(57)【要約】【課題】ＲＮＡポリメラーゼの酵素機能を簡便な方法で変換することで、変換前のＲＮＡポリメラーゼでは取り込むことができない核酸種を取り込む活性を獲得させる技術を提供する。【解決手段】(A)ＲＮＡポリメラーゼと、(B)ポリアルキレングリコールと、(C1)２’−修飾リボヌクレオチドと、(D)鋳型核酸とを含む(i)反応液中で、前記(D)鋳型核酸に相補的な修飾核酸を合成する工程を含み、前記(A)ＲＮＡポリメラーゼがシングルサブユニットタンパク質からなり、前記(B)ポリアルキレングリコールの平均分子量が１０〜１０００、前記(i)反応液中の濃度が１０重量％以上であり、前記(C1)２’−修飾リボヌクレオチドが、２’−ハロゲン化リボヌクレオチド及び２’−アルコキシリボヌクレオチドからなる群から選択される、核酸合成法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(A)ＲＮＡポリメラーゼと、(B)ポリアルキレングリコールと、(C1)２’−修飾リボヌクレオチドと、(D)鋳型核酸とを含む(i)反応液中で、前記(D)鋳型核酸に相補的な修飾核酸を合成する工程を含み、
前記(A)ＲＮＡポリメラーゼがシングルサブユニットタンパク質からなり、
前記(B)ポリアルキレングリコールの平均分子量が１０〜１０００、前記(i)反応液中の濃度が１０重量％以上であり、
前記(C1)２’−修飾リボヌクレオチドが、２’−ハロゲン化リボヌクレオチド及び２’−アルコキシリボヌクレオチドからなる群から選択される、核酸合成法。
【請求項２】
前記(D)鋳型核酸がプロモータ配列を含まず、前記(i)反応液が前記(D)の一部と相補的な配列を有する(E)プライマーをさらに含む、請求項１に記載の核酸合成法。
【請求項３】
前記(A)ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼである、請求項１又は２に記載の核酸合成法。
【請求項４】
前記(B)ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項１から３のいずれかに記載の核酸合成法。
【請求項５】
前記２’−ハロゲン化リボヌクレオチドが２’−フルオロリボヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸合成法。
【請求項６】
前記２’−アルコキシリボヌクレオチドにおける２’−アルコキシ基の炭素数が１〜３である、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸合成法。
【請求項７】
前記(E)プライマーが５’末端に修飾基を有する、請求項２〜６のいずれかに記載の核酸合成法。
【請求項８】
前記(i)反応液から、(C2)リボヌクレオチドを含み且つ前記(B)ポリアルキレングリコールの濃度が５重量％以下となるように希釈された(ii)反応液を調製し、前記(ii)反応液中で前記修飾核酸から前記(D)鋳型核酸に相補的なＲＮＡを伸長する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸合成法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の核酸合成法を行うためのキットであって、
(A)ＲＮＡポリメラーゼと、(B)ポリアルキレングリコールと、(C1)２’−修飾リボヌクレオチドと、を含み、
前記(A)ＲＮＡポリメラーゼがシングルサブユニットタンパク質からなり、
前記(B)ポリアルキレングリコールの平均分子量が１０〜１０００であり、
前記(C1)２’−修飾リボヌクレオチドが、２’−ハロゲン化リボヌクレオチド及び２’−アルコキシリボヌクレオチドからなる群から選択される、核酸合成キット。
【請求項１０】
鋳型核酸を固定化するための固相担体及び／又はリボヌクレアーゼＨをさらに含む、請求項９に記載の核酸合成キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸合成法に関し、より具体的には、ＲＮＡポリメラーゼの酵素機能を簡便な方法で変換することで、変換前のＲＮＡポリメラーゼでは取り込むことができない修飾核酸種を取り込ませる核酸合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸を用いた医薬品の開発が行われている。核酸を医薬品として用いる場合、その化学的安定性を高めるために、核酸に化学的修飾を施すことが知られている。しかしながら、本来の核酸ポリメラーゼは、化学的修飾された核酸に対する特異性がない。したがって、化学的修飾された核酸を基質として核酸ポリメラーゼによる核酸合成を行う場合、核酸ポリメラーゼを改変することで、化学修飾された核酸に対する基質特異性を獲得させる必要がある。改変の具体的手法としては、活性部位等のアミノ酸残基を変化させることで酵素内部の化学特性を変化させる方法が挙げられる。例えば、非特許文献１には、ＤＮＡの活性部位へのランダム変異導入によって変異体を作製することにより、本来のＤＮＡポリメラーゼでは合成できない２’−メトキシ又は２’−フルオロ部分修飾されたオリゴヌクレオチドを合成したことが開示されている。また、非特許文献２には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに変異を導入することで、２’−メトキシ修飾又は２’−フルオロ修飾されたリボース部分を取り込ませることが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】T. Chen et al., Nat. Chem. 2016, 8, 556
【非特許文献２】A. J. Meyer et al., Nucleic Acids Res. 2015, 43, 7480
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、本来の基質ではない修飾核酸をポリメラーゼに取り込ませるためのアプローチとしては、ポリメラーゼに変異を導入することが常識とされている。しかしながらこのようなアプローチで変異を導入して目的の活性を有する変異体をスクリーニングする必要があり、所望の活性を持たないポリメラーゼから所望の活性を持つポリメラーゼを取得するまでに、多大な時間と労力とが必要となる。
【０００５】
そこで本発明の目的は、ＲＮＡポリメラーゼの酵素機能を簡便な方法で変換することで、変換前のＲＮＡポリメラーゼでは取り込むことができない核酸種を取り込む活性を獲得させる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いた核酸合成法において、反応液中に高濃度のポリエチレングリコールを加えることで、ＲＮＡポリメラーゼの本来の基質であるＲＮＡ合成が抑制され、本来の基質ではないＤＮＡの合成が促進されたことを発見した。つまり、反応液中にポリエチレングリコールを高濃度で加えることで、ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ様の活性挙動を示す酵素に変化することを見出した。
【０００７】
本発明者は、このようなポリエチレングリコールを含む反応液中で活性挙動がＤＮＡポリメラーゼ様に変化するＲＮＡポリメラーゼについて検討を重ねた。その結果、驚くべきことに、ポリエチレングリコールを含む反応液中で活性挙動がＤＮＡポリメラーゼ様に変化したＲＮＡポリメラーゼが、２’−修飾された核酸種を取り込むという、ＤＮＡポリメラーゼにも無い活性も獲得していることを見出した。つまり、ポリエチレングリコールを高濃度で含む反応液中でＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸合成反応を行うことによって、上記の本発明の目的を達成できることを見出した。本発明は、この知見に基づき、さらに検討を重ねることにより完成された。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
