(57)【要約】      （修正有）【課題】アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（ビーチナッツ、ピスタチオ）が食品原料や製品等に含まれていた場合に、その量が微量であっても高感度で検出できる検出方法、およびその方法に使用するプライマーセットの提供。【解決手段】上記の木の実を検出対象とし、それぞれの対象物に特異的であり、同一条件下で検査可能なＰＣＲプライマー、および、当該プライマーを用いて上記の木の実を検出する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー、とからなるプライマーセット。
【請求項２】
配列表の配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー、とからなるプライマーセット。
【請求項３】
試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にビーチナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むビーチナッツの検出方法。
【請求項４】
試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項２に記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にピスタチオが存在しているか否かを検出する工程とを含むピスタチオの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を検出対象とし、当該木の実が食品原料や製品等に含まれていた場合に、その量が微量であっても高感度で検出することを可能とする木の実の検出方法、並びにその方法に使用するPCRプライマー、プライマーセット、及びキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーを引き起こす恐れのある食品のうち、特にその患者数の多い乳、卵、魚、甲殻類、小麦、大豆、落花生、木の実の8品目は、「The Big-8」とも言われ、アメリカ、カナダ、シンガポール、EU等、世界の多くの国や地域において、共通して含有食品への表示が義務付けられている。
【０００３】
アレルギーを引き起こす恐れのある食品は、生産、流通、加工段階での意図しない微量の混入も起こり得るため、食品原料ないし製品の提供者としては、それらが混入しているか否かの品質管理を行うことが重要となる。
【０００４】
乳、卵については、それぞれに特徴的な蛋白質を検出する方法（ELISA法、ウェスタンブロット法、及びイムノクロマト法）が、魚については、それぞれに特徴的なDNA塩基配列を検出する方法（PCR法）が、また、甲殻類、小麦、大豆、落花生については、その両方の検出方法が、各々確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっている。一方、木の実とは総称であり、生物学的に非常に幅広い生物種が含まれるため、木の実としてまとめて検出する方法は確立されていない。
【０００５】
木の実表示義務のある各国において、表示対象となる木の実とは、例えば、EU、シンガポールでは、アーモンド、クルミ、ピーカンナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ピスタチオの8種、カナダではさらに松の実を加えた9種が挙げられている。アメリカでは最も多く、上記の9種に加え、ビーチナッツ、バターナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヒッコリーナッツ、ライチ、ピリナッツ、シアナッツの計19種が挙げられている。
【０００６】
日本は諸外国とは異なり、木の実を一括した表示対象とせず、クルミとカシューナッツを「特定原材料に準ずるもの」として個別に表示することが推奨されている（アレルギー物質を含む食品に関する表示について、平成25年9月20日、消食表第257号）。近年、日本人の食生活の欧米化に伴って、木の実摂取量は増加しており、今後クルミ、カシューナッツ以外の木の実に対する食物アレルギー患者数の増加や、それに伴う「特定原材料に準ずるもの」への追加も大いにあると考えられる。
【０００７】
木の実混入の有無を検査するためには、個々の木の実に対する検出法を複数組み合わせることになるが、ELISA法やウェスタンブロット法を複数回行うことは、膨大な手間と費用がかかる。一方PCR法の場合、PCR条件が同一であれば、複数セットの試薬を調製し、一斉に検査することが可能となるため、木の実検出法として有用であると考えられる。また、一般に、蛋白質は、DNAと比べて、食品製造工程における様々な加工処理に対する安定性が低いため、蛋白質を検出する方法は、高度に加工された被験食品に対しては適用できない可能性が高い。そのため、蛋白質よりも加工処理に比較的強いとされるDNAの塩基配列を標的としたPCR法は、様々な加工処理工程を経た食品原料や製品中からの検出法に適していると考えられる。
【０００８】
現在、アーモンド、クルミ、ピーカンナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ピスタチオの8種については、PCR法を用いた個別の検出法が確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっている。該キットはTaqManプローブを用いたリアルタイムPCR法を採用することによって検出特異性を確保しているが、リアルタイムPCR用機器、試薬を必要とするため、プローブを用いない通常のPCR法と比較すると費用がかかる。また、前述の通り、食物アレルギーを引き起こす恐れのある木の実には少なくとも19種が存在し、該キットでは検出不可能な木の実が多く存在する。
【０００９】
個別の木の実検出法としては他にも、アーモンド、ヘーゼルナッツ、カシューナッツ、クルミについて、PCR法による検出方法が報告されている（特許文献1、2、3、4）が、いずれも単一種の木の実を検出する方法であり、複数種の木の実を検出することはできない。
【００１０】
また、クリの品種解析を目的として、SSRマーカーを用いた方法が報告されている（非特許文献1）が、被験試料が単一種の植物である場合に使用することを前提としており、複数の植物種が混合する試料の場合、使用するPCRプライマーは、他の植物DNAとも反応する可能性が非常に高いために、クリを特異的に検出することは困難となる。それ故に、複数の植物を含む食品中のクリDNAを特異的に検出するために使用することはできない。
【００１１】
また、ココナッツの検出法としては、ココナッツ特異的蛋白質標的としたイムノクロマト法を用いた検出法が確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっているが、DNA塩基配列を標的とした検出法に関する報告はない。
【００１２】
ビーチナッツ、バターナッツ、チンカピン、銀杏、ヒッコリーナッツ、ライチ、ピリナッツ、松の実、シアナッツについては、これまでに検出法に関する報告はない。
【００１３】
上述したように、食物アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を同一条件で簡便に検出する方法は報告されておらず、これらの木の実が食品原料や製品に混入しているか否かを科学的に検証可能な手法が、食品の品質管理手法として待望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】CN 101643786A
【特許文献２】CN 101643787A
【特許文献３】CN 101792815A
【特許文献４】特開2009-279000、プライマー及び特定植物の検出方法
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】井上栄一, 山本俊哉, 阮樹安, 松木裕美, 安西弘行, 原弘道, ニホングリSSRマーカーによる朝鮮半島由来のクリ7品種の解析; 園学研, 7(4):475-480, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を、食品原料や製品中から特異的に、一斉に検出できる方法、及びこの方法に用いるPCRプライマー、プライマーセット、キットを提供することを、主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を達成するために、本発明者らは、分子生物学的観点から、検出対象とする木の実及びその他の生物の遺伝子配列における共通性と特異性に着目し、食物アレルギー原因食物である木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）を高感度に検出することができる方法を鋭意研究した。その結果、アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミの各々に特徴的な塩基配列を見いだし、これらの塩基配列を利用してPCR法などの核酸分析を行うことで、アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミをそれぞれ簡便に検出し得ることを見いだし、更に鋭意検討を重ねて、それらを同一条件のもとで検出できるよう工夫し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の木の実検出用PCRプライマーセット、木の実検出法、並びに、木の実検出用キットに関与する。
【００１８】
項1.  下記の(1)〜(34)のいずれかのPCRプライマーセット。
(1)  配列表の配列番号1における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるPCRプライマーセット。
(2)  配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(3)  配列表の配列番号5における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号6における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(4)  配列表の配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(5)  配列表の配列番号9における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(6)  配列表の配列番号11における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号12における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(7)  配列表の配列番号13における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号14における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(8)  配列表の配列番号15における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号16における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット
(9)  配列表の配列番号17における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号18における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるPCRプライマーセット。
(10)  配列表の配列番号19における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号20における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(11)  配列表の配列番号21における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号22における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(12)  配列表の配列番号23における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号24における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(13)  配列表の配列番号25における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号26における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(14)  配列表の配列番号27における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号28における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(15)  配列表の配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(16)  配列表の配列番号31における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号32における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(17)  配列表の配列番号33における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号34における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー
とからなるプライマーセット。
(18)  配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(19) 配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(20) 配列表の配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(21) 配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(22) 配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(23) 配列表の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(24) 配列表の配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(25) 配列表の配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(26) 配列表の配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(27) 配列表の配列番号19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(28) 配列表の配列番号21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(29) 配列表の配列番号23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(30) 配列表の配列番号25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(31) 配列表の配列番号27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(32) 配列表の配列番号29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(33) 配列表の配列番号31の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号32の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
(34) 配列表の配列番号33の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、
配列表の配列番号34の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるプライマーセット
【００１９】
項２.      請求項１の(1)に記載のプライマーセット。
【００２０】
項３.      請求項１の(2)に記載のプライマーセット。
【００２１】
項４.      請求項１の(3)に記載のプライマーセット。
【００２２】
項５.      請求項１の(4)に記載のプライマーセット。
【００２３】
項６.      請求項１の(5)に記載のプライマーセット。
【００２４】
項７.      請求項１の(6)に記載のプライマーセット。
【００２５】
項８.      請求項１の(7)に記載のプライマーセット。
【００２６】
項９.      請求項１の(8)に記載のプライマーセット。
【００２７】
項１０.    請求項１の(9)に記載のプライマーセット。
【００２８】
項１１.    請求項１の(10)に記載のプライマーセット。
【００２９】
項１２.    請求項１の(11)に記載のプライマーセット。
【００３０】
項１３.    請求項１の(12)に記載のプライマーセット。
【００３１】
項１４.    請求項１の(13)に記載のプライマーセット。
【００３２】
項１５.    請求項１の(14)に記載のプライマーセット。
【００３３】
項１６.    請求項１の(15)に記載のプライマーセット。
【００３４】
