(57)【要約】【課題】分化を開始した多能性幹細胞を植え継ぎの際に効率的に排除する。【解決手段】容器２０の有する凹部２１に多能性幹細胞を播種する。凹部２１は、樹脂からなるとともにチャンバー３０ａ−ｃからなるマイクロパターン２５の設けられている内底面２２を備える。チャンバー３０ａ−ｃの内側には改質により親水化された樹脂の表面が露出している。多能性幹細胞をチャンバー３０ａ−ｃ内で成育することでチャンバー３０ａ−ｃ内に浮遊する細胞塊３５ａ−ｂを形成する。細胞塊３５ａ−ｂをチャンバー３０ａ−ｃから取り出すとともに新しい容器に植え継ぎする。成育の際に、分化を開始した細胞を改質された表面に接着させる。これによりチャンバー３０ｃ内に分化を開始した接着性細胞３６を残す。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器の有する凹部に多能性幹細胞を播種し、ここで
前記凹部は、樹脂からなるとともに複数のチャンバーからなるマイクロパターンの設けられている内底面を備え、
前記チャンバーの内側には前記樹脂の表面が露出しており、
前記樹脂の表面は改質により親水化されており、
前記改質はプラズマ処理、ＵＶ／オゾン処理、コロナ処理及びフレーム処理のいずれかによるものであり；
前記マイクロパターンを覆うように前記凹部の内腔に培地が注入されている状態で前記マイクロパターンに向かって前記多能性幹細胞を沈降させ；
前記多能性幹細胞を前記チャンバー内で成育することで前記チャンバー内に浮遊する細胞塊を形成し；
前記細胞塊を前記凹部から取り出すとともに新しい培養容器に植え継ぎするところ、前記成育の際に、前記多能性幹細胞のうち三胚葉への分化を開始した細胞を前記改質された表面に接着させることで、前記チャンバー内に前記分化を開始した細胞を残すことを特徴とする、
継代培養方法。
【請求項２】
前記新しい培養容器は前記凹部を備え、
前記植え継ぎの際、前記細胞塊を分解して得た新しい細胞を前記新しい培養容器の前記凹部に播種し、
前記成育と前記植え継ぎとを繰り返すことで前記多能性幹細胞の細胞数を拡大する、
請求項１に記載の継代培養方法。
【請求項３】
前記改質される前の樹脂の表面は、水和したポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）の表面よりも大きい水接触角を有し、
前記改質された樹脂の表面は、水和したポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）の表面よりも小さい水接触角を有する。
請求項２に記載の継代培養方法。
【請求項４】
前記改質される前の樹脂の表面は、６０度よりも大きい水接触角を有し、
前記改質された樹脂の表面は、４５度よりも小さい水接触角を有する。
請求項３に記載の継代培養方法。
【請求項５】
前記樹脂は熱可塑性樹脂である、
請求項４に記載の継代培養方法。
【請求項６】
前記樹脂はポリオレフィン系樹脂、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、フッ素系樹脂、塩化ビニル系樹脂及びシリコン樹脂のうちのいずれか又はこれらの混合物からなる、
請求項５に記載の継代培養方法。
【請求項７】
前記チャンバーの開口においての内接円の直径が１ｍｍ以下であり、
前記チャンバーの内底面には細胞を通すための孔が設けられておらず、
前記チャンバーにおいて前記開口から前記内底面までの深さは８００μｍ以下である、
請求項１〜６のいずれかに記載の継代培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多能性幹細胞の継代培養に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は多能性幹細胞をマイクロパターン上で継代培養する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１７／１１５８６５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１の方法では、三胚葉への分化を開始した細胞を継代培養中に意図的に排除することはされていない。本発明はマイクロパターンを用いた多能性幹細胞の継代培養において、三胚葉への分化を開始した細胞を多能性幹細胞の植え継ぎの際に選択的に排除することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
［１］  培養容器の有する凹部に多能性幹細胞を播種し、ここで
前記凹部は、樹脂からなるとともに複数のチャンバーからなるマイクロパターンの設けられている内底面を備え、
前記チャンバーの内側には前記樹脂の表面が露出しており、
前記樹脂の表面は改質により親水化されており、
前記改質はプラズマ処理、ＵＶ／オゾン処理、コロナ処理及びフレーム処理のいずれかによるものであり；
