(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子発現制御及び食用植物のアレルゲン性評価に有用なポリヌクレオチド、並びにその使用方法の提供。【解決手段】特定の塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列を含む、ポリヌクレオチド、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）植物の細胞において、アレルゲン遺伝子の上流領域における、当該ポリヌクレオチドを検出する工程を含む、マタタビ科植物のアレルゲン性の評価方法、及びアレルゲン性評価用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなり、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなり、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを、標的遺伝子の上流領域に含む細胞。
【請求項４】
標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、請求項１に記載のポリヌクレオチドを、前記標的遺伝子の上流領域に導入する工程を含む、方法。
【請求項５】
マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）植物の細胞において、アレルゲン遺伝子の上流領域における、請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する工程を含む、マタタビ科植物のアレルゲン性の評価方法。
【請求項６】
前記アレルゲン遺伝子がＡｃｔ１ａ遺伝子である、請求項５に記載のアレルゲン性の評価方法。
【請求項７】
前記マタタビ科植物が、アクチニジア属（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）に属する植物である、請求項５又は６に記載のアレルゲン性の評価方法。
【請求項８】
下記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも一方を含む、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）植物のアレルゲン性評価用キット。
（ｉ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部とアレルゲン遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部とを増幅可能なプライマーセット
（ｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブ
【請求項９】
前記アレルゲン遺伝子がＡｃｔ１ａ遺伝子である、請求項８に記載のアレルゲン性評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチド及びその使用に関する。より具体的には、ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドを含む細胞、及び該ポリヌクレオチドを用いた標的遺伝子の発現制御方法等に関する。さらに、前記ポリヌクレオチドを指標としたマタタビ科植物のアレルゲン性評価方法、及び該評価方法用いるアレルゲン性評価用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーは、食物を摂取したときにそこに含まれる物質をヒトの免疫系が異物と認識し、過剰に反応する疾患である。日本では、厚生労働省の調査などから、アトピー性皮膚炎の患者数が漸減しているのに対して、食物アレルギー患者はアレルギー性鼻炎と同様に増加していることが明らかになっている。食物アレルギーは、主たる患者年齢が０〜４歳の幼児期であり、育児や教育機関などの現場で重要な課題となつている。
【０００３】
キウイフルーツは、果物類の中では、食物アレルギー患者が多い果物として知られている。キウイフルーツにおけるアレルギーの原因物質としては、アクチニジンが知られており、グリーンキウイ種であるアクチニジア・デリシオサ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）では、総可溶性タンパク質の４０〜５０％のアクチニジンを含有する。
アクチニジンは、システインプロテアーゼ活性を有し、パパイン様サブファミリー（ｐａｐａｉｎ−ｌｉｋｅ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）に属する。キウイフルーツにおいて、アクチニジンのレベルは、果実の成熟に伴って増加するが、他の果物種におけるシステインプロテアーゼのレベルは、成熟プロセス中に減少する。その結果、キウイフルーツでは、食用段階において、果物類や野菜類の中で最も高いプロテアーゼ活性を有する。
【０００４】
アクチニジンの含有量は、キウイフルーツの品種間で差があることが報告されている（例えば、非特許文献１）。例えば、アクチニジア・シネンシス（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の品種の中でも、Ａ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ‘ＥＭ４’は、Ａ．ｄｅｌｉｃｉｏｓａ‘Ｈａｙｗａｒｄ’（ヘイワード）と同等のアクチニジン含有量を有する。一方、Ａ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ‘Ｈｏｎｇｙａｎｇ’（レインボーレッド）及び‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’（ホート１６Ａ）は、ごく微量のアクチニジンしか含有しない。
【０００５】
また、最近の研究では、Ａ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓの分離集団を用いて、アクチジンのコード遺伝子であるＡｃｔ１ａを含む領域の配列解析の結果が報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nieuwenhuizen et al., Identification and characterisation of acidic and novel basic forms of actinidin, the highly abundant cysteine protease from kiwifruit. Functional Plant Biology, 2007, 34, 946-961.
【非特許文献２】Nieuwenhuizen et al., Mapping, Complementation, and Targets of the Cysteine Protease Actinidin in Kiwifruit. Plant Physiology, 2012, 158, 376-388.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
キウイフルーツはビタミンＣ等の栄養素が豊富に含まれており、食品としての有用性が高い。しかしながら、食物アレルギーの問題があるため、アレルゲン性を低減した品種の開発が望まれる。
【０００８】
一方、遺伝子の発現制御技術は、遺伝子の機能解析やトランスジェニック動植物の研究等、生命科学分野において重要である。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、遺伝子発現制御及び食用植物のアレルゲン性評価に有用なポリヌクレオチド、並びにその使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の態様を含む。
〔１〕下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなり、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなり、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
〔２〕〔１〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔３〕〔１〕に記載のポリヌクレオチドを、標的遺伝子の上流領域に含む細胞。
〔４〕標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、〔１〕に記載のポリヌクレオチドを、前記標的遺伝子の上流領域に導入する工程を含む、方法。
〔５〕マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）植物の細胞において、アレルゲン遺伝子の上流領域における、請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する工程を含む、マタタビ科植物のアレルゲン性の評価方法。
〔６〕前記アレルゲン遺伝子がＡｃｔ１ａ遺伝子である、〔５〕に記載のアレルゲン性の評価方法。
〔７〕前記マタタビ科植物が、アクチニジア属（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）に属する植物である、〔５〕又は〔６〕に記載のアレルゲン性の評価方法。
〔８〕下記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも一方を含む、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）植物のアレルゲン性評価用キット。
（ｉ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部とアレルゲン遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部とを増幅可能なプライマーセット
（ｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブ
〔９〕前記アレルゲン遺伝子がＡｃｔ１ａ遺伝子である、〔８〕に記載のアレルゲン性評価用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、遺伝子発現制御及び食用植物のアレルゲン性評価に有用なポリヌクレオチド、並びにその使用方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】キウイフルーツの各種品種（Ａ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓの８品種、Ａ．ｄｅｌｉｏｓａの４品種、Ａ．ａｒｇｕｔａ及びＡ．ｅｒｉａｎｔｈａ）について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）後に、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った結果（上の写真）、及び抗アクチニジン抗体（Ａｃｔｉｎｉｄｉｎ  Ａｂ）を用いてイムノブロット解析を行った結果（下の写真）を示す。矢印は、２６ｋＤａのアクチニジンを示す。図中、幾つかの品種は省略名で示した。‘Ｓ．Ａｐｐｌｅ’は‘Ｓｅｎｓａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｅ’；‘Ｙ．ｑｕｅｅｎ’は‘Ｙｅｌｌｏｗ  ｑｕｅｅｎ’； ‘Ｓｈｏｎａｎ  Ｙ’は‘Ｓｈｏｎａｎ  ｙｅｌｌｏｗ’；‘Ｋａｔａｕｒａ  Ｙ．’は‘Ｋａｔａｕｒａ  ｙｅｌｌｏｗ’をそれぞれ示す。図２においても同様である。
【図２】キウイフルーツの各種品種について、ＥＬＩＳＡにより、アクチニジン含量を測定した結果を示す。‘Ｈａｙｗａｒｄ’から精製したアクチニジンを検量線の作成に用いた。アッセイは３連で行った。図中の値は、平均±ＳＥを示す（ｎ＝３）。
【図３】図３Ａは、‘Ｈａｙｗａｒｄ’、‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’及び‘Ｋｏｈｉ’のゲノムＤＮＡを用いて、Ａｃｔ１ａ及びＡｃｔ２ａを増幅したＰＣＲの結果を示す。図３Ｂは、‘Ｈａｙｗａｒｄ’、‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’及び‘Ｋｏｈｉ’から抽出したｍＲＮＡを用いて、Ａｃｔ１ａ及びＡｃｔ２ａを増幅したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図３Ｃは、 ‘Ｈａｙｗａｒｄ’、‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’及び‘Ｋｏｈｉ’から抽出したｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを用いて、Ａｃｔ１ａ及びＡｃｔ２ａの発現量を測定した定量ＰＣＲの結果を示す。Ａｃｔ１ａの発現量は、ＵｂｉＣ９の発現量により標準化した。縦軸の相対発現量は、‘Ｈａｙｗａｒｄ’における発現量を１．０としたときの相対値である。実験は３連で行った。図中の値は、平均±ＳＥを示す（ｎ＝３）。
【図４】‘Ｈａｙｗａｒｄ’及び‘Ｋｏｈｉ’のＡｃｔ１ａの上流領域を比較した結果を示す。Ａｃｔ１ａの上流領域（Ｉ）及び（ＩＩ）をゲノミックＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡの品質確認用のコントロールとして、ＵｂｉＣ９及びＥＦ１ａを増幅した。
【図５】‘Ｈａｙｗａｒｄ’及び‘Ｋｏｈｉ’のＡｃｔ１ａの上流領域の配列を比較した結果を示す。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、‘Ｈａｙｗａｒｄ’のＡｃｔ１ａプロモーター領域と、ＴＡＩＬ−ＰＣＲにより得た‘Ｋｏｈｉ’のＡｃｔ１ａ上流領域との、アライメントを行った。‘Ｈａｙｗａｒｄ’及び‘Ｋｏｈｉ’の共通配列は、四角で囲んだ。＋１は、主要な転写開始サイトを示す（Lin et al., 1993. Plant Mol. Biol. 23:489-499.）。アスタリスクは、翻訳開始コドンを示す。
【図６】‘Ｈａｙｗａｒｄ’（上図）及び‘Ｋｏｈｉ’（下図）のＡｃｔ１ａ上流領域におけるシトシンメチル化の分布を示す。メチル化率を決定するために、各位置について１３以上のクローンを解析した。Ｈは、Ａ、Ｔ又はＣを示す。
【図７】‘Ｋｏｈｉ'のＡｃｔ１ａ上流領域の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
[ポリヌクレオチド]
一実施形態において、本発明は、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなり、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなり、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
【００１４】
上記（ａ）〜（ｃ）において、連続した塩基配列の長さは、１００塩基以上であれば特に限定されないが、１５０塩基以上であることが好ましく、２００塩基以上であることがより好ましく、３００塩基以上であることがさらに好ましく、５００塩基以上であることが特に好ましい。
【００１５】
上記（ｂ）において、欠失、置換、付加、又は挿入される塩基の数は、結果として生じるポリヌクレオチドがＡｃｔ１ａ遺伝子のプロモーターの上流領域に存在したとき、Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制するする機能を有する限り、特に限定されないが、例えば１〜１８０個であることができ、１〜１５０個であることが好ましく、１〜１００個であることがより好ましく、１〜６０個であることがさらに好ましく、１〜３０個であることが特に好ましい。また、１〜２０個、１〜１０個、又は１〜５個であってもよい。
「ポリヌクレオチドがＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する」とは、Ａｃｔ１ａ遺伝子を有する細胞（例えば、図１においてアクチニジンの発現が確認された品種の細胞）のＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域（例えば、−８００ｂ〜−２０００ｂ付近）に該ポリヌクレオチドを導入したときに、該ポリヌクレオチドを導入しなかった場合と比較して、Ａｃｔ１ａ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が低下することを意味する。例えば、非導入の場合のｍＲＮＡ量に対して、該ポリヌクレオチドを導入した細胞のＡｃｔ１ａ遺伝子のｍＲＮＡ発現量が１０％以上低下している場合に、該ポリヌクレオチドはＡｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制すると評価することができる。前記ｍＲＮＡ発現量は、２０％以上低下していることが好ましく、５０％以上低下していることがより好ましく、７０％以上低下していることがさらに好ましい。Ａｃｔ１ａ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の測定は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等の公知技術により行うことができる。該ポリヌクレオチドの導入は、公知の遺伝子導入技術を用いて行うことができる。遺伝子導入技術としては、例えば、遺伝子編集、相同組換等が例示される。
【００１６】
上記（ｃ）において、配列同一性は、８０％以上である限り、特に限定されないが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【００１７】
上記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液を挙げることができる。
【００１８】
配列番号２に記載の塩基配列は、Ａ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐｌａｎｃｈ．）‘Ｋｏｈｉ’（紅妃）において、Ａｃｔ１ａ遺伝子の上流領域（−８７４ｂ〜−３６８７ｂ）に位置する塩基配列である。後述する実施例で示すように、‘Ｋｏｈｉ’は、Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現量が極めて低く、成熟果実のアクチニジン含有量が極めて低い品種である。また、配列番号２に記載の塩基配列は、潜在的メチル化サイトを多く含み、バイサルファイトシークエンスの解析結果から、それらの潜在的メチル化サイトが高い頻度でメチル化されていることが確認された。
【００１９】
配列番号２に記載の塩基配列は、アクチニジン含有量が高いＡ．ｄｅｌｉｃｉｏｓａ‘Ｈａｙｗａｒｄ’では構造が異なり、Ａｃｔ１ａ遺伝子の５’隣接領域（０〜−８７３ｂ）の配列は、‘Ｋｏｈｉ’と‘Ｈａｙｗａｒｄ’でほぼ共通である。そのため、‘Ｋｏｈｉ’におけるＡｃｔ１ａ遺伝子の発現抑制は、配列番号２に記載の塩基配列が、Ａｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在していることに起因する。
すなわち、配列番号２に記載の塩基配列がＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在することにより、プロモーターへの転写因子の結合が阻害され、Ａｃｔ１ａ遺伝子の転写が抑制されると考えられる。
【００２０】