項１７.    請求項１の(16)に記載のプライマーセット。
【００３５】
項１８.    請求項１の(17)に記載のプライマーセット。
【００３６】
項１９.    請求項１の(18)に記載のプライマーセット。
【００３７】
項２０.    請求項１の(19)に記載のプライマーセット。
【００３８】
項２１.    請求項１の(20)に記載のプライマーセット。
【００３９】
項２２.    請求項１の(21)に記載のプライマーセット。
【００４０】
項２３.    請求項１の(22)に記載のプライマーセット。
【００４１】
項２４.    請求項１の(23)に記載のプライマーセット。
【００４２】
項２５.    請求項１の(24)に記載のプライマーセット。
【００４３】
項２６.    請求項１の(25)に記載のプライマーセット。
【００４４】
項２７.    請求項１の(26)に記載のプライマーセット。
【００４５】
項２８.    請求項１の(27)に記載のプライマーセット。
【００４６】
項２９.    請求項１の(28)に記載のプライマーセット。
【００４７】
項３０.    請求項１の(29)に記載のプライマーセット。
【００４８】
項３１.    請求項１の(30)に記載のプライマーセット。
【００４９】
項３２.    請求項１の(31)に記載のプライマーセット。
【００５０】
項３３.    請求項１の(32)に記載のプライマーセット。
【００５１】
項３４.    請求項１の(33)に記載のプライマーセット。
【００５２】
項３５.    請求項１の(34)に記載のプライマーセット。
【００５３】
項３６.    試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項２〜３５のいずれかに記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に木の実が存在しているか否かを検出する工程とを含む木の実の検出方法。
【００５４】
項３７    試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項２又は１９記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にアーモンドが存在しているか否かを検出する工程とを含むアーモンドの検出方法。
【００５５】
項３８  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項３又は２０記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にビーチナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むビーチナッツの検出方法。
【００５６】
項３９  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項４又は２１記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にブラジルナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むブラジルナッツの検出方法。
【００５７】
項４０  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項５又は２２記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にカシューナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むカシューナッツの検出方法。
【００５８】
項４１  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項６又は２３記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にクリが存在しているか否かを検出する工程とを含むクリの検出方法。
【００５９】
項４２  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項７又は２４記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にココナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むココナッツの検出方法。
【００６０】
項４３  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項８又は２５記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に銀杏が存在しているか否かを検出する工程とを含む銀杏の検出方法。
【００６１】
項４４  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項９又は２６記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にヘーゼルナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むヘーゼルナッツの検出方法。
【００６２】
項４５  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１０又は２７記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にヒッコリーナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むヒッコリーナッツの検出方法。
【００６３】
項４６  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１１又は２８記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にライチが存在しているか否かを検出する工程とを含むライチの検出方法。
【００６４】
項４７  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１２又は２９記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にマカダミアナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むマカダミアナッツの検出方法。
【００６５】
項４８  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１３又は３０記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にピーカンナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むピーカンナッツの検出方法。
【００６６】
項４９  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１４又は３１記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に松の実が存在しているか否かを検出する工程とを含む松の実の検出方法。
【００６７】
項５０  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１５又は３２記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にピリナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むピリナッツの検出方法。
【００６８】
項５１  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１６又は３３記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にピスタチオが存在しているか否かを検出する工程とを含むピスタチオの検出方法。
【００６９】
項５２  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１７又は３４記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にシアナッツが存在しているか否かを検出する工程とを含むシアナッツの検出方法。
【００７０】
項５３  試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、請求項１８又は３５記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中にクルミが存在しているか否かを検出する工程とを含むクルミの検出方法。
【発明の効果】
【００７１】
本発明によれば、PCR等を用いた核酸分析による、精度及び検出感度の高い木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）由来DNAの検出を可能とし、被験食品原料や被験食品中に、上記木の実が混入しているか否か、又は、使用されているか否かといった品質管理検査の実施を可能にするという効果を奏する。また、アレルギーの未然防止、アレルギー症状が生じた際の原因物質の調査等にも寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明におけるプライマーセットを用いた場合のDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ａ）配列番号1及び配列番号2を用いたPCRにおけるアーモンドDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｂ）配列番号3及び配列番号4を用いたPCRにおけるビーチナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｃ）配列番号5及び配列番号6を用いたPCRにおけるブラジルナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｄ）配列番号7及び配列番号8を用いたPCRにおけるカシューナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｅ）配列番号9及び配列番号10を用いたPCRにおけるクリDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｆ）配列番号11及び配列番号12を用いたPCRにおけるココナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｇ）配列番号13及び配列番号14を用いたPCRにおける銀杏DNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｈ）配列番号15及び配列番号16を用いたPCRにおけるヘーゼルナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｉ）配列番号17及び配列番号18を用いたPCRにおけるヒッコリーナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｊ）配列番号19及び配列番号20を用いたPCRにおけるライチDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｋ）配列番号21及び配列番号22を用いたPCRにおけるマカダミアナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｌ）配列番号23及び配列番号24を用いたPCRにおけるピーカンナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｍ）配列番号25及び配列番号26を用いたPCRにおける松の実DNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｎ）配列番号27及び配列番号28を用いたPCRにおけるピリナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｏ）配列番号29及び配列番号30を用いたPCRにおけるピスタチオDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｐ）配列番号31及び配列番号32を用いたPCRにおけるシアナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。（Ｑ）配列番号33及び配列番号34を用いたPCRにおけるクルミDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下、本発明を詳細に説明する。
木の実検出用PCRプライマーセット
本発明者等は、上記の目的に従い、以下の17種の木の実検出用PCRプライマーセットを開発した。本発明の木の実検出用PCRプライマーセットには、アーモンドに特徴的な塩基配列を有するもの、ビーチナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ブラジルナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、カシューナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、クリに特徴的な塩基配列を有するもの、ココナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ヘーゼルナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、銀杏に特徴的な塩基配列を有するもの、ヒッコリーナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ライチに特徴的な塩基配列を有するもの、マカダミアナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ピーカンナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ピリナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、松の実に特徴的な塩基配列を有するもの、ピスタチオに特徴的な塩基配列を有するもの、シアナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、及びクルミに特徴的な塩基配列を有するものがある。
【００７４】
それぞれのプライマーセットは以下のようにして設計した。標的とする塩基配列は、感度向上の観点から、1細胞あたりのコピー数が多いものが望ましく、クロロプラストのrbcL(large subunit gene for ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)遺伝子配列、matk（maturase-encoding gene）遺伝子配列、rRNA遺伝子の内部転写スペーサー領域1（ITS1）塩基配列、及び内部転写スペーサー領域2（ITS2）塩基配列を候補として選定した。各種植物のそれらの配列を既知のDNAデータベース（GenBank nucleotide sequence database）から取得、あるいは、一部の植物については独自に解析することによって取得し、それらの膨大な塩基配列の多重並列配列図を作成した。その中でも、ITS領域は進化速度が速く、より近縁の種の識別が可能となるため、各種木の実特異的プライマーの標的配列として好適であった。
【００７５】
アーモンド検出用プライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をアーモンド（バラ目バラ科サクラ属ヘントウ（Prunus dulcis））に設定し、アーモンドと、その近縁種である同属のモモ（Prunus percica）、プルーン（Prunus domestica）、ウメ（Prunus mume）、スモモ（Prunus salicina）、アンズ（Prunus armeniaca）、サクランボ（Prunus avium）のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、アーモンド特異的な塩基配列を選出することは困難であったが、多重並列配列図を詳細に比較検討したところ、アーモンドに特異的な塩基配列領域を選出することができ、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。設計の際には、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００７６】
ビーチナッツ検出用プライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をビーチナッツ（ブナ目ブナ科ブナ属（Fagus spp.））に設定し、ビーチナッツと、その近縁種である同科クリ属のクリ（Castanea spp.）、シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya spp.）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、クルミ科クルミ属のクルミ（Juglans spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ビーチナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００７７】
ブラジルナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をブラジルナッツ（ツツジ目サガリバナ科ブラジルナッツノキ属ブラジルナッツノキ（Bertholletia excelsa））に設定し、ブラジルナッツと、その近縁種である同目アカテツ科シアーバターノキ属のシアナッツ（Vitellaria paradoxa）、アカテツ科フルクリコ属のミラクルフルーツ（Synsepalum dulcificum）、カキノキ科カキノキ属のカキ（Diospyros kaki）、カキノキ科ツバキ属の茶（Camellia sinensis）、マタタビ科マタタビ属のキウイフルーツ（Actinidia deliciosa）、ツツジ科スノキ属のブルーベリー（Vaccinium spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ブラジルナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００７８】
また、カシューナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をカシューナッツ（ムクロジ目ウルシ科カシューナットノキ属カシューナットノキ（Anacardium occidentale））に設定し、カシューナッツと、その近縁種である同科カイノキ属のピスタチオ（Pistacia vera）、マンゴー属のマンゴー（Mangifera indica）、サンショウモドキ属のピンクペッパー（Schinus molle）のITS領域の塩基配列を比較した。カシューナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００７９】
また、クリ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をクリ（ブナ目ブナ科クリ属（Castanea spp.））に設定した。チンカピン（Castanea pumila）もクリ属の一種であるため、検出対象とした。クリと、近縁種である同科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya spp.）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、クルミ科クルミ属のクルミ（Jugrans spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、クリ特異的な塩基配列を選出することは難しかったが、多重並列配列図を詳細に比較検討し、センスプライマー用の領域をヒッコリーナッツ、ピーカンナッツと相同性が高い領域から選出し、アンチセンスプライマー用の領域をヒッコリーナッツ、ピーカンナッツと相同性が低いが、ドングリとは相同性が高い領域を選出し、検出目的のクリ以外の生物種(ヒッコリーナッツ、ピーカンナッツ)に対して交錯性を示すセンスプライマーと、それらとはまた別の生物種(ドングリ)に対する交錯性を示すアンチセンスプライマーを互いに組み合わせることで、検出目的とするクリの当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないPCRプライマーセットを創意工夫して、新規に設計した。
【００８０】
また、ココナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をココナッツ（ヤシ目ヤシ科ココヤシ属ココヤシ（Cocos nucifera））に設定し、ココナッツと、その近縁種である同科ナツメヤシ属のナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、エウテルペ属のアサイー（Euterpe oleracea）のITS領域の塩基配列を比較した。ココナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００８１】
また、銀杏検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種を銀杏（イチョウ目イチョウ科イチョウ属イチョウ（Ginko biloba））に設定し、銀杏と、その他裸子植物のクロロプラストmatK遺伝子配列を比較した。銀杏に特異的な遺伝子配列領域を選定し、当該遺伝子配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該遺伝子配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００８２】
また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をヘーゼルナッツ（ブナ目カバノキ科ハシバミ属（Corylus spp.））に設定し、ヘーゼルナッツと、その近縁種である同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya spp.）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、クルミ科クルミ属のクルミ（Jugrans spp.）、クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ヘーゼルナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００８３】
また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をヒッコリーナッツ（ブナ目クルミ科ペカン属（Carya spp.））に設定し、ヒッコリーナッツと、その近縁種である同目クルミ科クルミ属のクルミ（Juglans spp.）、クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ヒッコリーナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００８４】
また、ライチ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をライチ（ムクロジ目ムクロジ科レイシ属レイシ（Litchi chinensis））に設定し、ライチとその近縁種である同科ランブータン属のランブータン（Nephelium lappaceum）のITS領域の塩基配列を比較した。ライチに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００８５】
また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をマカダミアナッツ（ヤマモガシ目ヤマモガシ科マカダミア属（Macadamia spp.））に設定し、マカダミアナッツと、その近縁種である同目ハス科ハス属のレンコン（Nelumbo nucifera）のITS領域の塩基配列を比較した。マカダミアナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００８６】
また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピーカンナッツ（ブナ目クルミ科ペカン属ペカン（Carya illinoinensis））に設定した。ピーカンナッツは前述のヒッコリーナッツ（ペカン属）の一種であるが、ヒッコリーナッツの中で最も多く市場に流通していることから、ピーカンナッツをその他のヒッコリーナッツと識別する必要があると考えた。ピーカンナッツと、その近縁種である同属のヒッコリーナッツ（Carya ovata、Carya laciniosa）、同目クルミ科クルミ属のクルミ（Juglans spp.）、クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、ピーカンナッツ特異的な塩基配列を選出することは難しかったが、多重並列配列図を詳細に比較検討したところ、ピーカンナッツに特異的な塩基配列領域を選出することができ、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００８７】
また、松の実検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種を松の実（マツ目マツ科マツ属（Pinus spp.））に設定し、松の実と、その他裸子植物のITS領域の塩基配列を比較した。松の実に特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００８８】
また、ピリナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピリナッツ（ムクロジ目カンラン科カンラン属ピリナッツ（Canarium ovatum））に設定し、ピリナッツと、その近縁種である同目ウルシ科カシューナットノキ属のカシューナッツ（Anacardium occidentale）、ウルシ科カイノキ属のピスタチオ（Pistacia vera）、ウルシ科マンゴー属のマンゴー（Mangifera indica）、ウルシ科サンショウモドキ属のピンクペッパー（Schinus molle）、ムクロジ科レイシ属のライチ（Litchi chinensis）、ムクロジ科ランブータン属のランブータン（Nephelium lappaceum）、ミカン科ミカン属のオレンジ（Citrus sinensis）のITS領域の塩基配列を比較した。ピリナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００８９】
また、ピスタチオ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピスタチオ（ムクロジ目ウルシ科カイノキ属ピスタチオ（Pistacia vera））に設定し、ピスタチオと、その近縁種である同科カシューナットノキ属のカシューナッツ（Anacardium occidentale）、マンゴー属のマンゴー（Mangifera indica）、サンショウモドキ属のピンクペッパー（Schinus molle）のITS領域の塩基配列を比較した。ピスタチオに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００９０】
また、シアナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をシアナッツ（ツツジ目アカテツ科シアーバターノキ属シアーバターノキ（Vitellaria paradoxa））に設定し、近縁種である同科フルクリコ属のミラクルフルーツ（Synsepalum dulcificum）、同目サガリバナ科ブラジルナッツノキ属のブラジルナッツ（Bertholletia excelsa）、カキノキ科カキノキ属のカキ（Diospyros kaki）、カキノキ科ツバキ属の茶（Camellia sinensis）、マタタビ科マタタビ属のキウイフルーツ（Actinidia deliciosa）、ツツジ科スノキ属のブルーベリー（Vaccinium spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。シアナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００９１】
また、クルミ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をクルミ（ブナ目クルミ科クルミ属（Juglans spp.））に設定した。バターナッツ（Juglans cinerea）もクルミ属の一種であるため、検出対象とした。クルミと、その近縁種である同科ペカン属のヒッコリーナッツ（Carya ovata、Carya laciniosa）、ピーカンナッツ（Carya illinoinensis）、同目クリ科クリ属のクリ（Castanea spp.）、ブナ科ブナ属のビーチナッツ（Fagus spp.）、ブナ科シイ属のシイ（Castanopsis spp.）、ブナ科コナラ属のドングリ（Quercus spp.）、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ（Corylus spp.）のITS領域の塩基配列を比較した。クルミに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。
【００９２】
なお、センスプライマーとアンチセンスプライマーのハイブリダイズや、個々のプライマー自身によるハイブリダイズを生じないように、すなわち、いわゆるプライマーダイマーの形成を極力回避するような工夫を施して、各々のプライマーを設計した。例えば、プライマーダイマーの形成を回避させるために、プライマーの検出特異性及び検出感度の低下を導かないような塩基置換をプライマーに施している。アーモンド検出用プライマーのセンスプライマーである配列番号1における塩基番号3及び4の塩基は、本来、Aであるが、センスプライマー自身によるプライマーダイマーの形成を回避するために、プライマーの検出特異性及び検出感度の低下を導かないような塩基置換として、Aの代わりにTを採用している。同様に、配列番号10における塩基番号8の塩基をCからAに、配列番号15における塩基番号6の塩基をGからAに、配列番号21における塩基番号3の塩基をCからAに、配列番号24における塩基番号4の塩基をCからAに、塩基番号7の塩基をAからTに置換している。
【００９３】
さらに、上記17種のプライマーセットによるPCR反応条件を同一にするため、PCR反応において、その反応条件を最も左右するアニーリング条件（アニーリング温度、アニーリング時間）が同一になるよう各PCRプライマーを設計した。複数種のPCRプライマーのアニーリング条件を同一にすることは非常に困難であったが、PCRプライマーの塩基数、プライマー自身の塩基配列を詳細に検討することにより、各々の検出特異性を損なうことなく、アニーリング条件が同一となるよう設計した。
【００９４】
本発明が提供するプライマーの塩基配列について網羅的に述べてきたが、理論上は首尾よく設計されたプライマーであっても、意図する性能（検出特異性等）を保有しえないプライマーが設計される場合がある。例えば、本発明の研究段階において、配列番号６９と配列番号７０とからなるピーカンナッツ検出用PCRプライマーセットを用いたPCRでは、ピーカンナッツに特有の塩基配列を用いたにも関わらず、ピーカンナッツDNAだけでなく、ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNAも検出し、意図した検出特異性を示さなかった。このように、単に論理的にプライマーを設計すれば、意図する性能（検出特異性等）を取得できるとは限らず、必要な性能を保有しない場合も生じうるために、その設計の際には、論理的設計だけでなく、さらなる工夫とその性能評価試験が重要となる。本発明が提供するプライマーは、論理的設計の上に、さらなる工夫を施して設計したものであり、最終的には性能評価試験をクリアーしたものである。
【００９５】
従って、本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCR法などの核酸分析の手法を用いて、各種食品中に含まれる木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミ）由来DNAを高感度かつ特異的に、一斉に検出することができる。
【００９６】
ここで、核酸分析とは、生物分類における、個々の種、属、あるいは、グループによって特徴的な塩基配列が存在することを利用して、その特徴的な塩基配列の有無を分析することによって、その生物の種、属、あるいは、グループを把握するために有効な手段であって、特定の微生物の検出や生物種の同定などに有用に用いられる方法である。
【００９７】
本発明が提供するプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
塩基番号          12345678901234567890123456789
配列番号１ （アーモンドS）AGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC
配列番号２ （アーモンドAS） ACGACGGGCAACCGAGGTC
配列番号３ （ビーチナッツS）GCCTTTCGTCCCCAAACGGTC
配列番号４ （ビーチナッツAS）TGCCACGGTCGCTTCGAATG
配列番号５ （ブラジルナッツS）GACGAGTGGTGGATCACGACACG
配列番号６ （ブラジルナッツAS）TCGATGCCTTGCCGCTTCG
配列番号７ （カシューナッツS）TGGCGTTCGGAACGAACCCG
配列番号８ （カシューナッツAS）GCGATGCGGGCGGGCATAG
配列番号９ （クリS）GGAACGCGCCAAGGAAATCA
配列番号１０（クリAS）TCCGCCCAGCCCCGAACC
配列番号１１（ココナッツS）GACGCTCCGCCCCCTCGA
配列番号１２（ココナッツAS) GTGCGGCACGCACCTGGG
配列番号１３（銀杏S）GGTGCTCACTCCCCAGTCAGG
配列番号１４（銀杏AS) CATCTAGCATTTTGATCCTAACCACGG
配列番号１５（ヘーゼルナッツS）ATGCCAGGGGCGAATCTTGTG
配列番号１６（ヘーゼルナッツAS) GCTACAGGGTCACAGAGCACAAGAC
配列番号１７（ヒッコリーナッツS）TGGGAGGGCACGATGAAAGC
配列番号１８（ヒッコリーナッツAS）CGACGCAATAGGGTCGAGGAGAG
配列番号１９（ライチS）GAGGCGTGGGGATGCGTTATC
配列番号２０（ライチAS）CGAGAGCCTTACGCCGACCG
配列番号２１（マカダミアナッツS）GCACCCCGTGTCTCTGTTCG
配列番号２２（マカダミアナッツAS）CGATGTCCGAACAATGGCAAAG
配列番号２３（ピーカンナッツS）ACGGTTGGGAGGGCACGA
配列番号２４（ピーカンナッツAS）TGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
配列番号２５（松の実S）CAGGCGATGTTTCGTGGCG
配列番号２６（松の実AS）CCCTACCCAATGGGAGGACAAG
配列番号２７（ピリナッツS） TGGTCGTAACGAACCTCGGTGC
