(57)【要約】【課題】  ヒトの肌に優しく、安全で、かつ、ミトコンドリアの活性化、Ｉ型コラーゲンの産生の促進、創傷治癒に優れた剤、これを用いたスキンケア化粧料を提供する。【解決手段】  ウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする剤およびこれを用いたスキンケア化粧料であり、ウマプラセンタ加水分解物は果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタ加水分解物であることが好ましく、ウマプラセンタ加水分解物が構成成分としてペプチドを最も多く含有することが好ましい。【選択図】  図１
2019206495.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群より選択される１または２以上のウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする剤；
（ａ）ミトコンドリア活性化剤、
（ｂ）Ｉ型コラーゲン産生促進剤、
（ｃ）創傷治癒剤。
【請求項２】
果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタ加水分解物である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
ウマプラセンタ加水分解物が、構成成分としてペプチドを最も多く含有する、請求項１または請求項２に記載の剤。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の剤と、保湿剤と、防腐剤とを含有するスキンケア化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする剤およびこれを用いたスキンケア化粧料に関し、詳細には、ミトコンドリア活性化剤、Ｉ型コラーゲン産生促進剤および創傷治癒剤からなる群より選択される１または２以上のウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする剤およびこれを用いたスキンケア化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラセンタ（ｐｌａｃｅｎｔａ）とは、有胎盤類などの雌の妊娠時に子宮内に形成されて、母体と胎児とを連絡する器官である胎盤のことであり、近年、家畜の胎盤からの抽出物を配合した皮膚外用剤が開発されている（特許文献１および特許文献２）。
【０００３】
そして、特許文献１には、プラセンタエキスがサイコサポニンｂ１およびｂ２の創傷治癒効果を向上させる旨、ならびにプラセンタエキスが人以外の哺乳動物の胎盤から得られる抽出物である旨が開示されており、特許文献２には、プラセンタエキスが人以外の哺乳類動物の胎盤、特にウシ胎盤から得られる抽出物であり、創傷治癒促進作用を有している旨、およびプラセンタエキスが一般にアミノ酸、ペプチド、核酸塩基、無機物、ビタミンなどを成分として含む旨が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−２６２６３５
【特許文献２】特開平１０−１０１５４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１および特許文献２に開示されているプラセンタエキスはプラセンタの抽出物であり、いずれも加水分解物ではない。すなわち、特許文献１および特許文献２に開示されているプラセンタエキスによる創傷治癒効果は、従来、プラセンタエキス（プラセンタ抽出物）に含まれていることが知られているＥＧＦ(上皮細胞増殖因子)、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＦＧＦ(線維芽細胞増殖因子)などの成長因子によるものであるが、加水分解物においては、これら成長因子がタンパク質であるために分解・失活してしまうことから、加水分解物による創傷治癒効果とは異なるものである。また、特許文献１および特許文献２には、ウマプラセンタ加水分解物がミトコンドリアを活性化すること、Ｉ型コラーゲンの産生を促進することも開示されていない。
【０００６】
本発明は、ヒトの肌に優しく、安全で、かつ、ミトコンドリアの活性化、Ｉ型コラーゲンの産生の促進、創傷治癒に優れた剤、これを用いたスキンケア化粧料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ウマプラセンタの加水分解物、特に果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタの加水分解物が、ミトコンドリアの活性化、Ｉ型コラーゲンの産生の促進、創傷治癒に優れていることを見いだし、下記の各発明を完成した。
【０００８】
（１）下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群より選択される１または２以上のウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする剤；
（ａ）ミトコンドリア活性化剤、
（ｂ）Ｉ型コラーゲン産生促進剤、
（ｃ）創傷治癒剤。
【０００９】
（２）果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタ加水分解物である、（１）に記載の剤。
【００１０】
（３）ウマプラセンタ加水分解物が、構成成分としてペプチドを最も多く含有する、（１）または（２）に記載の剤。
【００１１】
（４）ウマプラセンタ加水分解物が、構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有する、（１）から（３）のいずれか一項に記載の剤。
【００１２】
