｐ：ＧＦＰ−プロジェリンとする。ウェスタンブロットの下方の数は、ＧＡＰＤＨに照らして正規化された、ＧＦＰ−プロジェリンによるＴＨの発現：核−ＧＦＰによるＴＨの発現の比を指し示す。（Ｃ）ＲＮＡトランスフェクション後における細胞死であって、それらの凝縮された核形態により同定される細胞死を経る、ＧＦＰ＋細胞についての解析を示す図である。画像は、プロジェリンで処理された細胞内の、切断型カスパーゼ３による免疫細胞化学の代表例を提示する。（Ｄ）樹状突起マーカーであるＭＡＰ２についての免疫細胞化学を示す図である。（Ｅ）ＧＦＰ＋ニューロン１つ当たりの樹状突起の全長の定量化により、ＰＤ突然変異体ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンにおける、プロジェリンの過剰発現に応答した、樹状突起の、見かけ上の健常対照（Ｃ１〜４）と比較して加速化された短縮が示される図である。（ＦおよびＧ）ＡＫＴ経路によるシグナル伝達についてのウェスタンブロット解析（Ｆ）により、プロジェリンの過剰発現に対する遺伝子型特異的応答が裏付けられることを示す図である。リン酸化特異的バンドの定量化（Ｇ）は、全タンパク質に照らして正規化してから、プロジェリン処理による発現レベルの、核−ＧＦＰ処理による発現レベルに対する比をとった。点線は、両方の処理条件において、リン酸化型タンパク質が等量であることを指し示す。定量化は、各遺伝子型について、３つずつの独立の細胞単離物を表す。ダネット検定を伴う一元ＡＮＯＶＡにより、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である（全ての場合において、ｎ＝３つずつの独立の分化および改変ＲＮＡトランスフェクション）。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。ｎ：核−ＧＦＰ；ｐ：ＧＦＰ−プロジェリンとする；Ｃ１〜４：見かけ上の健常ドナーに由来する系；（Ｒ）：レトロウイルス因子を使用して導出されたｉＰＳＣ；（Ｓ）：センダイウイルス因子を使用して導出されたｉＰＳＣ。スケールバー：２５μｍである。
【００４５】
【図１５】図１５は、ＰＤ突然変異体ｉＰＳＣの、ｍＤＡニューロンへの分化、およびさらなるＰＤ患者の特徴付けを示す例示的なデータを提示する図である。ＰＩＮＫ１突然変異およびＰａｒｋｉｎ突然変異についての突然変異解析のほか、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンについての免疫細胞化学解析も提示され、ＰＤ  ｉＰＳＣは、健常ドナーによるｉＰＳＣと同じ能力で分化することが裏付けられる。（Ａ）ＰＤ突然変異体ｉＰＳＣ内では見出されるが、見かけ上の健常対照ｉＰＳＣ内では見出されない、ホモ接合性のＰＩＮＫ１  ｃ．１３６６Ｃ＞Ｔ突然変異およびＰＡＲＫ２  ｃ．１０７２ｄｅｌＴ突然変異についてのシークエンシングを示す図である。（Ｂ）分化の１３日目における免疫細胞化学では、ＯＣＴ４＋  ｉＰＳＣの、ＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋  ｍＤＡフロアプレート先駆体への転換における、健常ドナーとＰＤ患者との間の差異が裏付けられなかったことを示す図である。（Ｃ）先駆体の、有糸分裂後ｍＤＡニューロンへのさらなる分化は、ＰＤ突然変異体細胞内で影響を受けなかったことを示す図である。ｎ＝少なくとも３つの独立の分化である。（Ｄ）Ｐａｒｋｉｎ（ｐ．Ｒ２７５Ｗ）内にヘテロ接合性突然変異を伴うさらなるＰＤ患者における、ＡＫＴ経路によるシグナル伝達についてのウェスタンブロット解析を示す図である。ブロットの下方の数は、ｐ−ＡＫＴ（ＧＦＰ−プロジェリン）の、ｐ−ＡＫＴ（核−ＧＦＰ）に対する比を指し示す。ｎ：核−ＧＦＰ；ｐ：ＧＦＰ−プロジェリンとする。ｎ．ｓ．：有意差なし；スチューデントのｔ検定により、＊ｐ＜０．０５である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：５０μｍである。
【００４６】
【図１６】図１６は、長期にわたる、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるプロジェリンの過剰発現が、ＰＤ突然変異体細胞において、重度の変性表現型を顕在化させることを示す例示的なデータを提示する図である。（Ａ）６−ＯＨＤＡにより病変を施されたパーキンソン病マウスへの移植研究についての図式的例示である。Ｂ）対照ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンまたはｈＳｙｎ：：核−ＧＦＰもしくはｈＳｙｎ：：ＧＦＰ−プロジェリンを発現させるＰＤ突然変異体ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを移植された病変マウスの回転挙動解析を示す図である。マウスに病変を施し、アンフェタミンにより誘導される回転挙動について、移植の前に２回にわたり調べた。点線は、病変形成の成功についての閾値を指し示す。ピンク色の記号により、病変形成に成功した動物であって、回復を示さなかった動物を同定する。処理群１つ当たりの動物のｎ＝３〜５匹である。（Ｃ）移植の３カ月後における評価により、プロジェリンを過剰発現させるＰＤ突然変異体におけるＴＨ＋  ｍＤＡニューロンの劇的な喪失であって、対照トランスフェクション細胞または見かけ上の健常細胞についてははるかに小さな程度で観察される喪失が明らかとなったことを示す図である。（Ｄ）ＴＨ＋であるＧＦＰ＋細胞の百分率の定量化を示す図である。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。条件１つ当たりのマウスのｎ＝３匹である。（Ｅ〜Ｇ）移植の６カ月後における超微細構造解析により、プロジェリンの過剰発現を伴う移植片内の、リポフスチン沈着物（Ｅ：黄色の矢印）を伴う神経メラニンの蓄積が明らかとなったことを示す図である。注目すべきことに、プロジェリンを伴うＰＩＮＫ１突然変異体の移植片が、ミトコンドリアの肥大を提示した（Ｆ：橙色の矢印により指し示される、＋核−ＧＦＰ群における代表的なミトコンドリアと、＋ＧＦＰ−プロジェリン群における代表的なミトコンドリアとを比較されたい）のに対し、プロジェリンを伴うＰａｒｋｉｎ突然変異体の移植片は、大きな多重膜体を有した（Ｇ：ピンク色の矢印）。これらの表現型は、他のいずれの処理群でも観察されなかった。（Ｅ）および（Ｇ）におけるアステリスクは、線維体を指し示す。スチューデントのｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：２００μｍ（Ｃ）、５００ｎｍ（Ｅ〜Ｇ）である。
【００４７】
【図１７】図１７は、異種移植および移植されたｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの特徴付けを示す例示的なデータを提示する図である。（Ａ）移植の１日後にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再播種され、固定されたｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン内のＮＵＲＲ１およびＴＨについての免疫細胞化学を示す図である。細胞のうちの少なくとも５０％は、この時点において、既にシナプシン駆動型トランス遺伝子を発現させた。（Ｂ）移植の６カ月後におけるＴＨおよびＧＦＰについての免疫組織化学により、プロジェリンを過剰発現させる場合の、ＴＨ＋  ＰＤ  ｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロンの劇的な喪失が裏付けられることを示す図である。対照およびＰＤ突然変異体におけるＴＨ喪失のこのパターンは、移植の３カ月後において観察されたパターンと同様である。点線は、移植片を規定する。アステリスクは、脳梁を示す。挿入図は、代表的なＧＦＰ＋核を示す。（ＣおよびＤ）透過電子顕微鏡法（ＥＭ）による超微細構造解析を示す図である。代表的な（Ｃ）ＴＨ＋樹状突起および（Ｄ）ＧＦＰ＋核を概観し、各々を、それぞれ、ＤまたはＮで表示する。左下の数は、１μｍ２当たりのＴＨ−免疫金粒子の平均数を表す。アステリスクにより、線維体を同定する。（Ｅ）ＥＭ解析による神経メラニン沈着物の定量化を示す図である。動物１匹当たり１０カ所の５０μｍ２領域を解析した。（Ｆ）ＥＭ解析による、ＰＩＮＫ１−Ｑ４５６Ｘ動物における２５のミトコンドリアの面積の定量化を示す図である。スチューデントのｔ検定により、＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。棒グラフは、平均±ＳＥＭを表す。スケールバー：５０μｍ（Ａ）、４００μｍ（Ｂ）、５００ｎｍ（Ｃ）、２μｍ（Ｄ）である。
【００４８】
【図１８】図１８は、１１歳のドナー個体、８２歳のドナー個体、およびＨＧＰＳを伴う患者に由来する初代線維芽細胞内およびｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内の老化マーカーであるＳＡ−βＧａｌについての例示的なデータを提示する図である。
【００４９】
【図１９】図１９は、合成ｍＲＮＡ技術を使用する、プロジェリンの発現について記載する概略図を提示する図である。左側の概略図は、ＭａｎｄａｌおよびＲｏｓｓｉ、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ、８巻：５６８〜５８２頁（２０１３年）による概略図である。右側の概略図は、本出願において使用される実験プロトコールであって、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞を、核−ＧＦＰまたはＧＦＰ−プロジェリンを発現させる改変ＲＮＡで３日間にわたり処理する一方で、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを、核−ＧＦＰまたはＧＦＰ−プロジェリンを発現させる改変ＲＮＡで５日間にわたり処理したことについて記載する実験プロトコールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本開示は一般に、疾患を処置するための細胞療法、ならびに障害および／または疾患、特に、遅発性障害および／または疾患をモデル化するための、細胞ベースの系に関する。より具体的には、本明細書では、初代細胞（下記で定義される）の場合もあり、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、またはヒト対象もしくは動物対象から回収された幹細胞など、未分化の（幹）細胞に由来する場合もある、体細胞およびこのような細胞を産生するための方法が提供される。体細胞は、細胞年齢、成熟、および／または疾患に特徴的な１つまたは複数のマーカーであって、１もしくは複数の細胞内マーカーもしくは形態マーカーを検出することにより確認することもでき、かつ／または細胞内の経時的マーカーシグネチャーを構成する１もしくは複数のマーカーを含む、１もしくは複数の細胞内マーカーの非存在を検出することにより確認することもできる、１つまたは複数のマーカーを呈示する。
【００５１】
本明細書で開示される細胞およびこれらの細胞を産生するための方法は、初代体細胞の再プログラム化または脱分化から生じる人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、細胞年齢、成熟、および／または疾患に特徴的な１つまたは複数のマーカーを失うことが観察されている（Ｆｒｅｉｊｅ，  Ｊ．Ｍ．およびＬｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ，  Ｃ．（２０１２年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４巻、７５７〜７６４頁）が、所望の細胞型への分化の前または後において、ｉＰＳＣをプロジェリン様タンパク質と接触させることにより、このようなｉＰＳＣに、細胞年齢、成熟、および／または疾患に特徴的な１つまたは複数のマーカーを発現させうるという発見に基づく。細胞は、プロジェリン様タンパク質と接触させ、これにより、１つまたは複数の経時的マーカーシグネチャーを呈示させる前または呈示させた後において、ｉＰＳＣを分化させることにより産生される。このような「年齢相応」細胞は、障害および／または疾患を処置するための方法において使用することができ、遅発性障害および／または疾患を含む障害および／または疾患を研究するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系として使用することもできる。
【００５２】
体細胞の、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への、従来の再プログラム化では、それらの表現型が、胎児年齢まで戻すようにリセットされ、したがって、遅発性障害をモデル化するのに、著明な障害が提示されている。加えて、ヒト対象から回収された幹細胞およびこのような幹細胞に由来する体細胞はまた一般に、年齢も欠き、また、遅発性疾患の場合の疾患マーカーも欠くことが多い。本明細書で記載される通り、幹細胞由来の体細胞であって、限定なしに述べると、ヒトｉＰＳＣ由来の細胞系統を含む体細胞内で適切な経時的マーカーシグネチャーを誘導し、これにより、疾患モデルとして適する年齢相応細胞培養物を発生させるための方法が開示される。培養物中で体細胞を増殖させることが可能な場合、このような疾患モデルは、「若齢」マーカーシグネチャーを発現させる体細胞内で、老化経時的マーカーシグネチャー（必ずしも幹細胞の分化を誘導することにより導出されるわけではない）を誘導することにより開発することができる。この戦略を、アルツハイマー病（ＡＤ）もしくはパーキンソン病（ＰＤ）などの神経変性疾患、心筋細胞関連疾患、膵臓疾患、および／または造血器疾患を含むがこれらに限定されない、遅発性疾患および／または障害を伴う患者に由来する細胞培養物へと適用して、患者年齢をより正確に表し、したがって、疾患状態をより正確に表す、年齢相応細胞培養物を導出することができる。本開示の方法はまた、これらの老化ｉＰＳＣ由来細胞を使用する、遅発性疾患に関与性の薬物スクリーニングまたは他の任意の実験に活用される細胞へも適用することができる。例えば、年齢改変を伴わないｉＰＳＣ由来細胞を使用する薬物スクリーニングは、ＡＬＳのための薬物をスクリーニングするのに使用されている（Ｙａｎｇ  Ｙ．Ｍ．ら、２０１３年、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１２巻、７１３〜７２６頁）。また、上記で言及した疾患のためのｉＰＳＣ由来細胞であって、プロジェリン誘導性老化を経た細胞も、薬物スクリーニングに使用することができる。
【００５３】
開示される方法は、ｉＰＳＣ細胞系統の細胞などの体細胞の、プロジェリンまたは他のプロジェリン様タンパク質への曝露、および培養物中で細胞の老化の加速化を誘導するその能力を伴う。開示される方法はまた、体細胞の、培養物中のこれらの細胞の成熟を加速化するプロジェリン様タンパク質への曝露にも関する。本明細書で提示されるデータは、ｉＰＳＣ由来の細胞培養物（例えば、ｉＰＳ細胞から導出された線維芽細胞およびｉＰＳ細胞から導出されたニューロン）を、プロジェリン様タンパク質と接触させることにより、１つまたは複数の経時的マーカーシグネチャー、ならびに成熟細胞および／または老齢細胞などの年齢相応細胞の他の特徴を構成する１つまたは複数の経時的マーカーが誘導されることを裏付ける。
【００５４】
一部の実施形態では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける寿命が長い細胞であって、ニューロンおよび心筋細胞など、万一損傷または罹患したらすぐには補充されないことが典型的な細胞、ならびに老化状態にあるこのような細胞を得る方法に関する。これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する場合は通例、それらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける対応物を表す老化および／または成熟マーカーを呈示するのに、長い培養時間を必要とする。このような手順は、利用可能であっても、時間がかかり、費用がかさむ。一部の実施形態では、本開示は、このような細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、プロジェリン様タンパク質と接触させて、それらの成熟もしくは老化またはこれらの両方を加速化し、これにより、年齢相応細胞をもたらす方法に関する。一部の実施形態では、これらの細胞を使用して、神経変性疾患、アテローム性動脈硬化、および他の慢性代謝性疾患など、遅発性疾患をモデル化することができる。
【００５５】
一部の実施形態では、本開示は、このような細胞をプロジェリン様タンパク質と接触させることによる、細胞培養物中の、哺乳動物細胞の制御された成熟および／または老化に関する。単独で使用されても、他の試薬（ｉＰＳＣ細胞のための細胞分化プロトコールなど）と組み合わせて使用されても、本開示による方法は、細胞の成熟および／または老化を、細胞を接触させるプロジェリン様タンパク質の用量を調整することにより操作されうる制御された速度で加速化する能力を付与する。例えば、本開示の方法による細胞の成熟および／または老化は、プロジェリン様タンパク質の用量を低減することにより緩徐化することもでき、曝露時間を縮減することにより緩徐化することもでき、タンパク質の効力を低減することにより緩徐化することもできる。代替的に、プロジェリン様タンパク質の曝露は、プロジェリン様タンパク質を除去することにより停止させることもでき、タンパク質の阻害性因子（例えば、ＲＮＡサイレンシング、ｍＡｂなど）を導入することにより停止させることもできる。成熟させた細胞は、さらなる手順にかけることもでき、成熟細胞の使用が重要な実験で使用することもでき、細胞療法で使用することもできる。
【００５６】
本開示のこれらの態様および他の態様は、以下の非限定的な定義を参照することによりよりよく理解することができる。
【００５７】
定義
下記で定義される用語は、文脈によりそうでないことが明確に指し示されない限り、それらに帰せられる意味を有するものとする。定義された用語は、その同類語を含むものとする。
【００５８】
本明細書で使用される「患者」という用語は、ヒト、非ヒト霊長動物、齧歯動物などを含むがこれらに限定されない、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。本明細書で使用される、「対象」という用語と「患者」という用語とは、互換的である。
【００５９】
個体に言及して本明細書で使用される「若齢」という用語は、早い経時的年齢を指し、これは、ヒトでは、数年間にわたる年齢を指す。細胞に言及する場合の「若齢」という用語は、ｉＰＳＣ由来の若齢体細胞、すなわち、ｉＰＳＣをもたらした元の初代細胞のドナーの年齢に関わらず、若齢ドナーから単離された細胞のマーカーシグネチャーを提示する細胞など、未成熟細胞などの細胞状態を指す。これは、ｉＰＳＣ由来の「老齢」体細胞、または、実際のところ、老齢ドナーから単離された細胞のマーカーシグネチャーを提示する任意の体細胞と対照される。ｉＰＳＣ由来の老齢体細胞の例は、再プログラム化の後で、ｉＰＳＣ由来の体細胞をプロジェリンに接触させる場合に産生される体細胞である（ここでもまた、ｉＰＳＣをもたらした初代細胞のドナーの年齢に関わらない）。若齢細胞はまた、「初代若齢線維芽細胞」における通り、経時的年齢が若いドナーから導出された初代若齢細胞など、「若齢細胞」の集団も指す場合がある。
【００６０】
個体に言及して本明細書で使用される「老齢」という用語は、ヒトでは、数年間にわたる年齢を指す、経時的年齢を指す。細胞に言及する場合の「老齢」という用語は、細胞が、老化細胞と関連する１つまたは複数の経時的マーカーを発現させる細胞状態、または老齢ドナーに由来する初代体細胞を指す。老齢細胞はまた、「初代老齢線維芽細胞」における通り、経時的年齢が老いたドナーから導出された初代老齢細胞など、「老齢細胞」の集団も指す場合がある。
【００６１】
本明細書で使用される「ドナー個体」または「ドナー」という用語は、初代細胞培養物をもたらすように細胞をそこから得た、任意の生物、ヒトまたは非ヒトを指す。ドナー個体は、任意の年齢であることが可能であり、罹患していない場合もあり、罹患している場合もある。ドナーは、生検、皮膚生検、血液細胞などを含む生物学的試料を提供することにより、本方法における使用のための細胞を提供しうる。
【００６２】
本明細書で使用される「疾患」という用語は、生存する動物体もしくは植物体またはその部分のうちの１つの正常状態に対する任意の機能障害であって、死活的機能の性能を中断または改変する機能障害を指す。徴候および症状を識別することにより顕在化することが典型的であるが、疾患は通例、ｉ）環境因子（栄養不良、工業災害、または気候など）；ｉｉ）特殊な感染性作用物質（蠕虫、細菌、またはウイルスなど）；ｉｉｉ）生物の遺伝性欠損または後天性欠損（遺伝的異常または後成的異常など）；および／またはｉｖ）これらの因子の組合せに対する応答である。
【００６３】
本明細書で使用される「遅発性疾患」という用語は、中間齢患者および老齢患者における臨床的状態として顕在化する、患者の疾患または医学的状態を指す。したがって、遅発性疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン病など、神経変性疾患などの変性疾患、および心肥大、心臓線維症、ＩＩ型糖尿病、加齢黄斑変性を含む他の細胞系統の疾患、例えば、乳がん、結腸がん、および卵巣がん、家族性腺腫様ポリープ（ＦＡＰ）、心疾患などを含むがんを含みうるがこれらに限定されない。参照により組み込まれる、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ、１９巻：９７〜１０６頁（２００３年）を参照されたい。
【００６４】
本明細書で使用される「細胞培養物」という用語は、任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞培養物を指す。この用語には、連続細胞系（例えば、不死表現型を伴う）、初代細胞培養物、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、ならびに卵細胞および胚を含む、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで維持される他の任意の細胞集団が含まれる。
【００６５】
本明細書で使用される「欠損」という用語は、遺伝子のｍＲＮＡ、遺伝子のタンパク質産物、またはこれらの両方を発現させない（すなわち、このような発現を欠く）細胞、またはそれらを低減されたレベルで発現させる細胞を指す。
【００６６】
本明細書で使用される「ニューロン成熟培地」または「ＢＡＧＣＴ培地」という用語は、Ｎ２培地を含み、中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋  ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを分化させるための、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、グリア細胞系由来神経栄養因子、ジブチリルｃＡＭＰ、およびβ３型形質転換増殖因子をさらに含む培養培地を指す。
【００６７】
本明細書で使用される、「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」、「単離」という用語、および本明細書で使用されるこれらの文法的同等物は、試料に由来する少なくとも１つの夾雑物の量の低減を指す。例えば、細胞型は、望ましくない細胞型の量の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、および最も好ましくは少なくとも９０％の低減により精製される。したがって、細胞型の精製は、「濃縮」、すなわち、細胞培養物中の細胞型の量の増大を結果としてもたらす。
【００６８】
本明細書で使用される「プロジェリン」という用語は、ハッチンソン−ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）に関与する、ラミンＡタンパク質の切断形または他の形の改変形を指す。Ｃ１８２４Ｔ、Ｇ４３３Ａ、Ｇ１９６８Ａ、およびＧ１８２１Ａを含むがこれらに限定されない、ラミンＡ遺伝子（ＬＭＮＡ）の多数の突然変異は、プロジェリンの高い発現レベルをもたらすことができ、これにより、ＨＧＰＳが引き起こされる。プロジェリンはまた、切断型分子だけを発現させるような、ラミンＡ遺伝子内のクリプティックスプライス部位の活性化を介して、健常個体においても転写されうる。
【００６９】
本明細書で使用される「プロジェリン様タンパク質」という用語は、上記で定義したプロジェリンのほか、ラミンＡタンパク質の切断形または他の形の改変（突然変異）形である別のポリペプチドも包摂する。例えば、切断は、Ｃ末端切断部位の欠失を含みうる。このような欠損性ラミンＡタンパク質は、適正にプロセシングされず、したがって、核ラミナへと適正に組み込まれず、細胞へと、形態的異常、構造的異常、分子的異常、または細胞的異常であって、プロジェリンの影響と機能的に同様な異常を引き起こす。これらの異常は、核膜で捕捉されたファルネシル化タンパク質の核内蓄積、核の変形、ならびに核質足場構造および／または細胞質足場構造の破壊を含むがこれらに限定されない。幹細胞由来の体細胞に関して、プロジェリン様タンパク質の影響は、限定なしに述べると、（細胞型に応じて）核形態に影響を及ぼす年齢関連表現型の誘導および核組織化タンパク質の発現のほか、ヘテロクロマチンマーカー、ＤＮＡ損傷および反応性酸素分子種、樹状突起の変性、年齢関連神経メラニンの形成、ＡＫＴの調節異常、ＴＨ陽性ニューロン数の選択的低減、ならびにミトコンドリアの腫脹および封入体の超微細構造的証拠を含む。まとめると、プロジェリン様タンパク質とは、本段落で例示したプロジェリンの影響のうちの１つまたは複数を及ぼす、ラミンＡの変異体である。
【００７０】
本明細書で使用される「分化剤」または「分化誘導性化合物」という用語は、幹細胞を、体細胞をもたらす細胞経路にコミットさせる特性を有する、生体分子の場合もあり、低分子の場合もあり、物質の混合物の場合もある物質を指す。例えば、このような誘導性化合物は、Ｗｎｔ活性化剤またはＳＭＡＤ阻害剤を含みうるがこれらに限定されない。
【００７１】
本明細書で使用される「ソニックヘッジホッグタンパク質またはＳＨＨ」という用語は、ヘッジホッグと呼ばれる哺乳動物のシグナル伝達経路ファミリー内の３つのタンパク質のうちの１つを指す。ＳＨＨは、四肢の指の成長および脳の組織化など、脊椎動物の器官形成の調節において役割を果たすと考えられている。したがって、ソニックヘッジホッグタンパク質は、拡散して、濃度勾配を形成し、その濃度に応じて、発生しつつある胚細胞に異なる影響を及ぼすモルフォゲンである。ＳＨＨはまた、成年幹細胞の細胞分裂も制御する可能性があり、一部のがんの発生に関与している。
【００７２】
本明細書で使用される「Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ」または「ＳＭＡＤ」という用語は、細胞外シグナルを、形質転換増殖因子ベータのリガンドから、核へと伝達し、そこで、下流における遺伝子転写を活性化させる細胞内タンパク質であり、幹細胞の方向付けられた分化をモジュレートすることが可能なシグナル伝達分子のクラスのメンバーである。
【００７３】
本明細書で使用される「〜を接触させること」という用語は、細胞を、化合物または物質が、その活性を細胞へと及ぼすことを可能とする様式で、かつ／またはそのような位置において、化合物または物質へと曝露することを指す。接触は、任意の適する方法を使用して達成することができ、細胞外の場合もあり、細胞内の場合もある。例えば、一実施形態では、接触は、化合物／物質を、それ自体として細胞内に導入することを介するか、または化合物もしくは物質を発現させるように、細胞を遺伝子改変することを介する。接触は、細胞を、分子または分子を含有する媒体へと曝露する方法、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、トランスフェクションにより細胞へと送達する方法を含む、様々な方法で達することができる。接触はまた、接触が、細胞外膜上で生じるように、化合物または物質を細胞培養物へと添加することにより達成することもできる。接触はまた、細胞内の組換えタンパク質の産生により（例えば、プロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質をコードするｍＲＮＡの過剰発現により）、所与の細胞内で達成することもできる。
【００７４】
本明細書で使用される「再プログラム化すること」、「再プログラム化された」という用語は、「初代細胞」または「初代分化細胞」または「初代体細胞」の、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞など、未分化細胞への転換を指す。例えば、初代細胞の体細胞培養物（例えば、ある特定の年齢のドナーから単離された初代線維芽細胞またはハッチンソン−ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）などの疾患を有する患者から単離された初代線維芽細胞、例えば、ＨＧＰＳ線維芽細胞など）であって、細胞系を含む初代細胞の体細胞培養物を、人工多能性幹細胞へと再プログラム化することができる。次いで、さらに、初代体細胞培養物中に出現する年齢関連マーカーシグネチャーを、再プログラム化された未分化細胞内で変化させる。場合によって、分化させた体細胞培養物中に出現する疾患マーカーシグネチャー（すなわち、例えば、ＨＧＰＳマーカーシグネチャー）は、転換された未分化細胞内に存在しない可能性もあるが、正確なシグネチャーは、異なる初代体細胞ドナーから産生されたｉＰＳ細胞の間で異なりうる。初代細胞は、ドナー、すなわち、生検、皮膚生検、採血など、細胞系など、任意の供給源から得ることができる。
【００７５】
体細胞に言及して本明細書で使用される「分化させた」という用語は、細胞型に特徴的なマーカーシグネチャーなど、よりコミットした細胞型の特徴を有する細胞を指す。ｉＰＳ細胞由来の体細胞に言及する「分化させた」とは、ｉＰＳＣ内に存在しない少なくとも１つのマーカーシグネチャー、例えば、特化細胞のマーカーシグネチャーを有する細胞を指す。本明細書で使用される「分化の誘導」という用語は、分化剤として作用する化合物であって、Ｗｎｔ阻害剤、ソニックヘッジホッグタンパク質および／もしくはソニックヘッジホッグ活性化剤、ならびに／またはＳＭＡＤ阻害剤分子を含むがこれらに限定されない化合物により誘発される過程を指す。このような薬剤は、大部分が遺伝子的に制御された分化過程であって、未分化細胞（胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、初代幹細胞など）を、さらなる分化を許容する場合であれ、許容しない場合であれ、より顕著に異なる形態および機能を有する特化細胞の表現型である、コミットした体細胞表現型へと転換する分化過程を誘発または促進する。例えば、人工多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞、または限定なしに述べると、特異的な種類のジャンクション、特異的な範囲の送電速度、特異的な種類の神経化学的産生および／または神経化学的分泌などを伴うニューロンを含む、ｉＰＳＣ由来ニューロンへと転換することができる。細胞または細胞集団に言及して本明細書で使用される「老化」という用語は、若齢マーカーシグネチャーの発現から、老齢マーカーシグネチャーの発現への進行中の任意の段階を指す。老化の１つの例は、分子的マーカーおよび形態的マーカーを特徴とする、細胞内の天然の老化過程であって、ゲノムの不安定性、テロメアの短縮、タンパク質恒常性の喪失、ヘテロクロマチンの喪失、および遺伝子転写の変化、ミトコンドリアの機能不全、細胞の老化、および幹細胞の消耗など、老化細胞と関連する老化過程である。本明細書では、若齢細胞培養物の、プロジェリン様タンパク質による処理の後における誘導性老化の例を示す。老化はまた、成年細胞の、さらなる分子的特性、物理的特性、および機能的特性（経時的マーカーシグネチャーを含む）を発現させる成熟も包摂しうる。これは、例えば、細胞を老化させるのに要求される用量より低用量のプロジェリンおよび／または細胞を老化させるのに要求される時間より短いプロジェリンとの接触時間により誘導することができる。実際、一実施形態では、ｉＰＳＣ由来ニューロンをプロジェリンで処理することにより、変性と関連する年齢関連マーカーが誘導され、また、神経メラニンの蓄積、樹状突起の短縮、テロメアの短縮、ならびにＤＮＡ損傷、ヘテロクロマチンの喪失、およびミトコンドリアにおけるストレスによる他の結果などの成熟マーカーも誘導された。
【００７６】
本明細書で使用される「細胞老化の加速化」という用語は、ｉＰＳＣ由来の体細胞内の年齢関連マーカーシグネチャーであって、ｉＰＳＣ由来の「老化した」体細胞を創出するように、分化だけにより創出されるシグネチャーと比べて、異なる年齢を特徴付けるシグネチャーの確立を指す。例えば、この過程は、プロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質をコードするｍＲＮＡの、ｉＰＳＣ由来の体細胞への導入、およびその後における機能的なプロジェリンポリペプチドへの翻訳により媒介することができる。プロジェリンを過剰発現させるためのさらなる方法（誘導的でありうる）は、プロジェリンの発現が、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、および／またはタンパク質レベルで、一過性にまたは長期的に影響を受けるように、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、レトロウイルス、ＤＮＡプラスミドなど、多様なベクターのトランスフェクションを含むがこれらに限定されない。本明細書で記載される通り、この過程は、再プログラム化されたｉＰＳＣ由来の体細胞／分化させたｉＰＳＣ由来の体細胞を、老化したｉＰＳＣ由来の体細胞へと誘導する。
