(57)【要約】【課題】本発明は、長時間、肝細胞の活性、特に、薬剤代謝の活性を維持し、創薬開発に用いることができる、人工肝組織を提供することを目的とする。【解決手段】細胞接着性ハイドロゲル床と、前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に播種された肝細胞と、前記肝細胞を被覆する、間質細胞を含むシート状細胞群と、を含む、人工肝組織を提供する。また、人工肝組織の製造方法であって、（ｉ）培養基材上に細胞接着性ハイドロゲル床を形成する工程、（ｉｉ）前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に、肝細胞を播種して、培養する工程、（ｉｉｉ）前記肝細胞の上に、間質細胞を含むシート状細胞群を載せ、培養する工程、を含む、前記方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性ハイドロゲル床と、
前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に播種された肝細胞と、
前記肝細胞を被覆する、間質細胞を含むシート状細胞群と、
を含む、人工肝組織。
【請求項２】
前記シート状細胞群が、細胞シートである、請求項１に記載の人工肝組織。
【請求項３】
前記細胞シートが、収縮した細胞シートである、請求項２に記載の人工肝組織。
【請求項４】
前記間質細胞が、線維芽細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の人工肝組織。
【請求項５】
前記細胞接着性ハイドロゲル床が、コラーゲンゲル床である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工肝組織。
【請求項６】
薬剤代謝の評価に用いるための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の人工肝組織。
【請求項７】
人工肝組織の製造方法であって、
（ｉ）培養基材上に細胞接着性ハイドロゲル床を形成する工程、
（ｉｉ）前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に、肝細胞を播種して、培養する工程、
（ｉｉｉ）前記肝細胞の上に、間質細胞を含むシート状細胞群を載せ、培養する工程、
を含む、方法。
【請求項８】
前記シート状細胞群が、細胞シートである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞シートが、刺激応答性培養基材上で培養された細胞群を、刺激を与えることで剥離させることで得られた細胞シートである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞シートが、収縮した細胞シートである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記間質細胞が、線維芽細胞である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞接着性ハイドロゲル床が、コラーゲンゲル床である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
人工肝組織が、薬剤代謝の評価に用いるための人工肝組織である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工肝組織に関する。また、本発明は人工肝組織の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、糖新生、グリコーゲン貯蔵、脂質代謝、血漿タンパク質の産生や、ビリルビン代謝、ホルモン代謝、ビタミン代謝、薬物代謝及びアルコール代謝等といった代謝機能を担う重要な臓器である。全ての生体組織は、ある程度薬物を代謝する能力を有しているが、その中でも特に肝臓が薬物代謝を活発に行う臓器として知られている。
【０００３】
薬物代謝は、大きく分けて、第１相（変性）、第２相（抱合）及び第３相（追加変性及び排出）の反応からなり、第１相（変性）及び第２相（抱合）の反応は肝細胞が有する酵素がその多くを担う。例えば、肝細胞は、第１相反応に関与する、加水分解反応を担う加水分解酵素、酸化反応や還元反応に重要な役割を果たすシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）、第２相反応に関与し、硫酸、酢酸、グルタチオン又はグルクロン酸などを付与する抱合酵素などを有する。薬物代謝においてＣＹＰによる酸化反応は特に重要であり、ＣＹＰ酵素は生物種ごとに数十種類存在し、それぞれ基質特異性を有している。ＣＹＰ酵素は、薬物を投与することによって発現が誘導されたり、その反応が阻害されたりすることがある。
【０００４】
経口投与された薬物は、消化管から吸収され、肝臓を通過した後に全身へと循環される。そのため、患部へ到達する前に薬物代謝されてしまうと、所望の効果を十分に発揮することができない。また、逆に薬物が長期間分解されずに残存すると、薬物性肝障害などを引き起こす可能性がある。そのため、創薬開発において、動物やヒトに薬物投与を行う試験を計画する際、事前に当該薬物の代謝速度を予測することが重要となる。
【０００５】
