(57)【要約】【課題】ＷＮＴ組成物および精製方法の提供。【解決手段】ここでは、骨欠損部位における使用のための骨移植片材料を作製するための方法、プロセス、組成物、およびキットであって、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチド、リポソームＷｎｔ５ａポリペプチド、またはリポソームＷｎｔ１０ｂポリペプチドなどのリポソームＷｎｔポリペプチドを含有する組成物を利用する、方法、プロセス、組成物、およびキットが開示される。ここではまた、哺乳動物骨髄細胞を増強するための方法、プロセス、組成物、およびキットであって、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチド、リポソームＷｎｔ５ａポリペプチド、またはリポソームＷｎｔ１０ｂポリペプチドなどのリポソームＷｎｔポリペプチドを含有する組成物を利用する、方法、プロセス、組成物、およびキットも開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
Ｗｎｔタンパク質は、高度に保存された分泌型シグナル伝達分子であって、Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよび低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）によりコードされる細胞表面受容体に結合するシグナル伝達分子のファミリーを形成する。ＷＮＴ遺伝子ファミリーは、分泌型シグナル伝達タンパク質をコードする、構造的に類縁の遺伝子からなる。これらのタンパク質は、腫瘍形成、ならびに細胞運命の調節および胚発生時のパターン形成を含む、複数の発生過程に関与している。結合すると、リガンドは、細胞内イベントのカスケードであって、β−カテニンおよびＤＮＡ結合性タンパク質であるＴＣＦの核内活性を介して、標的遺伝子の転写を最終的にもたらす、カスケードを誘発する（CleversH、２００４年、Wnt signaling: Ig-norrin the dogma、Curr Biol、１４巻：Ｒ４３６〜Ｒ４３７頁；Nelson&Nusse、２００４年、Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways、Science、３０３巻：１４８３〜１４８７頁；Gordon& Nusse、２００
６年、Wnt signaling:Multiple pathways, multiple receptors, and multipletranscription factors、J Biol Chem、２８１巻：２２４２９〜２２４３３頁）。
Ｗｎｔタンパク質はまた、骨発生のプログラムと関連した、多種多様な細胞決定にも関与している。例えば、Ｗｎｔタンパク質は、間葉系前駆細胞の、骨格形成運命へのコミットメントに影響を及ぼす、ｓｏｘ９の発現レベルを調節する。Ｗｎｔタンパク質は、細胞の、骨芽細胞または軟骨細胞への分化に影響を及ぼす。成体動物では、Ｗｎｔシグナル伝達が、骨量を調節するという証拠が見られる。例えば、ヒトＷｎｔの共受容体であるＬＲＰ５内の突然変異は、Ｉ型骨粗鬆症、および骨内膜性骨化過剰症または常染色体優性骨硬化症を含む、複数の高骨量症候群のほか、低骨量疾患である、骨粗鬆症−偽性神経膠腫にも関連する。Ｗｎｔ阻害剤であるＤｋｋｌの産生の増大は、その顕著な特徴のうちの１つとして、骨吸収を増大させる疾患である、多発性骨髄腫と関連する。さらなる詳細については、S.Minearら、Wnt proteins promote bone regeneration、Sci. Transl. Med.、２巻、２９〜３０頁（２０１０年）；およびZhaoら、Controllingthe in vivo activity of Wnt liposomes、Methods Enzymol、４６５巻：３３１〜４７頁（２００９年）を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００２】
【非特許文献１】Clevers H、２００４年、Wnt signaling:Ig-norrin the dogma、Curr Biol、１４巻：Ｒ４３６〜Ｒ４３７頁
【非特許文献２】Nelson & Nusse、２００４年、Convergence of Wnt, beta-catenin, andcadherin pathways、Science、３０３巻：１４８３〜１４８７頁
【非特許文献３】Gordon & Nusse、２００６年、Wnt signaling:Multiple pathways,multiple receptors, and multiple transcription factors、J Biol Chem、２８１巻：２２４２９〜２２４３３頁
【非特許文献４】S. Minearら、Wnt proteins promote bone regeneration、Sci. Transl. Med.、２巻、２９〜３０頁（２０１０年）
【非特許文献５】Zhaoら、Controlling the in vivo activity ofWnt liposomes、MethodsEnzymol、４６５巻：３３１〜４７頁（２００９年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の概要
本明細書では、特定の実施形態では、機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であって、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む、組成物が開示される。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、リポソーム膜に取り込まれている（integrated）。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、リポソーム膜から脂質膜の外表面に突出する。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、前記リポソームの水性コアに組み込まれていない（isnot incorporated）。一部の実施形態では、前記機能
的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドの濃度が、約５μｇ／μＬ〜約１５μｇ／μＬ、または約８μｇ／μＬ〜約１２μｇ／μＬの間である。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃、約１５℃〜約２５℃、または約２０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームが、ｐＨ約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、または約７．２〜約７．６の間で正味の電荷０を有する。一部の実施形態では、リン脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。一部の実施形態では、前記リポソームが、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＭＰＣおよびコレステロールの濃度が、約７０：３０〜約１００：０の間の比により規定される。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、哺乳動物Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記哺乳動物が、ヒトである。一部の実施形態では、前記脂質修飾が、パルミトイル化である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、さらにグリコシル化されている。一部の実施形態では、前記組成物が、安定な組成物である。一部の実施形態では、前記組成物が、活性の実質的な喪失を伴わずに、最長約１０６日間安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、約１℃〜約８℃の間の温度で安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、窒素下で安定である。
【０００４】
本明細書では、特定の実施形態では、機能的に活性な哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であって、前記リポソームを構成するリン脂質が約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する組成物が開示される。本明細書ではまた、特定の実施形態では、機能的に活性な哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であって、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが炭素約１２個〜炭素約１４個の間である組成物が開示される。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、リポソーム膜に取り込まれている（integrate）。一部の実施形態で
は、前記Ｗｎｔポリペプチドが、リポソーム膜から脂質膜の外表面に突出する。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、前記リポソームの水性コアに組み込まれていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドの濃度が、約５μｇ／μＬ〜約１５μｇ／μＬ、または約８μｇ／μＬ〜約１２μｇ／μＬの間である。一部の実施形態では、前記リポソームがｐＨ約６．５〜約８．０の間で正味の電荷０を有する。一部の実施形態では、前記リポソームがｐＨ約６．５〜約８．０の間で正味の正電荷または正味の負電荷を有する。一部の実施形態では、前記リン脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。一部の実施形態では、前記リポソームが、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＭＰＣおよびコレステロールの濃度が、約７０：３０〜約１００：０の間の比により規定される。一部の実施形態では、前記哺乳動物が、ヒトである。一部の実施形態では、脂質修飾が、パルミトイル化である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、さらにグリコシル化されている。一部の実施形態では、前記組成物が、安定な組成物である。一部の実施形態では、前記組成物が、活性の実質的な喪失を伴わずに、最長約１０６日間安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、約１℃〜約８℃の間の温度で安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、窒素下で安定である。
【０００５】
本明細書では、特定の実施形態では、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、哺乳動物細胞を含む馴化培地から採取するステップと；（ｂ）前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したイオン交換カラムに導入するステップと；（ｃ）段階勾配（stepgradient）を
利用して、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドを前記イオン交換カラムから溶出させるステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）からの前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドをリポソームの水溶液と接触させるステップとを含む方法が開示される。一部の実施形態では、前記接触させるステップを、約２１℃〜約２５℃の間の温度で行う。一部の実施形態では、接触させる時間が、約３０分間〜約２４時間の間である。一部の実施形態では、前記段階勾配が、第１の勾配および第２の勾配を含む。一部の実施形態では、前記第１の勾配が、５０ｍＭの塩化カリウムを含む緩衝溶液を含み、前記第２の勾配が、約１５０ｍＭの塩化カリウム〜約１．５Ｍの間の塩化カリウムを含む緩衝溶液を含む。一部の実施形態では、前記緩衝溶液が、界面活性剤（detergent）をさらに含む。一部の実施形態では、前記界面活性剤が、ＣＨ
ＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。一部の実施形態では、前記馴化培地が、最大１０％のウシ胎仔血清を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の後の前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドの収率が、約６０％〜約９０％の間である。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃、約１５℃〜約２５℃、または約２０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームが、ｐＨ約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、または約７．２〜約７．６の間で正味の電荷０を有する。一部の実施形態では、リン脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。一部の実施形態では、前記リポソームが、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＭＰＣおよびコレステロールの濃度が、約７０：３０〜約１００：０の間の比により規定される。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、哺乳動物Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記哺乳動物が、ヒトである。一部の実施形態では、前記馴化培地が、血清または血清代替物を含む。一部の実施形態では、前記馴化培地が、血清を含む。一部の実施形態では、前記血清が、ウシ胎仔血清である。一部の実施形態では、血清濃度が、前記馴化培地中に約０．１％〜約１５％の間である。一部の実施形態では、前記馴化培地が、血清代替物を含む。一部の実施形態では、前記血清代替物が、脂質ベースの代替物である。一部の実施形態では、前記馴化培地が、無血清培地である。一部の実施形態では、脂質修飾が、パルミトイル化である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、さらにグリコシル化されている。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａ生成物を試料混合物から遠心分離により分離する。一部の実施形態では、前記遠心分離の時間が、約１℃〜約８℃の間の温度で最長１時間である。一部の実施形態では、遠心分離後のＷｎｔ３ａ生成物を、無菌１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させる。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａ生成物が、窒素下で安定である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａ生成物が、約１℃〜約８℃の間の温度で安定である。
【０００６】
本明細書では、特定の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドを調製する方法であって、Ｗｎｔポリペプチドを含む試料をリポソームの水溶液に接触させるステップを含み、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する方法が開示される。また本明細書では、特定の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドを調製する方法であって、Ｗｎｔポリペプチドを含む試料をリポソームの水溶液に接触させるステップを含み、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である方法が開示される。一部の実施形態では、前記接触させるステップを、約２１℃〜約２５℃の間の温度で行う。一部の実施形態では、接触させる時間が、約６時間〜約２４時間の間である。一部の実施形態では、前記方法は、前記Ｗｎｔポリペプチドをリポソームの水溶液に接触させるステップの前に、さらなる精製ステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記さらなる精製ステップが、イオン交換精製ステップ、疎水性精製ステップ、またはアフィニティー精製ステップである。一部の実施形態では、前記さらなる精製ステップが、イオン交換精製ステップである。一部の実施形態では、前記イオン交換精製ステップが、前記試料を、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したビーズまたはスルホン化多環芳香族化合物を固定化したカラムと接触させることを含む。一部の実施形態では、前記イオン交換精製ステップが、段階勾配を含む。一部の実施形態では、イオン交換精製緩衝液が、界面活性剤を含む。一部の実施形態では、前記界面活性剤が、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。一部の実施形態では、前記さらなる精製ステップが、疎水性精製ステップである。一部の実施形態では、前記疎水性精製ステップが、プロテインＡを固定化したビーズまたはプロテインＡカラムを含む。一部の実施形態では、前記さらなる精製ステップの後の前記Ｗｎｔポリペプチドの収率が、約６０％〜約９９％の間である。一部の実施形態では、前記方法は、Ｗｎｔポリペプチドを、発現細胞系に由来する細胞を含む馴化培地から採取するステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記発現細胞系が、哺乳動物発現細胞系である。一部の実施形態では、前記哺乳動物発現細胞系が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。一部の実施形態では、前記馴化培地が、血清または血清代替物を含む。一部の実施形態では、前記血清が、ウシ胎仔血清である。一部の実施形態では、血清濃度が、前記馴化培地中に約０．１％〜約１５％の間である。一部の実施形態では、前記馴化培地が、血清代替物を含む。一部の実施形態では、前記血清代替物が、脂質ベースの代替物である。一部の実施形態では、前記馴化培地が、無血清培地である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配���を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、前記リポソームが、ｐＨ約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、または約７．２〜約７．６の間で正味の電荷０を有する。一部の実施形態では、リン脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。一部の実施形態では、前記リポソームが、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＭＰＣおよびコレステロールの濃度が、約７０：３０〜約１００：０の間の比により規定される。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドである。一部の実施形態では、前記哺乳動物が、ヒトである。一部の実施形態では、脂質修飾が、パルミトイル化である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、さらにグリコシル化されている。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａ生成物を試料混合物から遠心分離により分離する。一部の実施形態では、前記遠心分離の時間が、約１℃〜約８℃の間の温度で最長１時間である。一部の実施形態では、遠心分離後のＷｎｔ生成物を、無菌１×ＰＢＳ中に再懸濁させる。一部の実施形態では、Ｗｎｔ生成物が、窒素下で安定である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａ生成物が、約１℃〜約８℃の間の温度で安定である。
【０００７】
本明細書では、特定の実施形態では、単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記細胞は、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の増強された発現レベルを有する組成物が開示される。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記齧歯動物骨髄細胞が、１０カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記ヒト骨髄細胞が、３５歳またはこれより老齢の被験体から得られる。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。一部の実施形態では、前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される。一部の実施形態では、前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約２％〜約２０％または約４％〜約１０％の間である。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルを、さらに有する。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される。一部の実施形態では、前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む。一部の実施形態では、アポトーシスレベルの前記低下が、約５０％である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む。一部の実施形態では、前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む。一部の実施形態では、前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される。一部の実施形態では、移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記自���骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、３５歳より若齢のヒト被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する。一部の実施形態では、前記リポソームＷｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。
【０００８】
本明細書では、特定の実施形態では、３５歳またはこれより老齢のヒト被験体から得られた哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、増強された発現レベルで、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数を発現する組成物が開示される。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。一部の実施形態では、前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される。一部の実施形態では、前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約２％〜約２０％または約４％〜約１０％の間である。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルを、さらに有する。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される。一部の実施形態では、前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む。一部の実施形態では、アポトーシスレベルの前記低下が、約５０％である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む。一部の実施形態では、前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む。一部の実施形態では、前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される。一部の実施形態では、移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では���前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、３５歳より若齢のヒト被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する。一部の実施形態では、前記リポソームＷｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。
【０００９】
本明細書では、特定の実施形態では、哺乳動物骨髄組成物であって、単離哺乳動物骨髄細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔポリペプチドと接触させるステップを含むプロセスによって作製され、ここで、接触させる時間が約３０分間〜約４時間の間である、哺乳動物骨髄組成物が開示される。一部の実施形態では、接触させる温度が、約０℃〜約３７℃、または約２０℃〜約２５℃の間である。一部の実施形態では、前記プロセスが、接触させるステップの後で、遊離リポソームＷｎｔポリペプチドを除去する洗浄ステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記プロセスが、前記リポソームＷｎｔポリペプチドを骨欠損部位に移植するステップをさらに含む。一部の実施形態では、前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の増強された発現レベルを有する。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。一部の実施形態では、前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約２％〜約２０％または約４％〜約１０％の間である。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルを、さらに有する。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される。一部の実施形態では、前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む。一部の実施形態では、アポトーシスレベルの前記低下が、約５０％である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む。一部の実施形態では、前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む。一部の実施形態では、前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される。一部の実施形態では、移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、大腿骨、脛骨、および／または腸骨稜から採取される。一部の実施形態では、前記��家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記単離哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記齧歯動物骨髄細胞が、１０カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記ヒト骨髄細胞が、３５歳またはこれより老齢の被験体から採取される。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、３５歳より若齢の被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する。一部の実施形態では、前記リポソームＷｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。
【００１０】
本明細書では、特定の実施形態では、被験体における骨欠損を処置する方法であって、（ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドと接触させるステップと；ｂ）前記試料を洗浄して、遊離リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドを除去するステップと；ｃ）前記リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップとを含む方法が開示される。一部の実施形態では、接触させる温度が、約０℃〜約３７℃、または約２０℃〜約２５℃の間である。一部の実施形態では、接触させる時間が、約３０分間〜約４時間の間である。一部の実施形態では、前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の増強された発現レベルを有する。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。一部の実施形態では、前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約２％〜約２０％または約４％〜約１０％の間である。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルをさらに有する。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される。一部の実施形態では、前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む。一部の実施形態では、アポトーシスレベルの前記低下が、約５０％である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む。一部の実施形態では、前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む。一部の実施形態では、前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される。一部の実施形態では、移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、大腿骨、脛骨、および／または腸骨稜から採取される。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含��。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記単離哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記齧歯動物骨髄細胞が、１０カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記ヒト骨髄細胞が、３５歳またはこれより老齢の被験体から採取される。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、３５歳より若齢の被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する。一部の実施形態では、前記リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。
【００１１】
本明細書では、特定の実施形態では、被験体における骨欠損を処置する方法であって、（ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔポリペプチドと接触させるステップと；（ｂ）前記試料を洗浄して、遊離リポソームＷｎｔポリペプチドを除去するステップと；（ｃ）前記リポソームＷｎｔポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップとを含む方法が開示される。一部の実施形態では、接触させる温度が、約０℃〜約３７℃、または約２０℃〜約２５℃の間である。一部の実施形態では、接触させる時間が、約３０分間〜約４時間の間である。一部の実施形態では、前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の増強された発現レベルを有する。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。一部の実施形態では、前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約２％〜約２０％または約４％〜約１０％の間である。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルを、さらに有する。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される。一部の実施形態では、前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む。一部の実施形態では、アポトーシスレベルの前記低下が、約５０％である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む。一部の実施形態では、前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む。一部の実施形態では、前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される。一部の実施形態では、移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、大腿骨、脛骨、および／または腸骨稜から採取される。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の��施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記単離哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記齧歯動物骨髄細胞が、１０カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記ヒト骨髄細胞が、３５歳またはこれより老齢の被験体から採取される。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、３５歳より若齢の被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する。一部の実施形態では、前記リポソームＷｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。
【００１２】
本明細書では、特定の実施形態では、前記リポソームＷｎｔポリペプチドを含む骨移植片材料を作製するためのキットが開示される。一部の実施形態では、前記リポソームＷｎｔポリペプチドは、機能的に活性な哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であり、ここで、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームＷｎｔポリペプチドは、機能的に活性な哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であり、ここで、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、リポソーム膜に取り込まれている。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、リポソーム膜から脂質膜の外表面に突出する。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、前記リポソームの水性コアに組み込まれていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドの濃度が、約５μｇ／μＬ〜約１５μｇ／μＬ、または約８μｇ／μＬ〜約１２μｇ／μＬの間である。一部の実施形態では、前記リポソームがｐＨ約６．５〜約８．０の間で正味の電荷０を有する。一部の実施形態では、前記リポソームがｐＨ約６．５〜約８．０の間で正味の正電荷または正味の負電荷を有する。一部の実施形態では、リン脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。一部の実施形態では、前記リポソームが、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＭＰＣおよびコレステロールの濃度が、約７０：３０〜約１００：０の間の比により規定される。一部の実施形態では、前記哺乳動物が、ヒトである。一部の実施形態では、脂質修飾が、パルミトイル化である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、さらにグリコシル化されている。一部の実施形態では、前記組成物が、安定な組成物である。一部の実施形態では、前記組成物が、活性の実質的な喪失を伴わずに、最長約１０６日間安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、約１℃〜約８℃の間の温度で安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、窒素下で安定である。
【００１３】
本明細書では、特定の実施形態では、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドを含む骨移植片材料を作製するためのキットが開示される。一部の実施形態では、前記リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドは、機能的に活性な哺乳動物Ｗｎｔ３ａポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であり、ここで、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、リポソーム膜に取り込まれている。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、リポソーム膜から脂質膜の外表面に突出する。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、前記リポソームの水性コアに組み込まれていない。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドの濃度が、約５μｇ／μＬ〜約１５μｇ／μＬ、または約８μｇ／μＬ〜約１２μｇ／μＬの間である。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃、約１５℃〜約２５℃、または約２０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームが、ｐＨ約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、または約７．２〜約７．６の間で正味の電荷０を有する。一部の実施形態では、リン脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である。一部の実施形態では、前記リポソームが、コレステロールをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＭＰＣおよびコレステロールの濃度が、約７０：３０〜約１００：０の間の比により規定される。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、哺乳動物Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記哺乳動物が、ヒトである。一部の実施形態では、脂質修飾が、パルミトイル化である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、さらにグリコシル化されている。一部の実施形態では、前記組成物が、安定な組成物である。一部の実施形態では、前記組成物が、活性の実質的な喪失を伴わずに、最長約１０６日間安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、約１℃〜約８℃の間の温度で安定である。一部の実施形態では、前記組成物が、窒素下で安定である。
【００１４】
本明細書では、特定の実施形態では、単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物を含む骨移植片材料を作製するためのキットが開示される。一部の実施形態では、前記単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物は、３５歳またはこれより老齢のヒト被験体から得られた哺乳動物骨髄細胞の組成物であり、ここで、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、増強された発現レベルで、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数を発現する。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。一部の実施形態では、前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される。一部の実施形態では、前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約２％〜約２０％または約４％〜約１０％の間である。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルを、さらに有する。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される。一部の実施形態では、前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む。一部の実施形態では、アポトーシスレベルの前記低下が、約５０％である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む。一部の実施形態では、前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む。一部の実施形態では、前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される。一部の実施形態では、移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、前記哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である。一部の実施形���では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む。一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、３５歳より若齢のヒト被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する。一部の実施形態では、前記リポソームＷｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない。一部の実施形態では、前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であって、前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む、組成物。
（項目２）
前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目１に記載の安定な組成物。
（項目３）
前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、リポソーム膜に取り込まれている、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、リポソーム膜から脂質膜の外表面に突出する、項目１から３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、前記リポソームの水性コアに組み込まれていない、項目１から４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドの濃度が、約５μｇ／μＬ〜約１５μｇ／μＬ、または約８μｇ／μＬ〜約１２μｇ／μＬの間である、項目１から７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である、項目１から８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃、約１５℃〜約２５℃、または約２０℃〜約２５℃の相転移温度を有する、項目１から９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
前記リポソームが、ｐＨ約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、または約７．２〜約７．６の間で正味の電荷０を有する、項目１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
リン脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である、項目１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
前記リポソームが、コレステロールをさらに含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４）
ＤＭＰＣおよびコレステロールの濃度が、約７０：３０〜約１００：０の間の比により規定される、項目１２または１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、哺乳動物Ｗｎｔ３ａポリペプチドである、項目１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
前記脂質修飾が、パルミトイル化である、項目１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、さらにグリコシル化されている、項目１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
安定な組成物である、項目１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
活性の実質的な喪失を伴わずに、最長約１０６日間安定である、項目１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２１）
