(57)【要約】【課題】  細胞を破壊することなく、未分化細胞の状態を評価可能な方法を提供することを課題とする。【解決手段】  未分化細胞を含む液の液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAを測定する工程と、該miRNAの測定値に基づいて、該未分化細胞の状態を評価する工程とを含む、未分化細胞の状態を評価する方法を提供することにより、上記の課題を解決する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化細胞を含む液の液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAを測定する工程と、
前記miRNAの測定値に基づいて、前記未分化細胞の状態を評価する工程と
を含む、未分化細胞の状態を評価する方法。
【請求項２】
前記未分化細胞が、多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、iPS細胞、ES細胞、ntES細胞又はEG細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記miRNAの測定値が、前記液中におけるナイーブ型多能性幹細胞の存在の指標である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記miRNAの測定値が第１の閾値以上の場合、前記未分化細胞がナイーブ型多能性幹細胞であると判定する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記miRNAの測定値が第２の閾値より低い場合、前記未分化細胞がプライム型多能性幹細胞であると判定する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記未分化細胞を含む液が、前記未分化細胞の細胞培養液である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記miR371が、miR371a又はmiR371bである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記miRNAの測定値が、miR371a測定値、miR371b測定値、miR372測定値、miR373測定値又はこれらのうちの少なくとも２つの測定値の合計値である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記miRNAの測定値が、定量RT-PCR法により測定される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法に用いる試薬キットであって、miR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAにハイブリダイズ可能なプライマーを少なくとも１つ含む、試薬キット。
【請求項１２】
未分化細胞を含む液の液相画分を取得する工程と、
前記液相画分に含まれるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAと、プライマーと、ポリメラーゼとを混合して反応液を調製する工程と、
前記反応液中で前記miRNAのcDNAを含むDNA断片を増幅し、増幅産物を検出する工程と
を含む、増幅産物の検出方法。
【請求項１３】
前記検出結果が、前記液中におけるナイーブ型多能性幹細胞の存在の指標となる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記取得工程の前に、前記液中で、前記未分化細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する工程をさらに含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
プライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞への誘導操作前に、未分化細胞を含む液の液相画分を取得し、前記液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAの第１測定値を取得し、
プライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞への誘導操作中に、未分化細胞を含む液の液相画分を取得し、前記液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAの第２測定値を取得し、
前記第１測定値と前記第２測定値とを比較することにより、前記未分化細胞の誘導操作をモニタリングする方法。
【請求項１６】
プライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞への誘導操作中の第１の時刻に、未分化細胞を含む液の液相画分を取得し、前記液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAの第１測定値を取得し、
プライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞への誘導操作中の第２の時刻に、未分化細胞を含む液の液相画分を取得し、前記液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAの第２測定値を取得し、
前記第１測定値と前記第２測定値とを比較することにより、前記未分化細胞の誘導操作をモニタリングする方法。
【請求項１７】
下記(１)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、下記(２)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、下記(３)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、及び下記(４)の塩基配列を3’末端側に有するプライマーから選択される少なくとも１つを含む、試薬キット。
5’-ACACT-3’  ・・・(１)
5’-GCACT-3’  ・・・(２)
5’-ACGCT-3’  ・・・(３)
5’-ACACC-3’  ・・・(４)
【請求項１８】
未分化細胞の細胞培養液の液相画分と、逆転写酵素と、miR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAにハイブリダイズ可能なプライマーと、dNTPsとを含む混合液。
【請求項１９】
前記プライマーが、下記(１)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、下記(２)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、下記(３)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、及び下記(４)の塩基配列を3’末端側に有するプライマーから選択される少なくとも１つである、請求項１８に記載の混合液。
5’-ACACT-3’  ・・・(１)
5’-GCACT-3’  ・・・(２)
5’-ACGCT-3’  ・・・(３)
5’-ACACC-3’  ・・・(４)
【請求項２０】