（５）（１）から（４）のいずれか一項に記載の剤と、保湿剤と、防腐剤とを含有するスキンケア化粧料。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る剤によれば、ヒトの肌に優しく、安全で、かつ、ミトコンドリアの活性化、Ｉ型コラーゲンの産生の促進、創傷治癒に優れた剤、これを用いたスキンケア化粧料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ウマプラセンタの加水分解物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分子量分布を表すクロマトグラムである。
【図２】ウマプラセンタの加水分解物、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンを添加した培地で正常ヒト線維芽細胞を培養した場合の細胞数を示す図である。
【図３】ウマプラセンタの加水分解物、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンを添加した培地で正常ヒト線維芽細胞を培養した場合の、細胞におけるミトコンドリアの量を示す図である。
【図４】ウマプラセンタの加水分解物、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンを添加した培地で正常ヒト線維芽細胞を培養した場合の、細胞におけるミトコンドリアの活性を示す図である。
【図５】ウマプラセンタの加水分解物、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンを添加した培地で正常ヒト線維芽細胞を培養した場合の、細胞におけるＩ型コラーゲン量を示す図である。
【図６】ウマプラセンタの加水分解物を添加しない場合と、ウマプラセンタの加水分解物を添加した場合（１００μｇ／ｍＬ）との細胞遊走試験の結果を示す図である。
【図７】ヒト表皮モデルの増殖例における培養過程を示す図である。
【図８】ヒト表皮モデル（ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ）の断面とヒト正常皮膚（眼瞼部）の断面との対比を示す図（ａ）および三次元培養キットにおける継代培養の構成と様子を示す図（ｂ）である。
【図９】皮膚増殖能確認試験の結果を示す図である。図中、（ａ）はコントロール、（ｂ）は５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を添加した場合、（ｃ）は５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を添加した場合を、それぞれ示す。
【図１０】皮膚刺激性試験の結果を示す図である。図中、（ａ）は５％ＳＬＳを検体とした場合、（ｂ）は５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合、（ｃ）は５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明に係る剤について詳細に説明する。本発明に係る剤は、ウマプラセンタ加水分解物を有効成分とし、（ａ）ミトコンドリア活性化剤、（ｂ）Ｉ型コラーゲン産生促進剤、（ｃ）創傷治癒剤からなる群より選択される１または２以上の剤である。
【００１６】
本発明において用いられるプラセンタは、ウマプラセンタ（ウマ由来のプラセンタ）である。ウマはブタやウシなどと比較して体温が５〜６℃高いため寄生虫の心配がないばかりか、奇蹄類に分類されるウマは、狂牛病（牛海綿状脳症）や口蹄疫などの偶蹄類に発症する病気にかからない。また、ウシのように反芻をしないウマの内臓は清潔でデリケートなため、添加物やホルモンを受けつけず、他の家畜のように薬物を多用できないうえに、ウマは抗原度が非常に低くアレルゲンになりにくいとされている点でブタ由来のプラセンタやウシ由来のプラセンタよりも優れている。 本発明において用いるウマプラセンタは、ウマの胎盤であれば特に限定されないが、粉砕品（ミンチ品）であると扱いやすく、好適である。また、ウマプラセンタには、血液やその他の部位が付着あるいは混在していることが考えられるため、あらかじめ洗浄などがされているものが好ましい。
【００１７】
本発明において、ウマプラセンタの加水分解に用いられる酵素は、プロテアーゼであれば特に限定されないが、システインプロテアーゼ（システインエンドペプチダーゼ）が好適であり、果実由来のシステインプロテアーゼがより好適である。そのようなプロテアーゼとしては、例えば、パパイン、キモパパイン、アスクレパイン、ブロメライン（ブロメリン）、ジンギパイン（ジンギバイン）、フィカイン（ファカイン、フィシン）、アクチニダイン（アクチニジン）、ジアリールヘプタノイド代謝産物（生ウコン由来のクルクミン）などを挙げることができる。
【００１８】
本発明に係る剤は、細胞のミトコンドリアを活性化する作用を有する。すなわち、本発明に係る剤はミトコンドリア活性化剤である。当該細胞は、哺乳動物の細胞であれば特に限定されないが、ヒト細胞が好適であり、ヒト線維芽細胞がより好適である。また、細胞のミトコンドリアが活性化されているか否かを検出するための手法は、特に限定されず、当業者によって適宜選択可能な手法を用いることができる。本明細書実施例においては、ローダミンを用いた細胞染色および蛍光強度値の測定により検出している。
【００１９】
また、本発明に係る剤は、細胞におけるＩ型コラーゲンの産生を促進する作用を有する。すなわち、本発明に係る剤はＩ型コラーゲン産生促進剤である。細胞におけるＩ型コラーゲンの産生が促進されているか否かを検出するための手法は、特に限定されず、当業者によって適宜選択可能な手法を用いることができる。本明細書実施例においては、エライザによる測定により検出している。
【００２０】
