(57)【要約】      （修正有）【課題】２−ヘプタノンの匂いを抑制する物質をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】下記工程（Ａ）〜（Ｃ）：（Ａ）試験物質の存在下で受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させる工程；（Ｂ）前記匂い原因物質に対する前記受容体タンパク質の応答を測定する工程；および（Ｃ）前記応答に基づいて前記試験物質を匂い抑制物質として同定する工程；を含み、前記応答が前記試験物質により阻害されている場合に、該試験物質を匂い抑制物質として同定し、前記匂い原因物質が、２−ヘプタノンであり、前記受容体タンパク質が、OR1D2タンパク質、OR2L8タンパク質、またはOR5P3タンパク質である、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
匂い抑制物質をスクリーニングする方法であって、
下記工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）試験物質の存在下で受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させる工程；
（Ｂ）前記匂い原因物質に対する前記受容体タンパク質の応答を測定する工程；および
（Ｃ）前記応答に基づいて前記試験物質を匂い抑制物質として同定する工程；
を含み、
前記応答が前記試験物質により阻害されている場合に、該試験物質を匂い抑制物質として同定し、
前記匂い原因物質が、２−ヘプタノンであり、
前記受容体タンパク質が、OR1D2タンパク質、OR2L8タンパク質、またはOR5P3タンパク質である、方法。
【請求項２】
前記応答が、前記受容体タンパク質と前記匂い原因物質との結合、または前記匂い原因物質による前記受容体タンパク質の活性化である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記受容体タンパク質が、細胞、細胞膜、人工脂質二重膜小胞、または人工脂質二重膜に担持された形態で使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記受容体タンパク質が、細胞に担持された形態で使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、動物細胞である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（Ｂ）および（Ｃ）が、それぞれ、下記工程（Ｂ１）および（Ｃ１）により実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法：
（Ｂ１）前記工程（Ａ）を実施した際の前記受容体タンパク質の活性化の程度Ｄ１を測定する工程；
（Ｃ１）前記活性化の程度Ｄ１に基づいて前記試験物質を匂い抑制物質として同定する工程。
【請求項７】
前記工程（Ｃ１）が、下記工程（Ｃ２）により実施される、請求項６に記載の方法：
（Ｃ２）前記活性化の程度Ｄ１と対照条件における前記受容体タンパク質の活性化の程度Ｄ２との差に基づいて前記試験物質を匂い抑制物質として同定する工程。
【請求項８】
前記対照条件が、下記条件（Ｃ２−１）または（Ｃ２−２）である、請求項７に記載の方法：
（Ｃ２−１）前記試験物質の非存在下で前記受容体タンパク質と前記匂い原因物質を接触させる条件；
（Ｃ２−２）前記試験物質の存在下で前記受容体タンパク質と前記匂い原因物質を接触させる条件であって、該試験物質の濃度が前記工程（Ａ）における該試験物質の濃度よりも低い濃度である条件。
【請求項９】
さらに、前記活性化の程度Ｄ２を測定する工程を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記活性化の程度Ｄ１が前記活性化の程度Ｄ２よりも低い場合に、前記試験物質を匂い抑制物質として同定する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性化の程度Ｄ２に対する前記活性化の程度Ｄ１の比率が４０％未満である場合に、前記試験物質を匂い抑制物質として同定する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記応答が、細胞内ｃＡＭＰ量を指標として測定される、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞内ｃＡＭＰ量が、レポーターアッセイによって測定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験物質が、単一の成分である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試験物質が、２種またはそれ以上の成分の組み合わせである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記OR1D2タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）哺乳類のOR1D2タンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のOR1D2タンパク質のキメラタンパク質。
【請求項１７】
前記OR1D2タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質。
【請求項１８】
前記OR2L8タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）哺乳類のOR2L8タンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のOR2L8タンパク質のキメラタンパク質。
【請求項１９】
前記OR2L8タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質。
【請求項２０】
前記OR5P3タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）哺乳類のOR5P3タンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のOR5P3タンパク質のキメラタンパク質。
【請求項２１】
前記OR5P3タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号１３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１３に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質。
【請求項２２】
さらに、同定された匂い抑制物質の匂い抑制能を評価する工程を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記評価が、官能評価によって実施される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、匂い抑制物質、具体的には２−ヘプタノン（2-heptanone）の匂いを抑制する物質、のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−ヘプタノンは、ケトンの１種であり、悪臭物質として認識される場合がある。
【０００３】
匂いを抑制する物質をスクリーニングする方法としては、例えば、当該匂いの原因となる物質に応答する嗅覚受容体を用いる方法が報告されている（特許文献１〜２）。
【０００４】
しかしながら、２−ヘプタノンに応答する嗅覚受容体は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2012/029922
【特許文献２】特開2015-211667
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、匂い抑制物質、具体的には２−ヘプタノンの匂いを抑制する物質、のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、嗅覚受容体OR1D2、OR2L8、およびOR5P3が２−ヘプタノンに応答することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
匂い抑制物質をスクリーニングする方法であって、
下記工程（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）試験物質の存在下で受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させる工程；
（Ｂ）前記匂い原因物質に対する前記受容体タンパク質の応答を測定する工程；および
（Ｃ）前記応答に基づいて前記試験物質を匂い抑制物質として同定する工程；
を含み、
前記応答が前記試験物質により阻害されている場合に、該試験物質を匂い抑制物質として同定し、
前記匂い原因物質が、２−ヘプタノンであり、
前記受容体タンパク質が、OR1D2タンパク質、OR2L8タンパク質、またはOR5P3タンパク質である、方法。
［２］
前記応答が、前記受容体タンパク質と前記匂い原因物質との結合、または前記匂い原因物質による前記受容体タンパク質の活性化である、前記方法。
［３］
前記受容体タンパク質が、細胞、細胞膜、人工脂質二重膜小胞、または人工脂質二重膜に担持された形態で使用される、前記方法。
［４］
前記受容体タンパク質が、細胞に担持された形態で使用される、前記方法。
［５］
前記細胞が、動物細胞である、前記方法。
［６］
前記工程（Ｂ）および（Ｃ）が、それぞれ、下記工程（Ｂ１）および（Ｃ１）により実施される、前記方法：
（Ｂ１）前記工程（Ａ）を実施した際の前記受容体タンパク質の活性化の程度Ｄ１を測定する工程；
（Ｃ１）前記活性化の程度Ｄ１に基づいて前記試験物質を匂い抑制物質として同定する工程。
［７］
前記工程（Ｃ１）が、下記工程（Ｃ２）により実施される、前記方法：
（Ｃ２）前記活性化の程度Ｄ１と対照条件における前記受容体タンパク質の活性化の程度Ｄ２との差に基づいて前記試験物質を匂い抑制物質として同定する工程。
［８］
前記対照条件が、下記条件（Ｃ２−１）または（Ｃ２−２）である、前記方法：
（Ｃ２−１）前記試験物質の非存在下で前記受容体タンパク質と前記匂い原因物質を接触させる条件；
（Ｃ２−２）前記試験物質の存在下で前記受容体タンパク質と前記匂い原因物質を接触させる条件であって、該試験物質の濃度が前記工程（Ａ）における該試験物質の濃度よりも低い濃度である条件。
［９］
さらに、前記活性化の程度Ｄ２を測定する工程を含む、前記方法。
［１０］
前記活性化の程度Ｄ１が前記活性化の程度Ｄ２よりも低い場合に、前記試験物質を匂い抑制物質として同定する、前記方法。
［１１］
前記活性化の程度Ｄ２に対する前記活性化の程度Ｄ１の比率が４０％未満である場合に、前記試験物質を匂い抑制物質として同定する、前記方法。
［１２］
前記応答が、細胞内ｃＡＭＰ量を指標として測定される、前記方法。
［１３］
細胞内ｃＡＭＰ量が、レポーターアッセイによって測定される、前記方法。
［１４］
前記試験物質が、単一の成分である、前記方法。
［１５］
前記試験物質が、２種またはそれ以上の成分の組み合わせである、前記方法。
［１６］
