(57)【要約】【課題】カロリー制限（ＣＲ）のマーカーを提供すること。【解決手段】カロリー制限（ＣＲ）のマーカーは、動物をＣＲ条件に曝露し、複数の被験体群においてＣＲ条件に応答して差次的に発現される１またはそれより多い遺伝子を選択することにより、選択された組織において同定することができる。候補化合物は、候補化合物で処理した動物における遺伝子の発現産物の組織レベルを、ＣＲに付された動物のレベルと比較することにより、動物に投与されるとＣＲの効果を模倣する可能性のある能力に関してスクリーニングすることができる。【選択図】図１
2019037240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書および図面に記載の物、方法またはシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇによって付与された助成金第１Ｒ４３ＡＧ０３４８３３−０１Ａ１号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、全般的には、カロリー制限の組織特異的普遍的バイオマーカーを包含する、カロリー制限の普遍的バイオマーカーを同定するための方法に関する。具体的には、本発明は、カロリー制限により発現に変化が生じる遺伝子の確固としたパネルと、カロリー制限の有益な効果を誘発することができる栄養素、薬物または他の機能性成分（即ち、「カロリー制限模倣物」）を同定するためのこのような普遍的バイオマーカーの使用とを提供する。
【背景技術】
【０００３】
若年期から始めるにしろ、中年期から始めるにしろ、適宜（ａｄ  ｌｉｂｉｔｕｍ）レベルを下回るカロリー摂取の制限（ＣＲ）は、齧歯類等、哺乳動物を包含する複数の種において寿命を延ばし、多くの加齢に関連する状態の開始を防ぐまたは遅らせることを示した。実際に、ヒトにおける健康パラメータを改善するＣＲの能力を検査するための臨床治験が開始された。しかし、食物欠乏により生じる社会的、生物学的および心理学的影響は、この食餌性レジメンの広範な実施と適合しない。このため、研究は、カロリー摂取を低下させることなくＣＲの有益な効果を模倣することのできる物質の同定に着目した。ＣＲの１または複数種の生理学的または生化学的効果を模倣する化合物の同定に向けての試みが為され、その例として、動物または細胞へと曝露した後にＣＲの全般的遺伝子発現プロファイルを模倣することができる化合物の発見が挙げられる。後者に関連して、遺伝子発現プロファイルの全般的な変更に基づく、ＣＲを模倣する化合物を同定するための方法が開示されている（Ｓｐｉｎｄｌｅｒら、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６，４０６，８５３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このようなアプローチの有効性にもかかわらず、検査したマウスモデルにおけるＣＲバイオマーカーの普遍的組織特異的パネルは未だ同定されていない。異なるマウス系統は、特有の遺伝的、代謝的および生理的特徴を有するため、いずれか特定のマウス系統におけるＣＲに応答したいずれか所定の遺伝子発現変化が、他のマウス系統または生物において再現される可能性は低い。よって、現在までに同定された有用なマーカーはない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示において説明されている技術は、普遍的カロリー制限（ＣＲ）バイオマーカー、即ち、複数の異なる遺伝的に多様な動物系統にわたり一貫してＣＲ応答に相関するマーカーを同定することにより、ＣＲバイオマーカーを同定する先の試みの不足を克服する。普遍的ＣＲバイオマーカーのパネルの同定は、動物系統または品種とは無関係に、また、全般的遺伝子発現プロファイリングを必要とすることなく、ＣＲを模倣する化合物の迅速なスクリーニングを可能にする。
【０００７】
一部の実施形態において、本開示は、特異的な組織におけるＣＲの確固としたかつ普遍的に適用可能な遺伝子発現マーカーを同定するための系および方法を提供する。一実施形態は、ＣＲに応答して組織において差次的に発現されるポリヌクレオチドの遺伝子パネルを提供する。特定の実施形態は、マウス、イヌ、ネコまたはヒト組織に由来する遺伝子を包含する。別の一態様において、遺伝子パネルは、肝臓組織、心臓組織、肺組織、脳組織、上皮組織、結合組織、白色脂肪、骨格筋、血液、神経組織、尿および唾液のいずれかに由来する遺伝子を包含する。
【０００８】
一部の実施形態において、評価される遺伝子は、表１、表２、表３、表４、表５、表６またはこれらのいずれかの組合せに見出される１またはそれより多い遺伝子である。一部の実施形態において、パネルにおける遺伝子は、ＣＲ被験体と対照被験体との間の遺伝子発現の変化を提示する。一部の実施形態において、パネルにおける遺伝子は、ＣＲの様々な動物モデルにわたるその検証のために選択される。
【０００９】
一部の実施形態において、本技術は、ＣＲの普遍的マーカーである遺伝子とハイブリダイズするポリヌクレオチドまたは係る遺伝子にコードされるポリペプチドと結合するポリペプチド結合剤を包含し得る、組織におけるＣＲの普遍的マーカーの差次的発現を検出するためのプローブを提供する。別の一実施形態において、組成物は、２種またはそれより多く（例えば、３種またはそれより多く、５種またはそれより多く、１０種またはそれより多く、２０種またはそれより多く、５０種またはそれより多く等）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドプローブを包含する。さらに特定の態様において、ポリヌクレオチドは、心臓組織または骨格筋または白色脂肪組織に由来する。
【００１０】
一実施形態において、キットは、表１から６に列挙されている遺伝子またはこれらの断片と特異的にハイブリダイズする増幅オリゴヌクレオチドと、表１から６に列挙されているタンパク質をコードする遺伝子またはこれらの断片と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む標識プローブとを包含することができる。特定の一実施形態において、プローブは、基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）と結合している（例えば、アレイの一部として）。
【００１１】
一部の実施形態において、本発明は、複数の動物系統の選択された組織において差次的に発現される１またはそれより多い遺伝子の発現プロファイルの決定により、ＣＲを模倣する候補化合物の効果を測定するための方法を提供する。
【００１２】
本開示は、本発明者らによる、選択された組織におけるＣＲの普遍的バイオマーカーの確固としたセットを同定するための方法の開発により生まれた。ある一実施形態において、選択された組織におけるカロリー制限（ＣＲ）の組織特異的普遍的マーカーを同定する方法は、複数の被験体群に属する被験体をＣＲ条件に曝露するステップと、被験体群のうちの複数に由来する被験体においてＣＲに応答して差次的に発現される１またはそれより多い遺伝子を選択するステップとを包含する。選択された遺伝子は、被験体群のうちの少なくとも２つまたは３つまたはそれより多くにおいて差次的に発現され得る。特定の一実施形態において、選択された遺伝子は、検査した被験体群の５０％またはそれより多くにおいて差次的に発現される。実施形態を踏まえると、被験体群は、マウス群、イヌ群、ネコ群またはヒト群を包含し得る。
【００１３】
一部の実施形態において、本発明は、所定の条件または候補化合物が、被験体におけるＣＲの模倣において有効となり得るかまたはＣＲ擬態の１もしくは複数の利益となり得るか評価する方法を提供する。方法は、第１の被験体をＣＲに曝露するステップと、第１の被験体に由来する組織の試料における２種またはそれより多い遺伝子の発現産物のレベルを測定して、ＣＲ発現プロファイルを得るステップと、第２の被験体に候補化合物を投与するステップと、第２の被験体に由来する組織の試料における発現産物を測定するステップと、レベルを比較して、該候補化合物がＣＲを模倣する程度を決定するステップとを包含し得る。マイクロアレイ解析、逆転写ＰＣＲ、定量的逆転写ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション解析のいずれかを用いて、試料における発現産物（例えば、ｍＲＮＡ）を測定することができる。このように評価された複数の候補化合物は、それぞれがＣＲを模倣する程度に基づきランク付けすることができる。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＣＲに応答して組織において差次的に発現される複数のポリヌクレオチドを含む遺伝子パネルであって、前記ポリヌクレオチドが、表１から６に列挙されている遺伝子から選択される、遺伝子パネル。
（項目２）
前記組織が、マウス被験体に由来する、項目１に記載の遺伝子パネル。
（項目３）
前記組織が、イヌ被験体またはネコ被験体に由来する、項目１に記載の遺伝子パネル。（項目４）
前記組織が、ヒト被験体に由来する、項目１に記載の遺伝子パネル。
（項目５）
前記組織が、肝臓組織、心臓組織、肺組織、脳組織、上皮組織、結合組織、白色脂肪、骨格筋、血液、神経組織、尿および唾液からなる群より選択される、項目１に記載の遺伝子パネル。
（項目６）
前記組織が、心臓組織であり、前記ポリヌクレオチドが、表１に列挙されている遺伝子から選択される、項目５に記載の遺伝子パネル。
（項目７）
前記ポリヌクレオチドが、表４に列挙されている遺伝子から選択される、項目６に記載の遺伝子パネル。
（項目８）
前記組織が、骨格筋であり、前記ポリヌクレオチドが、表２から選択される、項目５に記載の遺伝子パネル。
（項目９）
前記ポリヌクレオチドが、表５に列挙されている遺伝子から選択される、項目８に記載の遺伝子パネル。
（項目１０）
前記組織が、白色脂肪であり、前記ポリヌクレオチドが、表３から選択される、項目５に記載の遺伝子パネル。
（項目１１）
前記ポリヌクレオチドが、表６に列挙されている遺伝子から選択される、項目１０に記載の遺伝子パネル。
（項目１２）
組織におけるＣＲの普遍的マーカーの差次的発現を検出するためのプローブであって、
ａ）表１から３に列挙されている遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはその断片、または
