(57)【要約】【課題】作製に微細加工技術が不要であり、細胞懸濁液を播種する操作のみで細胞凝集塊が簡便かつ安定的に作製できる培養基材を提供する。【解決手段】この発明の細胞培養フィルム１は、基材１１と、基材１１の上に形成された細胞接着層１３とを有する。細胞接着層１３は、カルボキシル基の中和度が５ｍｏｌ％以上２５ｍｏｌ％以下のポリカルボン酸系重合体を含む材料からなる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、
前記基材上に形成され、カルボキシル基の中和度が０を超え２５ｍｏｌ％以下であるポリカルボン酸系重合体を含む材料からなる細胞接着層と、
を有する細胞培養フィルム。
【請求項２】
前記カルボキシル基の中和度が５ｍｏｌ％以上２５ｍｏｌ％以下である請求項１に記載の細胞培養フィルム。
【請求項３】
前記材料はケイ素含有化合物を含む請求項１または２に記載の細胞培養フィルム。
【請求項４】
前記カルボキシル基の中和度が１５ｍｏｌ％以上２５ｍｏｌ％以下である請求項１〜３の何れか１項に記載の細胞培養フィルム。
【請求項５】
前記カルボキシル基は二価の金属イオンにより中和されている請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞培養フィルム。
【請求項６】
前記ポリカルボン酸系重合体がポリアクリル酸である請求項１〜５の何れか１項に記載の細胞培養フィルム。
【請求項７】
前記基材と前記細胞接着層との間にアンカーコート層を有する請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞培養フィルム。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の細胞培養フィルムを有する細胞培養容器。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか１項に記載の細胞培養フィルムで成形された細胞培養容器。
【請求項１０】
請求項１〜７の何れか１項に記載の細胞培養フィルムまたは請求項８および９の何れかに記載の細胞培養容器を用いて細胞凝集塊を作製する細胞凝集塊の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養フィルム、細胞培養容器、及びこれらを用いた細胞凝集塊の作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、創薬や再生医療の分野におけてより生体に近い機能発現を目指し、三次元細胞培養技術の研究が盛んに行われている。
従来の技術としては、培養基材表面への微細加工や、細胞同士が凝集しやすいような容器形状の工夫などが挙げられる。さらには、細胞接着性が低い材料をコーティングした基材を用いた三次元組織形成技術が知られている。
特許文献１、２では、表面に数百ｎｍ〜数十μｍの微細形状を培養容器表面に施した細胞培養容器表面で培養することで細胞凝集塊を形成する例が示されている。
【０００３】
また、特許文献３では、底面が抜けたウェルを用いて、滴下した細胞懸濁液が重力の影響により底面の出口部の下方で広がり、この液適中で細胞凝集塊形成を可能にした例が示されている。
しかし、これらの細胞培養基材は、微細加工技術を必要とし、製法が煩雑である。また、液滴を作製する手法では、作製法に手技上の難しさがあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４１５９１０３号
【特許文献２】特許第５６０７５３５号
【特許文献３】特許第５８４７７３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、作製に微細加工技術が不要であり、細胞懸濁液を播種する操作のみで細胞凝集塊が簡便かつ安定的に作製できる細胞培養基材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明の一態様は、基材と、基材上に形成され、カルボキシル基の中和度が０を超え２５ｍｏｌ％以下であるポリカルボン酸系重合体を含む材料からなる細胞接着層と、を有する細胞培養フィルムを提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の細胞培養フィルムは、基材上に細胞接着層用塗液をコーティングすることで作製できるため、作製に微細加工技術が不要である。また、本発明の細胞培養フィルム上に細胞懸濁液を播種する操作のみで、細胞凝集塊を簡便かつ安定的に作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施形態の細胞培養フィルムの構成を示す断面図である。
【図２】実験１の結果（ＭＣＦ７細胞の観察画像）を示す図である。
【図３】実験２の結果（ＨＴ２９細胞の観察画像）を示す図である。
【図４】実験３の結果（ＨｅｐＧ２細胞の観察画像）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、この発明の実施形態について説明するが、この発明は以下に示す実施形態に限定されない。以下に示す実施形態では、この発明を実施するために技術的に好ましい限定がなされているが、この限定はこの発明の必須要件ではない。
図１に示すように、この実施形態の細胞培養フィルム１は、基材１１と、基材１１の上に形成されたアンカーコート層１２と、アンカーコート層１２の上に形成された細胞接着層１３とで構成されている。細胞接着層１３の上面（基材１１側と反対側の面）は露出している。細胞接着層１３は、カルボキシル基の中和度が０を超え２５ｍｏｌ％以下であるポリカルボン酸系重合体を含む材料からなる。アンカーコート層１２は、基材１１と細胞接着層１３の密着性を高めるために設けられている。
以下に、各構成について詳述する。
【００１０】
〔細胞培養フィルム〕
［基材］
基材１１に使用される材質としては、例えば、プラスチックス類、紙類、ゴム類等が挙げられる。これらの材質の中でも、基材との密着性の観点から、プラスチックス類が好ましい。
プラスチックス類としては、例えば、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、直鎖状低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ４−メチルペンテン、環状ポリオレフィン等のポリオレフィン系重合体、それらの共重合体およびそれらの酸変性物；ポリ酢酸ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体ケン化物、ポリビニルアルコール等の酢酸ビニル系共重合体；ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリε−カプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバリレート等のポリエステル系重合体およびそれらの共重合体；ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン１２、ナイロン６，６６共重合体、ナイロン６，１２共重合体、メタキシレンアジパミド・ナイロン６共重合体等のポリアミド系重合体およびそれらの共重合体；ポリエチレングリコール、ポリエーテルスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリフェニレンオキサイド等のポリエーテル系重合体；ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン等の塩素系またはフッ素系重合体およびそれらの共重合体；ポリメチルアクリレート、ポリエチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル等のアクリル系重合体およびそれらの共重合体；ポリイミド系重合体およびその共重合体；アルキッド樹脂、メラミン樹脂、アクリル樹脂、硝化綿、ポリウレタン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、フェノール樹脂、アミノ樹脂、フッ素樹脂、塗料用エポキシ樹脂等の樹脂；セルロース、澱粉、プルラン、キチン、キトサン、グルコマンナン、アガロース、ゼラチン等の天然高分子化合物およびそれらの混合物等が挙げられる。
【００１１】
基材１１の表面は、接着性の観点から、コロナ処理、火炎処理、プラズマ処理等の表面活性化処理が施されていてもよい。
基材１１の厚さは、その用途などによっても異なるが、通常は５μｍ〜２ｃｍである。基材１１の形態がシートである場合は、５〜８００μｍが好ましく、１０〜５００μｍがより好ましい。基材１１の厚さが上記範囲内であると、作業性および生産性に優れる。