前記OR1D2タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（Ａ）哺乳類のOR1D2タンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のOR1D2タンパク質のキメラタンパク質。
［１７］
前記OR1D2タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質。
［１８］
前記OR2L8タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（Ａ）哺乳類のOR2L8タンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のOR2L8タンパク質のキメラタンパク質。
［１９］
前記OR2L8タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質。
［２０］
前記OR5P3タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（Ａ）哺乳類のOR5P3タンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のOR5P3タンパク質のキメラタンパク質。
［２１］
前記OR5P3タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号１３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号１３に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、前記匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質。
［２２］
さらに、同定された匂い抑制物質の匂い抑制能を評価する工程を含む、前記方法。
［２３］
前記評価が、官能評価によって実施される、前記方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、匂い抑制物質、具体的には２−ヘプタノンの匂いを抑制する物質、を効率的にスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明の方法は、受容体タンパク質を利用した匂い抑制物質のスクリーニング方法である。本発明の方法においては、受容体タンパク質を利用して、匂い抑制物質を同定する（すなわち試験物質が匂い抑制物質であるかを同定する）ことができる。本発明の方法においては、具体的には、試験物質の存在下での匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答に基づいて、匂い抑制物質を同定する（すなわち当該試験物質が匂い抑制物質であるかを同定する）ことができる。本発明の方法においては、より具体的には、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答が試験物質により阻害されるかに基づいて、匂い抑制物質を同定する（すなわち当該試験物質が匂い抑制物質であるかを同定する）ことができる。すなわち、本発明の方法は、具体的には、（Ａ）試験物質の存在下で受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させる工程；（Ｂ）前記匂い原因物質に対する前記受容体タンパク質
の応答を測定する工程；及び、（Ｃ）前記応答に基づいて前記試験物質を匂い抑制物質として同定する工程、を含み、前記応答が前記試験物質により阻害されている場合に、該試験物質を匂い抑制物質として同定する、匂い抑制物質のスクリーニング方法であってよい。
【００１２】
＜１＞匂い原因物質および匂い抑制物質
「匂い原因物質」とは、匂いを呈する物質をいう。本発明において用いられる匂い原因物質は、２−ヘプタノンである。
【００１３】
「匂い抑制物質」とは、匂いを抑制する物質をいう。本発明においてスクリーニングされる匂い抑制物質は、２−ヘプタノンの匂い抑制物質（すなわち２−ヘプタノンの匂いを抑制する物質）である。すなわち、本発明において抑制の対象とする匂いは、２−ヘプタノンの匂いである。匂い抑制物質が有する匂い原因物質の匂いを抑制する機能を、「匂い抑制能」ともいう。匂い抑制物質は、単一の成分からなるもの（すなわち純物質）であってもよく、２種またはそれ以上の成分の組み合わせからなるもの（すなわち混合物）であってもよい。「混合物」を「組成物」ともいう。匂い抑制物質が混合物である場合、当該混合物が匂い抑制能を有する限り、当該混合物を構成する各成分は、単独で、匂い抑制能を有していてもよく、有していなくてもよい。
【００１４】
＜２＞試験物質
「試験物質」とは、匂い抑制物質の候補として本発明の方法に用いられる物質をいう。試験物質は、特に制限されない。試験物質は、単一の成分からなるもの（すなわち純物質）であってもよく、２種またはそれ以上の成分の組み合わせからなるもの（すなわち混合物）であってもよい。試験物質が混合物である場合、当該混合物を構成する成分の種類数や構成比率は、特に制限されない。試験物質は、公知物質であってもよく、新規物質であってもよい。試験物質は、天然物であってもよく、人工物であってもよい。試験物質は、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリーであってもよい。試験物質としては、例えば、アルコール、ケトン、アルデヒド、エーテル、エステル、炭化水素、糖、有機酸、核酸、アミノ酸、ペプチド、脂質、その他の有機または無機の各種成分が挙げられる。また、試験物質としては、特に、既存の食品添加物が挙げられる。「既存の食品添加物」とは、食品添加物としての使用が認められている物質をいう。試験物質としては、１種の試験物質を用いてもよく、２種またはそれ以上の試験物質を組み合わせて用いてもよい。２種またはそれ以上の成分をまとめて受容体タンパク質に接触させて本発明の方法を実施することにより、それらの成分の組み合わせが全体として匂い抑制物質であるかを同定することができる。「２種またはそれ以上の成分をまとめて受容体タンパク質に接触させる」場合としては、混合物である試験物質を受容体タンパク質に接触させる場合や、２種またはそれ以上の試験物質をまとめて受容体タンパク質に接触させる場合が挙げられる。
【００１５】
試験物質は、例えば、既存の食品添加物等の、上記例示したような物質を含むように選択されてよい。すなわち、試験物質としては、例えば、１種の既存の食品添加物を用いてもよく、２種またはそれ以上の食品添加物を組み合わせて用いてもよく、１種またはそれ以上の食品添加物と１種またはそれ以上の他の成分とを組み合わせて用いてもよい。
【００１６】
また、試験物質は、例えば、既知の匂い抑制物質以外の物質を含むように選択されてよい。「既知の匂い抑制物質」とは、匂い抑制能を有することが既知である物質をいう。すなわち、本発明の方法からは、試験物質が既知の匂い抑制物質からなる場合が除かれてもよい。また、本発明の方法からは、試験物質が既知の匂い抑制物質を含む場合が除かれてもよい。
【００１７】
＜３＞受容体タンパク質
「受容体タンパク質」とは、OR1D2タンパク質、OR2L8タンパク質、OR5P3タンパク質、またはそれらの組み合わせをいう。受容体タンパク質をコードする遺伝子を「受容体遺伝子」ともいう。
【００１８】
「OR1D2タンパク質」とは、Olfactory Receptor Family 1 Subfamily D Member 2に分類される嗅覚受容体タンパク質をいう。OR1D2タンパク質を単に「OR1D2」ともいう。OR1D2タンパク質をコードする遺伝子を「OR1D2遺伝子」ともいう。OR1D2タンパク質は、匂い原因物質に対する応答性を有する。OR1D2タンパク質としては、１種のOR1D2タンパク質を用いてもよく、２種またはそれ以上のOR1D2タンパク質を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
「OR2L8タンパク質」とは、Olfactory Receptor Family 2 Subfamily L Member 8に分類される嗅覚受容体タンパク質をいう。OR2L8タンパク質を単に「OR2L8」ともいう。OR2L8タンパク質をコードする遺伝子を「OR2L8遺伝子」ともいう。OR2L8タンパク質は、匂い原因物質に対する応答性を有する。OR2L8タンパク質としては、１種のOR2L8タンパク質を用いてもよく、２種またはそれ以上のOR2L8タンパク質を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
「OR5P3タンパク質」とは、Olfactory Receptor Family 5 Subfamily P Member 3に分類される嗅覚受容体タンパク質をいう。OR5P3タンパク質を単に「OR5P3」ともいう。OR5P3タンパク質をコードする遺伝子を「OR5P3遺伝子」ともいう。OR5P3タンパク質は、匂い原因物質に対する応答性を有する。OR5P3タンパク質としては、１種のOR5P3タンパク質を用いてもよく、２種またはそれ以上のOR5P3タンパク質を組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
受容体遺伝子および受容体タンパク質としては、各種生物の受容体遺伝子および受容体タンパク質が挙げられる。生物としては、例えば、哺乳類等の動物が挙げられる。哺乳類等の動物として、具体的には、例えば、表１〜３に示すものが挙げられる。哺乳類等の動物としては、特に、ヒトが挙げられる。各種生物の受容体遺伝子の塩基配列および受容体タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBIやEnsembl等の公開データベースから取得できる。ヒトのOR1D2遺伝子の塩基配列およびOR1D2タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１および２に示す。ヒトのOR2L8遺伝子の塩基配列およびOR2L8タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１０および１１に示す。ヒトのOR5P3遺伝子の塩基配列およびOR5P3タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１２および１３に示す。受容体タンパク質の一例を表１〜３に示す。表中、「Identity」は、ClustalWを用いて算出したヒトの受容体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２、１１、または１３）に対する各生物の受容体タンパク質のアミノ酸配列の同一性を示す。
【００２２】
【表１】
2019129772.tif 000002
【００２３】
【表２】
2019129772.tif 000003
【００２４】
【表３】
2019129772.tif 000004
【００２５】
すなわち、受容体遺伝子は、例えば、上記例示した受容体タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば表１〜３のEnsembl Translation IDで登録されているアミノ酸配列をコードする塩基配列）を有する遺伝子であってよい。また、受容体タンパク質は、例えば、上記例示した受容体タンパク質のアミノ酸配列（例えば表１〜３のEnsembl Translation IDで登録されているアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。
