(57)【要約】      （修正有）【課題】天然の胚沿軸中胚葉前駆細胞と区別するために、沿軸中胚葉前駆体のマーカーを発現する前駆細胞株を調製する方法の提供。【解決手段】有効量のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤と有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤とを含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆細胞を調製するｅｘ  ｖｉｖｏ方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤を含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆細胞を調製するｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項２】
有効量のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤と有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤とを含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆細胞を調製するｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項３】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路が古典的Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路及びＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路のうちの少なくとも一方である請求項１又は２に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項４】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化剤が、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーである請求項１〜３のいずれか一項に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項５】
前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーが、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、又は前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２の組合せからなる群において選択される請求項４に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項６】
前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ−３が、配列番号１の配列のヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−３又は配列番号５の配列のヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−３アイソフォーム２である請求項５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項７】
前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ−２が、配列番号３の配列のヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−２、配列番号６の配列のヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−２アイソフォーム２、又は配列番号７の配列のヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−２アイソフォーム３である請求項５に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項８】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤が、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ様１〜３、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ様１〜５、Ｄａｎファミリーのメンバー、並びにＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するそれらの変異体及びフラグメントからなる群より選択される請求項２に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項９】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤がＮｏｇｇｉｎである請求項８に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項１０】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤がＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ等のＢＭＰシグナル伝達の化学的阻害剤である請求項８に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項１１】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化剤がＧＳＫ−３βの阻害剤である請求項１又は２に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項１２】
前記適切な培養培地がＤＭＳＯ又は等価物を更に含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ方法。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞がマウス若しくはヒト胚性幹細胞、又はｉＰＳ細胞である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上する、Ｗｎｔ活性化
剤及びＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤を含む培養培地。
【請求項１５】
前記Ｗｎｔ活性剤がＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３であり、前記ＢＭＰシグナル伝達経路がＮｏｇｇｉｎである請求項１４に記載の培養培地。
【請求項１６】
ＤＭＳＯを更に含む請求項１５に記載の培養培地。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法により得ることができる人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団。
【請求項１８】
前記集団における細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、及び好ましくは９０％が、例えばＭｓｇｎ１遺伝子産物といった、高発現の沿軸中胚葉前駆細胞に特徴的なバイオマーカーを呈する請求項１７に記載の集団。
【請求項１９】
骨格筋系統、骨系統、軟骨系統、真皮細胞系統、脂肪細胞系統又は内皮細胞系統を含む集団を調製する方法であって、
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法に従って調製された人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を供給する工程と、
（ｂ）骨格筋系統、骨系統、軟骨系統、真皮細胞系統、脂肪細胞系統又は内皮細胞系統を含む沿軸中胚葉誘導体のうちから選択される所望の細胞系統へと人工沿軸中胚葉前駆細胞を分化させるのに適切な条件下で、前記人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を培養する工程とを含む、方法。
【請求項２０】
骨格筋細胞系統を含む集団を調製する請求項１９に記載の方法であって、
（ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法に従って調製された人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を供給する工程と、
（ｂ）少なくとも以下の成分：
ｉ．細胞外マトリクス材料；及び
ｉｉ．レチノイン酸、ＢＭＰ、ＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子β）、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｎｏｔｃｈ、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、ミオスタチン、インスリン、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋを含むが、これらに限定されない前記系統の分化を制御することが知られているシグナル伝達経路を活性化又は阻害する化合物；
を含む分化培地の存在下で前記人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を培養する工程と、
（ｃ）任意選択で、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）シグナル伝達経路、アクチビンシグナル伝達経路、ＥＧＦ（上皮増殖因子）シグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路、及びＩＧＦシグナル伝達経路を活性化若しくは阻害する少なくとも１又は複数の化合物、又はウマ血清若しくはトランスフェリン等の筋形成分化を促進することが知られている少なくとも１又は複数の化合物を含む、第２分化培地中で工程（ｂ）から得られた前記集団を培養する工程と、
を含み、それによって、Ｄｅｓｍｉｎ若しくはミオシン重鎖等のマーカーによって同定され得る骨格筋細胞系統を含む集団を得る、方法。
【請求項２１】
真皮細胞系統を含む集団を調製する請求項１９に記載の方法であって、ＢＭＰ経路、ＴＧＦβ経路、Ｗｎｔ経路、ＦＧＦ経路、ＥＧＦ経路、レチノイン酸経路、Ｎｏｔｃｈ経路及びＨｅｄｇｅｈｏｇ経路を活性化若しくは阻害する効果的な量の少なくとも１又は複数の化合物の存在下で請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法に従って調製された人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を培養する工程を含む、方法。
【請求項２２】
骨細胞系統又は軟骨細胞系統を含む集団を調製する請求項１９に記載の方法であって、
レチノイン酸経路、Ｗｎｔ経路、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路、ｐＴＨＲＰ経路、ＴＧＦβ経路、ＢＭＰ経路を活性化又は阻害する効果的な量の少なくとも１又は複数の化合物、又はデキサメタゾン、アスコルビン酸、ビタミンＤ３、及びベータ−グリセロリン酸等の骨若しくは軟骨の分化を促進することが知られている効果的な量の少なくとも１又は複数の化合物の存在下で請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法に従って調製された人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を培養する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効量のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤と有効量の骨形成タンパク質（Bone Morphogenetic Protein：ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤とを含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆（induced Paraxial Mesoderm Progenitor：ｉＰＡＭ）細胞を調製するｅｘ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹（Embryonic Stem：ＥＳ）細胞研究は、系統分化等の根本的な発生過程を理解するための先例のない可能性を提供する。胚性幹細胞株は初期胚から得られ、自己複製、即ち、培養物中において増殖性の未分化な状態で無期限に維持される能力を特徴とする。また、ＥＳ細胞は多能性であり、３つの胚系統、即ち、外肺葉、中胚葉及び内胚葉、更にそれらの全ての誘導体へと分化する能力を保持していることを意味する（非特許文献１）。最近のリプログラミング技術の発達により、現在では線維芽細胞等の体細胞からＥＳ細胞様幹細胞を作製することが可能である。少数の特定の転写因子セットである、マウス（非特許文献２）及びヒト（非特許文献３；非特許文献４）におけるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４、又はヒトにおけるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８（非特許文献５）の体細胞への導入により、様々な分化した細胞種をＥＳ様幹細胞状態へとリプログラムすることができる（人工多能性幹細胞すなわちｉＰＳ）。この戦略は、現在、個々の患者からのＥＳ様細胞株の作製を可能とし、そのようにしてヒト遺伝子疾患と関連性の高いｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを作り出す可能性を提供している。そのようなリプログラムされた細胞株が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の様々な疾患を有する患者から既に作製されており、かかるリプログラムされた細胞の欠損組織への分化がＡＬＳ等の幾つかの疾患に冒された患者由来のｉＰＳ細胞で達成され、したがって上記アプローチの実行可能性が立証されている（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００３】
心筋細胞又はニューロン等の幾つかの系統は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＥＳ細胞から容易に作製される一方で、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から骨格筋、真皮、軟骨、又は骨等の沿軸中胚葉誘導体を分化させることは困難であるとされている。幾つかの筋肉変性疾患の治癒のための細胞補充療法又は整形外科用の細胞補充療法によって与えられる裏付けを考慮すれば、筋系統及び骨格系統の前駆体を産生するためのプロトコルの開発が決定的に重要である。胚において、筋肉、背側真皮及び身体の中軸骨格は、沿軸中胚葉、より具体的には未分節中胚葉（ＰＳＭ）を形成する多能性前駆体に由来する。これらの前駆体は、遺伝子Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、Ｔｂｘ６及びＭｅｓｏｇｅｎｉｎ１（Ｍｓｇｎ１）（非特許文献８；非特許文献９）の発現を特徴とし、それらのほとんどが、骨格筋系統、真皮系統、骨格系統、並びに脂肪細胞及び内皮細胞を含む他の様々な誘導体へと分化する。マウス胚において、Ｒｓｐｏ３（Ｃｒｉｓｔｉｎ１、Ｔｈｓｄ２とも呼ばれる）は、ＰＳＭ及び体節において強く発現し、また後に凝縮している間葉系細胞中において強く発現する（非特許文献１０；非特許文献１１）。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ（Ｒｓｐｏ１〜Ｒｓｐｏ４遺伝子）は、トロンボスポンジン領域を含む分泌分子であり、Ｆｚｄ／ＬＲＰ／Ｌｇｒ４／Ｌｇｒ５コレセプター複合体を介して古典的Ｗｎｔシグナル伝達及びベータ−カテニンを活性化することができるが（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）、Ｓｙｎｄｅｃａｎ４にも結合してＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達を誘導することが示されている（非特許文献１６）。興味深いことに、生化学的アッセイにより、Ｒｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３は、Ｒｓｐｏ１及びＲｓｐｏ４に比べてより強力にＷｎｔシグナル伝達を活性化することが示されている（非特許文献１４）。また、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎは、骨形成及び軟骨形成（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１６）、筋形成（
非特許文献１９；非特許文献１０）、並びに血管新生（非特許文献２０）に関係することが示されている。
【０００４】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、二量体化してＢＭＰシグナル伝達を活性化し、Ｉ型及びＩＩ型ＢＭＰ受容体（ＢＭＰＲ−Ｉ及びＢＭＰＲ−ＩＩ）で構成されるレセプター複合体に結合し得る、ＴＧＦベータスーパーファミリーの分泌分子である。より正確には、ＢＭＰＲ−Ｉはアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−２／３及び６（それぞれＡｃｔＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＡ及びＢＭＰＲ−ＩＢとしても知られている）からなる場合もある。同様に、ＢＭＰＲ−ＩＩは、ＢＭＰＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩＡ及びＡｃｔＲ−ＩＩＢからなる場合もある。ＢＭＰレセプター複合体は、２つのＢＭＰＲ−Ｉ及び２つのＢＭＰＲ−ＩＩのヘテロテトラマー複合体によって形成される。ＢＭＰ受容体は、ＢＭＰ二量体の結合に際してＳｍａｄ１／５／８のリン酸化を可能とする細胞質内のセリン／トレオニンキナーゼ領域を含む。リン酸化されたＳｍａｄ１／５／８は、その後、Ｓｍａｄ４と連携し、核内へとシャトルして（shuttle）、ＤＮＡ結合阻害因子（Ｉｄ）１／２／３遺伝
