(57)【要約】【課題】色素沈着抑制剤をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】メラノサイトの細胞凝集の制御因子の活性を指標とする、色素沈着抑制剤のスクリーニング方法。好ましくは、前記制御因子の活性が、該制御因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、前記スクリーニング方法は、被験物質を細胞に添加する工程、及び被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して変化する被験物質を選択する工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノサイトの細胞凝集の制御因子の活性を指標とする、色素沈着抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記制御因子の活性が、該制御因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、
被験物質を細胞に添加する工程、及び
被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して変化する被験物質を選択する工程、
を含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記制御因子がメラノサイトの細胞凝集を抑制する因子であり、
前記変化が発現量の増大であり、
被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量の１１０％以上となる被験物質を選択する、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記制御因子が、ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子である、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記制御因子がメラノサイトの細胞凝集を亢進する因子であり、
前記変化が発現量の減少であり、
被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量の９０％以下となる被験物質を選択する、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記細胞がメラノサイトである、請求項２〜５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法を行う工程、及び
前記工程により選択された物質を含有させる工程、
を含む、組成物の設計方法。
【請求項８】
前記組成物が、美白用化粧料である、請求項７に記載の設計方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色素沈着抑制剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚における日焼け後の色素沈着、シミ、肝斑、老人性色素斑等は、皮膚に存在するメラノサイト（色素細胞）の活性化によりメラニン生成が著しく亢進した状態である。これらの皮膚色素沈着に関連するトラブルの発生や悪化は肌の美しさを妨げるものであるため、従来これらを予防又は改善する作用を有する成分に関する研究が盛んになされており、様々な作用機序に基づく美白成分が創出されている。
例えば、アスコルビン酸類、コロイド硫黄、グルタチオン、ハイドロキノン、カテコール等（非特許文献１）が、美白成分としてよく知られている。さらに近年、新たな作用機序に基づいた美白成分が種々開発されている。メラニン生成抑制を標的とするものとしては、チロシナーゼ関連蛋白阻害剤（特許文献１）、エンドセリン作用抑制剤（特許文献２）、プロトンポンプ阻害剤（特許文献３）、ステムセルファクター結合阻害剤（特許文献４）等がある。また、生成したメラニンの表皮への移動抑制を標的とするものとしては、メラノサイトのデンドライト伸張抑制剤（特許文献５）、メラニン移送又は放出抑制剤（特許文献６）等がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１９５７３２号公報
【特許文献２】特開２０１２−０２０９５０号公報
【特許文献３】特開２０１１−１７８７６０号公報
【特許文献４】特開２００８−０３１０９４号公報
【特許文献５】特開２００３−１１３０２７号公報
【特許文献６】特開２００８−１４３７９６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】メラニン色素の制御と美白剤の開発（フレグランスジャーナル社、臨時増刊）、Ｎｏ．１４、Ｐ．１１８−１２６（１９９５）
【非特許文献２】Ｔ．  Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ７３，  Ｉｓｓｕｅ  ３，  Ｍａｒｃｈ  ２０１４，  Ｐａｇｅｓ  ２５１−２５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今なおより高い効果が得られる美白用化粧料の開発を目指して、色素沈着抑制に有効な新たな成分の探索や、色素沈着抑制剤の標的となり得る新たな作用機序の検討がなされている。
ところで、肌のシミの部位では表皮においてメラノサイトが密集して存在することが報告されている（非特許文献２）。そのため、メラノサイトごとにメラニン産生を抑制することで肌色のトーンを全体的に薄くすることはできるが、シミの部位のコントラストは維持されてしまう。また、近くにあるメラノサイト同士は互いに刺激し合い、メラニンの産生が促進され、シミがさらに濃くなったり大きくなったりすることが問題となる。
本発明は、シミの解消に新しい機序でアプローチする、色素沈着抑制剤として有効な成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング法を確立することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、メラノサイトが集まり凝集塊を形成するという新たな現象を見出した。また、本発明者らは、黄色人種においてシミ等の色素沈着と相関性の高い遺伝子群を見出し、それらのうちにメラノサイトの細胞凝集の制御因子が存在することをも見出した。