本実施形態のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の塩基配列又はその変異配列からなるポリヌクレオチドであってもよく、前記ポリヌクレオチドの１００塩基以上の断片を含むものであってもよい。具体的には、配列番号３、４又は５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド又はその１００塩基以上の断片等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも、配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド又はその１００塩基以上の断片が好ましい。例えば、本実施形態のポリヌクレオチドの好ましい態様として、下記（ａ’）〜（ｄ’）のポリヌクレオチドが例示される。
（ａ’）配列番号５に記載の塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド
（ｂ’）配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、付加、又は挿入された塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなり、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
（ｃ’）配列番号５に記載の塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列からなり、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
（ｄ’）配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つＡｃｔ１ａ遺伝子の上流領域に存在したとき、前記Ａｃｔ１ａ遺伝子の発現を抑制する、ポリヌクレオチド
上記（ａ’）〜（ｄ’）における具体的な数値の例示については、上記（ａ）〜（ｄ）と同様である。  
【００２１】
本実施形態のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の塩基配列の中でも、潜在的メチル化サイトの出現頻度が高い領域を含むことが好ましい。「潜在的メチル化サイト」とは、メチル化されることが知られている配列を意味する。具体的には、潜在的メチル化サイトの配列としては、ＣＧ、ＣＨＧ、ＣＨＨ（Ｈは、Ａ、Ｔ又はＣ）が例示される。これらの中でも、本実施形態のポリヌクレオチドは、潜在的メチル化サイトとしてＣＧを多く含むことが好ましい。配列番号２に記載の塩基配列において、ＣＧを多く含む領域としては、配列番号２に記載の塩基配列の１１７０〜１５４０位の塩基配列、２３８０〜２８１４位の塩基配列等が挙げられる。したがって、配列番号２に記載の塩基配列の１１７０〜１５４０位の塩基配列、又は２３８０〜２８１４位の塩基配列から選択される連続した１００塩基以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、本実施形態のポリヌクレオチドの好適な例である。前記好適な例において、連続した１００塩基以上の塩基配列は、２００塩基以上が好ましく、３００塩基以上がより好ましく、３５０塩基以上がさらに好ましい。
【００２２】
本実施形態のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の塩基配列から選択される塩基配列に限定されず、配列番号２に記載の塩基配列において変異を有する塩基配列から選択される塩基配列を含んでいてもよい。変異の位置は、特に限定されないが、潜在的メチル化サイト以外の領域であることが好ましい。
【００２３】
本実施形態のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の塩基配列に基づいて、公知の核酸合成法等を用いて合成することにより、取得することができる。あるいは、Ａ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ‘Ｋｏｈｉ’のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２に記載の塩基配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲ法や等温増幅法等の公知の核酸増幅法によりポリヌクレオチド断片を増幅することにより、取得することができる。
【００２４】
本実施形態のポリヌクレオチドは、標的遺伝子の上流領域（例えば、プロモーターの転写因子結合サイトの５’隣接領域）に存在することにより、該標的遺伝子の発現が抑制されるため、後述する標的遺伝子の発現制御方法等に用いることができる。
【００２５】
［ベクター］
一実施形態において、本発明は、上記実施形態のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２６】
本実施形態のベクターは、上記実施形態のポリヌクレオチド（以下、「本ポリヌクレオチド」という。）を含む。本実施形態のベクターは、特に限定されず、市販のプラスミドベクター、ウイルスベクター等であってもよい。
本実施形態のベクターは、本ポリヌクレオチドに加えて、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等を含んでいてもよい。上記のマーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子をいう。マーカー遺伝子の具体例としては、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。上記の薬剤耐性遺伝子の具体例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。上記の蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子などが挙げられる。上記の発光酵素遺伝子の具体例としては、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。上記の発色酵素遺伝子の具体例としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が挙げられる。
【００２７】
本実施形態のベクターは、後述する標的遺伝子の発現制御方法等に用いることができる。
【００２８】
［細胞］
一実施形態において、本発明は、本ポリヌクレオチドを、標的遺伝子の上流領域に含む細胞を提供する。
【００２９】
本実施形態の細胞は、標的遺伝子の上流領域に、本ポリヌクレオチドを含む。本明細書において、「標的遺伝子」とは、本ポリヌクレオチドによる発現抑制の対象となる遺伝子を意味する。標的遺伝子は、特に限定されず、任意の遺伝子であってよい。具体例としては、アレルゲン性タンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、そのような遺伝子としては、例えば、アクチニジンをコードする遺伝子（Ａｃｔ１ａ、Ａｃｔ２ａなど）等が例示される。
【００３０】
本実施形態の細胞は、特に限定されないが、真核生物の細胞が好ましい。真核生物の細胞としては、動物細胞であってもよく、植物細胞であってもよいが、植物細胞であることが好ましい。植物細胞としては、陸上植物の細胞が好ましく、種子植物の細胞がより好ましく、被子植物の細胞がさらに好ましい。被子植物の細胞の中でも、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）の植物の細胞が好ましく、アクチニジア属（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）に属する植物の細胞がより好ましい。アクチニジア属に属する植物としては、アクチニジア・チネンシス（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｃｈｉｎｅｓｉｓ）、アクチニジア・デリシオサ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）、アクチニジア・アルグタ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ａｒｇｕｔａ）、アクチニジア・エリアンサ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｅｒｉａｎｔｈａ）等が挙げられる。
【００３１】
本明細書において、「標的遺伝子の上流領域」とは、標的遺伝子のコード配列の５’側に隣接する領域を意味する。５’側に隣接する領域としては、例えば、０ｂ〜−１００００ｂが例示される。なお、本明細書においては、標的遺伝子の転写開始点を＋１ｂとし、前記転写開始点の５’側に隣接するヌクレオチド残基を０ｂとして、標的遺伝子に対するヌクレオチド残基の位置を示すものとする。また、対象の配列に対して、５’側を上流、３’側を下流と表現する。本ポリヌクレオチドが存在する領域は、−５００ｂ〜−１００００ｂの範囲であってもよく、−７００ｂ〜−７０００ｂの範囲であってもよく、−８００ｂ〜−５０００ｂの範囲であってもよく、−８００ｂ〜−４０００ｂの範囲であってもよい。
【００３２】
あるいは、標的遺伝子の上流領域において、本ポリヌクレオチドが存在する位置としては、転写因子結合領域の５’側に隣接する領域も例示される。例えば、当該転写因子結合領域を起点として、その上流１ｂ〜１００００ｂの範囲に、本ポリヌクレオチドが存在してもよい。当該範囲は、１ｂ〜８００００ｂの範囲であってもよく、１ｂ〜５０００ｂの範囲であってもよく、１ｂ〜４０００ｂの範囲であってもよい。
【００３３】
例えば、標的遺伝子がＡｃｔ１ａ遺伝子である場合、本ポリヌクレオチドは、Ａｃｔ１ａ遺伝子の上流領域−６００ｂ〜−１００００ｂの範囲に存在することが好ましい。前記範囲は、−８００ｂ〜−７０００ｂの範囲であることが好ましく、−８００ｂ〜５０００ｂの範囲であることがより好ましく、−８００ｂ〜−４０００ｂの範囲であることがさらに好ましい。好ましくは、本ポリヌクレオチドの３’末端配列が、−６００ｂ〜−１０００ｂの範囲に存在し、−８００ｂ〜−１０００ｂの範囲に存在することがより好ましく、−８００ｂ〜−９５０ｂの範囲に存在することがさらに好ましい。
【００３４】