約１℃〜約８℃の間の温度で安定である、項目１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２２）
窒素下で安定である、項目１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３）
機能的に活性な哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であって、前記リポソームを構成するリン脂質が約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する組成物。
（項目２４）
機能的に活性な哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含む組成物であって、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが炭素約１２個〜炭素約１４個の間である組成物。
（項目２５）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、リポソーム膜に取り込まれている、項目２３または２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、リポソーム膜から脂質膜の外表面に突出する、項目２３から２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２７）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、前記リポソームの水性コアに組み込まれていない、項目２３から２６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２８）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである、項目２３から２７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２９）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３１）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目２８から３０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである、項目２３から２７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３）
前記Ｗｎｔポリペプチドの濃度が、約５μｇ／μＬ〜約１５μｇ／μＬ、または約８μｇ／μＬ〜約１２μｇ／μＬの間である、項目２３から３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３４）
前記リポソームがｐＨ約６．５〜約８．０の間で正味の電荷０を有する、項目２３から３３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５）
前記リポソームがｐＨ約６．５〜約８．０の間で正味の正電荷または正味の負電荷を有する、項目２３から３４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
前記リン脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である、項目２３から３４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３７）
前記リポソームが、コレステロールをさらに含む、項目２３から３６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３８）
ＤＭＰＣおよびコレステロールの濃度が、約７０：３０〜約１００：０の間の比により規定される、項目３６または３７に記載の組成物。
（項目３９）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目２３から３８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４０）
脂質修飾が、パルミトイル化である、項目２３から３９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４１）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、さらにグリコシル化されている、項目２３から４０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４２）
安定な組成物である、項目２３から４１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４３）
活性の実質的な喪失を伴わずに、最長約１０６日間安定である、項目２３から４２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４４）
約１℃〜約８℃の間の温度で安定である、項目２３から４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４５）
窒素下で安定である、項目２３から４４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４６）
リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドを調製する方法であって、
ａ）Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、哺乳動物細胞を含む馴化培地から採取するステップと；
ｂ）前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したイオン交換カラムに導入するステップと；
ｃ）段階勾配を利用して、前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドを前記イオン交換カラムから溶出させるステップと；
ｄ）ステップ（ｃ）からの前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドをリポソームの水溶液と接触させるステップと
を含む方法。
（項目４７）
前記接触させるステップを、約２１℃〜約２５℃の間の温度で行う、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
接触させる時間が、約３０分間〜約２４時間の間である、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記段階勾配が、第１の勾配および第２の勾配を含む、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記第１の勾配が、５０ｍＭの塩化カリウムを含む緩衝溶液を含み、前記第２の勾配が、約１５０ｍＭの塩化カリウム〜約１．５Ｍの間の塩化カリウムを含む緩衝溶液を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記緩衝溶液が、界面活性剤をさらに含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記界面活性剤が、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記馴化培地が、最大１０％のウシ胎仔血清を含む、項目４６に記載の方法。
（項目５４）
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、項目４６に記載の方法。
（項目５５）
ステップ（ｃ）の後の前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドの収率が、約６０％〜約９０％の間である、項目４６に記載の方法。
（項目５６）
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である、項目４６に記載の方法。
（項目５７）
前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃、約１５℃〜約２５℃、または約２０℃〜約２５℃の相転移温度を有する、項目４６または５６に記載の方法。
（項目５８）
前記リポソームが、ｐＨ約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、または約７．２〜約７．６の間で正味の電荷０を有する、項目４６、５６または５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
リン脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である、項目４６または５６から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記リポソームが、コレステロールをさらに含む、項目４６または５６から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
ＤＭＰＣおよびコレステロールの濃度が、約７０：３０〜約１００：０の間の比により規定される、項目５９または６０に記載の方法。
（項目６２）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む、項目４６に記載の方法。
（項目６３）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目４６に記載の方法。
（項目６４）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目４６、６２、または６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、哺乳動物Ｗｎｔ３ａポリペプチドである、項目４６、または６２から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記馴化培地が、血清または血清代替物を含む、項目４６に記載の方法。
（項目６８）
前記馴化培地が、血清を含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記血清が、ウシ胎仔血清である、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
血清濃度が、前記馴化培地中に約０．１％〜約１５％の間である、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記馴化培地が、血清代替物を含む、項目６７に記載の方法。
（項目７２）
前記血清代替物が、脂質ベースの代替物である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記馴化培地が、無血清培地である、項目４６に記載の方法。
（項目７４）
脂質修飾が、パルミトイル化である、項目４６から６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、さらにグリコシル化されている、項目４６から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
Ｗｎｔ３ａ生成物を試料混合物から遠心分離により分離する、項目４６から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記遠心分離の時間が、約１℃〜約８℃の間の温度で最長１時間である、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
遠心分離後のＷｎｔ３ａ生成物を、無菌１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させる、項目４６から７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
Ｗｎｔ３ａ生成物が、窒素下で安定である、項目４６から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
Ｗｎｔ３ａ生成物が、約１℃〜約８℃の間の温度で安定である、項目４６から７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
リポソームＷｎｔポリペプチドを調製する方法であって、Ｗｎｔポリペプチドを含む試料をリポソームの水溶液に接触させるステップを含み、前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する方法。
（項目８２）
リポソームＷｎｔポリペプチドを調製する方法であって、Ｗｎｔポリペプチドを含む試料をリポソームの水溶液に接触させるステップを含み、前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である方法。
（項目８３）
前記接触させるステップを、約２１℃〜約２５℃の間の温度で行う、項目８１または８２に記載の方法。
（項目８４）
接触させる時間が、約６時間〜約２４時間の間である、項目８１または８２に記載の方法。
（項目８５）
前記Ｗｎｔポリペプチドをリポソームの水溶液に接触させるステップの前に、さらなる精製ステップをさらに含む、項目８１または８２に記載の方法。
（項目８６）
前記さらなる精製ステップが、イオン交換精製ステップ、疎水性精製ステップ、またはアフィニティー精製ステップである、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記さらなる精製ステップが、イオン交換精製ステップである、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記イオン交換精製ステップが、前記試料を、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したビーズまたはスルホン化多環芳香族化合物を固定化したカラムと接触させることを含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記イオン交換精製ステップが、段階勾配を含む、項目８７または８８に記載の方法。
（項目９０）
イオン交換精製緩衝液が、界面活性剤を含む、項目８７から８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記界面活性剤が、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記さらなる精製ステップが、疎水性精製ステップである、項目８６に記載の方法。
（項目９３）
前記疎水性精製ステップが、プロテインＡを固定化したビーズまたはプロテインＡカラムを含む、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記さらなる精製ステップの後の前記Ｗｎｔポリペプチドの収率が、約６０％〜約９９％の間である、項目８５から９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
Ｗｎｔポリペプチドを、発現細胞系に由来する細胞を含む馴化培地から採取するステップをさらに含む、項目８１から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記発現細胞系が、哺乳動物発現細胞系である、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記哺乳動物発現細胞系が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記馴化培地が、血清または血清代替物を含む、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記血清が、ウシ胎仔血清である、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
血清濃度が、前記馴化培地中に約０．１％〜約１５％の間である、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記馴化培地が、血清代替物を含む、項目９８に記載の方法。
（項目１０２）
前記血清代替物が、脂質ベースの代替物である、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記馴化培地が、無血清培地である、項目９７に記載の方法。
（項目１０４）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである、項目８１から９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０７）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目１０４から１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである、項目８１から１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記リポソームが、ｐＨ約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、または約７．２〜約７．６の間で正味の電荷０を有する、項目８１から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
リン脂質が、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）である、項目８１から１０９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
前記リポソームが、コレステロールをさらに含む、項目８１から１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
ＤＭＰＣおよびコレステロールの濃度が、約７０：３０〜約１００：０の間の比により規定される、項目１１０または１１１に記載の方法。
（項目１１３）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドである、項目８１から１１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
脂質修飾が、パルミトイル化である、項目８１から１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、さらにグリコシル化されている、項目８１から１１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
Ｗｎｔ  生成物を試料混合物から遠心分離により分離する、項目８１から１１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記遠心分離の時間が、約１℃〜約８℃の間の温度で最長１時間である、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
遠心分離後のＷｎｔ生成物を、無菌１×ＰＢＳ中に再懸濁させる、項目８１から１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
Ｗｎｔ生成物が、窒素下で安定である、項目８１から１１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
Ｗｎｔ生成物が、約１℃〜約８℃の間の温度で安定である、項目８１から１２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記細胞は、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の増強された発現レベルを有する組成物。
（項目１２３）
前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である、項目１２２に記載の組成物。
（項目１２４）
前記齧歯動物骨髄細胞が、１０カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される、項目１２３に記載の組成物。
（項目１２５）
前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である、項目１２２に記載の組成物。
（項目１２６）
前記ヒト骨髄細胞が、３５歳またはこれより老齢の被験体から得られる、項目１２５に記載の組成物。
（項目１２７）
３５歳またはこれより老齢のヒト被験体から得られた哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、増強された発現レベルで、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数を発現させる組成物。
（項目１２８）
前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される、項目１２２または１２７に記載の組成物。
（項目１２９）
前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される、項目１２２または１２７に記載の組成物。
（項目１３０）
前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される、項目１２２から１２９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３１）
前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約２％〜約２０％または約４％〜約１０％の間である、項目１３０に記載の組成物。
（項目１３２）
リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルを、さらに有する、項目１２２から１３１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３３）
前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される、項目１３２に記載の組成物。
（項目１３４）
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む、項目１２２から１３３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３５）
アポトーシスレベルの前記低下が、約５０％である、項目１３４に記載の組成物。
（項目１３６）
前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む、項目１２２から１３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３７）
前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む、項目１３６に記載の組成物。
（項目１３８）
前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される、項目１３７に記載の組成物。
（項目１３９）
移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である、項目１３７または１３８に記載の組成物。
（項目１４０）
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目１２２から１３９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４１）
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目１４０に記載の組成物。
（項目１４２）
前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目１４１に記載の組成物。
（項目１４３）
前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目１４１に記載の組成物。
（項目１４４）
前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である、項目１２２から１４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４５）
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目１４４に記載の組成物。
（項目１４６）
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目１４５に記載の組成物。
（項目１４７）
前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目１４６に記載の組成物。
（項目１４８）
前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目１４６に記載の組成物。
（項目１４９）
前記哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である、項目１２２から１４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５０）
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目１４９に記載の組成物。
（項目１５１）
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目１５０に記載の組成物。
（項目１５２）
前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目１５１に記載の組成物。
（項目１５３）
前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目１５１に記載の組成物。
（項目１５４）
リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、３５歳より若齢のヒト被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する、項目１２６または１２７に記載の組成物。
（項目１５５）
前記リポソームＷｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む、項目１２２から１５４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５６）
前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する、項目１５５に記載の組成物。
（項目１５７）
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である、項目１５５または１５６に記載の組成物。
（項目１５８）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである、項目１５５に記載の組成物。
（項目１５９）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む、項目１５８に記載の組成物。
（項目１６０）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目１５８に記載の組成物。
（項目１６１）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目１５８から１６０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６２）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである、項目１５５に記載の組成物。
（項目１６３）
哺乳動物骨髄組成物であって、単離哺乳動物骨髄細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔポリペプチドと接触させるステップを含むプロセスによって作製され、ここで、接触させる時間が約３０分間〜約４時間の間である、哺乳動物骨髄組成物。
（項目１６４）
接触させる温度が、約０℃〜約３７℃、または約２０℃〜約２５℃の間である、項目１６３に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１６５）
前記プロセスが、接触させるステップの後で、遊離リポソームＷｎｔポリペプチドを除去する洗浄ステップをさらに含む、項目１６３または１６４に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１６６）
前記プロセスが、前記リポソームＷｎｔポリペプチドを骨欠損部位に移植するステップをさらに含む、項目１６３から１６５のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１６７）
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の増強された発現レベルを有する、項目１６３から１６６のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１６８）
前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される、項目１６３から１６６のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１６９）
前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される、項目１６３から１６６のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１７０）
前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約２％〜約２０％または約４％〜約１０％の間である、項目１６７から１６９のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１７１）
リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルをさらに有する、項目１６３から１７０のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１７２）
前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される、項目１７１に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１７３）
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む、項目１６３から１７２のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１７４）
アポトーシスレベルの前記低下が、約５０％である、項目１７３に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１７５）
前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む、項目１６３から１７４のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１７６）
前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む、項目１７５に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１７７）
前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される、項目１７６に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１７８）
移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である、項目１７６または１７７に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１７９）
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目１６３から１７８のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１８０）
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目１７９に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１８１）
前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目１８０に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１８２）
前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目１８０に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１８３）
前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である、項目１６３から１８２のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１８４）
前記自家骨髄細胞が、大腿骨、脛骨、および／または腸骨稜から採取される、項目１８３に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１８５）
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目１８３または１８４に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１８６）
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目１８５に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１８７）
前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目１８６に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１８８）
前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目１８６に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１８９）
前記単離哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である、項目１６３から１８２のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１９０）
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目１８９に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１９１）
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目１９０に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１９２）
前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目１９１に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１９３）
前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目１９１に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１９４）
前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である、項目１６３から１９３のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１９５）
前記齧歯動物骨髄細胞が、１０カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される、項目１９４に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１９６）
前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である、項目１６３から１９３のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１９７）
前記ヒト骨髄細胞が、３５歳またはこれより老齢の被験体から採取される、項目１９６に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１９８）
リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、３５歳より若齢の被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する、項目１９６または１９７に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目１９９）
前記リポソームＷｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む、項目１６３から１９８のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目２００）
前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する、項目１９９に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目２０１）
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である、項目１９９または２００に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目２０２）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである、項目１９９に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目２０３）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む、項目２０２に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目２０４）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目２０２に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目２０５）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目２０２から２０４のいずれか一項に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目２０６）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである、項目１９９に記載の哺乳動物骨髄組成物。
（項目２０７）
被験体における骨欠損を処置する方法であって、
ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドと接触させるステップと；
ｂ）前記試料を洗浄して、遊離リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドを除去するステップと；
ｃ）前記リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップと
を含む方法。
（項目２０８）
接触させる温度が、約０℃〜約３７℃、または約２０℃〜約２５℃の間である、項目２０７に記載の方法。
（項目２０９）
接触させる時間が、約３０分間〜約４時間の間である、項目２０７に記載の方法。
（項目２１０）
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強されたＲｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の発現レベルを有する、項目２０７に記載の方法。
（項目２１１）
前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される、項目２０７に記載の方法。
（項目２１２）
前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される、項目２０７に記載の方法。
（項目２１３）
前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約２％〜約２０％または約４％〜約１０％の間である、項目２０７または２１０から２１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１４）
リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルをさらに有する、項目２０７または２１０から２１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１５）
前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される、項目２１４に記載の方法。
（項目２１６）
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む、項目２０７または２１０から２１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１７）
アポトーシスレベルの前記低下が、約５０％である、項目２１６に記載の方法。
（項目２１８）
前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む、項目２０７または２１０から２１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１９）
前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む、項目２１８に記載の方法。
（項目２２０）
前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される、項目２１９に記載の方法。
（項目２２１）
移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である、項目２１９または２２０に記載の方法。
（項目２２２）
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目２０７から２２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２３）
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目２２２に記載の方法。
（項目２２４）
前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目２２３に記載の方法。
（項目２２５）
前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目２２３に記載の方法。
（項目２２６）
前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である、項目２０７から２２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２７）
前記自家骨髄細胞が、大腿骨、脛骨、および／または腸骨稜から採取される、項目２２６に記載の方法。
（項目２２８）
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目２２６または２２７に記載の方法。
（項目２２９）
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目２２８に記載の方法。
（項目２３０）
前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目２２９に記載の方法。
（項目２３１）
前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目２２９に記載の方法。
（項目２３２）
前記単離哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である、項目２０７から２２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３３）
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目２３２に記載の方法。
（項目２３４）
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目２３３に記載の方法。
（項目２３５）
前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目２３４に記載の方法。
（項目２３６）
前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目２３４に記載の方法。
（項目２３７）
前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である、項目２０７から２３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３８）
前記齧歯動物骨髄細胞が、１０カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される、項目２３７に記載の方法。
（項目２３９）
前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である、項目２０７から２３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４０）
前記ヒト骨髄細胞が、３５歳またはこれより老齢の被験体から採取される、項目２３９に記載の方法。
（項目２４１）
リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、３５歳より若齢のヒト被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する、項目２３９または２４０に記載の方法。
（項目２４２）
前記リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む、項目２０７から２４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４３）
前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する、項目２４２に記載の方法。
（項目２４４）
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である、項目２４２または２４３に記載の方法。
（項目２４５）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む、項目２４２に記載の方法。