そして、メラノサイトの凝集塊があるとシミが大きく又は濃くなるところ、かかる凝集を抑制することにより、シミを予防又は改善できるだろうと考え、メラノサイトの細胞凝集の制御因子の活性を指標とすれば、シミ等の色素沈着を予防又は改善できる素材をスクリーニングできることに想到し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]メラノサイトの細胞凝集の制御因子の活性を指標とする、色素沈着抑制剤のスクリーニング方法。
[２]前記制御因子の活性が、該制御因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、被験物質を細胞に添加する工程、及び被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して変化する被験物質を選択する工程、を含む、[１]に記載のスクリーニング方法。
[３]前記制御因子がメラノサイトの細胞凝集を抑制する因子であり、前記変化が発現量の増大であり、被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量の１１０％以上となる被験物質を選択する、[２]に記載のスクリーニング方法。
[４]前記制御因子が、ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子である、[３]に記載のスクリーニング方法。[５]前記制御因子がメラノサイトの細胞凝集を亢進する因子であり、前記変化が発現量の減少であり、被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量の９０％以下となる被験物質を選択する、[２]に記載のスクリーニング方法。
[６]前記細胞がメラノサイトである、[２]〜[５]のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[７][１]〜[５]のいずれかに記載のスクリーニング方法を行う工程、及び前記工程により選択された物質を含有させる工程、を含む、組成物の設計方法。
[８]前記組成物が、美白用化粧料である、[７]に記載の設計方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、メラノサイトの細胞凝集の制御因子の活性を指標とした、シミの解消に新しい機序でアプローチする色素沈着抑制剤のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】参考例における撮像箇所を表す図。
【図２】ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現を抑制したメラノサイトの細胞凝集を表す顕微鏡写真。
【図３】ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現を抑制したメラノサイトの細胞凝集塊の数を表すグラフ。
【図４】ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現を抑制したメラノサイトの細胞凝集塊の総面積を表すグラフ。
【図５】ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現を亢進させる被験物質を添加したメラノサイトの細胞凝集塊の数を表すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のスクリーニング方法は、メラノサイトの細胞凝集の制御因子の活性を指標とす
る。
本発明者らが新たに見出した、メラノサイトが凝集し凝集塊を形成するという現象は、シミ等の色素沈着部位を大きく又は濃くさせる原因の１つであると考えられる。そのため、メラノサイトの凝集を抑制することにより、シミ等の色素沈着を予防又は改善することができ、かかる作用を有する物質は色素沈着抑制剤となり得る。
【００１１】
本発明におけるメラノサイトの細胞凝集を制御する因子は、メラノサイトの細胞凝集を抑制する方向に制御する因子又は亢進する方向に制御する因子のいずれでもよい。例えば、メラノサイトの細胞凝集を抑制する方向に制御する因子としては、本発明者らがシミとの関連を新たに見出した遺伝子である、ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子が好ましく挙げられる。この遺伝子は、ヒトにおいて細胞内小胞輸送に関与する因子であるＲａｂ３５の活性化因子であることが知られており、また多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）に関与することも報告されているが、これまでにシミや皮膚における機能については一切知られていなかった。
なお、ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子のＤＮＡ塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列は公知であり（Ｇｅｎｅ ＩＤ ５７７０６、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１０ Ｆｅｂ １２；３７（３）：３７０−８２）、ＧｅｎＢａｎｋ等に開示されている。しかしながらこれに限定されず、既知の遺伝子であって、メラノサイトの細胞凝集を制御する因子は、本発明のスクリーニング方法においてその活性を指標として用いることができる。
【００１２】
本発明において、前記制御因子の活性とは、好ましくは該制御因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量をいう。
本発明のスクリーニング方法は、通常は、本発明の被験物質を細胞に添加する工程、及び被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して変化する被験物質を選択する工程、を含む。
【００１３】