前記液相画分が、miR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAを含む、請求項１８又は１９に記載の混合液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化細胞の状態を評価する方法に関する。本発明は、試薬キットに関する。本発明は、増幅産物の検出方法に関する。本発明は、未分化細胞の誘導操作をモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は、細胞移植などの再生医療を実現するために重要な役割を果たす細胞源として期待されている。しかし、これまでに樹立された幹細胞株は、未分化の程度が異なる不均一な細胞集団であり、株間で分化特性や多分化能が異なっていた。例えば、従来のヒト胚性幹細胞(ES細胞)は、着床前胚の段階の未分化細胞だけでなく、様々な発生段階の未分化細胞を含む。また、従来のヒト誘導多能性幹細胞(iPS細胞)も、様々な発生段階にリプログラミングされた不均一な細胞集団であることが知られている。それゆえ、同一のプロトコルを用いて多能性幹細胞を分化誘導しても、分化誘導の効率に大きなばらつきが生じていた。
【０００３】
近年、多能性幹細胞をナイーブ型(naive state)とプライム型(primed state)とに分類することが提唱されている。ナイーブ型多能性幹細胞は、着床前胚に相当する性質を有する細胞として知られ、均一で安定な基底状態(ground state)を維持できる。また、プライム型多能性幹細胞は、着床後胚に相当する性質を有する細胞として知られ、ナイーブ型よりも発生段階が進んだ細胞である。ナイーブ型多能性幹細胞は、プライム型多能性幹細胞よりも高い自己複製能及び多分化能を有するので、再生医療の分野において注目されている。このため、基底状態を維持したナイーブ型の性質を有する幹細胞株の樹立が望まれている。近年、高い均一性を有し、且つ基底状態を維持したナイーブ型の表現型を示すヒト幹細胞を樹立する方法が、相次いで報告された。
【０００４】
上述のように、ナイーブ型のヒト幹細胞は、再生医療への応用が期待される。しかし、幹細胞の集団が均一にナイーブ型の表現型を有していなければ、分化誘導の効率にばらつきが生じる。高い品質の未分化細胞を再生医療に利用するためには、未分化細胞の状態を評価する手段が必要となる。現在、ナイーブ型多能性幹細胞の評価法としては、ナイーブ関連遺伝子の発現解析などがある。例えば、非特許文献１には、ナイーブ型多能性幹細胞では、転写因子TFE3が核内に局在することが開示されている。非特許文献２には、ナイーブ型多能性幹細胞は、プライム型多能性幹細胞に比べて、マイクロRNA(miRNA)のmiR371-373クラスターの細胞内発現量が増加していることが開示されている。しかし、これらの発現解析は破壊検査であり、貴重な未分化細胞を品質評価のために消費することとなる。
【０００５】
非破壊検査の例として、細胞コロニーの形態の相違からプライム型とナイーブ型とを見分けることが知られている。しかし、全ての細胞サンプルを顕微鏡で観察することは多大な労力を要する。また、細胞の形態の観察に基づく検査であるので、客観的ではない。非特許文献３には、多能性幹細胞の培養上清中のmiRNA量を測定することにより、該細胞の多能性を評価することが開示されている。しかし、非特許文献３で検出対象となるmiRNAは、マウスにのみ存在することが知られたmiRNAである。また、非特許文献３では、miRNA量によって、ヒト多能性幹細胞のナイーブ型とプライム型とを判別することは検討していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gafni O.ら, Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells, Nature, 2013, vol.504, p.282-286
【非特許文献２】Rosa A.ら, Regulatory non-coding RNAs in pluripotent stem cells, Int. J. Mol. Sci., 2013, vol.14, p.14346-14373
【非特許文献３】Zhang Y.ら, A non-invasive method to determine the pluripotent status of stem cells by culture medium microRNA expression detection, Sci. Rep., 2016, 6:22380
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞を破壊することなく、未分化細胞の状態を評価可能な方法を提供することを目的とする。本発明者らは、初期胚により近い未分化細胞が、発生段階がより進んだ未分化細胞よりも、多量のmiR371、miR372及びmiR373を細胞外に放出することを新たに見出した。そして、細胞培養液の液相成分におけるmiR371、miR372及びmiR373を測定することにより、未分化細胞の状態を評価できることを見出して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
よって、本発明は、未分化細胞を含む液の液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAを測定する工程と、該miRNAの測定値に基づいて、該未分化細胞の状態を評価する工程とを含む、未分化細胞の状態を評価する方法を提供する。
【０００９】
本発明は、上記の方法に用いる試薬キットであって、miR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAにハイブリダイズ可能なプライマーを少なくとも１つ含む、試薬キットを提供する。
【００１０】
本発明は、未分化細胞を含む液の液相画分を取得する工程と、該液相画分に含まれるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAと、プライマーと、ポリメラーゼとを混合して反応液を調製する工程と、該反応液中で上記miRNAのcDNAを含むDNA断片を増幅し、増幅産物を検出する工程とを含む、増幅産物の検出方法を提供する。
【００１１】
本発明は、プライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞への誘導操作前に、未分化細胞を含む液の液相画分を取得し、該液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAの第１測定値を取得し、プライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞への誘導操作中に、未分化細胞を含む液の液相画分を取得し、該液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAの第２測定値を取得し、該第１測定値と該第２測定値とを比較することにより、上記未分化細胞の誘導操作をモニタリングする方法を提供する。
【００１２】
本発明は、プライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞への誘導操作中の第１の時刻に、未分化細胞を含む液の液相画分を取得し、該液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAの第１測定値を取得し、プライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞への誘導操作中の第２の時刻に、未分化細胞を含む液の液相画分を取得し、該液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAの第２測定値を取得し、該第１測定値と該第２測定値とを比較することにより、上記未分化細胞の誘導操作をモニタリングする方法を提供する。