【００２６】
また、受容体タンパク質としては、キメラ受容体タンパク質も挙げられる。キメラ受容体タンパク質としては、キメラOR1D2タンパク質、キメラOR2L8タンパク質、キメラOR5P3タンパク質が挙げられる。なお、キメラ受容体タンパク質の説明で言及される「受容体タンパク質」とは、キメラOR1D2タンパク質の場合にはOR1D2タンパク質を、キメラOR2L8タンパク質の場合にはOR2L8タンパク質を、キメラOR5P3タンパク質の場合にはOR5P3タンパク質を指す。「キメラ受容体タンパク質」とは、受容体タンパク質のキメラタンパク質（すなわち、２種またはそれ以上の受容体タンパク質のキメラタンパク質）をいう。また、言い換えると、「キメラ受容体タンパク質」とは、受容体タンパク質のキメラ配列を有するタンパク質（すなわち、２種またはそれ以上の受容体タンパク質のキメラ配列を有するタンパク質）をいう。「受容体タンパク質のキメラ配列」とは、受容体タンパク質のアミノ酸配列のキメラ配列（すなわち、２種またはそれ以上の受容体タンパク質のアミノ酸配列のキメラ配列）をいう。「受容体タンパク質のキメラ配列」とは、具体的には、受容体タンパク質のアミノ酸配列であって、その部分配列が、１種またはそれ以上の他の受容体タンパク質のアミノ酸配列の部分配列で置換されたアミノ酸配列をいう。キメラ受容体タンパク質の構築におけるアミノ酸配列の置換は、受容体タンパク質のアミノ酸配列中の対応する部位間で実施することができる。「受容体タンパク質のアミノ酸配列中の対応する部位」とは、それら受容体タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントにおいて対応する位置に配列される部位をいう。キメラ受容体タンパク質としては、例えば、上記例示した受容体タンパク質のキメラタンパク質（具体的には、上記例示した受容体タンパク質から選択される２種またはそれ以上の受容体タンパク質のキメラタンパク質）が挙げられる。キメラ受容体タンパク質として、具体的には、例えば、哺乳類のキメラ受容体タンパク質（具体的には、哺乳類の受容体タンパク質から選択される２種またはそれ以上の受容体タンパク質のキメラタンパク質）が挙げられる。すなわち、受容体タンパク質は、例えば、上記例示した受容体タンパク質のアミノ酸配列のキメラ配列（具体的には、上記例示した受容体タンパク質のアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列）を有するタンパク質であってもよい。キメラ受容体タンパク質としては、匂い原因物質に対する応答性を有するものを選択することができる。
【００２７】
キメラ受容体タンパク質を構成する受容体タンパク質の種類数は、特に制限されない。キメラ受容体タンパク質を構成する受容体タンパク質の種類数は、２種であってもよく、３種またはそれ以上であってもよい。
【００２８】
キメラ受容体タンパク質における各受容体タンパク質の構成比率は特に制限されない。各受容体タンパク質の構成比率は、キメラ受容体タンパク質を構成する受容体タンパク質の構成比率の合計が１００％を超えない範囲で適宜設定することができる。各受容体タンパク質の構成比率は、例えば、１％以上、３％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上であってもよく、９９％以下、９７％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、または１％以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。「各受容体タンパク質の構成比率」とは、キメラ受容体タンパク質を構成するアミノ酸残基の総数に対する各受容体タンパク質に由来するアミノ酸残基の個数の比率をいう。なお、キメラ受容体タンパク質を構成するアミノ酸残基が当該キメラ受容体タンパク質を構成する受容体タンパク質の保存配列に該当する場合、当該アミノ酸残基はそれら受容体タンパク質のいずれに由来するとみなしてもよい。
【００２９】
キメラ受容体タンパク質における各受容体タンパク質に由来する部位の分布態様は特に制限されない。キメラ受容体タンパク質において、各受容体タンパク質に由来する部位は、１ヶ所に固まって存在していてもよく、２ヶ所またはそれ以上に分散して存在していて
もよい。例えば、或る受容体タンパク質（受容体タンパク質Ａ）の内部のアミノ酸配列を別の受容体タンパク質（受容体タンパク質Ｂ）のアミノ酸配列で置換してキメラ受容体タンパク質をデザインした場合、受容体タンパク質Ａのアミノ酸配列は当該キメラ受容体タンパク質のＮ末側とＣ末側に分散して残存する。
【００３０】
同様に、受容体遺伝子としては、キメラ受容体遺伝子が挙げられる。キメラ受容体タンパク質についての記載は、キメラ受容体遺伝子にも準用できる。
【００３１】
受容体遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示した受容体遺伝子、例えば表１〜３のEnsembl Translation IDで登録されているアミノ酸配列をコードする塩基配列またはそれらのキメラ配列を有する遺伝子、のバリアントであってもよい。同様に、受容体タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示した受容体タンパク質、例えば表１〜３のEnsembl Translation IDで登録されているアミノ酸配列またはそれらのキメラ配列を有するタンパク質、のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「OR1D2遺伝子」、「OR2L8遺伝子」、および「OR5P3遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したOR1D2遺伝子、OR2L8遺伝子、およびOR5P3遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「OR1D2タンパク質」、「OR2L8タンパク質」、および「OR5P3タンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したOR1D2タンパク質、OR2L8タンパク質、およびOR5P3タンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示した受容体遺伝子や受容体タンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００３２】
また、由来する生物種で特定される受容体遺伝子は、当該生物種において見出される受容体遺伝子そのものに限られず、当該生物種において見出される受容体遺伝子の塩基配列を有する遺伝子およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、由来する生物種で特定される受容体タンパク質は、当該生物種において見出される受容体タンパク質そのものに限られず、当該生物種において見出される受容体タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。それら保存的バリアントは、当該生物種において見出されてもよく、見出されなくてもよい。例えば、「哺乳類の受容体タンパク質」という用語は、哺乳類において見出される受容体タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。また、例えば、「哺乳類のキメラ受容体タンパク質」という用語は、哺乳類において見出される受容体タンパク質のアミノ酸配列のキメラ配列を有するタンパク質およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。言い換えると、「哺乳類のキメラ受容体タンパク質」を構成する受容体タンパク質は、哺乳類において見出される受容体タンパク質そのものに限られず、それらの保存的バリアントであってもよい。
【００３３】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。すなわち、受容体遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが匂い原因物質に対する応答性を有するタンパク質をコードすることをいう。また、受容体タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが匂い原因物質に対する応答性を有することをいう。
【００３４】
タンパク質が匂い原因物質に対する応答性を有することは、例えば、当該タンパク質を匂い原因物質と接触させた際の当該タンパク質の応答を測定することにより、確認できる。
【００３５】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００３６】
受容体遺伝子のホモログまたは受容体タンパク質のホモログは、例えば、上記例示した受容体遺伝子の塩基配列または上記例示した受容体タンパク質のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、受容体遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、これら公知の受容体遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
【００３７】
受容体遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば表１〜３のEnsembl Translation IDで登録されているアミノ酸配列またはそれらのキメラ配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００３８】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００３９】
また、受容体遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００４０】
また、受容体遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば表１〜３のEnsembl Translation IDで登録されているアミノ酸配列をコードする塩基配列またはそれらのキメラ配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、例えばDNA、であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッド
が形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００４１】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００４２】
また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、受容体遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、受容体遺伝子は、例えば、遺伝コードの縮重による上記例示した受容体遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、受容体遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００４３】
なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、DNAに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「受容体遺伝子」とは、受容体タンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。受容体遺伝子は、DNAであってもよく、RNAであってもよく、その組み合わせであってもよい。受容体遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。受容体遺伝子は、一本鎖DNAであってもよく、一本鎖RNAであってもよい。受容体遺伝子は、二本鎖DNAであってもよく、二本鎖RNAであってもよく、DNA鎖とRNA鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。受容体遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、DNA残基とRNA残基の両方を含んでいてもよい。受容体遺伝子がRNAを含む場合、上記例示した塩基配列等のDNAに関する記載は、RNAに合わせて適宜読み替えてよい。受容体遺伝子は、イントロンを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。受容体遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。
【００４４】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【００４５】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから
入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
【００４６】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST（BLAST 2.0）を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００４７】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００４８】
また、受容体タンパク質は、受容体タンパク質の保存配列（すなわち、２種またはそれ以上の受容体タンパク質のアミノ酸配列の保存配列）の一部または全部を有していてもよい。受容体タンパク質は、例えば、上記例示した受容体タンパク質の保存配列（具体的には、上記例示した受容体タンパク質から選択される２種またはそれ以上の受容体タンパク質のアミノ酸配列の保存配列）の一部または全部を有していてもよい。受容体タンパク質は、具体的には、例えば、哺乳類のキメラ受容体タンパク質の保存配列（具体的には、哺乳類の受容体タンパク質から選択される２種またはそれ以上の受容体タンパク質のアミノ酸配列の保存配列）の一部または全部を有していてもよい。また、受容体タンパク質は、例えば、表１〜３のEnsembl Translation IDで登録されているアミノ酸配列（OR1D2タンパク質について計３６個、OR2L8タンパク質について計２７個、OR5P3タンパク質について計３４個）のアラインメントにおいて、１０個以上、２０個以上、または３０個以上のアミノ酸配列において保存されているアミノ酸配列の一部または全部を有していてもよい。保存配列は対象のアミノ酸配列のアラインメントにより決定できる。
【００４９】
また、受容体タンパク質は、上述したような受容体タンパク質のアミノ酸配列に加えて、その他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。すなわち、受容体タンパク質は、上述したような受容体タンパク質のアミノ酸配列とその他のアミノ酸配列との融合タンパク質であってもよい。その他のアミノ酸配列は、受容体タンパク質が匂い原因物質に対する応答性を損なわない限り、特に制限されない。その他のアミノ酸配列としては、例えば、HisタグやV5エピトープタグ等のタグ配列が挙げられる。その他のアミノ酸配列は、例えば、受容体タンパク質のＮ末端、若しくはＣ末端、又はその両方に連結されていてよい。
【００５０】
受容体タンパク質は、匂い抑制物質のスクリーニングに利用可能な任意の形態で使用することができる。すなわち、具体的には、受容体タンパク質は、試験物質と接触でき、且つ匂い原因物質に対する応答性を失わない限り、任意の形態で使用することができる。受容体タンパク質の使用形態は、本発明の方法の実施態様等の諸条件に応じて適宜設定でき
る。
【００５１】
受容体タンパク質は、例えば、精製物や粗精製物等の所望の程度に単離された形態で使用されてもよく、素材に含有された形態で使用されてもよい。受容体タンパク質は、具体的には、例えば、構造物に担持された形態で使用されてもよい。構造物としては、例えば、細胞、細胞膜、人工脂質二重膜小胞、人工脂質二重膜が挙げられる。構造物としては、特に、細胞が挙げられる。言い換えると、受容体タンパク質は、例えば、受容体タンパク質を有する細胞、受容体タンパク質を有する細胞膜、受容体タンパク質を有する人工脂質二重膜小胞、または受容体タンパク質を有する人工脂質二重膜等の受容体タンパク質を有する（担持する）構造物の形態で使用することができる。これら受容体タンパク質を有する構造物も、例えば、所望の程度に単離された形態で使用されてもよく、素材に含有された形態で使用されてもよい。また、受容体タンパク質は、器具の一部を構成していてもよい。すなわち、受容体タンパク質は、例えば、受容体タンパク質を備える器具の形態で使用することもできる。受容体タンパク質を備える器具としては、例えば、受容体タンパク質が固定化された器具や、受容体タンパク質を有する構造物（脂質二重膜等）を備える器具が挙げられる。脂質二重膜を備える器具としては、例えば、脂質二重膜を配列したチップが挙げられる（WO2005/000558；Watanabe R. et al., Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat Commun. 2014 Jul 24;5:4519.；Kamiya K. et al., 人工細胞膜作製とシングルイオンチャネル計測, Electrochemistry, 83, 1096-1100 (2015)）。これらの形態の受容体タンパク質は、いずれも、本発明の方法で使用される受容体タンパク質の範囲に含まれる。
【００５２】
受容体タンパク質は、例えば、受容体遺伝子を発現させることにより製造できる。受容体遺伝子の発現は、例えば、細胞を用いて実施してもよいし、無細胞タンパク質合成系を用いて実施してもよい。細胞を用いた受容体遺伝子の発現については、後述する受容体タンパク質を有する細胞の説明を参照できる。発現した受容体タンパク質は、適宜、上述したような形態で取得し、本発明の方法に利用できる。
【００５３】
受容体タンパク質を有する細胞を「本発明の細胞」ともいう。受容体タンパク質は、例えば、細胞膜に局在して機能し得る。よって、本発明の細胞は、受容体タンパク質を、例えば、細胞膜に有していてよい。
【００５４】
受容体タンパク質は、受容体遺伝子から発現する。よって、本発明の細胞は、受容体遺伝子を有する。本発明の細胞は、具体的には、受容体遺伝子を発現可能に有する。なお、本発明の細胞は、受容体タンパク質を発現するまで受容体遺伝子を有していれば足りる。すなわち、本発明の細胞は、受容体タンパク質の発現後には、受容体遺伝子を有していてもよく、いなくてもよい。また、本発明の細胞は、言い換えると、受容体遺伝子を発現した細胞であり、また、受容体タンパク質を発現した細胞である。なお、「受容体遺伝子の発現」と「受容体タンパク質の発現」とは同義に用いられ得る。
【００５５】
本発明の細胞は、１コピーの受容体遺伝子を有していてもよく、２コピーまたはそれ以上の受容体遺伝子を有していてもよい。また、本発明の細胞は、１種の受容体遺伝子を有していてもよく、２種またはそれ以上の受容体遺伝子を有していてもよい。また、本発明の細胞は、１種の受容体タンパク質を有していてもよく、２種またはそれ以上の受容体タンパク質を有していてもよい。
【００５６】
本発明の細胞は、本来的に受容体遺伝子を有するものであってもよく、受容体遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。
【００５７】
本来的に受容体遺伝子を有する細胞としては、上記のような受容体遺伝子が由来する生
物の細胞、例えば、ヒト等の哺乳類の嗅細胞、が挙げられる。本来的に受容体遺伝子を有する細胞は、例えば、当該細胞を含む生物体や組織から取得することができる。
【００５８】
受容体遺伝子を有するように改変された細胞としては、受容体遺伝子が導入された細胞が挙げられる。
【００５９】
なお、本発明の細胞およびそれを取得するために用いられる細胞（例えば、受容体遺伝子が導入される又は導入された細胞）を総称して「宿主細胞」ともいう。
【００６０】
宿主細胞は、機能する受容体タンパク質を発現でき、以て匂い抑制物質のスクリーニングに利用可能なものであれば特に制限されない。宿主細胞としては、例えば、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞等の真核細胞が挙げられる。より好ましい宿主細胞としては、動物細胞が挙げられる。動物としては、例えば、哺乳類、鳥類、両生類が挙げられる。哺乳類としては、例えば、げっ歯類や霊長類が挙げられる。げっ歯類としては、例えば、チャイニーズハムスター、ハムスター、マウス、ラット、モルモットが挙げられる。霊長類としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジーが挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリが挙げられる。両生類としては、例えば、アフリカツメガエルが挙げられる。また、宿主細胞が由来する組織または細胞は特に制限されない。宿主細胞が由来する組織または細胞としては、例えば、卵巣、腎臓、副腎、舌上皮、嗅上皮、松果体、甲状腺、メラノサイトが挙げられる。チャイニーズハムスターの細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（CHO）が挙げられる。CHOとして、具体的には、例えば、CHO-DG44やCHO-K1が挙げられる。ヒトの細胞としては、例えば、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（HEK）が挙げられる。HEKとして、具体的には、例えば、HEK293やHEK293Tが挙げられる。サルの細胞としては、例えば、アフリカミドリザル腎細胞由来細胞株（COS）が挙げられる。COSとして、具体的には、例えば、COS-1が挙げられる。アフリカツメガエルの細胞としては、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21、SF+等のSpodoptera frugiperda由来細胞や、High-Five等のTrichoplusia ni由来細胞が挙げられる。宿主細胞は、個々の独立した細胞（例えば遊離の細胞）であってもよいし、組織等の集合体を形成していてもよい。