前記制御因子がメラノサイトの細胞凝集を抑制する因子である場合、本発明のスクリーニング方法において前記変化は発現量の増大である。ここで発現量の増大の程度は、被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して大きければよく、好ましくは被験物質添加後１２または２４時間経過後に１１０％以上に増大した場合に変化したとすることができ、より好ましくは１２０％以上に増大であり、さらに好ましくは１３０％以上に増大である。
前記制御因子がメラノサイトの細胞凝集を抑制する因子である場合、例えば、前記制御因子がＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子である場合、この遺伝子の発現亢進と、メラノサイトの細胞凝集抑制とが相関し、結果的に色素沈着抑制と相関する。そのため、被験物質を細胞に添加することで、これらの遺伝子の発現亢進が生じた被験物質は、色素沈着抑制作用を有する成分として選択できる。
【００１４】
前記制御因子がメラノサイトの細胞凝集を亢進する因子である場合、本発明のスクリーニング方法において前記変化は発現量の減少である。ここで発現量の減少の程度は、被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して小さければよく、好ましくは被験物質添加後１２または２４時間経過後に９０％以下に減少した場合に変化したとすることができ、より好ましくは８０％以下に減少であり、さらに好ましくは７０％以下に減少である。
前記制御因子がメラノサイトの細胞凝集を亢進する因子である場合、これらの遺伝子の発現抑制と、メラノサイトの細胞凝集抑制とが相関し、結果的に色素沈着抑制と相関する。そのため、被験物質を細胞に添加することで、これらの遺伝子の発現抑制が生じた被験物質は、色素沈着抑制作用を有する成分として選択できる。
【００１５】
本明細書において、「細胞凝集の抑制」作用とは、通常は、メラノサイトが凝集して形成する塊（凝集塊）の数が減少もしくは増加しないこと、及び／又は凝集塊の総面積が減
少もしくは増加しないことをいう。
本明細書において、「色素沈着抑制」作用とは、通常は、メラノサイトの細胞凝集が抑制されることにより、シミ等の色素沈着が増えたり濃くなったりするのを予防又は改善する作用をいい、結果として肌に対して美白作用をもたらすものである。
【００１６】
メラノサイトの細胞凝集の制御因子の発現量は、任意の方法を用いて測定することができる。例えば、該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、メラノサイトの細胞凝集の制御因子が既知の遺伝子である場合、例えば前述したＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子等については、それらの塩基配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。
また、例えば、前記遺伝子によりコードされるタンパク質の細胞内存在量を、常法により定量的に測定して、前記遺伝子の発現量としてもよい。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法において、被験物質を添加する細胞は、メラノサイトの細胞凝集の制御因子の遺伝子が存在する細胞であれば特段限定されないが、通常はメラノサイトである。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質、動植物由来の抽出物、又はそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法により選択された色素沈着抑制剤は、メラノサイトの細胞凝集を抑制することによりメラノサイトの凝集塊の形成を予防又は改善する作用を有するため、シミ等の色素沈着が増えたり濃くなったりするのを予防又は改善する作用を有する。
そのため、本発明のスクリーニング方法により選択された色素沈着抑制剤は、化粧料等の美白用組成物に有効成分として好適に配合することができる。
【００２０】
すなわち、本明細書は、本発明のスクリーニング方法を行い、それにより選択された物質（色素沈着抑制剤）を含有させる工程を含む、組成物の設計方法も提供する。そして、かかる組成物は、経皮投与される組成物（例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤）や、経口投与／摂取される組成物（例えば、飲食品、医薬部外品、医薬品等の経口組成物）などの態様とすることができる。
また、組成物の剤型は特に限定されない。例えば、化粧料として設計される場合の剤型は、通常知られているローション剤型、乳液剤型、エッセンス剤型、クリーム剤型、粉体
含有剤型等が挙げられる。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法により選択された色素沈着抑制剤を含有する組成物を設計する際、色素沈着抑制剤の含有量（配合量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常８０質量％以下、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。上記範囲とすることで、好適に色素沈着抑制効果を奏する組成物とすることができる。
また、該組成物に含有させる色素沈着抑制剤の種類は、１種類のみでなく２種類以上であってもよい。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法により選択された色素沈着抑制剤を含有する組成物を設計する際は、前述した態様や用途に応じて、適宜必要な成分を配合するよう、設計してよい。
例えば、化粧料組成物として設計する場合は、通常化粧料に使用される成分を広く配合することが可能であり、また、その剤型や用途についても、何ら限定されない。以下、主に化粧料に適用される場合に化粧料中に含有させることができる成分について説明する。
【００２３】
有効成分としては、他の美白成分、シワ改善成分、抗炎症成分、動植物由来の抽出物等が挙げられる。なお、本発明のスクリーニング方法により選択された色素沈着抑制剤と重複して配合してもよい。