（項目２４６）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目２４２に記載の方法。
（項目２４７）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目２４２、２４５または２４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４８）
被験体における骨欠損を処置する方法であって、
ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔポリペプチドと接触させるステップと；
ｂ）前記試料を洗浄して、遊離リポソームＷｎｔポリペプチドを除去するステップと；
ｃ）前記リポソームＷｎｔポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップと
を含む方法。
（項目２４９）
接触させる温度が、約０℃〜約３７℃、または約２０℃〜約２５℃の間である、項目２４８に記載の方法。
（項目２５０）
接触させる時間が約３０分間〜約４時間の間である、項目２４８に記載の方法。
（項目２５１）
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の増強された発現レベルを有する、項目２４８に記載の方法。
（項目２５２）
前記バイオマーカーが、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される、項目２４８に記載の方法。
（項目２５３）
前記バイオマーカーが、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される、項目２４８に記載の方法。
（項目２５４）
前記増強された発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約２％〜約２０％または約４％〜約１０％の間である、項目２４８または２５１から２５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５５）
リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、前記哺乳動物骨髄細胞が、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの低下した発現レベルを、さらに有する、項目２４８または２５１から２５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５６）
前記哺乳動物骨髄細胞内の前記低下した発現レベルが、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較される、項目２５５に記載の方法。
（項目２５７）
前記骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む、項目２４８または２５１から２５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５８）
アポトーシスレベルの前記低下が、約５０％である、項目２５７に記載の方法。
（項目２５９）
前記哺乳動物骨髄細胞が、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して増強された骨形成潜在能を含む、項目２４８または２５１から２５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６０）
前記増強された骨形成潜在能が、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む、項目２５９に記載の方法。
（項目２６１）
前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較される、項目２６０に記載の方法。
（項目２６２）
移植された処置哺乳動物骨髄細胞の前記新たな骨成長レベルが、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である、項目２６０または２６１に記載の方法。
（項目２６３）
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目２４８から２６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６４）
前記哺乳動物骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目２６３に記載の方法。
（項目２６５）
前記付着骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目２６４に記載の方法。
（項目２６６）
前記付着骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目２６４に記載の方法。
（項目２６７）
前記哺乳動物骨髄細胞が、自家骨髄細胞である、項目２４８から２６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６８）
前記自家骨髄細胞が、大腿骨、脛骨、および／または腸骨稜から採取される、項目２６７に記載の方法。
（項目２６９）
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目２６７から２６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７０）
前記自家骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目２６９に記載の方法。
（項目２７１）
前記自家骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目２７０に記載の方法。
（項目２７２）
前記自家骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目２７０に記載の方法。
（項目２７３）
前記単離哺乳動物骨髄細胞が、同種骨髄細胞である、項目２４８から２６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７４）
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む、項目２７３に記載の方法。
（項目２７５）
前記同種骨髄細胞が、付着骨髄細胞である、項目２７４に記載の方法。
（項目２７６）
前記同種骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、項目２７５に記載の方法。
（項目２７７）
前記同種骨髄細胞が、骨髄間質細胞を含む、項目２７５に記載の方法。
（項目２７８）
前記哺乳動物骨髄細胞が、齧歯動物骨髄細胞である、項目２４８から２７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７９）
前記齧歯動物骨髄細胞が、１０カ月齢より老齢の齧歯動物から採取される、項目２７８に記載の方法。
（項目２８０）
前記哺乳動物骨髄細胞が、ヒト骨髄細胞である、項目２４８から２７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８１）
前記ヒト骨髄細胞が、３５歳またはこれより老齢の被験体から採取される、項目２８０に記載の方法。
（項目２８２）
リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置後の前記ヒト骨髄細胞が、３５歳より若齢の被験体において観察されるバイオマーカー発現レベルを呈示する、項目２８０または２８１に記載の方法。
（項目２８３）
前記リポソームＷｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームの水溶液とを含む、項目２４８から２８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８４）
前記リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する、項目２８３に記載の方法。
（項目２８５）
前記リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である、項目２８３または２８４に記載の方法。
（項目２８６）
前記ＷｎｔポリペプチドがＷｎｔ３ａポリペプチドである、項目２８３に記載の方法。
（項目２８７）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の配列同一性を含む、項目２８６に記載の方法。
（項目２８８）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目２８６に記載の方法。
（項目２８９）
前記Ｗｎｔ３ａポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されており、配列番号１に示されるアミノ酸残基７７に対応するアミノ酸位置において脂質修飾されていない、項目２８６から２８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９０）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである、項目２８３に記載の方法。
（項目２９１）
項目２３から４５に記載のリポソームＷｎｔポリペプチドを含む骨移植片材料を作製するためのキット。
（項目２９２）
項目１から２２に記載のリポソームＷｎｔ３ａポリペプチドを含む骨移植片材料を作製するためのキット。
（項目２９３）
項目１２７から１６２に記載の単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物を含む骨移植片材料を作製するためのキット。
【００１５】
さらなる態様および実施形態についても、本開示の残りの部分から明らかとなり、本発明中に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の精製スキームを図示する。
【００１７】
【図２】図２は、Ｗｎｔ３ａについてのＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析およびクーマシーブルーによる染色解析を指し示す。
【００１８】
【図３】図３は、質量分析データを例示する。
【００１９】
【図４】図４は、ＴＥＭによるＬ−Ｗｎｔ３ａについての特徴付けを説明する。ＴＥＭを使用して、Ｌ−Ｗｎｔ３ａを視覚化し、小胞の平均直径を計算した。
【００２０】
【図５】図５は、ヒトＷｎｔ３ａ活性およびＬ−Ｗｎｔ３ａ活性の定量を説明する。生物発光は、ｄｕａｌ−ｌｉｇｈｔ  ｒｅａｄｙ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）上の三連の読取りにより定量した。ヒトＷｎｔ３ａ（ｎｇ／ｕＬ；Ａ）およびＬ−Ｗｎｔ３ａ（Ｂ）の活性は、Ｗｎｔ３ａタンパク質の段階希釈により作成された検量線から規定した。
【００２１】
【図６】図６は、４℃におけるＬ−Ｗｎｔ３ａの安定性を指し示す。リポソーム−Ｗｎｔ３ａ間の相互作用を検討した。リポソームＷｎｔ３ａ（Ｌ−Ｗｎｔ３ａ）を、４℃で最長４８日間にわたりインキュベートした。次いで、ヒトＬ−Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、ＬＳＬアッセイにおいて、活性について調べた。Ｌ−Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、４８日間の試験期間にわたり、活性の喪失を示さなかった。
【００２２】
【図７】図７は、２３℃におけるＬ−Ｗｎｔ３ａの安定性を指し示す。
【００２３】
【図８】図８は、３７℃におけるＬ−Ｗｎｔ３ａの安定性を説明する。ヒトＷｎｔ３ａの、ＤＭＰＣ：コレステロールリポソームとの会合について調べて、それが、Ｗｎｔ３ａポリペプチドに安定性をもたらすのかどうかを決定した。複数の時点からのデータを、単一の指数関数的減衰に当てはめたところ、１０時間後、Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、３７℃で、その活性の半分を保持する（青線、図８Ａ）が、Ｗｎｔ３ａは、その活性を、５分間以内に喪失する（赤線、図８Ａ）ことが示された。ヒトＷｎｔ３ａにおける活性の喪失は、タンパク質分解に起因した。Ｗｎｔ３ａ＋ＣＨＡＰＳ溶液中では、免疫ブロットにより、低分子量バンドが検出可能であった（図８Ｂ）。Ｌ−Ｗｎｔ３ａ調製物の免疫ブロットでは、Ｗｎｔ３ａに対応する低分子量バンドが検出されなかった（図８Ｃ）。
【００２４】
【図９】図９は、懸濁液培養物中で増殖させた細胞から産生されたヒトＷｎｔ３ａポリペプチドを、付着培養物中で増殖させた細胞から産生されたヒトＷｎｔ３ａポリペプチドと対比して例示する。
【００２５】
【図１０】図１０は、ドキシサイクリン濃度依存性の、ヒトＷｎｔ３ａポリペプチド分泌の誘導を説明する。ドキシサイクリンは、培地に、ＣＨＯ細胞により産生されるヒトＷｎｔ３ａの量に影響を及ぼす範囲の濃度（ｎｇ／ｕＬ）で添加した。
【００２６】
【図１１】図１１は、ウシ胎仔血清を、ヒトＷｎｔ３ａポリペプチドの、ＣＨＯ細胞からの分泌のために使用したことを例示する。
【００２７】
【図１２】図１２は、ヒトＷｎｔ３ａの、ＣＨＯ細胞からの分泌を、培養物中の日数の関数として説明する。
【００２８】
【図１３】図１３は、ＬＳＬ細胞レポーターアッセイの頑健さ、精度、検出限界、および特異度を説明する。
【００２９】
【図１４】図１４は、初代細胞を使用して、Ｌ−Ｗｎｔ３ａの用量反応曲線を説明する。（Ａ）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）内では、有効濃度の線形範囲は、０．０２５〜０．１ｎｇ／μＬのヒトＷｎｔ３ａであった。（Ｂ）骨髄由来幹細胞内のＬ−Ｗｎｔ３ａ活性を示す図であり、これにより、有効濃度の線形範囲が、０．００４〜０．０８ｎｇ／μＬの範囲にわたることが決定された。
【００３０】
【図１５】図１５は、異なる脂質処方物下における、ヒトＷｎｔ３ａの活性を説明する。ＣＨＡＰＳを、ＤＭＰＣおよびコレステロール脂質で代替したところ、Ｗｎｔ３ａの活性は維持されたが、ＭＰＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＳ、ＤＭＰＧ、およびＤＭＧＥなどの脂質で作製されたリポソームは、不活性であった。
【００３１】
【図１６】図１６は、スクロースの密度勾配を例示する。
【００３２】
【図１７】図１７は、ヒトＷｎｔ３ａの、リポソーム膜に対するアフィニティーを例示する。Ｗｎｔ３ａ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ間の結合アフィニティーは、約３．６ｎＭであった。Ｗｎｔ３ａ／ＬＲＰ６間の結合アフィニティーは、約９ｎＭであった。Ｗｎｔ３ａとリポソーム膜との間の結合アフィニティーは、Ｗｎｔ３ａ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）、およびＬｒｐ６の間のプルダウンアッセイに基づき、約６ｎＭであった。
【００３３】
【図１８】図１８は、ヒトＷｎｔ３ａの、リポソームとの会合の反応速度を説明する。
【００３４】
【図１９】図１９は、Ｗｎｔ５ａポリペプチドおよびＷｎｔ１０ｂポリペプチドの、中性のＤＭＰＣリポソームへの結合を説明する。
【００３５】
【図２０】図２０は、骨移植片材料の個別の成分を説明する。骨移植片材料は、幹細胞集団および前駆細胞集団を含有する。図２０Ａは、ラット大腿骨から採取されたＢＧＭについてのゴモリ染色を指し示し、（図２０Ｂ）は、ラット腸骨稜から採取されたＢＧＭについてのゴモリ染色を指し示し、（図２０Ｃ）は、ラット脛骨から採取されたＢＧＭについてのゴモリ染色を指し示す。図２０Ｄは、表示の供給源から採取されたばかりのラットＢＧＭ内の、内因性骨形成遺伝子の発現についての定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。図２０Ｅは、自家ＢＧＭをラットのＳＲＣに移植する、実験デザインについての概略を説明する。図２０Ｆは、ＢｒｄＵの取込みを検出するように染色された、移植後７日目における腸骨稜ＢＧＭの代表的な組織切片を例示する。点線は、ＢＧＭ内に含まれる骨梁の小片を指し示す。図２０Ｇ、図２０Ｈ、および図２０Ｉは、それぞれ、Ｒｕｎｘ２、Ｓｏｘ９、およびＰＰＡＲγの発現である。図２０Ｊは、類骨マトリックスを検出するように、アニリンブルーで染色されたＢＧＭの代表的な組織切片を示し、アステリスクは、新たな骨マトリックスを、古い骨小片（黄色の点線）と対比して指し示す。このパネルおよび図２０Ｇでは、腎表面は、白色の点線で指し示される。図２０Ｋは、プロテオグリカンに富む軟骨（赤色）を検出する、サフラニンＯ／Ｆａｓｔ  ｇｒｅｅｎによる組織学であり、図２０Ｌは、脂肪細胞を検出するゴモリトリクローム染色である。略号：ＢｒｄＵ：ブロモデオキシウリジン；ＰＰＡＲγ：ペルオキシソーム増殖剤活性化タンパク質ガンマである。スケールバー：５０μｍであり、アステリスク：ｐ＜０．０５である。
【００３６】
【図２１】図２１は、骨移植片材料を、Ｗｎｔ応答性として説明する。図２１Ａは、骨膜の免疫染色により視覚化された、Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２；Ｒ２６ｍＴｍＧマウスにおけるＧＦＰ＋ｖｅ細胞を指し示し、図２１Ｂは、骨内膜である。図２１Ｃは、指定された顕微鏡視野内のＧＦＰ＋ｖｅ細胞／全細胞の定量である。図２１Ｄは、ＢＧＭ内のＧＦＰ＋ｖｅ細胞を、蛍光により視覚化したことを指し示す。図２１Ｅは、ＢＧＭｙｏｕｎｇ（緑色のバー）中およびＢＧＭａｇｅｄ（グレーのバー）中の内因性Ａｘｉｎ２発現、内因性Ｌｅｆ１発現、および内因性ＧＡＰＤＨ発現についての、定量的絶対ＲＴ−ＰＣＲ結果である。図２１Ｆは、ＢＧＭｙｏｕｎｇ（緑色のバー）中およびＢＧＭａｇｅｄ（グレーのバー）中の、Ｗｎｔ３ａ、全ベータカテニン、Ａｘｉｎ２、およびベータアクチンについてのウェスタンブロット解析を説明する。スケールバー＝５０μｍである。アステリスク：ｐ＜０．０５である。
【００３７】
【図２２】図２２は、ＢＧＭの骨分化潜在能が、年齢と共に低下することを示す。図２２Ａは、ＢＧＭｙｏｕｎｇ（緑色のバー）中およびＢＧＭａｇｅｄ（グレーのバー）中の、アルカリホスファターゼ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、およびオステオカルシンの発現についての、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を指し示す。図２２Ｂは、ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰマウスから採取され、ＳＲＣに移植され、明視野下で視覚化されたＢＧＭであり、図２２Ｃは、蛍光を利用する、ＢＧＭ内のＧＦＰシグナルの検出である。図２２Ｄは、ＢＧＭｙｏｕｎｇに由来する、アニリンブルーで染色（挿入図）された代表的な組織切片（Ｎ＝５）であり、（図２２Ｅ）は、ＢＧＭａｇｅｄに由来する、アニリンブルーで染色（挿入図）された代表的な組織切片である（Ｎ＝５）。点線は、腎表面を指し示す。図２２Ｆは、移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内のアニリンブルー＋ｖｅピクセルについての組織形態計測解析を指し示す。図２２Ｇおよび図２２Ｈは、（Ｇ）ＢＧＭｙｏｕｎｇ（Ｎ＝５）および（Ｈ）ＢＧＭａｇｅｄ（Ｎ＝５）に由来するＡＬＰ活性を検出するように染色された、代表的な組織切片を指し示す。図２２Ｉは、移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内のＡＬＰ＋ｖｅピクセルの定量を指し示す。図２２Ｊおよび図２２Ｋは、（図２２Ｊ）ＢＧＭｙｏｕｎｇ（Ｎ＝５）および（図２２Ｋ）ＢＧＭａｇｅｄ（Ｎ＝５）に由来するＧＦＰについて免疫染色された、代表的な組織切片を示す。図２２Ｌは、移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内のＧＦＰ＋ｖｅピクセルの定量を示す。略号：ＡＬＰ：アルカリホスファターゼ；Ｏｃ：オステオカルシンである。スケールバー：１００μｍである。アステリスク：ｐ＜０．０５であり、二重のアステリスク：ｐ＜０．０１である。
【００３８】
【図２３】図２３は、ＢＧＭの骨分化が、内因性Ｗｎｔシグナルを要請することを示す。図２３Ａは、マウスＩｇＧ２α  Ｆｃ断片を発現させるアデノウイルス（Ａｄ−Ｆｃ）で処置されたＢＧＭ内のＡＬＰ活性について染色された、代表的な組織切片を示し、または（図２３Ｂ）は、可溶性ＷｎｔアンタゴニストであるＤｋｋ１を発現させるアデノウイルス（Ａｄ−Ｄｋｋ１）で処置されたＢＧＭ内のＡＬＰ活性について染色された、代表的な組織切片を示す。図２３Ｃは、Ａｄ−Ｆｃで処置されたＢＧＭ内のＰＰＡＲγについて免疫染色された、代表的な組織切片を示し、または（図２３Ｄ）は、Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭ内のＰＰＡＲγについて免疫染色された、代表的な組織切片を示す。図２３Ｅは、Ａｄ−Ｆｃで処置されたＢＧＭ内のＤｌｋ１について免疫染色された、代表的な組織切片を説明し、または（図２３Ｆ）は、Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭ内のＤｌｋ１について免疫染色された、代表的な組織切片を説明する。図２３Ｇは、Ａｄ−Ｆｃで処置されたＢＧＭを施された欠損部位内の骨形成を検出する、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの再構成を説明し、または（図２３Ｈ）は、Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭを施された欠損部位内の骨形成を検出する、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの再構成を説明する。元の欠損は、赤色の点線による円で指し示す。図２３Ｉは、ｍｉｃｒｏ−ＣＴデータから計算される新たな骨体積（Ｎ＝５）±ＳＥＭを示す。図２３Ｊは、Ａｄ−Ｆｃで処置されたＢＧＭを施された欠損部位に由来する代表的な組織切片に対するアニリンブルー染色を指し示し、または（図２３Ｋ）は、Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭを施された欠損部位に由来する代表的な組織切片に対するアニリンブルー染色を指し示す。図２３Ｌは、組織形態計測解析を使用する、新たな骨体積の定量を指し示す図である。図２３Ｉは、Ａｄ−Ｆｃで処置されたＢＭ移植片内のＰＰＡＲ−γ発現を示し、または（図２３Ｊ）はＡｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＭ移植片内のＰＰＡＲ−γ発現を示す。単一のアステリスク：ｐ＜０．０５である。スケールバー：Ａ〜Ｂ：２００μｍ、Ｃ〜Ｆ、Ｊ〜Ｋ：５０μｍ、Ｇ〜Ｈ：２ｍｍである。
【００３９】
【図２４】図２４は、ヒトＷｎｔ３ａが、ＢＧＭａｇｅｄを活性化し、その骨分化潜在能を回復させることを説明する。図２４Ａは、老齢ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰマウスに由来するＢＧＭであって、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ（０．１５μｇ／ｍｌ）で１時間にわたり処置され、次いで、２４時間後に、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、標的遺伝子の発現についてアッセイされるか、または速やかに、ＳＲＣに７日間にわたり移植されたＢＧＭを指し示す。図２４Ｂは、Ｌ−ＰＢＳ（グレーのバー）またはＬ−ＷＮＴ３Ａ（青色のバー）で処置されたＢＧＭａｇｅｄ中の、Ａｘｉｎ２発現およびＬｅｆ１発現の倍数変化を説明する。図２４Ｃは、Ｌ−ＰＢＳ（グレーのバー）またはＬ−ＷＮＴ３Ａ（青色のバー）で処置されたＢＧＭａｇｅｄ中の、全ベータカテニン、Ａｘｉｎ２、およびベータアクチンについてのウェスタンブロット解析を示す図である。ＢＧＭａｇｅｄを、移植後４日目におけるＳＲＣから採取した後で、（図２４Ｄ）Ｌ−ＰＢＳ（Ｎ＝５）および（図２４Ｅ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片を、ＢｒｄＵの取込みについて染色した（Ｎ＝５）。図２４Ｆは、骨移植片内部を中心とする顕微鏡視野内のＢｒｄＵ＋ｖｅピクセルの定量を指し示す図である。図２４Ｇは、Ｌ−ＰＢＳで処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＢｒｄＵの取込みについて染色された組織切片を説明し（Ｎ＝５）、（図２４Ｈ）は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＢｒｄＵの取込みについて染色された組織切片を説明する。図２４Ｉは、上記と同様に、ＢｒｄＵ＋ｖｅピクセルの定量を説明する図である。図２４Ｊは、Ｌ−ＰＢＳで処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＤｌｋ１の発現について免疫染色された組織切片を指し示し（Ｎ＝５）、（図２４Ｋ）は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＤｌｋ１の発現について免疫染色された組織切片を指し示す。図２４Ｌは、移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内のＤｌｋ１＋ｖｅピクセルの定量を示す図である。図２４Ｍは、Ｌ−ＰＢＳで処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＯｃの発現について免疫染色された組織切片を示し（Ｎ＝５）、および（図２４Ｎ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料に由来する代表的な組織切片であって、移植後７日目におけるＯｃの発現について免疫染色された組織切片を示す。図２４Ｏは、Ｄｌｋ１について記載されたのと同様に、Ｏｃ＋ｖｅピクセルの定量を指し示す図である。図２４Ｐは、Ｌ−ＰＢＳで処置された試料中の類骨マトリックスを検出するようにアニリンブルーで染色された、代表的な組織切片を示し（Ｎ＝５）、（図２４Ｑ）は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（Ｎ＝５）で処置された試料中の類骨マトリックスを検出するようにアニリンブルーで染色された、代表的な組織切片を示す。図２４Ｒは、新たな骨マトリックスの、組織形態計測による定量を指し示す図である。略号は、本明細書の別の個所で記載される通り���ある。スケールバー：１００μｍである。アステリスク：ｐ＜０．０５；二重のアステリスク：ｐ＜０．０１である。
【００４０】
【図２５】図２５は、Ｌ−Ｗｎｔ３ａが、ＢＧＭ幹細胞を刺激し、脊椎固定を改善することを説明する。図２５Ａは、ヒトＭＳＣ培養物を、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａにより、３７℃で表示の期間にわたり処置し、Ａｘｉｎ２発現についてのｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、Ｗｎｔ応答を決定したことを示す。図２５Ｂは、マウスＳＳＣを、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａにより、３７℃で１２時間にわたり処置し、Ｗｎｔ応答について、Ａｘｉｎ２発現についてのｑＲＴ−ＰＣＲでアッセイしたことを示す。図２５Ｃは、Ｌ−ＰＢＳ（破線）またはＬ−ＷＮＴ３Ａ（０．１５μｇ／ｍＬ；青線）を伴う、室温で１時間にわたるインキュベーションに応答する、Ａｘｉｎ２発現およびＬｅｆ１発現についての定量的絶対ＲＴ−ＰＣＲ解析を説明する。データは、２４時間にわたるＲＮＡコピー数／合計ＲＮＡ含量の比として表す。図２５Ｄは、ラット棘突起を、最小限の切開を介して露出させ、腸骨稜に由来する標準化体積の自家ＢＧＭを、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａで１時間にわたり処置し、次いで、（図２５Ｅ）Ｌ４脊髄横突起と、Ｌ５脊髄横突起との間に移植したことを指し示す。図２５Ｆおよび図２５Ｇは、ＰＯＤ２に、（Ｆ）Ｌ−ＰＢＳおよび（Ｇ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置された移植片（ピンク）について、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの収集を実施したことを指し示す。図２５Ｈは、ＰＯＤ４９に、ｍｉｃｒｏ−ＣＴの収集を再度実施して、（図２５Ｈ）Ｌ−ＰＢＳ（グレー）および（図２５Ｉ）Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（青）で処置された移植片の骨成長を査定したことを指し示す。図２５Ｊは、移植片の成長を、処置群の各々について、ＰＯＤ２における各移植片サイズを、ＰＯＤ４９におけるそのサイズと比較する体積倍数としてグラフ化した（上記で言明された色により指し示される）ことを指し示す。略号：Ｌ４：第４腰椎、Ｌ５：第５腰椎、ＡＰ：先端突起、ＳＰ：棘突起、ＴＰ：横突起、ＰＯＤ：手術後〜日目である。
【００４１】
【図２６】図２６は、ＢＧＭ体積の定量を説明する。脛骨および大腿骨から採取されたＢＧＭを、約２０μＬずつ５つのアリコートに分け、次いで、細胞、間質、および骨断片の異種性混合物中の細胞密度を定量する手段として、ＤＮＡ濃度を査定した。試料＃１中のＤＮＡ濃度を１００とし、他の４つのアリコートの相対ＤＮＡ濃度を決定した。
【００４２】
【図２７】図２７は、ＢＧＭの生着効率を説明する。Ｌ−Ｗｎｔ３ａによる処置は、ＢＧＭの生着効率を改善する。図２７Ａは、ＳＲＣ内で４日後における、ＢＧＭａｇｅｄについての、ＧＦＰ免疫染色を説明し、（図２７Ｂ）は、ＢＧＭＡＣＴについての、ＧＦＰ免疫染色を説明する。図２７Ｃは、移植後４日目における、ＢＧＭにより占有された全ピクセルで割ったＧＦＰ＋ｖｅピクセルの定量を示す。図２７Ｄは、ＳＲＣ内で４日後における、ＢＧＭａｇｅｄについてのＴＵＮＥＬ染色を示し、（図２７Ｅ）は、ＢＧＭＡＣＴについてのＴＵＮＥＬ染色を示す。図２７Ｆは、移植後４日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内の全ＤＡＰＩ＋ｖｅピクセルで割った、ＴＵＮＥＬ＋ｖｅ細胞の定量を示す。図２７Ｇは、ＳＲＣ内で７日後における、ＢＧＭａｇｅｄについてのＴＵＮＥＬ染色を示し、（図２７Ｈ）は、ＢＧＭＡＣＴについてのＴＵＮＥＬ染色を示す。図２７Ｉは、移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内の、全ＤＡＰＩ＋ｖｅピクセルで割った、ＴＵＮＥＬ＋ｖｅ細胞の定量を示す図である。図２７Ｊは、ＳＲＣ内で７日後における、ＢＧＭａｇｅｄ内の破骨細胞を検出する、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性について染色された組織切片を説明し、（図２７Ｋ）は、ＢＧＭＡＣＴ内の破骨細胞を検出する、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性について染色された組織切片を説明する。図２７Ｌは、移植後７日目における、ＢＧＭにより占有された全領域内の、ＴＲＡＰ＋ｖｅピクセルの定量を示す。スケールバー＝１００μｍであり、＊＊は、ｐ＜０．０１を指し示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
本明細書では、リポソームＷｎｔポリペプチドを作製するのに使用するための、組成物、方法、プロセス、およびキットが開示される。本明細書ではまた、骨移植片材料を作製するための、組成物、方法、プロセス、およびキットも開示される。一部の実施形態では、組成物は、機能的に活性な哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含み、リポソームを構成するリン脂質は、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する。一部の実施形態では、組成物は、機能的に活性な哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含み、リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さは、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である。一部の実施形態では、組成物はまた、機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドと、リポソームを含む水溶液とを含み、機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む。
【００４４】
本明細書の一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドを調製する方法であって、Ｗｎｔポリペプチドを含む試料をリポソームの水溶液に接触させるステップを含み、リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する方法が記載される。本明細書の一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドを調製する方法であって、Ｗｎｔポリペプチドを含む試料をリポソームの水溶液に接触させるステップを含み、リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である方法が記載される。本明細書の一部の実施形態ではまた、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む馴化培地から採取するステップと；（ｂ）Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したイオン交換カラムに導入するステップと；（ｃ）段階勾配を利用して、Ｗｎｔ３ａポリペプチドをイオン交換カラムから溶出させるステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）によるＷｎｔ３ａポリペプチドをリポソームの水溶液と接触させるステップとを含む方法も記載される。
【００４５】
本明細書の一部の実施形態では、単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、細胞による、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の発現レベルが増強される組成物が記載される。本明細書の一部の実施形態ではまた、３５歳またはこれより老齢のヒト被験体から得られた哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷｎｔポリペプチドによる処置の後で、哺乳動物骨髄細胞が、増強された発現レベルで、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数を発現させる組成物も記載される。
【００４６】
本明細書の一部の実施形態では、単離哺乳動物骨髄細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔポリペプチドと接触させるステップを含むプロセスであって、接触させる時間が約３０分間〜約４時間の間であるプロセスにより作製される、哺乳動物骨髄組成物が記載される。
【００４７】
本明細書の一部の実施形態では、被験体における骨欠損を処置する方法であって、（ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔポリペプチドと接触させるステップと；（ｂ）試料を洗浄して、遊離リポソームＷｎｔポリペプチドを除去するステップと；（ｃ）リポソームＷｎｔポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップとを含む方法が記載される。本明細書ではまた、被験体における骨欠損を処置する方法であって、（ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドと接触させるステップと；（ｂ）試料を洗浄して、遊離リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドを除去するステップと；（ｃ）リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップとを含む方法も記載される。
【００４８】
本明細書の一部の実施形態では、骨移植片材料を作製する方法であって、（ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔポリペプチドと接触させるステップと；（ｂ）試料を洗浄して、遊離リポソームＷｎｔポリペプチドを除去するステップと；（ｃ）リポソームＷｎｔポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップとを含む方法が記載される。本明細書ではまた、骨移植片材料を作製する方法であって、（ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドと接触させるステップと；（ｂ）試料を洗浄して、遊離リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドを除去するステップと；（ｃ）リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップとを含む方法も記載される。
【００４９】
本明細書の一部の態様では、配列番号１の、機能的に活性なＷｎｔ３ａポリペプチドであって、Ｓｅｒ２０９において脂質修飾されるか、もしくはＣｙｓ７７における脂質修飾の非存在下にある非ヒト哺乳動物Ｗｎｔ３ａポリペプチドの、対応する、保存されたＳｅｒにおいて脂質修飾されるか；または非ヒト哺乳動物Ｗｎｔ３ａポリペプチドの、対応する、保存されたＣｙｓにおいて脂質修飾されたＷｎｔ３ａポリペプチドのうちの、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を含む組成物が記載される。本明細書の一部の実施形態では、Ｗｎｔ３Ａ以外の、機能的に活性なヒトＷｎｔポリペプチドであって、対応する、保存されたＣｙｓにおける、Ｗｎｔ３Ａ  Ｃｙｓ７７への脂質修飾の非存在下の、Ｗｎｔ３Ａ  Ｓｅｒ２０９に対応する、保存されたＳｅｒにおいて脂質修飾されたヒトＷｎｔポリペプチドのうちの、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を含む組成物が記載される。
【００５０】
一部の態様では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａまたはその機能的に活性な変異体である。他の態様では、Ｗｎｔポリペプチドは、ヒトＷｎｔ３ａまたはその機能的に活性な変異体である。さらに別の態様では、Ｗｎｔポリペプチドは、配列番号１のＷｎｔ３ａまたはその機能的に活性な変異体である。さらなる態様では、脂質修飾は、パルミトイル化である。他の態様では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１ポリペプチド、Ｗｎｔ２ポリペプチド、Ｗｎｔ２ｂ（またはＷｎｔ１３）ポリペプチド、Ｗｎｔ３ポリペプチド、Ｗｎｔ４ポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ｂポリペプチド、Ｗｎｔ６ポリペプチド、Ｗｎｔ７ａポリペプチド、Ｗｎｔ７ｂポリペプチド、Ｗｎｔ８ａポリペプチド、Ｗｎｔ８ｂポリペプチド、Ｗｎｔ９ａ（Ｗｎｔ１４、またはＷｎｔ１４ｂ）ポリペプチド、Ｗｎｔ９ｂ（Ｗｎｔ１４ｂ、またはＷｎｔ１５）ポリペプチド、Ｗｎｔ１０ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０ｂ（またはＷｎｔ１２）ポリペプチド、Ｗｎｔ１１ポリペプチド、Ｗｎｔ−１６ａポリペプチド、Ｗｎｔ−１６ｂポリペプチドまたはこれらの機能的に活性な変異体など、Ｗｎｔ３Ａ以外のヒトＷｎｔタンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｗｎｔ５ＡもしくはＷｎｔ１０ｂまたはその機能的に活性な変異体である。一部のこのような実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドを、リポソーム、例えば、ＤＭＰＣおよび／またはコレステロールを含むリポソームに調合する。
【００５１】
本明細書の別の態様では、Ｗｎｔポリペプチドを、限定なしに述べると、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、哺乳動物細胞培養物から精製するための方法であって、例えば、ゲル濾過精製ステップなど、代替的な精製ステップの非存在下において、クロマトグラフィーカラム（例えば、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換カラム）上の分離ステップなどの分離ステップを利用して、Ｗｎｔポリペプチドを含有する前記細胞の培養培地を、精製にかけるステップを含む方法が記載される。一部の実施形態では、精製はまた、ヘパリン硫酸カラムによる精製ステップの非存在下においても実施される。別の実施形態では、細胞は、付着細胞であり、培養培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）などの血清をさらに含む。さらなる実施形態では、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換カラムなどのカラム上の精製は、１５０ｍＭ〜１．５Ｍの塩勾配であって、塩が、例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムでありうる塩勾配を使用して実施する。場合によって、精製スキームに続いて、例えば、あらかじめ作製されたリポソームであって、ＤＰＭＣおよび／またはコレステロールなどの脂質を、例えば、９０：１０のモル：モル比で含みうるリポソームを使用する精製ステップなど、さらなる精製ステップを施す。場合によって、あらかじめ作製されたリポソームの使用では、Ｗｎｔポリペプチドの疎水性を利用し、ゲル濾過精製ステップおよび／またはヘパリン硫酸カラムによる精製ステップなど、さらなる精製ステップに対する必要をなくす。
【００５２】
細胞が懸濁細胞である場合、培養は、無血清条件下で実施することができる。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、ヒトＷｎｔ３ａ、例えば、配列番号１のヒトＷｎｔ３ａまたはその機能的に活性な変異体などのＷｎｔ３ａの場合もあり、Ｗｎｔ３Ａ以外のヒトＷｎｔポリペプチド、例えば、Ｗｎｔ１ポリペプチド、Ｗｎｔ２ポリペプチド、Ｗｎｔ２ｂ（またはＷｎｔ１３）ポリペプチド、Ｗｎｔ３ポリペプチド、Ｗｎｔ４ポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ｂポリペプチド、Ｗｎｔ６ポリペプチド、Ｗｎｔ７ａポリペプチド、Ｗｎｔ７ｂポリペプチド、Ｗｎｔ８ａポリペプチド、Ｗｎｔ８ｂポリペプチド、Ｗｎｔ９ａ（Ｗｎｔ１４、またはＷｎｔ１４ｂ）ポリペプチド、Ｗｎｔ９ｂ（Ｗｎｔ１４ｂ、またはＷｎｔ１５）ポリペプチド、Ｗｎｔ１０ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０ｂ（またはＷｎｔ１２）ポリペプチド、Ｗｎｔ１１ポリペプチド、Ｗｎｔ−１６ａポリペプチド、Ｗｎｔ−１６ｂポリペプチド、またはこれらの機能的に活性な変異体の場合もある。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｗｎｔ５ＡもしくはＷｎｔ１０ｂまたはその機能的に活性な変異体である。さらなる態様では、本発明は、前出の方法により精製されたＷｎｔ組成物に関する。一実施形態では、Ｗｎｔ組成物は、Ｗｎｔ３ａまたはその機能的に活性な変異体である、Ｗｎｔポリペプチドを含む。別の実施形態では、Ｗｎｔ組成物は、ヒトＷｎｔ３ａまたはその機能的に活性な変異体である、Ｗｎｔポリペプチドを含む。さらに別の実施形態では、Ｗｎｔ組成物は、配列番号１のヒトＷｎｔ３ａまたはその機能的に活性な変異体である、Ｗｎｔポリペプチドを含む。
【００５３】
本明細書の一部の態様にはまた、骨移植片材料を作製するためのキットであって、リポソームＷｎｔポリペプチド、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチド、または単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物を含むキットも含まれる。
【００５４】
Ａ．定義
本方法について記載する前に、このような方法は、変化することが当然であるので、本発明は、記載される特定の方法に限定されるものではないことを理解されたい。また、本発明の範囲を限定するのは、付属の特許請求の範囲だけであるので、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態だけについて記載することを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
【００５５】
値の範囲が提示される場合は、その範囲の上限と下限との間の、文脈によりそうでないことが明確に指示されない限りにおいて、下限の単位の１０分の１までの、各中間の値、およびその言明された範囲内の他の任意の言明された値または中間の値が、本発明に包摂されることが理解される。これらの小範囲の上限および下限は、独立に、本発明に包摂される小範囲内に含まれ、言明された範囲内の、任意の具体的に除外された限界により決まる。本明細書で使用される範囲および量はまた、「約」特定の値または範囲として表すこともできる。約はまた、ちょうどの量も含む。よって、「約５μＬ」とは、「約５μＬ」を意味するが、また、「５μＬ」も意味する。一般に、「約」という用語は、量の±１０％以内であることが予測される量を含む。
【００５６】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。Singletonら、Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology、２版、J. Wiley & Sons（New York、NY、１９９４年）は、当業者に、本出願で使用される用語の多くに対する一般的な指針をもたらす。
【００５７】
Ｗｎｔポリペプチドは、高度に保存された分泌型シグナル伝達分子であって、胚発生時の細胞間相互作用を調節するシグナル伝達分子のファミリーを形成する。本明細書で使用される場合の「Ｗｎｔ」または「Ｗｎｔ遺伝子産物」または「Ｗｎｔポリペプチド」という用語は、天然配列のＷｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチド断片、キメラＷｎｔポリペプチド、または前出の機能的に活性な変異体を包摂する。本明細書では、「ＷＮＴ」および「Ｗｎｔ」という用語は、互換的に使用される。同様に、本明細書では、「ＷＮＴ３Ａ」、「ＷＮＴ３ａ」、「Ｗｎｔ３Ａ」、または「Ｗｎｔ３ａ」という用語も、互換的に使用される。
【００５８】
「天然配列」のポリペプチドとは、天然に由来するＷｎｔポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このような天然配列のポリペプチドは、内因性Ｗｎｔタンパク質を産生する細胞から単離することもでき、組換え手段または合成的手段により作製することもできる。したがって、天然配列のポリペプチドは、例えば、自然発生のヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または他の任意の哺乳動物種、もしくは哺乳動物以外の種、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどに由来するポリペプチドのアミノ酸配列を有しうる。場合によって、「天然配列」のポリペプチドはまた、Ｎ末端メチオニンも含む。場合によって、「天然配列」のポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを含またない。