【００６１】
受容体遺伝子は、受容体遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムDNAやcDNA等の核酸を利用できる。また、受容体遺伝子は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
【００６２】
取得した受容体遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、受容体遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology,
Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、受容体遺伝子のバリアントを化学合成によって直接取得してもよい。
【００６３】
受容体遺伝子を宿主細胞に導入する形態は特に制限されない。受容体遺伝子は、発現可能に宿主細胞に保持されていればよい。具体的には、例えば、受容体遺伝子をDNA等の転
写を要する形態で導入する場合、宿主細胞において、受容体遺伝子は、当該宿主細胞で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主細胞において、受容体遺伝子は、染色体外に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主細胞に保持されていればよい。
【００６４】
受容体遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主細胞において機能するものであれば特に制限されない。「宿主細胞において機能するプロモーター」とは、宿主細胞においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主細胞由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、受容体遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、受容体遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであってもよい。例えば、動物細胞において機能するプロモーターとしては、SV40プロモーター、EF1aプロモーター、RSVプロモーター、CMVプロモーター、SRalphaプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００６５】
受容体遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主細胞に導入することができる。受容体遺伝子を含むベクターを、「受容体遺伝子の発現ベクター」ともいう。受容体遺伝子の発現ベクターは、例えば、受容体遺伝子を含むDNA断片をベクターと連結することにより、構築することができる。受容体遺伝子の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、同遺伝子を宿主細胞に導入することができる。ベクターは、薬剤耐性遺伝子などのマーカーを備えていてもよい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーター等の発現調節配列を備えていてもよい。ベクターは、宿主細胞の種類や受容体遺伝子の導入形態等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、動物細胞への遺伝子導入に用いることができるベクターとしては、プラスミドベクターやウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターが挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えば、pcDNAシリーズベクター（pcDNA3.1等；Thermo Fisher Scientific）、pBApo-CMVシリーズベクター（タカラバイオ）、pCI-neo（Promega）が挙げられる。なお、ベクターの種類や構成によっては、ベクターは、宿主細胞の染色体に組み込まれ得るし、宿主細胞の染色体外で自律複製し得るし、あるいは宿主細胞の染色体外に一時的に保持され得る。例えば、SV40複製起点等のウイルスの複製起点を有するベクターは、動物細胞の染色体外で自律複製し得る。具体的には、例えば、pcDNAシリーズベクターはSV40複製起点を有しており、SV40のラージＴ抗原を発現する宿主細胞（COS-1やHEK293T等）において染色体外で自律複製し得る。
【００６６】
また、受容体遺伝子は、例えば、同遺伝子を含む核酸断片を宿主細胞に導入することによっても、宿主細胞に導入することができる。受容体遺伝子を含む核酸断片を、「受容体遺伝子断片」ともいう。そのような断片としては、直鎖状DNAや直鎖状RNAが挙げられる。直鎖状RNAとしては、例えば、mRNAやcRNAが挙げられる。
【００６７】
ベクターや核酸断片等の核酸を宿主細胞に導入する方法は、宿主細胞の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、動物細胞等の宿主細胞にベクターや核酸断片等の核酸を導入する方法としては、DEAEデキストラン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が挙げられる。また、ベクターがウイルスベクターである場合は、同ベクター（ウイルス）を宿主細胞に感染させることにより、宿主細胞に同ベクターを導入することができる。
【００６８】
また、本来的に受容体遺伝子を有する細胞を、受容体遺伝子の発現が増大するよう改変して用いてもよい。「遺伝子の発現が増大する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変細胞と比較して増大することを意味する。ここでいう「非改変細胞」とは、標的の遺伝子の発現が増大するように改変されていない対照細胞を意味する。非改変細胞としては、野生型の細胞や改変元の細胞が挙げられる。受容体遺伝子の発現を増大させる手法としては、受容体遺伝子のコピー数を増加させることや受容体遺伝子の転写効率や翻訳効率を向上させることが挙げられる。受容体遺伝子のコピー数の増加は、受容体遺伝子を宿主細胞に導入することにより達成できる。受容体遺伝子の導入は、上述したように実施できる。なお、導入される受容体遺伝子は、宿主細胞由来であってもよく、異種由来であってもよい。受容体遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、プロモーター等の遺伝子の発現調節配列の改変により達成できる。例えば、受容体遺伝子の転写効率の向上は、受容体遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。
【００６９】
本発明の細胞は、匂い抑制物質のスクリーニングに利用できる限り、その他の任意の性質を有していてよい。そのような性質としては、例えば、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定するために有用な性質が挙げられる。
【００７０】
本発明の細胞は、例えば、受容体タンパク質以外の嗅覚受容体（「他の嗅覚受容体」ともいう）を有していてもよく、有していなくてもよい。本発明の細胞は、他の嗅覚受容体を有さないのが好ましい場合があり得る。他の嗅覚受容体を有さない細胞としては、他の嗅覚受容体をコードする遺伝子を有さない細胞や、他の嗅覚受容体をコードする遺伝子を有するが同遺伝子を発現していない細胞が挙げられる。本発明の細胞は、例えば、本来的に他の嗅覚受容体を有さないものであってもよく、他の嗅覚受容体を有さないように改変されたものであってもよい。他の嗅覚受容体を有さないように細胞を改変することは、例えば、他の嗅覚受容体をコードする遺伝子をノックアウトすることにより達成できる。
【００７１】
また、本発明の細胞は、例えば、シグナル伝達に関与するタンパク質を有していてよい。言い換えると、本発明の細胞は、シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有していてよい。シグナル伝達に関与するタンパク質としては、例えば、Ｇタンパク質（Golf等）、Ｇタンパク質活性化因子（Ric8B等）、アデニル酸シクラーゼ、カルシウムチャネルが挙げられる。Golfとしては、例えば、ヒトGolf（GenBank accession No. NP_892023；配列番号３）等の動物のGolfが挙げられる。Ric8Bとしては、例えば、ラットRic8B（GenBank accession No. NP_783188；配列番号４）等の動物のRic8Bが挙げられる。また、本発明の細胞は、例えば、測定するパラメーターに応じた構成要素を有していてよい。そのような構成要素としては、カルシウム指示薬等のプローブや、ルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子が挙げられる。カルシウム指示薬等のプローブを遺伝子から発現する場合、本発明の細胞は、当該プローブをコードする遺伝子を有していてよい。
【００７２】
また、本発明の細胞は、例えば、嗅覚受容体の膜発現を促進するタンパク質を有していてよい。言い換えると、本発明の細胞は、そのようなタンパク質をコードする遺伝子を有していてよい。そのようなタンパク質としては、例えば、RTP1sが挙げられる（Zhuang H and Matsunami H, J Biol Chem 282, 15284-15293 (2007)）。RTP1sとしては、例えば、ヒトRTP1s（GenBank accession No. AAT70680）、マウスRTP1s（GenBank accession No. ABU23737）、コウモリRTP1s（GenBank accession No. XP_006765914の37位のメチオニン残基からＣ末までのアミノ酸配列；配列番号５）等の動物のRTP1sが挙げられる。マウスRTP1sは、ヒトRTP1sのアミノ酸配列と93.3％の同一性を有する。コウモリRTP1s（配列番号５）は、ヒトRTP1sのアミノ酸配列と90.7％の同一性を有する。
【００７３】
本発明の細胞は、本来的に上記例示したような性質を有するものであってもよく、上記例示したような性質を有するように改変されたものであってもよい。細胞の改変について
は、受容体遺伝子の導入等の受容体遺伝子に関する細胞の改変の記載を準用できる。上記例示したような遺伝子は、宿主細胞由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。また、上記例示したような遺伝子は、受容体遺伝子と、同一の由来であってもよく、そうでなくてもよい。２つまたはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主細胞に保持されていればよい。それらの遺伝子は、例えば、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、それらの遺伝子は、例えば、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。上記例示したような遺伝子およびそれにコードされるタンパク質は、それぞれ、例えば、公知の遺伝子およびタンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列を有していてよい。また、上記例示したような遺伝子およびそれにコードされるタンパク質は、それぞれ、例えば、公知の遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントであってもよい。遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントについては、受容体遺伝子および受容体タンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【００７４】
