(57)【要約】      （修正有）【課題】植物の強度を維持しつつ、セルロース及びその分解物であるグルコースを抽出し易くするように植物を改変する方法を提供する。【解決手段】木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を生産する方法であって、前記方法は、植物の木質繊維細胞内において、第一のポリペプチドを発現させ、又はその機能を強化させることを含み、前記第一のポリペプチドは、特定の配列のアミノ酸配列を含み、及び／又は、特定の配列のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を生産する方法であって、
前記方法は、植物の木質繊維細胞内において、第一のポリペプチドを発現させ、又はその機能を強化させることを含み、
前記第一のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、及び／又は、配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる、方法。
【請求項２】
前記第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドと連結された融合ポリペプチドとして発現され、
前記第二のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を生産するための核酸であって、
前記核酸は、第一のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列を含み、
前記第一のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、及び／又は、配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる、核酸。
【請求項４】
前記第一のコーディング配列は、配列番号３又は配列番号５の塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドと連結された融合ポリペプチドとして発現され、
前記核酸は、第二のポリペプチドをコードする第二のコーディング配列を更に含み、
前記第二のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる、請求項３又は４に記載の核酸。
【請求項６】
前記第二のコーディング配列は、配列番号７の塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
前記コーディング配列と作動可能に連結され、木質繊維細胞で前記コーディング配列の発現を誘導するプロモータ配列を更に含む、請求項３〜６の何れか一項に記載の核酸。
【請求項８】
前記プロモータ配列が、配列番号１０又は配列番号１１と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項３〜８の何れか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を生産する方法であって、
請求項３〜８の何れか一項に記載の核酸又は請求項９に記載のベクターを、植物の木質繊維細胞内に導入して発現させることを含む、方法。
【請求項１１】
請求項１、２、及び１０の何れか一項に記載の方法により得られる、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物若しくはその子孫、又はその部分。
【請求項１２】
請求項３〜８の何れか一項に記載の核酸又は請求項９に記載のベクターを木質繊維細胞内に含む、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物若しくはその子孫、又はその部分。
【請求項１３】
グルコースを製造する方法であって、請求項１１又は１２に記載の植物若しくはその子孫、又はその部分に含まれる木質繊維細胞の細胞壁からグルコースを抽出することを含む方法。
【請求項１４】
グルコースの抽出が、前記の植物若しくはその子孫、又はその部分の少なくとも一部に酵素糖化処理を施すことにより行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
酵素糖化処理がセルラーゼにより行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
