(57)【要約】      （修正有）【課題】異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法の提供。【解決手段】RNAポリメラーゼII発現のための特別に設計された合成BCL11A標的指向性マイクロRNA、および胎児型ヘモグロビンレベルの発現レベルを上昇させることによって鎌状赤血球症またはサラセミアなどの異常ヘモグロビン症を治療するための使用方法、赤血球、赤血球始原細胞および胚性幹細胞を含む造血細胞および造血前駆細胞における遺伝子治療を達成するための改良された組成物および方法、並びに、造血関連障害を治療するための改良された遺伝子治療方法。【選択図】図２
2019129846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）第1のBCL11Aセグメント、ループセグメント；および
b）5'から3'への方向に直列に並んだ第2のBCL11Aセグメント
を含む合成BCL11AマイクロRNAであって、
該ループセグメントが第1および第2のBCL11Aセグメントの間にあってそれらと直接連結されており、かつ
第1および第2のBCL11Aセグメントが塩基対合してヘアピンループを形成するように第2のBCL11Aセグメントが第1のBCL11Aセグメントに対して相補的であり、該ループセグメントがそのようにして形成されたヘアピンループのループ部分を形成している、
前記合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項２】
第1および第2のBCL11Aセグメントが約18〜25ヌクレオチド長である、請求項1記載の合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項３】
第1のBCL11Aセグメントが、BCL11A mRNA配列に由来する配列を含む、請求項1または2記載の合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項４】
第1のBCL11Aセグメントが第2のBCL11Aセグメントに対して相補的である、請求項1〜3のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項５】
第1のBCL11Aセグメントが5'末端にて-GCGC-で始まり、第2のBCL11Aセグメントが3'末端にて-GCGC-で終わる、請求項1〜4のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項６】
第1のBCL11Aセグメントが、
2019129846.tif 000092
；本明細書に記載のBCL11A miR1オリゴに由来）、
2019129846.tif 000093
；本明細書に記載のBCL11A miR2オリゴに由来）、
2019129846.tif 000094
；本明細書に記載のBCL11A E3オリゴまたはshRNA1またはE3に由来）、
2019129846.tif 000095
；本明細書に記載のshRNA2またはB5に由来）、
2019129846.tif 000096
；本明細書に記載のshRNA4またはB11に由来）、
2019129846.tif 000097
；本明細書に記載のBCL11A D8オリゴまたはshRNA3またはD8に由来）、
2019129846.tif 000098
；本明細書に記載のshRNA5または50D12もしくはD12に由来）、
2019129846.tif 000099
；本明細書に記載のshRNA5または50A5に由来）、
2019129846.tif 000100
；本明細書に記載のshRNA7または50B11に由来）、
2019129846.tif 000101
；本明細書に記載のBCL11A XLC4、shRNA8および50C4に由来）、
2019129846.tif 000102
；本明細書に記載のBCL11A非標的指向性オリゴに由来）、
2019129846.tif 000103
；本明細書に記載のmiR1G5オリゴに由来）、
2019129846.tif 000104
；本明細書に記載のE3G5またはE3 modオリゴまたはshRNA1modに由来）、
2019129846.tif 000105
；本明細書に記載のB5G5またはshRNA2modに由来）、
2019129846.tif 000106
；本明細書に記載のB11G5またはshRNA4modに由来）、
2019129846.tif 000107
；本明細書に記載の50D12G5、D12G4またはshRNA5modに由来）、
2019129846.tif 000108
；本明細書に記載の50A5G5またはshRNA6modに由来）、
2019129846.tif 000109
；本明細書に記載の50B11G5またはshRNA7modに由来）、
2019129846.tif 000110
；本明細書に記載のBCL11A D8G5またはD8 modまたはshRNA3modに由来）、
2019129846.tif 000111
；本明細書に記載のBCL11A C4G5またはC4 modまたはshRNA8modに由来）、
2019129846.tif 000112
；本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来）、および
2019129846.tif 000113
；本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来）からなる群より選択される、
請求項1〜5のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項７】
ループセグメントがマイクロRNAに由来する、請求項1〜6のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項８】
前記マイクロRNAが造血特異的マイクロRNAである、請求項7記載の合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項９】
前記マイクロRNAがmiR223である、請求項8記載の合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項１０】
ループセグメントがctccatgtggtagagである、請求項9記載の合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項１１】
SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
【請求項１２】
対象において請求項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAをインビボで発現させる段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
【請求項１３】
インビボ発現が、対象における胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において起こる、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
請求項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを、対象の胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において発現させる段階であって発現がエクスビボである段階、および該細胞を対象に移植する段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
【請求項１５】
細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させる方法であって、細胞において請求項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを発現させる段階を含み、該細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、前記方法。
【請求項１６】
少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAが、真核細胞における発現のためにプロモーターと機能的に連結されてベクター中に構築されている、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAがRNAIIポリメラーゼから発現される、請求項12〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAがRNAIIIポリメラーゼからは発現されない、請求項12〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
プロモーターが、脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーターからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ベクターがウイルスである、請求項16〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
ウイルスがレンチウイルスである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）、ヒト免疫不全ウイルス2型（HIV-2）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２４】
SEQ ID NO：1のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項２５】
SEQ ID NO：2のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項２６】
SEQ ID NO：3のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項２７】
SEQ ID NO：4のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項２８】
SEQ ID NO：5のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項２９】
SEQ ID NO：6のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
SEQ ID NO：7のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
SEQ ID NO：8のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項３２】
SEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
SEQ ID NO：10のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項３４】
SEQ ID NO：13のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項３５】
SEQ ID NO：14のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項３６】
SEQ ID NO：15のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項３７】
SEQ ID NO：16のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項３８】
SEQ ID NO：17のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項３９】
SEQ ID NO：18のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項４０】
SEQ ID NO：25のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項４１】
SEQ ID NO：26のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項４２】
SEQ ID NO：27のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項４３】
SEQ ID NO：28のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項４４】
SEQ ID NO：29のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項４５】
SEQ ID NO：30のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項４６】
SEQ ID NO：31のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項４７】
SEQ ID NO：33のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項４８】
SEQ ID NO：34のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項４９】
SEQ ID NO：35のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項５０】
SEQ ID NO：36のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項５１】
SEQ ID NO：37のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項５２】
SEQ ID NO：38のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項５３】
SEQ ID NO：39のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項５４】
SEQ ID NO：40のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項５５】
SEQ ID NO：41のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項５６】
SEQ ID NO：42のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項５７】
SEQ ID NO：43のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項５８】
SEQ ID NO：44のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
【請求項５９】
請求項23記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項６０】
脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーターをさらに含む、請求項59記載のベクター。
【請求項６１】
請求項59または60記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６２】
胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、請求項61記載の細胞。
【請求項６３】
赤血球である、請求項61記載の細胞。
【請求項６４】
請求項23記載の単離された核酸分子を含む細菌。
【請求項６５】
請求項23記載の単離された核酸分子を含むウイルス。
【請求項６６】
レンチウイルスである、請求項65記載のウイルス。
【請求項６７】
レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）、ヒト免疫不全ウイルス2型（HIV-2）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）からなる群より選択される、請求項66記載のウイルス。
【請求項６８】
請求項1〜58のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項59もしくは60記載のベクター、請求項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または請求項65〜67のいずれか一項記載のウイルスを含む組成物。
【請求項６９】
請求項59もしくは60記載のベクター、請求項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または請求項65〜67のいずれか一項記載のウイルスを含む組成物。
【請求項７０】
薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項68または69記載の組成物。
【請求項７１】
対象における異常ヘモグロビン症の治療にまたはそれを発症するリスクを減少させるために用いるための、請求項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７２】
対象における異常ヘモグロビン症の治療におけるまたはそれを発症するリスクを減少させるための医薬の製造に用いるための、請求項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７３】
細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるのに用いるための、請求項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７４】
細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、請求項73記載の組成物。
【請求項７５】
請求項1〜58のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項59もしくは60記載のベクター、請求項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または請求項65〜67のいずれか一項記載のウイルスの治療的有効量を対象に投与する段階を含み、それによって対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
【請求項７６】
請求項68〜74のいずれか一項記載の組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含み、それによって対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
【請求項７７】
対象において細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させる段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
【請求項７８】
異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、請求項75〜77のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
異常ヘモグロビン症が鎌状赤血球症またはサラセミアである、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
酸素、ヒドロキシ尿素、葉酸または輸血を含む治療法を対象に施す段階をさらに含む、請求項75〜80のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条（e）の下で、2014年4月25日に提出された米国仮出願第61／984,247号、および2014年10月21日に提出された米国仮出願第62／066,783号の恩典を主張している国際出願であり、各出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の援助
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与された助成金番号：5U01HL117720-03の下で、米国政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本明細書において開示される態様は、異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法に関する。より詳細には、これらの態様は、内因性BCL11Aの選択的ノックダウンによって細胞内の胎児型ヘモグロビンを増加させる組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
鎌状赤血球症／鎌状赤血球貧血（SCD）およびサラセミア（THAL）を含む異常ヘモグロビン症は、ヒトにおいて最も有病率の高い遺伝性単一遺伝子病である。世界人口のおよそ5％が、グロビン遺伝子の突然変異を保有している。世界保健機構（World Health Organization）は、毎年約300,000人の幼児が重大なヘモグロビン障害を伴って生まれると推定している。SCDはサハラ以南アフリカ、インド、サウジアラビアおよび地中海諸国出身の集団に分離しており、これらの地域では全小児の最大2％がこの病状を伴って生まれるが、これはヘテロ接合性鎌状β-グロビン（βS）突然変異によって付与される、マラリア伝染に対する生存優位性のためである（WHO Report on Sickle-cell anaemia - A59.9. Fifty-ninth World Health Assembly - Provisional agenda item 114: United Nations; 2006:1-5（非特許文献1））。長い歴史のある移住および／または最近の移住が原因となって、今では先進諸国で見いだされる患者集団の数が増加しており、SCDの公衆衛生面での影響は重大である（Kauf et al., American Journal of Hematology. 2009;84:323-327（非特許文献2）；Amendah et al., American Journal of Preventive Medicine. 2010;38:S550-556（非特許文献3））。米国では1994年に、異常ヘモグロビン症を有する患者の生存期間中央値が男性では42年、女性では48年であると推定されている（Piatt et al., New England Journal of Medicine. 1994;330:1639-1644（非特許文献4））。分子レベルでは、SCDは分子変更と関連づけられることになった最初の疾患である（Pauling et al., Science. 1949;10:543-548（非特許文献5））。単一ヌクレオチドの突然変異により、β-グロビンタンパク質の位置6にあるグルタミン酸のバリンへの置換がもたらされる。この改変は、脱酸素条件下でのこの分子の重合およびそれに続く赤血球の「鎌状化」をもたらし、これは最終的には、溶血による貧血、ならびに腎臓、脳、肺などを含む複数の臓器に影響を及ぼす急性および慢性の血管閉塞性および虚血性合併症を招く。予防的手段（化学的予防薬であるヒドロキシ尿素を含む）により、特定の患者群では苦難の中程度の減少が得られているものの、現時点でSCDに対して利用しうる根治療法は同種異系造血幹細胞移植（HSCT）のみである（Hsieh et al., New England Journal of Medicine. 2009;361:2309-2317（非特許文献6）；Hsieh et al., Blood；Electronic pre-publication June 31, 2011（非特許文献7））。HSCTは残念ながら、SCDおよびTHALの状況では有意な死亡および病的状態を伴い、それは一部には、とりわけ、HSCT前の輸血に関連した鉄過剰、移植片対宿主病、および宿主の移植前状態調節のために必要な高用量の化学療法／放射線照射に起因する。
【０００５】
新たな分子療法も開発中である。例えば、米国特許第8,383,604号（特許文献1）は、BCL11Aが発生過程におけるグロビン遺伝子の重要な調節因子であることを記述している。特に、BCL11Aは、胎児発生過程における胎児型ヘモグロビン遺伝子の発現から成人型ヘモグロビン遺伝子の発現への移行切り換えを促進する。BCL11Aの抑制は、この移行切り換えを減少させ、胎児発生後にも胎児型ヘモグロビン遺伝子の有意に高い発現を維持させる。発現される胎児型ヘモグロビン遺伝子の量がより多いことにより、さまざまな異常ヘモグロビン症に伴う症状が改善される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第8,383,604号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】WHO Report on Sickle-cell anaemia - A59.9. Fifty-ninth World Health Assembly - Provisional agenda item 114: United Nations; 2006:1-5
【非特許文献２】Kauf et al., American Journal of Hematology. 2009;84:323-327
【非特許文献３】Amendah et al., American Journal of Preventive Medicine. 2010;38:S550-556
【非特許文献４】Piatt et al., New England Journal of Medicine. 1994;330:1639-1644
【非特許文献５】Pauling et al., Science. 1949;10:543-548
【非特許文献６】Hsieh et al., New England Journal of Medicine. 2009;361:2309-2317
【非特許文献７】Hsieh et al., Blood；Electronic pre-publication June 31, 2011
【発明の概要】
【０００８】
概要
特に例示的な態様において、本発明は、一部には、赤血球、赤血球始原細胞および胚性幹細胞を含む造血細胞および造血前駆細胞における遺伝子治療を達成するための改良された組成物および方法を提供する。本発明はさらに、造血関連障害を治療するための改良された遺伝子治療方法を提供する。
【０００９】
その目標は、形質導入された生着可能な造血幹細胞に由来する細胞において、BCL11Aを効率的にノックダウンすることである。γ-グロビンの誘導、ならびにそれ故に同時に起こるHbFの増加および突然変異体HbSの減少が成功するかどうかは、BCL11A転写物およびタンパク質の量的減少に依存する。本発明者らは、BCL11A shRNAをmir223ループ中に埋め込んだ。このアプローチにより、BCL11A shRNAが、ポリメラーゼIIIプロモーターではなくポリメラーゼII（pol II）プロモーターを介して転写されることが可能になる。これにより、マイクロRNAバイオジェネシス経路を利用して、生着可能なHSCにおけるBCL11A発現を標的とするsiRNAを作製することが可能になる。レンチウイルス導入遺伝子は、一次マイクロRNA（pri-miRNA）を模倣し、内因性マイクロプロセッサー（Microprocessor）複合体およびダイサー（Dicer）複合体によって逐次的にプロセシングを受けて、BCL11AメッセンジャーRNA（mRNA）に対して相補的な配列を有する低分子干渉性RNA（siRNA）を生じるshRNAを発現するように操作される。
【００１０】
1つの局面において、形質導入された生着可能な造血幹細胞に由来する細胞においてBCL11Aを効率的にノックダウンする組成物および方法が提供される。1つの態様において、BCL11A転写物およびタンパク質の量的減少により、γ-グロビン産生が誘導され、それ故にHbFの増加および突然変異体HbSの減少が起こる。1つの特定の態様において、BCL11A shRNAはmir223ループ中に埋め込まれる。特定の態様において、レンチウイルスは、pri-miRNAを模倣し、内因性マイクロプロセッサー複合体およびダイサー複合体によって逐次的にプロセシングを受けて、BCL11A mRNAに対して相補的な配列を有するsiRNAを生じるshRNAを発現するように操作される。
【００１１】
したがって、さまざまな例示的な態様において、本明細書は、一部には、第1のBCL11Aセグメント、ループセグメント、および5'から3'への方向に直列に並んだ第2のBCL11Aセグメントを含む合成BCL11AマイクロRNAであって、ループセグメントが第1および第2のBCL11Aセグメントの間にあってそれらと直接連結されており、かつ、第1および第2のBCL11Aセグメントが塩基対合してヘアピンループを形成するように第2のBCL11Aセグメントが第1のBCL11Aセグメントに対して相補的であり、ループセグメントがそのようにして形成されたヘアピンループのループ部分を形成している、前記合成BCL11AマイクロRNAを提供する。
【００１２】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1および第2のBCL11Aセグメントは約18〜25ヌクレオチド長である。第1のBCL11AセグメントはBCL11A配列に由来し、かつ二重鎖siRNAへのshRNAプロセシング中にパッセンジャー鎖を生じ、第2のBCL11Aセグメントは第1のBCL11Aセグメントに対して相補的であり、ここで第2のBCL11Aセグメントはガイド鎖を生じ、それはRNA干渉またはBCL11A遺伝子サイレンシングのためのRNA干渉特異性複合体（RISC）に組み入れられる。
【００１３】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1および第2のBCL11Aセグメントは、BCL11A mRNA配列に由来する配列を含む。
【００１４】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1のBCL11Aセグメントは5'末端にて-GCGC-で始まり、第2のBCL11Aセグメントは3'末端にて-GCGC-で終わる。
【００１５】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1のBCL11Aセグメントはさらに、5'末端が-GCGC-からなり、第2のBCL11Aセグメントは3'末端にて-GCGC-で終わる。
【００１６】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1のBCL11Aセグメントは5'末端にて-GCGA-、-TCTG-、または-TG-で始まり、第2のBCL11Aセグメントは第1のBCL11Aセグメントに対して相補的である。
【００１７】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1のBCL11Aセグメントはさらに、5'末端が-GCGA-、-TCTG-、または-TG-からなる。
【００１８】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第2のBCL11Aセグメントは3'末端にて-TTTT-で終わる。
【００１９】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、合成BCL11AマイクロRNAは、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、合成BCL11AマイクロRNAは、本開示に記載されたもの由来のヌクレオチド配列またはセグメントを含む。
【００２１】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、合成BCL11AマイクロRNAは、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる。
【００２２】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、合成BCL11AマイクロRNAは、本質的に、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる。
【００２３】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1のBCL11Aセグメントは、
2019129846.tif 000003
；本明細書に記載のBCL11A miR1オリゴに由来）、
2019129846.tif 000004
；本明細書に記載のBCL11A miR2オリゴに由来）、
2019129846.tif 000005
；本明細書に記載のBCL11A E3オリゴまたはshRNA1またはE3に由来）、
2019129846.tif 000006
；本明細書に記載のshRNA2またはB5に由来）、
2019129846.tif 000007
；本明細書に記載のshRNA4またはB11に由来）、
2019129846.tif 000008
；本明細書に記載のBCL11A D8オリゴまたはshRNA3またはD8に由来）、
2019129846.tif 000009
；本明細書に記載のshRNA5または50D12もしくはD12に由来）、
2019129846.tif 000010
；本明細書に記載のshRNA5または50A5に由来）、
2019129846.tif 000011
；本明細書に記載のshRNA7または50B11に由来）、
2019129846.tif 000012
；本明細書に記載のBCL11A XLC4、shRNA8および50C4に由来）、
2019129846.tif 000013
；本明細書に記載のBCL11A非標的指向性オリゴに由来）、
2019129846.tif 000014
；本明細書に記載のmiR1G5オリゴに由来）、
2019129846.tif 000015
；本明細書に記載のE3G5またはE3 modオリゴまたはshRNA1modに由来）、
2019129846.tif 000016
；本明細書に記載のB5G5またはshRNA2modに由来）、
2019129846.tif 000017
；本明細書に記載のB11G5またはshRNA4modに由来）、
2019129846.tif 000018
；本明細書に記載の50D12G5、D12G4またはshRNA5modに由来）、
2019129846.tif 000019
；本明細書に記載の50A5G5またはshRNA6modに由来）、
2019129846.tif 000020
；本明細書に記載の50B11G5またはshRNA7modに由来）、
2019129846.tif 000021
；本明細書に記載のBCL11A D8G5またはD8 modまたはshRNA3modに由来）、
2019129846.tif 000022
；本明細書に記載のBCL11A C4G5またはC4 modまたはshRNA8modに由来）、
2019129846.tif 000023
；本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来）、および
2019129846.tif 000024
；本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来）からなる群より選択される。
【００２４】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、ループセグメントはマイクロRNAに由来する。1つの態様において、マイクロRNAは造血特異的マイクロRNA、例えば、miR-142、miR-155、miR-181およびmiR-223である。
【００２５】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、マイクロRNAはmiR223である。
【００２６】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、ループセグメントはctccatgtggtagag（SEQ ID NO：68）である。
【００２７】
したがって、1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを提供する。
【００２８】
したがって、1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含む組成物を提供する。
【００２９】
したがって、1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含むベクターを少なくとも含む組成物を提供する。
【００３０】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：1のヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：2のヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：3のヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：4のヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：5のヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：6のヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：7のヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：8のヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：10のヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：13のヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：14のヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：15のヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：16のヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：17のヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：18のヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：25のヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：26のヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：27のヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：28のヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：29のヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：30のヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：31のヌクレオチド配列を含む。
【００５３】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：32のヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：33のヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：34のヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：35のヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：36のヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：37のヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：38のヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：39のヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：40のヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：41のヌクレオチド配列を含む。
【００６３】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：42のヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：43のヌクレオチド配列を含む。
【００６５】
記載されたいずれかの単離された核酸分子の1つの態様において、分子はSEQ ID NO：44のヌクレオチド配列を含む。
【００６６】
1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含むベクターを提供する。
【００６７】
記載されたいずれかのベクターの1つの態様において、ベクターは、脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーターをさらに含む。プロモーターは、その中の核酸分子またはその中の合成BCL11AマイクロRNAの標的を定めた発現をもたらす。
【００６８】