【００５９】
「天然配列のＷｎｔポリペプチド」という用語は、限定なしに述べると、ヒトＷｎｔポリペプチドまたはマウスＷｎｔポリペプチドなどの哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドを含む。ヒトＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１ポリペプチド、Ｗｎｔ２ポリペプチド、Ｗｎｔ２ｂ（またはＷｎｔ１３）ポリペプチド、Ｗｎｔ３ポリペプチド、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ４ポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ｂポリペプチド、Ｗｎｔ６ポリペプチド、Ｗｎｔ７ａポリペプチド、Ｗｎｔ７ｂポリペプチド、Ｗｎｔ８ａポリペプチド、Ｗｎｔ８ｂポリペプチド、Ｗｎｔ９ａ（Ｗｎｔ１４、またはＷｎｔ１４ｂ）ポリペプチド、Ｗｎｔ９ｂ（Ｗｎｔ１４ｂ、またはＷｎｔ１５）ポリペプチド、Ｗｎｔ１０ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０ｂ（またはＷｎｔ１２）ポリペプチド、Ｗｎｔ１１ポリペプチド、Ｗｎｔ−１６ａポリペプチド、またはＷｎｔ−１６ｂポリペプチドを含む。Ｗｎｔ１は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００５４２１．１および同ＡＡＨ７４７９９．１により参照することができる。Ｗｎｔ２は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８２．１および同ＡＡＨ７８１７０．１により参照することができる。一般に、Ｗｎｔ２は、脳の視床内、胎児および成体の肺内、ならびに胎盤内で発現しうる。Ｗｎｔ２Ｂは、２つのアイソフォームを有し、それらのＧｅｎｂａｎｋ参照番号は、それぞれＮＰ００４１７６．２およびＮＰ０７８６１３．１である。アイソフォーム１は、成体の心臓内、脳内、胎盤内、肺内、前立腺内、精巣内、卵巣内、小腸内、および／または結腸内で発現しうる。成体の脳内では、アイソフォーム１は主に、尾状核内、視床下核内、および視床内で見出される。場合によって、アイソフォーム１はまた、胎児の脳内、肺内、および腎臓内でも検出される。アイソフォーム２は、胎児の脳内、胎児の肺内、胎児の腎臓内、尾状核内、精巣内、および／またはがん細胞系内で発現しうる。
【００６０】
Ｗｎｔ３とＷｎｔ３ａとは、発生しつつある神経管の形態形成時の細胞間シグナル伝達において、顕著に異なる役割を果たす。Ｗｎｔ３は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＢ０６０２８４．１（また、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ６１０５２．１、およびＡＡＩ０３９２４．１も参照されたい）を有する。Ｗｎｔ３ａは、配列番号１に示されるアミノ酸配列および配列番号２に示される核酸配列を有する。天然ヒトＷｎｔ３ａのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＭ＿０３３１３１においても開示されており、タンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ＿１４９１２２において開示されている。Ｗｎｔ３ａタンパク質の前駆体は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ＿１４９１２２．１を有する。天然のＷｎｔ３ａは、３５２アミノ酸残基の長さである。天然のＷｎｔ３ａは、アミノ酸残基１〜１８に由来するシグナルペプチドを含有する。成熟タンパク質は、アミノ酸残基１９〜３５２を含有する。例えば、本明細書で使用される、Ｗｎｔ３ＡのＣｙｓ７７またはＳｅｒ２０９に対する言及は、配列番号１に示される全長配列に照らして行う。場合によって、「天然ヒトＷｎｔ３ａ」ポリペプチドという用語は、配列番号１の、天然ヒトＷｎｔ３ａポリペプチドであって、そのＮ末端メチオニン（Ｍｅｔ）を伴うかまたは伴わないポリペプチド、および天然のシグナル配列を伴うかまたは伴わないポリペプチドを指す。
【００６１】
Ｗｎｔ４は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ１１０３８８．２および同ＢＡＣ２３０８０．１を有する。Ｗｎｔ５ａは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８３．１および同ＮＰ００３３８３．２を有する。Ｗｎｔ５ｂは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＢＡＢ６２０３９．１および同ＡＡＧ３８６５９を有する。Ｗｎｔ６は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００６５１３．１および同ＢＡＢ５５６０３．１を有する。Ｗｎｔ７ａは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００４６１６．２および同ＢＡＡ８２５０９．１を有する。Ｗｎｔ７ａは、胎盤内、腎臓内、精巣内、子宮内、胎児の肺内、胎児の脳内または成体の脳内で発現しうる。Ｗｎｔ７ｂは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ４７８６７９．１および同ＢＡＢ６８３９９．１を有する。Ｗｎｔ７ｂは、胎児の脳内、肺内、および／もしくは腎臓内、または成体の脳内、肺内、および／もしくは前立腺内で発現しうる。Ｗｎｔ８Ａは、少なくとも２つの代替的な転写物、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ１１４１３９．１および同ＮＰ４９０６４５．１を有する。Ｗｎｔ８Ｂは、前脳内で発現しうる。Ｗｎｔ８Ｂは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８４．１を有する。Ｗｎｔ１０Ａは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＡＡＧ４５１５３および同ＮＰ０７９４９２．２を有する。Ｗｎｔ１０Ｂは、大半の成体組織内で検出され、心臓内および骨格筋内のレベルが最も高い。Ｗｎｔ１０Ｂは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８５．２を有する。Ｗｎｔ１１は、胎児の肺内、腎臓内、成体の心臓内、肝臓内、骨格筋内、および膵臓内で発現しうる。Ｗｎｔ１１は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００４６１７．２を有する。Ｗｎｔ１４は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８６．１を有する。Ｗｎｔ１５は、胎児の腎臓内または成体の腎臓内で発現しうる。Ｗｎｔ１５はまた、脳内でも発現しうる。Ｗｎｔ１５は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ００３３８７．１を有する。Ｗｎｔ１６は、２つのアイソフォームである、Ｗｎｔ−１６ａおよびＷｎｔ−１６ｂを有し、代替的なスプライシングにより産生される。アイソフォームであるＷｎｔ−１６ａは、膵臓内で発現しうる。アイソフォームであるＷｎｔ−１６ｂは、脾臓、虫垂、およびリンパ節などの末梢リンパ器官内、または腎臓内で発現しうる。しかし、Ｗｎｔ−１６ｂは、骨髄内では発現しえない。Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号は、Ｗｎｔ１６ａおよびＷｎｔ１６ｂについて、それぞれ、ＮＰ４７６５０９．１およびＮＰ０５７１７１．２である。列挙される、全てのＧｅｎＢａｎｋによる配列、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔによる配列、および他のデータベースによる配列は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００６２】
「変異体」（variant）ポリペプチドとは、下記で規定される、機能的に活性なポリペ
プチドであって、天然配列のポリペプチドとの配列同一性が１００％未満であるポリペプチドを意味する。このような変異体は、例えば、天然配列のＮ末端もしくはＣ末端または内部に１または複数のアミノ酸残基が付加されていたり、約１〜３００アミノ酸残基が欠失している、より長いまたはより短いポリペプチドを含む。変異体ポリペプチドは、天然のポリペプチド配列と比較して、１もしくは複数のアミノ酸置換を伴うポリペプチド、またはポリペプチド配列の誘導体であって、結果として得られる産物が、非自然発生のアミノ酸を有するように、アミノ酸残基を共有結合的に修飾した誘導体を含む。
【００６３】
「機能的に活性な」Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３ａポリペプチド）は、天然配列のＷｎｔポリペプチドにより直接的または間接的に引き起こされるかまたは果たされる、エフェクター機能を保持する。天然配列のＷｎｔポリペプチドのエフェクター機能は、β−カテニンの安定化、幹細胞の自己再生の刺激、Ｘｅｎｏｐｕｓ属動物キャップアッセイにおけるＣ５７ＭＧの形質転換および標的遺伝子の誘導のほか、ヒト奇形腫細胞内の標的遺伝子発現を含む。精製されたＷｎｔ組成物は、幹細胞の維持および増殖、組織再生などを含む、様々な治療法において使用される。
【００６４】
場合によって、機能的に活性なＷｎｔ変異体は、天然配列のＷｎｔポリペプチドに対して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。一実施形態では、天然配列のＷｎｔポリペプチドは、哺乳動物（例えば、ヒト）Ｗｎｔ３ａなどの、哺乳動物（例えば、ヒト）Ｗｎｔポリペプチドである。
【００６５】
「アミノ酸」という用語は、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子を指す。適切なアミノ酸は、限定なしに述べると、自然発生のアミノ酸のＤ−異性体およびＬ−異性体の両方のほか、有機合成または他の代謝経路により調製される、非自然発生のアミノ酸も含む。本明細書で使用されるアミノ酸という用語は、限定なしに述べると、α−アミノ酸、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体を含む。
【００６６】
「α−アミノ酸」という用語は、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子であって、α−炭素と称する炭素に結合した分子を指す。
【００６７】
「β−アミノ酸」という用語は、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子であって、β立体配置にある分子を指す。
【００６８】
「自然発生のアミノ酸」という用語は、天然で合成されるペプチド内で一般に見出され、一文字式の略号であるＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶで公知である、２０のアミノ酸のうちのいずれか１つを指す。
【００６９】
以下の表は、天然アミノ酸の特性の概要を示す。
【表３】
2019206551.tif 000002
【００７０】
「疎水性アミノ酸」は、小型の疎水性アミノ酸および大型の疎水性アミノ酸を含む。「小型の疎水性アミノ酸」とは、グリシン、アラニン、プロリン、およびこれらの類似体である。「大型の疎水性アミノ酸」とは、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびこれらの類似体である。「極性アミノ酸」とは、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、およびこれらの類似体である。「荷電アミノ酸」とは、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびこれらの類似体である。
【００７１】
「アミノ酸類似体」という用語は、アミノ酸と構造的に類似し、ペプチド模倣体の大員環を形成するときにアミノ酸を代替しうる分子を指す。アミノ酸類似体は、限定なしに述べると、β−アミノ酸およびアミノ基またはカルボキシ基が、類似の反応性基で置換された（例えば、一級アミンの、二級アミンもしくは三級アミンによる置換、またはカルボキシ基の、エステルによる置換）アミノ酸を含む。
【００７２】
「非天然アミノ酸」という用語は、天然で合成されるペプチド内で一般に見出され、一文字式の略号であるＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶで公知である、２０のアミノ酸のうちの１つではないアミノ酸を指す。非天然アミノ酸またはアミノ酸類似体は、限定なしに述べると、
【００７３】
【化１−１】
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【００７４】
【化１−２】
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【００７５】
【化１−３】
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【００７６】
【化１−４】
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【００７７】
【化１−５】
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【００７８】
【化１−６】
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【００７９】
【化１−７】
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に従う構造を含む。
【００８０】
アミノ酸類似体は、β−アミノ酸類似体を含む。β−アミノ酸類似体の例は、環状β−アミノ酸類似体；β−アラニン；（Ｒ）−β−フェニルアラニン；（Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−酢酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（１−ナフチル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−フリル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−ナフチル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−チエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３，４−ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−ベンゾチエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−ピリジル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−チエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ブロモフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ヨードフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ニトロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ピリジル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−ペンタフルオロ−フェニル酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−ヘキセン酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−ヘキシン酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−フェニルペンタン酸；（Ｒ）−３−アミノ−６−フェニル−５−ヘキセン酸；（Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−酢酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（１−ナフチル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−フリル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−ナフチル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−チエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３，４−ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４��（３−ベンゾチエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−ピリジル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−チエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ブロモフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−クロロフェニル）  酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）  酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ヨードフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ニトロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ピリジル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−ペンタフルオロ−フェニル酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−ヘキセン酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−ヘキシン酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−フェニルペンタン酸；（Ｓ）−３−アミノ−６−フェニル−５−ヘキセン酸；１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−カルボン酸；１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−カルボン酸；３−アミノ−３−（２−クロロフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（２−チエニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（３−ブロモフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（４−メトキシフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ−酪酸；３−アミノアジピン酸；Ｄ−β−フェニルアラニン；β−ロイシン；Ｌ−β−ホモアラニン；Ｌ−β−ホモアスパラギン酸γ−ベンジルエステル；Ｌ−β−ホモグルタミン酸δ−ベンジルエステル；Ｌ−β−ホモイソロイシン；Ｌ−β−ホモロイシン；Ｌ−β−ホモメチオニン；Ｌ−β−ホモフェニルアラニン；Ｌ−β−ホモプロリン；Ｌ−β−ホモトリプトファン；Ｌ−β−ホモバリン；Ｌ−Ｎω−ベンジルオキシカルボニル−β−ホモリシン；Ｎω−Ｌ−β−ホモアルギニン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモヒドロキシプロリン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモセリン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモトレオニン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモチロシン；γ−トリチル−Ｌ−β−ホモアスパラギン；（Ｒ）−β−フェニルアラニン；Ｌ−β−ホモアスパラギン酸γ−ｔ−ブチルエステル；Ｌ−β−ホモグルタミン酸δ−ｔ−ブチルエステル；Ｌ−Ｎω−β−ホモリシン；Ｎδ−トリチル−Ｌ−β−ホモグルタミン；Ｎω−２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル−Ｌ−β−ホモアルギニン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモヒドロキシ−プロリン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモセリン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモトレオニン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモチロシン；２−アミノシクロペンタンカルボン酸；および２−アミノシクロヘキサンカルボン酸を含むがこれらに限定されない。
【００８１】
アミノ酸類似体は、アラニン、バリン、グリシン、またはロイシンの類似体を含む。アラニン、バリン、グリシン、およびロイシンのアミノ酸類似体の例は、α−メトキシグリシン；α−アリル−Ｌ−アラニン；α−アミノイソ酪酸；α−メチル−ロイシン；β−（１−ナフチル）−Ｄ−アラニン；β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン；β−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン；β−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン；β−（２−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（２−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−（２−チエニル）−Ｄ−アラニン；β−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｌ−アラニン；β−（３−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−（４−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（４−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−クロロ−Ｌ−アラニン；β−シアノ−Ｌ−アラニン；β−シクロヘキシル−Ｄ−アラニン；β−シクロヘキシル−Ｌ−アラニン；β−シクロペンテン−１−イル−アラニン；β−シクロペンチル−アラニン；β−シクロプロピル−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；β−ｔ−ブチル−Ｄ−アラニン；β−ｔ−ブチル−Ｌ−アラニン；γ−アミノ酪酸；Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；２，４−ジニトロ−フェニルグリシン；２，５−ジヒドロ−Ｄ−フェニルグリシン；２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸；２−フルオロ−フェニルグリシン；３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ−酪酸；３−フルオロ−バリン；４，４，４−トリフルオロ−バリン；４，５−デヒドロ−Ｌ−ｌｅｕ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；４−フルオロ−Ｄ−フェニルグリシン；４−フルオロ−Ｌ−フェニルグリシン；４−ヒドロキシ−Ｄ−フェニルグリシン；５，５，５−トリフルオロ−ロイシン；６−アミノヘキサン酸；シクロペンチル−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸；Ｄ−α−アミノ酪酸；Ｄ−α−ｔ−ブチルグリシン；Ｄ−（２−チエニル）グリシン；Ｄ−（３−チエニル）グリシン；Ｄ−２−アミノカプロン酸；Ｄ−２−インダニルグリシン；Ｄ−アリルグリシン−ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ−シクロヘキシルグリシン；Ｄ−ノルバリン；Ｄ−フェニルグリシン；β−アミノ酪酸；β−アミノイソ酪酸；（２−ブロモフェニル）グリシン；（２−メトキシフェニル）グリシン；（２−メチルフェニル）グリシン；（２−チアゾイル）グリシン；（２−チエニル）グリシン；２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−プロピオン酸；Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；Ｌ−α−アミノ酪酸；Ｌ−α−ｔ−ブチルグリシン；Ｌ−（３−チエニル）グリシン；Ｌ−２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−プロピオン酸；Ｌ−２−アミノカプロン酸ジシクロヘキシル−アンモニウム塩；Ｌ−２−インダニルグリシン；Ｌ−アリルグリシン．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｌ−シクロヘキシルグリシン；Ｌ−フェニルグリシン；Ｌ−プロパルギルグリシン；Ｌ−ノルバリン；Ｎ−α−アミノメチル−Ｌ−アラニン；Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；β−シクロプロピル−Ｌ−アラニン；（Ｎ−β−（２，４−ジニトロフェニル））−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−４−メチルトリチル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−アリルオキシカルボニル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−γ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−４−メチルトリチル）−Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−４−メチルトリチル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−アリルオキシカルボニル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；４，５−デヒドロ−Ｌ−ロイシン；シクロペンチル−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨ；シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｄ−アリルグリシン；Ｄ−ホモシクロヘキシルアラニン；Ｌ−１−ピレニルアラニン；Ｌ−２−アミノカプロン酸；Ｌ−アリルグリシン；Ｌ−ホモシクロヘキシルアラニン；およびＮ−（２−ヒドロキシ−４−メトキシ−Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ−ＯＨを含むがこれらに限定されない。
【００８２】
アミノ酸類似体は、アルギニンまたはリシンの類似体を含む。アルギニンおよびリシンのアミノ酸類似体の例は、シトルリン；Ｌ−２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸；Ｌ−２−アミノ−３−ウレイドプロピオン酸；Ｌ−シトルリン；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２−ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＯＨ；Ｎδ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−オルニチン；Ｎω−ニトロ−Ｄ−アルギニン；Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン；α−メチル−オルニチン；２，６−ジアミノヘプタン二酸；Ｌ−オルニチン；（Ｎδ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−オルニチン；（Ｎδ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−オルニチン；（Ｎδ−４−メチルトリチル）−Ｄ−オルニチン；（Ｎδ−４−メチルトリチル）−Ｌ−オルニチン；Ｄ−オルニチン；Ｌ−オルニチン；Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ（非対称）；Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ（対称）；Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２−ＯＨ．ＨＣｌ；Ｌｙｓ（Ｍｅ３）−ＯＨクロリド；Ｎω−ニトロ−Ｄ−アルギニン；およびＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンを含むがこれらに限定されない。
【００８３】
アミノ酸類似体は、アスパラギン酸またはグルタミン酸の類似体を含む。アスパラギン酸およびグルタミン酸のアミノ酸類似体の例は、α−メチル−Ｄ−アスパラギン酸；α−メチル−グルタミン酸；α−メチル−Ｌ−アスパラギン酸；γ−メチレン−グルタミン酸；（Ｎ−γ−エチル）−Ｌ−グルタミン；［Ｎ−α−（４−アミノベンゾイル）］−Ｌ−グルタミン酸；２，６−ジアミノピメリン酸；Ｌ−α−アミノスベリン酸；Ｄ−２−アミノアジピン酸；Ｄ−α−アミノスベリン酸；α−アミノピメリン酸；イミノ二酢酸；Ｌ−２−アミノアジピン酸；トレオ−β−メチル−アスパラギン酸；γ−カルボキシ−Ｄ−グルタミン酸γ，γ−ジ−ｔ−ブチルエステル；γ−カルボキシ−Ｌ−グルタミン酸γ，γ−ジ−ｔ−ブチルエステル；Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ；Ｌ−Ａｓｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；およびピログルタミン酸を含むがこれらに限定されない。
【００８４】
アミノ酸類似体は、システインおよびメチオニンの類似体を含む。システインおよびメチオニンのアミノ酸類似体の例は、Ｃｙｓ（ファルネシル）−ＯＨ、Ｃｙｓ（ファルネシル）−ＯＭｅ、α−メチル−メチオニン、Ｃｙｓ（２−ヒドロキシエチル）−ＯＨ、Ｃｙｓ（３−アミノプロピル）−ＯＨ、２−アミノ−４−（エチルチオ）酪酸、ブチオニン、ブチオニンスルホキシミン、エチオニン、メチオニンメチルスルホニウムクロリド、セレノメチオニン、システイン酸、［２−（４−ピリジル）エチル］−ＤＬ−ペニシラミン、［２−（４−ピリジル）エチル］−Ｌ−システイン、４−メトキシベンジル−Ｄ−ペニシラミン、４−メトキシベンジル−Ｌ−ペニシラミン、４−メチルベンジル−Ｄ−ペニシラミン、４−メチルベンジル−Ｌ−ペニシラミン、ベンジル−Ｄ−システイン、ベンジル−Ｌ−システイン、ベンジル−ＤＬ−ホモシステイン、カルバモイル−Ｌ−システイン、カルボキシエチル−Ｌ−システイン、カルボキシメチル−Ｌ−システイン、ジフェニルメチル−Ｌ−システイン、エチル−Ｌ−システイン、メチル−Ｌ−システイン、ｔ−ブチル−Ｄ−システイン、トリチル−Ｌ−ホモシステイン、トリチル−Ｄ−ペニシラミン、シスタチオニン、ホモシスチン、Ｌ−ホモシスチン、（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、セレノ−Ｌ−シスチン、シスタチオニン、Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ、およびアセトアミドメチル−Ｄ−ペニシラミンを含むがこれらに限定されない。
【００８５】
アミノ酸類似体は、フェニルアラニンおよびチロシンの類似体を含む。フェニルアラニンおよびチロシンのアミノ酸類似体の例は、β−メチル−フェニルアラニン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、α−メチル−３−メトキシ−ＤＬ−フェニルアラニン、α−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、α−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、２，４−ジクロロ−フェニルアラニン、２−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、２−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、２−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、２−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、２−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、２−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、２−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、２−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、２−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、２−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、２，４，５−トリヒドロキシ−フェニルアラニン、３，４，５−トリフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４，５−トリフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジメトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，５，３’−トリヨード−Ｌ−サイロニン、３，５−ジヨード−Ｄ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−サイロニン、３−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、３−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｌ−チロシン、３−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−フルオロ−チロシン、３−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３−メトキシ−Ｌ−チロシン、３−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、３−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、４−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、４−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−アミノ−Ｄ−フェニルアラニン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｄ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ビス（２−クロロエチル）アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ−��ェニルアラニン、４−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、サイロキシン、３，３−ジフェニルアラニン、サイロニン、エチル−チロシン、およびメチル−チロシンを含む。
【００８６】
アミノ酸類似体は、プロリンの類似体を含む。プロリンのアミノ酸類似体の例は、３，４−デヒドロ−プロリン、４−フルオロ−プロリン、ｃｉｓ−４−ヒドロキシ−プロリン、チアゾリジン−２−カルボン酸、およびｔｒａｎｓ−４−フルオロ−プロリンを含むがこれらに限定されない。
【００８７】
アミノ酸類似体は、セリンおよびトレオニンの類似体を含む。セリンおよびトレオニンのアミノ酸類似体の例は、３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸、２−アミノ−３−エトキシブタン酸、２−アミノ−３−メトキシブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−アミノ−３−ベンジルオキシプロピオン酸、２−アミノ−３−ベンジルオキシプロピオン酸、２−アミノ−３−エトキシプロピオン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、およびα−メチルセリンを含むがこれらに限定されない。
【００８８】
アミノ酸類似体は、トリプトファンの類似体を含む。トリプトファンのアミノ酸類似体の例は、α−メチル−トリプトファン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｌ−アラニン；１−メチル−トリプトファン；４−メチル−トリプトファン；５−ベンジルオキシ−トリプトファン；５−ブロモ−トリプトファン；５−クロロ−トリプトファン；５−フルオロ−トリプトファン；５−ヒドロキシ−トリプトファン；５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン；５−メトキシ−トリプトファン；５−メトキシ−Ｌ−トリプトファン；５−メチル−トリプトファン；６−ブロモ−トリプトファン；６−クロロ−Ｄ−トリプトファン；６−クロロ−トリプトファン；６−フルオロ−トリプトファン；６−メチル−トリプトファン；７−ベンジルオキシ−トリプトファン；７−ブロモ−トリプトファン；７−メチル−トリプトファン；Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ノルハルマン−３−カルボン酸；６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−１−カルボン酸；７−アザトリプトファン；Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ノルハルマン−３−カルボン酸；５−メトキシ−２−メチル−トリプトファン；および６−クロロ−Ｌ−トリプトファンを含むがこれらに限定されない。
【００８９】
一部の実施形態では、アミノ酸類似体は、ラセミ体である。一部の実施形態では、アミノ酸類似体のＤ異性体を使用する。一部の実施形態では、アミノ酸類似体のＬ異性体を使用する。他の実施形態では、アミノ酸類似体は、Ｒ立体配置内またはＳ立体配置内のキラル中心を含む。さらに他の実施形態では、β−アミノ酸類似体のアミノ基を、保護基、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、トシルなどで置換する。さらに他の実施形態では、β−アミノ酸類似体のカルボン酸官能基を、例えば、エステル誘導体として保護する。一部の実施形態では、アミノ酸類似体の塩を使用する。
【００９０】
「非必須」アミノ酸残基とは、その必須の生物学的活性または生化学的活性（例えば、受容体の結合または活性化）を消失させるかまたは実質的に変化させずに、ポリペプチドの野生型配列から変化させうる残基である。「必須」アミノ酸残基とは、ポリペプチドの野生型配列から変化させると、ポリペプチドの必須の生物学的活性または生化学的活性の消失または実質的な消失を結果としてもたらす残基である。
【００９１】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえるアミノ酸置換である。当技術分野では、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、Ｋ、Ｒ、Ｈ）を伴うアミノ酸、酸性側鎖（例えば、Ｄ、Ｅ）を伴うアミノ酸、非荷電の極性側鎖（例えば、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ）を伴うアミノ酸、非極性側鎖（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ）を伴うアミノ酸、ベータ−分枝状側鎖（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ）を伴うアミノ酸、および芳香族側鎖（例えば、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ）を伴うアミノ酸を含む。したがって、ポリペプチド内で予測される非必須アミノ酸残基を、例えば、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置きかえる。許容可能な置換の他の例は、等体積比に関する検討事項（例えば、メチオニンに対するノルロイシン）または他の特性（例えば、フェニルアラニンに対する２−チエニルアラニン、またはトリプトファンに対する６−Ｃｌ−トリプトファン）に基づく置換である。
【００９２】
Ｂ．詳細な説明
Ｗｎｔ３ａの分子クローニングおよび特徴付けについては、Saitohら、Biochem Biophys Res Commun、２００１年、２８４巻（５号）：１１６８〜７５頁により記載された。天然ヒトＷｎｔ３ａとは、３５２アミノ酸（配列番号１）からなる、脂質修飾された増殖因子であって、幹細胞の活性化またはそれらの自己再生の刺激において有効な増殖因子である。場合によって、その疎水性の性質に起因して、活性のＷｎｔ３ａポリペプチドまたは他のＷｎｔポリペプチドは、スケーラブルなレベルで、均一性まで精製することが困難である。本明細書の一態様では、Ｗｎｔポリペプチドを精製するための方法が記載される。場合によって、精製法により、ヒトＷｎｔポリペプチドの純度および収率が改善される。一部の実施形態では、精製されたＷｎｔポリペプチドを、治療レジメンの一部として使用する。一部の実施形態では、精製されたＷｎｔポリペプチドを、治療ポリペプチドとして使用する。
【００９３】
本明細書の別の個所で記載される通り、Ｗｎｔポリペプチドは、高度に保存された分泌型シグナル伝達分子のファミリーを形成する。Ｗｎｔポリペプチドは、ヒトＷｎｔポリペプチドなど、哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドでありうる。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１ポリペプチド配列、Ｗｎｔ２ポリペプチド配列、Ｗｎｔ２ｂ（またはＷｎｔ１３）ポリペプチド配列、Ｗｎｔ３ポリペプチド配列、Ｗｎｔ３ａポリペプチド配列、Ｗｎｔ４ポリペプチド配列、Ｗｎｔ５ａポリペプチド配列、Ｗｎｔ５ｂポリペプチド配列、Ｗｎｔ６ポリペプチド配列、Ｗｎｔ７ａポリペプチド配列、Ｗｎｔ７ｂポリペプチド配列、Ｗｎｔ８ａポリペプチド配列、Ｗｎｔ８ｂポリペプチド配列、Ｗｎｔ９ａ（Ｗｎｔ１４、またはＷｎｔ１４ｂ）ポリペプチド配列、Ｗｎｔ９ｂ（Ｗｎｔ１４ｂ、またはＷｎｔ１５）ポリペプチド配列、Ｗｎｔ１０ａポリペプチド配列、Ｗｎｔ１０ｂ（またはＷｎｔ１２）ポリペプチド配列、Ｗｎｔ１１ポリペプチド配列、Ｗｎｔ−１６ａポリペプチド配列、もしくはＷｎｔ−１６ｂポリペプチド配列、またはこれらの機能的に活性な変異体を含む。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチド、およびこれらの機能的に活性なＷｎｔ変異体からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドまたはその機能的に活性な変異体である。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５ａポリペプチドまたはその機能的に活性な変異体である。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドまたはその機能的に活性な変異体である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、ヒトＷｎｔ３ａポリペプチドまたはその機能的に活性な変異体である。場合によって、機能的に活性な変異体のＷｎｔ３ａポリペプチドの配列同一性は、ヒトＷｎｔ３ａポリペプチド配列（例えば、配列番号１）など、天然のＷｎｔ３ａポリペプチド配列に対して、少なくとも、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％である。場合によって、機能的に活性な変異体のＷｎｔ３ａポリペプチドの配列同一性は、ヒトＷｎｔ３ａポリペプチド配列（例えば、配列番号１）など、天然のＷｎｔ３ａポリペプチド配列に対して、多くとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％である。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１に示されるか、またはＷｎｔ３ａポリペプチドは、配列番号２の核酸配列によりコードされる。
【００９４】
場合によって、本明細書で記載される精製スキームは、単純であり、廉価である。場合によって、本明細書で記載される精製スキームは、Ｗｎｔポリペプチドの機能的に活性な形態の、高純度による精製を可能とする。一部の実施形態では、本明細書で記載される精製法は、Ｗｎｔポリペプチドの、組換え宿主細胞の培養培地からの精製を可能とする。場合によって、組換え宿主細胞または発現細胞系は、原核宿主細胞もしくは原核発現細胞系、酵母宿主細胞もしくは酵母発現細胞系、昆虫宿主細胞もしくは昆虫発現細胞系、または哺乳動物宿主細胞もしくは哺乳動物発現細胞系である。
【００９５】
一部の実施形態では、組換え宿主細胞または発現細胞系は、酵母宿主細胞または酵母発現細胞系である。例示的な酵母宿主細胞は、ＧＳ１１５、ＫＭ７１Ｈ、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６８Ｈ、およびＸ−３３など、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの酵母株；ならびにＩＮＶＳｃ１など、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの酵母株を含むがこれらに限定されない。
【００９６】
