(57)【要約】【課題】網膜に対する障害などの眼の疾病の予防・改善に有効である網膜保護剤を提供する。【解決手段】本発明の網膜保護剤は、トチノキ種皮から水、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸またはこれらのうち２種以上の混合液よりなる溶媒により抽出された抽出物を有効成分として含有する。この抽出物は、例えば、（ａ）トチノキ種皮に、前記溶媒を加えることにより抽出液を形成する工程と、（ｂ）前記抽出液を濃縮することにより、濃縮物を得る工程と、を有する抽出工程により形成される。本発明の網膜保護剤は、ゲル濾過クロマトグラフィー分析による、１つめのピーク（保持時間２．９２分）で検出されるＡ−タイププロアントシアニジンを有する。また、２つめのピーク（保持時間３．８６分）で検出される分子量が１０００以下の８つのフラボノール配糖体を含有する。【選択図】図１
2019019072.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トチノキ種皮から水、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸またはこれらのうち２種以上の混合液よりなる溶媒により抽出された抽出物を有効成分として含有する、網膜保護剤。
【請求項２】
請求項１に記載の網膜保護剤において、
前記抽出物は、
（ａ）トチノキ種皮に、前記溶媒を加えることにより抽出液を形成する工程と、
（ｂ）前記抽出液を濃縮することにより、濃縮物を得る工程と、
を有する抽出工程により形成される、網膜保護剤。
【請求項３】
請求項２に記載の網膜保護剤において、
前記（ａ）工程は、前記抽出液の温度Ｔが、１００℃を超える、網膜保護剤。
【請求項４】
ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3(-O-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(ニコチノイル)-β-D-グルコピラノシド]，ケンペロール-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケンペロール-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(インドリン-2-オン-3-ヒドロキシ-3-アセチル)-β-D-グルコピラノシド]のいずれかを含有する、網膜保護剤。
【請求項５】
フラバン−３−オールを単位分子とする重合物であって、分子内にＡ−タイプインターフラバン結合を有するプロアントシアニジンを含有する、網膜保護剤。
【請求項６】
請求項４または５に記載の網膜保護剤において、
ルテインを含有する、網膜保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トチノキ種子抽出物を有効成分として含有する網膜保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼の疾病は、酸化ストレスと深く関連があると言われている。例えば、「白内障」、「緑内障」、「飛蚊症」、「加齢黄班変性症」などは、水晶体や網膜の酸化が主な原因と言われている。
【０００３】
ルテインは天然に存在する色素である「カロテノイド」の１つで、強い抗酸化作用を持ち、眼の疾病の予防・改善する目的で、アイケア商品として流通している。
【０００４】
トチノキ(Aesculus turbinata Blume)は、日本固有の品種であり、日本の国土に広く自生する落葉広葉樹である。５月に開花し、８月下旬〜９月には直径約５ｃｍほどの卵円形の果実ができ、熟すると３つに割れて、中には栗に似た茶褐色の種子が見られる。このトチノキ種子、すなわちトチノミは縄文時代の住居跡遺跡から多数発掘されていることから、当時は主食の一つであったと考えられている。また、トチノミは乾燥すれば数年保存が利くことから飢饉の際の非常食として用いられ、現在では、日本各地で栃餅や栃の実団子などの製菓原料として用いられている。
【０００５】
本発明者は、皮を剥いだトチノミに含まれている各種成分に着目し、それらの化学構造を明らかにするとともに、血糖値上昇抑制作用（非特許文献１、２、特許文献１）、脂肪吸収抑制作用（非特許文献３、特許文献２）、抗肥満作用（非特許文献３、特許文献２）について報告している。また、トチノキ種皮に含まれている各種成分に着目し、それらの化学構造を明らかにするとともに、それらの抗酸化作用（非特許文献４、特許文献３）、血糖値上抑制作用（非特許文献５、特許文献３）、脂肪吸収抑制作用（非特許文献６、特許文献３）、抗肥満作用（非特許文献５）、抗ガン剤（メトトキサレート）投与時の副作用である小腸炎の低減効果（非特許文献７）、ヘリコバクター・ピロリの接着抑制効果（非特許文献８、特許文献４）について報告している。
【０００６】
また、非特許文献９〜１７には、「加齢黄班変性症」などの眼の疾病についての、原因や予防効果を奏する物質についての報告がある。また、メラトニンが光障害に関与していること、ルテインに光障害の抑制効果があることについて、それぞれ、非特許文献１８、１９にその報告がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４７４１８９９号公報（血糖値上昇抑制剤の製造法および血糖値上昇抑制剤）
【特許文献２】特許第４９５８４５２号公報（リパーゼ阻害剤およびリパーゼ阻害剤の製造法）
【特許文献３】特許第５１７２５３１号公報（リパーゼ阻害剤、抗酸化剤、糖質分解酵素阻害剤、および薬剤の製造法）
【特許文献４】特許第５４０６０８５号公報（ヘリコバクター・ピロリ接着抑制剤）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】木村英人，渡邉あい，地阪光生，山本達之，木村靖夫，勝部拓矢，横田一成，あく抜き処理トチノキ種子のサポニン成分の化学構造と血糖値上昇抑制抑制作用，日本食品科学工学会誌，51，672-679 (2004)
【非特許文献２】木村英人，地阪光生，木村靖夫,  勝部拓矢，横田一成，あく抜き処理したトチノキ種子から単離されたサポニン成分の血糖値上昇抑制作用と苦味の低減化，日本食品科学工学会誌，53, 31-38 (2006）
【非特許文献３】Hideto Kimura, Satoshi Ogawa, Mitsuo Jisaka, Takuya Katsube, Kazushige Yokota, Antiobese effects of novel saponins from edible seeds of Japanese horse chestnut(Aesculus turbinata BLUME) after treatment with wooden ashes., J.Agric.Food Chem, 56, 4783-4788 (2008).
【非特許文献４】Satoshi Ogawa, Hideto Kimura, Ai Niimi, Takuya Katsube, Mitsuo Jisaka, Kazushige Yokota, Fractionation and structural characterization of polyphenolic antioxidants from seed shell Japanese horse chestnut(Aesculus turbinata BLUME)., J.Agric.Food Chem, 56, 12046-12051(2008).
【非特許文献５】Hideto Kimura, Satoshi Ogawa, Akihiko Sugiyama, Mitsuo Jisaka, Yasuo Kimura, Takashi Takeuchi, Kazushige Yokota, Anti-obesity effects of highly polymeric proanthocyanidins from seed shells of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata Blume)., Food Research International, 44(1), 121-126 (2011).
【非特許文献６】木村英人，小川智史，新見愛，地阪光生，勝部拓矢，横田一成，トチノキ種皮由来の高分子プロアントシアニジンの脂肪吸収に対する阻害作用, 日本食品科学工学会誌, 56, 483-489(2009).
【非特許文献７】Akihiko Sugiyama, Hideto Kimura, Satoshi Ogawa, Kazushige Yokota, Takashi Takeuchi, Effects of Polyphenols from Seed Shells of Japanese Horse Chestnut (Aesculus turbinata BLUME) on Methotrexate-Induced Intestinal Injury in Rats, J. Vet. Med. Sci. 73,673-678, (2011)．
【非特許文献８】國方敏夫，河野恵三，牛尾慎平，木村英人，小川智史，福田恵温，トチノキ(Aesculus turbinata Blume)種皮ポリフェノールによるHelicobacter pyloriの胃癌細胞株ＭＫＮ45への接着抑制作用，生薬学雑誌, 65(1), 43-49 (2011).