ｂ）表１から６に列挙されている遺伝子にコードされるポリペプチドと結合するポリペプチド結合剤
のうち１種を含む、プローブ。
（項目１３）
前記組織が、心臓組織であり、前記プローブが、表１に列挙されている遺伝子から選択されるポリヌクレオチドを含む、項目１２に記載のプローブ。
（項目１４）
前記ポリヌクレオチドが、表４に列挙されている遺伝子から選択される、項目１３に記載のプローブ。
（項目１５）
前記組織が、骨格筋であり、前記プローブが、表２から選択されるポリヌクレオチドを含む、項目１２に記載のプローブ。
（項目１６）
前記ポリヌクレオチドが、表５に列挙されている遺伝子から選択される、項目１５に記載のプローブ。
（項目１７）
前記組織が、白色脂肪であり、前記プローブが、表３から選択されるポリヌクレオチドを含む、項目１２に記載のプローブ。
（項目１８）
前記ポリヌクレオチドが、表６に列挙されている遺伝子から選択される、項目１７に記載のプローブ。
（項目１９）
２種またはそれより多いプローブを包含する、組織における差次的遺伝子発現を検出するための組成物であって、前記プローブが、
ａ）表１から６に列挙されている２種またはそれより多い遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはその断片、または
ｂ）表１から６に列挙されている２種またはそれより多い遺伝子にコードされるポリペプチドと結合するポリペプチド結合剤
を含む、組成物。
（項目２０）
前記組織が、心臓組織であり、前記プローブが、表１に列挙されている遺伝子から選択されるポリヌクレオチドを含む、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記ポリヌクレオチドが、表４に列挙されている遺伝子から選択される、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記組織が、骨格筋であり、前記プローブが、表２から選択されるポリヌクレオチドを含む、項目１９に記載の組成物。
（項目２３）
前記ポリヌクレオチドが、表５に列挙されている遺伝子から選択される、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
前記組織が、白色脂肪であり、前記プローブが、表３から選択されるポリヌクレオチドを含む、項目１９に記載の組成物。
（項目２５）
前記ポリヌクレオチドが、表６に列挙されている遺伝子から選択される、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記プローブが、ＰＣＲに適したオリゴヌクレオチドプライマーである、項目１９に記載の組成物。
（項目２７）
前記プローブが、抗体である、項目１９に記載の組成物。
（項目２８）
ａ）表１から６に列挙されている遺伝子と特異的にハイブリダイズする増幅オリゴヌクレオチドまたはその断片と、
ｂ）表１から６に列挙されているタンパク質をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその断片を含む標識プローブと
を含む、キット。
（項目２９）
前記プローブが、基材に結合している、項目２８に記載のキット。
（項目３０）
バッファー、対照試薬、固体支持体、標識、説明書、阻害剤、標識試薬、検出試薬および乾燥剤からなる群より選択される少なくとも１種の構成成分をさらに含む、項目２８に記載のキット。
（項目３１）
選択された組織におけるカロリー制限（ＣＲ）の組織特異的普遍的マーカーを同定する方法であって、
ａ）複数の被験体群に属する被験体をＣＲ条件に曝露するステップと、
ｂ）前記複数の被験体群のうちの複数に由来する被験体においてＣＲに応答して差次的に発現される１またはそれより多い遺伝子を選択するステップと、
を含む、方法。
（項目３２）
選択された前記遺伝子が、２つまたはそれより多い被験体群において差次的に発現される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
選択された前記遺伝子が、３つまたはそれより多い被験体群において差次的に発現される、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
選択された前記遺伝子が、検査された前記被験体群の５０％またはそれより多くにおいて差次的に発現される、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記組織が、肝臓組織、心臓組織、肺組織、脳組織、上皮組織、結合組織、白色脂肪、骨格筋、血液、神経組織、尿および唾液からなる群より選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３６）
前記組織が、心臓組織である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記組織が、骨格筋である、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記組織が、白色脂肪である、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
有意性レベルが、ｐ＜０．０１である、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
前記被験体群が、マウスである、項目３１に記載の方法。
（項目４１）
前記被験体群が、イヌまたはネコである、項目３１に記載の方法。
（項目４２）
前記被験体群が、ヒトである、項目３１に記載の方法。
（項目４３）
候補化合物が、被験体に投与されるとＣＲの効果の模倣において有効となる可能性があるか否かを決定するための方法であって、
ａ）第１の被験体をＣＲに曝露するステップと、
ｂ）前記第１の被験体由来の組織の試料における、表１から３に列挙されている２種またはそれより多い遺伝子の発現産物のレベルを測定して、ＣＲ発現プロファイルを得るステップと、
ｃ）前記候補化合物を第２の被験体に投与するステップと、
ｄ）前記第２の被験体由来の組織の前記試料における前記発現産物のレベルを測定するステップと、
ｅ）ｂ）における前記レベルとｄ）における前記レベルとを比較して、前記候補化合物がＣＲを模倣する程度を決定するステップと
を含む、方法。
（項目４４）
前記組織が、肝臓組織、心臓組織、肺組織、脳組織、上皮組織、結合組織、白色脂肪、骨格筋、血液、神経組織、尿および唾液からなる群より選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記組織が、心臓組織である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記組織が、骨格筋である、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記組織が、白色脂肪である、項目４４に記載の方法。
（項目４８）
前記測定するステップが、項目１２または項目１９に記載の組成物を用いて行われる、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
前記プローブが、基材と結合している、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記プローブが、アレイに存在する、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記プローブが、ＰＣＲに適したオリゴヌクレオチドプライマーである、項目４８に記載の方法。
（項目５２）
前記プローブが、抗体である、項目４８に記載の方法。
（項目５３）
前記試料における発現産物を測定するステップが、マイクロアレイ解析、逆転写ＰＣＲ、定量的逆転写ＰＣＲおよびハイブリダイゼーション解析からなる群より選択される検出技法を含む、項目４３に記載の方法。
（項目５４）
候補化合物がＣＲを模倣する程度に基づき複数の前記候補化合物をランク付けするステップをさらに含む、項目４３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、対照群およびＣＲに付された群におけるマウスの体重を示す一連のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
用語「投与」および「投与する」は、ある物質が被験体に提示される仕方を指す。投与は、経口、非経口、経皮、吸入、埋め込み等、様々な当技術分野で公知の経路により達成することができる。よって、経口投与は、薬物を含む経口剤形の嚥下、咀嚼、吸啜により、あるいは液体または半液体形態の摂取、例えば飲むことまたは胃管栄養法により達成することができる。非経口投与は、薬物組成物を静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内または皮下等に注射することにより達成することができる。経皮投与は、皮膚表面に経皮調製物を塗布する（ａｐｐｌｙｉｎｇ）、貼る（ｐａｓｔｉｎｇ）、巻く（ｒｏｌｌｉｎｇ）、付着させる、注ぐ、押圧する、擦ること等により達成することができる。上述および追加的な投与方法は、当技術分野において周知である。
【００１６】
用語「条件」は、本明細書において使用する場合、被験体に適用または投与することのできるいずれかの外因として定義される。この用語は、被験体に投与することのできる化合物、被験体に適用することのできる環境因子、被験体に影響を与え得る刺激等を指す。条件は、定性的であっても定量的であってもよい。よって、この用語は、医薬品、食物サプリメント、食餌レジメン、健康レジメン、食餌性サプリメント、栄養補助食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）、環境、食物、情動刺激、心理的刺激、物理的刺激、遺伝的改変等を包含する。
【００１７】
本明細書において使用する場合、用語「組織」は、材料を形成する、細胞間物質と一緒になった細胞の凝集塊を意味する。細胞は、全て特定の種類のものであっても、複数の細胞型のものであってもよい。組織は、上皮組織、結合組織、筋肉組織、血液または神経組織から選択されるがこれらに限定されない、動物組織の種類のいずれかとなり得る。組織は、いずれかの動物（例えば、ヒト、マウス等）に由来し得る。