植物の木質繊維細胞の一次細胞壁を増加させ、二次細胞壁中のリグニンを減少させるためのキットであって、請求項３〜８の何れか一項に記載の核酸又は請求項９に記載のベクターを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物、斯かる植物を得るための方法及び核酸、並びに斯かる植物を用いたグルコースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、過剰な二酸化炭素の放出による地球温暖化の進行と化石燃料の枯渇に対する危機感、及びそれに伴う化石燃料の価格上昇などの要因により、再生可能エネルギーやマテリアルの利用が注目を集めている。特に植物由来バイオ燃料やバイオマテリアルは、燃焼や廃棄等によって生じる二酸化炭素を新たな放出と捉える必要がない（カーボンニュートラル）ことから、非常に期待されている。しかし、従来のバイオ燃料やバイオマテリアルはトウモロコシのデンプンなど食糧になり得るものを原料として生産されており、世界人口の増加により食糧の需給が逼迫しつつある現況から考えて、持続可能なものとは言いがたい。そこで、非可食であるセルロースを原料とした次世代のバイオエタノールやバイオマテリアルの実用化が求められている。
【０００３】
セルロースは、グルコースが繰り返しβ−１，４結合したポリマーである。菌類などを由来とするセルラーゼによってセルロースを処理することによってグルコースが得られ、それを酵母で発酵させることによりエタノールが得られる。グルコースはポリマー原料となる化合物の合成出発物質としても有力である。また、近年ではセルロースそのものをナノセルロースファイバーとして樹脂などに混ぜ、強化剤として用いる方策も開発されつつある。
【０００４】
セルロースは植物の一次細胞壁及び二次細胞壁中に大量に含まれているが、二次細胞壁中のセルロースはリグニンやヘミセルロースと複雑に絡み合っており、セルロースだけを取り出したり、分解してグルコースを得たりするのは容易ではない。一方で、一次細胞壁は通常リグニンをほとんど含まないため、セルロースを取り出しやすく、分解してグルコースを得るのも容易であるが、セルロースの含有量は二次細胞壁よりも遥かに少ない。
【０００５】
植物の二次細胞壁の形成を制御する遺伝子としては、本発明者らが発見したＮＳＴ転写因子の遺伝子がよく知られている（非特許文献１：The Plant Cell, 2007, 19:270-280）。ＮＳＴ転写因子はモデル実験植物シロイヌナズナにおいて発見された遺伝子で、ｎｓｔ１・ｎｓｔ３二重変異体では、道管を除いて木質（二次細胞壁）が形成されなくなる。そのような植物では、結晶性の低いセルロースが一次細胞壁にしか含まれず、セルラーゼによる酵素糖化性が高まる（特許文献１：国際公開第２００７／１０２３４６号；非特許文献２：Journal of Biotechnology, 2009, 142:279-284）が、一次細胞壁は量的に少ないため、個体あたりのセルロース量は少なくなり、最終的な糖収量は減少してしまう。しかも、茎の強度が大幅に低下して、直立することができない。逆に、ＮＳＴ転写因子を植物体全体で過剰に発現させると、あらゆる細胞で異所的な木質形成が起きてしまい、植物の成長が著しく阻害されてしまう。
【０００６】
一方で、植物の一次細胞壁形成を制御する遺伝子としては、本発明者らが発見したＣＥＦ転写因子遺伝子が知られている（特許文献２：国際公開第２０１６／１９０３８６号）。このＣＥＦ転写因子遺伝子を、二次細胞壁を欠損しているｎｓｔ１・ｎｓｔ３二重変異体において木質繊維細胞特異的に発現させると、一次細胞壁様細胞壁を二次細胞壁のように肥厚させることができる（特許文献２：国際公開第２０１６／１９０３８６号）。こうして得られた植物はリグニンをほとんど含まないために、細胞壁抽出物をセルラーゼで処理した場合に、野生株やｎｓｔ１・ｎｓｔ３二重変異体に比べてより多くのグルコースを得ることができる（特許文献２：国際公開第２０１６／１９０３８６号）。しかし、細胞壁がリグニンをほとんど含まないために、その強度は十分ではなく、野外で栽培するには適さない。
【０００７】
バイオ燃料用にバイオマスを増強させる先行技術としては、特許文献３（特開２０１０−０５１２５２号公報）及び非特許文献３（Plant Cell Physiology, 2014, 56:299-310）が挙げられる。この文献では、ヒトの糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−ガラクトース）輸送体をタバコに発現させることにより、全体的なバイオマスの増加を実現させているが、細胞壁に焦点を絞ったものではなく、その他のあらゆる組織・器官が増加している。
【０００８】
特許文献４（特開２０１４−１３２８５８号公報）は、二次細胞壁を肥厚させる技術であるが、前述のとおり二次細胞壁はセルロースだけでなくリグニンやヘミセルロースを多く含むため、そこからセルロースを効率よく取り出すのは容易ではない。
【０００９】
このように、セルロースを取り出しやすい形で植物に生産させながら、野外での栽培に適した強度を維持せしめるのは容易ではなく、未だ確実な方法が確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００７／１０２３４６号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１９０３８６号