さらに、本発明に係る剤は、細胞組織の創傷治癒する作用を有する。すなわち、本発明に係る剤は創傷治癒剤である。上述の通り、従来、プラセンタエキス（プラセンタ抽出物）が含むことが知られているＥＧＦ(上皮細胞増殖因子)、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＦＧＦ(線維芽細胞増殖因子)などの成長因子は、タンパク質であるがゆえに、加水分解反応により分解・失活してしまうため、本発明に係る創傷治癒剤は、従来のプラセンタエキス（プラセンタ抽出物）の奏する創傷治癒効果とは異なるといえる。細胞における創傷治癒効果を確認するための手法は、特に限定されず、当業者によって適宜選択可能な手法を用いることができる。本明細書実施例においては、スクラッチ法による細胞遊走試験により確認している。
【００２１】
また、本発明におけるウマプラセンタ加水分解物は、構成成分としてペプチドを最も多く含有する加水分解物であることが、後述する実施例より明らかとなっている。また、本発明におけるウマプラセンタ加水分解物は、構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有することが、後述する実施例より明らかとなっている。なお、本発明において、「構成成分としてペプチドを最も多く含有する」とは、構成する成分の全重量を基準として（構成する成分の重量％を基準として）、ペプチドを最も多く含有することを意味し、「構成成分としてペプチドを最も多く含有する」は、「（ウマプラセンタ加水分解物において）構成成分としてのペプチドが最大組成比率の第一組成物である」と置換可能に用いられる。
【００２２】
また、本発明に係るスキンケア化粧料は、本発明に係る剤と、保湿剤と、防腐剤とを含有する。すなわち、本発明は、保湿剤と防腐剤とを選択して特定の剤に加え、スキンケア用化粧料に適用した点に特徴があり、保存安定性に優れるスキンケア用化粧料を提供するに至ったものである。
【００２３】
本発明において用いられる保湿剤は、本発明に係る剤の特徴を損なわない範囲で選択することができ、そのような保湿剤としては、例えば、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，２−ペンタンジオール、ポリグリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などのムコ多糖類またはそれらの塩を挙げることができる。
【００２４】
また、本発明において用いられる防腐剤は、本発明に係る剤の特徴を損なわない範囲で選択することができ、そのような防腐剤としては、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、フェノキシエタノール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール、カプリル酸グリセリル、エチルヘキシルグリセリンを挙げることができる。
【００２５】
本発明に係る剤の製造方法は、（ｉ）ウマプラセンタに加水分解酵素を添加して加水分解し、加水分解物を調製する工程（加水分解物調製工程）、（ｉｉ）加水分解物を調製した後に加水分解酵素を失活させる工程（酵素失活工程）、（ｉｉｉ）等電点処理する工程（等電点処理工程）、そしてその後、（ｉｖ）上澄みを分取して濾過する工程（上澄み分取濾過工程）、以上（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を包含する。
【００２６】
なお、（ｉ）加水分解物調製工程において、加水分解反応の温度設定や所要時間の設定は、加水分解反応に支障がない範囲で、適宜設定が可能である。また、（ｉｉ）酵素失活工程における酵素を失活させるための温度設定や所要時間の設定もまた、酵素を失活させることができる範囲で、適宜設定が可能である。
【００２７】
一方、（ｉｉｉ）等電点処理工程において用いる物質やｐＨの設定、（ｉｖ）上澄み分取濾過工程において用いられるメンブランフィルターの選択、例えば孔径の選択もまた、これら工程の実施が可能な範囲で、適宜選択が可能である。
【００２８】
本発明において、スキンケア化粧料には、本発明の特徴を損なわない範囲で、化粧品の分野において通常用いられる添加成分を適宜配合することができ、例えば、真珠光沢材料、酸化防止剤、色素、増粘剤、およびｐＨ調整剤から選択される１種以上の成分が挙げられる。また、芳香剤、抗菌剤、各種の油性成分、紫外線吸収剤、活性酸素除去剤、抗酸化剤、抗微生物剤、育毛剤、ミネラル、アミノ酸を用いることができる。さらに、公知の美白成分を併用してもよい。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明に係る剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される実施態様に限定されない。
【００３０】
１．ウマプラセンタ加水分解物の調製
本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物を調製した。あらかじめ冷凍で保存しておいた北海道産駒サラブレッドの胎盤のミンチ１００重量部を半解凍し、精製水３００重量部を加えて室温にて解凍した後、いずれも果実由来システインプロテアーゼであるパパイン０．０８重量部とブロメライン０．１２重量部とを加え、４５〜５５℃の条件下で計６時間加水分解反応させた。続いて、当該プロテアーゼを失活させて水冷し、乳酸を用いた等電点処理（ｐＨ４．３７）と活性炭（粉末；０．２５重量部）処理を行い、室温にて一晩静置した。その後、上澄みを分取し、メンブランフィルター（孔径３μｍ程度）を用いて濾過し、１０％（ｖ／ｖ）の水酸化ナトリウムを用いて中和（ｐＨ７．３）した後、メンブランフィルター（孔径１．０μｍおよび孔径０．４５μｍ）を用いて濾過してウマプラセンタの加水分解物を得た。
【００３１】
２．ウマプラセンタ加水分解物の一般栄養分析試験
１．で調製したウマプラセンタの加水分解物について、一般栄養分析試験を行った。当該分析試験は、一般財団法人日本食品分析センターへ委託した。具体的な試験方法は下記の通りである。