さらに、厚みのある基材を使用した場合、例えば1〜２０００μｍ程度の基材を用いることで、細胞培養フィルム１を熱成型することも可能となる。例えば、ＣＰＰ（無延伸ポリプロピレン）などの樹脂を基材１１として使用することで、後述のように、細胞培養フィルムのみで細胞培養容器を形成することも可能である。
【００１２】
［細胞接着層］
細胞接着層１３は、カルボキシル基の中和度が０を超え２５ｍｏｌ％以下であるポリカルボン酸系重合体を含む材料からなる。細胞接着層１３は、耐水性の観点から、シランカップリング剤、その加水分解物、およびこれらの縮合物からなる群から選択される少なくとも１種のケイ素含有化合物を、さらに含むことが好ましい。また、必要に応じて、ポリカルボン酸系重合体およびケイ素含有化合物以外の他の成分をさらに含有してもよい。
【００１３】
（ポリカルボン酸系重合体）
ポリカルボン酸系重合体とは、分子内に２個以上のカルボキシル基を有する重合体である。ポリカルボン酸系重合体としては、例えばエチレン性不飽和カルボン酸の（共）重合体；エチレン性不飽和カルボン酸と他のエチレン性不飽和単量体との共重合体；アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ペクチン等の分子内にカルボキシル基を有する酸性多糖類が挙げられる。
細胞接着層１３を構成するポリカルボン酸系重合体としては、１種単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
エチレン性不飽和カルボン酸としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸、クロトン酸等が挙げられる。
【００１４】
エチレン性不飽和カルボン酸と共重合可能な他のエチレン性不飽和単量体としては、例えば、エチレン、プロピレン、酢酸ビニル等の飽和カルボン酸ビニルエステル類、アルキルアクリレート類、アルキルメタクリレート類、アルキルイタコネート類、塩化ビニル、塩化ビニリデン、スチレン、アクリルアミド、アクリロニトリル等が挙げられる。
ポリカルボン酸系重合体としては、アクリル酸、マレイン酸、メタクリル酸、イタコン酸、フマル酸およびクロトン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の重合性単量体から誘導される構成単位を含む重合体、または該重合体の２種以上の混合物であることが好ましく、アクリル酸、マレイン酸、メタクリル酸、およびイタコン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の重合性単量体から誘導される構成単位を含む重合体、または該重合体の２種以上の混合物であることが特に好ましい。
【００１５】
なお、該重合体は、単独重合体でもよく共重合体でもよい。該重合体においては、前記アクリル酸、マレイン酸、メタクリル酸およびイタコン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種の重合性単量体から誘導される構成単位の含有量が、重合体を構成する全構成単位の合計に対し、８０ｍｏｌ％以上であることが好ましく、９０ｍｏｌ％以上であることがより好ましく、１００ｍｏｌ％であってもよい。
なお、上記構成単位以外の他の構成単位が含まれる場合には、その他の構成単位としては、例えば前述のエチレン性不飽和カルボン酸と共重合可能なエチレン性不飽和単量体から誘導される構成単位などが挙げられる。
【００１６】
ポリカルボン酸系重合体の数平均分子量は、２，０００〜１０，０００，０００が好ましく、５，０００〜１，０００，０００がより好ましい。数平均分子量が２，０００未満では、耐熱水性を達成できず、熱水によって透明性が悪化したり白化が発生したりするおそれがある。他方、数平均分子量が１０，０００，０００を超えると、ポリカルボン酸系重合体を含むコーティング液の塗工によりフィルム層を形成する際に、粘度が高くなり塗工性が損なわれるおそれがある。
なお、上記数平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により求めた、ポリスチレン換算の数平均分子量である。
【００１７】
また、細胞接着層中のポリカルボン酸系重合体は、カルボキシル基の一部が塩基性化合物で中和されているとよい。塩基性化合物としては、多価金属化合物、一価金属化合物、およびアンモニアからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
また、細胞接着層の耐水性を考慮すると、塩基性化合物として、Ｚｎ、Ｍｇ、Ｃａなどの２価金属を含む化合物（２価の金属イオンが生じる化合物）を用いることが好ましい。カルボキシル基を２価の金属イオンで中和することで、ポリマー同士を架橋させることができ、その結果、細胞接着層の強度が保たれ、安定した細胞培養を行うことができる。
【００１８】
ポリカルボン酸系重合体のカルボキシル基の一部が中和されていることで、細胞接着層の耐水性が向上するとともに、細胞接着層の酸性度が低下するため、培養時に細胞に及ぶ影響を低減することができる。
細胞接着層１３を構成するポリカルボン酸系重合体のカルボキシル基の中和度は０を超え２５ｍｏｌ％以下である。これにより、細胞接着層１３を塗布液のコーティングで作製でき、細胞接着層１３の耐水性も良好になる。この中和度が２５ｍｏｌ％を超えると、細胞接着層１３用塗布液が安定的に得られない。この中和度は５ｍｏｌ％以上２５ｍｏｌ％以下であることが好ましく、１５ｍｏｌ％以上２５ｍｏｌ％以下であることがより好ましい。
【００１９】
（ケイ素含有化合物）
ケイ素含有化合物は、シランカップリング剤、その加水分解物、およびこれらの縮合物からなる群から選択される少なくとも１種である。
なお、シランカップリング剤の加水分解物が縮合したものを、加水分解縮合物とも記す。
【００２０】
シランカップリング剤の具体例としては、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、γ−アミノプロピルトリエトキシシランが挙げられ、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、γ−アミノプロピルトリメトキシシランが好ましい。シランカップリング剤は、一種で用いても、二種以上で用いてもよい。
【００２１】
シランカップリング剤として、テトラメトキシシランやテトラエトキシシラン等のテトラアルコキシシランを用いる場合には、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン等と併用すると、耐水性により優れるため好ましい。
ケイ素含有化合物は、シランカップリング剤自体であってもよく、シランカップリング剤が加水分解した加水分解物でもよく、これらの縮合物であってもよい。
【００２２】
ケイ素含有化合物としては、例えばゾルゲル法を用いて、シランカップリング剤の加水分解および縮合反応を行ったものを用いることができる。
なお、通常シランカップリング剤は、加水分解が容易におこり、また、酸、アルカリ存在下では容易に縮合反応がおこるため、シランカップリング剤のみ、その加水分解物のみ、またはこれらの縮合物のみで存在することは稀である。すなわちケイ素含有化合物は、シランカップリング剤、その加水分解物、およびこれらの縮合物が混在しているものであることが多い。また、加水分解物には、部分加水分解物、完全加水分解物が含まれることが多い。
【００２３】
ケイ素含有化合物としては、少なくとも加水分解縮合物を含むことが好ましい。
ケイ素含有化合物が加水分解縮合物を含む場合には、シランカップリング剤の有するアルコキシ基（ＯＲ）の少なくとも一部が、水酸基に置換され加水分解物となり、さらに該加水分解物が縮合することによって、ケイ素原子（Ｓｉ）が酸素を介して結合した化合物が形成される。この縮合が繰り返されることにより、加水分解縮合物が得られる。
【００２４】
細胞接着層１３にケイ素含有化合物が含まれる場合、ケイ素含有化合物の含有量は、ポリカルボン酸系重合体の質量とケイ素含有化合物の質量との比（ポリカルボン酸系重合体：ケイ素含有化合物）が９９．５：０．５〜８０．０：２０．０となる量であることが好ましい。
ただし、シランカップリング剤以外のケイ素含有化合物の質量は、シランカップリング剤換算の質量である。つまり、ケイ素含有化合物は、通常、シランカップリング剤、その加水分解物、およびこれらの縮合物が混在するが、ケイ素含有化合物の質量は、シランカップリング剤に換算した値、すなわちシランカップリング剤の仕込み量である。
ケイ素含有化合物の含有量が上記範囲内であれば、基材との密着性に優れ、また、冷水にさらされた際に白化せず、耐水性に優れる。
【００２５】
（他の成分）
ポリカルボン酸系重合体の質量とケイ素含有化合物以外の他の成分としては、特に限定されず、各種の添加剤が含まれていてもよい。
添加剤としては可塑剤、樹脂、分散剤、界面活性剤、柔軟剤、安定剤、アンチブロッキング剤、膜形成剤、粘着剤、酸素吸収剤等が挙げられる。