配列番号２８（ピリナッツAS）CGTCACGGCGGCGCTTTC
配列番号２９（ピスタチオS） GGTGTCGGTCGTATGCTTCTGCAT
配列番号３０（ピスタチオAS）GTCGTTATTGATAATGAAAGAAGGCTACC
配列番号３１（シアナッツS） GCGTTGCCTCGGCTAAAAACTC
配列番号３２（シアナッツAS）GCGGTCAAGGCTCCGCAA
配列番号３３（クルミS）  GGTTGGGAGGGCACGTTGAG
配列番号３４（クルミAS）CGACGGGTCACGAGGGTTTC
また、本発明が提供する３０塩基のＤＮＡからなるプライマーとしては、例えば以下の塩
基配列のものを上げることができる。
配列番号３５（アーモンドS） cgacccgAGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC
配列番号３６（アーモンドAS）gacgaacgcacACGACGGGCAACCGAGGTC
配列番号３７（ビーチナッツS）ggcttcgcgGCCTTTCGTCCCCAAACGGTC
配列番号３８（ビーチナッツAS）cggacgaggtTGCCACGGTCGCTTCGAATG
配列番号３９（ブラジルナッツS）acggcacGACGAGTGGTGGATCACGACACG
配列番号４０（ブラジルナッツAS）tggggtcgcggTCGATGCCTTGCCGCTTCG
配列番号４１（カシューナッツS）cgacggtcggTGGCGTTCGGAACGAACCCG
配列番号４２（カシューナッツAS）ggggtcgcgacGCGATGCGGGCGGGCATAG
配列番号４３（クリS）    accccggcgcGGAACGCGCCAAGGAAATCA
配列番号４４（クリAS）  gggaggccaactTCCGCCCAGCCCCGAACC
配列番号４５（ココナッツS） atcatgccaagcGACGCTCCGCCCCCTCGA
配列番号４６（ココナッツAS）ccgatggctgggGTGCGGCACGCACCTGGG
配列番号４７（銀杏S）    gctctgaagGGTGCTCACTCCCCAGTCAGG
配列番号４８（銀杏AS）  aatCATCTAGCATTTTGATCCTAACCACGG
配列番号４９（ヘーゼルナッツS）acggcgtgcATGCCAGGGGCGAATCTTGTG
配列番号５０（ヘーゼルナッツAS）gcgcaGCTACAGGGTCACAGAGCACAAGAC
配列番号５１（ヒッコリーナッツS）caaaaacggtTGGGAGGGCACGATGAAAGC
配列番号５２（ヒッコリーナッツAS）gcaagaaCGACGCAATAGGGTCGAGGAGAG
配列番号５３（ライチS）  gcctcggacGAGGCGTGGGGATGCGTTATC
配列番号５４（ライチAS）gcttcagggtCGAGAGCCTTACGCCGACCG
配列番号５５（マカダミアナッツS）gcgaagattgGCACCCCGTGTCTCTGTTCG
配列番号５６（マカダミアナッツAS）cacgcacaCGATGTCCGAACAATGGCAAAG
配列番号５７（ピーカンナッツS）cccctcccaaaaACGGTTGGGAGGGCACGA
配列番号５８（ピーカンナッツAS）cgggaggccaTGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
配列番号５９（松の実S）  ctgaaatgtggCAGGCGATGTTTCGTGGCG
配列番号６０（松の実AS）taaatccgCCCTACCCAATGGGAGGACAAG
配列番号６１（ピリナッツS） accttcggTGGTCGTAACGAACCTCGGTGC
配列番号６２（ピリナッツAS）gtgcgggcgccgCGTCACGGCGGCGCTTTC
配列番号６３（ピスタチオS） tcgtcgGGTGTCGGTCGTATGCTTCTGCAT
配列番号６４（ピスタチオAS）aGTCGTTATTGATAATGAAAGAAGGCTACC
配列番号６５（シアナッツS） cctgaattGCGTTGCCTCGGCTAAAAACTC
配列番号６６（シアナッツAS）tgacctggggtcGCGGTCAAGGCTCCGCAA
配列番号６７（クルミS）  cccaaaaaacGGTTGGGAGGGCACGTTGAG
配列番号６８（クルミAS）gggcaacacaCGACGGGTCACGAGGGTTTC
【００９８】
本発明の研究段階において、意図した検出特異性を示さなかったプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
配列番号６９（ピーカンナッツS） CCCCAACACCTCGTATGATGTGTA    
配列番号７０（ピーカンナッツAS）TGTAGTTGCGCTCGTCGCCC      
（ Sはセンスプライマーを表し、ASはアンチセンスプライマーを表す。）
【００９９】
本発明は、第1のプライマーセットとして、配列表の配列番号1における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、アーモンド検出用に好適に使用できる。
【０１００】
本発明は、第2のプライマーセットとして、配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ビーチナッツ検出用に好適に使用できる。
【０１０１】
本発明は、第3のプライマーセットとして、配列表の配列番号5における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号6における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ブラジルナッツ検出用に好適に使用できる。
【０１０２】
本発明は、第4のプライマーセットとして、配列表の配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、カシューナッツ検出用に好適に使用できる。
【０１０３】
本発明は、第5のプライマーセットとして、配列表の配列番号9における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、クリ検出用に好適に使用できる。
【０１０４】
本発明は、第6のプライマーセットとして、配列表の配列番号11における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号12における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ココナッツ検出用に好適に使用できる。
【０１０５】
本発明は、第7のプライマーセットとして、配列表の配列番号13における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号14における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、銀杏検出用に好適に使用できる。
【０１０６】
本発明は、第8のプライマーセットとして、配列表の配列番号15における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号16における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ヘーゼルナッツ検出用に好適に使用できる。
【０１０７】
本発明は、第9のプライマーセットとして、配列表の配列番号17における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号18における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ヒッコリーナッツ検出用に好適に使用できる。
【０１０８】
本発明は、第10のプライマーセットとして、配列表の配列番号19における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号20における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ライチ検出用に好適に使用できる。
【０１０９】
本発明は、第11のプライマーセットとして、配列表の配列番号21における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号22における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、マカダミアナッツ検出用に好適に使用できる。
【０１１０】
本発明は、第12のプライマーセットとして、配列表の配列番号23における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号24における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピーカンナッツ検出用に好適に使用できる。
【０１１１】
本発明は、第13のプライマーセットとして、配列表の配列番号25における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号26における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、松の実検出用に好適に使用できる。
【０１１２】
本発明は、第14のプライマーセットとして、配列表の配列番号27における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号28における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピリナッツ検出用に好適に使用できる。
【０１１３】
本発明は、第15のプライマーセットとして、配列表の配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピスタチオ検出用に好適に使用できる。
【０１１４】
本発明は、第16のプライマーセットとして、配列表の配列番号31における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号32における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、シアナッツ検出用に好適に使用できる。
【０１１５】
本発明は、第17のプライマーセットとして、配列表の配列番号33における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号34における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、クルミ検出用に好適に使用できる。
【０１１６】
前記各プライマーにおいて、塩基配列の長さを15から30とするのは、PCR用プライマーとしての塩基配列の適切な長さが15〜30程度であること、また、3´末端側15個の塩基配列を特定するのは、3´末端側15個程度がPCRの特異的な増幅反応において重要であって、5´末端側の塩基配列が若干異なっていたり、配列の長さが多少違っていたりしても、PCRの反応自体への悪影響が、たいていの場合、小さいためである。
【０１１７】
本発明においては、さらに、第1のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（1´）（最も好ましくは配列番号1の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（2´）（最も好ましくは配列番号2の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはアーモンド検出用に好適に使用でき、配列番号1のプライマーと配列番号2のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（1´）の具体例としては配列番号３５のプライマー、（2´）の具体例としては配列番号３６のプライマーを例示できる。
【０１１８】
本発明においては、さらに、第2のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（3´）（最も好ましくは配列番号3の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（4´）（最も好ましくは配列番号4の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはビーチナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号3のプライマーと配列番号4のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（3´）の具体例としては配列番号３７のプライマー、（4´）の具体例としては配列番号３８のプライマーを例示できる。
【０１１９】
本発明においては、さらに、第3のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（5´）（最も好ましくは配列番号5の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（6´）（最も好ましくは配列番号6の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはブラジルナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号5のプライマーと配列番号6のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（5´）の具体例としては配列番号３９のプライマー、（6´）の具体例としては配列番号４０のプライマーを例示できる。
【０１２０】
本発明においては、さらに、第4のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（7´）（最も好ましくは配列番号7の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（8´）（最も好ましくは配列番号8の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはカシューナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号7のプライマーと配列番号8のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（7´）の具体例としては配列番号４１のプライマー、（8´）の具体例としては配列番号４２のプライマーを例示できる。
【０１２１】
本発明においては、さらに、第5のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（9´）（最も好ましくは配列番号9の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（10´）（最も好ましくは配列番号10の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはクリ検出用に好適に使用でき、配列番号9のプライマーと配列番号10のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（9´）の具体例としては配列番号４３のプライマー、（10´）の具体例としては配列番号４４のプライマーを例示できる。
【０１２２】
本発明においては、さらに、第6のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表
の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（11´）（最も好ましくは配列番号11の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（12´）（最も好ましくは配列番号12の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはココナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号11のプライマーと配列番号12のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（11´）の具体例としては配列番号４５のプライマー、（12´）の具体例としては配列番号４６のプライマーを例示できる。
【０１２３】
本発明においては、さらに、第7のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表
の配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（13´）（最も好ましくは配列番号13の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（14´）（最も好ましくは配列番号14の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは銀杏検出用に好適に使用でき、配列番号13のプライマーと配列番号14のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（13´）の具体例としては配列番号４７のプライマー、（14´）の具体例としては配列番号４８のプライマーを例示できる。
【０１２４】
本発明においては、さらに、第8のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（15´）（最も好ましくは配列番号15の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（16´）（最も好ましくは配列番号16の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはヘーゼルナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号15のプライマーと配列番号16のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（15´）の具体例としては配列番号４９のプライマー、（16´）の具体例としては配列番号５０のプライマーを例示できる。