前記マイクロパターンを覆うように前記凹部の内腔に培地が注入されている状態で前記マイクロパターンに向かって前記多能性幹細胞を沈降させ；
前記多能性幹細胞を前記チャンバー内で成育することで前記チャンバー内に浮遊する細胞塊を形成し；
前記細胞塊を前記凹部から取り出すとともに新しい培養容器に植え継ぎするところ、前記成育の際に、前記多能性幹細胞のうち三胚葉への分化を開始した細胞を前記改質された表面に接着させることで、前記チャンバー内に前記分化を開始した細胞を残すことを特徴とする、
継代培養方法。
［２］  前記新しい培養容器は前記凹部を備え、
前記植え継ぎの際、前記細胞塊を分解して得た新しい細胞を前記新しい培養容器の前記凹部に播種し、
前記成育と前記植え継ぎとを繰り返すことで前記多能性幹細胞の細胞数を拡大する、
［１］の継代培養方法。
［３］  前記改質される前の樹脂の表面は、水和したポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）の表面よりも大きい水接触角を有し、
前記改質された樹脂の表面は、水和したポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）の表面よりも小さい水接触角を有する。
［２］の継代培養方法。
［４］  前記改質される前の樹脂の表面は、６０度よりも大きい水接触角を有し、
前記改質された樹脂の表面は、４５度よりも小さい水接触角を有する。
［３］の継代培養方法。
［５］  前記樹脂は熱可塑性樹脂である、
［４］の継代培養方法。
［６］  前記樹脂はポリオレフィン系樹脂、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、フッ素系樹脂、塩化ビニル系樹脂及びシリコン樹脂のうちのいずれか又はこれらの混合物からなる、
［５］の継代培養方法。
［７］  前記チャンバーの開口においての内接円の直径が１ｍｍ以下であり、
前記チャンバーの内底面には細胞を通すための孔が設けられておらず、
前記チャンバーにおいて前記開口から前記内底面までの深さは８００μｍ以下である、
［１］〜［６］のいずれかの継代培養方法。
【発明の効果】
【０００６】
マイクロパターンを用いた多能性幹細胞の継代培養において、三胚葉への分化を開始した細胞を多能性幹細胞の植え継ぎの際に選択的に排除することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】培養容器の斜視図
【図２】マイクロパターンの断面図。
【図３】マイクロパターンの断面図。
【図４】マイクロパターンの断面図。
【図５】平面視した201B7株の写真。
【図６】平面視した253G1株の写真。
【図７】平面視した1231A3株の写真。
【図８】平面視したHepG2株の写真。
【図９】平面視した1383D2株の写真。
【図１０】1383D2株の細胞塊の写真。
【図１１】細胞塊回収後のマイクロパターンの写真。
【図１２】1383D2株の細胞塊の蛍光免疫染色像。
【図１３】マイクロパターンに残存した細胞の蛍光免疫染色像。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜多能性幹細胞＞
【０００９】
本実施形態に係る方法は図１に示す容器２０を用いて多能性幹細胞を培養する方法である。本実施形態において多能性（Pluripotency）とは三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に属する細胞系列のいずれにも分化し得る能力を指す。
【００１０】
多能性幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）でもよく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）でもよい。多能性幹細胞の動物種はヒト及びマウスを初めとする哺乳類動物が挙げられるがこれらに限定されない。ｉＰＳ細胞のソースとなる体細胞は線維芽細胞が挙げられるがこれに限定されない。体細胞はソースとなる個体の体内のいずれの組織から取得してもよい。
【００１１】
＜培養容器＞
【００１２】
図１に示す容器２０は細胞の培養容器である。容器２０は凹部２１を含む複数の凹部を備える。凹部２１は培地、特に液体の培地を保持することができる。凹部２１は上面側に開口２７を有する。好ましい態様において凹部２１には開口２７以外に穴が開いていない。各凹部は凹部２１と同様に形成されている。凹部２１と他の凹部の形状は必ずしも一致していなくてもよい。
【００１３】
図１に示す凹部２１は内底面２２を有する。内底面２２は側壁面２３に囲まれている。内底面２２は凹部２１の最も深い部分であってもよい。内底面２２は凹部２１の最も深い部分でなくともよい。内底面２２の上に凹部２１の内腔を構成する空間が広がっていればよい。また当該空間に培地を注入することでマイクロパターン２５を培地が覆うことが出来ればよい。凹部２１は時計皿のように側壁の無い凹部でもよい。