【００１８】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において使用する場合、２個またはそれより多いリボヌクレオチド、好ましくは、３個より多いリボヌクレオチドで構成された分子として定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、係る多くの因子は、オリゴヌクレオチドの最終的な機能および使用に依存するであろう。
【００１９】
本明細書において使用する場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ等が挙げられるがこれらに限定されない分子を含有する、いずれかの核酸を指す。この用語は、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン（ｍｅｔｈｙ１ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリン等が挙げられるがこれらに限定されない、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを包含する配列を網羅する。
【００２０】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、全長または断片の所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が保持される限り、全長コード配列またはコード配列のいずれかの部分によりコードされ得る。この用語は、構造遺伝子のコード領域およびコード領域に隣接して位置する配列も網羅し、この配列は、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに相当するように、５’および３’末端の両方において、いずれかの末端に約１ｋｂ以上の距離で位置する。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡに存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡに存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形態の両方を網羅する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と命名される非コード配列に中断されたコード領域を含有する。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）へと転写される遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサー等、調節性エレメントを含有し得る。イントロンは、核または一次転写産物から除去または「スプライシング除去」される。したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳において、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定するよう機能する。
【００２１】
用語「遺伝子パネル」およびそのバリアントは、同定された遺伝子の群、特に、ある共通の特性または特徴に基づき選択される群を指す。例えば、遺伝子パネルは、ある処理または環境因子（例えば、カロリー制限レジメン）により修飾されることが見出された複数の遺伝子を含むことができる。このような用法を踏まえると、用語「パネル」は、「クラスター」、「シグネチャー」、「スーパーマーカー（ｓｕｐｅｒｍａｒｋｅｒ）」、「パターン」その他等、遺伝子のグループ分けを示す他の名称で言及され得る。
【００２２】
用語「発現」は、本明細書において使用する場合、転写、翻訳またはその両方を指すよう用いることができる。したがって、「発現産物」は、転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）と共に、翻訳産物（例えば、ポリペプチド）を指す。
【００２３】
本明細書において使用する場合、用語「遺伝子発現のレベルの変化」は、対照被験体におけるレベルと比べて、被験被験体（例えば、ＣＲ被験体または被験条件に曝露された被験体）における遺伝子発現（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現）のより高いまたはより低いレベルを指す。
【００２４】
ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは、少なくとも約８０％、最も好ましくは、少なくとも約９０または９５％）が、ＤＮＡ配列の定義された長さにわたりマッチする場合、２種のＤＮＡ配列は「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて利用できる標準ソフトウェアを用いて配列を比較することにより、あるいはサザンハイブリダイゼーション実験（例えば、この特定の系に定義されるストリンジェントな条件下の）において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の技能範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｉ＆ＩＩ巻、上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記、を参照されたい。
【００２５】
用語「標準ハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄両方における５倍の食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファーおよび６５℃に実質的に相当する塩および温度条件を指す。しかし、当業者であれば、係る「標準ハイブリダイゼーション条件」が、バッファーにおけるナトリウムおよびマグネシウム濃度、ヌクレオチド配列の長さおよび濃度、パーセントミスマッチ、パーセントホルムアミドその他を包含する特定の条件に依存することを認めるであろう。「標準ハイブリダイゼーション条件」の決定において同様に重要なことは、ハイブリダイズする２配列が、ＲＮＡ−ＲＮＡであるか、ＤＮＡ−ＤＮＡであるか、ＲＮＡ−ＤＮＡであるかである。係る標準ハイブリダイゼーション条件は、周知の式に従って当業者により容易に決定され、ハイブリダイゼーションは通常、予測または決定されたＴｍを１０〜２０℃下回り、必要であれば洗浄をより高いストリンジェンシーで行う。
【００２６】
本明細書において使用する場合、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成の法則に関係してポリヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）に関連して用いられる。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。相補性は、塩基対形成の法則に従って一部の核酸塩基しかマッチしない「部分的」となり得る。あるいは、核酸間に「完全」または「全」相補性が存在し得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な効果を有する。これは、増幅反応と共に、核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
【００２７】
本明細書において使用する場合、用語「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはその相補体を指し、核酸増幅反応に関与する。増幅オリゴヌクレオチドの一例は、鋳型核酸とハイブリダイズし、増幅プロセスにおいてポリメラーゼにより伸長される３’ＯＨ末端を含有する「プライマー」である。増幅オリゴヌクレオチドの別の一例は、ポリメラーゼにより伸長されない（例えば、３’ブロック末端を有するため）が、増幅に関与またはこれを促進するオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドまたは類似体、あるいは増幅反応に関与するが、標的核酸と相補的ではないまたはそれに含有されない追加的なヌクレオチドを必要に応じて包含してよい。増幅オリゴヌクレオチドは、標的とも鋳型配列とも相補的ではない配列を含有してよい。例えば、プライマーの５’領域は、標的核酸に対して相補的ではないプロモーター配列（「プロモーター・プライマー」と称される）を包含してよい。当業者であれば、プライマーとして機能する増幅オリゴヌクレオチドが、５’プロモーター配列を包含するよう修飾されていてよく、よって、プロモーター・プライマーとして機能することを理解されよう。同様に、プロモーター・プライマーは、プロモーター配列の除去またはそれを用いない合成により修飾されていてよく、これは依然として、プライマーとして機能する。３’ブロック増幅オリゴヌクレオチドは、プロモーター配列をもたらし、重合の鋳型として働くことができる（「プロモーター・プロバイダー」と称される）。
【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「プライマー」は、精製された制限消化物のように天然に発生するにしろ、合成により作製されるにしろ、核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（即ち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼ等の誘導剤の存在下における、適した温度およびｐＨで）に置かれると合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のため一本鎖であるが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するよう用いられる前に、先ずその両鎖が分離するように処理される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下において伸長産物の合成を始めるのに十分に長い必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源およびこの方法の使用を包含する多くの因子に依存するであろう。
【００２９】