【００７７】
本明細書で使用される「経時的マーカーシグネチャー」という用語は、ドナー個体または細胞の具体的な年齢に特徴的な任意の細胞内構造であって、その状態を決定するのに十分であるような細胞内構造を指す。単一のマーカーシグネチャーは、ドナーに由来する初代細胞の年齢または細胞（とりわけ、ドナー個体の年齢特徴を有さない幹細胞、または再プログラム化中およびその後の分化中などにおいて年齢特徴を失った幹細胞から分化した細胞）の年齢表現型であって、年齢関連表現型が誘導されている年齢表現型を特徴付けるのに十分な場合もあり、複数の異なるマーカーシグネチャーのプロファイルを査定して、ドナーの年齢、もしくは、実際のところ、他の任意の細胞の年齢を特徴付ける場合もある。
【００７８】
本明細書で使用される「マーカー」という用語は、細胞の状態に特徴的であり、したがって、単独で、または他のマーカーと組み合わせて、その状態を指し示すのに有用な、分子的形質または形態的形質を指す。「マーカー」は、「年齢関連マーカー」および「成熟関連マーカー」を含む、「経時的マーカー」でありうる。「マーカー」はまた、「遅発性疾患マーカー」を含む「疾患関連マーカー」でもありうる。単一のマーカー（またはマーカーの組合せ）が、細胞の状態を指し示すのに十分であれば、それは、下記でさらに説明する通り、マーカーシグネチャーを構成する。
【００７９】
本明細書で使用される「年齢関連マーカーシグネチャー」という用語は、天然の老化過程に特徴的な、任意の経時的マーカーシグネチャー（１つまたは複数のマーカーを含む）を指す。単一の年齢関連マーカーシグネチャーは、ドナーに由来する初代細胞の年齢または細胞の表現型段階であって、年齢表現型が誘導されている表現型段階を特徴付けるのに十分な場合もあり、複数の異なるマーカーシグネチャーのプロファイルを査定して、ドナーに由来する初代細胞の年齢、または細胞の表現型段階であって、年齢表現型が誘導されている表現型段階、または細胞の表現型年齢を特徴付ける場合もある。
【００８０】
本明細書で使用される「成熟関連マーカーシグネチャー」という用語は、天然の成熟過程に特徴的な、任意の経時的マーカーシグネチャーを指す。単一の成熟関連マーカーシグネチャーは、初代細胞の成熟段階または細胞の表現型段階であって、年齢表現型が誘導されている表現型段階を特徴付けるのに十分な場合もあり、複数の異なるマーカーシグネチャーのプロファイルを査定して、初代細胞の成熟段階または細胞の表現型段階であって、年齢表現型が誘導されている表現型段階を特徴付ける場合もある。
【００８１】
本明細書で使用される「疾患関連マーカーシグネチャー」という用語は、特異的な疾患に特徴的な、任意の細胞構造（分子的または形態的）を指す。単一のマーカーシグネチャーは、疾患を特徴付けるのに十分な場合もあり、複数の異なるマーカーシグネチャーのプロファイルを査定して、疾患状態を特徴付けることが必要な場合もある。
【００８２】
本明細書で使用される「細胞」という用語は、単一の細胞のほか、細胞の集団（すなわち、複数の細胞）も指す。集団は、ニューロンの集団または未分化の胚性幹細胞の集団など、１つの細胞型を含む均一の集団でありうる。代替的に、集団は、複数の細胞型、例えば、ニューロンおよびグリア細胞を含む混合神経細胞集団も含みうる。集団内の細胞の数を限定することは意図せず、例えば、細胞の混合集団は、少なくとも１つの分化細胞を含みうる。一実施形態では、混合集団は、少なくとも１つの分化細胞および少なくとも１つの幹細胞を含みうる。本開示では、細胞集団が含みうる細胞型の数に対する限定はなされない。
【００８３】
本明細書で使用される「初代細胞」または「初代体細胞」という用語は、対象から直接培養された細胞であって、本明細書で開示される方法に従い、かつ／または適切な条件下で、すなわち、適正な増殖因子、化合物、細胞外シグナル、細胞内シグナルと接触させた場合、再プログラム化遺伝子（因子）をトランスフェクトした場合などに、未分化のｉＰＳＣを発生させるために、再プログラム化されうる細胞を指す。例えば、初代細胞（培養物）は、線維芽細胞、分化初代体細胞、幹細胞系などを含む。一部の実施形態では、初代細胞は、患者から単離する。一部の実施形態では、初代細胞は、細胞系である。一部の実施形態では、初代細胞は、幹細胞系である。一部の実施形態では、初代細胞は、胚性幹細胞である。一部の実施形態では、初代細胞は、健常ボランティア、患者、臨床兆候に関わらず、特定の疾患または医学的状態を有する患者、すなわち、ある特定の遺伝子型または表現型を有する患者などに由来する供給源から単離する。一部の実施形態では、初代細胞は、哺乳動物から単離する。一部の実施形態では、初代細胞は、動物から単離する。
【００８４】
体細胞（ｉＰＳＣ由来の体細胞であれ、ｉＰＳＣ由来でない体細胞であれ）に言及して本明細書で使用される「許容状態」という用語は、細胞が老化可能であり、かつ／または存在する場合に疾患表現型を顕在化させることが可能な場合に、プロジェリン様タンパク質と接触させた細胞であって、結果として、成熟または老齢の「年齢」マーカーを発現させることが可能な細胞を指す。例えば、プロジェリン様タンパク質は、ｉＰＳＣ由来の体細胞を、許容状態に到達するように誘導して、遅発性疾患のモデル化を可能とする。
【００８５】
本明細書で使用される「体細胞」という用語は、生物の任意の細胞であって、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、または未分化の幹細胞以外の、組織、皮膚、骨、血液、または器官の構成単位である細胞を指す。体細胞は、前駆細胞を含み、最終的には、分化細胞を含む。このような体細胞は、ニューロン、線維芽細胞、心筋細胞、上皮細胞、神経内分泌細胞、膵臓細胞、星状細胞、造血細胞、中脳ドーパミンニューロン、運動ニューロン、および／または大脳皮質ニューロンを含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される「神経細胞培養物」という用語は、ニューロンおよび／またはグリア細胞の細胞培養物であって、細胞が、中枢神経系および／または末梢神経系の細胞の特徴を提示する細胞培養物を指す。
【００８６】
本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、全能性または多能性または多分化能であり、胚性幹細胞、または器官から単離された幹細胞、例えば、間葉系幹細胞もしくは皮膚幹細胞もしくは人工多能性幹細胞など、１つまたは複数の異なる細胞型へと分化することが可能な細胞を指す。本明細書で使用される「胚性幹細胞」という用語は、胚または胎盤または臍帯から単離された細胞を指す。本明細書で使用される「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、胚性幹細胞と類似するが、体細胞（例えば、成年細胞）を、胚性幹細胞（ＥＳＣ）の「幹細胞性」、すなわち、異なる分化経路にコミットするように導かれるそれらの能力を維持するために重要な因子を発現させるように強いられることにより、胚性幹細胞様状態に入るように再プログラム化する場合に創出される種類の多能性幹細胞を指す。細胞に言及して本明細書で使用される「前駆体」という用語は、前記細胞が、もはや多能性幹細胞でないが、また、いまだ完全にコミットした細胞でもない、中間の細胞段階を指す。本開示における前駆細胞は、体細胞内に含まれる。
【００８７】
本開示による幹細胞は、「全能性」幹細胞の場合もあり、「多能性」幹細胞の場合もあり、かつ／または「多分化能」幹細胞の場合もある。本明細書で使用される「全能性」という用語は、分化した生物内の任意の細胞型のほか、胎盤など、胚体外素材の細胞へも分化する細胞の能力を指す。本明細書で使用される「多能性」という用語は、任意の分化細胞型へと分化することが可能な細胞または細胞系を指す。本明細書で使用される「多分化能」という用語は、少なくとも２つの分化細胞型へと分化することが可能な細胞または細胞系を指す。
【００８８】
マウスｉＰＳＣは、２００６年に報告され（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ、１２６巻：６６３〜６７６頁（２００６年））、ヒトｉＰＳＣは、２００７年の後半に報告された（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、２００７年１１月３０日、１３１巻（５号）：８６１〜７２頁）。マウスｉＰＳＣは、幹細胞マーカーの発現を含む、多能性幹細胞の重要な特徴を裏付ける。また、ヒトｉＰＳＣおよび動物ｉＰＳＣも、幹細胞マーカーを発現させ、３つの胚葉全てに特徴的な細胞を発生させることが可能である。胚性幹細胞とは異なり、ｉＰＳＣは、ある特定の胚性遺伝子（ＯＣＴ４トランス遺伝子、ＳＯＸ２トランス遺伝子、およびＫＬＦ４トランス遺伝子など）を、体細胞へと導入することにより人工的に形成される。例えば、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ、１２６巻：６６３〜６７６頁（２００６年）ならびにＡｇａｒｗａｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２９２〜２９６頁（２０１０年）を参照されたい。ｉＰＳＣは、例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、および／またはＫＬＦ４のうちの１つまたは複数など、１つまたは複数の遺伝子をトランスフェクトされた成年ヒト皮膚細胞または成年ヒト線維芽細胞から産生することができる。Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２４巻：７９７〜８０１頁（２００９年）を参照されたい。代替的に、それらは、血液または角化細胞など、他の種類の体細胞からも産生することができる。
【００８９】
本明細書で使用される「ｉＰＳＣ由来の年齢相応体細胞」という用語は、第１の幹細胞を分化させ（初代体細胞の再プログラム化に由来しうる）た後で、プロジェリン、プロジェリン様タンパク質、または他の機能的に同等な突然変異ラミンＡタンパク質と接触させることから導出された、任意の細胞を指す。ｉＰＳＣ由来の年齢相応体細胞は、それらが由来する第１の細胞の経時的マーカーシグネチャーを必ずしも特徴とせず、未成熟関連マーカーシグネチャーを提示する場合もあり、若齢関連マーカーシグネチャーを提示する場合もあり、成熟関連マーカーシグネチャーを提示する場合もあり、老齢関連マーカーシグネチャーを提示する場合もある。これらの細胞は、それらの意図される使用に適切な細胞年齢のマーカーを提示する点で「年齢相応」である。例えば、老齢細胞ではない成熟細胞は、老齢個体ではない成年個体の細胞モデルを確立するのに適切である。
【００９０】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的な環境および人工的な環境内で生じる過程または反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境は、試験管および細胞培養物を含むがこれらに限定されない。
【００９１】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、天然の環境（例えば、動物における環境）および胚性発生、細胞分化、神経管形成など、天然の環境内で生じる過程または反応を指す。
【００９２】
本明細書で使用される「培養細胞」という用語は一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持された細胞を指す。培養細胞は、「細胞系」および「初代培養細胞」を含む。「細胞培養物」という用語は、任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞培養物を指す。この用語には、連続細胞系（例えば、不死表現型を伴う）、初代細胞培養物、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持された他の任意の細胞集団であって、胚、多能性幹細胞を含む細胞集団（とりわけ、ニューロン）が含まれる。
【００９３】
本明細書で使用される「培養培地」および「細胞培養培地」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞（すなわち、細胞培養物、細胞系など）の成長を支援するのに適する培地を指す。用語を任意の特定の培養培地に限定することは意図されない。例えば、定義は、成長培地のほか、維持培地も包摂することが意図される。実際、用語は、目的の細胞培養物および細胞の成長または維持に適する任意の培養培地を包摂することが意図される。
【００９４】
本明細書で使用される「低分子」という用語は、医薬において一般に使用される有機分子とサイズが同等な、任意の有機分子を指す。用語は、生体高分子（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい低分子は、約１０Ｄａ〜約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、および最も好ましくは約１０００Ｄａまでのサイズの範囲にある。
【００９５】
ｉＰＳＣ由来細胞内で老化を誘導するための方法
ある特定の実施形態では、本開示は、ｉＰＳＣ由来の体細胞など、ｉＰＳＣ由来細胞内で老化の加速化を誘導するための方法であって、ｉＰＳＣ由来細胞をプロジェリン様タンパク質と接触させ、これにより、細胞内で１つまたは複数の経時的マーカーシグネチャーおよび／または他の年齢関連特徴を誘導するステップを含む方法を提示する。これらの実施形態の一部の態様では、マーカーシグネチャーおよび／または特徴は、老化および／または１もしくは複数の疾患表現型と関連する。
【００９６】
例えば、細胞型特異的経時的マーカーシグネチャーは、表１および２で提示される経時的マーカーのうちの１つまたは複数の組合せ、ならびに／または表１および２で提示される経時的マーカーのうちの１つまたは複数の非存在を含みうるがこれらに限定されない。細胞型に特異的な特徴は、例えば、老化したｉＰＳＣ由来のドーパミンニューロン内の神経メラニンの蓄積など、１つまたは複数の表現型を含みうるがこれらに限定されない。ニューロン内の疾患表現型（パーキンソン病に関連する）は、樹状突起の顕著な変性、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現の進行性の喪失、および／またはミトコンドリアの肥大もしくはレビー小体先駆体の封入を含むがこれらに限定されない。パーキンソン病（ＰＤ）ｉＰＳＣ由来のドーパミンニューロンのプロジェリン誘導性老化は、遺伝的感受性に基づきうる、疾患表現型を顕在化させた。
【００９７】
したがって、疾患表現型は、場合によって、老化感受性および／または遺伝的感受性に基づきうることが理解されるであろう。したがって、本開示は、１つまたは複数の経時的マーカーシグネチャーの誘導および提示を特徴とし、任意選択で、１つまたは複数の疾患シグネチャー（例えば、遺伝的素因を含む）の誘導および提示を特徴とする、ｈｉＰＳＣベースの年齢相応細胞培養物モデルにおいて、老化を誘導して、遅発性疾患および／または障害を検討するための方法を提示する。
【００９８】
本発明の方法は、老化細胞または成熟細胞の、体細胞（ｉＰＳＣ由来であれ、初代細胞由来であれ）または幹細胞または完全分化細胞もしくは部分的分化細胞からの産生に適用することができる。
【００９９】
本開示はまた、（１）「若齢」細胞または「未成熟」細胞のマーカーシグネチャーを提示する体細胞、幹細胞、および／または幹細胞誘導性体細胞を含む細胞内で、成熟または老化を誘導するための方法；（２）細胞培養物（体細胞培養物であれ、幹細胞培養物であれ、ｉＰＳＣ由来であれ、初代細胞由来であれ、分化途上の細胞であれ）中の誘導性老化を使用して、年齢相応細胞の培養物中の、パーキンソン病（ＰＤ）など、遅発性疾患および／または障害における時系列効果について研究するための方法；ならびに（３）１もしくは複数の経時的マーカーを産生するｉＰＳＣ由来年齢相応細胞、または１もしくは複数の経時的マーカーを産生しないｉＰＳＣ由来年齢相応細胞であって、これらの経時的マーカーの存在または非存在が、経時的マーカーシグネチャーおよび／または特定の細胞表現型に特徴的なｉＰＳＣ由来年齢相応細胞を含むｉＰＳＣ由来細胞（表１を参照されたい）も提示する。
【表１】
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【０１００】
本開示の一部の実施形態は、ドナー線維芽細胞などのドナー細胞の経時的年齢と緊密に相関する細胞マーカーのセットであって、細胞マーカーが、核内組織化、ヘテロクロマチン、ＤＮＡ損傷、およびミトコンドリアにおけるストレスのマーカーを含むがこれらに限定されないセットを使用するための方法を提示する。理論に束縛されずに述べると、１つまたは複数の年齢関連マーカーは、元のドナーの細胞の年齢と関連し、再プログラム化すると、失われると考えられる。さらに、老化のある特定の特徴は、分化させると、ｉＰＳＣ由来の細胞系統により再獲得されない。したがって、プロジェリン様タンパク質へと曝露された、見かけ上の健常非ＨＧＰＳ細胞は、ｉＰＳＣの誘導の前に、ドナー細胞の年齢を規定する１つまたは複数の年齢関連マーカーを誘導する。
【０１０１】
したがって、本開示は、細胞内で老化を誘導するための方法であって、その老化が、ｉＰＳＣ由来の細胞系統内で、正常な老化の複数の側面を模倣するが、加速化されている方法を提示する。ｉＰＳＣ由来細胞は、線維芽細胞を含むがこれに限定されない。加えて、本開示は、パーキンソン病などの遅発性障害をモデル化するための、開示される方法および細胞の１つの有用性も裏付け、他の疾患についての同様のモデルの確立についても教示する。プロジェリン様タンパク質へと曝露される細胞は、ｉＰＳＣの場合もあり、ｉＰＳＣに由来する場合もあり、胚性幹細胞、成年個体に由来する皮膚幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞など、別の種類の幹細胞の場合もあり、別の種類の幹細胞に由来する場合もある。実際、プロジェリン様タンパク質を使用して、由来に関わらず、ニューロンなど、ＨＧＰＳ患者においてさえ、プロジェリンを発現させない細胞であってもなお、任意の種類の体細胞内で老化を誘導することができる。しかし、健常ドナーに由来するニューロンを得ることは困難であるので、幹細胞の分化とプロジェリン様タンパク質への曝露との組合せが、「老齢」経時的マーカーシグネチャーを発現させるニューロンを得るのに好ましい方法である。
【０１０２】
表２は、老化ドナーに由来する初代線維芽細胞内で見出される年齢関連マーカーのセットであって、線維芽細胞のｉＰＳＣへの再プログラム化中に失われ、このようなｉＰＳＣを、線維芽細胞様細胞またはｍＤＡニューロンなどの分化細胞へと分化させても産生されないマーカーのセットを提示する。すなわち、再プログラム化／分化は、体細胞ドナーの年齢に関わらず、「若齢」表現型（これは、遅発性疾患を研究するには年齢不相応であろう）を有する細胞を発生させる。しかし、年齢関連マーカーは、プロジェリン様タンパク質と接触させ、かつ／またはプロジェリン様タンパク質を過剰発現させると、再確立することができ、これにより、年齢相応なｉＰＳＣ由来の「老齢」細胞または成熟ｉＰＳＣ由来細胞であって、成熟細胞もしくは遅発性疾患を研究するための、または成熟細胞の場合は、治療における使用のための、ｉＰＳＣ由来の「老齢」細胞または成熟ｉＰＳＣ由来細胞をもたらすことができる。
【０１０３】
例えば、パーキンソン病（ＰＤ）患者および見かけ上の健常ドナーに由来するｉＰＳＣは、それらの遺伝子型の差異にも拘らず、表現型では同一であると考えられる。ｍＤＡニューロンへと分化させたところ、ＰＤ細胞と対照細胞との間で観察されたのは、わずかな差異（疾患シグネチャーを伴わない／軽微な疾患シグネチャー）だけであった。プロジェリンは、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン細胞内のｍＤＡの老化様シグネチャーを誘発し、また、ＰＤ  ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内の、遺伝子型と表現型との間の相互作用を有する、複数の疾患関連（ＰＤ関連）表現型も顕在化させる（すなわち、疾患シグネチャーの増強）。
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１０４】
体細胞ドナーの年齢を予測するマーカーであって、再プログラム化中、分化中、および誘導性老化中に細胞年齢をモニタリングするのに使用されうるマーカーは、細胞が老化するのに応じて短縮され、再プログラム化および結果として得られる機能的なテロメラーゼの産生により回復されるテロメア長を含む（Ａｇａｒｗａｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４６４巻：２９２〜２９６頁（２０１０年）；およびＭａｒｉｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１４１〜１５４頁（２００９年））。同様に、ｉＰＳＣの誘導は、老化細胞のミトコンドリアを若返らせる（Ｐｒｉｇｉｏｎｅら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、７２１〜７３３頁（２０１０年）およびＳｕｈｒら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、５巻：ｅ１４０９５頁（２０１０年））。しかし、これらの研究は、高度に顕異する細胞型の間（線維芽細胞対ｉＰＳＣ）の個々の表現型の比較に限定されていた。これに対し、本開示は、ある範囲にわたる年齢関連マーカーであって、細胞年齢および対応する細胞運命と相関するマーカー（ドナーの線維芽細胞をｉＰＳＣ由来の線維芽細胞と対比させる）を提示する。
【０１０５】
さらなる適切なマーカーは、複数の組織にわたりドナー年齢を予測する、特定のＣｐＧ部位におけるメチル化レベル（Ｈａｎｎｕｍら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．、４９巻：３５９〜３６７頁（２０１３年）；ならびにＫｏｃｈおよびＷａｇｎｅｒ、Ａｇｉｎｇ、３巻：１０１８〜１０２７頁（２０１１年））、およびｉＰＳＣ内の、ドナー細胞運命の後成的記憶を反映するメチル化パターン（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、４６７巻：２８５〜２９０頁（２０１０年）；およびＰｏｌｏら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２８巻：８４８〜８５５頁（２０１０年））を含むがこれらに限定されない。
【０１０６】
本開示の一部として、プロジェリンレベルは、年齢関連表現型が出現するタイミングに影響を及ぼしうることが観察された。例えば、改変ＲＮＡを援用して、極めて高レベルの発現を迅速に誘導し、数日間以内に、線維芽細胞内（３日間）およびニューロン内（５日間）で、年齢関連マーカーの発現を誘発することができる。これに対し、ニューロン特異的プロモーターの制御下におけるレンチウイルスの発現は、はるかに低レベルの発現をもたらし、移植の１カ月後において、明白な表現型を誘発しなかったが、移植の３および６カ月後において、頑健で進行性の表現型が観察された。したがって、神経変性表現型は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、正常な老化中に生じる速度を実質的に超える速度で誘導することができる。したがって、本明細書で開示される誘導老化法は、遅発性病態を評価し、遅発性病態に影響を及ぼすのに適するモデルをもたらす。本明細書で開示される誘導老化法はまた、とりわけ、プロジェリン様タンパク質発現を誘導し、次いで、オフにしうる場合には、細胞の成熟の誘導にも関与する。
【０１０７】
改変ＲＮＡを使用するプロジェリンの発現またはニューロン特異的プロモーター下における発現は、ＨＧＰＳ患者の多様な組織間で見出される示差的なプロジェリンレベルをもたらさない。Ａ型ラミンの組織特異的発現は、疾患が器官系に及ぼす影響が同等でない理由である可能性が高い（Ｒｏｅｂｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１０５巻：３６５〜３７８頁（１９８９年））。特に、ＣＮＳは、ラミンＡおよびプロジェリンはターゲティングするが、ラミンＣはターゲティングしない、ｍｉＲ−９の発現により保護されると考えられている（Ｎｉｓｓａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、２巻：１〜９頁（２０１２年））。したがって、ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ由来ニューロンは、プロジェリン媒介型のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるニューロンの老化の使用に対する適切な代替物ではない。
【０１０８】
本開示は、異なる細胞系統内の細胞型特異的応答の誘導を裏付ける（表２）。さらに、本明細書では、プロジェリンへの曝露により、線維芽細胞内の年齢を再確立し、移植されたｍＤＡニューロン内の神経メラニンの存在、プロジェリンへの曝露後におけるｍＤＡニューロンの包括的な転写の変化、およびプロジェリンにより誘導される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける樹状突起の変性表現型など、正常なニューロン老化のある特定の側面を表現型複写しうることが裏付けられる。変性応答としてのプロジェリン媒介型の変化は、極めて広範な線維ネットワークが確立された後で生じる、神経突起の機能停止および表現型の進行性の性格をもたらすことが考えられる。これらの基準は、「神経変性」表現型もまた反映しうる、初代神経線維の成長の低減（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｄａｎｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、４巻：３８０〜３９５頁（２０１２年））とは顕著に異なる。
【０１０９】
本開示はまた、様々な細胞系統の老化を誘導するのにも適用することができる。これらの細胞は、脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、皮膚、肺、血液、動脈、眼、骨髄、およびリンパ系を含むがこれらに限定されない、様々な組織内および器官内で見出される主要な細胞型を含む。例えば、表３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、プロジェリン誘導性の老化または成熟から利益を得る可能性がある、さらなる細胞型およびそれらの老化マーカー（例えば、Ａ．  Ｓｈｅｙｄｉｎａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１年）、１２１巻、３１５〜３２９頁；Ｕ．  ＧｕｎａｓｅｋａｒａｎおよびＭ．  Ｇａｎｎｏｎ、２０１１年、Ａｇｉｎｇ、３巻（６号）：５６５〜５７５頁を参照されたい）を列挙する。加えて、ｉＰＳＣ由来細胞は、ＡＬＳ、パーキンソン病、およびアルツハイマー病を含む表７にまとめられる神経変性疾患について研究するのに使用されているが、これらのｉＰＳＣ由来ニューロンは、年齢改変されておらず、したがって、これらの遅発性疾患におけるニューロンを十分に表していない可能性がある。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表７】
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【０１１０】
本明細書で開示される通り、プロジェリンまたは他のプロジェリン様タンパク質との接触は、老化様状態を有する細胞であって、ＰＤなどの遅発性疾患をモデル化するのに適する細胞を産生するための本方法のための基盤である、正常な老化を模倣しうる。例えば、誘導老化戦略を使用して、少なくとも２つの遺伝性ＰＤ−ｉＰＳＣモデルにおいて、頑健な変性表現型が観察された。プロジェリンの発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて長期にわたり曝露すると、ＴＨ＋ニューロン数の進行性の低減を誘導することにより、ＰＤの少なくとも１つの側面を模倣する。
【０１１１】
本明細書で開示される通り、本方法は、外因性のプロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質を、細胞の老化の加速化を誘導するのに十分な投与量で、細胞へと導入するステップを施す。プロジェリンは、ｑＰＣＲにより、ＨＧＰＳ患者の線維芽細胞内では、健常若齢ドナーの線維芽細胞内および健常老齢ドナーの線維芽細胞内で発現する内因性レベルの４０〜１００倍で発現する（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ  Ｄら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．、２００７年、２巻（１２号）：ｅ１２６９頁を参照されたい）。現行の曝露では、プロジェリンを、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内において、ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内で見出されるプロジェリンの１〜５倍で過剰発現させる。一部の実施形態では、外因性のプロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質の発現は、前記細胞内の内因性プロジェリンの発現の約１０倍〜約５０００倍である。一部の好ましい実施形態では、外因性のプロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質の発現は、前記細胞内の内因性プロジェリンの発現の約４０倍〜約５００倍である。範囲を狭めると、細胞内の内因性プロジェリンの発現の約４０倍〜約２００倍である。
【０１１２】
本明細書ではまた、分化させたｉＰＳ細胞を成熟させるための方法であって、低レベルのプロジェリンの発現により、分化させたｉＰＳ細胞の成熟を容易としうるという観察に基づく方法も開示される。例えば、当技術分野で公知のｉＰＳ細胞法であって、細胞運命および細胞年齢の両方のプログラム化を含む方法に補完的な誘導老化法が提供される。
【０１１３】
人工多能性幹細胞由来の体細胞の、プロジェリン媒介型の老化の加速化
プロジェリンとは、ラミンＡの突然変異体形態であり、Ｃ末端近傍の５０アミノ酸を欠く。この突然変異は、プロジェリンが核周縁部に蓄積するように、ファルネシル基の除去を防止する。プロジェリンは、ハッチンソン−ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）と関連する核ラミナタンパク質である。ラミンＡはまた、正常な老化にも関与すると考えられている（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：１０５９〜１０６３頁（２００６年））。ＨＧＰＳは、極めてまれであり、ｄｅ  ｎｏｖｏの突然変異から生じる（出生８００万件当たり１例であり、医療歴中の症例１４０例であり、既知の症例８０例が現在生存している）。最も一般的な突然変異は、クリプティックスプライス部位を活性化させる、サイレントのｐ．Ｇｌｙ６０８Ｇｌｙ突然変異をもたらす１８２４Ｃ＞Ｔである。ＨＧＰＳは通例、致死性であり、死亡の平均年齢は１３歳である。臨床症状は、心血管系変性、筋骨格系変性、関節硬化、または脱毛を含むがこれらに限定されない。しかし、死亡時まで、明白な神経変性症状は見られない。ＨＧＰＳのような、他の疾患も早老の症状で公知である。表４を参照されたい。
【表４−１】
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【表４−２】
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【０１１４】
本明細書で提示されるデータは、細胞年齢の再プログラム化が、培養物中のｉＰＳＣ細胞などの幹細胞、およびｉＰＳＣ由来の体細胞など、幹細胞由来の細胞系統が、パーキンソン病などの遅発性障害を正確にモデル化することを妨げうることを裏付けている。ハッチンソン−ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）患者に由来する線維芽細胞内の候補年齢関連細胞マーカーのセットについて記載されている（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：１０５９〜１０６３頁（２００６年）、Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｉｎ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１１巻（４号）：４４０〜４４５頁（２００５年））。ＨＧＰＳは、多様な組織の早老を特徴とするまれな遺伝性障害であって、平均余命を１３年間とする早期の死亡を結果としてもたらす遺伝性障害である（Ｈｅｎｎｅｋａｍ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ、１４０巻：２６０３〜２６２４頁（２００６年））。
【０１１５】