1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００６９】
本明細書に記載のいずれかの宿主細胞の1つの態様において、宿主細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞、または造血始原細胞である。1つの態様において、宿主細胞は対象から単離される。1つの態様において、宿主細胞は、異常ヘモグロビン症を有すると診断された対象から単離される。診断は、当技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、遺伝子検査によって、RT-PCRによって、および血液細胞診によって行うことができる。
【００７０】
本明細書に記載のいずれかの宿主細胞の1つの態様において、宿主細胞は赤血球である。
【００７１】
1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子もしくは本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含むベクターまたは細菌を含む宿主細胞を提供する。
【００７２】
1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含むウイルスを含む宿主細胞を提供する。
【００７３】
本明細書に記載のいずれかのウイルスまたはベクターの1つの態様において、ウイルスはレンチウイルスである。
【００７４】
本明細書に記載のいずれかのベクターまたはウイルスの1つの態様において、レンチウイルスは、以下からなる群より選択される：ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）、ヒト免疫不全ウイルス2型（HIV-2）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）。
【００７５】
したがって、1つの局面において、本明細書は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞を、本明細書に記載の組成物の有効量、または少なくとも、本明細書に記載の単離された核酸分子の有効量と接触させる段階を含む、細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるための方法であって、それによって胎児型ヘモグロビンの発現が、細胞またはその子孫において、そのような接触の前の細胞に比して増加する方法を提供する。いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含む、少なくとも1種類のベクターまたは細胞を含む。1つの態様において、本方法は、接触のための幹細胞または始原細胞の試料を用意する段階をさらに含む。1つの態様において、細胞の試料はCD34+選択細胞を含む。1つの態様において、組成物は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列の混合物を含む。例えば、組成物は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択される2〜5種類のヌクレオチド配列を含む。例えば、組成物は、SEQ ID NO：34、37、39、41および43を含む。
【００７６】
1つの局面において、本明細書は、対象における異常ヘモグロビン症、例えばSCDおよびTHALを治療するか、またはそれが発症するリスクを低下させる方法を提供する。本方法は、対象または個体の造血幹細胞におけるBCL11A遺伝子の選択的ノックダウンを含みうる。これらの対象は、異常ヘモグロビン症を発症するリスクがある。
【００７７】
記載されたいずれかの方法の1つの態様において、造血幹細胞におけるBCL11A遺伝子の選択的ノックダウンは、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を用いること、またはSEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列のいずれか1つを含む核酸分子もしくは本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含むベクター（例えば、ウイルスベクター）を用いることを含む。
【００７８】
記載されたいずれかの方法の1つの態様において、造血幹細胞におけるBCL11A遺伝子の選択的ノックダウンは、造血幹細胞を、少なくとも、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含む組成物と、または少なくとも、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列のいずれか1つを含む核酸分子もしくは本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含むベクター（例えば、ウイルスベクター）を含む組成物と接触させることを含む。1つの態様において、造血幹細胞は接触の前に単離される。
【００７９】
記載されたいずれかの方法の1つの態様において、造血幹細胞におけるBCL11A遺伝子の選択的ノックダウンは、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで起こる。1つのさらなる態様において、選択的ノックダウンの標的とされる造血始原細胞は赤血球系列のものである。
【００８０】
記載されたいずれかの方法の1つの態様において、造血幹細胞と本明細書に記載の組成物のいずれかとの接触は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで起こる。1つのさらなる態様において、接触される造血始原細胞は赤血球系列のものである。
【００８１】
記載されたいずれかの方法の1つの態様において、造血幹細胞と本明細書に記載の組成物のいずれかとの接触は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで起こる。
【００８２】
記載されたいずれかの方法の他の態様において、BCL11A遺伝子の選択的ノックダウンは、造血幹細胞または造血始原細胞に加えて、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞でも起こる。1つの態様においては、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞または骨髄細胞を、記載された組成物と接触させる。胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞または骨髄細胞は、接触の前に単離される。1つの態様において、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞または骨髄細胞と本明細書に記載の組成物のいずれかとの接触は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで起こる。
【００８３】
記載されたいずれかの方法の他の態様において、造血幹細胞は、末梢血、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤血または骨髄から収集される。
【００８４】
記載されたいずれかの方法の他の態様において、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞または骨髄細胞は、末梢血、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤血または骨髄から収集される。
【００８５】
1つの局面において、本明細書は、本明細書に記載の1種類もしくは複数種類の単離された核酸分子、本明細書に記載のウイルスもしくはベクター、または本明細書に記載の細胞の治療的有効量を対象に投与し、それによって対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法であって、ウイルス、ベクターまたは細胞が、少なくとも、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1種類の核酸分子、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含む、前記方法を提供する。例えば、本明細書に記載の1種類もしくは複数種類の単離された核酸分子、本明細書に記載のウイルスもしくはベクター、または本明細書に記載の細胞の有効量を、対象の骨髄内に直接的に注入する。
【００８６】
1つの局面において、本明細書は、インビトロまたはエクスビボで、造血幹細胞の集団を、本明細書に記載の組成物と、または少なくとも、本明細書に記載の1種類もしくは複数種類の単離された核酸分子、本明細書に記載のウイルスもしくはベクターと接触させる段階、および接触された造血幹細胞またはその子孫細胞を対象に移植するかまたは投与する段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法を提供する。1つの態様において、接触された造血幹細胞または子孫細胞は対象において生着する。1つの態様においては、接触された造血幹細胞またはその子孫細胞は、接触された細胞の生着を促進するために、プロスタグランジンE2および／または抗酸化物質N-アセチル-L-システイン（NAC）とともに移植される。
【００８７】
1つの局面において、本明細書は、本明細書に記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを対象の胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において発現させる段階であって発現がエクスビボまたはインビトロである段階、および該細胞を対象に移植または投与する段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法を提供する。
【００８８】
1つの局面において、本明細書は、本明細書に記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを対象の胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において発現させる段階であって発現がエクスビボまたはインビトロまたはインビボである段階を含む、細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるための方法を提供する。1つの態様において、発現は、細胞を、本明細書に記載の組成物の有効量、または少なくとも、本明細書に記載の単離された核酸分子の有効量と接触させることによる。
【００８９】
1つの局面において、本明細書は、本明細書に記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを対象の胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において発現させる段階であって、発現がエクスビボまたはインビトロまたはインビボである段階を含む、細胞によって発現されるBCL11Aレベルを低下させるための方法を提供する。1つの態様において、発現は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞を、本明細書に記載の組成物の有効量、または少なくとも、本明細書に記載の単離された核酸分子の有効量と接触させ、それによって胎児型ヘモグロビンの発現が、細胞またはその子孫において、そのような接触の前の細胞に比して増加する段階を含む。いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含む、少なくとも1種類のベクターまたは細胞を含む。
【００９０】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つのさらなる態様において、接触される造血幹細胞または造血始原細胞は赤血球系列のものである。
【００９１】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、造血幹細胞または造血始原細胞は、末梢血、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤血または骨髄から収集される。
【００９２】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つのさらなる態様において、レシピエント対象は、接触またはトランスフェクションを受けた細胞の移植の前に、化学療法および／または放射線照射による治療を受ける。
【００９３】
1つの態様において、化学療法および／または放射線照射は、移植された細胞の生着を助長するために内因性幹細胞を減少させることを目的とする。
【００９４】
1つの局面において、本明細書は、造血幹細胞を対象から用意する段階、インビトロまたはエクスビボで、該造血幹細胞を、本明細書に記載の組成物と、または本明細書に記載の少なくとも1種類もしくは複数種類の単離された核酸分子、本明細書に記載のウイルスまたはベクターと接触させる段階、および接触された造血幹細胞を同じ対象に戻して移植または再投与する段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法を提供する。1つの態様において、接触された造血幹細胞または子孫細胞は対象において生着する。
【００９５】
いずれかの方法の1つの局面において、接触された造血幹細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、またはそれらの子孫細胞は、レシピエント対象におけるその後の生着を促進するために、エクスビボで、プロスタグランジンE2および／または抗酸化物質N-アセチル-L-システイン（NAC）によって処理される。
【００９６】
いずれかの方法の1つの局面において、造血幹細胞または宿主細胞の集団は、異常ヘモグロビン症を発症するリスクがある対象、または異常ヘモグロビン症を有すると診断された対象から入手される。
【００９７】
いずれかの方法の1つの局面において、造血幹細胞の集団は、対象にとって自己由来性または同種異系性である。
【００９８】
いずれかの方法の1つの局面において、造血幹細胞または宿主細胞の集団は、本明細書に記載の組成物と、または本明細書に記載の少なくとも1種類もしくは複数種類の単離された核酸分子、本明細書に記載のウイルスもしくはベクターと接触させる前に、エクスビボにて培養下で拡大される。
【００９９】
いずれかの方法の1つの局面において、造血幹細胞または宿主細胞の集団は、本明細書に記載の組成物と、または本明細書に記載の少なくとも1種類もしくは複数種類の単離された核酸分子、本明細書に記載のウイルスもしくはベクターと接触させた後に、エクスビボにて培養下で拡大される。
【０１００】
いずれかの方法の1つの局面において、接触された造血幹細胞または宿主細胞の集団は、対象に移植する前に、エクスビボにて培養下で予備分化させられる。
【０１０１】
いずれかの方法の1つの局面において、接触された造血幹細胞は、対象に投与する前に、インビトロまたはエクスビボにて拡大される。いずれかの方法の1つの局面において、接触された造血幹細胞は、対象に投与する前に凍結保存される。いずれかの方法のもう1つの局面において、接触された造血幹細胞は、対象に投与する前に、インビトロまたはエクスビボにて拡大されて、凍結保存される。いずれかの方法のもう1つの局面において、接触された造血幹細胞は、凍結保存の後、対象に投与する前にインビトロまたはエクスビボにて拡大される。
【０１０２】
いずれかの方法の1つの局面において、対象はヒトである。いずれかの方法の1つの局面において、対象は異常ヘモグロビン症を有すると診断されている。
【０１０３】
いずれかの方法の1つの局面において、本方法は、異常ヘモグロビン症を有すると診断された対象、または異常ヘモグロビン症を発症するリスクがある対象を選択する段階をさらに含む。
【０１０４】
いずれかの方法の1つの局面において、異常ヘモグロビン症は鎌状赤血球症（SCD）またはサラセミア（THAL）、例えば、β-サラセミアである。
【０１０５】
本方法の1つの局面において、本方法は、酸素、ヒドロキシ尿素、葉酸または輸血を含む治療法を対象に施す段階をさらに含む。
【０１０６】
1つの局面において、本明細書は、対象において本明細書に記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAをインビボで発現させる段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法を提供する。
【０１０７】
いずれかの方法の1つの局面において、インビボ発現は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において起こる。
【０１０８】
いずれかの方法の1つの局面において、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞は、対象にとって自己由来性または同種異系性である。
【０１０９】
いずれかの方法の1つの局面において、本明細書に記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを発現する胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞は、対象に投与する前に、インビトロまたはエクスビボにて拡大される。1つのさらなる態様において、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞および造血始原細胞は赤血球系列のものである。
【０１１０】
いずれかの方法の1つの局面において、本明細書に記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを発現する胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞は、対象に投与する前に凍結保存される。
【０１１１】
いずれかの方法のもう1つの局面において、本明細書に記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを発現する胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞は、対象に投与する前に、インビトロまたはエクスビボにて拡大されて、凍結保存される。
【０１１２】
いずれかの方法のもう1つの局面において、本明細書に記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを発現する胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞は、凍結保存の後、対象に投与する前にインビトロまたはエクスビボにて拡大される。
【０１１３】
いずれかの方法の1つの局面において、少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAは、真核細胞における発現のためにプロモーターと機能的に連結されてベクター中に構築される。
【０１１４】
いずれかの方法の1つの局面において、少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAは、RNAIIポリメラーゼから発現される。
【０１１５】
いずれかの方法の1つの局面において、少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAは、RNAIIIポリメラーゼからは発現されない。
【０１１６】
いずれかの方法の1つの局面において、プロモーターは、脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーター、または造血特異的プロモーターからなる群より選択される。
【０１１７】
いずれかの方法の1つの局面において、ベクターはウイルスである。
【０１１８】
いずれかの方法の1つの局面において、ウイルスはレンチウイルスである。
【０１１９】
いずれかの方法の1つの局面において、レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）、ヒト免疫不全ウイルス2型（HIV-2）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）からなる群より選択される。
【０１２０】
いずれかの方法の1つの局面において、対象は動物、ヒトまたは非ヒト、および齧歯動物または非齧歯動物である。例えば、対象は任意の哺乳動物、例えば、ヒト、他の霊長動物、ブタ、マウスもしくはラットなどの齧歯動物、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジもしくはヤギ、または鳥類などの非哺乳動物であってよい。
【０１２１】
いずれかの方法の1つの局面において、本方法は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞の試料または集団を対象から得る段階を含む。
【０１２２】
1つの態様において、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞、造血始原細胞は、宿主対象から単離され、トランスフェクトされ、培養されて（任意）、同じ宿主に戻して移植され、すなわち自己由来性細胞移植片となる。もう1つの態様において、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞は、異常ヘモグロビン症を有すると診断されたか、またはそれを発症するリスクのある宿主（レシピエント）とHLA型が一致するドナーから単離される。ドナー-レシピエントの抗原型マッチングは当技術分野において周知である。HLA型には、HLA-A、HLA-B、HLA-CおよびHLA-Dが含まれる。これらは、移植のために必要とされる最小限の数の抗原マッチングである。すなわち、トランスフェクトされた細胞は、異なる宿主、すなわちレシピエント宿主対象にとって同種異系性である宿主に移植される。ドナーまたは対象の胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞に本明細書に記載の核酸分子を含むベクターまたは核酸をトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を培養で拡大させて、続いて宿主対象に移植することができる。1つの態様において、移植された細胞は宿主対象に生着する。また、トランスフェクトされた細胞をトランスフェクションおよび貯蔵の後に凍結保存すること、または細胞を増やした後に凍結保存して貯蔵することもできる。
【０１２３】
本明細書で用いる場合、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させるとは、異常ヘモグロビン症の少なくとも1つの症状を改善することを意味する。1つの局面において、本発明は、対象における異常ヘモグロビン症を治療する、例えば、その重症度または進行を低下させる方法を特徴とする。もう1つの局面において、本方法はまた、対象における異常ヘモグロビン症を発症するリスクを減少させるため、対象における異常ヘモグロビン症の症状の発現を遅らせるため、または異常ヘモグロビン症を有する対象の寿命を延長するために用いることもできる。1つの局面において、本方法は、対象を、それらが異常ヘモグロビン症を有するか、または異常ヘモグロビン症を発症するリスクはあるがまだそれを有してはいないか、または基礎疾患として異常ヘモグロビン症を有する対象であるかに基づいて選択する段階を含みうる。対象の選択には、異常ヘモグロビン症の症状の検出、血液検査、遺伝子検査、または診療記録が含まれうる。検査の結果によって対象が異常ヘモグロビン症を有することが指し示される場合には、本方法はまた、本明細書に記載の組成物を投与して、それによって対象、例えば、電気泳動によって遺伝子型HbSS、HbS／β0サラセミア、HbSD、またはHbSO、および／またはHbFが10％未満であるSCDと診断された対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる段階も含みうる。
【０１２４】
本明細書で用いる場合、「異常ヘモグロビン症」という用語は、血中の異常ヘモグロビン分子の存在を伴う病状のことを指す。異常ヘモグロビン症の例には、SCDおよびTHALが非限定的に含まれる。また、異常ヘモグロビンの組み合わせが血中に存在する異常ヘモグロビン症も含まれる（例えば、鎌状細胞／Hb-C症）。そのような疾患の例示的な例には、SCDおよびTHALが非限定的に含まれる。SCDおよびTHALならびにそれらの症状は当技術分野において周知であり、以下にさらに詳細に説明する。対象は、その対象が異常ヘモグロビン症を有すると認識する、理解する、認める、決定する、結論づける、考える、または決断する医療提供者、医療介護者、医師、看護師、家族または知人によって、異常ヘモグロビン症を有すると診断されうる。
【０１２５】
「SCD」という用語は、本明細書において、赤血球の鎌状化の結果として起こる、あらゆる症候性貧血病状を含むと定義される。SCDの症状発現には以下が含まれる：貧血；疼痛；および／または臓器機能不全、例えば腎不全、網膜症、急性胸部症候群、虚血、持続勃起、および脳卒中。本明細書で用いる場合、「SCD」という用語は、SCDに、特にHbSにおける鎌状細胞置換に関してホモ接合性である対象に付随する種々の臨床的問題のことを指す。本明細書においてSCDという用語の使用によって言及される体質性症状発現には、成長および発達の遅れ、重篤感染症、特に肺炎球菌に起因するものを発症する傾向が大きくなること、脾機能の著明な障害、循環血中細菌の有効な排除が妨げられること、さらに脾組織の再発性梗塞および最終的な破壊がある。また、「SCD」という用語には、主として腰椎、腹部および大腿骨骨幹部が罹患し、機序および重症度の点で類似している、筋骨格痛の急性発作も含まれる。成人では、そのような発作は、数週間毎または数カ月毎に起こる短期間の軽度または中等度の発作として現れることが多く、その合間に1年に平均約1回ほど、5〜7日間続く苦痛を伴う発作が起こる。そのような急性発作の引き金になることが知られている事象には、アシドーシス、低酸素症および脱水があり、これらはすべてHbSの細胞内重合を増強する（J. H. Jandl, Blood: Textbook of Hematology, 2nd Ed., Little, Brown and Company, Boston, 1996, pages 544-545）。
【０１２６】
本明細書で用いる場合、「THAL」とは、ヘモグロビンの産生不全を特徴とする遺伝性障害のことを指す。1つの態様において、この用語は、ヘモグロビンの合成に影響を及ぼす突然変異が原因で起こる遺伝性貧血を範囲に含む。他の態様において、この用語は、重症サラセミアまたはβ-サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、ヘモグロビンH症などのα-サラセミアといったサラセミア性病状に起因する、あらゆる症候性貧血を含む。β-サラセミアはβ-グロビン鎖における突然変異によって引き起こされ、重症型または軽症型として起こりうる。重症型のβ-サラセミアでは、小児は出生時には正常であるが、生後1年までの間に貧血を発症する。軽症型のβ-サラセミアでは小さな赤血球が生じる。α-サラセミアは、グロビン鎖からの1つまたは複数の遺伝子の欠失によって引き起こされる。
【０１２７】
「疾患を発症するリスク」という語句は、対照の対象または集団（例えば、健常な対象または集団）と比較して、対象が異常ヘモグロビン症を発症すると考えられる相対的確率を意味する。例えば、個体がSCDと関連のある遺伝子突然変異であるβ-グロビン遺伝子のA→T突然変異を保有し、その個体がその突然変異に関してヘテロ接合性またはホモ接合性であれば、その個体のリスクは増加する。
【０１２８】
「阻害性RNA」という用語は、標的核酸のレベルまたは活性の低下を媒介する、標的核酸（例えば、標的マイクロRNA）に対して相補的な配列を含む核酸分子を含むことを意味している。阻害性RNAの非限定的な例には、干渉性RNA、shRNA、siRNA、リボザイム、アンタゴmir（antagomir）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。阻害性RNAを作製するための方法は本明細書に記載されている。阻害性RNAを作製するそのほかの方法も当技術分野において公知である。1つの態様において、本明細書に記載のBCL11AマイクロRNAは、BCL11A mRNAの活性の低下を引き起こす阻害性RNAである。
【０１２９】
本明細書で用いる場合、「干渉性RNA」とは、RNA干渉を媒介することによって、直接的または間接的に（すなわち、変換後に）遺伝子発現を阻害またはダウンレギュレートすることができる、あらゆる二本鎖または一本鎖RNA配列のことを指す。干渉性RNAには、低分子干渉性RNA（「siRNA」）および低分子ヘアピン型RNA（「shRNA」）が非限定的に含まれる。「RNA干渉」は、配列適合性メッセンジャーRNAの選択的分解のことを指す。
【０１３０】
本明細書で用いる場合、「shRNA」（低分子ヘアピン型RNA）とは、アンチセンス領域、ループ部分およびセンス領域を含むRNA分子のことを指し、ここでセンス領域は、アンチセンス領域と塩基対合して二重鎖ステムを形成する相補的ヌクレオチドを有する。転写後プロセシングの後に、低分子ヘアピン型RNAは、RNアーゼIIIファミリーのメンバーである酵素ダイサーによって媒介される切断イベントにより、低分子干渉性RNAに変換される。本明細書で用いる場合、「転写後プロセシング」という語句は、転写後に起こり、例えば、酵素ダイサーおよび／またはドローシャ（Drosha）によって媒介されるmRNAプロセシングのことを指す。
【０１３１】
本明細書で用いる「低分子干渉性RNA」または「siRNA」とは、配列特異的な様式でRNA干渉を媒介することによって遺伝子発現を阻害またはダウンレギュレートすることができる、あらゆる低分子RNA分子のことを指す。小型RNAは、例えば、約18〜21ヌクレオチド長であってよい。各siRNA二重鎖は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖によって形成される。エンドヌクレアーゼであるアルゴノート2（Argonaute 2）（Ago 2）は、siRNA二重鎖の巻き戻しを触媒する。巻き戻されると、ガイド鎖はRNA干渉特異性複合体（RISC）に組み入れられ、一方でパッセンジャー鎖は遊離される。RISCはガイド鎖を用いて、標的mRNAのエンドヌクレアーゼ切断につながる相補的配列を有するmRNAを見いだす。
【０１３２】
レトロウイルスとは、その複製サイクルの間に逆転写酵素を利用するRNAウイルスである。「レトロウイルス」という用語は、あらゆる公知のレトロウイルス（例えば、c型レトロウイルス、例えば、モロニーマウス肉腫ウイルス（MoMSV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、ネコ白血病ウイルス（FLV）、スプマウイルス、フレンドマウス幹細胞ウイルス（MSCV）およびラウス肉腫ウイルス（RSV）など）のことを指す。また、本発明の「レトロウイルス」には、ヒトT細胞白血病ウイルスであるHTLV-1およびHTLV-2、ならびにレンチウイルスファミリーのレトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルスであるHIV-1、HIV-2、サル免疫不全ウイルス（SW）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウマ免疫不全ウイルス（EIV）、ならびに他のクラスのレトロウイルスも含まれる。
【０１３３】
レトロウイルスのゲノムRNAは、逆転写酵素によって二本鎖DNAに変換される。この二本鎖DNA形態のウイルスは、感染細胞の染色体に組み込まれうる；ひとたび組み込まれると、それは「プロウイルス」と称される。プロウイルスはRNAポリメラーゼIIのテンプレートとしての役を果たし、新たなウイルス粒子の産生のために必要とされる構造タンパク質および酵素をコードするRNA分子の発現を誘導する。
【０１３４】
プロウイルスの各末端には、「長い末端反復配列」または「LTR」と呼ばれる構造がある。「長い末端反復配列（LTR）」という用語は、その天然の配列構成では直接反復配列であり、かつU3領域、R領域およびU5領域を含む、レトロウイルスDNAの末端に位置する塩基対のドメインのことを指す。LTRは一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写物の促進、開始、およびポリアデニル化）およびウイルス複製の基礎となる機能をもたらす。LTRは、転写調節エレメント、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製および組み込みのために必要な配列を含む、多数の調節シグナルを含む。ウイルスLTRは、U3、R、およびU5と呼ばれる3つの領域に分けられる。U3領域はエンハンサーエレメントおよびプロモーターエレメントを含む。U5領域はプライマー結合部位とR領域との間の配列であり、ポリアデニル化配列を含む。R（反復）領域は、U3領域とU5領域に挟まれている。U3領域、R領域およびU5領域で構成されるLTRは、ウイルスゲノムの5'末端および3'末端の両方に出現する。本発明の1つの態様において、5'LTRを含むLTR内のプロモーターは、異種プロモーターに置き換えられる。用いうる異種プロモーターの例には、例えば、脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）プロモーター、テトラサイクリン誘導性（TET）プロモーター、β-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーター（LCR）、ならびにサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターが含まれる。
【０１３５】
「レンチウイルス」という用語は、緩徐に進展する疾患を生じさせるレトロウイルスの群（または属）のことを指す。この群に含まれるウイルスには、ヒト後天性免疫不全症候群（AIDS）の病原体であるHIV（ヒト免疫不全ウイルス；HIV 1型およびHIV 2型を含む）；ヒツジにおいて脳炎（ビスナ）または肺炎（マエディ）を引き起こすビスナ・マエディ、ヤギにおいて免疫欠損、関節炎、および脳症を引き起こすヤギ関節炎脳炎ウイルス；ウマにおいて自己免疫性溶血性貧血および脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス；ネコにおいて免疫欠損を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（FIV）；ウシにおいてリンパ節症、リンパ球増加症を引き起こし、おそらくは中枢神経系感染も引き起こすウシ免疫不全ウイルス（BIV）；ならびに、類人猿において免疫不全および脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス（SIV）が含まれる。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、潜伏期間が長く経過が遷延性であることを特徴とする。通常、これらのウイルスは単球およびマクロファージを潜在性に感染させ、これらから他の細胞に伝播する。HIV、FIVおよびSIVは、Tリンパ球、すなわちT細胞にも容易に感染する。
【０１３６】
「R領域」という用語は、キャッピング基の開始点（すなわち、転写の開始点）で始まってポリAトラクトの開始点の直前で終わる、レトロウイルスLTR内の領域のことを指す。R領域はまた、U3領域とU5領域に挟まれているとも定義される。R領域は、逆転写の間に新生DNAをゲノムの一方の末端から他方の末端まで移行させる上で重要な役割を果たす。
【０１３７】
「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方をもたらしうる配列を含むDNAのセグメントのことを指す。例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種性」でありうる。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結されるエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種性」エンハンサー／プロモーターとは、その遺伝子の転写が、連結されたエンハンサー／プロモーターによって導かれるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的手法）によって遺伝子に近接配置されたもののことである。
【０１３８】
別に定義しない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載されている；当技術分野において公知である他の適した方法および材料も用いることができる。材料、方法および例は例示であるに過ぎず、限定的であることは意図していない。本明細書中に言及されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含め、本明細書が優先する。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図1は、開示される合成BCL11AマイクロRNAの2つの態様、すなわちBCL11A miR1およびBCL11A miR2オリゴヌクレオチドの略図である。オリゴヌクレオチド中のBCL11A標的指向性配列の相補的配列（太字で大文字のヌクレオチド塩基）によって、ステム／ループ構造が生じる。BCL11A標的指向性配列はBCL11Aセグメントである。続いて、ステム／ループ構造をmiR-223／miR-30バックグラウンド（マイクロRNAバックグラウンド）中にクローニングする。続いて、miRNA／shRNA構造全体を、導入遺伝子レポーター（Venus）を含むSINレンチウイルスベクターを含むSFFV／LCR／TETカセット中にクローニングする。
【図２】図2は、SFFVプロモーター、TETプロモーターおよびLCRプロモーターを有するレンチウイルスベクタープロウイルスの概略図である。
【図３】図3は、SFFV-LVがBCL11Aを効率的にノックダウンしてεγ-グロビン発現を誘導することを示している2本の棒グラフのパネルである。
【図４】図4は、LCR／TET-LVがBCL11Aを効率的にノックダウンしてεγ-グロビン発現を誘導することを描写している2本の棒グラフのパネルである。
【図５】図5は、形質導入されたCD34+ HSCがエクスビボで赤血球に分化してHbFを発現することを示している顕微鏡写真およびグラフのパネルである。
【図６】図6は、LCR-LVが形質導入されてNSGマウスに移植された、SCDを有する患者由来のCD34+ HSCを描写している散布図のパネルである。
【図７】図7は、リンパ系発生におけるBCL11Aの毒性に関する試験を示している顕微鏡写真およびグラフのパネルである。
【図８Ａ】pol IIIおよびpol II発現系におけるBCL11Aを標的とするshRNAのスクリーニングおよび評価を示している。shRNAカセットに埋め込まれた、それぞれRNAポリメラーゼIII（pol III、U6プロモーター、左側）およびRNAポリメラーゼII（pol II、SFFVプロモーター、右側）により駆動するshRNAおよびmiRNA（223）の概略図。いずれの発現カセットもレンチウイルスベクター中に人工的に導入した。さまざまな枠は、表記の通りのパッセンジャー鎖、ガイド鎖およびループ構造を表している。miRNA223スカフォールドは点線の枠で表わされている。BCL11Aを標的とする種々のshRNA配列をこれらの2種のバックボーンにおいて発現させて、ノックダウン効率に関して評価した。
【図８Ｂ】pol IIIおよびpol II発現系におけるBCL11Aを標的とするshRNAのスクリーニングおよび評価を示している。pol IIIベースのレンチウイルスベクターを用いたノックダウン効率に関する、BCL11A mRNAにおけるさまざまな領域を標的とする複数のshRNA配列のハイスループットスクリーニング（表記の通りの、XL／L共有アイソフォーム配列、XLに特異なコード配列およびXLアイソフォームの3'-UTR）。qPCRによるε-γの誘導およびFACSによるmCherryレポーターの誘導（レポーター細胞株におけるε-γ誘導の代用として）の両方を、BCL11Aノックダウンに関する機能的読み取りとして用いた。非標的指向性対照を基準とするε-γ mRNAの規格化された発現をy軸にプロットし、非形質導入対照を基準とするmCherry発現の平均蛍光強度（MFI）をx軸にプロットした。さらに試験した11種のshRNAには丸印を付している。
【図８Ｃ】pol IIIおよびpol II発現系におけるBCL11Aを標的とするshRNAのスクリーニングおよび評価を示している。図8Cおよび8Dは、pol IIIベースおよびpol IIベースの系における選択されたshRNAのノックダウン効率の比較を示す。MEL細胞に対して、表記のshRNAを発現させるためにLKOベクターまたはLEGOベクターによる形質導入を行い、形質導入細胞をピューロマイシンの存在下で選択するか（LKO）、またはVenus発現に関して選別した（LEGO）。miR1 shRNAは、Sankaran et al.（）によって以前に報告されている。BCL11Aタンパク質レベルは、β-アクチンを対照とするイムノブロットによって示されている（図8C）。XLおよびLは、BCL11Aタンパク質の各アイソフォームの位置を示している。（図8D）バンド強度はImageJソフトウェアを用いて分析した。
【図８Ｄ】詳細は図8Cの説明に記載の通り。
【図８Ｅ】pol IIIおよびpol II発現系におけるBCL11Aを標的とするshRNAのスクリーニングおよび評価を示している。非標的指向性対照と比較したε-γの規格化された発現の誘導倍数値を、qPCRによって測定した。非標的指向性shRNAが形質導入されたMEL細胞を用い、発現を1に設定した。データは、三重反復試験として実施した3回の独立した実験のうち代表的な実験による平均±SDを表している。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。