子を含む標的遺伝子を活性化する（非特許文献２１）。重要なことは、非常に多くのＢＭＰ／ＴＧＦβ分泌アゴニスト及びアンタゴニストが、発生の間にＢＭＰシグナル伝達を調節及び微調整することが説明されている。特に、ｎｏｇｇｉｎ、ｃｈｏｒｄｉｎ、ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ及びｇｒｅｍｌｉｎが、分泌されたＢＭＰを隔離することによってＢＭＰシグナル伝達を遮断し、受容体への結合を妨げる。ＢＭＰリガンド（著しくは、ＢＭＰ２、４及び７）、ＢＭＰ受容体、Ｓｍａｄ、Ｃｏ−Ｓｍａｄ及びＢＭＰアゴニスト／アンタゴニストは、中胚葉特異化及び発生の間の器官形成に関係している（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７及び非特許文献２８）。
【０００５】
ＥＳ細胞の沿軸内胚葉及びその誘導体への分化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは非常に非効率的である。自発的な骨格筋分化が制限されているのは、マウス胚様体の培養及びＤＭＳＯ処理（非特許文献２９；非特許文献３０）、又はレチノイン酸処理（非特許文献３１）よると説明されている。マウス及びヒトＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて筋肉系統へと分化させるための２つの明確な戦略が報告されている。１つ目は、表面マーカーを使用した前駆体の選別を含む。例えば、Studerのグループは、血清含有培地における培養期間の後に、ヒトＥＳ細胞由来ＣＤ７３＋間葉系前駆体の単離及びそれらのその後の骨格筋への分化を報告した（非特許文献３２）。また、衛星細胞ＳＭ／Ｃ−２．６に対する抗体を、マウスＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞から分化した筋原細胞を単離するために使用した（非特許文献３３；非特許文献３４）。最後に、マウスＥＳ細胞から分化した内胚葉前駆体もまた、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲａ）又は血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）等の他の表面マーカーの発現に基づいて単離された（非特許文献３５；非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３８）。しかしながら、このマーカーの組合せが沿軸内胚葉前駆体に厳密に特異的であるかどうかは立証されていない。２つ目の戦略は、転写因子であるＰａｘ３若しくはＭｙｏＤ、又は分泌因子であるインスリン増殖因子２（ＩＧＦ−２）のマウスＥＳ細胞における強制発現に基づくものである（非特許文献３９；非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３）。しかしながら、これらの戦略は効率が悪いか、安全な細胞療法の開発において大きな障害であるＥＳ細胞への外来性ＤＮＡの導入を必要とするかのいずれかであり、分化細胞は増殖力及び生着力が劣ることが多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Chambers I., 2004
【非特許文献２】Takahashi and Yamanaka, 2006
【非特許文献３】Park et al., 2008b
【非特許文献４】Takahashi et al., 2007
【非特許文献５】Yu et al., 2007
【非特許文献６】Dimos et al., 2008
【非特許文献７】Park et al., 2008a
【非特許文献８】Chapman et al., 1996
【非特許文献９】Yoon and Wold, 2000
【非特許文献１０】Kazanskaya et al., 2004
【非特許文献１１】Nam et al., 2007
【非特許文献１２】Carmon et al., 2011
【非特許文献１３】de Lau et al., 2011
【非特許文献１４】Kim et al., 2008
【非特許文献１５】Nam et al., 2006
【非特許文献１６】Ohkawara et al., 2011
【非特許文献１７】Hankenson et al., 2010
【非特許文献１８】Jin et al., 2011
【非特許文献１９】Han et al., 2011
【非特許文献２０】Kazanskaya et al., 2008
【非特許文献２１】Hollnagel A et al., 1999
【非特許文献２２】Derynck Rik, 2008
【非特許文献２３】Reshef R. et al, Gen Dev 1998
【非特許文献２４】Wijgerde M. et al, 2005
【非特許文献２５】McMahon JA et al, 1998
【非特許文献２６】Stafford DA et al, 2011
【非特許文献２７】Pourquie O. et al, 1996
【非特許文献２８】Tonegawa A. et al, 1997
【非特許文献２９】Dinsmore et al., 1996
【非特許文献３０】Rohwedel et al., 1994
【非特許文献３１】Kennedy et al., 2009
【非特許文献３２】Barberi et al., 2007
【非特許文献３３】Fukada et al., 2004
【非特許文献３４】Mizuno et al., 2010
【非特許文献３５】Sakurai et al., 2009
【非特許文献３６】Sakurai et al., 2008
【非特許文献３７】Sakurai H. et al., 2006
【非特許文献３８】Takebe A. et al, 2006
【非特許文献３９】Darabi et al., 2008
【非特許文献４０】Darabi et al., 2011
【非特許文献４１】Dekel et al., 1992
【非特許文献４２】Prelle et al., 2000
【非特許文献４３】Shani et al., 1992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、再生医療における応用の開発のため、筋肉細胞及び沿軸中胚葉由来系統を産生するためのより良好なＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の分化戦略を開発することが必要とされている。
【０００８】
本発明は、天然の胚沿軸中胚葉前駆細胞と区別するために沿軸中胚葉前駆体のマーカーを発現する、人工沿軸中胚葉前駆細胞又すなわちｉＰＡＭと呼ばれる多分化能の前駆細胞株を調製する方法を提供することによって、この要求を満たす。それらのｉｎ  ｖｉｖｏ
における対応物のように、ｉＰＡＭ細胞は、筋肉、骨格（骨及び軟骨）、真皮組織、並びに脂肪細胞及び内皮等の誘導体の細胞系統をもたらすことができる。本発明者らは、胚性幹細胞又は多能性のリプログラムされた細胞（ｉＰＳ）を、制限された数の因子を使用して人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞へと分化し得ることを示した。特に、本発明者らは、標的細胞のいかなる遺伝的修飾も伴うことなく、特定の因子で処理することによって、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を効率的に得ることが可能であるという驚くべき知見を得た。本発明者らは、得られた人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞が、内因性の沿軸中胚葉前駆細胞の特徴を呈することを示した。出願人の知る限り、本発明は、筋肉組織、骨格組織、脂肪組織又は真皮組織のいずれか、及び沿軸中胚葉由来内皮を再生するための前駆細胞としての使用に好適な無限の量の細胞を得る方法を初めて説明するものである。したがって、本発明は、とりわけ再生医学において非常に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、有効量のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤を含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するｅｘ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【００１０】
特に、本発明は、有効量のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤と有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤とを含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するｅｘ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【００１１】
より具体的には、本発明は、有効量のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーと有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤とを含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆細胞を調製するｅｘ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【００１２】
本発明は、有効量のＧＳＫ−３βの阻害剤のメンバーと有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤とを含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む代替方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎが人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞運命を誘導することを示す図である。（Ａ）組換えマウスＲｓｐｏ３（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むか又は含まない、ＦＢＳ１５％培地又はＫＳＲ１５％培地における基本培養条件（default culture conditions）下でのｍＥＳ細胞（Ｍｓｇｎ１ＲｅｐＶ）の分化４日後の蛍光Ｍｓｇｎ１レポーター活性化（ＹＦＰ陽性細胞（ＹＦＰ＋細胞））の比較。ＹＦＰチャネル、５０倍。（Ｂ）ＦＢＳ１５％培地中でマウスＲｓｐｏ３に反応したｉＰＡＭ細胞誘導の頑強性。フローサイトメトリーによる３組のウェルの測定。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．である。
【図２】Ｒｓｐｏ３による処理時のＭｓｇｎ１−ＹＦＰ＋（人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞）集団の誘導のフローサイトメトリー分析を示す図である。（Ａ）ＦＢＳ１５％培地での分化０日目におけるＭｓｇｎ１ＲｅｐＶ  ｍＥＳ細胞に対するフローサイトメトリー分析。ＹＦＰ＋集団は１％未満であった。（Ｂ）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３  １０ｎｇ／ｍＬを補充されたＦＢＳ１５％培地での分化４日目におけるフローサイトメトリー分析。ＹＦＰ＋集団は全集団の７０％より多かった。
【図３】沿軸中胚葉前駆体（人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞）の特性評価を示す図である。（Ａ）抗ＹＦＰ抗体で標識化され、ヘキストで共染色された培養物中における４日後のマウスＭｓｇｎ１ＲｅｐＶレポーターｍＥＳ細胞のｉＰＡＭ細胞への分化、１０倍。（Ｂ）沿軸中胚葉前駆体に特異的な遺伝子であるＭｓｇｎ１及びＴｂｘ６に対する、ＦＡＣＳで選別されたｉＰＡＭ  ＹＦＰ陽性集団のｑＲＴ−ＰＣＲ分析、非ｉＰＡＭ  ＹＦＰ陰性集団発現レベルに対して正規化された相対発現（濃縮倍率）。
【図４Ａ】図４Ａ−Ｃは古典的Ｗｎｔシグナル伝達によって媒介される人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ活性を示す図である。（図４Ａ）古典的Ｗｎｔ阻害剤であるＤｋｋ１の存在下又は不在下におけるＦＢＳ１５％培地での分化４日後のｉＰＡＭ誘導（％ＹＦＰ陽性細胞）に対する種々の用量のＲｓｐｏ３の効果の比較。濃度はｎｇ／ｍＬ。
【図４Ｂ】ＦＢＳ１５％培地での分化４日後におけるｉＰＡＭ誘導（％ＹＦＰ陽性細胞）に対する４つの組換えＲｓｐｏファミリーメンバーの効率の比較。濃度はｎｇ／ｍＬ。
【図４Ｃ】古典的Ｗｎｔシグナル伝達活性化のためにＢａｔｌｕｃレポーター構築物によって形質移入され、低血清（ＦＢＳ１％）含有培地中においてＲｓｐｏ３（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｄｋｋ１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＬｉＣｌ（５ｍＭ）の存在下で培養されたＭｓｇｎ１ＲｅｐＶレポーターｍＥＳ細胞におけるルシフェラーゼ検出。Ｒｓｐｏ３による処理は、分化しているＥＳ細胞における古典的Ｗｎｔ反応を強く活性化する。
【図５】Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ活性が、ＧＳＫ３ベータ阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１によって模倣され得ることを示す図である。ＦＢＳ１５％培地での分化３日後及び４日後におけるｉＰＡＭ誘導（％ＹＦＰ陽性細胞）に対するＲｓｐｏ３及びＣＨＩＲ９９０２１の効率の比較。Ｒｓｐｏ３についての濃度はｎｇ／ｍＬ、ＣＨＩＲ９９０２１についての濃度はμＭ。
【図６】ＤＭＳＯが人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞誘導に対して好ましい効果を有することを示す図である。ＤＭＳＯ０．５％を含有するＦＢＳ１５％培地での分化４日後におけるｉＰＡＭ誘導。最適なｉＰＡＭ誘導がＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ及びＤＭＳＯの併用により得られた。濃度はｎｇ／ｍＬ。
【図７】限定培地中におけるＲｓｐｏ２及びＲｓｐｏ３活性を示す図である。ＦＢＳ１％培地（Ａ）又はＫＳＲ１５％培地（Ｂ）での分化４日後におけるｉＰＡＭ誘導（ＹＦＰ陽性細胞の％）に対する組換えマウス及びヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３の効果の分析。濃度はｎｇ／ｍＬ。
【図８】分化１８日目における本発明の集団の特性評価を示す図である。０日目〜４日目において、マウスＥＳ細胞を、Ｒｓｐｏ３の存在下で分化させ、その後ＦＢＳ１５％培地中で１８日目まで分化させた。細胞種を組織特異的抗体染色、即ち、筋肉（デスミン、緑色）、内皮（ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）、緑色）及び軟骨（アルシアンブルー）により同定した。
【図９】培養５日後のｉＰＡＭ細胞の真皮及び筋形成分化を示す図である。ＥＳ細胞を、ＦＢＳ１５％、ＤＭＳＯ０．５％及びＲｓｐｏ３  １０ｎｇ／ｍｌ中で４日間培養し、その後、ＦＢＳ１５％若しくはＦＢＳ１％、又はソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）及びレチノイン酸添加ＦＢＳ１％（Ｆ１ＳｈｈＲＡ）又はＳｈｈ、Ｎｏｇｇｉｎ及びＬｉＣｌ添加ＦＢＳ１％（Ｆ１ＳＮＬｉ）に移した。次の日に細胞を回収し、真皮マーカーＤｅｒｍｏ１（Ａ）及び筋肉マーカーＭｙｆ５（Ｂ）についてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。グラフは、濃縮倍率を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ−ＤはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎがヒトＥＳ細胞においてｉＰＡＭ運命を誘導することを示す図である。（図１０Ａ）ｍｉｂｕｎｋａＨＵＥＳ１、又はＲｓｐｏ３を含むか若しくは含まないＦＢＳ１５％含有培地中で１０日目まで培養されたＨＵＥＳ１において、ＱＲＴ−ＰＣＲによって測定された、沿軸中胚葉前駆体マーカーであるＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現比較。未分化ＨＵＥＳ１細胞に対する相対的発現を示す（誘導倍率）。
【図１０Ｂ】沿軸中胚葉前駆体マーカーであるＰＤＧＦＲａの発現比較。未分化ＨＵＥＳ１細胞に対する相対的発現を示す（誘導倍率）。
【図１０Ｃ】沿軸中胚葉前駆体マーカーであるＴｂｘ６の発現比較。未分化ＨＵＥＳ１細胞に対する相対的発現を示す（誘導倍率）。
【図１０Ｄ】沿軸中胚葉前駆体マーカーであるＭｓｇｎ１の発現比較。未分化ＨＵＥＳ１細胞に対する相対的発現を示す（誘導倍率）。
【図１１】Ｎｏｇｇｉｎが、ＢＭＰ４活性を相殺することによってｉＰＡＭ運命を促進することを示す図である。Ｎｏｇｇｉｎ（２００ｎｇ／ｍｌ）の添加を伴う（ＲＤＮ）又は伴わない（ＲＤ）、Ｒｓｐｏ３  １０ｎｇ／ｍｌ及びＤＭＳＯ０．５％の存在下での分化３日目（ｄ３）及び４日目（ｄ４）におけるＢＭＰ４発現。データは、正規化された発現値として示される。灰色に着色されたデータポイントは、有意でないものとする。データポイントは、３組の生物試料の平均である。
【図１２】沿軸中胚葉分化の初期段階の分子特性評価を示す図である。（Ａ）ＰＳＭ領域の後方部及び前方部、並びにＲｓｐｏ３  １０ｎｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ０．５％及びＮｏｇｇｉｎ２００ｎｇ／ｍｌの存在下で、３日目及び４日目にそれぞれ回収されたｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化したＭｓｇｎ１ＲｅＰＶ  Ｖｅｎｕｓ陽性ＥＳ細胞の遺伝子サインリスト（ＧＳＬ法）を比較するベン図。ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのＶｅｎｕｓ陽性ＥＳ細胞（人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞）におけるＰＳＭ間で共有される主要なサイン遺伝子を強調する（黒色四角）。赤色矢印は、ＥＳ細胞分化の３日目及び４日目の間にシフトする遺伝子サインを示す。（Ｂ）ＰＳＭ、並びに３日間及び４日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化されたＭｓｇｎ１ＲｅｐＶ細胞（人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞）に共通のサイン遺伝子リストからの代表的な遺伝子。示される遺伝子は、強く発現され、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって沿軸中胚葉に特異的であることが確認された（データは非図示）。３日目に活性化された遺伝子はほとんどがＰＳＭ後方部に特異的であったのに対し、４日目に活性化された遺伝子はＰＳＭ前方部のアイデンティティーの獲得を明確に示した。
