(57)【要約】【課題】リンパ脈管筋腫症のバイオマーカー及びその利用方法を提供すること。【解決手段】被検体から採取された体液の細胞外小胞におけるタンパク質群（A）、及びmiRNA群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ脈管筋腫症を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、及びmiRNA群（B）：
（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程を含む、検査方法。
【請求項２】
検出したバイオマーカーが、タンパク質群（A1）、及びmiRNA群（B1）：
（A1）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、及びCD81 antigenからなるタンパク質群、並びに
（B1）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、及びmiR-6831-5pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、
さらに、（2a）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体がリンパ脈管筋腫症に罹患していると判定する工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
検出したバイオマーカーが、タンパク質群（A2）、及びmiRNA群（B2）：
（A2）CD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
（B2）miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、
さらに、（2b）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体がリンパ脈管筋腫症に罹患していると判定する工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
前記体液が全血、血漿、及び血清からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１〜３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項５】
前記被検体がヒトである、請求項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
【請求項６】
タンパク質群（A）：
（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
miRNA群（B）：
（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、リンパ脈管筋腫症の検査薬。
【請求項７】
タンパク質群（A）：
（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
miRNA群（B）：
（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの抑制剤を含有する、リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤。
【請求項８】
被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、
タンパク質群（A）：
（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
miRNA群（B）：
（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
【請求項９】
被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、
タンパク質群（A）：
（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
miRNA群（B）：
（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、リンパ脈管筋腫症の誘発性又は増悪性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ脈管筋腫症バイオマーカー、その利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ脈管筋腫症（Lymphangioleiomyonatosis:LAM）は平滑筋細胞様のLAM細胞が体軸リンパ節などで増殖、肺に転移し、多発性嚢胞を形成する、慢性・進行性かつ全身性の希少・難病である。病態は癌抑制遺伝子であるTSC遺伝子（TsclやTsc2）の異常により生じるLAM細胞（腫瘍）が主にリンパ管などを通じて肺などに転移することにより引き起こされる、低悪性度腫瘍性疾患である。日本での有病率が人口100万人あたり約1.9〜4.5人で、主に、若年女性に発症する。肺組織の破壊により、慢性呼吸不全を呈し、進行すると、酸素療法、さらには、肺移植が必要になる。基礎疾患として結節性硬化症（tuberoussclerosiscomplex:TSC）に伴って発生するTSC-LAMと、単独で発生する孤発性LAM（Sporadic-LAM）とに分類される。LAMのバイオマーカー（BM）としては血清VEGF-Dが診断、治療効果を反映し、診断基準の一項目となっているが、それのみで十分ではない。したがって、鑑別や治療に有用なさらなるバイオマーカー（BM）の開発が急務である。
【０００３】
血清は、非侵襲的に繰り返し採取可能な最も理想的なサンプルと考えられるものの、99%以上はBMの観点から爽雑物とされる多量タンパク（アルブミンなど）のため、プロテオミクスという観点から有用性を認めない。例えば、最近のLAM患者血柴プロデオミクスでも疾患特異的な蛋白は検出できていない。大量爽雑物を含む血清を用いた解析のため見出されたBMは血清爽雑物のみで、LAM特異的BMとは程遠い（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Banville, PLoS One. 2014 Aug 18;9(8):e105365.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、リンパ脈管筋腫症のバイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、被検体から採取された体液の細胞外小胞における特定のタンパク質群が、リンパ脈管筋腫症のバイオマーカーとして有用であることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００７】
項１．  
リンパ脈管筋腫症を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、及びmiRNA群（B）：
（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程を含む、検査方法。
【０００８】
項２．  
検出したバイオマーカーが、タンパク質群（A1）、及びmiRNA群（B1）：
（A1）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、及びCD81 antigenからなるタンパク質群、並びに
（B1）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、及びmiR-6831-5pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、
さらに、（2a）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体がリンパ脈管筋腫症に罹患していると判定する工程を含む、項１に記載の検査方法。
【０００９】
項３．  
検出したバイオマーカーが、タンパク質群（A2）、及びmiRNA群（B2）：
（A2）CD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
（B2）miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、
さらに、（2b）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体がリンパ脈管筋腫症に罹患していると判定する工程を含む、項１に記載の検査方法。