一部の実施形態では、組換え宿主細胞または発現細胞系は、昆虫宿主細胞または昆虫発現細胞系である。例示的な昆虫細胞系は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属Ｓ２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞、およびｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）細胞を含むがこれらに限定されない。
【００９７】
一部の実施形態では、組換え宿主細胞または発現細胞系は、哺乳動物宿主細胞または哺乳動物発現細胞系である。場合によって、哺乳動物細胞系は、安定的な細胞系、または目的の遺伝子素材を、それ自体のゲノムに組み込み、幾世代にもわたる細胞分裂の後に、遺伝子素材の産物を発現させる能力を有する細胞系である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞系は、医薬品の製造管理および品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）に適合性の細胞系である。例示的な哺乳動物細胞系は、２９３Ａ細胞系、２９３ＦＴ細胞系、２９３Ｆ細胞、２９３Ｈ細胞、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）２９３細胞系、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−２９３細胞系、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−３Ｔ３細胞系、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＢＨＫ細胞系、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＣＨＯ細胞系、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＣＶ−１細胞系、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−Ｊｕｒｋａｔ細胞系、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＧｒｉｐＴｉｔｅ（商標）２９３ＭＳＲ細胞系、ＧＳ−ＣＨＯ細胞系、ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞、Ｔ−ＲＥｘ（商標）Ｊｕｒｋａｔ細胞系、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞系、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ細胞系、およびＴ−ＲＥｘ（商標）−ＨｅＬａ細胞系を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、哺乳動物細胞系は、ＣＨＯ細胞系である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞系は、ＣＨＯ−Ｓ細胞系である。本明細書で使用される「ＣＨＯ細胞」または「ＣＨＯ細胞系」とは、異なる種類のＣＨＯ細胞およびＣＨＯ細胞系を包摂する総称的な用語である。
【００９８】
一部の実施形態では、哺乳動物宿主細胞を、液体懸濁培養物として、軟寒天中で、軟寒天の上部において、または単層として増殖させる。一部の実施形態では、ＣＨＯ細胞を、液体懸濁培養物として、軟寒天中で、軟寒天の上部において、または単層として増殖させる。一部の実施形態では、ＣＨＯ細胞を、液体懸濁培養物中で培養する。場合によって、培養培地は、血清を含有する。血清の非限定的な例は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＨｙＣｌｏｎｅ  ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅ  ＩＩおよびＨｙＣｌｏｎｅ  ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅ  ＩＩＩ、鉄補充ウシ胎仔血清（ＩＣＳ）、ならびにヒト血小板溶解物を含む。一部の実施形態では、血清は、ＦＢＳである。一部の実施形態では、培地中に存在するＦＢＳは、多くとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、またはこれ未満である。一部の実施形態では、培地中に存在するＦＢＳは、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、またはこれを超える。
【００９９】
一部の実施形態では、血清（例えば、ＦＢＳ）は、発現の誘導、およびＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３ａポリペプチド）の、培養培地への分泌に必要とされる。一部の実施形態では、血清は、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３ａ内のＳｅｒ２０９などの残基）上の脂質修飾に使用される１または複数の必須因子を供給する。一部の実施形態では、血清は、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３ａ）の、小胞体（ＥＲ）から、ゴルジ体へ、次いで、細胞膜への輸送に使用される、１または複数のシャペロンタンパク質および親油性分子を供給する。
【０１００】
一部の実施形態では、脂質成分を除去するように血清を改変する。次いで、場合によって、規定されたセットの脂質を、改変された血清に導入する。場合によって、木炭などの剥離剤を使用して、非極性の親油性材料（例えば、ウイルス、増殖因子、およびホルモン）を、血清から除去する。場合によって、脂質補充物質を、改変された血清に導入する。脂質補充物質の非限定的な例は、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌｉｐｏｇｒｏ（登録商標）（Ｒｏｃｋｙ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、およびＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞）を、無血清培地中で培養する。無血清培地の非限定的な例は、ＣＤ  ＣＨＯ培地、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ（商標）培地、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ
ＩＩ（任意選択で、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む）、ＣＤ  ２９３  ＡＧＴ（商標）培地、アデノウイルス発現培地（ＡＥＭ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５  ＰＦ  ＣＨＯ無血清培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯ−２動物成分非含有培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯ−３培地、およびＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤＨＯ  ＤＨＦＲ−動物成分非含有培地を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、無血清培地は、１または複数のさらなる補充物質を含有する。一部の実施形態では、さらなる補充物質は、血清である。場合によって、血清は、ＦＢＳである。場合によって、無血清培地中に存在するＦＢＳは、多くとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、またはこれ未満である。場合によって、無血清培地中に存在するＦＢＳは、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、またはこれを超える。
【０１０３】
一部の実施形態では、さらなる補充物質は、脂質補充物質である。脂質補充物質の非限定的な例は、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌｉｐｏｇｒｏ（登録商標）（Ｒｏｃｋｙ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、およびＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む。一部の実施形態では、無血清培地は、脂質補充物質を含有する。
【０１０４】
一部の実施形態では、さらなる補充物質は、血清代替物である。一部の実施形態では、血清代替物は、ＥＸＣＹＴＥ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＥＸ−ＣＹＴＥ＋ヒト血清アルブミン＋ＡＯＦ  ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、およびセレニウム；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ヒト血清アルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ヘパリン硫酸（Ｓｉｇｍａ）、本明細書の別の個所で記載される、ＤＭＰＣおよびコレステロール、Ｃｅｌｌ−ｅｓｓ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）などであるがこれらに限定されない脂質から選択される。場合によって、血清代替物の存在下におけるＷｎｔポリペプチドは、馴化培地に分泌される。場合によって、血清代替物の存在下におけるＷｎｔポリペプチドは、馴化培地に分泌されない。場合によって、血清代替物の存在下におけるＷｎｔ３ａポリペプチドは、馴化培地に分泌される。場合によって、血清代替物の存在下におけるＷｎｔ３ａポリペプチドは、馴化培地に分泌されない。
【０１０５】
一部の実施形態では、無血清培地条件を忍容する発現ベクターを使用する。場合によって、発現ベクターは、高コピー数の所望の転写物および目的のポリペプチドの分泌をもたらす。場合によって、発現ベクターは、ｃＧＭＰに適合する哺乳動物細胞系に適合性である。哺乳動物発現ベクターの非限定的な例は、ｐＯｐｔｉｖｅｃベクター、ｐＴａｒｇｅＴ（商標）ベクター、ＢａｃＭａｍ  ｐＣＭＶ−Ｄｅｓｔベクター、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）コアシステム、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）シリーズのベクター、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ベクター、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター、ｐＣＭＶＴＮＴ（商標）ベクター、およびｐｃＤＮＡ（商標）４／ＴＯベクターを含む。一部の実施形態では、発現ベクターは、ｐＯｐｔｉｖｅｃベクターおよびｐＴａｒｇｅＴ（商標）ベクターから選択される。ｐＯｐｔｉｖｅｃベクターとは、哺乳動物への分泌シグナルと、ＣＭＶプロモーターの下流にある目的の遺伝子とを含有する遺伝子の迅速なクローニングを可能とする、ＴＯＰＯ（登録商標）適応型バイシストロニックプラスミドである。ジヒドロ葉酸レダクターゼ選択マーカーにより、迅速な選択が可能となる。場合によって、このベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクションのために使用する。場合によって、ｐＴａｒｇｅＴ（商標）ベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクション、およびＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３ａ）を発現させる安定的な細胞系の創出のために使用する。
【０１０６】
一部の実施形態では、培養条件の酸性化を使用して、Ｗｎｔ分泌の一助とする。場合によって、培養条件の酸性化を使用して、Ｗｎｔ３ａ分泌の一助とする。場合によって、酸性化により、小胞内の酸性化を模倣する。場合によって、酸性化は、細胞質の酸性化である。場合によって、酸性化は、馴化培地中で増殖する細胞により分泌される酸など、自然発生するか、または、例えば、酢酸などの酸の添加など、人工的に発生する。場合によって、酸性化は、Ｗｎｔポリペプチドの分泌の一助となる。場合によって、酸性化は、Ｗｎｔ３ａポリペプチドの分泌の一助となる。
【０１０７】
一部の実施形態では、酵母細胞内、昆虫細胞内、または哺乳動物細胞内のＷｎｔポリペプチドの発現法は、当技術分野で周知のプロトコールに従う。場合によって、Ｗｎｔポリペプチドは、哺乳動物細胞内で発現させる。一部の実施形態では、転写誘導剤を使用して、Ｗｎｔポリペプチドの発現を誘導する。場合によって、転写誘導剤は、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、およびクメルマイシンを含む。場合によって、発現は構成的であるか、または、ポリペプチドは、誘導剤を伴わずに発現させる。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、培地に分泌させる。場合によって、馴化培地を採取し、さらなる薬剤を添加して、Ｗｎｔポリペプチドを可溶化する。場合によって、さらなる薬剤は、界面活性剤である。場合によって、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または双性イオン性界面活性剤である。例示的な界面活性剤は、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−（［３−コラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（nonyl  phenoxypolethoxylethanol）（ＮＰ−４０）、オクチルグ
ルコシド、オクチルチオグルコシド、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ２０、およびＴｗｅｅｎ８０を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、界面活性剤は、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。一部の実施形態では、界面活性剤は、ＣＨＡＰＳである。ＣＨＡＰＳとは、膜タンパク質の可溶化に有用な双性イオン性界面活性剤である。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドはまた、グリコシル化およびパルミトイル化を介して翻訳後修飾もなされる。
【０１０８】
パルミトイル化とは、パルミチン酸などの脂肪酸の、システイン残基、セリン残基、およびトレオニン残基への共有結合的接合である。場合によって、パルミトイル化は、タンパク質の疎水性を増強し、それらの膜との会合に寄与する。例えば、Ｎｕｓｓｅらは、マウスＷｎｔ３ａタンパク質を、保存されたシステイン残基（Ｃ７７）においてＳ−パルミトイル化させ（Willertら、Nature、２００３年、４２３巻：４４８〜４５２頁）、パル
ミトイル化させたＣｙｓ７７をアラニン（Ｃ７７Ａ）で置換した、マウスＷｎｔ３ａタンパク質の突然変異体形態が、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させる能力の減殺を示すが、培養培地に正常に分泌されることについて報告した。さらに、研究は、Ｃｙｓ７７残基のパルミトイル化が、生物学的活性に重要であることも示した。
【０１０９】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドを、システイン残基、セリン残基、および／またはトレオニン残基においてパルミトイル化させる。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、システイン残基、セリン残基、および／またはトレオニン残基においてパルミトイル化させる。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、配列番号１に示される、Ｃ７７、Ｓ１３９、Ｓ１８１、Ｓ２０９、またはＳ２１１においてパルミトイル化させる。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、配列番号１に示される、Ｃ７７、Ｓ１３９、Ｓ１８１、Ｓ２０９、またはＳ２１１から選択されるアミノ酸位置のうちの１または複数においてパルミトイル化させる。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、配列番号１に示されるＣ７７においてパルミトイル化させる。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、配列番号１に示されるＳ２０９においてパルミトイル化させる。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、配列番号１に示されるＣ７７およびＳ２０９においてパルミトイル化させる。場合によって、Ｗｎｔ３ａタンパク質を、配列番号１に示されるＣ７７においてパルミトイル化させない。場合によって、Ｗｎｔ３ａタンパク質を、配列番号１に示されるＳ２０９においてパルミトイル化させるが、配列番号１に示されるＣ７７においてはパルミトイル化させない。
【０１１０】
一部の実施形態では、パルミトイル化させた残基を含むＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａ天然ポリペプチド（例えば、ヒトＷｎｔ３ａ）の、機能的に活性な変異体など、機能的に活性な変異体ポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａ機能的活性変異体ポリペプチドは、配列番号１に示される、Ｃ７７、Ｓ１３９、Ｓ１８１、Ｓ２０９、およびＳ２１１から選択される、パルミトイル化させた残基を含む。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａ機能的活性変異体ポリペプチドは、配列番号１に示されるＳ１３９において、パルミトイル化させた残基を有する。一部の実施形態では、機能的に活性な変異体Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、配列番号１に示されるＳ１８１において、パルミトイル化させた残基を有する。一部の実施形態では、機能的に活性な変異体Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、配列番号１に示されるＳ２０９において、パルミトイル化させた残基を有する。一部の実施形態では、機能的に活性な変異体Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、配列番号１に示されるＳ２１１において、パルミトイル化させた残基を有する。一部の実施形態では、機能的に活性な変異体Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、配列番号１に示されるＳ２０９および他の１つの残基において、パルミトイル化させた残基を有する。一部の実施形態では、他の１つの残基は、Ｃ７７を含まない。一部の実施形態では、機能的に活性な変異体Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、配列番号１に示されるＳ２０９においてパルミトイル化させるが、配列番号１に示されるＣ７７においてはパルミトイル化させない。
【０１１１】
一部の実施形態では、本明細書で記載される精製スキームは、Ｗｎｔ１ポリペプチド、Ｗｎｔ２ポリペプチド、Ｗｎｔ２ｂ（またはＷｎｔ１３）ポリペプチド、Ｗｎｔ３ポリペプチド、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ４ポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ｂポリペプチド、Ｗｎｔ６ポリペプチド、Ｗｎｔ７ａポリペプチド、Ｗｎｔ７ｂポリペプチド、Ｗｎｔ８ａポリペプチド、Ｗｎｔ８ｂポリペプチド、Ｗｎｔ９ａ（Ｗｎｔ１４、またはＷｎｔ１４ｂ）ポリペプチド、Ｗｎｔ９ｂ（Ｗｎｔ１４ｂ、またはＷｎｔ１５）ポリペプチド、Ｗｎｔ１０ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０ｂ（またはＷｎｔ１２）ポリペプチド、Ｗｎｔ１１ポリペプチド、Ｗｎｔ−１６ａポリペプチド、およびＷｎｔ−１６ｂポリペプチドから選択される、Ｗｎｔポリペプチドに関する。場合によって、本明細書で記載される精製スキームは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドに関する。場合によって、本明細書で記載される精製スキームは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドに関する。場合によって、本明細書で記載される精製スキームは、Ｗｎｔ５ａポリペプチドに関する。場合によって、本明細書で記載される精製スキームは、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドに関する。
【０１１２】
一部の実施形態では、本明細書で記載される精製スキームは、配列番号１に示されるアミノ酸７７位のシステインに対応するシステイン残基、または配列番号１に示されるアミノ酸２０９位のセリンに対応するセリン残基におけるパルミトイル化を有する、Ｗｎｔ３ａポリペプチドに関する。一部の実施形態では、本明細書で記載される精製スキームは、配列番号１に示されるアミノ酸７７位のシステインに対応するシステイン残基におけるパルミトイル化を有する、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを選択する。一部の実施形態では、本明細書で記載される精製スキームは、配列番号１に示されるアミノ酸２０９位のセリンに対応するセリン残基におけるパルミトイル化を有する、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを選択する。一部の実施形態では、本明細書で記載される精製スキームは、配列番号１に示されるアミノ酸２０９位のセリンに対応するセリン残基、および少なくとも１つの他のパルミトイル化させた残基におけるパルミトイル化を有する、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを選択する。一部の実施形態では、少なくとも１つの他のパルミトイル化させた残基は、配列番号１に示されるＣ７７ではない。一部の実施形態では、本明細書で記載される精製スキームは、配列番号１に示されるアミノ酸７７位のシステインに対応するシステイン残基におけるパルミトイル化を有する、Ｗｎｔ３ａポリペプチドを選択しない。
【０１１３】
一部の実施形態では、本明細書で記載される精製スキームは、分離ステップを利用する。一部の実施形態では、分離ステップは、イオン交換精製ステップ、疎水性精製ステップ、またはアフィニティー精製ステップである。場合によって、分離ステップは、イオン交換精製ステップである。場合によって、イオン交換精製ステップは、１または複数のスルホン化多環芳香族化合物を固定化したビーズを利用する。場合によって、イオン交換精製ステップは、１または複数のスルホン化多環芳香族化合物を固定化したカラムを利用する。スルホン化多環芳香族化合物の非限定的な例は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ  Ｆ３ＧＡである。場合によって、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ  Ｆ３ＧＡは、トリアジニル色素である。場合によって、イオン交換精製ステップでは、トリアジニル色素を固定化したビーズおよび／またはカラムを使用する。Ｃｉｂａｃｒｏｎ  ｂｌｕｅ  Ｆ３ＧＡを固定化したクロマトグラフィーカラムの非限定的な例は、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムである。
【０１１４】
一部の実施形態では、精製は、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したビーズの使用を伴うバッチ方式で実行する。一般に、Ｗｎｔポリペプチドは、低濃度の塩を含有する結合緩衝液中で、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したビーズに結合させる。高濃度の塩は、タンパク質とビーズとの間の非共有結合的イオン性相互作用を不安定化させ、これにより、Ｗｎｔポリペプチドの溶出を可能とする。一部の実施形態では、結合緩衝液中で使用される塩の濃度は、多くとも０、０．０１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ｍＭ、またはこれ未満である。一部の実施形態では、結合緩衝液中で使用される塩の濃度は、少なくとも０、０．０１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ｍＭ、またはこれを超える。一部の実施形態では、１または複数の洗浄緩衝液を使用して、結合しなかった不純物を除去する。一部の実施形態では、多くとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれを超える洗浄ステップを使用する。一部の実施形態では、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれ未満の洗浄ステップを使用する。一部の実施形態では、洗浄緩衝液中で使用される塩の濃度は、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、またはこれを超える。一部の実施形態では、洗浄緩衝液中で使用される塩の濃度は、多くとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、またはこれ未満である。一部の実施形態では、１または複数の溶出ステップが続く。一部の実施形態では、溶出緩衝液中の塩の濃度は、少なくとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００ｍＭ、またはこれを超える。一部の実施形態では、溶出緩衝液中の塩の濃度は、多くとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００ｍＭ、またはこれ未満である。例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなどを含む。一部の実施形態ではまた、界面活性剤も、結合緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液に調合する。一部の実施形態では、界面活性剤は、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。一部の実施形態では、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の百分率は、少なくとも０．０１％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、またはこれを超える。一部の実施形態では、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の百分率は、多くとも０．０１％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、またはこれ未満である。場合によって、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）などの緩衝液成分を使用する。場合によって、緩衝液のｐＨは、少なくとも４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、またはこれを超える。場合によって、緩衝液のｐＨは、多くとも４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、またはこれ未満である。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。
【０１１５】
一部の実施形態では、精製は、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したカラムを使用して実行する。一般に、Ｗｎｔポリペプチドは、低濃度の塩を含有する結合緩衝液中で、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したカラムに結合させる。高濃度の塩は、ポリペプチドとカラムビーズとの間の非共有結合的イオン性相互作用を不安定化させ、これにより、Ｗｎｔポリペプチドの溶出を可能とする。一部の実施形態では、結合緩衝液中で使用される塩の濃度は、多くとも０、０．０１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ｍＭ、またはこれ未満である。一部の実施形態では、結合緩衝液中で使用される塩の濃度は、少なくとも０、０．０１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ｍＭ、またはこれを超える。一部の実施形態では、１または複数の洗浄緩衝液を使用して、結合しなかった不純物を除去する。一部の実施形態では、多くとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれを超える洗浄ステップを使用する。一部の実施形態では、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれ未満の洗浄ステップを使用する。一部の実施形態では、洗浄緩衝液中で使用される塩の濃度は、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、またはこれを超える。一部の実施形態では、洗浄緩衝液中で使用される塩の濃度は、多くとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、またはこれ未満である。一部の実施形態では、１または複数の溶出ステップが続く。一部の実施形態では、溶出緩衝液中の塩の濃度は、少なくとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００ｍＭ、またはこれを超える。一部の実施形態では、溶出緩衝液中の塩の濃度は、多くとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００ｍＭ、またはこれ未満である。例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなどを含む。一部の実施形態ではまた、界面活性剤も、結合緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液に調合する。一部の実施形態では、界面活性剤は、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。一部の実施形態では、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の百分率は、少なくとも０．０１％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、またはこれを超える。一部の実施形態では、ＣＨＡＰＳまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の百分率は、多くとも０．０１％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、またはこれ未満である。場合によって、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンＨＣｌ（トリス−ＨＣｌ）、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）などの緩衝液成分を使用する。場合によって、緩衝液のｐＨは、少なくとも４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、またはこれを超える。場合によって、緩衝液のｐＨは、多くとも４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、またはこれ未満である。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。
【０１１６】
一部の実施形態では、分離ステップは、疎水性精製ステップである。一部の実施形態では、疎水性精製ステップでは、疎水性リガンドを固定化したビーズ、または疎水性リガンドを固定化したカラムを利用する。リガンドの非限定的な例は、ブチル、オクチル、フェニル、プロテインＡなどを含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、分離ステップは、アフィニティー精製ステップである。一部の実施形態では、アフィニティー精製ステップでは、アフィニティーリガンドを固定化したビーズ、またはアフィニティーリガンドを固定化したカラムを利用する。例示的なリガンドは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体（Ｆｚｄ）またはその断片、および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）またはその断片を含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、溶出させたＷｎｔポリペプチドの濃度および収率は、さらなる精製ステップにかける前に測定する。一部の実施形態では、収率は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはこれを超える。一部の実施形態では、収率は、多くとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはこれ未満である。一部の実施形態では、純度は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはこれを超える。一部の実施形態では、純度は、多くとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはこれ未満である。
【０１１９】
一部の実施形態では、精製されたＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、配列番号１に示されるセリン２０９に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａポリペプチドを、分離ステップにより精製する。一部の実施形態では、配列番号１に示されるシステイン７７に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａポリペプチドを、分離ステップにより精製する。一部の実施形態では、配列番号１に示されるシステイン７７に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化、および配列番号１に示されるセリン２０９に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａポリペプチドを、分離ステップにより精製する。一部の実施形態では、配列番号１に示されるセリン２０９に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化、および少なくとも１つの他のアミノ酸残基におけるパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａポリペプチドを、分離ステップにより精製する。一部の実施形態では、少なくとも１つの他のアミノ酸残基は、配列番号１に示されるＣ７７ではない。
【０１２０】
一部の実施形態では、セリン２０９のパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａ分子種の、溶出させた生成物中の濃度は、システイン７７のパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａ分子種より大きい。一部の実施形態では、２つのＷｎｔ３ａ分子種の濃度は、比などの値により規定される。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａのセリン２０９分子種の、Ｗｎｔ３ａのシステイン７７分子種に対する比は、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約９９：１、または約１００：０の間である。一部の実施形態では、セリン２０９のパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａ分子種の、溶出させた生成物中の濃度は、システイン７７およびセリン２０９のパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａ分子種より大きい。一部の実施形態では、２つのＷｎｔ３ａ分子種の濃度は、比などの値により規定される。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａのセリン２０９分子種の、Ｗｎｔ３ａのシステイン７７／セリン２０９分子種に対する比は、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約９９：１、または約１００：０の間である。
【０１２１】
一部の実施形態では、さらなる精製ステップは、あらかじめ作製されたリポソームを利用するステップである。一部の実施形態では、リポソームは、血清（ＦＢＳ）を、ポリペプチド調製物から消失させる。一部の実施形態では、この後者のステップでは、Ｗｎｔポリペプチドの疎水性を利用し、例えば、その後のゲル濾過精製ステップおよび／またはクロマトグラフィー精製ステップ（例えば、ヘパリン硫酸固定化カラム）など、さらなる精製ステップまたはその後の精製ステップに対する必要をなくす。
【０１２２】
一部の実施形態では、リポソームは、当技術分野で周知の方法を使用して作製する。リポソームとは、ラメラ相の脂質二重層および水性コアを構成する、人工的に調製された球形の小胞である。多重膜小胞（ＭＬＶ）、小型単層リポソーム小胞（ＳＵＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）、および渦巻き型小胞など、複数種類のリポソームが存在する。場合によって、リポソームは、リン脂質により形成される。一部の実施形態では、リン脂質を、ジアシルグリセリド構造を伴うリン脂質、またはホスホスフィンゴ脂質に由来するリン脂質に分ける。一部の実施形態では、ジアシルグリセリド構造は、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ならびにホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトールビスリン酸（ＰＩＰ２）、およびホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）などのホスホイノシチドを含む。一部の実施形態では、ホスホスフィンゴ脂質は、セラミドホスホリルコリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、およびセラミドホスホリル脂質を含む。一部の実施形態では、リポソームは、ホスファチジルコリンから形成される。
【０１２３】
一部の実施形態では、脂質はまた、その相転移温度（Ｔｍ）、または液晶相とゲル相との間の界面温度にも基づいて選択される。一部の実施形態では、Ｔｍは、ヘッド基の分子種、炭化水素（hydrocarbone）の長さ、不飽和度、および電荷により統御される。例えば、短鎖の脂質（８、１０、または１２の尾部炭素鎖長を含有する脂質）は、４℃を下回る温度では、液晶相を有する。しかし、これらの短鎖の炭素による脂質から製造されたリポソームは、細胞膜を溶解させるため、細胞に対して毒性である。より長い炭素鎖による脂質から製造されたリポソームは、細胞に対して毒性でないが、それらの転移温度は高い。例えば、尾部炭素長が１６である、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）のＴｍは、約４１℃である。一部の実施形態では、本明細書で使用される脂質のＴｍは、約１０℃〜約３７℃、１５℃〜約３０℃、１８℃〜約２７℃、または２１℃〜約２５℃の間である。一部の実施形態では、本明細書で使用される脂質のＴｍは、少なくとも２２℃、２３℃、２４℃、またはこれを超える。一部の実施形態では、本明細書で使用される脂質のＴｍは、多くとも２２℃、２３℃、２４℃、またはこれ未満である。一部の実施形態では、本明細書で使用される脂質の尾部炭素の長さは、少なくとも約１２、１３、１４、またはこれを超える。一部の実施形態では、本明細書で使用される脂質の尾部炭素の長さは、多くとも約１２、１３、１４、またはこれ未満である。
【０１２４】
一部の実施形態では、脂質を、リポソームの正味の電荷に基づき、さらに選択する。一部の実施形態では、ｐＨ約４．０〜約１０．０、約５．０〜約９．０、約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、または約７．２〜約７．６の間でのリポソームの正味の電荷は０である。一部の実施形態では、ｐＨ約７．３、約７．４、または約７．５でのリポソームの正味の電荷は０である。一部の実施形態では、ｐＨ約４．０〜約１０．０、約５．０〜約９．０、約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、または約７．２〜約７．６の間でのリポソームの正味の電荷は正である。一部の実施形態では、ｐＨ約７．３、約７．４、または約７．５でのリポソームの正味の電荷は正である。一部の実施形態では、ｐＨ約４．０〜約１０．０、約５．０〜約９．０、約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、または約７．２〜約７．６の間での、リポソームの正味の電荷は負である。一部の実施形態では、ｐＨ約７．３、約７．４、または約７．５でのリポソームの正味の電荷は負である。
【０１２５】
一部の実施形態では、脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１−テトラデカノイル−２−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＭＰＳ）、および１，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＧ）から選択される。一部の実施形態では、脂質は、ＤＭＰＣである。
【０１２６】
一部の実施形態では、さらなる脂質を、リポソームに作製する。一部の実施形態では、さらなる脂質は、コレステロールである。場合によって、ＤＭＰＣおよびコレステロールなど、ホスファチジルコリンの濃度は、比などの値により規定される。一部の実施形態では、ＤＭＰＣおよびコレステロールなどのホスファチジルコリンの濃度の比は、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約９９：１、または約１００：０の間である。一部の実施形態では、ＤＭＰＣおよびコレステロールなどのホスファチジルコリンの濃度の比は、約９０：１０である。一部の実施形態では、濃度単位は、モルである。一部の実施形態では、比は、モル：モルである。
【０１２７】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドを、少なくとも約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５ｎｇ／μＬ、またはこれを超える濃度で、リポソームと共に再構成する。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドを、多くとも約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５ｎｇ／μＬ、またはこれ未満の濃度で、リポソームと共に再構成する。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。
【０１２８】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドを、少なくとも約０．１：５０、０．５：３０、１：２０、または１：１４、またはこれを超える、Ｗｎｔポリペプチド対リポソームの比で、リポソームと共に再構成する。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドを、多くとも約０．１：５０、０．５：３０、１：２０、または１：１４、またはこれ未満の、Ｗｎｔポリペプチド対リポソームの比で、リポソームと共に再構成する。場合によって、比は、重量対重量比である。場合によって、Ｗｎｔポリペプチドの単位は、ナノグラム単位である。
【０１２９】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドを、リポソームと共に再構成する温度は、少なくとも約１５℃〜約３７℃、約１８℃〜約３３℃、または約２０℃〜約２８℃の間である。一部の実施形態では、温度は、少なくとも約２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、またはこれを超える。一部の実施形態では、温度は、多くとも約２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、またはこれ未満である。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。
【０１３０】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソーム膜に取り込まれている。場合によって、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソーム膜から脂質膜の表面に突出する。場合によって、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソームの水性コアに組み込まれていない。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、リポソーム膜に取り込まれている。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、リポソーム膜から脂質膜の表面に突出する。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、リポソームの水性コアに組み込まれていない。
【０１３１】
一部の実施形態では、リポソームと共に再構成されたＷｎｔポリペプチドを、リポソームＷｎｔポリペプチドまたはＬ−Ｗｎｔと称する。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、リポソームと共に再構成されたＷｎｔ３ａポリペプチドを、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドまたはＬ−Ｗｎｔ３ａと称する。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５ａポリペプチドである。一部の実施形態では、リポソームと共に再構成されたＷｎｔ５ａポリペプチドを、リポソームＷｎｔ５ａポリペプチドまたはＬ−Ｗｎｔ５ａと称する。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、リポソームと共に再構成されたＷｎｔ１０ｂポリペプチドを、リポソームＷｎｔ１０ｂポリペプチドまたはＬ−Ｗｎｔ１０ｂと称する。
【０１３２】