【００１３】
本発明は、下記(１)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、下記(２)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、下記(３)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、及び下記(４)の塩基配列を3’末端側に有するプライマーから選択される少なくとも１つを含む、試薬キットを提供する。
5’-ACACT-3’  ・・・(１)
5’-GCACT-3’  ・・・(２)
5’-ACGCT-3’  ・・・(３)
5’-ACACC-3’  ・・・(４)
【００１４】
本発明は、未分化細胞の細胞培養液の液相画分と、逆転写酵素と、miR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAにハイブリダイズ可能なプライマーと、dNTPsとを含む混合液を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、細胞を破壊することなく、未分化細胞の状態を評価することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】実施例１で調製したプライム型iPS細胞の明視野像である。
【図１Ｂ】実施例１で調製したナイーブ型iPS細胞の明視野像である。
【図２】核内に局在したTFE3を有する細胞の明視野像及び免疫染色像である。
【図３】ナイーブ型iPS細胞及びプライム型iPS細胞のそれぞれについて、核内に局在したTFE3を有する細胞の割合を示すグラフである。
【図４】miR371、miR372及びmiR373について、プライム型iPS細胞の培養上清における発現量を１とした場合のナイーブ型iPS細胞の培養上清における相対発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［１．未分化細胞の評価方法］
本実施形態の未分化細胞の評価方法(以下、単に「方法」ともいう)では、未分化細胞を含む液の液相画分におけるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAを測定する。
【００１８】
本実施形態の方法で用いられる試料は、未分化細胞を含む液の液相画分である。「未分化細胞を含む液」とは、培養容器内で未分化細胞と接触した状態又は未分化細胞を浸漬した状態にある、未分化細胞を生存可能に保持できる液をいう。未分化細胞を含む液において、未分化細胞は、未分化細胞を生存可能に保持できる液中に浮遊していてもよいし、該液中で培養容器の底部に沈降又は付着していてもよい。
【００１９】
未分化細胞を生存可能に保持できる液は、所定の期間、未分化細胞を死滅又は激しく損傷しない限り、特に限定されない。例えば、未分化細胞用の液体培地、生理食塩水、緩衝液(例えばPBS、HEPES)などが挙げられる。それらの中でも、未分化細胞用の液体培地が好ましい。未分化細胞を生存可能に保持できる液として液体培地を用いる場合、本明細書では、未分化細胞を含む液を「未分化細胞の細胞培養液」ともいう。
【００２０】
本明細書において「液相画分」とは、未分化細胞を含む液の溶液部分の全部又は一部であって、実質的に細胞を含まない。未分化細胞を含む液の液相画分は、好ましくは培養上清である。培養上清は、未分化細胞の細胞培養液の液相画分である。
【００２１】
未分化細胞用の液体培地は、未分化細胞の種類に応じて公知の液体培地から適宜選択できる。そのような液体培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、EMEM培地、αMEM培地、DMEM培地、Ham’s F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、MEF-CM、StemPro(商標)34(Invitrogen社)、Essential 8(商標)(Thermo Fisher Scientific社)、hPSC Growth Medium DXF(商標)(タカラバイオ社)、StemFit(商標)AK02N(タカラバイオ社)、ReproNaive(商標)(リプロセル社)、及びこれらの混合培地などが挙げられる。
【００２２】
培養培地は、細胞の増殖及び維持に必要な成分を含んでいてもよい。例えば、血清、アルブミン、トランスフェリン、代替血清(Knockout(商標) Serum Replacement)(KSR社)、N2サプリメント(Invitrogen社)、B27サプリメント(Invitorogen社)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax(商標)(Invitorogen社)、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などが挙げられる。
【００２３】
未分化細胞が多能性幹細胞である場合は、生存又は未分化な状態の維持に必要な成分を培養培地に添加してもよい。そのような成分としては、白血病阻害因子(LIF)、アクチビン、線維芽細胞増殖因子(FGF)、幹細胞因子(stem cell factor)、MEK阻害剤、GSK3阻害剤、ROCK阻害剤などが挙げられる。
【００２４】
本実施形態において、未分化細胞は、分化能を有する細胞であれば特に限定されない。未分化細胞としては、幹細胞及び前駆細胞が挙げられる。幹細胞には、多能性幹細胞及び体性幹細胞がある。多能性幹細胞は、外胚葉、内胚葉及び中胚葉に由来する細胞に分化する能力(分化多能性；pluripotency)を有し、かつ増殖能を有する幹細胞である。多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、核移植ES細胞(ntES細胞)、胚性生殖幹細胞(EG細胞)などが挙げられる。
【００２５】
iPS細胞は、Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2などの所定のリプログラミング因子(DNA又はタンパク質)を皮膚細胞などの体細胞に導入することによって作製され、多分化能と増殖能とを有する幹細胞である。ES細胞は、哺乳動物の胚盤胞の内部細胞塊に由来する幹細胞であり、多分化能と増殖能とを有する幹細胞である。ntES細胞は、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚に由来する胚盤胞内部細胞塊から樹立されたES細胞である。ntES細胞は、ES細胞とほぼ同じ性質を有する。EG細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様の多能性を持つ細胞である。EG細胞は、LIF、塩基性FGF(bFGF)、幹細胞因子などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立され得る。
【００２６】
体性幹細胞は、種々の組織に存在し、当該組織において新しい細胞を供給する幹細胞である。体性幹細胞の分化能は、多能性幹細胞に比べて限定されている。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、骨格筋幹細胞などが挙げられる。
【００２７】
前駆細胞は、幹細胞から発生して最終分化細胞へ分化する細胞である。最終分化細胞とは、分化能を有さず、発生学的な細胞系譜上で最終分化に至った細胞をいう。前駆細胞としては、例えば、血小板前駆細胞、肝臓前駆細胞、心臓前駆細胞、神経前駆細胞などが挙げられる。
【００２８】