【特許文献３】特開２０１０−０５１２５２号公報
【特許文献４】特開２０１４−１３２８５８号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】The Plant Cell, 2007, 19:270-280
【非特許文献２】Journal of Biotechnology, 2009, 142:279-284
【非特許文献３】Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, 109:159-169
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、植物の強度を維持しつつ、セルロース及びその分解物であるグルコースを抽出し易くするように植物を改変する技術の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは鋭意検討の結果、植物の木質を蓄積する繊維細胞（以降適宜「木質繊維細胞」と称する。）において特定のポリペプチドを発現させ、又はその機能を強化することにより、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加するのみならず、二次細胞壁中のリグニンが減少し、セルロース及びその分解物であるグルコースが抽出し易い植物が得られることを見出し、本発明に到達した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を生産する方法であって、
前記方法は、植物の木質繊維細胞内において、第一のポリペプチドを発現させ、又はその機能を強化させることを含み、
前記第一のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、及び／又は、配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる、方法。
［２］前記第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドと連結された融合ポリペプチドとして発現され、
前記第二のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる、［１］の方法。
［３］木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を生産するための核酸であって、
前記核酸は、第一のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列を含み、
前記第一のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、及び／又は、配列番号２若しくは配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる、核酸。
［４］前記第一のコーディング配列は、配列番号３又は配列番号５の塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する、［３］の核酸。
［５］前記第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドと連結された融合ポリペプチドとして発現され、
前記核酸は、第二のポリペプチドをコードする第二のコーディング配列を更に含み、
前記第二のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる、［３］又は［４］の核酸。
［６］前記第二のコーディング配列は、配列番号７の塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有する、［５］の核酸。
［７］前記コーディング配列と作動可能に連結され、木質繊維細胞で前記コーディング配列の発現を誘導するプロモータ配列を更に含む、［３］〜［６］の核酸。
［８］前記プロモータ配列が、配列番号１０又は配列番号１１と少なくとも８０％の同一性を有する、［７］の核酸。
［９］［３］〜［８］の何れか一項に記載の核酸を含むベクター。
［１０］木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を生産する方法であって、
［３］〜［８］の核酸又は［９］のベクターを、植物の木質繊維細胞内に導入して発現させることを含む、方法。
［１１］［１］、［２］、及び［１０］の何れか一項に記載の方法により得られる、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物若しくはその子孫、又はその部分。