【００１４】
図１に示す容器２０は凹部２１と同様にマイクロパターンを有する凹部を、凹部２１を含めて１個以上有していればよい。かかる凹部の数は６、２４、９６、３８４、及びそれ以上の数でもよい。
【００１５】
図１に示す内底面２２の一部又は全部にはマイクロパターン２５が設けられている。図中では内底面２２の全体にマイクロパターン２５が形成されている。図中にはさらにマイクロパターン２５の拡大図が示されている。
【００１６】
図１の拡大図に示すようにマイクロパターン２５はチャンバー３０ａ−ｃを含む複数のチャンバーからなる。これらのチャンバーはそれぞれマイクロ空間（micro room）と呼ばれる区画を形成している。
【００１７】
図１の拡大図に示すチャンバー３０ａ−ｃを含むチャンバーは内底面２２上に設けられている。これらのチャンバーが格子状に整列していることで、マイクロパターン２５が形成されている。図中では正方形を格子単位とする正方格子状にチャンバーが配置されている。格子単位は正三角形でもよい。
【００１８】
図１に示すチャンバー３０ａ−ｃの上面開口は円形である。チャンバー３０ａ−ｃの上面開口の形状は三角形、四角形、及びその他の多角形、円形及び楕円形並びにその他二次元形状とすることが出来る。
【００１９】
図１に示すマイクロパターン２５は樹脂成形によって得られたものであることが好ましい。マイクロパターン２５を含む内底面２２全体が樹脂成形品であってもよい。マイクロパターン２５を含む容器２０全体が樹脂成形品であってもよい。
【００２０】
図１に示す容器２０は、樹脂成形によって得られたマイクロパターン２５を内底面２２に貼り付けることで得てもよい。容器２０は、樹脂成形によって得られた内底面２２を有する平板を、側壁面２３を有する側壁の下端に取り付けることで得てもよい。
【００２１】
＜樹脂の選択と成形＞
【００２２】
樹脂成形に用いられる樹脂は熱可塑性樹脂でもよく、熱可塑性エラストマーでもよい。樹脂はポリオレフィン系樹脂、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、フッ素系樹脂、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のいずれかでもよい。樹脂はこれらの混合物でもよい。
【００２３】
ポリオレフィン系樹脂はポリプロピレン系樹脂及びポリエチレン系樹脂のいずれかでもよい。ポリオレフィン系樹脂はシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）でもよい。
【００２４】
他の観点において、樹脂はポリエチレン（ＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ＡＢＳ樹脂（ＡＢＳ）、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリエステル（ＰＥｓ）及びポリアミド（ＰＡ）のいずれか又はこれらの混合物である。
【００２５】
ポリエステル（ＰＥｓ）は、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ，ＰＥＴＥ）、ポリブチレンテレフタラート（Ｐｏｌｙｂｕｔｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）（ＰＢＴ）、ポリトリメチレンテレフタラート（Ｐｏｌｙｔｒｉｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）（ＰＴＴ）、ポリエチレンナフタラート（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｎａｐｈｔｈａｌａｔｅ）（ＰＥＮ）及びポリブチレンナフタラート（ＰＢＮ）のいずれか又はこれらの混合物である。
【００２６】
ポリアミド（ＰＡ）はナイロン及びアラミドのいずれか又はこれらの混合物である。
【００２７】
ポリスチレンは薬剤耐性、透明性及び加工性の面から好適である。ポリスチレンは加工性に優れるためチャンバーの形成がしやすい。
【００２８】
マイクロパターンを作製する方法としては、例えば、モールドを用いた転写成形が挙げられる。転写成形では、例えば金属構造体をモールドとして樹脂成形で凹凸パターンを形成してもよい。金属構造体は、フォトリソグラフィによって作製されたレジストパターンや三次元光造形によって作製された樹脂パターンにメッキ処理を施すことで作製できる。樹脂成形としては、例えば、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形及びロール転写のための押出成形を挙げることができる。樹脂成形に用いる樹脂としては熱可塑性樹脂が好適である。