【非特許文献９】Frederik J. G. M. van Kuijk and Paul Duck, Fatty Acid Composition of the Human macula and peripheral retina., Invest. Ophthalmol. Visual Sci., 33, 3493-3496 (1992)
【非特許文献１０】Monica De La Paz and Robert E. Anderson, Region and Age-Dependent Variation in Susceptibility of the human retina to lipid peroxidation., Invest. Ophthalmol. Visual Sci., 33, 3499-3499 (1992)
【非特許文献１１】Mihoko Suzuki, Motohiro Kamei, Hiroyuki Itabe, Kazuhito Yoneda, Hajime Bando, Noriaki Kume, Yasuo Tano, Oxidized phospholipids in the macula increase with age and in eyes with age-related macular degeneration., Mol. Vision, 13, 772-778 (2007)
【非特許文献１２】Smailhodzic D, van Asten F, Blom AM, Mohlin FC, den Hollander AI, van de Ven JP, van Huet RA, Groenewoud JM, Tian Y, Berendschot TT, Lechanteur YT, Fauser S, de Bruijn C, Daha MR, van der Wilt GJ, Hoyng CB, Klevering BJ., Zinc supplementation inhibits complement activation in age-related macular degeneration. PLoS One. 9(11):e112682
【非特許文献１３】Daniel T. Organisciak, Ruth M. Darrow, Yih-ling Jiang, George E. Marak, Janer C.Blanks, Protection by dimethylthiourea against retinal light Damage in rats., Invest. Ophthalmol. Visual Sci., 33, 1599-1609 (1992)
【非特許文献１４】Masaki Tanito, Michael H. Elliott, Yashige Kotake, Robert E. Anderson, Protein modifications by 4-hydroxynonenal and 4-hydroxyhexenal in light-exposed rat retina., Invest. Ophthalmol. Visual Sci., 46, 3859-3868 (2005)
【非特許文献１５】Masaki Tanito, Akira Nishiyama, Toru Tanaka, Hiroshi Masutani, Hajime Nakamura, Junji Yodoi, Akihiro Ohira, Change of redox status and modulation by thiol replenishment in retinal photooxidative damage., Invest. Ophthalmol. Visual Sci., 43, 2392-2400 (2002)
【非特許文献１６】Daniel T. Organisciak, Yih-ling Jiang, Hih-min Wang, and Ina Bicknell, The protective effect of ascorbate in retinal light damage of rats., Invest. Ophthalmol. Visual Sci., 26, 1580-1588 (1985).
【非特許文献１７】Masaki Tanito, Hiroshi Masutani, Hajime Nakamura, Akihiro Ohira, Junji Yodoi, Cytoprotective effect of thioredoxin against retinal photic injury in mice., Invest.Ophthalmol.Visual Sci., 43, 1162-1167 (2002)
【非特許文献１８】Takeshi Sugawara, Paul A. Sieving, P. Michael Iuvone, Ronald A. Bush, The Melatonin Antagonist Luzindole Protects Retinal photoreceptors from light damage in the rat., Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 39(12): 2458-2465 (1998)
【非特許文献１９】Mariko Sasaki, Kenya Yuki, Toshihide Kurihara, Seiji Miyake, Kosuke Noda, Saori Kobayashi, Susumu Ishida, Kazuo Tsubota, Yoko Ozawa, Biological role oflutein in the light-induced retinal degeneration., J Nutr Biochem., 23, 423-429 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
眼の疾病の一種である「加齢黄班変性症」は、欧米では失明原因の第１位、日本では第４位となる重篤な疾患であり、それには酸化ストレスが関与していると言われている。また近年、パソコンやスマートフォンの普及に伴い、眼を酷使する機会が増え、それによる眼精疲労などが問題となっている。本発明者は、前述したように、トチノキ種子に着目し研究を進め、その中で、トチノキ種皮の抗酸化性を明らかにした。今回、トチノキ種皮に含まれている各種成分の化学構造を明らかにするとともに、網膜保護剤（網膜保護組成物）としての効果を検討した。
【００１０】
本発明の目的は、トチノキ種皮成分による網膜に対する障害などの眼の疾病の予防・改善することが可能な網膜保護剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の網膜保護剤は、トチノキ種皮から水、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸またはこれらのうち２種以上の混合液よりなる溶媒により抽出された抽出物を有効成分として含有する。
【００１２】
上記抽出物は、（ａ）トチノキ種皮に、前記溶媒を加えることにより抽出液を形成する工程と、（ｂ）前記抽出液を濃縮することにより、濃縮物を得る工程と、を有する抽出工程により形成される。
【００１３】
上記（ａ）工程は、前記抽出液の温度Ｔが、１００℃を超える温度である。
【００１４】
本発明の網膜保護剤は、ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3(-O-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(ニコチノイル)-β-D-グルコピラノシド]，ケンペロール-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケンペロール-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(インドリン-2-オン-3-ヒドロキシ-3-アセチル)-β-D-グルコピラノシド]のいずれかを含有する。
【００１５】
本発明の網膜保護剤は、フラバン−３−オールを単位分子とする重合物であって、分子内にＡ−タイプインターフラバン結合を有するプロアントシアニジンを含有する。
【００１６】
上記網膜保護剤は、ルテインを含有する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の網膜保護剤は、網膜に対する障害などの眼の疾病の予防・改善に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】トチノキ種皮抽出物のゲル浸透クロマトグラフィーによる分析結果を示す図である。