核膜タンパク質であるラミンＡをコードする遺伝子である、ＬＭＮＡ内の突然変異は、プロジェリンとして公知の短い転写物を産生する、クリプティックスプライス部位の活性化を結果としてもたらす。プロジェリンタンパク質は、核膜内に異常に蓄積され、クロマチンの組織化、ヘテロクロマチンの形成、ＤＮＡ損傷応答、細胞周期、および遺伝子転写を含む、核内の複数の過程を調節する重要な足場形成タンパク質としての正常なラミンＡ機能に干渉し、テロメア長またはテロメア機能および細胞の老化など、正常な老化に関与している他の過程に影響を及ぼす（Ｄｅｃｈａｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅ、２２巻：８３２〜８５３頁、２００８年において総説されている）。興味深いことに、低レベルのプロジェリンはまた、健常個体においても発現し、同様の年齢関連プロファイルが、正常な老化ドナーに由来する線維芽細胞内でも観察されている（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：１０５９〜１０６３頁（２００６年））。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本開示は、ドナー年齢、例えば、線維芽細胞ドナーの年齢と相関する経時的マーカーシグネチャーであって、核形態および核組織化タンパク質発現についてのマーカーのほか、ヘテロクロマチン、ＤＮＡ損傷、および反応性酸素分子種についてのマーカーを含むがこれらに限定されないマーカーシグネチャーのセットを提示する。「老齢」線維芽細胞内のこれらの年齢関連経時的マーカーシグネチャーは、再プログラム化中に失われ、その後の分化中に再獲得されないことから、ｉＰＳＣ由来細胞は、年齢記憶を維持しないという仮説が裏付けられる。組織特異的年齢関連マーカーシグネチャーは、短期間のプロジェリンへの曝露後に、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内およびｍＤＡニューロン内のいずれにおいても誘導することができる。本明細書で開示される方法では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるパーキンソン病をモデル化するために、かつ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの移植後に、細胞年齢と関連する経時的マーカーシグネチャーを迅速に誘導する能力を援用する。
【０１１７】
本明細書で開示される通り、最新のｉＰＳＣ技術を使用しても観察されない、複数の年齢関連表現型および疾患関連表現型であって、本開示の細胞によりもたらされる年齢関連表現型および疾患関連表現型は、樹状突起の変性、年齢関連神経メラニンの形成、ＡＫＴの調節異常、ＴＨ＋ニューロンの数の選択的低減、ミトコンドリアの腫脹および封入体の超微細構造的証拠などを含むがこれらに限定されない。誘導性老化は、ｉＰＳＣ研究のためのモデル系であり、遅発性障害における遺伝的感受性および年齢関連感受性の寄与に取り組むための他の細胞型および疾患の病態へと適合させうるモデル系をもたらす。
【０１１８】
したがって、本開示は、初代線維芽細胞および／またはｉＰＳＣ由来の線維芽細胞およびｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミンニューロンについてのモデルとしての、包括的な遺伝的シグネチャーおよび後成的シグネチャーを含むがこれらに限定されない、経時的マーカーシグネチャーを提示する。ある特定の態様では、経時的マーカーシグネチャーは、細胞年齢の正確なシグネチャーとしての、ゲノムワイドの遺伝的プロファイルおよび後成的プロファイルを同定することが可能な細胞挙動を反映する。細胞年齢は、例えば、遺伝的プロファイルを伴い、かつ／または後成的プロファイルを介する、年齢関連マーカーの間の相互作用により決定することができる。
【０１１９】
年齢関連マーカーの再プログラム化は、（１）ＨＧＰＳ線維芽細胞と、８２歳のドナーから単離された線維芽細胞とが、年齢関連マーカーシグネチャーおよび早老マーカーシグネチャーであって、ｉＰＳＣへと再プログラム化すると、「若齢」状態へとリセットされるシグネチャーのいずれも共有したこと；（２）ＨＧＰＳ−ｉＰＳＣに由来する（すなわち、分化させた）線維芽細胞は、分化させると、年齢関連マーカーシグネチャーおよびＨＧＰＳ関連マーカーシグネチャーを再確立するが、対照ｉＰＳＣ（例えば、非罹患ｉＰＳＣ）に由来する線維芽細胞は、これらを再確立しないこと；ならびに（３）年齢関連マーカーシグネチャーは、分化させた若齢／老齢のｉＰＳＣ線維芽細胞内で合成プロジェリンｍＲＮＡを発現させることにより、「要求に応じて」発生させることができること（図１）という現在の観察に基づく。
【０１２０】
本明細書で提示されるデータは、再プログラム化状態または分化状態における年齢関連マーカーシグネチャーの出現／非存在に応じて、継代数、成熟段階、および培養条件などの細胞パラメータを提示する。さらに、これらのデータは、さらなる候補年齢関連マーカーシグネチャーを予測し、プロファイリング研究を偏りなく査定する。例えば、これらのデータは、包括的な遺伝子発現データセットまたは後成的データセットが、上記で記載された年齢関連マーカーシグネチャーの発現パターンを説明し、細胞年齢の分子的シグネチャーを確立するのかどうかについて取り扱っている。開示されるデータはまた、年齢関連因子の間の包括的な相互作用のモデル化も可能とし、これにより、細胞による老化応答における因果関係の決定を容易とする。
【０１２１】
線維芽細胞およびニューロンは、ドナー個体の特定の年齢に基づき、特異的なバイオマーカーを有することが公知である。本開示は、初代線維芽細胞（若齢または老齢の）内の年齢関連マーカーが、ｉＰＳＣの誘導中に、胚形成期のマーカーシグネチャーへと「リセット」されうることを裏付ける。その後、分化させると、胚形成期マーカーシグネチャーは、大部分が不変である。次いで、細胞をプロジェリン様タンパク質（例えば、プロジェリン様タンパク質の発現）と接触させて、未成熟／胚性／若齢の年齢関連マーカーシグネチャーを、老齢の年齢関連マーカーシグネチャー（または成熟の年齢マーカーシグネチャー）へと転換することができる。このような年齢関連マーカーは、表２および表３に列挙される年齢関連マーカーを含むがこれらに限定されない。
【０１２２】
上記で概観した再プログラム化／分化パラダイムを使用して、初代線維芽細胞内、ｉＰＳＣ内、およびｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内の核ラミナ、形態、クロマチン状態、ＤＮＡ損傷応答、およびミトコンドリア機能と関連する年齢関連マーカーについての定量的測定を行った（図２〜６）。これらのデータは、細胞を幹細胞へと再プログラム化することにより、年齢関連マーカーの喪失が引き起こされるが、プロジェリンの発現（ＨＧＰＳ細胞内の天然の発現であれ、例えば、遺伝子改変細胞内の外因性発現であれ）は、８２歳のドナー個体に由来する老齢の初代線維芽細胞内で観察される年齢関連マーカープロファイルを誘導するのに十分であることを裏付ける。さらに、ＨＧＰＳ線維芽細胞内で発現する高レベルのプロジェリンは、プロジェリンの過剰発現に対する必要性を伴わずに、老化表現型の迅速な兆候を誘発するのに十分である。これらのデータは、ＨＧＰＳをモデル化する最近のｉＰＳＣ研究と符合する（Ｚｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、８巻：３１〜４５頁（２０１１年）；Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ、４７２巻：２２１〜２２５頁（２０１１年））。ニューロンは、ラミンＡ（Ｐａｍｉｎ  Ａ）を発現させないので、プロジェリンから比較的保護されることに注目されたい。したがって、ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ由来ニューロンで、外因性プロジェリン様タンパク質と接触させるｉＰＳＣ由来ニューロンを置換することはできない。
【０１２３】
ｉＰＳＣ由来ニューロン細胞内で老化を誘導するための方法
ある特定の実施形態では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるニューロンの老化を方向付けて、遅発性神経変性障害の疾患モデルを確立するための方法を提示する。理論に束縛されることを意図せずに述べると、ドナーの年齢および／または疾患と関連するマーカーは、ｉＰＳＣベースの再プログラム化中にリセットされ、その後のｉＰＳＣ由来の細胞系統への分化後には再確立されないことが考えられる。したがって、本開示は、ｉＰＳＣ由来の細胞系統を分化させ、１つまたは複数の年齢関連マーカーおよび／または疾患関連マーカーであって、それらのマーカーの存在または非存在が、１つまたは複数の年齢関連マーカーシグネチャーおよび／または疾患関連マーカーシグネチャーおよび／または細胞挙動を含みうるマーカーを再確立するための方法を提示する。これらの実施形態のある特定の態様では、ｉＰＳ細胞の分化を、Ｗｎｔ阻害剤および／またはＳＭＡＤ阻害剤を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の化合物により誘発する。他の態様では、誘導性老化を、内因性プロジェリンまたは外因性プロジェリンの発現により誘発する。
【０１２４】
ｉＰＳＣ技術の到来は、広範にわたる遺伝性障害のための治療の開発を加速化する潜在的可能性を有し、疾患過程についての日常的な研究を繰り返しうる細胞培養プラットフォームを提示する。ｉＰＳＣ法はまた、疾患過程への機構的洞察をもたらす可能性もあり、したがって、将来の薬物開発のための標的部位を同定することもできる。
【０１２５】
年齢という構成要素を、遅発性障害のｉＰＳＣベースのモデルへと導入するための方法が開示される。本明細書で記載される通り、確立された体細胞培養物の再プログラム化は、人工多能性幹細胞由来の未成熟細胞型であって、罹患した老化個体において発生する、遅発性障害および／または疾患の表現型を呈示しない細胞型をもたらす。したがって、一実施形態では、本開示は、これらの細胞をプロジェリン様タンパク質と接触させることにより、「年齢」および／または「成熟」を、ｉＰＳＣ由来の細胞型へと導入するための方法を提示する。多様な細胞型および老化についてのマーカーの例は、表２および表３に列挙されるものを含むがこれらに限定されない。
【０１２６】
これらの方法についての一態様では、ｉＰＳＣ由来の体細胞は、遅発性疾患および／または障害の表現型の１つまたは複数のマーカーを呈示する。これらの方法についての関連態様では、許容度の大きい状態は、ｉｎ  ｖｉｖｏの老化ＰＤ脳内で観察される細胞応答と緊密に符合する、１つまたは複数の細胞応答を含む。本明細書で開示される通り、１つまたは複数の経時的マーカーシグネチャーを含む、１つまたは複数の経時的マーカーを、ｉＰＳＣ細胞培養物内でモニタリングすることもでき、再プログラム化することもでき、かつ／または誘導することもできる。ｉＰＳＣ由来の細胞培養物モデルにおいて、経時的マーカーシグネチャーを誘導することにより、遅発性ヒト疾患のモデル化および治療標的の発見を改善し、より一般に、ヒト疾患および年齢に関連する根本的疑問に取り組む。
【０１２７】
本明細書で開示される方法は、ｉＰＳＣ技術を援用して、年齢関連マーカーをリセットし、神経疾患についての細胞培養物モデルにおいて、これを再確立する。ドナー細胞型のＤＮＡメチル化の残留など、ある特定の後成的特徴は、ｉＰＳＣの導出後に、少なくとも一過性に保持することができる（Ｋｉｍら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９巻：１１１７〜１１１９頁（２０１１年）；Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、４６７巻：２８５〜２９０頁（２０１０年）；およびＰｏｌｏら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２８巻：８４８〜８５５頁（２０１０年））。本開示は、例えば、線維芽細胞など、初代老化細胞内の経時的マーカーは、ｉＰＳＣへと変換し、再プログラム化されたｉＰＳＣを、その後、線維芽細胞および／またはニューロン細胞などの体細胞へと分化させても再獲得されないことを裏付けるデータを提示する。
【０１２８】
したがって、本開示は、異なる細胞型内の経時的マーカーシグネチャーおよび／または機能的特徴を比較するための方法を提示する。例えば、中枢神経系内の増殖細胞（例えば、星状細胞）および有糸分裂後細胞（例えば、ニューロン）のいずれも、本明細書で開示される方法により産生し、老化させ、細胞の増殖および成熟と細胞型特異的な老化シグネチャーとの関係について研究するためのモデル系として使用することができる。多様な細胞型および老化についてのマーカーの例は、表２および表３に列挙されるものを含むがこれらに限定されない。
【０１２９】
プロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質は、とりわけ、ウイルスベクター、ナノ粒子、リポソーム、電気穿孔、および遺伝子銃を含む、様々な方法を使用して、細胞へと導入することができる。
【０１３０】
多種多様なウイルスベクターであって、例えば、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターを含み、核酸、特に、治療用タンパク質を標的細胞特異的に発現させるための発現カセットを含む核酸を送達するための、本明細書で開示される系における使用に適合させうるウイルスベクターは、当業者に周知であり、たやすく入手可能である。
【０１３１】
天然のウイルスまたは操作されたウイルスの、特異的な受容体への指向性は、核酸を送達するためのウイルスベクターを構築するための基礎である。これらのベクターの標的細胞への接合は、ウイルスベクター上のリガンドによる、細胞表面上の特異的な受容体の認識に付随する。それらの表面上において極めて特異的なリガンドを提示するウイルスは、細胞上の特異的な受容体へとアンカリングする。ウイルスは、目的の標的細胞の表面上に提示された受容体に対するリガンドを提示するように操作することができる。細胞受容体とウイルスリガンドとの相互作用は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ｔｏｌｌ様受容体によりモジュレートされる。
【０１３２】
ウイルスベクターの細胞への侵入は、受容体媒介型エンドサイトーシスを介するのであれ、膜融合を介するのであれ、ウイルスベクターの、エンドソーム経路および／またはリソソーム経路からの回避を許容する、ドメインの特異的なセットを要求する。他のドメインは、核への侵入を容易とする。複製、アセンブリー、および潜伏は、ベクターと細胞との相互作用の動態を決定し、ウイルスベクターの選択のほか、がんの自殺遺伝子治療のデザインにおいて、細胞を保有する治療用カーゴの操作においても、重要な検討事項である。
【０１３３】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、エンベロープＤＮＡウイルスである、ヘルペスウイルス科に属する。ＨＳＶは、それらの３つの主要なリガンド糖タンパク質：ｇＢ、ｇＨ、およびｇＬのオルソログを介して細胞受容体に結合し、場合によって、アクセサリータンパク質を援用する。これらのリガンドは、ウイルスの、疾患の口腔形態、眼形態、および生殖器形態への侵入の主要経路において決定的な役割を果たす。ＨＳＶは、神経系の細胞受容体への高い指向性を保有し、発現カセットを、老化細胞、がん細胞、および感染作用物質を感染させた細胞を含む標的細胞へと送達するための組換えウイルスを操作するのに活用することができる。治療的バイスタンダー効果は、コネキシンコード配列を、構築物へと組み入れることにより増強される。核酸を、標的細胞へと送達するための単純ヘルペスウイルスベクターは、ＡｎｅｓｔｉおよびＣｏｆｆｉｎ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、１０巻（１号）：８９〜１０３頁（２０１０年）；Ｍａｒｃｏｎｉら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、６５５巻：１１８〜４４頁（２００９年）；ならびにＫａｓａｉおよびＳａｅｋｉ、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、６巻（３号）：３０３〜１４頁（２００６年）において総説されている。
【０１３４】
レンチウイルスは、エンベロープ一本鎖ＲＮＡレトロウイルスである、レトロウイルス科に属し、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む。ＨＩＶのエンベロープタンパク質は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、マクロファージ、および樹状細胞など、ヒト免疫系の細胞上に存在するＣＤ４に結合する。細胞へと侵入すると、ウイルスのＲＮＡゲノムは、二本鎖ＤＮＡへと逆転写され、これが、細胞核へと移入され、細胞ＤＮＡへと組み込まれる。ＨＩＶベクターは、治療用遺伝子を、白血病細胞へと送達するのに使用されている。組換えレンチウイルスは、正常細胞への実質的な非特異的送達を伴わない、核酸の、膵臓がん細胞、上皮性卵巣癌細胞、およびグリア腫細胞へのムチン媒介型送達について記載されている。核酸を、標的細胞へと送達するためのレンチウイルスベクターは、Ｐｒｉｍｏら、Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２１巻（３号）：１６２〜７０頁（２０１２年）；ＳｔａｕｎｓｔｒｕｐおよびＭｉｋｋｅｌｓｅｎ、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１１巻（５号）：３５０〜６２頁（２０１１年）；ならびにＤｒｅｙｅｒ、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、４７巻（２号）：１６９〜８７頁（２０１１年）において総説されている。
【０１３５】
アデノウイルスとは、二本鎖の直鎖状ＤＮＡゲノムおよびカプシドからなる非エンベロープウイルスである。天然では、アデノウイルスは、アデノイドに常在し、上気道感染の原因となりうる。アデノウイルスは、鼻腔内、気管内、および肺上皮へと侵入するために、アデノウイルス線維タンパク質に対する、細胞のコックサッキーウイルスアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を活用する。ＣＡＲは、老化細胞上およびがん細胞上において、低レベルで発現する。核酸の標的細胞への送達が可能な組換えアデノウイルスを産生することができる。複製コンピテントアデノウイルス媒介型自殺遺伝子治療（ＲｅＣＡＰ）は、新規に診断された前立腺がんについての臨床試験にかけられている。核酸を、標的細胞へと送達するためのアデノウイルスベクターは、ＨｕａｎｇおよびＫａｍｉｈｉｒａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ．、３１巻（２号）：２０８〜２３頁（２０１３年）；Ａｌｅｍａｎｙ、Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１１５巻：９３〜１１４頁（２０１２年）；ＫａｕｆｍａｎｎおよびＮｅｔｔｅｌｂｅｃｋ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、１８巻（７号）：３６５〜７６頁（２０１２年）；ならびにＭｏｗａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ、７巻（１２号）：１３７３〜８５頁（２０１０年）において総説されている。
【０１３６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよび他の一部の霊長動物種に感染する小型のウイルスである。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことが知られておらず、極めて軽微な免疫応答を引き起こすウイルスである。ＡＡＶを使用するベクターは、分裂細胞および休眠細胞のいずれにも感染する可能性があり、宿主細胞のゲノムへと組み込まれずに、染色体外状態にとどまりうる。これらの特徴により、ＡＡＶは、本開示の系における使用のためのウイルスベクターを創出するための、極めて魅力的な候補となっている。核酸を標的細胞へと送達するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターについては、Ｌｉら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１７２巻（２号）：５８９〜６００頁（２０１３年）；Ｈａｊｉｔｏｕ、Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ、６９巻：６５〜８２頁（２０１０年）；ＭｃＣａｒｔｙ、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１６巻（１０号）：１６４８〜５６頁（２００８年）；ならびにＧｒｉｍｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、３９２巻：３８１〜４０５頁（２００５年）において総説されている。
【０１３７】
包括的トランスクリプトーム
本開示は、５−メチルシトシン（５−ｍＣ）および／またはＤＮＡのメチル化シグネチャーを測定することにより、包括的トランスクリプトームを査定するための方法を提示する。例えば、細胞の発生および再プログラム化の一構成要素は、ＤＮＡのメチル化およびヒストンマーカーの後成的改変を含む。５−メチルシトシン（５−ｍＣ）および５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）のいずれも、ニューロンの分化中および神経変性条件下（それぞれ、Ｓｚｕｌｗａｃｈら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１４巻：１６０７〜１６１６頁（２０１１年）；ならびにＩｒｉｅｒおよびＪｉｎ、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、３１巻（増刊１号）：Ｓ４２〜４８頁（２０１２年））で、根本的に改変される。しかし、これらの後成的マーカーの機能的な役割は、分化させたｉＰＳＣおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける年齢モデル化の文脈で完全に探索されているわけではない。したがって、本明細書で開示される、神経変性疾患の遅発性をモデル化するための再プログラム化／分化／老化パラダイムは、これらの後成的変化およびこれらの遺伝子発現に対する影響を探索するためのプラットフォームを提示する。
【０１３８】
本明細書で開示されるデータは、年齢関連初代線維芽細胞内およびそれらのｉＰＳＣ内のゲノムワイドの５−ｍＣプロファイルおよび５−ｈｍＣプロファイルを裏付ける。例えば、ｉＰＳＣは、５−ｍＣマーカーおよび５−ｈｍＣマーカーのいずれにおいても、それらの初代線維芽細胞よりかなり大幅にメチル化されている（図９）（ＷｕおよびＺｈａｎｇ、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ、１０巻：２４２８〜２４３６頁（２０１１年））。いずれの細胞型によるメチル化シグネチャーも、５−ｍＣおよび５−ｈｍＣのメチル化の増大が、テロメア領域内で明らかに強化されていることを指し示す。ＲＮＡ−ｓｅｑにより、プロジェリンを発現させるｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンに由来する後成的特徴付けに加えて、固有の転写プロファイルも同定された。これらの結果が、プロジェリンを発現させるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、遺伝子発現プロファイルが、ＨＧＰＳドナーの祖先に由来するｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンと類似することを示すことから、老化の共通のシグネチャーが示唆される。したがって、これらのデータは、後成的データおよび転写データが、早老関連の老化過程および天然の老化過程についての有用な洞察をもたらすことを示す。
【０１３９】
データは、本明細書で開示される再プログラム化／分化パラダイム（図１）の、初代線維芽細胞、若齢線維芽細胞、老齢線維芽細胞、およびＨＧＰＳ線維芽細胞の各々に対する使用が、ｉＰＳＣの細胞系統を発生させた後、ｉＰＳＣ線維芽細胞およびｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン細胞系へと分化させたことをさらに裏付ける。老化は、後者のｉＰＳＣ由来の体細胞内で誘導することができる。代替的に、プロジェリン様タンパク質との接触は、ｉＰＳＣまたは他の任意の幹細胞の、任意の細胞系統への分化前に開始することもでき、任意の細胞系統への分化中に開始することもできる。
【０１４０】
一実施形態では、本開示は、ＤＮＡのメチル化データおよびトランスクリプトミクスデータを、年齢関連表現型マーカーシグネチャーデータと統合して、細胞の年齢についてのより正確な記載をもたらすための方法を提示する。一実施形態では、年齢のより精密な特徴付け（例えば、複数の老化マーカー、例えば、表２および表３に列挙されるマーカーの発現を測定することによる）により、ｉＰＳＣ由来の細胞培養物など、体細胞培養物を使用して、遅発性疾患のモデル化を改善する。この実施形態のある特定の態様では、データの統合により、プロジェリン誘発性老化の特徴を解明する。他の態様では、方法は、順方向および／または逆方向の遺伝子操作を使用するステップをさらに含む。
【０１４１】
いくつかのコンピュータ解析により、データの統合を実施して、遺伝的（後成的）変化の、老化に対する機能的な影響を同定することができる。例えば、ＤＮＡのメチル化と遺伝子発現との統合解析を実施して、「老齢」線維芽細胞を識別する、調節異常経路および「駆動」イベントを同定することができる。これらの解析は、老化線維芽細胞内およびプロジェリン誘導性ｉＰＳＣ線維芽細胞内に存在する後成的変化と転写変化との機能的関係の同定を伴う。
【０１４２】
１つの手法は、メチル化状態による遺伝子発現の直接的な調節を同定することである。５−ｍＣプロファイリングまたは５−ｈｍＣプロファイリングによる示差的なメチル化領域は、ＤＮＡのメチル化により調節される可能性が最も高い、近位遺伝子と関連しうる。次に、これらのメチル化の変化と最も相関する遺伝子発現の変化を同定することができる。
【０１４３】
別の手法は、後成的変化および転写変化の両方により相互に調節される共通の経路の同定に焦点を当てることである。メチル化状態の異常により同定される遺伝子および／または示差的に発現する遺伝子に対して、機能的な強化解析を実施することができる（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０２巻：１５５４５〜１５５５０頁（２００５年））。
【０１４４】
それらの全てが、遺伝子間の相互作用を考慮に入れて、機能的「モジュール」（特異的な細胞機能または細胞経路に関与し、共調節される相互接続遺伝子の群（Ｍｅｒｉｃｏら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、５巻：ｅ１３９８４頁（２０１０年）））を同定する、ＳＰＩＡ４３、ＮｅｔＢｏｘ４４、およびＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｍａｐを含むがこれらに限定されないツールを使用して、これらの遺伝子セットのネットワーク的接続性を探索することができる。よって、メチル化データセットおよび遺伝子発現データセットのいずれにおいても高い度数で表される経路は、老化過程について機能的に関与性である可能性が高い。
【０１４５】
遺伝子発現シグネチャーおよび機能的経路の摂動の、年齢関連マーカーシグネチャーとの相関は、細胞の老化を駆動する遺伝過程を決定しうる。例は、示差的発現および／または示差的メチル化などの遺伝性変化の関数としての、年齢関連バイオマーカーシグネチャー（例えば、ヘテロクロマチン状態、ＤＮＡ損傷、および核形態）に由来する定量的リードアウトのモデル化を伴う。回帰モデル（リッジ回帰、レッソ回帰、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、またはサポートベクトル回帰など）は、示差的なメチル化領域を、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３マーカーにより定量的に測定されるヘテロクロマチンの変化と相関させうる。同様に、示差的なメチル化および発現遺伝子は、損傷したミトコンドリア機能からＤＮＡ損傷応答を識別するように、単純ベイズ分類器、ロジスティック回帰、およびサポートベクトルマシンなどのアルゴリズムを使用する、教師ありの分類スキームにおいても使用することができる。
【０１４６】
これらの想定されるコンピュータモデルはまた、老化表現型を最もよく予測するゲノム特徴の最小のセットももたらしうる。回帰スキームおよび分類スキームの両方における多様な特徴選択法を使用して、年齢バイオマーカーアッセイを最もよく予測する、遺伝子および後成的改変を同定することができる。例えば、ｑＰＣＲを使用して、検証を目的として使用されるサブセットを同定することができる。代替的に、ＲＮＡｉ実験を使用して、機能的関係について調べることができる（Ｌｉｐｃｈｉｎａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２５巻：２１７３〜２１８６頁（２０１１年））。
【０１４７】
細胞老化の機能的特徴
一部の実施形態では、本開示は、誘導性老化と経時的老化との関係を調べるための方法を提示する。これらの実施形態のある特定の態様では、誘導性老化過程は、可逆性である。他の態様では、誘導性老化モデルおよび経時的老化モデルは、ヒト脳における年齢を研究するのに関与性の新規のマーカーセットを含む。
【０１４８】
本明細書で提示されるデータは、本開示により想定される一部の実施形態、例えば、（ｉ）プロジェリン誘導細胞のために「年齢同等物」を正確に示す（例えば、「誘導性老化」により、細胞を、４０または８０歳の個体における同等な細胞型の挙動へと導く）ための方法、および（ｉｉ）予測可能な時間スケールおよび時系列において、プロジェリン誘導性変化を逆転するための方法を取り扱っている。ある特定の態様では、方法は、年齢関連変化のうちのいずれを、正常個体の老化脳内で見出しうるのかを決定するステップをさらに含む。
【０１４９】
年齢関連マーカーの感度
経時的およびプロジェリン誘導性細胞老化を使用して、年齢関連マーカーの感度を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて調べることができる。本明細書で開示される、初代線維芽細胞によるデータは、１１歳のドナー個体から導出された初代線維芽細胞を、８２歳のドナー個体から導出された初代線維芽細胞と対比して比較する場合に、年齢関連マーカーシグネチャーの発現における明らかな差異を示す。しかし、これらのデータは、これらの年齢関連変化の開始の速度については取り扱わなかった。例えば、これらの変化は、ドナーがある特定の年齢（例えば、＞７０歳）に到達すると、突然生じる場合もあり、老齢が進むにつれ、年齢関連マーカーの発現の漸進的な増大がなされる場合もある。さらに、これらのデータは、年齢関連マーカーシグネチャーの異なるセット（例えば、ヘテロクロマチン、ＤＮＡ損傷、ＲＮＡプロファイル、後成的プロファイル）が、協調的に変化するのかどうかについても、このような変化がそれに従って生じる階層性があるのかどうかについても取り扱わなかった。
【０１５０】
健常ドナー個体から、３つの異なる年齢群：（ｉ）０〜１５歳、（ｉｉ）３０〜５０歳、（ｉｉｉ）７０〜９０歳の初代線維芽細胞を得ることができる。確立された年齢関連マーカーシグネチャー（例えば、核ラミナ構造、ヘテロクロマチン、ＤＮＡ損傷、およびミトコンドリアの損傷）のほか、新たに発見された年齢関連マーカーシグネチャーおよび／または遺伝性マーカーを決定することにより、マーカーの発現と線維芽細胞ドナーの個体年齢との関係を決定しうる。例えば、年齢関連マーカーシグネチャーの発現は、同一の継代数で維持された各線維芽細胞系について、かつ、各年齢群につき少なくとも３つずつの線維芽細胞系について、独立の３連で決定することができる。これらの時間経過データを、プロジェリンで、１、３、または５日間にわたり処理された、８２歳のドナー個体に由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞系および１１歳のドナー個体に由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞系と比較する。
【０１５１】
これらのデータの解析により、年齢関連アッセイの感度、および多様な年齢マーカー間の関係を決定することができる。これらのデータは、年齢関連表現型内および年齢関連表現型間に現存する階層性についての情報をもたらしうる。第２に、これらのデータを使用して、プロジェリン様タンパク質で処理されたｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内の所与の表現型についての「年齢同等物」を、多様なドナー年齢の初代線維芽細胞と対比して正確に示し、プロジェリン様タンパク質への曝露後における一時的変化が、高齢化させる場合のドナー個体に由来する初代線維芽細胞内で観察される経時的変化にマッチするのかどうかを評価することができる。図２２を参照されたい。
【０１５２】
年齢関連マーカーは、可逆性を変化させる
本明細書で提示されるデータは、細胞の老化中に観察された年齢関連マーカーの変化が、プロジェリンへの曝露後に誘導されたことを裏付ける。さらに、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）誘導性線維芽細胞系または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−プロジェリンｍＲＮＡによる一過性処理パラダイムを使用するデータは、培養で増殖させた線維芽細胞内、拡張すると、体細胞内の多くの早老関連表現型も可逆性である（図１０Ａ）（ＳｃａｆｆｉｄｉおよびＭｉｓｔｅｌｉ  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１０巻：４５２〜４５９頁（２００８年））ことを示唆する。プロジェリンの産生に干渉することにより、正常老化細胞内では、年齢関連マーカーを逆転しうることが報告されている（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：１０５９〜１０６３頁（２００６年））。しかし、中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンなどの非分裂細胞内でも同様の表現型の逆転が生じるのかどうか、または年齢関連マーカーが、プロジェリンの除去後に同様に逆転されるのかどうかは明らかでない。