本実施形態の細胞においては、標的遺伝子の上流領域に本ポリヌクレオチドを含む。本ポリヌクレオチドは、潜在的メチル化サイトを多く含み、本ポリヌクレオチドがゲノム中に存在すると、前記潜在的メチル化サイトが高頻度にメチル化される。これにより、標的遺伝子のプロモーターの機能が阻害され、標的遺伝子の発現が抑制される。したがって、本実施形態の細胞は、本ポリヌクレオチドを含まない同種の細胞と比較して、標的遺伝子の発現が抑制されている点に特徴を有する。
【００３５】
本実施形態の細胞は、本ポリヌクレオチドを、ホモで含んでいることが好ましい。本ポリヌクレオチドを、標的遺伝子の上流領域にホモで含むことにより、標的遺伝子の発現がより抑制される。
【００３６】
本実施形態の細胞において、標的遺伝子の上流領域に存在する本ポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ導入技術により、外来から導入されたものであることが好ましい。本ポリヌクレオチドが外来のものであるか否かは、標的遺伝子上流領域の配列解析を行い、野生株の配列と比較することにより確認することができる。あるいは、ＰＣＲ法又はサザンハイブリダイゼーション法等により確認してもよい。
【００３７】
本実施形態の細胞は、本ポリヌクレオチドを、公知のＤＮＡ導入技術を用いて、目的の細胞に導入することにより作製することができる。例えば、相同組換法や遺伝子編集技術を用いることにより、標的遺伝子の上流領域の所望の位置に、本ポリヌクレオチドを導入することが可能である。ＤＮＡの細胞への導入方法も公知の方法を用いることができ、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等が挙げられる。
【００３８】
本実施形態の細胞が、植物細胞である場合、植物体のいずれの部位の細胞であってもよく、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の細胞が挙げられる。また、植物体ではなく、培養細胞等であってもよい。例えば、本実施形態の細胞からカルスを形成させ、それを再分化させて不定胚や不定芽等を得て、植物体に生長させてもよい。このようにして得られた植物体は、野生株と比較して、標的遺伝子の発現が抑制されている。したがって、本実施形態の細胞から、所望の標的遺伝子の発現が抑制された植物体を得ることができる。よって、本発明は、本ポリヌクレオチドが、標的遺伝子の上流領域に導入された植物体もまた提供する。例えば、標的遺伝子をＡｃｔ１ａ遺伝子とし、Ａｃｔ１ａ遺伝子の上流領域（例えば、−６００ｂ〜−１００００ｂの範囲）に、本ポリヌクレオチドが導入されたアクチニジア属の細胞は、本実施形態の細胞の好適な例である。前記細胞から形成された植物体からは、野生株と比較して、アクチニジン含有量が低減された果実を得ることができる。
【００３９】
［標的遺伝子の発現制御方法］
一実施形態において、本発明は、標的遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。本実施形態の方法は、本ポリヌクレオチドを、標的遺伝子の上流領域に導入する工程を含む。
【００４０】
本実施形態の方法は、上記［細胞］において、上記実施形態の細胞の作製方法として挙げた方法と同様に行うことができる。標的遺伝子は、特に限定されず、上記［細胞］で例示したものと同様のものが例示される。また、標的遺伝子の上流領域についても、上記［細胞］で例示した領域と同様の領域が挙げられる。さらに、本実施形態の方法において、本ポリヌクレオチドを導入する対象である細胞についても、上記［細胞］で例示した細胞と同様の細胞が例示される。本ポリヌクレオチドを、標的遺伝子の上流領域に導入する方法は、公知のＤＮＡ導入技術を用いればよく、上記［細胞］で例示した方法と同様のものが挙げられる。本ポリヌクレオチドが、標的遺伝子の上流領域に導入されたことを確認する方法についても、上記［細胞］で例示した方法と同様のものが挙げられる。
【００４１】
本実施形態の方法によれば、本ポリヌクレオチドを、標的遺伝子の上流領域に導入することにより、当該標的遺伝子の発現を抑制することができる。したがって、所望の表現型を有する細胞を得ることができ、当該細胞から植物体又は動物体を発生させることにより、所望の表現型を有する植物又は動物を得ることができる。そのため、本実施形態の方法は、動植物の育種に利用可能である。
【００４２】
［アレルゲン性評価方法］
一実施形態において、本発明は、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）植物のアレルゲン性の評価方法を提供する。本実施形態の方法は、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）植物の細胞において、アレルゲン遺伝子の上流領域における、本ポリヌクレオチドを検出する工程を含む。
【００４３】
本明細書において、「アレルゲン性」とは、摂食により、アレルギー応答を引き起こす食品の性質をいう。したがって、マタタビ科植物のアレルゲン性は、可食部である果実を摂食したときのアレルギー応答の程度を意味する。「アレルゲン」とは、アレルギー反応を引き起こす原因物質をいう。「アレルゲン遺伝子」とは、アレルゲンとなり得るタンパク質をコードする遺伝子をいう。
マタタビ科植物が有するアレルゲンは、特に限定されないが、アクチニジンが例示される。また、アレルゲン遺伝子としては、アクチニジンをコードする遺伝子が（Ａｃｔ１ａ、Ａｃｔ２ａなど）が挙げられる。好ましくは、アレルゲン遺伝子はＡｃｔ１ａ遺伝子である。
【００４４】
本実施形態の方法により評価されるマタタビ科植物は、特に限定されないが、アレルゲン遺伝子を有することが好ましい。そのようなマタタビ科植物としては、アクチニジア属に属する植物が挙げられる。アクチニジア属に属する植物としては、上記[細胞]で例示したものと同様のものが例示される。
本実施形態の方法で用いる細胞は、植物体のいずれの部位の細胞であってもよい。例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の細胞を用いることができる。
【００４５】
アレルゲン遺伝子の上流領域における、本ポリヌクレオチドの有無を調べる方法は、公知の方法を特に制限なく用いることができる。例えば、ＰＣＲ法、サザンブロット法、シークエンス法等が例示される。
【００４６】
本実施形態の方法をＰＣＲ法により行う場合、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部を増幅可能なプライマーセットを用いることが好ましい。より好ましくは、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部と、アレルゲン遺伝子のプロモーター領域（０ｂ〜−９００ｂの範囲等）の少なくとも一部と、を含む領域を増幅可能なプライマーセットを用いる。例えば、アレルゲン遺伝子がＡｃｔ１ａ遺伝子である場合、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部と、配列番号６又は７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部と、を含む領域を増幅可能なプライマーセットを好適に用いることができる。そのようなプライマーセットとしては、後述する［アレルゲン性評価用キット］に例示するプライマーセット等が挙げられる。なお、配列番号６に記載の塩基配列は、‘Ｋｏｈｉ’のＡｃｔ１ａ遺伝子の翻訳開始点から−８７３ｂの領域の塩基配列である。配列番号７に記載の塩基配列は、‘Ｈａｙｗａｒｄ’のＡｃｔ１ａ遺伝子の翻訳開始点から−８６７の領域の塩基配列である。配列番号６及び７の配列は、‘Ｋｏｈｉ’及び‘Ｈａｙｗａｒｄ’で高度に保存されており（図５参照）、他のマタタビ科植物においても保存されていると考えられる。
【００４７】
例えば、マタタビ科植物の細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、上記のようなプライマーセットを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの条件は、プライマー配列に応じて、適宜決定すればよい。ＰＣＲ反応終了後、アガロースゲル電気泳動等により増幅断片の確認を行う。増幅断片の有無、増幅断片のサイズ等により、アレルゲン遺伝子の上流領域における本ポリヌクレオチドの有無を判定することができる。また、本ポリヌクレオチドが、ホモで存在するか、ヘテロで存在するかを調べるためには、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲを行ってもよい。あるいは、アレルゲン遺伝子がＡｃｔ１ａ遺伝子である場合、本ポリヌクレオチドが、ホモかヘテロでかを調べるために、配列番号１に記載の塩基配列の１〜３０１位、１０２９〜１０７７位、又は１３８１〜１４５８位の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部と、配列番号５又は６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部とを含む領域を増幅可能なプライマーセットを用いてもよい。配列番号１に記載の塩基配列は、‘Ｋｏｈｉ'のＡｃｔ１ａ遺伝子の翻訳開始点（＋６０ｂ）から−３９８９ｂの塩基配列であり、前記例示した領域は、アクチニジア属に属する植物において高度に保存されている。そのため、これらのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、サイズの異なる断片が複数増幅された場合には、当該植物は、本ポリヌクレオチドをヘテロで有すると判定することができる。一方、同じサイズの断片が１つのみ増幅された場合には、増幅断片のサイズによって、本ポリヌクレオチドをホモで有する（例えば、１０００ｂ以上の断片が増幅された場合）、又はホモで有しない（例えば、１０００ｂ未満の断片が増幅された場合）と判定することができる。
【００４８】