【００３２】
［２−１］一般栄養分析試験の試験方法
分析試験項目を水分、タンパク質、脂質、灰分、炭水化物、エネルギー、ナトリウム、食塩相当量とし、水分については常圧加熱乾燥法により、タンパク質については燃焼法により（窒素・タンパク質換算係数：６．２５）、脂質については酸分解法により、灰分については直接灰化法により、炭水化物については食品表示基準（平成２７年内閣府令第１０号）による計算式（１００−（水分＋タンパク質＋脂質＋灰分））により、エネルギーについては食品表示基準（平成２７年内閣府令第１０号）によるエネルギー換算係数（タンパク質４：脂質９：炭水化物４）により、ナトリウムについては原子吸光光度法により、食塩相当量については所定の計算式（ナトリウム×２．５４）により、それぞれの値を求めた。ウマプラセンタの加水分解物についての一般栄養分析試験結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2019206495.tif 000003
【００３４】
［２−２］結果
表１に示すように、本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物は、構成成分としてタンパク質を８８．１ｇ／１００ｇ含んでいることが示された。このことから、本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物は、構成成分として、タンパク質、すなわちペプチドを最も多く含有することが明らかとなった。
【００３５】
３．分子量分布の分析試験
１．で調製したウマプラセンタの加水分解物について、分子量分布の分析試験を行った。当該分析試験は、一般財団法人日本食品分析センターへ委託した。具体的な試験方法は下記の通りである。
【００３６】
［３−１］標準溶液の調製
下掲の表２に示した分子量標準品（タンパク質、ペプチド）を、水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸の混液（体積比が５５：４５：０１）に溶解し、標準溶液とした。なお、表１中、＊１はグリシン残基、＊２中はチロシン残基、＊３はアルギニン残基を示す。
【００３７】
【表２】
2019206495.tif 000004
【００３８】
［３−２］試験溶液の調製
１．で調製したウマプラセンタの加水分解物０．０２ｇを採取し、水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸の混液（体積比が５５：４５：０１）１０ｍＬを加えた。室温で一晩静置した後、メンブランフィルター（孔径０．４５μｍ）を用いて濾過し、試験溶液とした。
【００３９】
［３−３］ＨＰＬＣによる分析
［３−２］で得られた試験溶液について、［３−１］で得られた標準溶液に基づき、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分子量分布の分析試験（サイズ排除クロマトグラフ法）を行った。下記にＨＰＬＣの操作条件を示し、下掲の表３に基点分子量の溶出時間を示す。
機種：ＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社）
検出器：紫外可視検出器  ＳＰＤ−２０Ａ（島津製作所社）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２５００ＰＷＸＬ、φ７．８ｍｍ×３００ｍｍ（東ソー社）
カラム温度：４０℃
移動相：上述した、水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸の混液
流量：０．５ｍＬ／分
測定波長：２２０ｎｍ
注入量：２０μＬ
【００４０】
【表３】
2019206495.tif 000005
【００４１】
また、分子量（Ｍ）および溶出時間（Ｔ）の関係式（検量線）は、下記の通りである。
ｌｏｇＭ＝−０．３１５４１０３Ｔ＋７．６９２８７０９
【００４２】
［３−４］結果
以上より、試験溶液について得られたクロマトグラムを図１に示し、分析試験結果であるウマプラセンタの加水分解物についての分子量分布を表４に示す。なお、表４に示す分子量分布は、図１のクロマトグラムのピーク面積を百分率で示したものである。
【００４３】
【表４】
2019206495.tif 000006
【００４４】
図１および表４に示すように、本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物は、分子量分布のピークが１，０００以上３，０００未満であることが示された。なお、本実施例に係る分子量標準品はタンパク質とペプチドである。このことから、本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物は、構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有することが明らかとなった。
【００４５】
４．Ｄｙｅ  Ｃ５７を用いたペプチドアッセイ
アミノカルボン酸の存在により蛍光物質に変化するＤｙｅ  Ｃ５７を用いて、試料中の２〜２０アミノ酸よりなるペプチド濃度をＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＰＥＰ２００（ＰｒｏＦｏｌｄｉｎ社）を用いて、蛍光法により測定した。具体的な試験方法は下記の通りである。
【００４６】
［４−１］ペプチドアッセイの試験方法
１．で調製したウマプラセンタの加水分解物またはウマプラセンタ原料そのもののリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液１００μｇ／ｍＬを１ｍＬ、９６穴プレートの３箇所に滴下し、またブランクとしてＰＢＳを１ｍＬ、９６穴プレートの１箇所に滴下した。これらに２５μＬの１×Ｄｙｅ  Ｃ５７をＰＢＳで１００μＬに濃度調整した溶液を各々加え、混釈した後、室温にて１５分間静置し、プレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｌｏＭａｘ  ＤＩＳＣＯＶＥＲ  ＧＭ３０００）を用いて、励起４７５ｎｍ、測定５００〜５５０ｎｍの条件で蛍光法により測定した。