未分化細胞は、好ましくは多能性幹細胞であり、より好ましくは、iPS細胞、ES細胞、ntES細胞又はEG細胞である。本実施形態では、未分化細胞は、分化能を有さない細胞から分化能を有する細胞へ誘導する途中段階の細胞であってもよい。そのような細胞としては、例えば、iPS細胞とするために所定のリプログラミング因子を導入された体細胞などが挙げられる。
【００２９】
未分化細胞は、生体から採取した未分化細胞であってもよいし、生体から採取した分化細胞をリプログラミングして人工的に調製された細胞であってもよい。再生医療研究及び臨床適用という観点から、人工的に調製された多能性幹細胞が好ましい。未分化細胞の由来は特に限定されない。ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシなどの哺乳動物由来であることが好ましい。
【００３０】
近年、多能性幹細胞をナイーブ型とプライム型とに分類することが提唱されている。「ナイーブ型多能性幹細胞」とは、発生段階が着床前胚に相当する多能性幹細胞をいう。「プライム型多能性幹細胞」とは、発生段階が着床後胚に相当する多能性幹細胞をいう。一般的に、ナイーブ型多能性幹細胞は、プライム型多能性幹細胞と比較して、均一な基底状態を維持しており、高い多分化能を示す細胞であることが知られている。また、ナイーブ型及びプライム型のそれぞれの多能性幹細胞の特徴として、以下のことが知られている。
【００３１】
＜ナイーブ型多能性幹細胞の特徴＞
・細胞のコロニーが、小さく、ドーム状の形態をしている
・全ゲノムに渡る広範なDNAの脱メチル化
・Ｘ染色体が活性化状態(XaXa)
・所定の転写因子(例えばTFE3)が核内に局在している割合が高い
【００３２】
＜プライム型多能性幹細胞の特徴＞
・細胞のコロニーが、大きく、平坦な形態をしている
・DNAのメチル化
・Ｘ染色体が不活化状態(XaXi)
・所定の転写因子(例えばTFE3)が核内に局在している割合が低い
【００３３】
マウスES細胞の場合、LIF、MEK阻害剤及びGSK3阻害剤を含む化学合成培地2i/LIF培地で培養することにより、ナイーブ型のES細胞を得ることができる。一方、ヒトES細胞及びヒトiPS細胞は、従来の培養法では、着床後胚に相当する性質を示し、プライム型に分類される。近年、プライム型のヒト多能性幹細胞にNANOG遺伝子及びKLF2遺伝子を導入することで、ナイーブ型に誘導する方法が報告されている(Takashima Y.ら, Cell, vol.158, p1254-1269, 2014参照)。また、遺伝子導入なしで、プライム型からナイーブ型へ誘導可能な液体培地(以下、「誘導培地」ともいう)も知られている。そのような誘導培地としては、ReproNaive(商標)(リプロセル社)などが挙げられる。
【００３４】
一実施形態では、未分化細胞は、プライム型多能性幹細胞、ナイーブ型多能性幹細胞又はそれらの混合物であるが、いずれであるかは不明である。別の実施形態では、未分化細胞は、本発明の方法とは異なる方法でプライム型及びナイーブ型のいずれであるかを判断された細胞である。この場合、本実施形態の方法によって、プライム型多能性幹細胞及びナイーブ型多能性幹細胞のいずれであるかについて再検証を行うことができる。また、未分化細胞は、プライム型からナイーブ型へ誘導している途中段階の多能性細胞であってもよい。そのような細胞としては、例えば、NANOG遺伝子及びKLF2遺伝子を導入した多能性幹細胞、液体培地を誘導培地に置換された多能性幹細胞が挙げられる。
【００３５】
未分化細胞の培養方法は、未分化細胞の種類に応じて公知の培養方法から適宜選択できる。細胞の培養には、通常、浮遊培養、接着培養又はこれらが併用される。浮遊培養とは、培養容器に対して非接着性の条件下で行う培養をいう。浮遊培養においては、必ずしも細胞が液体培地中に分散している必要はなく、細胞が培養容器の底部に沈降していてもよい。浮遊培養に用いられる培養容器は特に限定されず、例えば、フラスコ、ディッシュ、プレート、チャンバー、チューブなどが挙げられる。浮遊培養で使用される培養容器は、細胞非接着性であることが好ましい。培養容器は、疎水性の材質であるか、表面に細胞の接着を防止するためのコーティング剤(例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリレート共重合体など)で被覆されていることが好ましい。
【００３６】
接着培養とは、細胞を支持体に接着して行う培養をいう。支持体としては培養容器が用いられる。接着培養に用いられる培養容器は特に限定されない。接着培養には、浮遊培養に用いられる培養容器と同様のものを使用できるが、培養容器の表面又は内部は、細胞を接着させるコーティング剤(細胞培養基質、接着基質などとも呼ばれる)で被覆されていることが好ましい。コーティング剤としては、例えば、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリ-D-リジン、ポリオルニチン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどが挙げられる。ラミニン511-E8フラグメントを含むiMatrix-511(nippi社)などの市販品を用いることもできる。また、支持体として公知のスキャフォールドを用いることもできる。これを用いることにより、未分化細胞がスキャフォールドを足場として増殖し、三次元培養を行うことができる。このようなスキャフォールドとしては、市販品を用いることができ、例えば、Matrigel(商標)(コーニング社)、QGel(商標)MT 3D Matrix(Qgel SA社)、3-D Life Biomimetic(Cellendes社)、Puramatrix(3D MATRIX社)、alvetex(reinnavate社)などが挙げられる。
【００３７】
必要に応じて、未分化細胞は、フィーダー細胞と共に培養してもよい。フィーダー細胞の種類は特に限定されず、公知のフィーダー細胞から適宜選択できる。例えば、マウス胚性線維芽細胞(MEF）、マウス胚性線維芽細胞株(STO)、SL10細胞、SNL細胞などが挙げられる。
【００３８】
培養条件は、未分化細胞の種類に応じて適宜調整できる。例えば、培養温度は好ましくは約30〜40℃、二酸化炭素濃度は好ましくは約１〜10％である。
【００３９】
本実施形態の方法では、miRNA測定の試料として、未分化細胞を含む液の液相画分を採取する。未分化細胞を含む液から液相画分を取得する方法は、特に限定されない。液相画分を取得する方法としては、浮遊培養の場合、未分化細胞を含む液を遠心することにより、本実施形態の液相画分として遠心後の上清が取得され得る。細胞は液中で沈降するので、細胞を分散させた上で培養容器の下部から液相画分を取得してもよい。未分化細胞を含む液をフィルターで濾過し、細胞を含む画分と、液相画分とに分離することにより、液相画分を取得してもよい。
【００４０】
接着培養の場合、細胞は培養容器の底部に接着しているので、培養容器内の上清をピペットなどで吸引することで、本実施形態の液相画分を取得できる。
【００４１】
取得した液相画分に細胞が混入している可能性がある場合は、該液相画分を遠心分離又はフィルター濾過することなどによって細胞を分離・除去してもよい。
【００４２】
未分化細胞を含む液から液相画分を取得する時期は、特に限定されない。未分化細胞を生存可能に保持できる液、好ましくは液体培地を収容した培養容器に未分化細胞を播種した後、任意の時点において液相画分を採取できる。また、培地交換後に液相画分を採取してもよい。例えば、培養容器内で培養している未分化細胞から液体培地を除き、未分化細胞を生存可能に保持できる液に培地交換してから１〜168時間後に、液相画分を採取してもよい。あるいは、予め適切に培養した未分化細胞を、未分化細胞を生存可能に保持できる液を収容した別の培養容器に移してから１〜168時間後に、液相画分を採取してもよい。