【図２】実験Ａ（Ｓ１〜Ｓ１０）のラットの網膜電図の測定結果を示す図である。
【図３】実験Ｂのラットの網膜電図の測定結果を示す図である。
【図４】実験Ｂのラットの網膜外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さの測定結果を示す図である。
【図５】実験Ｃ（Ｓ１１〜Ｓ１６）のラットの網膜電図の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、トチノキ種皮抽出物を有効成分として含有する網膜保護剤に関する。本発明で用いるトチノキ種皮抽出物は、トチノミ（栃の実）の皮から、水、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸またはこれらのうち２種以上の混合液よりなる溶媒により抽出することができる。
【００２０】
具体的には、トチノキ種皮に、上記溶媒を加えることにより抽出液を形成する。この抽出液中には、網膜を保護する作用のある有効成分が含まれている。抽出操作終了後、濾過または遠心分離などの方法で抽出残渣を除去して抽出液を得ることができる。
【００２１】
抽出液中の有効成分は、ポリフェノール類であり、後述するように、低分子のフラボノール配糖体または高分子のプロアントシアニジンよりなる。ポリフェノール類は、同一分子内に２個以上のフェノール性水酸基をもつ化合物の総称である。また、トチノキ種皮抽出液中の有効成分は、ポリフェノール類のうちの、フラバン−３−オール類（フラバノール類）とも呼ばれ、2-フェニル-3,4-ジヒドロ-2H-クロメン-3-オールの骨格を有する。
【００２２】
低分子のフラボノール配糖体は、ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3(-O-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(ニコチノイル)-β-D-グルコピラノシド]，ケンペロール-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケンペロール-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(インドリン-2-オン-3-ヒドロキシ-3-アセチル)-β-D-グルコピラノシド]のいずれかよりなる。
【００２３】
プロアントシアニジンは、ポリフェノールの一種である。なかでも、トチノキ種皮抽出物に含まれるプロアントシアニジンは、以下の構造式１に示すＡ−タイププロアントシアニジンである。
【００２４】
【化１】
2019019072.tif 000003
【００２５】
本発明において、抽出物を得るための抽出方法に特に制限はなく、浸漬による抽出、加熱抽出、連続抽出および超臨界抽出など、種々の方法を用いることができるが、常温での浸漬による抽出、加熱抽出が好ましく用いられる。例えば、オートクレーブなどを使用し、１００℃を超える温度での加熱抽出が可能である。１００℃を超える温度での加熱抽出によれば、後述するように、トチノキ種皮抽出物の収率を向上させることができる。また、加熱による減菌効果も期待できる。
【００２６】
上記抽出液を濃縮し、濃縮液としてもよい。また、通風乾燥、真空乾燥、真空凍結乾燥などで乾燥することにより、粉末または固状の乾燥された抽出物を得ることができる。このような濃縮液、乾燥された抽出物をまとめて濃縮物と呼ぶ場合がある。
【００２７】
さらに、抽出液または、抽出物を上記溶媒に溶解した溶液を、例えば、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィーなどの方法により精製することもできる。
【００２８】
吸着クロマトグラフィーによれば、抽出液または、抽出物を上記溶媒に溶解した溶液から、糖、タンパク質、脂質などの夾雑物を取り除くことができる。
【００２９】
逆相クロマトグラフィーによれば、低分子のフラボノール配糖体や高分子のプロアントシアニジンのような、フラバン−３−オール類（フラバノール類）を選択的に抽出（精製）することができる。フラバン−３−オール類（フラバノール類）は、以下の構造式２に示す、2-フェニル-3,4-ジヒドロ-2H-クロメン-3-オールの骨格を有するフラボノイドの一群である。
【００３０】
【化２】
2019019072.tif 000004
【００３１】
ゲル浸透クロマトグラフィーもしくはゲル濾過クロマトグラフィーによれば、上記ポリフェノール類の内、比較的低分子のものと、比較的高分子のものとを分離することができる。具体的には、上記逆相クロマトグラフィーにより、抽出（精製）されたポリフェノール類を、低分子のフラボノール配糖体と、高分子のプロアントシアニジンとに、分離精製することができる。
【００３２】
上記クロマトグラフィーにより得られた溶出液（フラクション）を、濃縮または固化し、精製物を調製してもよい。
【００３３】
本発明の網膜保護剤は、経口投与剤として用いることができる。例えば、上記抽出液（濃縮液を含む）、抽出物または精製物をそのまま、あるいは、これらに製薬学的に許容される添加物などを必要に応じて適宜混合し、網膜保護剤として製造することができる。例えば、上記抽出液（濃縮液を含む）、抽出物または精製物を乳等、結晶セルロース、澱粉、デキストリン等と共に形成し、網膜保護剤としてそのまま飲むようにすることもできる。
【００３４】
また、上記抽出液（濃縮液を含む）、抽出物または精製物を食品素材および食品添加物に配合することにより、飲食品として製造することができる。このような飲食品としては、例えば、清涼飲料、緑茶、コーヒー、紅茶、清酒、ビール、乳飲料、乳酸菌飲料、ドロップ、キャンディー、チューインガム、チョコレート、グミ、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン、水羊羹、ゼリー、菓子、クッキーなどが挙げられる。また、パン、豆腐、麺類、調味料などが挙げられる。
【００３５】
例えば、上記麺類のうち、蕎麦には、眼の疾病の予防・改善に有用なルテインが含まれている。後述するように、本発明のトチノキ種皮抽出物は、ルテインと混合して用いた場合にも、お互いの効果を相殺することなく、有効に機能する。よって、蕎麦に本発明のトチノキ種皮抽出物を添加することにより、網膜保護効果の高い食品として提供することができる。
【００３６】
また、上記蕎麦の例において示したとおり、トチノキ種皮抽出物とルテインとの混合物を網膜保護剤として用いてもよい。ルテインは、比較的高価な健康食品原料であるが、比較的安価に製造することができるトチノキ種皮抽出物を混合することにより、より低コストで網膜保護効果の高い網膜保護剤を製造することができる。
【００３７】
トチノキ種皮由来のポリフェノール類は、水、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸またはこれらのうち２種以上の混合液よりなる溶媒に可溶である。このうち低分子のフラボノール配糖体の精製物は白色またはうすい黄色の粉末であり、高分子のプロアントシアニジンの精製物は茶色の粉末である。
【００３８】
上記各種製剤および飲食品を経口的に摂取する場合、トチノキ種皮由来のポリフェノール類の成人一人当たりの用量が、１日あたり２ｍｇ以上となるように、飲食品を摂取することが好ましい。後述するように、例えば、トチノキ種皮１５ｇから１．４ｇの精製物を得ることができ、トチノキ種皮１５ｇから７００日分（＝１４００ｍｇ÷２ｍｇ）の有効成分を得ることができる。このように、トチノキ種皮抽出物は、簡易に、安価に、製造することが可能であり、その抽出収率や用量も現実的なものであるため、網膜保護剤として有用性が高い。
【００３９】
トチノキ種皮由来のポリフェノールは、後述する「実施例」からも明らかなように、網膜保護作用を有し、「加齢黄班変性症」などの眼の疾病の予防・改善に有効である。
【００４０】
この「加齢黄班変性症」について以下に説明する。「加齢黄班変性症」は、眼球の網膜黄斑部中心窩に組織障害が生じ視力が徐々に低下すると共に、視野内にゆがみや暗点が見られる疾病であり、進行すると失明に至る場合がある。網膜組織にある黄斑部は最も視覚機能に関与する部分で酸素消費量が多く特有の脂肪酸構成様式となっている（例えば、上記非特許文献９参照）。したがって、黄斑部は網膜周辺よりも酸化ストレスの感受性が高く、加齢とともに脂質過酸化は増加することが明らかとなっている（例えば、上記非特許文献１０参照）。これらのことから、「加齢黄班変性症」の発症要因として酸化ストレスが考えられ、実際に、患者の眼の酸化リン脂質量は正常眼に比べ有意に増加していることが確認されている（例えば、上記非特許文献１１）。そして、抗酸化物質、ビタミン、ミネラルは、「加齢黄班変性症」進行の危険性を軽減することが示されている（例えば、上記非特許文献１２参照）。また、眼における酸化ストレスとして、可視光も黄斑部の細胞の活性酸素種発生の一因であり、網膜への過度の光照射は網膜組織の脂質過酸化を誘発することが明らかとなっている（例えば、上記非特許文献１４参照）。