【０００９】
項１．  (A)ＲＮＡポリメラーゼと、(B)ポリアルキレングリコールと、(C1)２’−修飾リボヌクレオチドと、(D)鋳型核酸とを含む(i)反応液中で、前記(D)鋳型核酸に相補的な修飾核酸を合成する工程を含み、
前記(A)ＲＮＡポリメラーゼがシングルサブユニットタンパク質からなり、
前記(B)ポリアルキレングリコールの平均分子量が１０〜１０００、前記(i)反応液中の濃度が１０重量％以上であり、
前記(C1)２’−修飾リボヌクレオチドが、２’−ハロゲン化リボヌクレオチド及び２’−アルコキシリボヌクレオチドからなる群から選択される、核酸合成法。
項２．  前記(D)鋳型核酸がプロモータ配列を含まず、前記(i)反応液が前記(D)の一部と相補的な配列を有する(E)プライマーをさらに含む、項１に記載の核酸合成法。
項３．  前記(A)ＲＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼである、項１又は２に記載の核酸合成法。
項４．  前記(B)ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、項１から３のいずれかに記載の核酸合成法。
項５．  前記２’−ハロゲン化リボヌクレオチドが２’−フルオロリボヌクレオチドである、項１〜４のいずれかに記載の核酸合成法。
項６．  前記２’−アルコキシリボヌクレオチドにおける２’−アルコキシ基の炭素数が１〜３である、項１〜５のいずれかに記載の核酸合成法。
項７．  前記(E)プライマーが５’末端に修飾基を有する、項２〜６のいずれかに記載の核酸合成法。
項８．前記(i)反応液から、(C2)リボヌクレオチドを含み且つ前記(B)ポリアルキレングリコールの濃度が５重量％以下となるように希釈された(ii)反応液を調製し、前記(ii)反応液中で前記修飾核酸から前記(D)鋳型核酸に相補的なＲＮＡを伸長する工程をさらに含む、項１〜７のいずれかに記載の核酸合成法。
項９．  項１〜８のいずれかに記載の核酸合成法を行うためのキットであって、
(A)ＲＮＡポリメラーゼと、(B)ポリアルキレングリコールと、(C1)２’−修飾リボヌクレオチドと、を含み、
前記(A)ＲＮＡポリメラーゼがシングルサブユニットタンパク質からなり、
前記(B)ポリアルキレングリコールの平均分子量が１０〜１０００であり、
前記(C1)２’−修飾リボヌクレオチドが、２’−ハロゲン化リボヌクレオチド及び２’−アルコキシリボヌクレオチドからなる群から選択される、核酸合成キット。
項１０．  鋳型核酸を固定化するための固相担体及び／又はリボヌクレアーゼＨをさらに含む、項９に記載の核酸合成キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＲＮＡポリメラーゼの酵素機能を簡便な方法で変換することで、変換前のＲＮＡポリメラーゼでは取り込むことができない核酸種を取り込む活性を獲得させる技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の核酸合成法の一例を説明する模式図である。
【図２】試験例１における核酸合成法を説明する模式図である。
【図３】試験例１の結果であり、リボザイム型ポリメラーゼ（tC9Y）を用いた場合の変性ＰＡＧＥゲル電気泳動写真（ａ）及び平均分子量200のポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００）の含有量に対するプライマー伸長率のグラフ（ｂ）；Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）を用いた場合の変性ＰＡＧＥゲル電気泳動写真（ｃ）及びＰＥＧ２００の含有量に対するプライマー伸長率のグラフ（ｄ）；及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（KF）を用いた場合の変性ＰＡＧＥゲル電気泳動写真（ｅ）及びＰＥＧ２００の含有量に対するプライマー伸長率のグラフ（ｆ）を示す。
【図４】試験例２の結果であり、ＰＥＧ２００の含有量に対するプライマー伸長率のグラフ（ａ）（図３の（ｄ）と同じ）、エチレングリコール（ＥＧ）の含有量に対するプライマー伸長率のグラフ（ｂ）、平均分子量8000のポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）の含有量に対するプライマー伸長率のグラフ（ｃ）を示す。
【図５】実施例１における核酸合成法を説明する模式図である。
【図６】実施例１の結果であり、基質ごとの変性ＰＡＧＥゲル電気泳動写真（ａ）及び基質ごとのプライマー伸長率のグラフ（ｂ）を示す。
【図７】実施例２における核酸合成法を説明する模式図である。
【図８】実施例２の結果であり、基質ごとのプライマー伸長率のグラフを示す。
【図９】実施例３における核酸合成法（1st step:修飾核酸を合成する工程、2nd step：修飾核酸からＲＮＡを伸長する工程）を説明する模式図である。
【図１０】実施例３の結果であり、1st stepで用いた基質ごとの変性ＰＡＧＥゲル電気泳動写真（ａ）及び1st stepで用いた基質ごとのプライマー伸長率又はＲＮＡ伸長率のグラフ（ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［１．核酸合成法］
本発明の核酸合成法は、(A)ＲＮＡポリメラーゼと、所定高濃度の(B)ポリアルキレングリコールと、(C1)２’−修飾リボヌクレオチドと、(D)鋳型核酸とを含む(i)反応液中で、前記(D)鋳型核酸に相補的な修飾核酸を合成する工程を含む。好ましくは、(i)反応液には、(D)鋳型核酸の一部に相補的な(E)プライマーを含む。また、本発明の核酸合成法は、(i)反応液から、(C2)リボヌクレオチドを含み且つ(B)ポリアルキレングリコールの濃度が所定低濃度に希釈された(ii)反応液を調製し、(ii)反応液中で修飾核酸から(D)鋳型核酸に相補的なＲＮＡを伸長する工程をさらに含む。(ii)反応液中での工程により、ハイブリッド型ＲＮＡが得られる。
【００１３】
本発明において相補的とは、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいう。ここでいうストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール（商品名）、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが共存する条件等が挙げられる。
【００１４】
本発明の核酸合成法の一例を説明する模式図を図１に示す。図１では、(A)ＲＮＡポリメラーゼの表示を省略し、(B)ポリアルキレングリコールとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を例示し、(C1)２’−修飾リボヌクレオチドをＸで表記し、(C2)リボヌクレオチドをＮで表記し、(D)鋳型核酸としてＲＮＡを例示し、(E)プライマーとしてＲＮＡを例示する。
【００１５】
［１−１．(A)ＲＮＡポリメラーゼ］
本発明に用いられる(A)ＲＮＡポリメラーゼは、シングルサブユニットタンパク質からなるＲＮＡポリメラーゼである。シングルサブユニットタンパク質からなるＲＮＡポリメラーゼは、進化的観点で配列が類似していることから核酸合成時における作用メカニズムが同等であるため、特に制限なく用いることができる。シングルサブユニットタンパク質の中でも、ＲＮＡ合成効率の観点で、バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼであることが好ましい。バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｋ１１  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼが挙げられ、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００１６】