【０１５３】
線維芽細胞の可逆性
一部の実施形態では、本開示は、線維芽細胞をＧＦＰ−プロジェリンｍＲＮＡまたは核−ＧＦＰ対照ｍＲＮＡと接触させるための方法を提示する。ある特定の態様では、接触は、３日間にわたりうる。関連する態様では、方法は、線維芽細胞を、年齢関連マーカーシグネチャーの表現型の変化の順序についてモニタリングするステップをさらに含む。他の態様では、方法は、表現型の逆転のタイミングを、核内のＧＦＰ−プロジェリンの漸進的な喪失とマッチさせるステップをさらに含む。ＧＦＰ−プロジェリンの喪失は、例えば、ＧＦＰ発現の喪失により測定することもでき、プロジェリン／ラミンＡレベルにより測定することもできる。
【０１５４】
ニューロンの可逆性
他の実施形態では、本開示は、中脳ドーパミンニューロンの培養物をＧＦＰ−プロジェリンｍＲＮＡまたは核−ＧＦＰ対照ｍＲＮＡと接触させるための方法を提示する。ある特定の態様では、接触は、５日間にわたりうる。他の態様では、方法は、ニューロンを、年齢関連マーカーシグネチャーの表現型の変化の順序についてモニタリングするステップをさらに含む。関連する態様では、方法は、表現型の逆転のタイミングを、核内のＧＦＰ−プロジェリンの漸進的な喪失とマッチさせるステップをさらに含む。ＧＦＰ−プロジェリンの喪失は、ＧＦＰ発現の喪失により測定することもでき、プロジェリンおよび／またはラミンＡレベルにより測定することもできる。
【０１５５】
年齢関連マーカーシグネチャーの検証
開示される通り、ヒト組織を、年齢関連マーカーシグネチャーについて研究し、これにより、本明細書で例示される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験における観察を検証した。特に、この検証プロトコールは、再プログラム化、分化、およびプロジェリンの誘導の後のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、年齢関連マーカーシグネチャーの特異的な変化の観察に基づいた。これらの研究では、ヒト脳の正常な老化におけるこれらの年齢関連マーカーの一部の関与性について取り組んだ。例えば、本明細書で記載されるデータは、老化ドナーに由来する脳組織試料のいくつかの変化を示す（図１１）。
【０１５６】
本明細書で提示されるデータはまた、ｍｉＲ−９によるラミンＡの負の調節の報告にも拘らず、７０歳を超える個体のヒト脳内のラミンＡおよびプロジェリンの発現も裏付ける（図１１Ａおよび１１Ｂ）（Ｎｉｓｓａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ、２巻：１〜９頁（２０１２年）；Ｊｕｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０９巻：Ｅ４２３〜４３１頁（２０１２年））。また、免疫組織化学法により、ヒトパラフィン切片内の年齢関連マーカーシグネチャーも検出される（図１１Ｂ）。また、＞７０歳の脳内の、包括的なＨ３Ｋ９ｍｅ３の組織化の再配置も観察された（図１１Ｃ）。これらのデータの検証は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ；ｎｄｒｉ．ｏｒｇ）で入手可能な、既知の年齢の脳組織についてのスクリーニングにより達することができる。遺伝子の発現は、実施例４に従い、ｑＰＣＲ、候補部位の５−ｍＣのメチル化および５−ｈｍＣの決定により検証することができる。
【０１５７】
パーキンソン病のモデル化
パーキンソン病は、米国内で罹患した患者約０．５〜１．０×１０６例の有病率を有する。症状は、硬直、振戦、動作緩慢（運動の緩慢さ）、および／または平衡感覚／歩行の不良を含むがこれらに限定されない。臨床病理学では、ＰＤを、主に、中脳ドーパミンニューロンの喪失により診断する。ＰＤの病因は、大部分が未知であり、散発性であるが、複数の遺伝子が、ＰＤの家族性形態に関与している。
【０１５８】
一実施形態では、本開示は、細胞の老化を誘導して、例えば、ＰＤモデル系として援用されうる、遅発性神経変性疾患細胞を創出するステップを含む方法を提示する。ある特定の態様では、細胞は、人工多能性幹細胞である。
【０１５９】
誘導性の細胞老化は、遅発性神経変性疾患の年齢関連態様をモデル化する系を提示する。このような系を使用して、疾患表現型における遺伝的感受性と年齢関連脆弱性との相互作用について直接調べることができる。
【０１６０】
本開示はまた、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内の細胞年齢を誘導するための方法も提示する。ある特定の態様では、これらの方法は、パーキンソン病（ＰＤ）における年齢依存性作用をモデル化するために援用することができる。本明細書で提示されるデータは、以下の問題：例えば、（ｉ）真正のｍＤＡニューロンを発生させるように方向付けられた分化技法を使用すること；（ｉｉ）広範囲にわたる遺伝性ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系を確立すること；（ｉｉｉ）年齢関連マーカーシグネチャーの表現型をｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン内で検証すること；（ｉｖ）年齢表現型と疾患表現型との相互作用について裏付けること；および（ｖ）遺伝子編集ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系を確立することについて取り組む。これらの遺伝子編集細胞系は、年齢誘導脆弱性と対比した遺伝的感受性の理解に寄与しうる。
【０１６１】
本開示はまた、少なくとも１つのＰＤ−ｉＰＳ細胞を含む細胞も提示する。一態様では、ＰＤ−ｉＰＳ細胞は、ＰＤ患者の皮膚線維芽細胞に由来する。他の態様では、ＰＤ−ｉＰＳ細胞をもたらす線維芽細胞は、Ｐａｒｋｉｎ、ＰＩＮＫ１、ＬＲＲＫ２、α−シヌクレイン、およびグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）（Ｋｉｔａｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３９２巻：６０５〜６０８頁（１９９８年）；Ｖａｌｅｎｔｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４巻：１１５８〜１１６０頁（２００４年）；Ｚｉｍｐｒｉｃｈら、Ｎｅｕｒｏｎ、４４巻、６０１〜６０７頁（２００４年）；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６巻：２０４５〜２０４７頁（１９９７年）；Ｔｏｆｔら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６６巻：４１５〜４１７頁（２００６年））を含む群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。したがって、ＰＤ−ｉＰＳ細胞をもたらす線維芽細胞は、疾患表現型を発現させる。
【０１６２】
本明細書で提示されるデータは、組換えプロジェリンの発現後における、Ｐａｒｋｉｎ細胞系内およびＰＩＮＫ１細胞系内の年齢関連マーカー特徴の変化について取り扱った。例えば、プロジェリンの発現は、ＰＩＮＫ１突然変異体またはＰａｒｋｉｎ突然変異体のパーキンソン病個体に由来するｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミン細胞培養物から導出されたｍＤＡニューロン内の、加速化された樹状突起変性表現型および／または樹状突起短縮表現型を誘導する（図１５）。
【０１６３】
さらに、Ａｋｔシグナル伝達は、遺伝子型の、年齢との明らかな相互作用を指し示す、極めて頑健な表現型をもたらした（図２２）。特定の低ｐ−ＡｋｔレベルにおけるＡｋｔシグナル伝達の変化は、早期ＰＤと関連する（Ｇｒｅｅｎｅら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、３１巻：９６９〜９７８頁（２０１１年））。これに対し、ＨＧＰＳでは、ｐ−Ａｋｔは、異常に上方調節されることが公知である（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４９３巻：３３８〜３４５頁（２０１３年））。本明細書で開示されるデータは、対照ｉＰＳＣ  ｍＤＡニューロン内では、プロジェリンへの曝露後において、ｐ−Ａｋｔの増大が見られることを裏付けるが、これは、ＨＰＧＳ表現型と符合する。これに対し、ＰＤ−ｉＰＳＣ  ｍＤＡニューロンは、ＰＤ様表現型の誘導と適合的な、ｐ−Ａｋｔの一貫した低減を示した。
【０１６４】
年齢誘導性多能性幹細胞由来の中脳ドーパミンニューロン内の年齢の逆転または遺伝子損傷
本開示は、老化が誘導された多能性幹細胞由来の中脳ドーパミンニューロン細胞を提供する。突然変異体系と対照系との、マッチさせたアイソジェニック対内の疾患表現型を援用して、遺伝的感受性を細胞から除去することの効果を査定することができる。
【０１６５】
年齢表現型の逆転は、（ｉ）ｐ−ＡＫＴ活性の低下、（ｉｉ）樹状突起の変性の、対照と比較した非存在または低減、または（ｉｉｉ）アポトーシス速度の、プロジェリンを発現させるＰＤ−ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンと比較した低減によりモニタリングすることができる。突然変異させた遺伝子の遺伝子編集により、年齢関連挙動がリセットされ、本発明者らの対照細胞系内で得られたデータと同等なデータがもたらされる。ＰＤ表現型の可逆性により、老化は、疾患症状を誘発するのに必要な状態ではあるが、十分な状態ではないことが論じられるであろう。
【０１６６】
初代線維芽細胞の、中脳ＤＡニューロンへの分化
本明細書で開示される通り、初代線維芽細胞を、人工多能性幹細胞へと再プログラム化し（実施例１を参照されたい）、これを、ニューロンの誘導を促進する培地へと切り替え、次いでニューロンの成熟を促進する培地（ＢＡＧＣＴ：実施例７を参照されたい）中でさらに維持した。ｉＰＳＣの神経原性変換により、ｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミン細胞を産生した。ある特定の態様では、ｉＰＳＣ由来のＤＡニューロンを、ＳＨＨシグナル伝達およびカノニカルのＷＮＴシグナル伝達の低分子ベースの活性化後であり、かつ、早期分化段階中に得た。これは、高度に効率的な過程であり、培養ディッシュ内の細胞のうちの過半が成熟中脳マーカープロファイルを採択した。
【０１６７】
例えば、ヒトＥＳＣ細胞系（Ｈ９、Ｈ１）およびｉＰＳＣ細胞系（２Ｃ６およびＳｅＶ６）を、改変二重ＳＭＡＤ阻害（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年））ベースのフロアプレート誘導（Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））プロトコール下に置くことができる。ＳＨＨ  Ｃ２５ＩＩ、パルモルファミン、ＦＧＦ８、およびＣＨＩＲ９９０２１への曝露は、中脳フロアプレートおよびＤＡニューロンの新規の集団の収率について最適化することができる。フロアプレートを誘導した後、さらなる成熟（１１〜２５日目にわたり、または２５日間より長期にわたり培養物中で、少なくとも１００日間にわたるまで培養物中で）を、ＤＡニューロンの生存、ならびにＡＡ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦβ３、およびｄｂｃＡＭＰなどの成熟因子の存在下にある、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７に基づく分化培地中で実行することができる（Ｐｅｒｒｉｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０１巻：１２５４３〜８頁（２００４年））。結果として得られるＤＡニューロン集団を、例えば、ドーパミンを検出するための免疫細胞化学、ｑＲＴ−ＰＣＲ、包括的な遺伝子発現プロファイリング、ＨＰＬＣ解析、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける電気生理学的記録のうちの１つまたは複数を使用して、広範な表現型の特徴付けの下に置くことができる。しかし、他の分化プロトコールも使用することができる（Ｂａｄｇｅｒ  ＪＬら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．、２０１４年１月、７６巻Ａ部：８８〜９頁）。
【０１６８】
さらなる適用／治療的適用
細胞は、健常対象、危険性がある対象、罹患した対象、および本明細書で提示される方法に従う、未分化のｉＰＳ細胞の発生における使用のための対象から単離することもでき、当技術分野で利用可能な他の方法で単離することもできる。再プログラム化するために使用される初代体細胞は、細胞の「年齢」またはドナーの「年齢」に関わらず、線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、白血球、循環白血球、粘膜細胞、および角化細胞を含むがこれらに限定されない、循環細胞および／または患者／対象の組織内の細胞など、様々な体内の位置から単離することができる。一部の態様では、初代体細胞は、若齢ドナーから単離された、「若齢」細胞マーカーシグネチャーを発現させる若齢細胞であって、疾患シグネチャーを発現させる場合もあり、発現させない場合もある細胞でありうる。他の態様では、初代体細胞は、「老齢」マーカーシグネチャーを発現させる老齢細胞でありうる。さらなる態様では、初代体細胞は、ドナーの経時的年齢に関わらず、疾患マーカーシグネチャーを発現させる細胞でありうる。ｉＰＳＣを体細胞から発生させるための任意の方法を使用して、これらの初代細胞を、培養物中で再プログラム化して、ｉＰＳＣをもたらすことができる。当技術分野では、本明細書で記載または言及される方法以外のこのような方法が公知である。
【０１６９】
発生させた任意の由来のｉＰＳ細胞であって、本明細書で記載される方法により発生させた細胞を含むｉＰＳ細胞を、分化するｉＰＳＣ由来細胞および分化させたｉＰＳＣ由来細胞を産生するための分化プロトコールであって、プロジェリンによる老化組成物および本開示の方法において使用されうる分化プロトコールにおいて使用することができる。分化するｉＰＳＣ由来細胞および分化させたｉＰＳＣ由来細胞は、それらが、それらの特定の細胞型、すなわち、許容細胞の遺伝子マーカーシグネチャーおよび細胞マーカーシグネチャーを発現させることが可能である限りにおいて、部分的に分化させた（すなわち、分化する）細胞を含む、デフォルトおよび非デフォルトの分化細胞系統を含むがこれらに限定されない。本開示のプロジェリン様タンパク質を使用する老化の誘導において使用されうる細胞型の例は、ニューロン（運動ニューロン、大脳皮質ニューロン、末梢感覚ニューロン、中脳ドーパミンニューロンなど、任意の亜型）、心筋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、膵臓ベータ細胞、星状細胞などを含むがこれらに限定されない、ｉＰＳＣ由来細胞である。
【０１７０】
したがって、本開示によるプロジェリン処理では、ある特定の段階にあるｉＰＳ由来細胞であって、分化を経始めつつあるｉＰＳ由来細胞、コミットした細胞型へと進行しつつあるｉＰＳ由来細胞、成熟細胞型へと進行しつつあるｉＰＳ由来細胞などを含むがこれらに限定されないｉＰＳ由来細胞が使用されるであろう。
【０１７１】
一部の実施形態では、本明細書で記載される通りに得られる、老化したｉＰＳＣ由来の細胞型は、疾患のモデル化において、かつ、プロジェリンにより老化させた細胞段階であって、治療剤としての使用のための新たな薬物化合物の試験における使用のための細胞段階および患者の処置における実際の使用のための細胞段階を同定するためなど、発生中の治療的に関与性の細胞段階を同定するために使用されうる。したがって、一部の実施形態では、ｉＰＳＣ由来の細胞型のための初代体細胞ドナーは、ｉＰＳＣ由来の細胞培養物／組織培養物内で、プロジェリンまたは別のプロジェリン様タンパク質により誘導される疾患または疾患表現型であって、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病、タウオパチー、すなわち、ヒト脳内のタウタンパク質の病理学的凝集と関連する神経変性疾患のクラスなど、実際の神経変性疾患またはモデルの神経変性疾患、心筋細胞関連疾患（心肥大、心臓線維症、チャネル病、例えば、ナトリウムチャネルの病態、不整脈など）、膵臓疾患、造血器疾患、代謝性疾患、がんなどを含むがこれらに限定されない、疾患または疾患表現型を有する。
【０１７２】
本開示のプロジェリン様タンパク質組成物および老化誘導法と共に使用されうる、特異的なｉＰＳＣ由来の細胞型および関連疾患の非限定的な例は、神経変性疾患のためのｉＰＳＣ由来ニューロン、心臓変性疾患のためのｉＰＳＣ由来の心筋細胞、白血病ならびに他の白血球疾患および白血球障害、ならびに、より一般に、造血器疾患／障害のためのｉＰＳＣ由来の造血幹細胞、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、およびＩＩ型糖尿病など、ある特定の他の種類のインスリン調節障害のためのｉＰＳＣ由来の膵臓ベータ細胞、ＡＬＳのためのｉＰＳＣ由来の運動ニューロン、アルツハイマー病のためのｉＰＳＣ由来の大脳皮質ニューロン、大脳皮質基底核変性症のためのｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンおよびｉＰＳＣ由来の大脳皮質ニューロン、神経変性障害のためのｉＰＳＣ由来の星状細胞、心肥大および心臓線維症のためのｉＰＳＣ由来の心筋細胞などを含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、ｉＰＳＣを、ある特定の体細胞型であって、未成熟であるか、または成熟するのに長時間を要する体細胞型（例えば、細胞内のタンパク質発現、遺伝子発現プロファイル、機能的試験などにより評価される）へと分化させる。このような未成熟細胞は、プロジェリン様タンパク質と接触させて、細胞集団内で成熟を誘導することができるので、これらの細胞は、細胞療法において使用することができる。このような未成熟のｉＰＳＣ分化細胞の例は、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンであって、ペースメーカー活性、ドーパミントランスポーターであるＤＡＴの発現、および神経メラニンを欠き、パーキンソン病マウスをレスキューするのに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてさらに５カ月間にわたる成熟を要求する、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンである（Ｉｓａｃｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０巻：４７７〜４８２頁（１９９７年）；Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））。さらに、ＢｒａｉｎＳｐａｎ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．  ｂｒａｉｎｓｐａｎ．ｏｒｇ）に基づくと、多能性幹細胞由来の神経細胞による遺伝子発現データは、妊娠初期胎児のトランスクリプトームにマッチする。未成熟ニューロンは、上記で列挙されたマーカーについて、細胞療法および／または薬物開発における使用のために想定される、所望の成熟ニューロンの亜型に特徴的であると評価された、それらの成熟を加速化する目的で、プロジェリン様タンパク質と接触させることができる。特に、本開示の方法によりもたらされる細胞であって、プロジェリン様タンパク質と接触させた細胞は、薬物のスクリーニング、すなわち、老化制御剤のための化合物候補、本明細書で記載される疾患または障害など、特異的な疾患または障害を処置するための薬剤などの査定において使用することができる。
【０１７４】
ｉＰＳＣ由来細胞を使用する他の例は、ｉＰＳＣに由来するＨＳＣであって、成年ＨＳＣのシグネチャーマーカーを発現させず、成年マーカーシグネチャー（限定なしに述べると、ＨｏｘＢ４、Ｔｅｋ（Ｔｉｅ２としてもまた公知の）、およびＨｏｘＡ９を含む）の発現を誘導する、プロジェリンによる処理から利益を得る可能性があるＨＳＣである。他のマーカーの例については、マウスから精製された、発生しつつあるＨＳＣのトランスクリプトームについて示す、ＭｃＫｉｎｎｅｙ−Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１１巻：７０１〜７１４頁（２０１２年）を参照されたい。
【０１７５】
別の例として、ｉＰＳＣに由来する心筋細胞は、未成熟であり、本開示のプロジェリン組成物、ならびにナトリウム電流の増大、リドカインに対する感受性の低減、拍動頻度、テトロドトキシン（ＴＴＸ）に対する感受性、およびアクチニンなどのサルコメアタンパク質の組織化パターンなどの電気生理学的特性を含むがこれらに限定されない、成熟マーカーの誘導を同定するための方法において使用されるであろう。免疫細胞化学、ＴＥＭ、電気生理学、およびＣａ２＋イメージングを使用して、細胞を、トロポニンＴ、トロポニンＩ、およびα−アクチニン、Ｃａ２＋の、細胞質への放出であって、フルオ−４により検出される放出について染色し、テトロドトキシン（ＴＴＸ）処理の前後における蛍光強度をトレースした。ナトリウムチャネル活性は、穿孔型パッチクランプ法を使用して、低濃度のナトリウム緩衝液中で測定することができる。
【０１７６】
細胞の超微細構造は、透過電子顕微鏡法で解析することができるが、ｔ細管の存在は、蛍光色素であるＤｉ−８−ＡＮＥＰＰＳを使用して探索することができる。Ｍｅｄｉｎｅ、Ｈｅａｒｔ、９９巻：Ｓ２頁（２０１３年）およびＳｈｅｎｇ、Ｐｆａｎｎｋｕｃｈｅ（２０１２年）などにおける例を参照されたい。
【０１７７】
ｉＰＳＣに由来するベータ細胞は、本開示のプロジェリン組成物および方法において使用され、細胞療法および／または薬物開発における使用に想定されるであろう。特に、ｉＰＳ由来のベータ細胞の、プロジェリン様タンパク質との接触は、未成熟細胞内では見出されない、グルコースに応答する、インスリンの発現およびインスリンの放出を誘導する能力と共に、成熟マーカーであるＵｃｎ３の発現を誘導するために使用することができる。例えば、Ｂｌｕｍ−Ｍｅｌｔｏｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３０巻：２６１〜２６４頁（２０１２年）は、ベータ細胞の成熟が、ＧＳＩＳの、低グルコースレベルに対する感受性の低下、およびＵｃｎ３の発現の増大であって、インスリンおよびＵｃｎ３についての細胞内ＦＡＣＳ解析により示される低下および増大により規定されるのはどこであるのかを示す。
【実施例】
【０１７８】
（実施例１）
センダイベクター系による再プログラム化
本実施例は、センダイベクター系を介する、組込みを伴わない再プログラム化技法について記載する（Ｆｕｓａｋｉら、Ｐｒｏｃ  Ｊａｐａｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ：３４８〜３６２頁（２００９年））。下記で記載されるような改変を伴う本方法を使用して、体細胞をｉＰＳＣへと再プログラム化した。
【０１７９】
本方法は、挿入による突然変異誘発であって、表現型に寄与する再プログラム化ベクターの組込みにより誘導される突然変異誘発についての懸念を消失させることが考えられる。例えば、本方法は、組込みを伴わないＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ細胞系を発生させている（図１８）。
【０１８０】
（実施例２）
ｉＰＳＣ由来の体細胞培養物へのプロジェリンの形質導入
本実施例は、合成ｍＲＮＡ法（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７巻：６１８〜６３０頁（２０１０年））または多様なベクターを使用して、プロジェリン遺伝子を、ｉＰＳＣ由来の体細胞培養物へと導入するための方法について例示する。安定的トランスフェクション技法とは異なり、ｍＲＮＡの添加は、遺伝子発現の持続期間の容易な操作を可能とする。この利点を活用して、プロジェリンの発現を中断し、タンパク質の代謝回転後における効果をモニタリングする（図１９を参照されたい）。このプロトコールを使用して、他の任意のプロジェリン様タンパク質を、ｉＰＳＣであれ、初代幹細胞であれ、胚性幹細胞であれ、ｉＰＳＣに由来しない初代または培養体細胞であれ、細胞へと導入することができる。
【０１８１】
以下は、分化するｉＰＳＣ由来細胞内または分化させたｉＰＳＣ由来細胞内で改変ＲＮＡを使用するプロジェリンの過剰発現のためのプロトコールである。
１．プロジェリンにより改変されたＲＮＡ（合成方法については、実施例９で記載する）を調製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｉＰＳＣ由来の体細胞へと送達し、インキュベートする。
ａ．ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞のためには、連続３日間にわたりトランスフェクションを反復する。
ｉ．注：量／持続期間の組合せにより、毒性を最小限とし、著明な効果を最も早期とするために、処理を最適化する。
ｂ．ｉＰＳＣ由来のドーパミンニューロンのためには、連続５日間にわたりトランスフェクションを反復する。
ｉ．注：量／持続期間の組合せにより、毒性を最小限とし、著明な効果を最も早期とするために、処理を最適化する。
ｃ．他のｉＰＳＣ由来の体細胞のためには、パイロット実験を実施して、プロジェリンにより改変されたＲＮＡの量および持続期間を決定する。
ｄ．成熟関連表現型および／または年齢関連表現型について解析する。
代替的に、プロジェリンの発現はまた、プロジェリンを発現させる、温度感受性のセンダイウイルスの使用を介して達することもできる。加えて、プロジェリンの発現は、レンチウイルスを使用することにより達することもできる。
【０１８２】
（実施例３）
ニューロン細胞型の方向付けられた分化
本実施例は、方向付けられた分化技法のうちの１つの方法であって、特異的な神経細胞型を発生させる方法について記載する。中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンなど、ＣＮＳ細胞系統のほぼ純粋な集団を、本明細書で記載される方法において使用する。Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１１年、下掲のプロトコールを使用することができる（他の方法のうちで）。
【０１８３】
略述すると、既に記載されており（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））、図８で図式化されている通りに、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールの改変形を使用して、細胞を、フロアプレートベースのｍＤＡニューロンへと方向付けた。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを、分化の３０日目において、１０μＭのＹ−２７６３２（３２日目まで）、ならびにＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、アスコルビン酸（ＡＡ；０．２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ＴＧＦβ３（形質転換増殖因子β３型、１ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）、およびＤＡＰＴ（１０ｎＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）を補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／Ｌ−グルタミン含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ポリオルニチン（ＰＯ：ｐｏｌｙｏｒｎｉｔｈｉｎｅ；１５μｇ／ｍｌ）／ラミニン（１μｇ／ｍｌ）／フィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）であらかじめコーティングされたディッシュ上に、１ｃｍ２当たりの細胞２６０，０００個で再播種した。播種の１〜２日後、細胞を、１μｇ／ｍｌマイトマイシンＣ（Ｔｏｃｒｉｓ）で、１時間にわたり処理して、任意の残りの増殖夾雑物を死滅させた。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを、２〜３日ごとにフィードし、所与の実験のための所望の時点まで、継代せずに維持した。ＰＯ、ラミニン、およびフィブロネクチンを、７〜１０日ごとに培地へと添加して、ニューロンの離昇を防止した。
【０１８４】
（実施例４）
ｍＲＮＡ、５ｈＭＣ、およびＤＮＡのメチル化についてのプロファイリング
本実施例は、本明細書で記載される年齢パラダイムにおける、ｍＲＮＡ、５ｈＭＣ、およびＤＮＡのメチル化についてプロファイリングする１つの技術について記載する。これらの方法は、年齢関連因子に対する分子的制御に関するデータをもたらす。
【０１８５】
５−ｍＣの検出
強化型減少表示バイサルファイトシークエンシング（ＥＲＲＢＳ）法を使用することができる。このプロトコールでは、ゲノムＤＮＡを、ＭｓｐＩ制限酵素により消化し、断片をサイズで選択して、ＣｐＧ部位について濃縮された断片を得る。これらの断片に、亜硫酸水素塩転換を施し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００３５上でシークエンシングし、シークエンシングデータを、亜硫酸水素塩処理シークエンシングのリードおよび出力を、同定されたＣｐＧ部位のメチル化状態へとマップする、特注のソフトウェアにより解析する。
【０１８６】
５−ｈｍＣの検出
Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ製のＨｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（商標）キットを使用することができる。このプロトコールは、ビオチン部分の、５−ｈｍＣ位置への選択的付加に続く免疫沈降（ＩＰ）ステップに基づく。ＣｈＩＰ−ｓｅｑ実験と同様に、細胞の総入力およびＩＰ断片の両方をシークエンシングする。５−ｈｍＣ修飾を、バックグラウンドレベルを凌駕する高カバレッジ領域として同定する。
【０１８７】
遺伝子発現の検出
ＲＮＡ−ｓｅｑプロトコールを使用することができる。このプロトコールは、当技術分野で周知であり、ＷＣＭＣエピゲノミクスコアにおいて日常的に実施されている。シークエンシング実験は、シークエンシングの費用を軽減し、バッチエフェクトを防止する、マルチプレックス実験となろう。
【０１８８】
（実施例５）
遺伝子補正ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系
本実施例は、遺伝子補正ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系（例えば、ＴＡＬＥＮベースの遺伝子ターゲティング）の使用について記載する。開示の機構を理解することは必要でないが、これらの細胞系は、ＰＤ−ｉＰＳＣと対照ｉＰＳＣとのアイソジェニック対へのアクセスであって、年齢に関連する疾患因子と、ＰＤに対する遺伝的感受性に関連する因子とをより正確に識別するアクセスをもたらすと考えられる。
【０１８９】
（実施例６）
正常な老化におけるラミンＡおよびプロジェリンの関与
本実施例は、正常に老化した大脳皮質組織内では、ｉ）ラミンＡ／プロジェリンの上方調節；ｉｉ）ヘテロクロマチン状態の変化；ｉｉｉ）ニューロン内の核の拡張が見られることを示すデータを提供する。図１１は、老化ヒト脳組織内のラミンＡおよびプロジェリンの発現を示す例示的なデータを提示する。パネルＡは、ラミンＡおよびプロジェリンのいずれもが、老化個体から得られた大脳皮質組織内のｍＲＮＡ発現レベルの上昇を示すことを裏付ける。パネルＢは、４４および８２歳の２例のドナーのそれぞれから得られたラミンＡ／ＣおよびＭＡＰ２についての免疫蛍光による、パラフィン包埋されたヒト大脳皮質組織内の核膜の視覚化およびニューロンの同定について描示する。矢印は、ＭＡＰ２陽性ニューロンの例を指し示す。パネルＣは、可溶性トリメチル化Ｈ３Ｋ９についてのウェスタンブロット解析（左パネル）であって、ラミンＡおよびプロジェリンの上方調節と同様のタイミングによるヘテロクロマチン組織化の劇的な変化を指し示すウェスタンブロット解析を示す。これらの変化は、右パネルで裏付けられる通り、ヘテロクロマチンの、年齢に応じた不溶性のヘテロクロマチン性病巣への再組織化を反映しうる。
【０１９０】
（実施例７）
人工多能性幹細胞の、中脳ドーパミン細胞への代替的な分化
代替的に、二重ＳＭＡＤ阻害の改変形（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年））を使用して、ｉＰＳＣの神経分化を誘発することもできる。ＬＤＮ−１９３１８９（１００ｎＭ（０．５〜５０μＭの濃度の範囲にわたる）；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ（０．５〜５０μＭの濃度の範囲にわたる）；Ｔｏｃｒｉｓ、Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ、ＭＩ）、ＳＨＨ  Ｃ２５ＩＩ（１００ｎｇ／ｍｌ（１０〜２０００ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）；Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、パルモルファミン（２μＭ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）；Ｒ＆Ｄ）、およびＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；３μＭ（０．１〜１０μＭの濃度の範囲にわたる）；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）への時限式の曝露に基づく、フロアプレート誘導（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、６巻：３３６〜３４７頁（２０１０年））プロトコールを使用することができる。「ＳＨＨ」処理とは、細胞の、１００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ  Ｃ２５ＩＩ＋パルモルファミン（２μＭ）の組合せへの曝露、すなわち接触を指す。