【００４１】
また、トチノキ種皮由来のポリフェノール類の網膜保護作用は、「加齢黄班変性症」の他、「白内障」、「緑内障」、「飛蚊症」などの予防・改善に有用である。また、眼精疲労などの予防・改善に有用である。
〔実施例〕
（実験材料）
トチノミとしては、兵庫県北部の山林で採取されたトチノミ、または、（株）タカキ（倉敷、岡山）から購入したトチノミを用いた。これらのトチノミは、トチノキ(Aesculus turbinata Blume)の種子である。
【００４２】
吸着クロマトグラフィー用のカラム担体である合成吸着剤は、三菱化学（東京）製のDIAION HP-20を用いた。逆相クロマトグラフィー用のオクタデシルシリカカラムは、富士シリシア化学（春日井）製のChromaorex ODS 1024Tを用いた。ゲル濾過クロマトグラフィー用のカラム担体であるSephadex LH-20は、GEヘルスケア（東京）から得た。ゲル浸透クロマトグラフィー用の高速液体クロマトグラフィーカラムは東ソー（東京）のTSK-gel Super AW 3000カラムを用いた。
【００４３】
生理食塩水は、大塚製薬（東京）、ミドリンＰ点眼液は、参天製薬（大阪）、セラクタール２％注射液は、バイエル薬品株式会社（大阪）、ケタラール筋注用５００ｍｇは、第一三共株式会社（東京）、エオジンは、サクラファインテック（東京）、エンテランニューは、Merck KGaA（Darmstadt, Germany）製のものを用いた。還元水飴であるPO-30は、東和化成工業（東京）から得た。その他の試薬は、和光純薬工業(大阪)から購入した。
【００４４】
＜トチノキ種皮抽出物の分析＞
（抽出）
トチノキの種子（トチノミ）のうち、種皮の部分を凍結乾燥した。凍結乾燥物１．０ｇを乳鉢に取り、海砂５ｇと混合した。混合物に、アセトン：水：酢酸（７０：２９．５：０．５、ｖ／ｖ）の溶液（以下ＡＷＡ溶液と示す）を１０ｍＬ加え、混合液を得た。
【００４５】
上記混合液を、５０ｍＬ用のファルコンチューブに入れ、室温にて３０秒間ボルテックスミキサーにて撹拌した。次いで、ブランソン超音波洗浄機（日本エマソン製、神奈川）を用いて３７℃、５分間、超音波処理した。次いで、室温で１０分間静置後、３０秒間ボルテックスミキサーにて撹拌した。次いで、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清（第１上清）を、２５ｍＬ容のメスフラスコに入れた。沈殿物に、ＡＷＡ溶液１０ｍＬを加え、上記混合液と同様に、ボルテックスミキサーでの撹拌、超音波処理、静置、ボルテックスミキサーでの撹拌、遠心分離の各処理を行い、上清（第２上清）を、上記２５ｍＬ容のメスフラスコに入れた。
【００４６】
メスフラスコ中の上記上清（第１上清、第２上清の混合物）に、ＡＷＡ溶液を添加し、２５ｍＬにフィルアップしたものを、サンプル液とした。
【００４７】
（分析１）
上記サンプル液１ｍＬを試験管に取り、窒素ガスで乾固した。乾固物を、ＧＰＣの移動相溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／３Ｍギ酸アンモニウム（９９．５：０．５、ｖ／ｖ）１ｍＬに溶解し、ＧＰＣ用の溶液を得た。なお、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ギ酸アンモニウムは、和光純薬（大阪）から得た。
【００４８】
上記ＧＰＣ用の溶液を、０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、濾液１μＬを、クロマトグラフィー装置に注入した。標準物質は、昭和電工（東京）のShodex GPC用標準ポリスチレンキット(STANDARD SL-105)(Mw 580, 1110, 1530, 2170, 3070, 4430, 5120, 7210, 10200, 19600)と、東ソー（東京）の標準ポリスチレンF-4(Mw 37200)を用いた。また、フラボノール配糖体であるルチン(Mw 610.5)も分析した。
【００４９】
クロマトグラフィー装置としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置と呼ばれる、島津製作所（京都）製のLC-2010Aシステムと、クロマトパックC-R8Aを用いた。カラムは、東ソー（東京）のTSK-gel Super AW 3000カラム（長さ150 mm×内径6.0 mm）を使用した。移動相溶媒として、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／３Ｍギ酸アンモニウム（９９．５：０．５、ｖ／ｖ）を用いて、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度２０℃、検出波長２８０ｎｍおよび３４０ｎｍの条件で分析した。
【００５０】
トチノキ種皮抽出物のゲル浸透クロマトグラフィーによる分析結果を図１に示す。図１（Ａ）は、検出波長２８０ｎｍでの分析チャート、図１（Ｂ）は、検出波長３４０ｎｍでの分析チャートである。各分析チャートにおいて、横軸は、保持時間（分）であり、縦軸は、ＡＵ（任意単位）である。
【００５１】
図１（Ａ）に示す検出波長２８０ｎｍでの分析においては、保持時間２．９２分に１つのピークが確認され、図１（Ｂ）に示す検出波長３４０ｎｍでの分析においては、保持時間２．９２分と３．８６分の２つのピークが確認された。なお、図１（Ａ）に示す分析チャートにおいては、３分〜４分の間にピークの肩が確認でき、２種の成分のピークが重なり合って１つのピークになっていると思われる。
【００５２】
図１（Ｂ）に示す１つめのピーク（保持時間２．９２分）は、本発明者らの過去の成分分析および構造解析（非特許文献８参照）から、以下の構造式１に示すＡ−タイププロアントシアニジンのピークである。以下に示すように、Ａ−タイププロアントシアニジンは、フラバン−３−オールを単位分子とする重合物である。そして、Ａ−タイププロアントシアニジンは、Ｂ−タイプインターフラバン結合の他に、Ａ−タイプインターフラバン結合を有している。なお、Ｂ−タイププロアントシアニジンは、Ａ−タイプインターフラバン結合を有さず、Ｂ−タイプインターフラバン結合により単位分子が接続されている。
【００５３】
【化３】
2019019072.tif 000005
【００５４】
図１（Ｂ）に示す２つめのピーク（保持時間３．８６分）は、標準物質のルチン(Mw 610.5)の保持時間３．８４分と近いことから、分子量が１０００以下の比較的低分子の物質であることが推定される。
【００５５】
（分析２）
この分析２では、トチノキ種皮抽出物の質量分析について説明する。
【００５６】
上記「抽出」の欄において説明したサンプル液５０μＬを、窒素ガスで乾固した。乾固物を、移動相溶媒である０．１％ギ酸／アセトニトリル（９０：１０、ｖ／ｖ）１ｍＬに溶解し、測定試料溶液を得た。
【００５７】
この測定試料溶液を、０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、濾液を、質量分析計で分析した。分析計としては、超高速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレー方式イオン化飛行時間型質量分析計(UPLC-ESI-TOF/MSE)を用いた。具体的には、Waters Corporation (Milford, MA, USA)のACQUITY Ultra Performance Liquid Chromatographyシステムと、SYNAPT G2 HDMS システムを使用した。カラムは、Waters製のACQUITY UPLC BEH C18(長さ100 mm×内径2.1 mm,粒径1.7μm)を使用した。移動相は、０．１％ギ酸／アセトニトリル（９０：１０、ｖ／ｖ）を用い、１０分で、ギ酸：アセトニトリル比を、９０：１０（ｖ／ｖ）から８５：１５（ｖ／ｖ）まで直線的に変化させた状態で溶出した。即ち、直線的濃度勾配法を用いて溶出した。
【００５８】
なお、この溶出条件では、高分子のプロアントシアニジンは、カラム担体に吸着されたままであり、ここでは、分子量が１０００以下の比較的低分子の物質について質量分析を行った。この理由は、プロアントシアニジンのような高分子化合物は、本質量分析計の条件では、測定できないためである。カラム温度は４０℃、流速は０．３ｍＬ／分、検出は、フォトダイオードアレイ検出器(PDA detector)を用いて３４０ｎｍで行った。質量分析（ＭＳE）は、負イオンモード〔negative mode〕で測定し、以下の条件で行った。測定感度は、センシティブモード〔sensitive mode〕あるいはハイレゾリューションモード〔high resolution mode〕で測定した。