【００１０】
項４．  
前記体液が全血、血漿、及び血清からなる群より選択される少なくとも1種である、項１〜３のいずれかに記載の検査方法。
【００１１】
項５．  
前記被検体がヒトである、項１〜４のいずれかに記載の検査方法。
【００１２】
項６．  
タンパク質群（A）：
（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
miRNA群（B）：
（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、リンパ脈管筋腫症の検査薬。
【００１３】
項７．  
タンパク質群（A）：
（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
miRNA群（B）：
（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの抑制剤を含有する、リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤。
【００１４】
項８．  
被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、
タンパク質群（A）：
（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
miRNA群（B）：
（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
【００１５】
項９．  
被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、
タンパク質群（A）：
（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群、並びに
miRNA群（B）：
（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群、
からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、リンパ脈管筋腫症の誘発性又は増悪性の評価方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、リンパ脈管筋腫症のバイオマーカーを提供することができる。該バイオマーカーを利用することにより、リンパ脈管筋腫症の検査等を、より簡便、より効率的、且つより低コストで行うことができる。さらに、該バイオマーカーを利用することにより、リンパ脈管筋腫症の予防又は治療、リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング等も可能になり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】細胞外小胞画分の粒子数及び粒子径を示す（試験例1）。Healthy volunteersは健常被検体から得られた細胞外小胞画分の結果を示し、Sporadic-LAM及びTSC-LAMはそれぞれ当該疾患に罹患している被検体から得られた細胞外小胞画分の結果を示す。
【図２】Sporadic-LAMに罹患している被検体から得られた細胞外小胞画分の電子顕微鏡観察像を示す（試験例1）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１９】
1．リンパ脈管筋腫症の検査方法
本発明は、その一態様において、リンパ脈管筋腫症を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、及びmiRNA群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程（工程1）を含む、検査方法（本明細書において、「本発明のリンパ脈管筋腫症検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００２０】
1-1．工程（1）
検査対象である「リンパ脈管筋腫症（LAM）」は、特に制限されず、Sporadic-LAM（S-LAM）、TSC-LAMのいずれでもよい。検査対象は、好ましくはS-LAMである。
【００２１】
被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
【００２２】
被検体の状態は、特に制限されない。被検体としては、例えばリンパ脈管筋腫症に罹患しているかどうか不明な検体、リンパ脈管筋腫症に罹患していると既に別の方法により判定されている検体、リンパ脈管筋腫症に罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、リンパ脈管筋腫症の治療中の検体等が挙げられる。
【００２３】
体液は、特に制限されない。体液としては、例えば全血、血清、血漿、髄液、唾液、関節液、尿、組織液（気管支肺胞洗浄液を含む）、汗、涙、喀痰、鼻汁などが挙げられ、好ましくは全血、血清、血漿、髄液が挙げられ、より好ましくは全血、血清、血漿が挙げられる。体液は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００２４】
体液は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。例えば、全血は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。血清は、全血から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、全血から血球を除去した部分であり、例えば、全血を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。
【００２５】
細胞外小胞は、細胞から分泌、放出等される膜小胞である限り特に制限されない。細胞外小胞は、通常は、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている膜小胞として定義される。細胞外小胞としては、例えばエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体、エクトソーム、マイクロパーティクル、分泌マイクロベシクル等が挙げられる。
【００２６】
細胞外小胞は、体液から、公知の方法に従って又は準じて、精製、分離、濃縮等することができる。細胞外小胞を精製、分離、濃縮等する方法としては、例えば超遠心法（例えばペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等）、イムノアフィニティー担体を用いる方法、ゲルろ過法、フィールド・フロー分画法、FACS法等が挙げられる。また、細胞外小胞の精製、分離、濃縮等は、市販のキットを用いて行うことも可能である。これらの方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００２７】
工程（1）の検出対象は、タンパク質群（A）、及びmiRNA群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（本明細書において、これらをまとめて「対象バイオマーカー」と示すこともある。）である。
【００２８】
タンパク質群（A）は、リンパ脈管筋腫症特異的なバイオマーカーであり、これを指標とすることによりリンパ脈管筋腫症を鑑別可能である。
【００２９】
タンパク質群（A）は、（A）Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、CD81 antigen、及びCD63 antigenからなるタンパク質群である。
【００３０】