現在、このような薬物の代謝速度を予測する方法として、凍結ヒト肝細胞を用い、懸濁状態で培養した後に対象薬物を投与し、その代謝速度から、当該薬物の生体内での代謝速度を予測する方法が採用されている。しかしながら、初代ヒト肝細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養において数時間で失活してしまうために、特に代謝が遅い薬物を用いる場合は、代謝速度を予測することが困難となっている。そのような状況の下、様々な研究開発が行われており、肝細胞の活性を維持するような培養系の開発が行われている。
【０００６】
例えば、非特許文献１及び２には、直径約５００μｍの円形に肝実質細胞を「島」状に播種し、その周辺を３Ｔ３−Ｊ２マウス線維芽細胞で取り囲む系を開示している。この系では、活性を維持するために肝実質細胞の「島」同士の中心間の距離が、約１２００μｍとなるよう厳密に設計さている。
【０００７】
非特許文献３及び４には、タイプＩコラーゲンでコートされたウェル底面上で、肝実質細胞と非実質性間質細胞を単層状で共培養する系を開示している。
【０００８】
非特許文献５には、特殊なポリマーが被覆され、直径１００μｍの円形状領域（１００μｍ間隔で配列）のみに細胞が接着できるように加工されたマルチウェルプレートが開示されている。このプレートに、フィーダー細胞（非実質性間質細胞）を播種した後に、肝実質細胞を播種することにより、スフェロイドを形成させている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｈｅｔａｎｉ  ＆  Ｂｈａｔｉａ（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２０−１２６．
【非特許文献２】Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．４１：２０２４−２０３２．
【非特許文献３】Ｂｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６），Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．４４：５２７−５３３．
【非特許文献４】Ｈｕｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６），Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１３：２７９６−２８０７．
【非特許文献５】Ｏｈｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，２９：３７３−３７８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、長時間、肝細胞の活性、特に、薬剤代謝の活性を維持し、創薬開発に用いることができる、人工肝組織を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、驚くべきことに、細胞接着性ハイドロゲル床に肝細胞を播種し、その上に間質細胞を含むシート状細胞群を被覆することにより、従来の人工肝組織を凌駕する活性を維持する人工肝組織を得ることができることを見出した。すなわち、本発明は以下の内容が含まれる。
【００１２】
［１］  細胞接着性ハイドロゲル床と、
前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に播種された肝細胞と、
前記肝細胞を被覆する、間質細胞を含むシート状細胞群と、
を含む、人工肝組織。
［２］  前記シート状細胞群が、細胞シートである、［１］に記載の人工肝組織。
［３］  前記細胞シートが、収縮した細胞シートである、［２］に記載の人工肝組織。
［４］  前記間質細胞が、線維芽細胞である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の人工肝組織。
［５］  前記細胞接着性ハイドロゲル床が、コラーゲンゲル床である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の人工肝組織。
［６］  薬剤代謝の評価に用いるための、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の人工肝組織。
【００１３】
［７］  人工肝組織の製造方法であって、
（ｉ）培養基材上にコラーゲン床を形成する工程、
（ｉｉ）前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に、肝細胞を播種して、培養する工程、
（ｉｉｉ）前記肝細胞の上に、間質細胞を含むシート状細胞群を載せ、培養する工程、
を含む、方法。
［８］  前記シート状細胞群が、細胞シートである、［７］に記載の方法。
［９］  前記細胞シートが、刺激応答性培養基材上で培養された細胞群を、刺激を与えることで剥離させることで得られた細胞シートである、［８］に記載の方法。