【００２９】
＜チャンバー＞
【００３０】
図２にはマイクロパターン２５の断面が示されている。チャンバー３０ａ−ｃはそれぞれ、壁２９で仕切られている。チャンバー３０ａ−ｃからマイクロ空間が形成される。なお図中には一つのマイクロパターン２５に対してチャンバーが３つしか描かれていないが、これは模式化して表された結果に過ぎない。本明細書の図はマイクロパターン当たりのチャンバーの数を限定するものではない。
【００３１】
図２に示すようにチャンバー３０ａ−ｃのマイクロ空間に培地２６を保持することができる。この時マイクロパターン２５が面する空間、すなわち凹部２１の内腔にも培地２６が保持されていてもよい。チャンバー３０ａ−ｃからなるマイクロ空間と凹部２１の内腔とは連続している。かかる連続した空間に培地２６が配置される。マイクロ空間内で消費された栄養は内腔から新たに供給される。マイクロ空間内で生じたガスや栄養は内腔に拡散する。
【００３２】
図２に示すようにチャンバー３０ａにおいてマイクロ空間は開口３１ａ、チャンバー底面３２ａ及び内壁面３３ａで囲まれている。チャンバー底面３２ａには細胞を通すための孔が設けられていない。内壁面３３ａは壁２９の有する壁面である。チャンバー底面３２ａ及び内壁面３３ａは予め改質により親水化されている。言い換えればチャンバー３０ａの表面は予め改質により親水化されている。チャンバー３０ｂ−ｃにおいて同様である。
【００３３】
図２に示すようにチャンバー３０ａ−ｃから形成されるマイクロ空間の形状は柱状である。チャンバー底面３２ａは半球である。チャンバー底面３２ａは平面でもよい。さらに内壁面３３ａにテーパを設けることで開口３１ａを大きくしてもよい。
【００３４】
図２において壁２９の上面が改質されていてもよい。マイクロパターン２５の表面全体が改質されていてもよい。図１に示す内底面２２全体が改質されていてもよい。凹部２１全体が改質されていてもよい。容器２０全体が改質されていてもよい。
【００３５】
＜改質の方法＞
【００３６】
以下においてはマイクロパターンの表面を改質するという形式で改質の具体的な方法を説明する。しかしながら容器中の改質される領域の拡がりは上記実施形態に従い適宜設定できるものとする。改質の方法としては、プラズマ処理、ＵＶ／オゾン処理、コロナ処理及びフレーム処理のいずれかまたはこれらの組み合わせが好ましい。
【００３７】
プラズマ処理、ＵＶ／オゾン処理、コロナ処理及びフレーム処理では、物質を電離させることでプラズマを得られる。電離とはイオンと電子に分離することである。電離させるために必要なエネルギーを供給する方式の例として放電、熱電離及び光電離が想定される。
【００３８】
プラズマ処理及びコロナ処理では放電によりプラズマを得る。プラズマ処理はプラズマ表面処理ともいう。コロナ処理はコロナ表面処理ともいう。コロナ処理ではとくにコロナ放電を利用する。一例において空気中で放電することにより、空気中の酸素分子が電離する。ここで酸素原子が励起される。このため自由電子、酸素イオン及び酸素ラジカルを含むプラズマが発生する。電離される物質は酸素分子に限定されない。希ガスや不活性ガスの雰囲気で放電を行ってもよい。また酸素の代わりにＣＦ４のような反応性ガスを添加してもよい。
【００３９】
発生したプラズマ中の電子、イオン及びラジカルが基材上に形成されたマイクロパターンに接触する。マイクロパターン上の分子とプラズマ中の電子、イオン及びラジカルの少なくともいずれかの粒子とが反応する。反応によりマイクロパターン上に親水基が生成される。
【００４０】
マイクロパターンは樹脂で形成されているのでマイクロパターンの表面には親水基が乏しい。マイクロパターンの表面の改質はプラズマによって行われる。放電により放出されたプラズマ中の電子、イオン及びラジカルの少なくともいずれかは樹脂の分子の化学結合を切断する。樹脂の種類に応じて水酸基、カルボニル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基及びニトロ基を初めとする親水基が生成される。またエーテル結合（-O-）及びエステル結合（-COO-）のような親水性の部分構造が形成される。
【００４１】
フレーム処理は火焔処理ともいう。フレーム処理の一例では燃焼性ガスと空気とからなる混合ガスを燃焼させることで空気中の酸素分子が熱電離する。これにより自由電子、酸素イオン及び酸素ラジカルを含むプラズマが発生する。このように生じた酸素プラズマをマイクロパターンに適用する。プラズマは上述の通りマイクロパターンの表面を改質する。
【００４２】
ＵＶ／オゾン処理の一例では紫外線により空気中の酸素分子が光電離する。これにより自由電子、酸素イオン及び酸素ラジカルを含むプラズマが発生する。このように生じた酸素プラズマからオゾンが生じる。かかるオゾンをマイクロパターンに適用する。オゾンはマイクロパターンの表面と化学反応を起こす。このため改質がなされる。