【０１９１】
細胞を播種し（１ｃｍ２当たりの細胞３５〜４０×１０３個）、ＤＭＥＭ、１５％のノックアウト血清代替、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０μＭの（１〜２５μＭの濃度の範囲にわたる）β−メルカプトエタノールを含有するノックアウト血清代替（ＫＳＲ）培地中のマトリゲルまたはゲルトレックス上（購入時の通りに使用する）（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）で培養することができる。ＫＳＲ培地は、分化の５日目から始めて、既に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７巻：２７５〜２８０頁（２００９年））通りに、５〜６日目において７５％（ＫＳＲ）：２５％（Ｎ２）、７〜８日目において５０％（ＫＳＲ）：５０％（Ｎ２）、および９〜１０日目において２５％（ＫＳＲ）：７５％（Ｎ２）の比で混合することにより、Ｎ２培地へと漸進的にシフトさせた。
【０１９２】
分化の１１日目において、培地を、ＣＨＩＲ（１３日目まで）、ならびにＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、５〜１００の範囲にわたる２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、アスコルビン酸（ＡＡ；０．２ｍＭ（０．０１〜１ｍＭの濃度の範囲にわたる）、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ（１〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）；Ｒ＆Ｄ）、ＴＧＦβ３（形質転換増殖因子β３型、１ｎｇ／ｍｌ（０．１〜２５ｎｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）；Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ（０．０５〜２ｍＭの濃度の範囲にわたる）；Ｓｉｇｍａ）、およびＤＡＰＴ（１０ｎＭ（０．５〜５０ｎＭの濃度の範囲にわたる）；Ｔｏｃｒｉｓ）を補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地／Ｂ２７培地（１：５０の希釈率）／Ｌ−グルタミン（有効範囲：０．２〜２ｍＭ））含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと、９日間にわたり交換することができる。
【０１９３】
２０日目において、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、細胞を解離し、高細胞密度条件（例えば、１ｃｍ２当たりの細胞３００〜４００×１０３個）下で、ポリオルニチン（ＰＯ）；１５μｇ／ｍｌ（１〜５０μｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）／ラミニン（１μｇ／ｍｌ）（０．１〜１０μｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）／フィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ（０．１〜２０μｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたる）分化培地中で（ＮＢ／Ｂ２７＋ＢＤＮＦ、ＡＡ、ＧＤＮＦ、ｄｂｃＡＭＰ（本明細書で記載される濃度の範囲にわたる）、ＴＧＦβ３およびＤＡＰＴ（本明細書で記載される濃度の範囲にわたる）であらかじめコーティングされたディッシュ上に、所与の実験のための所望の成熟段階まで再播種することができる。
【０１９４】
（実施例８）
ｉＰＳＣの導出および分化
ＭＯＩを１０として、ＣｙｔｏＴｕｎｅセンダイウイルス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｃｏｒｉｅｌｌから購入された、見かけ上の健常若齢ドナー、老齢ドナー、ならびにＨＧＰＳ患者およびパーキンソン病患者の線維芽細胞を、記載される（Ｆｕｓａｋｉら、Ｐｒｏｃ  Ｊａｐａｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ：３４８〜３６２頁（２００９年））通りに再プログラム化した。ｉＰＳＣクローンを、ＣｙｔｏＴｕｎｅによる感染の約４週間後に単離し、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する多能性維持培地中のＭＥＦ上で維持し、Ｄｉｓｐａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、毎週１回の継代を施した。分化のための調製物中で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ｉＰＳＣを採取した。線維芽細胞の分化（Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、１４１〜１４６頁（２００８年））およびｍＤＡニューロンの分化（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））を、既に記載されている通りに実施した。
【０１９５】
（実施例９）
改変ＲＮＡの合成およびウイルスベクターの構築
既に記載されている（Ｍａｎｄａｌら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ、８巻：５６８〜５８２頁（２０１３年）；およびＷａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７巻：６１８〜６３０頁（２０１０年））、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）プロトコールを使用して、改変ＲＮＡを発生させた。
【０１９６】
略述すると、プロジェリンをコードする改変ＲＮＡを合成するためのプロトコールは、
１．ハッチンソン−ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）線維芽細胞に由来するｃＤＮＡに由来するプロジェリンのオープンリーディングフレームをクローニングし；
２．プロジェリン特異的バンド（約１８５０ｂｐ）をゲル精製し；
３．プロジェリンのＯＲＦを、合成ＲＮＡ発現ベクターによるスプリントライゲーションまたはクローニング（Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７巻：６１８〜６３０頁（２０１０年）および補遺：ＤＯＩ  １０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１０．０８．０１２）を介して、上流におけるＴ７プロモーター、５’ＵＴＲ配列と、下流における３’ＵＴＲ配列とで挟み；
４．ＰＣＲを実施して、Ｔ７−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ配列を増幅し、産物を精製し；
５．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＰＣＲ産物を転写し、結果として得られる改変ＲＮＡを精製すること
を伴う。他方、ウイルスプラスミドを合成するためのプロトコールは以下の通り：
１．プロジェリンのオープンリーディングフレームを、上記の通りにクローニングし；
２．プロジェリン特異的バンド（約１８５０ｂｐ）をゲル精製し；
３．プロジェリンのＯＲＦを、所望のプロモーターと共に、レンチウイルス／レトロウイルス／センダイウイルス骨格へとクローニングし；
４．例えば、ｉＰＳＣ由来のドーパミンニューロン内で発現させるために、ｐＬｅｎｔｉ−ｈＳｙｎ−ｅＮｐＨＲ  ３．０−ＥＹＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ；プラスミド２６７７５）を使用することができ；
５．標準的な手順を使用してウイルスを産生し、−８０℃で保存し；
６．蛍光タンパク質の発現または他の手段をリードアウトとして使用して、パイロット実験を実施して、レンチウイルスの力価を決定すること
である。
【０１９７】
改変ＲＮＡのトランスフェクションを、細胞型特異的培地中で実施した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で希釈された改変ＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。
【０１９８】
（実施例１０）
免疫細胞化学的解析
細胞培養物を、４％のパラホルムアルデヒド中で、１５分間にわたり固定した。ブロッキングを、１％のＢＳＡおよび０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を補充されたリン酸緩衝生理食塩液中で実施した。抗体および濃度のリストを、表５に提示する。二次抗体は、種特異的Ａｌｅｘａ色素コンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とした。マウス組織についてのさらなる詳細のほか、詳細な定量化法についても、下記に記載する。
【０１９９】
これらの抗体は、とりわけ、電子顕微鏡法（ＥＭ）；フローサイトメトリー（ＦＣ）；免疫細胞化学（ＩＣＣ）；免疫組織化学（ＩＨＣ）；ウェスタンブロット（ＷＢ）を含む技法により経時的マーカーを検出するために使用することができる。
【表５−１】
2019004900.tif 000010
【表５−２】
2019004900.tif 000011
【０２００】
（実施例１１）
フローサイトメトリーおよびミトコンドリアにおけるＲＯＳ解析
細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅで解離し、製造元により推奨される濃度に従い、氷上で１時間にわたり、コンジュゲート抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で直接染色した。ミトコンドリアにおけるＲＯＳを評価するため、細胞を、製造元の指示書に従い、細胞培養培地中２０μＭの最終濃度のＭｉｔｏＳＯＸ  Ｒｅｄミトコンドリアスーパーオキシドインジケーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。細胞分取は、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で実施した。
【０２０１】
（実施例１２）
遺伝子の発現解析
細胞を、ＴｒｉＺｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で溶解させた。ＲＮＡを、製造元の指示書に従い、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写した。Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ＲｅａｌＰｌｅｘ２（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）プラットフォームを使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＮＡ−ｓｅｑのために、全ＲＮＡを、２回の独立の実験から単離し、ＭＳＫＣＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｏｒｅファシリティーによりプロセシングした。
【０２０２】
（実施例１３）
タンパク質解析
細胞ペレットを、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を伴うＲＩＰＡ緩衝液で溶解させた。２０〜４０μｇの試料を、４倍濃度のＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液でさらに希釈し、９５℃で５分間にわたり煮沸し、ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％ビス−トリスプレキャストゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上へとロードし、ＰＶＤＦ膜へと転写した。ブロットを、一次抗体（使用される抗体のリストについては、表Ｓ４を参照されたい）中で一晩にわたりインキュベートした後、適切なＨＲＰ標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）中でインキュベートした。
【０２０３】
（実施例１４）
異種移植
ｈＳｙｎ：：ＧＦＰ−プロジェリンレンチウイルスまたはｈＳｙｎ：：核−ＧＦＰレンチウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染させた後で、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを、病変ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の大脳基底核線条体へと移植した。細胞数の立体解析を使用して、移植片についての免疫組織化学を定量化した。移植の６カ月後において、既に記載されている（Ｍｉｌｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、７９３巻：２３〜５９頁（２０１１年））通りに、電子顕微鏡法を実施した。本方法で使用されうる適切な市販のレンチウイルスベクターは、Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  ｐＬｅｎｔｉベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ；型番２６７７５）である。
【０２０４】
（実施例１５）
統計学的解析
分布は、対応する累積分布についての統計学的解析であって、異なる年齢または処理の間の差異を解析するコルモゴロフ−スミルノフ検定を使用する統計学的解析により比較した。棒グラフは、平均±ＳＥＭとしてプロットし、注記される場合を除き、生物学的３連を表す。スチューデントのｔ検定を使用して、２群間の比較を解析した。対照に照らした複数群間の比較は、ダネット検定を伴うＡＮＯＶＡを使用して解析した。Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０ａ、ＧｒａｐｈＰａｄ）を、データの提示および解析のために使用した。
【０２０５】
（実施例１６）
ｉＰＳＣの発生および特徴付け
線維芽細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から購入し、Ｆｕｓａｋｉら、Ｐｒｏｃ  Ｊａｐａｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ：３４８〜３６２頁（２００９年）により改変されたプロトコールであって、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃ−ＭＹＣを発現させるＣｙｔｏＴｕｎｅセンダイウイルス（ＯＳＫＭ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用するプロトコールに基づき、再プログラム化した。略述すると、線維芽細胞を、ゼラチン上に、１５％のウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充されたＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、１２ウェルプレートのウェル１つ当たり、１ｃｍ２当たりの細胞１０，５００個で播種した。ＣｙｔｏＴｕｎｅウイルスを、ＭＯＩを１０として組み合わせ、線維芽細胞へと、翌日（０日目として表記する）のほか、場合によって、２日目にも添加した。
【０２０６】
添加の約１６時間後において、培地を置きかえた。４日目において、トリプシン化により線維芽細胞を採取し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、２０％のノックアウト血清代替（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、および１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ）を含有するｉＰＳＣ維持培地であって、接着を支援する１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤（Ｙ−２７６３２；Ｔｏｃｒｉｓ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）を補充されたｉＰＳＣ維持培地中の、マイトマイシンＣ処理マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ；Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｅｍ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）上へと、１ｃｍ２当たりの細胞１０，５００個で再播種した。その後、隔日で培地を置きかえた。既に記載されている（Ｈｕａｎｇｆｕら、Ｉｎ  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１２６９〜１２７５頁（２００８年））通りに、バルプロ酸（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、培地へと、１ｍＭの最終濃度で、６日目〜１３日目にわたり添加して、再プログラム化効率を増強した。
【０２０７】
加えて、細胞を、５％の酸素中で、形質導入の１週間前〜形質導入の２．５週間後にわたり培養して、ｉＰＳＣのコロニー形成の可能性をさらに改善した（Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２３７〜２４１頁（２００９年））。また、再プログラム化に対する障壁として作用しうるＨＧＰＳ表現型（Ｃａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３巻：８９〜５８頁（２０１１年））を低減するために、形質導入の１週間前から、ｉＰＳＣコロニーの最初の出現まで、ＨＧＰＳ線維芽細胞を、６８０ｎＭのラパマイシン（Ｓｉｇｍａ）でも処理した。形質導入の約３０日後、ヒト胚性幹細胞コロニーに類似するコロニーを、機械的に単離し、２４ウェルプレート内のＭＥＦ上へと再播種した。独立の再プログラム化イベントを確保するために、ｉＰＳＣクローンは、個別に形質導入されたウェルから採取した。その後、各出発線維芽細胞系に由来する、少なくとも３つずつの生存コロニーを、ｉＰＳＣ培地中のＭＥＦフィーダー層上で維持し、ｄｉｓｐａｓｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）を使用して、毎週約１回継代培養した。
【０２０８】
標準的なＧバンド手順を使用する、ＭＳＫＣＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｅファシリティーにより、核型解析を実施した。既に記載されている（Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、１４１〜１４６頁（２００８年））通りに、胚様体形成を介する自発的分化を実施した。線維芽細胞系１つ当たり３つずつの独立のクローンを使用して、ｉＰＳＣを使用する実験を実施した。細胞（下記で列挙される細胞を含む）を、マイコプラズマについて、２〜４週間ごとに定期的に調べ、陰性であることを見出した。
【０２０９】
（実施例１７）
ＰＤのモデル化のためのｉＰＳＣ
ＰＩＮＫ１内の突然変異（ｃ．１３６６Ｃ＞Ｔ、ｐ．Ｑ４５６ＸＳｔｏｐ）またはＰＡＲＫ２／Ｐａｒｋｉｎ内の突然変異（ｃ．１０７２Ｔｄｅｌ、ｐ．Ｖ３２４ｆｓＸ１１０）を伴う患者に由来するＯＳＫＭのレトロウイルスによる過剰発現により発生させたＰＤ  ｉＰＳＣは、Ｄ．Ｋｒａｉｎｃラボ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）により恵与された。これもまた、ｐＭＩＧレトロウイルス（ＯＳＫ；ｃ−Ｍｙｃを伴わない）を使用して確立された、見かけ上の健常ｉＰＳＣ（Ｃ１、３６歳；Ｃ２、４８歳）は、Ｋ．Ｅｇｇａｎラボ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から得た。さらなるｉＰＳＣクローンは、センダイウイルスを使用して、ＰＡＲＫ２／Ｐａｒｋｉｎ内の異なる突然変異（ｃ．９２４Ｃ＞Ｔ、ｐ．Ｒ２７５Ｗ）を伴う患者に由来する線維芽細胞から導出した。上記で列挙された、若齢ｉＰＳＣ（本実施例では、Ｃ３と呼ばれる）および老齢ｉＰＳＣ（本実施例ではＣ４と呼ばれる）は、これらもまた、センダイウイルスの再プログラム化因子を使用して導出されたため、対照として使用した。
【０２１０】
（実施例１８）
線維芽細胞の分化
ｉＰＳＣの、線維芽細胞様細胞への分化は、Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、１４１〜１４６頁（２００８年）によるプロトコールに基づいた。略述すると、ｉＰＳＣクローンを、Ｄｉｓｐａｓｅを使用して、酵素的に継代培養し、多細胞塊として、ＭＥＦ上で２４時間にわたり馴化され、次いで、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２および１０μＭのＹ−２７６３２を補充されたｉＰＳＣ維持培地中のゼラチンへと播種した。翌日、培地を、１５％のウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で置きかえ、その後、隔日で持続的に交換した。分化細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、最初の２週間にわたり、５〜６日ごとに注意深く継代培養し、次いで、その後、トリプシン化した。継代日に、Ｙ−２７６３２を、培地へと添加して、接着を支援する一助とした。４週間後、線維芽細胞様細胞を、表現型評価および過剰発現研究の前に、ＣＤ−１３およびＨＬＡ−ＡＢＣの高発現レベルに基づき分取した。その後、分取された細胞を、１５％のウシ胎仔血清を伴うＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ（Ｙ−２７６３２を伴わない）中で増殖させた。
【０２１１】
（実施例１９）
ｍＤＡニューロンの分化
本実施例は、実施例３のプロトコールのロングバージョンを含有する。既に記載されており（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））、図８Ａで図式化されている通りに、二重ＳＭＡＤ阻害プロトコールの改変形を使用して、細胞を、フロアプレートベースのｍＤＡニューロンへと方向付けた。
【０２１２】
ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを、分化の３０日目において、１０μＭのＹ−２７６３２（３２日目まで）、ならびにＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、アスコルビン酸（ＡＡ；０．２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（グリア細胞系由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ＴＧＦβ３（形質転換増殖因子β３型、１ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）、およびＤＡＰＴ（１０ｎＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）を補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／Ｌ−グルタミン含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ポリオルニチン（ＰＯ；１５μｇ／ｍｌ）／ラミニン（１μｇ／ｍｌ）／フィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）であらかじめコーティングされたディッシュ上に、１ｃｍ２当たりの細胞２６０，０００個で再播種した。
【０２１３】
播種の１〜２日後、細胞を、１μｇ／ｍｌマイトマイシンＣ（Ｔｏｃｒｉｓ）で、１時間にわたり処理して、任意の残りの増殖夾雑物を死滅させた。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを、２〜３日ごとにフィードし、所与の実験のための所望の時点まで、継代せずに維持した。ＰＯ、ラミニン、およびフィブロネクチンを、７〜１０日ごとに培地へと添加して、ニューロンの離昇を防止した。
【０２１４】
（実施例２０）
合成ｍＲＮＡ（改変ＲＮＡ）のクローニング、合成、および使用
本実施例は、実施例９のプロトコールを含有する。既に記載されている（Ｍａｎｄａｌら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ、８巻：５６８〜５８２頁（２０１３年）；およびＷａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７巻：６１８〜６３０頁（２０１０年））、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）プロトコールを使用して、改変ＲＮＡを発生させた。プロジェリンのＯＲＦは、ＰＣＲにより、ＨＧＰＳ線維芽細胞から得た。プロジェリンＯＲＦの配列を、配列番号１として列挙する。Ｎ末端におけるＧＦＰの融合は、ＩｎＦｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニング技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して、プロジェリンのＯＲＦを、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｃへと挿入することにより達した。融合させたＧＦＰ−プロジェリンのＯＲＦの配列を、配列番号２として列挙する。核−ＧＦＰは、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｎｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型とした。リン酸化ＯＲＦは、ジェネリック５’ＵＴＲおよびジェネリック３’ＵＴＲを既に含有する骨格へとクローニングした。テールＰＣＲとＩＶＴとの反応は、既に記載されている（Ｍａｎｄａｌら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ、８巻：５６８〜５８２頁（２０１３年））通りに、実行した。
【０２１５】
過剰発現実験のために、改変ＲＮＡを氷上で融解させ、１００ｎｇ／μｌの作業濃度へと調整した。細胞１００，０００個のトランスフェクション当たり、２００ｎｇの改変ＲＮＡを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中１０μｌまで希釈し、ボルテックスし、室温で１０分間にわたりインキュベートした。別個の試験管内で、０．６μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中１０μｌまで希釈し、同じ時間枠にわたりインキュベートした。次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を、改変ＲＮＡ混合物を含有する試験管へと移し、ボルテックスし、さらに１０分間にわたりインキュベートした。トランスフェクション混合物は、トランスフェクションの前に少なくとも４時間にわたり、２００ｎｇ／ｍｌのインターフェロン阻害剤であるＢ１８Ｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であらかじめ処理された細胞へと、滴下により添加した。
【０２１６】
３７℃で４時間後、全懸濁液を、Ｂ１８Ｒを補充された新鮮な培地で置きかえた。ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞へのトランスフェクションを、分化の５０日目から始めて実施し、その後、２日間連続で反復した。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンには、分化の６５日目または１２０日目から始めてトランスフェクトし、その後、４日間連続で反復した。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内の表現型を確立するために、さらに２日間にわたるトランスフェクションを行った。最終回のトランスフェクションの１日後に細胞を解析した。
【０２１７】
（実施例２１）
細胞の免疫染色
細胞を、４％のパラホルムアルデヒド中で、１５分間にわたり固定した。１％のＢＳＡおよび０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を補充されたリン酸緩衝生理食塩液中で、３０分間〜１時間にわたりブロッキングを実施した。細胞を、４℃で一晩にわたり、ブロッキング緩衝液中で希釈された一次抗体により染色した。抗体および濃度のリストを、表Ｓ４に提示する。複数回にわたる洗浄の後、細胞を、室温、ブロッキング緩衝液中１：５００の適切なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、３０分間〜３時間にわたり染色した。細胞を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で対比染色して、核を視覚化した。画像は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ  ＣＣＤカメラを使用するＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１顕微鏡により収集した。
【０２１８】
（実施例２２）
マウス組織
ヒトｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを移植した３カ月後において、マウスの腹腔内に、過剰用量のペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を施して、深い麻酔を誘導し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ：ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）中で潅流した。脳を抽出し、４％のＰＦＡ中で後固定し、次いで、３０％のスクロース溶液中に、２〜５日間にわたり浸漬した。組織を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｓａｋｕｒａ−Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）中に包埋した後で、クライオスタット上で切片化した（３０μｍ）。電子顕微鏡法のためのマウス組織の処理については、下記を参照されたい。
【０２１９】
（実施例２３）
免疫染色の定量化
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞
２０倍の対物レンズを使用して、Ｏｐｅｒｅｔｔａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上で、画像を収集した。Ｈａｒｍｏｎｙ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０）を使用して、画像の加工を実施した。
【０２２０】
継代をマッチさせた細胞を、３回にわたる独立の実験によりスコア付けした。プロジェリン陽性細胞に対するバイアスに起因して必要な場合は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４３ｕ、ＮＩＨ）を使用して、画像を加工した。これらの場合、条件１つ当たりの細胞５０個ずつを、各独立の実験について評価した。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ：ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ）として提示する。
【０２２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウス脳組織
細胞カウントは、既に記載されている（Ｔａｂａｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３巻（５号）：６０１〜６０６頁（２００５年））通りに、Ｓｔｅｒｅｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭＢＦ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｅｒｍｏｎｔ）を使用する、光学分割プローブおよびＣａｖａｌｉｅｒｉ推定器を使用して決定した。細胞カウントは、ランダム化グリッドを使用して、移植片を同定可能な、切片５枚目ごとにスコア付けした。カウントは、条件１つ当たり３匹ずつの動物により決定した。データは、推定総細胞数±ＳＥＭとして提示する。