タンパク質群（A）中、タンパク質群（A1）：Fibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Bleomycin hydrolase、Transferrin receptor protein 1、Fibrinogen alpha chain、Protein S100-A12、Properdin、Aminopeptidase N、tRNA-dihydrouridine(20) synthase [NAD(P)+]-like、G-protein coupled receptor family C group 5 member C、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C、C4b-binding protein alpha chain、Vitamin K-dependent protein S、Suprabasin、Alpha-1-antichymotrypsin、Complement C1q subcomponent subunit C、Proteoglycan 4、Lactadherin、Protein S100-A9、Alpha-1-antitrypsin、Collagen alpha-3(VI) chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Protein S100-A6、Angiopoietin-1、Carbonic anhydrase 1、Glutathione peroxidase 3、Versican core protein、及びCD81 antigenからなるタンパク質群は、リンパ脈管筋腫症検体における量が健常検体における量よりも高いタンパク質群である。
【００３１】
タンパク質群（A）中、タンパク質群（A2）：CD63 antigenからなるタンパク質群は、リンパ脈管筋腫症検体における量が正常検体における量よりも低いタンパク質群である。
【００３２】
タンパク質群（A）の中でも、正常検体に対する量比がより高いという観点からは、好ましくはFibrinogen beta chain、Fibrinogen gamma chain、Putative alpha-1-antitrypsin-related protein、Protein S100-A8、Versican core protein等が挙げられる。
【００３３】
タンパク質群（A）のタンパク質は、ヒトの場合であれば、後述の実施例における表1-2に示されるUniProtKBアクセッション番号によって特定されるタンパク質である。他の生物種の場合であれば、表1に示されるUniProtKBアクセッション番号によって特定されるタンパク質のオーソログである。
【００３４】
miRNA群（B）は、リンパ脈管筋腫症特異的なバイオマーカーであり、これを指標とすることによりリンパ脈管筋腫症を鑑別可能である。
【００３５】
miRNA群（B）は、（B）miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、miR-6831-5p、miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA群である。
【００３６】
miRNA群（B）中、miRNA群（B1）：miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p、miR-6858-3p、miR-519d-5p、miR-1915-3p、miR-4707-5p、miR-3663-3p、miR-4755-3p、miR-3654、miR-3184-5p、miR-5705、miR-4450、miR-4439、miR-6872-5p、miR-3194-3p、miR-7851-3p、miR-4482-3p、miR-4481、miR-4515、miR-6127、miR-3614-5p、miR-6873-5p、miR-4532、及びmiR-6831-5pからなるmiRNA群は、リンパ脈管筋腫症検体における量が健常検体における量よりも高いmiRNA群である。
【００３７】
miRNA群（B）中、miRNA群（B2）：miR-451a、miR-16-5p、及びmiR-1224-3pからなるmiRNA質群は、リンパ脈管筋腫症検体における量が正常検体における量よりも低いmiRNA群である。
【００３８】
miRNA群（B）の中でも、正常検体に対する量比がより高いという観点からは、好ましくはmiR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-4633-3p等が挙げられる。
【００３９】
miRNA群（B）のmiRNAは、ヒトの場合であれば、後述の実施例における表3に示されるIDによって特定されるmiRNAである。他の生物種の場合であれば、表3に示されるIDによって特定されるmiRNAに対応するmiRNAである。
【００４０】
工程（1）における対象バイオマーカーの数は、1種のみでもよいが、2種以上の組み合わせであってもよい。より多く（例えば2種、5種、10種、20種、30種以上）の検出対象を組み合わせることにより、リンパ脈管筋腫症の検査等を、より正確に行うことが可能になる。
【００４１】
検出は、通常は、対象バイオマーカーの量又は濃度を測定することによって行われる。「濃度」とは、絶対濃度に限らず、相対濃度や、単位体積辺りの重量や、絶対濃度を知るために測定した生データなどでもよい。
【００４２】
対象バイオマーカーを検出する方法としては、対象バイオマーカーの一部又は全部を特異的に検出できる方法であれば特に制限されない。検出方法としては、具体的には、例えば、対象バイオマーカーを構成するペプチドを検出する質量分析法、対象バイオマーカーを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法、ノーザンブロット法、RT-PCR法、DNAチップ解析法等を挙げることができる。なお、対象バイオマーカーのアミノ酸配列情報は、UniProtKBアクセッション番号を基に、EBI（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html）のデータベースで検索することにより得ることができる。
【００４３】
免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ELISA法、サンドイッチELISA法、EIA法、RIA法、ウェスタンブロッティング法等を好適に例示することができる。
【００４４】
質量分析法とは、ペプチド試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチド試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、EI法、CI法、FD法、FAB法、MALDI法、ESI法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また、2以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（MS／MS）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。また、サンプルがリン酸化したペプチドを含む試料の場合、質量分析計へのサンプル導入前に、サンプルを鉄イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー（Fe-IMAC）を用いて濃縮することができる。また、液体クロマトグラフ（LC）やHPLCにより、対象バイオマーカーを構成するペプチドを分離・精製してサンプルとすることができる。また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。なお、質量分析法を用いて対象バイオマーカーを構成するペプチドを質量分析法で検出・定量する場合、かかるペプチドと同一のアミノ酸配列からなる、濃度が既知の安定同位体で標識したペプチドを内部標準とすることができる。かかる安定同位体標識ペプチドとしては、検出する対象バイオマーカーを構成するペプチドにおけるアミノ酸の1個以上が、15N，13C，18O，及び2Hのいずれか1以上を含む安定同位体標識ペプチドであれば、アミノ酸の種類、位置、数などは適宜選択することができ、かかる安定同位体標識ペプチドは、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてF-moc法（Amblard., et al. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で化学合成することができるが、iTRAQ（登録商標）試薬、ICAT（登録商標）試薬、ICPL（登録商標）試薬、NBS（登録商標）試薬などの標識試薬を用いて作製することもできる。
【００４５】
ノーザンブロット法を利用する場合は、具体的には、プローブを放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした上記発現系由来のmRNAとハイブリダイズさせた後、形成された診断薬と被検者の試料由来のmRNAとの二重鎖を、プローブの標識物（RI若しくは蛍光物質などの標識物質）に由来するシグナルを放射線検出器BAS-1800II（富士フィルム社製）又は蛍光検出器などで検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従ってプローブを標識し、上記発現系由来のmRNAとハイブリダイズさせた後、プローブ標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００４６】