【００４３】
本実施形態の測定対象となるmiRNAは、miR371、miR372及びmiR373である。miR371は、miR371a及びmiR371bを含むファミリーを形成する。ヒトのmiR371、miR372及びmiR373をコードする遺伝子群は19番染色体に存在し、miR371-373クラスターを形成している。本明細書において、「miR371-373クラスターのmiRNA」とは、これらの遺伝子から転写されたmiRNAを意味する。以下、「miR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAを測定する」ことを、「miR371-373クラスターのmiRNAを測定する」ともいう。
【００４４】
miRNAは、遺伝子から転写された後、pri-miRNA及びpre-miRNAを経て成熟する。本実施形態では、成熟miRNAを測定することが好ましい。miR371a、miR371b、miR372及びmiR373の成熟miRNAのヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１〜４に示す。なお、これらのmiRNAをコードする遺伝子はそれぞれGenBankデータベースにおいて表１のとおり公開されている。
【００４５】
【表１】
2019129747.tif 000003
【００４６】
miRNAの測定方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、プローブのハイブリダイゼーションを利用した測定法、核酸増幅法を利用した測定法、質量分析法を利用した測定法、シークエンシングを利用した測定法などが挙げられる。プローブのハイブリダイゼーションを利用した測定法としては、例えば、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、RNaseプロテクションアッセイなどが挙げられる。核酸増幅法を利用した測定法としては、例えば、定量RT-PCR法、定量RT-LAMP法などが挙げられる。定量RT-PCR法としては、例えば、SYBR(商標)Green法、TaqMan(商標)法などが挙げられる。増幅対象のmiRNAは短いので、核酸増幅を利用した方法においては通常、ステムループプライマーやpoly(A)付加法などが用いられる。
【００４７】
本実施形態の方法では、miRNAの測定値に基づいて、未分化細胞の状態を評価する。miRNAの測定値は、miR371aの測定値、miR371bの測定値、miR372の測定値及びmiR373の測定値のいずれであってもよいし、これらのうちの少なくとも２つの測定値の合計値であってもよい。また、miR371の測定値は、miR371aの測定値、miR371bの測定値、又はこれらの合計値であってもよい。
【００４８】
本明細書において「測定値」は、液相画分中のmiRNAの存在量を反映する値である。例えば、光学的測定値(蛍光強度、濁度、吸光度など)、光学的測定値が所定の基準値に達したときの反応サイクル数又は反応時間、検量線を用いて算出されるmiRNAの定量値(コピー数、質量、濃度)などが挙げられる。所定の基準値は、miRNAの存在量又は濃度を示す値の種類によって適宜設定できる。例えば、定量RT-PCR法を用いる場合、所定のサイクル数を基準値として、核酸増幅反応が対数増幅を示すときの蛍光強度の変化量を設定できる。
【００４９】
多能性幹細胞において、miR371、miR372及びmiR373は、細胞内で特定のmRNAと結合し、タンパク質への翻訳を阻害する機能を有するので、細胞内に存在することは知られている。しかし、miR371、miR372及びmiR373が、多能性幹細胞の細胞外へ放出されることは知られていない。本発明者らは、意外なことに、miR371、miR372及びmiR373が多能性幹細胞の細胞外に放出されることを見出した。特に、プライム型多能性幹細胞よりも、ナイーブ型多能性幹細胞において、より多量のmiR371、miR372及びmiR373が細胞外に放出されることを見出した。よって、本実施形態では、未分化細胞が多能性幹細胞であるとき、miRNAの測定値を、未分化細胞を含む液中におけるナイーブ型多能性幹細胞の存在の指標として用いることができる。
【００５０】
プライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞への誘導操作とは、プライム型未分化細胞をナイーブ型未分化細胞へ誘導するための、プライム型未分化細胞に行う所定の処理をいう。そのような処理としては、例えば、上記の遺伝子導入とその後の細胞培養、誘導培地での培養などが挙げられる。誘導操作中とは、誘導操作の開始後かつ完了前をいう。
【００５１】
上述のように、プライム型多能性幹細胞よりも、ナイーブ型多能性幹細胞の方がより初期胚に近いので、ナイーブ型多能性幹細胞は再生医療において有用と考えられている。誘導の完了まで、すなわちプライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞が得られるまでには、通常、数時間から数週間を要する。本実施形態の方法では、上記miRNAの測定値がナイーブ型多能性幹細胞の存在の指標となるので、誘導操作中の多能性幹細胞の状態をモニターすることができる。この場合、プライム型からナイーブ型への誘導操作中の多能性幹細胞の細胞培養液から液相画分を採取し、該液相画分をmiRNA測定に用いる。
【００５２】
例えば、プライム型未分化細胞からナイーブ型未分化細胞への誘導操作の開始前及び誘導操作中に液相画分のmiRNAを測定し、得られた２つの測定値を比較する。誘導操作の開始前のmiRNA測定値と、誘導操作中のmiRNA測定値との間にあまり差がない場合は、誘導操作が適切に行われていないと判断し、誘導操作を中断できる。誘導操作中のmiRNA測定値が、誘導操作の開始前のmiRNAの測定値よりも高いとき、誘導操作が適切に行われていると判断し、誘導操作を継続できる。あるいは、プライム型多能性幹細胞がナイーブ型多能性幹細胞に誘導されたと判断し、誘導操作を完了してもよい。
【００５３】
別の例では、誘導操作中の複数の時点においてmiR371-373クラスターのmiRNAを測定し、測定値を比較することにより、ナイーブ型への誘導の進行状況をモニターすることができる。具体的には、まず、ナイーブ型への誘導操作中の第１の時刻において細胞培養液から液相画分を採取し、miR371-373クラスターのmiRNAを測定して第１測定値を取得する。次いで、ナイーブ型への誘導操作中の第２の時刻において細胞培養液から液相画分を採取し、miR371-373クラスターのmiRNAを測定して第２測定値を取得する。そして、第１測定値と第２測定値とを比較して、誘導の進行状況を評価できる。例えば、第２測定値が第１測定値よりも高いとき、誘導が適切に行われていると判断し、誘導操作を継続できる。あるいは、プライム型がナイーブ型に誘導されたと判断し、誘導操作を完了してもよい。
【００５４】
さらなる実施形態では、ナイーブ型への誘導操作が完了した後の多能性幹細胞を含む液の液相画分をmiRNA測定に用いる。誘導操作自体が完了しても、多能性幹細胞が全てナイーブ型になったとは限らず、プライム型多能性幹細胞が残存する可能性がある。上述のとおり、プライム型とナイーブ型の多能性幹細胞が混在した細胞集団では、分化誘導の効率にばらつきが生じるので、再生医療に用いる多能性幹細胞としての品質が低下する。そこで、誘導操作が完了した後の細胞集団の品質検査として、miRNAの測定値に基づいて、多能性幹細胞がナイーブ型であるか、又はプライム型が混在するかを判定する。この判定結果は、例えば、多能性幹細胞の品質の評価などに用いることができる。判定は、miRNAの測定値と、所定の閾値との比較により行うことができる。例えば、miRNAの測定値が、第１の閾値以上であるとき、未分化細胞はナイーブ型多能性幹細胞であると判定できる。この場合、誘導後の多能性幹細胞を、再生医療又はそのための研究などに用いるとの判断ができる。miRNAの測定値が、第１の閾値より低いとき、未分化細胞にはプライム型多能性幹細胞が混在すると判定できる。この場合、さらに誘導操作を行うなどの判断ができる。