本明細書において使用する場合、用語「プローブ」は、精製された制限消化物のように天然に発生するにしろ、合成により、組換えによりまたはＰＣＲ増幅により作製されるにしろ、目的とする別のオリゴヌクレオチドの少なくとも部分とハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離において有用である。本発明において用いられるいずれかのプローブが、いずれかの「レポーター分子」で標識されて、いずれかの検出系において検出可能となることが考慮され、検出系の例として、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡや、酵素に基づく組織化学的アッセイ）、蛍光、放射性および発光系等が挙げられるがこれらに限定されない。本発明が、いずれかの特定の検出系または標識に限定されることは企図されない。
【００３０】
用語「単離された」は、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように核酸に関して用いられる場合、同定され、通例その天然の供給源において関連している少なくとも１種の構成成分または夾雑物から分離される核酸配列を指す。単離された核酸は、天然に見出される形態または状況とは異なる形態または状況で存在する。対照的に、単離されていない核酸は、それが天然に存在する状態で見出されるＤＮＡおよびＲＮＡ等、核酸を包含する。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、宿主細胞染色体において付近の遺伝子に近接して見出される。特異的タンパク質をコードする特異的ｍＲＮＡ配列等、ＲＮＡ配列は、細胞において数多くのタンパク質をコードする数多くの他のｍＲＮＡとの混合物として見出される。しかし、所定のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、所定のタンパク質を通例発現する細胞における係る核酸を包含し、核酸は、天然の細胞とは異なる染色体上の位置に存在する、さもなくば天然に見出されるものとは異なる核酸配列の側方にある。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、タンパク質の発現に利用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最小でもセンスまたはコード鎖を含有するであろう（即ち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖となり得る）が、センスおよびアンチセンス鎖の両方を含有してもよい（即ち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、二本鎖となり得る）。
【００３１】
本明細書において使用する場合、用語「精製された」または「精製する」は、試料から構成成分（例えば、夾雑物）の除去を指す。例えば、抗体は、混入する非免疫グロブリンタンパク質の除去により精製される。抗体は、標的分子と結合しない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子と結合しない免疫グロブリンの除去は、試料における標的反応性免疫グロブリンのパーセントの増加をもたらす。別の一例において、組換えポリペプチドは、細菌宿主細胞において発現され、ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質の除去により精製される。これにより、試料における組換えポリペプチドのパーセントは増加する。
【００３２】
本明細書において使用する場合、用語「被験体」および「患者」は、イヌ、ネコ、トリ、家畜、マウス、ラットおよびヒトのような哺乳動物等、いずれかの動物を指す。
【００３３】
語句「候補化合物」または「候補物質」は、身体機能の疾患、疾病、病気または障害の処置または予防に用いることのできる、さもなくば老化に対する対抗等、試料の生理的または細胞状況を変更することのできる、いずれかの化学的実体、医薬品、薬物その他を指す。被験化合物は、公知および有望な治療化合物の両方を含む。被験化合物は、本発明のスクリーニング方法を用いたスクリーニングにより治療的であると決定することができる。
【００３４】
本明細書において使用する場合、用語「食物材料」は、ヒトまたは非ヒト動物に与えられるいずれかの食物の種類を指す。食物材料は、食物構成成分（練り粉、フレーク（ｆｌａｋｅ）等）、食物中間体（製品または構成成分の作製において用いられる移行段階）および食物成分を包含する。食物材料は、植物、真菌もしくは動物起源または合成供給源の材料となり得る。食物材料は、炭水化物、タンパク質、脂肪、ビタミン、ミネラル、繊維、セルロース等、身体栄養素（ｂｏｄｙ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ）を含有し得る。
【００３５】
本明細書において使用する場合、用語「栄養補助食品」は、ヒトまたは動物により消費されるときに、食餌性または健康利益をもたらし得るいずれかの化合物または化学薬品を指す。栄養補助食品の例として、ビタミン、ミネラル、植物性栄養素その他が挙げられる。栄養補助食品の意図は、食物と関連しない可能性のある健康利益または望ましい生理的効果を付与することである。
【００３６】
「医薬または薬物」は、本明細書において使用する場合、患者に適切に投与されると治療効果を誘導することのできる化合物または組成物を指す。本明細書における他の化学用語は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，  Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５年））に例証される通り、当技術分野における従来の用法に従って用いられる。
【００３７】
本明細書において使用する場合、用語「食餌性サプリメント」は、１または複数種の食餌性成分を有するまたは含有する食餌を補充するよう企図された製品を指し、食餌性成分の例として、ビタミン、ミネラル、微量栄養素、植物性栄養素、ハーブもしくは他の生薬、アミノ酸、総一日摂取量を増加させることにより食餌を補充するために人間が用いるための食餌性物質または濃縮物、代謝物、構成物、抽出物、またはこれらの組合せ等が挙げられるがこれらに限定されない。同様の定義は、世界中の他の地域、例えば欧州に存在する。「食物サプリメント」、「栄養補助食品」、「機能性食物」または単純に「食物」等、「食餌性サプリメント」または同様の食品に関する異なる呼称（ｄｅｎｏｍｉｎａｔｉｏｎ）が世界中で用いられている。この文脈において、用語「食物サプリメント」は、このような呼称または定義のいずれも網羅する。
【００３８】
用語「遺伝的改変」は、本明細書において使用する場合、外因性ＤＮＡの意図的な導入による、前駆細胞の遺伝子型の安定的または一過的な変更を指す。ＤＮＡは、合成しても、天然由来のものでもよく、遺伝子、遺伝子の部分または他の有用なＤＮＡ配列を含有し得る。用語「遺伝的改変」は、本明細書において使用する場合、天然のウイルス活性、天然の遺伝子組換えその他により発生する変更等、天然に存在する変更を包含してもよい。
【００３９】
本明細書において使用する場合、用語「環境条件」は、環境の１または複数種の物理的側面を包含するよう定義される。環境条件は、被験体に影響するまたはしない可能性のあるいずれかの外因を包含し得る（温度、気圧、気体濃度、酸素レベル、放射線、空中の（ａｉｒ  ｂｏｒｎ）粒子等）。
【００４０】
用語「食餌レジメン」は、動物被験体により経時的に消費される、水を包含する食物材料、成分または成分の混合物を指す。用語「食餌レジメン」は、消費される特異的な食物材料、食物材料の種類、消費される容量、食物材料の供給源、給餌の頻度、給餌の時間等を考慮し得る。
【００４１】
用語「健康レジメン」は、被験体の全体的な健康に経時的に影響し得る、動物被験体の一日の活動を指す。用語「健康レジメン」は、食餌レジメン、サプリメントの使用、医薬品の使用、運動、睡眠／休息、ストレス等を考慮し得る。
【００４２】
用語「製剤」および「組成物」は、本明細書において互換的に用いることができる。
【００４３】
濃度、量、溶解度および他の数的データは、本明細書において、範囲形式で提示することができる。係る範囲形式が、単に簡便さおよび簡潔さのために用いられ、範囲の限界として明確に記述されている数値のみならず、各数値および小範囲（ｓｕｂ−ｒａｎｇｅ）が明確に記述されているかの如く、該範囲内に網羅されるあらゆる個々の数値または小範囲も包含するよう柔軟に解釈すべきであることを理解されたい。例えば、０．１〜５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲は、０．１ｎｇ／ｍｌおよび５ｎｇ／ｍｌの明確に記述されている濃度限界のみならず、０．２ｎｇ／ｍｌ、０．７ｎｇ／ｍｌ、１．０ｎｇ／ｍｌ、２．２ｎｇ／ｍｌ、３．６ｎｇ／ｍｌ、４．２ｎｇ／ｍｌ等の個々の濃度および０．３〜２．５ｎｇ／ｍｌ、１．８〜３．２ｎｇ／ｍｌ、２．６〜４．９ｎｇ／ｍｌ等の小範囲も包含するよう解釈するべきである。このような解釈は、範囲の幅または記載されている特徴にかかわらず適用するべきである。
【００４４】
本明細書において使用する場合、用語「約」は、寸法、処方、パラメータならびに他の量および特徴が、正確ではなくその必要もないが、許容範囲、換算係数、四捨五入、測定誤差その他および当業者にとって公知の他の因子を反映して、要望通りに近似および／またはより大きくもしくはより小さくなり得ることを意味する。さらに、他に特段の断りがなければ、用語「約」は、範囲および数的データに関する上述と一貫して、「正確に」を明らかに包含する。
【００４５】
本明細書において使用する場合、用語「実質的に」は、作用、特徴、特性、状態、構造、物品または結果の完全なまたは殆ど完全な度合いまたは程度を指す。例えば、「実質的に」封入された物は、この物が、完全に封入されているか、あるいは殆ど完全に封入されていることを意味する。絶対的な完全性からの逸脱の正確な許容できる程度は、一部の事例において、特定の文脈に依存する。しかし、一般的に言えば、完成の近さは、絶対的および全き完成が得られるかの如く、同一の全体的な結果を有するようなものとなるであろう。作用、特徴、特性、状態、構造、物品または結果の完全なまたは殆ど完全な欠如を指すための否定的な意味合いで用いられる場合にも、「実質的に」の使用は等しく適用可能である。例えば、粒子が「実質的にない」組成物は、粒子を完全に欠くか、あるいは粒子を完全に欠く場合と効果が同一となる程に、粒子を殆ど完全に欠く。即ち、成分またはエレメントが「実質的にない」組成物は、その測定可能な効果がないのであれば、このような物品を実際に含有していてもよい。