【図１３Ａ】図１３Ａ−Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＥＳ細胞から分化されたＰａｘ３陽性ＰＳＭ前駆体が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて筋線維を作製することができることを示す図である。（図１３Ａ）ＣＡＧ−ＧＦＰレンチウイルスで標識化され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて分化されたＰａｘ３陽性細胞（人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞）を用いた移植の１ヶ月後に前脛骨筋を採取した（横断面）。コントロール（Ｃｔｒｌ、非移植領域）及び生着領域をジストロフィン（ＤＹＳ）及びラミニン（ＬＡＭＡ１）に対する抗体で染色（赤色）した。生着した前駆体は、ジストロフィン及びラミニンを発現する筋線維を広範囲に亘って産生した。核をヘキストで対比染色した。スケールバー、１００μｍ。
【図１３Ｂ】移植１か月後に前脛骨筋を採取した（横断面）。コントロール（Ｃｔｒｌ）及び生着領域をミオゲニン（ＭＹＯＧ）及びＰＡＸ７（赤色）に対する抗体で染色した。核をヘキストで対比染色した。ＰＡＸ７欄について、挿入欄はＧＦＰ分布を示す。スケールバー、１００μｍ。
【図１３Ｃ】生着した細胞は、胚性ミオシンＭｙＨＣｅｍｂ、ＭｙＨＣＩ（遅筋）及びＭｙＨＣｐｅｒｉ／ＭｙＨＣＩＩ（速筋）（左欄）を発現し、対応するＧＦＰ／ヘキスト対比染色とのオーバーレイを右欄に示す。各抗体について、移植組織を上段に示し、コントロール組織を下段に示す。スケールバー、２００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製する方法
本発明の第１の態様は有効量のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤を含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するｅｘ  ｖｉｖｏ方法に関する。
【００１５】
別の特定の態様では、本発明は、有効量のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤を含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の集団を調製するｅｘ  ｖｉｖｏ方法にも関する。
【００１６】
特定の態様では、本発明は、有効量のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤と有効量の骨
形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤とを含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するｅｘ  ｖｉｖｏ方法にも関する。
【００１７】
特定の態様では、本発明は、有効量のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤と有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤とを含む適切な培養培地中で多能性細胞を培養する工程を含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の集団を調製するｅｘ
ｖｉｖｏ方法に関する。
【００１８】
本明細書で使用される用語「Ｗｎｔシグナル伝達経路」は、２つの経路、即ち「古典的Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路」及び「Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路」に分けられ得るシグナル伝達経路を表す。本明細書で使用される用語「古典的Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路」又は「Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路」は、その一般的な意味において、胚発生及びがんにおける役割で最もよく知られているのみならず、成体動物における正常な生理学的プロセスに関与するタンパク質及び他の生物活性因子（脂質、イオン、糖等）のネットワークを表す。「古典的Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路」は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）のＷｎｔ依存性の阻害を特徴とし、後のβ−カテニンの安定化をもたらし、その後、核へと移行し転写因子として作用する。「Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路」は、ＧＳＫ−３β又はβ−カテニンを含まず、カルシウム依存性シグナル伝達、平面内細胞極性（ＰＣＰ）分子、低分子ＧＴＰアーゼ及びＣ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達を含む幾つかのシグナル伝達の分岐を含む。これらの経路は、Clevers, 2006；Montcouquiol et al, 2006；Schlessinger et al, 2009等の多数の総説において詳しく記載されている。
【００１９】
１つの実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路である。
【００２０】
更に好ましい実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路である。
【００２１】
別の好ましい実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路及びＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路である。
【００２２】
本明細書で使用される用語「活性化剤」は、Ｗｎｔシグナル伝達活性を増強する物質を表す。例えば、古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路について、この活性は、ＬＥＦ／ＴＣＦ結合部位レポーターの確立された多量体を使用するＷｎｔレポーター活性、及び／又はＧＳＫ−３βの阻害、及び／又はＴ、Ｔｂｘ６、Ｍｓｇｎ１、若しくはＡｘｉｎ２等の古典的Ｗｎｔ標的遺伝子の活性化によって測定され得る。
【００２３】
本明細書で使用される用語「人工沿軸中胚葉前駆細胞」又は「ｉＰＡＭ」は、任意の細胞種由来であるが、沿軸中胚葉の前駆細胞の特徴を呈する細胞を指す。１つの実施形態において、ｉＰＡＭ細胞は、以下の特性を特徴とする：
ａ）それらは、Ｔｂｘ６、ＥｐｈｒｉｎＡ１、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥＰＨＡ４、ＰＤＧＦＲアルファ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ３、Ｐａｐｃ（Ｐｃｄｈ８）、Ｌｆｎｇ、Ｈｅｓ７、Ｒｉｐｐｌｙ１、Ｒｉｐｐｌｙ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、Ｃｄｘ２、Ｃｄｘ４、Ｅｖｘ１、Ｃｘｃｒ４、Ｉｌｌ７ｒｄ、Ｆｇｆ８、Ｆｇｆ１７、Ｇｂｘ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｒｓｐｏ３、ＳＰ５、ＳＰ８、Ｈａｓ２、Ｄｋｋ１、Ｄａｃｔ１、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２又はＭｓｇｎ１遺伝子等の沿軸中胚葉前駆細胞に特徴的なバイオマーカーを発現する。例えば、Ｍｓｇｎ１プロモーターを含む遺伝子レポーターアッセイで測定されるようにＭｓｇｎ１遺伝子を優先的に発現す
る；並びに、
ｂ）それらは多能性細胞であり、少なくとも骨格細胞系統、真皮細胞系統又は筋肉細胞系統への分化が可能である；
ｃ）任意選択で、それらは、例えば、６か月を超えて培養物中に維持され得る、長期の自己複製特性を有してもよい。
【００２４】
上記人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の多分化能を、例えば、以下、特に実施例において記載されるプロトコルを使用して、骨格細胞系統、真皮細胞系統又は筋肉細胞系統へのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて試験することができる。
【００２５】
本明細書で使用される、用語「多分化能」は、環境条件及び培養条件に依存して２以上の細胞系統へと分化することが可能な細胞を指す。多能性であり全ての種類の体細胞系統へと分化し得る胚性幹細胞とは対照的に、本発明の人工沿軸中胚葉前駆細胞は、限定された分化能を有する。
【００２６】
用語「多能性細胞」は、本明細書で使用される場合、様々な異なる細胞系統のもととなり得る哺乳類未分化細胞を指す。典型的には、多能性細胞は、以下のマーカー、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３及びＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１／８１を発現し得る。International Stem Cell Initiative recommendations, 2007を参照されたい。
【００２７】
１つの実施形態において、多能性細胞はヒト多能性細胞である。
【００２８】
別の実施形態において、多能性細胞は非ヒト哺乳類多能性細胞である。
【００２９】
１つの実施形態において、多能性細胞は幹細胞である。
【００３０】
典型的には、上記幹細胞は胚性幹細胞である。
【００３１】
別の実施形態において、多能性細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）である。典型的には、下表に記載されるもののようなｈＥＳ細胞株（Loser et al, 2010）が、本発明の方
法に採用され得る。
【００３２】
【表１】
2019004903.tif 000002
【００３３】
１つの実施形態において、多能性細胞は、マウス幹細胞、齧歯類幹細胞又は霊長類幹細胞等の非ヒト胚性幹細胞である。
【００３４】
１つの実施形態において、多能性細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、或る特定の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞から人工的に得られた多能性幹細胞の種類である。ｉＰＳ細胞は、２００６年にマウス細胞から最初に産生され（非特許文献２）、２００７年にヒト細胞から産生された（非特許文献４；非特許文献５）。
【００３５】
別の実施形態において、本発明の古典的Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路又はＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路の活性化剤は、脊椎動物種起源であるか又は修飾されたＲ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーである。
【００３６】
別の実施形態において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーは、哺乳類Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーである。
【００３７】
特定の実施形態において、本発明によるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ４からなる群において選択される。
【００３８】
特定の実施形態において、本発明によるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーはＲ
−ｓｐｏｎｄｉｎ３である。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明によるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２である。
【００４０】
本明細書で使用される用語「Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３」又は「Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２」は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する脊椎動物における分泌タンパク質のファミリーのメンバーを指す。
【００４１】
ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３タンパク質の例示的配列は、アクセッション番号ＮＰ＿１１６１７３．２（配列番号１）のもと、データベースに寄託されている。マウスＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３タンパク質の例示的配列は、アクセッション番号ＮＰ＿０８２６２７．３（配列番号２）のもと、データベースに寄託されている。ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２タンパク質の例示的配列は、アクセッション番号ＮＰ＿８４８６６０．３（配列番号３）のもと、データベースに寄託されている。マウスＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２タンパク質の例示的配列は、アクセッション番号ＮＰ＿７６６４０３．１（配列番号４）のもと、データベースに寄託されている。
【００４２】
また、本明細書で使用される用語「Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３」は、かかる機能的変異体が本発明の目的のための分化因子の有利な特性を保持する限り、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３野生型（天然起源）タンパク質の任意の機能的変異体も包含する。１つの実施形態において、上記機能的変異体は、最も密接に関連する既知の天然Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３ポリペプチド配列に対して、例えば、それぞれ配列番号１又は配列番号２のヒト又はマウスポリペプチドＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３に対して、少なくとも６０％、８０％、９０％又は少なくとも９５％の同一性を有し、かつ関連する野生型タンパク質と実質的に同一のＷｎｔ活性化活性を保持する、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３の機能的ホモログである。別の実施形態において、上記機能的変異体は、例えば、野生型Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３タンパク質の少なくとも５０、１００、又は２００の連続するアミノ酸を含み、かつ実質的に同一のＷｎｔ活性化活性を保持する、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３のフラグメントである。別の実施形態において、かかる機能的変異体は、参照番号Ｑ９ＢＸＹ４−２及びＣＡＩ２０１４２．１（配列番号５）のもとに記載されるヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３のアイソフォーム２等のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３遺伝子産物アイソフォームにおいて構成され得る。
【００４３】
本明細書で使用される用語「Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２」もまた、かかる機能的変異体が本発明の目的のための分化因子の有利な特性を維持する限り、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２野生型（天然起源）タンパク質の任意の機能的変異体を包含する。
【００４４】
１つの実施形態において、上記機能的変異体は、最も密接に関連する既知の天然Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２ポリペプチド配列に対して、例えば、それぞれ配列番号３又は配列番号４のヒト又はマウスポリペプチドＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２に対して、少なくとも６０％、８０％、９０％又は少なくとも９５％の同一性を有し、かつ関連する野生型タンパク質と実質的に同一のＷｎｔ活性化活性を保持する、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２の機能的ホモログである。別の実施形態において、上記機能的変異体は、例えば、野生型Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２タンパク質の少なくとも５０、１００、又は２００の連続するアミノ酸を含み、かつ実質的に同一のＷｎｔ活性化活性を保持する、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２のフラグメントである。別の実施形態において、上記機能的変異体は、それぞれ参照番号Ｑ６ＵＸＸ９−２（配列番号６）又は参照番号Ｑ６ＵＸＸ９−３（配列番号７）のもと記載されるヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２のアイソフォーム２又はアイソフォーム３等のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２遺伝子産物アイソフォームにおいて構成され得る。