［１２］［３］〜［８］の核酸又は［９］のベクターを木質繊維細胞内に含む、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物若しくはその子孫、又はその部分。
［１３］グルコースを製造する方法であって、［１１］又は［１２］の植物若しくはその子孫、又はその部分に含まれる木質繊維細胞の細胞壁からグルコースを抽出することを含む方法。
［１４］グルコースの抽出が、前記の植物若しくはその子孫、又はその部分の少なくとも一部に酵素糖化処理を施すことにより行われる、［１３］の方法。
［１５］酵素糖化処理がセルラーゼにより行われる、［１４］の方法。
［１６］植物の木質繊維細胞の一次細胞壁を増加させ、二次細胞壁中のリグニンを減少させるためのキットであって、［３］〜［８］の核酸又は［９］のベクターを含むキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を得ることができる。斯かる植物を用いれば、二次細胞壁中に含まれるセルロースや、それを分解して得られるグルコース等の成分を、容易に抽出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、シロイヌナズナのNST3pro:VAMP722-VP16導入株（対照）（Ａ，Ｄ，Ｇ，Ｊ）、NST3pro:CEF2-VP16導入株（Ｂ，Ｅ，Ｈ，Ｋ）、及び、NST3pro:CEF4-VP16導入株（Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ）の各々について、茎の横断切片を明視野観察した画像（最上段）、明視野観察画像を二値化処理した画像（２段目）、リグニンの自家蛍光を観察した画像（３段目）、及びルテニウムレッドにより染色した画像（最下段）を示す。茎の横断切片における細胞壁の様子を観察したところ、CEF2-VP16及びCEF4-VP16（第一及び第二のポリペプチドの融合ポリペプチド）をそれぞれコードする核酸を含むベクターにより形質転換したシロイヌナズナ（それぞれ適宜「NST3pro:CEF2-VP16導入株」及び「NST3pro:CEF4-VP16導入株」、又は単に「CEF2-VP16導入株」及び「CEF4-VP16導入株」という。）では、隣接する細胞同士の二次細胞壁間に一次細胞壁が肥厚しているのが認められた（Ａ−Ｉ）。また、一次細胞壁の主要構成成分の一つであるペクチンを主に染色するルテニウムレッドで染色したところ、CEF2-VP16導入株（Ｋ）及びCEF4-VP16導入株（Ｌ）では、対照株（Ｊ）に比べてより強い染色が認められた。
【００１７】
【図２】図２は、シロイヌナズナのNST3pro:VAMP722-VP16導入株（対照）、NST3pro:CEF2-VP16導入株、及び、NST3pro:CEF4-VP16導入株の各々について、茎の下部１０ｃｍから抽出した新鮮重量あたりのアルコール不溶性画分量（細胞壁量に近い）（Ａ）、及び、同画分の単糖組成（Ｂ）を示すグラフである。CEF2-VP16導入株及びCEF4-VP16導入株では、一次細胞壁が肥厚していることを反映して、新鮮重量あたりの細胞壁量が対照に比べて増えている（Ａ）。また、細胞壁の単糖組成においても、一次細胞壁に豊富に存在するガラクツロン酸（ＧａｌＡ）、ラムノース（Ｒｈａ）、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、アラビノース（Ａｒａ）などが増加している一方で、二次細胞壁に豊富に存在するキシロース（Ｘｙｌ）やメチルグルクロン酸（ｍＧｌｃＡ）は顕著に変化していない（Ｂ）。
【００１８】
【図３】図３は、シロイヌナズナのNST3pro:VAMP722-VP16導入株（対照）（Ａ，Ｄ，Ｆ）、NST3pro:CEF2-VP16導入株（Ｂ）、及び、NST3pro:CEF4-VP16導入株（Ｃ，Ｅ，Ｇ）の茎（Ａ−Ｅ）及び胚軸（Ｆ，Ｇ）の各々について、横断切片をモイレ染色（Ａ−Ｃ，Ｆ，Ｇ）又はフロログルシン染色（Ｄ，Ｅ）して明視野観察した画像を示す。CEF2-VP16導入株及びCEF4-VP16導入株では、いずれの染色も対照に比べて弱くなっており、とりわけCEF4-VP16導入株では、胚軸の木質繊維細胞ではまったく染色が見られない。
【００１９】
【図４】図４は、シロイヌナズナのNST3pro:VAMP722-VP16導入株（対照）、NST3pro:CEF2-VP16導入株、及び、NST3pro:CEF4-VP16導入株の各々について、茎の下部１０ｃｍから抽出した細胞壁成分に含まれるリグニンをクラソンリグニン量として定量した結果を示すグラフである。CEF2-VP16導入株及びCEF4-VP16導入株ではリグニン量の減少が認められる。
【００２０】