【００４６】
本明細書において使用する場合、複数の物品、構造的エレメント、組成上のエレメントおよび／または材料は、簡便さのために共通のリストに提示することができる。しかし、これらのリストは、リストの各メンバーが、別個および特有のメンバーとして個々に同定されるかの如く解するべきである。よって、係るリストの個々のメンバーは、それとは反対のことが示されていない共通の群におけるこれらの提示に専ら基づき、同一リストのその他のメンバーの事実上の均等物として解するべきではない。
【００４７】
本発明は、全般的には、臓器特異的基準においてＣＲの代謝効果を模倣する条件を同定するための方法に関する。具体的には、本発明は、ＣＲにより発現に変化を生じる遺伝子のパネルを提供する。この遺伝子パネルは、ＣＲのマーカーを提供する。このパネルは、ＣＲの模倣効果を有する条件（例えば、医薬品、治療法、食物、サプリメント、環境因子等）の探索に用いることができる。
【００４８】
次に、本発明を実施するためのある特定の例示的な実施形態をより詳細に説明する。本発明は、これらの特定の実施形態に限定されない。
【００４９】
遺伝子発現の評価
幅広い種類の技法を用いて、本発明のマーカーの遺伝子発現を評価することができる。例示的な方法、キットおよび試薬は、本明細書に記載されている。
【００５０】
一部の実施形態において、マーカー発現を評価するために、マイクロアレイが用いられる。
【００５１】
マイクロアレイが、ＣＲに関連する遺伝子であって表１〜３に同定される遺伝子に対し特異性を有し、固体支持体の表面に付着された、多くの異なるオリゴヌクレオチドを有することが考慮される。一部の実施形態において、試料が、被験被験体（例えば、老化におけるその効果に関してＣＲと比較されようとする条件下の被験体）および必要に応じて対照被験体の組織ＲＮＡ試料から調製され、調製された試料が、ハイブリダイゼーションのためにマイクロアレイに適用されることが考慮される。対照試料と比べた被験試料の差次的ハイブリダイゼーション、または予め確立された対照値（例えば、ＣＲ下で得られた発現プロファイルに由来）と比較した被験試料の発現量は、老化における検査した条件の効果を同定すると考慮される。
【００５２】
異なる種類の生物学的アッセイは、マイクロアレイと呼ばれ、その例として、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ）；タンパク質マイクロアレイ；組織マイクロアレイ；トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ；化合物マイクロアレイ；および抗体マイクロアレイ等が挙げられるがこれらに限定されない。一般に遺伝子チップ、ＤＮＡチップまたはバイオチップとして公知のＤＮＡマイクロアレイは、数千種の遺伝子を同時に発現プロファイリングまたは発現レベルをモニタリングする目的で、固体表面（例えば、ガラス、プラスチックまたはシリコンチップ）に付着してアレイを形成した、顕微鏡レベルのＤＮＡスポットのコレクションである。貼り付けられたＤＮＡセグメントは、１個のＤＮＡマイクロアレイにつき数千種を用いることのできるプローブとして公知である。マイクロアレイは、疾患および正常細胞における遺伝子発現を比較することにより、疾患遺伝子を同定するために用いることができる。マイクロアレイは、様々な技術を用いて製作することができ、技術の例として、微細で尖った（ｆｉｎｅ−ｐｏｉｎｔｅｄ）ピンによるガラススライド上へのプリント；予め作製された（ｐｒｅ−ｍａｄｅ）マスクを用いたフォトリソグラフィー；動的マイクロミラーデバイス（ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ）を用いたフォトリソグラフィー；インクジェットプリント；または微小電極アレイにおける電気化学等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５３】
サザンおよびノーザンブロッティングを用いて、それぞれ特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を検出することもできる。試料から抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡを断片化し、マトリックスゲルにおいて電気泳動により分離し、メンブランフィルターに移す。フィルターに結合したＤＮＡまたはＲＮＡを、目的の配列と相補的な標識プローブとのハイブリダイゼーションに付す。フィルターと結合しハイブリダイズしたプローブを検出する。手順の変法は、メンブランに貼り付けられた基質核酸が、単離されたＤＮＡ断片のコレクションであり、プローブが、組織から抽出され標識されたＲＮＡである、リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）ノーザンブロットである。
【００５４】
ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡは、検出に先立ちまたはそれと同時に増幅することができる。核酸増幅技法の例示的な非限定的な例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。当業者であれば、ある特定の増幅技法（例えば、ＰＣＲ）が、増幅に先立ちＲＮＡがＤＮＡに逆転写されることを必要とする（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）一方、他の増幅技法が、ＲＮＡを直接的に増幅する（例えば、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）ことを認識されよう。
【００５５】
ポリメラーゼ連鎖反応（それぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号および第４，９６５，１８８号明細書）は一般に、ＰＣＲと称され、複数のサイクルの変性、プライマー対の逆ストランドへのアニーリングおよびプライマー伸長を用いて、標的核酸配列のコピー数を指数関数的に増加させる。ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる変種において、逆転写酵素（ＲＴ）を用いて、ｍＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成し、続いてＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅して、ＤＮＡの複数のコピーを作製する。ＰＣＲの他の様々な並べ替えに関して、例えば、それぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号明細書；Ｍｕｌｌｉｓら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５巻：３３５頁（１９８７年）；およびＭｕｒａｋａｗａら、ＤＮＡ  ７巻：２８７頁（１９８８年）を参照されたい。
【００５６】
転写増幅法（それぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４８０，７８４号および第５，３９９，４９１号明細書）は一般に、ＴＭＡと称され、実質的に一定温度、イオン強度およびｐＨの条件下で、標的核酸配列の複数のコピーを自己触媒的に合成し、その際、標的配列の複数のＲＮＡコピーが、追加的なコピーを自己触媒的に生成する。例えば、それぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９９，４９１号および第５，８２４，５１８号明細書を参照されたい。米国特許出願公開第２００６００４６２６５号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている変種において、ＴＭＡは、ブロッキング部分、終結部分および他の修飾部分の使用を必要に応じて組み込んで、ＴＭＡプロセス感度および精度を改善する。
【００５７】
リガーゼ連鎖反応（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷｅｉｓｓ，  Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４巻：１２９２頁（１９９１年））は一般に、ＬＣＲと称され、標的核酸の隣接領域とハイブリダイズする２セットの相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルにおいてＤＮＡリガーゼにより共有結合されて、検出可能な二本鎖ライゲーションオリゴヌクレオチド産物を作製する。
【００５８】
鎖置換増幅（それぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷａｌｋｅｒ，  Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：３９２〜３９６頁（１９９２年）；米国特許第５，２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号明細書）は一般に、ＳＤＡと称され、プライマー配列の対と標的配列の逆ストランドとのアニーリング、ｄＮＴＰαＳの存在下におけるプライマー伸長のサイクルを用いて、二重鎖ヘミホスホロチオエート化（ｈｅｍｉｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ）プライマー伸長産物を作製し、ヘミ修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介性ニッキングおよびニックの３’末端からポリメラーゼ媒介性プライマー伸長して、現存の鎖を置換し、次回のプライマーアニーリング、ニッキングおよび鎖置換のために鎖生成して、産物の幾何的増幅をもたらす。好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）は、基本的に同一方法において、より高温で好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを用いる（欧州特許第０６８４３１５号明細書）。