(A)ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡに対する基質特異性を有し、且つ、本発明で用いられる所定の(B)ポリアルキレングリコール不存在下で(C1)２’−修飾リボヌクレオチドに対する基質特異性を有していないものであれば、野生型であっても遺伝子工学的に変異を導入したものであってもよいが、好ましくは野生型が挙げられる。
【００１７】
（Ａ）ＲＮＡポリメラーゼの（ｉ）反応液中の濃度としては、（Ｂ）ポリアルキレングリコールの量などによって決定されうるが、たとえば、０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが挙げられる。
【００１８】
［１−２．(B)ポリアルキレングリコール］
本発明に用いられる(B)ポリアルキレングリコールは、(A)ＲＮＡポリメラーゼの基質特異性を変化させるために用いられる。好ましくは、(B)ポリアルキレングリコールは、(A)ＲＮＡポリメラーゼの基質特異性を可逆的に変化させるために用いられる。(B)ポリアルキレングリコールは、下記式（Ｉ）で表される化合物である。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
式（I）中、ｎは整数でアルキレンオキサイド単位の付加モル数を表し、Ｒはアルキレン基を表す。アルキレン基の炭素数は、好ましくは２又は３、より好ましくは２である。つまり、(B)ポリアルキレングリコールとしては、好ましくはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールが挙げられ、より好ましくはポリエチレングリコールが挙げられる。(B)ポリアルキレングリコールは、１種単独で用いられてもよいし、複数種の組み合わせで用いられてもよい。付加モル数ｎとしては、例えば２〜５０、好ましくは３〜２０が挙げられる。
【００２１】
(B)ポリアルキレングリコールの平均分子量は、１０〜１０００である。平均分子量は、ピリジン無水フタル酸法にて測定された水酸基の濃度（ＪＩＳ  Ｋ１５５７に準拠）から計算される。平均分子量が１０以上であることにより、(i)反応液中で所定高濃度で存在させた場合には、ＲＮＡポリメラーゼの(C1)２’−修飾リボヌクレオチドに対する基質特異性を獲得させることができ、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼの(C1)２’−修飾リボヌクレオチドに対する基質特異性を獲得させるとともに、(C2)リボヌクレオチドに対する基質特異性は本来的な基質特異性よりも低くすることができる一方で、(ii)反応液中で所定低濃度で存在させた場合には、ＲＮＡポリメラーゼの(C2)リボヌクレオチドに対する本来的な基質特異性を生じさせることができ、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼの(C2)リボヌクレオチドに対する本来的な基質特異性を生じさせるとともに、(C1)に対する基質特異性は低くすることができる。平均分子量が１０００以下であることにより、(i)反応液中で所定高濃度で存在させても、ＲＮＡポリメラーゼの変性及び凝集を防止することができる。これらの効果をより良好に得る観点から、ポリアルキレングリコールの平均分子量としては、好ましくは５０〜８００、より好ましくは５０〜４００、さらに好ましくは１００〜３００、一層好ましくは１５０〜２５０が挙げられる。
【００２２】
(B)ポリアルキレングリコールは、(i)反応液中、所定高濃度で含有される。本明細書において所定高濃度とは、具体的には(i)溶液中１０重量％以上の濃度をいう。これによって、(i)反応液中でＲＮＡポリメラーゼの(C1)２’−修飾リボヌクレオチドに対する基質特異性を獲得させることができ、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼの(C1)２’−修飾リボヌクレオチドに対する基質特異性を獲得させるとともに、(C2)リボヌクレオチドに対する基質特異性は本来的な基質特異性よりも低くすることができる。このような効果をより良好に得る観点で、(B)ポリアルキレングリコールの(i)反応液中の濃度は、好ましくは１２重量％以上、より好ましくは１５重量％以上、さらに好ましくは１８重量％以上であってもよい。(B)ポリアルキレングリコールの(i)反応液中の濃度の上限は特に限定されないが、たとえばＲＮＡポリメラーゼの変性及び凝集を防止やすくする観点から、例えば４０重量％以下、好ましくは３５重量％以下、より好ましくは３０重量％以下、さらに好ましくは２５重量％以下であってよい。
【００２３】
［１−３．(C1)２’−修飾リボヌクレオチド］
(C1)２’−修飾リボヌクレオチドは、(i)反応液中において基質として用いられる。(C1)２’−修飾リボヌクレオチドは、(A)ＲＮＡポリメラーゼの本来的な基質ではない。(C1)２’−修飾リボヌクレオチドは、リボースの２’位に修飾基を有するリボヌクレオシドの５’−リン酸エステルをいう。具体的には、(C1)２’−修飾リボヌクレオチドは、２’−ハロゲン化リボヌクレオチド及び２’−アルコキシリボヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２４】
２’−ハロゲン化リボヌクレオチドとしては特に限定されず、たとえば化学的安定性（生分解耐性）、細胞膜透過性、分子認識性の向上などの目的で核酸医薬の用途において有効とされているものを当業者が適宜選択することができる。例えば、２’−ハロゲン化リボヌクレオチドとしては、２’−フッ化リボヌクレオチド、２’−塩化リボヌクレオチド、２’−臭化リボヌクレオチド、及び２’−ヨウ化リボヌクレオチドが挙げられ、基質特異性等の観点から、好ましくはフッ化リボヌクレオチドが挙げられる。
【００２５】
２’−アルコキシリボヌクレオチドとしては特に限定されず、たとえば化学的安定性（生分解耐性）、細胞膜透過性、分子認識性の向上などの目的で核酸医薬の用途において有効とされているものを当業者が適宜選択することができる。２’−アルコキシリボヌクレオチドにおける２’−アルコキシ基の炭素数としては、基質特異性等の観点から、たとえば１〜３、好ましくは１及び２、より好ましくは１が挙げられる。
【００２６】
(C1)２’−修飾リボヌクレオチドの核酸塩基としては特に限定されず、鋳型核酸に相補的となる核酸塩基が適宜選択される。具体的には、アデニン、チミン、グアニン、ウラシル、シトシンなどが挙げられる。
【００２７】
(C1)２’−修飾リボヌクレオチドは、一種が単独で用いられてもよいし、修飾基が異なる複数種が組み合されて用いられてもよいし、塩基が異なる複数種が組み合されて用いられてもよいし、修飾基も塩基も異なる複数種が組み合わされて用いられてもよい。
【００２８】
(C1)２’−修飾リボヌクレオチドの(i)反応液中の濃度としては、たとえば、５〜１００μＭ、好ましくは１０〜５０μＭが挙げられる。
【００２９】
［１−４．(D)鋳型核酸］
(D)鋳型核酸としては特に限定されず、任意の起源、塩基長、及び配列等が選択される。また、一本鎖及び二本鎖を問わず、ＤＮＡ及びＲＮＡも問わない。たとえば、生物のゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ等のゲノム核酸；当該ゲノム核酸を物理的手段又は制限酵素消化により切断した核酸断片；核酸断片を、プラスミド、ファージ等のベクターに挿入した核酸構築物；核酸を含む可能性のある試料から単離した核酸；核酸自動合成機等を使用して合成された合成核酸などが挙げられる。