【００４７】
［４−２］結果
ウマプラセンタ原料そのものの蛍光強度が２４８（ブランク補正後）であったのに対し、本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物の蛍光強度は６２６（ブランク補正後）であった。このことから、ウマプラセンタを果実由来システインプロテアーゼで加水分解処理した本実施例に係るウマプラセンタの加水分解物は、ウマプラセンタ原料そのものと比較してペプチドの含有量が約８倍になったことが明らかとなった。
【００４８】
５．ミトコンドリアの賦活性およびＩ型コラーゲンの産生促進性についての検証試験
正常ヒト線維芽細胞を用いてウマプラセンタの加水分解物、医療用として使用されているブタ由来低分子量ハイグレードゼラチン（平均分子量が約８，０００）およびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチン（平均分子量が約６０，０００）によるミトコンドリアの賦活性（量・活性）、Ｉ型コラーゲンの産生促進性について、検証試験を行った。当該分析試験は、株式会社エーセルへ委託した。具体的な試験方法は下記の通りである。なお、ウマプラセンタ加水分解物との比較サンプルとしてブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチン（コラーゲン）を用いた理由は、（１）他のウマプラセンタもしくはその他哺乳動物由来のプラセンタの加水分解物で、ペプチドの分子量をはっきりと提示している他社製品サンプルが存在しなかったこと、（２）コラーゲンは一般的に哺乳類のタンパク構成成分として生体内に広く分布しておりプラセンタ中にも存在することが推測されること、（３）ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチン（コラーゲン）は医療用グレードで品質管理がなされ、かつ、低分子量および中分子量であることがはっきりと提示されていることにより比較対象物となりうると判断したためである。
【００４９】
［５−１］正常ヒト線維芽細胞の培養条件
正常ヒト線維芽細胞を起眠後に基本培地（ＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．０８４５６−６５）、１０％ＦＢＳ（ｂｉｏｗｅｓｔ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ１８２０，Ｌｏｔ  Ｎｏ．５１６５３６）および１％抗生物質）にてＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で必要細胞数に達するまで培養した。培養後、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥離し細胞数を測定した後に試験に使用した。 なお、試験培地の組成は、ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳおよび１％抗生物質である。
【００５０】
［５−２］被験物質の調整
１．で調製したウマプラセンタの加水分解物、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンは２５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように試験培地に添加し、濾過滅菌後、濃縮検体溶液として使用した。陽性対照物質として、レスベラトロール（ＳＩＧＭＡ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ５０１０−１００ＭＧ）を２００ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解し濾過滅菌後に濃縮溶液として使用した。同じく陽性対照物質として、ビタミンＣ（アスコルビン酸、和光純薬社；０１３−１９６４１）を２００ｍＭとなるようにＰＢＳに溶解し濾過滅菌後に濃縮溶液として使用した。
【００５１】
［５−３］細胞培養
基本培地で調整した正常ヒト線維芽細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／０．１ｍＬ／ウェル／９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０９０の蛍光観察用ブラックプレート）に播種し、２４時間培養後に培養上清を、被験物質を含む基本培地に置換し、再び培養した。最大で２１日間培養し、その間に２〜３日毎に培地交換した（図１参照）。
【００５２】
［５−４］細胞数、ミトコンドリア量およびミトコンドリア活性の測定