［１０］  前記細胞シートが、収縮した細胞シートである、［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］  前記間質細胞が、線維芽細胞である、［７］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］  前記細胞接着性ハイドロゲル床が、コラーゲンゲル床である、［７］〜［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］人工肝組織が、薬剤代謝の評価に用いるための人工肝組織である、［７］〜［１２］のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来のように、培養面に対して特殊なパターニングを設けることによって肝細胞の空間的な位置を厳密に制御することを必要とせず、長時間、肝細胞の活性、特に、薬剤代謝の活性を維持し、創薬開発に用いることができる人工肝組織を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】一実施態様における、本発明の人工肝組織を作製する方法及び得られる人工肝組織の概略図である。
【図２】一実施態様における、本発明の人工肝組織を作製する方法の培養スケジュールを示す。
【図３】一実施例における、本発明の人工肝組織の薬剤代謝活性を示す。（Ａ）ＣＹＰ１Ａ２酵素活性、（Ｂ）ＣＹＰ３Ａ４酵素活性。
【図４】一実施例における、長期間培養後（０、５、７、１４又は２１日後）の本発明の人工肝組織の薬剤代謝酵素活性（ＣＹＰ１Ａ２）を示すグラフである。
【図５】一実施例における、長期間培養後（０、５、７、１４又は２１日後）の本発明の人工肝組織の薬剤代謝酵素活性（ＣＹＰ２Ｂ６）を示すグラフである。
【図６】一実施例における、長期間培養後（０、５、７、１４又は２１日後）の本発明の人工肝組織の薬剤代謝酵素活性（ＣＹＰ３Ａ４）を示すグラフである。
【図７】一実施例における、長期間培養後（０、５又は７日後）の本発明の人工肝組織及び比較例の人工肝組織の薬剤代謝酵素活性を示すグラフである。
【図８】一実施例における、人工肝組織の尿素合成量（μｇ／１０６個の肝細胞／日）の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、「肝細胞」とは、肝臓を構成する主要な細胞であって、タンパク質の合成と貯蔵、炭水化物の変換、コレステロール、胆汁酸、リン脂質の合成並びに物質の解毒、編成、排出に関与する細胞であり、「肝実質細胞」ともいう。従来、肝細胞は、肝臓又は肝組織から単離された肝細胞、特に初代肝細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された場合、数時間で活性を失ってしまうという課題があった。しかしながら、本発明の人工肝組織は、長時間にわたってその活性を維持するという極めて優れた効果を有している。
【００１７】
肝臓や肝細胞は、代謝において重要な役割を果たす。代謝に関与する酵素として、例えばシトクロムＰ４５０（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０、以下「ＣＹＰ」という）が知られている。ＣＹＰは様々な基質を酸化し、解毒を行う酵素として知られている。また、ＣＹＰはステロイドホルモンの生合成、脂肪酸の代謝などを行う。ＣＹＰは、そのアミノ酸配列の相同性に基づいて分類されており、ヒトにおいては、以下のものが知られている。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
本明細書において、「人工肝組織」とは、生体から得られた肝臓又はその一部の肝組織とは異なり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、肝細胞を含む細胞群を用いて再構築された組織をいう。本発明の人工肝組織は、細胞接着性ハイドロゲル床と、前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に播種された肝細胞と、前記肝細胞を被覆する、間質細胞を含むシート状細胞群とを含んでいる。本発明は、従来の人工肝組織とは異なり、長時間（例えば、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、２１日以上）、肝細胞の活性を維持し、例えば創薬開発に用いることができる人工肝組織を提供することができる。
【００２０】
本明細書において、「肝細胞の活性」とは、尿素の合成量、肝細胞が発現するタンパク質の量（例えば、アルブミン産生量）、又は酵素、特に薬剤代謝酵素の活性を意味する。薬剤代謝の活性は、例えば、ＣＹＰ（例えば、ヒトの場合、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４又はＣＹＰ３Ａ５）の発現量や、特異的な基質によって誘導されるＣＹＰの発現量に相関するものであり、ＣＹＰの発現量を測定することによって評価することができる。あるいは、肝細胞にＣＹＰの基質を添加し、当該基質がＣＹＰによって変換される量（ＣＹＰ酵素活性）を測定することによって、薬剤代謝の活性を評価することができる。
【００２１】