他の美白成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、アスコルビン酸グルコシド、３−О−エチルアスコルビン酸、トラネキサム酸、アルブチン、エラグ酸、コウジ酸、リノール酸、ニコチン酸アミド、５，５'−ジプロピルビフェニル−２，２'−ジオール、５'−アデニル酸二ナトリウム、トラネキサム酸セチル、４−メトキシサリチル酸カリウム塩、ハイドロキノン、パントテン酸等が挙げられる。
化粧料における美白成分の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、０．３〜５質量％がより好ましい。
【００２４】
シワ改善成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、三フッ化イソプロピルオキソプロピルアミノカルボニルピロリジンカルボニルメチルプロピルアミノカルボニルベンゾイルアミノ酢酸ナトリウム、ニコチン酸アミド、ビタミンＡ又はその誘導体（レチノール、レチナール、レチノイン酸、トレチノイン、イソトレチノイン、レチノイン酸トコフェロール、パルミチン酸レチノール、酢酸レチノール等）、ウルソール酸ベンジルエステル、ウルソール酸リン酸エステル、ベツリン酸ベンジルエステル、ベンジル酸リン酸エステルが挙げられる。
化粧料におけるシワ改善成分の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。
【００２５】
動植物由来の抽出物としては、一般的に医薬品、化粧料、食品等に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、アケビエキス、アスナロエキス、アスパラガスエキス、アボカドエキス、アマチャエキス、アーモンドエキス、アルニカエキス、アロエエキス、アロニアエキス、アンズエキス、イチョウエキス、インドキノエキス、ウイキョウエキス、ウドエキス、エイジツエキス、エゾウコギエキス、エンメイソウエキス、オウゴンエキス、オウバクエキス、オウレンエキス、オタネニンジンエキス、オトギリソウエキス、オドリコソウエキス、オレンジエキス、カキョクエキス、カッコンエキス、カモミラエキス、カロットエキス、カワラヨモギエキス、カンゾウエキス、キウイエキス、キューカンバーエキス、グアバエキス、クジンエキス、クチナシエキス、クマザサエキス、クララエキス、クルミエキス、グレープフルーツエキス、黒米エキス、クロレラエキス、クワエキス、ケイケットウエキス、ゲットウヨウエキス、ゲンチアナエキス、ゲンノショウコエキス、紅茶エキス、ゴボウエキス、コメエキス、コメ発酵エキス、コメヌカ発酵エキス、コ
メ胚芽油、コケモモエキス、サルビアエキス、サボンソウエキス、ササエキス、サンザシエキス、サンシャエキス、サンショウエキス、シイタケエキス、ジオウエキス、シコンエキス、シソエキス、シナノキエキス、シモツケソウエキス、シャクヤクエキス、ショウキョウエキス、ショウブ根エキス、シラカバエキス、スギナエキス、ステビアエキス、ステビア発酵物、セイヨウキズタエキス、セイヨウサンザシエキス、セイヨウニワトコエキス、セイヨウノコギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、セージエキス、ゼニアオイエキス、センキュウエキス、センブリエキス、ソウハクヒエキス、ダイオウエキス、ダイズエキス、タイソウエキス、タイムエキス、タンポポエキス、茶エキス、チョウジエキス、チンピエキス、甜茶エキス、トウガラシエキス、トウキエキス、トウキンセンカエキス、トウニンエキス、トウヒエキス、ドクダミエキス、トマトエキス、納豆エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、ノバラエキス、ハイビスカスエキス、バクモンドウエキス、ハスエキス、パセリエキス、バーチエキス、ハマメリスエキス、ヒキオコシエキス、ヒノキエキス、ビワエキス、フキタンポポエキス、フキノトウエキス、ブクリョウエキス、ブッチャーブルームエキス、ブドウエキス、ブドウ種子エキス、ヘチマエキス、ベニバナエキス、ペパーミントエキス、ボダイジュエキス、ボタンエキス、ホップエキス、マツエキス、マヨナラエキス、マロニエエキス、ミズバショウエキス、ムクロジエキス、メリッサエキス、モズクエキス、モモエキス、ヤグルマギクエキス、ユーカリエキス、ユキノシタエキス、ユズエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ヨモギエキス、ラベンダーエキス、緑茶エキス、リンゴエキス、ルイボス茶エキス、レイシエキス、レタスエキス、レモンエキス、レンギョウエキス、レンゲソウエキス、ローズエキス、ローズマリーエキス、ローマカミツレエキス、ローヤルゼリーエキス、ワレモコウエキス等のエキスが好ましいものとして挙げられる。
化粧料中における動植物由来抽出物の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。
食品中における動植物抽出物の含有量は、通常０．０１〜８０質量％であり、０．１〜５０質量％が好ましく、１〜３０質量％がより好ましい。
【００２６】
抗炎症成分としては、クラリノン、グラブリジン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、パントテニルアルコール等が挙げられ、好ましくは、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルレチン酸アルキル及びその塩、並びに、グリチルレチン酸及びその塩である。
化粧料中における抗炎症成分の含有量は、通常０．０１〜３０質量％であり、０．１〜１０質量％が好ましく、１〜５質量％がより好ましい。
【００２７】
油性成分としては、極性油、揮発性炭化水素油等が挙げられる。
極性油としては、合成エステル油として、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、酢酸ラノリン、イソノナン酸２−エチルヘキシル、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、１２−ヒドロキシステアリン酸コレステリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、モノイソステアリン酸Ｎ−アルキルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリル、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリスリトール、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリル、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパンを挙げることができる。