例えば、細胞接着層に可塑剤が含まれる場合には、延伸性を向上させることができる。そのため、可塑剤を加えることでより熱成型も可能となる。例えば、ウェルを２４個有する２４ウェルマイクロプレート、９６個有する９６ウェルマイクロプレートのような形状を有する細胞培養容器を、細胞培養フィルムのみで成型することができる。
【００２６】
可塑剤としては、公知の可塑剤から適宜選択して使用することが可能である。可塑剤の具体例としては、例えば、エチレングリコール、トリメチレングリコール、プロピレングリコール、テトラメチレングリコール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリエチレンオキサイド、ソルビトール、マンニトール、ズルシトール、エリトリトール、グリセリン、乳酸、脂肪酸、澱粉、フタル酸エステルなどを例示することができる。これらは必要に応じて、混合物で用いてもよい。
これらの中でも、延伸性の観点から、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、グリセリン、澱粉が好ましい。
【００２７】
なお、可塑剤として、ポリビニルアルコール等の水酸基を２つ以上有する化合物を含む場合には、その水酸基と、ポリカルボン酸系重合体のカルボキシル基の一部とがエステル結合を形成していてもよい。
添加剤が含まれている場合には、ポリカルボン酸系重合体の質量と添加剤の質量との比（ポリカルボン酸系重合体：添加剤）は、７０：３０〜９９．９：０．１であることが好ましく、８０：２０〜９８：２であることがより好ましい。
【００２８】
（厚さ）
細胞接着層の厚さは、０．０５〜５μｍが好ましい。
（作製方法）
細胞接着層の形成方法としては、例えば、ポリカルボン酸系重合体と溶媒とを含むコーティング液（ｂ）を基材上に塗工し、乾燥することにより形成される。
コーティング液（ｂ）は、必要に応じて、ケイ素含有化合物や他の成分をさらに含んでいてもよい。
【００２９】
コーティング液（ｂ）に用いる溶媒としては、シランカップリング剤を含有する場合には通常、加水分解反応を行うための水が必要であることを除いては、特に限定が無く、水、有機溶媒、水と有機溶媒との混合溶媒等を用いることができる。
有機溶媒としては、炭素数１〜５の低級アルコールおよび炭素数３〜５の低級ケトンからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
有機溶媒として具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。
【００３０】
水と有機溶媒との混合溶媒としては、上述した有機溶媒を用いた混合溶媒が好ましく、水と炭素数１〜５の低級アルコールとの混合溶媒がより好ましい。
混合溶媒としては、水が２０〜９５質量％の量で存在し、該有機溶媒が８０〜５質量％の量で存在する（ただし、水と有機溶媒との合計を１００質量％とする）ものが好ましい。
溶媒としては、ポリカルボン酸系重合体の溶解性、コストの面では水が好ましい。シランカップリング剤の溶解性、コーティング液（ｂ）の塗工性の観点からは、アルコールを含んでいることが好ましい。
【００３１】
コーティング液（ｂ）にケイ素含有化合物が含まれる場合、ポリカルボン酸系重合体の質量と、ケイ素含有化合物の質量との比（ポリカルボン酸系重合体：ケイ素含有化合物）は、９９．５：０．５〜８０．０：２０．０であることが好ましい。
ただし、シランカップリング剤以外のケイ素含有化合物の質量は、シランカップリング剤換算の質量である。つまり、ケイ素含有化合物は、通常シランカップリング剤、その加水分解物、およびこれらの縮合物が混在するが、ケイ素含有化合物の質量は、シランカップリング剤に換算した値、すなわちシランカップリング剤の仕込み量である。
上記範囲では、冷水にさらされた際に白化せず、耐水性に優れるフィルムを得ることができる。
【００３２】
コーティング液（ｂ）においては、塗工性の観点から、コーティング液（ｂ）中のポリカルボン酸系重合体と、好ましくは含まれるケイ素含有化合物と、必要に応じて含まれる他の成分との合計含有量（固形分質量）が、コーティング液（ｂ）の総質量に対して、０．５〜５０質量％であることが好ましく、０．８〜３０質量％であることがより好ましく、１．０〜２０質量％であることが特に好ましい。
コーティング液（ｂ）は、各成分を混合することにより調製できる。
【００３３】
コーティング液（ｂ）がケイ素含有化合物を含み、ケイ素含有化合物が加水分解縮合物を含む場合には、シランカップリング剤を、ポリカルボン酸系重合体および水を含む液に直接混合してコーティング液（ｂ）を調製してもよく、シランカップリング剤に水を加えることによって、加水分解およびそれに続く縮合反応を行い、得られた加水分解縮合物を、ポリカルボン酸系重合体と混合してコーティング液（ｂ）を調製してもよい。
コーティング液（ｂ）の塗工方法としては、特に限定されず、例えばキャスト法、ディッピング法、ロールコーティング法、グラビアコート法、スクリーン印刷法、リバースコート法、スプレーコート法、キットコート法、ダイコート法、メタリングバーコート法、チャンバードクター併用コート法、カーテンコート法等が挙げられる。
【００３４】
基材上にコーティング液（ｂ）を塗工した後、コーティング液（ｂ）の溶媒を乾燥により除去することによって、基材上に細胞接着層が形成される。
乾燥の方法としては特に限定は無く、例えば熱風乾燥法、熱ロール接触法、赤外線加熱法、マイクロ波加熱法等の方法が挙げられ、該方法は単独または組み合わせて行ってもよい。乾燥温度としては特に限定は無いが、溶媒として上述した水や、水と有機溶媒との混合溶媒を用いる場合には、通常は５０〜１６０℃が好ましい。また乾燥の際の圧力は通常は常圧または減圧下で行うことが好ましく、設備の簡便性の観点から常圧で行うことが好ましい。
【００３５】
コーティング液（ｂ）にケイ素含有化合物が含まれる場合には、細胞接着層に含まれるケイ素含有化合物中の縮合物の割合を増加させる目的で、乾燥が終了（または、ほぼ終了）した時点、または後述する熟成処理が終了した時点で熱処理を行ってもよい。
前記熱処理としては通常は、温度１２０〜２４０℃、好ましくは１５０〜２３０℃で、通常は１０秒〜３０分、好ましくは２０秒〜２０分行われる。
なお、前記乾燥および熱処理は、温度等の条件が重複する部分があるが、これらは明確に区別される必要は無く、連続的に行われてもよい。
【００３６】
〔アンカーコート層〕
アンカーコート層１２を構成する材料としては、例えば、アルキッド樹脂、メラミン樹脂、アクリル樹脂、硝化綿、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、フェノール樹脂、アミノ樹脂、フッ素樹脂、エポキシ樹脂、およびカルボジイミド基含有樹脂を用いることができ、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂およびカルボジイミド基含有樹脂等の樹脂が挙げられる。これらの樹脂は、一種単独でも、二種以上を用いてもよい。
【００３７】
前記樹脂としては特に、ポリウレタン樹脂が好ましい。
ポリウレタン樹脂を構成するポリオールとしては、ポリエステル系ポリオールが好ましい。ポリエステル系ポリオールとしては、例えば多価カルボン酸等とグリコール類とを反応させて得られるポリエステル系ポリオールが挙げられる。
ポリウレタン樹脂を構成するポリイソシアネートとしては、例えば２，４−トリレンジイソシアネート、２，６−トリレンジイソシアネート、ｍ−フェニレンジイソシアネート、ｐ−フェニレンジイソシアネート、４，４'−ジフェニルメタンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートが挙げられる。
【００３８】
アンカーコート層は、細胞接着層との密着性の点から、カルボジイミド基含有樹脂を含んでいてもよい。
必要に応じて、前記の樹脂に、硬化剤、シランカップリング剤等の添加物が添加されていてもよい。シランカップリング剤としては、前記と同様のものが挙げられる。
アンカーコート層の厚みは、密着性と外観の観点から、０．０１〜１μｍであることが好ましく、０．０５〜１μｍであることがより好ましい。
アンカーコート層の単位面積当たりの質量は、０．０１〜１ｇ／ｍ２であることが好ましく、０．０５〜１ｇ／ｍ２であることがより好ましい。
【００３９】
アンカーコート層の形成方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択できる。例えば、アンカーコート剤を塗工し、乾燥することによりアンカーコート層を形成できる。
アンカーコート層を形成するために用いるアンカーコート剤としては、前述の樹脂またはその前駆体と、溶媒と、必要に応じて添加剤を含むものが挙げられる。樹脂またはその前駆体としては、ポリウレタン系、ポリエステル系またはアクリル系のポリマー材料が好ましく、中でも、ポリウレタン系ポリマー材料である、ポリエステル系ポリオールを含有する主剤と、イソシアネートを含有する硬化剤からなる二液型のアンカーコート剤が好ましい。