【図９Ａ】pol III転写物とpol II転写物とのプロセシングの差異を明示している、低分子RNA配列解析から収集したデータである。miR1またはC4 shRNAのいずれかを発現する、形質導入された、選別された、またはピューロマイシンにより選択されたMEL細胞から、全RNAを単離した。その結果得られたRNAを、続いてRNAディープシークエンシングに供した。（図9A）pol III（LKO）（SEQ ID NO：103）から転写された、プロセシングされた最終的なガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列をx軸上に表示し、各鎖の100万の総リード当たりの対応するリード数をy軸上にプロットしている。
【図９Ｂ】pol III転写物とpol II転写物とのプロセシングの差異を明示している、低分子RNA配列解析から収集したデータである。miR1またはC4 shRNAのいずれかを発現する、形質導入された、選別された、またはピューロマイシンにより選択されたMEL細胞から、全RNAを単離した。その結果得られたRNAを、続いてRNAディープシークエンシングに供した。（図9B）pol II（LEGO）（SEQ ID NO：104）から転写された、プロセシングされた最終的なガイド鎖およびパッセンジャー鎖の配列をx軸上に表示し、各鎖の100万の総リード当たりの対応するリード数をy軸上にプロットしている。
【図９Ｃ】pol III転写物とpol II転写物とのプロセシングの差異を明示している、低分子RNA配列解析から収集したデータである。（図9C）pol IIIプロモーターから転写された、miR1のプロセシングされた変異体ガイド鎖の配列をy軸上にプロットし、総リード数をx軸上にプロットしている。
【図９Ｄ】pol III転写物とpol II転写物とのプロセシングの差異を明示している、低分子RNA配列解析から収集したデータである。（図9D）pol IIプロモーターから転写された、miR1のプロセシングされた変異体ガイド鎖の配列をy軸上にプロットし、総リード数をx軸上にプロットしている。
【図９Ｅ】pol III転写物とpol II転写物とのプロセシングの差異を明示している、低分子RNA配列解析から収集したデータである。（図9E）pol IIIプロモーターから転写された、C4のプロセシングされた変異体ガイド鎖種の配列をy軸上にプロットし、総リード数をx軸にプロットしている。
【図９Ｆ】pol III転写物とpol II転写物とのプロセシングの差異を明示している、低分子RNA配列解析から収集したデータである。（図9F）pol IIプロモーターから転写された、C4のプロセシングされた変異体ガイド鎖種の配列をy軸上にプロットし、総リード数をx軸にプロットしている。
【図１０Ａ】shRNA配列の改変が、ノックダウンの増加およびガイド鎖とパッセンジャー鎖との比の向上をもたらすことを示している。4つの5'塩基が欠失し、GCGCが3'末端に付加されて、miR1 G5およびC4G5と名づけられた改変shRNAが生じるように、mIR1およびC4 shRNAを改変した。
【図１０Ｂ】shRNA配列の改変が、ノックダウンの増加およびガイド鎖とパッセンジャー鎖との比の向上をもたらすことを示している。改変shRNA配列および親shRNA配列のノックダウン効率の比較。MEL細胞に対して、pol IIプロモーターを介して表記のshRNAを発現させるためにLEGOによる形質導入を行い、形質導入細胞をVenus発現に関して選別した。BCL11Aタンパク質レベルを、β-アクチンをローディング対照とするイムノブロットによって測定した。XLおよびLは、BCL11Aタンパク質のこれらのアイソフォームの位置を指し示している。
【図１０Ｃ】shRNA配列の改変が、ノックダウンの増加およびガイド鎖とパッセンジャー鎖との比の向上をもたらすことを示している。イムノブロットのバンド強度を、ImageJソフトウェアを用いて分析した。
【図１０Ｄ】shRNA配列の改変が、ノックダウンの増加およびガイド鎖とパッセンジャー鎖との比の向上をもたらすことを示している。qPCRによって測定した、改変／非改変shRNA配列によるε-γの非標的指向性対照と比較した規格化された発現の誘導倍数値。データは、同様の結果を示す三重反復試験として実施した3回の独立した実験のうち代表的な実験による平均±SDを表している。*P＜0.05、**P＜0.01。
【図１１】図11A〜11Cは、4塩基対改変shRNAのRNA配列分析により、忠実度の高いプロセシングが示されたことを示している。図11A：改変miR1 shRNAおよび改変C4 shRNAを発現する、形質導入されて選別されたMELから、すべての低分子RNA（SEQ ID NO：141）を単離して、シークエンシングを行った。pol IIプロモーターから転写された改変miR1（miR1-G5およびC4G5）のプロセシングされたガイド鎖種の頻度分布をx軸上にプロットし、100万の総リード当たりのリードの割合をy軸にプロットしている。図11Bおよび11C：mIR1-G5およびC4-G5のプロセシングされた変異体ガイド鎖種の配列をy軸上に表示し、リードの頻度をx軸上に示している。
【図１２Ａ】pLKOベクターを用いた、BCL11Aを標的とするshRNAスクリーニングによる候補。
【図１２Ｂ】PLKOにおけるガイド鎖配列の組成および分布。pLKO構築物を用いる場合には常に5'末端にシフトがあり、これは3'末端でのTリッチ配列の伸長に起因する可能性がある。付加されたTはpol III終止配列の一部である。成熟shRNA配列におけるこのシフトは、ダイサー媒介性プロセシングの間には3'カウントルール（3' counting rule）が優位であることを指し示しており、これはshRNAの切断が3'末端から21ntの箇所で開始されることを意味する。これは5'末端に3塩基対または4塩基対のシフトをもたらし、標的認識のための、同じくシフトしたシード領域ももたらす（ガイド鎖の塩基2〜7）。
【図１３】LEGOにおけるガイド鎖配列の組成および分布。低分子RNAのディープシークエンシング分析により、pol III転写物とpol II転写物とのプロセシングの差異が明示されている。lego構築物を用いた場合には5'末端にシフトがなく、ガイド鎖はダイサーによって忠実にプロセシングされ、その結果、予想される産物が生じる。このため、pol III駆動性構築物とpol II駆動性構築物との間では最終的なガイド鎖が異なる。
【図１４Ａ】pLKOベクターで産生される、成熟ガイド鎖を模倣する新たなshRNAのデザイン。shRNAをすべて、5'側の4塩基が欠失してGCGCが3'末端に付加されるように改変することで、miR1G5、E3G5、B5G5、D8G5、B11G5、50D12G5、50B11G5、50A5G5、50C4G5と名づけられた改変shRNAを生じさせた。このシフトを組み入れた場合には、BCL11Aノックダウンおよびε-γ誘導に関してE3G5、D8G5およびC4G5の有意な改善が観察された。「xxxx」は、非改変miR1、E3、B5、D8、B11、50D12（D12とも称される）、50B11、50A5（A5とも称される）および50C4（C4とも称される）からの4塩基の除去をもたらす4塩基対（bp）フレームシフトの位置を表している。
【図１４Ｂ】改変LEGOにおけるガイド鎖配列の組成および分布。改変shRNAのRNAディープシークエンシング分析により、4bpシフトを伴う忠実度の高いプロセシングが示されており、このことは、シフトを導入することによって本発明者らがpLKO-ベクターの産物を完全に模倣しうることを指し示している。有効なshRNAのスクリーニングのためにpLKOベクターを用いたことから、この改変は、pol II駆動性バックボーンの中にshRNAカセットを移入した場合に、正確な成熟産物ガイド配列を模倣する。
【図１５】改変されたガイド配列によるBCL11Aノックダウンの比較。改変shRNA配列および親shRNA配列のノックダウン効率の比較。BCL11A発現を示しているウエスタンブロット（XLアイソフォームおよびLアイソフォーム、上のパネル）。赤の丸印は、4bpシフトの導入によってBCL11Aノックダウンの改善が達成されたshRNAを指し示している。下のパネル：qPCRによる測定で、改変／非改変shRNA配列によるε-γの規格化された発現の誘導倍数値を、非標的指向性対照と比較した。
【図１６】改変されたガイド配列によるmiR発現の比較。ノーザン分析を改変された構築物において行い、改変されていないもの、特にE3G5、D8G5およびC4G5を用いて比較したところ、ノックダウン効率およびε-y誘導の増大に一致して、ガイド鎖発現は高度であった（これはノックダウン効率の増大につながる）。
【図１７】LEGOベクターによるBCL11Aノックダウン効率およびεγ誘導。pLKOpol IIIベースの系およびpLEGO pol IIベースの系における、選択されたshRNAのノックダウン効率の比較。MEL細胞に対して、pLKOベクターまたはpLEGOベクターのいずれかの中にある表記のshRNAによる形質導入を行い、形質導入細胞をピューロマイシンの存在下で選択するか（pLKO）、またはVenus発現に関して選別した（pLEGO）。BCL11Aタンパク質レベルは、β-アクチンを対照とするイムノブロットによって測定した。非標的指向性対照と比較した規格化されたε-γの誘導倍数値はqPCRによって測定している。非標的指向性shRNAが形質導入されたMEL細胞を陰性対照として用いた。フレームシフトはノックダウン効率およびεγ誘導の両方に対して強い効果を及ぼす。XLアイソフォームを標的とするshRNAのみでも、εγ誘導に対して強い影響を及ぼす。データは、それぞれ三重反復試験として実施した3回の独立した実験による平均±SDを表している。*P＜0.05。
【図１８】図18は、pol-IIIshRNAベクターおよびpol-IIマイクロRNA適合shRNAベクターにおけるプロセシングの差異を示している。
【図１９】図19A〜19Dは、pol III発現系およびpol II発現系におけるBCL11Aを標的とするshRNAのスクリーニングおよび評価を示している。図19A：LKO-U6-BCL11A-shRNA（左側）およびLEGO-SFFV-BCL11A-shRNAmiR（右側）の略図。両方の発現カセットを、材料および方法の項に記載したように、レンチウイルスベクター中に設計した。ライトグレーの枠はセンス鎖を表している；白の枠はアンチセンス鎖を表している；ダークグレーの枠はループ構造を表しており、miRNA223スカフォールドは点線によって指し示されている。ヘアピン構造は下方に示されている。BCL11Aを標的とする種々のshRNA配列をこれらの2種のバックボーンにおいて発現させ、ノックダウン効率に関して評価した。図19B：pol IIIベースのレンチウイルスベクターを用いた、BCL11A mRNAを標的とする複数のshRNA配列のノックダウン効率に関するハイスループットスクリーニング。qRT-PCRによるHbb-y mRNAの誘導、およびFACSによるmCherryレポーターの誘導（レポーター細胞株におけるε-γ誘導に関する代用として）の両方を、BCL11Aノックダウンに関する機能的読み取り値として用いた。非標的指向性対照を基準とするHbb-y mRNAの規格化された発現をy軸にプロットし、非形質導入対照を基準とするmCherry発現（平均蛍光強度、MFIによる）の誘導倍数値をx軸にプロットしている。スクリーニングにより単離されたshRNAのうち成績の良い上位8種をさらに試験し、1から8までのラベルを付した。図19C：pol III（U6）ベースおよびpol II（SFFV）ベースの系における選択されたshRNAのノックダウン効率の比較。MEL細胞に対して、表記のshRNAを発現させるためにU6-ベクター（上のパネル）またはSFFV-ベクター（下のパネル）による形質導入を行い、形質導入細胞をピューロマイシンの存在下で選択するか（pol III）、またはVenus発現に関して選別した（pol II）。BCL11Aタンパク質レベルは、β-アクチンを対照とするイムノブロットによって示されている。パネルの左側にあるXLおよびLは、BCL11Aタンパク質の各アイソフォームの位置を表している。図19D：qPCRによって測定した、非標的指向性対照と比較したHbb-yの規格化された発現の誘導倍数値。非標的指向性（NT）shRNAが形質導入されたMEL細胞における発現を1に設定した。黒のバーはU6プロモーターにより駆動されるshRNAによる相対的発現を表し、白のバーはSFFVプロモーターにより駆動されるshRNAを表している。データは、三重反復試験として実施した3回の独立した実験のうち代表的な実験による平均±SDを表している。*P＜0.05。
【図２０Ａ】低分子RNA配列分析により、pol III転写物とpol II転写物とのプロセシングの差異が明示されたことを示している。U6-shRNAおよびSFF V-shRNAmiR 1、2、3、4、7または8が形質導入されたMEL細胞の低分子RNAシークエンシングの結果。RNA配列を、各パネルの上部に太字で示された対応する参照ガイド鎖配列およびグレーで示された隣接配列に対してアラインメントした。（図20A）U6-shRNAから産生されたガイド鎖の種々の変異体をy軸上にプロットしている。各変異体の相対的寄与（％）を、参照shRNA配列と一致するリードの総数に基づいて算出してx軸上に示している。
【図２０Ｂ】低分子RNA配列分析により、pol III転写物とpol II転写物とのプロセシングの差異が明示されたことを示している。U6-shRNAおよびSFF V-shRNAmiR 1、2、3、4、7または8が形質導入されたMEL細胞の低分子RNAシークエンシングの結果。RNA配列を、各パネルの上部に太字で示された対応する参照ガイド鎖配列およびグレーで示された隣接配列に対してアラインメントした。（図20B）SFFV-shRNAmiRから産生されたガイド鎖の種々の変異体をy軸上にプロットしている。各変異体の相対的寄与（％）を、参照shRNA配列と一致するリードの総数に基づいて算出してx軸上に示している。
【図２１Ａ】shRNA配列の改変が、MEL細胞において、ノックダウンの増加およびガイド鎖とパッセンジャー鎖との比の向上をもたらすことを示している。SFFV-shRNAmiRを、ガイド配列から最初の4塩基を欠失させて3'末端にGCGCを付加することによって改変した（改変shRNA）。
【図２１Ｂ】shRNA配列の改変が、MEL細胞において、ノックダウンの増加およびガイド鎖とパッセンジャー鎖との比の向上をもたらすことを示している。MEL細胞においてSFFV-pol IIプロモーターから発現させた改変shRNAmiR配列および親shRNAmiR配列のノックダウン効率の比較。BCL11Aタンパク質レベルは、FACSで選別された形質導入細胞において、β-アクチンをローディング対照とするイムノブロットによって測定した。上のパネルの左側にあるXLおよびLは、BCL11Aタンパク質のこれらのアイソフォームの位置を指し示している。PIII：pol IIIプロモーターベクター；PII：pol IIプロモーターベクター；PIIM：改変shRNAmiR配列を含むpol IIプロモーターベクター。
【図２１Ｃ】shRNA配列の改変が、MEL細胞において、ノックダウンの増加およびガイド鎖とパッセンジャー鎖との比の向上をもたらすことを示している。qRT-PCRによって測定した、非改変（白のバー）および改変（網掛けバー）shRNAmiR配列による、非標的指向性対照と比較したHbb-yの誘導倍数値。データは平均±SDを表している。**P＜0.01。
【図２１Ｄ】shRNA配列の改変が、MEL細胞において、ノックダウンの増加およびガイド鎖とパッセンジャー鎖との比の向上をもたらすことを示している。複数のshRNAおよびshRNAmiRが形質導入された細胞から抽出した全RNAのノーザンブロット分析。shRNAおよびshRNAmiRの位置1から20までのガイド鎖およびパッセンジャー鎖に対して相補的なプローブ（20nt）を、プロセシングされた低分子RNAの存在量を測定するために利用した。5S RNAに対して相補的なプローブを、RNAローディングを判定するための内部対照として用いた。PIII：pol IIIプロモーターベクター；PII：pol IIプロモーターベクター；PIIM：改変shRNAmiR配列を含むpol IIプロモーターベクター。
【図２１Ｅ】shRNA配列の改変が、MEL細胞において、ノックダウンの増加およびガイド鎖とパッセンジャー鎖との比の向上をもたらすことを示している。shRNA 1、2、3、4、7または8を発現する形質導入MEL細胞の均質集団のRNAシークエンシングの結果。これらのRNAの配列を、各パネルの上部に示された対応する参照ガイド鎖配列に対してアラインメントした。種々のガイド鎖種の配列をy軸上に表示し、頻度をアラインメントされたリードのパーセンテージとしてx軸上に示している。
【図２２】図22A〜22Eは、改変shRNAmiRが、ヒトCD34+由来赤血球系細胞におけるBCL11Aノックダウン効率の増大およびγグロビン誘導を招くことを示している。図22A：改変を伴うかまたは伴わない種々のshRNAを発現するpol IIIまたはpol IIベクターにより形質導入されたCD34+細胞を、ピューロマイシンの存在下で選択するか（pol III）、またはVenus発現に関して選別した（pol IIおよび改変pol II）。BCL11A発現は、分化第11日に、β-アクチンをローディング対照とするイムノブロットによって測定した。図22B：γ-グロビンmRNAの誘導を、分化第18日にqRT-PCRにより判定した。データは、β-遺伝子座産物全体（γ-グロビン＋β-グロビン）のうちγ-グロビンのパーセンテージを、pol III（黒のバー）、pol II（白のバー）および改変pol II（グレーのバー）に関して表している。*p＜0.05；***p＜0.001。図22C：赤血球系分化マーカー（CD71、GpA）の定量および統計的分析、さらに核除去をフローサイトメトリーによって評価した。CTRL：対照ベクターSFFV-shRNAmiRNTおよびSEW；PIII：pol IIIベクター；PII：pol IIベクター；PIIM：改変shRNAmiR配列を含むpol IIベクター。データは3回の独立した実験による平均±SDを表している。***p＜0.001。図22D：細胞溶解物のヘモグロビンFを、分化第18日にHPLCによって測定した。矢印はHbFピークを指し示しており、ヘモグロビン全体に占めるHbFのパーセンテージをクロマトグラムの下方に示している。図22E：qRT-PCRによって評価したγ-グロビンmRNA発現とHPLCによるHbFとの相関グラフ。黒の丸印はpol IIIベクターを表し、白抜き丸印およびグレーの丸印はそれぞれpol IIshRNAmiRまたは改変shRNAmiRを表している。相関係数（r2）を全データについて示している。
【図２３Ａ】インビボでのHSCに対するBCL11Aノックダウンの悪影響が、発現を赤血球系細胞に限定することによって妨げられることを示している。β-YACマウスから単離された系列陰性骨髄細胞（CD45.2）に対して、エクスビボで、BCL11Aを標的とするshRNAmiR*を発現するLeGOベクター、または非標的指向性対照ベクター（SFF-shRNAmiRNT）による形質導入を行い、致死的な放射線照射BoyJレシピエント（CD45.1）に移植した。非形質導入対照細胞を対照として移植した。生着分析を、末梢血および骨髄のそれぞれにおいて移植後4週、8週および12週に行った（n＝各群当たりマウス4匹）。
【図２３Ｂ】インビボでのHSCに対するBCL11Aノックダウンの悪影響が、発現を赤血球系細胞に限定することによって妨げられることを示している。これらのマウスにおける遺伝子改変細胞（Venus+細胞）の比率を、末梢血および骨髄において移植後4週、8週および12週に決定した。
【図２３Ｃ】インビボでのHSCに対するBCL11Aノックダウンの悪影響が、発現を赤血球系細胞に限定することによって妨げられることを示している。表記のベクターによって形質導入されたCD45.1およびCD45.2ドナー細胞を用いて競合的移植片を用意し、CD45.1／2ヘテロ接合性マウスに移植した（上方のパネル）。または、青色蛍光性タンパク質をコードする中立的ベクター（SFFV-BFP）を、CD45.2レシピエント環境でのCD45.1ドナーにおける競合体集団を同定するために用いた（下方のパネル）。示されているのは、形質導入から3日後に移植に用いた種々の混在性集団の代表的なドットブロットである。2種の競合性ベクターは各パネルの上方に指し示されており、最初のものはそれぞれCD45.2またはSFFV-BFPにより形質導入された集団を指し示している。
【図２３Ｄ】インビボでのHSCに対するBCL11Aノックダウンの悪影響が、発現を赤血球系細胞に限定することによって妨げられることを示している。競合的に再増殖させたマウスにおける遺伝子改変細胞の寄与を、末梢血（PB）において移植4週後および8週後に、または骨髄（BM）および脾臓（Spl）において第12週に分析した。2種の競合性ベクターにより形質導入された遺伝子改変細胞の相対的寄与を示している。言及した第1のベクターは造血性アウトプットを優位にした。各ドットは個々のレシピエントマウスを表している。
【図２３Ｅ】インビボでのHSCに対するBCL11Aノックダウンの悪影響が、発現を赤血球系細胞に限定することによって妨げられることを示している。BCL11A標的指向性ベクターと対照ベクター（SFF-shRNAmiRNTとSFFV-BFP、左のパネル）の間での、細胞の形質導入画分における骨髄B細胞画分のペアワイズ比較。同様に、形質導入細胞画分におけるLSK含有量も分析した。各ドットは個々のレシピエントを表しており、*および**はそれぞれp値≦0.05および≦0.01を指し示している。
【図２３Ｆ】インビボでのHSCに対するBCL11Aノックダウンの悪影響が、発現を赤血球系細胞に限定することによって妨げられることを示している。赤血球系特異的発現のために用いたLCR-shRNAmiRベクターの立体配置（詳細は本文中）。
【図２３Ｇ】インビボでのHSCに対するBCL11Aノックダウンの悪影響が、発現を赤血球系細胞に限定することによって妨げられることを示している。LCR-ベクターのインビボ発現プロフィールをさまざまな造血系列において移植12週後に分析した。各マウスにおけるVenus+細胞のパーセンテージを、CD71+／Ter119+赤血球系細胞に対して規格化した（n＝4）。
【図２３Ｈ】インビボでのHSCに対するBCL11Aノックダウンの悪影響が、発現を赤血球系細胞に限定することによって妨げられることを示している。cおよびdに記載した通りの競合的移植実験を、shRNAmiR*を発現するLCRベクターまたはSFFVベクターを用いて行った。各ドットは個々のレシピエントを表している。
【図２３Ｉ】インビボでのHSCに対するBCL11Aノックダウンの悪影響が、発現を赤血球系細胞に限定することによって妨げられることを示している。動員された末梢血CD34+細胞に対して、LCR-shRNAmiR*、3および8またはSFFV-GFPモックベクターによる形質導入を行って、インビトロで赤血球系分化に供した。形質導入から7日後に、種々の赤血球系部分集団におけるSFFV-GFPベクターおよびLCR-ベクターのプロモーター活性を評価した。代表的な流れ図を示している。すべての図中でエラーバー＝SDである。統計分析：t-検定。
【図２４Ａ】改変shRNAmiRによる系列特異的BCL11Aノックダウンおよびγグロビン誘導を示している。LCR-shRNAmiR 3、8またはSFFV-GFPモックベクターによって形質導入されたCD34+ HSPCを、蛍光性レポーター発現に関してFACS選別し、分化第11日にBCL11A発現をβ-アクチンをローディング対照とするイムノブロットによって測定した。
【図２４Ｂ】改変shRNAmiRによる系列特異的BCL11Aノックダウンおよびγグロビン誘導を示している。γ-グロビンmRNAの誘導を、分化第18日にqRT-PCRにより判定した。データは、γ／（γ＋β）グロビンのパーセンテージを表している。
【図２４Ｃ】改変shRNAmiRによる系列特異的BCL11Aノックダウンおよびγグロビン誘導を示している。フローサイトメトリー分析による赤血球系分化マーカー（CD71、GpA）および核除去の定量および統計的分析。CTRL：SFFV-GFP対照ベクター；LCRM：LCRプロモーターを介して発現される、図23Aに示されている改変shRNAmiR。データは3回の独立した実験による平均±SDを表している。
【図２４Ｄ】改変shRNAmiRによる系列特異的BCL11Aノックダウンおよびγグロビン誘導を示している。細胞溶解物のHbFレベルを、分化第18日にHPLCによって測定した。矢印はHbFピークを指し示しており、ヘモグロビン全体に占めるHbFのパーセンテージをクロマトグラムの下方に示している。
【図２４Ｅ】改変shRNAmiRによる系列特異的BCL11Aノックダウンおよびγグロビン誘導を示している。qRT-PCRによるγ-グロビン誘導とHPLCによるHbFの相関グラフ。エラーバーは、3回の独立した実験による±SDを指し示している。
【図２４Ｆ】改変shRNAmiRによる系列特異的BCL11Aノックダウンおよびγグロビン誘導を示している。骨髄CD34+ HSPCに対してLCR-shRNAmiR3またはNTによる形質導入を行い、致死量以下の放射線照射を行ったNSGマウス（n＝1群当たり3匹）に移植した。非形質導入細胞を対照として用いた。14週後に、移植した動物の骨髄からCD34細胞を単離し、インビトロでの赤血球系分化に14日間供した。γ-グロビンおよびβ-グロビンの発現を、Venusレポーター発現に関して選別した細胞において評価した。
【図２５】図25は、4種の細胞株における247種のプロセシングされたTRC shRNA産物のディープシークエンシングを示している。
【図２６】図26は、LCR-shRNAmiRベクターのインビボ発現プロフィールを示している。
【図２７】図27Aは、BCL11Aアイソフォーム（LおよびXL）およびローディング対照としてのβ-アクチンを示している、健常ドナー由来の形質導入CD34+細胞に由来するインビトロで分化させた赤血球系細胞のウエスタンブロットであり、BCL11A XLの有効なノックダウンを実証している。DNA PCRによって決定されたVCNを各レーンの下方に示している。図27Bは、赤血球系細胞におけるBCL11Aノックダウンの定量を示している。データは、図27Aに示すようなウエスタンブロットに由来する。データは、単一ドナー由来の細胞を用いた3回の独立した実験をまとめている（エラーバー：SD）。図27Cは、RT-qPCRによって評価した赤血球系細胞におけるγグロビンの誘導、およびHPLCによって評価したヘモグロビン（HbF）を示している（エラーバー：SD）。
【図２８】図28は、RT-qPCRによって評価した、赤血球系細胞におけるγグロビンの誘導を示している。赤血球系細胞におけるγグロビン誘導の量は、細胞におけるインビボでのBCL11Aノックダウンの指標である。エラーバー：SD。1群当たり3匹ずつの移植を受けた動物によるデータを示している。
【図２９】図29Aは、BCL11Aアイソフォーム（LおよびXL）およびローディング対照としてのβ-アクチンを示しているウエスタンブロットであり、BCL11A XLの有効なノックダウンを実証している。各パネル（レーンの下方のラベル表示1〜6）は、単一ドナー由来の細胞を用いた独立した実験を表している。図29Bは、赤血球系細胞におけるBCL11Aノックダウンの定量を示している。データは、図29Aに示されたウエスタンブロットに由来する（エラーバー：SD）。図29Cは、HPLCによるHbFの結果として起こる誘導を示している（エラーバー：SD）。
【図３０】図30は、CD34+分化赤血球系細胞におけるBCL11AのノックダウンのためのSFFVバックボーンおよびLCRバックボーンの両方に用いた配列を示している。
【図３１】図31は、CD34+分化赤血球系細胞におけるBCL11Aノックダウンのウエスタンブロットを示している。
【発明を実施するための形態】
【０１４０】
詳細な説明
本明細書に記載の本開示は、一部には、造血幹細胞（HSC）の子孫においてBCL11A標的指向性shRNAを選択的に発現するレンチウイルス遺伝子治療ベクターの開発に基づく。したがって、本開示は、赤血球系細胞におけるγ-グロビン発現の調節のための新規方法を範囲に含む。より具体的には、これらの活性を、BCL11A遺伝子産物の阻害を介したγ-グロビンの誘導により、SCDおよびTHALを含む異常ヘモグロビン症の治療のための方法に利用することができる。特定の態様において、HSC、造血始原細胞、または胎児細胞などの他の幹細胞の子孫においてBCL11A標的指向性shRNAを選択的に発現するレンチウイルス遺伝子治療ベクターが提供される。
【０１４１】
正常な成人ヘモグロビンは4つのグロビンタンパク質で構成され、そのうち2つはアルファ（α）タンパク質であり、2つはベータ（β）タンパク質である。哺乳動物の胎児発生の間に、特にヒトにおいて、胎児は胎児型ヘモグロビンを産生し、これは2つのβ-グロビンタンパク質の代わりに2つのガンマ（γ）-グロビンタンパク質を含む。胎児発生中のある時点で、グロビンの胎児性スイッチングが起こり、その時点で胎児における赤血球は、主としてγ-グロビンを産生することから主としてβ-グロビンを産生するように切り替わる。胎児型ヘモグロビンまたはHbF（α2γ2）を主とする産生から、成人ヘモグロビンまたはHbA（α2β2）の産生への発生上のスイッチングは、妊娠約28週〜34週の間に起こり、HbAが主体となるまでは出生後も短期間続く。このスイッチングは主として、γ-グロビン遺伝子の転写の減少およびβ-グロビン遺伝子の転写の増加に起因する。正常成人の血液は平均するとHbFを約2％しか含有しないとはいえ、健常成人における残留HbFレベルには20倍を上回るばらつきがある（Atweh, Semin. Hematol. 38:367-73 (2001)）。
【０１４２】
異常ヘモグロビン症は、赤血球（RBC）の産生の減少および／または破壊（溶血）の増加がみられる、遺伝的原因によるいくつかの貧血を範囲に含む。これらにはまた、異常ヘモグロビンの産生をもたらし、酸素濃度を維持する能力の障害を同時に伴う遺伝的欠陥も含まれる。そのような障害には、正常β-グロビンを十分な量で産生できなくなることを伴うものもあれば、正常β-グロビンを全く産生できなくなることを伴うものもある。β-グロビンタンパク質に関連するこれらの障害は、一般に異常ヘモグロビン症と称される。例えば、SCDはβ-グロビン構造遺伝子における点突然変異に起因し、それは異常（鎌状化）ヘモグロビン（HbS）の産生を招く。HbS RBCは正常RBCよりも脆弱であり、溶血をより容易に起こし、それは最終的に貧血を招く（Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)）。THALはβ-グロビン遺伝子の部分的または完全な欠損に起因し、それはHbAの欠乏または欠如を招く。
【０１４３】
異常ヘモグロビン症の患者におけるグロビン鎖不均衡の軽減を目的とする治療の探索は、胎児HbFの薬理学的操作に着目してきた。そのようなアプローチの治療可能性は、β鎖異常を有しかつHbFが正常レベルよりも高い成人患者の特定の集団はHbFが正常成人レベルである患者よりも疾患の臨床経過が軽度であるという観察所見によって明示されている。例えば、HbFを20〜30％発現するサウジアラビア鎌状細胞貧血患者の群では、疾患の臨床症状発現は軽度に過ぎない（Pembrey, et al., Br. J. Haematol. 40: 415-429 (1978)）。現在では、SCDおよびTHALなどの異常ヘモグロビン症がHbF産生の増加によって改善されることが受け入れられている（Jane et al., Br. J. Haematol. 102: 415-422 (1998)；Bunn, N. Engl. J. Med. 328: 129-131 (1993)）。
【０１４４】
転写リプレッサーであるBCL11Aは、β-異常ヘモグロビン症の治療標的である。造血細胞におけるBCL11A発現を低下させるために、pol IIIプロモーターにより発現される短鎖ヘアピンRNA（shRNA）を用いるRNA干渉を適用した。マウス造血幹細胞（HSC）におけるBCL11Aのノックダウンにより、長期的生着が損なわれた。HSC毒性を回避するために、pol IIプロモーターにより発現されるマイクロRNA適合shRNA（shRNAmiR）を介して、赤血球系細胞におけるBCL11Aの発現を選択的に抑制した。同一の標的に適合させた複数の配列を用いることにより、標的ノックダウンに強い影を及ぼす系同士の間でガイド鎖に3〜5ntの違いがあることが原因で、pol IIベクターを用いた際にノックダウンの著しい低下が観察された。対応する4ntシフトをshRNAmiRのガイド鎖に人工的に導入したところ、それは驚いたことに、かつ予想外のことに、BCL11Aのノックダウン、およびマウス赤血球系細胞株におけるヒトγ-グロビン遺伝子の機能的ホモログであるHbb-yの抑制解除を向上させた。改変shRNAmiRを赤血球系特異的な様式で発現させたところ、マウスHSC生着に対する有害作用が回避され、これにより、ヒトCD34由来赤血球系細胞において効率的なBCL11Aノックダウンおよび高レベルのHbFがもたらされた。pol IIIにより発現されるshRNAスクリーニング物に由来するshRNAmiRの前向きデザインのための戦略を開発した。この戦略は、遺伝子サイレンシング配列の系列特異的発現を必要とする異常ヘモグロビン症および他の疾患の遺伝子治療のための改良されたアプローチとなる。
【０１４５】
レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクター
いくつかの態様において、本開示は、赤血球系細胞または赤血球前駆細胞における移入された治療用遺伝子の持続的な高レベル発現を達成する、レトロウイルスに基づく、例えばレンチウイルスに基づく遺伝子送達ベクターを用いて、異常ヘモグロビン症を治療するための改良された組成物および方法を提供する。本発明の1つの態様において、ベクターは、内因性miR-223配列のステムループ内にクローニングされた、BCL11Aに対する標的指向性配列を含む人工的miRNAを含む（Amendola et al., Mol Ther 17:1039-52, 2009）。本ベクターのステム／ループ構造は、本明細書に開示されたSEQ ID NO：1〜18および25〜44オリゴヌクレオチドの相補的配列によって生成される。図1、12A、14A、21A、および実施例11を参照されたい。このステム／ループ構造を、miR-223／miR-30バックグラウンド中にクローニングした。続いて、このmiRNA／shRNA構造全体を、自己不活性化（SIN）ベクターの、SFFV、TETまたはLCRプロモーターを有するカセット内にクローニングした。本発明の具体的なレンチウイルスベクターは、参照により本明細書に組み入れられる、Pawliuk et al. (2001) Science 294:2368およびImren et al. (2002) PNAS 99: 14380に記載されている。
【０１４６】
したがって、1つの局面において、本明細書において提供されるのは、第1のBCL11Aセグメント、ループセグメント、および5'から3'への方向に直列に並んだ第2のBCL11Aセグメントを含む合成BCL11AマイクロRNAであって、ループセグメントが第1および第2のBCL11Aセグメントの間にあってそれらと直接連結されており、かつ、第1および第2のBCL11Aセグメントが塩基対合してヘアピンループを形成するように第2のBCL11Aセグメントが第1のBCL11Aセグメントに対して相補的であり、ループセグメントがそのようにして形成されたヘアピンループのループ部分を形成している、前記合成BCL11AマイクロRNAである。
【０１４７】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1および第2のBCL11Aセグメントは約18〜25ヌクレオチド長である。第1のBCL11AセグメントはBCL11A配列に由来し、かつ二重鎖siRNAへのshRNAプロセシング中にパッセンジャー鎖を生じ、第2のBCL11Aセグメントは第1のBCL11Aセグメントに対して相補的であり、ここで第2のBCL11Aセグメントは、RNA干渉またはBCL11A遺伝子サイレンシングのためのRNA干渉特異性複合体（RISC）に組み入れられるガイド鎖を生じる。
【０１４８】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1および第2のBCL11AセグメントはBCL11A mRNA配列に由来する。
【０１４９】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1のBCL11Aセグメントは5'末端にて-GCGC-で始まり、第2のBCL11Aセグメントは3'末端にて-GCGC-で終わる。
【０１５０】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1のBCL11Aセグメントはさらに、5'末端が-GCGC-からなり、第2のBCL11Aセグメントは3'末端にて-GCGC-で終わる。
【０１５１】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1のBCL11Aセグメントは5'末端にて-GCGA-、-TCTG-、または-TG-で始まり、第2のBCL11Aセグメントは第1のBCL11Aセグメントに対して相補的である。
【０１５２】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1のBCL11Aセグメントはさらに、5'末端が-GCGA-、-TCTG-、または-TG-からなる。
【０１５３】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第2のBCL11Aセグメントは3'末端にて-TTTT-で終わる。
【０１５４】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、合成BCL11AマイクロRNAは、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０１５５】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、合成BCL11AマイクロRNAは、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる。
【０１５６】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、合成BCL11AマイクロRNAは、本質的に、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる。
【０１５７】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、第1のBCL11Aセグメントは、
2019129846.tif 000025
；本明細書に記載のBCL11A miR1オリゴに由来）、
2019129846.tif 000026
；本明細書に記載のBCL11A miR2オリゴに由来）、
2019129846.tif 000027
；本明細書に記載のBCL11A E3オリゴまたはshRNA1またはE3に由来）、
2019129846.tif 000028
；本明細書に記載のshRNA2またはB5に由来）、
2019129846.tif 000029
；本明細書に記載のshRNA4またはB11に由来）、
2019129846.tif 000030
；本明細書に記載のBCL11A D8オリゴまたはshRNA3またはD8に由来）、
2019129846.tif 000031
；本明細書に記載のshRNA5または50D12もしくはD12に由来）、
2019129846.tif 000032
；本明細書に記載のshRNA5または50A5に由来）、
2019129846.tif 000033
；本明細書に記載のshRNA7または50B11に由来）、
2019129846.tif 000034
；本明細書に記載のBCL11A XLC4、shRNA8および50C4に由来）、
2019129846.tif 000035
；本明細書に記載のBCL11A非標的指向性オリゴに由来）、
2019129846.tif 000036
；本明細書に記載のmiR1G5オリゴに由来）、
2019129846.tif 000037
；本明細書に記載のE3G5またはE3 modオリゴまたはshRNA1modに由来）、
2019129846.tif 000038
；本明細書に記載のB5G5またはshRNA2modに由来）；
2019129846.tif 000039
；本明細書に記載のB11G5またはshRNA4modに由来）；
2019129846.tif 000040
；本明細書に記載の50D12G5、D12G4またはshRNA5modに由来）；
2019129846.tif 000041
；本明細書に記載の50A5G5またはshRNA6modに由来）；
2019129846.tif 000042
；本明細書に記載の50B11G5またはshRNA7modに由来）；
2019129846.tif 000043
；本明細書に記載のBCL11A D8G5またはD8 modまたはshRNA3modに由来）、
2019129846.tif 000044
；本明細書に記載のBCL11A C4G5またはC4 modまたはshRNA8modに由来）、
2019129846.tif 000045
；本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来）、および
2019129846.tif 000046
；本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来）からなる群より選択される。
【０１５８】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、ループセグメントはマイクロRNAに由来する。1つの態様において、マイクロRNAは造血特異的マイクロRNA、例えば、miR-142、miR-155、miR-181およびmiR-223である。