受容体遺伝子を有する細胞は、そのまま、あるいは適宜受容体遺伝子を発現させて、受容体タンパク質を有する細胞（本発明の細胞）として使用することができる。すなわち、受容体遺伝子を有する細胞が既に受容体遺伝子を発現している場合、当該細胞は、そのまま、受容体タンパク質を有する細胞（本発明の細胞）として使用してもよい。また、受容体遺伝子を有する細胞に受容体遺伝子を発現させることにより、受容体タンパク質を有する細胞（本発明の細胞）が得られる。例えば、受容体遺伝子を有する細胞を培養することにより、受容体遺伝子を発現させることができ、以て受容体タンパク質を有する細胞（本発明の細胞）が得られる。具体的には、例えば、受容体遺伝子の導入（例えばトランスフェクション）後、宿主細胞の培養を継続し、受容体遺伝子を発現させることができる。培地組成や培養条件は、受容体遺伝子を有する細胞を維持する（例えば増殖させる）ことができ、受容体遺伝子が発現する限り、特に制限されない。培養の際に、受容体遺伝子を有する細胞は、増殖してもよく、しなくてもよい。培地組成や培養条件は、宿主細胞の種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。培養は、例えば、動物細胞等の細胞の培養に利用される通常の培地および通常の条件をそのまま、あるいは適宜改変して用いて実施することができる。例えば、動物細胞の培養に利用できる培地として、具体的には、Opti-MEM培地（Thermo Fisher Scientific）、DMEM培地、RPMI 1640培地、CD293培地が挙げられる。培養は、例えば、３６℃〜３８℃で、５％ＣＯ２等のＣＯ２含有雰囲気下で静置培養により行うことができる。また、必要に応じて、選択薬剤や発現誘導剤を用いることができる。
【００７５】
受容体タンパク質が発現したことは、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定することにより確認できる。また、受容体タンパク質が発現したことは、受容体遺伝子から転写されるmRNAの量を測定することや、抗体を用いてウェスタンブロットにより受容体タンパク質を検出することでも確認できる。
【００７６】
本発明の細胞は、例えば、そのまま（培養物に含まれたまま）、あるいは培地から回収して、本発明の方法に使用することができる。また、培養物やそれから回収した細胞は、例えば、適宜、洗浄、濃縮、希釈等の処理をしてから、本発明の方法に使用してもよい。このように、本発明の細胞は、例えば、所望の程度に単離された形態で使用されてもよく、素材に含有された形態で使用されてもよい。受容体タンパク質を有する他の構造物についても同様である。
【００７７】
受容体タンパク質を有する細胞膜は、例えば、本発明の細胞から調製することができる。受容体タンパク質を有する細胞膜は、具体的には、例えば、本発明の細胞を破砕した際の膜画分として得られる。
【００７８】
また、受容体タンパク質を利用して受容体タンパク質を有する人工脂質二重膜小胞や人工脂質二重膜を製造することができる。人工脂質二重膜小胞や人工脂質二重膜は、例えば、公知の手段により製造できる。人工脂質二重膜小胞は、受容体タンパク質を、例えば、その膜に有していてよい。脂質二重膜小胞としては、リポソームが挙げられる。
【００７９】
＜４＞本発明の方法
まず、試験物質の存在下で受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させることができる。言い換えると、匂い原因物質の存在下で受容体タンパク質と試験物質を接触させることができる。また、言い換えると、受容体タンパク質と匂い原因物質および試験物質を接触させることができる。すなわち、「試験物質の存在下で受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させる」、「匂い原因物質の存在下で受容体タンパク質と試験物質を接触させる」、および「受容体タンパク質と匂い原因物質および試験物質を接触させる」という表現は、互いに同義で用いることができる。以下、匂い原因物質および試験物質を総称して、単に、「物質」ともいう。
【００８０】
受容体タンパク質と両物質との接触は、適当な液体中で実施することができる。受容体タンパク質と両物質との接触が実施される液体を「反応液」ともいう。すなわち、例えば、適当な反応液中で受容体タンパク質と両物質とを共存させることにより、受容体タンパク質と両物質とを接触させることができる。具体的には、例えば、受容体タンパク質（例えば受容体タンパク質を有する細胞等の上記例示したような形態のもの）および両物質を適当な液体媒体中に溶解、懸濁、分散等して共存させることにより、受容体タンパク質と両物質とを接触させることができる。液体媒体としては、水や水性緩衝液等の水性媒体が挙げられる。なお、両物質等の２種またはそれ以上の成分をまとめて受容体タンパク質に接触させる場合、それらの成分と受容体タンパク質との接触は、同時に開始してもよく、そうでなくてもよい。すなわち、例えば、或る成分と受容体タンパク質との接触を開始した後、別の成分をさらに反応系に添加してもよい。具体的には、例えば、試験物質と受容体タンパク質との接触を開始した後で匂い原因物質をさらに反応系に添加してもよく、匂い原因物質と受容体タンパク質との接触を開始した後で試験物質をさらに反応系に添加してもよい。通常は、試験物質と匂い原因物質とを予め混合してから受容体タンパク質に接触させればよい。反応条件（受容体タンパク質と両物質との接触を実施する条件）は、匂い抑制物質のスクリーニングが可能である限り、特に制限されない。反応条件は、受容体タンパク質の使用形態、試験物質の種類、受容体タンパク質の応答の測定手法等の諸条件に応じて適宜設定できる。反応条件としては、例えば、タンパク質とリガンド間の相互作用等の物質間の相互作用を測定する際の公知の反応条件をそのまま、あるいは適宜改変して利用してもよい。試験物質の濃度は、例えば、0.01 nM〜500 mM、10 nM〜100 mM、または1μM〜10 mMであってもよい。匂い原因物質の濃度は、例えば、0.01 mM〜500 mM、0.1 mM〜100 mM、または0.5 mM〜10 mMであってもよい。受容体タンパク質の濃度は、例えば、1 pg/mL〜10 mg/mLであってもよい。また、受容体タンパク質を有する細胞を用いる場合、受容体タンパク質を有する細胞の濃度は、例えば、10 cell/mL〜10,000,000 cell/mLであってもよい。受容体タンパク質と両物質との接触は、適当な時点で終了してもよいし、しなくてもよい。受容体タンパク質と両物質との接触は、通常、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答の測定時まで継続されていてよい。受容体タンパク質と両物質との接触の継続時間は、例えば、０．１秒以上、０．５秒以上、１秒以上、５秒以上、１０秒以上、３０秒以上、１分以上、５分以上、１０分以上、３０分以上、１時間以上、または２時間以上であってもよく、２４時間以下、１２時間以下、６時間以下、２時間以下、または１時間以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。受容体タンパク質と両物質との接触の継続時間は、具体的には、例えば、１時間〜６時間であってもよい。反応系は、匂い抑制物質のスクリーニングが可能である限り、受容体タンパク質（例えば受容体タンパク質を有する細胞等の上記例示したような形態のもの）および
両物質に加えて、その他の成分を含有していてよい。その他の成分は、受容体タンパク質の使用形態、試験物質の種類、受容体タンパク質の応答の測定手法等の諸条件に応じて適宜設定できる。その他の成分としては、培地成分やｐＨ緩衝剤が挙げられる。
【００８１】
次いで、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定することができる。匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答は、後述するように、試験物質による応答阻害を評価するための指標となる。よって、「匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定する」とは、具体的には、試験物質による応答阻害を測定することを意味してもよい。「試験物質による応答阻害」とは、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答が試験物質により阻害されることをいう。
【００８２】
匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答としては、受容体タンパク質と匂い原因物質との結合や、匂い原因物質による受容体タンパク質の活性化が挙げられる。
【００８３】
匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定するタイミングは、試験物質が匂い抑制物質であった場合に測定可能な程度に当該試験物質による応答阻害が生じている時点であれば特に制限されない。匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定するタイミングは、具体的には、受容体タンパク質と両物質との接触が開始した時点から、試験物質による応答阻害が消失する時点までの適当な時点であってよい。匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定するタイミングは、例えば、試験物質による応答阻害が最大となる時点であってもよい。また、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定するタイミングは、例えば、受容体タンパク質と両物質との接触が開始した時点の０．１秒後以降、０．５秒後以降、１秒後以降、５秒後以降、１０秒後以降、３０秒後以降、１分後以降、５分後以降、１０分後以降、３０分後以降、１時間後以降、または２時間後以降であってもよく、２４時間後まで、１２時間後まで、６時間後まで、２時間後まで、または１時間後までであってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定するタイミングは、具体的には、例えば、受容体タンパク質と両物質との接触が開始した時点の１時間後以降６時間後までであってもよい。
【００８４】
次いで、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答に基づいて、試験物質が匂い抑制物質であるかを同定することができる。すなわち、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答に基づいて、試験物質を匂い抑制物質として同定することができる。