【００５９】
他の増幅方法は、例えば、一般にＮＡＳＢＡと称される核酸配列ベース増幅（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３０，２３８号明細書）；一般にＱβレプリカーゼと称される、ＲＮＡレプリカーゼを用いてプローブ分子それ自体を増幅する方法（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＬｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．６巻：１１９７頁（１９８８年））；転写ベース増幅方法（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１１７３頁（１９８９年））；および自家持続配列複製法（それぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ
８７巻：１８７４頁（１９９０年））を包含する。公知の増幅方法のさらなる記述に関して、Ｐｅｒｓｉｎｇ，  Ｄａｖｉｄ  Ｈ．、「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら、編）、５１〜８７頁（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ（１９９３年））を参照されたい。
【００６０】
非増幅または増幅核酸は、いずれかの従来手段により検出することができる。例えば、一部の実施形態において、表１〜３から選択されたパネル由来の核酸は、検出可能に標識されたプローブとのハイブリダイゼーションと、その結果得られるハイブリッドの測定により検出される。検出方法の例示的な非限定的な例について、下に記す。
【００６１】
例示的な検出方法の一つであるハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）は、化学発光オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、アクリジニウムエステル標識（ＡＥ）プローブ）と標的配列とのハイブリダイズと、ハイブリダイズしていないプローブに存在する化学発光標識の選択的加水分解と、ルミノメーターにおける残存するプローブから生じる化学発光の測定とに関与する。例えば、米国特許第５，２８３，１７４号明細書およびＮｏｒｍａｎ  Ｃ．  Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ｃｈ．１７（それぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＬａｒｒｙ  Ｊ．  Ｋｒｉｃｋａ編、第２版、１９９５年）を参照されたい。
【００６２】
別の例示的な検出方法は、リアルタイムにおける増幅プロセスの定量的評価を提供する。「リアルタイム」における増幅プロセスの評価は、増幅反応における連続的または定期的のいずれかによる、反応混合物におけるアンプリコンの量を決定することと、決定された値を使用して試料に初期に存在する標的配列の量を計算することとを含む。リアルタイム増幅に基づく、試料に存在する初期標的配列の量を決定するための様々な方法は、当技術分野において周知である。このような方法は、それぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，３０３，３０５号および第６，５４１，２０５号明細書において開示される方法を包含する。試料に初期に存在する標的配列の量を決定するための別の方法（但し、リアルタイム増幅に基づかない）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７１０，０２９号明細書に開示されている。
【００６３】
その多くがステムループ構造を有する様々な自己ハイブリダイズプローブの使用により、増幅産物は、リアルタイムにおいて検出することができる。係る自己ハイブリダイズプローブは、プローブが自己ハイブリダイズ状態であるか標的配列とのハイブリダイゼーションにより変更された状態であるかに応じて、異なって検出可能なシグナルを放射するように標識される。非限定的な例として、「分子トーチ（ｔｏｒｃｈ）」は、連結領域（例えば、非ヌクレオチドリンカー）により接続され、既定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする自己相補性の別々の領域（「標的結合ドメイン」および「標的密接ドメイン（ｔａｒｇｅｔ  ｃｌｏｓｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）」と称される）を包含する、自己ハイブリダイズプローブの一型である。好ましい一実施形態において、分子トーチは、１〜約２０塩基の長さであり、鎖置換条件下の増幅反応において存在する標的配列とのハイブリダイゼーションにアクセス可能な一本鎖塩基領域を標的結合ドメインに含有する。鎖置換条件下において、標的配列の存在下を除き、完全に相補的であっても部分的に相補的であってもよい分子トーチの２種の相補的領域のハイブリダイゼーションが好ましく、これは、標的結合ドメインに存在する一本鎖領域と結合し、標的密接ドメインの全体または部分を置換する。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的密接ドメインは、分子トーチが自己ハイブリダイズするときと、分子トーチが標的配列とハイブリダイズするときとで異なるシグナルが生じ、これにより、ハイブリダイズしていない分子トーチの存在下において被験試料におけるプローブ：標的二重鎖の検出を可能にするように配置された、検出可能な標識または相互作用する標識対（例えば、発光／クエンチャー）を包含する。分子トーチおよび様々な種類の相互作用する標識対は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３４，２７４号明細書に開示されている。
【００６４】
自己相補性を有する検出プローブの別の一例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、標的相補的配列と、増幅反応において存在する標的配列の非存在下において密接したコンフォメーションのプローブを保持する親和性対（または核酸アーム（ａｒｍ））と、プローブが密接したコンフォメーションであるときに相互作用する標識対とを有する核酸分子を包含する。標的配列と標的相補的配列とのハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離し、これによりプローブを開放コンフォメーションへとシフトする。開放コンフォメーションへのシフトは、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であってよい標識対の相互作用の低下により検出可能である。分子ビーコンは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９２５，５１７号および第６，１５０，０９７号明細書に開示されている。
【００６５】
他の自己ハイブリダイズプローブは、当業者にとって周知のものである。非限定的な例として、米国特許第５，９２８，８６２号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているもの等、相互作用標識を有するプローブ結合対は、本発明における使用に適応させることができよう。一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に用いられるプローブ系も、本発明において利用することができよう。追加的な検出系は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５００４２６３８号明細書に開示されている「分子スイッチ」を包含する。インターカレート色素および／または蛍光色素を含むプローブ等、他のプローブもまた、本発明における増幅産物の検出に有用である。例えば、米国特許第５，８１４，４４７号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００６６】
データ解析
一部の実施形態において、コンピュータに基づく解析プログラムを用いて、検出アッセイにより作成された生データ（例えば、表１〜６に列挙されている遺伝子からなる群より選択される遺伝子パネルの発現の存在、非存在または量）を、臨床医または研究者のための予測値のデータへと翻訳する。使用者は、いずれかの適した手段を用いて予測データにアクセスすることができる。よって、一部の好ましい実施形態において、本発明は、遺伝学または分子生物学において修練を積んでいないかもしれない使用者が、生データを理解する必要がないという、さらなる利益を提供する。データは、その最も有用な形態で使用者に直接的に提示される。続いて、使用者は、被験体（あるいは使用者が被験体である場合は使用者自身）のケアを最適化するために情報を直ちに利用することができる。
【００６７】
本発明は、アッセイを行っている研究室、情報提供者、医療従事者（ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｅｒｓｏｎａｌ）および被験体へ、またはそれらから情報を受領、処理および伝達することのできるいずれかの方法を考慮する。例えば、本発明の一部の実施形態において、試料（例えば、生検材料または血液もしくは血清試料）は、被験体から得られると、世界中のいずれかの地域（例えば、被験体が居住する国または情報が最終的に利用される国とは異なる国）にあるプロファイリングサービス（例えば、医療施設、ゲノムプロファイリングビジネスにおける臨床検査室（ｌａｂ）等）へと提出されて、生データを作成する。試料が、組織または他の生物学的試料を含む場合、被験体が医療センターを訪れ、試料が得られ、プロファイリングセンターに送ることができる、あるいは被験体が自分で試料（例えば、尿試料）を収集して、これをプロファイリングセンターに直接送ることができる。試料が、以前に決定された生物学的情報を含む場合、情報は、被験体によってプロファイリングサービスに直接送ることができる（例えば、情報を含有する情報カードをコンピュータによりスキャンして、電子通信システムを用いてデータをプロファイリングセンターのコンピュータに伝達することができる）。プロファイリングサービスにより受領されると、試料が処理され、被験体にとって望ましい診断または予後情報に特異的なプロファイル（即ち、発現データ）が作成される。