【００４５】
本明細書で使用される、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップ数及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置数の関数（即ち、％同一性＝同一の位置数／全位置数×１００）である。２つの配列間の配列比較及び同一性パーセントの決定は、以下に記載される数学的アルゴリズムを使用して達成される。
【００４６】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＰＡＭ１２０重量残基表（weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、E.Meyers及びW. Millerの
アルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, 1988）を使用して決定することがで
きる。
【００４７】
別の実施形態において、本発明による活性化剤は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２の組合せである。
【００４８】
別の実施形態において、本発明による活性化剤は、配列番号５の配列のヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−３アイソフォーム２であってもよい。
【００４９】
別の実施形態において、本発明による活性化剤は、配列番号６の配列のヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−２アイソフォーム２又は配列番号７の配列のヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−２アイソフォーム３であってもよい。
【００５０】
特定の実施形態において、多能性細胞の培養に使用されるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであり、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌである。
【００５１】
特定の実施形態において、多能性細胞の培養に使用されるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２の濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌである。
【００５２】
特定の実施形態において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２の濃度は、１０ｎｇ／ｍｌである。１０ｎｇ／ｍｌの濃度により、５０％を超えて７０％までの多能性細胞が人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞において分化される。
【００５３】
別の実施形態において、多能性細胞は、１日〜１５日間又はそれよりも短い期間に亘って、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２と共に培養される。特定の実施形態において、多能性細胞は少なくとも１０日間に亘って、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３又は／及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２と共に培養される。
【００５４】
本明細書で使用される用語「ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤」は、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）シグナル伝達経路の活性化の低下を生じさせる、天然又は合成の任意の化合物を表す。ＢＭＰシグナル伝達経路は、Ｉ型及びＩＩ型ＢＭＰ受容体で構成されるヘテロ複合体への二量体ＢＭＰタンパク質の結合を特徴とし、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化をもたらすリン酸化カスケードを生じ、Ｉｄ遺伝子等の標的遺伝子の活性化を生じるものである。典型的には、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、タンパク質Ｓｍａｄ１、５及び８のリン酸化レベルの低下を誘発する（Gazzero and Minetti, 2007）。
【００５５】
当業者であれば、所定の化合物がＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤であるかどうかについてどのように評価するか理解している。典型的には、化合物は、該化合物の存在下で細胞を培養した後、リン酸化Ｓｍａｄ１、５又は８のレベルが、上記化合物の非存在下で培
養された細胞と比較して減少していれば、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤であると判断する。リン酸化Ｓｍａｄタンパク質のレベルは、該Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化形態に特異的な抗体を使用するウェスタンブロットによって測定され得る。
【００５６】
Ｉｄ遺伝子等の標的遺伝子活性化は、典型的には、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を介して、直接的なＩｄ１／２／３転写産物（ｍＲＮＡ）産生によって測定され、発現レベルを上記化合物の非存在下におけるコントロール状況と比較することができる。
【００５７】
ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、ＢＭＰアンタゴニスト、Ｉ型及び／又はＩＩ型ＢＭＰ受容体活性を遮断する化合物（Ｉ／ＩＩ型ＢＭＰ受容体阻害剤）、Ｉ型及び／又はＩＩ型ＢＭＰ遺伝子発現の阻害剤、又はＢＭＰシグナル伝達経路の任意の下流段階を阻害する分子であってもよい。ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、天然化合物又は合成化合物であってもよい。ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤がタンパク質である場合、精製タンパク質又は組換えタンパク質若しくは合成タンパク質であってもよい。
【００５８】
１つの実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤である。
【００５９】
組換えタンパク質を産生するための多くの方法が当該技術分野において既知である。当業者であれば、所定のタンパク質の配列の知識、又は該タンパク質をコードするヌクレオチド配列の知識から、標準的な分子生物学的技術及び生化学的技術を使用して該タンパク質を容易に産生することができる。
【００６０】
本発明の１つの実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ及び関連するタンパク質（Ｃｈｏｒｄｉｎ様１／２／３）、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ及び関連するタンパク質（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ様１／２／３／４／５）、Ｄａｎファミリーのタンパク質（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ１、Ｇｒｅｍｌｉｎ１及び２、Ｃｅｒｌ−２（Ｃｏｃｏ）、ＳＯＳＴ（Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）、ＳＯＳＴＤＣ１（Ｗｉｓｅ）を含む）並びにＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するそれらの変異体及びフラグメントからなる群より選択される。
【００６１】
本発明の別の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、ＢＭＰ−１／Ｔｏｌｌｏｉｄ様タンパク質、ＴＷＳＧ１（ｔｗｉｓｔｅｄ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）、ＴＭＥＦＦ（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）、Ｂｉｇｌｙｃａｎ、ＴＳＫ（Ｔｓｕｋｕｓｈｉ）、ＢＭＰＥＲ（Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ  ２）、Ｏｇｏｎ（Ｓｉｚｚｌｅｄ）、ＡＭＮ（Ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）、ＣＴＧＦ（結合組織増殖因子）、及びＨＳＰＧ（Ｇｌｙｐｉｃａｎ３及びＳｙｎｄｅｃａｎ４を含む）からなる群より選択される。
【００６２】
別の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤はｎｏｇｇｉｎである。ｎｏｇｇｉｎは、マウスｎｏｇｇｉｎ（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０３２７３７によって例示されるマウスｎｏｇｇｉｎ、配列番号１０）又はヒトｎｏｇｇｉｎ（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＥＡＷ９４５２８によって例示されるヒトｎｏｇｇｉｎ、配列番号１１）であってもよい。それは精製されてもよく、組換え体であってもよい。それは、単量体形態又は二量体形態であってもよい。
【００６３】
１つの実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、ＢＭＰシグナル伝達カスケードを阻害する化合物である。特定の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達カスケードを阻害する化合物は、合成化合物又は化合物である。
【００６４】
別の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、Ｉ型ＢＭＰ受容体の阻害剤である。
【００６５】
本明細書で使用される「骨形成タンパク質」に対する用語「Ｉ型ＢＭＰ受容体」は、特定の細胞基質上の或る特定のセリンアミノ酸及びトレオニンアミノ酸に対してリン酸塩分子の付加を媒介するセリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有する膜貫通タンパク質を表す。当該技術分野においては、Ｉ型ＢＭＰ受容体の阻害剤は、ＢＭＰシグナル伝達経路を遮断し得ることがよく知られている。例えば、Yu et al, Nat Chem Biol. 2008を
参照されたい。
【００６６】
好ましい実施形態において、Ｉ型ＢＭＰ受容体の阻害剤は、化合物Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ又は構造活性研究によって作製された任意の誘導体（Cuny GD et al, 2008）であ
る。Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、化合物Ｃとしても知られる）は、Ｉ型ＢＭＰ受容体（ＡＬＫ２、３及び６）を特異的に阻害する（Yu PB et al, 2008）。
【００６７】
組換えＮｏｇｇｉｎは、R&D Systems若しくはPeprotechから購入することができ、又は上述の標準的な技術を使用して産生することができる。
【００６８】
典型的には、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、１ｎｇ／ｍｌ〜１００００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、更に好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００６９】
典型的にはｎｏｇｇｉｎは、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲、更に好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００７０】
典型的には、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎは、０．１μＭ〜２μＭの濃度範囲、好ましくは１μＭの濃度で本発明の培養培地に添加される。
【００７１】
１つの実施形態において、多能性細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤と共に１日〜４日間培養される。
【００７２】
１つの実施形態において、本発明による培養培地は多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するため、本発明によるＷｎｔ活性化剤及びＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤を含む。
【００７３】
１つの実施形態において、Ｗｎｔ活性剤はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３であり、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤はＮｏｇｇｉｎである。
【００７４】
別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）又はＤＭＳＯの等価物を更に含んでもよい。
【００７５】
本明細書で使用される用語「等価物」は、極性化合物及び非極性化合物の両方を溶解する溶媒であるＤＭＳＯと同一の特性を呈する物質を意味する。
【００７６】
別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（
ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、Ｎｏｇｇｉｎ及びＤＭＳＯを含む。
【００７７】
別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３及びＤＭＳＯを含む。
【００７８】
別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、Ｎｏｇｇｉｎ及びＤＭＳＯを含む。
【００７９】
別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２及びＤＭＳＯを含む。
【００８０】
別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ及びＤＭＳＯを含む。
【００８１】
別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ及びＤＭＳＯを含む。
【００８２】
更なる別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、Ｎｏｇｇｉｎ及びＤＭＳＯを含む。
【００８３】
更なる別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２及びＤＭＳＯを含む。
【００８４】
更なる別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ及びＤＭＳＯを含む。
【００８５】
脊椎動物組換えＲ−ｓｐｏｎｄｉｎは、商業的に購入することができ、又は順化培養培地として産生することができる。これは、ＣＯＳ細胞等のコンピテント細胞中にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質のコード配列を含む構築物を発現させることを含む。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質は、培養培地中に分泌される。順化培地を、多能性細胞に直接適用してもよく、又は予め基本培地中に希釈してもよい。
【００８６】
別の実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化剤は、ＧＳＫ−３βの阻害剤である。
【００８７】
本明細書で使用される「グリコーゲン合成キナーゼ３ベータ」に対する用語「ＧＳＫ−３β」は、特定の細胞基質上の或る特定のセリンアミノ酸及びトレオニンアミノ酸に対するリン酸塩分子の付加を媒介するセリン／トレオニンプロテインキナーゼを表す。当該技術分野において、ＧＳＫ−３βの阻害剤は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化し得ることがよく知られている。例えば、Cohen and Goedert, 2004；Sato et al, 2004；Taelman et al, 2010；Wu and Pan, 2010を参照されたい。
【００８８】
好ましい実施形態において、ＧＳＫ−３βの阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。
【００８９】
別の好ましい実施形態において、以下の代替手段を生体内（the system）でのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ因子の活性を高めるために使用することができる：
１．上記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ因子又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎの修飾形態をコードする遺伝子の内因性の発現を増強する；
２．制御配列に制御可能に連結されたＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ因子のコード配列を含む発現ベクターを多能性細胞に導入して分化させるか、又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ因子に対するコーディングＲＮＡを細胞に導入することによって上記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ因子の異所性の発現を可能とする；
３．例えば、培養培地中、若しくは順化培地中の組換えＲ−ｓｐｏｄｉｎ因子（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１、２、３及び４のファミリー）として、又は基体コーティングとして、適切な量のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ因子を細胞環境に直接導入する；