【図５】図５は、シロイヌナズナの野生株及びNST3pro:CEF4-VP16導入株の各々について、茎の下部１０ｃｍから抽出した細胞壁成分を一定のセルラーゼ処理によって糖化したときのグルコース収量を示すグラフである。CEF4-VP16導入株では糖収量の向上が認められる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
【００２２】
なお、本明細書で引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許文献は、何れもその全体が援用により、あらゆる目的において本明細書に組み込まれるものとする。
【００２３】
１．細胞壁が改変された植物の産生方法
（１）概要
本発明は、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を生産する方法（以下適宜「本発明の植物産生方法」と略称する）に関する。
【００２４】
植物からのセルロースの抽出効率を減ずることなく、セルロースの生産量を増加させ、且つ強度を維持した植物を作製するには、一次細胞壁を肥厚させる機能を有する遺伝子を、木質を蓄積する繊維細胞（木質繊維細胞）内で発現させ、或いはそうした遺伝子が既に植物細胞内に存在する場合には、その遺伝子の機能を強化するのが望ましいと考えられる。本発明者らはそのような方法を広く検討する中で、AP2/ERF転写因子遺伝子の一つであり、nst1・nst3二重変異体において木質繊維細胞の一次細胞壁を肥厚させる効果のある、CEF2遺伝子又はCEF4遺伝子（特許文献２）に着目した。その上で、野生株植物を改変し、木質繊維細胞においてCEF2遺伝子又はCEF4遺伝子の発現産物（それぞれ以下適宜「CEF2ポリペプチド」及び「CEF4ポリペプチド」という。）の機能を強化した植物体を作製したところ、木質繊維細胞の一次細胞壁が肥厚するのみならず、思いがけず二次細胞壁中のリグニンが減少することを見出した。更に本発明らは、CEF2ポリペプチド及びCEF4ポリペプチドのアミノ酸配列を解析し、木質繊維細胞の一次細胞壁の肥厚及び二次細胞壁中のリグニンの減少に関与している蓋然性が高いコンセンサス配列（配列番号１）を特定した。斯かる知見に基づき、本発明は完成された。
【００２５】
即ち、本発明の植物産生方法は、植物の木質繊維細胞内において、第一のポリペプチドを発現させ、又はその機能を強化させることを含む。一態様によれば、第一のポリペプチドは、CEF2ポリペプチド（配列番号２）若しくはCEF4ポリペプチド（配列番号４）、又はこれらのポリペプチドの類似体である。別の態様によれば、第一のポリペプチドは、CEF2及びCEF4ポリペプチドのコンセンサス配列（配列番号１）を含むポリペプチドである。
【００２６】
また、第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドと連結された融合ポリペプチドとして発現されることが好ましい。ここで、第二のポリペプチドとしては、転写活性化因子として公知のVP16遺伝子の発現産物であるVP16ポリペプチド（配列番号６）、又はその類似体が挙げられる。
【００２７】
本発明の植物産生方法は、後述の本発明の核酸又は本発明のベクターを、植物の木質繊維細胞内に導入して発現させることにより実施することが好ましい。ここで、本発明の核酸又は本発明のベクターを、植物の木質繊維細胞内に導入して発現させることにより、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を生産する方法も、本発明の植物産生方法の一例に含まれる。
以下、詳細を説明する。
【００２８】
（２）対象植物
本発明の植物の産生方法の対象となる植物は、制限されるものではなく、イモ類、豆類、ナス科類などの双子葉植物一般に適用できる。特に、バイオマス資源の観点からは、ポプラ、ユーカリ、アカシアなどの双子葉木本植物が好ましい。但し、本発明の植物の産生方法は、これらの植物に限定されるものではなく、ミスカンザス、エリアンサス、ダンチク、ソルガム、ススキなどの単子葉エネルギー植物の育種一般にも適用できる。
【００２９】
（３）第一のポリペプチド
ある態様によれば、第一のポリペプチドは、CEF2ポリペプチド（配列番号２）若しくはCEF4ポリペプチド（配列番号４）、又はその類似体である。類似体としては、例えばそのホモログ（オルソログ及びパラログを含む）、又はそのフラグメントが挙げられる。
【００３０】
具体的に、第一のポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列相同性を有することが望ましい。
【００３１】
また、第一のポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが望ましい。
【００３２】