【００４３】
図２に示すようにチャンバー３０ａ−ｃの表面は改質されたままの状態で、培地２６に対して露出していることが好ましい。マイクロパターン２５の表面は親水性の材料でコートされていないことが好ましい。従来から用いられている親水性の材料の例としてはポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（略称：ｐ−ＨＥＭＡ、Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)）が挙げられる。
【００４４】
上記の通りマイクロパターンを構成する樹脂が改質されることでその親水性が向上する。例えばマイクロパターン上での水接触角が低下する。一例において改質される前の樹脂の表面は、水和したｐ−ＨＥＭＡの表面よりも大きい水接触角を有する。一例において改質された後の樹脂の表面は、水和したｐ−ＨＥＭＡの表面よりも小さい水接触角を有する。
【００４５】
樹脂の表面が改質される前において、樹脂の表面の水接触角は１８０度より小さく、２０度以上であってもよい。水接触角は３０度、４５度、６０度及び９０度のいずれかでもよい。樹脂の表面が改質された後において、樹脂の表面の水接触角は０度より大きく、４５度以下であることが好ましい。水接触角は３０度、１５度、１０度及び５度のいずれかでもよい。
【００４６】
＜継代培養＞
【００４７】
図１に示す凹部２１の内腔に培地を注ぐ。マイクロパターン２２を覆うように凹部２１の内腔に培地を予め注入する。その後凹部２１に多能性幹細胞を播種する。緩衝液や培地中に予め多能性幹細胞を懸濁しておくのがよい。細胞が懸濁された培地を直接に凹部２１の内腔に注入してもよい。多能性幹細胞はシングルセルレベルまで分解していることが好ましい。一例としてピペットの吸い口で懸濁液を出し入れすることで細胞を分解することが出来る。
【００４８】
播種密度は図１に示すマイクロパターン２５の面積１ｃｍ２当たり以下の通りとすることが出来る。播種密度は１．０×１０２〜１．０×１０６／ｃｍ２が好ましく、１．０×１０3〜１．０×１０5細胞／ｃｍ２がより好ましい。
【００４９】
図２に示すように播種された細胞３４培地中で重力に従いマイクロパターン２５に向かって沈降する。細胞３４は多能性幹細胞である。細胞が懸濁された培地を直接に注入する場合は、多能性幹細胞の懸濁された培地にムラが無いようにしておくことでマイクロパターン２５中の各チャンバーに均等に細胞３４を割り振ることが出来る。
【００５０】
図２に示すように細胞３４はマイクロパターン２５の上方の空間からチャンバー３０ａ−ｃで形成されたマイクロ空間に向かって進入する。細胞３４をチャンバー３０ａ−ｃ内で成育（growth）する。細胞３４の成育（growth）の過程には細胞分裂を伴う細胞３４の増殖が含まれる。細胞３４は各チャンバー内で浮遊している。
【００５１】
図３にはマイクロパターン２５の断面が描かれている。多能性幹細胞の成育の結果、図に示すようにチャンバー３０ａ−ｂ内にそれぞれ細胞塊３５ａ−ｂが形成される。細胞塊３５ａ−ｂは各チャンバー内に浮遊している。
【００５２】
図２において細胞３４をチャンバー３０ａ−ｃ内に詰め込むことでマイクロ空間と同サイズの細胞塊を形成しなくともよい。細胞塊は播種した細胞の凝集と細胞増殖との結果によって生ずると考えられる。細胞３４は成育に伴い、時に自己凝集作用を伴って自発的に図３に示すような細胞塊３５ａ−ｂを形成する。
【００５３】
１つのチャンバーには１個の細胞塊が形成される傾向にある。この傾向は細胞自身の生物学的機能による結果であってもよく、あるいはチャンバー表面が細胞に対して働きかけた結果であってもよく、あるいはこれらの相互作用による結果であってもよい。
【００５４】
細胞塊３５ａ−ｂを効率的に形成するためにチャンバー３０ａ−ｃの寸法を下記の通りとすることで、細胞が自律的に又は液流によって動くことのできるマイクロ空間のサイズを制限することが好ましい。
【００５５】
図２においてチャンバー３０ａ−ｃの寸法は以下の通りとすることが出来る。開口３１ａ−ｃにおいて内接円が置ける場合、内接円の直径はそれぞれ２ｍｍ以下、好ましくは１５００μｍ以下である。開口３１ａ−ｃにおける内接円の直径は５００μｍ、４００μｍ、２００μｍ及び１００μｍのいずれかでもよい。
【００５６】
図２において開口３１ａ−ｃからチャンバー底面３２ａ−ｃまでの深さはそれぞれ１２００μｍ以下、好ましくは６００μｍ以下である。かかる深さはチャンバー３０ａ−ｃの深さと考えてもよい。深さとは開口３１ａ−ｃからチャンバー底面３２ａ−ｃの最深部までの深さと考えてもよい。チャンバー３０ａ−ｃの深さは４００μｍ、２００μｍ及び１００μｍのいずれかでもよい。
【００５７】