【００２８】
さらに、セチル２−エチルヘキサノエート、２−エチルヘキシルパルミテート、トリミリスチン酸グリセリル、トリ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセライド、ヒマシ油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オイル、セトステアリルアルコール、アセトグリセライド、
パルミチン酸２−ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソブチル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸−２−オクチルドデシルエステル、アジピン酸ジ−２−ヘプチルウンデシル、エチルラウレート、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、ミリスチン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸２−ヘキシルデシル、アジピン酸２−ヘキシルデシル、セバチン酸ジイソプロピル、コハク酸２−エチルヘキシル、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸アミル、クエン酸トリエチル、オクチルメトキシシンナメート等も挙げられる。
【００２９】
また、天然油として、アボガド油、ツバキ油、タートル油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、シナギリ油、日本キリ油、ホホバ油、胚芽油、トリグリセリン、トリオクタン酸グリセリル、トリイソパルミチン酸グリセリル等が挙げられる。
【００３０】
揮発性炭化水素油としては、イソドデカン、イソヘキサデカン等が挙げられる。
【００３１】
界面活性剤としては、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、
ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等） 、グリセリン脂肪酸エステル類（モノステアリン酸グリセリル等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、等が挙げられる。
【００３２】
多価アルコールとしては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等が挙げられる。
【００３３】
増粘剤としては、グアーガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラ
ン、ケラト硫酸、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸，キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト等が挙げられる。
【００３４】
粉体類としては、表面を処理されていてもよい、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面を処理されていてもよい、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類、表面を処理されていてもよい、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていてもよい赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、が挙げられる。
【００３５】
紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２'−ヒドロキシ−５'−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４'−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類、等が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
＜参考例＞ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子発現抑制によるメラノサイトの細胞凝集への影響
以下の手順で、メラノサイトにおけるＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現をｓｉＲＮＡで阻害することにより、メラノサイトの細胞凝集への影響を検討した。
ヒト正常メラノサイト（新生児、Ｄａｒｋ／ＡｆｒｉｃａｎＡｍｅｒｉｃａｎ、Ｍａｌｅ、 Ｌｏｔ. １２２３１５０、ライフテクノロジーズ社製）に、ＮＥＰＡ ２１（ネッパジーン社製）を使用してエレクトロポレーション法にて、ｓｉＲＮＡを導入した。ｓｉＲＮＡ試薬は、Ｈｓ＿ＤＥＮＮＤ１Ａ＿２＿ Ｆｌｅｘｉ Ｔｕｂｅ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ Ｎｏ． ＳＩ０４１３４８７９）を用い、コントロールとしてはＡｌｌｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ Ｎｏ． ＳＩ０３６５０３１）を用いた。該メラノサイトを２４ウェルプレートに播種し（８．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）、Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で２４時間３７℃でＯ／Ｎ培養した。培養後、培地を調製培地（Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地からＢＰＥ、ＰＭＡ、及びへパリンを除いたもの）に交換し、さらに４８時間３７℃でＯ／Ｎ培養した。培養後、明視野画像を１ウェルにつき３箇所（図１の四角３つ）を４０倍で撮影した。画像解析ソフトウェア「ＩｍａｇｅＪ」を用いて、撮影した画像データに対して解析を行い、各画像におけるメラノサイトの細胞凝集塊の数及び総面積を算出し、１ウェルあたりの測定結果とした。