【００３０】
本発明の核酸合成法では、ＲＮＡポリメラーゼを用いるにも関わらず、(E)プライマーを用いることによって(D)鋳型核酸にプロモータ配列を含まなくても核酸合成を開始することができる。したがって、本発明の核酸合成法により得るべき産物の５’末端の配列の自由度を獲得する観点から、(i)反応液に(E)プライマーを含ませて、(D)鋳型核酸がプロモータ配列を含まないことが好ましい。プロモータ配列は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列であり、(i)反応液中で共に用いられる(A)ＲＮＡポリメラーゼに対応した配列をいう。たとえば、(i)反応液中で(A)ＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は、Ｔ７プロモータをいう。
【００３１】
(D)鋳型核酸の核酸長としては特に限定されず、本発明の核酸合成法により得るべき産物の核酸長に応じて当業者が適宜決定することができる。たとえば、核酸医薬を産物として得る場合などにおいては、（Ｄ）鋳型核酸の長さとしては、例えば２０〜１１０ｍｅｒ、好ましくは２０〜７０ｍｅｒが挙げられる。また、(E)プライマーを用いる場合は、(E)プライマーの長さよりも長ければよく、例えば２１〜１１０ｍｅｒ、好ましくは２１〜７０ｍｅｒが挙げられる。
【００３２】
(D)鋳型核酸の(i)反応液中の濃度としては、たとえば、０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが挙げられる。
【００３３】
［１−５．(E)プライマー］
本発明の核酸合成法においては、ＲＮＡポリメラーゼを用いるにも関わらず、産物の５’末端の配列の自由度を獲得する観点から、本来的にＲＮＡポリメラーゼとは共に用いられない(E)プライマーを用いることが好ましい。本発明の核酸合成法では(E)プライマーの３’末端から核酸伸長させるため、(E)プライマーは、本発明による産物の一部を構成する。
【００３４】
(E)プライマーは、(D)鋳型核酸の一部と相補的な配列を有する。当該相補的な配列の５’末端は、(D)鋳型核酸上の任意の位置（但し(C1)２’−修飾リボヌクレオチドを相補結合すべき位置よりも３’末端側）、好ましくは(D)鋳型核酸上の３’末端の位置に対応し、当該相補的な配列の３’末端は、(D)鋳型核酸上の(C1)２’−修飾リボヌクレオチドを相補結合すべき位置よりも３’末端側、好ましくは(D)鋳型核酸上の(C1)２’−修飾リボヌクレオチドを相補結合すべき位置の３’末端側の隣接位置に対応する。プライマーの配列設計は、(D)鋳型核酸の配列を予め調査して決定することができる。(D)鋳型核酸の塩基配列の調査には、GeneBank、EBI等のデータベースを用いることができる。
【００３５】
(E)プライマーは、ホスホアミダイト法等による化学合成や、(D)鋳型核酸の相補核酸の制限酵素消化によって得てよい。(E)プライマーの塩基長は、(D)鋳型核酸を特異的に認識する程度に短すぎず、且つ、非特異的反応を誘発しない程度に長すぎない長さが当業者によって適宜選択される。(E)プライマーの長さは、ＧＣ含量等の(D)鋳型核酸の配列情報、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定することができるが、たとえば２０〜５０ｍｅｒが挙げられる。
【００３６】
(E)プライマーは、上述の基本的な相補的配列を有していれば、得るべき産物に応じて自由に設計することができる。たとえば、(E)プライマーは、ＤＮＡであってもよいしＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡとＲＮＡの混合配列でもよい。また、(E)プライマーは、５’末端に修飾基を有してもよい。修飾基としては特に限定されず、たとえば、シグナル基及び反応性官能基などが挙げられる。
【００３７】
シグナル基としては、たとえば、蛍光物質、放射性元素含有物質、磁性物質等に由来する基が挙げられる。検出容易性等の観点から、上述のシグナル物質としては蛍光物質であることが好ましい。蛍光物質としては、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素などのシアニン系色素、ローダミン系色素などの蛍光色素；ＧＦＰなどの蛍光タンパク質；金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子などが挙げられる。上述の放射性元素含有物質としては、18Fなどの放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸などが挙げられる。上述の磁性物質としては、フェリクロームなどの磁性体、フェライトナノ粒子、ナノ磁性粒子などが挙げられる。
【００３８】
反応性官能基としては、本発明の核酸合成法によって得られた産物を化学修飾等に付す場合に、修飾試薬と化学反応可能な共有結合性基が挙げられる。より具体的には、反応性官能基としては、アミノ基、チオール基などが挙げられる。
【００３９】
(E)プライマーの（ｉ）反応液中の濃度としては、（Ｄ）鋳型核酸の濃度などにより決定しうるが、たとえば、０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが挙げられる。
【００４０】
［１−６．他の成分］
(i)反応液は、上述の成分を緩衝液中に含む。緩衝液としては、一般的には、適当な緩衝成分およびマグネシウム塩等を水中に含む溶液が挙げられる。緩衝成分としては、トリス酢酸、トリス塩酸、リン酸ナトリウム、及びリン酸カルシウム等のリン酸塩等が挙げられる。緩衝成分の最終濃度としては５ｍＭ〜１００ｍＭ、ｐＨとしてはｐＨ６．０〜９．５、より好ましくはｐＨ７．０〜８．０が挙げられる。また、マグネシウム塩としては塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等が挙げられる。更に、必要に応じて、ＫＣｌ等のカリウム塩、ＤＭＳＯ、ベタイン、ゼラチン、Ｔｒｉｔｏｎ等の界面活性剤等が含まれていてよい。
【００４１】
(i)反応液中には、基質としてさらにデオキシリボヌクレオチドも含んでよい。(i)反応液中の(A)ＲＮＡポリメラーゼは、(A)ＲＮＡポリメラーゼの本来の基質ではないデオキシリボヌクレオチドに対しても基質特異性を有するため、産物中の構成塩基として組み込むことができる。
【００４２】
［１−７．(i)反応液中での修飾核酸の合成］
(i)反応液は、例えば１０〜４５℃、好ましくは２０〜３７℃で、２〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間の条件に供されることによって、（Ｄ）鋳型核酸に相補的な修飾核酸を合成することができる。（Ｅ）プライマーを用いて合成する場合は、(E)プライマーの３’末端から修飾核酸が伸長する。(i)反応液中で合成される修飾核酸の塩基長（つまり(i)反応液中で１個の(A)ＲＮＡポリメラーゼに取り込ませる基質の数）は、たとえば１以上、好ましくは１〜５０であってよく、基質である(C1)２’−修飾リボヌクレオチドの濃度や反応時間によって適宜調整される。
【００４３】
［１−８．(ii)反応液の調製］