図２における壁２９の厚さは、壁２９の最も薄い部分の厚さである。壁２９の厚さは、５μｍ以上、５０μｍ以下が好ましい。壁２９の厚さは１０μｍ、１５μｍ、及び２０μｍのいずれかとしてもよい。壁２９が薄いほど、壁２９の上面に取り残されてチャンバー内に進入しない細胞を減らすことが出来る。
【００５８】
なお後述する図９に示すように平面視した時に正方形のチャンバーを、正方形の格子単位をもつ格子状に、格子とチャンバーの向きを揃えて並べてもよい。この場合、壁の厚さを一定にすることが出来る。
【００５９】
図３に示すように改質されたチャンバー３０ａ−ｂの表面が培地２６中に露出している。チャンバー３０ａ−ｂの表面の親水性が高いため、これらの浮遊する細胞塊はチャンバー３０ａ−ｂの表面に接着しない。
【００６０】
図３において細胞塊３５ａ−ｂは未分化の多能性幹細胞からなる。ここで未分化の多能性幹細胞とは、三胚葉への分化を開始していない多能性幹細胞である。未分化の多能性幹細胞では未分化マーカーが陽性であることが好ましい。分化マーカーが陰性であることが好ましい。分化を開始した細胞には多能性を失った細胞が含まれる。
【００６１】
未分化マーカーは例えばTRA-1-60でもよい。TRA-1-60が陽性であるか否かは、例えばフローサイトメーターを用いて、陰性の細胞集団と比較して陽性の細胞集団が出現するか否かを検討する事で判定できる。また他の方法として、未分化マーカーをPCRにより検出してもよい。TRA-1-60の他に、多能性幹細胞マーカーとしてNanog及びOct3/4の少なくともいずれか一つを選択してもよい。発現していない分化細胞、例えば繊維芽細胞などをコントロールとしてこれらのマーカー遺伝子の発現を検出する。
【００６２】
分化マーカーは外胚葉、内胚葉及び中胚葉の少なくともいずれか一つの分化マーカーであることが好ましい。外胚葉の分化マーカーをPax6、SOX2、PsANCAM及びTUJ1の少なくともいずれか一つとしてもよい。内胚葉の分化マーカーをFOXA2、AFP、サイトカイン8.18及びSOX17の少なくともいずれか一つとしてもよい。中胚葉の分化マーカーをBrachyury及びMSX1の少なくともいずれか一つとしてもよい。分化マーカーをフローサイトメーターやPCRにより検出してもよい。
【００６３】
多能性幹細胞の成育の結果、図３に示すようにチャンバー３０ｃ内に接着性細胞３６が生じる場合がある。接着性細胞３６はチャンバー３０ｃのチャンバー底面３２ｃに接着している。接着性細胞３６は播種した細胞の凝集と細胞増殖との結果によって細胞集団になる場合がある。接着性細胞３６は単一の細胞であってもよい。接着性細胞３６は三胚葉への分化を開始した多能性幹細胞からなる。
【００６４】
仮に図３に示すチャンバー３０ｃの表面がｐ−ＨＥＭＡ等でコートされていると、チャンバー３０ｃの表面は適度な親水性を発揮するため分化した細胞であってもこれに接着しにくい。しかしながら本実施形態では改質されたチャンバー３０ｃの表面が培地２６中に露出している。
【００６５】
図３においてチャンバー３０ｃの表面には改質された樹脂の表面が露出しているため、各接着性細胞３６はチャンバー底面３２ｃに接着する。本実施形態では多能性幹細胞のうち三胚葉への分化を開始した細胞を改質された表面に接着させる。改質された樹脂の表面に、分化を開始した細胞が特異的に接着しやすいことは発明者が初めて発見した現象である。
【００６６】
一例において三胚葉への分化を開始した細胞では未分化マーカーが陰性である。一例において三胚葉への分化を開始した細胞では三胚葉のいずれかの分化マーカーが陽性である。これらのマーカーをフローサイトメーターやPCRにより検出してもよい。
【００６７】
図３に示すように細胞塊３５ａ−ｂが形成された後に、細胞塊３５ａ−ｂをチャンバーから取り出す。例えば培地２６ごと細胞塊３５ａ−ｂを回収してもよい。細胞塊３５ａ−ｂを回収する道具としてピペットを用いてもよい。ピペットを用いずに洗い流しやデカントで細胞塊３５ａ−ｂを回収してもよい。
【００６８】
上記の通り回収された細胞塊をピペットの吸い口で出し入れすることで分解してもよい。細胞塊はシングルセルレベルまで分解することが好ましい。分解された細胞を新しい培地に懸濁する。細胞懸濁液を改めて新しい容器に注入することで、細胞を植え継ぐ。新しい容器は、図１に示すような凹部２１を備えるものでもよい。凹部２１に細胞を播種することで植え継ぎをしてもよい。
【００６９】
本実施形態において植え継ぎ（subculture）とは植え継ぎ元となる容器又は培地から一部の細胞を取り出すとともに、取り出した細胞を植え継ぎ先となる新しい容器及び培地中に播種することで、新しい容器及び培地中での細胞の成育を改めて開始することをいう。一つの植え継ぎ元から複数の植え継ぎ先に細胞を移した後、細胞を成育することで結果として細胞数を拡大することもできる。
【００７０】
本実施形態において継代培養（passage culture）とは、植え継ぎにより２代以上に渡って細胞を継続的にin vitro培養することを意味する。継代培養には一定水準の数の細胞を長期間保全すること、すなわち維持培養のみならず、植え継ぎ回数又は時間とともに細胞数を拡大することが含まれる。