ＣＹＰの発現量又はＣＹＰ酵素活性の測定は、当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。例えば、ＣＹＰの発現量の測定は、定量的ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）、ウエスタンブロット法、フローサイトメータ法（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法など、周知の技術を用いて実施することができる。ＣＹＰ酵素活性は、肝細胞にＣＹＰの基質を添加し、当該基質がＣＹＰによって変換される量（ＣＹＰ酵素活性）を測定することによって評価することができ、その場合、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定することができる。また、ＣＹＰ酵素活性の相対比（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）を評価する場合、市販されているＣＹＰ酵素活性の測定に利用可能なキットを用いても実施可能であり、例えば、ＣＹＰ３Ａ４であれば、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＰ４５０−Ｇｌｏ（商標）  ＣＹＰ３Ａ４  Ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−ＩＰＡなどを利用することができる。測定するＣＹＰの種類によって公知の方法やキットを使用すればよい。
【００２２】
肝細胞の活性は、例えば、少なくとも１種類以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上のＣＹＰの発現量又はＣＹＰ酵素活性を測定することによって評価してもよい。
【００２３】
本明細書において、「肝細胞の活性の維持」とは、従来の凍結肝細胞を用いた懸濁培養系（使用時に、融解）においては、培養開始後数時間未満（例えば、２時間未満、３時間未満、４時間未満、５時間未満又は６時間未満）で実質的に消失する薬剤代謝の活性が、６時間以上（例えば、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１３日以上、１４日以上又は２１日以上）培養した後であっても、人工肝組織が薬剤代謝の活性を示すことをいう。
【００２４】
本発明であれば、肝細胞の活性が高い人工肝組織を提供可能となる。本明細書において、「肝細胞の活性が高い」とは、本発明の人工肝組織を６時間以上（例えば、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１３日以上、１４日以上又は２１日以上）培養した後であっても、融解直後に使用した凍結肝細胞の活性（例えば、融解後２時間未満、３時間未満、４時間未満、５時間未満又は６時間未満）の１０％〜５００％、例えば、１０％〜４００％、１５％〜３００％、２０％〜２５０％、２５％〜２００％の活性を維持した状態をいう。
【００２５】
本発明の人工肝組織は、移植用の人工肝組織としても用いることも可能である。本発明の人工肝組織には、肝細胞以外にも、肝臓に含まれる細胞、例えば、類洞内皮細胞、クッパー細胞、肝星細胞、ピット細胞、胆管上皮細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞及び／又は線維芽細胞、その他の細胞が含まれてよい。
【００２６】
本発明に用いられる「肝細胞」は、肝臓又はその一部から単離される細胞であってもよく、初代培養肝細胞、肝前駆細胞、肝幹細胞又は不死化した肝細胞であってもよく、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞又はＭｕｓｅ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導して得られる肝細胞であってもよい。また、本発明に用いられる「肝細胞」は、哺乳動物由来（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等）、より好ましくは、ヒト及びヒト以外の霊長類由来、特に好ましくはヒトの肝細胞である。本発明の人工肝組織において、細胞接着性ハイドロゲル床上に播種される肝細胞の細胞数は、細胞の状態、動物種、細胞種などによって異なるため、特に限定されないが、所望の効果、例えば薬物代謝活性が評価できる程度の細胞数が播種されればよく、例えば、０．３×１０4〜１０×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．５×１０4〜８×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．７×１０4〜５×１０6個／ｃｍ2であってもよく、１．０×１０４〜１．０×１０６個／ｃｍ２であってもよく、５．０×１０４〜５．０×１０５個／ｃｍ２の細胞密度で播種されてもよい。
【００２７】
本明細書において、「細胞接着性ハイドロゲル床」とは、播種される肝細胞の下に設けられたゲル状の細胞接着性ハイドロゲルをいい、例えば、０．０１μｍ以上、０．１μｍ以上、１μｍ以上、１０μｍ以上、１００μｍ以上、１ｍｍ以上またはそれ以上の厚みを有している。細胞接着性ハイドロゲルの厚みの上限については、用途によって異なり、例えば、５ｃｍ以下、１ｃｍ以下、５ｍｍ以下又は２ｍｍ以下であってもよい。
【００２８】