４．上記標的細胞においてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ因子シグナル伝達に関与する遺伝子の内因性の発現を活性化若しくは阻害する；又は、
５．上記標的細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ因子の発現レベルの制御、突然変異及び全体的な調節に関与するタンパク質を過剰発現させる。
【００９０】
１つの実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、ＣＨＩＲ９９０２１及び本発明によるＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤であるＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎを含む。
【００９１】
１つの実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ及びＤＭＳＯを含む。
【００９２】
１つの実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３及びＣＨＩＲ９９０２１の組合せであるＷｎｔ活性化剤と、Ｎｏｇｇｉｎ及びＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎの組合せである本発明によるＢＭＰシグナル伝達の阻害剤とを含む。
【００９３】
更なる別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ及びＤＭＳＯを含む。
【００９４】
更なる別の実施形態において、本発明による培養培地は、多能性細胞の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞への分化を向上するために、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｎｏｇｇｉｎ及びＤＭＳＯを含む。
【００９５】
別の実施形態において、生体内でのＷｎｔシグナル伝達経路の活性を高めるための代替手段として、例えば、化合物ＣＨＩＲ９９０２１のような適切な量の薬理学的なＧＳＫ−３β阻害剤の単独又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎとの併用による直接的な細胞環境への導入を使用する。
【００９６】
本発明は、多能性細胞から人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するための組成物に関し、ここで、該組成物は、有効量の本発明によるＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤、及び有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤を含む。
【００９７】
また、本発明は、多能性細胞由来の人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するための組成物に関し、ここで、該組成物は、有効量の本発明によるＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤を含む。
【００９８】
また、本発明は、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するためのキットに関し、該キットは、
ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化剤、
ｂ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤、及び
ｃ）任意選択で、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するための使用説明書、
を含む。
【００９９】
また、本発明は、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するためのキットに関し、該キットは、
ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化剤、及び
ｂ）任意選択で、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するための使用説明書、
を含む。
【０１００】
好ましい実施形態において、上記活性化剤は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーである。
【０１０１】
別の実施形態において、上記活性化剤は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ４からなる群より選択される。
【０１０２】
別の好ましい実施形態において、上記活性化剤は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３である。
【０１０３】
別の好ましい実施形態において、上記活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１等のＧＳＫ−３βの阻害剤である。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明による阻害剤は、ＢＭＰ／ＴＧＦベータファミリーの分泌アンタゴニストである。
【０１０５】
別の実施形態において、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ様１／２／３、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ様１／２／３／４／５、並びにＣｅｒｂｅｒｕｓ１、Ｇｒｅｍｌｉｎ１／２を含むＤａｎファミリーのメンバーからなる群より選択される。
【０１０６】
別の好ましい実施形態において、上記阻害剤はＮｏｇｇｉｎ又はＦｏｌｌｉｓｔａｔｉｎである。
【０１０７】
別の好ましい実施形態において、上記阻害剤は、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ等のＢＭＰシグナル伝達の化学的阻害剤である。
【０１０８】
特定の実施形態において、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製する上記キットは、
ａ）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーを含む組成物、
ｂ）ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤を含む組成物、及び
ｃ）ＤＭＳＯ又は等価物、
を含む。
【０１０９】
別の特定の実施形態において、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製する上記キットは、
ａ）Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのメンバーを含む組成物、及び
ｂ）ＤＭＳＯ又は等価物、
を含む。
【０１１０】
特定の実施形態において、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を調製するための上記キットは、
ａ）ＧＳＫ−３βの化合物阻害剤を含む組成物、
ｂ）Ｉ型ＢＭＰ受容体の化合物阻害剤を含む組成物、及び
ｃ）ＤＭＳＯ又は等価物、
を含む。
【０１１１】
本発明の方法により得ることができる人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団
本発明は、さらに、上記方法により得ることができる人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団に関する。
【０１１２】
これらの集団は、典型的には、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞に加えて、他の細胞種を含んでもよい。１つの実施形態において、本発明の集団は、例えばＭｓｇｎ１遺伝子産物といった沿軸中胚葉前駆細胞に特徴的な少なくとも１つのバイオマーカーの高発現を呈する細胞を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％及び好ましくは少なくとも９０％含む。
【０１１３】
沿軸中胚葉前駆細胞に特徴的な他のバイオマーカーとしては、限定ではないが、以下の１又は複数のタンパク質が挙げられる：Ｔｂｘ６、ＥｐｈｒｉｎＡ１、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥＰＨＡ４、ＰＤＧＦＲアルファ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ３、Ｐａｐｃ（Ｐｃｄｈ８）、Ｌｆｎｇ、Ｈｅｓ７、Ｒｉｐｐｌｙ１、Ｒｉｐｐｌｙ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、Ｃｄｘ２、Ｃｄｘ４、Ｅｖｘ１、Ｃｘｃｒ４、Ｉ１１７ｒｄ、Ｆｇｆ８、Ｆｇｆ１７、Ｇｂｘ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｒｓｐｏ３、ＳＰ５、ＳＰ８、Ｈａｓ２、Ｄｋｋ１、Ｄａｃｔ１、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２。
【０１１４】
遺伝子発現を測定するために当該技術分野において既知の任意の方法を使用することができ、特に、リアルタイム定量的ＰＣＲ若しくはマイクロアレイ等の定量的方法、又は遺伝子レポーター発現を使用する方法であって、該遺伝子レポーターが実施例に記載されるＭｓｇｎ１プロモーターを含む方法、又は免疫染色法等の定性的方法、若しくは細胞表面マーカーを含む特異的バイオマーカーを呈する細胞を同定する細胞ソーティング法を使用してもよい。
【０１１５】
本明細書で使用される、Ｍｓｇｎ１遺伝子は、Ｍｅｓｏｇｅｎｉｎ１をコードする遺伝子を指す。マウス及びヒトにおいてＭｅｓｏｇｅｎｉｎ１をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の例として、それぞれ、配列番号８（ＮＭ＿０１９５４４．１）及び配列番号９（ＮＭ＿００１１０５５６９．１）が挙げられる。
【０１１６】
１つの実施形態において、遺伝子発現に対する定量的アッセイにおいて発現が検出可能である場合にＭｓｇｎ１の発現が高いとされる。別の実施形態において、本来の多能性細胞において観察された発現レベルよりも上記発現レベルが有意に高いか、又はマウス多能性細胞に対するＬＩＦ（白血病抑制因子）を含まないか、若しくはヒト多能性細胞に対するＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）を含まない基本培養培地等の非特異的条件下で分化する細胞において観察された発現レベルよりも上記発現レベルが有意に高い場合に、Ｍｓｇｎ１の発現が高いとされる。コントロール細胞及び試験細胞間の発現レベルは、ＧＡＰＤＨ又はベータアクチン等の構成的に発現される遺伝子を使用して正規化され得る。
【０１１７】
人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団は、適切な増殖条件下で無期限に培養
され得る。当業者であれば、例えば胚性幹細胞若しくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の確立された増殖条件、又は以下の実施例に記載される増殖条件に基づいて適切な増殖条件を確立し得る。増殖条件は、有利には、例えば、ＦＧＦ、ＷＮＴのような増殖因子、又はそれぞれのシグナル伝達経路を調整する化合物を補充されたＫＳＲ（Gibco）、ＥＳＧ
ＲＯ（Chemicon/Millipore）といった血清置換培地の使用を含んでもよい。
【０１１８】
人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞は精製されてもよく、又は上記集団は人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を選択することによって人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞において濃縮されてもよい。１つの実施形態において、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞集団の精製又は濃縮のための人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞に特異的なマーカーは、以下のマーカー：Ｍｓｇｎ１、Ｔｂｘ６、ＥｐｈｒｉｎＡ１、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥＰＨＡ４、ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ３、Ｐａｐｃ（Ｐｃｄｈ８）、Ｌｆｎｇ、Ｈｅｓ７、Ｒｉｐｐｌｙ１、Ｒｉｐｐｌｙ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）、Ｃｄｘ２、Ｃｄｘ４、Ｅｖｘ１、Ｃｘｃｒ４、Ｉ１１７ｒｄ、Ｆｇｆ８、Ｆｇｆ１７、Ｇｂｘ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｒｓｐｏ３、ＳＰ５、ＳＰ８、Ｈａｓ２、Ｄｋｋ１、Ｄａｃｔ１、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２の１又は複数のうちから選択されてもよく、又は神経運命等の他の系統／細胞種のマーカーを用いて否定的に選択されてもよい。
【０１１９】
精製又は人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の濃縮は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）若しくは人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の上記細胞表面マーカーの特異的バインダーを含む磁気ビーズ等のセルソーティング技術、又は沿軸中胚葉前駆体マーカーに対する蛍光レポーターを使用して達成され得る。別の方法は、規定の基体上への選択的付着によって人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の特異接着特性を利用してなる。
【０１２０】
したがって、精製又は濃縮の後、上記集団は、例えばＭｓｇｎ１遺伝子産物といった人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞に特徴的なバイオマーカーを高発現で有する細胞を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％より多く、又は９５％より多く含み得る。
【０１２１】
別の好ましい実施形態において、本発明は、上述の方法により得ることができる人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞集団を含む組成物に関する。
【０１２２】
人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の分化による細胞系統の調製方法
人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞は、骨格筋、骨、軟骨、真皮細胞、並びに脂肪細胞又は内皮細胞を含むがこれらに限定されない沿軸中胚葉の他の誘導体を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化条件下で有利に培養され得る。
【０１２３】
したがって、本発明は、骨格筋系統、骨系統、軟骨系統、真皮細胞系統、脂肪細胞系統又は内皮細胞系統を含む集団を調製する方法であって、
（ａ）人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を供給する工程と、
（ｂ）骨格筋系統、骨系統、軟骨系統、真皮細胞系統、脂肪細胞系統又は内皮細胞系統を含む沿軸中胚葉誘導体のうちから選択される所望の細胞系統へと人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を分化させるために適切な条件下で、上記人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を培養する工程とを含む、方法に関する。
【０１２４】
さらに、本発明は、本発明による人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む細胞系統集団の調製のための組成物、及び所望の細胞系統への分化に適切な条件に関する。
【０１２５】
１つの特定の実施形態において、本発明は、骨格筋細胞系統を含む集団を調製する方法
であって、
（ａ）人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を供給する工程と、
（ｂ）少なくとも以下の成分：
（ｉ）細胞外マトリクス材料；及び
（ｉｉ）レチノイン酸、ＢＭＰ、ＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子β）、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｎｏｔｃｈ、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、ミオスタチン、インスリン、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋを含むが、これらに限定されない上記系統の分化を制御することが知られているシグナル伝達経路を活性化又は阻害する化合物；
を含む分化培地の存在下で上記人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を培養する工程と、
（ｃ）任意選択で、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）シグナル伝達経路、アクチビンシグナル伝達経路、ＥＧＦ（上皮増殖因子）シグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路、及びＩＧＦシグナル伝達経路を活性化若しくは阻害する少なくとも１又は複数の化合物、又はウマ血清若しくはトランスフェリン等の筋形成分化を促進することが知られている少なくとも１又は複数の化合物を含む、第２分化培地中で工程（ｂ）から得られた上記集団を培養する工程と、