【００７１】
図４には細胞塊３５ａ−ｂを取り出した後のマイクロパターン２５の断面が示されている。接着性細胞３６は底面３２ｃに接着しているので、培地２６ごと細胞塊３５ａ−ｂを回収する作業によってもマイクロパターン２５から回収されない。このため元の培養容器に各接着性細胞３６を残すことができる。この結果、新しい容器に対して分化を開始した細胞を持ち込むことを抑制することができる。
【００７２】
本実施形態では多能性幹細胞の植え継ぎの際に三胚葉への分化を開始した細胞を選択的に排除することができる。結果として、継代を繰り返した後においても未分化状態が保たれた細胞集団を得ることが出来る。
【００７３】
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。
【００７４】
［実施例１ａ−ｃ］
【００７５】
図５−７に示すようにチャンバー中でｉＰＳ細胞の細胞塊を形成した。チャンバーに対するプラズマ処理の条件及び培養の条件は以下の通りである。細胞株として201B7（図５、実施例１ａ）、253G1（図６、実施例１ｂ）及び1231A3（図７、実施例１ｃ）を使用した。これらの細胞株は京都大学ｉＰＳ細胞研究所から入手した。
【００７６】
チャンバーを平面視すると開口は直径５００μｍの円形であった。チャンバーの深さは４００μｍであった。チャンバーは正三角形を格子単位とする格子状に配列されていた。チャンバーは９６ウェルプレートの底面に配列されている。ポリスチレンによってチャンバーを備えるウェルプレートを作製した。
【００７７】
ウェルプレートの底面を酸素プラズマにより親水化することでチャンバーの表面を親水化した。チャンバーの表面の水接触角を推定するために、リファレンスとしてバルクのポリスチレンフィルムの表面をウェルプレートの底面と同時にプラズマ処理した。処理後のポリスチレンフィルムの表面の水接触角は約１０度であった。処理前のポリスチレンフィルムの水接触角は９０度であった。
【００７８】
上記３種の細胞株はそれぞれ６．８×１０３細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培地はStemFit AK02N（味の素社、StemFitは登録商標）を使用した。培地量は１つのウェルあたり２００μＬとした。播種翌日すなわち培養１日目及び培養３日目及び培養５日目に培地交換を実施した。培地交換は半量交換とした。すなわちウェル内の２００μＬの培地を含む１００μＬ抜き取り、新たに１００μＬを添加した。培養７日目に細胞塊を回収した。回収した細胞塊に含まれる細胞数の計測を行った。さらに細胞塊からのＲＮＡ抽出を行った。
【００７９】
未分化マーカーであるOCT3/4及びNANOGの発現をｍＲＮＡのコピー数を基準にして測定した。ここでｍＲＮＡのコピー数とは、GAPDHのｍＲＮＡ転写量を１としたときの各未分化マーカーの転写量を示す相対的な値を表す。
【００８０】
細胞株201B7の細胞塊においては、OCT3/4のコピー数は平均７．８７、標準偏差１．７２（サンプル数３）であった。対照群として細胞株201B7を平面上で培養した。平面上で培養した細胞は細胞塊になっていなかった。細胞株201B7から得られたOCT3/4のコピー数は平均１０．４４、標準偏差０．４５（サンプル数３）であった。有意水準５％の両側t検定においてチャンバー内培養と平面培養との間に有意差は認められなかった。
【００８１】
また細胞塊においては、NANOGのコピー数は平均０．０８、標準偏差０．０１であった。これに対して、対照群として平面培養した細胞から得られたNANOGのコピー数は平均０．１０、標準偏差０．００５であった。OCT3/4と同じく、チャンバー内培養と平面培養との間に有意差は認められなかった。
【００８２】
同様にして、細胞株253G1及び細胞株1231A3についても、OCT3/4及びNANOGの発現を調べた。チャンバー内培養と平面培養との間に有意差は認められなかった。チャンバー内で細胞塊を形成したiPS細胞では、当該細胞自身の未分化状態が維持されていることが確認された。
【００８３】
［比較例１］
【００８４】
図８に示すようにチャンバー中で肝がん細胞の培養を行った。培養の条件は以下の通りである。細胞株としてAmerican Type Culture Collectionから入手したHepG2を使用した。チャンバーを平面視すると開口は一辺の長さ２００μｍの正方形であった。チャンバーの深さは１００μｍであった。チャンバーは正方形を格子単位とする格子状に配列されていた。
【００８５】