培養終了後に培養上清を除去した後、ＰＢＳで２回細胞を洗浄、１０００倍希釈したＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ  Ａ１を含む試験培地（１００μＬ／ウェル）を添加し、６０分間、３７℃にて培養した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＯＪＩＮＤＯ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．３４６−０７９５１、終濃度５μｇ／ｍＬ）、１０μｇ／ｍＬのＶｅｃｔａＣｅｌｌ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３ (フナコシ社；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＢ−２１００)、５００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭ−Ｈ２Ｘｒｏｓ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；Ｍ７５１２） を含む試験培地に置換し（１００μＬ／ウェル）、３０分間、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で反応後に各ウェルから染色液を除去、ＰＢＳで２回洗浄した後、新たに試験培地を添加して、マイクロプレートリーダーにて各ウェルの蛍光強度値を測定した。ヘキスト染色での蛍光強度により総細胞数を算出し、ＶｅｃｔａＣｅｌｌ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３染色および ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭ−Ｈ２Ｘｒｏｓ染色の蛍光強値をヘキスト値で平均化し各相対蛍光値を算出した。それぞれの測定波長を下記に示す。
【００５３】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（細胞数）：
３４０ｎｍ（励起波長）／４６１ｎｍ（蛍光波長）
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭ−Ｈ２Ｘｒｏｓ（ミトコンドリア）：
５７９ｎｍ（励起波長）／５９９ｎｍ（蛍光波長） 
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３（ミトコンドリア活性）：
５０５ｎｍ（励起波長）／５３４ｎｍ（蛍光波長）
【００５４】
［５−５］Ｉ型コラーゲン量の測定
各培養終了後に培養上清（各３日間培養後のコラーゲン蓄積）を回収し、測定まで−８０℃にて保管した。測定時に氷上で解凍し原液をヒトＩ型コラーゲンＥＬＩＳＡキット（ＡＣＥＬ社；ＥＣ１−Ｅ１０５）にて測定した。Ｉ型コラーゲン量の測定は、キットに添付のプロトコールに従い、下記のように行った。
【００５５】
コラーゲン標準原液（２００μｇ／ｍＬ）をもとに、反応緩衝液を用いて１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６２５μｇ／ｍＬのコラーゲン標準溶液を調製し、コラーゲン標準溶液および検体（培養上清）と、ビオチン標識コラーゲン抗体溶液を、９：１の割合になるよう新たなチューブ中で混合した。 コラーゲン固相化マイクロプレートを洗浄液で３回洗浄し、コラーゲン標準溶液および検体（培養上清）とビオチン標識コラーゲン抗体溶液との混合液を、それぞれのウェルに５０μＬずつ添加した後、プレートミキサーで振とうしながら、室温で６０分間反応させた（一次反応）。 その後、ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識アビジン溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、プレートミキサーで振とうしながら、室温で６０分間反応させた（二次反応）。続いて、ウェル内の溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄し、酵素基質溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、遮光・室温下で１５分間静置した（発色反応）。その後、反応停止溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、プレートミキサーで１分間混和後、プレートリーダーで各ウェルの吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ）、標準曲線から、検体中のコラーゲン濃度を算出した。
【００５６】
［５−６］結果
細胞数、ミトコンドリア量、ミトコンドリア活性およびＩ型コラーゲン量の測定結果を図２〜５に示す。細胞数については、図２に示すように、各被験物質および各濃度区において差異は認められなかった。このことから、各被験物質による細胞増殖促進性は認められないことが明らかとなった。また、ミトコンドリア量については、図３に示すように、培養３日間においてウマプラセンタ加水分解物添加区で顕著なミトコンドリア量の増加を示したが、７日間処理以降の長期処理ではウマプラセンタ加水分解物添加のミトコンドリア量増加作用は認められなかった。一方、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンにおいてミトコンドリア量増加作用は認められなかった。これらのことから、ウマプラセンタ加水分解物添加処理では、線維芽細胞において短期的にミトコンドリア量が増大したことが明らかとなった。
【００５７】
続いて、ミトコンドリア活性評価について、図４に示すように、培養７日間以降の長期処理においてウマプラセンタ加水分解物処理によりミトコンドリア活性が顕著に増大したが、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンにおいては、ミトコンドリア活性増大作用は認められなかった。また、ミトコンドリア賦活作用の陽性対照として使用したレスベラトロールは培養２１日間処理においてのみミトコンドリア活性増大作用が認められた。これらのことから、ウマプラセンタ加水分解物は、正常ヒト線維芽細胞のミトコンドリアの活性を増大させることが明らかとなった。また、Ｉ型コラーゲン産生評価について、図５に示すように、培養１４日間、２１日間においてウマプラセンタ加水分解物処理でＩ型コラーゲンの産生が増大したが、ブタ由来低分子量ハイグレードゼラチンおよびブタ由来中分子量ハイグレードゼラチンにおいてコラーゲンの増加は認められず、むしろ、一部減少が認められた。Ｉ型コラーゲン産生促進の陽性対照として使用したビタミンＣ（アスコルビン酸）ではいずれの培養区においても顕著なＩ型コラーゲン増加作用を示した。また、各被験物質中のコラーゲンがＩ型コラーゲンとして検出される可能性があることから、事前に被験物質を含む試験培地のコラーゲンを測定したが、いずれの培地においてＩ型コラーゲンは未検出レベルであった。これらのことから、ウマプラセンタ加水分解物は、正常ヒト線維芽細胞のＩ型コラーゲンの産生を促進させることが明らかとなった。