本実施形態の方法をサザンブロット法により行う場合、配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列からなるポリヌクレオチド若しくはその断片に特異的にハイブリダイズするプローブを用いることができる。「特異的にハイブリダイズする」とは、対象のポリヌクレオチドにハイブリダイズするが、他のポリヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを意味する。例えば、プローブが、上記［ポリヌクレオチド］で例示したストリンジェントな条件で対象のポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該対象ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするとしてもよい。そのようなプローブとしては、後述する［アレルゲン性評価用キット］に例示するプローブ等が挙げられる。プローブは、放射放射性同位体、発色酵素、蛍光色素等で標識されていてもよい。
【００４９】
例えば、マタタビ科植物の細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部と、アレルゲン遺伝子のプロモーター領域（０ｂ〜−９００ｂの範囲等）の少なくとも一部と、を含む断片が生じるように、適切な制限酵素等により切断する。次いで、アガロースゲル電気泳動等を行った後、ニトロセルロース膜やナイロン膜等のメンブレンに転写する。次いで、上記のようなプローブを用いて、メンブレン上でハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼーション反応後、ハイブリダイゼーションしたプローブの標識を検出し、検出バンドの有無、検出バンドのサイズ等により、アレルゲン遺伝子の上流領域における本ポリヌクレオチドの有無を判定することができる。
【００５０】
プローブとしては、配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列からなるポリヌクレオチド若しくはその断片に特異的にハイブリダイズするプローブ（以下、「プローブ１」という場合がある。）に加えて、アレルゲン遺伝子のプロモーター領域（０ｂ〜−９００ｂの範囲等）に特異的にハイブリダイズするプローブ（以下、「プローブ２」という場合がある。）を用いてもよい。例えば、プローブ１及びプローブ２にそれぞれ異なる標識を用い、ハイブリダイゼーション反応後に、それらの標識が同一バンド上で検出された場合には、アレルゲン遺伝子の上流領域に、本ポリヌクレオチドが存在すると判定することができる。また、両標識の検出量および検出位置により、本ポリヌクレオチドがホモで存在するか、ヘテロで存在するかを確認することができる。上記プローブ２は、制限酵素等で消化した際に、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部と同一断片上に存在すると想定される限り、アレルゲン遺伝子の５’非翻訳領域（５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ：５’ＵＴＲ）又はコード領域に特異的にハイブリダイズするプローブであってもよい。
【００５１】
上記のように、アレルゲン遺伝子の上流領域における本ポリヌクレオチドを検出し、アレルゲン遺伝子の上流領域に本ポリヌクレオチドが存在すると判定された場合には、当該マタタビ科植物は、低アレルゲン性であると評価することができる。さらに、本ポリヌクレオチドが、アレルゲン遺伝子の上流領域にホモで存在すると判定された場合、より低アレルゲン性であると評価することができる。
【００５２】
本実施形態の方法によれば、果実の成熟を待つことなく、植物体のいずれの生長段階でもアレルゲン性の評価を行うことができる。そのため、低アレルゲン性の植物体の選抜や低アレルゲン性品種の育種等に利用することができる。
【００５３】
［アレルゲン性評価用キット］
一実施形態において、本発明は、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）植物のアレルゲン性評価キットを提供する。本実施形態のキットは、下記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも一方を含む。
（ｉ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部とアレルゲン遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーセット
（ｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブ
【００５４】
（（ｉ）プライマーセット）
プライマーセットは、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部と、アレルゲン遺伝子のプロモーター領域の少なくとも一部と、を含む領域を増幅可能なプライマーセットであることが好ましい。プロモーター領域は、アレルゲン遺伝子の種類により異なるが、例えば、０ｂ〜−９００ｂの範囲等が挙げられる。例えば、アレルゲン遺伝子がＡｃｔ１ａ遺伝子である場合、０ｂ〜−８５０ｂ程度までの領域がプロモーターとして例示される。
【００５５】
より具体的には、プライマーセットは、例えば、フォワードプライマーとして、配列番号２に記載の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドに特異的にアニーリング（ハイブリダイズ）するプライマーを含んでいてもよい。そのようなフォワードプライマーとしては、配列番号２に記載の塩基配列の一部を含むプライマーが挙げられる。また、フォワードプライマーは、配列番号１に記載の塩基配列の１〜３１１５位の配列の一部を含むプライマーであってもよい。例えば、配列番号１に記載の塩基配列の１〜３０１位、１０２９〜１０７７位、又は１３８１〜１４５８位の塩基配列の一部を含むプライマーが好ましく例示される。前記配列の一部を含むプライマーは、本ポリヌクレオチドが、ホモであるかヘテロであるかの判定にも利用可能である。
また、リバースプライマーとして、アレルゲン遺伝子のプロモーター領域（０ｂ〜−９００ｂの範囲等）、５’ＵＴＲ、又はコード領域のセンス鎖に特異的にアニーリング（ハイブリダイズ）するプライマーを含んでいてもよい。そのようなリバースプライマーとしては、アレルゲン遺伝子のプロモーター領域（０ｂ〜−９００ｂの範囲等）、５’ＵＴＲ、又はコード領域のアンチセンス鎖の塩基配列の一部を含むプライマーが挙げられる。アレルゲン遺伝子がＡｃｔ１ａ遺伝子である場合、リバースプライマーとしては、例えば、配列番号６又は７に記載の塩基配列の相補配列の一部を含むプライマーが挙げられる。プライマーの設計は、他の領域の塩基配列やＴｍ値等に応じて、適宜行えばよい。
【００５６】
プライマーの長さは、増幅反応を妨げない限り特に限定されないが、例えば、１０〜５０塩基程度が例示され、１５〜４０塩基程度が好ましく、１８〜３０塩基程度がより好ましい。
【００５７】
（（ｉｉ）プローブ）
プローブは、配列番号２に記載の塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部を含むことが好ましい。プローブの長さは、ハイブリダイゼーション反応を妨げない限り特に限定されないが、例えば、５０〜５００塩基程度、５０〜３００塩基程度、５０〜２００塩基程度、５０〜１００塩基程度等が挙げられる。プローブの塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列に特異的な領域から選択することが好ましい。
【００５８】
また、プローブは、標識化されたものであってもよい。標識化のための標識物質は、特に限定されず、公知のものを用いればよい。標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼなどの酵素標識；カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト（ＨＥＸ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７などの蛍光標識；ヨウ素１２５などの放射性同位体標識；ルテニウム錯体などの電気化学発光標識；ビオチン；金属ナノ粒子等が挙げられる。プローブの標識化は、標識物質の種類に応じて、適宜、公知の方法を選択して行うことができる。なお、標識物質としてビオチンを用いる場合には、本実施形態のキットは、さらに、標識化されたアビジンを含んでいてもよい。アビジンの標識物質としては、上記例示した標識物質のうちビオチン以外の標識物質が例示される。
【００５９】
プローブは、２本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、１本鎖ポリヌクレオチドであってもよい。また、プローブは、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物であってもよい。また、プローブは、ＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）等の人工核酸を含むものであってもよい。
【００６０】
（他の要素）
本実施形態のキットは、上記プライマーセット及びプローブ以外の他の要素を含んでいてもよい。他の要素は、特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ法又はサザンブロット法に用いる試薬類等が挙げられる。
【００６１】
ＰＣＲ法に用いる試薬類としては、ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、ｄＮＴＰ等が例示される。
サザンブロット法に用いる試薬類としては、バッファー類（ブロッキングバッファー、洗浄バッファー、ハイブリダイゼーションバッファー等）、プローブ標識の検出試薬、上記［アレルゲン性評価方法］で記載したプローブ２に該当するプローブ等が例示される。