ここで、２つのアミノ酸配列の「相同性」（similarity）とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基又は類似の（すなわち、物理化学的性質が類似する）アミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」（identity）とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。
【００３３】
また、第一のポリペプチドは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。ここで、「アミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、当該アミノ酸配列中のアミノ酸が、そのポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく改変していることを指す。また、「数個」とは、通常２〜５０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜５個の変異が存在することを指す。
【００３４】
別の態様によれば、第一のポリペプチドは、以下に示すCEF2及びCEF4ポリペプチドのコンセンサス配列（配列番号１）を含むポリペプチドである。
ＹＲＧＶＲＭＲ［Ｓ／Ｎ］ＷＧＫＷＶＳＥＩＲＥＰＲＫＫＳＲＩＷＬＧＴ［Ｙ／Ｆ］ＰＴ［Ａ／Ｐ］ＥＭＡＡＲＡＨＤＶＡＡＬ［Ａ／Ｓ］ＩＫＧ［Ｎ／Ｔ］［Ｓ／Ａ］［Ｇ／Ａ］［Ｆ／Ｉ］ＬＮＦＰＥＬ［Ｓ／Ａ］［Ｇ／Ｄ］［Ｌ／Ｓ］［Ｌ／Ｆ］ＰＲＰＶＳ［Ｃ／Ｌ］ＳＰ［Ｋ／Ｒ］ＤＩＱ［Ａ／Ｔ］ＡＡ［Ｔ／Ｌ］ＫＡＡ
但し、上記配列中、角括弧（［  ］）内にスラッシュ（／）で区切って複数のアミノ酸残基を表示している箇所は、これらのアミノ酸残基の何れかであることを表している。
【００３５】
斯かる第一のポリペプチドは、前記コンセンサス配列（配列番号１）を有していれば、その他の特徴は特に限定されないが、そのアミノ酸長は配列番号２（２５６アミノ酸）及び配列番号４（２３６アミノ酸）と同程度であることが好ましく、具体的には通常１８０アミノ酸以上、中でも２００アミノ酸以上、更には２２０アミノ酸以上、また、通常３００アミノ酸以下、中でも２８０アミノ酸以下、更には２６０アミノ酸以下であることが好ましい。また、前記コンセンサス配列（配列番号１）以外の配列についても、配列番号２（CEF2）又は配列番号４（CEF4）と類似していることが好ましく、具体的には、第一のポリペプチド全体が、配列番号２（CEF2）又は配列番号４（CEF4）と前述したような配列相同性又は配列同一性の関係を有していることが好ましい。
【００３６】
（４）第一のポリペプチドの発現又は機能強化の手法
本発明の植物産生方法における第一のポリペプチドは、一次細胞壁の合成を促進しつつ二次細胞壁中のリグニンを減少させる活性を有するポリペプチドである。ここで「一次細胞壁の合成を促進しつつ二次細胞壁中のリグニンを減少させる活性」とは、例えば「CEF2遺伝子」又は「CEF4遺伝子」によりコードされる転写制御因子が本来的に備えている、一次細胞壁やリグニンの生合成に関係する遺伝子の転写制御活性をいう。本発明においてはとりわけ、斯かる転写制御因子やその変異体・ホモログ等（第一のポリペプチド）において、その機能を強化した際に、植物体内において一次細胞壁の合成を促進しつつ二次細胞壁中のリグニンを減少させる場合、斯かる転写制御因子等（第一のポリペプチド）は、一次細胞壁の合成を促進しつつ二次細胞壁中のリグニンを減少させる活性を有しているということができる。また、当該転写制御因子等（第一のポリペプチド）が本来的に備えている転写の制御活性は、当該転写制御因子等（第一のポリペプチド）の機能と同義で使用される。
【００３７】
当該転写制御因子等（第一のポリペプチド）の機能を強化する手法は、植物体内における当該転写制御因子等（第一のポリペプチド）の遺伝子又はタンパク質の発現を増強することであっても、当該転写制御因子等（第一のポリペプチド）により制御される下流の標的遺伝子の発現を増強させることであってもよい。なお、当該転写制御因子の機能を強化する方法は、当該分野において周知の技術が用いられればよく、当該転写制御因子をコードする遺伝子の発現増強、当該転写制御因子をコードする遺伝子に転写活性化ドメインをコードする遺伝子を付加するなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３８】
なお、本発明において、当該転写制御因子の機能を強化する場合、好ましくは、植物の木質繊維細胞特異的に当該転写制御因子の機能を強化する手法である。そのような手法は、当業者であれば、例えば、プロモータとともに核酸を導入する手法において、木質繊維細胞特異的プロモータの利用などにより適宜実施することができる。
【００３９】