【００４０】
アンカーコート層を設ける場合には、基材１１上にアンカーコート剤を塗工し、乾燥することでアンカーコート層１２を形成した後、コーティング液（ｂ）を塗工し、乾燥して細胞接着層１３を形成する。その後、熟成処理を行ってもよい。熟成処理としては、通常３０〜２００℃、好ましくは３０〜１５０℃の温度条件で、０．５〜１０日、好ましくは１〜７日間保持する処理が挙げられる。
また、アンカーコート層１２は、蒸着法により形成された無機材料からなる層でもよい。
無機蒸着層を構成する無機材料としては、例えば、アルミニウム、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化ケイ素、酸化錫等が挙げられる。無機材料は、必要に応じて、１種または２種以上が組み合わせられて用いられる。
【００４１】
酸化アルミニウムは、アルミニウム（Ａｌ）と酸素（Ｏ）の存在比がモル比で、Ａｌ：Ｏ＝１：１．５〜１：２．０であることが好ましい。例えば、酸化アルミニウム蒸着層は、アルミニウムを蒸着材料にして、酸素、炭酸ガスと不活性ガス等との混合ガスの存在下、薄膜形成を行う反応性蒸着、反応性スパッタリング、反応性イオンプレーティング等により形成することができる。この時、アルミニウムを酸素と反応させれば、化学量論的にはＡｌ２Ｏ３であることから、アルミニウム（Ａｌ）と酸素（Ｏ）の存在比がモル比で、Ａｌ：Ｏ＝１：１．５であるはずである。
しかしながら、蒸着方法によって、一部アルミニウムのまま存在するものや、または、過酸化アルミニウムで存在するものもあり、Ｘ線光電子分光分析装置（ＸＰＳ）等を用いて、酸化アルミニウム蒸着層の元素の存在比を測定すると、一概に、アルミニウム（Ａｌ）と酸素（Ｏ）の存在比がモル比で、Ａｌ：Ｏ＝１：１．５とは言えないことが分かる。
【００４２】
一般に、アルミニウム（Ａｌ）と酸素（Ｏ）の存在比がモル比で、Ａｌ：Ｏ＝１：１．５よりも酸素量が少なく、アルミニウム量が多い場合、酸化アルミニウム蒸着層は緻密になるが、酸化アルミニウム蒸着層は黒く着色し、光線透過量が低くなる傾向がある。一方、アルミニウム（Ａｌ）と酸素（Ｏ）の存在比がモル比で、Ａｌ：Ｏ＝１：１．５よりも酸素量が多く、アルミニウム量が少ない場合、酸化アルミニウム蒸着層は疎になるため、光線透過量が高く透明となる。
酸化ケイ素は、特に無機蒸着層に耐水性が必要とされる場合に好適に用いられる。
【００４３】
無機蒸着層の厚さは、用途によっても異なるが、５〜３００ｎｍであることが好ましく、１０〜５０ｎｍであることがより好ましい。無機蒸着層の厚さが前記範囲の下限値以上であれば、無機蒸着層の連続性が良好であり、無機蒸着層の厚さが前記範囲の上限値以下であれば、無機蒸着層の柔軟性（可撓性）が優れ、折り曲げ、引っ張り等の外的要因による亀裂が生じにくい。
無機蒸着層の厚さは、たとえば、蛍光Ｘ線分析装置を用いて、事前に同様のサンプルを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）にて測定し得た検量線の結果から算出することができる。
【００４４】
無機蒸着層を形成する方法としては、公知の種々の蒸着方法を用いることができる。例えば、真空蒸着法、スパッタリング法、イオンプレーティング法、化学気相成長法等が挙げられる。
真空蒸着法による真空蒸着装置の加熱手段としては、電子線加熱方式、抵抗加熱方式、誘導加熱方式等が好ましく用いられる。また、基材に対する無機蒸着層の密着性および無機蒸着層の緻密性を向上させるためには、前記の加熱手段に加えて、プラズマアシスト法やイオンビームアシスト法を用いることもできる。
蒸着の際、無機蒸着層の透明性を上げるために、酸素ガス等を吹き込んだりする反応蒸着を行ってもよい。
【００４５】
〔細胞培養容器〕
実施形態の細胞培養フィルムを有する細胞培養容器としては、容器本体（容器の形態を保持するもの）と細胞培養フィルムとで構成されたものと、細胞培養フィルムのみで構成されたものが挙げられる。
容器本体としては、例えば、培養用のシャーレ又はディッシュ、マルチウェルプレート、フラスコ、チャンバースライド等が挙げられる。
【００４６】
容器本体と細胞培養フィルムを一体化する方法としては種々の方法があるが、例えば、細胞培養フィルムを、既存の細胞培養容器の底面積に合わせて切り出し、無毒性かつ透明性のある接着剤や両面テープなどを用いて接合して使用する。
また、厚手の無延伸ポリプロピレンなどからなる基材１１上に細胞接着層１３を形成した細胞培養フィルム１を、別に作製した鋳型を用いて目的の形状に熱成型することで、細胞培養フィルムのみで構成された細胞培養容器を作製することも可能である。
【００４７】
〔使用方法、作用効果〕
上述した細胞培養フィルム上又は細胞培養容器の細胞培養フィルム上に、凝集塊を形成したい細胞を播種し、培養することで、細胞は分裂を繰り返し、三次元立体状の細胞凝集塊（スフェロイド）となる。
細胞としては、間葉系細胞、肝細胞、線維芽細胞、内皮細胞、神経細胞、心筋細胞、グリア細胞、角膜上皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞等の正常な細胞や、癌細胞由来細胞株(例えば、ＭＣＦ７、ＨｅｐＧ２、ＨＴ２９)や、イモータライズ(不死化)された細胞や染色体異常を有する細胞等の異常な細胞を用いることができる。
【００４８】
細胞凝集塊形成環境(培養条件)は、用いる細胞種に適した環境であればよい。培養に使用する培地は、かかる目的の細胞の種別に応じて当業者であれば適宜調製して使用することができる。また、培養時間についても用いられる細胞種、細胞数、あるいは目的の大きさによって任意に選定してよい。培養温度についても目的とするものに適した条件であればよい。さらに、播種する細胞数については、培養環境によって任意に設定することができ、例えば１×１０3〜１０6個で実施することができる。
【００４９】
また、実施形態の細胞培養フィルムおよび細胞培養容器を用いて得られる細胞凝集塊は、一部が細胞培養フィルムに接着（固定）しているため、培地交換の際に細胞培養容器内にとどまり、回収の際には強めのピペッティングを行うことにより細胞にダメージを与えず、凝集塊のまま回収することが可能である。
さらに、実施形態の細胞培養フィルムは、溶液のｐＨにより基材１１の表面を構成する樹脂の側鎖の電荷状態を変化させることで細胞凝集塊を剥離させ、回収することが可能である。
【００５０】
すなわち、実施形態の細胞培養フィルムを用いることで、細胞の増殖率が高くかつ、細胞の回収が容易となる。また、本実施形態の細胞培養フィルムを成形した細胞培養容器でも同様の効果を得ることができる。
実施形態の細胞培養フィルムおよび細胞培養容器を用いて得られる細胞凝集塊は、主に、単一の細胞が分裂することで生じたクローン細胞によって構成される。通常、生体内にできる癌細胞は、従来技術の細胞凝集塊のように複数の細胞が凝集してなるものではなく、単一細胞が分裂して形成されるため、実施形態の細胞培養フィルムおよび細胞培養容器を用いることで、生体内にできる癌細胞により近い性質の細胞凝集塊を培養することができ、より角度の高いスクリーニングを行うことができる。
【００５１】
また、実施形態の細胞培養フィルムおよび細胞培養容器を用いて得られる細胞凝集塊は、薬剤のスクリーニングのために使用することができる。すなわち、化学物質、薬剤等を添加し、細胞凝集塊を形成する細胞に対してなんらかの効果を有するものをスクリーニングすることができる。
また、実施形態の細胞培養フィルムおよび細胞培養容器を用いて得られる細胞凝集塊は、細胞の代謝活性評価に用いることができる。例えば、ＨｅｐＧ２などを用いて、肝ガン細胞のアルブミン産生能などを評価することができる。
【００５２】
さらに、実施形態の細胞培養フィルムおよび細胞培養容器を用いて得られる細胞凝集体は、疾病の悪性度鑑別のために使用することもできる。すなわち、生体から採取した組織片や腫瘍片を、細胞ごとに分散させた後、細胞凝集体とする過程において増殖能を評価したり、細胞凝集体からの遊離細胞の有無を評価したりすることにより、癌転移脳を評価することができる。
また、実施形態の細胞培養フィルムおよび細胞培養容器を用いて得られる細胞凝集体は、再生医療のために使用することもできる。すなわち、健常な組織より採取した細胞より、細胞凝集体を調製し、かかる細胞凝集体を患者や治療を要する動物の当該組織に直接的又は間接的に注入することで、当該組織の機能の維持・再生に使用することができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例および比較例について説明する。
〔細胞培養フィルムの作製〕
＜実施例１＞