【０１２５】
本発明においては、さらに、第9のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（17´）（最も好ましくは配列番号17の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（18´）（最も好ましくは配列番号18の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはヒッコリーナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号17のプライマーと配列番号18のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（17´）の具体例としては配列番号５１のプライマー、（18´）の具体例としては配列番号５２のプライマーを例示できる。
【０１２６】
本発明においては、さらに、第10のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（19´）（最も好ましくは配列番号19の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（20´）（最も好ましくは配列番号20の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはライチ検出用に好適に使用でき、配列番号19のプライマーと配列番号20のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（19´）の具体例としては配列番号５３のプライマー、（20´）の具体例としては配列番号５４のプライマーを例示できる。
【０１２７】
本発明においては、さらに、第11のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（21´）（最も好ましくは配列番号21の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（22´）（最も好ましくは配列番号22の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはマカダミアナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号21のプライマーと配列番号22のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（21´）の具体例としては配列番号５５のプライマー、（22´）の具体例としては配列番号５６のプライマーを例示できる。
【０１２８】
本発明においては、さらに、第12のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（23´）（最も好ましくは配列番号23の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（24´）（最も好ましくは配列番号24の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピーカンナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号23のプライマーと配列番号24のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（23´）の具体例としては配列番号５７のプライマー、（24´）の具体例としては配列番号５８のプライマーを例示できる。
【０１２９】
本発明においては、さらに、第13のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（25´）（最も好ましくは配列番号25の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（26´）（最も好ましくは配列番号26の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは松の実検出用に好適に使用でき、配列番号25のプライマーと配列番号26のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（25´）の具体例としては配列番号５９のプライマー、（26´）の具体例としては配列番号６０のプライマーを例示できる。
【０１３０】
本発明においては、さらに、第14のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表
の配列番号27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（27´）（最も好ましくは配列番号27の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（28´）（最も好ましくは配列番号28の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピリナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号27のプライマーと配列番号28のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（27´）の具体例としては配列番号６１のプライマー、（28´）の具体例としては配列番号６２のプライマーを例示できる。
【０１３１】
本発明においては、さらに、第15のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（29´）（最も好ましくは配列番号29の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（30´）（最も好ましくは配列番号30の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピスタチオ検出用に好適に使用でき、配列番号29のプライマーと配列番号30のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（29´）の具体例としては配列番号６３のプライマー、（30´）の具体例としては配列番号６４のプライマーを例示できる。
【０１３２】
本発明においては、さらに、第16のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号31の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（31´）（最も好ましくは配列番号31の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号32の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（32´）（最も好ましくは配列番号32の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはシアナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号31のプライマーと配列番号32のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（31´）の具体例としては配列番号６５のプライマー、（32´）の具体例としては配列番号６６のプライマーを例示できる。
【０１３３】
本発明においては、さらに、第17のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号33の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（33´）（最も好ましくは配列番号33の塩基配列のDNAからなるプライマー）をセンスプライマーとし、配列表の配列番号34の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー（34´）（最も好ましくは配列番号34の塩基配列のDNAからなるプライマー）をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはクルミ検出用に好適に使用でき、配列番号33のプライマーと配列番号34のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、（33´）の具体例としては配列番号６７のプライマー、（34´）の具体例としては配列番号６８のプライマーを例示できる。
【０１３４】
木の実検出法
本発明の木の実検出方法は、試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、本発明のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に木の実（アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ）が存在しているか否かを検出する工程とを含む方法である。
【０１３５】
即ち、上記本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いて、試料中のDNAをPCR等で核酸分析することにより、試料中の木の実を特異的に検出することが可能となる。このとき、アーモンドを検出する場合には、アーモンド検出用PCRプライマーセットを使用し、同様にビーチナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミを検出する場合には、それぞれビーチナッツ検出用PCRプライマーセット、ブラジルナッツ検出用PCRプライマーセット、カシューナッツ検出用PCRプライマーセット、クリ検出用PCRプライマーセット、ココナッツ検出用PCRプライマーセット、銀杏検出用PCRプライマーセット、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセット、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセット、ライチ検出用PCRプライマーセット、マカダミアナッツ検出用PCRプライマーセット、ピーカンナッツ検出用PCRプライマーセット、松の実検出用PCRプライマーセット、ピリナッツ検出用PCRプライマーセット、ピスタチオ検出用PCRプライマーセット、シアナッツ検出用PCRプライマーセット、クルミ検出用PCRプライマーセットを使用すればよい。
【０１３６】
検出法（核酸分析）の種類は、特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法やPCR増幅産物をプローブで検出する方法等を例示することができる。
【０１３７】
PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法としては、検出目的に応じて選択した上記本発明の木の実検出用プライマーセットを用いて、試料中のDNAにおける標的塩基配列を選択的に増幅させ、PCR増幅産物の有無を測定する方法が挙げられる。PCR増幅産物の有無の確認は、通常、PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンIなどの核酸染色によって行うことができる。リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行う場合は、その装置の検出システムにより自動的にPCR増幅産物の有無を確認することができる。例えば、PCR反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合、サイバーグリーンIが二本鎖DNAに結合したときに発する蛍光量に依存したPCR増幅産物量をサイクル毎にモニターすることができる。蛍光量によりPCR増幅が見られた場合には、先述のアガロースゲル電気泳動によって増幅産物の有無とそのサイズを確認すればよい。
【０１３８】
具体的には、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約515 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にアーモンドが存在していたことを示唆する。
【０１３９】
具体的には、配列番号3記載のプライマーと配列番号4記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約75 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にビーチナッツが存在していたことを示唆する。
【０１４０】
具体的には、配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約91 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にブラジルナッツが存在していたことを示唆する。
【０１４１】
具体的には、配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約102 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にカシューナッツが存在していたことを示唆する。
【０１４２】
具体的には、配列番号9記載のプライマーと配列番号10記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約293 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にクリが存在していたことを示唆する。
【０１４３】
具体的には、配列番号11記載のプライマーと配列番号12記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約224 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にココナッツが存在していたことを示唆する。
【０１４４】
具体的には、配列番号13記載のプライマーと配列番号14記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約186 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に銀杏が存在していたことを示唆する。
【０１４５】
具体的には、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約361 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にヘーゼルナッツが存在していたことを示唆する。
【０１４６】
具体的には、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約543 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にヒッコリーナッツが存在していたことを示唆する。
【０１４７】
具体的には、配列番号19記載のプライマーと配列番号20記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約162 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にライチが存在していたことを示唆する。
【０１４８】
具体的には、配列番号21記載のプライマーと配列番号22記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約111 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にマカダミアナッツが存在していたことを示唆する。
【０１４９】
具体的には、配列番号23記載のプライマーと配列番号24記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約468 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピーカンナッツが存在していたことを示唆する。
【０１５０】
具体的には、配列番号25記載のプライマーと配列番号26記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約139 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に松の実が存在していたことを示唆する。
【０１５１】
具体的には、配列番号27記載のプライマーと配列番号28記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約83 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピリナッツが存在していたことを示唆する。
【０１５２】
具体的には、配列番号29記載のプライマーと配列番号30記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約163 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピスタチオが存在していたことを示唆する。
【０１５３】
具体的には、配列番号31記載のプライマーと配列番号32記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約518 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にシアナッツが存在していたことを示唆する。