本明細書において、「細胞接着性ハイドロゲル」とは、細胞外基質成分、或いは、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル、ラミニンゲル及びフィブリンゲル、並びにそれらの混合物からなる群から選択されるものをいう。これらのうち、キトサンゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ペプチドゲル及びラミニンゲルは、例えば温度、ｐＨ及び／又は塩濃度を変更することによりゲル化される。フィブリンゲルは、モノマーであるフィブリノーゲンが酵素であるトロンビンと作用することによりゲル化される。本発明に用いられる細胞接着性ハイドロゲル床に用いられる細胞接着性ハイドロゲルは、好ましくはコラーゲンゲルである。本明細書において、コラーゲンゲルに含まれるコラーゲンとは、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、タイプＶＩ、タイプＶＩＩ、タイプＶＩＩＩ、タイプＩＸ、タイプＸ、タイプＸＩ、タイプＸＶ、タイプＸＶＩＩ、もしくはタイプＸＶＩＩＩのコラーゲン又はアテロコラーゲン、あるいはその組み合わせである。コラーゲンゲルに含まれるコラーゲンは、例えば、哺乳動物由来（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等）であってもよく、哺乳動物のコラーゲン遺伝子を基に、遺伝子工学的に得られたものであってもよい。
【００２９】
本明細書において、「シート状細胞群」とは、任意の細胞を含む１層又は複数層のシート形状の組織をいう。シート状細胞群は、細胞とハイドロゲルとを混合して、培養することにより得られたものであってもよく、細胞シートであってもよい。本発明に用いられるシート状細胞群は、好ましくは細胞シートである。
【００３０】
細胞シートを得る方法としては、例えば、温度、ｐＨ、光、電気等の刺激によって分子構造を変化させる高分子が被覆された刺激応答性培養基材上で細胞を培養し、温度、ｐＨ、光、電気等の刺激の条件を変えて刺激応答性培養基材を変化させることで、細胞同士の接着状態は維持しつつ、刺激応答性培養基材から細胞をシート状に剥離する方法、任意の培養基材にて細胞を培養し、細胞培養基材上のシート状の細胞群を端部から物理的にピンセット等により剥離する方法、ハイドロゲル等と共に細胞を培養基材上に播種し、形成されたシート状の細胞群を剥離する方法などが挙げられる。
【００３１】
本明細書において、刺激応答性培養基材に被覆されている「刺激応答性高分子」としては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ビニルフェロセン）共重合体、γ線照射したポリ（ビニルメチルエーテル）（ＰＶＭＥ）、ポリ（オキシエチレン）、核酸などの生体物質を高分子に組み込んだ樹脂、及び上記高分子に対して架橋剤によって架橋し作製したゲルなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３２】
本明細書において「温度応答性高分子」は、刺激応答性高分子の１つであり、温度に応答して、その形状及び／又は性質を変化させる高分子をいう。温度応答性高分子としては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ビニルフェロセン）共重合体、γ線照射したポリ（ビニルメチルエーテル）及び上記高分子に対して架橋剤によって架橋し作製したゲルなどが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート）共重合体、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム）共重合体及び上記高分子に対して架橋剤によって架橋したものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３３】
本明細書において、培養基材に被覆されている温度応答性高分子としては、例えば、水に対する上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ：Ｕｐｐｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）又は下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ：Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）が０〜８０℃であるものが挙げられるがそれらに限定されない。臨界溶液温度とは、高分子の形状及び／又は性質を変化させる閾値の温度をいう。本発明では、好ましくは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）が、少なくともその培養面の一部に被覆された細胞培養基材が使用され得る。
【００３４】
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）は３２℃に下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有する高分子であり、遊離状態であれば、水中で３２℃以上の温度で脱水和を起こしＰＩＰＡＡｍが凝集して白濁する。逆に３２℃未満の温度ではＰＩＰＡＡｍは水和し、水に溶解した状態となる。本発明の一実施態様で用いられる温度応答性培養基材は、ＰＩＰＡＡｍがシャーレなどの培養基材に被覆されて固定されたものである。したがって、３２℃以上の温度であれば、培養表面のＰＩＰＡＡｍも同じように脱水和するが、ＰＩＰＡＡｍが培養基材に固定されているために培養基材表面が疎水性を示す。逆に、３２℃未満の温度では、培養基材表面のＰＩＰＡＡｍは水和するが、ＰＩＰＡＡｍが培養基材表面に被覆されているため、培養基材表面が親水性を示す。疎水性の培養基材表面には細胞が付着して増殖することができ、また、親水性の培養基材表面は細胞が付着しにくい表面である。そのため、温度応答性培養基材を３２℃未満に冷却すると、細胞が培養基材表面から剥離する。
【００３５】