【００５８】
以上をまとめると、ウマプラセンタ加水分解物は、ヒト線維芽細胞のミトコンドリア量を増加させ、ミトコンドリアの活性を増大し、かつ、コラーゲン産生を促進する作用を有していることが明らかとなった。また、ウマプラセンタ加水分解物は、短期的な処理によってもミトコンドリア量を増加させ、さらに長期的な処理によりミトコンドリア活性を増大させることも明らかとなった。Ｉ型コラーゲンの産生が促進されたのは、 ヒト線維芽細胞中のミトコンドリアの活性に伴い、ヒト繊維芽細胞のＩ型コラーゲン産生能が高まったと考えられる。また、細胞数自体は各培養期間において変化がないことから、ウマプラセンタ加水分解物による、ヒト線維芽細胞のミトコンドリア量を増加させ、ミトコンドリアの活性を増大し、かつ、コラーゲン産生を促進する作用については、細胞増殖を伴う作用ではなく、細胞機能自体を促進したものと考えられる。
【００５９】
６．スクラッチ法による細胞遊走試験
創傷治癒の過程では、傷に向かって線維芽細胞が増殖・遊走して創が収縮・閉鎖されることが知られており、これを利用してウマプラセンタの加水分解物による細胞遊走促進作用を検証することとした。具体的な試験方法は下記の通りである。
【００６０】
［６−１］細胞遊走試験の試験方法
あらかじめ、６０ｍｍのＤｉｓｈの裏側に十字の線を描いておき、そこに、ヒト正常線維芽細胞を４０００個／ｃｍ２の割合で播種し、当該細胞がコンフルエントになるまで培養した後、コンフルエントな状態となった当該細胞を専用のスティックで剥がし、スクラッチした。続いて、本実施例に係るウマプラセンタ加水分解物試料を添加した培地または添加しない培地に交換し、０時間、２４時間および４８時間後に画像を撮影し、スクラッチによる十字の線を参考にして、空白部分への進む距離を測定した。なお、１ウェルにおいて２、３箇所測定して平均し、ｎ数は４または５とした。その結果を図６に示す。
【００６１】
［６−２］結果
図６に示すように、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物を添加した場合（１００μｇ／ｍＬ）は、当該添加しない場合と比較して、０時間、２４時間、４８時間と時間が経過するにつれ、ヒト正常線維芽細胞が増殖するとともに遊走活性が向上する。このことから、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物は、創傷治癒能を有することが明らかとなった。また、上述の通り、従来、プラセンタエキス（プラセンタ抽出物）に含まれることが知られているＥＧＦ(上皮細胞増殖因子)、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＦＧＦ(線維芽細胞増殖因子)などの成長因子は、タンパク質であるがゆえに、加水分解反応により分解・失活してしまうため、本発明に係る創傷治癒剤は、従来のプラセンタエキス（プラセンタ抽出物）の奏する創傷治癒効果とは異なるといえる。
【００６２】
７．皮膚増殖能確認試験
ウマプラセンタの加水分解物が皮膚増殖能を有しているか否かを確認するため、表皮組織の三次元培養キットを用いて試験した。具体的な試験方法は下記の通りである。なお、作業はクリーンベンチ内で行い、器具は滅菌済ディスポーサルの器具を使用した。
【００６３】
［７−１］皮膚増殖能確認試験の試験方法
当該試験は、ヒト表皮モデル作成キット（ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＫＩＴ；ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社）を用い、その取扱説明書の記載に従って試験した。
【００６４】
［７−２］結果
図７にヒト表皮モデルの増殖例における培養過程（１日目→４日目→７日目→１０日目→１４日目→１８日目→２１日目および２８日目）を、図８（ａ）にヒト表皮モデル（ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ）の断面とヒト正常皮膚（眼瞼部）の断面との対比を、図８（ｂ）に三次元培養キットにおける継代培養の構成と様子を、図９に本試験結果（（ａ）はコントロール、（ｂ）は５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を添加した場合、（ｃ）は５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を添加した場合を、それぞれ示す）を、それぞれ示す。図９に示すように、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物を添加しない培地でヒト正常線維芽細胞を継代培養した場合（図９（ａ））は、表皮組織が形成されていないが、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物を添加した培地でヒト正常線維芽細胞を継代培養した場合（図９（ｂ）および（ｃ））は、表皮組織が形成されて増殖している。このことから、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物は、皮膚増殖能を有することが明らかとなった。
【００６５】
８．皮膚刺激安全性試験
ウマプラセンタの加水分解物の皮膚刺激性について確認するため、表皮組織の三次元培養キットおよび皮膚刺激性の測定キットを用いて試験した。具体的な試験方法は下記の通りである。