【０１５９】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、マイクロRNAはmiR223である。
【０１６０】
本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAのいずれか1つの1つの態様において、ループセグメントは
2019129846.tif 000047
である。
【０１６１】
1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを提供する。
【０１６２】
したがって、1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含む組成物を提供する。
【０１６３】
したがって、1つの局面において、本明細書は、少なくとも、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含むベクターもしくは細菌を含む組成物を提供する。
【０１６４】
1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含むベクターまたはウイルスを含む宿主細胞を提供する。
【０１６５】
1つの局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含むベクター、ウイルスまたは細菌を含む宿主細胞を提供する。
【０１６６】
1つの態様において、ベクターはウイルスベクターまたはウイルスである。
【０１６７】
短鎖干渉性RNA（siRNA）またはマイクロRNA（miRNA）によって媒介されるRNA干渉（RNAi）は、遺伝子発現の転写後調節のための強力な方法である。RNAiは哺乳動物細胞における生物過程の研究のために幅広く用いられており、遺伝子発現の選択的モジュレーションが望ましいと考えられるヒト疾患に対する治療アプローチになりうる可能性がある。miRNAと標的mRNA配列との相補性の度合いに応じて、コグネイトmRNAの分解の誘導によって、または翻訳減衰によって、遺伝子発現の低下が起こる。内因性miRNAは一次転写物として転写され、その後にRNアーゼIII酵素ドローシャ（Drosha）（1）によってプロセシングされて、ステムループ構造を作り出す。核外移行およびダイサーによる切断によって、成熟した短い二本鎖分子（siRNA）が生じ、それはガイド鎖とパッセンジャー鎖に分かれる。ガイド鎖は、RISCタンパク質との機能的なガイド鎖結合を伴って標的mRNAの切断を媒介するエフェクター複合体であるRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）にロードされるが（2）、パッセンジャー鎖は分解される［（3）に概説されている］。ガイド鎖とパッセンジャー鎖のRISCへのローディングの違いはsiRNAの5'末端安定性に主に依存し、安定性の低い鎖の方がRISCに選好的に組み入れられるが（4、5）、哺乳動物細胞における正確な調節は完全には解明されていない。ガイド鎖の5'末端は「シード領域」を含み、それは標的識別にとって重大な意味を持つ（6,7）。ドローシャおよびダイサーによる的確な切断が、適切な標的mRNAへの効果的な結合を媒介する、所定のシード領域を有するガイドRNAの生成にとって、重大な意味を持つ。不正確なプロセシングはオフターゲット分子との結合をもたらすが、切断部位のシフトは二重鎖末端のヌクレオチド組成も変化させ、それはRISCへの鎖ローディングに対して重大な影響を及ぼす（8）。
【０１６８】
選択された標的ポリペプチドの発現の阻害は、RNA干渉物質の使用による。RNA干渉（RNAi）では、選択的分解のために標的ポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAを標的とする低分子干渉性RNA（siRNA）二重鎖を用いる。遺伝子発現のsiRNA依存的な転写後サイレンシングは、siRNAによって導かれた部位で標的メッセンジャーRNA分子を切断することを伴う。RNAiは進化的に保存された過程であり、この過程では、標的遺伝子と同一であるか非常に類似する配列のRNAの発現または導入が、その標的遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA（mRNA）の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）をもたらし（Coburn, G. and Cullen, B. (2002) J. Virology 76(18):9225を参照）、それによって標的遺伝子の発現を阻害する。1つの態様において、RNAは二本鎖RNA（dsRNA）である。この過程は、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞において記述されている。自然界では、RNAiは、長いdsRNAの、siRNAと名づけられた二本鎖断片への前進的切断（processive cleavage）を促進するdsRNA特異的エンドヌクレアーゼであるダイサーによって開始される。siRNAは、標的mRNAを認識して切断するタンパク質複合体（「RNA誘導サイレンシング複合体」または「RISC」と名づけられる）に組み込まれる。また、RNAiを、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングするために、核酸分子、例えば合成siRNAまたはRNA干渉物質を導入することによって開始させることもできる。本明細書で用いる場合、「標的遺伝子発現の阻害」は、RNA干渉が誘導されていない状況と比較した、標的遺伝子または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現またはタンパク質活性またはレベルの何らかの低下を含む。この低下は、RNA干渉物質による標的とされていない標的遺伝子の発現または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、もしくは99％、またはそれ以上の低下であると考えられる。
【０１６９】
「RNA干渉物質」および「RNA干渉」という用語は、それらが本明細書で用いられる場合、RNA干渉物質がsiRNA、miRNA、shRNA、または他の二本鎖RNA分子を含むか否かにかかわらず、二本鎖RNAによって媒介される遺伝子サイレンシングのそのような形態を範囲に含むことを意図している。siRNAは、例えばRNAiによって標的遺伝子の発現を阻害するように機能するRNA作用物質として定義される。siRNAは化学的に合成するか、インビトロ転写によって生成させるか、または宿主細胞内で産生させることが可能である。1つの態様において、siRNAは、長さが約15〜約40個のヌクレオチド、好ましくは約15〜約28個のヌクレオチド、より好ましくは長さが約19〜約25個のヌクレオチド、より好ましくは長さが約19、20、21、22、または23個のヌクレオチドの二本鎖RNA（dsRNA）分子であり、約0、1、2、3、4または5個のヌクレオチドの長さを有する3'および／または5'オーバーハングを各鎖上に含むことができる。オーバーハングの長さは2本の鎖間で独立しており、すなわち、一方の鎖上のオーバーハングの長さは、他方の鎖上のオーバーハングの長さに依存しない。好ましくは、siRNAは、標的メッセンジャーRNA（mRNA）の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）を介してRNA干渉を促進することができる。
【０１７０】
siRNAには、低分子ヘアピン（ステムループとも呼ばれる）RNA（shRNA）も含まれる。1つの態様において、これらのshRNAは、短い（例えば、約19〜約25個のヌクレオチドの）アンチセンス鎖と、これに続く約5〜約9個のヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖から構成される。または、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行してもよく、アンチセンス鎖が後に続いてもよい。これらのshRNAをプラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルス中に含めて、例えば、pol III U6プロモーターまたは別のプロモーターから発現させることができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるStewart, et al. (2003) RNA April；9(4):493-501を参照）。RNA干渉物質の標的遺伝子または配列は、細胞遺伝子またはゲノム配列、例えばBCL11A配列とすることができる。siRNAは、標的遺伝子もしくはゲノム配列、またはその断片と実質的に相同でありうる。これに関連して用いられる「相同」という用語は、標的のRNA干渉を生じさせるために、標的mRNAまたはその断片と、実質的に同一であること、十分に相補的であること、または類似していることとして定義される。標的配列の発現を阻害するかまたは発現に干渉するのに適したRNAには、ネイティブなRNA分子のほかに、RNA誘導体および類似体も含まれる。好ましくは、siRNAはその標的と同一である。siRNAはただ1つの配列を標的とすることが好ましい。siRNAなどのRNA干渉物質のそれぞれは、例えば、発現プロファイリングによって、可能性のあるオフターゲット効果についてスクリーニングすることができる。そのような方法は当業者に公知であり、例えば、Jackson et al. Nature Biotechnology 6:635-637, 2003に記載されている。発現プロファイリングに加えて、オフターゲット効果を有する可能性のある配列を同定するために、可能性のある標的配列を配列データベース中の類似配列についてスクリーニングすることもできる。例えば、配列同一性を有する15個の連続するヌクレオチド、またはおそらくは11個程度の短さの連続するヌクレオチドでも、標的としない転写産物のサイレンシングを導くのに十分である。このため、、可能性のあるオフターゲットサイレンシングを避けるために、BLASTなどの任意の公知の配列比較法による配列同一性分析を用いて、提案されたsiRNAを最初にスクリーニングすることができる。siRNA配列は、siRNAのアンチセンス（ガイド）鎖のRISCへの取り込みを最大にし、それによって分解のためにヒトGGT mRNAを標的とするRISCの能力を最大にするように選択される。これは、アンチセンス鎖の5'末端で最小の結合自由エネルギーを有する配列についてスキャニングを行うことによって達成することができる。より低い自由エネルギーはsiRNA二重鎖のアンチセンス鎖の5'末端の巻き戻しの強化を招き、それにより、アンチセンス鎖がRISCに取り込まれてヒトBCL11A mRNAの配列特異的切断を導くことを確実にする。siRNA分子は、RNAのみを含む分子に限定される必要はなく、例えば、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに範囲に含み、また、リボース糖分子が別の糖分子にまたは同様の機能を果たす分子に置換されている分子も含む。さらに、ヌクレオチド残基間の非天然の結合、例えば、ホスホロチオエート結合を用いることもできる。RNA鎖は、フルオロフォ��などのレポーター基の反応性官能基によって誘導体化することができる。特に有用な誘導体は、RNA鎖の一端または両端において、典型的にはセンス鎖の3'末端において修飾されている。例えば、3'末端の2'-ヒドロキシルは種々の基で容易にかつ選択的に誘導体化することができる。他の有用なRNA誘導体は、2'O-アルキル化残基または2'-O-メチルリボシル誘導体および2'-O-フルオロリボシル誘導体といった修飾された糖質部分を有するヌクレオチドを組み入れている。RNA塩基を修飾することもできる。標的配列の発現を阻害するかまたは発現に干渉するために有用な任意の修飾塩基を用いることができる。例えば、5-ブロモウラシルおよび5-ヨードウラシルなどのハロゲン化塩基を組み入れることができる。また、塩基をアルキル化することもでき、例えば、7-メチルグアノシンをグアノシン残基の代わりに組み入れることができる。好首尾な阻害を生じさせる非天然塩基を組み入れることもできる。最も好ましいsiRNA修飾には、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンまたはロックド核酸（LNA）ヌクレオチド、およびホスホジエステルまたはさまざまな数のホスホロチオエート結合のいずれかを含むRNA二重鎖が含まれる。そのような修飾は当業者に公知であり、例えば、Braasch et al., Biochemistry, 42: 7967-7975, 2003に記載されている。siRNA分子にとって有用な修飾のほとんどは、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術のために確立された化学反応を用いて導入することができる。好ましくは、修飾は2'-O-メチル修飾を最小限にしか含まず、好ましくはそのような修飾は除外される。修飾からは、好ましくはsiRNAの遊離5'-ヒドロキシル基の修飾も除外される。本明細書における実施例では、BCL11A mRNAを有効に標的とするshRNA分子といった、RNA干渉物質の具体的な例を提示している。
【０１７１】
ポリメラーゼ（pol）IIIにより駆動される短鎖ヘアピンRNA（shRNA）は、生物学実験環境で最もよく用いられている。shRNAはmiRNA前駆中間体の構造を模しており、それ故にドローシャによって媒介される第1の切断段階を免れる。shRNAは効率的なノックダウンをもたらすために多量に発現される。しかし、高い感染多重度（MOI）では、内因性RNAi機構の過飽和が、場合によっては内因性miRNAの調節不全に起因する細胞毒性作用を伴うことが報告されている（9-11）。マイクロRNAプロセシングの2つの構成要素であるExportin5およびAgo2がこの経路の能力を制約しているように思われ、これらのタンパク質の過剰発現はノックダウン能力の増大をもたらす（12-15）。さらに、低分子RNAによって配列特異的かつ非特異的な様式で誘発される先天免疫応答の活性化も細胞毒性副作用を媒介する可能性があり（16、17）、このことは（18）に概説がある。これらの作用は、いくつかの実験的トランスジェニックモデル系においてマウスの死亡率増加をもたらしており、shRNA過剰発現の直接的な副作用として報告されている（14,19）。
【０１７２】
RNAiに基づく治療薬の臨床移行のためには、ポリメラーゼIIプロモーターを利用する代替的な発現系が必要になる可能性が高いと考えられる。このクラスのプロモーターは、系列特異的またはさらには細胞型特異的な発現のための適切な調節エレメントの利用を可能にする。これはまた、pol IIIプロモーターと比較してより低いレベルの発現をもたらしうると考えられ、それにより、高MOIで形質導入された細胞で報告されているプロセシング機構の過飽和が未然に防がれる可能性がある。shRNA発現のためのpol IIプロモーターの使用を複雑にするものであるが、効率的なプロセシングのために内因性miRNA前駆体に通常由来する隣接配列の中にshRNA配列を埋め込む必要がある。miRNAスカフォールドが隣接したshRNAは内因性miRNAの構造を模している（10,20）。今日に至るまで、ヒトmiRNA-30およびmiRNA-223に由来する隣接領域は、哺乳動物細胞における発現のための組換えshRNAの組み入れのために広く用いられており、この発現戦略をさらに良く理解するため、および改良するために数多くの取り組みが行われている（21）。後者のmiRNAは、造血細胞におけるshRNA発現のためのスカフォールドとして用いると特に有効であることが示されており、いくつかの造血細胞型において効率的なプロセシングおよびパッセンジャー鎖活性の低さの結果として標的mRNAの実質的なノックダウンを媒介する（21,22）。
【０１７３】
本開示において、本発明者らは、将来の治療用途のためにshRNAmiRのプロセシングおよび最適化を研究するための標的としてBCL11Aを利用した。BCL11Aは、主要な異常ヘモグロビン症である鎌状赤血球症（SCD）およびβ-サラセミアにおける、γ-グロビン遺伝子、それ故にHbF発現の再活性化のための実証された治療標的である。BCL11Aのダウンモジュレーションまたは遺伝子欠失はγ-グロビン抑制を軽減し（23）、赤血球系列におけるBCL11Aの不活性化は遺伝的に操作されたマウスにおけるSCD表現型および臓器毒性を妨げる（24）。マウス胚性Hbb-y遺伝子はヒトγ-グロビン遺伝子の機能的ホモログであり、それ故に、マウス赤白血病（MEL）細胞におけるBCL11Aノックダウンの影響の評価のための簡便な代用物としての役を果たす。当初、本発明者らは、pol IIベースのベクターを用いたshRNAの発現後に、pol IIIベースのベクターによる場合と比較して、BCL11Aのノックダウンの効率の著しい低下を観察した。pol IIIおよびpol II shRNAmiRのデザインは、典型的には、21塩基の標的部位に一致させた配列をパリンドローム性ヘアピンステムの中に組み入れているが、これらの2種類の発現カセットからの転写物は異なるようにプロセシングされると予想される（25）。pol II shRNAmiR転写物はドローシャプロセシングの上流でRNAiプロセシング経路に入るが、はるかに短いpol III産物はドローシャの下流で経路に入って、ダイサーによってループ末端でのみ切断されると予想される。pol IIIプロモーターおよびpol IIプロモーターに由来する、プロセシングされた低分子RNAの配列に基づいて、本発明者らは、pol III shRNAカセットおよびpol II shRNAmiRカセットが、21塩基の標的と一致する配列の相対位置の点で、異なるようにプロセシングされたshRNAを生じさせることを観察した。有効なpol IIIで駆動されるshRNAによって産生される成熟ガイド鎖配列を模した、再設計されたshRNAmiRは、プロセシング効率および標的mRNAの阻害の強化につながった。赤血球系特異的な哺乳動物発現ベクターへのこれらの改変の組み入れは、BCL11Aタンパク質の著しいノックダウンおよび胎児型ヘモグロビンの再誘導につながった。また、この戦略により、汎造血性shRNA発現を伴う造血幹細胞およびB細胞系列区画における毒性も回避された。以上をまとめると、これらのデータは、種々のベクター環境におけるshRNAの使用に関連するRNAプロセシングの臨床的特徴を実証しており、また、広範な発現の有害な帰結を免れる系列特異的遺伝子ノックダウンのための戦略も提示している。本発明者らの知見は、マイクロRNAに埋め込まれたshRNAの設計、およびRNAiに基づく遺伝子治療アプローチにおけるそれらの適用のために重要な意味を持つ。
【０１７４】
1つの態様において、RNA干渉物質は、薬学的に許容される担体中にある状態で送達されるか、または投与される。リポソームなどの追加の担体物質を、薬学的に許容される担体に加えることができる。もう1つの態様において、RNA干渉物質は、薬学的に許容される担体中にある、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）をコードするベクターによって、個体の器官の細胞に送達される。shRNAは、細胞によって、転写後に例えばBCL11Aを標的とすることができるsiRNAに変換される。
【０１７５】
1つの態様において、RNA干渉物質は、SEQ ID NO：1〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAである。
【０１７６】
1つの態様において、ベクターは、テトラサイクリン誘導性ベクターなどの、調節可能なベクターである。例えば、pTet-Onベクター（BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）を用いる、Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5103-5106に記載された方法を用いることができる。1つの態様において、本明細書に記載の方法に用いられるRNA干渉物質は、ベクターを用いることなく、静脈内注入、例えば水圧注入（hydrodynamic injection）の後にインビボで細胞によって能動的に取り込まれ、これはRNA干渉物質の効率のよいインビボ送達の例証となる。siRNAを送達するための1つの方法は、適切な薬学的に許容される担体中にある状態での局所投与による。また、本発明の方法に用いられるRNA干渉物質、例えばsiRNAまたはshRNAを送達するための他の戦略、例えば、ベクター、例えばプラスミド、またはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターによる送達を使用することもできる。そのようなベクターは、例えば、Xiao-Feng Qin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 183-188に記載されたように用いることができる。他の送達方法には、RNA干渉物質を塩基性ペプチド、例えばTATペプチドの断片とコンジュゲートさせるかもしくは混合することによって塩基性ペプチドを用いて、陽イオン性脂質と混合して、または粒子に製剤化して、本発明のRNA干渉物質、例えばsiRNAまたはshRNAなどを送達することが含まれる。RNA干渉物質、例えばBCL11A mRNAを標的とするsiRNAは、単独で送達してもよく、または他のRNA干渉物質、例えばsiRNA（例えば他の細胞遺伝子を対象とするsiRNAなど）と組み合わせて送達してもよい。BCL11A siRNAはまた、皮膚の炎症を含む疾患または障害を治療または予防するために用いられる他の医薬品と組み合わせて投与することもできる。shRNA分子を含む合成siRNA分子は、当業者に公知のいくつかの手法を用いて得ることができる。例えば、siRNA分子は、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトおよび従来のDNA／RNA合成装置を用いて、化学的に合成すること、または組換え法によって生成させることができる（例えば、Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411 :494-498；Elbashir, S.M., W. Lendeckel and T. Tuschl (2001) Genes & Development 15: 188-200；Harborth, J. et al . (2001) J. Cell Science 114:4557-4565；Masters, J.R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98:8012-8017；およびTuschl, T. et al . (1999) Genes & Development 13:3191-3197を参照）。または、いくつかの商業的なRNA合成の供給元を利用することもでき、これには、Proligo（Hamburg, Germany）、Dharmacon Research（Lafayette, CO, USA）、Pierce Chemical（Perbio Scienceの一部、Rockford, IL, USA）、Glen Research（Sterling, VA, USA）、ChemGenes（Ashland, MA, USA）、およびCruachem（Glasgow, UK）が非限定的に含まれる。このように、siRNA分子は合成することが過度に困難ではなく、RNAiに適した品質で容易に提供される。さらに、dsRNAを、プラスミドベクター、レトロウイルスおよびレンチウイルスによってコードされたステムループ構造として発現させることもできる（Paddison, P. J. et al. (2002) Genes Dev. 16:948-958；McManus, M.T. et al. (2002) RNA 8:842-850；Paul, CP. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508；Miyagishi, M. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500；Sui, G. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:5515-5520；Brummelkamp, T. et al. (2002) Cancer Cell 2:243；Lee, N.S., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505；Yu, J.Y., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:6047-6052；Zeng, Y., et al. (2002) Mol. Cell 9: 1327-1333；Rubinson, D.A., et al. (2003) Nat. Genet. 33:401-406；Stewart, S.A., et al. (2003) RNA 9:493-501）。これらのベクターは一般に、dsRNAの上流にpol IIIプロモーターを有し、センスおよびアンチセンスRNA鎖を別々におよび／またはヘアピン構造として発現することができる。細胞内で、ダイサーが短鎖ヘアピンRNA（shRNA）を有効なsiRNAにプロセシングする。本発明のsiRNA分子の標的領域は、所与の標的遺伝子配列、例えば、開始コドンの約25〜50ヌクレオチド、約50〜75ヌクレオチド、または約75〜100ヌクレオチド下流から始まる、BCL11Aコード配列から選択することができる。ヌクレオチド配列は、5'または3' UTRおよび開始コドンの近傍の領域を含んでもよい。本発明のsiRNA分子を設計する1つの方法は、23ヌクレオチドの配列モチーフを同定して、少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％または75％のG／C含量を有するヒットを選択することを伴う。または、そのような配列が見いだされない場合には、モチーフNA（N21）を用いて検索を拡張することができ、ここでNは任意のヌクレオチドであってよい。この状況では、センスsiRNAの3'末端を、センスおよびアンチセンス3'オーバーハングの配列組成に関して対称的な二重鎖の生成を可能にするために、TTに変換することができる。続いて、アンチセンスsiRNA分子を、23ヌクレオチド配列モチーフのヌクレオチド位置1〜21に対する相補鎖として合成させることができる。対称的な3' TTオーバーハングの使用は、低分子干渉リボ核タンパク質粒子（siRNP）を、センスおよびアンチセンス標的RNA切断siRNPに関しておよそ等しい比で確実に形成させるために好都合でありうる（Elbashir et al., （2001）前記およびElbashir et al, 2001 前記）。また、NCBI、BLAST、DerwentおよびGenSeqを非限定的に含む配列データベースの分析、ならびにOLIGOENGINE（登録商標）などの商業的に利用可能なオリゴ合成会社を利用して、ただ1つの遺伝子のみが確実に標的となるようにESTライブラリーに対してsiRNA配列を選択することもできる。
【０１７７】
本発明のレンチウイルスベクターには、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、HIV-1、HIV-2）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）が非限定的に含まれる。治療法に用いるためにそれらの安全性を高めるため、および、異常ヘモグロビン症を非限定的に含む病状を治療するためのsiRNAをコードする下記のものなどの適した発現エレメントおよび治療用遺伝子を含めるために、当技術分野で認知された手法を用いて、これらのベクターを構築して操作することができる。
【０１７８】
レンチウイルスの想定される毒性を考慮して、遺伝子治療の用途におけるそれらの安全性を高めるために、さまざまなやり方でベクターを設計することができる。例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,365,150号に記載されているように、必要なレンチウイルス遺伝子（例えば、gagおよびpol）を別々のベクターに分離することによって、ベクターをより安全にすることができる。すなわち、レトロウイルスコード配列（gag、pol、env）が、レトロウイルスを複製能欠損性にする関心対象の遺伝子によって置き換えられるように、組換えレトロウイルスを構築することができる。続いて、複製能欠損レトロウイルスを、標準的な手法によるヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株の使用を通じて、ビリオン内にパッケージングする。組換えレトロウイルスを作製するため、およびインビトロまたはインビボで細胞をそのようなウイルスに感染させるためのプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14および他の標準的な実験マニュアルに記載がある。
【０１７９】
ウイルスを遺伝子送達ベクターとして用いるための主要な必要条件は、特に細胞集団における野生型ウイルスの伝播の可能性に関して、その使用の安全性を確保することである。複製能欠損レトロウイルスのみを産生する開発用パッケージング細胞株により、遺伝子治療に対するレトロウイルスの有用性が高まり、欠損レトロウイルスは遺伝子治療を目的とする遺伝子移入における使用に関して十分に特徴づけられている（概説については、Miller, A. D. (1990) Blood 76:271を参照）。したがって、本発明の1つの態様において、パッケージング細胞株が、ベクターウイルスの力価を高める目的で、本発明のベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を増殖させるために用いられる。パッケージング細胞株の使用はウイルスを増殖させるための安全なやり方とも考えられるが、これは、この系を用いると、組換えが起こって野生型ウイルスが生じる可能性が低くなるためである。加えて、パッケージングタンパク質の発現によって引き起こされる細胞への毒性を低下させるために、ウイルスのパッケージング機能をコードするプラスミドが例えば化学的手段によって一過性にのみトランスフェクトされるパッケージング系を用いることもできる。
【０１８０】
もう1つの態様において、特定のレンチウイルス配列を非レンチウイルス配列に置き換えることにより、ベクターをより安全にすることができる。したがって、本開示のレンチウイルスベクターは、その機能（例えば、ウイルス力価、感染性、組込み、ならびに高レベルおよび長期間の治療用遺伝子の発現を付与する能力）が実質的に低下しない限り、部分的（例えば、分割）遺伝子レンチウイルス配列、および／または非レンチウイルス配列（例えば、他のレトロウイルス由来の配列）を含んでもよい。ウイルスベクター中にクローニングしうる要素には、プロモーター、パッケージングシグナル、LTR、ポリプリントラクト、および逆応答エレメント（RRE）が非限定的に含まれる。
【０１８１】
本開示の1つの態様において、LTR領域は、ウイルスLTRプロモーターを異種プロモーターに置き換えることによって改変される。1つの態様において、5' LTRのプロモーターは異種プロモーターに置き換えられる。用いうる異種プロモーターの例には、脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）プロモーター、テトラサイクリン誘導性（TET）プロモーター、β-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーター（LCR）、およびサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターが非限定的に含まれる。
【０１８２】
いくつかの態様において、本開示のレンチウイルスベクターには、遺伝子治療における遺伝子送達物質としてのベクターの使用における安全性を改善するために改変されたベクターも含まれる。本発明の1つの態様においては、ベクターのLTR領域、例えば3' LTRなどが、U3および／またはU5領域において改変され、SINベクターが作り出される。そのような改変は、遺伝子送達を目的とするベクターの安全性の増大に寄与する。1つの態様において、本発明のSINベクターは、U3領域の一部分がインスレーターエレメントに置き換えられ、3' LTRにおける欠失を含む。インスレーターは、ベクター内のエンハンサー／プロモーター配列が付近のゲノム中の遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止し、かつその反対に、付近のゲノム配列がベクター内の遺伝子の発現に影響を及ぼすのを防止する。本発明の1つのさらなる態様において、3' LTRは、U5領域が例えば理想的なポリ（A）配列に置き換えられるように改変される。LTRの改変、例えば3' LTR、5'LTR、または3' LTRと5'LTRとの両方の改変なども、本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１８３】
レンチウイルスベクターのプロモーターは、特定遺伝子の5'隣接領域に天然に付随する（すなわち、インビボで細胞に存在する）ものでもよく、または非天然性に付随するものであってよい。プロモーターは、真核生物ゲノム、ウイルスゲノム、または合成配列に由来しうる。プロモーターは、非特異的（すべての組織において活性がある）（例えば、SFFV）、組織特異的（例えば、（LCR）、天然の調節過程によって調節される、外因性に適用された薬物によって調節される（例えば、TET）、または急性期応答中に活性化されるかもしくは複製中の細胞のみにおいて活性化されるプロモーターなどのように特定の生理的状態によって調節される）であるように選択することができる。本発明におけるプロモーターの非限定的な例には、脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、β-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーター（LCR）、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、レトロウイルスLTRプロモーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、SV40プロモーター、およびジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターが含まれる。また、プロモーターを、異常ヘモグロビン症を非限定的に含む病状と関連することが見いだされていてもよい選ばれた細胞型において特異的に発現されることが示されているものから選択することもできる。本発明の1つの態様において、プロモーターは、遺伝子発現が赤血球に限定されるように細胞特異的である。赤血球特異的発現は、ヒトβ-グロビンプロモーター領域および遺伝子座制御領域（LCR）を用いることによって達成される。
【０１８４】
当業者は、関心対象のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターの選択が、ベクター、核酸カセット、標的とされる細胞型、および所望の生物学的効果に依存すると考えられることを認識しているであろう。当業者はまた、プロモーターの選択において、パラメーターには以下が含まれうることも認識しているであろう：生理的効果を達成するのに十分に高いレベルの遺伝子発現を達成すること；決定的なレベルの遺伝子発現を維持すること；遺伝子発現の時間的調節を達成すること；細胞型特異的発現を達成すること；遺伝子発現の薬理学的、内分泌的、パラクリン性またはオートクリン性調節を達成すること；および、不適切なまたは望ましくないレベルの発現を防止すること。選択要求条件のいかなる所与のセットも諸条件に依存すると考えられるが、特定の要求条件が決定されれば容易に決定することができる。本発明の1つの態様において、プロモーターは、遺伝子発現が赤血球に限定されるように細胞特異的である。赤血球特異的発現は、ヒトβ-グロビンプロモーター領域および遺伝子座制御領域（LCR）を用いることによって達成される。
【０１８５】
本発明に用いるのに適した発現ベクターの構築のための標準的な手法は当業者には周知であり、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y.などの刊行物に記載がある。DNAの断片のライゲーションのためには種々の戦略が利用可能であり、その選択はDNA断片の末端の性質に依存し、選択は当業者によって容易に行われうる。
【０１８６】
前述のレンチウイルスベクターなどの本発明の遺伝子治療ベクターは、形質転換された赤血球系細胞において種々の治療用siRNAを発現させるために用いることができる。1つの態様において、ベクター中で発現させようとする関心対象のsiRNAは、異常ヘモグロビン症を治療するために用いうる遺伝子に由来し、例えば、BCL11Aに対するsiRNAなどである。
【０１８７】
本発明の具体的な遺伝子治療用構築物には、図2に示されたものが非限定的に含まれる。本明細書に記載の3種のレンチウイルスベクターが、BCL11A mRNA標的指向性配列を含むshRNAのステムとともに図式的に示されており、ループはmiR223特異的である。すべてが蛍光色素マーカー（Venus）を含み、自己不活性化（SIN）delta-U3 LEGOバックボーン（Ferhse Lab, Germany）内に構築されている。標的指向性shRNAの機能および毒性を評価するために、標的指向性shRNAが極めて強く遍在性に発現されるSFFVプロモーターを介して発現される、構成的ノックダウンレンチウイルスを用いた。標的指向性shRNAの機能、用量およびスケジュール依存的効果を評価するために、shRNAがPGKテトラサイクリン誘導性プロモーターを介して発現される誘導性ノックダウンレンチウイルスを用いた。shRNAがβ-グロビンLCRプロモーターランドスケープ（HS2／3 DNA高感受性部位、Naldini Lab, Italy）を介して発現される系列特異的レンチウイルスを、インビボ系で検証するための治療選択肢とした。LTR領域はさらに、U3およびU5領域、ならびにR領域も含む。U3およびU5領域を併せてまたは独立に改変することで自己不活性化性であるベクターを作り出すことができ、そうすることで遺伝子送達に用いるためのベクターの安全性を高めることができる。U3およびU5領域は、インスレーターエレメントを含むようにさらに改変することができる。
【０１８８】
細胞における感染性ウイルス粒子の産生を容易にする段階は、従来の手法、例えば標準的な細胞培養増殖手法を用いて実施することができる。当業者により所望であれば、本発明のベクターおよび方法を用いて、レンチウイルス保存溶液を調製してもよい。ウイルス保存溶液を調製する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633およびN. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113に記載さている。本発明において保存溶液を作製する方法では、レンチウイルス許容性細胞（本明細書ではプロデューサー細胞と称する）を、本発明のベクター系によってトランスフェクトさせる。続いて細胞を適した細胞培養条件下で増殖させて、レンチウイルス粒子を上記のように細胞自体または細胞培地のいずれかから収集する。適したプロデューサー細胞株には、ヒト胚性腎臓細胞株293、ウマ真皮細胞株NBL-6およびイヌ胎児胸腺細胞株Cf2THが非限定的に含まれる。
【０１８９】
感染性ウイルス粒子を収集する段階も、従来の手法を用いて実施しうる。例えば、当技術分野において公知であるように、感染性粒子は細胞溶解または細胞培養物の上清の収集によって収集することができる。任意で、収集されたウイルス粒子を所望であれば精製してもよい。適した精製手法は当業者には周知である。
【０１９０】
遺伝子治療におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法は、例えば、Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.): 1385-1425；Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9: 1975-81；Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74；Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11: 179-86；Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7: 1744-52；Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56；Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58；Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101；Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172；Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49；およびLee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8に記載がある。
【０１９１】