【００５５】
さらなる実施形態では、プライム型からナイーブ型への誘導中及び誘導の完了後に多能性幹細胞の状態の評価を行うことができる。この場合、誘導の進行状況のモニターと、誘導後の多能性幹細胞の品質検査を行うことができる。
【００５６】
別の実施形態では、本実施形態の方法と、その他の方法とを組み合わせて、未分化細胞がナイーブ型かプライム型かを判定することができる。例えば、コロニーの形態、核内のTFE3局在、本実施形態の方法などを総合的に考慮して判定を行うことができる。別の例では、コロニーの形態、核内のTFE3局在などの方法による判断結果を、本実施形態の方法でバリデートすることができる。
【００５７】
上記のいずれの実施形態においても、プライム型からナイーブ型への誘導開始時に培地を新しい培地に交換する場合は、古い培地をmiRNA測定に用いてもよい。
【００５８】
試験、研究などの目的によっては、プライム型多能性幹細胞が必要な場合もある。さらなる実施形態では、miRNAの測定値に基づいて、多能性幹細胞がプライム型であるか否かを判定する。判定は、miRNAの測定値と、所定の閾値との比較により行うことができる。プライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞に比べて、細胞外へ放出されるmiR371、miR372及びmiR373の量が少ない。よって、所定の閾値は、上記の第１の閾値よりも低い値が好ましい。ここでは、第１の閾値よりも低い所定の閾値を、第２の閾値と呼ぶ。miRNAの測定値が、第２の閾値より低いとき、未分化細胞はプライム型多能性幹細胞であると判定できる。miRNAの測定値が、第２の閾値以上であるとき、未分化細胞にはナイーブ型多能性幹細胞が混在すると判定できる。
【００５９】
所定の閾値は、本実施形態の方法を実施する前に予め設定しておくことが好ましい。例えば、ナイーブ多能性幹細胞のみを含む細胞培養液の液相画分と、プライム型からナイーブ型への誘導操作中の多能性幹細胞を含む細胞培養液の液相画分と、プライム型多能性幹細胞のみを含む細胞培養液の液相画分とを各々複数準備し、各々の液相画分についてmiR371-373クラスターのmiRNAを測定する。そして、ナイーブ型多能性幹細胞のみを含む細胞培養液を最も精度よく分類できる値を、第１の閾値として設定できる。同様に、プライム型多能性幹細胞のみを含む細胞培養液を最も精度よく分類できる値を、第２の閾値として設定できる。
【００６０】
本実施形態には、ナイーブ型多能性幹細胞の存在量を半定量的に検出することを含む。半定量的検出とは、多能性幹細胞の存在量を「-」、「＋」、「＋＋」(陰性、弱陽性、強陽性)などのように段階的に示すことをいう。ナイーブ型多能性幹細胞の半定量的検出は、miRNAの測定値を複数の閾値と比較することにより行うことができる。複数の閾値としては、例えば、上記の第１閾値及び第２の閾値を用いることができる。具体的な判定は、次のとおりである。miRNAの測定値が、第２の閾値より低いとき、ナイーブ型多能性幹細胞が存在しない「-」と判定できる。miRNAの測定値が、第２の閾値以上且つ第１の閾値より低いとき、ナイーブ型多能性幹細胞が少量存在する「＋」と判定できる。miRNAの測定値が、第１の閾値以上のとき、ナイーブ型多能性幹細胞が存在する「＋＋」と判定できる。
【００６１】
［２．試薬キット］
本発明の範囲には、上記の本実施形態の未分化細胞の状態を評価方する方法に用いるための試薬キットも含まれる。本実施形態の試薬キットは、miR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAにハイブリダイズ可能なプライマーを少なくとも１つ含む。該プライマーは、上記miRNAの逆転写反応のためのプライマー(以下、「RTプライマー」ともいう)であってもよいし、上記miRNAから合成されたcDNAを増幅するためのフォワードプライマー及び／又はリバースプライマー(以下、「cDNA増幅用プライマー」ともいう)であってもよい。本実施形態の試薬キットは、RTプライマーと、cDNA増幅用プライマーとの両方を含んでもよい。
【００６２】
プライマーを用いて成熟miRNAを測定する場合、成熟miRNAはヌクレオチド長が短いので、逆転写用プライマー及び／又はcDNA増幅用プライマーとしてステムループプライマーを用いることができる。上記のプライマーは、プレートや粒子などの固相に結合されていてもよい。
【００６３】
本発明の範囲には、下記(１)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、下記(２)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、下記(３)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、及び下記(４)の塩基配列を3’末端側に有するプライマーから選択される少なくとも１つを含む、試薬キットも含まれる。
5’-ACACT-3’  ・・・(１)
5’-GCACT-3’  ・・・(２)
5’-ACGCT-3’  ・・・(３)
5’-ACACC-3’  ・・・(４)
【００６４】
この試薬キットは、上記の本実施形態の未分化細胞の状態を評価する方法に用いてもよい。また、この試薬キットは、後述の増幅産物の検出方法に用いてもよい。
【００６５】
上記(１)〜(４)の塩基配列はそれぞれ、配列番号１〜４の塩基配列の3’末端から５塩基に相補的な配列である。上記のプライマーは、これらの塩基配列を3’末端側に有するので、miR371a、miR371b、miR372及びmiR373の各成熟miRNAにハイブリダイズできる。そして、ポリメラーゼにより、プライマーの3’末端が伸長されて該成熟miRNAの5’末端側の相補鎖が合成される。これらのプライマーにおいては、上記(１)〜(４)の塩基配列の5’末端側に任意の塩基配列を付加してもよい。
【００６６】
これらのプライマーは、RTプライマーであってもよいし、cDNA増幅用プライマーであってもよい。これらのプライマーの形状は、リニアプライマーであってもよいし、ステムループプライマーであってもよい。これらのプライマーは、プレートや粒子などの固相に結合されていてもよい。
【００６７】
上記のいずれの試薬キットも、緩衝液、dNTPs(dATP、dTTP、dGTP及びdCTP)、ポリメラーゼなどの他の試薬を含んでいてもよい。
【００６８】
［３．増幅産物の検出方法］
本発明の範囲には、液相画分に含まれるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAに由来する増幅産物を検出する方法(以下、「検出方法」ともいう)も含まれる。本実施形態の検出方法では、まず、未分化細胞を含む液の液相画分を取得する。未分化細胞、該細胞を含む液、該液の液相画分及び該液相画分の取得に関する詳細は、上記の本実施形態の方法について述べたことと同じである。
【００６９】