【００８５】
具体的には、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答に基づいて試験物質による応答阻害を評価することができ、さらに、試験物質による応答阻害に基づいて試験物質を匂い抑制物質として同定することができる。より具体的には、試験物質による応答阻害が認められた場合に、すなわち、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答が試験物質により阻害されている場合に、当該試験物質を匂い抑制物質として同定することができる。すなわち、例えば、受容体タンパク質と匂い原因物質との結合または匂い原因物質による受容体タンパク質の活性化が試験物質により阻害されている場合に、当該試験物質を匂い抑制物質として同定することができる。受容体タンパク質と匂い原因物質との結合が試験物質により阻害されることを、「試験物質による結合阻害」ともいう。匂い原因物質による受容体タンパク質の活性化が試験物質により阻害されることを、「試験物質による活性化阻害」または「試験物質による受容体タンパク質の不活性化」ともいう。試験物質は、いずれか１種の受容体タンパク質についてのみ応答阻害を引き起こしてもよく、２種またはそれ以上の受容体タンパク質について応答阻害を引き起こしてもよい。
【００８６】
試験物質による受容体タンパク質の不活性化は、前記工程（Ａ）を実施した際の（すなわち試験物質の存在下で受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させる条件における）受
容体タンパク質の活性化の程度（活性化の程度Ｄ１）を指標として決定することができる。すなわち、上記工程（Ｂ）は、例えば、（Ｂ１）活性化の程度Ｄ１を測定する工程であってよい。また、上記工程（Ｃ）は、例えば、（Ｃ１）活性化の程度Ｄ１に基づいて試験物質が匂い抑制物質であるかを同定する工程であってよい。
【００８７】
試験物質による受容体タンパク質の不活性化は、具体的には、前記工程（Ａ）を実施した際の（すなわち試験物質の存在下で受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させる条件における）受容体タンパク質の活性化の程度（活性化の程度Ｄ１）と対照条件における受容体タンパク質の活性化の程度（活性化の程度Ｄ２）とを比較することにより決定できる。すなわち、上記工程（Ｃ１）は、例えば、（Ｃ２）活性化の程度Ｄ１と活性化の程度Ｄ２との差に基づいて試験物質が匂い抑制物質であるかを同定する工程であってもよい。
【００８８】
「対照条件」とは、下記条件（Ｃ２−１）または（Ｃ２−２）をいう：
（Ｃ２−１）試験物質の非存在下で受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させる条件；（Ｃ２−２）試験物質の存在下で受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させる条件であって、該試験物質の濃度が上記工程（Ａ）における該試験物質の濃度よりも低い濃度である条件。
【００８９】
言い換えると、試験物質による受容体タンパク質の不活性化は、例えば、匂い原因物質の存在下での試験物質の有無または濃度差による受容体タンパク質の活性化の程度の差を指標として決定できる。
【００９０】
上記条件（Ｃ２−１）としては、受容体タンパク質と試験物質を接触させる前の条件であって、受容体タンパク質と匂い原因物質を接触させる条件が挙げられる。上記条件（Ｃ２−１）としては、受容体タンパク質と匂い原因物質および試験物質を接触させた後の条件であって、試験物質が実質的に（例えば完全に）反応系から除去され、且つ試験物質による応答阻害が実質的に（例えば完全に）消失している条件も挙げられる。上記条件（Ｃ２−２）における試験物質の濃度は、活性化の程度Ｄ１と活性化の程度Ｄ２とで測定可能な程度に差が認められる濃度であれば特に制限されない。上記条件（Ｃ２−２）における試験物質の濃度は、例えば、上記工程（Ａ）における試験物質の濃度の、９０％以下、７０％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の濃度であってよい。対照条件は、試験物質の有無または濃度以外は、試験物質による応答阻害を評価することができる限り、特に制限されない。対照条件は、試験物質の有無または濃度以外は、例えば、上記工程（Ａ）の条件と同一であってよい。
【００９１】
本発明の方法は、活性化の程度Ｄ２を測定する工程を含んでいてもよい。活性化の程度Ｄ１と活性化の程度Ｄ２は、単一の反応系において時間差で測定されてもよいし、それぞれ別個の反応系において同時にあるいは時間差で測定されてもよい。活性化の程度Ｄ２は、活性化の程度Ｄ１よりも先に測定されてもよく、後に測定されてもよい。例えば、活性化の程度Ｄ２を測定した後、反応系に試験物質を添加して活性化の程度Ｄ１を測定してもよい。
【００９２】
活性化の程度Ｄ１が低い場合に、試験物質による受容体タンパク質の不活性化が認められたと判断できる。具体的には、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも低い場合に、試験物質による受容体タンパク質の不活性化が認められたと判断できる。例えば、活性化の程度Ｄ２に対する活性化の程度Ｄ１の比率が８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満である場合に、試験物質による受容体タンパク質の不活性化が認められたと判断してもよい。当該比率を、「活性の残存率」ともいう。また、活性の残存率を１００％から減算した値を、「活性の阻害率」ともいう。活性の阻害率として、具体的には、例えば、実施例に記載の阻害率が
挙げられる。
【００９３】
試験物質による受容体タンパク質の不活性化を決定する場合についての上記の記載は、試験物質による結合阻害を決定する場合等の、他の指標に基づいて試験物質による応答阻害を決定する場合にも準用できる。その場合、上記の記載における「活性化の程度」は、適宜、「受容体タンパク質への匂い原因物質の結合量」等の対応する用語に読み替えればよい。
【００９４】
匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定する手法は特に制限されない。匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定する手法は、受容体タンパク質の使用形態や測定する応答の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。すなわち、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答は、例えば、受容体タンパク質と匂い原因物質との結合または匂い原因物質による受容体タンパク質の活性化を測定できる適当な手法により測定することができる。
【００９５】
受容体タンパク質と匂い原因物質の結合を測定する手法は特に制限されない。受容体タンパク質と匂い原因物質の結合は、例えば、タンパク質とリガンド間の結合等の物質間の結合を測定する公知の手法により測定することができる。そのような手法としては、例えば、等温滴定型熱量測定（Isothermal Titration Calorimetry；ITC）、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；SPR）、核磁気共鳴（nuclear magnetic resonance；NMR）蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy；FCS）が挙げられる。
【００９６】
匂い原因物質による受容体タンパク質の活性化を測定する手法は特に制限されない。匂い原因物質による受容体タンパク質の活性化は、例えば、嗅覚受容体等の受容体の活動を測定する公知の手法により測定することができる。そのような手法としては、例えば、細胞内カルシウム量測定法や細胞内cAMP量測定法が挙げられる。すなわち、匂い原因物質による受容体タンパク質の活性化は、例えば、細胞内カルシウム量または細胞内cAMP量を指標として測定することができる。例えば、HEK293T細胞において、嗅覚受容体は、香気成分によって活性化されると、細胞内のＧタンパク質（Golf等）と共役してアデニル酸シクラーゼを活性化し、以て細胞内cAMP量を増加させることが知られている（Kajiya K. et al., Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience, 2001, 21:6018-6025）。細胞内cAMP量を測定する手法としては、例えば、ELISAやレポーターアッセイが挙げられる。レポーターアッセイとしては、例えば、ルシフェラーゼアッセイが挙げられる。レポーターアッセイによれば、cAMP量に依存して発現するように構成されたレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子等）を利用して細胞内cAMP量を測定することができる。細胞内カルシウム量を測定する手法としては、例えば、カルシウムイメージングが挙げられる。カルシウムイメージングによれば、カルシウム指示薬を利用して細胞内カルシウム量を測定することができる。カルシウム指示薬としては、カルシウム感受性蛍光色素やカルシウム感受性蛍光タンパク質が挙げられる。カルシウム感受性蛍光色素としては、例えば、Fura 2、Fluo 4が挙げられる。また、カルシウム感受性蛍光タンパク質としては、例えば、Cameleon、TN-XL、GCaMP、G-GECOが挙げられる。なお、受容体タンパク質が人工脂質二重膜小胞等の内部空間を有する形態で使用され、且つ、当該人工脂質二重膜小胞等が細胞と同様にその内部空間のカルシウム量またはcAMP量が変動するように構成されている場合も、上記と同様の手法により匂い原因物質による受容体タンパク質の活性化を測定することができる。その場合、「細胞内カルシウム量」および「細胞内cAMP量」とは、それぞれ、内部空間におけるカルシウム量およびcAMP量と読み替えればよい。
【００９７】
なお、「或るパラメーターを測定し、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定するための指標として利用する」とは、当該応答を測定できる限り、具体的には、当
該応答に基づいて試験物質による応答阻害を評価できる（すなわち、試験物質による応答阻害が認められるかを判定できる）限り、当該パラメーターを反映するデータを取得して利用することで足り、当該パラメーターの値自体を取得することは必要としない。すなわち、或るパラメーターを反映するデータを取得した場合、当該データから当該パラメーターの値自体を算出することは必要としない。具体的には、例えば、ルシフェラーゼアッセイにより細胞内cAMP量を測定し、匂い原因物質による受容体タンパク質の活性化を測定するための指標として利用する場合、当該活性化を測定できる限り、具体的には、当該活性化に基づいて試験物質による受容体タンパク質の不活性化を評価できる（すなわち、試験物質による受容体タンパク質の不活性化が認められるかを判定できる）限り、細胞内cAMP量を反映するデータ（例えば、蛍光強度）を取得して利用することで足り、当該データから細胞内cAMP量自体を算出することは必要としない。