RT-PCR法を利用する場合は、具体的には、上記発現系由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的領域が増幅できるように、一対のプライマー（上記cDNA（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記PCRを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識プローブを使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００４７】
DNAチップ解析を利用する場合は、DNAプローブ（1本鎖又は2本鎖）を貼り付けたDNAチップを用意し、これに上記発現系由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。
【００４８】
ウェスタンブロット法は、一次抗体を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などの標識物質に由来するシグナルを放射線測定器BAS-1800II（富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定する方法が例示される。また、一次抗体を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(Amersham Pharmacia Biotech社製)で測定することもできる。
【００４９】
工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、リンパ脈管筋腫症の検出指標である対象バイオマーカーの量及び／又は濃度を提供することができ、これによりリンパ脈管筋腫症の検出などを補助することができる。
【００５０】
工程（1）を含む本発明の検査方法による検査結果は、治療効果判定、リンパ脈管筋腫症の病態解明、リンパ脈管筋腫症の予後予測、患者層別化、治療方法の選択（個別化医療、治療反応性）、リンパ脈管筋腫症における難治化や、リモデリングの評価、リンパ脈管筋腫症の組織型や表現型等の鑑別等に利用し得る。
【００５１】
1-2．工程（2）
本発明の検査方法は、一態様として、検出したバイオマーカーが、タンパク質群（A2）、及びmiRNA群（B2）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、さらに、（2a）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体がリンパ脈管筋腫症に罹患していると判定する工程を含むことが好ましい。該工程2aを含む本発明の検査方法によれば、リンパ脈管筋腫症を判定することが可能となる。
【００５２】
本発明の検査方法は、一態様として、検出したバイオマーカーが、タンパク質群（A1）、及びmiRNA群（B1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、さらに、（2b）前記工程（1）で検出されたバイオマーカーの量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体がリンパ脈管筋腫症に罹患していると判定する工程を含むことが好ましい。該工程2bを含む本発明の検査方法によれば、リンパ脈管筋腫症を判定することが可能となる。
【００５３】
カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、リンパ脈管筋腫症に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、リンパ脈管筋腫症に罹患していない被検体から採取された体液の細胞外小胞における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば1〜1.5倍の値とすることができる。
【００５４】
工程（2）の好ましい一態様においては、被検体がリンパ脈管筋腫症の治療中の検体である場合、カットオフ値を、例えば同一検体についての過去の試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度に基づいた値とすることにより、治療効果を判定することができる。
【００５５】
2．リンパ脈管筋腫症のより高い精度での診断
工程（2）を含む本発明の検査方法により、被検体がリンパ脈管筋腫症に罹患していると判定された場合、本発明の検査方法に、さらにリンパ脈管筋腫症の医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度でリンパ脈管筋腫症を診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確にリンパ脈管筋腫症を検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「リンパ脈管筋腫症に罹患している」と診断できる。
【００５６】
3．リンパ脈管筋腫症の治療
工程（2）を含む本発明の検査方法により被検体がリンパ脈管筋腫症に罹患していると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「2．リンパ脈管筋腫症のより高い精度での診断」に記載の様にリンパ脈管筋腫症に罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）リンパ脈管筋腫症に罹患していると判定又は診断された被検体に対して、該疾患の治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより正確にリンパ脈管筋腫症を検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、リンパ脈管筋腫症に罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療できる。
【００５７】
リンパ脈管筋腫症の治療方法は、特に制限されないが、代表的には投薬治療が挙げられる。投薬治療に用いる医薬としては、特に制限されないが、例えばシロリムス、エベロリムス、性腺刺激ホルモン放出ホルモン誘導体、メドロキシプロゲステロン等が挙げられる。医薬は、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５８】
4．リンパ脈管筋腫症の検査薬
本発明は、その一態様において、タンパク質群（A）、及びmiRNA群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、リンパ脈管筋腫症の検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００５９】
タンパク質群（A）、miRNA群（B）、リンパ脈管筋腫症等については、上記「1．リンパ脈管筋腫症の検査方法」における定義と同様である。
【００６０】
検出剤は、対象バイオマーカーを特異的に検出できるものである限り特に制限されない。該検出剤としては、例えば対象バイオマーカーに対する抗体、対象バイオマーカーに対するプライマー、プローブ等が挙げられる。
【００６１】
検出剤は、その機能が著しく損なわれない限りにおいて、修飾が施されていてもよい。修飾としては、例えば、標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等の付加が挙げられる。
【００６２】
本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、HEX（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、NED（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、6-FAM（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドECL 3’-オリゴラベリングシステム等）。
【００６３】
検出剤は、任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明の検査薬は、検出剤を固定化した基板（例えばプローブを固定化したマイクロアレイチップ等。別の例として、抗体を固定化したELISAプレート等）の形態として提供することができる。