一部の実施形態では、Ｌ−Ｗｎｔに遠心分離ステップを施し、次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液中に懸濁させる。場合によって、Ｌ−Ｗｎｔは、窒素下で保存する。場合によって、Ｌ−Ｗｎｔは、窒素下で、活性の実質的な喪失を伴わずに安定である。場合によって、Ｌ−Ｗｎｔは、約１℃〜約８℃の間の温度で保存する。場合によって、Ｌ−Ｗｎｔは、少なくとも約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、またはこれを超える温度で、活性の実質的な喪失を伴わずに安定である。場合によって、Ｌ−Ｗｎｔは、多くとも約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、またはこれ未満の温度で、活性の実質的な喪失を伴わずに安定である。一部の実施形態では、Ｌ−Ｗｎｔは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、３５６、４００、７００、１０００日間、またはこれを超えて、活性の実質的な喪失を伴わずに安定である。一部の実施形態では、Ｌ−Ｗｎｔは、多くとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、３５６、４００、７００、１０００日間、またはこれ未満にわたり、活性の実質的な喪失を伴わずに安定である。
【０１３３】
一部の実施形態では、Ｌ−Ｗｎｔ３ａに遠心分離ステップを施し、次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液中に懸濁させる。場合によって、Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、窒素下で保存する。場合によって、Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、窒素下で、活性の実質的な喪失を伴わずに安定である。場合によって、Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、約１℃〜約８℃の間の温度で保存する。場合によって、Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、少なくとも約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、またはこれを超える温度で、活性の実質的な喪失を伴わずに安定である。場合によって、Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、多くとも約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、またはこれ未満の温度で、活性の実質的な喪失を伴わずに安定である。一部の実施形態では、Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、３５６、４００、７００、１０００日間、またはこれを超えて、活性の実質的な喪失を伴わずに安定である。一部の実施形態では、Ｌ−Ｗｎｔ３ａは、多くとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、３５６、４００、７００、１０００日間、またはこれ未満にわたり、活性の実質的な喪失を伴わずに安定である。
【０１３４】
場合によって、「活性の実質的な喪失を伴わずに」という用語は、リポソームＷｎｔポリペプチドの機能的活性が、リポソームの非存在下における、対応する天然Ｗｎｔポリペプチドの活性に近いことを指す。場合によって、リポソームＷｎｔポリペプチドの機能的活性は、天然Ｗｎｔポリペプチドの機能的活性と比較して、少なくとも約１００％、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、またはこれを超える。場合によって、リポソームＷｎｔポリペプチドの機能的活性は、天然Ｗｎｔポリペプチドの機能的活性と比較して、多くとも約１００％、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、またはこれ未満である。場合によって、Ｗｎｔポリペプチドの機能的活性は、例えば、質量分析、本明細書の別の個所で記載されるバイオマーカー解析と関連するアッセイ、腎被膜下移植術などの移植術、脊椎固定術、ＡＬＰ染色、ＴＲＡＰ染色、およびＴＵＮＥＬ染色、免疫組織化学、ならびに移植片の成長についてのＭｉｃｒｏ−ＣＴ解析および定量などの、アッセイを使用して検出する。
【０１３５】
場合によって、「安定な」という用語は、フォールディング状態にあり、アンフォールディングされていないまたは分解されていないＷｎｔポリペプチドを指す。場合によって、「安定な」という用語はまた、活性の実質的な喪失を伴わずに、機能的活性を保持するＷｎｔポリペプチドも指す。場合によって、安定性を決定するのに使用されるアッセイは、上記で記載したアッセイなど、Ｗｎｔポリペプチドの活性を確立するアッセイであり、また、マウスＬＳＬ細胞ベースのアッセイなど、ＬＳＬ細胞ベースのアッセイなども含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、本明細書で記載される精製法は、Ｗｎｔポリペプチドの疎水性ドメインを採用し、Ｗｎｔポリペプチドのコンフォメーション、または機能的活性に干渉しない。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドの疎水性ドメインは、配列番号１に示されるセリン２０９に対応するセリン残基上のパルミトイル化を含有する。
【０１３７】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドのリポソームに対するアフィニティーは、Ｗｎｔポリペプチドの結合パートナーより小さい。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ｂポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａポリペプチドのリポソームに対するアフィニティーは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドの結合パートナーより小さい。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａポリペプチドの結合パートナーは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、その断片、ＬＲＰ６タンパク質、およびその断片を含む。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａのリポソームに対するアフィニティーは、約４ｎＭ〜約５０ｎＭ、および約４．５ｎＭ〜約２０ｎＭ、および約５ｎＭ〜約１５ｎＭの間である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａのリポソームに対するアフィニティーは、少なくとも約５．５ｎＭ、６ｎＭ、６．５ｎＭ、７ｎＭ、７．５ｎＭ、８ｎＭ、８．５ｎＭ、９ｎＭ、９．５ｎＭ、１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、またはこれを超える。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａのリポソームに対するアフィニティーは、多くとも約５．５ｎＭ、６ｎＭ、６．５ｎＭ、７ｎＭ、７．５ｎＭ、８ｎＭ、８．５ｎＭ、９ｎＭ、９．５ｎＭ、１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、またはこれ未満である。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａポリペプチドのその結合パートナーに対するアフィニティーは、約０．０１ｎＭ〜約４ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約４ｎＭ、または約１ｎＭ〜約４ｎＭの間である。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドのその結合パートナーに対するアフィニティーは、少なくとも約１．１ｎＭ、１．３ｎＭ、１．５ｎＭ、１．７ｎＭ、２ｎＭ、２．３ｎＭ、２．５ｎＭ、２．７ｎＭ、３ｎＭ、３．１ｎＭ、３．２ｎＭ、３．３ｎＭ、３．４ｎＭ、３．５ｎＭ、３．６ｎＭ、３．７ｎＭ、３．８ｎＭ、３．９ｎＭ、またはこれを超える。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドのその結合パートナーに対するアフィニティーは、多くとも約１．１ｎＭ、１．３ｎＭ、１．５ｎＭ、１．７ｎＭ、２ｎＭ、２．３ｎＭ、２．５ｎＭ、２．７ｎＭ、３ｎＭ、３．１ｎＭ、３．２ｎＭ、３．３ｎＭ、３．４ｎＭ、３．５ｎＭ、３．６ｎＭ、３．７ｎＭ、３．８ｎＭ、３．９ｎＭ、またはこれ未満である。
【０１３８】
異なる精製スキームは、異なる量の精製ポリペプチドをもたらす。一部の実施形態では、配列番号１に示されるシステイン７７に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａポリペプチドは、活性形態である。一部の実施形態では、配列番号１に示されるセリン２０９に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａポリペプチドは、活性形態である。一部の実施形態では、配列番号１に示されるセリン２０９に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化、および配列番号１に示されるシステイン７７に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａポリペプチドは、活性形態である。一部の実施形態では、配列番号１に示されるセリン２０９に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化、および配列番号１に示されるシステイン７７に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａポリペプチドは、活性形態でない。一部の実施形態では、配列番号１に示されるシステイン７７に対応するアミノ酸残基におけるパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａポリペプチドは、活性形態でない。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３ａポリペプチド）の活性を検出または測定するためのさらなるアッセイとカップリングさせた質量分析を使用して、活性分子種を同定する。場合によって、さらなるアッセイは、本明細書の別の個所で記載されるバイオマーカー解析と関連するアッセイ、腎被膜下移植術などの移植術、脊椎固定術、ＡＬＰ染色、ＴＲＡＰ染色、およびＴＵＮＥＬ染色、免疫組織化学、ならびに移植片の成長についてのＭｉｃｒｏ−ＣＴ解析および定量を含む。
【０１３９】
一部の態様では、セリン２０９のパルミトイル化を含有するリポソームＷｎｔ３ａ分子種の、溶出させた生成物中の濃度は、システイン７７のパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａ分子種より大きい。一部の実施形態では、２つのＷｎｔ３ａ分子種の濃度は、比などの値により規定される。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａのセリン２０９分子種の、Ｗｎｔ３ａのシステイン７７分子種に対する比は、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約９９：１、または約１００：０の間である。一部の実施形態では、セリン２０９のパルミトイル化を含有するリポソームＷｎｔ３ａ分子種の、溶出させた生成物中の濃度は、システイン７７およびセリン２０９のパルミトイル化を含有するＷｎｔ３ａ分子種より大きい。一部の実施形態では、２つのＷｎｔ３ａ分子種の濃度は、比などの値により規定される。一部の実施形態では、Ｗｎｔ３ａのセリン２０９分子種の、Ｗｎｔ３ａのシステイン７７／セリン２０９分子種に対する比は、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約９９：１、または約１００：０の間である。
【０１４０】
場合によって、本明細書で開示される参考文献において記載されている精製スキームを含む、前出の精製スキームにより、２つの分子種の混合物（例えば、単一修飾／活性：二重修飾／不活性を１：５とする）が得られる。場合によって、本明細書で記載される精製スキームを使用すると、主要なポリペプチド分子種は、単一修飾（Ｓｅｒ２０９における）された、活性の立体配置をとる。場合によって、本明細書で記載される精製法により、Ｓｅｒ２０９における脂質修飾を含有する、活性形態のポリペプチドを主に含有する、Ｗｎｔ３ａ組成物がもたらされる。場合によって、本明細書で記載される精製法により、Ｃｙｓ７７  Ｗｎｔ３ａ分子種など、他のポリペプチド分子種が夾雑していない、Ｗｎｔ３ａ組成物がもたらされる。
【０１４１】
本明細書の一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドを調製する方法であって、Ｗｎｔポリペプチドを含む試料をリポソームの水溶液に接触させるステップを含み、リポソームを構成するリン脂質が、約１０℃〜約２５℃の相転移温度を有する方法が記載される。本明細書の一部の実施形態では、リポソームＷｎｔポリペプチドを調製する方法であって、Ｗｎｔポリペプチドを含む試料をリポソームの水溶液に接触させるステップを含み、リポソームを構成するリン脂質の尾部炭素の長さが、炭素約１２個〜炭素約１４個の間である方法が記載される。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。
【０１４２】
本明細書の一部の実施形態では、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む馴化培地から採取するステップと；（ｂ）Ｗｎｔ３ａポリペプチドを、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したイオン交換カラムに導入するステップと；（ｃ）段階勾配を利用して、Ｗｎｔ３ａポリペプチドをイオン交換カラムから溶出させるステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）によるＷｎｔ３ａポリペプチドをリポソームの水溶液と接触させるステップとを含む方法が開示される。
【０１４３】
本明細書の一部の実施形態では、リポソームＷｎｔ５ａポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）Ｗｎｔ５ａポリペプチドを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む馴化培地から採取するステップと；（ｂ）Ｗｎｔ５ａポリペプチドを、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したイオン交換カラムに導入するステップと；（ｃ）段階勾配を利用して、Ｗｎｔ５ａポリペプチドをイオン交換カラムから溶出させるステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）によるＷｎｔ５ａポリペプチドをリポソームの水溶液と接触させるステップとを含む方法が開示される。
【０１４４】
本明細書の一部の実施形態では、リポソームＷｎｔ１０ｂポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む馴化培地から採取するステップと；（ｂ）Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドを、スルホン化多環芳香族化合物を固定化したイオン交換カラムに導入するステップと；（ｃ）段階勾配を利用して、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドをイオン交換カラムから溶出させるステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）によるＷｎｔ１０ｂポリペプチドをリポソームの水溶液と接触させるステップとを含む方法が開示される。
【０１４５】
当技術分野では、Ｗｎｔポリペプチドの生物学的活性を決定する機能アッセイが周知であり、例えば、β−カテニンの安定化、幹細胞の増殖の促進、非機能アッセイ中に存在するＷｎｔポリペプチドの量の定量、例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、クーマシー染色ゲル上または銀染色ゲル上の量化など、および機能的に活性なＷｎｔの、全Ｗｎｔに対する比についての解析を含みうる。生物学的活性についての例示的なアッセイは、Ｗｎｔ組成物を、細胞、例えば、マウスＬ細胞と接触させ、次いで、少なくとも約１時間など、β−カテニンを安定化させるのに十分な時間にわたり、細胞を培養するステップを含む。次いで、細胞を溶解させ、細胞溶解物を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで解像した。その後、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより解像された細胞溶解物成分を、ニトロセルロースに転写し、次いで、β−カテニンに特異的な抗体でプローブした。Ｗｎｔ活性を解析するための他のアッセイは、標的遺伝子の誘導についての、Ｃ５７ＭＧの形質転換およびＸｅｎｏｐｕｓ属動物キャップアッセイを含む。さらなる例示的アッセイについては、米国特許第７，３３５，６４３号を参照されたい。
【０１４６】
Ｃ．使用法
本明細書では、骨欠損部位における使用のための骨移植片材料を作製するための方法、プロセス、組成物、およびキットが開示される。本明細書ではまた、哺乳動物骨髄細胞を増強するための方法、プロセス、組成物、およびキットも開示される。場合によって、骨欠損とは、天然骨の修復性成長を刺激および誘導するのに移植材料が必要とされる骨折などの骨損傷を指す。
【０１４７】
一部の実施形態では、方法は、骨移植片材料を作製する方法であって、（ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷＮＴポリペプチドと接触させるステップと；（ｂ）試料を洗浄して、遊離リポソームＷＮＴポリペプチドを除去するステップと；（ｃ）リポソームＷＮＴポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップとを含む方法を指す。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。
【０１４８】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、方法は、骨移植片材料を作製する方法であって、（ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷＮＴ３ａポリペプチドと接触させるステップと；（ｂ）試料を洗浄して、遊離リポソームＷＮＴ３ａポリペプチドを除去するステップと；（ｃ）リポソームＷＮＴ３ａポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップとを含む方法を指す。
【０１４９】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５ａポリペプチドである。一部の実施形態では、方法は、骨移植片材料を作製する方法であって、（ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷＮＴ５ａポリペプチドと接触させるステップと；（ｂ）試料を洗浄して、遊離リポソームＷＮＴ５ａポリペプチドを除去するステップと；（ｃ）リポソームＷＮＴ５ａポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップとを含む方法を指す。
【０１５０】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、方法は、骨移植片材料を作製する方法であって、（ａ）哺乳動物骨髄細胞を含む試料を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷＮＴ１０ｂポリペプチドと接触させるステップと；（ｂ）試料を洗浄して、遊離リポソームＷＮＴ１０ｂポリペプチドを除去するステップと；（ｃ）リポソームＷＮＴ１０ｂポリペプチドで処置された骨移植片材料を骨欠損部位に移植するステップとを含む方法を指す。
【０１５１】
一部の実施形態では、プロセスは、単離哺乳動物骨髄細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷＮＴポリペプチドと接触させるステップを含むプロセスであって、接触させる時間が約３０分間〜約４時間の間であるプロセスにより作製される、哺乳動物骨髄組成物に言及する。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。
【０１５２】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、プロセスは、単離哺乳動物骨髄細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷＮＴ３ａポリペプチドと接触させるステップを含むプロセスであって、接触させる時間が約３０分間〜約４時間の間であるプロセスにより作製される、哺乳動物骨髄組成物に言及する。
【０１５３】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５ａポリペプチドである。一部の実施形態では、プロセスは、単離哺乳動物骨髄細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷＮＴ５ａポリペプチドと接触させるステップを含むプロセスであって、接触させる時間が約３０分間〜約４時間の間であるプロセスにより作製される、哺乳動物骨髄組成物に言及する。
【０１５４】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、プロセスは、単離哺乳動物骨髄細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、リポソームＷＮＴ１０ｂポリペプチドと接触させるステップを含むプロセスであって、接触させる時間が約３０分間〜約４時間の間であるプロセスにより作製される、哺乳動物骨髄組成物に言及する。
【０１５５】
一部の実施形態では、組成物は、単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷＮＴポリペプチドによる処置の後で、細胞による、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の発現レベルが増強される組成物を指す。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。
【０１５６】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、組成物は、単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷＮＴ３ａポリペプチドによる処置の後で、細胞による、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の発現レベルが増強される組成物を指す。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。
【０１５７】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５ａポリペプチドである。一部の実施形態では、組成物は、単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷＮＴ５ａポリペプチドによる処置の後で、細胞による、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の発現レベルが増強される組成物を指す。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。
【０１５８】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、組成物は、単離された増強哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷＮＴ１０ｂポリペプチドによる処置の後で、細胞による、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数の発現レベルが増強される組成物を指す。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。
【０１５９】
一部の実施形態では、組成物はまた、３５歳またはこれより老齢のヒト被験体から得られた哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷＮＴポリペプチドによる処置の後で、哺乳動物骨髄細胞が、増強された発現レベルで、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数を発現させる組成物も指す。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチド、Ｗｎｔ５ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである。
【０１６０】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３ａポリペプチドである。一部の実施形態では、組成物はまた、３５歳またはこれより老齢のヒト被験体から得られた哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷｎｔ３ａポリペプチドによる処置の後で、哺乳動物骨髄細胞が、増強された発現レベルで、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数を発現させる組成物も指す。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。
【０１６１】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５ａポリペプチドである。一部の実施形態では、組成物はまた、３５歳またはこれより老齢のヒト被験体から得られた哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷｎｔ５ａポリペプチドによる処置の後で、哺乳動物骨髄細胞が、増強された発現レベルで、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数を発現させる組成物も指す。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。
【０１６２】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドである。一部の実施形態では、組成物はまた、３５歳またはこれより老齢のヒト被験体から得られた哺乳動物骨髄細胞の組成物であって、リポソームＷｎｔ１０ｂポリペプチドによる処置の後で、哺乳動物骨髄細胞が、増強された発現レベルで、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの１または複数を発現させる組成物も指す。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシン、オステオポンチン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、およびＴｃｆ４から選択される。一部の実施形態では、バイオマーカーは、オステオカルシンおよびオステオポンチンから選択される。
【０１６３】
一部の実施形態では、発現レベルの増強を、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較する。場合によって、発現レベルの増強は、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約１％〜約１００％、約１％〜約５０％、約２％〜約２０％、約３％〜約１５％、または約４％〜約１０％の間である。場合によって、発現レベルの増強は、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、少なくとも約５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、またはこれを超える。場合によって、発現レベルの増強は、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、多くとも約５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、またはこれ未満である。
【０１６４】
一部の実施形態では、リポソームＷＮＴポリペプチドによる処置の後で、哺乳動物骨髄細胞による、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγから選択されるバイオマーカーの発現レベルは、さらに低下する。場合によって、哺乳動物骨髄細胞内の発現レベルの低下を、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較する。場合によって、発現レベルの低下は、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、約１％〜約１００％、約２％〜約８０％、約３％〜約５０％、約３％〜約３０％、または約４％〜約２０％の間である。
【０１６５】
一部の実施形態では、骨髄細胞は、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較したアポトーシスレベルの低下をさらに含む。場合によって、アポトーシスレベルの低下は、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、またはこれを超える。場合によって、アポトーシスレベルの低下は、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較して、多くとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、またはこれ未満である。
【０１６６】
一部の実施形態では、哺乳動物骨髄細胞は、非処置哺乳動物骨髄細胞と比較した、骨形成潜在能の増強を含む。一部の実施形態では、骨形成潜在能の増強は、処置された哺乳動物骨髄細胞を移植した後の骨欠損部位における新たな骨成長レベルを含む。場合によって、処置されて移植された哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルは、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１％〜約２０％または約５％〜約１２％の間である。場合によって、処置されて移植された哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルは、移植された非処置哺乳動物骨髄細胞の新たな骨成長レベルと比較して、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、またはこれを超えて増大する。
【０１６７】
本明細書で使用される骨移植片材料とは、ドナーから得られた細胞組成物を指し、ドナーは、生体の場合もあり、遺体の場合もある。骨移植片材料は、複合細胞集団を含むことが典型的であり、間葉系幹細胞などの幹細胞を含み、場合によってまた、骨細胞およびそれらの前駆細胞も含む。場合によって、細胞は、付着骨髄細胞または非付着骨髄細胞である。場合によって、骨髄細胞は、付着骨髄細胞である。場合によって、付着骨髄細胞は、骨髄幹細胞または骨髄前駆細胞である。場合によって、付着骨髄細胞は、骨髄間質細胞である。一部の実施形態では、ドナーは、同種ドナーである。場合によって、ドナーは、レシピエントに照らした自家ドナーである。骨移植のための細胞の量は、ドナー、レシピエント、移植の目的などにより変化しうる。骨移植片は、最大約１０３、最大約１０４、最大約１０５、最大約１０６、最大約１０７、最大約１０８、最大約１０９、最大約１０１０個またはこれを超える細胞を含みうる。
【０１６８】
骨移植片材料は、ドナー、例えば、腸骨稜、下顎枝前部（顎領域）から得られ、大腿骨および／または脛骨、腓骨、肋骨、下顎枝前部；背骨の部分、例えば、手術時に摘出される部分、遺体の骨などのリーミング、吸引、および潅流から得られる。場合によって、移植片材料は、骨髄、例えば、適切な骨の骨内膜面からこすり取られた骨髄から採取されるか、または骨髄および骨の小ブロックを含有するブロック移植片から採取される。場合によって、同種移植骨は、遺体、骨バンクなど、例えば、股関節置換術による大腿骨頭から採取される。場合によって、骨移植片材料は、採取したてであるか、または当技術分野で公知の通り、必要となるまで低温保存される。
【０１６９】
一部の実施形態では、骨移植片細胞は、有効用量のリポソームＷｎｔポリペプチド、例えば、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ、Ｌ−Ｗｎｔ５ａ、またはＬ−Ｗｎｔ１０ｂの存在下で、適切な培養培地中に懸濁させる。例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＰＢＳなど、任意の適切な培地を使用することができる。細胞は、インキュベーション手順中の生存可能性を維持する濃度、例えば、１ｍｌ当たり最大約１０４個、１ｍｌ当たり最大約１０５個、１ｍｌ当たり最大約１０６個、１ｍｌ当たり最大約１０７個で再懸濁させることが典型的である。
【０１７０】
場合によって、接触温度は、約０℃〜約３７℃、または約２０℃〜約２５℃の間である。一部の実施形態では、接触温度は、低温、例えば、最高約３２℃、最高約２５℃、最高約１５℃、最高約１０℃、最高約８℃、最高約４℃、最高約１℃であるが、低温保存のために特別に調製するのでない限りにおいて、氷点を上回ることが典型的である。場合によって、インキュベーション温度は、少なくとも約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、またはこれを超える。場合によって、インキュベーション温度は、多くとも約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、またはこれ未満である。
【０１７１】
場合によって、骨移植片材料は、Ｗｎｔポリペプチドと、少なくとも約１０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、および最長約３６時間、最長約２４時間、最長約１８時間、最長約１５時間、最長約１２時間、最長約８時間、最長約６時間、または最長約４時間にわたり接触する。
【０１７２】
Ｗｎｔポリペプチドの有効用量は、供給源、純度、調製法などに応じて変化しうる。場合によって、Ｗｎｔポリペプチドの有効用量は、少なくとも、約０．０１μｇ／ｍｌ，  ０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．３５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．４５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、またはそれ超である。場合によって、、Ｗｎｔポリペプチドの有効用量は、多くとも、約０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．３５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．４５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、またはそれ未満である。
【０１７３】
一部の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｌ−Ｗｎｔ３ａであり、Ｗｎｔ３ａ歩の有効用量は、少なくとも、約０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．３５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．４５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、  またはそれ超である。場合によって、Ｗｎｔ３ａポリペプチドの有効用量は、多くとも、約０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．３５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．４５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、またはそれ未満である。
【０１７４】
場合によって、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｌ−Ｗｎｔ５ａであり、Ｗｎｔ５ａポリペプチドの有効用量は、少なくとも、約０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．３５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．４５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、またはそれ超である。場合によって、Ｗｎｔ５ａポリペプチドの有効用量は、多くとも、約０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．３５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．４５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、またはそれ未満である。
【０１７５】
場合によって、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｌ−Ｗｎｔ１０ｂであり、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドの有効用量は、少なくとも、約０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．３５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．４５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、またはそれ超である。場合によって、Ｗｎｔ１０ｂポリペプチドの有効用量は、多くとも、約０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．１５μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．３５μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．４５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．６μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．９μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、３．５μｇ／ｍｌ、４．０μｇ／ｍｌ、４．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、またはそれ未満である。
【０１７６】
一部の実施形態では、骨移植片材料は、Ｗｎｔポリペプチドと共に、骨形成能を増強するのに十分な期間にわたり、インキュベートする。増強は、本明細書で記載されるバイオマーカーの使用など、多様な方式で測定することができ、例えば、Ａｘｉｎ２の発現の増大により測定することもでき、骨移植片材料内の有糸分裂活性（移植後約２日目〜約６日目に測定する）の増大により測定することもでき、移植後における骨形成の増大により測定することもでき、Ｒｕｎｘ２またはオステオカルシンの発現の増大により測定することもでき、移植後におけるアポトーシスの低減により測定することもでき、移植後に産生された骨の体積により測定することもできる。
【０１７７】
インキュベーション後、骨移植片材料は、例えば、背骨の修復、骨折、歯科支持体などのための従来のプロトコール後において、レシピエントに移植することができる。
【０１７８】
一部の実施形態では、Ｗｎｔで処置された骨移植片材料を、患者に移植し戻す前に、洗浄ステップを実施して、任意の遊離リポソームＷｎｔポリペプチドを除去する。一部の実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５回またはこれを超える洗浄を実施する。一部の実施形態では、多くとも約１、２、３、４、５回またはこれ未満の洗浄を実施する。一部の実施形態では、例えば、リン酸緩衝食塩溶液など、任意の適切な緩衝液を洗浄のために使用する。
【０１７９】
場合によって、洗浄ステップの後で残存するリポソームＷｎｔは、多くとも約０．０１ｐｇ（ピコグラム）、０．０５ｐｇ、０．１ｐｇ、０．５ｐｇ、１ｐｇ、１．５ｐｇ、２ｐｇ、２．５ｐｇ、３ｐｇ、３．５ｐｇ、４ｐｇ、４．５ｐｇ、５ｐｇ、５．５ｐｇ、６ｐｇ、またはこれ未満である。場合によって、洗浄ステップの後で残存するリポソームＷｎｔは、少なくとも約０．０１ｐｇ（ピコグラム）、０．０５ｐｇ、０．１ｐｇ、０．５ｐｇ、１ｐｇ、１．５ｐｇ、２ｐｇ、２．５ｐｇ、３ｐｇ、３．５ｐｇ、４ｐｇ、４．５ｐｇ、５ｐｇ、５．５ｐｇ、６ｐｇ、またはこれを超える。
【０１８０】
場合によって、本明細書で記載される、骨移植片材料をＷｎｔで処置するための方法は、Ｗｎｔポリペプチドの、細胞への曝露回数、曝露の持続時間、曝露の濃度、および／または毒性に対する制御を可能とする。場合によって、本明細書で記載される、骨移植片材料をＷｎｔ３ａで処置するための方法は、Ｗｎｔ３ａポリペプチドの、細胞への曝露回数、曝露の持続時間、曝露の濃度、および／または毒性に対する制御を可能とする。
【０１８１】
一部の実施形態では、老齢の骨移植片への骨形成潜在能の回復は、例えば、Ｌ−Ｗｎｔ３ａ、Ｌ−Ｗｎｔ５ａ、またはＬ−Ｗｎｔ１０ｂなどのＷｎｔポリペプチドを伴うインキュベーションによりなされる。場合によって、リポソームＷｎｔ３ａ処置により、老齢の骨移植片内の細胞死が低減される。場合によって、移植後、リポソームＷｎｔ３ａで処置された骨移植片により、より多くの骨が産生された（ｐ＜０．０５）。場合によって、リポソームＷｎｔ３ａ処置により、移植片内の細胞生存が増強され、老齢動物に由来する移植片の骨を形成する能力が再確立された。
【０１８２】
一部の実施形態では、哺乳動物骨髄細胞は、ヒトを含むがこれに限定されない、任意の哺乳動物から得られる。場合によって、ドナーは、マウスまたはラットなどの齧歯動物である。場合によって、ドナーは、ウサギである。場合によって、ドナーは、ヒトである。場合によって、ドナーは、レシピエント自身であり、骨髄細胞は、自家骨髄細胞である。場合によって、本明細書の別の個所で記載される通り、自家骨髄細胞は、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。場合によって、自家骨髄細胞は、付着骨髄細胞である。場合によって、自家骨髄細胞は、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。場合によって、自家骨髄細胞は、骨髄間質細胞を含む。場合によって、ドナーは、別の個体であり、骨髄細胞は、同種骨髄細胞である。場合によって、同種骨髄細胞は、生体ドナーまたは遺体ドナーから得られる。場合によって、本明細書の別の個所で記載される通り、同種骨髄細胞は、付着骨髄細胞および非付着骨髄細胞を含む。場合によって、同種骨髄細胞は、付着骨髄細胞である。場合によって、同種骨髄細胞は、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む。場合によって、同種骨髄細胞は、骨髄間質細胞を含む。場合によって、ドナーは、３５歳またはこれより老齢の個体である。場合によって、３５歳またはこれより老齢の個体から得られた骨髄細胞は、老年骨髄細胞または老齢骨髄細胞であると考えられる。一部の実施形態では、ドナーは、３５歳より若齢の個体である。場合によって、３５歳より若齢の個体から得られた骨髄細胞は、若年骨髄細胞であると考えられる。場合によって、３５歳またはこれより老齢の個体から得られた骨髄細胞は、自家骨髄細胞または同種骨髄細胞である。場合によって、３５歳より若齢の個体から得られた骨髄細胞は、自家骨髄細胞または同種骨髄細胞である。本明細書では、本明細書で使用される「個体」、「被験体」、「ドナー」、および「患者」という用語は、互換的に使用され、ヒトを含むがこれに限定されない、任意の哺乳動物を意味する。
【０１８３】
一部の実施形態では、本明細書で記載される方法、組成物、プロセス、およびキットは、老齢患者に由来する骨移植片、および治癒能が低下した他の患者であって、例えば、喫煙者、糖尿病、または栄養不良を伴う患者などの患者に由来する骨移植片を再活性化するための、臨床的に適用可能な、再生医療ベースの戦略を提供する。
【０１８４】
当技術分野では、Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲン、Ａｘｉｎ２、Ｌｅｆ１、Ｔｃｆ４、ＳＯＸ９およびＰＰＡＲγなどのバイオマーカーの発現レベルまたは存在を決定するための方法が周知である。場合によって、バイオマーカーの発現レベルまたは存在は、例えば、これらのバイオマーカーのうちのいずれかを発現させる細胞についてのフローサイトメトリー、免疫組織化学、ウェスタンブロット、免疫沈降、磁気ビーズによる選択、および定量により測定する。バイオマーカーのＲＮＡまたはＤＮＡの発現レベルであれば、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｑｔ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ノーザンブロット、または他の類似の技術により測定しうるであろう。本明細書で使用される「バイオマーカー」および「マーカー」という用語は、互換的に使用される。
【０１８５】
本明細書で開示される通り、目的のバイオマーカーの発現または存在の、ポリペプチドレベルまたはヌクレオチドレベルにおける決定は、当業者に公知の任意の検出法を使用して達成する。「発現の検出」または「〜のレベルの検出」により、バイオマーカーのタンパク質または遺伝子の、生物学的試料中の発現レベルまたは存在を決定することを意図する。したがって、「発現の検出」とは、バイオマーカーが、発現しないこと、検出可能な程度には発現しないこと、低レベルで発現すること、通常レベルで発現すること、または過剰発現することを決定する場合を包摂する。
【０１８６】
ある特定の態様では、これらの多様なバイオマーカーおよび任意の臨床的に有用な予後診断マーカーの、生物学的試料中の発現または存在を、例えば、免疫組織化学法、またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲなど、核酸ベースの技法を使用して、タンパク質レベルまたは核酸レベルで検出する。一部の実施形態では、１または複数のバイオマーカーの発現または存在の決定は、核酸増幅のための手段、核酸シークェンシングのための手段、核酸マイクロアレイ（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を利用する手段、または特異的に標識されたプローブを使用する、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための手段により実行する。