【０１５４】
具体的には、配列番号33記載のプライマーと配列番号34記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約501 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にクルミが存在していたことを示唆する。
【０１５５】
PCR増幅産物をプローブで検出する方法としては、Taq Man法に代表されるように、PCR増幅産物の内部塩基配列とハイブリダイズするような蛍光物質標識プローブを反応液に添加し、該プローブがPCR増幅産物にハイブリダイズ後、該プローブが分解されるときに生じる蛍光量をリアルタイムPCR装置で自動的に検出することによって、PCR増幅産物の有無を確認する方法が挙げられる。なお、PCR増幅産物をプローブで検出するその他の方法としては、Molecular Beacon法、CycleavePCR法、ハイブリプローブを利用する方法等が挙げられる。これらの方法で使用するPCRプライマーは、本発明の木の実検出用PCRプライマーセットの何れかを使用すればよく、各々のPCRプライマーセットで増幅されるPCR増幅産物の内部塩基配列から標的とする生物種に共通な塩基配列領域を別途選択し、その領域に基づいたプローブを使用すればよい。
【０１５６】
本発明の木の実の検出法において、対象となる被験試料の種類は、特に限定されない。例えば、被験試料としては、食品原料や加工食品等が挙げられる。食品原料としては、木の実を取り扱う食品原料生産工場において、別途生産される木の実を意図的に含まない食品原料が挙げられる。加工食品としては、菓子類、麺類、粉末スープ、液体スープ、熱風乾燥又は凍結乾燥した具材、あるいは、これらの加工食品を含有する各種調理食品等が挙げられる。また、木の実を取り扱う食品製造工場において、別途生産される木の実を意図的に含まない加工食品が挙げられる。また、木の実を含む加工食品を製造後、木の実を含まない加工食品を製造する際には、木の実残渣の除去を念頭においた食品製造設備の入念な清掃作業が必須となる。この清掃作業方法の有効性、並びに、食品製造設備の木の実残渣の有無を確認する観点から、当該製造設備の拭き取り試料も被験試料として挙げられる。
【０１５７】
また、試料の形態も特に限定されず、一般的な既知のDNA抽出法（消費者庁次長通知、アレルギー物質を含む食品の検査方法について、平成26年3月26日、消食表第36号）や市販の各種DNA抽出キット［例えば、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits（GE Healthcare Biosciences Corp., USA）、DNA Extraction IsoplantII kit（Nippon Gene Co. Ltd., Japan）、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）等］によって、DNAの回収が可能な試料であれば、上記の検出法に適用することができる。上記のDNA抽出法によって、ゲノムDNA及び細胞小器官由来DNA（ミトコンドリアDNAやクロロプラストDNA）を、通常、試料から抽出することができる。
【０１５８】
木の実検出用キット
本発明は、また、木の実検出キットに関する。当該キットは、上記本発明の木の実検出用PCRプライマーセットの少なくとも１セットを含んで成るものであれば、その構成は特に限定されない。
具体的には、配列番号1における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号5における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号6における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号9における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号11における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号12における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号13における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号14における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号15における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号16における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号17における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号18における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号19における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号20における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号21における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号22における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列表の配列番号23における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号24における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号25における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号26における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号27における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号28における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号31における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号32における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号33における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号34における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；の1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。
【０１５９】
そして、好ましいものとして、配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列表の配列番号23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号31の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号32の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット；配列番号33の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号34の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセットの1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。
【０１６０】
その中でも、特に好ましいものとして、配列番号1の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号2の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；
配列番号3の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号4の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号5の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号6の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号7の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号8の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号9の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号10の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号11の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号12の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号13の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号14からなるPCRプライマーとのセット；配列番号15の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号16の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号17の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号18の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号19の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号20の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号21の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号22の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列表の配列番号23の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号24の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号25の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号26の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号27の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号28の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号29の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号30の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号31の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号32の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット；配列番号33の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号34の塩基配列からなるPCRプライマーとのセットの1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。
また、上記の各々のプライマーセット、及び当該の各々のプライマーセットで増幅され
るPCR増幅産物を検出するためのプローブ等を含む木の実検出キットなども挙げられる。
【０１６１】
当該キットには、使用目的等に応じて、適当な試薬や各種容器等を含めることができる。具体的には、PCRプライマー伸長生成物を合成するための重合用試薬、例えば、耐熱性DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、マグネシウム及び、PCR反応用緩衝液、並びに、それらの品質を適切に保持可能な保存容器等を含めることができる。
【０１６２】
実施例
以下に、本発明について実施例を用いて、さらに、詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能である。
【０１６３】
実施例1
各種動物、植物、真菌、及び細菌由来DNAに対する木の実検出用PCRプライマーセットの検出特異性の確認
本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを使用したPCR分析法の有効性を確認するために、各種生物由来DNAに対するPCRの検出特異性を調べる実験を、下記のように実施した。
【０１６４】
ヒトの精製DNAは、セマイン社（CeMines, LLC, USA）から購入したものを使用した。
【０１６５】
ウシ、ブタ、ニワトリ、シロエビ、タラバガニ、コウイカ、ベニザケ、及びマサバの精製DNAは、商店から購入した各々の試料の（筋）肉質部分を凍結後、マルチビーズショッカー（安井器械、大阪）で破砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits（GE Healthcare Biosciences Corp., USA）、DNA Extraction IsoplantIIkit（Nippon Gene Co. Ltd., Japan）、またはDNeasy Blood&Tissue kit（Qiagen GmbH,Germany）を用いて調製したものを使用した。
【０１６６】
コショウ、ナガイモ、ネギ、ココナッツ、ナツメヤシ、アサイー、バナナ、マカダミアナッツ（オーストラリア産、ケニア産）、レンコン、ラッカセイ、ダイズ、アーモンド（アメリカ産、スペイン産）、モモ、プルーン、ウメ、スモモ、アンズ、サクランボ、リンゴ、ビワ、イチゴ、カボチャ、ピーカンナッツ、クルミ（アメリカ産、フランス産）、ヘーゼルナッツ、ピリナッツ、カシューナッツ（インド産、ベトナム産）、ピスタチオ（イラン産、アメリカ産）、マンゴー、ピンクペッパー、ライチ、ランブータン、キャベツ、ブラジルナッツ、シアナッツ、ミラクルフルーツ、カキ、茶、キウイフルーツ、ブルーベリー、ゴマ、ジャガイモ、ニンジン、銀杏、松の実は、商店から購入し、イネは国内栽培農家から入手した。これらの精製DNAは、各々の試料の一部（種子、果皮部、葉部、塊茎部）を70%エタノールで洗浄し、さらに、TE緩衝液で素早く洗浄後、マルチビーズショッカー（安井器械、大阪）で破砕した試料からGenomic-tip 20/G（Qiagen GmbH, Germany）、DNeasy plant Mini kits（Qiagen GmbH, Germany）、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits、または、DNA Extraction IsoplantII kitを用いて調製したものを使用した。
【０１６７】
ソバ及びコムギの精製DNAは、商店から購入したそば粉及び小麦粉からGenomic-tip 20/Gを用いて調製したものを使用した。
【０１６８】
トウモロコシの精製DNAは、バイオチェイン・インスティテュート社（BioChain Institute, Inc., USA）から購入したものを使用した。
【０１６９】
ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）の精製DNAは、東京大学大学院理学系研究科附属植物園から分譲された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。
【０１７０】
クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ）の精製DNAは、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構果樹研究所から提供された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。
【０１７１】
クリ（チンカピン）の精製DNAは、独立行政法人森林総合研究所多摩森林科学園から分譲された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。
【０１７２】
ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）、シイ、ドングリ（シラカシ）の精製DNAは、自然界より入手した葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。
【０１７３】
ピキア・アノマラ（Pichia anomala IFO 0144）、及びバチルス・セレウス菌（Bacillus cereus ATCC11950）の精製DNAは、各々の菌株を適切な培地で培養後、その培養液からPuregene Yeast and Gram-Positive DNA Isolation kit（Gentra Systems Inc., USA）を用いて調製したものを使用した。なお、いずれの精製DNAもRNA分解酵素によるRNAの除去操作を実施してある。