【００６４】
固定化に使用される固相は、抗体、ポリヌクレオチド等を固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相への検出剤の固定は、特に制限されない。固定方法は、例えばマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００６５】
抗体は、対象バイオマーカーを選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばウェスタンブロット法やELISA法において、対象バイオマーカーが特異的に検出できることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物が対象バイオマーカーに由来するものであると判断できるものであればよい。
【００６６】
抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。対象バイオマーカーのアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００６７】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象バイオマーカーを用いて、あるいは常法に従って当該対象バイオマーカーの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した対象バイオマーカー、あるいは対象バイオマーカーの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００６８】
抗体の作製に免疫抗原として使用される対象バイオマーカーは、公知の遺伝子配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
【００６９】
具体的には、対象バイオマーカーをコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また対象バイオマーカーの部分ペプチドは、公知の遺伝子配列情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００７０】
また本発明の抗体は、対象バイオマーカーの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、対象バイオマーカーと同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つ対象バイオマーカーのアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
【００７１】
かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
【００７２】
プライマーやプローブ等は、対象バイオマーカーやそれに由来する核酸等を選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、対象バイオマーカーが特異的に検出できること、またRT-PCR法においては対象バイオマーカー若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）が特異的に増幅されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または増幅物が対象バイオマーカーに由来するものであると判断できるものであればよい。
【００７３】
プライマーやプローブの具体例としては、下記（a）に記載するポリヌクレオチド並びに下記（b）に記載するポリヌクレオチド：
（a）対象バイオマーカーの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、並びに
（b）対象バイオマーカーの塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００７４】
相補的なポリヌクレオチド又は相補的な塩基配列（相補鎖、逆鎖）とは、対象バイオマーカーの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチド又は塩基配列を意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００７５】
プライマーやプローブ等は、例えば対象バイオマーカーの塩基配列をもとに、例えばベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記対象バイオマーカーの塩基配列をベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列を、プライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００７６】
プライマーやプローブ等の塩基長は、上述のように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであれば特に制限されず、用途に応じて適宜設定することができる。塩基長としては、例えばプライマーとして用いる場合であれば、例えば15塩基〜35塩基が例示でき、例えばプローブとして用いる場合であれば、例えば15塩基〜35塩基が例示できる。
【００７７】
本発明の検査薬は、組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
【００７８】
本発明の検査薬は、キットの形態であってもよい。該キットには、上記検出剤或いはこれを含む上記組成物のほかに、被検体の体液の細胞外小胞における対象バイオマーカーの検出に使用し得るものを含んでいてもよい。このようなものの具体例としては、各種試薬（例えば二次抗体、緩衝液等）、器具（例えば細胞外小胞の精製、分離、濃縮用器具（例えばカラム等））等が挙げられる。
【００７９】
5．リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤
本発明は、その一態様において、タンパク質群（A）、及びmiRNA群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの抑制剤を含有する、リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００８０】
タンパク質群（A）、miRNA群（B）等については、上記「1．リンパ脈管筋腫症の検査方法」における定義と同様である。
【００８１】
抑制剤としては、好ましくは対象バイオマーカーの発現抑制剤が挙げられる。
【００８２】
対象バイオマーカーの発現抑制剤としては、対象バイオマーカー、そのmRNA、その前駆体などの発現量を抑制し得るものである限り特に制限されず、例えば対象バイオマーカーの遺伝子特異的small interfering RNA（siRNA）、対象バイオマーカーの遺伝子特異的microRNA（miRNA）、対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター；  対象バイオマーカーの遺伝子特異的リボザイム；  CRISPR/Casシステムによる対象バイオマーカーの遺伝子遺伝子編集剤などが挙げられる。
【００８３】
なお、発現抑制とは、対象バイオマーカー、そのmRNAなどの発現量を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、これらの発現量を0とすることをも包含する。
【００８４】
対象バイオマーカーの遺伝子siRNAは、対象バイオマーカーをコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。また、siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さの組み合わせが想定される。
【００８５】
siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であっても良い。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、shRNAは、ある領域の配列を配列aとし、配列aに対する相補鎖を配列bとすると、配列a、スペーサー、配列bの順になるようにこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するようにし、全体で45〜60塩基の長さとなるように設計することができる。配列aは、標的となる対象バイオマーカーをコードする塩基配列の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されず、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列aの長さは19〜25塩基、好ましくは19〜21塩基である。