細胞シートは、例えば温度応答性培養基材上でコンフルエント又はサブコンフルエントになるまで細胞を培養し、温度を、被覆ポリマーの上限臨界溶液温度以上若しくは下限臨界溶液温度以下にすることによって得ることができる。細胞シートを、より早く、高効率に剥離させて回収するために、培養基材を軽くたたいたり、揺らしたりする方法や、ピペットを用いて培地を撹拌する方法、ピンセットを用いる方法等を単独又は併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は常法に従えばよい。
【００３６】
本発明の一実施態様において用いられる細胞シートは、好ましくは、収縮した細胞シートである。細胞シートは、培養基材表面上で培養されているときは単層状態であるが、培養基材表面から剥離されると、収縮する。それにより、細胞シートに含まれる細胞が部分的に重なり、細胞密度が上昇する。収縮した細胞シートで肝細胞を被覆することにより、長時間、肝細胞の活性を高いまま維持することが可能となる。
【００３７】
本明細書において、「間質細胞」とは、臓器の結合組織の細胞であって、生体組織の支持構造を構成し、実質細胞を支える細胞である。本発明に用いられる間質細胞は、生体から単離される初代細胞であってもよく、株化された細胞であってもよく、或いは、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞又はＭｕｓｅ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導して得られる間質細胞であってもよい。本発明の一実施形態において、シート状細胞群に含まれる間質細胞は、線維芽細胞、周皮細胞、肝星細胞、内皮細胞もしくは平滑筋細胞、又はそれらの組み合わせであり、好ましくは線維芽細胞である。本発明に用いられる「間質細胞」は、哺乳動物由来（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等）、より好ましくは、ヒト及びヒト以外の霊長類由来、特に好ましくはヒトの間質細胞である。また、本発明に用いられるシート状細胞群には、間質細胞以外の細胞がさらに含まれても良い。
【００３８】
本発明において、シート状細胞群に含まれる細胞数は、動物種や細胞種によって異なるが、例えば、０．３×１０4〜１０×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．５×１０4〜８×１０6個／ｃｍ2であってもよく、０．７×１０4〜５×１０6個／ｃｍ2であってもよい。
【００３９】
本発明に用いられるシート状細胞群を、播種された肝細胞の上に被覆する方法としては、例えば、ピペット等によって培養液中に浮かんでいるシート状細胞群を培養液ごと吸い取り、別の培養皿の肝細胞上にシート状細胞群を放出して被覆する方法、シート状細胞群の移動治具を用いて積層する方法等が挙げられる。
【００４０】
また、本発明は、人工肝組織の製造方法を提供し、以下の工程が含まれる。
（ｉ）培養基材上に細胞接着性ハイドロゲル床を形成する工程、
（ｉｉ）前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に、肝細胞を播種して、培養する工程、
（ｉｉｉ）前記肝細胞の上に、間質細胞を含むシート状細胞群を載せ、培養する工程。
【００４１】
本発明の方法によって得られる人工肝組織であれば、従来のように、培養面に対して特殊なパターニングを設けることによって肝細胞の空間的な位置を厳密に制御することなく、長時間にわたってその活性を維持することができるという極めて優れた効果を有している。
【実施例】
【００４２】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００４３】
１．使用した材料
各実施例では、以下の材料を用いた。
・φ３５ｍｍ培養皿（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、＃３５３００１）
・コラーゲンＩコート６ウェルプレート（サーモフィッシャー）
・コラーゲンゲル溶液（０．５％タイプＩコラーゲン溶液）（ＫＯＫＥＮ社、ＩＡＣ−５０）
・温度応答性培養皿（セルシード（日本）、ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、φ３５ｍｍ）
・凍結ヒト肝細胞（サーモフィッシャー、ＨＭＣＰＴＳ）
・マウス線維芽細胞（３Ｔ３）
・ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）
・ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（シグマアルドリッチ、Ｄ６４２９；コーニング、１０−０１７−ＣＶＲ）
・フィブリノーゲン（シグマ、Ｆ８６３０）
・トロンビン（シグマ、Ｆ４６４８）
・（比較例用）Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ（商標）９６ウェルプレート（東洋合成工業、日本）
【００４４】
２．方法
２−１．人工肝組織の製造方法
図１は、一実施態様における本発明の人工肝組織の製造方法を示す概略図である。また、図２は、一実施態様における本発明の人工肝組織の製造方法のスケジュールを示す。
【００４５】
人工肝組織は、以下の手順で作製した（図１及び図２参照）。