【００６６】
［８−１］皮膚刺激性試験の試験方法
当該試験は、ヒト表皮モデル作成キット（ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＫＩＴ；ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社）および皮膚刺激性の測定キットであるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＫＩＴの取扱説明書および「ヒト３次元培養表皮ＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ２４を用いた皮膚刺激性試験法」の記載に従って試験した。皮膚刺激性の測定は下記の手順で行った。
【００６７】
先ず、「７．皮膚増殖能確認試験」と同様の手法にてヒト表皮モデルを作成した。続いて、陽性対照物質として、皮膚刺激剤である５％（ｗ／ｗ）のＳｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＬＳ）、５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物および５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体として、各々を当該作成したヒト表皮モデルに接触させ、５日間培養した後、それぞれの検体を除去し、ＭＴＴ法により細胞毒性を測定した。６０ｍｍディッシュで培養したＭＴＴ培地（２ｍＬまたは３ｍＬ）にＤｙｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ添加し、３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した後、１ｍＬのＳｏｌｕｂｉｌｌｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ／Ｓｔｏｐ  Ｍｉｘを加え、３７℃で１時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。続いて、９６ウェルプレートのウェル内に２００μＬずつ移した後、５６０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。
【００６８】
［８−２］結果
図１０に本試験結果を示す。なお、図１０中、（ａ）は５％ＳＬＳを検体とした場合、（ｂ）は５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合、（ｃ）は５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合の結果を示す。図１０に示すように、５％ＳＬＳを検体とした場合は細胞数が約３５％となり、ヒト表皮モデルに対してダメージを与えているが、５０％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合は細胞数が約１１５％と約１５％増加し、５％（ｗ／ｗ）のウマプラセンタ加水分解物を検体とした場合は細胞数が約１０８％と約８％増加している。このことから、本実施例で用いるウマプラセンタの加水分解物は、皮膚に対する安全性が高く、むしろ皮膚の各組織・細胞の成長を促していることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月7日(2019.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有するウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする、ヒト細胞において短期的にミトコンドリア量を増大させるとともに長期的にミトコンドリアの活性を増大させる剤。
【請求項２】
構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有するウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする、ヒト細胞を増殖させるとともに遊走活性を向上させることよる創傷治癒剤。
【請求項３】
果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタ加水分解物である、請求項１または請求項２に記載の剤。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の剤と、保湿剤と、防腐剤とを含有するスキンケア化粧料。
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月20日(2019.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有する、果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタ加水分解物からなる、ヒト細胞において短期的にミトコンドリア量を増大させるとともに長期的にミトコンドリアの活性を増大させる剤。
【請求項２】
構成成分として１，０００以上３，０００未満の分子量を有するペプチドを最も多く含有する、果実由来システインプロテアーゼによるウマプラセンタ加水分解物からなる、ヒト細胞を増殖させるとともに遊走活性を向上させることによる創傷治癒剤。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、ウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする剤に関し、詳細には、ミトコンドリア活性化剤、Ｉ型コラーゲン産生促進剤および創傷治癒剤からなる群より選択される１または２以上のウマプラセンタ加水分解物を有効成分とする剤に関する。