本発明では、(i)反応液中で合成された修飾核酸から、さらにＲＮＡを伸長させることができる。この場合、(i)反応液から(ii)反応液を調製する。(ii)反応液は、(i)反応液中に存在していた(A)ＲＮＡポリメラーゼ及び(D)鋳型核酸と、基質として(C2)リボヌクレオチドを含む。また、(ii)反応液中では、(B)ポリアルキレングリコールの濃度が５重量％以下の低濃度となるように希釈されている。これによって、(i)反応液中で(C1)２’−修飾リボヌクレオチドに対する基質特異性を獲得した状態にあった(A)ＲＮＡポリメラーゼを、当該基質特異性を失わせ、本来の基質特異性つまり(C2)リボヌクレオチドに対する基質特異性を有する状態に回復させることができる。このような回復効果をより好ましく生じさせる観点から、(ii)反応液中の(B)ポリアルキレングリコールの濃度は、好ましくは３重量％以下、より好ましくは１重量％以下であってもよい。さらに、(ii)反応液のｐＨは、(i)反応液中で合成された修飾核酸と(D)鋳型核酸との相補的結合状態を維持するために、ｐＨ７．０〜８．０であることが好ましい。
【００４４】
(i)反応液から(ii)反応液を調製する方法としては特に限定されないが、以下の方法が挙げられる。例えば、(B)ポリアルキレングリコールを含まず(C2)リボヌクレオチドを希釈用の緩衝液中に含む調製用液を用意し、修飾核酸が合成された後の(i)反応液と混合することによって、(ii)反応液を調製することができる。緩衝液としては、上述と同様の緩衝液が用いられる。なお、(ii)反応液調製において、修飾核酸が合成された後の(i)反応液から未反応の(E)プライマーは除去する必要はなく、(ii)反応液中に引き続いて混在させてもよい。
【００４５】
また、(D)鋳型核酸を予め固相担体に固定化された状態で用意して(i)反応液中で反応を行い、反応後、固相担体を取り出して上述の調製用液と混合することによって(ii)反応液を調製することもできる。固相担体の素材としては特に限定されず、たとえば、ガラス、金属、高分子ポリマー（たとえばポリスチレン等）等が挙げられる。固相担体の形状としても特に限定されず、板状（基板担体）、粒子状（ビーズ担体）などが挙げられる。好ましくは、ポリスチレン等の高分子ポリマーで構成されたビーズ担体が挙げられる。また、固相担体と(D)鋳型核酸との固定態様としても特に限定されず、共有結合及び非共有結合を問わないが、例えば、固相担体に(D)鋳型核酸を結合させる固定化条件が(D)鋳型核酸への影響が無く、操作が容易である等の観点から非共有結合であることが好ましく、さらに強い結合力も得る等の観点から、ビオチン−アビジン類（例えば、アビジン、ストレプトアビジン等）の結合であることが好ましい。(D)鋳型核酸を固相担体に固定化する方法としては、３’末端にビオチニル基などの固定化用官能基が付された(D)鋳型核酸と、表面にアビジン等の固定化用物質又は固定化用官能基が化学結合された固相担体と、を緩衝液中で混合する方法が挙げられる。
【００４６】
［１−９．(ii)反応液中でのＲＮＡの合成］
(ii)反応液中では、(B)ポリアルキレングリコールの濃度が５重量％以下に希釈されることで、(i)反応液中で獲得した(C1)２’−修飾リボヌクレオチドに対する基質特異性を失い、(A)ＲＮＡポリメラーゼの本来の基質特異性を回復する。従って、本来の基質特異性を回復した（Ａ）ＲＮＡポリメラーゼは、（ｉｉ）反応中の本来の基質である（Ｃ２）リボヌクレオチドを取り込むことができるようになる。従って、（ｉｉ）反応液を、例えば１０〜４５℃、好ましくは２０〜３７℃で２〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間の条件に供することによって、修飾核酸の３’末端から（Ｄ）鋳型核酸に相補的なＲＮＡを伸長することができる。これによって、合成産物としてＲＮＡ鎖の一部に修飾基を有するハイブリッド型ＲＮＡを合成することができる。
【００４７】
なお、図示されないが、(ii)反応液中でＲＮＡ伸長をある程度まで（具体的には(D)鋳型核酸の５’末端の位置まで伸長が至る前まで）行った後に、さらに(B)ポリアルキレングリコールと、必要に応じて非本来的な基質としての(C1)２’−修飾リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドと、を反応液(ii)に加えてもよい。この場合、(B)ポリアルキレングリコールを再び１０重量％以上の濃度に上昇させることで、(i)反応液と同様に(A)ＲＮＡポリメラーゼに対し(C1)２’−修飾リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドに対する基質特異性を獲得させることができる。従ってＲＮＡ伸長鎖の３’末端からさらに非本来的な基質に由来する核酸塩基を伸長することもできる。このように、(B)ポリアルキレングリコールの濃度を変動させることで(A)ＲＮＡポリメラーゼの活性を変化させ、非本来的な基質（２’−修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド）の合成と本来的な基質（リボヌクレオチド）の合成とを交互に行うこともできる。このようにして得られる合成産物は、ＲＮＡ鎖中の複数個所で非本来的な基質（少なくとも１か所では２’−修飾リボヌクレオチド）に由来の核酸塩基を有するハイブリッド型ＲＮＡである。
【００４８】
このように、本発明の方法によると、 (A)ＲＮＡポリメラーゼの配列を変えることなく、(B)ポリプロピレングリコールの濃度を変動させて反応液中の化学的環境を変化させるという極めて簡便な手法で基質の反応効率を変化させ、単純な試薬の組み合わせで容易にハイブリッド型ＲＮＡを合成するうことができる。
【００４９】
反応終了後の(ii)反応液中からのハイブリッド型ＲＮＡの回収は、(ii)反応液中のｐＨを上げる等により(D)鋳型核酸とハイブリッド型ＲＮＡとの二重鎖を解き、クロマトグラフィーなどでハイブリッド型ＲＮＡを分離精製する等によって行うことができる。二重鎖を解くためには、例えばリボヌクレアーゼＨなどの酵素を用いることができる。また、分離精製を行うためには、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動等、任意の核酸精製法が挙げられる。(D)鋳型核酸を予め固相担体に固定化させた状態で用いた場合は、二重鎖を解いた後、固液分離によって固相を除去した後、上述の任意の核酸精製法を行うことができる。本発明によって得られるハイブリッド型ＲＮＡの核酸長さは用途により異なり得るため特に限定されないが、たとえば数ｍｅｒ〜数百ｍｅｒ、具体的には１０〜１００ｍｅｒ、好ましくは１０〜６０ｍｅｒ、より好ましくは１０〜４０ｍｅｒが挙げられる。
【００５０】
［１−１０．ハイブリッド型ＲＮＡ］
本発明の核酸合成法により合成されるハイブリッド型ＲＮＡは、修飾を有さない場合に比べ、化学的安定性（生分解耐性）、細胞膜透過性、及び／または分子認識性等の点で向上した機能を有する。たとえば細胞内において内因性ヌクレアーゼに対する安定性を有し、相補的ターゲット配列に対し高いアフィニティを示す。特に、ハイブリッド型ＲＮＡが２’−フルオロ化された塩基を含んでいると、アフィニティ及び安定性が顕著に向上する。ハイブリッド型ＲＮＡは、リボザイム、アプタマー、オリゴヌクレオチド等の核酸医薬として有用である。また、ハイブリッド型ＲＮＡは、リサーチツールとしても有用である。したがって、本発明の核酸合成法を用いて様々な配列を有するハイブリッド型ＲＮＡを調製して非天然核酸ライブラリを作製することで、非天然型核酸の有用性をスクリーニングすることもできる。
【００５１】
［２．核酸合成キット］
本発明の核酸合成キットは、上述の核酸合成法を実施するためのキットであり、(A)ＲＮＡポリメラーゼと、(B)ポリアルキレングリコールと、(C1)２’−修飾リボヌクレオチドと、を含む。これらの成分は、(D)鋳型核酸、または(D)鋳型核酸及び(E)プライマーとともに(i)反応液を構築するために用いられる。
【００５２】