【００９８】
また、「匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定する」とは、当該応答を反映するデータであって、試験物質による応答阻害を評価するために利用できるものを取得することで足りる。同様に、試験物質による応答阻害を評価するための指標として利用される「匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答」とは、当該応答を反映するデータであって、試験物質による応答阻害を評価するために利用できるものであれば足りる。そのようなデータとしては、例えば、匂い原因物質に対する受容体タンパク質の応答を測定する手法を実施することにより得られたデータ（例えば、上記例示したようなパラメーターやそれを反映するデータ）を、そのまま、あるいは適宜加工して、用いることができる。
【００９９】
このようにして匂い抑制物質を同定することができる。本発明の方法は、さらに、同定された匂い抑制物質の匂い抑制能を評価する工程を含んでいてもよい。すなわち、同定された匂い抑制物質の匂い抑制能を評価することにより、当該匂い抑制物質が実際に匂い原因物質の匂いを抑制するかを確認することができる。同定された匂い抑制物質の匂い抑制能を評価する手法は特に制限されない。同定された匂い抑制物質の匂い抑制能は、例えば、物質の香気を評価する公知の手法により評価することができる。そのような手法としては、官能評価（官能試験による評価）が挙げられる。同定された匂い抑制物質の匂い抑制能は、具体的には、例えば、匂い抑制物質の共存下での匂い原因物質の匂いと、匂い抑制物質の非共存下での匂い原因物質の匂いとを比較することにより、評価することができる。
【０１００】
従来の匂い抑制剤の開発過程では、官能試験等によって膨大な数の物質またはそれらの組み合わせの匂い抑制能を１つ１つ確認して匂い抑制物質を選択していかなければならなかったため、匂い抑制剤の開発までに多くの時間とコストが必要であった。しかし、本発明の方法によれば、受容体タンパク質を利用することにより、匂い抑制物質を効率的にスクリーニングすることができる。よって、本発明の方法によれば、匂い抑制剤の開発の効率を大きく向上させることができる。
【０１０１】
スクリーニングされた匂い抑制物質の用途は、特に制限されない。匂い抑制物質は、例えば、匂い原因物質を含有する対象物（例えば飲食品や香粧品）に配合して使用することができる。匂い抑制物質の配合により、匂い原因物質を含有する対象物における匂い原因物質の匂いを抑制することができる。また、匂い抑制物質は、例えば、新たな匂い抑制物質の開発のための原料として使用することもできる。
【実施例】
【０１０２】
以下、非限定的な実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【０１０３】
＜１＞ヒト嗅覚受容体発現細胞の作製
＜１−１＞ヒト嗅覚受容体の発現ベクターの作製
ヒト嗅覚受容体遺伝子を、GenBankに登録されている配列情報を基に、TrueClone cDNA Cloneコレクション（OriGene）から購入したヒト嗅覚受容体遺伝子を鋳型としたPCR法によりそれぞれ増幅した。増幅した各遺伝子を、EcoRIおよびXhoIサイトを利用して、Rho-pME18Sベクター（K. Kajiya et al., Journal of Neuroscience 15 August 2001, 21 (16)
6018-6025）のRhoタグ配列の下流にサブクローニングし、ヒト嗅覚受容体の発現ベクターを得た。ヒト嗅覚受容体としては、OR1D2、OR2L8、およびOR5P3を採用した。
【０１０４】
＜１−２＞コウモリRTP1s発現ベクターの作製
コウモリのRTP1s遺伝子（GenBank accession No. XM_006765851の109位のAから3'末までの塩基配列）をユーロフィンジェノミクスの人工遺伝子合成サービスを用いて合成し、HindIIIおよびEcoRIサイトを利用してpcDNA3.1(+)ベクター（Thermo Fisher Scientific）にクローニングし、コウモリRTP1sの発現ベクターpcDNA3.1-microbat RTP1sを得た。
【０１０５】
＜１−３＞ヒトGolf発現ベクターの作成
ヒトGolfタンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されている（GenBank accession No. NM_182978）。ヒトmRNAを鋳型として、配列番号６と７のプライマーを用いて、RT-PCRを行った。増幅したDNA断片を、GENEART Seamless Cloning and Assembly Kit（A13288、ライフテクノロジーズ社）を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)（ライフテクノロジーズ社)のHindIII-EcoRIサイトにクローニングし、ヒトGolf発現ベクターpcDNA3.1-Golfを得た。
【０１０６】
＜１−４＞ラットRic8B発現ベクターの作成
ラットRic8Bタンパク質をコードする全長cDNAの配列は、NCBIのGenBankに登録されている（GenBank accession No. NM_175598）。ラットmRNAを鋳型として、配列番号８と９のプライマーを用いて、RT-PCRを行った。増幅したDNA断片を、GENEART Seamless Cloning and Assembly Kit（A13288、ライフテクノロジーズ社）を用いてプラスミドpcDNA3.1(+)（ライフテクノロジーズ社)のHindIII-XbaIサイトにクローニングし、ラットRic8B発現ベクターpcDNA3.1-Ric8Bを得た。
【０１０７】
＜１−５＞嗅覚受容体（OR1D2、OR2L8、OR5P3）発現細胞の作製
嗅覚受容体3種（OR1D2、OR2L8、OR5P3）をそれぞれ発現させたHEK293T細胞を以下の手順で作製した。表４に示す組成の発現ベクター混合液を調製し、クリーンベンチ内で20分静置した後、前日に10 cmシャーレに播種したHEK293T細胞（2.5×106細胞/10 cmシャーレ）に添加した。37℃、5% CO2を保持したインキュベータ内で5時間培養した後、96ウェルプレート（BD）の各ウェルにHEK293T細胞（2.5×105細胞/ml）を100μlずつ播種し、37℃、5% CO2を保持したインキュベータ内で一晩培養した。このようにして、表４に示す発現ベクターがトランスフェクションされ、それら発現ベクターにコードされる遺伝子を適宜発現する細胞の培養物を得た。
【０１０８】
【表４】
2019129772.tif 000005
【０１０９】
＜２＞ルシフェラーゼアッセイ
嗅覚受容体発現細胞を利用して、試験物質の存在下および非存在下での２−ヘプタノンに対する嗅覚受容体の応答を測定して比較し、試験物質による嗅覚受容体の応答阻害を評価した。
【０１１０】
HEK293T細胞に発現させた嗅覚受容体3種（OR1D2、OR2L8、OR5P3）は、Golfと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化し、以て細胞内cAMP量を増加させる。本実施例において、２−ヘプタノンに対する嗅覚受容体の応答の測定には、細胞内cAMP量の増加をホタルルシフェラーゼ由来の発光値の増加としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。「ルシフェラーゼレポータージーンアッセイ」を「ルシフェラーゼアッセイ」ともいう。ホタルルシフェラーゼは、pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] Vectorに搭載されたホタルルシフェラーゼ遺伝子から、細胞内cAMP量依存的に発現する。なお、必要に応じて、ウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値を各ウェルの遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正するための内部標準として用いることができるが、本実験では省略した。ウミシイタケルシフェラーゼは、pGL4.74[hRluc/TK] Vectorに搭載されたウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子から、CMVプロモーターの制御下で構成的に発現する。
【０１１１】
上記＜１−５＞で得られた培養物から培地を取り除き、１０種の試験物質／２−ヘプタノン混合溶液（試験物質を100μM、２−ヘプタノンを1 mM含有する）または２−ヘプタノン溶液（２−ヘプタノンを1 mM含有する）を15μl添加し、反応液とした。各溶液は、指定の物質をCD293（Life Technologies,Inc.）に溶解して調製した。細胞をCO2インキュベータ内で３７℃、3時間培養し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で充分に発現させた。細胞内のホタルルシフェラーゼ由来の発光値を測定し、「Luc値」とした。ホタルルシフェラーゼ由来の発光値は、Dual-GloTMluciferase assay system（Promega）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定した。
【０１１２】
試験物質による受容体応答の阻害率は、以下のとおり算出した。２−ヘプタノン単独で刺激した細胞でのLuc値（X）を、刺激を行わなかった細胞でのLuc値（Y）で引き算した。同様に、２−ヘプタノンと試験物質の混合物で刺激した細胞でのLuc値（Z）を、刺激を行わなかった細胞でのLuc値（Y）で引き算した。以下の計算式により、２−ヘプタノン単独刺激による発光値の増加分（X−Y）を基準に、試験物質による受容体応答の阻害率を算出した。実験は二連で行い、平均値を得た。
阻害率（％）＝｛１−（Z−Y）／（X−Y）｝×100
【０１１３】
結果を表５に示す。OR1D2、OR2L8、OR5P3のいずれに対しても、8種類の試験物質が阻害活性を示した（表５）。
【０１１４】
【表５】
2019129772.tif 000006
【０１１５】
さらに、阻害活性を示した試験物質について、阻害活性の濃度依存性を調べた。試験物質の濃度は、3、10、30、または100μMとした。各試験物質濃度下における２−ヘプタノン（1 mM）に対する受容体の応答を、試験物質非存在下での２−ヘプタノン（1 mM）に対する受容体の応答強度を１００%とする相対応答強度として測定した。その結果から、各試験物質の50%阻害濃度（IC50値）を算出した。結果を表６に示す。
【０１１６】
【表６】
2019129772.tif 000007
【０１１７】
＜配列表の説明＞
配列番号：
１：ヒトのOR1D2遺伝子の塩基配列
２：ヒトのOR1D2タンパク質のアミノ酸配列
３：ヒトのGolfタンパク質のアミノ酸配列
４：ラットのRic8Bタンパク質のアミノ酸配列
５：コウモリのRTP1sタンパク質のアミノ酸配列
６〜９：プライマー
１０：ヒトのOR2L8遺伝子の塩基配列
１１：ヒトのOR2L8タンパク質のアミノ酸配列
１２：ヒトのOR5P3遺伝子の塩基配列
１３：ヒトのOR5P3タンパク質のアミノ酸配列
【配列表】
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