【００６２】
本実施形態のキットは、マタタビ科植物の植物のアレルゲン性を評価するために用いることができる。本実施形態のキットは、ＰＣＲ法やサザンブロット法で用いられる一般的な方法と同様に使用することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
［材料と方法］
（植物材料）
アクチニジア・チネンシス（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（Ｐｌａｎｃｈ．）‘Ｋｏｈｉ’は、日本国徳島県のくゆな農園から入手した。Ａ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’は、地域市場で購入した。アクチニジア・デリシオサ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）（Ａ．Ｃｈｅｖ．）Ｃ．Ｆ．Ｌｉａｎｇ  ＆  Ａ．Ｒ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ栽培品種（‘Ｈａｙｗａｒｄ’、‘Ａｂｂｏｔｔ’、‘Ｍｏｎｔｙ’及び‘Ｂｒｕｎｏ’）、並びに他のアクチニジア・チネンシス栽培品種（‘Ｓｅｎｓａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｅ’、‘Ｇｏｌｄｅｎ  ｋｉｎｇ’、‘Ｙｅｌｌｏｗ  ｑｕｅｅｎ’、‘Ｓｈｏｎａｎ  ｙｅｌｌｏｗ’、‘Ｋａｔａｕｒａ  ｙｅｌｌｏｗ’及び‘Ｋｏｓｈｉｎ’）は、日本国神奈川県根府川の野外で栽培した。アクチニジア・アルグタ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ａｒｇｕｔａ）及びアクチニジア・エリアンサ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｅｒｉａｎｔｈａ）は、日本大学（日本国神奈川県藤沢市）の野外で栽培した。キウイフルーツは、食べ頃に熟すまで室温で保存した。熟したキウイフルーツは、皮をむいて切り、液体窒素で凍結して、使用するまで−８０℃で保存した。以下の各実験単位では、少なくとも３つの果実を使用した。
【００６５】
（抗体の調製）
アクチニジン抗体を作製するために、Pastorello et al（Pastorello et al.,1998. J. Allergy Clin. Immunol. 101: 531-537.）に記載の方法に若干変更を加えた方法で、‘Ｈａｙｗａｒｄ’の果実からアクチニジンを精製した。アクチニジンをＡＫＴＡ（登録商標）１０Ｓ（GE Healthcare life sciences）を用いたアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。果実の粗抽出物を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉ−Ｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（１６ｍｍ×２６ｍｍ、GE Healthcare life sciences）にロードした。タンパク質をＮａＣｌ濃度直線勾配（０〜０．５Ｍ）で溶出し、分画した。高プロテアーゼン活性を有する画分を集め、２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）で平衡化したＳＯＵＲＣＥ  １５Ｑ（４．６ｍｍ×１００ｍｍ、GE Healthcare life sciences）にロードし、ＮａＣｌ濃度直線勾配（０〜０．５Ｍ）で溶出した。プロテアーゼアッセイを行い、高活性を示す画分をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、アクチニジンの単一バンドを確認した。凍結乾燥したアクチニジン（５．６ｇ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈに送付し、抗アクチニジン  ウサギ抗体の作製を依頼した。
【００６６】
（イムノブロット解析）
皮を除去した果実組織を、２倍量のホモジナイズバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム［ｐＨ７．０］、２％［ｗ／ｖ］ポリビニルピロリドン［ＰＶＰ］、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｋｔａｉｌ［Roche Diagnostics］）中で、ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ１０−３５ＧＴ（Central Scientific Commerce）を用いて４℃でホモジナイズした。次いで、８，５００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。上清をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Millipore）で濾過し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ１０カラム（GE Healthcare life sciences）に通した。サンプルを当量のＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、２．５％［ｗ／ｖ］ＳＤＳ、２５％［ｖ／ｖ］グリセロール、２．５％［ｖ／ｖ］β−メルカプトエタノール、０．００２％［ｗ／ｖ］ブロモフェノールブルー）と混合し、９５℃で１分間加熱した。前記混合物２０μＬを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％アクリルアミドゲル）を行った。電気泳動後、タンパク質をＣｌｅａｒＴｒａｎｓ（登録商標）  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｗａｋｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に転写した。イムノブロット解析を、以前記載したように行った（Kamiyoshihara, et al., Plant Physiol.160: 488-497.）。抗血清を１／２０００倍希釈で用いた。全てのタンパク質を可視化するために、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Thermo Fisher Scientific）で染色した。
【００６７】
（Enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）
ＰＤ１０カラム後のサンプルを、コーティングバッファー（５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３［ｐＨ９．５］）で２５倍希釈した。アリコート（５０μＬ）を、９６Ｆ  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）  ＢｌａｃｋＭｉｃｒｏｗｅｌｌ  ＳＨ（Nunc）の各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（GIBCO）（ＰＢＳＴ）で洗浄後、ウェルを１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳでブロックした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴで希釈（１／４００）した抗アクチニジン抗体を各ウェルに添加し、上記のようにインキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、抗原−抗体結合を、製造者の説明書に従い、ＳｕｒｅＢｌｕｅ（Funakoshi）を用いて検出した。反応を１Ｎ  ＨＣｌを添加することにより停止し、４５０ｎＭの吸光度をＳｙｎｅｒｇｙ２（Biotek）を用いてモニターした。実験は３連で行った。‘Ｈａｙｗａｒｄ’から精製したアクチニジンを検量線の作製に使用した。
【００６８】
（ゲノムＤＮＡの抽出）
ＤＮＡ抽出は、以前記載された方法（Xu et al., Plant. 2004. Plant. Mol. Biol. Rep. 22:301a-301g.）に若干変更を加えて行った。液体窒素中ですりつぶした１．０ｇの果実組織を、５ｍＬの洗浄バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３５Ｍグルコース、２％［ｗ／ｖ］ＰＶＰ、４％［ｖ／ｖ］２-メルカプトエタノール）と混合し、氷上で３０分間インキュベートした。６，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。沈殿を、５ｍＬの抽出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、３％［ｗ／ｖ］セチルトリメチルアンモニウムブロミド、４％［ｖ／ｖ］２−メルカプトエタノール）に再懸濁し、数回攪拌しながら６５℃で３０分間インキュベートした。６，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離後、上清を０．１倍量の５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．８）及び等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）と混合した。短く遠心分離した後の上清を、０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム及び等量のイソプロパノールと混合し、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを７０％エタノールで３回洗浄し、２００μＬの滅菌水で再構成した。ＤＮＡサンプルを、１μｇのＲＮａｓｅの存在下、３７℃で３時間インキュベートし、混入ＲＮＡを分解した。