上記のようなレンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクター、またはそれを含む細胞は、当技術分野において周知であるように、任意の適した経路によって対象にインビボで投与することができる。「投与」という用語は、製剤化されたベクターの体内への導入の経路のことを指す。例えば、投与は、血管内、動脈内、静脈内、筋肉内、局所的、経口的であるか、または遺伝子銃もしくはハイポスプレー装置によるものであってよい。したがって、投与は標的組織に対して直接的であってもよく、または全身送達を経由してもよい。投与が骨髄内への直接注射であってもよい。標的組織への直接的な投与には、針注射、ハイポスプレー、エレクトロポレーション、または遺伝子銃が含まれる。例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO 93／18759号を参照のこと。
【０１９２】
または、本発明のレトロウイルスベクターを、当技術分野において周知の標準的なトランスフェクション手法を用いて、エクスビボまたはインビトロで細胞または組織に投与することもできる。
【０１９３】
1つの態様において、本発明のレトロウイルスベクターを、胚性幹細胞、体性幹細胞または始原細胞を含む宿主細胞に形質導入することができる。本発明のレトロウイルスベクターによって形質導入しうる始原宿主細胞の例には、赤血球の前駆細胞および造血幹細胞が含まれる。もう1つの態様において、宿主細胞は赤血球である。形質導入された宿主細胞を、異常ヘモグロビン症の治療において関心対象の遺伝子の赤血球系特異的発現を達成する方法に用いることができる。
【０１９４】
本発明のもう1つの局面は、本発明のレンチウイルスベクターの薬学的組成物に関する。1つの態様において、組成物は、異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる（例えば、異常ヘモグロビン症の症状を改善する）のに十分な治療的有効量にあるレンチウイルスベクターと薬学的に許容される担体とを含む。「治療的有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の治療結果、例えば、異常ヘモグロビン病状の治療または予防を達成するのに有用な量のことを指す。レンチウイルスベクターの治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびにレンチウイルスベクターがその個体において所望の応答を誘発する能力といった要因に応じて異なりうる。投薬レジメンは、最適な治療反応が得られるように調整することができる。治療的有効量はまた、レンチウイルスベクターのいかなる毒性または有害な作用よりも、治療上有益な効果の方が上回る量でもある。本発明のレンチウイルスベクターについて考えられる毒性を、細胞ベースのアッセイまたは当技術分野で認知された動物モデルを用いてアッセイし、顕著な毒性を示さない、治療的に有効なモジュレーターを選択することができる。1つの好ましい態様において、レンチウイルスベクターの治療的有効量は、異常ヘモグロビン症を治療するのに十分である。
【０１９５】
滅菌注射用溶液は、必要量のレンチウイルスベクターを、必要に応じて上に列挙されている種々の他の成分とともに適切な溶媒中に組み入れ、その後に濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌媒体中に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、活性成分および任意の追加的な所望の成分の粉末が、予め滅菌濾過したそれらの溶液から得られる、真空乾燥および凍結乾燥技法である。
【０１９６】
投与量の値は、軽減しようとする病状の重症度に応じて異なりうることに留意されたい。任意の特定の対象に関して、特定の投薬レジメンを、その個体の必要性および、この組成物を投与する者または組成物の投与を監督する者の専門家としての判断にしたがって、時間経過とともに調整することができること、および、本明細書に記載される投与量範囲は例示というだけであり、特許請求される組成物の範囲または実施の制限を意図したものでないことが、さらに理解されるべきである。1つの態様において、投与量は103〜108個のウイルス粒子／50kg体重の範囲である。他の態様において、投与量は103〜105個のウイルス粒子／50kg体重、104〜106個のウイルス粒子／50kg体重、105〜107個のウイルス粒子／50kg体重、103〜108個のウイルス粒子／50kg体重の範囲である。1つの態様において、投与量は約104個のウイルス粒子／50kg体重である。
【０１９７】
組成物中のウイルスベクターの量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重といった要因に応じて異なりうる。投薬レジメンは、最適な治療反応が得られるように調整することができる。例えば、例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、いくつかの分割用量を時間をかけて投与してもよいし、または治療状況の要件によって示される通りに用量を比例的に増減してもよい。投与の簡便性および投与量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で用いられる単位剤形とは、治療される哺乳動物対象に対する単位投与量として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体とともに、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（a）活性化合物の独自の特徴、および達成しようとする特定の治療効果、ならびに（b）個体における過敏症の治療のためにこのような活性化合物を配合する分野に固有の制約によって規定され、これらに直接依存する。しかし、いかなる所与の場合についても、適切な「有効量」は、慣行的な実験のみを用いて当業者によって決定されうる。
【０１９８】
本発明は、特定の態様において、異常ヘモグロビン症の治療に用いるための、本明細書において想定している治療用ポリペプチドおよび阻害性RNAを発現するように遺伝的に改変された細胞を想定している。本明細書で用いる場合、「遺伝的に操作された」または「遺伝的に改変された」という用語は、細胞内の遺伝物質の付加、欠失、または改変のことを指す。「遺伝的に改変された細胞」、「改変された細胞」および「改めて方向づけられた（redirected）細胞」という用語は、互換的に用いられる。特定の態様において、本明細書において想定しているベクターによって形質導入された細胞は、遺伝的に改変されている。本明細書で用いる場合、「遺伝子治療」という用語は、所望の治療成績を得るために細胞の生理現象を回復させる、是正する、または修正する、DNAまたはRNAの形態にある外部遺伝物質の、細胞内の遺伝物質全体への導入のことを指す。
【０１９９】
さまざまな態様において、本明細書において想定している遺伝的に改変された細胞は、インビトロまたはエクスビボで本発明のベクターによって形質導入され、さらに任意で、エクスビボで拡大される。続いて形質導入細胞を、遺伝子治療を必要とする対象に投与する。
【０２００】
本明細書において想定している遺伝子治療方法における形質導入および投与に適した細胞には、幹細胞、始原細胞、および分化細胞が非限定的に含まれる。ある態様において、形質導入細胞は、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、胎盤幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、赤血球始原細胞、および赤血球系細胞である。
【０２０１】
造血幹細胞（HSC）は、生物体の生存期間にわたって成熟血液細胞のレパートリー全体を生成することができる拘束された造血始原細胞（HPC）を生じさせる。「造血幹細胞」または「HSC」という用語は、骨髄系列（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系列（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞）、および当技術分野で公知のその他の系列を含めた、生物体の血液細胞の種類のすべてを生じさせる多分化能性幹細胞のことを指す（Fei, R., et al., 米国特許第5,635,387号；McGlave, et al., 米国特許第5,460,964号；Simmons, P., et al., 米国特許第5,677,136号；Tsukamoto, et al., 米国特許第5,750,397号；Schwartz, et al., 米国特許第5,759,793号；DiGuisto, et al., 米国特許第5,681,599号；Tsukamoto, et al., 米国特許第5,716,827号を参照）。致死的な放射線照射を受けた動物またはヒトに移植すると、造血幹・始原細胞は赤血球、好中球-マクロファージ、巨核球およびリンパ系の造血細胞プールを再増殖させることができる。
【０２０２】
いくつかの態様において、形質導入される細胞は、骨髄、臍帯血、または末梢循環から単離された造血幹細胞および／または造血始原細胞である。特定の態様において、形質導入される細胞は、骨髄、臍帯血、または末梢循環から単離された造血幹細胞である。
【０２０３】
1つの態様において、造血細胞はCD34+細胞である。
【０２０４】
1つの態様において、造血細胞は赤血球始原細胞である。
【０２０５】
1つの態様において、造血細胞は赤血球系細胞である。
【０２０６】
本発明の細胞は、自己由来／自源性（autogeneic）（「自己」）であっても非自己由来（「非自己」、例えば、同種異系、同系または異種）であってもよい。「自己由来」とは、本明細書で使用される場合、同じ対象由来の細胞を指す。「同種異系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。「同系」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。「異種」とは、本明細書で使用される場合、比較する細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい態様において、本発明の細胞は同種異系のものである。「単離された細胞」とは、インビボの組織または器官から得られ、かつ細胞外マトリックスを実質的に含まない細胞のことを指す。
【０２０７】
本明細書において想定している細胞ベースの治療法に適した遺伝的に改変された細胞の例示的な例には、以下が非限定的に含まれる：胚性幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、胎盤幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、造血始原細胞、骨髄系始原細胞、赤血球始原細胞、および他の赤血球系細胞。
【０２０８】
好ましい態様において、本明細書において想定している細胞ベースの治療法に適した細胞には、以下が非限定的に含まれる：造血幹細胞または始原細胞、前赤芽球、好塩基球性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、多染性赤血球、および赤血球（RBC）、またはそれらの任意の組み合わせ。
【０２０９】
異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法
本発明は、BCL11Aの発現を阻害するベクターを投与することによってHbF産生を増加させるための改良された組成物および方法を提供する。データから、BCL11Aの阻害がγ-グロビン遺伝子からの発現増大を招くことが実証されている。本明細書に開示される通り、細胞内の胎児型ヘモグロビンレベルを高めるための組成物および方法を提供することが、本発明の1つの目的である。いくつかの態様において、細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞、造血始原細胞、またはそれらの子孫である。
【０２１０】
したがって、本発明の1つの局面は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞を、少なくとも本明細書に記載の核酸分子を含むウイルスまたはベクターを含む組成物の有効量と接触させ、それによって細胞またはその子孫において、そのような接触の前の細胞に比して、BCL11Aの発現が低下し、胎児型ヘモグロビン発現が増大する段階を含む、細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるための方法を提供する。1つの態様において、ベクターまたはウイルスは、BCL11Aを阻害するBCL11AマイクロRNAであるRNA干渉物質を発現し、それによってBCL11Aの発現を低下させる。
【０２１１】
細胞をBCL11Aの阻害薬と接触させることに関連して、細胞における「胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させること」は、BCL11A阻害薬によって治療された集団では、BCL11A阻害薬が全く存在しない同等の対照集団よりも、HbFが少なくとも5％高いことを指し示している。BCL11A阻害薬で治療された集団におけるHbF発現のパーセンテージは、同等のサイズおよび培養条件の対照処理集団よりも、少なくとも10％高い、少なくとも20％高い、少なくとも30％高い、少なくとも40％高い、少なくとも50％高い、少なくとも60％高い、少なくとも70％高い、少なくとも80％高い、少なくとも90％高い、少なくとも1倍高い、少なくとも2倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも100倍高い、少なくとも1000倍高い、またはそれを上回ることが好ましい。「対照処理集団」という用語は、非標的指向性オリゴヌクレオチドを例外として、同一の培地、ウイルス誘導、核酸配列、温度、培養密度、フラスコサイズ、pHなどで処理された細胞の集団を説明するために本明細書で用いられる。
【０２１２】
本明細書に記載の方法のいずれかのうちいくつかの態様において、対象は、異常ヘモグロビン症、例えば、SCDまたはTHALを有する疑いがあるか、またはそれを有するリスクがある。異常ヘモグロビン症を有するかまたはそれを発症するリスクがある対象を認識することは、十分に当業者の技能の範囲内にある。
【０２１３】
また、対象が、種々の追加的な治療処置のいずれかを受けていてもよい。したがって、例えば、対象は、酸素、ヒドロキシ尿素、葉酸、または輸血によって治療されている対象であってもよい。
【０２１４】
RNA干渉物質、例えばsiRNA、またはRNA干渉物質を含むベクターを、取り込みのために標的細胞、例えば赤血球または他の所望の標的細胞に送達する方法には、RNA干渉物質、例えばsiRNAを含む組成物の注入、または細胞、例えば赤血球と、RNA干渉物質、例えばsiRNAを含む組成物との直接接触が含まれる。もう1つの態様において、RNA干渉物質、例えばsiRNAは、静脈、動脈、細静脈または細動脈などの血管に、例えば水圧注入またはカテーテル挿入によって直接注入することができる。投与は1回の注入によっても、または2回もしくはそれを上回る注入によってもよい。RNA干渉物質は薬学的に許容される担体中にある状態で送達される。1種または複数種のRNA干渉物質を同時に用いることができる。1つの好ましい態様においては、ヒトBCL11Aを標的とする単一のsiRNAのみを用いる。1つの態様においては、特定の細胞をRNA干渉の標的とし、RNA干渉の非特異的なターゲティングによって引き起こされるRNA干渉の潜在的な副作用を制限する。この方法では、例えば、RNA干渉を細胞に有効に送達するために用いられる細胞ターゲティングモイエティとRNA干渉結合モイエティとを含む複合体または融合分子を用いることができる。例えば、抗体-プロタミン融合タンパク質は、siRNAと混合されると、siRNAと結合して、その抗体によって認識される抗原を発現する細胞内にsiRNAを選択的に送達し、その結果、その抗原を発現する細胞においてのみ遺伝子発現のサイレンシングを引き起こす。siRNAまたはRNA干渉誘導分子の結合モイエティは、タンパク質またはタンパク質の核酸結合ドメインもしくは断片であり、結合モイエティはターゲティングモイエティの一部分と融合されている。ターゲティングモイエティの場所は、構築物のカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれか、または融合タンパク質の中央でありうる。また、ウイルス媒介性送達機構を、Xia, H. et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10): 1006）に記載されたように、インビトロおよびインビボで細胞にsiRNAを送達するために用いることもできる。また、Rubinson, D.A., et al.（(2003) Nat. Genet. 33:401-406）およびStewart, S.A., et al.（(2003) RNA 9:493-501）に記載されたように、shRNAのプラスミド媒介性またはウイルス媒介性送達機構を、インビトロおよびインビボで細胞にshRNAを送達するために用いることもできる。RNA干渉物質、例えばsiRNAまたはshRNAを、以下の作用の1つまたは複数を遂行する構成要素とともに導入することができる：細胞、例えばリンパ球または他の細胞による、RNA干渉物質、例えばsiRNAの取り込みを強化する、一本鎖のアニーリングを阻害する、一本鎖を安定化する、または他の様式で標的細胞への送達を助長して、標的遺伝子、例えばBCL11Aの阻害を増大させる。特定のRNA干渉物質の用量は、特定の標的遺伝子のRNA干渉、例えば翻訳後遺伝子サイレンシングを達成し、それによって標的遺伝子発現の阻害または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルの阻害をもたらすために必要な量であると考えられる。
【０２１５】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、または造血始原細胞、または造血幹細胞（HSC）は、エクスビボまたはインビトロで接触される。1つの具体的な態様において、接触される細胞は、赤血球系列の細胞である。1つの態様において、組成物はBCL11A発現を阻害する。
【０２１６】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、または造血始原細胞、またはHSCは、本明細書に記載の組成物と接触させる前、またはSEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択される核酸配列を含む核酸分子を保有するウイルスもしくはベクターと接触させる前、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを発現するウイルスもしくはベクターと接触させる前に、対象から単離される。
【０２１７】
成熟血液細胞の寿命は有限であり、一生を通じて継続的に置き換えられなければならない。血液細胞は多能性造血幹細胞（HSC）の極めて小規模な集団の増殖および分化によって生成され、自己再生によって自らを補充する能力も有する。HSCは、中胚葉性血管芽細胞から発生する多能性の自己再生性始原細胞である。HSCは他のすべての血液細胞を生み出す血液細胞であり、それには赤血球系、リンパ系および骨髄系系列由来の、分化したすべての血液細胞が含まれる。HSCは成人の骨髄、末梢血および臍帯血中に位置している。
【０２１８】
分化の間に、HSCの子孫はさまざまな中間成熟段階を経て発達し、成熟に達する前に、多能性造血始原細胞および系列が拘束された造血始原細胞を生じる。骨髄（BM）はヒトにおける主要な造血部位であり、正常な状態では、末梢血（PB）中にはごく少数のHSCおよび造血始原細胞しか認められない。サイトカイン（特に顆粒球コロニー刺激因子；G-CSF）、癌治療に用いられる骨髄抑制薬、および造血細胞とBMストローマ細胞との相互作用を妨げる化合物による治療により、多数の幹細胞および始原細胞を循環血中に急速に動員することができる。
【０２１９】
「造血始原細胞」は、本明細書でこの用語を用いる場合、骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系系列（T細胞、B細胞、NK細胞）を含む、すべての血液細胞型を生み出す造血幹細胞系列の細胞のことを指す。「赤血球系列の細胞」は、接触される細胞が、最終分化するとそれが赤血球（erythrocyte）または赤血球（RBC）を形成するように、赤血球生成を起こす細胞であることを指し示している。そのような細胞は、骨髄造血始原細胞から派生する赤血球系、リンパ系および骨髄系という3種の系列の1つに属する。特定の増殖因子および造血微小環境の他の構成要素に曝露されると、造血始原細胞は、一連の中間分化細胞型、赤血球系列のすべての中間体を経て、RBCへと成熟することができる。したがって、「赤血球系列」の細胞は、本明細書でこの用語を用いる場合、造血始原細胞、前赤芽球、前赤血球、赤芽球、後赤血球、網状赤血球および赤血球を含む。
【０２２０】
本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの態様において、造血始原細胞は、造血始原細胞に特徴的な細胞表面マーカー：CD34+、CD59+、Thy1／CD90+、CD38lo／-、およびC-kit／CD117+のうち少なくとも1つを有する。好ましくは、造血始原細胞はこれらのマーカーのいくつかを有する。
【０２２１】
本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの態様において、赤血球系列の造血始原細胞は、赤血球系列に特徴的な細胞表面マーカー：CD71およびTer119を有する。
【０２２２】
本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの態様において、HSCは、造血始原細胞に特徴的な細胞表面マーカー：CD34+、CD59+、Thy1／CD90+、CD38lo／-、およびC-kit／CD117+の少なくとも1つを有する。
【０２２３】
HSCは、造血始原細胞と同様に、増殖して、多数の母細胞を生成する能力を有するさらに多くの始原細胞を生み出すことができ、それらの母細胞がひいては分化した娘細胞または分化可能な娘細胞を生み出す。娘細胞自体を、増殖して、後に1つまたは複数の成熟細胞型へと分化する子孫を生じるように誘導することもでき、同時に、親の発生能を有する1つまたは複数の細胞も維持することができる。「幹細胞」という用語はこの場合、特定の環境下で、より特化または分化した表現型へと分化する能力または潜在能力を有し、かつある特定の環境下では、実質的に分化することなく増殖する能力も保っている細胞のことを指す。1つの態様において、始原細胞または幹細胞という用語は、その子孫（descendant）（子孫（progeny））が、胚細胞および組織の進行性多様化において起こるように、分化によって、例えば、完全に個別的な特徴を獲得することによって、多くの場合は異なる方向に特化する、全般性母細胞のことを指す。細胞分化は複雑な過程であり、典型的には多くの細胞分裂を経由して起こる。分化した細胞は、それ自体が多能性細胞に由来する多能性細胞に由来していることがあり、以下も同様である。これらの多能性細胞のそれぞれを幹細胞と見なしてもよいが、それぞれが生み出すことのできる細胞型の範囲にはかなりの違いがある。ある種の分化した細胞が、より多くの発生能を持つ細胞を生み出す能力を有することもある。そのような能力は天然性であってもよく、またはさまざまな因子による治療によって人工的に誘導されてもよい。多くの生物学な事例において、幹細胞は、複数の別個の細胞型の子孫を生じるという理由で「多能性」でもあるが、これは「幹細胞性」にとって必要ではない。自己再生は幹細胞定義のもう一方の古典的な部分であり、本文書で用いる場合には必須である。理論上、自己再生はこの2つの主要な機序のいずれかによって起こりうる。幹細胞は、幹細胞状態を保っている一方の娘細胞と、幾分異なる他の特定の機能および表現型を発現する他方の娘細胞とに非対称に分裂することがある。または、集団内の幹細胞のうちのいくつかが2つの幹細胞に対称的に分裂し、それ故に全体として集団内にいくつかの幹細胞が維持されうる一方で、集団内の他の細胞が分化した子孫のみを生み出すこともある。一般に、「始原細胞」は、より原初的である（すなわち、完全に分化した細胞よりも発生経路または進行の上でより早い段階にある）細胞表現型を有する。多くの場合、始原細胞はまた、顕著または非常に高い増殖能も有する。始原細胞は、発生経路ならびに細胞が発生および分化する環境に依存して、複数の別個の分化した細胞型を生み出すこともあれば、または単一の分化した細胞型を生み出すこともある。
【０２２４】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、造血幹細胞または造血始原細胞は、末梢血、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤血、または骨髄から収集される。
【０２２５】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、または骨髄細胞は、末梢血、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤血または骨髄から収集される。
【０２２６】
末梢血始原細胞（PBPC）は、同種異系移植および自己移植のための造血始原細胞の好ましい供給源となっているが、これは収集が技術的に容易であり、かつ生着のために必要な時間がより短いためである。伝統的には、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が、より多くのPBPCを刺激して、骨髄から造血始原細胞を放出させるために用いられてきた。G-CSFを用いるレジメンは通常、十分な数のPBPCを健常ドナーから収集することには成功しているが、5％〜10％では幹細胞がほとんど動員されないと考えられ、複数回の多量のアフェレーシスまたは骨髄採取を必要とする。
【０２２７】
本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの態様において、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、または造血始原細胞、またはHSCは、接触の前にCD34+表面マーカーに関して選択される。
【０２２８】
したがって、本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、単離されたCD34+胚性幹細胞、単離されたCD34+体性幹細胞、単離されたCD34+始原細胞、単離されたCD34+骨髄細胞、単離されたCD34+造血始原細胞、または単離されたCD34+HSCは、本明細書に記載の組成物と接触されるか、またはSEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択される核酸配列を含む核酸分子を保有するウイルスもしくはベクターと接触されるか、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを発現するウイルスもしくはベクターと接触される。
【０２２９】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、または造血始原細胞、またはHSCは、本明細書に記載の組成物との任意の接触の前、またはSEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択される核酸配列を含む核酸分子を保有するウイルスもしくはベクターと接触させる前、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを発現するウイルスもしくはベクターと接触させる前に、凍結保存される。
【０２３０】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、接触はインビトロ、エクスビボまたはインビボである。
【０２３１】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、接触は少なくとも1回繰り返される。すなわち、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、または造血始原細胞、またはHSCと、本明細書に記載の組成物との、またはSEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択される核酸配列を含む核酸分子を保有するウイルスもしくはベクターとの、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを発現するウイルスもしくはベクターとの、最初の第1の接触の後に、細胞を洗浄し、洗浄した細胞を続いて2回目に、本明細書に記載の組成物と接触させるか、またはSEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択される核酸配列を含む核酸分子を保有するウイルスもしくはベクターと接触させるか、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを発現するウイルスもしくはベクターと接触させる。
【０２３２】
他の態様においては、最初の第1の接触の後に、接触を少なくとも2回繰り返す。
【０２３３】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、接触の後に、接触された胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、または造血始原細胞、またはHSCは、使用、例えばエクスビボ拡大および／または対象への移植の前に、凍結保存される。
【０２３４】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、接触の後に、接触された胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、または造血始原細胞、またはHSCは、使用、例えば凍結保存および／または対象への移植／生着の前に、エクスビボにて培養下で拡大される。
【０２３５】
本明細書に記載のいずれかの方法の1つの態様において、接触の後に、接触された胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、または造血始原細胞、またはHSCを、使用、例えば凍結保存および／または対象への移植／生着の前に、エクスビボにて培養下で分化させる。
【０２３６】
細胞発生（cell ontogeny）の文脈で、「分化した」、または「分化している」という形容詞は、相対的な用語である。「分化した細胞」は、それと比較される細胞よりも、発生経路でさらに下流まで進んでいる細胞である。すなわち、幹細胞は、系列が限定された前駆細胞（造血始原細胞など）に分化することができ、それが次に経路のさらに下流にある他の型の前駆細胞（赤血球前駆細胞）に分化することができ、続いて、ある特定の組織型において特徴的な役割を果たしかつさらに増殖する能力を保っていることも保っていないこともある、赤血球などの最終段階分化細胞に分化することができる。
【０２３７】
1つの態様において、BCL11A発現の阻害薬は、BCL11A特異的RNA干渉物質、または前記BCL11A特異的RNA干渉物質をコードするベクターである。1つの具体的な態様において、RNA干渉物質は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列のうち1つまたは複数である。
【０２３８】
「核酸」とは、本明細書に記載される場合、RNAまたはDNAであってよく、かつ一本鎖または二本鎖であってよく、例えば、以下のものを含む群から選択されうる：関心対象のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えばペプチド-核酸（PNA）、疑似相補的PNA（pc-PNA）、ロックド核酸（LNA）など。そのような核酸配列には、例えば、例えば転写リプレッサーとして作用するタンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、例えばRNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi（miRNA）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを非限定的に含む低分子阻害性核酸配列が非限定的に含まれる。
【０２３９】
本明細書に開示される通り、対象における胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるための方法を提供することが、本発明の1つの目的である。
【０２４０】
したがって、本発明の1つの局面は、対象における造血始原細胞またはHSCを、BCL11Aの阻害薬を含む組成物の有効量と接触させ、それによってHbF発現を、そのような接触の前の発現に比して増加させる段階を含む、その必要のある対象において胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるための方法を提供する。1つの態様において、BCL11Aの阻害薬は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列のうち1つもしくは複数を含むRNA干渉物質、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAである。
【０２４１】
対象における細胞をBCL11Aの阻害薬と接触させることに関連して、細胞における「HbFレベルを上昇させること」は、BCL11A阻害薬によって治療された集団では、BCL11A阻害薬が全く存在しない同等の対照集団よりも、対象におけるHbFが少なくとも5％高いことを指し示している。BCL11A阻害薬で治療された対象における胎児型ヘモグロビンの発現は、同等の対照治療対象よりも、少なくとも10％高い、少なくとも20％高い、少なくとも30％高い、少なくとも40％高い、少なくとも50％高い、少なくとも60％高い、少なくとも70％高い、少なくとも80％高い、少なくとも90％高い、少なくとも1倍高い、少なくとも2倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも100倍高い、少なくとも1000倍高い、またはそれを上回ることが好ましい。「同等の対照治療集団」という用語は、非標的指向性オリゴヌクレオチドの添加を例外として、同一の治療を受けた対象を説明するために本明細書で用いられる。
【０２４２】
したがって、1つの態様において、対象は異常ヘモグロビン症と診断されている。1つのさらなる態様において、異常ヘモグロビン症はSCDである。本明細書で用いる場合、SCDは、鎌状細胞貧血、鎌状ヘモグロビンC症（HbSC）、鎌状β+サラセミア（HbS／β+）、または鎌状β0サラセミア（HbS／β0）である。もう1つの好ましい態様において、異常ヘモグロビン症はTHALである。
【０２４３】
本発明による治療は、個体における胎児型ヘモグロビンの量を増加させることによって本障害に伴う1つまたは複数の症状を改善する。異常ヘモグロビン症に典型的に伴う症状には、例えば、貧血、組織低酸素、臓器機能不全、異常なヘマトクリット値、無効造血、異常な網状赤血球（赤血球）数、異常な鉄負荷、環状鉄芽球の存在、脾腫、肝腫大、末梢血流の障害、呼吸困難、溶血の増加、黄疸、貧血性疼痛発作、急性胸部症候群、脾臓血球貯留、持続勃起、脳卒中、手足症候群、および疼痛、例えば狭心症などが含まれる。
【０２４４】
1つの態様においては、造血始原細胞またはHSCをエクスビボまたはインビトロで接触させ、この細胞またはその子孫を対象に投与する。1つのさらなる態様において、造血始原細胞は赤血球系列の細胞である。
【０２４５】
1つの態様において、造血始原細胞またはHSCは、BCL11Aの阻害薬と薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む組成物と接触される。1つの態様において、組成物は、注射、注入、滴下投与または経口摂取によって投与される。1つの態様において、組成物は骨髄内への直接注射によって投与される。
【０２４６】
記載されたいずれか1つの方法の1つの態様において、遺伝子治療方法は、ヘモグロビンC症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（SCD）、鎌状細胞貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β-サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α-サラセミア、およびヘモグロビンH症からなる群より選択される異常ヘモグロビン症を治療、予防または改善するために用いられる。
【０２４７】
記載されたいずれか1つの方法のさまざまな態様において、レトロウイルスベクターは、遺伝子治療を必要とする対象の細胞、組織または器官へのインビボでの直接注射によって投与される。記載されたいずれか1つの方法のさまざまな他の態様において、細胞は、インビトロまたはエクスビボで本発明のベクターによって形質導入され、任意でエクスビボにて拡大される。続いて形質導入細胞を、遺伝子治療を必要とする対象に投与する。
【０２４８】
「対象」は、本明細書で用いる場合、本明細書の他所で開示されている遺伝子治療ベクター、細胞ベースの治療薬、および方法を用いて治療することができる単一遺伝子性の疾患、障害または病状の症状を呈する任意の動物を含む。好ましい態様において、対象には、本明細書の他所で開示されている遺伝子治療ベクター、細胞ベースの治療薬、および方法を用いて治療しうる造血系の疾患、障害または病状、例えば異常ヘモグロビン症の症状を呈する任意の動物が含まれる。適した対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなど）、家畜、および家飼い動物または愛玩動物（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長動物、好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対象には、遺伝子治療によってモジュレートすることができる、異常な量（「正常」または「健常」な対象よりも少量または多量）の1つまたは複数の生理的活性を呈する動物が含まれる。
【０２４９】
1つの態様において、本明細書で用いる場合、「治療」または「治療すること」には、疾患または病的状態の症状または病態に対する任意の有益なまたは望ましい効果が含まれ、かつ、治療されている疾患または病状の1種または複数種の測定可能なマーカーの最小限の減少でさえも含まれうる。もう1つの態様において、治療は、任意で、疾患もしくは病状の症状の軽減もしくは改善、または疾患もしくは病状の進行の遅延を含みうる。「治療」は、必ずしも疾患もしくは病状、またはそれに伴う症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。
【０２５０】
1つの態様において、本明細書で用いる場合、「予防する」および類似の語、例えば、「予防される」、「予防すること」などは、疾患または病状の発生または再発を予防するため、阻害するため、またはその可能性を低下させるためのアプローチのことを指す。もう1つの態様において、この用語は、疾患もしくは病状の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは病状の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。もう1つの態様において、本明細書で用いる場合、「予防」および類似の語は、疾患または病状が発症または再発する前に、疾患または病状の強度、影響、症状および／または負担を軽減することも含む。
【０２５１】
記載されたいずれか1つの方法の1つの態様において、本方法は、記載された遺伝子治療を必要とする対象を選択する段階をさらに含む。例えば、異常ヘモグロビン症の症状または細胞診を呈する対象は、ヘモグロビンC症、ヘモグロビン鎌状赤血球症（SCD）、鎌状細胞貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β-サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α-サラセミア、およびヘモグロビンH症からなる群より選択される。または、対象は、本明細書において記載された遺伝子突然変異である、異常ヘモグロビン症に関連した遺伝子突然変異を保有する。例として、電気泳動によって遺伝子型HbSS、HbS／β0サラセミア、HbSD、またはHbSO、および／またはHbFが10％未満であるSCDと診断された対象が挙げられる。
【０２５２】
記載されたいずれか1つの方法のさまざまな態様においては、遺伝子治療を必要とする対象に、本明細書において想定している遺伝的に改変された細胞の有効量を含む細胞の集団が投与される。それは、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列のうち1つもしくは複数、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを発現する遺伝的に改変された細胞である。
【０２５３】
本明細書で用いる場合、「量」という用語は、臨床結果を含む有益なまたは所望の予防結果または治療結果を達成するためのウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「有効な量」または「有効量」のことを指す。
【０２５４】
「予防的有効量」とは、所望の予防結果を達成するために有効な、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の量のことを指す。必ずではないが典型的には、予防的用量は疾患の前に、または疾患のより早い段階で対象に用いられることから、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【０２５５】
ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「治療的有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに幹細胞および始原細胞が個体において所望の応答を誘発する能力といった要因に応じて異なりうる。治療的有効量は、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞のいかなる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な効果が上回る量でもある。「治療的有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療する」ために有効な量を含む。
【０２５６】
1つの態様において、本発明は、本明細書において想定しているベクターによって形質導入された1つまたは複数の細胞を対象に、例えば非経口的に投与する段階を含む、形質導入細胞を対象に提供する方法を提供する。1つの態様において、ベクターは、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列のうち1つもしくは複数、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを保有するものである。
【０２５７】
1つの特定の態様においては、対象における異常ヘモグロビン症を予防、改善または治療する方法が提供される。本方法は、本明細書において想定しているベクターによって形質導入された造血細胞を含む細胞の集団を投与する段階を含む。1つの態様において、ベクターは、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列のうち1つもしくは複数、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを保有するものである。
【０２５８】
特定の態様において、対象に投与される細胞の集団は、造血幹細胞または始原細胞、前赤芽球、好塩基球性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、多染性赤血球、および赤血球（RBC）、またはそれらの任意の組み合わせを含み、かつそれらの任意の割合が、本明細書において想定しているベクターによって遺伝的に改変されてよい。1つの態様において、ベクターは、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列のうち1つもしくは複数、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを保有するものである。
【０２５９】
遺伝的に改変された細胞は、骨髄除去療法を受けた個体または受けていない個体において骨髄移植または臍帯血移植の一部として投与することができる。1つの態様において、本明細書において想定している遺伝的に改変された細胞を、化学除去（chemoablative）または放射線除去（radioablative）骨髄療法を受けた個体に骨髄移植において投与する。
【０２６０】
1つの態様において、遺伝的に改変された細胞は対象に静脈内送達される。好ましい態様において、遺伝的に改変された造血幹細胞は対象に静脈内投与される。
【０２６１】
特定の態様において、患者は、細胞約1×105個／kg、細胞約5×105個／kg、細胞約1×106個／kg、細胞約2×106個／kg、細胞約3×106個／kg、細胞約4×106個／kg、細胞約5×106個／kg、細胞約6×106個／kg、細胞約7×106個／kg、細胞約8×106個／kg、細胞約9×106個／kg、細胞約1×107個／kg、細胞約5×107個／kg、細胞約1×108個／kg、またはそれを上回る用量の、遺伝的に改変された細胞、例えば、造血幹細胞を、1回の単回静脈内投与として受ける。ある態様において、患者は、少なくとも細胞1×105個／kg、少なくとも細胞5×105個／kg、少なくとも細胞1×106個／kg、少なくとも細胞2×106個／kg、少なくとも細胞3×106個／kg、少なくとも細胞4×106個／kg、少なくとも細胞5×106個／kg、少なくとも細胞6×106個／kg、少なくとも細胞7×106個／kg、少なくとも細胞8×106個／kg、少なくとも細胞9×106個／kg、少なくとも細胞1×107個／kg、少なくとも細胞5×107個／kg、少なくとも細胞1×108個／kg、またはそれを上回る用量の遺伝的に改変された細胞、例えば、造血幹細胞を、1回の単回静脈内投与として受ける。
【０２６２】
1つの追加的な態様において、患者は、細胞約1×105個／kg〜細胞約1×108個／kg、細胞約1×106個／kg〜細胞約1×108個／kg、細胞約1×106個／kg〜細胞約9×106個／kg、細胞約2×106個／kg〜細胞約8×106個／kg、細胞約2×106個／kg〜細胞約8×106個／kg、細胞約2×106個／kg〜細胞約5×106個／kg、細胞約3×106個／kg〜細胞約5×106個／kg、細胞約3×106個／kg〜細胞約4×108個／kgの用量の、またはそれらの任意の中間用量である細胞個数／kgの、遺伝的に改変された細胞、例えば、造血幹細胞を投与される。
【０２６３】
さまざまな態様において、本発明の方法は、既存の方法よりも頑強かつ安全な遺伝子治療であって、形質導入された細胞を約5％、形質導入された細胞を約10％、形質導入された細胞を約15％、形質導入された細胞を約20％、形質導入された細胞を約25％、形質導入された細胞を約30％、形質導入された細胞を約35％、形質導入された細胞を約40％、形質導入された細胞を約45％、または形質導入された細胞を約50％含む細胞の集団または用量を対象に投与する段階を含む遺伝子治療を提供する。
【０２６４】
1つの態様において、本発明は、赤血球系細胞の集団を拡大または増加させる能力を有する遺伝的に改変された細胞、例えば幹細胞、例えば造血幹細胞などを提供する。本発明のベクターによって造血幹細胞に形質導入し、異常ヘモグロビン症に対する治療法を必要とする個体に投与する。造血幹細胞は赤血球系細胞が起源であり、それ故に好ましい。1つの態様において、ベクターは、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列のうち1つもしくは複数、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを保有するものである。
【０２６５】
本明細書で用いる場合、組成物、担体、希釈剤および試薬を指す場合の「薬学的に許容される」という用語およびその文法上の変化形は互換的に用いられ、その材料を悪心、めまい、胃のむかつきなどのような望ましくない生理的影響を生じることなく対象に投与しうることを表している。各担体は、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容される」でもなければならない。薬学的に許容される担体は、それが望まれる場合を除き、混合される作用物質に対する免疫応答の発生を促進しないと考えられる。溶解または分散される活性成分を内部に含有する薬理学的組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されており、製剤に基づいて限定される必要はない。薬学的製剤は、本発明の化合物を、1つまたは複数の薬学的に許容される成分と組み合わせて含有する。担体は、固体、半固体または液体の希釈剤、クリームまたはカプセルの形態であってよい。典型的には、そのような組成物は溶液または懸濁液のいずれかとして注入可能なように調製されるが、使用前に液体中に溶解または懸濁させるのに適した固体形態を調製することもできる。また、調製物を乳化すること、またはリポソーム組成物として提示することもできる。活性成分は、薬学的に許容されかつ活性成分と適合性のある添加剤と、本明細書に記載の治療法において用いるのに適した量で混合することができる。適した添加剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組み合わせである。加えて、必要に応じて、組成物は、活性成分の有効性を強化する、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤などの補助物質を少量含んでもよい。本発明の治療用組成物は、成分の薬学的に許容される塩をその中に含むことができる。薬学的に許容される塩には、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄の水酸化物などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から導き出すことができる。生理学的に許容される担体は当技術分野において周知である。例示的な液状担体は、活性成分と水のほかに何の物質も含まないか、生理的pH値のリン酸ナトリウム、生理食塩水または両方、例えばリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤を含む、滅菌水溶液である。さらに、水性担体は、2種以上の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含むことができる。液体組成物はまた、水に加えてまたは水を除いて液相を含むことができる。そのような追加の液相の例には、グリセリン、綿実油などの植物油、および水-油エマルジョンがある。特定の障害または病状の治療に有効と考えられる、本発明で用いられる活性作用物質の量は、その障害または病状の性質に依存すると考えられ、標準的な臨床手法によって決定することができる。「薬学的に許容される担体または希釈剤」という語句は、身体のある器官または部分から身体の別の器官または部分への対象薬剤の運搬または輸送に関与する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、添加剤、溶媒またはカプセル化材料などの、薬学的に許容される物質、組成物または媒体を意味する。
【０２６６】
記載されたいずれかの方法の1つの態様において、本明細書で用いる場合、「投与される」とは、BCL11Aの阻害薬を、所望の部位での阻害薬の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって対象に配置することを指す。BCL11Aを阻害する作用物質は、対象において有効な治療を生じさせる任意の適切な経路によって投与することができ、すなわち、投与は対象の所望の位置への送達をもたらし、送達された組成物の少なくとも一部、すなわちBCL11Aを阻害する少なくとも1種の作用物質は、その所望の部位である期間にわたって活性である。阻害薬が活性である期間は、対象への投与後のインビボでの半減期に依存し、数時間、例えば、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、少なくとも10時間、少なくとも12時間、少なくとも18時間、少なくとも24時間のように短いことも、数日、数年のように長いこともある。投与の様式には、注射、注入、滴下投与または経口摂取が含まれる。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、皮膜下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内の注射および注入が非限定的に含まれる。
【０２６７】
1つの態様において、本明細書に記載の組成物、またはSEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択される核酸配列を含む核酸分子を保有するウイルスもしくはベクター、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを発現するウイルスもしくはベクターは、骨髄内に注射される。
【０２６８】
1つの態様において、治療を必要とする対象由来の造血始原細胞またはHSCは、BCL11A発現を阻害する組成物と接触される。他の態様において、組成物は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択される核酸配列を含む核酸分子を保有するウイルスもしくはベクター、または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを発現するウイルスもしくはベクターを含む。治療を必要とする対象は、SCDまたはTHALなどの異常ヘモグロビン症を有すると診断された対象である。
【０２６９】
「BCL11A発現を阻害する」とは、BCL11A阻害薬によって治療された集団において、BCL11A阻害薬が存在しない同等の対照集団よりもBCL11Aの発現の量が少なくとも5％少ないことを意味する。BCL11A阻害薬によって治療された集団におけるBCL11A発現のパーセンテージは、BCL11A阻害薬を加えていない同等の対照処理集団よりも、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも1倍低い、少なくとも2倍低い、少なくとも5倍低い、少なくとも10倍低い、少なくとも100倍低い、少なくとも1000倍低い、またはそれを上回って低い。
【０２７０】
1つの態様において、核酸は、BCL11A特異的RNA干渉物質、またはRNA干渉物質をコードするベクターである。1つの態様において、RNA干渉物質は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18、25〜44のヌクレオチド配列のうち1つまたは複数である。
【０２７１】
対象の治療または対象における異常ヘモグロビン症を発症するリスクを減少させる方法の一例として、本方法は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択される核酸配列、または本明細書に記載のBCL11AマイクロRNAを保有するベクターを含む改変され操作された細胞を含む組成物を対象に投与する段階を含む。1つの態様において、本方法は、異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクがある対象を同定する段階をさらに含む。もう1つの態様において、本方法は、異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクがある、同定された対象を選択する段階をさらに含む。
【０２７２】
対象の治療または対象における異常ヘモグロビン症を発症するリスクを減少させる方法のもう1つの例として、本方法は以下の段階を含む：対象において造血幹細胞および造血始原細胞を動員する；対象から末梢血を採取および収集する、末梢血からのCD34+細胞の陽性選択、SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択される核酸配列または本明細書に記載のBCL11AマイクロRNAを保有するベクターによってインビトロでCD34+選択細胞の形質導入またはトランスフェクションを行う；形質導入されたCD34+選択細胞を洗浄する；ならびに細胞を対象に投与する。1つの態様において、本方法は、異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクのある対象を同定する段階をさらに含む。1つの態様において、本方法は、異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクのある対象を選択する段階をさらに含む。もう1つの態様において、本方法は、洗浄した形質導入CD34+選択細胞を、対象に投与する前に、インビトロにて培養下で拡大する段階をさらに含む。もう1つの態様において、本方法は、洗浄した形質導入CD34+選択細胞を、対象に投与する前に、インビトロにて培養下で分化させる段階をさらに含む。
【０２７３】
対象の治療または対象における異常ヘモグロビン症を発症するリスクを減少させる方法のもう1つの例として、本方法は以下の段階を含む：ドナー対象において造血幹細胞および造血始原細胞を動員する；ドナー対象から末梢血を採取および収集する、末梢血からのCD34+細胞の陽性選択、SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択される核酸配列または本明細書に記載のBCL11AマイクロRNAを保有するベクターによってインビトロでCD34+選択細胞の形質導入またはトランスフェクションを行う；形質導入されたCD34+選択細胞を洗浄する；ならびに細胞をレシピエント対象に投与する。1つの態様において、本方法は、異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクのあるレシピエント対象を選択する段階をさらに含む。もう1つの態様において、本方法は、洗浄した形質導入CD34+選択細胞を、レシピエント対象に投与する前に、インビトロにて培養下で拡大する段階をさらに含む。もう1つの態様において、本方法は、洗浄した形質導入CD34+選択細胞を、レシピエント対象に投与する前に、インビトロにて培養下で分化させる段階をさらに含む。
【０２７４】
対象の治療または対象における異常ヘモグロビン症を発症するリスクを減少させる方法のもう1つの例として、本方法は以下の段階を含む：対象の骨髄から血液を採取および収集する、骨髄血からのCD34+細胞の陽性選択、SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択される核酸配列または本明細書に記載のBCL11AマイクロRNAを保有するベクターによってインビトロでCD34+選択細胞の形質導入またはトランスフェクションを行う；形質導入されたCD34+選択細胞を洗浄する；ならびに細胞を対象に投与する。1つの態様において、本方法は、異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクのある対象を同定する段階をさらに含む。1つの態様において、本方法は、異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクのある対象を選択する段階をさらに含む。もう1つの態様において、本方法は、洗浄した形質導入CD34+選択細胞を、対象に投与する前に、インビトロにて培養下で拡大する段階をさらに含む。もう1つの態様において、本方法は、洗浄した形質導入CD34+選択細胞を、対象に投与する前に、インビトロにて培養下で分化させる段階をさらに含む。
【０２７５】
対象の治療または対象における異常ヘモグロビン症を発症するリスクを減少させる方法のもう1つの例として、本方法は以下の段階を含む：ドナー対象の骨髄から血液を採取および収集する、骨髄血からのCD34+細胞の陽性選択、SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択される核酸配列または本明細書に記載のBCL11AマイクロRNAを保有するベクターによってインビトロでCD34+選択細胞の形質導入またはトランスフェクションを行う；形質導入されたCD34+選択細胞を洗浄する；ならびに細胞をレシピエント対象に投与する。1つの態様において、本方法は、異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクのあるレシピエント対象を同定する段階をさらに含む。1つの態様において、本方法は、異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクのあるレシピエント対象を選択する段階をさらに含む。もう1つの態様において、本方法は、洗浄した形質導入CD34+選択細胞を、レシピエント対象に投与する前に、インビトロにて培養下で拡大する段階をさらに含む。もう1つの態様において、本方法は、洗浄した形質導入CD34+選択細胞を、レシピエン対象に投与する前に、インビトロにて培養下で分化させる段階をさらに含む。
【０２７６】
1つの態様において、本明細書における本開示は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択される核酸配列、または本明細書に記載のBCL11AマイクロRNAを含む、改変され操作された細胞を提供する。
【０２７７】
1つの態様において、本明細書における本開示は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択される核酸配列、または本明細書に記載のBCL11AマイクロRNAを含むベクターによって形質導入されるかトランスフェクトされた、改変され操作された細胞を提供する。1つの態様において、ベクターはレンチウイルスである。
【０２７８】
1つの態様において、本明細書における本開示は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択される核酸配列、または本明細書に記載のBCL11AマイクロRNAによって形質導入されるかまたはトランスフェクトされた、改変され操作された細胞を投与する段階を含む、対象の治療または対象における異常ヘモグロビン症を発症するリスクを減少させる方法を提供する。1つの態様において、ベクターはレンチウイルスである。
【０２７９】
1つの態様において、本明細書における本開示は、SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択される核酸配列、または本明細書に記載のBCL11AマイクロRNAを含む改変され操作された細胞を投与する段階を含む、対象の治療または対象における異常ヘモグロビン症を発症するリスクを減少させる方法を提供する。
【０２８０】
1つの態様において、改変され操作された細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である。
【０２８１】
1つの態様において、改変され操作された細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞から分化した細胞である。
【０２８２】
1つの態様において、改変され操作された細胞は、赤血球系列に分化した細胞である。
【０２８３】
1つの態様において、改変され操作された細胞は、赤血球に分化した細胞である。
【０２８４】
1つの態様において、改変され操作された細胞はCD34+細胞である。
【０２８５】
本発明は、以下の番号付きの項のいずれかの通りに定義することができる。
［１］
a）第1のBCL11Aセグメント、ループセグメント；および
b）5'から3'への方向に直列に並んだ第2のBCL11Aセグメント
を含む合成BCL11AマイクロRNAであって、
ループセグメントが第1および第2のBCL11Aセグメントの間にあってそれらと直接連結されており、かつ
第1および第2のBCL11Aセグメントが塩基対合してヘアピンループを形成するように第2のBCL11Aセグメントが第1のBCL11Aセグメントに対して相補的であり、ループセグメントがそのようにして形成されたヘアピンループのループ部分を形成している、
前記合成BCL11AマイクロRNA。
［２］第1および第2のBCL11Aセグメントが約18〜25ヌクレオチド長である、項1記載の合成BCL11AマイクロRNA。
［３］第1のBCL11Aセグメントが、BCL11A mRNA配列に由来する配列を含む、項1または2記載の合成BCL11AマイクロRNA。
［４］第1のBCL11Aセグメントが第2のBCL11Aセグメントに対して相補的である、項1〜3のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
［５］第1のBCL11Aセグメントが5'末端にて-GCGC-で始まり、第2のBCL11Aセグメントが3'末端にて-GCGC-で終わる、項1〜4のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
［６］第1のBCL11Aセグメントが、
2019129846.tif 000048
；本明細書に記載のBCL11A miR1オリゴに由来）、
2019129846.tif 000049
；本明細書に記載のBCL11A miR2オリゴに由来）、
2019129846.tif 000050
；本明細書に記載のBCL11A E3オリゴまたはshRNA1またはE3に由来）、
2019129846.tif 000051
；本明細書に記載のshRNA2またはB5に由来）、
2019129846.tif 000052
；本明細書に記載のshRNA4またはB11に由来）、
2019129846.tif 000053
；本明細書に記載のBCL11A D8オリゴまたはshRNA3またはD8に由来）、
2019129846.tif 000054
；本明細書に記載のshRNA5または50D12もしくはD12に由来）、
2019129846.tif 000055
；本明細書に記載のshRNA5または50A5に由来）、
2019129846.tif 000056
；本明細書に記載のshRNA7または50B11に由来）、
2019129846.tif 000057
；本明細書に記載のBCL11A XLC4、shRNA8および50C4に由来）、
2019129846.tif 000058
；本明細書に記載のBCL11A非標的指向性オリゴに由来）、
2019129846.tif 000059
；本明細書に記載のmiR1G5オリゴに由来）、
2019129846.tif 000060
；本明細書に記載のE3G5またはE3 modオリゴまたはshRNA1modに由来）、
2019129846.tif 000061
；本明細書に記載のB5G5またはshRNA2modに由来）、
2019129846.tif 000062
；本明細書に記載のB11G5またはshRNA4modに由来）、
2019129846.tif 000063
；本明細書に記載の50D12G5、D12G4またはshRNA5modに由来）、
2019129846.tif 000064
；本明細書に記載の50A5G5またはshRNA6modに由来）、
2019129846.tif 000065
；本明細書に記載の50B11G5またはshRNA7modに由来）、
2019129846.tif 000066
；本明細書に記載のBCL11A D8G5またはD8 modまたはshRNA3modに由来）、
2019129846.tif 000067
；本明細書に記載のBCL11A C4G5またはC4 modまたはshRNA8modに由来）、
2019129846.tif 000068
；本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来）、および
2019129846.tif 000069
；本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来）からなる群より選択される、
項1〜5のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
［７］ループセグメントがマイクロRNAに由来する、項1〜6のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
［８］マイクロRNAが造血特異的マイクロRNAである、項7記載の合成BCL11AマイクロRNA。
［９］マイクロRNAがmiR223である、項8記載の合成BCL11AマイクロRNA。
［１０］ループセグメントがctccatgtggtagagである、項9記載の合成BCL11AマイクロRNA。
［１１］SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、項1〜10のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
［１２］対象において項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAをインビボで発現させる段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
［１３］インビボ発現が、対象における胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において起こる、項12記載の方法。
［１４］項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを、対象の胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において発現させる段階であって発現がエクスビボである段階、および該細胞を対象に移植する段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
［１５］細胞において項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを発現させる段階を含む、細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させる方法であって、該細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、前記方法。
［１６］少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAが、真核細胞における発現のためにプロモーターと機能的に連結されてベクター中に構築されている、項12〜15のいずれか一項記載の方法。
［１７］少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAがRNAIIポリメラーゼから発現される、項12〜16のいずれか一項記載の方法。
［１８］少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAがRNAIIIポリメラーゼからは発現されない、項12〜17のいずれか一項記載の方法。
［１９］プロモーターが、脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーターからなる群より選択される、項18記載の方法。
［２０］ベクターがウイルスである、項16〜19のいずれか一項記載の方法。
［２１］ウイルスがレンチウイルスである、項20記載の方法。
［２２］レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）、ヒト免疫不全ウイルス2型（HIV-2）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）からなる群より選択される、項21記載の方法。
［２３］SEQ ID NO：1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
［２４］SEQ ID NO：1のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［２５］SEQ ID NO：2のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［２６］SEQ ID NO：3のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［２７］SEQ ID NO：4のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［２８］SEQ ID NO：5のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［２９］SEQ ID NO：6のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［３０］SEQ ID NO：7のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［３１］SEQ ID NO：8のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［３２］SEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［３３］SEQ ID NO：10のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［３４］SEQ ID NO：13のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［３５］SEQ ID NO：14のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［３６］SEQ ID NO：15のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［３７］SEQ ID NO：16のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［３８］SEQ ID NO：17のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［３９］SEQ ID NO：18のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［４０］SEQ ID NO：25のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［４１］SEQ ID NO：26のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［４２］SEQ ID NO：27のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［４３］SEQ ID NO：28のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［４４］SEQ ID NO：29のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［４５］SEQ ID NO：30のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［４６］SEQ ID NO：31のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［４７］SEQ ID NO：33のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［４８］SEQ ID NO：34のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［４９］SEQ ID NO：35のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［５０］SEQ ID NO：36のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［５１］SEQ ID NO：37のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［５２］SEQ ID NO：38のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［５３］SEQ ID NO：39のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［５４］SEQ ID NO：40のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［５５］SEQ ID NO：41のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［５６］SEQ ID NO：42のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［５７］SEQ ID NO：43のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［５８］SEQ ID NO：44のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
［５９］項23記載の単離された核酸分子を含むベクター。
［６０］脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーターをさらに含む、項59記載のベクター。
［６１］項59または60記載のベクターを含む宿主細胞。
［６２］胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、項61記載の細胞。
［６３］赤血球である、項61記載の細胞。
［６４］項23記載の単離された核酸分子を含む細菌。
［６５］項23記載の単離された核酸分子を含むウイルス。
［６６］レンチウイルスである、項65記載のウイルス。
［６７］レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）、ヒト免疫不全ウイルス2型（HIV-2）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（CAEV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）、ウシ免疫不全ウイルス（BIV）、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）からなる群より選択される、項66記載のウイルス。
［６８］項1〜58のいずれか一項記載の単離された核酸分子、項59もしくは60記載のベクター、項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または項65〜67のいずれか一項記載のウイルスを含む組成物。
［６９］項59もしくは60記載のベクター、項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または項65〜67のいずれか一項記載のウイルスを含む組成物。
［７０］薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、項68または69記載の組成物。
［７１］対象における異常ヘモグロビン症の治療またはそれを発症するリスクを減少させるために用いるための、項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
［７２］対象における異常ヘモグロビン症の治療またはそれを発症するリスクを減少させるために用いるための医薬の製造に用いるための、項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
［７３］細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるのに用いるための、項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
［７４］細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、項73記載の組成物。
［７５］項1〜58のいずれか一項記載の単離された核酸分子、項59もしくは60記載のベクター、項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または項65〜67のいずれか一項記載のウイルスの治療的有効量を対象に投与する段階を含み、それによって対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
［７６］項68〜74のいずれか一項記載の組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含み、それによって対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
［７７］対象において細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させる段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
［７８］異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、項75〜77のいずれか一項記載の方法。
［７９］異常ヘモグロビン症が鎌状赤血球症またはサラセミアである、項78記載の方法。
［８０］酸素、ヒドロキシ尿素、葉酸または輸血を含む治療法を対象に施す段階をさらに含む、項75〜80のいずれか一項記載の方法。
【０２８６】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、それは特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２８７】
材料および方法
典型的なPCR反応条件は以下の通りである：総容積100μl中、1×反応緩衝液（MgCl2 1.5mM；3.0mM；4.5mM（最終濃度）からなる）；各0.2mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP；25pmolの各プライマー；50ngのテンプレートDNA；構造を融解させるための3〜10％（v／v）DMSO（これは任意である）。
【０２８８】
以下は、PCR反応のためのサーマルサイクラーでの典型的な反応条件または環境である：94℃で3〜5分間、この間に1U DNAポリメラーゼを添加するか、または氷上で反応物を準備し、続いてPCR装置が94℃になったところでそこにチューブを入れる；その後に94℃ 1分間；60℃ 1分間、および70℃ 1分間を25サイクル；最後に、PCR試料を用いるまで4℃とする。
【０２８９】
実施例1
合成miRの作製
3種類の合成miRを構築した。これらのうち2種類はBCL11Aの異なる部位を標的とし、かつ第3の非標的指向性のものは対照としての役を果たすためのものであった。これらのmiRのそれぞれを、構成的発現ベクター、TET誘導性ベクター、および赤血球系特異的ベクター中に挿入した。
【０２９０】
miRは、BbsIによる制限消化物に残されるスティッキー末端に対応する4塩基対の5'オーバーラップを有する、相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって作製した。
【０２９１】
BCL11A miR1オリゴ：
センス
2019129846.tif 000070
アンチセンス
2019129846.tif 000071
【０２９２】
BCL11A miR2オリゴ：
センス
2019129846.tif 000072
アンチセンス