本発明の核酸合成キットには、上述の核酸合成法を実施するための任意の他の成分が更に含まれていてもよい。更に含まれてよい他の成分としては、(D)鋳型核酸を固定化するための固相担体、リボヌクレアーゼＨ、(D)鋳型核酸、及び(E)プライマー、並びに、(ii)反応液を構築するための、(B)ポリアルキレングリコールを含まない希釈用の緩衝液、及び(C2)リボヌクレオチド等から１種または複数種が挙げられる。この中でも、少なくとも(D)鋳型核酸を固定化するための固相担体及び／又はリボヌクレアーゼＨを含むことが好ましい。なお、核酸合成キットの汎用性を考慮すると、(D)鋳型核酸、及び(E)プライマーは核酸合成キットに含ませずにユーザが用意できるように構成することが好ましい。これによって、ユーザは任意の(D)鋳型核酸及び／又は(E)プライマーを自由に選択し、本発明の核酸合成キットを用いることで、選択された(D)鋳型核酸及び／又は(E)プライマーに応じた所望の修飾核酸を得ることができる。
【００５３】
本発明の核酸合成キットにおいて、上述の成分は、それぞれ別個別個に個装されたアイテムの態様で含まれていてよい。あるいは、１個のアイテム中に、上述の成分から選択される複数の成分が混合されていてもよい。固相担体以外については、それぞれ液体状態（たとえば、緩衝液中に成分を溶解させた溶液、グリセロールストック等）又は固体状態（たとえば、結晶、凍結乾燥物等）であってよい。例えば、(A)ＲＮＡポリメラーゼと(B)ポリアルキレングリコールとを混合溶液として１個のアイテムを構成することができる。(A) ＲＮＡポリメラーゼの安定性を考慮すると、別個のアイテムとして構成することが好ましい。
【００５４】
(B)ポリアルキレングリコールを含むアイテムは通常液体状態（ポリアルキレングリコール溶液）である。当該ポリアルキレングリコール溶液中の(B)ポリアルキレングリコールの濃度は、本発明の核酸合成キット使用に際し他の成分と混合されて(i)反応液を構築した時に、当該(i)反応液中で(B)ポリアルキレングリコールの濃度を容易に所定濃度（１０重量％以上）とすることができるように調整されている。たとえば、ポリアルキレングリコール溶液中では、(B)ポリアルキレングリコールの濃度が、(i)反応液中で設定される所定濃度の２倍の濃度であってよい。この場合、他の成分を含む同体積量の液体と混合することで、所定濃度の(B)ポリアルキレングリコールを含む(i)反応液を容易に調製することができる。
【００５５】
また、(ii)反応液を構築するための、(B)ポリアルキレングリコールを含まない希釈用の緩衝液と(C2)リボヌクレオチドとは、それぞれ別アイテムとしてキットに含まれていてもよいし、両成分が混合された１個のアイテム（調製用液）としてキットに含まれていてもよい。この場合、ユーザは、(i)反応液に(B)ポリアルキレングリコールを含まない希釈用の緩衝液と(C2)リボヌクレオチドとを加えることによって、(B)ポリアルキレングリコールが所定濃度（好ましくは５重量％以下）に希釈された(ii)反応液を容易に調製することができる。
【００５６】
本発明の核酸合成キットに含まれる、又は含まれてよい上記の(A)ＲＮＡポリメラーゼ、(B)ポリアルキレングリコール、(C1)２’−修飾リボヌクレオチド、(D)鋳型核酸、(E)プライマー、(C2)リボヌクレオチド、固相担体、リボヌクレアーゼＨ、緩衝液、調整用液の詳細及び使用方法については、上述の「１．核酸合成法」で記載した通りである。
【実施例】
【００５７】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００５８】
［試薬］
ＲＮＡポリメラーゼについては、Ｔ７  ＲＮＡＰはタカラバイオ株式会社から購入し、ＫＦはニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社から購入し、ｔＣ９ＹはＰＣＲ増幅によりＤＮＡからin vitro転写することで調製した。
ＥＧ、ＰＥＧ２００、及びＰＥＧ８０００は和光純薬工業株式会社から購入し、精製せずに用いた。  ２’−Ｆ  ＮＴＰｓ、及び２’−ＯＭｅ  ＮＴＰｓはTrilink社から購入した。
ＮＴＰ溶液はサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ｄＮＴＰ溶液は東洋紡株式会社から購入した。
鋳型ＲＮＡ鎖はin vitroでＤＮＡ鎖を鋳型としたin vitro転写法によって得た。すべてのＤＮＡはＨＰＬＣグレードのものをユーロフィンジェノミクス株式会社より購入した。
ＦＩＴＣ標識プライマーは株式会社日本バイオサービスから購入した。
その他の試薬は和光純薬工業株式会社から購入した。
【００５９】
［試験例１：異なるＲＮＡポリメラーゼ及び異なる濃度のＰＥＧ２００を用いた核酸合成］
リボザイム型ポリメラーゼ（tC9Y）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）、及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（KF）について、図２に示すように、３９ｍｅｒのＲＮＡ鎖（5'-GUCAAUGACACGCUUCGCXCGGUUGGCAG（配列番号１））を鋳型に、ＦＩＴＣ標識された１０ｍｅｒのＲＮＡ（5'-CUGUUAACCG（配列番号２））をプライマーに用い、プライマー伸長アッセイを行った。なお、鋳型の名称（鋳型Ｘ）は、鋳型配列中の塩基Ｘに対応する。すなわち、鋳型配列中の塩基ＸがＡ（アデニン）であれば、鋳型の名称は鋳型Ａとする。
【００６０】
ポリメラーゼ（０．５μＭ）を、０〜２０重量％のポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ２００、平均分子量２００）、０．５μＭのＦＩＴＣ標識されたＲＮＡプライマー（鋳型に相補的）、０．５μＭのＲＮＡ鋳型Ａ、並びに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１０ｍＭのＭｇＣｌ2中１００μＭのＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓとともに２５℃で１２時間インキュベートした。生成物に、５μＬのローディング溶液（３ｘローディングダイ）、１２５ｍＭのＥＤＴＡ、４．８Ｍの尿素及び２．６ｎｇ／μＬの競合鋳型を加え、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（変性ＰＡＧＥ）を用いて分離した。伸長したプライマー及び未反応のプライマーにそれぞれ相当するバンドを、蛍光強度を測定することにより定量した。
【００６１】
図３に結果を示す。図３（ａ）及び図３（ｂ）は、それぞれ、リボザイム型ポリメラーゼ（tC9Y）を用いた場合の変性ＰＡＧＥゲル電気泳動写真、及びＰＥＧ２００の含有量に対するプライマー伸長率のグラフを示す。
【００６２】
図３（ｃ）及び図３（ｄ）は、それぞれ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）を用いた場合の変性ＰＡＧＥゲル電気泳動写真、及びＰＥＧ２００の含有量に対するプライマー伸長率のグラフを示す。図３（ｅ）及び図３（ｆ）は、それぞれ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（KF）を用いた場合の変性ＰＡＧＥゲル電気泳動写真、及びＰＥＧ２００の含有量に対するプライマー伸長率のグラフを示す。なお、ＰＡＧＥ分析において、それぞれのレーンにおける条件は、レーン１が未反応プライマー、レーン２がＮＴＰｓ及び０重量％のＰＥＧ２００、レーン３がＮＴＰｓ及び５重量％のＰＥＧ２００、レーン４がＮＴＰｓ及び１０重量％のＰＥＧ２００、レーン５がＮＴＰｓ及び１５重量％のＰＥＧ２００、レーン６がＮＴＰｓ及び２０重量％のＰＥＧ２００、レーン７がｄＮＴＰｓ及び０重量％のＰＥＧ２００、レーン８がｄＮＴＰｓ及び５重量％のＰＥＧ２００、レーン９がｄＮＴＰｓ及び１０重量％のＰＥＧ２００、レーン１０がｄＮＴＰｓ及び１５重量％のＰＥＧ２００、レーン１１がｄＮＴＰｓ及び２０重量％のＰＥＧ２００、及びレーン１２が未反応プライマーである。さらに、生成物のバンド位置（ｎ＋１、２、３、４、５、６：ｎはプライマー塩基長を表す。）も示した。