【００６８】
次に、プロファイルデータを使用者による解釈に適した形式に調製する。例えば、発現生データを提供するのではなく、調製された形式は、特定の処置選択肢の推奨と共に、対象の尤度（例えば、検査された条件がＣＲを模倣する尤度）を表すことができる。データは、いずれかの適した方法により使用者に表示することができる。例えば、一部の実施形態において、プロファイリングサービスは、使用者のためにプリント（例えば、ポイントオブケアにおいて）してもコンピュータモニター上で使用者に表示してもよい報告を作成する。
【００６９】
一部の実施形態において、情報は先ず、ポイントオブケアまたは地域施設において解析される。次に、さらなる解析のため、および／または生データを臨床医または患者にとって有用な情報に変換するため、生データを中央処理施設に送る。中央処理施設は、プライバシーの利点（中央施設において均一なセキュリティープロトコールにより全データが記憶される）、スピードおよびデータ解析の均一性を提供する。次に、中央処理施設は、被験体処置後のデータの運命を管理することができる。例えば、電子通信システムを用いて、中央施設は、臨床医、被験体または研究者にデータを提供することができる。
【００７０】
一部の実施形態において、被験体は、電子通信システムを用いてデータに直接的にアクセスすることができる。被験体は、結果に基づきさらなる介入またはカウンセリングを選ぶことができる。一部の実施形態において、データは、研究用途に用いられる。例えば、データは、特定の条件または疾患ステージの有用な指標としてマーカーの包含または排除のさらなる最適化に用いることができる。
【００７１】
一部の実施形態において、本明細書に記載されている方法は、ＣＲがその発現変化をもたらす遺伝子のパネルの作成に用いることができる。パネルにおける遺伝子は、変化の規模、変化の方向または徴候、統計学的有意性のレベル、被験体群にわたる変化の頑健性等が挙げられるがこれらに限定されない、さらに別の判断基準に従って選択することができる。本明細書における「被験体群」は、属または種、特に、遺伝的要素を有する、例えば、系統、品種および人種集団内のいずれかの同定可能なグループ分けを指す。ある一態様において、遺伝子は、マウス、イヌ、ネコまたはヒト科の動物（ｈｏｍｉｎｉｄ）等が挙げられるがこれらに限定されない、適した分類群において同定される。
【００７２】
遺伝子パネルの遺伝子発現における変化の特定のパターンは、個体または被験体の群におけるＣＲの効果のプロファイルとして役立つことができる。このＣＲ発現プロファイルは、次に、遺伝子発現におけるＣＲの効果を模倣する物質および他の処置の同定に用いることができる。したがって、係る物質は、ＣＲの他の効果を模倣すると予想することができる。したがって、ＣＲ関連の遺伝子パネルおよび発現プロファイルは、被験体にＣＲの効果を付与する目的で被験体に投与するための物質のスクリーニングに用いることができる。
【００７３】
本技術の一態様において、ある個体由来の結果の解釈を大きな被験体群に外挿することができるように、遺伝子パネルは、広範な遺伝的多様性を表すことができる。例えば、特定のマウス系統における成分のスクリーニングから得られる発現プロファイルを用いて、複数のマウス系統における成分の同様の効果を予測することができる。別の一例において、特定の人種集団に属する個体において同定された遺伝子を含む遺伝子パネルを用いて、人種集団にわたる有効ＣＲ模倣をスクリーニングすることができる。
【００７４】
ある一実施形態において、より具体的な遺伝子パネルは、上述の完全パネルにおける遺伝子のサブセットを含むことができる。例えば、係るパネルの一つは、組織または組織型により特異的なＣＲ応答性遺伝子を含むことができる。別の一例において、被験条件下でより豊富な発現を示す、あるいは物質の投薬に対して感受性がより高いまたは低い遺伝子のサブセットを用いることができる。これらの判断基準は、特定の目的に役立つよう特異的パネルの遺伝子を選択することのできる因子に対し徹底的ではない。ある一態様において、より特異的なパネルは、初期スクリーニングステップにおいて利用して、完全パネルに対し検査するための候補として物質を同定することのできる、より迅速および／またはより容易に解釈可能な結果を提供することができる。
【００７５】
本技術に係る遺伝子パネルおよび方法は、製剤の構成成分の選択において用いることができる。ある一実施形態において、候補化合物が、動物に投与されるとＣＲ効果の模倣において有用となる可能性があるか決定するための方法は、候補化合物で動物を処置するステップと、ＣＲ遺伝子パネル由来の複数の遺伝子の発現を測定するステップと、候補化合物が該遺伝子のＣＲ発現プロファイルを模倣するか決定するステップとを含むことができる。特定の一例において、ＣＲ発現プロファイルは、ＣＲに付された動物の組織を解析して、パネルにおける遺伝子の発現産物を測定することにより得ることができる。物質で処置した動物における該遺伝子の発現をＣＲ発現プロファイルと比較して、物質がＣＲを模倣するか、また、それがどの程度であるか決定することができる。一実施形態において、解析される遺伝子は、ＣＲ応答性遺伝子の完全パネルから選択することができる。別の一実施形態において、解析される遺伝子は、より特異的なパネルから選択される。特異的な一例において、多くの物質から作製された試料は最初に、特異的被験パネルにおける遺伝子の発現を測定することによりスクリーニングされる。次に、物質は、測定値または各物質がＣＲを模倣する程度を示す指数に基づきランク付けされる。一態様において、指数およびランク付けは、従来の統計学的ツールを用いて得ることができる。別の一態様において、ランク付けは、少なくとも一部には、ＣＲプロファイルと比べた処置誘導性倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）、被験パネルにおける遺伝子数、有意に影響された遺伝子数またはこれらのいずれかの組合せを包含する符号化方式を用いて行うことができる。続いて、ランク付けされた物質の１または複数種を選択することにより、製剤を作製することができる。さらに別の検証ステップとして、製剤または１もしくは複数の物質は、完全遺伝子パネルに対し検査することができる。
【００７６】
組成物
本発明の診断方法において用いるための組成物として、プローブ、増幅オリゴヌクレオチドおよび抗体が挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましい組成物は、目的とする被験体から得られる生物学的試料（例えば、組織の試料）から、表１〜６に列挙されている１またはそれより多い遺伝子の発現レベルの検出に有用、それに必要、あるいはそれに十分である。
【００７７】
このような組成物のいずれかを単独で、あるいは本発明の他の組成物と組み合わせて、キットの形態で提供することができる。例えば、単一の標識プローブおよび増幅オリゴヌクレオチド対は、表１〜６に列挙されている遺伝子からなる群より選択される遺伝子のパネルの増幅および検出および／または定量化のためのキットにおいて提供することができる。キットは、試薬それ自体、バッファー、対照試薬（例えば、組織試料、陽性および陰性対照試料等）、固体支持体、標識、文書の（ｗｒｉｔｔｅｎ）および／または画像による（ｐｉｃｔｏｒｉａｌ）説明書および製品情報、阻害剤、標識および／または検出試薬、パッケージ環境管理物（例えば、氷、乾燥剤等）その他等が挙げられるがこれらに限定されない、アッセイに必要なまたはそれに十分なありとあらゆる構成成分を包含することができる。一部の実施形態において、キットは、必要な構成成分のサブセットを提供し、使用者が残りの構成成分を供給することが予想される。一部の実施形態において、キットは、２個以上の別個の容器を含み、各容器は、送達されることになる構成成分のサブセットを収容する。
【実施例】
【００７８】
実施例１−ＣＲおよび対照被験体において差次的に発現される遺伝子の同定
対照食餌を与えたマウスと比較してＣＲマウスにおいて差次的に発現される遺伝子を同定するため、本発明の実施形態の開発において実験を行った。異なる７系統のマウス（１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ＣＢＡ／Ｊ、ＤＢＡ／２ＪおよびＢ６Ｃ３Ｆ１／Ｊ）を、２カ月齢から５カ月齢までカロリー制限された（ＣＲ）食餌に付した。マウスに、ＡＩＮ９３Ｍ処方に基づく対照食餌または同様の栄養組成を有するが３０〜５０％カロリー制限を表す食餌を与えた。食物の割り当ては、各系統の代謝それぞれに合わせた。治験期間にわたる各系統の体重に対するＣＲ食餌の効果を図１に示す。５カ月齢のときに、対照およびＣＲ食餌を与えたマウスから組織を収集した。ＣＲおよび対照マウス間で２０，７８９遺伝子の遺伝子発現レベルを比較した。心臓組織において、７０遺伝子が、ＣＲに応答して遺伝子発現に高度に有意な変化を示した（表１を参照；７系統のうち４系統における＜０．０１のｐ値カットオフ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統における発現の＞＝１．２倍または＜＝−１．２倍数変化（ＦＣ））；筋肉組織において、９４遺伝子が、ＣＲに応答して遺伝子発現に高度に有意な変化を示した（表２を参照；７系統のうち５系統における＜０．０１のｐ値カットオフ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統における発現の＞＝１．３倍または＜＝−１．３ＦＣ）；白色脂肪組織において、１６５遺伝子が、ＣＲに応答して遺伝子発現に高度に有意な変化を示した（表３を参照；７系統のうち６系統における＜０．０１のｐ値カットオフ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統における発現の＞＝１．５倍または＜＝−１．５ＦＣ）。
【００７９】
【表１−１】
2019037240.tif 000003
【００８０】
【表１−２】
2019037240.tif 000004
【００８１】
【表２−１】
2019037240.tif 000005
【００８２】
【表２−２】
2019037240.tif 000006
【００８３】
【表２−３】
2019037240.tif 000007