【０１７４】
配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、及び34に記載の各々のPCRプライマーは、ユーロフィンジェノミクス社で合成されたものを、以下のPCRで使用した。
【０１７５】
上述したように準備した各種動物、植物、真菌、及び細菌DNA量を測定後、滅菌水を用いて、DNA濃度を10 ng/μLに調製した。調製した5 μLのDNA試料液を含む20 μL容量の反応液は、タカラバイオ社のSYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（Takara Bio Inc., Japan）を用いて調製した。この試薬は、TaKaRa Ex Taq HS（ホットスタートタイプ）、dNTP Mixture、Mg2+およびSYBR Green Iを溶液中に含んでいる。反応液は、SYBR Premix ExTaqをベースとし、250 nMセンスプライマー、250 nMアンチセンスプライマーを含む組成として、調製した。PCR反応は、LightCycler（Roche Diagnostics GmbH, Germany）で行い、増幅反応条件は以下の通りである。
【０１７６】
95℃で1分間のサイクルを一回実施後、20℃/秒の速度で95℃まで昇温後、5秒間同温度で保温、次に20℃/秒の速度で68℃まで降温後、10秒間同温度で保温、さらに10℃/秒の速度で72℃まで昇温後、30秒間同温度で保温する3つのステップからなる増幅サイクルを35回実施した。PCR増幅産物は、SYBR Green I依存性の蛍光量として、各々のサイクルの最終ステップに記録した。蛍光量から増幅が確認された場合は、2%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の5 μL）を分離し、Gel DOC EZ（Bio Rad）を用いて増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてOneMARK 100（GeneDireX）を使用した。電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出された場合を、PCR反応陽性と判定した。これらのPCRの結果を表1に記載した。表中の＋（プラス）はPCR反応陽性を示し、−（マイナス）はPCR反応陰性を示す。
【０１７７】
アーモンド検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、アーモンド（アメリカ産、スペイン産）DNAを使用した場合のみ515bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるモモDNA、プルーンDNA、ウメDNA、スモモDNA、アンズDNA、サクランボDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１７８】
また、ビーチナッツ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNAを使用した場合のみ75bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるクリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNA、ピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、ヘーゼルナッツDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１７９】
また、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ブラジルナッツDNAを使用した場合のみ91bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるシアナッツDNA、ミラクルフルーツDNA、カキDNA、茶DNA、キウイフルーツDNA、ブルーベリーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１８０】
また、カシューナッツ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、カシューナッツ（インド産、ベトナム産）DNAを使用した場合のみ102bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるピスタチオ（イラン産、アメリカ産）DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１８１】
また、クリ検出用PCRプライマー（配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNAを使用した場合のみ293bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNA、ピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、ヘーゼルナッツDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１８２】
また、ココナッツ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ココナッツDNAを使用した場合のみ224bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるナツメヤシDNA、アサイーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１８３】
また、銀杏検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、銀杏DNAを使用した場合のみ186bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１８４】
また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ヘーゼルナッツDNAを使用した場合のみ361bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１８５】
また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNA、ピーカンナッツDNAを使用した場合のみ543bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるクルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１８６】
また、ライチ検出用PCRプライマー（配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ライチDNAを使用した場合のみ162bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるランブータンDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１８７】
また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、マカダミアナッツ（オーストラリア産、ケニア産）DNAを使用した場合のみ111bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるレンコンDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１８８】
また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー（配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピーカンナッツDNAを使用した場合のみ468bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNA、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１８９】
また、松の実検出用PCRプライマー（配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、松の実DNAを使用した場合のみ139bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１９０】
また、ピリナッツ検出用PCRプライマー（配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピリナッツDNAを使用した場合のみ83bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるカシューナッツ（インド産、ベトナム産）DNA、ピスタチオ（イラン産、アメリカ産）DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNA、ライチDNA、ランブータンDNA、オレンジDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１９１】
また、ピスタチオ検出用PCRプライマー（配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピスタチオ（イラン産、アメリカ産）DNAを使用した場合のみ163bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるカシューナッツ（インド産、ベトナム産）DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１９２】
また、シアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、シアナッツDNAを使用した場合のみ518bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるミラクルフルーツDNA、ブラジルナッツDNA、、カキDNA、茶DNA、キウイフルーツDNA、ブルーベリーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１９３】
また、クルミ検出用PCRプライマー（配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クルミ（アメリカ産、フランス産）DNAを使用した場合のみ501bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された（表1）。近縁種であるピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツ（オーバータヒッコリー）DNA、クリ（和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン）DNA、ビーチナッツ（ブナ、イヌブナ）DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ（シラカシ）DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった（表1）。
【０１９４】
【表１】
2019129841.tif 000003
【０１９５】
実施例2
木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度の確認
実施例1で使用した木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度を調べるために、下記のような実験を実施した。実施例1で調製したアーモンド（アメリカ産）、ビーチナッツ（ブナ）、ブラジルナッツ、カシューナッツ（インド産）、クリ（チュウゴクグリ）、ココナッツ、ヘーゼルナッツ、銀杏、ライチ、マカダミアナッツ（オーストラリア産）、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ（アメリカ産）、シアナッツ、及びクルミ（アメリカ産）の各DNAを滅菌水で希釈し、1 fg/μl、10 fg/μl、100 fg/μl、1 pg/μl、10 pg/μl、100 pg/μl のDNA溶液の希釈系列を作製し、これらの希釈した被験DNA液の1 μLを、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。PCR反応後、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０１９６】
図1に示すように、アーモンド検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ビーチナッツ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、カシューナッツ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 ｐg DNA/分析であり、クリ検出用PCRプライマー（配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、ココナッツ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 pg DNA/分析であり、銀杏検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ライチ検出用PCRプライマー（配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー（配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、松の実検出用PCRプライマー（配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピリナッツ検出用PCRプライマー（配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピスタチオ検出用PCRプライマー（配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、シアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、クルミ検出用PCRプライマー（配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット）を使用した場合の検出感度は、1 fg DNA/分析であった。
【０１９７】
実施例3
木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRによる木の実含有食品中の木の実由来DNAの検出
各種木の実を原料として含有する市販食品等に対する本発明の木の実検出用PCRプライ
マーセットを用いたPCR分析を下記のように行い、本発明の実用性を検討した。
【０１９８】
各種木の実を原料として含有することが明記されている市販食品（表2）を準備し、10〜100 gをマルチビーズショッカーで粉砕した。その混合破砕物の2 gから各々のDNAをGenomic-tip 20/G kitを用いて抽出した。抽出時には、RNA分解酵素によるRNAの除去操作も実施した。抽出した食品試料DNA量を測定後、滅菌水を用いて、食品試料DNAの濃度を10 ng/μLに調製した。なお、ビーチナッツ、ヒッコリーナッツ、およびシアナッツを原料として含有する市販食品の入手が困難であったため、代替試料として、ココナッツサブレ（日清シスコ）DNA溶液（10 ng/μL）に各DNAを10 pg/μLの濃度で添加したものを使用した。これらの調製DNA液の5 μLを、実施例1で使用した木の実検出用PCRプライマーセットを用い、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。蛍光量から増幅が確認された場合は、2%（wt/vol）アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物（反応液の5 μL）を分離し、Gel DOC EZ（Bio Rad）を用いて増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてOneMARK 100（GeneDireX）を使用した。電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出された場合を、PCR反応陽性と判定した。これらのPCRの結果を表2に記載した。表中の＋（プラス）はPCR反応陽性を示し、−（マイナス）はPCR反応陰性を示す。さらに、食品試料DNAから増幅されたPCR増幅産物を、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit（Applied Biosystems社）を用いて、両方向からダイレクトシーケンス後、Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）によって塩基配列を分析した。分析した塩基配列データをGenBank nucleotide sequence database（BLAST search）もしくは、発明者らが保有するDNAデータベースと比較解析し、その塩基配列の類似性に基づいて、PCR増幅産物由来DNAの生物種を帰属・同定した。
【０１９９】