【００６９】
（全ＲＮＡ抽出）
ＲＮＡ抽出を、以前記載された方法（Wan and Wilkins, 1994. Anal. Biochem. 223: 7-12.）に若干の変更を加えて行った。液体窒素中ですりつぶした果実組織（１ｇ）を、１０ｍｇ／ｍＬ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを含む５ｍＬの予熱した抽出バッファー（０．２Ｍホウ酸ナトリウム［ｐＨ９．０］、３０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％  ＳＤＳ、２％  ＰＶＰ、１％  ４−ノニルフェニルポリエチレングリコール、１０ｍＭジチオスレイトール）中で、４２℃で９０分間インキュベートした。３Ｍ  ＫＣｌ（終濃度０．１６Ｍ）を添加した後、氷上で１時間インキュベートした。サンプルを７，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収して、１／３量の１０ＭＬｉＣｌと混合し、−２０℃で一晩インキュベートした。１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して得られたペレットを、５００μＬの２Ｍ  ＬｉＣｌに再懸濁した。２Ｍ  ＬｉＣｌでの洗浄を３回繰り返し、ペレットを４００μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。ＤＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ（Invitrogen）で消化した。
【００７０】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
ｃＤＮＡ合成をＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Takara）及びＮｏｔ  Ｉ−Ｏｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）１８  ｐｒｉｍｅｒ(5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'［配列番号１０］)を用いて、製造者の説明書に従って行った。ＰＣＲを、２×ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Promega）、０．５μＭプライマー、及びｃＤＮＡからなる２０μＬの混合液で行った。ＰＣＲ条件は、以下のとおりとした：工程１，９５℃で２分；工程２，９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分／１ｋｂ長；工程３，７２℃で５分。工程２は、３０回繰り返した。以下の遺伝子特異的プライマーセットをＤＮＡ断片増幅に用いた。
Ａｃｔ１ａ：センスプライマー，5'-GAAGTCAAGGCCATGTACGAG-3'（配列番号１１）
アンチセンスプライマー，5'-AACCGCTTGTAAATCCCAAGT-3'（配列番号１２）
Ａｃｔ２ａ：センスプライマー，5'-GTCAGCCATCGACATCGAAAACTCAGT-3'（配列番号１３）
アンチセンスプライマー，5'-GAAACGGTTCAAGCCCAAAGA-3'（配列番号１４）
ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行い、ＵＶ照明下でエチジウムブロミドを用いて検出した。
【００７１】
（リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲを、ｃＤＮＡを鋳型とし、０．４μＭプライマーを用いて、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ Ｔａｑ（Takara）を使って行った。反応及び検出は、Ｍｘ３０００Ｐ（Stratagene）を用いて行った。反応条件は以下の通りとした：工程１，９５℃で１０秒；工程２，９５℃で５秒、６０℃で２０秒。工程２は、４０回繰り返した。定常的に発現するＵｂｉＣ９レベルを用いて、Ａｃｔ１ａの発現レベルを標準化した。以下の遺伝子特異的プライマーセットをＤＮＡ断片増幅に用いた。
Ａｃｔ１ａ：センスプライマー，5'-GGCACAGAGGGAGGTATCGA-3'（配列番号１５）
アンチセンスプライマー，5'-CAATTCCACATGTTCCAGCA-3'（配列番号１６）
ＵｂｉＣ９：センスプライマー，5'-CCATTTCCAAGGTGTTGCTT-3'（配列番号１７）
アンチセンスプライア―，5'-TACTTGTTCCGGTCCGTCTT-3'（配列番号１８）
【００７２】
（熱非対称インターレスＰＣＲ：ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）
‘Ｋｏｈｉ’のＡｃｔ１ａの５’−ｆｌａｎｉｎｇ領域を得るために、ＴＡＩＬ−ＰＣＲを、Ｌｉｕら（Liu et al., 1995. Plant J. 8: 457-463.）に記載の方法に従って行った。‘Ｈａｙｗａｒｄ’のプロモーターに対する特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ：ＳＰ）プライマーと、５種の任意のディジェネレート（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ：ＡＤ）プライマーをデザインした。
ＳＰ１：5'-GTTGGAACTGCAGATTCAGCAG-3'（配列番号１９）
ＳＰ２：5'-CTTTAAATCCTTATCCAACCACAAC-3'（配列番号２０）
ＳＰ３：5'-GAATGCAAGTAGCTAACCCTGTGG-3'（配列番号２１）
ＡＤ１：5'-NGTCGASWGANAWGAA-3'（配列番号２２）
ＡＤ２：5'-GTNCGASWCANAWGTT-3'（配列番号２３）
ＡＤ３：5'-WGTGNAGWANCANAGA-3'（配列番号２４）
ＡＤ４：5'-AGWGNAGWANCAWAGG-3'（配列番号２５）
ＡＤ５：5'-NTCGASTWTSGWGTT-3'（配列番号２６）
【００７３】
ＳＰプライマー（０．５μＭ）及び混合ＡＤプライマー（各０．８μＭ）と共に、ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標）  ＭＡＸ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  Ｍｉｘ（Takara）を用いて、ＰＣＲを３ラウンド行い、増幅産物をＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ２０（Takara）にクローニングした。ＰＣＲ条件は、Ｌｉｕら（Liu et al., 1995. Plant J. 8: 457-463.）に記載の方法に従った。
【００７４】
（配列分析）
Ａｃｔ１ａ遺伝子の配列及びプロモーター領域の配列解析をＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（Thermo Fisher Scientific）を用いて、サンガー法により行った。マルチシークエンスアライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて行った。
【００７５】
（バイサルファイトシークエンス）
抽出したゲノムＤＮＡを、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Takara）で処理し、非メチル化シトシンをウラシルに変換した。ＫＯＤ−Ｍｕｌｔｉ  ＆  Ｅｐｉ−（Toyobo）を用いて、ＤＮＡセグメントのプロモーター領域を増幅した。反応条件は以下の通りとした：工程１，９４℃で２分；工程２，９８℃で１０秒、５２℃で３０秒、６８℃で３０秒。工程２は、４０回繰り返した。‘Ｋｏｈｉ’及び‘Ｈａｙｗａｒｄ’の保存配列領域には、以下の同じプライマーセットを用いた。
−８２２ｂ〜−５２０ｂ：
センスプライマー，5'-ATTTGTTTTAYGAAGAAGATAGTTTTGTGATTTG-3'（配列番号２７）
アンチセンスプライマー，5'-CCTAATAAATCTAAACAAAACAACTAAAAAATCC-3'（配列番号２８）
−６０３ｂ〜ー＋６７ｂ：
センスプライマー，5'-YAAAATTGYAYTTGTATTAAGGTTG-3'（配列番号２９）
アンチセンスプライマー，5'-CAAACCCATTTTTRTTCTCTCTCRTTTTTTRAAT-3'（配列番号３０）
【００７６】
‘Ｈａｙｗａｒｄ’の特異領域には、以下のプライマーを用いた。
−１１８８ｂ〜−８０７ｂ：
センスプライマー，5'-TTAAATTTTATGGGGTTATTGAGAAAT-3'（配列番号３１）
アンチセンスプライマー，5'-AAAAACAACAAATCACAAAACTATCTTC-3'（配列番号３２）
【００７７】
‘Ｋｏｈｉ’の特異領域には、以下のプライマーを用いた。
−１４４９ｂ〜−１０８４ｂ：
センスプライマー，5'-GTTGAATATAAYGAGGTGGTGGCAT-3'（配列番号３３）
アンチセンスプライマー，5'-ACCATACTAACCCATTTACTTAATC-3'（配列番号３４）
−１１０８ｂ〜−８５３ｂ：
センスプライマー，5'-GATTAAGTAAATGGGTTAGTATGGTA-3'（配列番号３５）
アンチセンスプライマー，5'-AAATCTAACACACTCCACTATTAAAAATAT-3'（配列番号３６）
【００７８】
Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（Thermo Fisher Scientific）を、増幅産物でライゲーションしたプラスミドｐＺｅｒｏ２．１（Thermo Fisher Scientific）で形質転換した。少なくとも、１３個の独立したクローンを用いて配列解析を行い、各領域のメチル化率を求めた。
【００７９】
［結果］