（１）細胞シートを積層する３〜５日前にマウス線維芽細胞（３Ｔ３）又はヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（１×１０６個）をφ３５ｍｍの温度応答性培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において、ダルベッコ改変イーグル培地（１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、１％（ｖ／ｖ）のペニシリン‐ストレプトマイシン溶液を含む）中で培養した。
（２）φ３５ｍｍの培養皿内に内径１８ｍｍの円形のシリコーン枠を設置し、その枠内に１００μＬのコラーゲンゲルを加え、直径約１８ｍｍのコラーゲンゲル床（厚さ：約４００μｍ）を作製した。
（３）細胞シートを積層する１日前に解凍した凍結ヒト肝細胞（２０×１０4個又は１０×１０4個）をコラーゲンゲル床に播種し、播種用培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ培地Ｅ（サーモフィッシャー、Ａ１２１７６０１）にＨｅｐｔｏｃｙｔｅ  Ｐｌａｔｉｎｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（サーモフィッシャー、ＣＭ３０００）を加えたもの）を加えて、２４時間、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において培養した。
（４−１）マウス線維芽細胞（３Ｔ３）又はヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を培養している温度応答性培養皿を２０℃まで温度を下げ、マウス線維芽細胞（３Ｔ３）又はヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を細胞シート（以下、それぞれ「３Ｔ３細胞シート」又は「ＮＨＤＦ細胞シート」という。）として剥離した。
（５−１）３Ｔ３細胞シート又はＮＨＤＦ細胞シートを培地ごとピペットで吸い取り、コラーゲンゲル床に播種された肝細胞上（事前に播種用培地は除去されている）に、３Ｔ３細胞シート又はＮＨＤＦ細胞シートを排出することで積層した。その後、培養用培地（Ｍａｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１０：２０２７−２０５３．に記載のＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）を加えて、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において培養した。
（６）２〜３日毎に、新鮮な培養用培地に交換した。
【００４６】
なお、コラーゲンゲル床に播種された肝細胞上に細胞シートを積層する方法して、上記工程（４−１）及び（５−１）に代わりに、以下の工程を実施する方法も採用した（図８）。
【００４７】
（４−２）Ｈａｒａｇｕｃｈｉらの方法（Ｈａｒａｇｕｃｈｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｂｙ  ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｈｅｅｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，７，８５０，２０１２．）に従って、ゼラチンゲル付きスタンプデバイスを作製した。ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を培養している温度応答性培養皿の播種用培地を除去し、フィブリノーゲン２μＬを滴下した。その後、スタンプする面にトロンビン２μＬを滴下したスタンプデバイスをヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に密着させた。その状態にて室温で放置し、ＮＨＤＦ細胞シートをスタンプデバイスに接着させた。
（５−２）コラーゲンゲル床に播種された肝細胞上（事前に播種用培地は除去されている）にフィブリノーゲン２μＬを滴下した。その後、ＮＨＤＦ細胞シートが接着したゼラチンゲルをスタンプデバイスから切り出し、肝細胞と接する面にトロンビン２μＬを滴下し、肝細胞上に載せた。５分間静置後、３７℃にて１０分間インキュベートした。ゼラチンが溶けた後、温めたＰＢＳで溶けたゼラチンを洗い流した。その後、培養用培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下において培養した。
【００４８】
上記手順を基本として、比較するために、コラーゲンＩコート６ウェルプレート（サーモフィッシャー）上で培養した肝細胞（２０×１０4個／ウェル）（コラーゲンゲル床なし、細胞シートによる被覆なし）、コラーゲンゲル床に播種した肝細胞（２０×１０4個）（細胞シートによる被覆なし）も作製した。また、細胞シートの代わりに、肝細胞上に直接３Ｔ３細胞（１×１０６個）を播種した人工肝組織も作製した。
【００４９】
なお、実施例１〜３では、工程（４−１）及び（５−１）を実施し、実施例４では、工程（４−２）及び（５−２）を実施して人工肝組織を作製した。
【００５０】
２−２．ＣＹＰ活性の測定方法