を含み、それによって、Ｄｅｓｍｉｎ若しくはミオシン重鎖等のマーカーによって同定され得る骨格筋細胞系統を含む集団を得る、方法を提供する。
【０１２６】
設計された細胞外マトリクス又は三次元足場の使用は、当該技術分野において広く記載されている（Metallo et al, 2007）。特定の実施形態において、細胞外マトリクス材料
は、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、ポリリジン、ＰＤＭＳ及びＭａｔｒｉｇｅｌからなる群より選択される。
【０１２７】
さらに、本発明は、更に以下を含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞から骨格筋細胞系統を調製するための組成物に関する：
ｉ．細胞外マトリクス材料、
ｉｉ．レチノイン酸経路、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）経路、ＴＧＦβ経路、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路、Ｎｏｔｃｈ経路、ＦＧＦ経路、Ｗｎｔ経路、ミオスタチン経路、インスリン経路、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）経路、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）経路、ＭＡＰＫ経路、ＰＩ３Ｋ経路を活性化又は阻害する少なくとも１又は複数の化合物。上記組成物は、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＨＧＦシグナル伝達経路、アクチビンシグナル伝達経路、ＥＧＦシグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路及びＩＧＦシグナル伝達経路を活性化又は阻害する少なくとも別の化合物、又はウマ血清若しくはトランスフェリン等の筋形成分化を促進することが知られている化合物を更に含む。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明は、真皮細胞系統を含む集団を調製する方法を提供し、該方法は、ＢＭＰ経路、ＴＧＦβ経路、Ｗｎｔ経路、ＦＧＦ経路、ＥＧＦ経路、レチノイン酸経路、Ｎｏｔｃｈ経路及びＨｅｄｇｅｈｏｇ経路を活性化又は阻害する効果的な量の少なくとも１又は複数の化合物の存在下で人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を培養する工程を含む。真皮細胞は、Ｄｅｒｍｏ−１等のマーカーを使用して同定され得る。
【０１２９】
さらに、本発明は、ＢＭＰ経路、ＴＧＦβ経路、Ｗｎｔ経路、ＦＧＦ経路、ＥＧＦ経路、レチノイン酸経路、Ｎｏｔｃｈ経路及びＨｅｄｇｅｈｏｇ経路を活性化又は阻害する少なくとも１又は複数の化合物を更に含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞由来の真皮細胞系統を調製するための組成物に関する。
【０１３０】
別の実施形態において、本発明は、レチノイン酸経路、Ｗｎｔ経路、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路、ＰＴＨｒＰ経路、ＴＧＦＧβ経路、ＢＭＰ経路を活性化若しくは阻害する効果的な
量の少なくとも１又は複数の化合物、又はデキサメタゾン、アスコルビン酸、ビタミンＤ３及びベータ−グリセロリン酸等の骨若しくは軟骨分化を促進することが知られている効果的な量の少なくとも１又は複数の化合物の存在下で、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を培養する工程を含む、骨細胞系統又は軟骨細胞系統を含む集団を調製する方法を提供する。軟骨細胞は、アルシアンブルー等の古典的染色法によって同定され、骨細胞はアリザリンレッド又はフォンコッサ染色によって同定され得る。
【０１３１】
さらに、本発明は、レチノイン酸経路、Ｗｎｔ経路、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路、ＰＴＨｒＰ経路、ＴＧＦβ経路、ＢＭＰ経路を活性化若しくは阻害する少なくとも１又は複数の化合物、又はデキサメタゾン、アスコルビン酸、ビタミンＤ３及びベータ−グリセロリン酸等の骨若しくは軟骨分化を促進することが知られている少なくとも１又は複数の化合物を更に含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞由来の骨細胞系統又は軟骨細胞系統を調製するための組成物に関する。
【０１３２】
更なる別の実施形態において、本発明は、脂肪細胞を含む集団を調製する方法を提供し、該方法は、デキサメタゾン、イソブチルキサンチン及びインスリンを含む、脂肪細胞の分化を促進することが知られている効果的な量の少なくとも１又は複数の化合物の存在下で人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を培養する工程を含む。脂肪細胞は、ＯｉｌＲｅｄＯ染色によって検出され得る。
【０１３３】
さらに、本発明は、デキサメタゾン、イソブチルキサンチン及びインスリンを含む、脂肪細胞の分化を促進することが知られている少なくとも１つの化合物を更に含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞から脂肪細胞を調製するための組成物に関する。
【０１３４】
更なる別の実施形態において、本発明は、内皮細胞を含む集団を調製する方法を提供し、上記方法は、ＶＥＧＦ経路又はＦＧＦ経路を活性化又は阻害する効果的な量の少なくとも１又は複数の化合物の存在下で人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む集団を培養する工程を含む。内皮は、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）免疫染色によって検出され得る。
【０１３５】
さらに、本発明は、ＶＥＧＦ経路又はＦＧＦ経路を活性化又は阻害する少なくとも１又は複数の化合物を更に含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞から内皮細胞を調製するための組成物に関する。
【０１３６】
人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、軟骨細胞、筋肉細胞又は内皮細胞へと分化させるための幾つかの好適な条件の例が、下記実施例において記載される。
【０１３７】
別の実施形態において、本発明は、骨格筋系統、骨系統、軟骨系統、真皮細胞系統、脂肪細胞系統又は内皮細胞系統、及び人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞に由来する他の誘導体を含む集団を提供する。
【０１３８】
好ましい実施形態において、本発明は、骨格筋系統、骨系統、軟骨系統、真皮細胞系統、脂肪細胞系統又は内皮細胞系統、及び本発明の組成物により得られた人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞に由来する他の誘導体を含む集団を提供する。
【０１３９】
別の実施形態において、本発明は、本発明による方法によって得ることができる、骨格筋系統、骨系統、軟骨系統、真皮細胞系統、脂肪細胞系統又は内皮細胞系統を含む組成物に関する。
【０１４０】
ｉＰＡＭ細胞、ｉＰＡＭ細胞由来の細胞集団、及びそれらの使用
本発明の別の態様は、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を含む上記集団の使用、又
は人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の分化に由来する骨格筋細胞系統、骨細胞系統、軟骨細胞系統又は真皮細胞系統を含む上記集団の使用のみならず、脂肪組織及び内皮の沿軸中胚葉誘導体の使用に関し、以下、これらを本発明の集団と呼ぶ。
【０１４１】
本発明の集団を、様々な適用、特に研究分野又は治療分野において使用し得る。
【０１４２】
適用の主要な分野の１つとして、細胞療法又は再生医療が挙げられる。例えば、遺伝的欠陥を患う患者から得られた細胞を培養して、当該技術分野において既知の方法に従って遺伝的に補正し、その後、上記患者に再投与するためにｉＰＳ細胞へとリプログラムして人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞又はその誘導体へと分化させてもよい。
【０１４３】
同様に、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞、又は適切な前駆体若しくは細胞系統を含むそれらの誘導体のいずれかを含む集団の直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ移植によってｉｎ  ｖｉｖｏにおいて損傷した組織を再生することにより、機能障害、損傷又は欠陥組織より生じる任意の疾患を潜在的に治癒するため、再生医療を使用することができる。
【０１４４】
したがって、１つの態様において、本発明は、哺乳類、例えばヒト患者への移植用の細胞療法製品としての使用のための人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞、若しくはそれらの誘導体、又は本発明の集団に関する。
【０１４５】
１つの特定の実施形態において、本発明は、本発明により得られた人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の集団を含む医薬組成物に関する。別の好ましい実施形態において、本発明は、例えば、少なくとも１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、又は
少なくとも１０9のＭｓｇｎ１発現細胞を含む、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の
集団を含む医薬組成物に関する。別の実施形態において、この組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む。
【０１４６】
１つの特定の実施形態において、本発明の集団を、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はその他の任意の遺伝的筋ジストロフィーといった筋遺伝子疾患の治療に使用する。
【０１４７】
１つの実施形態において、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を様々な細胞種と共培養し、所望の系統への分化を誘導する。別の実施形態において、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、受容ホストへと直接に移植する。再生医療の目的のため、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、当該技術分野において既知の方法による遺伝子補正の後に移植することもできる。
【０１４８】
別の特定の実施形態において、本発明の集団を、加齢、疾患によって、又は外傷若しくは反復性緊張により生じるような身体的負荷によって引き起こされた関節又は軟骨若しくは骨の損傷の治療のための整形外科において使用する。
【０１４９】
また、別の特定の実施形態において、本発明の集団を、真皮組織、例えば皮膚組織の産生、再生医療又は研究における使用、特に化粧料産業又は火傷治療及び形成外科における使用のため、有利に使用し得る。
【０１５０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の集団を含む組成物に関する。本発明の集団を含む組成物は、細胞療法又は再生医療において使用され得る。
【０１５１】
本発明は、以下の図面及び実施例により更に解説される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、何ら本発明の範囲を制限するものと解釈されるものではない。
【０１５２】
図及び表：
【０１５３】
【表２】
2019004903.tif 000003
2019004903.tif 000004
【実施例】
【０１５４】
材料及び方法
細胞培養
未分化のマウスＥＳ細胞Ｍｓｇｎ１ＲｅｐＶ（Ｅ１４由来）は、ゼラチンコーティングしたディッシュ上でウシ胎児血清（ＦＢＳ；PAAより）１５％、ペニシリン、ストレプト
マイシン、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、非必須アミノ酸０．１ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、β−メルカプトエタノール０．２％、及びＬＩＦ１５００Ｕ／ｍＬを補充されたＤＭＥＭ中に維持した。ＥＳ細胞をマイトマイシン不活性化ＭＥＦ（フィーダー）と共培養した。未分化ヒトＥＳ細胞は、ｍａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences）でコーティングしたプレート上でｍＴｅＳＲ培地（STEMCELL Technologies）中で培養した。培養物を、３７
℃にて５％ＣＯ２のインキュベーター内で維持した。
【０１５５】
ＥＳ細胞の分化
ＥＳ細胞をトリプシン処理し、因子及びＤＭＳＯ（Sigma）を補充された血清ベース（
ＦＢＳ１５％）条件又は血清置換（ＫＳＲ１５％、Invitrogen）条件において、ゼラチンでコーティングしたフィーダーを含まない２４ウェルプレートに様々な密度で直接播種した。組換えタンパク質を商業的に（R&D）入手し、ストック溶液を製造業者の推奨に従っ
て調製した。ＧＳＫ−３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１及びＩ型ＢＭＰ受容体阻害剤ＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎをStemgentから購入し、製造業者の推奨に従って調製した。蛍光レポーター分析及び画像取得をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ上にて行った。
【０１５６】
ＦＡＣＳ分析及びセルソーティング
細胞培養物をトリプシン処理することによって解離し、ＹＦＰ発現に従ってＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）上でフローサイトメトリーにより分析した。データをＭｏＦｌｏソフトウェア（Beckman Coulter）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより更に分
析した。
【０１５７】
ＤＮＡマイクロアレイ
マウスＥ９．５胚のＰＳＭを顕微解剖し、以前に記載されているように加工し（Krol et al, 2011）、調製した試料をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ａｒｒａｙｓ上で実行した。分化細胞培養物について、Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋発現に基づくフローサイトメトリーによりｉＰＡＭを選別し、マイクロアレイ用に試料を調製した。実験を生物学的に３通り実施した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ（ＭＡＳ）５．０を使用してデータセットを加工した。
【０１５８】
遺伝子サインリスト法
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０  Ａｒｒａｙｓ  （ＧＥＯ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｉｄ  ＧＰＬ１２６１）に対応する、ＧＥＯに寄託された野生型マウス組織の全マイクロアレイを使用して遺伝子発現参照を構築した。各マクロアレイについて平均値を算出することにより正規化を行った。全マイクロアレイに亘るそれらの平均値の分布に対する中央値を決定した。その後、この中央値（median）を各マイクロアレイに対する各値のスケーリング因子として使用した。一旦全てのマイクロアレイを正規化すると、各プローブセットに対する中央発現値（median expression value）は参
照値として規定される。１つの実験条件に特異的な遺伝子サインリストを、参照データセットのような対応するマイクロアレイデータを正規化することによって作製した。正規化発現値（normalized expression value）が対応する参照値より１０倍高いプローブセッ
トをその条件のサイン遺伝子とした。
【０１５９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ（Invitrogen）を使用するか、又はＲｎａｅａｓｙ  ｐｌｕｓ  ｍｉｎｉ−ｋｉｔ  （Qiagen）によりＥＳ細胞培養物から全ＲＮＡを抽出した。ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Qiagen）、適切なプライマーを使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩ（Roche）を実行して、ＲＴ−ＰＣＲを全Ｒ
ＮＡ５ｎｇに対して実施した。ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして使用した。
【０１６０】
分化培養物のフェノタイピング
４℃にて一晩、ＰＦＡ４％により細胞培養物を固定した。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中にウシ胎児血清１％及びＴｒｉｔｏｎ０．１％で構成されるブロッキング溶液を用いて、細胞を２０分間インキュベートした。一次抗体インキュベーションを４℃にて一晩実施し、抗体使用希釈は以下の通りであった：抗ＧＦＰ（Abcam）は１：１０００、抗
Ｄｅｓｍｉｎ（DSHB）は１：１００、抗ＣＤ３１（BD Pharmingen）は１：１００。ＴＢ
Ｓで洗浄後、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識二次抗体（Molecular probes）と１：５００にて３０分間インキュベートし、ヘキストにより対比染色を行った。アルシアンブルー染色を標準的なプロトコルに従って行った。
【０１６１】
細胞の調製及び損傷した前脛骨筋への移植