【０１８７】
他の実施形態では、１または複数のバイオマーカーの発現または存在の決定は、ゲル電気泳動により実行する。一実施形態では、決定は、膜への転写および特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより実行する。
【０１８８】
他の実施形態では、１または複数のバイオマーカーの発現または存在の決定は、診断用イメージング法により実行する。
【０１８９】
さらに他の実施形態では、１または複数のバイオマーカーの発現または存在の決定は、検出可能な固体基質により実行する。一実施形態では、検出可能な固体基質は、抗体により機能化された常磁性ナノ粒子である。
【０１９０】
一部の実施形態では、バイオマーカーの発現を、例えば、特異的なバイオマーカータンパク質を指向する抗体を使用して、タンパク質レベルで検出する。これらの抗体は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、マルチプレックス化技術、免疫沈降、または免疫組織化学法など、多様な方法で使用される。一部の実施形態では、バイオマーカーの検出は、ＥＬＩＳＡにより達成する。一部の実施形態では、バイオマーカーの検出は、電気化学発光（ＥＣＬ）により達成する。
【０１９１】
一部の実施形態では、目的のバイオマーカータンパク質の、生物学的試料中の発現レベルを、そのバイオマーカータンパク質またはその機能的に活性な変異体と特異的に相互作用することが可能な結合タンパク質を介して検出する。一部の実施形態では、標識された抗体、その結合性部分、または他の結合パートナーを使用する。本明細書で使用される場合の「標識」という語は、検出可能な化合物または組成物であって、「標識された」抗体を作製するように、抗体に直接的または間接的にコンジュゲートさせた化合物または組成物を指す。一部の実施形態では、標識は、それ自体（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）により検出可能であるか、または、酵素的標識の場合、検出可能な基質化合物または基質組成物の化学的変化を触媒する。
【０１９２】
バイオマーカータンパク質を検出するための抗体は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体に由来するか、または合成もしくは組換えにより作製される。複合体化したタンパク質の量、例えば、結合タンパク質、例えば、バイオマーカータンパク質に特異的に結合する抗体と会合したバイオマーカータンパク質の量は、当業者に公知の標準的なタンパク質検出法を使用して決定する。免疫学的アッセイのデザイン、理論、およびプロトコールについての詳細な総説は、当技術分野の多数の教科書において見出される（例えば、Ausubelら編（１９９５年）、CurrentProtocols in Molecular Biology（Greene Publishing and Wiley-Interscience、NY）；Coliganら編（１９９４年）、CurrentProtocols in Immunology（John Wiley & Sons, Inc.、New York、N.Y.）を参照されたい）。
【０１９３】
抗体を標識するのに使用されるマーカーの選択は、適用に応じて変化するであろう。しかし、当業者には、マーカーの選択は、たやすく決定可能である。これらの標識された抗体は、イムノアッセイのほか、任意の目的のバイオマーカーまたはタンパク質の存在を検出する組織学的適用でも使用される。標識された抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。さらに、目的のタンパク質の検出における使用のための抗体は、本明細書の別の個所で記載される通り、放射性原子、酵素、色素部分もしくは蛍光部分、または比色タグで標識される。また、タグ付け標識の選択も、所望の検出限界に依存するであろう。酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、酵素でタグ付けされた複合体の、酵素基質との相互作用により形成される有色生成物の検出を可能とすることが典型的である。検出可能な標識として用いられる放射性核種は、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９を含む。検出可能な標識として用いられる酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含むがこれらに限定されない。色素部分は、フルオレセインおよびローダミンを含むがこれらに限定されない。抗体は、当技術分野で公知の方法により、これらの標識にコンジュゲートさせる。例えば、酵素および色素分子は、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどのカップリング剤を介して、抗体にコンジュゲートさせる。代替的に、コンジュゲーションは、リガンド−受容体対を介しても生じる。適切なリガンド−受容体対の例は、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン、および抗体−抗原である。
【０１９４】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、完全にアセンブルされた抗体、抗原に結合しうる抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディー、抗体のキメラ体、ハイブリッド抗体、二特異性抗体、ヒト化抗体など）、および前出を含む組換えペプチドを対象とする。
【０１９５】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均一な抗体集団、すなわち、集団を構成する個別の抗体が、少量で存在しうる可能な自然発生の突然変異を除いて、同一である集団から得られた抗体を指す。
【０１９６】
「天然の抗体」および「天然の免疫グロブリン」とは、通例、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質であって、２つの同一な軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖からなる糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合的ジスルフィド結合により重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および各軽鎖はまた、規則的に間隔を置いた鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端部において、可変ドメイン（ＶＨ）に続いて、複数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の端部において、可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の端部において、定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと位置を合わせて並び、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと位置を合わせて並ぶ。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。
【０１９７】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分の配列が、抗体間で大幅に異なるという事実を指す。可変領域は、抗原結合特異性を付与する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインを通して均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのいずれにおいても、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメント内に集約されている。可変ドメインのうちの高度に保存的な部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域内に分布する。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ領域であって、大部分が、３つのＣＤＲであり、βプリーツシート型構造を接続し、場合によって、その部分を形成する、ループを形成する、ＣＤＲにより接続された、βプリーツシート型立体配置を採用する、ＦＲ領域を含む。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ領域により、併せて緊密に保持され、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する（Kabatら（１９９１年）、ＮＩＨ刊行物第９１−３２
４２号、Ｉ巻、６４７〜６６９頁を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接は関与（involved）しないが、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）の結合、抗体の抗体依存性細胞傷害作用への関与（participation）、補体依存性細胞傷害作用の誘発、および肥満
細胞の脱顆粒など、多様なエフェクター機能を呈示する。
【０１９８】
本明細書で使用される場合の「超可変領域」という用語は、抗原の結合の一因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）；ならびに重鎖可変ドメイン内の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Kabatら（１９９１年）
、Sequences of Proteins of Immunological Interest、５版、Public Health Service、NationalInstitute of Health、Bethesda、Md.）；および／または「超可変ループ」に
由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）；ならびに重鎖可変ドメイン内の（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；ClothiaおよびLesk（１９８７年）
、J. Mol. Biol.、１９６巻：９０１〜９１７頁）を含む。「フレームワーク」または「
ＦＲ」残基とは、本明細書でみなされる通り、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１９９】
「抗体断片」は、完全抗体の部分、好ましくは、完全抗体の抗原結合性領域または可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片；ダイアボディー；直鎖状抗体（Zapataら（１９９５年）、ProteinEng.、１０巻：１０５７〜１０６２頁）；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異性抗体を含む。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、２つの同一な抗原結合性断片であって、各々が、単一の抗原結合性（binding）部位と、その名称がたやすく結晶す
るその能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片とを伴う、抗原結合性断片をもたらす（produce）。ペプシン処理は、２つの抗原結合性（combining）部位を有し、抗原を架橋することがやはり可能な、Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす（yield）。
【０２００】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位および抗原結合性部位を含有する、最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合的会合下にある、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つずつのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上で、抗原結合性部位を規定するのは、この立体配置においてである。併せて、６つのＣＤＲは、抗原結合特異性を、抗体に付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でもなお、結合性部位全体より小さなアフィニティーではあるが、抗原を認識し、抗原に結合する能力を有する。
【０２０１】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ断片は、抗体のヒンジ領域に由来する１または複数のシステインを含む重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における、いくつかの残基の付加により、Ｆａｂ’断片と異なる。本明細書では、Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が、遊離チオール基を保有するＦａｂ’のための呼称である。Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片の重鎖ジスルフィド架橋を還元することにより作製する。また、抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【０２０２】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの顕著に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。
【０２０３】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちの複数は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元的立体構成は周知である。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプおよびヒトＩｇＧ３アイソタイプは、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用）活性を有する。
【０２０４】
一部の実施形態では、生物学的試料中、例えば、組織試料中の、１または複数の目的のバイオマーカーまたは他のタンパク質の発現または存在を、ラジオイムノアッセイまたは酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合結合性酵素免疫測定アッセイ、ドットブロット（例えば、PromegaProtocols and Applications Guide、Promega Corporation（１９
９１年）を参照されたい）、ウェスタンブロット（例えば、Sambrookら（１９８９年）、Molecular Cloning, A LaboratoryManual、３巻、１８章（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、N.Y.）を参照されたい）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィー、または当技術分野で公知の他のアッセイにより決定する。したがって、検出アッセイは、免疫ブロット法、免疫拡散、免疫電気泳動、または免疫沈降などであるがこれらに限定されないステップを伴う。
【０２０５】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるバイオマーカーのうちの１または複数の発現または存在はまた、核酸レベルでも決定される。当技術分野では、発現を評価するための核酸ベースの技法が周知であり、例えば、生物学的試料中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを決定することを含む。多くの発現検出法では、単離ＲＮＡを使用する。ｍＲＮＡの単離に照らして選択するのではない、任意のＲＮＡ単離法を、ＲＮＡの精製のために利用する（例えば、Ausubelら（１９８７〜１９９９年）、CurrentProtocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons、New York）を参照されたい）。加えて、多数の組織試料の加工も、例えば、米国特許第４，８４３，１５５号において開示されている、単一ステップによるＲＮＡ単離プロセスなど、当業者に周知の技法を使用して、たやすくなされる。
【０２０６】
したがって、一部の実施形態では、目的のバイオマーカーまたは他のタンパク質の検出は、核酸プローブを使用して、核酸レベルでアッセイされる。「核酸プローブ」という用語は、具体的に意図される標的核酸分子、例えば、ヌクレオチド転写物に選択的に結合することが可能な任意の分子を指す。プローブは、当業者が合成するか、または適切な生物学的調製物に由来する。プローブは、例えば、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、比色タグ、または上記で論じたか、もしくは当技術分野で公知の、他の標識もしくはタグで標識するように、特別にデザインする。プローブとして利用される分子の例は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含むがこれらに限定されない。
【０２０７】
例えば、単離ｍＲＮＡは、サザン解析またはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応解析、およびプローブアレイを含むがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイで使用される。ｍＲＮＡレベルを検出するための１つの方法は、単離ｍＲＮＡを、検出される遺伝子によりコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズする核酸分子（プローブ）と接触させるステップを伴う。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡ、またはその部分であって、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドの長さであり、本明細書の上記で記載したバイオマーカーである、バイオマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと、厳密な条件下で、特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのオリゴヌクレオチドなどの部分を含む。ｍＲＮＡの、プローブとのハイブリダイゼーションは、目的のバイオマーカーまたは他の標的タンパク質が発現していることを指し示す。
【０２０８】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを、固体表面上に固定化し、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲル上で泳動させ、ｍＲＮＡを、ゲルからニトロセルロースなどの膜に転写することにより、プローブと接触させる。代替的な実施形態では、例えば、遺伝子チップアレイ内で、プローブを、固体表面上に固定化し、ｍＲＮＡを、プローブと接触させる。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出法を、目的のバイオマーカーまたは他のタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルの検出における使用にたやすく適応させる。
【０２０９】
試料中の、目的のｍＲＮＡのレベルを決定するための代替的な方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号を参照されたい）、リガーゼ連鎖反応（Barany（１９９１年）、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、８８巻：１８９〜１９３頁）、自己持続配列複製（Guatelliら（１９９０年）、Proc. Natl. Acad.Sci. USA、８７巻：１８７４〜１８７８頁）、転写増幅系（Kwohら（１９８９年）、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA、８６巻：１１７３〜１１７７頁）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Lizardiら（１９８
８年）、Bio/Technology、６巻：１１９７頁）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８５４，０３３号）、または他の任意の核酸増幅法による核酸増幅プロセスの後で、当業者に周知の技法を使用する、増幅された分子の検出を伴う。これらの検出スキームは、このような分子が極めて少数で存在する場合、核酸分子の検出にとりわけ有用である。本発明の特定の態様では、バイオマーカーの発現を、定量的蛍光ＲＴ−ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ０  Ｓｙｓｔｅｍ）により評価する。
【０２１０】
目的のＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（ノーザン解析、ドット解析などのハイブリダイゼーション解析で使用される膜ブロットなど）、またはマイクロウェル、試験管、ゲル、ビーズ、もしくは繊維（または結合させた核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニタリングする。参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号、および同第５，４４５，９３４号を参照されたい。発現の検出はまた、溶液中の核酸プローブの使用も含む。
【０２１１】
一部の実施形態では、マイクロアレイを使用して、１または複数のバイオマーカーの発現または存在を決定する。マイクロアレイは、異なる実験間の再現可能性のために、この目的に特によく適する。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルの同時的な測定のための１つの方法をもたらす。各アレイは、固体支持体に接合された捕捉プローブの再現可能なパターンからなる。標識されたＲＮＡまたはＤＮＡを、アレイ上の相補的なプローブとハイブリダイズさせ、次いで、レーザー走査により検出する。アレイ上の各プローブについてのハイブリダイゼーションの強度を決定し、相対遺伝子発現レベルを表す定量値に転換する。参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０４０，１３８号、同第５，８００，９９２号、および同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、および同第６，３４４，３１６号を参照されたい。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多数のＲＮＡについての遺伝子発現プロファイルを決定するのに特に有用である。
【０２１２】
機械的合成法を使用して、これらのアレイを合成するための技法は、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３８４，２６１号において記載されている。一部の実施形態では、アレイを、事実上任意の形状の表面上、なおまたは多数の表面上で作製する。一部の実施形態では、アレイは、平面状のアレイ表面である。一部の実施形態では、アレイは、ビーズ上、ゲル上、ポリマー表面上、光ファイバーなどの繊維上、ガラス上、または他の任意の適切な基質上のペプチドまたは核酸（それらの各々がそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号、および同第５，８００，９９２号を参照されたい）を含む。一部の実施形態では、アレイを、診断法または全てを包含するデバイスの他の操作を可能とするような様式でパッケージングする。
【０２１３】
Ｄ．キット／製品
本明細書のある特定の実施形態では、本明細書で記載される、１または複数の方法、プロセス、および組成物を伴う使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験管などの、１または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法で使用される個別の要素のうちの１つを含む容器を受容するように区画されたキャリングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一部の実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料から形成される。
【０２１４】
本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。パッケージング材料の例は、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択される処方物ならびに意図される投与方式および処置に適する任意のパッケージング材料を含むがこれらに限定されない。
【０２１５】
例えば、容器は、Ｌ−Ｗｎｔポリペプチドを含む。このようなキットは、識別のための記載もしくは表示、または本明細書で記載される方法におけるその使用に関する指示書を任意選択で含む。
【０２１６】
キットは、内容物について列挙する表示および／または使用のための指示書、ならびに使用のための指示書を伴う添付文書を含むことが典型的である。また、指示書のセットも含まれることが典型的である。
【０２１７】
一実施形態では、表示は、容器上に貼付されているか、または容器に付随する。一実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体に接着されているか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されており；表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば、添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示す。
【０２１８】
本発明のさらなる詳細については、以下の非限定的な実施例で提示する。
【実施例】
【０２１９】
（実施例１）
ヒトＷｎｔ３ａポリペプチドの産生および精製
ヒトＷＮＴ３Ａとは、脂質修飾されたヒト幹細胞増殖因子であって、成体幹細胞を活性化させ、それらの自己再生および生存を刺激するのに有効なヒト幹細胞増殖因子である。天然ヒトＷＮＴ３Ａの３５２アミノ酸のポリペプチドは、グリコシル化およびパルミトイル化により翻訳後修飾されている。疎水性ポリペプチドは、スケーラブルなレベルで、均一性まで精製することが困難でありうる。
【０２２０】
本明細書で記載され、図１で説明される通り、ヒトＷＮＴ３Ａは、ＣＨＯ細胞から分泌され、イオン交換（Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムを使用して精製される。精製後、組換えヒトＷＮＴ３Ａは、ＤＭＰＣおよびコレステロールからなる脂質小胞に再構成される。スクロースの密度勾配データにより、ＷＮＴ３Ａとリポソームとの間の物理的会合が裏付けられる。さらに、リポソームヒトＷｎｔ３ａポリペプチド（Ｌ−ＷＮＴ３Ａ）は、生理学的な水性条件下で安定でありうる。場合によって、リポソーム構造の形成は、この相互作用に必須ではない。場合によって、ランダムな構造的特徴を伴う脂質は、ヒトＷＮＴ３Ａと相互作用し、水性環境内でポリペプチドを安定化させることが可能である。
【０２２１】
一部の態様では、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処方物は、骨治癒遅延の危険性が高い患者における骨欠損を処置する治験新薬（ＩＮＤ）フェーズＩ研究で使用されるものとする。場合によって、自家骨移植片材料（ＢＧＭ）は、採取され、ｅｘ  ｖｉｖｏでＬ−ＷＮＴ３Ａにより処置され、次いで、洗浄され、ペレット化される。場合によって、結果として得られる材料である、活性化ＢＧＭ（例えば、ＢＧＭＡＣＴ）は、医薬品であると考えられ、即時的な使用の準備ができている。場合によって、Ｌ−ＷＮＴ３Ａは、患者に直接投与されず、ｅｘ  ｖｉｖｏで自家細胞を活性化させるのに使用されるであろう。場合によって、プログラムの初期段階では、処方物は、全身投与されるリポソームタンパク質処方物について承認された、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による基準（純度、安定性など）を満たすことが期待される。
【０２２２】
ＷＮＴ３Ａの、ＣＨＯ細胞からの産生
ヒトＷＮＴ３Ａポリペプチドを、チャイニーズハムスター卵巣細胞系に導入し、３２〜３７℃の範囲にわたる温度で、付着細胞として増殖させた。懸濁液中のＣＨＯ細胞が、ＷＮＴ３Ａを効率的に分泌するのかどうかを査定するために、懸濁液中で増殖させたＣＨＯ細胞について調べた（図９）。
【０２２３】
ＷＮＴ３Ａで形質転換されたＣＨＯ細胞を、Ｇｌｕｔａｍａｘ、抗生剤、および血清を添加したＤＭＥＭ中で増殖させた。ＷＮＴ３Ａプラスミドは、誘導性プラスミドとし、ある範囲のドキシサイクリン濃度について調べた（図１０）。ドキシサイクリン濃度は、ＣＨＯ細胞によるＷｎｔ３ａの分泌量をモジュレートしうることが観察された。細胞は、最長１０日間にわたり増殖させることができ、その後、細胞の新たなアリコートを使用した。
【０２２４】
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、ＷＮＴ３Ａの、ＣＨＯ細胞からの分泌のために使用した（図１１）。
【０２２５】
ＣＨＯ細胞培養物に由来する馴化培地（ＣＭ）を回収し、プールし、４℃で最長２カ月間にわたり、活性の喪失を伴わずに保存した（図１２）。
【０２２６】
精製の前に、ＣＭを濾過し（０．２２ミクロンのフィルター）、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した。ＣＭ（４０ｍＬ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７．５および１％のＣＨＡＰＳ中で平衡化させたＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１．６ｍｌ）に適用した。フロースルーを回収し、４カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７．５、１％のＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのＫＣｌで、カラムを洗浄した。４カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７．５、１％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＫＣｌで、カラムを再度洗浄した。次いで、３カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７．５、１％のＣＨＡＰＳ、１５０ｍＭのＫＣｌで、カラムを洗浄したが、ここで、この洗浄液から、ヒトＷＮＴ３Ａを溶出させた。４カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７．５、１％のＣＨＡＰＳ、２５０ｍＭのＫＣｌで、カラムを再度洗浄した。４０ｍＬのＣＭからの収量は、純度およそ６０％のポリペプチド１２μｇであった。他の精製スキームと比較して、この方法は、ＷＮＴ３Ａを、高純度および高収率でもたらした。場合によって、純度は、７０％であった。
【０２２７】
ＷＮＴ３Ａの産生およびリポソーム
ＷＮＴ３Ａの特徴付け：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット：ＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析およびクーマシーブルーによる染色解析のために、ＷＮＴ３Ａの精製画分を回収し、クーマシーブリリアントブルーおよび硝酸銀で染色された、１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより、ＷＮＴ３Ａポリペプチドの純度について解析した（図２）。図２に示される通り、精製画分を回収し、クーマシーブリリアントブルーおよび硝酸銀で染色された、１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより、ＷＮＴ３Ａポリペプチドの純度について解析した。ＷＮＴ３Ａの推定純度は、７０％であった。Ｐｉｅｒｃｅ６６０タンパク質アッセイキットおよび２８０ｎｍにおける吸光度を使用して、全タンパク質濃度を測定した。各アッセイでは、ＢＳＡ検量線を作成して、全タンパク質濃度を推定した。ＷＮＴ３Ａポリペプチド濃度は、定量的ウェスタンブロットおよびＷＮＴ３Ａ検量線を使用して決定した。
【０２２８】
質量分析（mass spectroscopy）：質量分析（mass spectrometry）解析により、ＷＮＴ３Ａポリペプチドが、脂質付加され、グリコシル化されていることを検証した（図３）。ポリペプチドは、Ｓ２０９においてパルミトイル化されていることが観察された。
【０２２９】
図３に示される通り、ＷＮＴ３Ａ試料を質量分析のために調製する方法は、以下の通りであった。ポリペプチド試料を、−８０℃であらかじめ冷却された、４倍体積のアセトンを使用して沈殿させた。試料を、−８０℃で一晩にわたり保存した後、４℃、１０，０００ＲＰＭで１０分間にわたり、超遠心分離にかけた。上清を除去し、ポリペプチドを、８Ｍの尿素およびプロテアーゼミックス（Promega）を含有する溶液中で再構成した。試料
を、５ｍＭのＤＴＴで還元し、５５℃で３０分間にわたりインキュベートした。次いで、試料を、室温まで冷却させ、次いで、アクリルアミド（１５ｍＭ）を使用して、室温で３０分間にわたりアルキル化させた。次いで、試料を、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム、ｐＨ８．０で、尿素＜１Ｍの濃度まで希釈し、１μｇのトリプシンプロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。消化は、３７℃で一晩にわたり実施した。反応は、５０％のギ酸を添加することによりクェンチングし、ペプチドを速やかに清浄化させ、Ｃ１８マイクロカラム（ＮＥＳＴ  ｇｒｏｕｐ）上で濃縮した。
【０２３０】
液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＬＣＭＳ）：ペプチドを移動相Ａ中で再構成した。３００ｎＬ／分でランさせ、８０〜１２０分間の間の長さでは勾配を使用する、Ｗａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＬＣを使用した。解析用カラムは、長さおよそ１５ｃｍのＰＥＥＫＥ  Ｃ１８  ３ｕｍマトリックスを使用して、溶融石英（内径７５ｕｍ）により、自社で充填および作製した。データ依存式収集（ＤＤＡ）モードに設定されたＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計を使用して、ＭＳＭＳによる、強度の大きな前駆体イオンに対するフラグメント化を実施した。ＣＡＤフラグメント化法、ＨＣＤフラグメント化法、およびＥＴＤフラグメント化法を使用した。
【０２３１】
データベースの検索および解析：Ｓｅｑｕｅｓｔを使用して、質量分析計からの．ＲＡＷファイルを、ヒトＵｎｉｐｒｏｔデータベースに照らして検索した。次に、ＷＮＴ３Ａ配列を含有する特注のデータベースを創出し、検索し、ＳＴＹリン酸化、ＳＴ  ｈｅｘＮａｃ、ＳＴ  Ｎａｃ、ＳＴＣパルミトイル化などに限定されない、一連の可変的修飾を可能とした。Ｓｅｑｕｅｓｔにより検索された全てのファイルは、精査および半定量的解析のために、Ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）にアップロードした。
【０２３２】
陽性対照（ＳｔｅｍＲＤから購入されたＷＮＴ３Ａタンパク質）の場合、およそ４３％のカバレッジが達成された。配列カバレッジおよび固有のペプチドは、黄色で強調した（図３Ａ）。修飾された残基は、緑色で示す。パルミトイル化修飾が検出されたのは、Ｃ７７残基上に限られた（図３Ｂ）。精製されたＷＮＴ３Ａの場合、約５１％のカバレッジが達成された。配列カバレッジおよび固有のペプチドは、黄色で強調した（図３Ｃ）。修飾された残基は、緑色で示す。パルミトイル化修飾が検出されたのは、Ｓ２１１残基上に限られ（図３Ｃ、Ｄ）、可能なミリストイル化修飾は、残基Ｓ１３９上およびＳ１８１上で検出された。
【０２３３】
Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処方物および特徴付け
【０２３４】
正に荷電した脂質、負に荷電した脂質、または電荷が中和された脂質を、室温で、精製されたＷｎｔ３ａと共に、少なくとも約６時間〜最長約２４時間にわたりインキュベートすることにより、正味の正の電荷、負の電荷、または中性の電荷を含有するリポソームＷｎｔ３ａ（Ｌ−Ｗｎｔ３ａ）ポリペプチドを製造した。脂質対コレステロール比は、９０：１０で維持した。インキュベーション後、４℃、１６，０００〜１５０，０００×ｇの範囲の力で、最長１時間にわたり遠心分離することにより、Ｌ−Ｗｎｔ３ａを、ＣＨＡＰＳおよび他の不純物から分離した。次いで、Ｌ−Ｗｎｔ３ａのペレットを無菌１×ＰＢＳ中に再懸濁させ、窒素ガスで覆い、４℃で保存した。
【０２３５】
脂質のＷＮＴ３Ａとの相互作用：多様な炭素鎖の長さを有する脂質と組み合わせたところ、ＷＮＴ３Ａは、非荷電脂質との機能的に関与性の相互作用を裏付けた（図１５）。これらのデータは、相互作用が主に、ＷＮＴ３Ａポリペプチドとリポソームとの間の会合を媒介する疎水性相互作用であったことを示唆する（図４）。
【０２３６】
ＴＥＭによるＬ−ＷＮＴ３Ａについての特徴付け：ＴＥＭを使用して、Ｌ−ＷＮＴ３Ａについて観察される直径の範囲を視覚化した（図４）。Ｌ−ＷＮＴ３Ａの外見およびサイズは、エキソソームについて報告されたサイズの範囲内、例えば、２０〜１００ｎＭ内に収まる。また、参照によりその全体において本明細書に具体的に組み込まれる、Dhamdhereら（２０１４年）、PLoSONE、９巻（１号）：ｅ８３６５０頁も参照されたい。
【０２３７】
マウスＬＳＬ細胞ベースのアッセイ：ベータガラクトシダーゼ活性を細胞数に照らして標準化するために、マウスＬＳＬ細胞に、Ｗｎｔ応答性のルシフェラーゼレポータープラスミドであるｐＳｕｐｅｒＴＯＰＦｌａｓｈ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、および構成的ＬａｃＺ発現構築物であるｐＥＦ／Ｍｙｃ／Ｈｉｓ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、安定的にトランスフェクトした。ヒト胎児由来腎臓上皮（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞に、上記の２つのプラスミドを、安定的にトランスフェクトした。そうでないことが言明されるのでない限りにおいて、細胞（ウェル１つ当たりの細胞５００００個、９６ウェルプレート）を、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、および１％のＰ／Ｓ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を補充したＤＭＥＭ中に、１５０ｕＬの合計体積中１０ｕＬの濃度のＬ−ＷＮＴ３Ａで処置した。また、精製されたＷＮＴ３Ａポリペプチドの希釈系列も組み入れた。
【０２３８】
細胞を、５％のＣＯ２、３７℃で一晩にわたりインキュベートし、次いで、洗浄し、溶解緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で溶解させ、ｄｕａｌ−ｌｉｇｈｔ
ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ）を使用して、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの発現レベルを定量した。生物発光は、ｄｕａｌ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅａｄｙ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）上の三連の読取りにより定量した。ＷＮＴ３Ａ（ｎｇ／ｕＬ）およびＬ−ＷＮＴ３Ａの活性は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドの段階希釈により作成された検量線から規定した（図５）。時間経過を伴う実験では、ＷＮＴ３Ａ活性を、活性パーセントとして表した。活性パーセントは、以下の通りに計算した：
【数１】
2019206551.tif 000010
【０２３９】
安定性データの概要
ＬＳＬレポーター細胞アッセイおよびＰＡＧＥ−ウェスタンブロット解析に基づくと、発酵に由来する馴化培地は、４℃で最短２カ月間にわたり安定であった。ＬＳＬレポーター細胞アッセイおよびＰＡＧＥ−ウェスタンブロット解析に基づくと、Ｌ−ＷＮＴ３Ａは、４℃で＞１０６日間にわたり安定であった（図６）。ＬＳＬレポーター細胞アッセイおよびＰＡＧＥ−ウェスタンブロット解析に基づくと、２３℃で、Ｌ−ＷＮＴ３Ａの半減期は、＞４８時間であった（青線、図７）。２３℃で、５分間以内にその活性を喪失した、リポソームを伴わないＷＮＴ３Ａポリペプチドと比較されたい。
【０２４０】
ＬＳＬレポーター細胞アッセイおよびＰＡＧＥ−ウェスタンブロット解析に基づくと、３７℃で、Ｌ−ＷＮＴ３Ａの半減期は、１０．５時間であった（青線、図８）。疎水性ポリペプチドを安定化させるように、界面活性剤（ＣＨＡＰＳ）を添加してもなお、ＷＮＴ３Ａは、５分間以内にその活性を喪失した（赤線、図８）ことに注目されたい。
【０２４１】
ＷＮＴ細胞レポーターアッセイの特徴付け
ＬＳＬレポーター細胞系を使用して、Ｗｎｔポリペプチドおよびアゴニストの活性を評価した。Ｌ−ＷＮＴ３Ａについての以下の特徴付けは、以下のレポーターアッセイを使用して行った。ＬＳＬレポーター細胞系およびＨＥＫ２９３レポーター細胞系を使用して、細胞を、アッセイウェル１つ当たり５．０×１０４個で播種し、ＷＮＴ３ＡおよびＬ−ＷＮＴ３Ａの活性を定量した。これらの条件下で、ＷＮＴ３ＡおよびＬ−ＷＮＴ３Ａは、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させる同様の能力を示した（図１３）。
【０２４２】
精度および検出限界：アッセイの感度は、Ｒ２＝０．９９である。図１４Ａおよび図１４Ｂでは、ＷＮＴは、０．１ｎｇ／μＬの最適濃度に到達することが示された。アッセイのカットオフ点は、０．０２５ｎｇ／μＬおよび０．２ｎｇ／μＬであった。ＬＳＬアッセイは、ＷＮＴ３Ａ濃度の意図的な変動の影響を受けなかった（図１４Ｃ）。ＷＮＴ３Ａ濃度の範囲により、時間経過にわたる比例的なルシフェラーゼ応答が裏付けられ、これにより、アッセイの信頼性が指し示された。
【０２４３】
特異度は、ＷＮＴポリペプチドとの相乗作用により、ＷＮＴ経路を活性化させるＷｎｔポリペプチドアゴニストである、Ｒ−スポンディン２を使用して裏付けた。アッセイの特異度はまた、Ｗｎｔ共受容体であるＲｏｒ２の存在下で、ベータカテニンにより媒介される経路の活性化を抑制する、ＷＮＴ５Ａを使用しても裏付けられた。図１３Ｄに示される通り、いずれの試薬も、ＬＳＬレポーターアッセイでは、活性が裏付けられなかった。
【０２４４】
図１３（Ａ、Ｂ）に示される通り、細胞を、アッセイウェル１つ当たり５．０×１０４個で播種し、ＷＮＴ３Ａの活性およびＬ−ＷＮＴ３Ａの活性の両方を定量した。これらの条件下では、ＷＮＴ３ＡおよびＬ−ＷＮＴ３Ａのいずれも、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化させる同様の能力を示した。アッセイの感度は、Ｒ２＝０．９９である。精製されたヒトＷＮＴ３Ａポリペプチドを、陽性対照として使用した。（Ｃ）ＬＳＬアッセイは、ＷＮＴ３Ａ濃度の意図的な変動の影響を受けなかった。ある範囲の濃度によるデータにより、時間経過にわたる比例的なルシフェラーゼ応答が裏付けられ、これにより、アッセイの信頼性の指標がもたらされた。（Ｄ）特異度は、ＷＮＴ３Ａの存在下および非存在下におけるＲｓｐｏ２の添加により裏付けられた。
【０２４５】
確度：アッセイの、アッセイ内変動係数およびアッセイ間変動係数は、１７．２％であった。
【０２４６】
初代ＭＥＦを使用する、Ｌ−ＷＮＴ３Ａの用量反応曲線
ＬＳＬ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＷｎｔおよびＷｎｔアゴニストに対して感受性となるように操作し、これにより、用量、薬物効果、および臨床応答の間の関係についての、ささやかながらも有意味なデータをもたらした。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｗｎｔ刺激に対する細胞応答をより緊密に模倣するため、Ｗｎｔの標的遺伝子であるＡｘｉｎ２の発現を、経路活性の尺度として使用して、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）についてアッセイした。
【０２４７】
初代細胞内では、有効濃度の線形範囲は、０．０２５〜０．１ｎｇ／μＬのＷＮＴ３Ａであった（図１４Ａ）。また、骨髄由来幹細胞内のＬ−ＷＮＴ３Ａ活性についてもアッセイし、有効濃度の線形範囲は、０．００４〜０．０８ｎｇ／μＬの範囲にわたることを見出した（図１４Ｂ）。したがって、初代細胞集団は、Ｗｎｔ刺激に対する著明に異なる感受性を呈示した。
【０２４８】
より抜きの脂質でＣＨＡＰＳを代替して、ＷＮＴ３Ａを維持することができる。ＤＭＰＣおよびコレステロール脂質ならば、ＣＨＡＰＳを代替して、ＷＮＴ３Ａ活性を維持しうるであろう。例えば、ＭＰＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＳ、ＤＭＰＧ、およびＤＭＧＥなど、他の脂質で作製されたリポソームは、不活性であった（図１５）。
【０２４９】
脂質によるＷＮＴ３Ａの再構成
高温では、多くのタンパク質が変性し、体温でこのような変性を回避することが、タンパク質治療剤の持続期間を拡張する鍵である。リポソームパッケージングにより、Ｗｎｔ３ａの生物学的活性が保存され、この処方物は、複数の骨損傷適用において有効性を持ちうる。Ｗｎｔ３ａの、リポソームに対するアフィニティーおよびこの会合の安定性について特徴付けた。Ｌ−ＷＮＴ３ＡによるＷｎｔ経路活性化の反応速度および動態が裏付けられた。
【０２５０】
ＷＮＴ３Ａとリポソームとの間のアフィニティー：スクロースの密度勾配データにより、ＷＮＴ３Ａポリペプチドと脂質との間の物理的会合が裏付けられた（図１６）。図１６のスクロース密度勾配により、ＷＮＴ３Ａと脂質との間の物理的会合が裏付けられた。ＷＮＴ３Ａポリペプチドは、高密度画分に局在化し（図１６Ａ）、この高密度画分は、ＷＮＴ活性もさらに示した（図１６Ｂ）。ウェスタン解析により、ＷＮＴ３Ａポリペプチドの大半が、この高密度画分に局在化することが裏付けられた（図１６Ｃ）。リン脂質アッセイにより、この高密度画分は、脂質の大半を含有することが裏付けられた（オレンジ線、図１６Ｂ）。したがって、ＷＮＴ３Ａ単独（低密度画分２〜３に区分される；図１６Ｄ、Ｅ）と比較すると、Ｌ−ＷＮＴ３Ａは、高密度画分にシフトし、これにより、物理的会合であり、ＷＮＴ３Ａとリポソームとの間の凝集としてではない会合が裏付けられた。
【０２５１】