電圧：キャピラリー…２．５ｋＶ、サンプリングコーン…５０Ｖ、エクストラクションコーン…４．０Ｖ
温度：ソース…１５０℃、デソルベイション…５００℃
ガス流速：コーンガス…５０Ｌ／時、デソルベイションガス…１０００Ｌ／時
スキャンタイム：０．５秒
コリジョンエネルギー：
ファンクション１、［低エネルギー］
トラップコリジョンエネルギー…ＯＮ、６Ｖ
トランスファーコリジョンエネルギー…ＯＦＦ
ファンクション２、［高エネルギー］
ランプトラップコリジョンエネルギー…ＯＮ、６−４５Ｖ
トランスファーコリジョンエネルギー…ＯＦＦ
また、皮を剥いだトチノミについても上記同様の分析を行ったところ、トチノキ種皮と同様なクロマトパターンが得られたことにより、分子量１０００以下の物質についてはトチノキ種皮および皮を剥いだトチノミにも含まれていることが確認された。
【００５９】
（分析３）
この分析３では、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルによる分析について説明する。前述のUPLC-ESI-TOF/MSEによる分析で、トチノキ種子（トチノミ）の皮及び実の双方に同様の分子量１０００以下の物質が含まれていることが確認されたので、トチノキ種子（トチノミ）から、1Ｈ−ＮＭＲと13Ｃ−ＮＭＲ分析用の試料を単離した。以下にその方法を記す。
【００６０】
トチノミ１００ｇをミルで粉砕後、７０％メタノール１０００ｍＬを加えて、７０℃で２時間加熱還流した。抽出液をアドバンテックNo.2濾紙で濾過後、濾液をロータリーエバポレーターで減圧留去した。この抽出物を蒸留水３００ｍＬに溶解し、DIAION HP-20カラム(長さ300 mm×内径30 mm)に供し、蒸留水４００ｍＬで洗浄した後、メタノール４００ｍＬで溶出した。得られたメタノール溶出画分を減圧濃縮し、乾固物４．６ｇを得た。
【００６１】
この抽出物を蒸留水３００ｍＬに溶解し、Chromatorex ODS DM1020Tカラム(長さ300 mm×内径30 mm) に供した。蒸留水４００ｍＬで洗浄後、１０、２０、３０、４０、５０、６０％メタノール３００ｍＬで溶出した。得られた４０％メタノール溶出画分および５０％メタノール溶出画分を減圧濃縮し、４０％メタノール溶出画分では５４８ｍｇ、５０％メタノール溶出画分では４１３ｍｇの乾固物を得た。
【００６２】
４０％メタノール溶出画分および５０％メタノール溶出画分を分取ＨＰＬＣにかけて、各成分を単離した。４０％メタノール溶出画分からは７成分が単離され、５０％メタノール溶出画分からは４成分が単離された。なお、このうち３成分は４０％メタノール溶出画分および５０％メタノール溶出画分で、重複して確認されたので、結果的に８成分を単離した。分取ＨＰＬＣに用いた装置は、Shimadzu（京都）製のものである。ＨＰＬＣポンプは、LC-20AD、UV/VIS 検出器はSPD-20A、カラムオーブンはCTO-10ASVP、クロマトパックは Chromatopac C-R3Aを用いた。
【００６３】
分取ＨＰＬＣ条件は、以下の通りである。カラムはワイエムシィ（京都）製のODS-AM（長さ150 mm×内径10 mm 粒子径5 μm）を用いた。移動相は３０分で０．１％ギ酸水溶液／アセトニトリル９０：１０（ｖ／ｖ）から８０：２０（ｖ／ｖ）の直線濃度勾配で溶出した。カラム温度は４０℃、流速は３．５ｍＬ／ｍｉｎ，検出は３４０ｎｍで行った。
【００６４】
上記各成分（単離した各試料）について1Ｈ−ＮＭＲと13Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。ＮＭＲ装置は、日本電子社製のJEOL JNM-A400 FT-NMR(400Mz)を用いた。上記乾固物をメタノール−ｄ４に溶解して測定した。
【００６５】
上記「分析２」の質量分析および上記「分析３」のＮＭＲによる分析の結果、前述した分子量が１０００以下の比較的低分子の物質として、以下の構造式３および表１で示される８つのフラボノール配糖体を同定した。４０％メタノール溶出画分から得られた７成分は、化合物１−６及び８であり、５０％メタノール溶出画分から得られた４成分は、化合物５−８であった。
【００６６】
【化４】
2019019072.tif 000006
【００６７】
【表１】
2019019072.tif 000007
【００６８】
上記構造式３および表１に示すように、トチノキ種皮抽出物には、構造式３のＲ1、Ｒ2に、表１で示される組み合わせの置換基を有する化合物１〜８の８つのフラボノール配糖体を有することが分かった。
【００６９】
化合物１は、ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3(-O-β-D-グルコピラノシドである。
【００７０】
化合物２は、ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-β-D-グルコピラノシドである。
【００７１】
化合物３は、ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシドである。
【００７２】
化合物４は、ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシドである。
【００７３】
化合物５は、ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(ニコチノイル)-β-D-グルコピラノシド]である。
【００７４】
化合物６は、ケンペロール-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシドである。
【００７５】
化合物７は、ケンペロール-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシドである。
【００７６】
化合物８は、ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(インドリン-2-オン-3-ヒドロキシ-3-アセチル)-β-D-グルコピラノシド]である。
【００７７】
＜網膜保護作用の検討＞
ここでは、トチノキ種皮抽出物の網膜保護作用について説明する。トチノキ種皮抽出物を含む各種試料を調製しラットに投与するとともに、ラットに対し光障害を与え、各種試料の網膜保護作用について検討した（実験Ａ、実験Ｂ）。
【００７８】
（試料の調製）
トチノキ種皮抽出物として、ポリフェノール類、即ち、上記表１および構造式３に示す８種類の低分子のフラボノール配糖体と、上記構造式１に示すＡ−タイププロアントシアニジンの混合物（ＴＰ）を、抽出、精製した。
【００７９】
具体的には、以下のようにして、トチノキ種皮１５ｇから上記ＴＰを精製した。まず、トチノキ種皮に蒸留水１Ｌを加えて、２時間加熱還流した（１００℃の熱水抽出を行った。）。得られた液体を、放冷後、Advantec NO.2のろ紙（東洋濾紙，東京）を用いて吸引濾過した。この濾液中の、糖、タンパク質、脂質などの夾雑物を取り除くため、DIAION HP-20を充填した吸着クロマトグラフィー（長さ300 mm×内径30 mm）に供し、蒸留水１Ｌで洗浄後、メタノール５００ｍＬで溶出した。このメタノール溶出液（第１溶出液）を、ロータリーエバポレーター(ヤマト科学，東京)を用いて減圧乾固した。この乾固物を、５％メタノール１００ｍＬに溶解し、溶液を得た。
【００８０】
この溶液を、Chromatorex ODS 1024Tを充填した逆相クロマトグラフィー（長さ300 mm×内径30 mm）に供し、５％メタノール５００ｍＬで洗浄後、５０％メタノール５００ｍＬで溶出した。この溶出液（第２溶出液）を減圧乾固し、精製物（ＴＰ）を１．４ｇ得た。
【００８１】
同様の工程により得られたＴＰ１．４ｇを準備し、Sephadex LH-20カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー（長さ300 mm×内径30 mm）に供し、エタノール５００ｍＬ、メタノール５００ｍＬ、７０％アセトン５００ｍＬで順次溶出した。
【００８２】
エタノール溶出画分は、上記表１および構造式３に示す８種類の低分子のフラボノール配糖体であった。このエタノール溶出画分に含まれる、フラボノール配糖体を、ＬＰで示す。このエタノール溶出画分を減圧乾固し、精製物（ＬＰ）を０．１７ｇ得た。
【００８３】
メタノール溶出画分と７０％アセトン溶出画分は、それぞれ、上記構造式１に示すＡ−タイププロアントシアニジンであった。メタノール溶出画分と７０％アセトン溶出画分をあわせて用い、これらの溶出画分に含まれる、Ａ−タイププロアントシアニジンを、ＰＡで示す。メタノール溶出画分を減圧乾固し、精製物（ＰＡ）を０．５９ｇ得た。また、７０％アセトン溶出画分を減圧乾固し、精製物（ＰＡ）を０．６３ｇ得た。