次に、液相画分に含まれるmiR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAと、プライマーと、ポリメラーゼとを混合して反応液を調製する。本実施形態では、液相画分からmiRNAを抽出することが好ましい。miRNAの抽出は、公知の方法により行うことができる。例えば、液相画分をフェノール／クロロホルム抽出することにより、miRNAを含むTotal RNAを回収することができる。なお、液相画分からのmiRNAの抽出及び精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
【００７０】
プライマーとしては、逆転写反応のためのプライマー、cDNA増幅用プライマーが挙げられる。miRNAからのcDNAの合成と、cDNAの増幅とを２ステップで、すなわち逐次行う場合、逆転写反応のためのプライマーは、ランダムプライマーであってもよいし、miR371、miR372及びmiR373の各成熟miRNAにハイブリダイズ可能なプライマーであってもよい。miRNAからのcDNAの合成と、cDNAの増幅とを１ステップで、すなわち同時に行う場合、逆転写反応のためのプライマーとして、miR371、miR372及びmiR373の各miRNAにハイブリダイズ可能なプライマーを用いる。cDNA増幅用プライマーとして、上記miRNAから合成されたcDNAを増幅可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いる。各プライマーは、miR371、miR372及びmiR373の各成熟miRNAの塩基配列に応じて適宜設計できる。
【００７１】
ポリメラーゼは、公知の逆転写酵素及び公知のDNAポリメラーゼから適宜選択できる。逆転写酵素としては、例えば、AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素などが挙げられる。DNAポリメラーゼとしては、例えば、Taqポリメラーゼ、Pfuポリメラーゼ、Tthポリメラーゼなどが挙げられる。また、市販のRT-PCRキット又はリアルタイムRT-PCRキットを用いて、反応液を調製してもよい。
【００７２】
本実施形態では、miRNAからのcDNAの合成と、cDNAの増幅とを１テップで行う場合は、例えば、次のようにして反応液を調製できる。液相画分から調製したmiRNAを含む液と、測定対象のmiRNAにハイブリダイズ可能な逆転写用プライマーと、該miRNAから合成されたcDNAを増幅可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーと、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼとを混合する。ここに、緩衝液、dNTPsなどの核酸増幅反応に必要な試薬をさらに加えてもよい。
【００７３】
miRNAからのcDNAの合成と、cDNAの増幅とを２ステップで行う場合は、例えば、次のようにして反応液を調製できる。まず、液相画分から調製したmiRNAを含む液と、逆転写用プライマーと、逆転写酵素とを混合して、逆転写用反応液を調製する。ここに、緩衝液、dNTPsなどの核酸増幅反応に必要な試薬をさらに加えてもよい。そして、逆転写用反応液を用いて逆転写反応を行う。次に、反応完了後の逆転写用反応液と、cDNAを増幅可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーと、DNAポリメラーゼとを混合する。これにより、cDNA増幅用反応液を得ることができる。ここに、緩衝液、dNTPsなどの核酸増幅反応に必要な試薬をさらに加えてもよい。
【００７４】
本実施形態では、調製した反応液中で上記miRNAのcDNAを含むDNA断片を増幅し、増幅産物を検出する。増幅反応は、miRNAの逆転写及びcDNAの増幅に適した公知の条件で行うことができる。また、増幅反応は、市販のサーマルサイクラーやリアルタイムPCR装置を用いて行うことができる。
【００７５】
本明細書において、「検出する」とは、増幅産物の存否を定性的に判定すること、増幅産物を定量すること、及び増幅産物の存在量を半定量的に検出することを含む。半定量的検出とは、増幅産物の存在量を「-」、「＋」、「＋＋」(陰性、弱陽性、強陽性)などのように段階的に示すことをいう。
【００７６】
増幅産物を検出する手段は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択できる。例えば、核酸増幅反応に付した後の反応液から、蛍光強度、濁度、吸光度などの光学的情報を取得することにより、増幅産物を検出してもよい。例えば、SYBR(商標) Greenなどの二本鎖DNAに結合可能な蛍光物質を用いるインターカレーター法により蛍光強度を測定することで、増幅産物を検出してもよい。また、TaqMan(商標)プローブなどの、5'末端を蛍光物質で修飾し且つ3'末端をクエンチャー物質で修飾したプローブを用いる方法により、該プローブから生じた蛍光を検出することで、増幅産物を検出してもよい。そのようなプローブは、検出対象の増幅産物において上記のプライマーがハイブリダイズする領域とは異なる領域にハイブリダイズするように設計される。
【００７７】
例えば、増幅産物が検出されたという結果が得られた場合、その結果は、液相画分に上記miRNAが含まれていることを示す。上述のように、本発明者らは、ナイーブ型多能性幹細胞が、miR371、miR372及びmiR373を細胞外に放出することを見出している。よって、本実施形態では、検出結果は、未分化細胞を含む液におけるナイーブ型多能性幹細胞の存在の指標として用いてもよい。
【００７８】
本実施形態では、液相画分の取得の前に、未分化細胞を含む液中で、該未分化細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導してもよい。例えば、未分化細胞がプライム型多能性幹細胞であるとき、上記の遺伝子導入又は誘導培地での培養により、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導できる。本実施形態では、誘導後の未分化細胞を含む液から採取した液相画分を用いて反応液を調製し、miR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAに由来する増幅産物を検出してもよい。この場合、検出結果は、プライム型からナイーブ型への誘導状況のモニタリングに利用できる。
【００７９】
本発明の別の実施形態は、未分化細胞の細胞培養液の液相画分と、逆転写酵素と、miR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAにハイブリダイズ可能なプライマーと、dNTPsとを含む混合液である。miR371、miR372及びmiR373から選択される少なくとも１つのmiRNAにハイブリダイズ可能なプライマーは、下記(１)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、下記(２)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、下記(３)の塩基配列を3’末端側に有するプライマー、及び下記(４)の塩基配列を3’末端側に有するプライマーから選択される少なくとも１つである。
5’-ACACT-3’  ・・・(１)
5’-GCACT-3’  ・・・(２)
5’-ACGCT-3’  ・・・(３)
5’-ACACC-3’  ・・・(４)
【００８０】
上記の混合液は、miRNAから合成されたcDNAを増幅するためのDNAポリメラーゼをさらに含んでいてもよい。逆転写酵素、DNAポリメラーゼおよびプライマーの詳細については、上述したとおりである。
【００８１】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８２】