【０２２２】
（実施例２４）
老化の評価
製造元の指示書に従い、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製の染色キットを使用して、老化活性化ベータ−ガラクトシダーゼを評価した。陽性細胞染色は、手作業で評価した（各々細胞５０個ずつの２連）。
【０２２３】
ＨＴ−ＱＦＩＳＨによるテロメア長の測定
細胞を、底部が透明で壁面が黒色の９６ウェルプレートであって、試料１例当たりのウェル４連を含む９６ウェルプレート上に播種し、既に記載されている（Ｃａｎｅｌａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０４巻：５３００〜５３０５頁（２００７年））通りに、ハイスループット定量的蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＨＴ−ＱＦＩＳＨ）を実施した。画像は、２０倍の対物レンズを使用するＯｐｅｒｅｔｔａで捕捉した。Ｈａｒｍｏｎｙ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、画像の加工を実施した。テロメア長の値は、四連試料中のＣｙ３標識テロメアプローブ（試料１例当たり＞６００個のスポット）の特異的結合に対応する個々のテロメアスポットを使用して測定し、既に記載されている（Ｃａｎｅｌａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０４巻：５３００〜５３０５頁（２００７年）；およびＭｃＩｌｒａｔｈら、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、６１巻：９１２〜９１５頁（２００１年））通りに、テロメア長が既知である対照細胞系を使用して、蛍光強度をキロベースへと転換した。
【０２２４】
（実施例２５）
フローサイトメトリー
細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅで解離し、製造元により推奨される濃度に従い、氷上で１時間にわたり、コンジュゲート抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で直接染色した。細胞分取は、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で実施した。
【０２２５】
ミトコンドリアにおけるＲＯＳの評価
細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅで解離し、細胞培養培地中２０μＭの最終濃度のＭｉｔｏＳＯＸ  Ｒｅｄミトコンドリアスーパーオキシドインジケーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。染色は、３７℃のインキュベーター内で、３０分間にわたり実行した。細胞は、洗浄し、ＤＡＰＩを含有する細胞培養培地中で再懸濁させて、死細胞を解析から除外した。細胞ショックに起因する陽性染色を防止するために、使用される試薬を３７℃まであらかじめ温め、ＦＡＣＳＡｒｉａ上の解析の直前まで、試料を３７℃に保った。試料は、非処理の若齢ドナーの線維芽細胞／ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞／ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンのほか、ミトコンドリア内のスーパーオキシド産生を誘導するように、２０μＭのカルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ；Ｓｉｇｍａ）で４８時間にわたり処理された若齢ドナー細胞と常に比較した。これらの対照は、試薬が時間と共に酸化したのでも、染色プロトコール中に細胞がストレスを受けたのでもないことを確認する一助となった。ＭｉｔｏＳＯＸ試薬を酸化させた集団のパーセントの定量化は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．５．３；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して実施し、条件１つ当たり少なくとも３つの独立のクローンまたは実験について平均した。陰性対照試料が、フローサイトメトリーにより完全な陽性のリーディングを示した場合は、個々の実験によるデータを、解析から除外したことは、条件または試薬自体が損なわれたことを示唆する。
【０２２６】
（実施例２６）
ＤＮＡの抽出および突然変異の解析
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡを、細胞ペレットから抽出した。製造元の指示書に従い、ＨｉＦｉ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、突然変異近傍の小領域をＰＣＲ増幅した。標準的なフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を使用して、ＰＣＲ産物を清浄化した。ＰＣＲ産物についてのＤＮＡシークエンシングを、ＭＳＫＣＣ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＣｏｒｅファシリティーまたはＧＥＮＥＷＩＺ（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）により実施した。
【０２２７】
（実施例２７）
ＲＮＡの抽出および遺伝子の発現解析
細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で直接溶解させた。クロロホルムおよびエタノール沈殿を使用してＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してさらに清浄化した。試料は、さらに加工するまで、−８０℃で保存した。全ＲＮＡを逆転写し（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０ｎｇのＲＮＡを使用して、各ＲＴ−ＰＣＲ反応の鋳型とした。プロジェリンの発現レベルを解析するために、全ＲＮＡを、０．１倍容量の５Ｍ  ＮａＯＨにより、室温で３０分間にわたり加水分解した後、０．１倍容量の５Ｍ  ＨＣｌで加水分解した（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：１０５９〜１０６３頁（２００６年））。製造元の指示書に従い、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ＲｅａｌＰｌｅｘ２（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）プラットフォームを使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。発現レベルは、注記の通り、シクロフィリンＡまたは１８Ｓ（ハウスキーピング遺伝子対照）に照らして正規化した。ＲＮＡ−ｓｅｑのために、全ＲＮＡを、２回の独立の実験から単離し、ＭＳＫＣＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｏｒｅファシリティーによりプロセシングした。
【０２２８】
ＲＴ−ＰＣＲ実験において使用されるプライマーの配列およびシークエンシングのためのプライマーの配列を、表６に列挙する。
【表６】
2019004900.tif 000012
【０２２９】
ペアドエンドの７５塩基対によるＲＮＡシークエンシングライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００上でシークエンシングした。マッピングパラメータをデフォルトとするＳＴＡＲ  ２．３．０ｅ（Ｄｏｂｉｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２９巻：１５〜２１頁（２０１３年））を使用して、リードをヒトゲノム（Ｈｇ１９）へとマップし、ＨＴＳｅｑを使用して、リードカウントを評価した。主成分分析は、ベースの「ｓｔａｔｓ」パッケージを使用して、Ｒ（ｖ２．１５．２）により遂行した。示差的に発現する遺伝子は、ｌｉｍｍａ  ｖｏｏｍ（Ｓｍｙｔｈ、Ｓｔａｔ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３巻：論文３（２００４年））により同定した。保守的な手法を取り、シークエンシングライブラリー内の低カバレッジを説明し、試料が、ｌｉｍｍａにより評価される遺伝子についてのゼロでないリードカウントを含有するように、低リードカウントフィルターを使用した。示差的に発現する遺伝子は、±２の倍数変化カットオフおよびボンフェローニ調整された０．０５のｐ値を使用して同定した。超幾何検定を使用して、若齢ドナーによるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内および老齢ドナーによるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内のプロジェリンの過剰発現に応答する類似性を評価した。遺伝子オントロジー解析は、核−ＧＦＰを発現させるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンと、ＧＦＰ−プロジェリンを発現させるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンとの間の倍数変化を１０ビンにわたる連続変数とするｉＰＡＧＥ（Ｇｏｏｄａｒｚｉら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、３６巻：９００〜９１１頁（２００９年））を使用して遂行した。ベン図、バープロット、およびＰＣＡプロットは、ベースのＲ「ｇｇプロット２」グラフィックスパッケージ（Ｗｉｃｋｈａｍ，  Ｈ．（２００９年）、ｇｇｐｌｏｔ２：  ｅｌｅｇａｎｔ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｆｏｒ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））を使用して、Ｒ（ｖ２．１５．２）により作成した。生データは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／（ＧＳＥ４９１１２）において入手可能である。
【０２３０】
（実施例２８）
タンパク質の単離およびウェスタンブロット解析
細胞は、カルシウムもマグネシウムも伴わない、氷冷リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ−／−）中で、セルリフター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）により回収した。細胞ペレットは、エタノールおよびドライアイス上で迅速に凍結させ、−８０℃で保存した。細胞ペレットを氷上で融解させ、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を伴う、５０〜２００μｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液（ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０）中で再懸濁させた。細胞懸濁液を、氷上の４５分間にわたるインキュベーション中に１５分間隔でボルテックスした。４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間にわたるスピンの後に、溶解物を単離した。２０〜４０μｇの試料を、４倍濃度のＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液でさらに希釈し、９５℃で５分間にわたり煮沸し、ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％ビス−トリスプレキャストゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上へとロードした。１００Ｖで２時間にわたり、ゲル電気泳動を実施した。製造元の指示書に従い、ＸＣｅｌｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ゲルを、メタノール活性化ＰＶＤＦ膜へと転写した。ブロットを、室温、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を加えたトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ−Ｔ）中３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）で、４５分間にわたりブロッキングした。ブロットを、シェーカー上４℃の一次抗体中で、一晩にわたりインキュベートした（使用される抗体のリストについては、表Ｓ４を参照されたい）。
【０２３１】
ＴＢＳ−Ｔによる複数回にわたる洗浄の後、ブロットを、適切なＨＲＰ標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）中、室温で１時間にわたりインキュベートした。製造元の指示書に従い、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を使用して、タンパク質バンドの視覚化を実施し、ＳＲＸ−１０１Ａ  ｘ線フィルムプロセッサー（Ｋｏｎｉｃａ  Ｍｉｎｏｌｔａ、Ｗａｙｎｅ、ＮＪ）上で現像した。ＩｍａｇｅＪを、３回にわたる独立の実験によるブロット上で使用して、密度測定による定量化を実施した。
【０２３２】
（実施例２９）
神経突起の定量化
樹状突起を標識するＭＡＰ２による免疫染色の後、ランダムに選択されたＧＦＰ＋細胞の画像を、４０倍の対物レンズを使用するＨａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ  ＣＣＤカメラを使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１顕微鏡上で、手作業により収集した。樹状突起の長さは、ＩｍａｇｅＪを使用して、ＧＦＰ＋核から伸長する、標識された各神経突起をたどって測定した。核周囲のＭＡＰ２染色を伴う細胞をゼロとした。ＭＡＰ２染色を伴わないＧＦＰ＋核のほか、凝縮されたＧＦＰ＋核を伴う細胞も、スコア付けしなかった。条件１つ当たり５０個ずつの細胞を、３つの独立の分化の各々について評価した。
【０２３３】
（実施例３０）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける評価
移植
動物手順は、ＮＩＨガイドラインに従い実施され、地域のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ
Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＢＣ）のほか、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＥＳＣＲＯ）により承認された。６週齢のＮＯＤＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウス（２０〜３５ｇ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ；Ａｋｏｒｎ、Ｄｅｃａｔｕｒ、ＩＬ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ；Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ、ＩＡ）で麻酔をかけた。１０μｇの６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を、６週齢のマウスの大脳基底核線条体の以下の座標（ミリメートル単位）：ＡＰ：０．５（前項から）；ＭＬ：−２．０；ＤＶ：−３．０（硬膜から）へと定位注射した。
【０２３４】
病変形成の２週間後、マウスを、２回にわたり（１週間隔てて）、回転挙動（下記を参照されたい）について調べた。高回転数／低回転数を示す動物が、群間で均等に分布するように、動物を６つの群へと分け、次いで、特定の群へと無作為に割り当てた。群１つ当たり少なくとも３匹ずつの動物についての解析を、３カ月後の時点において可能とするように、条件１つ当たり５匹ずつの動物の初期の試料サイズを選択した。分化の２１日目において、対照（Ｃ１）のｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロンおよびＰＤ突然変異体（ＰＩＮＫ１−Ｑ４５６Ｘ、Ｐａｒｋｉｎ−Ｖ３２４Ａ）のｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロンに、ｈＳｙｎ：：ＧＦＰ−プロジェリンまたはｈＳｙｎ：：核−ＧＦＰを発現させるレンチウイルスベクターを感染させ、３０日目において移植した（移植時において約２．５カ月齢の動物）。合計２００×１０３個の細胞を、２μｌの容量で、大脳基底核線条体の以下の座標（ｍｍ単位）：ＡＰ：０．５；ＭＬ：−１．８；ＤＶ：３．２へと注射した。
【０２３５】
回転試験
アンフェタミン誘導性回転試験を、移植前および移植の１２日後において実施した。マウスにおける回転挙動は、ｄ−アンフェタミン（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ）をｉ．ｐ．注射した１０分後に記録し、３０分間にわたり記録された。データは、１分間当たりの回転の平均数として提示した。
【０２３６】
（実施例３１）
電子顕微鏡法
手順は、Ｍｉｌｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、７９３巻：２３〜５９頁（２０１１年）に従い実施した。略述すると、ヒトｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを移植した６カ月後に、マウスに、１５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムを、腹腔内に過剰投与した。脳を、１ｍｌ当たり１０００単位のヘパリン、３．７５％のアクロレイン５０ｍｌ、および０．１Ｍのリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ７．４）中に２％のパラホルムアルデヒド、およびＰＢ中に２％のＰＦＡ  ２００ｍｌを含有する生理食塩液（０．９％）による大動脈弓潅流で逐次的に固定した。脳を摘出し、ＰＢ中１．８７％のアクロレイン／２％のＰＦＡにより、室温で３０分間にわたり後固定した。冠状組織ブロックを、振動型ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）上で切片化した（４０μｍ）。異種移植片を含有する選択された切片は、１％の水素化ホウ素ナトリウム中で前処理した。非特異的結合は、０．１Ｍのトリス−生理食塩液（ＴＳ：Ｔｒｉｓ−ｓａｌｉｎｅ；ｐＨ７．６）中に０．５％のＢＳＡでブロッキングした。一次抗体（表Ｓ４を参照されたい）は、ＴＳ中に０．１％のＢＳＡ中で希釈し、４℃で一晩にわたりインキュベートした。切片は、ビオチニル化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ
ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と共に、室温で３０分間にわたりインキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を使用して、ペルオキシダーゼによる標識付けを実施した後で、ジアミノベンジジンを伴うインキュベーションを７分間にわたり実施した。次いで、切片を、金コンジュゲート二次抗体（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＥＭＳ）、Ｆｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）中、４℃で一晩にわたりインキュベートした。切片を、２％のグルタルアルデヒド中で後固定し、０．２Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で洗浄し、Ｓｉｌｖｅｒ  ＩｎｔｅｎＳＥ  Ｍキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、銀増感させた。複数回にわたる洗浄の後、切片を、２％の四酸化オスミウム中で１時間にわたり固定し、昇順のエタノール希釈系列を介して脱水し、一晩にわたり、酸化プロピレン／ＥＭＢｅｄ  ８１２（ＥＭＳ）中に入れた。次いで、切片を、６０℃で、Ａｃｌａｒプラスチックシート２枚の間のＥＭＢｅｄ  ８１２中で４日間にわたり包埋した。移植片を含有する選択された切片を、Ｂｅｅｍカプセル上に貼付し、ガラスナイフ（Ｌｅｉｃａ）を使用して、ウルトラミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ）上で切り刻んだ。極薄切片は、グリッド上に回収し、酢酸ウラニルおよびレイノルドによるクエン酸鉛で対比染色した。最終調製物を検討し、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｃ１０透過電子顕微鏡を使用して撮影した。ＩｍａｇｅＪを使用して、群１つ当たり２５個ずつの樹状突起１μｍ２当たりのＴＨ−免疫金粒子の数の定量化、および群１つ当たり２５個ずつのミトコンドリアの面積（μｍ２）の定量化を実施した。
【０２３７】
（実施例３２）
統計学的解析
度数分布プロットは、任意単位で５０または１００の増分によりビニングされた、３回にわたる独立の実験（他の実施例も全て同じ）の各々による、細胞（線維芽細胞）１００個または細胞５０〜１００個の蛍光強度の定量化を提示する。分布は、対応する累積分布についての統計学的解析であって、異なる年齢または処理の間の差異を解析するコルモゴロフ−スミルノフ検定を使用する統計学的解析により比較した。異なる時点において染色を実施したため、異なる細胞型の度数分布についての任意単位は、比較しないものとする。
【０２３８】
棒グラフは、平均±ＳＥＭとしてプロットし、注記される場合を除き、生物学的３連を表す。技術的多連は、統計学的解析に組み入れる前に平均した（すなわち、実験１回についての技術的多連の平均＝生物学的１連）。スチューデントのｔ検定を使用して、２群間の比較を解析した。対照に照らした複数群間の比較は、ダネット検定を伴うＡＮＯＶＡを使用して解析した。Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０ａ、ＧｒａｐｈＰａｄ）を、データの提示および解析のために使用した。
【０２３９】
（実施例３３）
再プログラム化は、年齢関連マーカーを、「若齢」状態に戻す
再プログラム化中および再分化中に追跡しうるマーカープロファイルを検証するために、継代数についてマッチさせた、１２の線維芽細胞集団であって、見かけ上の健常若齢ドナー（１１歳）、中間齢ドナー（３１〜５５歳）、老齢ドナー（７１〜９６歳）、および早老ＨＧＰＳ患者（３〜１４歳）に由来する線維芽細胞集団の比較を実施した。多様な年齢関連マーカーであって、ＨＧＰＳ線維芽細胞内で既に記載されているマーカー（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：１０５９〜１０６３頁（２００６年））を含むマーカーとドナーの線維芽細胞年齢の間で、著明な相関が観察された（図２Ａ〜２Ｃおよび図５Ａ）。
【０２４０】
免疫細胞化学を、８２歳のドナーに由来する老齢の線維芽細胞と比較した、１１歳のドナーに由来する若齢の線維芽細胞における、核ラミナ（ラミンＡ／Ｃ）、ラミナ関連タンパク質（ＬＡＰ２α）、および末梢ヘテロクロマチン（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、ＨＰ１γ）を同定するマーカーについて実施した。百分率は、フォールディングした核形態を伴う細胞および／またはブレブ形成した核形態を伴う細胞の比率を指し示す。図２Ａ。図２Ａにおけるマーカーの定量化により、選択された年齢関連マーカーの、若齢ドナーの線維芽細胞と、老齢ドナーの線維芽細胞とを層別化する能力、および老齢ドナーの線維芽細胞の、早老であるＨＧＰＳ患者の線維芽細胞との類似性が裏付けられた。データは、継代をマッチさせた単一の線維芽細胞系に由来する細胞１００個についての、相対蛍光強度の度数分布としてプロットする。図２Ｂ。ＨＧＰＳ患者の線維芽細胞と同様に、老齢ドナーの線維芽細胞は、若齢ドナーの線維芽細胞より、ＤＮＡ損傷（γＨ２ＡＸ免疫細胞化学により測定される）のレベルが高く、ミトコンドリア内の反応性酸素分子種（ＲＯＳ；スーパーオキシドの指標であるＭｉｔｏＳＯＸを使用するフローサイトメトリーにより測定される）のレベルも高い。ｎ＝３回にわたる独立の実験。図２Ｃ。若齢ドナーの線維芽細胞および老齢ドナーの線維芽細胞に由来する、継代１０代目（Ｐ１０）のｉＰＳＣ内の年齢関連マーカーについての免疫細胞化学。図２Ｄ。図２Ｄにおける染色の定量化により、老齢ドナー由来のｉＰＳＣが、再プログラム化を通して、年齢関連マーカーを保持できない（ＨＧＰＳ由来ｉＰＳＣと同様である）ことが指し示された。各々細胞のｎ＝３００個ずつ（３つの独立のｉＰＳＣクローンに由来する細胞１００個ずつ）。図２Ｅ。再プログラム化すると、ＤＮＡ損傷レベルおよびミトコンドリア内のスーパーオキシドレベルがリセットされる。
【０２４１】
老齢ドナーに由来する線維芽細胞は、ＨＧＰＳ線維芽細胞に緊密に相似したことから、Ｍｉｓｔｅｌｉおよび同僚（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：１０５９〜１０６３頁（２００６年）；Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｉｎ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１１巻（４号）：４４０〜４４５頁（２００５年））によるかつての知見が裏付けられる。より具体的には、老齢ドナーの線維芽細胞は、若齢ドナーに由来する線維芽細胞と比較した場合の、核形態の異常（すなわち、フォールディングおよびブレブ形成）、ＬＡＰ２αなど、核ラミナ関連タンパク質の喪失、末梢ヘテロクロマチンマーカーであるトリメチル化Ｈ３Ｋ９（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）およびヘテロクロマチンタンパク質１ガンマ（ＨＰ１γ）の包括的な喪失のほか、ＤＮＡ損傷レベルおよびミトコンドリア内のスーパーオキシドレベルの上昇を示した。ＨＧＰＳに関与する突然変異体タンパク質であるプロジェリンの発現が低レベルである（図５Ｂ）にも拘らず、老齢ドナーの線維芽細胞内のマーカーの発現は、ＨＧＰＳ線維芽細胞と同等であった。これらのデータは、経時的マーカーシグネチャーが、見かけ上の健常ドナーに由来する若齢ドナーの線維芽細胞を、老齢ドナーの線維芽細胞と対比して、信頼できる形で層別化しうることを示唆する。
【０２４２】
再プログラム化の、細胞年齢のマーカーに対する効果について取り組むために、線維芽細胞を、若齢（１１歳）ドナー、老齢（８２歳）ドナー、およびＨＧＰＳ（１４歳）ドナーから選択し、ドナーの線維芽細胞系の各々に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃを発現させるセンダイベクター（Ｆｕｓａｋｉら、Ｐｒｏｃ  Ｊａｐａｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ：３４８〜３６２頁（２００９年））を形質導入した（図５Ｃ）。細胞質ＲＮＡウイルスを使用することにより、形質導入の２５〜４０日後までに、組込みを伴わないｉＰＳＣの導出が可能となった。ｉＰＳＣクローンにより、核（図５Ｄ）および細胞表面（図５Ｅ）の多能性マーカーの発現、ならびに胚様体への分化後における３つの胚葉への分化（図５Ｆ）を含む、多能性細胞に特徴的な特性が裏付けられた。
【０２４３】
ｉＰＳＣクローンは、正常核型を有し、ＨＧＰＳ患者の線維芽細胞に由来するｉＰＳＣは、疾患突然変異を維持した（図５Ｇ）。上記で示した年齢関連分子マーカーのサブセットを評価して、若齢の線維芽細胞と老齢の線維芽細胞とを識別した。外因性センダイウイルスの喪失（図５Ｄ）を確保するように、ｉＰＳＣは、継代の前に評価しなかった。再プログラム化の後、老齢ドナーの線維芽細胞に由来するｉＰＳＣは、ラミンＡ、ＬＡＰ２α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ、およびＨＰ１γの発現に関して、若齢ドナー由来のｉＰＳＣと識別不可能であった（図２Ｄおよび２Ｅ）。さらに、ｉＰＳＣが提示するＤＮＡ損傷またはミトコンドリア内の反応性酸素分子種は、存在する場合でも極めてわずかであった（図２Ｆ）ことから、多能性細胞段階における表現型年齢のリセットが示唆される。しかし、年齢関連シグネチャーは、プロジェリンの発現に依存することが示唆されている（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：１０５９〜１０６３頁（２００６年））。
【０２４４】
異なる年齢のドナーに由来する線維芽細胞の年齢関連変化を裏付けるマーカーについての免疫細胞化学解析の定量化：若齢ドナー：１１歳、中間齢ドナー：３１〜５５歳、老齢ドナー：７１〜８２歳、ＨＧＰＳ（ハッチンソン−ギルフォード早老症候群）：ドナー３〜１４歳とする。年齢群１つ当たりｎ＝３例の独立のドナーである。図５Ａ。若齢ドナー（１１歳）線維芽細胞内、老齢ドナー（８２歳）線維芽細胞内、およびＨＧＰＳ患者（１４歳）線維芽細胞内の、各ＬＭＮＡアイソフォームについての定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析である。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。ｎ＝３代にわたる連続継代である。図５Ｂ。ラパマイシン処理を伴うＨＧＰＳ患者の線維芽細胞は、プロジェリンの代謝回転を増大させ、これにより、プロジェリン誘導性の表現型の、再プログラム化効率に対する負の影響（Ｃａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３巻：８９〜５８頁（２０１１年））を低減した。ＯＳＫＭ：ＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣ；ＭＥＦ：マウス胚性線維芽細胞；ＶＰＡ：バルプロ酸とする。図５Ｃ。２つの代表的なｉＰＳＣクローンにより、多能性マーカーであるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４の、Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と同様の発現のほか、継代１０代目まで、残留センダイウイルスの発現の徴候が見られないことも裏付けられた。図５Ｄ。多能性表面マーカー（ＳＳＥＡ４、上）および線維芽細胞（ＨＬＡ−ＡＢＣ、下）表面マーカーについての、ｉＰＳＣのフローサイトメトリー解析である。ドナー１例当たり２つずつの代表的なｉＰＳＣクローンのほか、ドナーの線維芽細胞も、Ｈ９  ｈＥＳＣと比較した。ｉＰＳＣクローンの、三次元的胚様体（ＥＢ）構造への自発的分化により、ｉＰＳＣクローンが、３つの胚葉（内胚葉：ＧＡＴＡ４、ＡＦＰ；中胚葉：ＲＵＮＸ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ；外胚葉：ＮＥＳＴＩＮ、ＮＣＡＭ）のマーカーを上方調節する潜在的可能性が裏付けられる。画像は、単一のｉＰＳＣクローンから導出された代表的なＥＢについて描示する。図５Ｆ。シークエンシング結果は、見かけ上の健常若齢ドナーおよび老齢ドナーに由来する線維芽細胞内またはｉＰＳＣ内には存在しなかった、１８２４Ｃ＞Ｔヘテロ接合性突然変異の、再プログラム化を通した、ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ内の維持を示す。ｎ．ｓ．：有意差なし；ダンを伴うＡＮＯＶＡにより、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図５Ｆ。
【０２４５】
したがって、ｉＰＳＣ内の年齢関連表現型の非存在は、多能性細胞が、著明なレベルのＡ型ラミンであって、プロジェリンを含むＡ型ラミンを発現させないという事実を反映するに過ぎない可能性がある（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕら、ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ、２４巻：１７７〜１８５頁（２００６年））。Ａ型ラミンアイソフォームについての免疫細胞化学的解析は、ｉＰＳＣコロニーの周縁部では、発現が、自発的な分化を経る細胞へと制約されることを示した（図２Ｄ、左欄）。ＨＧＰＳ−ｉＰＳＣは、多能性段階における、年齢関連マーカーの同等な喪失を裏付けた（図２Ｂ〜Ｃおよび２Ｅ〜Ｆ）。しかし、本実施例のデータは、再プログラム化により、年齢の真のリセットがなされるのではなく、老齢ドナーの線維芽細胞集団間で、年齢関連マーカーの発現が低レベルである細胞（「若齢」細胞）が選択されるという可能性を排除しない。興味深いことに、ドナーの初代線維芽細胞のクローン増殖は、バルク培養物として維持された元の線維芽細胞集団と同様の年齢関連マーカーの分布を２週間以内に再確立する培養物を結果としてもたらした。しかし、機構に関わらず、本実施例の結果は、ドナーの年齢またはＨＧＰＳ状態に依存しないｉＰＳＣが、年齢関連マーカーの発現を欠くことを裏付ける。
【０２４６】
（実施例３４）
老齢ドナーに由来するｉＰＳＣを分化させた後で、年齢は再導入されない