【００８４】
（網膜光障害モデル試験）
ラットに対して、光障害モデル試験を行い、上記ＴＰ、ＬＰ、ＰＡについて網膜保護作用に関する以下の実験Ａ、実験Ｂを行った。
【００８５】
５週齢の雄のＳＤラットは、日本チャールスリバー株式会社（横浜）より購入し、１２時間の明暗サイクル（７ａｍ−７ｐｍ、５Ｌｕｘ、２０℃）で１週間予備飼育した後、実験に用いた。飼料としてオリエンタル酵母（東京）のＭＦを用いた。
【００８６】
上記「試料の調製」の欄で説明した、ＴＰ、ＬＰ、ＰＡを用いて、試料含有水飴を調製した。また、比較用（ポジティブコントロール１）の試料として、ルテインを用いて、試料含有水飴を調製した。また、比較用（ポジティブコントロール２）の試料として、ＰＢＮ（N-tert-butyl-α-phenylnitrone、N-tert-ブチル−α−フェニルニトロン）を準備した。なお、ＰＢＮは、腹腔内投与用試料である。
【００８７】
試料含有水飴（経口投与用試料）を、以下のように調製し、ラットに経口投与した。ＴＰ、ＬＰ、ＰＡ、ルテインに、それぞれ還元水飴であるＰＯ−３０（２．０ｇ）を加えて乳鉢で混合し、混合物を得た。この混合物に、蒸留水を加え、４ｍＬにフィルアップすることで、１００ｍｇ／ｍＬの試料含有水飴（経口投与用試料）を調製した。また、ＴＰ、ＬＰ、ＰＡ、ルテインなどの試料を含まないコントロール水飴（水飴のみ、ＰＯ−３０溶液（５０％、ｗ／ｖ））も調製した。
【００８８】
（実験Ａ）
上記試料含有水飴（経口投与用試料）およびコントロール水飴を、ラット（雄性、６週齢）に、表２に記載の投与量になるように、ラット用経口胃ゾンデを用いて７日間経口投与した。なお、上記試料含有水飴（経口投与用試料）およびコントロール水飴の吸収効率を高めるため、上記試料含有水飴（経口投与用試料）およびコントロール水飴の投与の前後３時間は絶食させた。また、ＰＢＮについては、表２に記載の投与量になるように、経口投与に代えて、ラットの腹部に注射により投与した。このＰＢＮは、腹膜から吸収されて血液を介し全身循環に入る。このような投与方法を腹腔内投与と呼ぶ。
【００８９】
経口投与開始から４日目に、光照射を行った（光障害を加えた）。４日目の上記試料含有水飴（経口投与用試料）およびコントロール水飴を投与した１５分後に、ミドリンＰ点眼液にて散瞳を行い、その１５分後から、白色蛍光灯５０００Ｌｕｘ（Ｐｈｉｌｉｐｓ、東京）の光の照射を１２時間行った。
【００９０】
なお、ラットが夜行性であること、また、網膜の視細胞で夜間に合成されるメラトニンが光障害に寄与している（例えば、上記非特許文献１８参照）ことから、光照射の開始時刻を１８時とした。光照射は、金網フタ付プラスチックケージ内にて、１ケージにつき１匹ずつ入れて行った。光照射終了後、各ラットは、１２時間の明暗サイクル（７ａｍ−７ｐｍ、５Ｌｕｘ、２０℃）に戻し、５日目〜７日目の３日間は、上記試料含有水飴（経口投与用試料）およびコントロール水飴をそれまでと同様に与えつつ、８日目〜１０日目の３日間は、飼料としてオリエンタル酵母（東京）を用いた通常飼育をした。
【００９１】
光照射した日から６日後（経口投与開始から１０日目）の夜から一晩暗順応を行った。この翌日（経口投与開始から１１日目）に、各ラットに、散瞳薬を点眼した後、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇラット体重）とキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇラット体重）の混合薬を筋肉注射し、麻酔した。麻酔が十分に効いたのを確認した後、網膜電図（electroretinogram: ERG）解析装置であるLS-W（メイヨー、愛知）を用いて、暗室にてフラッシュＥＲＧ測定を行い、両眼のＥＲＧの平均値を求めた。なお、フラッシュＥＲＧ測定は９時から実施し、ＥＲＧ測定準備期間は、赤色灯下にて準備を行った。
【００９２】
フラッシュＥＲＧ測定後、各ラットを麻酔下において安楽死させ、眼球を摘出した。眼球を固定後、パラフィン切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色（Hematoxylin and Eosin（ＨＥ）染色）を行った。
【００９３】
すなわち、第１〜第３のガラス容器に入れたキシレンを準備し、パラフィン切片を、第１〜第３のガラス容器内で、それぞれ１分間ずつ処理し、パラフィン切片のパラフィンを除去した。この後、１００、９９、９０、８０、７０％のエタノールで順次１分間ずつ処理した後、流水で５分間、蒸留水で１分間処理することで親水化を行った。このサンプルをヘマトキシリンで５分間核染色を行い、１５分間流水にて洗浄し、１分間蒸留水で浸漬処理した後、エオジンで１０分間染色を行い細胞質の染色を行った。
【００９４】
上記染色したサンプルを７０、８０％エタノールで順次１０秒間浸漬処理し、続けて、９０、９９％エタノールで１分間浸漬処理し、さらに、１００％エタノールで３分間浸漬処理した。次いで、第１〜第３のガラス容器に入れたキシレンでそれぞれ１分間ずつ浸漬処理することで、脱水処理を行った。
【００９５】
上記脱水処理後、余分なキシレンはキムワイプで除去した。このサンプルを封入体（エンテランニュー）とカバーガラスで封入後、スライドウォーマーで乾燥し、ＨＥ染色切片を作成した。
【００９６】
全網膜について、各ＨＥ染色切片を、digital imaging system：Eclipse E800（Nikon ，東京）を用いて、１００倍率のデジタル画像として取り込んだ。網膜外顆粒層（Outer Nuclear Layer：ONL）の厚さは、フリーソフトウェア（ImageJ 1.32）を用い、視神経乳頭から０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ｍｍの上方および下方の部分、および網膜の端から０．１ｍｍの部位(peri)について、測定した。網膜外顆粒層の厚さ測定は、両眼について行い、その平均値を求めた。なお本試験には、１群６匹のラットを用いた。
【００９７】
【表２】
2019019072.tif 000008
【００９８】
（実験Ａの結果）
表２に示すように、Ｓ１は、コントロール水飴を経口投与し、上記光障害を与えなかったものである。Ｓ２は、ＴＰを、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えなかったものである。Ｓ３は、コントロール水飴を経口投与し、上記光障害を与えたものである（ネガティブコントロール）。Ｓ４は、ＴＰを、ラット体重１ｋｇ当たり３０ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたものである。Ｓ５は、ＴＰを、ラット体重１ｋｇ当たり１００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたものである。Ｓ６は、ＴＰを、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたものである。Ｓ７は、ルテインを、ラット体重１ｋｇ当たり１００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたものである。Ｓ８は、ルテインを、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたものである。Ｓ９は、ＰＢＮを、ラット体重１ｋｇ当たり１０ｍｇとなるように、腹腔内投与し、上記光障害を与えたものである。Ｓ１０は、ＰＢＮを、ラット体重１ｋｇ当たり５０ｍｇとなるように、腹腔内投与し、上記光障害を与えたものである。
【００９９】
上記Ｓ１〜Ｓ１０のラットの網膜電図の測定結果を図２に示す。図２（Ａ）は、ａ−波、図２（Ｂ）は、ｂ−波の場合を示す。図２において、縦軸は、電位の振幅（μＶ）である。なお、図２において、データは、１群６匹のラットの“平均±標準偏差”で表した。有意差検定はDunnett法により行い、Ｓ３のネガティブコントロールに対する有意差を求めた（＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５）。
【０１００】
図２に示すように、光障害を加え、各種試料の非投与の場合（Ｓ３）においては、障害を加えず、各種試料の非投与の場合（Ｓ１）と比較して、有意な電位の振幅の低下が確認された。これは、光照射（５０００Ｌｕｘ、１２時間）により網膜にダメージが加わっていることを意味する。一方で、ルテイン（１００、３００ｍｇ／ｋｇラット体重）、ＰＢＮ（１０、５０ｍｇ／ｋｇラット体重）をそれぞれ投与した場合（Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０）においては、光障害を加え、各種試料の非投与の場合（Ｓ３）と比較し、有意な電位の振幅の低下の抑制が確認された。また、ＴＰ（３０、１００、３００ｍｇ／ｋｇラット体重）をそれぞれ投与した場合（Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６）においては、光障害を加え、各種試料の非投与の場合（Ｓ３）と比較し、有意な電位の振幅の低下の抑制が確認された（Ｐ＜０．０１）。なお、光障害を加えない場合においては、非投与の場合（Ｓ１）と、ＴＰ（３００ｍｇ／ｋｇラット体重）を投与した場合（Ｓ２）との有意な差は認められなかった。