2019129846.tif 000073
【０２９３】
非標的指向性オリゴ：
センス
2019129846.tif 000074
アンチセンス
2019129846.tif 000075
【０２９４】
オリゴヌクレオチド対を変性させ、続いてリアニーリングさせて（LM-PCRプロトコールにおけるオリゴカセットの場合と同様に）、その後に微量遠心濃縮デバイスを用いてカセットを精製した。その間に、プラスミドO.6.pBKS（miR223）をBbsIで消化し、アガロースゲル（アルカリホスファターゼで処理せず）で泳動させて精製した。続いて、消化したO.6.pBKS構築物中に各オリゴカセットをライゲートして、コンピテント細菌（Stbl3）に形質転換導入した。細菌クローンを採取し、ミニプレップ法を行って、単離されたベクターを調製した。合成miRのシークエンシングには、構造を融解させるためにDMSOを用いた上でプライマーmiR223 SEQ FORおよびmiR223 SEQ REVを用いた。
2019129846.tif 000076
【０２９５】
実施例2
構成的miRベクターの作製
Venus-miR発現が構成的SFFVプロモーターによって駆動されるように、各miRをLeGO-V2レンチウイルスバックボーン中にクローニングした。
【０２９６】
Venus cDNAの改変
Venus cDNAをPCRを介して増幅させて、NaeI制限部位を5'末端に付加し（優れたKozakコンセンサス配列を維持しながら）、NotI部位を3'末端に付加する。
2019129846.tif 000077
【０２９７】
PCR産物をアガロースゲルで泳動させて、続いて精製する。精製されたPCR産物を、TAクローニングキットを用いて、ベクターPCR 2.1 TOPO（INVITROGEN（商標））中にTAクローニングした。細菌クローンを採取して、DNAのミニプレップを行った。制限消化物分析を用いて、a）Venus PCR産物（EcoRI消化物）を含有し、かつb）クローンを、付加されたNotIがポリリンカー中でNotI部位の次にある（すなわち、NotI消化物がPCR断片を切り出さずにベクターを線状化するだけであるような）向きで含む、クローンを選択した。続いて、M13順方向および逆方向プライマーを用いて、これらのクローンのシークエンシングを行った。
【０２９８】
Venus-PCR 2.1 TOPOプラスミドへのmiR配列の挿入
Venus-PCR 2.1 TOPOプラスミドをNotIで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した上で、アガロースゲルで泳動させて、精製した。合成miR構築物を、NotIおよびPspOMIによる二重消化によってO.6.pBKSプラスミドから切り出し、その後にアガロースゲル抽出によって精製した。消化されたmiRインサートをVenus-PCR 2.1 TOPOプラスミド中にライゲートし、連結産物をコンピテント細菌（Stbl3）の形質転換に用いた。個々の細菌クローンを採取してミニプレップを行った。miRインサートを正しい向きで含む（すなわち、NotIおよびNaeIで消化した時に完全断片が生じる）プラスミドを選択した。
【０２９９】
LeGO-V2へのVenus-miRカセットの挿入
NotIおよびNaeIによる二重消化によってVenus-miRカセットをPCR 2.1 TOPOから切り出し、その後にKlenowラージ断片で処理して、NotIオーバーハングを平滑末端化した。このカセットをアガロースゲル抽出によって精製した。LeGO-V2またはLeGOG2をBamHIおよびEcoRIで消化し、Venus／eGFP cDNAを遊離させた。この線状化ベクターをKlenowラージ断片で処理して、EcoRIおよびBamHIオーバーハングを平滑末端化し、その後にアガロースゲル電気泳動によるベクターの精製を行った。精製されたVenus-miRカセットおよびLeGOベクターをライゲートして1つにし、その産物をコンピテント細菌の形質転換に用いた。個々の細菌クローンを採取し、DNAのミニプレップを行った。インサートを正しい向きで含むクローンを選択し、増殖させた上で、ウイルス上清の作製のためのマキシプレップに用いた。
【０３００】
実施例3
赤血球系特異的miRベクターの作製
上記のように作製したVenus-miRカセットにポリアデニル化シグナルを結びつけた。その結果得られたVenus-miR-ポリAカセットを、Guilianna Ferrariにより提供された赤血球系特異的pRRL-HS3-HS2-B-グロビンレンチウイルスベクター中にアンチセンスの向きで挿入した。
【０３０１】
BGHポリアデニル化シグナルの改変
PspOMI制限部位が5'末端に維持され、NaeI部位およびNotI部位が3'末端に付加されるように、BGHポリAシグナルをPCRを介して増幅した。
2019129846.tif 000078
【０３０２】
PCR産物をアガロースゲルで泳動させて、続いて精製した。精製されたPCR産物を、TAクローニングキットを用いて、ベクターPCR 2.1 TOPO（INVITROGEN（商標））中にTAクローニングした。細菌クローンを採取して、DNAミニプレップを行った。制限消化物分析を用いて、BGHpA PCR産物（EcoRI消化物および／またはNotI／PspOMI二重消化物）を含むクローンを選択した。M13順方向および逆方向プライマーを用いて、これらのクローンのシークエンシングを行った。
【０３０３】
上記のように作製したVenus-miR-PCR 2.1 TOPOプラスミドへのBGHpA配列の挿入
PspOMIおよびNotIによる消化によってBGHpAカセットをPCR 2.1 TOPOから切り出し、その後にアガロースゲル抽出によってインサートを精製した。上記のB2で作製したVenus-miR-PCR 2.1 TOPO構築物をNotIで消化し、その後に子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。線状化されたVenus-miR-PCR 2.1 TOPOベクターをアガロースゲルでの泳動によって精製した。BGHpAインサートをVenus-miR-PCR 2.1 TOPOベクター中にライゲートし、産物をコンピテント細菌（Stbl3）の形質転換に用いた。個々の細菌クローンを採取し、ミニプレップを行う。正しい向きで挿入された（NaeIによる消化後にインサート全体が得られる）BGHpA配列を含むプラスミドを選択した。
【０３０４】
pRRL-HS3-HS2-B-グロビンベクターへのVenus-miR-BGHpAカセットの挿入
NaeIによる消化によってVenus-miR-BGHpAカセットをPCR 2.1 TOPOから切り出した。これらのインサートをアガロースゲル電気泳動によって精製した。pRRL-HS3-HS2-B-グロビンベクターをEcoRVで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。線状化ベクターをアガロースゲル電気泳動によって精製した。Venus-miR-BGHpAカセットをpRRL-HS3-HS2-B-グロビン中にライゲートし、連結産物をコンピテント細菌の形質転換に用いた。個々の細菌クローン採取し、ミニプレップを行った。pRRL-HS3-HS2-B-グロビンベクター中にVenus-miR-BGHpAカセットを正しい向きで含むプラスミドを、それらをレンチウイルス上清の作製に用いる目的でマキシプレップ用に増殖させた。
【０３０５】
実施例4
インビトロ細胞RNA干渉実験は以下の通りに行う
FCSを加えたIMDM中で培養下に保ったマウス赤白血病細胞に対して、フィブロネクチン上でSFFV-LV（NT＝スクランブルshRNA、miR-2＝標的指向性shRNA）によりMOI＝2で形質導入を行い、Venus蛍光に関して選別した。形質導入後に分析した時点は第7日であった。細胞はVenus陽性が95％超であり、106個の細胞を収集してRNAを抽出し、逆転写によってcDNAを入手して、BCL11A mRNAおよびε-γグロビンmRNAに関するリアルタイムqPCRを、内部対照転写物としてのGapdhとともに行った（図3）。発現の定量には標準曲線法を使用した。
【０３０６】
マウスにおけるインビボRNA干渉実験は以下の通りに行う
BojJドナー由来のLSK HSCを、フィブロネクチン上でSFFV-LV（NT＝スクランブルshRNA、miR-1＝標的指向性shRNA）によりMOI＝2で形質導入を行った後に、致死的な放射線照射を行ったC57／BL6マウスに移植した。注入する細胞用量はマウス1匹当たり細胞100,000個とした。4カ月時点でVenus陽性WBCを保有する個体をプールし（n＝2）、生存性染色（7-AAD）の後に骨髄をVenus蛍光に関して選別した（図3）。RNA抽出およびqPCRは上記の通りに行った。
【０３０７】
実施例5
LCR-LV
FCSを加えたIMDM中で培養下に保ったマウス赤白血病細胞に対して、フィブロネクチン上でLCR-LV（NT＝スクランブルshRNA、miR-1＝標的指向性shRNA）によりMOI＝2およびMOI＝100で形質導入を行い、Venus蛍光に関して選別した。形質導入後に分析した時点は第7日であった。細胞はVenus陽性が95％超であり、106個の細胞を収集してRNAを抽出し、逆転写によってcDNAを入手して、BCL11A mRNAおよびε-γグロビンmRNAに関するリアルタイムqPCRを、内部対照転写物としてのGapdhとともに行った（図4）。発現の定量には標準曲線法を使用した。
【０３０８】
TET-LV
FCSを加えたIMDM中で培養下に保ったマウス赤白血病細胞に対して、フィブロネクチン上でTET-LV（NT＝スクランブルshRNA、miR-1＝標的指向性shRNA）によりMOI＝2で形質導入を行い、種々の濃度のドキシサイクリンへの曝露後にVenus蛍光に関して選別した。形質導入後に分析した時点は第7日であった。細胞はVenus陽性が95％超であり、106個の細胞を収集してRNAを抽出し、逆転写によってcDNAを入手して、ε-γグロビンmRNAに関するリアルタイムqPCRを、内部対照転写物としてのGapdhとともに行った（図4）。発現の定量には標準曲線法を使用した。
【０３０９】
実施例6
末梢血SCD患者由来のCD34+循環HSCを、廃棄されたアフェレーシス材料から分画した（およそ200ml、106個のCD34+細胞）。細胞に対して、フィブロネクチン上でSFFV-LV（NT＝スクランブルshRNA、miR-1＝標的指向性shRNA）によりMOI＝2で形質導入を行い、一部変更したGiarratana et al.（Nat Biotech 2005）のように分化させた。細胞を赤血球系表面マーカー（GPA、CD71）の成熟獲得に関してフローサイトメトリーによって分析した。赤血球系細胞は赤芽球および赤血球形態を逐次的に獲得し、Venus蛍光を発現するようになる。細胞を終末分化段階で収集してRNAを抽出し、miR-1 SFFV-IVによるγ-グロビンmRNA誘導をスクランブル（NT）対照と比較して評価するためのqPCR分析を行った（図5）。
【０３１０】
実施例7
末梢血SCD患者由来のCD34+循環HSCを、廃棄されるアフェレーシス材料から分画した（およそ200ml、106個のCD34+細胞）。細胞に対して、フィブロネクチン上でLCR-LV（NT＝スクランブルshRNA、miR-1標的指向性shRNA）によりMOI＝2で形質導入を行い、致死量以下の放射線照射を行ったNSGマウスに事前選別を行わずに細胞30,000個／匹を注入した。マウスを注入後4週間飼育し、RBCを固定して透過処理を行った。HbF染色を行い、ヒトHbFレベルが10％であるLCR-LV-miR-1マウスを同定した（図6）。
【０３１１】
実施例8
臍帯血由来CD34+ヒトHSCに対して、フィブロネクチン上でSFFV-LV（NT＝スクランブルshRNA、miR-1＝標的指向性shRNA）によりMOI＝2で形質導入を行い、Venus蛍光に関して選別した。細胞をMS-5ストローマ上で蛍光顕微鏡検査によっても可視化した。細胞を、Luo et al.（Blood 2009）を一部変更した方法により、Bリンパ球生成経路に沿って分化させた。SFFV-LVを介したBCL11Aのノックダウンによって引き起こされる分化阻止を同定するために、細胞を、成熟Bリンパ球表面マーカーの獲得および未熟始原マーカーの喪失に関して毎週分析した。細胞を毎週の時点で収集し、SFFV-LV-miR-1を介したshRNAターゲティングによるBCL11A mRNAノックダウンを検証するためにRNAを抽出した（図7）。
【０３１２】
実施例9
赤血球系細胞における胎児型ヘモグロビンの誘導を目的とするBCL11Aのプロセシング強化および効率的ノックダウンのための、レンチウイルスベクターRNAポリメラーゼIIで駆動するマイクロRNAに埋め込まれたshRNAの最適化
pol IIIプロモーターを介して発現される短鎖ヘアピンRNA（shRNA）を用いるRNA干渉（RNAi）技術は、種々の哺乳動物細胞型における遺伝子発現をモジュレートするために広く利用されている。mRNAの系列特異的ターゲティングを達成するためには、pol IIプロモーターを介したshRNAの発現が必要であり、これは発現およびプロセシングのためにshRNAを哺乳動物マイクロRNA（shRNAmiR）配列に埋め込むことを必要とする。ここでは、異常ヘモグロビン症に直接的に移行適用しうる、造血細胞におけるBCL11A転写因子のノックダウンを達成する目的で、本発明者らはpol IIIベースおよびpol IIベースのレンチウイルスベクターを介したmRNAモジュレーションの効率を比較した。BCL11Aタンパク質の抑制は、そのノックダウンによって最終的に胎児型ヘモグロビンテトラマー（HbF、α2γ2）のレベルの強化を招く胎児HBG（γ-グロビン）遺伝子の発現が誘導されることが示されていることから、鎌状赤血球症およびβ-サラセミアの治療標的になりうると考えられる。マウスでは、BCL11Aは、マウスのHBGホモログであるマウスHbb-y遺伝子の重要なリプレッサーである。本発明者らは、shRNAmiRを用いると、pol IIIにより媒介されるshRNAベクターバックボーンを用いた場合と比較して、BCL11Aノックダウン効率の低下が原因で、Hbb-y誘導が最大で100〜1000分の1に低下することを実証する。これらの差異の分子的基盤を解明する目的で、本発明者らは、複数のshRNA-shRNAmiR対による形質導入を受けた細胞の低分子RNA配列分析を実施した。本発明者らは、U6 pol IIIプロモーターを介して発現されたshRNAでは、pol IIで駆動する（shRNAmiR）成熟ガイド鎖配列と比較して4bpシフトの違いのあるガイド鎖配列が生じることを示す。RNAシークエンシングにより、pol III終止シグナルの一部を構成するウリジンの連鎖が転写されて、pol IIIベクターバックボーン内の成熟shRNAの3'末端に含められることが実証された。これらの付加的な配列が存在しないことに伴って、ダイサー切断部位に対応するシフトが生まれ、それによって、pol IIベースのベクターにおける標的遺伝子ノックダウンの有効性に影響を及ぼす代替的なシード配列を有する異なる成熟shRNAが生じる。加えて、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の絶対存在量およびそれらの比は両方とも、pol IIベースまたはpol IIIベースのベクターのいずれが細胞に形質導入されるかによって有意に異なる。shRNAmiRのガイド鎖に4bpシフトが組み入れられることにより、高い忠実度でプロセシングされた（U6で駆動されるsh-RNAと同一の成熟ガイド鎖配列）shRNA配列がもたらされ、BCL11Aのノックダウン効率はタンパク質レベルで50〜70％向上し、それに伴ってマウス赤白血病細胞におけるHbb-y誘導が100〜300倍強化された。本発明者らは、標的遺伝子の系列特異的調節を達成するためのshRNAmiRベクターバックボーンの前向きデザインのための改変された戦略を発見した。
【０３１３】
実施例10
系列特異的BCL11AノックダウンおよびヘモグロビンF誘導のためのmiRNAに埋め込まれたshRNAの最適化
材料および方法
shRNAの設計およびスクリーニング
BCL11A／BCL11A mRNAを標的とする種々のshRNAを発現する、U6プロモーターで駆動されるレンチウイルスベクター（pol III-puro）を、Broad Institute（Cambridge, MA）から入手した。pol III-puroは、hPGKプロモーターで駆動されるピューロマイシン選択マーカーを有する。XL／L型の両方またはXL型のみのいずれか、および3'UTR領域を標的とする100種を上回るshRNAを、Qiagen Turbocaptureプレートを用いる96ウェル形式でMEL細胞において、GapdhおよびHbb-yを測定する多重Taqman qRT-PCR反応を用いてスクリーニングした。
【０３１４】
shRNAmiR構築物の構築
shRNA配列を、隣接mir223配列とともに、SFFVで駆動されるVenusレポーターを含むレンチウイルスLeGO-V2ベクター中にクローニングすることによって、shRNAmiRベクターを構築した（28）。mir223ループを有するshRNAmiR配列はgenscript USAInc.（NJ, USA）によって合成され、その結果得られたshRNAmiRを、pol IIバックボーン中のVenusコード配列の下流に、Xba1部位およびBamH1部位を用いてクローニングした。shRNAのすべての配列を図21Aに列記している。非標的指向性対照shRNA配列を設計して、SFFV-shRNAmiRNTまたは短縮形でNTと命名した。いずれのshRNAカセットも含まず、GFPをSFFVプロモーターを介して発現するSFFV-GFPベクターを、モック対照として用いた（33）。
【０３１５】
ウイルス産生および用量設定
レンチウイルスベクター上清は、10μgのレンチウイルス移入ベクター、10μgのgag-pol、5μgのrev、および2μgのVSVGパッケージングプラスミドを、10cm培養皿の中のHEK293T細胞にリン酸カルシウム試薬（INVITROGEN（商標））を用いてコトランスフェクトすることによって作製した。上清をトランスフェクションから24時間後および48時間後に収集し、0.4ミクロン膜（CORNING（登録商標）, NY, USA）に通して濾過し、その後にSW-28スイングバケットを用いてBeckmann XL-90遠心分離機で23000rpm、2時間の超遠心を行うことによって濃縮した。力価を決定するには、NIH3T3細胞をポリブレン（8μg／ml）の存在下でウイルスに感染させて、形質導入から48時間後に、Venus発現に関するFACSによって（pol II構築物）、またはピューロマイシン選択（1mg／ml、pol III構築物）によって分析した。
【０３１６】
細胞培養
3T3細胞、293T細胞およびMEL細胞を、10％ウシ胎仔血清、2％ペニシリン-ストレプトマイシンおよび2mMグルタミンをそれぞれ加えたダルベッコ変法イーグル培地またはRPMI培地中で培養した。
【０３１７】
インビトロ赤血球系分化培養
初代ヒトCD34+細胞の凍結ストックを、健常ドナーの動員末梢血（Center of Excellence in Molecular Hematology at Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle or the Flow Core at Boston Children's Hospital）から、BCHの施設内審査委員会により承認されたプロトコールに従って入手した。用いた赤血球系分化プロトコールは（48）から採用した3相プロトコールである。細胞を、安定化グルタミン、330μg／mLのホロ-ヒトトランスフェリン（SIGMA（登録商標））、10μg／mLの組換えヒトインスリン（SIGMA（登録商標））、2 IU／mLのヘパリンChoay（SIGMA（登録商標））および5％溶媒／界面活性剤ウイルス不活化（S／D）血漿を加えたIMDM（イスコーブ変法ダルベッコ培地）（CELLGRO（登録商標））を基にした赤血球系分化培地（EDM）中で培養した。第1の拡大相（第0日〜第7日）では、CD34+細胞を、10-6Mヒドロコルチゾン（HC）（SIGMA（登録商標））、100ng／mLのSCF（R&D SYSTEMS（商標））、5ng／mLのIL-3（R&D SYSTEMS（商標）））および3 IU／mLのEpo（AMGEN（登録商標））の存在下で、EDM（赤血球系分化培地）中で培養した。第4日に、細胞を、SCF、IL-3、EpoおよびHCを含むEDM中に再懸濁させた。第2の相（第7日〜第11日）では、細胞を、SCFおよびEpoを加えたEDM中に再懸濁させた。第3の相（第11日〜第18日）では、細胞を、Epoのみを加えたEDM中で培養した。培養物は5％ CO2を含む空気中で37℃に保った。
【０３１８】
インビトロ培養物に関する形質導入およびフローサイトメトリー
MEL細胞およびCD34+細胞に対して、U6-shRNAまたはSFFV-shRNAmiRを発現するレンチウイルスベクターによる形質導入を、MEL細胞の場合はポリブレン（8μg／ml）（SIGMA-ALDRICH（登録商標）Corp. St. Louis, MO, US）の存在下で、CD34+細胞の場合は10μMのプロスタグランジンE2および2μg／mlのポリブレンの存在下で行い、室温で2時間（2000rpm）遠心分離を行った。生細胞を形質導入から48時間後にBD FACS AriaII（BD BIOSCIENCES（登録商標））を用いてVenus発現に関して選別するか（pol IIベクター）、または細胞をピューロマイシンの存在下で選択した（1mg／ml、pol III構築物）。FACS分析のために、7AAD（INVITROGEN（商標））を死細胞マーカーとして含めた。CD34+細胞を、アロフィコシアニン（APC）結合抗体、フィコエリトリン（PE）結合抗体およびPE-シアニン7結合抗体で標識した。抗CD235（グリコホリンA）-PE抗体、抗CD71-APC抗体または抗CD71-PE-シアニン7抗体およびDRAQ-5（いずれもEBIOSCIENCE（登録商標））を表現型分類のために用いた。分析は、LSR-IIフローサイトメーター（BECTON DICKINSON（登録商標））で、DivaまたはFloJoX（TREESTAR（商標））ソフトウェアを用いて行った。
【０３１９】
マウス移植実験に関する単離、形質導入およびフローサイトメトリー
CD45.1 BoyJマウス（B6.SJL-Ptprca Pepcb／BoyJ）およびCD45.2 B6マウス（C57BL／6J）の大腿骨、脛骨および股関節のフラッシングによって系列陰性マウス骨髄細胞を単離し、その後にマウス系列細胞除去キット（Miltenyi,Biotec Inc., San Diego, USA）を用いて系列除去を行った。細胞を、100ng／mLのmSCF、20ng／mLのmIL-3（両方ともPEPROTECH（登録商標）、Rocky Hill, USA）、100ng／mLのhFlt3-Lおよび100ng／mLのhTPO（両方ともCELLGENIX（登録商標）、Portsmouth, USA）を含むSTEMSPAN（商標）SFEM培地（STEMCELL（登録商標）Technologies, Vancouver, CA）中で0.2〜1×106個／mlの密度で培養した。24時間の予備刺激後に、細胞に対して1×106個／mlの密度にてMOI 40で形質導入を行い、単離から3日後に、致死的な放射線照射を行った（7Gy＋4Gy、分割照射）レシピエントに移植した。競合的再増殖実験に関しては、種々の形質導入群からの同数の細胞を混合した後に、CD45.2またはヘテロ接合性CD45.1／CD45.2二重陽性レシピエントに移植した（0.4〜1×106個／匹）。細胞混合物を、両方の競合性細胞画分の寄与が等しいことを確かめるためにフローサイトメトリーによって分析し、必要に応じて再調整した。末梢血、骨髄および脾臓の分析を、以下の抗体を用いて複数の時点で行った：CD45.1、CD45.2、B220、CD11b、CD3、CD71、Ter119および定着性生存性色素EFLUOR780（登録商標）。赤血球系列赤血球溶解の分析は省いた。分析は、LSR-IIまたはLSRFortessaフローサイトメーター（BECTON DICKINSON（登録商標））およびDivaまたはFloJoX（Treestar（商標））ソフトウェアを用いて行った。データの分析および統計処理はExcel（MICROSOFT（登録商標））およびGRAPHPAD PRISM（登録商標）5を用いて行った。
【０３２０】
hCD34細胞の移植のためには、ほぼ10週齢の雌性NSGマウス（NOD／LtSz-scid Il2rg-/-）（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）に2.7Gyの放射線を照射し、その後にほぼ106個／匹の細胞を単離から3日後に注入した。放射線照射マウスにはBAYTRIL（登録商標）を加えた水を14日間摂取させた。
【０３２１】
RNA抽出およびqRT-PCR
選別／ピューロマイシンによる選択から7日後のMEL細胞から、またはCD34+細胞の赤血球系分化第18日に新たに選別した細胞から、QIAGEN（登録商標）RNA Plus microキット（Valencia, CA）を用いて全RNAを抽出した。CDNAは、ランダムヘキサマープライマーおよびsuperscriptIII（INVITROGEN（商標）, Carlsbad, CA）を用いて作製した。定量的PCRは、SYBR（登録商標）Green PCR master mix（APPLIED BIOSYSTEMS（登録商標）, Warrington UK）を、イントロンスパニング性のマウスHbb-yプライマーおよびGapdhプライマー
2019129846.tif 000079
ならびにヒトHBG、HBBおよびGAPDHプライマー
2019129846.tif 000080
を用いて行った。PCR増幅条件は以下とした：95℃を10分間、その後に95℃ 15秒間および60℃ 1分間を40サイクル。qPCRは、ABI（登録商標）7500機器（APPLIED BIOSYSTEMS（登録商標）, Foster City, CA）で行った。DNAの系列希釈物を用いた標準曲線を、各反応に関する厳密な増幅効果を判定するために用いた。Hbb-yおよびγ-グロビンの発現レベルは内部対照としてのGAPDHに対して規格化し、増幅効率の差に対する補正を含め、PCRデータの分析には相対的遺伝子発現（ΔΔCt法）を用いた。
【０３２２】
ノーザンブロット分析
U6-shRNAおよびSFFV-shRNAmiRにより形質導入されたMEL細胞を選別し、7日間のピューロマイシン選択培養後に収集した。1mlのTRIZOL（登録商標）試薬（AMBION（登録商標））を用いて全RNAを単離し、15μgを15％アクリルアミドゲルで分離した。低分子転写物のサイズはDecade Ladder（AMBION（登録商標）、Austin, TX）を用いて決定した。RNAをHYBOND（商標）-XL膜（AMERSHAM（商標）、Piscataway, NJ）に移して、UV架橋させた。ブロットのプレハイブリダイゼーションをUltraHyb-Oligo（AMBION（登録商標）、Austin, Tx）を35℃で用いて行い、γ-32P標識オリゴヌクレオチド（4ポリヌクレオチドキナーゼ；AMERSHAM（商標）、Piscataway, NJ）を37℃で1時間用いてプローブ探索した上で、30〜35℃の2×クエン酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウムで洗浄し、フィルムに露出させた。成熟miRNAを検出するためのプローブ配列は以下の通りとした。
2019129846.tif 000081
【０３２３】
ウエスタンブロット分析
形質導入されたMEL細胞およびCD34+細胞を、プロテアーゼ（ROCHE（登録商標））およびホスファターゼ阻害薬（SANTA CRUZ BIOTECHNOLGY（登録商標））、ペプスタチンおよびロイペプチン（SIGMA）を含む溶解緩衝液（RIPA）中で溶解させた。タンパク質溶解物をBCAタンパク質アッセイ（THERMO SCIENTIFIC）によって推定した。タンパク質25μgを2×Laemmli試料緩衝液中に再懸濁させて沸騰させた上で、8％ SDS-ポリアクリルアミドゲルにロードし、その後にフッ化ポリビニリデン（PVDF）膜（MILLIPORE（登録商標））に移行させた。0.1％ Triton-X100および5％脱脂粉乳を含むPBS中でブロックした後に、PVDF膜をモノクローナルマウス抗BCL11A抗体（ABCAM（登録商標））またはマウス抗β-アクチン（SIGMA（登録商標））とともにインキュベートした。抗マウスIgG HRP結合二次抗体（CELL SIGNALING（登録商標））を、化学発光20×LUMIGLO（登録商標）試薬および20×Peroxide（CELL SIGNALING（登録商標））による検出のために用いた。
【０３２４】
HPLC分析
分化第18日の細胞から、水中での浸透圧溶解および3回の急速凍結解凍サイクルを用いて溶血産物を調製した。溶解物を用いる酢酸セルロースによるヘモグロビン電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を、Brigham and Women's Hospitalの臨床検査室でヒトヘモグロビンの臨床的に較正した標準値を用いて実施した。
【０３２５】
RNAシークエンシングおよび分析
mirVana miRNA単離キット（INVITROGEN（商標））を製造元の指示に従って用いて低分子RNAを6×106個のMEL細胞から抽出し、ILLUMINA（登録商標）Hiseq2000を用いるディープRNAシークエンシングのために搬送した。自らの開発によるPERLスクリプトを用いてアダプター配列を取り出し、19〜25ntの低分子RNAをさらなる分析に用いた。BOWTIEソフトウェア（インターネットのウェブサイト、bowtie-bio period sourceforge period netから入手）をアラインメントのために用い、1つのミスマッチは許容することとした。種々の試料の比較のために、低分子RNAの発現レベルを各ライブラリーの100万の総リードに対して規格化した。4種の細胞株で250種のTRC shRNAを用いる実験のためには、ハイスループットウイルス調製プロトコールを用いてBroad Instituteによってレンチウイルスが調製され、96ウェルプレート内の1ウェル当たり単一のshRNAを高MOIで細胞に感染させ（そのプロトコールは、Broad Institute at Cambridge, MA, USAのインターネットのウェブサイトにあるRNAi public resourcesの「ピューロマイシン」の項から入手可能である）、感染から1日後に添加し、感染から4日後に細胞をTRIZOL（登録商標）で溶解させた。各細胞株について溶解物をすべてプールし、その後に全RNAの抽出および低分子RNAライブラリーの調製を行った（49）。ILLUMINA（登録商標）のリードはトリミングし、一意的なリード（＞17nt）となるように収束させてカウント数を付し、ミスマッチを許容しないTRC shRNA発現ベクター配列へとマッピングした。shRNA全体の平均をとる前に、各shRNAについて成熟shRNA配列分布を計算した。
【０３２６】
統計分析
GRAPHPAD PRISM（登録商標）5.0ソフトウェアパッケージを統計分析に用いた。結果は平均±標準偏差（SD）として表現する。統計的有意性はt検定によって評価した。
【０３２７】
結果
単純なステム-ループshRNAとの比較による、マイクロRNAスカフォールドに埋め込まれたshRNA（shRNAmiR）によるBCL11Aのノックダウン効率の低下
BCL11Aの有効なノックダウンを媒介するshRNA候補を同定するために、ヒトとマウスとの間で保存されているBCL11A mRNAのコード配列を標的とする118種のshRNAのレンチウイルスライブラリーを、MEL細胞においてスクリーニングした。LKO-U6-BCL11A-shRNAmiR（本明細書では以下、U6-shRNA）と命名した、選択用のピューロマイシン耐性遺伝子を含むLKOレンチウイルスバックボーン（26）内にあるpol IIIベースのU6プロモーターから、ShRNAを発現させた（図19A、左のパネル）。グロビン遺伝子調節の研究のためによく用いられる細胞株であるMEL細胞に対して、shRNAを発現するレンチウイルスベクターにより感染多重度（MOI）2で形質導入を行った。ヒトγ-グロビン遺伝子の機能的ホモログとしての役を果たす胎児型マウスHbb-y mRNA（27）の規格化された発現により、BCL11Aノックダウンの間接的読み取りが得られる（図19B、y軸）。第2の読み取りとして、Hbb-y遺伝子座にmCherryノックインを有するMEL-レポーター細胞株（D. Bauer、未発表）を用いて、shRNAプールもスクリーニングした。蛍光レポーター誘導はフローサイトメトリーによって分析した（図19B、x軸）。BCL11Aのノックダウン用の系列特異的発現ベクターを開発することを目的として、MEL細胞におけるHbb-yおよびmCherryレポーター発現を一貫して誘導した8種のshRNA（図19Bでラベル表示され、shRNA1から8まで命名されている）を、ヒトマイクロRNA223（miR-223）隣接配列およびループ配列中にクローニングして、合成マイクロRNA（shRNAmiR）を作り出した。初期分析については、このカセットをpLeGOレンチウイルスベクター（28）（図19A、右のパネル）中の、強くかつ遍在性に発現される脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）プロモーター／エンハンサーの制御下にあるVenus蛍光性レポーターの3'非翻訳領域に組み入れて、LEGO-SFFV-BCL11A-shRNAmiRと命名した（本明細書では以下、SFFV-shRNAmiR）。
【０３２８】
同じ21塩基の標的に一致する配列を組み入れたshRNAのノックダウン効果を直接比較したが、これは、陰性対照として非標的指向性（NT）shRNAを用いた、MEL細胞におけるpol IIIおよびpol II発現カセット（すなわち、U6-shRNAとSFFV-shRNAmiRの比較）の環境であった。MOI 2で形質導入を受けたMEL細胞からの細胞溶解物中に、イムノブロットによってBCL11Aタンパク質が検出された（図19C）。BCL11Aのノックダウンは、SFFV-shRNAmiRを発現する細胞の方が、U6-shRNAと比較して一貫して低い効率であった（図19C）。この差異の機能的意義を確かめるために、本発明者らは、ピューロマイシン選択または蛍光活性化細胞選別（FACS）のいずれかによって得た形質導入細胞の均質集団において、Hbb-y mRNAレベルの誘導をqRT-PCRによって測定した（図19D）。U6-shRNAと比較しての、SFFV-shRNAmiRのノックダウン効率の低下（図19C参照）は、SFFV-shRNAmiRによるHbb-yの誘導が有意に少ないことにつながり（図19D）、Hbb-y誘導の差異はBCL11Aノックダウンの差異よりもより顕著であるように思われる。
【０３２９】
SFFV-shRNAmiRおよびU6-shRNAは異なる成熟ガイド鎖配列を生み出す
これらの差異の分子的基盤を解明するために、さまざまなU6-shRNAによる形質導入を受けた細胞由来の低分子RNA、およびその対応するSFFV-shRNAmiR対応物のシークエンシングを行った。Hbb-y誘導の有意な違いは、pol II環境およびpol III環境から産生される別個のshRNA含有転写物からの異なる成熟ガイド鎖の産生に起因するという仮説を立てた。このため、U6-shRNA環境およびSFFV-shRNAmiR環境の両方由来のプロセシングされたガイド鎖配列を評価した（図20AおよびB）。SFFV-shRNAmiRから産生された最も多量に見いだされた成熟ガイドRNAは、インシリコで予想された成熟配列と厳密に対応していた（図20B）。対照的に、U6-shRNAのほとんどは、pol III転写物の3'末端のほぼ22ntからなる予想されるダイサー産物と一致する成熟ガイド鎖配列であり、これはpol III終止シグナルに由来する3〜5ntの連鎖を含むが、5'末端にある標的と一致する配列の対応する数のヌクレオチドは欠いていた。プロセシングされた産物の同様の分布は、A549、MCF7、JurkatおよびU937細胞株における247種のU6-shRNAの大規模スクリーニングでも観察されており、その場合には主たるガイド鎖配列の平均長は22ntであり、その5'末端は定常ループ配列からの4塩基から始まっていた。これらの4種の細胞株における247種のプロセシングされたTRC shRNA産物のディープシークエンシングを行った（図25）。その結果、主たる成熟ガイド鎖がshRNAのアンチセンス配列の位置4で始まり、3'末端U残基を4つ含むことが指し示されている。プロセシングは一般に複数の細胞株間で一貫しており、異なるshRNA配列間でも一貫していた。各成熟配列に関する平均リード頻度にはどのshRNAにも同じ重みづけを行ったが、いくつかのshRNAは他のものよりも1,000倍を上回るリードを生じた。ライブラリー調製中のRNAリガーゼのバイアスが強いことが原因で、低分子RNAシークエンシングには半定量的性質があり、そのため相対的発現またはプロセシングレベルの比較は不可能であるが、細胞株間およびshRNA間の一貫した傾向からは、主たるガイド鎖の同一性の可能性が高いことが実証される。センス鎖のリードも検出され（平均でshRNA当たり30％未満）、その大多数は「GG」で始まってセンス鎖配列中に20nt伸びていた。これらの成熟配列は初期hU6 shRNA転写物のダイサー産物と正確に一致しており、ドローシャ／DCGR8プロセシング段階を誘発する必要がない。以上を総合すると、これらの知見は、shRNA配列をベクター間で移行させる場合に、pol II shRNAmiRおよびpol III shRNA転写物から成熟配列を生じさせるプロセシングイベントを考慮することの重要性を指し示している。試験した4種の細胞型で観察された成熟配列の分布が非常に類似していたことは、これらのプロセシングパターンを種々の細胞環境に対して一般化しうる可能性を示唆する。pol IIIベースおよびpol IIベースのベクターで生成された成熟ガイド鎖配列の違いは、SFFV-shRNAmiRと比較してU6-shRNAで観察されたBCL11Aダウンレギュレーションの差異の実質的な一因である。これらのデータは、pol IIIベクターとpol IIベクターとの間で予想される変換が、pol III shRNAのダイサー切断と比較した、pol II shRNAのドローシャおよびダイサー切断を考慮することによって可能になりうることを示唆する。
【０３３０】
pol IIベースのベクターにおけるshRNA配列の改変はノックダウン効率の向上をもたらす
これらの知見に基づいて、本発明者らは、配列をSFFV-shRNAmiRに移入する場合に、pol III shRNAベクターからの予想される成熟配列を用いると、ノックダウン効率の強化を招くであろうという仮説を立てた。このため、ガイド鎖配列の5'末端に4ヌクレオチドのシフトを含むSFFV-shRNAmiRのセットを設計した（図21A）。siRNA二重鎖における3'末端のより高い熱力学的安定性を達成するために3'末端にヌクレオチドGCGCを付加し、それは意図するガイド鎖の選好的RISC-ローディングを促進するはずである。ノックダウン効率およびHbb-y誘導に及ぼす改変の影響を、それぞれイムノブロットおよびqRT-PCRによってMEL細胞において評価した。BCL11Aタンパク質のノックダウン効率の向上が、SFFV-shRNAmiR1、3および8で観察された（図21B）。ノックダウンの強化は、Hbb-y転写物の誘導の200〜400倍の増加と相関した（図21C）。他のSFFV-shRNAmiRは認知しうるノックダウン効率の増大を示さなかった。改変SFFV-shRNAmiR 1、3および8の効率向上の基礎にある機序をさらに十分に解明するために、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖低分子RNAの存在量ならびにそれらの比をノーザンブロット法によって分析した。まず、いずれの場合にもpol IIIベクターの方がpol IIベクターとの比較でガイド鎖の存在量が多いことが認められた。その上、特に改変SFFV-shRNAmiR 1および3については、非改変shRNAmiRとの比較でガイド鎖の方が存在量が多く、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との比が高いことが見いだされたが、これらのパラメーターはSFFV-shRNA8については影響がみられなかった（図21D）。ガイド鎖配列に対する改変の影響を評価するため、およびそれをBCL11Aノックダウンについて観察された変化と相関づけるために、低分子RNAのディープシークエンシングを行った。一般に、結果的に生じたプロセシングされた配列は、導入された4ntシフトを反映しており、その結果、LKOバックボーンで発現されたpol III shRNAから得られる配列に類似したシード領域を有するガイド鎖が生じた。SFFV-shRNAmiR 1、3および8については、単一の優位な配列が認められ、このことはより有効性の低いSFFV-shRNAmiRで配列のより幅広い分布が示されたのと対照的である。
【０３３１】
初代ヒトCD34+由来赤血球系細胞におけるBCL11Aノックダウンおよびγ-グロビン誘導に対するshRNAmiR改変の影響