老齢ドナー由来のｉＰＳＣを調べて、ラミンＡ／プロジェリンの喪失を介して、多能性段階では一過性に抑制される、それらのドナー年齢の記憶の保持を決定した。
【０２４７】
血清含有培地を使用して、線維芽細胞に由来するｉＰＳＣを、３０日間にわたり線維芽細胞様細胞へと分化させた（図６Ａ）後で、ＣＤ１３＋／ＨＬＡ−ＡＢＣｈｉ（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．、１０６巻：１２７５９〜１２７６４頁（２００９年）；Ｖｅｒｌｉｎｄｅｎ，  Ｊ．，  Ｍ．、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ、１２３巻：２８７〜２９０頁（１９８１年））についての蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を行った（図６Ｂ）。精製された細胞を、さらに３０日間にわたり、さらに増殖させてから行った特徴付けにより、線維芽細胞マーカーであるビメンチンの発現および神経先駆体マーカーであるネスチンの非存在が裏付けられた（図６Ｃ）。
【０２４８】
ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞（分化の６０日目における）は、ラミンＡおよびプロジェリンの発現を、ドナーの初代線維芽細胞内で観察されるレベルと同様のレベルで示した（図６Ｄ）。ｉＰＳＣを、血清含有培地中で、３０日間にわたり、線維芽細胞様細胞へと分化させ（図６Ａ）、線維芽細胞マーカーであるＣＤ１３およびＨＬＡ−ＡＢＣの、ｉＰＳＣと比較して高レベルの発現（赤色ボックス）について、フローサイトメトリーで分取した（図６Ｂ）。分取後におけるｉＰＳＣ由来の線維芽細胞により、線維芽細胞様形態および免疫細胞化学によるビメンチンの発現は提示されたが、ネスチン（神経マーカー）の発現は提示されなかった。図６Ｃ。ラミンＡ転写物およびプロジェリン転写物についてのＲＴ−ＰＣＲにより、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞（ｉＰＳＣ線維芽細胞）内の、ドナーの線維芽細胞内で観察されるのと同様のレベルまでの上方調節が示された。図６Ｄ。改変ＲＮＡは、対照としての核局在化緑色蛍光タンパク質（核−ＧＦＰ）またはＧＦＰへと融合させたプロジェリン（ＧＦＰ−プロジェリン）を発現させるようにデザインした。ジェネリック５’ＵＴＲおよびジェネリック３’ＵＴＲのほか、ポリ（Ａ）テールおよび５’キャップ構造の付加により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写反応を容易とした（Ｍａｎｄａｌら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ、８巻：５６８〜５８２頁（２０１３年）；Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７巻：６１８〜６３０頁（２０１０年））。図６Ｅ。トランス遺伝子の発現についてのウェスタンブロット解析である。ｎ：核−ＧＦＰ；ｐ：ＧＦＰ−プロジェリンとする。ラミンＡ／Ｃ抗体（Ｎ−１８）を使用する検出についての解析により、プロジェリンの過剰発現は、ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内で観察される内因性プロジェリンレベルより高レベルを誘導することが明らかにされた（矢印）。図６Ｆ。Ｑ−ＦＩＳＨによる、テロメア長および２キロベース（ｋｂ）未満のテロメアの百分率の定量化である。ｎ＝４連のウェルである。図６Ｇ。老化マーカーである老化活性化ベータ−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）の、初代線維芽細胞から、プロジェリンを過剰発現させる、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞への全ての段階における評価である。ｎ＝２連のウェルである。図６Ｈ。
【０２４９】
しかし、分化は、老齢ドナーによるｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内で、それらは今や、継代をマッチさせた若齢ドナーによるｉＰＳＣ由来の線維芽細胞のプロファイルに緊密にマッチするので、年齢関連マーカープロファイルを再確立しなかった（図３Ａ〜Ｃ）。これらのデータは、老化した見かけ上の健常ドナーに由来する初代線維芽細胞内の年齢関連マーカーは、再プログラム化の後でリセットされ、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞へと分化させても再確立されないことを裏付ける。
【０２５０】
したがって、年齢は、再プログラム化の後で失われ、それらの年齢を再確立するには、数年間にわたるｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養を要求する潜在的可能性がある、ｉＰＳＣ由来の若齢様線維芽細胞がもっぱらもたらされる。これに対し、ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞は、ＨＧＰＳについての他のｉＰＳＣベースのモデルにおいて報告されている（Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ、４７２巻：２２１〜２２５頁（２０１１年）；Ｚｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、８巻：３１〜４５頁（２０１１年））通り、分化させると、年齢関連マーカーの発現シグネチャーを自発的に再確立した（図３Ｂおよび３Ｃ）ことから、適正なキュー（すなわち、高レベルでのプロジェリンの発現）を施せば、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞を、老化様状態へと戻しうることが示唆される。
【０２５１】
年齢関連マーカーについての免疫細胞化学：百分率は、フォールディングした核形態を伴う細胞および／またはブレブ形成した核形態を伴う細胞の比率を指し示す。図３Ａ。（Ａ）で示されたマーカーの定量化により、若齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞と、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞との間で、年齢様表現型を再確立するＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞と比較した高度の重複が指し示される。図３Ｂ。ＤＮＡ損傷（左）およびミトコンドリア内のスーパーオキシド（右）の解析により、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来の線維芽細胞が、「若齢」様状態へとリセットされたことがさらに示される。図３Ｃ。
【０２５２】
（実施例３５）
プロジェリンの急性過剰発現は、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内の年齢関連マーカーを再確立する
さらなる試験を実施して、プロジェリンの過剰発現が、再分化の後で識別不可能な若齢様表現型を提示する、見かけ上の健常若齢ドナーによるｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内および老齢ドナーによるｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内で、年齢関連マーカーを誘導するのに十分であるのかどうかを決定した。
【０２５３】
合成ｍＲＮＡ（改変ＲＮＡと称する）（Ｋａｒｉｋｏら、２００５年；Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、７巻：６１８〜６３０頁（２０１０年））を使用して、プロジェリンへと融合させたＧＦＰ（ＧＦＰ−プロジェリン）または核局在化ＧＦＰ対照（核−ＧＦＰ；図６Ｅ）を過剰発現させることにより、発現の量および持続期間の容易な操作を可能とした。毎日１回ずつ３日間にわたる改変ＲＮＡのトランスフェクション（図４Ａ）により、プロジェリンの発現を、ＨＧＰＳ  ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内で観察されるレベルと同様のレベルまたはこれより高度なレベルへと誘導した（図６Ｆ、矢印）。注目すべきことに、見かけ上の健常若齢ドナーによるｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内および老齢ドナーによるｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内のＧＦＰ−プロジェリンの過剰発現は、核形態の異常、ＬＡＰ２α発現の喪失、ＤＮＡ二本鎖破断の形成（γＨ２ＡＸ）、ヘテロクロマチンマーカー（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３およびＨＰ１γ）の喪失、およびミトコンドリア機能不全の増大を誘導したが、核−ＧＦＰは、これらを誘導しなかった（図４Ｂ〜４Ｄ）。これらのプロジェリンにより誘導される特徴は、正常な老化ドナーに由来する初代線維芽細胞内で観察される特徴と識別不可能であった（図２Ａ〜２Ｃおよび図５Ａ）。
【０２５４】
改変ＲＮＡを、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞へと、４日目における解析の前に、３日間連続でトランスフェクトした。図４Ａ。ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内の、プロジェリンの過剰発現（ＧＦＰ−プロジェリン）により、核局在化ＧＦＰ対照（核−ＧＦＰ）の過剰発現では観察されなかった、核形態の変化（ＧＦＰにより見られる）、ラミナ関連タンパク質（ＬＡＰ２α）の発現、ＤＮＡ損傷のレベル（γＨ２ＡＸ）、およびクロマチンの組織化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３；ＨＰ１γ）が引き起こされる。百分率は、フォールディングした核形態を伴う細胞および／またはブレブ形成した核形態を伴う細胞の比率を指し示す。図４Ｂ。（図４Ｂ）で示されたデータの定量化である。度数分布プロットは、独立のｉＰＳＣクローンから導出された、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞の、３回にわたる独立のＲＮＡトランスフェクションに由来する細胞１００個の蛍光強度を表す。図４Ｃ。ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターであるＭｉｔｏＳＯＸについてのフローサイトメトリー解析により、プロジェリンの過剰発現を伴うミトコンドリアの機能不全の劇的な増大が示唆される。
【０２５５】
有糸分裂細胞の正常な老化は、テロメアの、細胞が老化を経る臨界点であって、ヘイフリック限界（Ｈａｙｆｌｉｃｋ、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、３７巻：６１４〜６３６頁（１９６５年））に達する臨界点までの短縮と関連することが典型的である。プロジェリンが、テロメアの短縮を誘導しうるのかどうかを決定するのに、トランスフェクトされたｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内の定量的蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、テロメア長を測定した（Ｃａｎｅｌａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
Ｕ  Ｓ  Ａ、１０４巻：５３００〜５３０５頁（２００７年））。プロジェリンを過剰発現させた後、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞は、全体的な長さの減少およびプロジェリンを過剰発現させた短いテロメアの百分率の増大を裏付けた（図６Ｇ）。この結果は、老化活性化βガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）染色の増大によりさらに確証された（図６Ｈ）。ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内のプロジェリン誘導の変化は、ドナーの年齢に依存しなかったことから、細胞が若齢ドナーに由来するのであれ、老齢ドナーに由来するのであれ、表現型の差異は見られないことが裏付けられた。
【０２５６】
これらのデータは、プロジェリンの過剰発現が、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内の表現型であって、正常な老化の一部の側面を表現型複写する表現型を迅速に誘導するのに十分であることを指し示す。
【０２５７】
（実施例３６）
プロジェリンは、ニューロンの老化表現型を、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内で誘導する
誘導老化戦略をさらに検証するために、他の細胞型を調べた。例えば、年齢様表現型を有糸分裂後細胞内で誘導する、プロジェリンの過剰発現を調べた。既に確立されたプロトコール（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））を使用して、若齢ドナーおよび老齢ドナーによるｉＰＳＣを、ＰＤにおいて主に影響を受ける細胞型である、中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンへと分化させた（図８Ａ）。１３日以内に、分化させたｉＰＳＣは、ｍＤＡニューロン発生の早期段階である、ＬＭＸ１Ａ／ＦＯＸＡ２二重陽性中脳フロアプレート先駆体へと転換された（図８Ｂ）。
【０２５８】
分化の３２日目における未成熟ｍＤＡニューロンを、マイトマイシンＣで一過性に処理して、任意の夾雑する増殖細胞を消失させた（図８Ｃ）。さらに６週間にわたりさらに成熟させた、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、７０日目においても、ｉＰＳＣクローン内で、ドナーの年齢に依存せずに、ＦＯＸＡ２およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）などのｍＤＡマーカーを発現させ続けた（図８Ｄおよび８Ｅ）。興味深いことに、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、これが、年齢様表現型を反映するのか、単純に組織特異的な挙動および細胞型特異的な挙動であるのかは明らかでないが、内因性ラミンＡ発現の開始と共時的に生じる、軽度にフォールディングされた核形態を有した（図８Ｆ）。
【０２５９】
ｍＤＡニューロンをｉＰＳＣから導出するための分化プロトコールについての図式的例示。Ｍｉｔ．Ｃ：マイトマイシンＣとする。図８Ａ。分化の１３日目における、ＦＯＸＡ２（赤色）、ＬＭＸ１Ａ（緑色）、およびＯＣＴ４（ピンク色）についての免疫細胞化学である。図８Ｂ。最終日である３０日目の再播種の１日後におけるマイトマイシンＣ処理は、残りの増殖細胞（影響を受けなかった有糸分裂後のニューロン）を消失させる一助となった。図８Ｃ。免疫細胞化学（図８Ｄ）および定量化（図８Ｅ）により、分化の７０日目における残りの細胞のうちのほぼ１００％が、有糸分裂後ニューロン（ＴＵＪ１＋／Ｋｉ６７−）であり、これらのニューロンのうちの８０％超が、ｍＤＡ特異的マーカー（ＦＯＸＡ２＋／ＴＨ＋）を発現させたことが裏付けられる。既に報告されている通り（Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ、４８０巻：５４７〜５５１頁（２０１１年））ＴＨ＋ニューロンのうちの約４０％はまた、成熟度の大きなｍＤＡマーカーであるＮＵＲＲ１も発現させる。独立のｉＰＳＣクローンの、ｎ＝少なくとも３つの独立の分化である。ｍＤＡニューロンの分化中におけるラミンＡおよびラミンＢ２についての免疫細胞化学は、核フォールディングの開始と同様のタイミングで、ラミンＡアイソフォームの内因性の上方調節を示す。図８Ｆ。
【０２６０】
また、ｉＰＳＣ由来ニューロンを使用することにより、このモデル化パラダイムを、遅発性神経変性障害の年齢関連マーカーシグネチャーへも適用した（図７および８）。興味深いことに、ＨＧＰＳ患者は、彼らの比較的短い寿命において、神経変性の明白な徴候を示さない（死亡時の中央値年齢は、１１〜１３歳である）（Ｈｅｎｎｅｋａｍ、Ａｍ  Ｊ
Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ、１４０巻：２６０３〜２６２４頁（２００６年））。開示の機構を理解することは必要でないが、ｍｉＲ−９の中枢神経系特異的発現による、ラミンＡおよびプロジェリンの負の調節に起因して、これらの患者には、プロジェリンが蓄積するのに十分な時間が存在しない可能性があると考えられる（Ｎｉｓｓａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ、２巻：１〜９頁（２０１２年）；Ｊｕｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０９巻：Ｅ４２３〜４３１頁（２０１２年））。実際、本実施例のデータは、ヒト脳内のラミンＡおよびプロジェリンの上方調節は、晩年（＞７０歳）に生じることを示す（図１１）。
【０２６１】
３日間にわたる、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内のプロジェリン改変ＲＮＡの急性過剰発現は、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞と比較して、プロジェリンタンパク質の蓄積を結果として低減し、明白な表現型はもたらさなかった。これに対し、ｍＤＡニューロン内のプロジェリンへの曝露を、５日間まで延長したところ（図７Ａ）、タンパク質レベルは、内因性Ａ型ラミン発現のレベルを超えて誘導された（図７Ｂ、矢印）。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内でプロジェリンを発現させなくとも、分化の７０日目までに、ドナー年齢に関わらず、より高い基礎レベルのＤＮＡ損傷およびミトコンドリアＲＯＳが既に観察されていたことは注目に値する（図７Ｃおよび７Ｄ）。プロジェリンを過剰発現させた後、ＧＦＰ陽性細胞は、核のフォールディングおよびブレブ形成の増強、それぞれ、γＨ２ＡＸ病巣およびミトコンドリア内のスーパーオキシドの蓄積により測定される、ＤＮＡ損傷の蓄積の増大（図７Ｃ）、およびミトコンドリア機能不全の徴候（図７Ｄ）の証拠を示した。
【０２６２】
しかし、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞（図４）とは対照的に、ニューロン内で、ＬＡＰ２α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、またはＨＰ１γの著明な変化は観察されなかった（図７Ｅ）。いずれの処理条件下でも、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内では、老化のマーカーであるＳＡ−β−Ｇａｌの陽性染色は検出されなかった。これらのデータは、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞およびｍＤＡニューロンによる、本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける老化パラダイムに対する、共通の応答および細胞型特異的応答の両方を裏付ける。
【０２６３】
改変ＲＮＡを、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンへと、６日目における解析の前に、５日間連続でトランスフェクトした。図７Ａ。トランス遺伝子の発現についてのウェスタンブロット解析である。１００ｋＤａにおけるＧＦＰバンドは、ＧＦＰ−プロジェリン融合タンパク質を表示するのに対し、２７ｋＤａにおけるＧＦＰバンドは、核−ＧＦＰトランス遺伝子を表す。トランス遺伝子を含むラミンＡアイソフォームは、単一の抗体により認識した。プロジェリンの過剰発現レベルは、内因性ラミンＡレベルを超えることに注意されたい（矢印）。ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、検出可能レベルのプロジェリンタンパク質を、内因的には発現させないと考えられる。ｎ：核−ＧＦＰ；ｐ：ＧＦＰ−プロジェリンとする。図７Ｂ。プロジェリンの過剰発現により、若齢ドナー由来のｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンおよび老齢ドナー由来のｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンのいずれにおいても、核のフォールディングおよびブレブ形成（ラミンＢ２により見られる、ピンク色）が増強され、ＤＮＡ損傷の蓄積が増大する（γＨ２ＡＸ）。百分率は、核のフォールディングおよび／またはブレブ形成が増強された細胞の比率、または＞３つの肥大したγＨ２ＡＸ病巣を伴う細胞の比率を指し示す。図７Ｃ。ミトコンドリア内のスーパーオキシドレベル（ＭｉｔｏＳＯＸ）についてのフローサイトメトリー解析により、プロジェリンの過剰発現を伴うミトコンドリアの機能不全の増大が裏付けられる。独立のｉＰＳＣクローンから導出された、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの、ｎ＝３回にわたる独立のＲＮＡトランスフェクションである。図７Ｄ。ＬＡＰ２α、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、およびＨＰ１γについての免疫細胞化学の定量化により、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内で観察される表現型と異なり、ＧＦＰ−プロジェリンをトランスフェクトされたｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン、または核−ＧＦＰをトランスフェクトされたｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンの間では差異が示されない。蛍光強度は、核−ＧＦＰ処理細胞内で観察される強度に照らして正規化した。図７Ｅ。
【０２６４】
本明細書で提示されるデータは、ＦＯＸＡ２＋／ＴＨ＋中脳ドーパミンニューロン培養物への神経分化およびニューロン分化の効率が、ドナーの線維芽細胞年齢またはＨＧＰＳ状態による影響を受けないことを示す。しかし、合成ｍＲＮＡ技術を使用する、ｉＰＳＣ由来の中脳ドーパミンニューロン培養物中のプロジェリンの強制発現は、ｉＰＳＣ由来の線維芽細胞内で観察される変化と同等な核ラミナの変化を誘発する。データはまた、プロジェリン媒介型の、ＤＮＡ損傷およびミトコンドリアにおけるストレスの誘導が、Ｎｕｒｒ１＋中脳ドーパミンニューロンの識別への影響を伴わないことも示す（図７および８）。
【０２６５】
プロジェリンへの曝露に対する、細胞型特異的な応答をさらに検討するために、樹状突起分枝の変性による変化（Ｈｏｆら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２７巻：６０７〜６１３頁（２００４年））など、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるニューロンの老化と関連するパラメータを探索した。注目すべきことに、分化させた（６５日目）ｍＤＡニューロン内の５日間にわたるプロジェリンへの曝露は、ＴＵＪ１染色により視覚化される、確立された神経突起の機能停止を結果としてもたらす変性表現型を誘導するのに十分であった（図１２Ａ）。対照の核−ＧＦＰ  ｍＲＮＡをトランスフェクトされた細胞内では、変性が観察されなかった。
【０２６６】
また、樹状突起を特異的に標識するＭＡＰ２の発現（Ｂｅｒｎｈａｒｄｔら、Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ、２２６巻：２０３〜２２１頁（１９８４年））も評価した。定量的解析は、若齢ドナーによるｉＰＳＣおよび老齢ドナーによるｉＰＳＣのいずれに由来するｍＤＡニューロン内でも、プロジェリンへの曝露後における、平均樹状突起長の顕著な低減を示した（図１２Ｂ）。ｍＤＡニューロンマーカーであるＮＵＲＲ１およびＴＨを発現させるｉＰＳＣ由来ニューロンの百分率は、不変のままであったことから、プロジェリンの添加は、ｍＤＡニューロンの、ｍＤＡニューロンマーカーの喪失を迅速に誘導するＣＣＣＰなどのミトコンドリア毒素による処理とは対照的に、ｍＤＡニューロン毒性の単純な誘導ではなかった（図１３Ａおよび１３Ｂ）ことが示唆される。
【０２６７】
プロジェリンの過剰発現後における、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内の年齢様表現型をさらに特徴付けるために、ＲＮＡ−ｓｅｑによる遺伝子発現解析を実施した（生データ：ＧＥＯ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）；受託番号：ＧＳＥ５２４３１）。主成分分析により、再プログラム化の後における遺伝子発現のリセットが確認され、異なる年齢のドナーに由来するｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの間の類似性が例示された（図１２Ｃ）。さらに、プロジェリンの過剰発現は、若齢ドナーによるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内および老齢ドナーによるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内の、高度に類似の（ｐ＜２．９３×１０−３２１）変化を誘導した（図１２Ｃおよび図１３Ｃ）。プロジェリン誘導性の遺伝子発現の変化の重複の多く（図１３Ｃ）は、軸索の変性／再生（ＴＭＳＢ１０、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＣＤＣ１２６、ＴＳＮＡＸ、ＮＯＳＴＲＩＮ、ＬＡＭＣ３）、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集（ＮＥＤＤ８、ＰＳＭＢ３、ＰＰＩＢ、ＵＢＣ）、酸化ストレス（ＥＮＨＯ、ＮＤＵＦＢ６、ＡＴＰ５Ｌ、ＰＲＤＸ４、ＦＴＬ、ＡＴＯＸ１、ＴＮＩＰ３）、ＤＮＡ損傷（ＮＯＰ１０、ＴＣＥＡＬ７）、細胞周期の誘導（ＰＣＮＡ、ＭＩＲ６６３Ａ）、およびクロマチンの改変（ＰＲＤＭ１）など、ニューロンの老化と関連する過程（図１２Ｄ）において役割を果たすことが既に報告されている。
【０２６８】
年齢様過程と関連する転写物の誘導は、遺伝子オントロジーを解析することにより確認した（図１３Ｄ）。示差的に発現した転写物の間で、複数の特徴付けされていない遺伝子および非コードＲＮＡ（図１２Ｅ）であって、老化ラット脳内でなされた最近の観察（Ｗｏｏｄら、Ａｇｅ  （Ｄｏｒｄｒ）、３５巻：７６３〜７７６頁（２０１３年））を想起させる遺伝子および非コードＲＮＡが見出された。
【０２６９】
汎ニューロンマーカーであるＴＵＪ１についての免疫細胞化学により、確立されたニューロンネットワークが、７０日目において、プロジェリンを過剰発現させるｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンでは失われるが、核−ＧＦＰを過剰発現させるｉＰＳＣ由来ニューロンでは失われないことが示される。図１２Ａ。ＭＡＰ２についての免疫細胞化学により、若齢ドナーおよび老齢ドナーの両方に由来する全てではない（挿入図）が大半のｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン内の、プロジェリンの過剰発現後における、無傷の樹状突起の長さの縮減が明らかにされる。度数分布は、３回にわたる独立のＲＮＡトランスフェクション（核が非アポトーシス性の細胞５０個ずつ）による、樹状突起長の全測定値を提示する。図１２Ｂ。ＲＮＡ−ｓｅｑ遺伝子発現データについての主成分分析により、再プログラム化により誘導される年齢のリセットであって、若齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンと、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンとの高度な類似性を結果としてもたらす、年齢のリセットがさらに確証される。プロジェリンの過剰発現により、ドナー年齢に依存しない、ｍＤＡニューロンの同様の変化が誘導される。プロジェリン処理において、対照の核−ＧＦＰで処理された若齢ドナーによるｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン（緑色）および老齢ドナーによるｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン（青色）と比較して上方調節された遺伝子（左）および下方調節された遺伝子（右）の上位２０である。遺伝子を、老齢ドナーに由来するｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロンによりランク付けする。赤色は、特徴付けされていない遺伝子を表示し、橙色は、非コードＲＮＡを表示する。点線は、有意性についての閾値を指し示す。図１２Ｄ。有意に示差的に発現する転写物であって、コード転写物、非コード転写物、または特徴付けされていない転写物である、転写物の比率を表す円グラフである。図１２Ｅ。
【０２７０】
ＮＵＲＲ１＋  ｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロンの百分率（図１３Ａ）およびＴＨのタンパク質発現レベル（図１３Ｂ）は、トランスフェクションを経ても不変のままであったことから、プロジェリンの過剰発現は、ｍＤＡニューロンのタンパク質（急性毒性の典型的な徴候）を下方調節しないことが指し示される。各色の円により、２つの群の間で示差的に発現する遺伝子の数（倍数変化±２、ｐ＜０．０５）を指し示すベン図である。黒色の円は、さらに解析された重複する「老化シグネチャー」を指し示す。図１３Ｃ。核−ＧＦＰで処理されたｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内またはＧＦＰプロジェリンで処理されたｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内で濃縮される、著明な遺伝子オントロジーターム（左〜右）である。図１３Ｄ。プロジェリンにより、最近記載されたＰＤのバイオマーカー（Ｐｏｔａｓｈｋｉｎら、ＰｌｏＳ  ｏｎｅ、７巻、ｅ４３５９５頁（２０１２年））の共活性化因子であるＺＮＨＴ３の上方調節、およびＰＤ患者に由来する死後組織内で低度に発現することが見出された遺伝子であるＢＣＡＳ１（Ｋｉｍら、ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３巻：２７５〜２８６頁（２００７年））の下方調節が誘導されたことは、注目に値する。最後に、プロジェリンの過剰発現は、代謝の調節および長寿の促進における役割が報告されている（Ｓｈｉｈら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ、４巻：９１〜９６頁（２０１３年））ミトコンドリアのサーチュインであるＳＩＲＴ４の下方調節を引き起こした。
【０２７１】
（実施例３７）
プロジェリン誘導性老化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける遅発性ＰＤの特徴のモデル化を可能とする
本実施例は、年齢相応細胞を使用して、パーキンソン病（ＰＤ）などの遅発性神経変性障害のモデルを開示する。
【０２７２】
最近、複数の研究が、ＰＤのｉＰＳＣベースの疾患モデルについて報告しているが、これらの研究は、神経幹細胞など、疾患に対する関与性が不確実な細胞型内で生じる表現型（Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ、４９１巻：６０３〜６０７頁（２０１２年））、またはヒト疾患において観察される重度の神経変性の任意の徴候より前の、早期の生化学的表現型を表す表現型（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、４巻：１４１〜１９０頁（２０１２年）；Ｎｇｕｙｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、８巻：２６７〜２８０頁（２０１１年）；Ｓｅｉｂｌｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：５９７０〜５９７６頁（２０１１年））について記載している。本実施例のデータは、遅発性疾患の多様なｉｎ  ｖｉｔｒｏ疾患モデルにおける神経変性表現型の非存在は、再プログラム化中における年齢のリセットの結果でありうるという点で、別のことを示唆している。
【０２７３】
晩年まで疾患症状を呈示しないＰＤ患者と同様に、ＰＤ  ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンも、疾患の変性期を模倣するには余りに「若齢」に過ぎる可能性がある。開示の機構を理解することは必要でないが、プロジェリンの過剰発現は、現在のところ、ＰＤ  ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの「若齢」状態に起因してモデル化することができない、疾患関連表現型を顕在化させうると考えられる。
【０２７４】