Ｍｓｇｎ１ＲｅｐＶ  ＥＳ細胞培養物を分化の４日後にトリプシン処理し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ又はＭｏｆｌｏｗ  Ａｓｔｒｉｏｓ（ＢＤ）を使用してＹＦＰ蛍光発光に基づいてｉＰＡＭを選別した。ＣＡＧ−ＧＦＰレンチウイルス（２０〜３０のＭＯＩ）を用いて一晩形質導入を行うことによって不可逆的にｉＰＡＭを標識化した。融合していないウイルス粒子を除去するため、細胞を数回洗浄し、移植のための調製前に培地中で１時間再度インキュベートした。移植筋を１か月後に採取し、免疫組織化学用に加工した。解剖された前脛骨筋を、以前に記載されているように（B. Gayraud-Morel B. et al., 2012）凍結切片用（１２μｍ）に調製した。この研究において使用された抗体は、抗ジストロフィン（Sigma）、抗ラミニン（Sigma）、ミオゲニン（Dako）、Ｐａｘ７（DSHB）及びＧＦＰ（Abcam）であった。ミオシンアイソフォームに対する抗体はS.J.Mathew Dev 138, 371 (2011)に記載されている。組織切片を一次抗体と共に一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ（Molecular probes）で標識された二次抗体を１：５００で使用した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  ｏｂｓｅｒｖｅｒ上で画像化を行い、Ａｄｏｂｅ  ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて画像を加工した。
【０１６２】
結果
実施例１：Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化剤の使用
ｉｎ−ｖｉｔｒｏでの人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の産生
本発明者らは、当初、ＥＳ細胞由来の沿軸中胚葉系統の分化を促進する主要な分子プレーヤーの同定に焦点を絞っていた。最初に、本発明者らは、ウシ胎児血清１５％（ＦＢＳ１５％）を補充されたＤＭＥＭ系培地において、胚様体を形成した後にマウスＥＳ細胞が分化する間、沿軸中胚葉誘導の経時的変化を調査した。沿軸中胚葉前駆細胞における分化は、ＰＣＲによって検出されるＢｒａｃｈｙｕｒｙ／Ｔマーカー、Ｔｂｘ６マーカー、及びＭｓｇｎ１マーカーの活性化を特徴とした。培養１日目から４日目の本発明者らのデータは、幾つかの分化細胞は未分節中胚葉様段階にあることを示唆している。
【０１６３】
Ｍｓｇｎ１ＲｅｐＶ受容体ＥＳ株の特性評価
中胚葉アイデンティティーの獲得後の骨格筋分化の第１段階を表す、沿軸中胚葉分化（即ち、未分節運命（presomitic fate））の第１期へのＥＳ細胞の分化を追跡するため、
本発明者らは、沿軸中胚葉前駆体において特異的に発現する蛍光性レポーターを保持するトランスジェニックマウスＥＳ細胞株を作製した。本発明者らは、Ｖｅｎｕｓ（修飾ＹＦＰ）の発現を制御する未分節中胚葉に特異的な遺伝子であるマウスＭｓｇｎ１由来のプロモーターを使用した。その後、完全にトランスジェニックＥＳ細胞に由来する胚を作製す
るために４倍体凝集法を使用して、トランスジェニックＭｓｇｎ１ＲｅｐＶ（Ｍｅｓｏｇｅｎｉｎ１  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｖｅｎｕｓ）マウスＥＳ細胞株を検証した。予想通り、トランスジェニックマウス胚は、蛍光標識された沿軸中胚葉組織を呈し、したがって、トランスジェニックＥＳ細胞株におけるＶｅｎｕｓ発現の組織特異性が検証された。
【０１６４】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの同定
沿軸中胚葉前駆体の分化条件を最適化するため、本発明者らは、ＥＳ細胞に対して様々なシグナル伝達経路に干渉する候補増殖因子及び薬物を試験する手作業のスクリーニングアッセイを開発した。ゼラチン（０．１％）でコーティングされた２４ウェルプレートにＭｓｇｎ１ＲｅｐＶレポーター細胞を所定の密度で播種した。２種の基本培養培地を選択した：ウシ胎児血清１５％（ＦＢＳ、高血清）を含有するＤＭＥＭ系培地、及びＫＳＲ１５％（Invitrogen/Gibco）を含有する限定無血清培地。分化の０日目において、これらの基本培地を候補因子により補填した。コントロール条件及び実験条件を並行して培養した。２日目又は３日目に培地を交換し、細胞を３日間から４日間に亘って分化させた。分化の３日目及び４日目に細胞培養物を目視で分析し、更にＹＦＰ＋集団の定量化のためフローサイトメトリーによって分析した。
【０１６５】
分化の４日後、ＦＢＳ１５％におけるコントロールの分化は、低く変化しやすいＹＦＰ＋細胞の誘導を生じ（典型的には培養物の１％〜１５％）、限定培地ＫＳＲ１５％（Invitrogen）における分化は更に低い誘導を生じた（典型的には１％）。試験された一連の候補物質のうち、本発明者らは、分泌されたＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３タンパク質がＹＦＰ＋細胞の誘導を劇的に増加することが可能であると同定した。本発明者らのアッセイにおいて、１０ｎｇ／ｍＬでのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３は、ＦＢＳ系培地及びＫＳＲ系培地の両方においてＹＦＰ＋細胞の誘導を７０％まで顕著に増加するのに十分であった（図１、２及び７）。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３反応は３０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの間で飽和した。０日目において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３補填分化培地中のＹＦＰ＋集団は細胞の１％未満であったのに対し、４日目においてはＹＦＰ＋集団は細胞の５０％を超え、７０％までを示し得た（図２Ｂ）。ヒトＥＳ細胞において、沿軸中胚葉前駆体マーカーであるＢｒａｃｈｙｕｒｙ、ＰＤＧＦＲａ、Ｔｂｘ６及びＭｓｇｎ１の誘導は、ｈｕＥＳ１をＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３で処理する場合、ＦＢＳ１５％を含有する培地における培養の３日〜１０日後に観察される（図１０）。
【０１６６】
沿軸中胚葉前駆体の特性評価
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＥＳ細胞の分化に際する沿軸中胚葉前駆細胞運命の誘導を確認するため、本発明者らは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３の存在下での分化の４日後にＹＦＰ＋細胞集団を選別し（図３Ａ）、主要な沿軸中胚葉マーカーであるＭｓｇｎ１及びＴｂｘ６についてｑＲＴ−ＰＣＲによりＹＦＰ−細胞に対するＹＦＰ＋細胞を分析した（図３Ｂ）。本発明者らは、ＹＦＰ＋集団はＭｓｇｎ１内因性遺伝子、並びにＴｂｘ６を強く発現していることを確認し、これは本発明者らがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）を作製し得ることを立証している。
【０１６７】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリー及びＷｉｎｔシグナル伝達
次に、本発明者らは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーの他のメンバーが沿軸中胚葉前駆体ｉＰＡＭ細胞（Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋沿軸中胚葉前駆体）を誘導し得るかどうかを問うた。ＥＳ細胞を、ＦＢＳ１５％を補充された組換えＲ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１〜４）を含有する培地中で培養し、４日間に亘って分化させた（図４Ｂ）。このファミリーの２つのメンバー、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３が同等の活性を呈し、ＹＦＰ＋細胞数を顕著に増加した。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリータンパク質の活性は、古典的Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達と関連し（非特許文献１４；非特許文献１５）、より最近では、Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達と関連している（
非特許文献１６）。本発明者らは、分泌されたＤｋｋ１阻害剤を使用して、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ依存性分化に対する古典的Ｗｎｔシグナル伝達の阻害効果を分析した（図４Ａ）。細胞外ＷｎｔアンタゴニストであるＤｋｋ１による培地の補填は、ＹＦＰ＋誘導の急激な減少を生じる。さらに、ＦＢＳ含有培地にＤｋｋ１を添加すると、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３の効果が遮断され、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３効果は、Ｗｎｔ古典的経路によって媒介されていることを示唆している。また、本発明者らは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、及びＤｋｋ１、又はＷｎｔシグナル経路を活性化し得る化合物ＬｉＣｌによって処理された、又は処理されていないＥＳ細胞において形質移入された古典的Ｗｎｔシグナル伝達に反応するプロモーター（ＢＡＴ−ｌｕｃ）により制御されるプラスミド由来のルシフェラーゼ発現を分析した（図４Ｃ）。ルシフェラーゼは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３処理によって強く活性化され、このような状況において古典的Ｗｎｔ経路を活性化することを示唆している。
【０１６８】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３効果がＷｎｔ古典的経路によって媒介されているかどうかを更に試験するため、本発明者らは、十分に説明されているＧＳＫ−３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（Ring et al., 2003）の効果を試験した。図５は、４日後において、ＣＨＩ
Ｒ９９０２１がＲｓｐｏ−３と同様にＹＦＰ＋細胞の誘導に効果的であることを示し、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３効果が古典的Ｗｎｔ経路の活性化によって媒介されていることを示唆している。
【０１６９】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、幾つかの細胞種、特にＰ１９胚性癌腫（ＥＣ）細胞株由来の中胚葉の分化を促進することが示されている（McBurney et al., 1982；Skerjanc, 1999）。細胞培養物中のＤＭＳＯの正確な作用機構は知られておらず、ＤＭＳＯ
が原形質膜の特性を修飾することによって分化培地中に存在する細胞外シグナルに対して細胞をより反応性とすると仮定されている。ＦＢＳ含有培地への０．５％のＤＳＭＯの添加により、培養４日後におけるＹＦＰ＋細胞の増加が生じるが（図５、６及び７）、この増加はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２若しくはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、又はその両方の添加に起因する増加と比較して控えめである。興味深いことに、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ及びＤＭＳＯの添加は相乗的に沿軸中胚葉前駆体の分化を増強する（図５、６及び７）。ＤＭＳＯ及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２及び／又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３の両方を併用した場合の沿軸中胚葉分化に最適な条件を観察した（図５、６及び７）。重要なことは、この効果は、無血清の限定ＫＳＲ系培地においても見られたことである（図７Ｂ）。
【０１７０】
沿軸中胚葉前駆体の分化可能性
本発明者らは、次に、ｉＰＡＭ細胞集団の分化可能性を探索した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、沿軸中胚葉前駆細胞は、骨格筋、脊椎組織（軟骨、骨）、背側真皮、内皮、及び脂肪組織等の他の組織になるよう運命づけられている。
【０１７１】
それゆえ、本発明者らは、最初にｉＰＡＭ細胞を作製し、その後、１５％ＦＢＳ培地中でそれらを更に分化させることを目的とする連続的な分化プロトコルを実施するか、又は様々な記載されている分化プロトコル（以下を参照）、特に「筋形成」培地及び「軟骨形成」培地を適用することによって、実施した。
【０１７２】
例えば、０日目から４日目の間、ＥＳ細胞を最適化された分化条件（即ち、ＦＢＳ１５％基本培地中にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３  １０ｎｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ  ０．５％）に暴露した。４日目に培養培地を交換し、３日毎に培地交換をしながら、細胞を１８日目まで特定の分化培地に暴露した。１８日目において、細胞培養物を固定し、組織特異的な組織化学的染色又は免疫蛍光法により分析した（図８）。最適化された分化条件下において、細胞培養物は、軟骨（アルシアンブルー陽性小結節）、筋肉（デスミン陽性線維）及び内皮（ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１）に対して陽性であった。或いは、分化条件（即ち、ＦＢＳ１５％基本培地中にＲｓｐｏ３  １０ｎｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ０．５％）において４日後、ＦＢ
Ｓ１５％、又はＦＢＳ１％、若しくはソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）及びレチノイン酸添加ＦＢＳ１％（Ｆ１ＳｈｈＲＡ）、若しくはＳｈｈ、Ｎｏｇｇｉｎ及びＬｉＣｌ添加ＦＢＳ１％（Ｆ１ＳＮＬｉ）に細胞を移した。次の日に細胞を回収し、真皮マーカーＤｅｒｍｏ１及び筋肉マーカーＭｙｆ５についてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した（図９）。これらのマーカーの顕著な活性化が観察され、ｉＰＡＭ細胞の真皮系統及び筋肉系統への分化がそれぞれ示された。
【０１７３】
筋形成プロトコル：
代替的に、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、３日間に亘ってＢＭＰ４、アクチビンＡ及びＩＧＦ−１を補完されたＳＦＯ３培地を使用する二次元培養の後、ＬｉＣｌ及びＳｈｈを補完されたＳＦＯ３培地中で３日間に亘り、筋肉細胞へと分化させることができる。
【０１７４】
人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％、ウマ血清５％（Sigma）、２−メルカプトエタノール０．１ｍＭ、非必須アミノ酸０．１ｍＭ、及び
ペニシリン／ストレプトマイシン５０ｕｇ／ｍｌを補充されたＤＭＥＭで構成される分化培地中において、８００細胞／２０μＬで３日間に亘って懸滴培養することができる。３日後、培地を交換し、細胞凝集物を低吸着プレートに移した。６日目において、細胞を蒔き、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（BD Bioscience、ベッドフォード、マサチューセッツ州、アメリ
カ合衆国）でコーティングしたプレート上の分化培地中で培養した。筋形成分化は、ＦＢＳをコンフルエント細胞から除去し、インスリン１０ｕｇ／ｍｌ、トランスフェリン５ｕｇ／ｍｌ、及びウマ血清２％を添加することにより達成される。
【０１７５】
また、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、ＥＧＦ、インスリン、フェチュイン、デキサメタゾン、及びｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を補完された骨格筋細胞培地（Lonza、Chemicon）中で３週間にわたって培養することもできる。
【０１７６】
骨形成プロトコル：
骨格系統については、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、ヒト又はマウス組換えＢＭＰ４  ２００ｎｇ／ｍｌ、又はレチノイン酸１μＭ及び塩化リチウム１０ｍＭの組合せに暴露する。或いは、細胞を、１ウェル（２４ウェルプレート）当たり１〜３×１０3
の密度でゼラチンコーティングしたプレートに蒔き、骨特異的マーカーを発現する細胞又はアルシアンブルー陽性細胞外マトリクスを分泌する細胞を観察するため、骨分化培地（ＤＭＥＭ、ＦＢＳ１０％、ｌ−グルタミン２ｍＭ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、デキサメタゾン０．１μＭ、アスコルビン酸２リン酸５０μＭ、β−グリセロリン酸１０ｍＭ、ＢＭＰ４  １０ｎｇ／ｍＬ）中で２８日間培養する。分化した骨格細胞系統を、アルシアンブルー又はアリザリンレッドを含む骨及び軟骨の細胞外マトリクス成分に対する特異的染色を使用して、並びに軟骨細胞特異的抗体及び／又は骨細胞特異的抗体を使用する免疫蛍光法により同定する。
【０１７７】
また、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、ＤＭＥＭ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、１×Ｐ／Ｓ、デキサメタゾン０．１ｍＭ、アスコルビン酸２リン酸５０ｍＭ、ベータ−グリセロリン酸１０ｍＭ、及びＢＭＰ４  １０ｎｇ／ｍＬで構成される以下の分化培地を使用して、ビタミンＤ３と共に２０日間に亘り、３日毎の培地交換をしながら、骨系統へと分化させることもできる。骨形成は、当該技術分野においてよく知られている通り、分化した骨を赤く染色するアリザリンレッドを用いて分化している培養物を染色することによって確認することができる。また、カルシウムの細胞外蓄積は、フォンコッサ染色によって可視化することができる。或いは、分化している細胞を溶解し、ＢＢＴＰ試薬を使用してＡＬＰ活性についてアッセイすることもできる。或いは、分化している細胞を、例えば、Ｏｓｔｅｒｉｘ（Ｏｓｘ）及びＣｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２、アルカリホスフ