【００８４】
【表３−１】
2019037240.tif 000008
【００８５】
【表３−２】
2019037240.tif 000009
【００８６】
【表３−３】
2019037240.tif 000010
【００８７】
【表３−４】
2019037240.tif 000011
【００８８】
心臓組織におけるＲＴ−ＰＣＲ解析に用いることのできるマーカーのパネルを作成するため、表１から８種の有望なＣＲのマーカーを、ＲＴ−ＰＣＲによるアレイデータの確認のために選択した（表４）。マイクロアレイ実験における豊富な発現、ＣＲに応答した遺伝子発現の確固とした変化および／またはＣＲ食餌に影響される代謝経路との以前の関連等（但し、これらに限定されない）を含む、複数の要因に基づき遺伝子を選択した。アレイ試験に用いたものとは別個のコホートの対照およびＣＲ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得られたＲＮＡ試料を用いたところ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、全遺伝子がＣＲにより有意に変化したことを明らかにした。
【００８９】
【表４】
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【００９０】
筋肉組織におけるＲＴ−ＰＣＲ解析に用いることのできるマーカーのパネルを作成するため、表２から１０種の有望なＣＲのマーカーを、ＲＴ−ＰＣＲによるアレイデータの確認のために選択した（表５）。マイクロアレイ実験における豊富な発現、ＣＲに応答した遺伝子発現の確固とした変化および／またはＣＲ食餌に影響される代謝経路との以前の関連等（但し、これらに限定されない）を含む、複数の要因に基づき遺伝子を選択した。アレイ試験に用いたものとは別個のコホートのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得られたＲＮＡ試料を用いたところ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、全遺伝子がＣＲにより有意に変化したことを明らかにした。
【００９１】
【表５】
2019037240.tif 000013
【００９２】
白色脂肪組織におけるＲＴ−ＰＣＲ解析に用いることのできるマーカーのパネルを作成するため、表３から１５種の有望なＣＲのマーカーを、ＲＴ−ＰＣＲによるアレイデータの確認のために選択した（表６）。マイクロアレイ実験における豊富な発現、ＣＲに応答した遺伝子発現の確固とした変化および／またはＣＲ食餌に影響される代謝経路との以前の関連等（但し、これらに限定されない）を含む、複数の要因に基づき遺伝子を選択した。アレイ試験に用いたものとは別個のコホートのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得られたＲＮＡ試料を用いたところ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、全遺伝子がＣＲにより有意に変化したことを明らかにした。
【００９３】
【表６】
2019037240.tif 000014
【００９４】
実施例２−カロリー制限の擬態に関する成分の試験
給餌試験：
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、６週齢のときにＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｂａｒｇｅｒ  ＪＬら（２００８年）Ａ  Ｌｏｗ  Ｄｏｓｅ  ｏｆ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｍｉｍｉｃｓ  Ｃａｌｏｒｉｃ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔａｒｄｓ  Ａｇｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３巻（６号）：ｅ２２６４頁（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００２２６４）に以前に記載された通りに維持した。要約すると、マウスをシューボックス型ケージ内に個々に収容し、１週間当たり２４グラム（ほぼ８４ｋｃａｌ）のＡＩＮ−９３Ｍ食餌（月曜日および水曜日に７グラム、金曜日に１０グラム）を提供した。８週齢から始めて２２週齢まで続け、マウスを次のいずれかに付した：ａ）ＡＩＮ−９３Ｍ食餌で維持した（対照群）、ｂ）８〜１６週齢において６３ｋｃａｌ／週の修飾ＡＩＮ９３Ｍを提供するカロリー制限（ＣＲ）食餌を与え、次に、１６〜２２週齢において４９ｋｃａｌ／週の修飾ＡＩＮ９３Ｍを提供する食餌へとさらに低下させた、あるいはｃ）次の被験成分のうち１種を補充したＡＩＮ９３Ｍ食餌に割り当てた：１）５，０００ｍｇ／ｋｇ食餌の用量のベザフィブラート；２）１，９０９ｍｇ／ｋｇ食餌の用量のメトホルミン；３）１，８００ｍｇ／ｋｇ食餌の用量のＬ−カルニチン；４）１８ｍｇ／ｋｇ体重の用量のブラッドオレンジ抽出物；５）２２ｍｇ／ｋｇ体重の用量のパープルコーン（ｐｕｒｐｌｅ  ｃｏｒｎ）抽出物；６）３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量のレスベラトロール；および７）１７．６ｍｇ／ｋｇ体重の用量のケルセチン。２２週齢のときにマウスから組織を収集し、液体窒素中で瞬時に凍結し、後の解析のために−８０℃で貯蔵した。
【００９５】
ＣＲを模倣する能力に関して成分をスクリーニングするため、全群のマウスの白色脂肪組織から単離したＲＮＡを用いて定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）解析を行った。ＲＴ−ｑＰＣＲ実験の実験方法およびデータ解析は、Ｂａｒｇｅｒ、ＪＬら、（２００８年）Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｍｉｍｉｃｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃａｌｏｒｉｃ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅａｒｔ、Ｅｘｐ．  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ４３巻（９号）：８５９頁（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｘｇｅｒ．２００８．０６．０１３）において以前に発表された。要約すると、対照動物と比較したＣＲおよび処置群に対し、表６に列挙されている遺伝子毎の遺伝子発現における変化の規模を決定した。両側ｔ検定（等しい分散を想定）を用いて、個々の遺伝子発現の変化が、統計学的に有意であるか否かを決定した。発現の変化の規模（「倍数変化」）の値をｌｏｇ２補正して、統計学的解析のための正規性仮定（ｎｏｒｍａｌｉｔｙ  ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ）に適合させた。
【００９６】
結果
ＣＲ擬態は、被験群の各遺伝子において観察される倍数変化として、ＣＲ群における該遺伝子に観察される倍数変化のパーセンテージとして表した。表７は、当該成分により有意に変化した遺伝子毎の、各成分により達成されるＣＲ擬態を示す。
【００９７】
【表７】
2019037240.tif 000015
【００９８】
ＣＲ模倣成分のランク付け
検査した成分は、遺伝子パネルにわたるその模倣効果に基づいた。有意に変化した全遺伝子の擬態値を成分毎に平均化した。
【００９９】
ランク付けアプローチの一法において、平均擬態（ＣＲの分数として）に有意に変化した遺伝子の数を掛けて、模倣指数（ＣＭＩＩ）を得た。表８に示す通り、ベザフィブラートは、ＣＲの模倣において最も有効であったが、一方、ケルセチンは、最も低い程度のＣＲ擬態を示した。
【０１００】
別のランク付けアプローチを用いて、全遺伝子にわたる効果を反映させた。遺伝子毎にその擬態スコアに基づくポイント数をそれぞれ割り当てることにより、各成分の遺伝子毎のＣＲ模倣指数（ＣＲＭＩ）を計算した。正の擬態値には、正のポイントを与えた（１１〜２０％＝１ポイント、２１〜３０％＝２ポイント、３１〜４０％＝３ポイント、等々）。負の擬態値（即ち、遺伝子発現効果がＣＲに観察される効果とは反対である場合）には、対応する負のスコアを与えた（即ち、−１１〜−２０％＝−１ポイント、−２１〜−３０％＝−２ポイント、−３１〜−４０％＝３ポイント、等々）。擬態値の統計学的有意性に対し５ポイントを加えた。成分毎の平均ＣＲＭＩを表８に示す。
【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
実施例３
ベザフィブラートによるＣＲ擬態に対する用量の効果の試験
実施例２の実験プロトコールにおいて、５，０００ｍｇ／ｋｇ食餌のベザフィブラートと、より低用量（１００および５００ｍｇ／ｋｇ）との比較も行った。表９は、当該投薬量により有意に変化した遺伝子毎の、各投薬量により達成されるＣＲ擬態の程度を示す。
【０１０３】
【表９】
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【０１０４】
実施例２と同様に、５００ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ用量に関して、模倣指数を計算した。表１０に示す通り、ベザフィブラートがＣＲを模倣する程度は、用量依存的であった。
【０１０５】
【表１０】
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【０１０６】
前述の実施例は、本発明の原理を１または複数の特定の適用において説明するものであるが、当業者であれば、発明能力を発揮せずとも、また、本発明の原理および概念から逸脱することなく、実施の形態、利用および詳細において数多くの修正を行ってよいことが明らかであろう。よって、後述する特許請求の範囲による場合を除き、本発明が限定されることは企図されていない。
【図１】
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【外国語明細書】
2019037240000001.pdf