BCL11Aノックダウンによる胎児型グロビンの再活性化は、鎌状赤血球症およびβ-サラセミアの治療に対する治療可能性がある。初代ヒト細胞におけるBCL11Aのノックダウン効率ならびにγ-グロビンおよびHbF発現の誘導に対する改変SFFV-shRNAmiRの効果を評価するために、健常志願者由来のG-CSF動員末梢血（mPB）CD34+ HSPCに対して、U6-shRNA、SFFV-shRNAmiRおよび改変SFFV-shRNAmiRを発現するベクターによる形質導入を行い、続いて赤血球系分化を行わせた。培養11日後に、BCL11Aレベルをウエスタンブロットによって判定した（図22A）。MEL細胞における所見と一致して、改変SFFV-shRNAmiR 1、3および8ではノックダウンの強化が観察され、それはγ-グロビン転写物の誘導の増加ももたらした（図22B）。赤血球系分化の状態を評価した。培養第18日に、CD71およびGpAの表面発現ならびに核除去に関して、フローサイトメトリー分析によって分析した。SFFV-shRNAmiRおよび対照ベクターにより形質導入を行った試料の間に有意差は観察されなかった（図22C）。対照的に、U6-shRNAは、成熟の後期相において分化マーカー獲得の軽度の遅れを招き、それはU6-プロモーターにより媒介されるshRNA過剰発現に起因する毒性を示す可能性がある。γ-グロビンmRNAの高度の誘導という観察所見は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって測定したHbFタンパク質の増加によって確かめられた。試験した3種の改変shRNAmiRはすべて、非改変SFFV-shRNAmiRと比較してHbF産生量の増加を生じさせ（図22D）、赤血球系細胞における総ヘモグロビンの40〜50％がHbFであった。γ-グロビンmRNAとHbFタンパク質との相関は高度であり（r2＝0.96）、このことは分析の信頼性を裏づける（図22E）。
【０３３２】
以上をまとめると、本発明者らは、miRNAスカフォールド内に埋め込まれてpol IIプロモーターを介して発現されるshRNAが、形質導入細胞においてプロセシングされて、U6プロモーターから発現されるsiRNAと比較して異なる成熟siRNAを生じることを実証した。pol IIIプロモーター構築物に由来する成熟shRNAにおける標的が一致する配列は、3'側に3〜5ntだけ均一にシフトしており、この違いに伴って標的転写物のノックダウン効率に有意差がみられた。考えられる治療標的であるBCL11Aの場合には、これにより、γ-グロビン発現の再活性化に認知しうる差異がもたらされた。これらのデータは、pol II媒介性発現を可能にするためにshRNA配列をマイクロRNAスカフォールドに移入する場合の設計最適化の重要性を実証している。
【０３３３】
造血幹・始原細胞（HSPC）におけるBCL11Aの遍在的ノックダウンは造血再構成を低下させ、それはshRNAmiR発現を赤血球系細胞にターゲティングすることによって回避可能である
インビボでのSFFV-shRNAmiR発現の影響を、HSPC形質導入および移植のマウスモデルにおいて評価した。CD45.2細胞表面マーカーを発現するβ-YACマウスの骨髄由来の系列-陰性（lin-）HSPCに対して、SFFV-shRNAmiRベクターまたは非標的指向性ベクター（SFFV-shRNAmiRNT）によってエクスビボで形質導入を行い、致死的な放射線照射を受けたCD45.1 BoyJ-レシピエントマウスに移植した。対照群では非形質導入細胞を移植した。β-YACマウスは、マウス環境において発生的に調節されるヒトβ-グロビン遺伝子座を導入遺伝子として保有しており、胎児型および成人型のβ-グロビン遺伝子の発現の差異を示す。検証の目的、および以前発表されたデータとより優れた比較を行うために、miRNA223隣接配列に埋め込まれた、十分に記載のあるshRNA（23,27,29）（本明細書ではshRNAmiR*と名づける）を使用した。移植から4、8および12週後に、ドナー細胞の生着をCD45.1およびCD45.2キメリズムに基づいて判定した（図23A）。ドナー細胞の生着は予想されたパターンに従い、8週後には末梢血（PB）および骨髄（BM）においてほぼ完全に生着した。しかし、予想外のことに、遺伝子改変細胞の画分は時間経過とともに急激に減少した（図23B）。BCL11Aノックダウンベクターを用いた初期形質導入率はほぼ40％であったにもかかわらず、第12週での遺伝子標識はドナー由来のCD45細胞全体の2〜3％に過ぎなかった。SFFV-shRNAmiR NTの過剰発現にも、より少ない程度ではあるが遺伝子改変細胞の生着低下がみられ、このことは生着中のHSPC細胞における配列特異的毒性および非特異的毒性の両方を指し示す。shRNAを発現するドナー細胞の喪失の時期からは、より原始的な造血幹細胞区画に対する影響が示唆される。
【０３３４】
造血再構成に対する悪影響についてさらに調べるために、定量的競合的再増殖実験を行った（図23C〜23F）。CD45.1（BoyJ）およびCD45.2（Bl/6）ドナー動物由来の系列陰性細胞に対して、遍在性に発現されるSFFV-プロモーター（SFFV-BFP）の制御下で、BCL11Aに対するSFFV-shRNAmiR、shRNAmiRNT、または青色蛍光性タンパク質（BFP）レポーターのみを発現するさまざまなベクターによる形質導入を行った。ドナー集団およびレシピエント細胞の両方の同定が可能になるように、細胞をコンジェニックCD45.1／CD45.2動物に移植した。SFFV-BFPベクターを使用する実験では、CD45.1ドナー細胞をCD45.2動物に移植し、形質導入を行ったドナー細胞集団を蛍光に基づいて同定して比較した。移植の前に、競合性ベクターによる形質導入を行った2つの集団からの同数の細胞を混合した。移植された集団において両方のベクターを用いて得られた遺伝子改変細胞の最終的な比をフローサイトメトリーによって分析したところ、55〜70％の範囲にある同等な形質導入率が確かめられた（図23C）。移植の4、8および12週後に、移植された動物における遺伝子改変細胞の寄与を末梢血、骨髄および脾臓で評価し（図23D）、注入した形質導入細胞の比のわずかな違いもこの分析では考慮に入れた。すべての事例および各時点で、BCL11Aを標的とするベクターによる形質導入を受けた細胞は、NTまたはSFFV-BFPベクターによる形質導入を受けた細胞よりも競合性が劣っており、このことはBCL11Aノックダウンの選択的不利を指し示している。2種のBCL11A標的指向性ベクターが互いに競合する場合には、初期に移植された集団の比と比較して、造血細胞の再構成の有意差は観察されなかった。図23Bにおける所見と一致して、shRNAmiRNTの過剰発現は造血再構成にも悪影響を及ぼし、この群はSFFV-BFPのみを発現してshRNAを発現しないベクターによる形質導入を受けた細胞よりも競合性が劣っていた。本発明者らは、骨髄細胞の形質導入画分におけるBリンパ球およびより原始的なHSC区画に対してより詳細な分析を行った（図23E）。BCL11A-/-マウスにB細胞が存在しないことを示した以前の研究から予期されたように（30,31）、B220陽性B細胞の数はBCL11Aノックダウンによって有意に減少した。有意には達しなかったものの、生着するHSC区画を含む、より原始的なlin-、Sca-1+、c-kit+（LSK）細胞が減少する傾向がみられた。
【０３３５】
BCL11Aの赤血球系特異的ノックダウンは、赤血球系細胞におけるγ-グロビン誘導の治療効果を維持しながら、HSCおよびB細胞に対するBCL11Aノックダウンの有害作用を回避させうる可能性がある。ノックダウンを赤血球系細胞に選択的に向かわせるために、shRNAmiRカセットおよびVenus蛍光性レポーターが、β-グロビン遺伝子座制御領域（LCR）の高感受性部位2および3（HS2およびHS3）（32）と連結された最小β-グロビン近位プロモーターの制御下で発現されるレンチウイルスベクターを作製し（図23F）、LV-LCR-BCL11A-shRNAmiRと命名した（本明細書では以下、LCR-shRNAmiR）。インビボで生着した造血細胞集団におけるVenusレポーター導入遺伝子の発現プロフィールを、形質導入を行ったHSPCを移植したマウスにおいてまず評価した（図23Gおよび図26）。図26では、系列陰性細胞に対してLCR-shRNAmiRベクターを用いて形質導入を行い、致死的な放射線照射を行ったレシピエントマウスに生着させた。12週後に、ドナー細胞および異なる造血細胞型を表面マーカーを用いて同定した。ここに示されているのは、さまざまな系列におけるVenus発現を示している、代表的なゲーティングスキームおよびヒストグラムブロットである。ブロット中の数値は、venus陽性細胞のパーセンテージおよび平均蛍光強度（MFI）を指し示している。導入遺伝子の発現は厳密に調節されていた；数匹のマウスにおいて、LSK細胞およびB細胞の画分では検出可能な発現はなく、T細胞における発現は極めて低いレベルであり、骨髄系細胞における発現は低レベルであった。対照的に、導入遺伝子の発現は赤血球系分化の間は強くアップレギュレートされており、それは赤血球始原細胞および前赤芽球に相当するCD71+／Ter119-細胞に始まり、好塩基球性赤芽球に相当するCD71+／Ter119+二重陽性段階でピークとなった。赤血球系成熟の最終段階には、網状赤血球および成熟赤血球に相当するCD71-／Ter119+細胞の大部分が、CD71+／Ter119+細胞と同程度のパーセンテージでレポーターを発現した。
【０３３６】
次に、LCR-ベクターの使用によって、遍在的なSFFV-shRNAmiR過剰発現の際に観察された再構成の欠陥が回避されるか否かを明らかにするために、LCR-shRNAmiRおよびSFFV-shRNAmiRを用いる競合的移植実験を行った（図23H）。LCR-ベクターはlin-細胞では転写的にサイレントであるため、移植に用いようとする細胞のアリコートをインビトロ赤血球系分化に供し、転写許容性CD71+／Ter119+集団において測定されるVenus+細胞の比を、SFFV形質導入細胞とLCR形質導入細胞の比の規格化のために用いた。移植された動物におけるVenus発現を赤血球系細胞において比較したが、それはこれが、両方のベクターによる発現を等しく許容する唯一の集団であるためである。移植されたマウスの再構成により、LCR-ベクターによる形質導入を受けたHSPCに由来する細胞の明らかな優位性が実証され、このことはLCR-shRNAmiRの赤血球系列特異的発現に伴うHSPCの毒性の低下を示唆する（図23H）。以上をまとめると、これらのデータは、HSC生着／機能に対するBCL11Aノックダウンの有害作用が赤血球系特異的miRNA発現によって回避されうることを実証している。
【０３３７】
改変shRNAmiRを用いてLCR-ベクターにより媒介されるBCL11Aの赤血球系特異的ノックダウンは、ヒト赤血球系細胞において高レベルのHbFを生じさせる
ヒト実験系においてLCRにより媒介されるBCL11Aの赤血球系特異的ノックダウンの有効性を検討するために、CD34+細胞に対して、改変shRNAmiR 3または8を含むLCR-shRNAmiRベクターによる形質導入を行った（図23F）。本発明者らはまず、ヒトmPB CD34+細胞のインビトロ赤血球系分化における、いくつかのLCR-shRNAmiRベクター（LCR-shRNA*、LCRshRNAmiR3および8）の発現プロフィールを確かめた。LCR-ベクター、およびshRNAmiR-カセットを含まずSFFVで駆動される対照ベクター（SFFV-GFP）（33）によるVenus発現を、CD71およびGpA染色によって定義されるような、赤血球系成熟の種々の段階で評価した（図23I）。図23Gに示されたマウス細胞における所見と一致して、CD71-／GpA-未熟赤血球系細胞では低レベルの発現が観察された。CD71+単一陽性細胞では発現の強いアップレギュレーションがみられ、より成熟したCD71+／GpA+二重陽性細胞では最も高レベルの導入遺伝子発現がみられた。予想された通り、SFFV-GFP対照はすべての部分集団において高レベルの構成的発現を生じさせた。以前に記載された分化プロトコールに従って、BCL11Aタンパク質レベルを培養第11日に測定して、非標的指向性ベクターおよびモック対照ベクター（LCR-shRNAmiRNTおよびSFFV-GFP）と比較した。改変shRNAmiRを発現する細胞では、非標的指向性（NT）および対照ベクター（SEW）を発現する細胞と比較して、BCL11Aの有意な減少が観察された（図24A）。shRNAmiR3および8を発現するベクターによる形質導入を受けたCD34+細胞に由来する細胞内のβ様グロビン全体のうち、γグロビンmRNAはそれぞれ40％および70％を占めた（図24B）。LCR-shRNAmiRまたは対照ベクターによる形質導入を受けた細胞間で、細胞増殖については差が観察されなかった。CD71、GpAの表面発現、および核除去によって評価した赤血球系分化は、対照と識別不能であり（図24C）、このことはBCL11A shRNAmiRの系列特異的発現によるBCL11Aノックダウンに悪影響がないことを示唆する。γ-グロビンmRNAのレベル（qRT-PCR）とHPLCによって評価したHbFのレベルとの間には強い相関が観察された（図24D）。HbFは、LCR-shRNAmiR3およびLCR-shRNAmiR8による形質導入を受けた細胞において総ヘモグロビンの35％および55％の寄与であり、これはSFFV-プロモーターにより媒介される発現と同等なレベルである（図22Dおよび図24E）。さらに、LCR-shRNAmiRにより媒介されるノックダウンによってhCD34+細胞の効率的な生着およびγ-グロビンの誘導が可能になるという原理証明を示すために、LCR-shRNAmiR3またはNTベクターによる形質導入を行った骨髄由来CD34+ HSPCの移植を、致死量以下の放射線照射を行ったNSGマウスに行った。この異種移植モデルではヒト赤血球系細胞の発生が不良であることから、移植14週後に移植動物の骨髄からCD34+ HSPCを単離し、インビトロで赤血球系分化に供した。Venus+細胞をFACSによって濃縮し、RT-PCRによってγ-およびβ-グロビンの発現を判定した（図24F）。以前のデータと一致して、β-グロビン遺伝子座の産生量全体のうちγ-グロビンの画分は、LCR-shRNAmiR3による形質導入を受けた細胞では44.9％±5.5％であり、これに対して、非形質導入細胞またはLCR-shRNAmiRNT形質導入細胞からなる2つの対照群ではほぼ9％±0.5％であった。
【０３３８】
shRNAは生物学研究において遺伝子機能を分析するために広く用いられており、治療を目的とするRNAiの使用にはますます関心が寄せられている。BCL11Aは、RNAiに基づくモジュレーションのための魅力的な治療標的である。BCL11Aはγ-グロビン発現のリプレッサーであり、それ故に赤血球系細胞における胎児型ヘモグロビンから成人型ヘモグロビンへのスイッチングにおいて主な調節因子として作用する。重要なこととして、高レベルの胎児型ヘモグロビンは鎌状赤血球症（SCD）およびβ-サラセミアにおいてより軽症の疾患表現型と関連しており、BCL11Aの系列特異的ノックアウトはSCDのモデルにおいて治療戦略として検証されている。本明細書で報告した研究において、本発明者らの目標は、RNAiにより媒介されるBCL11Aの抑制によって胎児型ヘモグロビン発現を再活性化するための、臨床的に適用可能なベクターを開発することであった。赤血球系列特異的pol IIプロモーターから発現されるmiRNA適合shRNA（shRNAmiR）を含む最適化されたレンチウイルスベクターを用いて、本発明者らは、形質導入を行ったCD34+ HSPCに由来する初代赤血球系細胞において総ヘモグロビンの50％を上回るHbFレベルを達成した。このHbF誘導のレベルは臨床的に有効である可能性が高く、本明細書で報告したSINレンチウイルスベクターの系列特異性および安全性プロフィールを欠くpol IIIで駆動する発現カセットを利用する、過去に発表されたベクター（23,27,29）に勝るとも劣らない。
【０３３９】
SCDに対する治癒的治療は、造血幹細胞移植（HSCT）によって得ることができる。SCDにおける良好な転帰は主として、マッチする同胞ドナーが得られるかどうかにかかっている。SCD患者のうち、罹患しておらずHLAがマッチする同胞の可能性があるドナーがいるのは10％未満である（34）。異常ヘモグロビン症に対する遺伝子治療は、自己由来細胞の使用によるGVHDのリスクがなくせるという明らかな利点がある。本発明者らの研究の長期目標は、ヘモグロビンスイッチングをモジュレートして、防御的HbFの誘導および鎌状グロビンの抑制を内因性かつ生理的にもたらすことである。本発明者らは、発現のこの二重調節が、突然変異型重合性ヘモグロビンの溶血および末端器官障害を含むSCDにおける毒性を防止するための最も有効な治療アプローチと考えられるという仮説を立てている。治療効果という目的を実現するには、細胞ベースでBCL11Aの十分なノックダウンおよびHbFの誘導が起こらなければならず、疾患表現型を弱めるための赤血球区画のキメリズムのために、遺伝子改変された長寿命のHSCが十分な数だけ生着しなければならない。したがって、本明細書に示されたようなBCL11Aノックダウンの最適化および形質導入HSCPの再構成能力の保持が、SCDにおける遺伝子治療の長的奏効のためには決定的に重要である。この第2の点に関して、本発明者らはこれが現時点で達成可能であると考えているが、これは混合キメリズムをもたらした同種異系移植による以前のデータから、骨髄系区画のキメリズムが10％程度であっても80〜100％という末梢血赤血球キメリズムを伴うことが実証されているためである（35）。生着後の赤血球塊の歪みが、鎌状細胞と比較して正常赤血球の生存性が高いことの原因である可能性が最も高い。寿命の長い骨髄系細胞のこのレベルの特徴づけは、β-サラセミア（39）を含む、レンチウイルスベクター（36-38）を利用するヒトの治験において得られている。
【０３４０】
pol IIIで駆動するshRNAは、RNAiによって遺伝子ノックダウンを生じさせるための最もよく利用されているベクター系であるが、これらのベクターは、高い発現レベルによる非特異的毒性および特定の細胞型における配列特異的毒性の両方を伴う可能性がある遍在性発現を媒介する。本明細書で、本発明者らは、HSCにおけるBCL11Aノックダウンが、移植環境におけるこれらの細胞の生着およびインビボでのB細胞発生を障害させることを実証している。BCL11Aの非存在下での生着の低下は報告されていない現象であるが、本明細書で報告したデータは、初期HSPCにおけるBCL11Aの発現が知られていること、およびBCL11Aの遺伝子欠失によりマウスにおけるHSC含有量がほぼ2分の1に減少するという報告に一致する（31,40,41）。生着中のHSCに対するBCL11Aノックダウンの悪影響は、この実験状況に存在する選択圧がより高いことから、本明細書で報告したアッセイにおいてより明白でありうる。HSCのエクスビボ培養およびこれらの細胞の形質導入後には一般に限られた数のHSCしか存在せず、本明細書で用いたアッセイで利用した対照HSCとの競合は、そのHSCレベルでの毒性の検出を強化している可能性がある。赤血球系列においてBCL11Aは必須ではない（24）。本明細書で報告したデータでは、β-グロビン遺伝子座に由来する調節配列（32,42）を含む赤血球系特異的LCR-ベクターにより、HSC生着に対するBCL11Aノックダウンの有害作用が回避された。このLCR-ベクターは、BCL11Aを標的とするshRNAmiRの発現に関して、高度の系列忠実度を示した。加えて、このベクターの構成は、他の導入遺伝子を発現させるために用いた場合に近傍細胞遺伝子のトランス活性化のリスクを減少させることが実証されており（43）、これは臨床移行のためには重要な特徴である。したがって、shRNAmiRの転写ターゲティングはBCL11Aの場合には決定的に重要であるように思われ、有効なpol IIベースのノックダウンベクターを開発することの重要性を強く示している。このアプローチは、HSPCに対する、またリンパ系細胞の発生（30,31）に対するBCL11Aのノックダウンの悪影響を回避するとともに、shRNA過剰発現に関連した毒性を防ぎ（9,11,19）、ベクター系の安全性プロフィールを改善し、その一方で、治療有効性は維持する。
【０３４１】
shRNA発現のためのpol IIプロモーターの使用には、shRNAをマイクロRNA配列中に埋め込むことが必要である。これまでに検証された有効なshRNA配列の大半は、pol IIIプロモーターを用いて行われた分析に由来しており、市販のノックダウン系の大半はpol IIIプロモーターに基づくことから、shRNA配列のpol II立体配置への変換が重要である。この領域でのかなりの研究にもかかわらず、有効なpol IIIベースのベクターに由来するshRNA配列をpol IIベースのshRNAmiRベクターに変換するための指針は乏しい。本明細書では、両方の種類のベクターによる形質導入細胞によるRNAプロセシングの結果を並行して比較することによって、本発明者らは、標的と一致させた配列に対して異なる低分子RNA産物が生成され、その結果pol IIベースのベクターを介した標的ノックダウンの効率が著しく低下することを確かめた。同一の標的mRNAと一致する配列を含むpol II系およびpol III系から産生される成熟ガイド鎖配列は一般に、互いに3〜5ntのシフトがある。pol III終止シグナルからの3〜5個のU残基をshRNA転写物の3'末端に付加することにより、ダイサー切断部位の対応するシフトがもたらされ、ダイサー切断のための3'カウントルールの役割が優位となる（44,45）。pol IIと比較したpol IIIにおけるガイド鎖のシフトはノックダウン効率に大きな影響を及ぼすが、これはシード領域が改変されて低分子RNA二重鎖の熱力学的特性および末端ヌクレオチドの実体が変化し、それによってRISC-エフェクター複合体へのガイド鎖組み入れに影響が及ぶためである（4,5,46,47）。pol IIIで駆動されるshRNAによって産生される成熟ガイド鎖配列を模すようにshRNAmiRを再設計することにより、標的mRNAのプロセシング強化およびノックダウン向上がもたらされた。このアプローチは、他の系列特異的発現カセットを含む、pol IIプロモーターを用いる他の遺伝子を標的とするベクターの開発に対しても適用可能なはずである。
【０３４２】
以上をまとめると、これらのデータは、異なるベクター環境におけるshRNAの使用に関連するRNAプロセシングの決定的な特徴を実証しており、また、広範な発現の有害な結果を回避する系列特異的遺伝子ノックダウンのための戦略も提供している。これらの知見は、RNAiに基づく遺伝子治療アプローチにおける、マイクロRNAに埋め込まれたshRNAの設計およびそれらの適用にとって、重要な意義がある。
【０３４３】
実施例11
健常ドナーのヒトCD34+細胞におけるBCL11A shRNAmiRの形質導入の有効性試験
転写リプレッサーBCL11Aはβ-異常ヘモグロビン症の治療標的となる。pol IIプロモーターにより発現されるマイクロRNA適合shRNA（shRNAmiR）を介した赤血球系細胞におけるBCL11Aの選択的抑制は、マウス細胞およびヒト細胞の両方においてBCL11Aの有効なノックダウンをもたらした。改変shRNAmiRを赤血球系特異的な様式で発現させることにより、マウスHSCの生着およびB細胞の発生に対する有害作用が回避され（実施例10、前記を参照）、初代ヒトCD34由来赤血球系細胞、ならびにマウス異種移植における改変CD34+細胞の完全生着後にインビトロで分化させたヒト赤血球系細胞における、効率的なBCL11Aノックダウンおよび高レベルのHbFをもたらした。本発明者らはまた、鎌状赤血球症を有するドナーから入手した形質導入CD34細胞に由来する赤血球系細胞におけるHbFの有効な誘導も実証した。
【０３４４】
一連の実験において、健常なドナー由来のGCSF動員CD34に対して、非標的指向性shRNA（LCR-NT）またはBMS11-D12G5を発現するベクターによる形質導入を行い、赤血球系インビトロ分化に供した。
【０３４５】
BCL11A D12G5-2 shRNA：センス
2019129846.tif 000082
アンチセンス
2019129846.tif 000083
【０３４６】
図27Aは、BCL11Aアイソフォーム（LおよびXL）およびローディング対照としてのβ-アクチンを示している、形質導入CD34細胞に由来するインビトロで分化させた赤血球系細胞のウエスタンブロットであり、BCL11A XLの有効なノックダウンを実証している。図27Bは、赤血球系細胞におけるBCL11Aノックダウンの定量を示している。データは、図27Aに示すようなウエスタンブロットに由来する。データは、単一ドナー由来の細胞を用いた3回の独立した実験をまとめている。（エラーバー：SD）
【０３４７】
図27Cは、RT-qPCRによって評価した赤血球系細胞におけるγグロビンの誘導、およびHPLCによって評価したヘモグロビン（HbF）を示している。
【０３４８】
実施例12
赤血球系細胞におけるBCL11Aノックダウンの定量
BCL11A発現のインビボでのノックダウンの有効性を含めて、形質導入CD34+細胞のNSG免疫不全マウスにおける生着を調査した。ヒトCD34に対してLCR-NTまたはBMS11-D8G5による形質導入を行い、致死量以下の放射線照射を行ったNSG-レシピエントマウスに注入した。骨髄CD34+を14週後に単離し、赤血球系インビトロ分化に供した。図28は、RT-qPCRによって評価した、赤血球系細胞におけるγグロビンの誘導を示している。
【０３４９】
実施例13
鎌状細胞患者由来の形質導入CD34細胞に由来する赤血球系細胞におけるBCL11Aのノックダウンおよび胎児型ヘモグロビンの誘導
HU治療を受けたベースラインHBF値が高いSCD患者から、骨髄CD34を単離した。細胞にLCR-NTまたはLCR-D12G5による形質導入を行って、赤血球系インビトロ分化に供した。
【０３５０】
BCL11Aノックダウンを鎌状細胞患者の細胞において調査した。骨髄CD34を鎌状細胞患者から単離し、細胞に対してLCR-NTまたはLCR-D12G5-2による形質導入を行い（非形質導入細胞を別の対照として用いた）、インビトロでの赤血球系分化に供した。図29Aは、BCL11Aアイソフォーム（LおよびXL）およびローディング対照としてのβ-アクチンを示しているウエスタンブロットであり、BCL11A XLの有効なノックダウンを実証している。各パネル（レーンの下方のラベル表示1〜6）は、単一ドナー由来の細胞を用いた独立した実験を表している。図29Bは、赤血球系細胞におけるBCL11Aノックダウンの定量を示している。データは、図29Aに示されたウエスタンブロットに由来する。図29Cは、HPLCによる、結果として起こるHbFの誘導を示している。この患者はヒドロキシ尿素治療を受けており、それがベースラインHb Fレベルの高さの一因であった。
【０３５１】
実施例14
治療プロトコールの態様
初期評価
患者に施設ガイドラインに従って自己由来骨髄移植のための標準的な精密検査を行い、続いてバックアップ用骨髄として用いるため（最小限2×106個のCD34+細胞／kg）、および遺伝子移入のための自己由来骨髄の採取のために（目標は5×106個のCD34+細胞／kg、最小限は4×106個のCD34+細胞／kg）、2回の骨髄採取を最短で4週間を隔てて行う。
【０３５２】
バックアップ用自己移植片の採取
治療に先立ち、患者からサルベージ手順（「バックアップ移植片」）として役立てる造血細胞を収集するが、その際、遺伝的に操作された細胞の注入後6週間は造血回復が観察されないこと、または操作された細胞が放出基準を満たさないこととする。骨髄（最大20cc／kg）の採取は、遺伝子治療の少なくとも4週間前に、全身麻酔下にある患者の両側の後腸骨稜から複数回の穿刺によって行う。2×106個のCD34+細胞／kgを含む骨髄の部分を、バックアップ移植片を構成するために自己由来骨髄収集のための標準的な臨床手順に従って、液体窒素蒸気（162℃および-180℃）中で、操作しないまま凍結させた。採取物の残りは、CD34+細胞用に選択し（下記）、かつ遺伝子改変用に利用する（下記）。
【０３５３】
骨髄採取
第1の骨髄採取物のうち、必要なバックアップ骨髄から余った残りを、遺伝子移入のための第2の骨髄採取物とともに利用する。第2の採取は、初回採取（上記）から4週後以降に行う。第2の採取のためには、骨髄を再び全身麻酔下にある患者の両側の後腸骨稜から複数回の穿刺によって採取する。収集する骨髄の量は最大で20ml／kg体重とする。これにより、有核細胞の総数はほぼ4×108個／kgを上回ることになる。これはひいては、CD34+細胞選択後に4×106個／kgを上回る用量のCD34+細胞が得られることになるはずである。
【０３５４】
両方の採取による推定CD34+数がいずれも4×106個／kg未満である対象には、前処置（conditioning）を行わないこととする。少なくとも6週間の期間をおいた後に、対象が試験に残ることを希望するならば、再度採取を行ってよい。対象が再度採取されることを望まないならば、その対象は試験から離脱することになる。
【０３５５】
形質導入を行ったCD34+細胞の投与前に試験から離脱した対象には、通常の診療を再開する（支持療法および／または同種異系HSCT）。有効性および安全性の評価は、離脱した時点以後は実施せず、データベース用のデータも収集しない。
【０３５６】
CD34+細胞の単離、予備刺激および形質導入
CD34+細胞の精製
前処置用薬剤の排出のために十分な時間がとられ、予備刺激および培養の時間が最小限となるように、骨髄全体を一晩保存する。作製段階はすべて、DFCIのConnell & O'Reilly Families Cell Manipulation Core Facilityで行う。骨髄は、密度勾配遠心によって赤血球が除去されたものとする。CliniMACS試薬および装置を用いて、骨髄単核細胞からCD34+細胞を陽性選択する。純度および無菌性を評価するために、品質管理（QC）用試料を採取する。精製された細胞は、予備刺激および形質導入のために直ちに処理する。
【０３５７】
CD34+の予備刺激および形質導入
形質導入は、一方または両方の採取時に実施する。第1の採取物からのバックアップ骨髄目標物から余った細胞に形質導入を行い、以後に用いるために凍結する。第2の採取物は全体を遺伝子移入に用い、第2の採取物の形質導入産物を、前処置後の第1の採取物からの融解させた形質導入細胞とともに注入する。
【０３５８】
精製されたCD34+細胞を、閉鎖培養バッグ内の、増殖因子（IL-3、SCF、FLT3L、TPO）を加えた無血清培地中に0.5〜1×106個／mlの密度で播種し、37℃、5％ CO2のインキュベーターに入れる。24〜30時間後に、細胞を採取して計数する。さらなるQC試験には、細胞生存性およびコロニー形成単位（CFU）アッセイが含まれる。細胞を新たな培養バッグに移し、レンチウイルス上清によって処理する。この1回目の形質導入では、細胞を18〜24時間インキュベートする。続いて細胞を採取し、計数して、2回目の形質導入用にレンチウイルス上清とともに新たなバッグに移す。
【０３５９】
最終的な採取および製剤化
2回目の形質導入後に、細胞を採取し、プラズマライト（plasmalyte）中で洗浄して、それらの最終的な製剤中に容量50〜100mLとして再懸濁させる（PLASMALYTE、1％ HSA）。QC試料を取り出した後の利用可能なすべての細胞を患者に注入する。QCには、細胞数、生存性、洗浄上清の無菌性、マイコプラズマ、上清のエンドトキシン、表現型、CFU、RCL（採取されて保管された試料）、挿入分析、およびqPCRによる平均ベクターコピー数（培養細胞）が含まれる。グラム染色用の試料は患者への送達直前に生成物から採取する。
【０３６０】
対象への再注入前の試験
手順の間および終了時に、試料を、細胞数および生存性（トリパンブルー排除または同等のもの）、無菌性、マイコプラズマ、形質導入効率（ベクターコピー数）、グラム染色、エンドトキシンおよびRCL試験のために収集する。これらのうち、細胞生存性、無菌性（過程の間、72時間）、グラム染色およびエンドトキシン測定値は注入前に得られるようにする。
【０３６１】
微生物培養物で、72時間時点でのグラム染色または培養結果陽性によって一過性の細菌混入が判明した場合には、Cell Manipulation Core Facilityのスタッフが、治験責任医師（PI）、副医長および主治医に連絡を取って、バックアップ採取物を注入するか、または生成物に抗生物質処理を行った上で注入するかの決断を求める。バックアップ採取物を注入する場合には、対象はプロトコールからの離脱とする。細胞生存性が70％未満であるか、無菌性試験の結果が陽性であるか、またはエンドトキシンが5 EU／kg／時を上回る場合には、細胞を戻さないこととし、バックアップ採取物を注入した上で、対象をプロトコールからの離脱とする。
【０３６２】
形質導入の終了時に、両方の採取物／形質導入物からの生細胞数が4×106個のCD34+細胞／kg以上である場合には、細胞を注入する。両方の採取物／形質導入物からの生細胞数が、形質導入の終了時に4×106個のCD34+細胞／kg未満であれば、細胞を注入せず、バックアップ採取物を48時間後に注入する。
【０３６３】
対象の前処置レジメン
対象に対して、形質導入細胞の注入前に、第-4日から第-2日まで、ブスルファン（ほぼ4mg／kg静脈内を毎日、体重補正を行い、1日1回、3時間かけて）の投与による骨髄破壊的前処置を行う。前処置は、骨髄細胞の精製および形質導入と同時並行的に行う。3日間の投与日すべてで採血によりブスルファンレベルを評価し、第1日および第2日のレベルを用いて、目標とする曲線下面積に調整する。
【０３６４】
形質導入細胞の注入
Boston Children's Hospital Hematopoietic Stem Cell Transplantation Unitの標準的ガイドラインに従って、標準的な予備水分補給および予備投薬の後に、細胞を30〜45分間かけて静脈内に注入する。この基準では、注入中すべておよびその後30分間にわたって、患者の心臓、呼吸および酸素飽和度を連続的にモニターすることを求めている。バイタルサインの測定および記録は、輸注の前、輸注を開始する15分間、注入期間中は1時間毎、および輸注終了時に行う。輸注の最初の5分間は、登録看護婦（RN）が付き添うこととする。2種の形質導入産物を投与する場合には、第2の形質導入産物は第1のものの後に間を置かずに投与する。
【０３６５】
本発明をその詳細な記載とともに説明してきたが、上述の説明は本発明を例示するためのものであり、その範囲を制限するものではなく、それは添付する特許請求の範囲によって規定されることが理解される必要がある。その他の局面、利点および変更は、以下の特許請求の範囲内にある。
【０３６６】
参考文献
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2019129846.tif 000085
2019129846.tif 000086
2019129846.tif 000087
【０３６７】
合成miRオリゴヌクレオチドの一覧
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2019129846.tif 000089
2019129846.tif 000090
2019129846.tif 000091
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
2019129846.tif 000150
【図２１Ｃ】
2019129846.tif 000151
【図２１Ｄ】
2019129846.tif 000152
【図２１Ｅ】
2019129846.tif 000153
【図２２】
2019129846.tif 000154
【図２３Ａ】
2019129846.tif 000155
【図２３Ｂ】
2019129846.tif 000156
【図２３Ｃ】
2019129846.tif 000157
【図２３Ｄ】
2019129846.tif 000158
【図２３Ｅ】
2019129846.tif 000159
【図２３Ｆ】
2019129846.tif 000160
【図２３Ｇ】
2019129846.tif 000161
【図２３Ｈ】
2019129846.tif 000162
【図２３Ｉ】
2019129846.tif 000163
【図２４Ａ】
2019129846.tif 000164
【図２４Ｂ】
2019129846.tif 000165
【図２４Ｃ】
2019129846.tif 000166
【図２４Ｄ】
2019129846.tif 000167
【図２４Ｅ】
2019129846.tif 000168
【図２４Ｆ】
2019129846.tif 000169
【図２５】
2019129846.tif 000170
【図２６】
2019129846.tif 000171
【図２７】
2019129846.tif 000172
【図２８】
2019129846.tif 000173
【図２９】
2019129846.tif 000174
【図３０】
2019129846.tif 000175
【図３１】
2019129846.tif 000176
【配列表】
2019129846000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月9日(2019.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成BCL11AマイクロRNAをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターを含む造血幹細胞または造血始原細胞であって、
該合成BCL11AマイクロRNAが、
a）BCL11A配列を含む第1のBCL11Aセグメント、ループセグメント；および
b）5'から3'への方向に直列に並んだ第2のBCL11Aセグメント
を含み、
該ループセグメントが第1および第2のBCL11Aセグメントの間にあってそれらと直接連結されており、
第1および第2のBCL11Aセグメントが塩基対合してヘアピンループを形成するように第2のBCL11Aセグメントが第1のBCL11Aセグメントに対して相補的であり、該ループセグメントがそのようにして形成されたヘアピンループのループ部分を形成しており、かつ
該第1のBCL11Aセグメントが5'末端にて-GCGC-で始まり、該第2のBCL11Aセグメントが3'末端にて-GCGC-で終わる、
前記造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項２】
造血幹細胞である、請求項1に記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項３】
造血始原細胞である、請求項1に記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項４】
赤血球系細胞である、請求項1に記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項５】
第1および第2のBCL11Aセグメントが約18〜25ヌクレオチド長である、請求項1〜4のいずれか一項記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項６】
第1のBCL11Aセグメントが、BCL11A mRNA配列に由来する配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項７】
第1のBCL11Aセグメントが第2のBCL11Aセグメントに対して相補的である、請求項1〜6のいずれか一項記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項８】
第1のBCL11Aセグメントが、
2019129846.tif 000177
；本明細書に記載のmiR1G5オリゴに由来）、
2019129846.tif 000178
；本明細書に記載のE3G5またはE3 modオリゴまたはshRNA1modに由来）、
2019129846.tif 000179
；本明細書に記載のB5G5またはshRNA2modに由来）、
2019129846.tif 000180
；本明細書に記載のB11G5またはshRNA4modに由来）、
2019129846.tif 000181
；本明細書に記載の50D12G5、D12G4またはshRNA5modに由来）、
2019129846.tif 000182
；本明細書に記載の50A5G5またはshRNA6modに由来）、
2019129846.tif 000183
；本明細書に記載の50B11G5またはshRNA7modに由来）、および
2019129846.tif 000184
；本明細書に記載のBCL11A D8G5またはD8 modまたはshRNA3modに由来）からなる群より選択される、
請求項1〜7のいずれか一項記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項９】
ループセグメントがマイクロRNAに由来する、請求項1〜8のいずれか一項記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項１０】
前記マイクロRNAが造血特異的マイクロRNAである、請求項1〜9のいずれか一項記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項１１】
前記マイクロRNAがmiR223である、請求項1〜9のいずれか一項記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項１２】
ループセグメントがctccatgtggtagagである、請求項1〜9のいずれか一項記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項１３】
前記合成BCL11AマイクロRNAが、SEQ ID NO：34、35、36、37、38、39、40、41、および42からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の造血幹細胞または造血始原細胞。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか一項記載の造血幹細胞または造血始原細胞を含む、組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
対象における異常ヘモグロビン症を治療するのに使用するためのまたはそれを発症するリスクを減少させるための、請求項14または15記載の組成物。
【請求項１７】
対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させるための医薬の製造において使用するための、請求項14または15記載の組成物。
【請求項１８】
細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるのに使用するための、請求項14または15記載の組成物。