ポリエステル系主剤（三井化学ポリウレタン株式会社製  タケラック  Ａ５２５：固形分濃度５０質量％）と硬化剤（三井化学ポリウレタン株式会社製  タケネート  Ａ５２：固形分濃度７５質量％）とを、質量比（主剤／硬化剤）が９／１となるようにして溶媒（酢酸エチル）に溶解させて、固形分濃度５質量％のアンカーコート層用コーティング液(a-1)を得た。
得られたコーティング液(a-1)を、ポリエステルフィルム（東レ株式会社製  ルミラーＰ６０：厚さ１２μｍ）からなる基材１１上に、乾燥後の単位面積当たりの質量が０．２０ｇ／ｍ2、厚さが０．２μｍとなるようにバーコーター（ＲＫ  Ｐｒｉｎｔ−Ｃｏａｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製  Ｋ３０３  バー）を用いて塗工し、ドライヤーで乾燥することで、アンカーコート層１２を形成した。
【００５４】
数平均分子量２００，０００のポリアクリル酸（東亞合成株式会社製  アロン  Ａ−１０Ｈ：２５質量％水溶液）８０ｇを蒸留水１１９．４３ｇで溶解し、酸化亜鉛（和光純薬製）０．５７ｇを加えてポリアクリル酸のカルボキシル基の５モル％を中和した後、蒸留水を加えて固形分濃度を１０質量％に調製し、コーティング液（ｂ−１）を得た。
次に、上記コーティング液（ｂ−１）２４．３ｇに蒸留水３７．６ｇを加え充分に撹拌した後に、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ、信越シリコーン社製）０．１５ｇを添加し、１時間かけて加水分解および縮合反応を行った後、ＩＰＡ（イソプロピルアルコール）を３８．０ｇ加えて攪拌し、細胞接着層用コーティング液（ｂ−２）を得た。
【００５５】
アンカーコート層１２上に、コーティング液（ｂ−2）を、前記バーコーターを用いて、乾燥後の単位面積当たりの質量が０．４０ｇ／ｍ2、厚さが０．３μｍとなるように塗工し乾燥することにより、細胞接着層１３を形成した。
このようにして、基材１１上にアンカーコート層１２を介して、カルボキシル基の中和度が５モル％であるポリアクリル酸からなる細胞接着層１３が形成された細胞培養フィルム１が得られた。つまり、カルボキシル基の中和度が５モル％であるポリアクリル酸を塗液化および手塗りで塗膜化することができた。
【００５６】
＜実施例２＞
以下の方法でコーティング液（ｂ−１）を得た以外は実施例１と同じ方法で、細胞培養フィルム１を作製した。
コーティング液（ｂ−１）は、数平均分子量２００，０００のポリアクリル酸（東亞合成株式会社製  アロンＡ−１０Ｈ：２５質量％水溶液）８０ｇを蒸留水１１８．８７ｇで溶解し、酸化亜鉛（和光純薬製）１．１３ｇを加えてポリアクリル酸のカルボキシル基の１０モル％を中和した後、蒸留水を加えて固形分濃度を１０質量％に調製して得た。
これにより、基材１１上にアンカーコート層１２を介して、カルボキシル基の中和度が１０モル％であるポリアクリル酸からなる細胞接着層１３が形成された細胞培養フィルム１が得られた。つまり、カルボキシル基の中和度が１０モル％であるポリアクリル酸を塗液化および手塗りで塗膜化することができた。
【００５７】
＜実施例３＞
以下の方法でコーティング液（ｂ−１）を得た以外は実施例１と同じ方法で、細胞培養フィルム１を作製した。
コーティング液（ｂ−１）は、数平均分子量２００，０００のポリアクリル酸（東亞合成株式会社製  アロン  Ａ−１０Ｈ：２５質量％水溶液）８０ｇを蒸留水１１８．３０ｇで溶解し、酸化亜鉛（和光純薬製）１．７０ｇを加えてポリアクリル酸のカルボキシル基の１５モル％を中和した後、蒸留水を加えて固形分濃度を１０質量％に調製して得た。
これにより、基材１１上にアンカーコート層１２を介して、カルボキシル基の中和度が１５モル％であるポリアクリル酸からなる細胞接着層１３が形成された細胞培養フィルム１が得られた。つまり、カルボキシル基の中和度が１５モル％であるポリアクリル酸を塗液化および手塗りで塗膜化することができた。
【００５８】
＜実施例４＞
以下の方法でコーティング液（ｂ−１）を得た以外は実施例１と同じ方法で、細胞培養フィルム１を作製した。
コーティング液（ｂ−１）は、数平均分子量２００，０００のポリアクリル酸（東亞合成株式会社製  アロン  Ａ−１０Ｈ：２５質量％水溶液）８０ｇを蒸留水１１７．７４ｇで溶解し、酸化亜鉛（和光純薬製）２．２６ｇを加えてポリアクリル酸のカルボキシル基の２０モル％を中和した後、蒸留水を加えて固形分濃度を１０質量％に調製して得た。
これにより、基材１１上にアンカーコート層１２を介して、カルボキシル基の中和度が２０モル％であるポリアクリル酸からなる細胞接着層１３が形成された細胞培養フィルム１が得られた。つまり、カルボキシル基の中和度が２０モル％であるポリアクリル酸を塗液化および手塗りで塗膜化することができた。
【００５９】
＜実施例５＞
以下の方法でコーティング液（ｂ−１）を得た以外は実施例１と同じ方法で、細胞培養フィルム１を作製した。
コーティング液（ｂ−１）は、数平均分子量２００，０００のポリアクリル酸（東亞合成株式会社製  アロン  Ａ−１０Ｈ：２５質量％水溶液）８０ｇを蒸留水１１７．１７ｇで溶解し、酸化亜鉛（和光純薬製）２．８３ｇを加えてポリアクリル酸のカルボキシル基の２５モル％を中和した後、蒸留水を加えて固形分濃度を１０質量％に調製して得た。
これにより、基材１１上にアンカーコート層１２を介して、カルボキシル基の中和度が２５モル％であるポリアクリル酸からなる細胞接着層１３が形成された細胞培養フィルム１が得られた。つまり、カルボキシル基の中和度が２５モル％であるポリアクリル酸を塗液化および手塗りで塗膜化することができた。
【００６０】
＜実施例６＞
実施例２で作製したカルボキシル基の中和度が１０モル％であるポリアクリル酸を含むコーティング液（ｂ−２）を、バーコーターによる手塗りではなく、機械による塗工でアンカーコート層１２上に塗布して、細胞接着層１３を形成した。機械としてはグラビアコーターを用いた。これ以外は実施例１と同じ方法で細胞培養フィルム１を作製した。
＜実施例７＞
実施例４で作製したカルボキシル基の中和度が２０モル％であるポリアクリル酸を含むコーティング液（ｂ−２）を用いた以外は、実施例６と同じ方法で細胞培養フィルム１を作製した。
【００６１】
＜比較例１＞
以下の方法でコーティング液（ｂ−１）を得た以外は実施例１と同じ方法で、細胞培養フィルムを作製した。
コーティング液（ｂ−１）は、数平均分子量２００，０００のポリアクリル酸（東亞合成株式会社製  アロンＡ−１０Ｈ：２５質量％水溶液）８０ｇを蒸留水１２０ｇで溶解した後、蒸留水を加えて固形分濃度を１０質量％に調製して得た。
【００６２】
これにより、基材１１上にアンカーコート層１２を介して、カルボキシル基の中和度が０であるポリアクリル酸からなる細胞接着層が形成された細胞培養フィルムが得られた。つまり、カルボキシル基の中和度が０であるポリアクリル酸を塗液化および手塗りで塗膜化することができた。しかし、耐水性が低く、細胞接着性試験で培養液を添加した直後に膨潤する様子が見られ、細胞接着性試験に耐えられる塗膜ではないことが分かった。
【００６３】
＜比較例２＞
以下の方法でコーティング液（ｂ−１）を作製し、実施例１と同じ方法で細胞培養フィルムを作製することを試みた。
数平均分子量２００，０００のポリアクリル酸（東亞合成株式会社製  アロン  Ａ−１０Ｈ：２５質量％水溶液）８０ｇを蒸留水１１６．６１ｇで溶解し、酸化亜鉛（和光純薬製）３．３９ｇを加えてポリアクリル酸のカルボキシル基の３０モル％を中和することを試みたが、酸化亜鉛の一部は溶解されなかった。この状態で、蒸留水を加えて固形分濃度を１０質量％に調製して、コーティング液（ｂ−１）を得た。
【００６４】
このコーティング液（ｂ−１）に対し、２４．３ｇに蒸留水３７．６ｇを加え充分に撹拌した後に、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ、信越シリコーン社製）０．１５ｇを添加し、１時間かけて加水分解および縮合反応を行った後、ＩＰＡを３８．０ｇ加えて攪拌し、コーティング液（ｂ−２）を作製することを試みた。しかし、酸化亜鉛の一部が溶解されていない状態であり、均一な塗液とすることができなかった。
つまり、カルボキシル基の中和度が３０ｍｏｌ％であるポリアクリル酸を塗液化および塗膜化することはできなかった。
実施例１〜６および比較例１、２の細胞培養フィルムの状態を下記の表１にまとめて示す。
【００６５】
【表１】
2019004739.tif 000003
【００６６】
この結果から、カルボキシル基の中和度が５ｍｏｌ％以上２５ｍｏｌ％以下であるポリアクリル酸にγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランが添加されたコーティング液（ｂ−２）により安定的な塗液が得られ、これを用いて形成された塗膜は耐水性にも優れていることが分かる。
〔細胞培養フィルムを用いた細胞接着性試験〕