【００８６】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNAは、5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2〜4塩基程度である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシチミジンを表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「asymmetrical interfering RNA（aiRNA）」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々3塩基のオーバーハング構造をとる。
【００８８】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNAの標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、一実施形態において、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）などのホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認することが好ましい。特異性が確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19−21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19−21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるshRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
【００８９】
siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。
【００９０】
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これを、RNA切断タンパク質ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
【００９１】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNAは、対象バイオマーカーをコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNAは、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA（precursor miRNA）、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百〜数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50〜80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18〜30塩基である。一実施形態において、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このような対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。
【００９２】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸とは、対象バイオマーカーをコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、対象バイオマーカー合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性リボヌクレアーゼH（RNase H）に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、対象バイオマーカーの遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、対象バイオマーカーの遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTAなどのホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
【００９３】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果として対象バイオマーカーへの翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象バイオマーカーをコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよい。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題などを考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、対象バイオマーカーの遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域又は3’端ヘアピンループなどをアンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されるものではない。
【００９４】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸は、対象バイオマーカーの遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン（antigene））であってもよい。
【００９５】
上記した対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNA、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNA、及び対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含んでもよい。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate; PS)、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロジチオネート（phosphorodithioate）などの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH3（2’-O-Me）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、又はCH2CH2CNなど）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などを施してもよい。また、siRNAやmiRNAを構成するヌクレオチド分子の一部は、天然型のDNAに置換されていてもよい。
【００９６】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNA、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNA、及び対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸などは、対象バイオマーカーの遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも公知の手法により、化学的に合成することができる。
【００９７】