結果として、ＰＩＮＫ１内のホモ接合性突然変異（Ｑ４５６Ｘ）またはＰａｒｋｉｎ内のホモ接合性突然変異（Ｖ３２４ｆｓＸ４３４）（図１５Ａ）を伴うＰＤ−ｉＰＳＣを分化させることにより、ｍＤＡニューロンを発生させた。ＰＩＮＫ１およびＰａｒｋｉｎ。これらのＰＤ突然変異は、ユビキチンプロテアソーム経路におけるＰａｒｋｉｎの固有の機能（Ｓｈｉｍｕｒａら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２５巻：３０２〜３０５頁（２０００年））に加えて、損傷したミトコンドリアの選択的な自己貪食性分解を促進する共通の経路においても作用する（Ｄｏｄｓｏｎら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、１７巻：３３１〜３３７頁（２００７年）において総説されている）と考えられている。一部の疾患関連表現型が、ＰＩＮＫ１突然変異体であるｉＰＳＣ由来ニューロン内で既に報告されている（Ｓｅｉｂｌｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：５９７０〜５９７６頁（２０１１年））が、それらは、ミトコンドリア毒素による処理を要求し、ニューロンの変性を誘発しなかった。
【０２７５】
ＰＩＮＫ１  ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系およびＬＲＲＫ２  ＰＤ−ｉＰＳＣ細胞系は、複数の理由：ｉ）組込みを伴わないｉＰＳＣの利用可能性、およびＴＡＬＥＮベースの遺伝子編集後において、マッチさせたクローンのアイソジェニック対をもたらしうる独立の取組み；ｉｉ）２つの突然変異であって、それらの各々が、ＰＤを誘発するための、顕著に異なる疾患表現型を有すると考えられている（ミトコンドリア仮説対凝集仮説）、突然変異の選択、ｉｉｉ）散発性のＰＤの理解に対する、ＬＲＲＫ２（ＰＤにおいて最も一般的なヒト突然変異）の関与性；およびｉｖ）ＰＩＮＫ１細胞系内の、疾患に関連する超微細構造的表現型についての予備的証拠であって、ＰＤの発症機序における、ＰａｒｋｉｎおよびＰＩＮＫ１の役割についての文献（１０）と符合する証拠（異常なミトコンドリア）で選択した。ＬＲＲＫ２突然変異体細胞は、異なる突然変異の文脈で、ＰＤの発症機序となる共通の表現型について裏付けることにより、データを補充しうる。開示の機構を理解することは必要でないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける老化へと曝露されたＰＤ  ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、対照ｉＰＳＣに由来するｍＤＡニューロンと共通の表現型およびこれらと顕著に異なる表現型のセットを呈示すると考えられる。
【０２７６】
データは、ＰＤ−ｉＰＳＣが、見かけ上の健常ドナー（Ｃ１およびＣ２；図１５Ｂおよび１５Ｃ）に由来するｉＰＳＣと同様の効率で、ｍＤＡニューロンへと分化したことを示す。分化の６５日目において、ＰＤ−ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンおよび対照ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの各々に、ＧＦＰ−プロジェリンまたは核−ＧＦＰを、５日間にわたりトランスフェクトした。ＰＤ−ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンと対照ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンとの間で同等な、ＮＵＲＲ１（図１４Ａ）およびＴＨ（図１４Ｂ）などのｍＤＡニューロンマーカーは、短期間のＧＦＰ−プロジェリンへの曝露の後で不変であった。
【０２７７】
ＰＤ突然変異体ｉＰＳＣ内では見出されるが、見かけ上の健常対照ｉＰＳＣ内では見出されない、ホモ接合性のＰＩＮＫ１  ｃ．１３６６Ｃ＞Ｔ突然変異およびＰＡＲＫ２  ｃ．１０７２ｄｅｌＴ突然変異についてのシークエンシングである。図１５Ａ。分化の１３日目における免疫細胞化学では、ＯＣＴ４＋  ｉＰＳＣの、ＦＯＸＡ２＋／ＬＭＸ１Ａ＋
ｍＤＡフロアプレート先駆体への転換における、健常ドナーとＰＤ患者との間の差異は裏付けられなかった。図１５Ｂ。先駆体の、有糸分裂後ｍＤＡニューロンへのさらなる分化は、ＰＤ突然変異体細胞内で影響を受けなかった。ｎ＝少なくとも３つの独立の分化である。図１５Ｃ。Ｐａｒｋｉｎ（ｐ．Ｒ２７５Ｗ）内にヘテロ接合性突然変異を伴うさらなるＰＤ患者における、ＡＫＴ経路によるシグナル伝達についてのウェスタンブロット解析である。ブロットの下方の数は、ｐ−ＡＫＴ（ＧＦＰ−プロジェリン）の、ｐ−ＡＫＴ（核−ＧＦＰ）に対する比を指し示す。ｎ：核−ＧＦＰ；ｐ：ＧＦＰ−プロジェリンとする。図１５Ｄ。
【０２７８】
特に興味深いのは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける誘導性老化に依存し、これにより、疾患の遅発性性格を模倣する、ＰＤ関連表現型を規定することにある。例えば、細胞死の誘発が、ＰＤ対対照ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内の、凝縮された核であって、切断型カスパーゼ３を発現させる核の出現の著明な増大により観察された（図１４Ｃ）ことから、ＰＤ突然変異体のｍＤＡニューロンは、老化を誘導されると、細胞死プログラムを活性化する傾向が強いことが指し示される。ＧＦＰ−プロジェリン陽性の凝縮された核は、プロジェリントランスフェクションの４日目または５日目まで検出されなかったことから、急性毒性ではなく、進行性の老衰が示唆される。さらに、生存するＴＨ／ＭＡＰ２陽性ｍＤＡニューロン内の樹状突起の長さが、ＰＤ対対照ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内でそれほど異ならなかったのに対し、プロジェリンの過剰発現は、ＰＩＮＫ１突然変異体ｍＤＡニューロン内およびＰａｒｋｉｎ突然変異体ｍＤＡニューロン内の樹状突起の変性を、健常ドナーに由来するｍＤＡニューロンと比較して加速化した（図１４Ｄおよび１４Ｅ）。
【０２７９】
ＰＤにおけるニューロンの生存の減少は、少なくとも部分的に、リン酸化Ｓ４７３  ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）レベルの低下であって、ＰＤモデル（Ｍａｌａｇｅｌａｄａら、Ｉｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４３６３〜１４３７１頁（２００８年）；Ｒｉｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１８７５７〜１８７６２頁（２００６年）；Ｔａｉｎら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１１２９〜１１３５頁（２００９年））のほか、散発性ＰＤ患者に由来する脳組織（Ｔｉｍｍｏｎｓら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ、３０〜３５頁（２００９年））においても観察されている低下により引き起こされることが示唆された。興味深いことに、ＰＩＮＫ１−Ｑ４５６Ｘ突然変異体およびＰａｒｋｉｎ−Ｖ３２４Ａ突然変異体である、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンが、プロジェリンに応答してｐ−ＡＫＴの著明な低減を示したのに対し、Ｃ１  ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンおよびＣ２  ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、プロジェリンへの曝露後において、ｐ−ＡＫＴのわずかな増大を示した（図１４Ｆおよび１４Ｇ）。また、ＡＫＴシグナル伝達の調節異常も、下流におけるシグナル伝達標的である、ＵＬＫ１および４ＥＢＰ１のリン酸化の、対応する変化を結果としてもたらした（図１４Ｆおよび１４Ｇ）。ＡＫＴ、ＵＬＫ１、および４ＥＢＰ１の基礎レベルでは、無視できないばらつきであって、多連の分化にわたる、遺伝子型および処理に依存しないばらつきが見られた（図１４Ｆ、図１５Ｄ）。しかし、ＰＤ対対照ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内の、ＡＫＴシグナル伝達構成要素の各々の活性化状態の、プロジェリン誘導性の低減は一貫しており（基礎レベルに依存せず）、ＰＤ患者の脳およびＰＤの動物モデルにおいて報告されたシグナル伝達の変化を模倣した。
【０２８０】
ＰＤ−ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンと、対照ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンとの間の、プロジェリン誘導性の差異をさらに確認するため、ヘテロ接合性Ｒ２７５Ｗ  Ｐａｒｋｉｎ突然変異を伴うＰＤ患者に由来するさらなる線維芽細胞を、センダイウイルスベースの再プログラム化を使用して再プログラム化した。ＰＩＮＫ１−Ｑ４５６Ｘ内およびＰａｒｋｉｎ−Ｖ３２４Ａ内のプロジェリン誘導性の表現型と同様に、プロジェリンの過剰発現は、Ｐａｒｋｉｎ−Ｒ２７５Ｗ  ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロン内で、見かけ上の健常若齢ドナーおよび老齢ドナー（Ｃ３およびＣ４）に由来する細胞と比較して、アポトーシスの増大（図１４Ｃ）、樹状突起の短縮の増強（図１４Ｅ）、およびＡＫＴ活性化の低減（図１５Ｅ）を駆動した。
【０２８１】
ＮＵＲＲ１＋細胞の定量化（Ａ）およびＴＨタンパク質レベルについてのウェスタンブロット解析（Ｂ）では、ＧＦＰ−プロジェリン改変ＲＮＡのトランスフェクションに応じた著明な差異が明らかにならない。ｎ：核−ＧＦＰ；ｐ：ＧＦＰ−プロジェリンとする。ウェスタンブロットの下方の数は、ＧＡＰＤＨに照らして正規化された、ＧＦＰ−プロジェリンによるＴＨの発現：核−ＧＦＰによるＴＨの発現の比を指し示す。図１４Ａおよび１４Ｂ。ＲＮＡトランスフェクション後における細胞死であって、それらの凝縮された核形態により同定された細胞死を経る、ＧＦＰ＋細胞についての解析である。画像は、プロジェリンで処理された細胞内の、切断型カスパーゼ３による免疫細胞化学の代表例を提示する。図１４Ｃ。樹状突起マーカーであるＭＡＰ２についての免疫細胞化学である。図１５Ｄ。ＧＦＰ＋ニューロン１つ当たりの樹状突起の全長の定量化により、ＰＤ突然変異体ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンにおける、プロジェリンの過剰発現に応答した、樹状突起の、見かけ上の健常対照（Ｃ１〜Ｃ４）と比較して加速化された短縮が示される。図１５Ｄ。ＡＫＴ経路によるシグナル伝達についてのウェスタンブロット解析（図１５Ｆ）により、プロジェリンの過剰発現に対する遺伝子型特異的応答が裏付けられる。リン酸化特異的バンドの定量化（図１５Ｇ）は、全タンパク質に照らして正規化してから、プロジェリン処理による発現レベルの、核−ＧＦＰ処理による発現レベルに対する比をとった。点線は、両方の処理条件において、リン酸化型タンパク質が等量であることを指し示す。
【０２８２】
プロジェリン曝露の長期にわたる影響を評価するために、ＰＤ−ｉＰＳＣに由来するｍＤＡニューロンおよび対照ｉＰＳＣに由来するｍＤＡニューロンに、ＧＦＰ−プロジェリンまたは核−ＧＦＰを発現させるレンチウイルスベクターを、ニューロン特異的ヒトシナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーターの制御下において形質導入し、６−ヒドロキシドーパミン病変ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｇｃヌルマウスの大脳基底核線条体へと移植した（図１６Ａ）。
【０２８３】
移植の２４時間後における、マッチさせた細胞アリコートについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析により、ＧＦＰ陽性細胞内のＮＵＲＲ１およびＴＨの発現が確認された（図１７Ａ）。ｈＳｙｎに駆動されるトランス遺伝子の発現は、移植の１日前に開始させ、発現は、培養された細胞内で、少なくとも９０日間（最後の被験時点）にわたり維持した。移植の３カ月後におけるｉｎ  ｖｉｖｏ解析は、大半の動物において、アンフェタミン誘導性回転スコアの低減を結果としてもたらした（図１６Ｂ）ことから、挙動の改善に要求される閾値を上回るｍＤＡニューロンの生存が指し示される。
【０２８４】
しかし、興味深いことに、プロジェリンを発現させる、ＰＩＮＫ１由来のニューロンまたはＰａｒｋｉｎ由来のニューロンを施された動物のサブセットは回復しなかった（図１６Ｂ、ピンク色の記号）ことは、これらの条件下で、挙動をレスキューするのに要求されるｍＤＡニューロンの生存が少数であることを考慮すると、驚くべきことであった。動物における挙動の回復が不完全であることが、生存するｍＤＡニューロンが少数であることに起因したのかどうかについて取り組むために、本発明者らは、移植片の立体的定量化を実施した。移植片の容量が、対照群と対比されたプロジェリン処理群においてそれほど影響を受けなかったのに対し、プロジェリンを発現させるｍＤＡニューロン移植片は、ＴＨ＋細胞数の劇的な低減を示した（図１６Ｃおよび１６Ｄ）。注目すべきことに、ＴＨ＋細胞の欠損は、ＰＩＮＫ１−Ｑ４５６Ｘ  ｉＰＳＣおよびＰａｒｋｉｎ−Ｖ３２４Ａ  ｉＰＳＣに由来する、プロジェリンを発現させるｍＤＡニューロン移植片内で、特に顕著であり、対照ｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン移植片内では最小限であった。ＴＨ＋細胞喪失の機構はいまだ決定されていないが、これらの結果は、ＰＤ患者において観察されるＴＨの喪失の加速化を模倣する。
【０２８５】
ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの年齢および疾患状態についてのバイオマーカーをさらに評価するために、移植の６カ月後において、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により、ヒト移植片についての超微細構造解析を実施した。包埋されたマウス脳についての、光学顕微鏡法による初期観察により、プロジェリンを過剰発現させる移植片内のＴＨ免疫反応性の、持続的で進行性の喪失が裏付けられた（図１７Ｂ）。ＴＥＭによる解析は、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの樹状突起内およびフォールディングされた核形態内のＴＨ発現の、プロジェリン誘導性低減を確認した（図１７Ｃおよび１７Ｄ）。
【０２８６】
移植されたニューロンの年齢状態を決定するために、本発明者らは、細胞内の神経メラニンの蓄積に焦点を当てた。神経メラニンとは、成年のｍＤＡニューロン内には存在するが、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを含む胎児期または新生児期には存在しない暗色の色素である（Ｍａｎｎら、Ｂｒａｉｎ、９７巻：４８９〜４９８頁（１９７４年）；Ｓｕｌｚｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、１０６巻：２４〜３６頁（２００８年））。ヒト胎児組織の移植研究では、神経メラニンは、線条体内注射の４〜１４年後において、移植片内で検出されたが、これは、正常な発生と同様の時間経過である（Ｃｈｕら、ＳＴＥＭ
ＣＥＬＬＳ、２４巻：１７７〜１８５頁（２０１０年））。プロジェリンを過剰発現している移植片において選択的に、リポフスチン沈着とともに神経メラニンの頑健な蓄積がわずか６カ月後に観察された（対照の核−ＧＦＰ発現移植片内の０．５と対比して、５５μｍ２当たりの平均で８つの沈着物；図１６Ｅ）ことから、プロジェリンは、遺伝的バックグラウンドに関わらず、ｍＤＡニューロンの老化を劇的に加速化することが指し示される。
【０２８７】
加えて、プロジェリンの過剰発現は、ＰＤ−ｉＰＳＣに由来する移植片内の遺伝子型特異的効果であって、核−ＧＦＰを過剰発現させるＰＤ移植片内または任意の非ＰＤ対照移植片内では観察されない表現型である効果を顕在化させた。例えば、プロジェリンを過剰発現させるＰＤ由来の移植片内では、線維体の出現など、神経突起変性の徴候が顕著であった（図１６Ｅおよび１６Ｇおよび図１７Ｃのアステリスク）ことから、微小管の機能停止が指し示される（Ｊａｗｏｒｓｋｉら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１７９巻：２００１〜２０１５頁（２０１１年））。さらに、本発明者らは、ＰＩＮＫ１−Ｑ４５６Ｘ  ｉＰＳＣ由来の移植片またはＰａｒｋｉｎ−Ｖ３２４Ａ  ｉＰＳＣ由来の移植片に限られるプロジェリン誘導性の表現型についても観察した。ＰＩＮＫ１移植片は、プロジェリンを過剰発現させる細胞内ではるかにより顕著な表現型である、ミトコンドリアの肥大（面積＝ＰＩＮＫ１＋核−ＧＦＰの０．０３８７μｍ２と比較して、０．１６７μｍ２；ｐ＝０．０００５；図１６Ｆおよび図１７Ｆ）を伴う細胞を含有した。
【０２８８】
移植の１日後にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再播種され、固定されたｉＰＳＣ−ｍＤＡニューロン内のＮＵＲＲ１およびＴＨについての免疫細胞化学である。細胞のうちの少なくとも５０％は、この時点において、シナプシン駆動型トランス遺伝子を発現させた。図１７Ａ。移植の６カ月後におけるＴＨおよびＧＦＰについての免疫組織化学により、プロジェリンを過剰発現させる場合の、ＴＨ＋  ＰＤ  ｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロンの劇的な喪失が裏付けられる。対照およびＰＤ突然変異体におけるＴＨ喪失のこのパターンは、移植の３カ月後において観察されたパターンと同様である（図１６を参照されたい）。点線は、移植片を規定する。アステリスクは、脳梁を示す。挿入図は、代表的なＧＦＰ＋核を示す。図１７Ｂ。透過電子顕微鏡法（ＥＭ）による超微細構造解析である。代表的な（図１７Ｃ）ＴＨ＋樹状突起および（図１７Ｄ）ＧＦＰ＋核を概観し、各々を、それぞれ、ＤまたはＮで表示する。左下の数は、１μｍ２当たりのＴＨ−免疫金粒子の平均数を表す。アステリスクにより、線維体を同定する。ＥＭ解析による神経メラニン沈着物の定量化である。動物１匹当たり１０カ所の５０μｍ２領域を解析した。図１７Ｅ。ＥＭ解析による、ＰＩＮＫ１−Ｑ４５６Ｘ動物における２５のミトコンドリアの面積の定量化である。スチューデントのｔ検定により、＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。図１７Ｆ。
【０２８９】
これに対し、Ｐａｒｋｉｎ突然変異体の移植片が示すミトコンドリア欠損はそれほど劇的ではなく（異常なミトコンドリアの融合など）、大規模な多重膜封入を呈示する（図１６Ｇ）ことがより顕著であった。多重膜封入は、多様な神経変性モデル（Ｃｈｅｎｇら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３１巻：２１２５〜２１３５頁（２０１１年）；Ｈｏｏｐｆｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ、５０巻：８８３〜８９５頁（２００６年）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２８巻：６５６９〜６５８２頁（２００８年））において観察されており、パーキンソン病患者に由来する脳内で生存するｍＤＡニューロン内で見出される、特徴的なレビー小体の先駆体であると考えられている（Ｆｏｒｎａｉら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、８８巻：１１４〜１２３頁（２００４年））。これらのニューロンの封入体の存在は、正常Ｐａｒｋｉｎ機能の喪失により引き起こされる、ユビキチンプロテアソーム経路の機能低下を指し示す。しかし、表現型の、プロジェリンの発現への依存は、年齢関連因子が、この機能不全に寄与することを示唆する。
【０２９０】
６−ＯＨＤＡにより病変を施されたパーキンソン病マウスへの移植研究についての図式的例示である。図１６Ａ。対照ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンまたはｈＳｙｎ：：核−ＧＦＰもしくはｈＳｙｎ：：ＧＦＰ−プロジェリンを発現させるＰＤ突然変異体ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンを移植された病変マウスの回転挙動解析である。マウスに病変を施し、アンフェタミンにより誘導される回転挙動について、移植の前に２回にわたり調べた。点線は、病変形成の成功についての閾値を指し示す。ピンク色の記号により、病変形成に成功した動物であって、回復を示さなかった動物を同定する。処理群１つ当たりの動物のｎ＝３〜５匹。図１６Ｂ。移植の３カ月後における評価により、プロジェリンを過剰発現させるＰＤ突然変異体におけるＴＨ＋  ｍＤＡニューロンの劇的な喪失であって、対照トランスフェクション細胞または見かけ上の健常細胞についてははるかに小さな程度で観察される喪失が明らかとなった。図１６Ｃ。ＴＨ＋であるＧＦＰ＋細胞の百分率の定量化である。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。条件１つ当たりのマウスのｎ＝３匹である。図１６Ｄ。移植の６カ月後における超微細構造解析により、プロジェリンの過剰発現を伴う移植片内の、リポフスチン沈着物（Ｅ：黄色の矢印）を伴う神経メラニンの蓄積が明らかとなった。注目すべきことに、プロジェリンを伴うＰＩＮＫ１突然変異体の移植片は、ミトコンドリアの肥大を提示した。図１６Ｅ〜Ｇ。代表的なミトコンドリアを比較した（＋核２７ＧＦＰ群および＋ＧＦＰ−プロジェリン群内で、橙色の矢印により指し示される）が、プロジェリンを伴うＰａｒｋｉｎ突然変異体の移植片は、大きな多重膜体を有した（Ｇ：ピンク色の矢印）。これらの表現型は、他のいずれの処理群でも観察されなかった。（Ｅ）および（Ｇ）におけるアステリスクは、線維体を指し示す。図１６Ｆ。
【０２９１】
本明細書で開示されるｉｎ  ｖｉｖｏの結果は、ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンの年齢は、「若齢」状態へとリセットされ、ヒト疾患の遅発性特徴をモデル化することにはつながらないという、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるデータを確証する。これに対し、プロジェリン誘導性のニューロンの老化は、正常な老化と符合する表現型のほか、ＰＤの遅発性神経変性的側面のモデル化におけるＰＤ遺伝子型と年齢との相乗的相互作用を反映する、疾患関連表現型も顕在化させる。
【０２９２】
核凝縮データに基づくと、アポトーシス性表現型は、プロジェリンにより、培養物中のアポトーシス性細胞の百分率が増大することを裏付けた。これらのデータは、プロジェリンの存在下または非存在下で、ＰＤ−ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンと、対照ｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンとを比較するように、定量的ＴＵＮＥＬアッセイを使用してさらに査定することができる。
【０２９３】
α−シヌクレイン蓄積の表現型は、ウェスタンブロット解析および免疫細胞化学を使用する、α−シヌクレインレベルおよび細胞の局在化を使用して、モニタリングすることができる。これらのデータは、誘導性老化が、ｍＤＡニューロン内のα−シヌクレインのプロセシングの産物に影響を及ぼすのかどうかについて取り扱っている。
【０２９４】
実施例３８（予測的）
年齢改変細胞を使用して薬物をスクリーニングするための方法
ｉＰＳＣは、例えば、本明細書で開示される方法、およびそうでなければ当技術分野で公知の方法により、ヒト線維芽細胞から得ることができる。年齢改変体細胞は、分化およびプロジェリン様タンパク質との接触により、ｉＰＳＣから得ることができる。したがって、特化した年齢改変体細胞であって、脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、皮膚、肺、血液、動脈、眼、骨髄、およびリンパ系から単離された体細胞の特徴を有する細胞を得ることができる。心筋細胞（例えば、Ｖａｎ  Ｏｏｒｓｃｈｏｔ  ＡＡら、Ｐａｎｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄ．、２０１０年６月、５２巻（２号）：９７〜１１０頁を参照されたい）、肝細胞（例えば、Ａｌａｉｍｏ  Ｇ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０１３年６月、２２８巻（６号）：１２４９〜５４頁を参照されたい）、腎細胞（例えば、Ｄｅ
Ｃｈｉａｒａ  Ｌ．ら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２０１４年２月、２５巻（２号）：３１６〜２８頁を参照されたい）、膵臓ベータ細胞（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｅ．ら、Ｊ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２０１２年、７巻（４号）：２１１〜２８頁を参照されたい）、白血球（例えば、ｄｅ  Ｐｏｏｔｅｒ  ＲＦら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２００７年、３８０巻：７３〜８１頁を参照されたい）を含むこのような体細胞をもたらす分化プロトコールは公知である。
【０２９５】
このような年齢改変体細胞は、これらを、プロジェリンまたはプロジェリン様タンパク質と接触させることにより発生させることができる。接触は、本明細書で記載される、プロジェリンまたは他のプロジェリン様タンパク質の一過性発現または構成的発現の影響を受ける可能性がある。一部の実施形態では、結果として得られる年齢改変体細胞はまた、疾患マーカーシグネチャーも発現させ、他の実施形態では、それらは、プロジェリン様タンパク質と接触させることにより老化するに過ぎないであろう。老化体細胞（疾患マーカーシグネチャーを発現させる老化体細胞および発現させない老化体細胞の両方）は、精製され、ハイスループットのスクリーニングなど、公知のスクリーニング法を使用して、候補薬物をスクリーニングするために使用されるであろう。
【０２９６】
細胞をスクリーニングのために準備できたら、それらを播種して、多様な播種密度および細胞培養容器について調べることができる。例えば、これらの細胞は、６ウェルプレート上、２４ウェルプレート上、９６ウェルプレート上、３８４ウェルプレート上、または薬物スクリーニングを容易とする他の任意のプラットフォーム上に播種することができる。適切なＨＴＳフォーマットを選択したら、栄養素の施与中止の開始時および持続期間も最適化することになろう。
【０２９７】
幹細胞由来の体細胞に基づく薬物スクリーニングについては記載されている。例えば、Ｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１２巻：７１３〜７２６頁（２０１３年）を参照されたい。略述すると、低分子による生存スクリーニングは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）におけるＭＮの死滅に対抗する薬物について探索するように、野生型のＳＯＤ１マウス胚性幹細胞および突然変異体のＳＯＤ１マウス胚性幹細胞の両方に由来するｉＰＳＣ由来の運動ニューロン（ＭＮ）を使用して実行した。マウスＥＳＣを、ＭＮへと分化させ、９６ウェルプレート内または３８４ウェルプレート内に播種した。加えてまた、分化の３０日後における、ヒトＥＳＣに由来するヒトＭＮおよびヒトｉＰＳＣに由来するヒトＭＮも使用した。低分子スクリーニングのために、解離されたばかりの細胞を、ウェル１つ当たりのＧＦＰ＋細胞８，０００個（３８４ウェルプレート）またはＧＦＰ＋細胞３０，０００個（９６ウェルプレート）の密度で播種した。４日後、栄養素を除去し、個々の化合物をウェルへと添加した。一次スクリーニングのため、各化合物を、３つの濃度（０．１ｍＭ、１ｍＭ、および１０ｍＭ）の２連で調べた。さらに７２時間後（７日目）、細胞を固定および染色し、全ウェル内の残りのＧＦＰ＋細胞をカウントすることにより、生存するＭＮの数を解析した。生存は、栄養素を伴わずに維持された培養物と比較した倍数の増大として測定する。この方法を使用して、Ｙａｎｇおよび同僚は、ケンパウロンという化合物が、ＭＮの健常な生存を延長する目覚ましい能力を有することを発見した。
【０２９８】
本開示で記載されている年齢改変法と、ＨＴＳプラットフォームとを組み合わせることにより、薬物スクリーニングを、遅発性ヒト疾患を表す細胞に対して実施することができる。本開示の方法によれば、適切な年齢マーカーおよび／または成熟マーカーを伴う年齢改変細胞は、体細胞から発生させることもでき、幹細胞から発生させることもできる。例えば、年齢相応のｉＰＳＣ由来のｍＤＡニューロンは、ｉＰＳＣ由来ニューロンを、プロジェリン様タンパク質と接触させることにより発生させることができる。薬物スクリーニングにおける被験細胞を播種して、多様な播種密度および細胞培養容器について調べることができる。例えば、細胞は、６ウェルプレート上、２４ウェルプレート上、９６ウェルプレート上、３８４ウェルプレート上、または薬物スクリーニングを容易とする他の任意のプラットフォーム上に播種することができる。適切なＨＴＳフォーマットを選択したら、栄養素の施与中止の開始時および持続期間も最適化することになろう。
【０２９９】
薬物スクリーニングにおける使用のための分子は、自家製でデザインすることもでき、商業的に入手することもできる、低分子化合物ライブラリーを含む様々な供給源に由来しうる。年齢相応のｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロンの場合、パーキンソン病などの神経変性疾患のための公知の薬物分子であって、生体分子および低分子を含む薬物分子について調べることができる。このような分子を、薬物スクリーニング有効性を最適化するように、異なる細胞密度と組み合わせた、異なる濃度でスクリーニングすることができる。例えば、Ｙａｎｇらは、約５０００の低分子のコレクションについてスクリーニングして、ＡＬＳ薬について探索した。一次スクリーニングのため、各化合物を、３つの濃度（０．１ｍＭ、１ｍＭ、および１０ｍＭ）の２連で調べた。さらに７２時間後（７日目）、ＭＮ細胞を固定し、染色し、生存について評価した（Ｙａｎｇら、同上）。
【０３００】
処置を意図する疾患のほか、これらの化合物／分子の、これらの細胞に対する意図される効果に応じて、候補化合物（低分子であれ、生物学的薬剤であれ）への曝露後における年齢改変細胞の表現型変化を選択することができる。これらの表現型の変化は、とりわけ、細胞の生存、細胞の形態的変化、細胞によるある特定の因子の分泌、ある特定の細胞表面分子の発現、細胞の、他の細胞および／または固体支持体との相互作用、細胞の光学的特性、電気的特性、および化学的特性の変化、細胞の蛍光シグナル（例えば、細胞にＧＦＰ−プロジェリンなどの蛍光タンパク質をトランスフェクトする場合など）、ならびに疾患マーカーの減衰または消失を含むがこれらに限定されない。本開示で記載される方法の１つの適用は、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患にとって鍵となるニューロン細胞の健常な生存を延長しうる薬物についてスクリーニングすることである。したがって、薬物スクリーニングは、ニューロンの生存を促進する化合物を選択するようにデザインすることができる。ＰＤの場合、ｉＰＳＣに由来する年齢改変ｍＤＡニューロンを培養し、播種し、化合物へと曝露し、それらの生存率を評価することができる。さらに、さらなるマーカーを、細胞の生存に加えて、薬物スクリーニングのベースとして活用することもできる。例えば、表２または表３に列挙されたマーカーなどの老化／成熟関連マーカーを、薬物スクリーニングのための基準として使用することができる。１つまたは複数の老化マーカーまたは疾患マーカーの発現を緩徐化しうるか、停止させうるか、または逆転しうる化合物であれば、これらの神経変性疾患を処置する一助となりうる薬物のための候補となりうるであろう。
【０３０１】
ヒットとは、上記で記載した１つまたは複数の年齢関連マーカーシグネチャーまたは疾患関連マーカーシグネチャーを効果的に逆転する化合物／分子として規定することができる。例えば、細胞の生存を評価項目として使用する場合、細胞に適切な形態的特徴を保存しながら、生存細胞（例えば、年齢相応のｉＰＳＣ由来ｍＤＡニューロン）の数を実質的に増大させる分子を選択することができる。
【０３０２】
一次スクリーニングから選択された候補化合物は、任意選択で、再度調べることができ、用量反応アッセイおよび毒性アッセイを含むがこれらに限定されない、さらなる試験下に置くことができる。リード化合物を選択することができ、所望の特徴を改善し、かつ／または副作用を低減するように、構造的に改変することができる。リード化合物に対する他の改善は、吸収の増大、半減期の延長、細胞に対するアフィニティーの増大、ならびに局所送達および／または全身送達の増強を含みうる。リード化合物およびその改変された変異体について、適切な細胞培養物による研究および動物モデル系による研究を含む前臨床研究でさらに研究することができ、好適な治療的プロファイルおよび毒性プロファイルを呈示する化合物は、ヒト臨床試験において、さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ試験下に置くことができる。
【０３０３】
本明細書で引用された全ての参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【数１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ＡＢＣ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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