以下の各実験では、細胞調製、形態観察、生存数評価を以下の方法で行った。
【００６７】
（細胞調製）
培養液としては、１０ｖｏｌ／ｖｏｌ％ウシ血清(Ｃｏｒｎｉｎｇ社製  ＃３５−０１０−ＣＶ)、１ｖｏｌ／ｖｏｌ％ペニシリンストレプトマイシン(和光純薬社製  １６８−２３１９１)、１ｖｏｌ／ｖｏｌ％非必須アミノ酸溶液(和光純薬社製  １３９−１５６５１)を含有するＤ−ＭＥＭ(和光純薬社製  ０４３−３００８５)を用いた。
各試験で用いる細胞を、１０ｃｍシャーレ(住友ベークライト社製)にて３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養し、サブコンフルエントになった時点で細胞を剥離し、細胞懸濁液を作製した。次に、２４ｗｅｌｌマイクロプレート(表面処理なし)(ＩＷＡＫＩ製  １８２０−０２４)を用意し、各ウェルの底面積の大きさで切り出した細胞培養フィルムを、各ウェルの底面に両面テープを用いて貼り付けた。細胞数計測の後、１ウェルあたり１×１０5個になるように５００μＬずつ播種した。
【００６８】
（形態観察）
細胞播種後１日、4日後(又は５日後)の細胞形態を観察し、細胞凝集塊の形成について評価した。なお、細胞凝集塊（スフェロイド）の形成と伸展している細胞は目視で判別した。
○・・・細胞凝集塊形成有り
△・・・一部細胞凝集塊形成有り
×・・・細胞凝集塊形成無し
【００６９】
（細胞生存性の評価）
細胞の生存性を評価するために、MTT細胞数測定キット（ナカライテスク株式会社）を使用して生細胞数を測定した。
具体的には、細胞播種後から、６時間、１日後、５日後の生細胞数を測定した。MTT試薬を５０μLずつウェルに入れ、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で２．５時間呈色反応を行った後、可溶化溶液を５００μＬずつ添加し、沈殿したホルマザンをピペッティングにて溶解したのち、プレートリーダーを用いて、５７０ｎｍの吸光度値(リファレンス６５０ｎｍ)を測定した。同時に作製した検量線を用いて、吸光度から細胞数を求めた。
すなわち、細胞の形態に関わらず測定ウェル中の生細胞数を求めた。
【００７０】
（増殖率評価）
また、実施形態の細胞培養フィルムを用いて培養した細胞が増殖しているかを確認するため、下記式で増殖率を算出した。増殖率が１を超えていれば、細胞が増殖しているといえる。
増殖率＝５日後の生細胞数÷１日後の生細胞数
【００７１】
＜実験１：ＭＣＦ７(ヒト乳がん由来)細胞を使用した実験＞
＜実験１−１＞
実施例３で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が手塗り形成で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が１５モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＭＣＦ７細胞を培養したところ、１日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、７．５０×１０4個、８．８０×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．１７倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００７２】
＜実験１−２＞
実施例４で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が手塗り形成で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が２０モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＭＣＦ７細胞を培養したところ、１日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、８．５０×１０4個、９．３０×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．０９倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００７３】
＜実験１−３＞
実施例５で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が手塗り形成で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が２５モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＭＣＦ７細胞を培養したところ、１日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、９．３０×１０4個、１．２０×１０5個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．２９倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００７４】
＜実験１−４＞
実施例６で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が機械塗工で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が１０モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＭＣＦ７細胞を培養したところ、１日後の形態観察時に一部細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、６．５４×１０4個、９．２０×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．４１倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００７５】
＜実験１−５＞
実施例７で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が機械塗工で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が２０モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＭＣＦ７細胞を培養したところ、１日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、７．４８×１０4個、８．８５×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．１８倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
なお、実験１−１〜１−５の形態観察結果から、ＭＣＦ７細胞においては、１日後では細胞凝集塊の形成が確認できたが、４日後には伸展が優位になることが分かった。
【００７６】
＜実験１−６＞
マイクロプレートの各ウェルの底面に５％ＢＳＡを５００μＬ添加し、室内で１時間インキュベートした。その後、５％ＢＳＡ溶液を取り除いてから、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）１ｍＬで２回洗浄した。これにより、ＢＳＡがコーティングされた細胞非吸着底面を有する細胞培養容器を得た。
この細胞培養容器を使用してＭＣＦ７細胞を培養したところ、１日後、４日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、５．５０×１０4個、４．３０×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は０．７８倍であり、細胞増殖が低下していることが分かった。
【００７７】
＜実験１−７＞
ＯＲＧＡＮＯＧＥＮＩＸ社製の三次元培養プレートＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ  （ＮＣＰ）（ＮＣＰ−ＨＳ２４）を用いて、ＭＣＦ７細胞を培養したところ、１日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、１．００×１０５個、２．５０×１０5個であった。また、１日後から５日後の増殖率は２．５０倍であり、細胞増殖性を確認した。なお、形態観察結果から、ＭＣＦ７細胞においては、１日後では細胞凝集塊の形成が確認できたが、４日後には伸展が優位になることが分かった。
【００７８】
＜実験１−８＞