なお、以下では、第一のポリペプチド（転写制御因子）を発現させその機能を強化する手法として、その転写を活性化する機能を有するポリペプチド（第二のポリペプチド）を第一のポリペプチドに融合して発現させる手法を用いる場合を、一例として具体的に説明する。しかしながら、本発明の植物産生方法では、下記で説明する手法に限られず、第一のポリペプチド（転写制御因子）を発現させ、又はその機能を強化する手法であれば、任意の手法を採用することができる。
【００４０】
（５）第二のポリペプチド
ある態様によれば、第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドと連結された融合ポリペプチドとして発現される。ここで、第二のポリペプチドは、VP16遺伝子の発現産物であるVP16ポリペプチド（配列番号６）、又はその類似体である。類似体としては、例えばそのホモログ（オルソログ及びパラログを含む）、又はそのフラグメントが挙げられる。
【００４１】
具体的に、第二のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列相同性を有することが望ましい。
【００４２】
また、第二のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが望ましい。
【００４３】
また、第二のポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるものであってもよい。
【００４４】
第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとは、相互に連結されて融合ポリペプチドを形成する。この場合、第一及び第二のポリペプチドに対応するドメイン（それぞれ以下適宜「第一のドメイン」及び「第二のドメイン」と略称する。）は、互いに直接連結されていてもよいが、ペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。
【００４５】
ペプチドリンカーを使用する場合、そのアミノ酸配列は、第一及び第二のポリペプチドの機能を実質的に阻害しない限りにおいて限定されないが、例としては、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、或いはこれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列相同性又は配列同一性を有するペプチドリンカーが挙げられる。但し、ペプチドリンカーには、ベクターへの当該転写制御因子のゲートウェイクローニングの結果によって生じたアミノ酸配列、例えばゲートウェイLR反応によって生じたattＢ配列に相当するアミノ酸配列等が含まれていてもよい。従って、ペプチドリンカーは上記の配列に限定されず、使用するベクターの種類等に応じて、当業者であれば適宜好ましいペプチドリンカーを設計可能である。
【００４６】
なお、第一及び第二のポリペプチドが互いに連結されて融合ポリペプチドを形成する場合、第一及び第二のポリペプチドに対応するドメイン（第一及び第二のドメイン）の配置順序は制限されず、どちらがＮ末端側に配置されてもよいが、第一のドメインがＮ末端側、第二のドメインがＣ末端側に配置されることが好ましい。
【００４７】
２．細胞壁が改変された植物を産生するための核酸
（１）概要
本発明は、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物を生産するための方法（本発明の植物産生方法）に使用される核酸（以下適宜「本発明の核酸」と略称する）にも関する。
【００４８】
本発明の核酸は、前述の第一のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列を含む。ここで、第一のコーディング配列は、CEF2遺伝子（配列番号３）又はCEF4遺伝子（配列番号５）、又はこれらの遺伝子の類似配列であることが好ましい。
【００４９】
また、前述の第一のポリペプチドが、前述の第二のポリペプチドと連結された融合ポリペプチドとして発現される場合には、本発明の核酸は、前述の第二のポリペプチドをコードする第二のコーディング配列を更に含むことが好ましい。ここで、第二のコーディング配列は、公知のVP16遺伝子（配列番号７）、又はこれらの遺伝子の類似配列であることが好ましい。
【００５０】
また、本発明の核酸は、前記の第一のコーディング配列（及び、第二のコーディング配列が存在する場合には、第二のコーディング配列）と作動可能に連結され、木質繊維細胞で前記コーディング配列の発現を誘導するプロモータ配列を更に含むことが好ましい。このプロモータ配列は、公知のNST1プロモータ（配列番号１０）又はNST3プロモータ（配列番号１１）、又はその類似配列であることが好ましい。
以下、詳細を説明する。
【００５１】
（２）第一のコーディング配列（転写制御因子）