（アクチニジア属植物の果実におけるアクチニジンレベル）
アクチニジア属の果実におけるアクチニジンレベルを求めるために、‘Ｈａｙｗａｒｄ’の果実から抽出した天然アクチニジンに対して産生されたポリクローナル抗体を用いて、イムノブロット解析を行った。全可溶性タンパク質を、熟した果実組織全体から抽出して解析した。全タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、泳動後のゲルをＣＢＢ染色したところ、Ａ．ｄｅｌｉｃｉｏｓａの４種の栽培品種、Ａ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓの８種の栽培品種のうちの６種及びＡ．ａｒｇｕｔａにおいて、２６ｋＤａの位置に、主要なタンパク質が検出された（図１）。抗アクチニジン抗体を用いたイムノブロット解析により、前記タンパク質は、アクチニジンであると確認された（図１）。
一方、アクチニジンは、Ａ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓの２種（‘Ｋｏｈｉ’、‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’）及びＡ．ｅｒｉａｎｔｈａでは、ほとんど検出されなかった。ＣＢＢ染色ゲルでは、‘Ｋｏｓｈｉｎ’、‘Ｋｏｈｉ’及び‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’において、アクチニジンレベルよりもわずかに低分子のタンパク質が検出されている（図１）。このたんぱく質は、抗アクチニジン抗体反応せず、これらの種では、他の主要タンパク質が存在することを示している。
【００８０】
次に、果実中のアクチニジンを定量するために、ＥＬＩＳＡを行った。Ａ．ｄｅｌｉｃｉｏｓａ及びＡ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓのほとんどの栽培種におけるアクチニジン含量は、約１〜２ｍｇ／ｇ生重量の範囲であり、‘Ｓｅｎｓａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｅ’（１．９５±０．１４ｍｇ／ｇＦＷ）が最大量であった（図２）。イムノブロット解析の結果と同様に、ＥＬＩＳＡの結果においても、‘Ｋｏｈｉ’（０．０６±０．０１ｍｇ／ｇＦＷ）及び‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’（０．０９±０．０１ｍｇ／ｇＦＷ）のアクチニジンレベルがはるかに低いことが確認された（図２）。
【００８１】
（Ａｃｔ１ａ及びＡｃｔ２ａの発現解析）
‘Ｋｏｈｉ’におけるアクチニジンレベルの低さの分子的機序を解明するために、アクチニジンのコード遺伝子Ａｃｔ１ａ及びＡｃｔ２ａの遺伝子発現解析を行った。これらの遺伝子は、‘Ｈａｙｗａｒｄ’及び‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’の熟した果実で検出されることが報告されている（Nieuwenhuizen et al., 2007. Funct. Plant Biol. 34: 946-961.）。ゲノムＤＮＡのＰＣＲの結果により、‘Ｋｏｈｉ’でも、‘Ｈａｙｗａｒｄ’及び‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’と同様に、Ａｃｔ１ａ及びＡｃｔ２ａが存在していることが確認された（図３Ａ）。しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲでは、‘Ｈａｙｗａｒｄ’及び‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’とは異なり、‘Ｋｏｈｉ’においてはＡｃｔ１ａ断片が確認されなかった（図３Ｂ）。一方。Ａｃｔ２ａ断片は、３種の栽培品種全て確認された（図３Ｂ）。
そこで、Ａｃｔ１ａの発現レベルを定量ＰＣＲで確認したところ、‘Ｈｏｒｔ１６Ａ’における発現レベルは、‘Ｈａｙｗａｒｄ’とほぼ同じであったが、‘Ｋｏｈｉ’ではほとんど発現が検出されなかった（図３Ｃ）。そのため、‘Ｈｏｒｔ’１６Ａと‘Ｋｏｈｉ’とでは、異なる要因により低アクチニジンの表現型となっていると考えられた。
【００８２】
（Ａｃｔ１ａ上流配列の解析）
ゲノミックＰＣＲの結果は、‘Ｋｏｈｉ’のゲノムにＡｃｔ１ａ遺伝子が存在していることを示している。そこで、Ａｃｔ１ａのゲノム領域の配列解析を行った。‘Ｈａｙｗａｒｄ’の配列に対する複数の変異が、‘Ｋｏｈｉ’のエクソン及びイントロンの両方で見出されたが、‘Ｋｏｈｉ’のゲノムには、完全なＡｃｔ１ａ遺伝子が存在していると考えられた。そこで、Ａｃｔ１ａの上流プロモーター領域の解析を行った。
【００８３】
‘Ｈａｙｗａｒｄ’におけるＡｃｔ１ａプロモーターは、以前に報告されている（Lin et al., 1993. Plant Mol. Biol. 23:489-499.; Snowden and Gardner. 1990. Nucleic Acids Res. 18: 6684-6684.）。そこで、‘Ｈａｙｗａｒｄ’の配列に基づくプライマーを用いて、‘Ｋｏｈｉ’の対応領域が増幅できるか確認した。領域（Ｉ）（‘Ｈａｙｗａｒｄ’配列における＋５ｂ〜−８６７ｂ）は、‘Ｈａｙｗａｒｄ’及び‘Ｋｏｈｉ’の両方のＤＮＡで増幅された（図４）。一方、領域（ＩＩ）（‘Ｈａｙｗａｒｄ’配列における−７２８ｂ〜−１２９４ｂ）は、‘Ｋｏｈｉ’のＤＮＡでは増幅されなかった（図４）。この結果は、領域（ＩＩ）においては ‘Ｋｏｈｉ’の配列が、‘Ｈａｙｗａｒｄ’とは異なることを示している。
【００８４】
そこで、ＴＡＩＬ  ＰＣＲを行い、‘Ｋｏｈｉ’におけるＡｃｔ１ａ上流領域を取得した。特異的プライマー及び任意プライマー（arbitrary primer）の組合せで３ラウンドのＰＣＲを行なったところ、１．５ｋｂ断片が得られた。この断片のシークエンス解析を行ったところ、Ａｃｔ１ａ遺伝子近傍領域（０〜−８７３ｂ）は、‘Ｈａｙｗａｒｄ’とほとんど同じ配列であることが確認された（図５）。一方、さらに上流領域（−８７４ｂ〜−１４４９ｂ）は、‘Ｈａｙｗａｒｄ’とはほとんど類似していなかった（図５）。この領域の配列を用いて、様々なゲノムデータベースを検索したが、類似配列は検出されなかった。しかし、この配列は、元のプロモーター機能を破壊している可能性がある。
【００８５】
（Ａｃｔ１ａ上流領域のメチル化解析）
‘Ｋｏｈｉ’の上記配列は、シトシン残基の数が多いという特徴がある。プロモーター領域においてしばしばシトシンはメチル化されており、メチル化レベルが下流遺伝子発現に影響することが報告されている（Vanyushin and Ashapkin. 2011. BBA Gene Regul. Mech. 1809: 360-368.）。植物において、メチル化は、ＣＧ、ＣＨＧ及びＣＨＨ（Ｈは、Ａ、Ｔ又はＣを示す。）との関連で生じる。一方、動物においては、ＣＧのみがメチル化の標的となる。
そこで、Ａｃｔ１ａ上流領域について、潜在的メチル化サイトの数を調べた。その結果を表１及び表２に示す。表１は、‘Ｈａｙｗａｒｄ’及び‘Ｋｏｈｉ’の両者で配列が保存された領域の結果である。表２は、Ｈａｙｗａｒｄ’及び‘Ｋｏｈｉ’の両者で配列が分岐している（異なっている）領域の結果である。
【００８６】
‘Ｋｏｈｉ’の分岐領域は、‘Ｈａｙｗａｒｄ’に比べて、ＣＧリッチであり（‘Ｋｏｈｉ’は４４サイト、‘Ｈａｙｗａｒｄ’は４サイト）だった。一方、他のサイトは、ほぼ同じ頻度であり、潜在的メチル化サイト全体では、‘Ｋｏｈｉ’における数が、‘Ｈａｙｗａｒｄ’における数の約１．６倍だった。
【００８７】
そこで、‘Ｋｏｈｉ’及び‘Ｈａｙｗａｒｄ’の各領域について、バイサルファイトシークエンス解析を行い、メチル化状態を確認した。その結果を表１、表２、及び図６に示す。
【００８８】
【表１】
2019129749.tif 000002
【００８９】
【表２】
2019129749.tif 000003
【００９０】
保存領域では、数か所を除いて、メチル化はほとんど確認できなかった（‘Ｈａｙｗａｒｄ’：−６６６ｂ、−６６４ｂ、−６３１ｂ及び−６２１ｂでそれぞれ２５％のメチル化；‘Ｋｏｈｉ’：−６６６ｂ及び−６６４ｂでそれぞれ２０％のメチル化）（図６）。一方、分岐領域は、‘Ｈａｙｗａｒｄ’及び‘Ｋｏｈｉ’の両方で、顕著にメチル化されていた。
分岐領域におけるメチル化の割合は、‘Ｈａｙｗａｒｄ’（６５．７％）よりも‘Ｋｏｈｉ’（８０．５１％）の方が高かった。また、分岐領域は、‘Ｋｏｈｉ’では全体的にメチル化されていたが、‘Ｈａｙｗａｒｄ’の−１１００ｂ〜−１０００ｂの領域では、メチル化の割合が制限されていた。さらに、ＣＧサイトは‘Ｋｏｈｉ’において、ＣＨＧサイト及びＣＨＨサイトよりも優先的にメチル化されていた。しかし、ＣＨＨサイトは、‘Ｈａｙｗａｒｄ’では高頻度にメチル化されていた。
【００９１】
以上の結果より、‘Ｋｏｈｉ’のＡｃｔ１ａ上流領域（−１３７７ｂ〜−８７４ｂ）の配列が高頻度にメチル化されることにより、Ａｃｔ１ａのプロモーターの機能が阻害され、Ａｃｔ１ａの転写が抑制されていると示唆された。
【００９２】
（Ａｃｔ１ａ上流領域の構造）
’Ｋｏｈｉ’のＡｃｔ１ａの上流領域のさらなる解析を行い、配列番号１に記載の塩基配列（＋６０ｂ〜―３９８９ｂ）を取得した。’Ｋｏｈｉ’のＡｃｔ１ａ上流領域の構造を図７に示す。図７中の「保存領域」は、‘Ｈａｙｗａｒｄ'のＡｃｔａ１上流領域と比較して、配列が保存されている領域である。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、遺伝子発現制御及び食用植物のアレルゲン性評価に有用なポリヌクレオチド、並びにその使用方法が提供される。本発明に係るポリヌクレオチドは、特に、マタタビ科植物のアレルゲン性の評価に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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