実施例１
(１) iPS細胞の調製
実施例１では、iPS細胞として、iPSポータル社より入手したヒトiPS細胞HPS0063(201B7クローン)を用いた。HPS0063細胞はプライム型iPS細胞であり、通常のES/iPS細胞用培地で培養した場合はプライム型が維持される。プライム型iPS細胞は、ReproNaive(商標)などのナイーブ型iPS細胞誘導培地で培養することで、遺伝子導入なしでナイーブ型へ誘導できる。実施例１では、HPS0063細胞を下記の手順で培養して、プライム型iPS細胞及びナイーブ型iPS細胞のそれぞれを得た。
【００８３】
(1.1) プライム型iPS細胞の調製
維持培養培地Stem Fit(商標)AK02N(タカラバイオ社製)に、10 mM Y-27632を終濃度10μMとなるように加えて混合し、培養培地を調製した。調製した培養培地(１mL)を、細胞培養基質iMatrix-511 (nippi社製)で内部をコーティングした６ウェルプレート(Iwaki社製)に添加した。ここに、上記の培養培地で予め培養したiPS細胞(105 cells/1.0 mL)を添加して、CO2インキュベーター内(37℃、５%CO2)で１日間培養した。培養後、培養上清を回収した。図１Ａに、培養後の細胞の明視野像を示す。
【００８４】
(1.2) ナイーブ型iPS細胞の調製
ReproNaive(商標)Basal Medium(５mL, リプロセル社製)に、ReproNaive(商標)Supplement(34.0μL, リプロセル社製)、10μg/mL LIF(10μL)及び10 mM Y-27632(５μL)を加えて、培養培地を調製した。調製した培養培地(１mL)を、SL10フィーダー細胞が播種された６ウェルプレート(Iwaki社製)に添加した。ここに、上記の培養培地で予め培養したiPS細胞(105 cells/1.0 mL)を添加して、CO2インキュベーター内(37℃、５%CO2)で１日間培養した。培養後、培養上清を回収した。図１Ｂに、培養後の細胞の明視野像を示す。
【００８５】
(1.3) 測定サンプルの調製
上記(1.1)で回収した上清50μL及び上記(1.2)で回収した上清50μLを測定サンプルとした。また、ネガティブコントロールとして、細胞を含まず細胞培養に供していない培地Essential 8(Gibco社製)50μLを用いた。
【００８６】
(２) 転写因子TFE3の免疫染色
SL10フィーダー細胞が播種された６ウェルプレート(Iwaki社製)上に、上記(1.1)と同様にしてヒトiPS細胞(201B7株)を培養した。また、iMatrix-511(nippi社製)でコーティングした別の６ウェルプレート上に、上記(1.2)と同様にして201B7株を培養した。これらのウェルプレート上のiPS細胞を２％パラホルムアルデヒド含有PBSで固定した。固定したiPS細胞をPBSで洗浄して、0.5％サポニン及び0.1％BSA含有PBSで透過処理した。そして、iPS細胞を、0.5％サポニン及び0.1％BSA含有PBS溶液で1：50に希釈したAlexa Fluor(商標)647標識ウサギ抗TFE3抗体(ab210650、アブカム社製)の溶液と、1：1000に希釈したHoechst(同仁化学社製)の溶液と共に室温にて30分間インキュベートした。iPS細胞を0.5％サポニン及び0.1％BSA含有PBSで３回洗浄した。このようにして免疫染色したiPS細胞を、イメージング・フローサイトメータ(ImageStreamX MarkII Imaging Flow Cytometer、アムニス社製)で観察した。図２に、核内に局在したTFE3を有する細胞の一例を示す。図２中、左のパネルから明視野像(BF)、核、TFE3及び核/TFE3(Merge)を示す。
【００８７】
(３) TFE3が核内に局在したiPS細胞の計数
上記(２)で免疫染色した６ウェルプレート上の細胞のうち、核内に局在したTFE3を有するiPS細胞を計数し、その割合を算出した。図３に、ナイーブ型iPS細胞及びプライム型iPS細胞のそれぞれについて、核内に局在したTFE3を有する細胞の割合を示す。
【００８８】
(４) 培養上清中のmiRNAの測定
High Pure miRNA isolation kit (Roche Diagnostics社)を用いて、上記(１)で取得した各測定サンプルからTotal RNAを回収した。得られたTotal RNA(1μL)を定量RT-PCRを行い、miR302d、miR367、miR371、miR372及びmiR373をそれぞれ測定した。定量RT-PCRは、TaqMan(商標)MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan(商標)MicroRNA Assays及びTaqMan(商標)Universal Master Mix II、Applied Biosystems(商標)7500fast (Thermo Fisher Scientific社製)を用いて、添付プロトコルに従って行った。図４に、各miRNAについて、プライム型iPS細胞の培養上清における発現量を１とした場合のナイーブ型iPS細胞の培養上清における相対発現量を示す。
【００８９】
(５) 結果
図１Ａに示されるように、プライム型を維持する培養条件下では、iPS細胞は、平坦で大きなコロニーを形成していた。これは、プライム型細胞のコロニーに特徴的な形態であり、プライム型iPS細胞を調製できたことが示された。図１Ｂに示されるように、ナイーブ型に誘導する培養条件下では、iPS細胞は、ドーム状で小さなコロニーを形成していた。これは、ナイーブ型細胞のコロニーに特徴的な形態であり、ナイーブ型iPS細胞を調製できたことが示された。また、図３に示されるように、TFE3の核内局在が、調製したナイーブ型iPS細胞において、プライム型iPS細胞よりも高い割合で認められた。非特許文献１にも記載のように、TFE3は、ナイーブ型iPS細胞では核内に局在し、プライム型iPS細胞では細胞質全体に分散するという特徴がある。これらのことから、本実施例では、ナイーブ型iPS細胞及びプライム型iPS細胞のそれぞれを調製できたことが確認された。
【００９０】
図４に示されるように、プライム型iPS細胞の培養上清に比べて、ナイーブ型iPS細胞の培養上清では、miR371、miR372及びmiR373の量が顕著に多いことがわかった。このことから、未分化細胞の培養上清に含まれるmiR371、miR372及びmiR373の測定値に基づいて、該未分化細胞が、ナイーブ型及びプライム型のいずれの状態にあるかを判定できることが示された。一方、培養上清中のmiR302及びmiR367の量は、プライム型iPS細胞の培養上清と、ナイーブ型iPS細胞の培養上清との間で差が見られなかった。ここで、miR302及びmiR367は、ナイーブ型iPS細胞内での発現量が高いことが知られている。今回の定量測定の結果においても、miR302及びmiR367の測定値は、miR371、miR372及びmiR373よりも高いことが確認されている。このことから、ナイーブ型iPS細胞内でmiRNAの発現量が高かったとしても、必ずしも発現量の高いmiRNAが細胞外に放出されるとは限らず、そのmiRNAを本実施形態の評価方法に利用可能であるとは言えない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
2019129747.tif 000007
【図４】
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【配列表】
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