【０１０１】
上記Ｓ２のラットの網膜外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さを測定したところ、上方網膜において光照射による顕著なＯＮＬの菲薄化が確認された。しかしながら、ＴＰを投与した場合（上記Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６）ではその上方網膜の菲薄化は視神経乳頭から０．５〜２．０ｍｍの範囲で抑制されていた（Ｐ＜０．０１）。
【０１０２】
以上より、ＴＰは光障害下での網膜保護作用を示すことが明らかとなった。
【０１０３】
（実験Ｂ）
ＬＰまたはＰＡを有する試料含有水飴（経口投与用試料）およびコントロール水飴を上記のとおり調製し、実験Ａと同様にして、網膜光障害モデル試験を行った。ＬＰまたはＰＡは、３００ｍｇ／ｋｇラット体重となるように経口投与した。
【０１０４】
具体的には、コントロール水飴を経口投与し、上記光障害を与えなかったもの、コントロール水飴を経口投与し、上記光障害を与えたもの、について、フラッシュＥＲＧ測定および網膜外顆粒層の厚さ測定を行った。また、ＬＰを、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたもの、ＰＡを、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたもの、について、網膜電図の測定および網膜外顆粒層の厚さ測定を行った。
【０１０５】
（実験Ｂの結果）
図３および図４に、実験Ｂの結果を示す。図３、図４おいて、「normal」は、コントロール水飴を経口投与し、上記光障害を与えなかった場合、「＋Ｌ」は、コントロール水飴を経口投与し、上記光障害（５０００Ｌｕｘ、１２時間）を与えた場合を示す。また、「ＬＰ＋Ｌ」は、ＬＰを、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えた場合、「ＰＡ＋Ｌ」は、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えた場合を示す。
【０１０６】
図３は、網膜電図の測定結果である。図３（Ａ）は、ａ−波、図３（Ｂ）は、ｂ−波の場合を示す。図３において、縦軸は、電位の振幅（μＶ）である。なお、図３において、データは、１群６匹のラットの“平均±標準偏差”で表した。有意差検定はDunnett法により行い、「＋Ｌ」のネガティブコントロールに対する有意差を求めた（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。
【０１０７】
図３に示すように、ＬＰ（３００ｍｇ／ｋｇラット体重）を投与した場合、ＰＡ（３００ｍｇ／ｋｇラット体重）を投与した場合の双方について、光障害を加え、各種試料の非投与の場合（＋Ｌ）と比較し、有意な電位の振幅の低下の抑制が確認された。
【０１０８】
電位の振幅の低下の抑制効果としては、ＬＰよりＰＡの方が大きかった。
【０１０９】
図４は、網膜外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さの測定結果である。図４において、縦軸は、ＯＮＬの厚さ（μｍ）であり、横軸は、視神経乳頭からの距離（ｍｍ）である。なお、図４において、データは、１群６匹のラットの“平均±標準偏差”で表した。有意差検定はDunnett法により行い、「＋Ｌ」のネガティブコントロールに対する有意差を求めた（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。
【０１１０】
図４に示すように、上記「＋Ｌ」のラットの網膜外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さを測定したところ、上記「normal」と比較し、上方網膜において光照射による顕著なＯＮＬの菲薄化が確認された。しかしながら、ＬＰを投与した場合（ＬＰ＋Ｌ）ではその上方網膜の菲薄化は視神経乳頭から０．５〜２．０ｍｍの範囲で抑制されていた。また、ＰＡを投与した場合（ＰＡ＋Ｌ）ではその上方網膜の菲薄化は視神経乳頭から０．５〜２．０ｍｍの範囲で抑制されていた。
【０１１１】
網膜外顆粒層（ＯＮＬ）の薄化の抑制効果としては、ＬＰよりＰＡの方が大きかった。
【０１１２】
以上より、ＬＰ、ＰＡはそれぞれ、光障害下での網膜保護作用を示すことが明らかとなった。また、光障害下での網膜保護作用は、ＬＰよりＰＡの方が大きいことが明らかとなった。
【０１１３】
上記実験Ａ、Ｂから、トチノキ種皮抽出物である、ポリフェノール類、即ち、低分子のフラボノール配糖体と、高分子のプロアントシアニジンの混合物（ＴＰ）の他、低分子のフラボノール配糖体（ＬＰ）、高分子のプロアントシアニジン（ＰＡ）についても、網膜保護作用が認められた。
【０１１４】
（ＴＰの経口投与量について）
ＴＰの経口投与量の推奨量については、ルテインの経口投与量との比較により求められる。
【０１１５】
前述したように、ルテインは天然に存在する色素である「カロテノイド」の１つで、強い抗酸化作用を持ち、眼の疾病の予防・改善する目的で、アイケア商品として流通している。
【０１１６】
上記「実験Ａ」において説明したように、ＴＰは、ルテインより強い網膜保護効果を示した。例えば、図２のＳ８（ルテインを、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたもの）より、Ｓ５（ＴＰを、ラット体重１ｋｇ当たり１００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたもの）の方が、網膜保護効果が大きい。
【０１１７】
この対比から、ＴＰはルテインの３分の１の濃度で、同等またはそれ以上の網膜保護効果を奏することとなる。アイケア商品として市場に流通しているルテインを含有する機能性表示食品であって、「眼の調子を整える機能性食品」等の表記をした機能性表示食品においては、１日あたり摂取量が６〜２０ｍｇとされている。
【０１１８】
以上の考察から、ＴＰの経口投与量については、１日あたり２ｍｇ以上の投与により、網膜保護効果が得られると考えられる。
【０１１９】
また、図２のＳ３（ネガティブコントロール）と、Ｓ６（ＴＰを、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたもの）の比較、図３の「＋Ｌ（ネガティブコントロール）」と、「ＬＰ＋Ｌ」または「ＰＡ＋Ｌ」の比較により、ＬＰの経口投与量については、１日あたり６ｍｇ以上、ＰＡの経口投与量については、１日あたり１．８ｍｇ以上が好ましいと考えられる。
【０１２０】
上記ルテインは、比較的高価な健康食品原料であるのに対し、トチノミ抽出物は、比較的安価に製造することができる。特に、食品残渣として廃棄されるトチノミの種皮の部分を利用することで、さらに、安価にトチノキ種皮抽出物を得ることができる。すなわち、網膜保護剤を安価に製造することができる。
【０１２１】
（実験Ｃ）
実験Ａにおいては、ルテインと、ＴＰとを個別に用いて試験したが、ルテインとＴＰとを混合した試料を用いてもよい。ここでは、ルテインとＴＰとの相乗効果について検討する。
【０１２２】
上記「試料の調製」の欄で説明した、ＴＰ、ルテインを用いて、試料含有水飴を調製した。すなわち、ＴＰ、ルテイン、ＬＰとルテインの混合物に、それぞれ還元水飴であるＰＯ−３０（２．０ｇ）および蒸留水を加え、１００ｍｇ／ｍＬの試料含有水飴（経口投与用試料）を調製した。また、ＴＰ、ＬＰ、ＰＡ、ルテインなどの試料を含まないコントロール水飴（水飴のみ、ＰＯ−３０溶液（５０％、ｗ／ｖ））も調製した。
【０１２３】
上記試料含有水飴（経口投与用試料）およびコントロール水飴を、ラット（雄性、６週齢）に、表３に記載の投与量になるように投与し、実験Ａと同様にして、網膜光障害モデル試験を行った。
【０１２４】
【表３】
2019019072.tif 000009
【０１２５】