チャンバーは２４ウェルプレートの底面に配列された。チャンバーの表面は酸素プラズマにより親水化した。リファレンスとして同時にプラズマ処理したポリスチレンフィルム表面の水接触角は約１０度であった。細胞を１．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培地はＤＭＥＭに１０％のＦＢＳを添加したものを用いた。培地量は１つのウェルあたり１ｍＬとした。播種翌日すなわち培養１日目及び培養３日目に培地交換を実施した。培地交換は半量交換とした。１ｍＬの培地から５００μＬ抜き取り、新たに５００μＬを添加した。
【００８６】
培養５日目に顕微鏡にて観察を行った。図８に示すように細胞はチャンバーの底面に接着していた。また、チャンバーの底の平面上に伸展している様子が観察された。細胞塊の形成は確認されなかった。
【００８７】
［実施例２］
【００８８】
図９に示すようにチャンバー中でｉＰＳの細胞塊を形成した。ここに記載する点を除き培養の条件は比較例１と同様である。細胞株として京都大学ｉＰＳ細胞研究所から入手した1383D2を使用した。また培地はStemFit AK02Nを用いた。
【００８９】
培養５日目に顕微鏡にて観察を行った。図９に示すように各チャンバーの中で細胞塊と分かる構造が形成されていた。また、細胞塊は浮遊していた。一部のチャンバーでは、細胞塊の形成に関与しない少数の細胞がチャンバー底面に接着している様子が観察された。
【００９０】
［実施例３］
【００９１】
培養に用いたチャンバーを平面視すると開口は直径５００μｍの円形であった。チャンバーの深さは４００μｍであった。チャンバーは正三角形を格子単位とする格子状に配列されていた。チャンバーは６ウェルプレートの底面に配列されている。その表面を酸素プラズマにより親水化した。リファレンスとして同時にプラズマ処理したポリスチレンフィルムの表面の水接触角は約１０度であった。
【００９２】
細胞株として京都大学iPS細胞研究所から入手した1383D2株を使用した。細胞は６．２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培地はStemFit AK02N（味の素）を使用した。培地量は１つのウェルあたり６ｍLとした。播種翌日すなわち培養１日目と、培養３日目とに培地交換を実施した。培地交換は半量交換とした。すなわちウェル中の６ｍＬの培地から３ｍＬ抜き取り、新たに３ｍＬを添加した。培養５日目に細胞塊を回収し、蛍光免疫染色を行った。
【００９３】
図１０及び１１には細胞塊を形成している1383D2株と細胞塊回収後のマイクロパターンの写真が示されている。図１０に示すようにチャンバー内でiPSの細胞塊を形成した。その後、細胞塊を回収した。図１１に示すようにチャンバー底面には接着した少数の細胞が回収されずに残存していた。回収した細胞塊及び残存した細胞に対して未分化マーカーであるOCT3/4及びTra-1-60及びSSEA4の蛍光免疫染色を実施した。
【００９４】
図１２には1383D2株の細胞塊を未分化マーカーで蛍光免疫染色した様子が示されている。回収した細胞塊を未分化マーカーOct3/4及びTra-1-60及びSSEA4で蛍光免疫染色するとともに顕微鏡観察した。蛍光染色に際しては凍結切片を作製した。図１２に示すように凝集塊中の細胞のいずれにおいても未分化マーカーの発現が見られた。
【００９５】
図１３にはマイクロパターン上に残存した細胞を未分化マーカーで蛍光免疫染色した様子が示されている。細胞塊回収後のチャンバー底面に残された接着性細胞に対して、未分化マーカーOct3/4、Tra-1-60及びSSEA4の蛍光免疫染色を行った。図１３に示すように核が染色されているにも関わらず、未分化マーカーに対しては陰性（−）の細胞が観察された。これらの細胞は既に分化した細胞である可能性が高い。
【００９６】
上記ではマイクロパターンを用いた多能性幹細胞の継代培養において、三胚葉への分化を開始した細胞を改質により親水化された表面に接着させた。一方、多能性幹細胞の細胞塊は係る表面に接着しなかった。以上より多能性幹細胞の植え継ぎの際に、分化を開始した細胞を選択的に排除できることが分かった。
【００９７】
これに対して、例えばｐ−ＨＥＭＡでコートされた樹脂表面では、分化を開始した細胞の接着も阻害されるのが一般的である。したがってｐ−ＨＥＭＡでコートされたチャンバーは分化を開始した細胞を植え継ぎの際に選択的に排除するのには適していない。
【符号の説明】
【００９８】
２０  容器、  ２１  凹部、  ２２  内底面、  ２３  側壁面、  ２５  マイクロパターン、  ２７  開口、  ２９  壁、  ３０ａ−ｃ  チャンバー、  ３１ａ−ｃ  開口、  ３２ａ−ｃ  内底面、  ３３ａ−ｃ  内壁面、  ３４  細胞、  ３５ａ−ｂ  細胞塊、  ３６  接着性細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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