その結果、アーモンド検出用PCRプライマー（配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、アーモンド含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びプチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAにおいてのみ、515bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びプチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、アーモンドのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、アーモンド非含有食品試料からアーモンド由来DNAやその他のDNAを検出しないが、アーモンド含有食品試料からアーモンド由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２００】
また、ビーチナッツ検出用PCRプライマー（配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ビーチナッツ含有食品の代替試料［50pgビーチナッツDNAを添加したココナッツサブレ(日清シスコ)］由来DNAにおいてのみ、75 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ビーチナッツ含有食品の代替試料由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ビーチナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ビーチナッツ非含有食品試料からビーチナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ビーチナッツ非含有食品中に添加された微量のビーチナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２０１】
また、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ブラジルナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAにおいてのみ、91bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ブラジルナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ブラジルナッツ非含有食品試料からブラジルナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ブラジルナッツ含有食品試料からブラジルナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２０２】
また、カシューナッツ検出用PCRプライマー（配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、カシューナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAにおいてのみ、102bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）及びトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、カシューナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、カシューナッツ非含有食品試料からカシューナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、カシューナッツ含有食品試料からカシューナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２０３】
また、クリ検出用PCRプライマー（配列番号9、及び10からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クリ含有食品である、栗饅頭（山久YK）由来DNAにおいてのみ、293bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、栗饅頭（山久YK）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、クリのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、クリ非含有食品試料からクリ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、含有食品試料からクリ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２０４】
また、ココナッツ検出用PCRプライマー（配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ココナッツ含有食品である、トリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）及びココナッツサブレ（日清シスコ）由来DNAにおいてのみ、224bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、トリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）及びココナッツサブレ（日清シスコ）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ココナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ココナッツ非含有食品試料からココナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ココナッツ含有食品試料からココナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２０５】
また、銀杏検出用PCRプライマー（配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、銀杏含有食品である、ぎんなん羊羹（山岸モータース）由来DNAにおいてのみ、186bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ぎんなん羊羹（山岸モータース）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、銀杏のクロロプラストmatK遺伝子配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、銀杏非含有食品試料から銀杏由来DNAやその他のDNAを検出しないが、銀杏含有食品試料から銀杏由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２０６】
また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー（配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ヘーゼルナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAにおいてのみ、361bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー（ドーセットシリアル）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ヘーゼルナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ヘーゼルナッツ非含有食品試料からヘーゼルナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ヘーゼルナッツ含有食品試料からヘーゼルナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２０７】
また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー（配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ヒッコリーナッツ含有食品の代替試料［50pgヒッコリーナッツDNAを添加したココナッツサブレ（日清シスコ）］由来DNA、及びピーカンナッツ含有食品であるトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）においてのみ、543 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ヒッコリーナッツ含有食品の代替試料由来DNA及びトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ヒッコリーナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ヒッコリーナッツ非含有食品試料からヒッコリー由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピーカンナッツ含有食品試料、及びヒッコリーナッツ非含有食品中に添加された微量のヒッコリーナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２０８】
また、ライチ検出用PCRプライマー（配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ライチ含有食品である、フルーツセラピー  ホワイトピーチ（フジッコ）由来DNAにおいてのみ、162bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、フルーツセラピー  ホワイトピーチ（フジッコ）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ライチのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ライチ非含有食品試料からライチ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ライチ含有食品試料からライチ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２０９】
また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、マカダミアナッツ含有食品である、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAにおいてのみ、111bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、マカダミアナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、マカダミアナッツ非含有食品試料からマカダミアナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、マカダミアナッツ含有食品試料からマカダミアナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２１０】
また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー（配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ピーカンナッツ含有食品であるトリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）においてのみ、468 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、トリプルナッツチョコレート（メリーチョコレートカムパニー）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピーカンナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピーカンナッツ非含有食品試料からピーカンナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピーカンナッツ含有食品試料からピーカンナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２１１】
また、松の実検出用PCRプライマー（配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、松の実含有食品であるまぜるだけのスパゲッティソース  バジル（エスビー食品）においてのみ、139 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、まぜるだけのスパゲッティソース  バジル（エスビー食品）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、松の実のITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、松の実非含有食品試料から松の実由来DNAやその他のDNAを検出しないが、松の実含有食品試料から松の実由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２１２】
また、ピリナッツ検出用PCRプライマー（配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、ピリナッツ含有食品であるLA2PU CRISPY PILINUT with Garlic（ロイヤルコンツェルン）においてのみ、83 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、LA2PU CRISPY PILINUT with Garlic（ロイヤルコンツェルン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピリナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピリナッツ非含有食品試料からピリナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピリナッツ含有食品試料からピリナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２１３】
また、ピスタチオ検出用PCRプライマー（配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、ピスタチオ含有食品である、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAにおいてのみ、163bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、プチチョコリーフパイ（エル・マドロン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピスタチオのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピスタチオ非含有食品試料からピスタチオ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピスタチオ含有食品試料からピスタチオ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２１４】
また、シアナッツ検出用PCRプライマー（配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット）を使用した場合は、シアナッツ含有食品の代替試料［50pgシアナッツDNAを添加したココナッツサブレ（日清シスコ）］由来DNAにおいてのみ、518 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、シアナッツ含有食品の代替試料由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、シアナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、シアナッツ非含有食品試料からシアナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、シアナッツ非含有食品中に添加された微量のシアナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２１５】
また、クルミ検出用PCRプライマー（配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット）を使用した場合、クルミ含有食品である、あずきくるみデニッシュ（敷島製パン）由来DNAにおいてのみ、501bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった（表2）。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、あずきくるみデニッシュ（敷島製パン）由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、クルミのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、クルミ非含有食品試料からクルミ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、クルミ含有食品試料からクルミ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。
【０２１６】
【表２】
2019129841.tif 000004
【図１】
2019129841.tif 000005
【配列表】
2019129841000001.app