表３に示すように、Ｓ１１は、コントロール水飴を経口投与し、上記光障害を与えなかったものである。Ｓ１２は、コントロール水飴を経口投与し、上記光障害を与えたものである（ネガティブコントロール）。Ｓ１３は、ＴＰを、ラット体重１ｋｇ当たり３０ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたものである。Ｓ１４は、ルテインを、ラット体重１ｋｇ当たり１００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたものである。Ｓ１５は、ルテインを、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたものである。Ｓ１６は、ルテインおよびＴＰを、それぞれ、ラット体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ、ラット体重１ｋｇ当たり３０ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたものである。
【０１２６】
図５は、Ｓ１１〜Ｓ１６のラットの網膜電図の測定結果である。図５（Ａ）は、ａ−波、図５（Ｂ）は、ｂ−波の場合を示す。図５において、縦軸は、電位の振幅（μＶ）である。なお、図５において、データは、１群６匹のラットの“平均±標準偏差”で表した。有意差検定はDunnett法により行い、Ｓ１２のネガティブコントロールに対する有意差を求めた（＃＃Ｐ＜０．０１）。
【０１２７】
図５に示すように、Ｓ１６（ルテインおよびＴＰを、それぞれ、ラット体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ、ラット体重１ｋｇ当たり３０ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたもの）は、Ｓ１５（ルテインを、ラット体重１ｋｇ当たり３００ｍｇとなるように、経口投与し、上記光障害を与えたもの）より、網膜保護効果が大きかった。
【０１２８】
ルテインは、比較的高価な健康食品原料であるが、比較的安価に製造することができるトチノキ種皮抽出物を混合することにより、より低コストで網膜保護効果の高い網膜保護剤を製造することができる。
【０１２９】
（実験Ｄ）
前述したように、トチノキ種皮抽出物を得るための抽出方法については、常温での浸漬による抽出、加熱抽出が好ましく用いられる。
【０１３０】
ここでは、トチノキ種皮抽出物を短時間かつ効率的に得るため、抽出温度について検討する。
【０１３１】
トチノキ種皮１０ｇに蒸留水１Ｌを加えて、８０、１００、１２１℃で、２０分間熱水抽出を行った。１２１℃の処理においては、オートクレーブを使用した。得られた液体を、放冷後、Advantec NO.2のろ紙（東洋濾紙，東京）を用いて吸引濾過した。この濾液に、蒸留水を加えて、１Ｌにフィルアップした溶液は、抽出液とした。
【０１３２】
前述したように、トチノキ種皮抽出液の主要成分は、ポリフェノール類であり、低分子のフラボノール配糖体や高分子のプロアントシアニジンのような、フラボノール類である。抽出液中の総ポリフェノール量は、フォーリン・チオカルト法（Folin-ciocalteu法）にて測定することができる。フォーリン・チオカルト法により、没食子酸を標準品として、総ポリフェノール量を定量した。８０℃での抽出液中の総ポリフェノール量（濃度）は、８．９％、１００℃での抽出液中の総ポリフェノール量（濃度）は、２１．９％、１２１℃での抽出液中の総ポリフェノール量（濃度）は、２８．２％であった。各抽出液の乾固物を、「分析１」の場合と同様にして、ＧＰＣの移動相溶媒に溶解し、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ用カラムを用いたＨＰＬＣ）に供したところ、分析結果（溶出パターン、図１参照）に差はなく、いずれの抽出液にも、ＴＰ（ＬＰ、ＰＡ）が含まれることが判明した。このように、１００℃を越える加熱抽出処理を行っても、トチノキ種皮抽出液の主要成分は、分解されることなく、ＴＰ、ＬＰまたはＰＡとして、存在することが判明した。
【０１３３】
このため、抽出温度（抽出液の温度）Ｔとしては、１００℃を超える温度とすることで、短時間かつ効率的にＴＰ、ＬＰまたはＰＡを得ることができる。抽出温度（抽出液の温度）Ｔを１００℃を超える温度とするためには、例えば、オートクレーブなどを使用し大気圧より圧力の高い状態（加圧状態）において、熱水抽出する。具体的には、１００℃を超え、２ａｔｍでの水の沸点である１２１℃以下（１００℃＜Ｔ≦１２１℃）とすることで、短時間かつ効率的にＴＰ、ＬＰまたはＰＡを得ることができる。
【０１３４】
なお、上記実験においては、トチノキ種皮から得られたＴＰ（ＬＰおよびＰＡ）を用いたが、前述したように、皮を剥いだトチノミ（皮剥トチノミ）にも、ＬＰが含まれる。
【０１３５】
このように、トチノキ種皮から得られたＴＰ（ＬＰまたはＰＡ）に限らず、皮剥トチノミに含まれるＬＰを網膜保護剤として用いてもよい。
【０１３６】
以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態および実施例に基づき具体的に説明したが、本発明は上記実施の形態や実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明のトチノキ種皮抽出物を有効成分として含有する網膜保護剤は、眼の疾病の予防・改善に有用である。特に、「白内障」、「緑内障」、「飛蚊症」、「加齢黄班変性症」などの予防・改善に有用である。
【図１】
2019019072.tif 000010
【図２】
2019019072.tif 000011
【図３】
2019019072.tif 000012
【図４】
2019019072.tif 000013
【図５】
2019019072.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月18日(2018.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トチノキ種皮を、水、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸またはこれらのうち２種以上の混合液よりなる溶媒により抽出し、低分子のフラボノール配糖体を分離精製することにより、
ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(ニコチノイル)-β-D-グルコピラノシド]，ケンペロール-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケンペロール-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(インドリン-2-オン-3-ヒドロキシ-3-アセチル)-β-D-グルコピラノシド]のいずれかを有効成分として含有する、経口用の網膜保護剤を製造する、網膜保護剤の製造方法。
【請求項２】
トチノキ種皮を、水、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸またはこれらのうち２種以上の混合液よりなる溶媒により抽出し、高分子のプロアントシアニジンを分離精製することにより、
抽出物中のフラバン−３−オールを単位分子とする重合物であって、分子内にＡ−タイプインターフラバン結合を有するプロアントシアニジンを有効成分として含有する、経口用の網膜保護剤を製造する、網膜保護剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の網膜保護剤の製造方法において、
（ａ）トチノキ種皮に、前記溶媒を加えることにより抽出液を形成する工程と、
（ｂ）前記抽出液を濃縮することにより、濃縮物を得る工程と、
（ｃ）前記濃縮物をカラムにより分離精製する工程と、
を有する、網膜保護剤の製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の網膜保護剤の製造方法において、
前記（ａ）工程は、前記抽出液の温度Ｔが、１００℃を超える、網膜保護剤の製造方法。
【請求項５】
ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(ニコチノイル)-β-D-グルコピラノシド]，ケンペロール-3-O-[β-D-グルコピラノシル(1→3)]-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケンペロール-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド，ケルセチン-3-O-[β-D-キシロピラノシル(1→2)]-β-D-グルコピラノシド-3'-O-[6-O-(インドリン-2-オン-3-ヒドロキシ-3-アセチル)-β-D-グルコピラノシド]のいずれかを含有する、経口用の網膜保護剤。
【請求項６】
フラバン−３−オールを単位分子とする重合物であって、分子内にＡ−タイプインターフラバン結合を有するプロアントシアニジンを含有する、経口用の網膜保護剤。
【請求項７】
請求項５または６に記載の網膜保護剤において、
ルテインを含有する、経口用の網膜保護剤。