対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNA、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNA、又は対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸の発現ベクターについては、対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNA、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNA、又は対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸が発現可能な状態で組み込まれている限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現ベクターは、プロモーター配列、及び対象バイオマーカーの遺伝子特異的siRNA、対象バイオマーカーの遺伝子特異的miRNA、又は対象バイオマーカーの遺伝子特異的アンチセンス核酸のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどのRNA polymerase II（polII）系プロモーター；  マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどのRNA polymerase III（polIII）系プロモーターなどが挙げられ、これらの中でも、短いRNAの転写を正確に行うことができるという観点から、polIII系プロモーターが好ましい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤耐性遺伝子の種類及びベクターの種類は上述のものを例示できる。
【００９８】
対象バイオマーカーの遺伝子発現抑制剤の別の例としては、対象バイオマーカーの遺伝子特異的リボザイムなどが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAを意味するが、本願では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものは、ウイロイドやウイルソイドなどの感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型などが知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないという利点を有する。対象バイオマーカーの遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
【００９９】
本発明の剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。
【０１００】
本発明の剤の形態は、特に限定されず、本発明の剤の用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
【０１０１】
形態としては、用途が医薬、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられる。
【０１０２】
形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどが挙げられる。
【０１０３】
形態としては、用途が口腔用組成物である場合は、例えば液体（溶液、乳液、懸濁液など）、半固体（ゲル、クリーム、ペーストなど）、固体（錠剤、粒子状剤、カプセル剤、フィルム剤、混練物、溶融固体、ロウ状固体、弾性固体など）などの任意の形態、より具体的には、歯磨剤（練歯磨、液体歯磨、液状歯磨、粉歯磨など）、洗口剤、塗布剤、貼付剤、口中清涼剤、食品（例えば、チューインガム、錠菓、キャンディ、グミ、フィルム、トローチなど）などが挙げられる。
【０１０４】
本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば医薬、食品組成物、口腔用組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
【０１０５】
本発明の剤の対象バイオマーカーの抑制剤の含有量は、抑制剤の種類、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001〜100重量％、好ましくは0.001〜50重量％とすることができる。
【０１０６】
本発明の組成物の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に一日あたり0.1〜1000 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2〜3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【０１０７】
6．リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、及びmiRNA群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【０１０８】
体液、細胞外小胞、タンパク質群（A）、miRNA群（B）、リンパ脈管筋腫症、対象バイオマーカーの量又は濃度の測定等については、上記「1．リンパ脈管筋腫症の検査方法」における定義と同様である。
【０１０９】
動物の生物種は特に制限されない。動物の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
【０１１０】
被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。
【０１１１】
本発明の有効成分スクリーニング方法は、より具体的には、指標とするバイオマーカーが、タンパク質群（A1）、及びmiRNA群（B1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質をリンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤の有効成分（或いは、リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤の有効成分の候補物質）として選択する工程を含む。
【０１１２】
本発明の有効成分スクリーニング方法は、別の具体例として、指標とするバイオマーカーが、タンパク質群（A2）、及びmiRNA群（B2）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質をリンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤の有効成分（或いは、リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤の有効成分の候補物質）として選択する工程を含む。
【０１１３】
対応バイオマーカーとは、指標としている対象バイオマーカーと同じタンパク質を意味する。
【０１１４】
「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。
【０１１５】
「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。
【０１１６】
7．リンパ脈管筋腫症の誘発性又は増悪性の評価方法
本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液の細胞外小胞における、タンパク質群（A）、及びmiRNA群（B）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、リンパ脈管筋腫症の誘発性又は増悪性の評価方法（本明細書において、「本発明の毒性評価方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【０１１７】
体液、細胞外小胞、タンパク質群（A）、miRNA群（B）、リンパ脈管筋腫症、対象バイオマーカーの量又は濃度の測定、動物の生物種、被検物質等については、上記「1．リンパ脈管筋腫症の検査方法」及び「6．リンパ脈管筋腫症の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法」における定義と同様である。
【０１１８】
本発明の毒性評価方法は、より具体的には、指標とするバイオマーカーが、タンパク質群（A1）、及びmiRNA群（B1）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質をリンパ脈管筋腫症の誘発性又は増悪性があると判定する工程を含む。
【０１１９】