組織培養用マイクロプレート(表面処理有り)（３８２０−０２４）（ＩＷＡＫＩ社製)を使用して、ＭＣＦ７細胞を培養したところ、形態観察時に細胞凝集塊は形成せず、伸展している様子を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．０５×１０5個、１．７０×１０5個、６．００×１０5個であった。また、１日後から５日後の増殖率は３．５３倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００７９】
＜実験１−９＞
実施例７で作製した細胞培養フィルムの細胞接着層１３の上面に対して、酸化亜鉛等の多価金属化合物を含有するコーティング液を塗布してトップコート層（通常バリア性フィルムとして用いられるフィルムと同様の組成の層）を形成することで、図１の細胞培養フィルム１の細胞接着層１３の上面が覆われた積層体を得た。
この積層体の基板１１側をマイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＭＣＦ７細胞を培養したところ、形態観察時に細胞凝集塊は形成せず、浮遊している様子が見られた。なお、生存試験については実施しなかった。
【００８０】
＜実験２：ＨＴ２９(ヒト大腸がん由来)細胞を使用した実験＞
＜実験２−１＞
実施例１で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が手塗り形成で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が５モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨＴ２９細胞を培養したところ、５日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、６．５４×１０4個、９．２０×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．４１倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００８１】
＜実験２−２＞
実施例２で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が手塗り形成で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が１０モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨＴ２９細胞を培養したところ、５日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、７．４８×１０4個、８．８５×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．１８倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００８２】
＜実験２−３＞
実施例４で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が手塗り形成で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が２０モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨＴ２９細胞を培養したところ、５日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、９．４０×１０4個、１．１７×１０5個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．２４倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００８３】
＜実験２−４＞
実施例６で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が機械塗工で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が１０モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨＴ２９細胞を培養したところ、５日後の形態観察時に一部細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、７．００×１０4個、８．５０×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．２１倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００８４】
＜実験２−５＞
実施例７で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が機械塗工で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が２０モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨＴ２９細胞を培養したところ、５日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、７．５０×１０4個、９．００×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．２０倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００８５】
＜実験２−６＞
マイクロプレートの各ウェルの底面に５％ＢＳＡを５００μＬ添加し、室内で１時間インキュベートした。その後、５％ＢＳＡ溶液を取り除いてから、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）１ｍＬで２回洗浄した。これにより、ＢＳＡがコーティングされた細胞非吸着底面を有する細胞培養容器を得た。
この細胞培養容器を使用してＨＴ２９細胞を培養したところ、５日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．０×１０5個、４．３６×１０4個、３．５７×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は０．８２倍であり、細胞増殖が低下していることが分かった。
【００８６】
＜実験２−７＞
ＯＲＧＡＮＯＧＥＮＩＸ社製の三次元培養プレートＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ  （ＮＣＰ）（ＮＣＰ−ＨＳ２４）を使用して、ＨＴ２９細胞を培養したところ、５日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、１．００×１０５個、２．１１×１０5個であった。また、１日後から５日後の増殖率は２．１１倍であり、本発明で作製した細胞培養フィルム上で培養した場合と同等の細胞増殖性を確認した。
【００８７】
＜実験２−８＞
組織培養用マイクロプレート(表面処理有り)（３８２０−０２４）（ＩＷＡＫＩ社製)を使用して、ＨＴ２９細胞を培養したところ、形態観察時に細胞凝集塊は形成せず、伸展している様子を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．１６×１０5個、１．６５×１０５個、６．１８×１０5個であった。また、１日後から５日後の増殖率は３．７５倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００８８】
＜実験２−９＞
実施例７で作製した細胞培養フィルムの細胞接着層１３の上面に対して、酸化亜鉛等の多価金属化合物を含有するコーティング液を塗布してトップコート層（通常バリア性フィルムとして用いられるフィルムと同様の組成の層）を形成することで、図１の細胞培養フィルム１の細胞接着層１３の上面が覆われた積層体を得た。
この積層体の基板１１側をマイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨＴ２９細胞を培養したところ、形態観察時に細胞凝集塊は形成せず、浮遊している様子が見られた。なお、生存試験については実施しなかった。
【００８９】
＜実験３：ＨｅｐＧ２(ヒト肝臓がん由来)細胞を使用した実験＞
＜実験３−１＞
実施例３で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が手塗り形成で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が１５モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨｅｐＧ２細胞を培養したところ、４日後の形態観察時に一部細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、６．８０×１０4個、９．５０×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．４０倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００９０】