Ｗｎｔ３ａとリポソームとの間のアフィニティーの推定値：Ｗｎｔ３ａ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ間の結合アフィニティーは、約３．６ｎＭであった。Ｗｎｔ３ａ／リポソーム間の結合アフィニティーは、約９ｎＭであった。Ｌ−Ｗｎｔ３ａとＦｒｉｚｚｌｅｄとの間の競合アッセイでは、Ｗｎｔ３ａは、リポソームペレット中で観察された（図１７Ａ）。さらなるインキュベーション後、Ｗｎｔ３ａは、リポソームペレットから解離し、上清中でＦｒｉｚｚｌｅｄと優先的に会合した（図１７Ｂ）。したがって、Ｗｎｔ３ａの、リポソーム膜に対するアフィニティーは、Ｗｎｔ３ａの、Ｆｒｉｚｚｌｅｄに対するアフィニティーより小さかった。
【０２５２】
リポソームとＬＲＰ６との間の第２の競合アッセイでは、ＬＲＰ６は、上清中で観察された（図１７Ｃ）。ＬＲＰ６を、Ｌ−Ｗｎｔ３ａの存在下でインキュベートしたところ、ＬＲＰ６タンパク質は、上清（図１７Ｃ）から、Ｌ−Ｗｎｔ３ａのペレット（図１７Ｄ）に移行した。
【０２５３】
結論：これらのプルダウンアッセイに基づくと、Ｗｎｔ３ａとリポソーム膜との間の結合アフィニティーは、約６ｎＭであると推定された。また、これらのアッセイにより、リポソーム膜内で再構成されたＷｎｔ３ａが、そのレポーターであるＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰ６と相互作用しうるような様式で配置されることも裏付けられた。
【０２５４】
ＷＮＴ３Ａのリポソームとの会合の反応速度
ＬＳＬレポーター細胞アッセイおよびＰＡＧＥ−ウェスタンブロット解析に基づくと、Ｗｎｔ３ａは、リポソームと急速に会合し、この会合は、ポリペプチドの活性を維持する一因となった。当初、Ｗｎｔ３ａ活性は、上清中で観察された。約３０分間の経過にわたり、Ｗｎｔ３ａポリペプチドは、上清からペレットに、約３×１０−３ｎＭ／秒の速度で移動した（図１８Ａ）。６時間後までに、Ｗｎｔ３ａ活性のうちの９０％は、ペレット中で観察された。同様に、ウェスタンブロット解析は、ポリペプチドのうちの９０％が、ペレット中で見出されることを示した（図１８Ｂ）。２３℃で２４時間後、リポソームは、水性の上清から遠心分離により分離された。ペレット中に、目視可能なポリペプチドの沈殿は観察されなかった。ウェスタンブロットにより、Ｗｎｔ３ａの大半は、リポソームペレット中に存在することが裏付けられた（図１８Ｃ）。図１８Ｄは、実験終了時における、上清中およびペレット中のＷｎｔ３ａ活性を示す。
【０２５５】
図１９は、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ１０ｂの、リポソームとの相互作用を説明する（図１９）。
【０２５６】
スケールアップ実験：冷凍庫の備蓄からの細胞を、１５ｃｍの組織培養プレートに播種した。３７℃、５％のＣＯ２で、３〜４日間にわたるインキュベーション後、細胞を、１：５で、２×１５ｃｍのプレートに、４日間にわたり増殖させた。これらの細胞を、１：５で、２０×１５ｃｍのプレートにさらに増殖させた。インキュベーションの２４時間後、細胞を、ドキシサイクリンで誘導した。ＣＭを、２４時間ごとに回収し、４℃で保存した。ＣＭの活性を測定して、ＷＮＴ３Ａの分泌を確認した。１％のＴｒｉｔｏｎＸを、１ＬのＣＭに添加し、０．２２μｍのフィルターを介して濾過した。次いで、ＣＭを、１５０ｍｌのＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードした。この試験から、８０μｇのＷＮＴ３Ａを、ＫＣｌ勾配中で溶出させる結果として、４０％の合計収率をもたらした。
材料および供給元
ＣＨＯ細胞：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
プラスミドベクター：Ｐｒｏｍｅｇａ
脂質：Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ
Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製カラム：
ＷＮＴ３Ａ標準物質：Ｓｔｅｍ  Ｒ＆Ｄ
ＬＳＬ細胞：
超遠心分離機：
略号
ＢＧＭ：骨移植片材料
ＢＧＭＡＣＴ：Ｌ−ＷＮＴ３Ａ活性化骨移植片材料
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
ＣＭ：馴化培地
Ｆｚ：ＷＮＴ受容体である、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ
ＨＥＫ：ヒト胎児由来腎臓
ＬＳＬ：マウスＬ細胞（ｍｏｕｓｅ  Ｌ  ｃｅｌｌ）
Ｌ−ＷＮＴ３Ａ：リポソームＷＮＴ３Ａ
ＭＥＦ：マウス胚性線維芽細胞
【０２５７】
（実施例２）
ヒトＷｎｔ３ａポリペプチドは、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系の、ヒトＷｎｔ３ａ核酸を保有するプラスミドによるトランスフェクションを介して産生させた。リポフェクチンベースのトランスフェクション法を使用した。プラスミドは、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下に置いた。Ｗｎｔ３ａで形質転換されたＣＨＯ細胞を、付着培養物中、またはＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）＋１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（グルタミンベースのジペプチド）、抗生剤（例えば、ドキシサイクリン）、Ｇ４１８、非必須アミノ酸、ブラストサイジン（blasticidine）、および血清を含有する培養培地中の懸濁培養物中、約３２〜３７℃の範囲にわたる温度で増殖させた。ＣＨＯ細胞から分泌されるＷｎｔ３ａの量は、それらを付着培養物として増殖させたのか、懸濁培養物として増殖させたのかに依存した。ドキシサイクリンは、培地に、ＣＨＯ細胞により産生されるヒトＷｎｔ３ａの量をモジュレートしうる範囲の濃度で添加した。培養培地は、ＣＨＯ細胞がＷｎｔ３ａを分泌する培養期間を通して存在する、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含んだ。細胞は、最長１０日間にわたり増殖させることができ、その後、細胞の新たなアリコートを使用した。
【０２５８】
連続勾配またはゲル濾過を使用する精製スキームと比較して、本精製スキームでは、段階勾配を使用し、これにより、表１および２に示される通り、高純度および高収率がもたらされる。連続勾配またはゲル濾過を使用する精製スキームでは、連続的な塩勾配を、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上で、１５０ｍＭ〜１．５ＭのＮａＣｌにわたりランさせた後、ゲル濾過およびヘパリン硫酸カラムにかけた。場合によって、本明細書の別の個所で記載される通り、本スキームではまた、疎水性カラム（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム）などの疎水性精製ステップも利用する。
【０２５９】
表１は、本発明の精製ステップにより得られた結果を示し、表２は、連続勾配精製ステップまたはゲル濾過精製ステップを使用する精製スキームにより得られた結果を示す。
【表１】
2019206551.tif 000011
【表２】
2019206551.tif 000012
【０２６０】
（実施例３）
動物
全ての手順は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより承認されたプロトコールに従った。ベータ−アクチン増強緑色蛍光タンパク質（ＡＣＴＢ−ｅＧＦＰ；Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＣＤ１が野生型の同系マウスを使用した。マウス＜３カ月齢を若齢と考え、マウス＞１０カ月齢を老齢と考えた。Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ／＋およびＲ２６ＲｍＴｍＧ／＋マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから購入した。老齢野生型Ｌｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ、ＭＡ製の「リタイアードブリーダー」）は、ＡＡＵＣガイドラインおよびＩＵＰＡＣガイドラインに従う脊椎固定術のために利用した。
【０２６１】
齧歯動物モデルのための、骨移植片材料（ＢＧＭ）の回収および処置
この研究では、ラットおよびマウスの両方を採用した。マウスモデルの使用により、広範なスペクトルにわたる分子解析が可能となるが、自家移植片は、これらの小型動物には高度に侵襲性であるため、自家移植を実施する場合は、ラットを使用し（例えば、図２０および２５）、先進的な分子的技法を採用する場合は、同系マウスを使用した（図２１〜２４）。全ての例において、骨移植片材料（ＢＧＭ）は、骨長手方向に引き裂き、骨内膜面を、鋭利な器具で静かにこすり取り、骨髄内容物を、回収ディッシュに潅流することにより、大腿骨、脛骨、および腸骨稜から採取した。この方法では、ヒトにおいて使用されるリーマー／潅流／吸引（ＲＩＡ）法を模倣した。
【０２６２】
Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ／＋；Ｒ２６ＲｍＴｍＧ／＋マウスにおける組換えを誘導する（図２１）ため、動物に、連続５日間にわたるＩＰ注射または強制経口投与を介して、体重１ｇ当たり１６０μｇのタモキシフェンを施した。組織は、最初の処置の７日後に採取し、ＧＦＰ免疫染色または蛍光により解析した。
【０２６３】
腎被膜下（ＳＲＣ）への移植のためのＢＧＭアリコートが、細胞含量に関して同等であることを確認するため、３匹のマウス（同腹仔）に由来するＢＧＭをプールし、次いで、移植アッセイにおける場合とまったく同様に、２０μＬのアリコートに分割した。ＤＮＡ内容物は、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出し、相対ＤＮＡ濃度は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびマイクロプレート蛍光リーダー（ＢＥＲＴＨＯＬＤ、Ｂａｄ  Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。ＤＮＡ含量のパーセント変動は、＜２０％であった（図２６）。
【０２６４】
ＢＧＭＡＣＴを得るために、採取されたばかりのＢＧＭを、リン酸緩衝食塩水によるリポソーム処方物（Ｌ−ＰＢＳ）またはＷＮＴ３Ａによるリポソーム処方物（Ｌ−ＷＮＴ３Ａ；Ｌ−ＷＮＴ３Ａの有効濃度＝０．１５μｇ／ｍＬ）を含有する、２０μＬの培養培地に入れ、２３℃で１時間にわたり維持した。
【０２６５】
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
組織試料は、ＴＲＩｚｏｌ溶液中でホモジナイズした。ＲＮＡを単離し、逆転写を実施した。定量的リアルタイムＰＣＲは、Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍおよびＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実行した。遺伝子発現のレベルは、ΔΔＣＴ法およびそれらのＧＡＰＤＨ値に照らした標準化により決定した。全ての反応は、三連で実施し、平均および標準偏差を計算した。
【０２６６】
プライマー配列（５’から３’へ）は、以下の通りである：Ａｘｉｎ２、［ｆｏｒ−ＴＣＡＴＴＴＴＣＣＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＣＧＣ］、［ｒｅｖ−ＧＣＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣ］；Ｌｅｆ１、［ｆｏｒ−ＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴ］、［ｒｅｖ−ＣＧＴＧＣＡＣＴＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＡＴ］；ＧＡＰＤＨ、［ｆｏｒ−ＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧ［ｒｅｖ−ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴ］；ＡＬＰ［ｆｏｒ−ＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣ、［ｒｅｖ−ＣＡＴＡＴＡＧＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＧ］；Ｏｓｔｅｒｉｘ、［ｆｏｒ−ＧＧＡＧＡＣＣＴＴＧＣＴＣＧＴＡＧＡＴＴＴＣ］、［ｒｅｖ−ＧＧＧＡＴＣＴＴＡＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＡＡＣ］；Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、［ｆｏｒ−ＴＧＴＧＡＣＧＡＧＣＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＧ］、［ｒｅｖ−ＧＡＧＧＡＴＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣ］。
【０２６７】
ウェスタン解析
ＢＧＭを、若齢（Ｎ＝５）マウスおよび老齢（Ｎ＝５）マウスから採取し、次いで、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に入れ、５％のＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。２４時間後、非付着細胞を除去し、培地を置きかえ、付着細胞を、それらがコンフルエンスに達するまで継代培養した。培地は、３日ごとに交換した。一部の実験では、継代３代目の後の細胞を、Ｌ−ＰＢＳまたはＬ−ＷＮＴ３Ａ（有効濃度＝０．０３μｇ／ｍＬ）で処置した。これらの実験では、細胞を２４時間後に回収し、ＲＩＰＡ緩衝液を使用して溶解させた。ウェスタン解析のために、全タンパク質を抽出した。パンアクチンを、内部対照として使用して、タンパク質の完全性を確認した。ＷＮＴ３Ａ、非リン酸化β−カテニン、およびＡｘｉｎ２に対する抗体を使用した。積分強度は、ＩｍａｇｅＪにより解析して、ウェスタンブロット法による結果を定量した。
【０２６８】
腎被膜下移植術
場合によって、腎被膜下アッセイ（ＳＲＣＡ）を採用して、その分化潜在能についてアッセイした。同系宿主マウスに麻酔剤を吸入させた後、胸郭に対してすぐの尾側の左脇腹に皮膚切開を施した。腹腔を開いて、腎臓を露出させた。腎被膜に小さな切開を施し、軟性プラスチックチューブを使用して、ＢＧＭを、被膜下に、注意深く入れた。次いで、腎臓を、腹腔に戻し、腹膜および皮膚を、縫合糸により閉止した。鎮痛のために、ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を使用した。
【０２６９】
ＢＧＭを、Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２；Ｒ２６ｍＴｍＧドナーから採取する場合は、その後、宿主に、０日目に開始して５日間にわたる強制経口投与（１０ｍｇ／ｍＬで１００μＬ）により、タモキシフェンを施した。ＳＲＣ移植片は、表示の時点に採取した。
【０２７０】
アデノウイルスに媒介される、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害
ＤＫＫ１のアデノウイルス構築物および陰性対照であるＦｃのアデノウイルス構築物を作製した。アデノウイルス構築物を、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、細胞を回収し、溶解させ、遠心分離により沈殿させた。精製アデノウイルスをアリコートにし、−８０℃で保存した。Ｗｎｔの阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＢＧＭの、Ａｄ−Ｄｋｋ１および対照Ａｄ−Ｆｃとの、２時間にわたるインキュベーションにより達成し、次いで、ＢＧＭアリコートを、頭蓋冠欠損に移植した。
【０２７１】
頭蓋冠の臨界サイズ欠損術
マウスに麻酔をかけ、３ｍｍの切開を施して、頭頂骨を露出させた。マイクロダイセクション用尖頭器を使用して、直径を２ｍｍとする、環状の全層欠損を創出したが、硬膜は攪乱させなかった。ＢＧＭアリコートを、Ａｄ−Ｄｋｋ１および対照Ａｄ−Ｆｃと共に、２時間にわたりインキュベートした。次いで、ＢＧＭアリコートを、頭蓋冠欠損に移植し、縫合糸により皮膚を閉止した。手術からの回復後、鎮痛のために、マウスにブプレノルフィンを施した。
【０２７２】
Ｍｉｃｒｏ−コンピュータ断層撮影（Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ）解析は、以下の通りに実施した。マウスに、２％のイソフルランで麻酔をかけ、４０μｍの分解能で、マルチモードポジトロン断層法−コンピュータ断層撮影データ収集システム（Ｉｎｖｅｏｎ  ＰＥＴ−ＣＴ）を使用して走査した。データは、ＭｉｃｒｏＶｉｅｗソフトウェアで解析した。三次元関心領域ツールを使用して、各試料について、構造および骨体積を割り当てた。
【０２７３】
再生物の骨体積画分（合計骨体積を、再生物の骨体積で除することにより計算される百分率［ＢＶ／ＴＶ、％］）の評価は、高分解能のｍｉｃｒｏ−ＣＴ（ｖｉｖａＣＴ４０）、ならびに７０ｋＶｐ、５５μＡ、２００ミリ秒の積分時間、および１０．５μｍのイソトロピックボクセルサイズを使用して実施した。関心領域は、２ｃｍの長さであり、欠損の縁辺部の近位２５０μｍから、欠損の反対側の縁辺部を越えた遠位２５０μｍに広がる（全直径を１．５ｃｍとする）。骨は、１ｃｍ３当たりのヒドロキシアパタイト２７５ｍｇの閾値を使用して、軟組織から区分した。走査および解析は、公表されているガイドラインに準拠した。
【０２７４】
脊椎固定術
７０〜１００ｍｇ／ｋｇのケタミンと、５〜１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンとのカクテルを使用して、Ｌｅｗｉｓラットに麻酔をかけた。次いで、ラットの腰部領域を剃毛し、Ｂｅｔａｄｉｎｅに浸漬したガーゼで消毒した。皮膚を切開する前に、ラットに、鎮痛剤である０．０２ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンをＳＣ／ＩＰ注射した。まず、骨移植片材料（ＢＧＭ）を、腸骨稜から採取した。略述すると、左腸骨棘を触診し、垂直方向の皮膚切開を施し、腸骨棘の背側隆起にアクセスし、ブラントダイセクションにより露出させた。付着した筋肉および骨膜を持ち上げ、０．３ｇのＢＧＭを、彫骨鉗子で採取し、少量に分配した。次いで、ＢＧＭを、１００μＬのＬ−ＰＢＳまたは１００μＬ［０．１５μｇ／ｍＬ］のＬ−Ｗｎｔ３ａと共にインキュベートする一方で、横突起を露出させた。
【０２７５】
横突起を露出させるために、後側部のブラントダイセクションを実施し、反射した傍脊柱筋を、開創器により、その場に保持した。Ｌ４〜Ｌ５にわたる横突起から、骨膜を取り除き、バーで皮質を除去した。ＢＧＭを、Ｌ４〜Ｌ５の横突起の上および間に塗布した。傍脊柱筋を、吸収性縫合糸（４−０  Ｖｉｃｒｙｌ；Ｅｔｈｉｃｏｎ）で閉止し、皮膚を、結節非吸収性縫合糸（４−０  Ｎｙｌｏｎ；Ｅｔｈｉｃｏｎ）で閉止した。手術部位を、抗生剤軟膏で処置した。１０ｍｇ／ｋｇのＢａｙｔｒｉｌを、皮下送達した。ブプレノルフィン（０．０２ｍｇ／ｋｇ）を、手術後３日間にわたり投与し、その後の投薬は、疼痛をコントロールする必要に応じて施した。
【０２７６】
試料の調製、組織の加工、組織学
組織は、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中、４℃で一晩にわたり固定した。試料は、１９％のＥＤＴＡ中で、１日間にわたり脱灰した。検体は、昇順のエタノール系列により脱水してから、パラフィン包埋した。８ミクロンの厚さの長型切片を切り出し、組織学のために、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ−ｐｌｕｓスライド上に回収した。サフラニンＯ染色、アニリンブルー染色、およびゴモリ染色を実施した。組織切片は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ５０００Ｂデジタルイメージングシステムを使用して写真撮影した。
【０２７７】
ＡＬＰ染色、ＴＲＡＰ染色、およびＴＵＮＥＬ染色
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、およびＮＴＭ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ９．５、５ｍＭのＭｇＣｌ）中のインキュベーションにより検出した。酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性は、製造元の指示書に従って、白血球酸ホスファターゼ染色キットを使用して観察した。現像の後、スライドを、エタノールの希釈系列中で脱水し、Ｃｉｔｒｉｓｏｌｖ中で清浄化し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ封入剤でカバースリップ処理した。ＴＵＮＥＬ染色のために、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１％のクエン酸ナトリウムを使用して、切片を透過処理し、ＴＵＮＥＬ反応混合物（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）と共にインキュベートした。切片は、ＤＡＰＩ封入剤で封入し、落射蛍光顕微鏡下で視覚化した。
【０２７８】
ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）アッセイのために、マウスに、ＢｒｄＵ標識化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）の腹腔内注射を施し、注射の４時間後に安楽死させた。ＢｒｄＵの検出は、製造元の指示書に従って、ＢｒｄＵ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して実行した。
【０２７９】
免疫組織化学
組織切片を脱パラフィンし、ＰＢＳ中で再水和させた。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％の過酸化水素により、５分間にわたりクェンチングし、次いで、ＰＢＳ中で洗浄した。スライドを、５％のヤギ血清により、室温で１時間にわたりブロッキングした。適切な一次抗体を添加し、４℃で一晩にわたりインキュベートした。次いで、試料を、適切なビオチニル化二次抗体およびアビジン（advidin）／ビオチニル化酵素複合体と共にイン
キュベートし、ＤＡＢ基質キットで現像した。使用される抗体は、ＧＦＰ抗体、ならびにＤＬＫ１抗体、Ｒｕｎｘ２抗体、Ｓｏｘ９抗体、およびＰＰＡＲ−γ抗体を含んだ。
【０２８０】
移植片成長についてのＭｉｃｒｏ−ＣＴ解析および定量
走査および解析は、公表されているガイドラインに準拠した。ラットに、２％のイソフルランで麻酔をかけ、５２μｍの分解能で、ｍｉｃｒｏ−コンピュータ断層撮影データ収集システム（Ｉｎｖｅｏｎ）により走査した。各試料内で生じた移植片成長を規定するために、時点ＰＯＤ２およびＰＯＤ４９の走査データを、Ｏｓｉｒｉｘソフトウェアバージョン５．８にエクスポートし、セグメンテーションのために、同じ配向性で登録した。形成された新たな骨を、移植された初期のＢＧＭ体積と比較した。データセット間の差異は、ＸＬＳｔａｔソフトウェアバージョン内のマン−ホイットニー検定を利用することにより決定した。ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意と考えた。
【０２８１】
定量および統計学的解析
ＧＦＰ染色、ＢｒｄＵ染色、ＴＵＮＥＬ染色、ＤＬＫ１染色、オステオカルシン染色、およびアニリンブルー染色を定量した。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ５を使用して、損傷部位における関心領域（ＲＯＩ）内のピクセル数を決定した。ｍａｇｉｃ  ｗａｎｄツールを使用して、ＲＯＩ内の陽性ピクセルの面積を定めた。陽性シグナルピクセルの、ＲＯＩピクセルに対する比を、百分率として表した。損傷部位にわたり等間隔を置いた、少なくとも５つの切片を定量して、各試料の平均値を決定した。各群に５例ずつの試料を組み入れた（ｎ＝５）。結果は、平均±ＳＤとして提示する。本明細書で記載される通り、スチューデントのｔ検定を使用して、差異を定量した。Ｐ≦０．０５を、有意と考えた。
【０２８２】
骨移植片材料は、複数の幹細胞集団／前駆細胞集団を含有する
場合によって、自家移植片を採取するのに最適な解剖学的部位は、ドナー部位の罹患状態および骨備蓄の利用可能性を含む、多数の因子に依存する。改変リーマー潅流吸引（ＲＩＡ）法を使用して、ＢＧＭを、３カ所の解剖学的部位から採取したところ、大腿骨、腸骨稜、および脛骨は、組織学的外見が顕著に異なるＢＧＭをもたらすことが注目された。大腿骨のＢＧＭは、若齢動物から採取する場合であってもなお、造血細胞に加えて、脂肪細胞も含有した（図２０Ａ）。腸骨稜のＢＧＭは大部分、緊密な付着細胞で覆われた骨梁断片を含んだ（図２０Ｂ）。脛骨に由来するＢＧＭは、大量の線維性間質、および小型の無核細胞を含有した（図２０Ｃ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、内因性骨形成遺伝子の発現を査定し、３つの供給源のうち、腸骨稜のＢＧＭが、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンを、有意に高レベルで発現させることを見出した（図２０Ｄ）。
【０２８３】
場合によって、自家移植片の骨形成特性は、骨移植片材料（ＢＧＭ）内の幹細胞集団／前駆細胞集団および骨芽細胞に帰せられると考えられる。ＢＧＭを、腎被膜下（ＳＲＣ）アッセイに移植することにより、自家移植片の、この骨形成特性について調べた。ＳＲＣは、移植された組織に血管を供給し、細胞の、複数の種類の組織であって、骨、皮膚、筋肉、歯、臓器、および腫瘍を含む組織への分化を支援する。ＢＧＭを、腸骨稜から採取し、次いで、動物の腎被膜の下に移植し（図２０Ａ）、７日間にわたりそこで発生させた。
【０２８４】
ＢｒｄＵの取込みにより、自家ＢＧＭ内の細胞の高度な有糸分裂活性が裏付けられた（図２０Ｂ）。Ｒｕｎｘ２（図２０Ｃ）、Ｓｏｘ９（図２０Ｄ）、およびＰＰＡＲγ（図２０Ｅ）についての免疫染色により、ＢＧＭ内の細胞のサブセットは、骨形成、軟骨形成、および脂肪形成へのコミットメントと関連した遺伝子マーカーを発現させることが裏付けられた。７日目には、ＢＧＭ由来細胞の部分集団は、骨（図２０Ｆ）、軟骨（図２０Ｇ）、および脂肪（図２０Ｈ）に分化していた。まとめると、これらのデータにより、ＢＧＭは、３つの系統全てに分化することが可能な幹細胞／前駆細胞を含有することが裏付けられた。
【０２８５】
骨移植片材料内のＷｎｔシグナル伝達は、年齢と共に減衰する
Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２；Ｒ２６ｍＴｍＧレポーターマウスを使用して、組換えを誘導し、これにより、骨膜（図２１Ａ）内および骨内膜（図２１Ｂ）内のＧＦＰ＋ｖｅ前骨芽細胞を同定した。骨内膜内のＧＦＰ＋ｖｅ細胞の頻度は、約０．１％であった（図２１Ｃ）。ＧＦＰ＋ｖｅ細胞はまた、採取されたばかりのＢＧＭ内でも同定された（図２１Ｄ）。したがって、異種性ＢＧＭ内の細胞のサブセットは、Ｗｎｔ応答性である。
【０２８６】
若齢（＜３カ月齢）マウスに由来するＢＧＭのＷｎｔ応答性状態と、老齢（＞１０カ月齢）マウスに由来するＢＧＭのＷｎｔ応答性状態とを比較した。定量的絶対ＲＴ−ＰＣＲにより、老齢マウス（ＢＧＭａｇｅｄ）から採取されたＢＧＭ内では、Ｗｎｔの標的遺伝子である、Ａｘｉｎ２およびＬｅｆ１の発現が、若齢マウス（ＢＧＭｙｏｕｎｇ）から採取されたＢＧＭ内と対比して、ほぼ２分の１であることが裏付けられた（図２１Ｆ）。ウェスタン解析により、ＢＧＭａｇｅｄ内のＷｎｔ３ａ、リン酸化ベータカテニン、およびＡｘｉｎ２の発現は全て、ＢＧＭｙｏｕｎｇ内と比較して、有意に低度であることが確認された（図２１Ｇ）。したがって、ＢＧＭの内因性Ｗｎｔ応答性状態は、年齢と共に劣化する。
【０２８７】
骨分化能もまた、年齢と共に低下する
ヒトでは、骨治癒率は、年齢と共に低下する。ＢＧＭの骨形成能の、同様な加齢に伴う低下はまた、マウスにおいても見出された。採取されたばかりのＢＧＭａｇｅｄは、骨形成遺伝子である、アルカリホスファターゼ、Ｏｓｔｅｒｉｘ、およびオステオカルシンの、採取されたばかりのＢＧＭｙｏｕｎｇと比較して有意に低い発現レベルを示した（図２２Ａ）。
【０２８８】
骨形成遺伝子の発現の低減が、ＢＧＭの骨形成能に影響を及ぼすのかどうかについて調べるために、ＳＲＣアッセイを使用した。しかし、マウスにおいて自家移植を実施することは、明らかに外傷性である。自家移植を模倣するために、同系のドナーおよび宿主を使用した。同系動物は、極めて近縁であるため、それらの組織は、免疫学的に適合性であり、組織の移植は、免疫応答を引き起こさない。ドナーとして用いられたＡＣＴＢ−ｅＧＦＰマウスおよびＢＧＭは、そのＧＦＰ蛍光により、ＳＲＣ内でたやすく同定可能であった（図２２Ｂ、図２２Ｃ）。
【０２８９】
移植の７日後、ＢＧＭを採取し、骨形成の証拠について解析した。アニリンブルー染色された類骨マトリックスは、ＢＧＭｙｏｕｎｇ内では明らかであった（図２２Ｄ）が、ＢＧＭａｇｅｄ内では見られなかった（図２２Ｅ；図２２Ｆで定量されている）。ＢＧＭｙｏｕｎｇ内の類骨マトリックスは、ＡＬＰ染色により示される通り、石灰化を経つつあった（図２２Ｇ）が、ＢＧＭａｇｅｄは、ＡＬＰ染色を示さなかった（図２２Ｈ；Ｉで定量されている）。さらに、ＧＦＰ免疫染色により、ＢＧＭｙｏｕｎｇ（図２２Ｊ）およびＢＧＭａｇｅｄ（図２２Ｋ）のいずれにおいても、見られる生存ドナー細胞の数は同様であることが裏付けられた（図２２Ｌで定量されている）。まとめると、これらのデータは、ＢＧＭによる骨形成遺伝子の発現および骨形成能が、年齢と共に低下することを指し示した。
【０２９０】
ＢＧＭによるＷｎｔシグナル伝達および骨形成能
ＢＧＭの内因性Ｗｎｔ応答性および骨形成能は、年齢と共に減殺される。Ｗｎｔシグナル伝達の低減が、この加齢に伴う骨形成潜在能の低下に寄与するのかどうかについて調べるために、ＢＧＭ内の内因性Ｗｎｔシグナル伝達を遮断した。また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＷｎｔシグナル伝達を、一過性に消滅させるのに、Ｗｎｔの過剰発現に対する阻害剤であるＤｋｋ１も使用した。Ａｄ−Ｄｋｋ１またはＡｄ−Ｆｃ（対照）を、若齢マウスの骨髄腔に送達し、次いで、２４時間後にＢＧＭｙｏｕｎｇを採取し、アリコートを、臨界サイズ（非治癒性）の骨格欠損に移植した。
【０２９１】
対照ＢＧＭｙｏｕｎｇが、ＡＬＰ活性について強く陽性となった（図２３Ａ）、７日後において、Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭｙｏｕｎｇは、最小の活性を示した（図２３Ｂ）。その代わりに、Ａｄ−Ｄｋｋ１で処置されたＢＧＭｙｏｕｎｇは、脂肪形成タンパク質であるＰＰＡＲ−γ（図２３Ｃ、図２３Ｄ）およびＤｌｋ１（図２３Ｅ、図２３Ｆ）の広範な発現を示した。ＢＧＭについてのｍｉｃｒｏ−ＣＴ（図２３Ｇ、図２３Ｈ；図２３Ｉで定量されている）および組織形態計測解析（図２３Ｊ、図２３Ｋ；図２３Ｌで定量されている）により示される通り、骨形成は、Ａｄ−Ｄｋｋ１処理により抑制された。したがって、ＢＧＭの骨形成能は、内因性Ｗｎｔシグナルに依拠する。
【０２９２】
ＢＧＭａｇｅｄ内の内因性Ｗｎｔシグナルを増進させることにより、その骨形成能を回復させる
図２３Ｊ〜図２３Ｌにより、内因性Ｗｎｔシグナル伝達は、ＢＧＭの骨形成能を活性化させうることが示された。また、Ｗｎｔによる刺激が、ＢＧＭの有効性を増強するのに十分であるのかどうかについても調べた。ＢＧＭａｇｅｄを採取し、Ｌ−ＷＮＴ３ＡまたはリポソームＰＢＳ（Ｌ−ＰＢＳ）で処置し、次いで、３７℃でインキュベートした（図２４Ａ）。絶対ｑＲＴ−ＰＣＲ解析により、Ａｘｉｎ２発現のわずかな上昇が明らかにされた（図２４Ｂ）。Ｌｅｆ１は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａに応答して、わずかに上昇した（図２４Ｂ）。ウェスタン解析は、ベータカテニンタンパク質およびＡｘｉｎ２タンパク質のいずれもが、Ｌ−ＷＮＴ３Ａに応答して上昇することを指し示した（図２４Ｃ）。
【０２９３】
ＢＧＭ内の有糸分裂活性は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置により増大した。移植後４日目に、Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたＢＧＭａｇｅｄでは、細胞増殖が、Ｌ−ＰＢＳで処置されたＢＧＭａｇｅｄと比較して増大した（図２４Ｄ、図２４Ｅ；図２４Ｆで定量されている）。細胞周期に対する影響は、一過性であった：移植後７日目までに、ＢｒｄＵの取込みは、Ｌ−ＰＢＳ試料とＬ−ＷＮＴ３Ａ試料との間で同等であった（図２４Ｇ、図２４Ｈ；図２４Ｉで定量されている）。
【０２９４】
ＢＧＭａｇｅｄ内の細胞分化について査定した。Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたＢＧＭａｇｅｄ内では、脂肪形成タンパク質であるＤｌｋ１の発現は低度であり（図２４Ｊ、図２４Ｋ；図２４Ｌで定量されている）、骨形成タンパク質であるオステオカルシンの発現は高度であった（図２４Ｍ、図２４Ｎ；図２４Ｏで定量されている）。新たな骨形成は、Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたＢＧＭａｇｅｄ内だけで見出された（図２４Ｐ、図２４Ｑ；図２４Ｒで定量されている）。Ｌ−ＷＮＴ３Ａによる処置は、生着効率に影響を及ぼさなかった（図２７Ａ、Ｂ；図２７Ｃで定量されている）が、プログラム細胞死についての解析により、Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたＢＧＭａｇｅｄが有するＴＵＮＥＬ＋ｖｅ細胞は、Ｌ−ＰＢＳで処置された試料より少ないことが裏付けられた（図２７Ｄ、図２７Ｅ；図２７Ｆで定量されている）。アポトーシスの低減はまた、移植後７日目においても観察された（図２７Ｇ、図２７Ｈ；図２７Ｉで定量されている）。新たな骨形成は、破骨細胞に媒介される骨のリモデリングのための刺激として用いられ、Ｌ−ＷＮＴ３Ａで処置されたＢＧＭａｇｅｄ試料中で新たに形成された類骨マトリックスの近傍においてＴＲＡＰ活性が観察された（図２７Ｊ、図２７Ｋ；図２７Ｌで定量されている）。
【０２９５】
Ｌ−ＷＮＴ３Ａは、ＢＧＭａｇｅｄ内の幹細胞を活性化し、脊椎固定モデルにおける骨の発生を改善する
また、ＢＧＭ内の細胞集団であって、Ｌ−ＷＮＴ３Ａに媒介される骨形成能の増大の一因となる集団も同定した。標準的な手順を利用して、２つの幹細胞集団をＢＧＭから単離し、Ｌ−ＰＢＳ（対照としての）またはＬ−ＷＮＴ３Ａを使用して、それらのＷｎｔ応答性に基づき査定した。
【０２９６】
時間経過についての解析により、幹細胞の、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置への応答が明らかにされた。Ｌ−ＷＮＴ３Ａへの曝露の１５時間以内に、Ａｘｉｎ２の４倍の活性化が観察され、３６時間後には、最大のＡｘｉｎ２の活性化が達成された（図２５Ａ）。６０時間後の時点における、幹細胞内のＡｘｉｎ２発現の低下により示される通り、効果は一過性であった（図２５Ａ）。ＢＧＭから単離された第２の幹細胞集団を使用して、幹細胞がＬ−ＷＮＴ３Ａに応答することを検証した（図２５Ｂ）。
【０２９７】
ＢＧＭの活性化状態は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより示された。ＢＧＭａｇｅｄを採取し、Ｌ−ＷＮＴ３ＡまたはＬ−ＰＢＳで処置し、次いで、Ａｘｉｎ２発現およびＬｅｆ１発現を使用して、そのＷｎｔ応答性状態について解析した（図２５Ｃ）。１２時間以内に、Ｌｅｆ１の上昇が検出可能となった。２４時間以内に、Ａｘｉｎ２およびＬｅｆ１のいずれもが上昇した（図２５Ｃ）。これらの解析により、ＷＮＴに媒介されるＢＧＭの活性化状態が確認されるが、本明細書の以下では、この材料を、ＢＧＭＡＣＴと称する。
【０２９８】
また、ラット脊椎固定モデルにより、ＢＧＭＡＣＴの治療的可能性についても調べた。第４腰椎および第５腰椎（例えば、Ｌ４〜５）の横突起から、皮質を除去し（図２５Ｄ）、この手順中に、腸骨稜に由来する自家ＢＧＭａｇｅｄを採取し、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ（またはＬ−ＰＢＳ）で、１時間にわたり処置した。次いで、結果として得られる材料であるＢＧＭＡＣＴ（またはＢＧＭａｇｅｄ）を、Ｌ４突起およびＬ５突起、ならびにＬ４突起〜Ｌ５突起の間に移植した（図２５Ｅ）。手術後２日目に、ｍｉｃｒｏ−ＣＴにより、ＢＧＭの体積について査定した。これらの解析により、ＢＧＭａｇｅｄ（図２５Ｆ）およびＢＧＭＡＣＴ（図２５Ｇ）が、当初は、同等量の石灰化組織を含有することを検証した（また、図２６も参照されたい）。
【０２９９】
手術後４９日目に、新たな骨形成の体積について再査定した。ｍｉｃｒｏ−ＣＴデータの三次元再構成により、ＢＧＭａｇｅｄで処置された部位内の骨再生は低度であることが裏付けられた（グレー；図２５Ｈ）。これに対し、ＢＧＭＡＣＴで処置された部位は、頑健な骨形成および横突起の融合の証拠を示した（青色；図２５Ｉ）。Ｌ４横突起およびＬ５横突起、ならびにＬ４横突起〜Ｌ５横突起の間における新たな骨体積を定量した。ＢＧＭａｇｅｄと比較して、ＢＧＭＡＣＴは、石灰化が高度なマトリックスをもたらした（図２５Ｊ）。したがって、Ｌ−ＷＮＴ３Ａ処置は、老齢動物に由来する自家移植片の骨形成能を改善する。
【０３００】
（実施例４）
Ｗｎｔ３ａの、無血清ＣＨＯ細胞に特異的なベクターからの発現
Ｗｎｔ３ａを分泌するＣＨＯ懸濁（ＣＨＯ−Ｓ）細胞はまた、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ製の発現培地など、適切な発現培地中、無血清条件下でも培養しうるであろう。ｃＧＭＰに適合するＣＨＯ−Ｓ細胞系、およびＷＮＴ３Ａをクローニングする２種類のベクターを使用した。１つのベクターは、哺乳動物への分泌シグナルと、ＣＭＶプロモーターの下流にある目的の遺伝子とを含有する遺伝子の迅速なクローニングを可能とする、ＴＯＰＯ（登録商標）適応型バイシストロニックプラスミドである、ｐＯｐｔｉｖｅｃであった。ジヒドロ葉酸レダクターゼ選択マーカーにより、迅速な選択が可能となる。このベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクションのために使用した。別のベクターは、ｐＴａｒｇｅＴであった。このベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクションのために使用し、また、ＷＮＴ３Ａを発現させる安定的な細胞系を創出するのにも使用した。
【０３０１】
ＣＨＯ細胞培養物に由来する馴化培地（ＣＭ）は、誘導後３日目〜１３日目の間に回収し、プールした。各日におけるＣＭ中のタンパク質の産生についての解析に基づき、この範囲の日数を、培養条件下で最適であると決定した。これらの条件下では、高度なタンパク質産生が、３日目〜１３日目の間に生じる一方で、１３日目以後には、細胞が死滅し始めることを観察した。
【０３０２】
（実施例５）
脂質が規定された代替物による血清の置きかえ
それらを、規定されたセットの脂質で置きかえうるのかどうかを決定するために、血清中の脂質成分について調べる。木炭剥離により、非極性の親油性材料（ウイルス、増殖因子、ホルモン）を、血清から除去する。ＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳ中で増殖させる対照条件と比較して、木炭により剥離されたＦＢＳ中で増殖させたＣＨＯ細胞は、Ｗｎｔ３ａを分泌しない。これらのデータは、血清の親油性成分が、Ｗｎｔ３ａの分泌に要請されるという結論を裏付ける。コレステロール、トコフェロール、および非動物由来の脂肪酸（リノール（inoleic）酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、お
よびステアリン酸）を含有するＬｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ１（Ｓｉｇｍａ）の補充により、ＣＨＯ細胞の増殖速度が改善され、Ｗｎｔ３ａの分泌が、ＣＨＯ細胞に回復される。
【０３０３】
（実施例６）
血清依存性の段階的な低減
また、ＷＮＴ３Ａを産生するための、血清非依存的なプロセスに到達するための手段としての逐次培養についても調べる。ＣＨＯ細胞の増殖速度は、血清の低減と同時的に低減され、結果として、馴化培地を回収するための時間枠をシフトさせることが重要となる。場合によって、細胞を、０．５％のＦＢＳに適応させる。
【０３０４】
前出の記載では、ある特定の実施形態に言及しながら、本発明について説明してきたが、本発明は、このように限定されるわけではない。実際、前出の記載から、当業者には、本明細書で示されて記載される改変に加えて、本発明の多様な改変も明らかであり、これらは、付属の特許請求の範囲内に収まるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月26日(2019.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における骨欠損の処置のための組成物であって、哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームを含有する水溶液とを含み、
前記リポソームは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）であるリン脂質を含み、前記リポソームは、コレステロールを含み、ＤＭＰＣとコレステロールの濃度が、７０：３０〜９０：１０の間の比によって規定され、
前記組成物は、哺乳動物骨髄幹細胞を含む試料を前記組成物とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ；前記試料が、遊離リポソームＷｎｔポリペプチドを除去するように洗浄され；かつ、前記組成物が、骨欠損部位に移植されるときに、骨欠損の処置を提供することを特徴とする、
組成物。
【請求項２】
前記接触させる温度が、０℃〜３７℃、または２０℃〜２５℃である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記接触させる時間が、３０分間〜４時間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物の骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記哺乳動物の骨髄細胞が自家骨髄細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＷｎｔポリペプチドがＷｎｔ３ａポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＷｎｔポリペプチドがＷｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｗｎｔポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において修飾された脂質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記脂質の修飾がパルミトイル化である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記Ｗｎｔポリペプチドがさらにグリコシル化される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
安定な組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
活性の実質的な喪失を伴わずに最長約１０６日間安定である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
約１℃〜約８℃の間の温度で安定である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
窒素下で安定である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記哺乳動物骨髄細胞が３５歳またはこれより老齢の被験体から採取される、請求項１に記載の組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月9日(2019.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における骨欠損の処置のための組成物であって、哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドと、リポソームを含有する水溶液とを含み、
前記リポソームは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）であるリン脂質を含み、前記リポソームは、コレステロールを含み、ＤＭＰＣとコレステロールの濃度が、７０：３０〜９０：１０の間の比によって規定され、
前記組成物は、哺乳動物骨髄幹細胞を含む試料を前記組成物とｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ；そして、前記組成物が、骨欠損部位に移植されるときに、骨欠損の処置を提供するものであることを特徴とする、
組成物。
【請求項２】
前記接触させる温度が、０℃〜３７℃、または２０℃〜２５℃である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記接触させる時間が、３０分間〜４時間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物の骨髄細胞が、骨髄幹細胞および骨髄前駆細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記哺乳動物の骨髄細胞が自家骨髄細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＷｎｔポリペプチドがＷｎｔ３ａポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＷｎｔポリペプチドがＷｎｔ５ａポリペプチドまたはＷｎｔ１０ｂポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｗｎｔポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において修飾された脂質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記脂質の修飾がパルミトイル化である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記Ｗｎｔポリペプチドがさらにグリコシル化される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
安定な組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
活性の実質的な喪失を伴わずに最長約１０６日間安定である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
約１℃〜約８℃の間の温度で安定である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
窒素下で安定である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記哺乳動物骨髄細胞が３５歳またはこれより老齢の被験体から採取される、請求項１に記載の組成物。