本発明の毒性評価方法は、別の具体例として、指標とするバイオマーカーが、タンパク質群（A2）、及びmiRNA群（B2）からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーである場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液の細胞外小胞における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質をリンパ脈管筋腫症の誘発性又は増悪性があると判定する工程を含む。
【０１２０】
対応バイオマーカーとは、指標としている対象バイオマーカーと同じタンパク質を意味する。
【０１２１】
「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。
【０１２２】
「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。
【実施例】
【０１２３】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【０１２４】
試験例1．細胞外小胞画分の調製
リンパ脈管筋腫症（LAM）であると診断されたヒト被検体（8名：Sporadic-LAM（S-LAM、3名）＋TSC-LAM（5名））それぞれの血清、健常ヒト被検体（4名：女性）それぞれの血清、及び慢性閉塞性肺疾患（COPD）であると診断されたヒト被検体（10名）から、細胞外小胞画分の調製した。細胞外小胞画分の調製は段階的超遠心法により行った。具体的には次のようにして行った。血清をPBSで希釈して、遠心（2000 g、4℃、30分間）した。上清を0.22μmのフィルターに通して、超遠心（100000 g、4℃、90分間）した。ペレットをPBSで洗浄した後、さらに同条件で超遠心した。この洗浄−超遠心工程を計2回繰り返して行った。最終的に得られたペレットをPBSで懸濁して、細胞外小胞画分を得た。
【０１２５】
続いて、得られた細胞外小胞画分について、細胞外小胞の粒子数及び粒子径を測定した。具体的には、ナノサイト（日本カンタム・デザイン株式会社、Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) Version 2.3 Build 0025）を使用して測定した。これは、粒子径ごとのブラウン運動速度の違いをもとに解析するものであり、画面に映る散乱光１つ１つの動きを追尾（トラッキング）し、各々の移動速度（拡散係数）から液中における粒子径（流体力学径）を算出することができる。結果を図１に示す。
【０１２６】
さらに、細胞外小胞を免疫電子顕微鏡法によって観察した。具体的には、次のようにして行った。固定済み細胞外小胞溶液を5〜8μLずつグリッドへ載せ15分静置して、グリッドのフォルムバールへ細胞外小胞を定着させた。PBSで3回洗浄した後、ブロッキング反応（1%BSA/PBS、10分）を行い、続いて一次抗体反応（Invitrogen AHS0902 Mouse (monoclonal) Anti-Human Leukemia and Platelet Associated Antigen CD9 Clone: MM2/57、100倍希釈、2時間半、室温）を行った。PBSで6回洗浄した後、二次抗体反応（CRL EMGMHL10 Anti-IgG (H＋L), Mouse, Goat-Poly, Gold 10 nm, EM、200倍希釈、1時間、室温）を行った。PBSで6回洗浄した後、1%GA/PBSで15分間処理し、さらにPBSで3回洗浄した。水洗し、0.5% UA（酢酸ウラニル）で処理して、乾燥させて、電子顕微鏡で観察した。得られた結果の代表例を図２に示す。
【０１２７】
図１〜２に示されるように、得られた画分にはエクソソームが存在しており、その粒子数及び粒子径は、健常被検体とLAM被検体とでほぼ差が見られないことが分かった。
【０１２８】
試験例2．プロテオミクス解析（TMTラベル、LC-MS/MS）
既報の文献（Journal of Proteome Research., 2017, 16 (2), pp 1077-1086.）に従って、TMTラベル-LC-MS/MSプロテオミクス解析を行った。概要は次のとおりである。試験例1で得られた細胞外小胞画分中のタンパク質をトリプシン消化して得られたペプチドサンプルを、TMT 10-plex試薬でラベルした。ラベル化サンプルをSCXカラムで分画し、質量分析計（LTQ-Orbitrap XL、Thermo Fisher Scientific社製）を用いてLC-MS/MS解析した。得られた生データを、解析プログラム（UniProt/SwissProtに対するMascot v2.3.1（Matrix Science社製）を備える、Proteome Discoverer ver.1.3（Thermo Fisher Scientific社製））を用いて解析し、各種タンパク質の定量データを得た。
【０１２９】
S-LAM被検体の細胞外小胞画分における量（S-LAM群）が、健常被検者の細胞外小胞画分における量（コントロール群）よりも有意に（p値＝0.05未満）高く（1.25倍以上）、且つCOPD被検体の細胞外小胞画分における量（COPD群）がコントロール群と有意な差が無いタンパク質を、LAMバイオマーカーとして一定程度の有効性があると判定し、選択した（群1）。
【０１３０】
また、S-LAM群、且つ、TSC-LAM被検体の細胞外小胞画分における量が、コントロール群よりも高く（1.25倍以上）、且つCOPD群がコントロール群と有意な差が無いタンパク質も、LAMバイオマーカーとして一定程度の有効性があると判定し、選択した（群2）。
【０１３１】
さらに、S-LAM群がコントロール群よりも高く（1.25倍以上）、且つ機能的にLAMに関連していると判断したタンパク質も、LAMバイオマーカーとして一定程度の有効性があると判定し、選択した（群3）。
【０１３２】
選択されたタンパク質、及びコントロール群に対する量比を表１に示す。
【０１３３】
【表１】
2019158753.tif 000002
【０１３４】
試験例3．プロテオミクス解析2（SRM/MRM）
既報の文献（Molecular & Cellular Proteomics 13: 10.1074/mcp.M113.037093, 1471-1484, 2014.）に従って、SRMプロテオミクス解析を行った。概要は次のとおりである。タンパク質のアミノ酸配列情報を基に、SRM法で特異的に検出されるペプチド（トリプシン消化断片）を1又は2種類ずつ選択し、それぞれに対するペプチドと同じアミノ酸配列からなる安定同位体標識ペプチド（SIペプチド）を、内部標準ペプチドとして用いた。試験例1で得られた細胞外小胞画分のタンパク質をトリプシン消化して、内部標準ペプチドと混合し、質量分析計（TSQ Vantage、Thermo Fisher Scientific社製）を用いたSRM法により相対定量解析した。得られた定量データに基づいて、S-LAM群がコントロール群よりも高く、且つ機能的にLAMに関連していると判断したタンパク質をLAMバイオマーカーとして一定程度の有効性があると判定し、LAMバイオマーカーとなるタンパク質を選択した。
【０１３５】
選択されたタンパク質、及びコントロール群に対する量比を表２に示す。
【０１３６】
【表２】
2019158753.tif 000003
【０１３７】
試験例4．miRNA解析
試験例1で得られた細胞外小胞画分中のmiRNA（microRNA）を測定対象としたマイクロアレイ解析を東レ社に委託して行った（3D-Gene（登録商標） miRNA Oligo chip）。
【０１３８】
S-LAM群がコントロール群よりも高い（2倍以上）、又はS-LAM群がコントロール群よりも低い（0.5倍以下）タンパク質を、LAMバイオマーカーとして一定程度の有効性があると判定し、選択した。
【０１３９】
選択されたタンパク質、及びコントロール群に対する量比を表３に示す。表３中、1〜3はコントロール群それぞれの被検体のデータを表し、4〜6はS-LAM群それぞれの被検体のデータを表し、Iは1〜3の平均を表し、IIは4〜6の平均を表し、ratioはII/Iを表す。
【０１４０】
【表３】
2019158753.tif 000004
【０１４１】
さらに、上記miRNAの中でも、疾患群で2/3の検体で検出可能であるという基準に従って、miR-4730、miR-6132、miR-744-5p、miR-1915-3p、miR-3663-3p、miR-4707-5pを、より有望なバイオマーカーとして選択した。
【図１】
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【図２】
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