ァターゼ、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン及びオステオポンチンといった骨芽細胞系統マーカー発現について分析することができる。
【０１７８】
軟骨形成プロトコル：
軟骨形成細胞分化について、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、１ウェル（２４ウェルプレート）当たり８×１０4の密度で蒔き、軟骨分化培地（αＭＥＭ、ＦＢＳ１０
％、ｌ−グルタミン２ｍＭ、１×Ｐ／Ｓ、デキサメタゾン０．１μＭ、アスコルビン酸２リン酸１７０μＭ）中で３７℃のインキュベーターにおいて３０分間培養する。次に、等量のＴＧＦベータ３  １０ｎｇ／ｍＬを含む軟骨細胞分化培地をウェルに添加する。１週間後、Ｂｍｐ２  １０ｎｇ／ｍＬを補充された軟骨分化培地で培地を置換する。２１日後、細胞外マトリクスを分泌する軟骨小結節を観察することができる。また、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、アルファＭＥＭ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、１×Ｐ／Ｓ、デキサメタゾン０．１ｍＭ、及びアスコルビン酸２リン酸１７０ｍＭに基づく分化培地、又はデキサメタゾン０．１ｍＭ、アスコルビン酸０．１７ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１．０ｍＭ、Ｌ−プロリン０．３５ｍＭ、インスリン−トランスフェリンナトリウム１％、ウシ血清アルブミン１．２５ｍｇ／ｍｌ、リノール酸５．３３ｕｇ／ｍｌ、及びトランスフォーミング増殖因子ベータ０．０１ｕｇ／ｍｌ）並びにＴＧＦベータ３又はＢＭＰ２を補充されたＤＭＥＭを使用して、軟骨細胞へと分化させることもできる。細胞を、３日毎に培地交換をしながら数週間培養する。また、分化を、ＦＢＳ１０％及び抗生物質を含有し、組換えヒト骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）１００ｎｇ／ｍｌ及びアスコルビン酸５０ｍｇを補充されたＤＭＥＭ系培地中において、アルギン酸ビーズ等の３Ｄ足場上に高密度で行うこともできる。ムコ糖タンパク質（Muco-glycoproteins）を青く染色することが当該技術分野においてよく知られている、分化している培養物のアルシアンブルー染色によって、軟骨形成を確認することができる。或いは、サフラニンＯ染色を行うことができる。
【０１７９】
真皮線維芽細胞プロトコル：
人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）又は増殖因子のＷｎｔファミリーのメンバー等の線維芽細胞増殖因子を含有する培地中でコラーゲンの足場上でそれらを培養することによって真皮線維芽細胞へと分化させることができる。
【０１８０】
次に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎもまたヒトＥＳ細胞分化から沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を誘導することを確認するため、ＨＵＥＳ１細胞を単一細胞として蒔き、ＦＢＳ１５％を含有する培地中で、Ｒｓｐｏ３と共に、又はＲｓｐｏ３を含まずに分化させた。沿軸中胚葉前駆体マーカー発現に対するｑＲＴ−ＰＣＲ時間経過分析を行った（図１０）。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３の存在下におけるｈＥＳ細胞分化の間のＭｓｇｎ１及びＴｂｘ６の強い活性化は、ｉＰＡＭ細胞がｈＥＳ細胞から分化され得ることを立証している。
【０１８１】
実施例２：Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化剤及びＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤の使用
Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋細胞集団の特性評価
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎタンパク質及びＤＭＳＯを使用することにより、本発明者らは、１つの工程で７０％のＭｓｇｎ１−ＹＦＰ＋細胞を産生することができる（図２Ｂ）。Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋のトランスクリプトームをそれらのｉｎ  ｖｉｖｏ対応物（即ち、未分節中胚葉、ＰＳＭ）と直接比較するため、本発明者らは、マイクロアレイを使用して、徐々により成熟した分化段階を表す、連続したマウスフラグメントの全体的なトランスクリプトームプロファイリングを作製した（データは非図示）。ＰＳＭフラグメントは、下肢芽レベルから筋形成プログラムが最初に活性化される体節領域にまで及んだ。このマイクロアレイシリーズに基づいて、本発明者らは、下肢芽（エピブラスト）から未分節中胚葉
及び体節段階への細胞の進行性の成熟段階を規定するサイン遺伝子セットを特定することができた。並行して、本発明者らは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３及びＤＭＳＯ（ＲＤ）の存在下でＥＳ細胞を分化し、Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋細胞集団を選別して、この集団の分化３日目及び４日目のマイクロアレイをそれぞれ作製した。全体的なトランスクリプトーム及びサイン遺伝子セットを、ｉｎ  ｖｉｖｏＰＳＭ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋細胞間で比較した（データは非図示）。
【０１８２】
本発明者らは、Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋細胞が、Ｍｓｇｎ１及びＴｂｘ６等のＱ−ＰＣＲによって既に検証されている多数の主要な沿軸中胚葉マーカーを発現することを確認している（図３Ｂ）。本発明者らは、本来のＰＭＳ細胞とは対照的に、Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋集団は、より腹側／外側中胚葉誘導体のサインである心臓マーカー及び血管新生マーカーも活性化することに気付いた。また、本発明者らは、ＴＧＦβ／ＢＭＰシグナル伝達は、Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋において上方制御される傾向にあることを見出した。予想外に、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＰＭＳでは非常に低いレベルでしかＢＭＰ４が検出されるに過ぎないのに対し、Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋細胞集団はＢＭＰ４を顕著なレベルで発現していることを見出した。これは、ＢＭＰ４が、側板運命を犠牲にして沿軸中胚葉運命を獲得する細胞を防止することが示されているため、問題であった（非特許文献２７、非特許文献２８）。
【０１８３】
ＢＭＰ４シグナル伝達を相殺するＮｏｇｇｉｎ
このＢＭＰ４活性を相殺するため、本発明者らは、ＢＭＰ４を阻害することが知られている組換えＮｏｇｇｉｎ（Ｎｏｇ）タンパク質の分化培地への添加の効果を試験した。本発明者らは、分化の０日目又は１日目からのＮｏｇｇｉｎの添加により、Ｎｏｇｇｉｎを含まない分化培地中で培養された細胞と比較して、Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋細胞は効果的にＢＭＰ４発現を抑制することを見出した。さらに、本発明者らは、Ｎｏｇｇｉｎを添加する最適な濃度及び最適なタイミングの両方を特定した。ＮｏｇｇｉｎはＭｓｇｎ１−ＹＦＰ＋人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の総数（産生効率）を変化せず、培養物中の総細胞数も変化しないが、むしろＭｓｇｎ１−ＹＦＰ＋の成熟（成熟効率）を変化する。Ｍｓｇｎ１−ＹＦＰ＋細胞に対するＮｏｇｇｉｎの影響をより詳しく特性評価するため、本発明者らは、分化の３日目と４日目にＭｓｇｎ１−ＹＦＰ＋人工沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）集団に対してマイクロアレイを実施した（図１１、条件ＲＤＮ及び条件ＲＤを比較）。
【０１８４】
本発明者らは、培地へのＮｏｇｇｉｎの添加がＭｓｇｎ１−ＹＦＰ＋細胞におけるＢＭＰ４発現を抑制し、Ｔｂｘ６、Ｐｃｄｈ８、Ｐａｘ３、Ｆｏｘｃ１、Ｒａｌｄｈ２及びＲｉｐｐｌｙ２を含む幾つかのＰＳＭ特異的マーカーの上方制御をもたらすことを示す（図１２Ｂ及びデータは非図示）。
【０１８５】
ＢＭＰ阻害剤及びＢＭＰシグナル伝達
本発明者らは、マウスＰＳＭマイクロアレイシリーズにおけるＢＭＰ阻害剤であるＦｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ（Ｆｓｔ）及びＣｅｒｂｅｒｕｓ（Ｃｅｒｌ）の強い上方制御を検出した。またＣｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、及びＧｒｅｍｌｉｎ１等の他のＢＭＰ阻害剤は、発生の間近接する組織によって発現されることが知られている（非特許文献２５；非特許文献２６及びScott IC et al, 2000）。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＰＳＭが適切に成熟するためにＢＭＰ阻害を必要とし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてもＢＭＰ阻害がｉＰＡＭ細胞の適切な成熟に必要であることを示唆している。
【０１８６】
本発明者らは、組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ（Ｎｏｇ）、Ｃｈｏｒｄｉｎ（Ｃｈｄ）、Ｃｈｏｒｄｉｎ様１（Ｃｈｄｌ１）、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ（Ｆｓｔ）、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ様１（Ｆｓｔｌ１）を含む一連のＢＭＰ阻害剤、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ１（Ｃｅ
ｒｂｅｒｕｓ）及びＧｒｅｍｌｉｎ１（Ｇｒｅｍ１）を含むＤａｎファミリータンパク質を、様々な濃度範囲（１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬ）、及び様々な時間枠（０日目〜４日目、１日目〜４日目）においてスクリーニングし、また、ＢＭＰ４及びＰＳＭマーカーであるＴｂｘ６の発現に対する影響を分析した。さらに、本発明者らは、様々な濃度（０．１μＭ〜１μＭ）及び様々な時間枠（０日目〜４日目、１日目〜４日目）においてＩ型ＢＭＰ受容体の特異的阻害剤である、化合物Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（化合物Ｃ）を試験した。ＢＭＰ阻害剤の添加は、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞の数又は培養物中の総細胞数に影響を与えない（データは非図示）。試験された一連の候補物質のうち、本発明者らは、特にＮｏｇｇｉｎ（Ｎｏｇ）、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ（Ｆｓｔ）及びＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎが、ＢＭＰ４を相殺し、Ｍｓｇｎ１発現及びＴｂｘ６発現を活性化することによって人工沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）成熟を促進することを同定した（データは非図示）。
【０１８７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したＭｓｇｎ１ＲｅｐＶ細胞のＰＳＭアイデンティティーを観測するため、本発明者らは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３及びＮｏｇｇｉｎの存在下での分化３日後及び４日後の両方においてＦＡＣＳによってそれらを精製した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、選別された集団は、ＰＳＭ細胞に対して予測されたように、Ｍｓｇｎ１及びＴｂｘ６を強く発現することが確認された（図３Ｂ）。より系統的な分析のため、遺伝子サインを上述の両方の時間点に対して作製した。３日目の分化ＥＳ遺伝子サインとＰＳＭ転写領域のそれを比較すると、分化ＥＳ細胞はＴ、Ｒｓｐｏ３及びＦｇｆ８を含む多数のＰＳＭ前方部の遺伝子を発現することが明らかとなった（図１２Ａ及びＢ）。それにより、Ｍｓｇｎ１レポーターを発現する細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの対応物に近い分子類似性を有している。
【０１８８】
その後、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて成熟過程を更に遂行できるかどうかを問うた。印象的なことは、３日目ではなく４日目の分化ＥＳ細胞により、Ｍｅｓｐ２、Ｒｉｐｐｌｙ２又はＦｏｘｃ１等のＰＳＭ前方部に特異的な遺伝子を活性化することが見出され、これらの細胞が、ＰＳＭ前方部のアイデンティティーを獲得したことを示している（図１２Ｂ）。特に、これらの４日目の細胞は、Ｐａｘ３遺伝子を顕著に上方制御した。Ｐａｘ３は、筋形成系統の分化を調節し、近年、ＥＳ細胞におけるＰａｘ３の過剰発現は筋肉を誘導することが示された（Darabi, R et al, 2008）。これにより、Ｒ−ｓｐｏ
ｎｄｉｎ３及びＮｏｇｇｉｎ処理によって、遺伝子操作を行うことなく、徐々に未分化ＥＳ細胞を真のＰａｘ３陽性筋前駆体に形質転換し得ることが示唆された。
【０１８９】
結論として、これらの結果は、人工沿軸中胚葉前駆（ｉＰＡＭ）細胞を取得するため、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３のようなＷｎｔシグナル伝達経路の活性化剤と、Ｎｏｇｇｉｎのような骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤との使用可能性及び相乗効果を立証している。
【０１９０】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｖｏにおける筋形成系統の作製
これらの前駆体の最終分化を更に制御するため、本発明者らは、次に、ｉｎ  ｖｉｖｏアプローチを採用した。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３及びＮｏｇｇｉｎを含有する培地での分化４日後に得られたＰａｘ３陽性細胞を、ＧＦＰ発現レンチウイルスにより形質導入し、恒久的に標識した。その後、蛇毒心臓毒の筋肉内投与によって損傷された免疫無防備状態のＲａｇ２−／−：γｃ−／−成体マウス（Gayraud-Morel B. et al., 2012）の前脛骨筋
にそれらを注入した。１ヶ月後の移植された筋肉の検査より、移植ＧＦＰ発現細胞は、ラミニン及びジストロフィンを発現する筋線維により満たされた広い面積を再構成したことが示された（ｎ＝３；図１３Ａ）。分化マーカーであるミオゲニンを高レベルで発現した線維は、直径が小さく、成体の筋肉のようには整列されておらず、胚性一次線維（embryonic primary fibers）に対応している可能性があることを示唆している（図１３Ｂ）（Ga
yraud-Morel B. et al., 2009）。これは、上記線維がミオシン重鎖の胚性アイソフォー
ム及び周産期アイソフォーム発現することを示すことにより確認された（図１３Ｃ）。注目すべきことは、筋衛星細胞特異的マーカーであるＰａｘ７を発現する重要な細胞集団が、生着した再生領域において観察され、これは分化ＥＳ細胞が筋細胞の前駆体プール（progenitor pool）を産生することもできることを示唆している（図１３Ｂ）。このように
して、損傷した筋肉にｉｎ  ｖｉｖｏで移植された場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られたＰａｘ３陽性細胞は筋形成系統へのそれらの分化を継続することができる。
【０１９１】
参照文献：
本出願全体に亘り、様々な参照文献により本発明が属する現行の技術水準が記載される。これらの参照文献の開示は、引用することにより本開示の一部をなすものとする。
【表３】
2019004903.tif 000005
2019004903.tif 000006
2019004903.tif 000007
2019004903.tif 000008
2019004903.tif 000009
2019004903.tif 000010
【図１】
2019004903.tif 000011
【図２】
2019004903.tif 000012
【図３】
2019004903.tif 000013
【図４Ａ】
2019004903.tif 000014
【図４Ｂ】
2019004903.tif 000015
【図４Ｃ】
2019004903.tif 000016
【図５】
2019004903.tif 000017
【図６】
2019004903.tif 000018
【図７Ａ】
2019004903.tif 000019
【図７Ｂ】
2019004903.tif 000020
【図８】
2019004903.tif 000021
【図９Ａ】
2019004903.tif 000022
【図９Ｂ】
2019004903.tif 000023
【図１０Ａ】
2019004903.tif 000024
【図１０Ｂ】
2019004903.tif 000025
【図１０Ｃ】
2019004903.tif 000026
【図１０Ｄ】
2019004903.tif 000027
【図１１】
2019004903.tif 000028
【図１２】
2019004903.tif 000029
【図１３Ａ】
2019004903.tif 000030
【図１３Ｂ】
2019004903.tif 000031
【図１３Ｃ】
2019004903.tif 000032
【配列表】
2019004903000001.app
【外国語明細書】
2019004903000001.pdf
2019004903000002.pdf
2019004903000003.pdf
2019004903000004.pdf