【００６３】
また、プライマー伸長率は、伸長産物のバンドの蛍光強度（ＬＡＵ／ｍｍ2）を、全検出バンドの総蛍光強度（ＬＡＵ／ｍｍ2）で除することによって導出した。破線で表した折れ線グラフは本来の基質であるＮＴＰを用いた場合、実線で表した折れ線グラフは本来の基質ではないｄＮＴＰを用いた場合の結果を示す。データポイントは、T7 RNAPのデータは６サンプルの平均であり、その他のデータは３サンプルの平均（以下、全ての例においても３サンプルの平均）である。誤差は標準偏差を表す。
【００６４】
図３（ａ）及び図３（ｂ）が示すように、リボザイム型ポリメラーゼ（tC9Y）によるＲＮＡ依存的ＲＮＡ合成は、バッファー中にＰＥＧ２００を含まない場合には不十分であり、わずか３．３％のプライマーが伸長したのみであった。ＰＥＧ２００存在下で反応は明らかに促進され、プライマー伸長画分はＰＥＧ２００の濃度上昇に伴い増加した。ＰＥＧ２００が２０重量％である場合、８７％のプライマーが伸長され、６個のＮＴＰｓの重合に至った。
ｄＮＴＰｓを基質として用いた場合は、ＰＥＧ２００を含まない場合は僅かな伸長が観察されたのみであった。ｄＮＴＰｓの伸長は、２０重量％のＰＥＧ２００を含む場合に促進され、８２％のプライマーが伸長した。
このように、リボザイム型ポリメラーゼ（tC9Y）では、ＰＥＧ２００の濃度上昇に伴ってｄＮＴＰｓ及びＮＴＰｓのいずれも同様に重合効率が上昇した。（なお、ＰＥＧ２００の代わりにエチレングリコールを用いて同様に試験すると、ＰＥＧ２００を用いた場合に比べてプライマーの伸長度は低くなり、ＰＥＧ２００の代わりにＰＥＧ８０００を用いて同様に試験すると、ＮＴＰｓ及びｄＮＴＰｓいずれを基質に用いてもＰＥＧ２００を用いた場合に匹敵する程度にプライマー伸長を促進したことを別途確認した。）加えて、ＰＥＧはＲＮＡへリックスの安定性を低下させ、プライマー伸長の効率を下げる。こうして、リボザイム型ポリメラーゼ（tC9Y）は分子環境に依存した効率でＲＮＡ及びＤＮＡの両方を合成する。
【００６５】
図３（ｃ）及び図３（ｄ）が示すように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）を用いたプライマー伸長については、ＰＥＧ２００が含まれていない場合は４５％のプライマーがＮＴＰｓを基質として伸長し、４個以上のＮＴＰｓが重合された。１０重量％のＰＥＧ２００存在下では、プライマー伸長率はＰＥＧ２００が含まれていない場合と同等であった。２０重量％のＰＥＧ２００存在下では、わずか２３％のプライマーが伸長されたのみであった。これに対し、基質ｄＮＴＰに関しては、プライマーの伸長画分はＰＥＧ２００の濃度上昇とともに増加した。ＰＥＧ２００が含まれていない場合はわずか１３％のプライマーが伸長されたのみであったが、２０重量％のＰＥＧ２００存在下では、６９％のプライマーが伸長された。（ＰＥＧ２００によりＲＮＡ合成が抑制されＤＮＡ合成が促進されたことは、ＰＥＧ２００の、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのコンホメーションに対する影響、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、プライマー、鋳型核酸、及び核酸からなる複合体の解離、及び／又は基質特異性の変化に起因すると考えられる。なお、ＰＥＧ２００がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを変性しないことを、円偏光二色性分析により別途確認した。さらに、反応開始前にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをＰＥＧ２００存在下でプレインキュベーションしても、生成物が変わらないことも別途確認した。これらの結果から、ＰＥＧ２００が基質特異性に重要な影響を与えていると考えられる。）
【００６６】
図３（ｅ）及び図３（ｆ）が示すように、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（KF）によるＲＮＡプライマーからのＲＮＡ依存的ＤＮＡ伸長は、ＰＥＧ２００により促進された。ＰＥＧ２００が含まれていない場合は６７％のプライマーがｄＮＴＰｓを基質として伸長した。２０重量％のＰＥＧ２００存在下では、９３％のプライマーが伸長した。一方で、ＰＥＧ２００がどのような条件でもＮＴＰｓの伸長は観察されなかった。
【００６７】
［試験例２：付加モル数が異なるＰＥＧ(又はＥＧ)を用いた核酸合成］
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）について、０〜２０重量％のポリエチレングリコール２００の代わりに、０〜２０重量％のエチレングリコール（ＥＧ）又は０〜２０重量％のポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００、平均分子量８０００）を用いたことを除き、試験例１と同様にプライマー伸長を行った。つまり、  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）（０．５μＭ）を、０〜２０重量％のＥＧ又は０〜２０重量％のＰＥＨ８０００、０．５μＭのＦＩＴＣ標識されたＲＮＡプライマー（鋳型に相補的）、０．５μＭのＲＮＡ鋳型Ａ、並びに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１０ｍＭのＭｇＣｌ2中１００μＭのＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓとともに２５℃で１２時間インキュベートした。得られた生成物を試験例１と同様に変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（変性ＰＡＧＥ）を用いて分離し、伸長したプライマー及び未反応のプライマーにそれぞれ相当するバンドを、蛍光強度を測定することにより定量した。
【００６８】
図４に結果を示す。図４（ａ）は、試験例１で得られた図３で示したＰＥＧ２００の含有量に対するプライマー伸長率のグラフ、図４（ｂ）は、本試験例で得られたＥＧの含有量に対するプライマー伸長率のグラフ、図４（ｃ）は、本試験例で得られたＰＥＧ８０００の含有量に対するプライマー伸長率のグラフを示す。いずれも、破線で表した折れ線グラフは本来の基質であるＮＴＰを用いた場合、実線で表した折れ線グラフは本来の基質ではないｄＮＴＰを用いた場合の結果を示す。
【００６９】
図４（ｂ）が示すように、ＥＧを用いた場合は含有量の上昇と共にＮＴＰｓ及びｄＮＴＰｓいずれについてもプライマー伸長を促進した。一方、図４（ｃ）が示すように、ＰＥＧ８０００を用いた場合は、ＮＴＰｓ及びｄＮＴＰｓいずれについてもプライマー伸長が抑制された。この結果から、ＰＥＧ８０００がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）を変性又は凝集させたことが考えられる。
（なお、このように示されたＰＥＧの分子量の違いによる影響が、リボザイム型ポリメラーゼ（tC9Y）よりもＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）のほうがより強く出ることを別途確認した。）
【００７０】
［実施例１：２’−フッ化リボヌクレオチドを基質に用いた核酸合成］