＜実験３−２＞
実施例４で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が手塗り形成で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が２０モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨｅｐＧ２細胞を培養したところ、５日後の形態観察時に一部細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、８．３０×１０4個、１．３０×１０5個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．５７倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００９１】
＜実験３−３＞
実施例５で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が手塗り形成で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が２５モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨｅｐＧ２細胞を培養したところ、４日後の形態観察時に一部細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、９．５０×１０4個、１．５０×１０5個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．５８倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００９２】
＜実験３−４＞
実施例６で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が機械塗工で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が１０モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨｅｐＧ２細胞を培養したところ、細胞凝集塊の形成を確認することができなかった。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、６．５０×１０4個、８．７０×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．３４倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００９３】
＜実験３−５＞
実施例７で作製した細胞培養フィルム（細胞接着層が機械塗工で、細胞接着層を形成するポリアクリル酸のカルボキシル基中和度が２０モル％）を、マイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨｅｐＧ２細胞を培養したところ、４日後の形態観察時に一部細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、７．２０×１０4個、８．５０×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は１．１８倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
なお、形態観察結果から、ＨｅｐＧ２細胞においては、１日後では細胞凝集塊の形成が確認されなかったが、４日後には徐々に凝集している様子が観察された。
【００９４】
＜実験３−６＞
マイクロプレートの各ウェルの底面に５％ＢＳＡを５００μＬ添加し、室内で１時間インキュベートした。その後、５％ＢＳＡ溶液を取り除いてから、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）１ｍＬで２回洗浄した。これにより、ＢＳＡがコーティングされた細胞非吸着底面を有する細胞培養容器を得た。
この細胞培養容器を使用してＨｅｐＧ２細胞を培養したところ、４日後の形態観察時に細胞凝集塊の形成を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、５．３０×１０4個、４．５０×１０4個であった。また、１日後から５日後の増殖率は０．８５倍であり、細胞増殖が低下していることが分かった。
【００９５】
＜実験３−７＞
ＯＲＧＡＮＯＧＥＮＩＸ社製の三次元培養プレートＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ  （ＮＣＰ）（ＮＣＰ−ＨＳ２４）を使用して、ＨｅｐＧ２細胞を培養したところ、細胞凝集塊の形成を確認することができなかった。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．００×１０5個、９．００×１０４個、１．８０×１０5個であった。また、１日後から５日後の増殖率は２．００倍であり、細胞増殖性を確認することができた。なお、今回形態観察条件とした４日後の時点では細胞凝集塊の形成が観察されなかったが、１週間後に観察を行ったところ、細胞凝集塊の形成を確認した。
【００９６】
＜実験３−８＞
組織培養用マイクロプレート(表面処理有り)（３８２０−０２４）（ＩＷＡＫＩ社製)を使用して、ＨｅｐＧ２細胞を培養したところ、形態観察時に細胞凝集塊は形成せず、伸展している様子を確認した。６時間、１日後、５日後の生存細胞数を測定したところ、それぞれ１．２０×１０5個、１．５０×１０５個、６．２０×１０5個であった。また、１日後から５日後の増殖率は４．１３倍であり、細胞増殖性を確認することができた。
【００９７】
＜実験３−９＞
実施例７で作製した細胞培養フィルムの細胞接着層１３の上面に対して、酸化亜鉛等の多価金属化合物を含有するコーティング液を塗布してトップコート層（通常バリア性フィルムとして用いられるフィルムと同様の組成の層）を形成することで、図１の細胞培養フィルム１の細胞接着層１３の上面が覆われた積層体を得た。
この積層体の基板１１側をマイクロプレートの各ウェルの底面に貼り付けて細胞培養容器を形成した。この細胞培養容器を使用してＨｅｐＧ２細胞を培養したところ、形態観察時に細胞凝集塊は形成せず、浮遊している様子が見られた。なお、生存試験については実施しなかった。
実験１の結果を表２に示す。実験２の結果を表３に示す。実験３の結果を表４に示す。
【００９８】
【表２】
2019004739.tif 000004
【００９９】
【表３】
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【０１００】
【表４】
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【０１０１】
この結果から、実施例１〜７の細胞培養フィルムは、その上に細胞懸濁液を播種する操作のみで細胞凝集塊が得られることが分かる。つまり、実施例１〜７の細胞培養フィルムは、簡便かつ安定的に細胞凝集塊を作製可能な細胞培養基材として期待できるものである。
また、実施例１〜７の細胞培養フィルム上で作製した細胞凝集塊は、ＢＳＡコーティング上で作製した細胞凝集塊よりも増殖率が向上することが分かる。
【０１０２】
また、実験１−９、２−９、３−９の結果から、細胞接着層の上面が覆われると、細胞凝集塊を形成しないため、細胞接着層の上面が露出していることが好ましいことが分かる。
なお、細胞培養フィルムは、既存の細胞培養用基材上に貼り付けたり、熱成型により使用したい形状に合わせて成型することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明の一態様の細胞培養フィルムを用いて得られる細胞凝集塊は、薬剤のスクリーニングや代謝活性評価、疾病の悪性度鑑別のために使用することができる。また、再生医療への利用として、健常な組織より採取した細胞より、本発明の細胞凝集体を調製し、かかる細胞凝集体を患者や治療を要する動物の当該組織に直接的又は間接的に注入することで、当該組織の機能の維持・再生に使用することが期待できる。
【符号の説明】
【０１０４】
１  細胞培養フィルム
１１  基材
１２  アンカーコート層
１３  細胞接着層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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