上記で作製した人工肝組織において、２日後、５日後、７日後、１４日後及び２１日後において、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４の活性を測定した。具体的には、肝組織にＣＹＰの基質３種（１００μＭ  フェナセチン、２００μＭ  ブプロピオンおよび５０μＭ  ミダゾラム）を溶解したＷｉｌｌｉａｍ’ｓ培地Ｅを添加し、１０分後および３０分後に培地を取得した。取得培地中の各基質に対応する代謝成分（アセトアミノフェン、ＯＨ−ブプロピオン、ＯＨ−ミダゾラム）の濃度を液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）にて定量し、各ＣＹＰの活性値を求めた。１０分後および、３０分後に取得した培地の内、高い活性値を示した方のデータを採用した。
【００５１】
２−３．尿素合成量の測定方法
上記で作製した人工肝組織において、尿素合成量を測定した（図８）。具体的には、以下の人工肝組織において、６日目〜２１日目に、培地上清中に含まれる尿素合成量を測定した。
・Ｌ２０：２０×１０４個のヒト肝細胞をコラーゲンゲル床上に播種し、ＮＨＤＦ細胞シート（１×１０６個）を積層した系；
・Ｃ２０：２０×１０４個のヒト肝細胞をコラーゲンゲル床上に播種し、ＮＨＤＦ細胞シートを積層していない系；
・Ｌ１０：１０×１０４個のヒト肝細胞をコラーゲンゲル床上に播種し、ＮＨＤＦ細胞シート（１×１０６個）を積層した系
・Ｃ１０：１０×１０４個のヒト肝細胞をコラーゲンゲル床上に播種し、ＮＨＤＦシートを積層していない系
・ＦＢＳ２０：２０×１０４個のヒト肝細胞を、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）をプレコートした培養皿上に播種した系（コントロール）
【００５２】
尿素合成量（μｇ／１０６個の肝細胞／日）は、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（ＴＭ）  Ｕｒｅａ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＤＩＵＲ−１００）を用いて測定した。
【００５３】
３．実施例１
図３は、コラーゲンコートプレート上に播種した肝細胞（コラーゲンコート培養）と細胞シート積層人工肝組織（細胞シート積層肝モデル）の、フェナセチン代謝（ＣＹＰ１Ａ２）及びミダゾラム代謝（ＣＹＰ３Ａ４）におけるＣＹＰ酵素活性を示す図である。点線は、懸濁培養系の肝細胞の活性値（Ｄａｙ０）を示している。図からも明らかであるように、本発明の人工肝組織は、長期間にわたって、コラーゲンコートプレート上で培養した肝細胞よりも、ＣＹＰ活性が維持されている。また、その値は、従来行われている濁培養系（Ｄａｙ０）のＣＹＰ活性（ＣＹＰ１Ａ２：９３．２ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／１０6ｃｅｌｌ、ＣＹＰ３Ａ４：２１７ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／１０6ｃｅｌｌ）を超える値を示した。
【００５４】
４．実施例２
図４〜６は、コラーゲンコートプレート上に播種した肝細胞（コラーゲンコート培養）；コラーゲンゲル床に播種した肝細胞（コラーゲンゲルのみ）；コラーゲンゲル床に播種した肝細胞上に３Ｔ３細胞シートを被覆した人工肝組織（３Ｔ３シート積層）；コラーゲンゲル床に播種した肝細胞上にＮＨＤＦ細胞シートを被覆した人工肝組織（ＮＨＤＦシート積層）；及びコラーゲンゲル床に播種した肝細胞上に３Ｔ３細胞を播種した人工肝組織（３Ｔ３播種）の、フェナセチン（図４、ＣＹＰ１Ａ２）、ブプロピオン（図５、ＣＹＰ２Ｂ６）又はミダゾラム代謝（図６、ＣＹＰ３Ａ４）におけるＣＹＰ酵素活性を示す図である。
【００５５】
その結果、３Ｔ３シート及びＮＨＤＦシートを積層した人工肝組織では、いずれもＣＹＰ酵素が、高活性を長期間維持することが明らかとなった。
【００５６】
５．実施例３
図７は、本発明によって得られる人工肝組織（細胞シート積層系）と、市販されている人工肝組織作製キット（Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ（登録商標））（東洋合成工業、日本）（比較例）のＣＹＰ酵素活性を比較した結果を示す。Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ（登録商標）は、付属の説明書に従って人工肝組織を調製した。３種の基質（フェナセチン、ブプロピオン、およびミダゾラム）を溶解した培地を添加し、１０分または３０分後に取得した培地中の各基質に対応する代謝成分（それぞれ、アセトアミノフェン、ＯＨ−ブプロピオン、ＯＨ−ミダゾラム）の濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法にて定量し、求めた各ＣＹＰ酵素活性を示す。
【００５７】
その結果、本発明の人工肝組織は、Ｃｅｌｌ−ａｂｌｅ（登録商標）の系よりも、ＣＹＰ酵素活性が総じて高い値を示した。
【００５８】
６．実施例４
図８は、肝細胞の細胞数の違いと、細胞シートの有無による、尿素合成量（μｇ／１０６個の肝細胞／日）の経時変化を示すグラフである。図８の結果より、２０万個の細胞を播種した方が１０万個播種した場合よりも、肝機能の指標となる尿素合成量が大きくなり、持続時間も長くなることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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