図５に示すように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）、鋳型Ａ及びＦＩＴＣ標識されたプライマーを用い、基質に２’−フッ化リボヌクレオチド（２’−Ｆ  ＵＴＰ、又は２’−Ｆ  ＴＴＰ）を用いて、試験例１と同様にプライマー伸長アッセイを行った。
【００７１】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）（０．５μＭ）を、２０重量％のポリエチレングリコール２００、０．５μＭのＦＩＴＣ標識されたＲＮＡプライマー（鋳型に相補的）、０．５μＭのＲＮＡ鋳型Ａ、並びに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１０ｍＭのＭｇＣｌ2中１００μＭの２’−Ｆ  ＵＴＰ又は２’−Ｆ  ＴＴＰとともに２５℃で１２時間インキュベートした。試験例１と同様に、生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（変性ＰＡＧＥ）を用いて分離し、伸長したプライマー及び未反応のプライマーにそれぞれ相当するバンドを、蛍光強度を測定することにより定量した。
【００７２】
図６に結果を示す。図６においては、基質に２’−Ｆ  ＵＴＰ又は２’−Ｆ  ＴＴＰを用いた本試験例で得られた結果とともに、基質にｄＴＴＰを用いた試験例１で得られた結果（比較用）も併記する。図６（ａ）及び図６（ｂ）は、それぞれ、基質ごとの変性ＰＡＧＥゲル電気泳動写真、及び基質ごとのプライマー伸長率のグラフを示す。なお、ＰＡＧＥ分析において、それぞれのレーンにおける条件は、左レーンが反応前（比較用）、真ん中レーンがＰＥＧ２００不含（比較用）、右レーンが２０重量％のＰＥＧ２００含有である。
【００７３】
図６に示すように、２’−Ｆ  ＵＴＰ及び２’−Ｆ  ＴＴＰ共に、２０重量％のＰＥＧ２００によってプライマー伸長が促進された。このうちでも、ＤＮＡのカノニカルな塩基であるチミジンを有する２’−Ｆ  ＴＴＰのほうが、伸長効率が良好であった。
【００７４】
［実施例２：異なる２’−修飾リボヌクレオチドを基質に用い、異なる鋳型核酸を用いた核酸合成］
図７に示すように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（T7 RNAP）、鋳型核酸（鋳型Ｕ、鋳型Ｇ、鋳型Ｃ又は鋳型Ａ）及びＦＩＴＣ標識されたプライマーを用い、基質に２’−フッ化リボヌクレオチド（２’−Ｆ  ＮＴＰｓ）又は２’−メトキシリボヌクレオチド（２’−ＯＭｅ  ＮＴＰｓ）を用いて、実施例１と同様にプライマー伸長アッセイを行った。また、参考または比較用に、基質として非修飾ＮＴＰｓ又はｄＮＴＰｓを用いて同様にプライマー伸長アッセイを行った。
【００７５】
図８に結果を示す。図８は、基質ごとのプライマー伸長率のグラフを示す。図８が示すように、非修飾ＵＴＰ以外の非修飾ＮＴＰｓを基質に用いた場合（比較用）は、２０重量％のＰＥＧによる伸長向上効果はほとんど見られなかったが、基質としてｄＮＴＰｓを用いた場合（参考用）及び２’−修飾ＮＴＰｓ（２’−Ｆ  ＮＴＰｓ及び２’−ＯＭｅ  ＮＴＰｓ）を用いた場合は、２０重量％のＰＥＧによる伸長向上効果が得られた。特に、基質に２’−Ｆ  ＣＴＰ、２’−ＯＭｅ  ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、２’−Ｆ  ＧＴＰ、２’−ＯＭｅ  ＧＴＰ、ｄＵＴＰ、２’−ＯＭｅ  ＵＴＰ、ｄＴＴＰ又は２’−Ｆ  ＴＴＰを基質に用いた場合には、ＰＥＧを含ませない場合（比較用）と比べてポリマー伸長度が２倍以上であった。これらのデータから、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、いずれの鋳型核酸に対しても反応液中の分子環境を単純に変えるだけで２’−修飾ＮＴＰｓを取り込めるようになることが示された。
【００７６】
［実施例３：ハイブリッド型ＲＮＡ（キメラ核酸）の合成］
図９に示すように、２０重量％のＰＥＧ存在下、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、鋳型Ａ及びＦＩＴＣ標識されたプライマーを用い、基質に２’−フッ化リボヌクレオチド（２’−Ｆ  ＵＴＰ、又は２’−Ｆ  ＴＴＰ）を用いて実施例１と同じプライマー伸長を行うことで修飾核酸合成を行い（1st step）、その後、ＮＴＰｓ溶液を加えて５倍希釈することで、ＰＥＧの濃度が４重量％に希釈され且つ基質としてＮＴＰｓを新たに含む反応液を調製し、調製された反応液中でプライマー伸長反応を続行することで天然核酸合成を行った（2nd step）。
【００７７】
図１０に結果を示す。図１０（ａ）及び図１０（ｂ）は、それぞれ、1st stepで用いた基質ごとの変性ＰＡＧＥゲル電気泳動写真、及び、1st stepで用いた基質ごとのプライマー伸長率又はＲＮＡ伸長率のグラフを示す。なお、ＰＡＧＥ分析において、それぞれのレーンにおける条件は、左レーンが1st step後、右レーンが2nd step後である。
【００７８】
図１０が示すように、1st stepではＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの本来の基質ではないｄＴＴＰ（参考用）、２’−Ｆ  ＵＴＰ及び２’−Ｆ  ＴＴＰを伸長することで修飾核酸を合成した一方、2nd stepでは本来の基質であるＮＴＰｓを伸長することで天然核酸鎖を合成した。このことから、1st stepでは、２０重量％のＰＥＧが基質ＵＴＰに対して不活性な基質酵素複合体を形成していた一方で、2nd stepではＰＥＧ濃度を４重量％に希釈したことで、当該不活性な基質酵素複合体が変化して基質ＵＴＰに対して活性化され、基質ＵＴＰの取り込みが進行した。さらに、2nd stepにおけるＲＮＡ伸長の間、1st stepで形成されたような不活性な基質酵素複合体は形成されず、天然核酸鎖が伸長した。このようにして、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでは本来的に合成できない２’−Ｆ  ＮＴＰｓを含むキメラＲＮＡ（5'-FITC-CUGCCAACCGNGCGAAGCGUGUCAUUGAC-3'（配列番号３）；配列中、Nは２’−フッ化塩基を表す。）を、同一のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて得ることができた。
【００７９】
なお、2nd stepを行うまでに1st stepでの未反応プライマーは除去しなかった。しかしながら、ｄＴＴＰ（参考用）及び２’−Ｆ  ＴＴＰいずれを基質に用いた場合も、一塩基が伸長した核酸のバンドは、1st stepで得られた生成物におけるよりも2nd stepで得られた生成物において明らかに減少したことを確認した。この結果から、2nd stepで引き続いて伸長される天然核酸鎖は、本来の基質ではないデオキシリボヌクレオチド又は２’−修飾リボヌクレオチドから伸長することが示された。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明はそれらのみに限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な実施形態が他になされる。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１は、合成核酸であり、１９番目の塩基はＡ、Ｃ、Ｇ、又はＵである。
配列番号２は、合成核酸である。
配列番号３は、合成核酸であり、１１番目の塩基はＡ、Ｃ、Ｇ、又はＵであり、１１番目のヌクレオチドは２’−フルオロリボヌクレオチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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