【００３８】
また、前述のｓｉＲＮＡを導入したメラノサイトについて、前記Ｏ／Ｎ培養後にＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ株式会社製）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ株式会社製）を用いて細胞を回収し、ＱＩＡｃｕｂｅ （ＱＩＡＧＥＮ株式会社製）にてＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、Ｈｓ＿ＤＥＮＮＤ１Ａ＿１＿ＳＧ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ 
Ａｓｓａｙ（ＱＴ０００５９３１１、ＱＩＡＧＥＮ株式会社製）を用いて定法によりＲＴ−ＰＣＲを行い、ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。
【００３９】
図２に、ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現を抑制したメラノサイトの細胞凝集を表す顕微鏡写真を示す。また、図３及び図４に、ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現を抑制したメラノサイトの細胞凝集塊の数及び総面積をそれぞれ示す。なお、凝集塊の総面積は、コントロール群を１００％としたときの相対値として示した。ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現を抑制したメラノサイトにおいて、細胞凝集塊の数及び総面積のいずれもが有意な増大が認められた。
また、ｓｉＲＮＡを導入したメラノサイトにおいて、ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現量が有意に抑制されたことが、ＲＴ−ＰＣＲの結果から確認された（対コントロール：１０％）。
【００４０】
＜実施例１＞培養ヒト正常メラノサイトを用いたＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標とするスクリーニング
以下の手順で、メラノサイトにおけるＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を指標として色素沈着抑制剤のスクリーニングを行った。
正常ヒトメラノサイト（新生児、Ｄａｒｋ／ＡｆｒｉｃａｎＡｍｅｒｉｃａｎ、Ｍａｌｅ、Ｌｏｔ．１２２３１５０、ライフテクノロジーズ社製）を２４ウェルプレートに８．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル播種し、Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）培地で２４時間３７℃でＯ／Ｎ培養した。培養後に、最終濃度１．０質量％の被験物質を添加して試験群とし、各被験物質に代えてその溶媒を同量添加したものをコントロール群とし、さらに２４時間３７℃でＯ／Ｎ培養した。培養後に、参考例と同様に、回収したメラノサイトからｍＲＮＡを抽出し、合成したｃＤＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、各遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。
【００４１】
表１に、メラノサイトにおけるＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、被験物質非添加（コントロール）のメラノサイトにおける同発現量を「１」とした場合の相対値で示した。
ヒレハリソウエキスにおいて、コントロールの１６０％以上にＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現が亢進したことが認められ、このエキスがメラノサイトの細胞凝集抑制作用を有し、その結果色素沈着抑制効果を奏することが示唆された。
【００４２】
【表１】
2019004747.tif 000003
【００４３】
＜実施例２＞細胞凝集抑制作用評価
以下の手順で、ＤＥＮＮＤ１Ａ遺伝子の発現を亢進させる物質の、メラノサイトの細胞凝集抑制効果を評価した。
参考例と同様にｓｉＲＮＡを導入した正常ヒトメラノサイト（新生児、Ｄａｒｋ／ＡｆｒｉｃａｎＡｍｅｒｉｃａｎ、Ｍａｌｅ、Ｌｏｔ． １２２３１５０、ライフテクノロジーズ社製）を２４ウェルプレートに８．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル播種し、Ｍｅｄｉｕｍ２５４＋ＨＭＧＳ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）培地で２４時間３７℃でＯ／Ｎ培養した。培養後に、最終濃度１．０質量％の実施例１と同じ被験物質を添加して試験群とし、各被験物質に代えてその溶媒を同量添加したものをコントロール群とし、さらに２４時間３７℃でＯ／Ｎ培養した。培養後に、参考例と同様に、細胞の凝集塊の数及び総面積を測定した。
【００４４】
表２及び図５に、メラノサイトの細胞凝集塊の数及び総面積を、コントロール群を１００％としたときの相対値として示す。ヒレハリソウエキスにおいて、有意な細胞凝集の抑制が認められた。
【００４５】
【表２】
2019004747.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、メラノサイトの細胞凝集の制御因子の活性を指標とした、新たな色素沈着抑制剤のスクリーニング方法が提供される。これにより、美白用化粧料等の設計・製造に有用となり得る素材の探索が可能になるので、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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