本発明の核酸は、第一のコーディング配列を含む。第一のコーディング配列は、前述の第一のポリペプチドをコードするコーディング配列であれば、その塩基配列は限定されない。但し、CEF2遺伝子（配列番号３）又はCEF4遺伝子（配列番号５）、又はこれらの遺伝子の類似配列であることが好ましい。
【００５２】
具体的に、第一のコーディング配列は、配列番号３又は配列番号５の塩基配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが望ましい。
【００５３】
また、第一のコーディング配列は、配列番号３又は配列番号５の塩基配列の相補配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号３又は配列番号５に示す塩基配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低い塩基配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。斯かるストリンジェントな条件は、通常のハイブリダイゼーション操作におけるＴｍ値を高めた条件として、当業者には自明である。具体的には、T.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989）Cold Spring Harbor Laboratory等を参照のこと。例としては、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ［Denhardt’s］、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００］及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃で４時間〜一晩保温を行う条件等が挙げられる。
【００５４】
（３）第二のコーディング配列（転写活性化因子）
第一のポリペプチドが、第二のポリペプチドと連結された融合ポリペプチドとして発現される場合には、本発明の核酸は、第二のポリペプチドをコードする第二のコーディング配列を含むことが好ましい。ここで、第二のコーディング配列は、前述の第二のポリペプチドをコードするコーディング配列であれば、その塩基配列は限定されない。但し、公知のVP16遺伝子（配列番号７）、又はこれらの遺伝子の類似配列であることが好ましい。
【００５５】
具体的に、第二のコーディング配列は、配列番号７の塩基配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが望ましい。
【００５６】
また、第一のコーディング配列は、配列番号７の塩基配列の相補配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。
【００５７】
なお、第一のコーディング配列及び第二のコーディング配列も相互に連結され、融合ポリペプチドを直接コードしていてもよい。この場合、第一及び第二のコーディング配列は、互いに直接連結されていてもよいが、融合ポリペプチドの第一及び第二のドメインがペプチドリンカーを介して連結されている場合には、斯かるペプチドリンカーをコードする配列を有するポリヌクレオチドリンカーを介して、第一及び第二のコーディング配列が連結されていてもよい。
【００５８】
ポリヌクレオチドリンカーを使用する場合、その塩基配列は、ペプチドリンカーをコードする塩基配列であれば限定されないが、例としては、配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドリンカー、或いはこれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドリンカーが挙げられる。但し、ポリヌクレオチドリンカーには、ベクターへの当該転写制御因子のゲートウェイクローニングの結果によって生じた塩基配列、例えばゲートウェイLR反応によって生じたattＢ配列等が含まれていてもよい。従って、ポリヌクレオチドリンカーは上記の配列に限定されず、使用するベクターの種類等に応じて、当業者であれば適宜好ましいポリヌクレオチドリンカーを設計可能である。
【００５９】
なお、第一及び第二のコーディング配列は、本発明の核酸上にどのような順序で配置されてもよい。即ち、第一のコーディング配列が５’末端側でもよく、第二のコーディング配列が５’末端側でもよい。しかし、第一及び第二のコーディング配列の配置順は、第一及び第二のポリペプチドに対応するドメイン（第一及び第二のドメイン）の配置順に一致させることが好ましい。即ち、融合ポリペプチドが、Ｎ末端側から「第一のドメイン」→（任意により「ペプチドリンカー」→）「第二のドメイン」という配置で構成される場合、本発明の核酸上の配置は、「第一のコーディング配列」→（任意により「ポリヌクレオチドリンカー」→）「第二のコーディング配列」とすることが好ましい。もし何らかの事情により、本発明の核酸上における第一及び第二のコーディング配列の配置順を、融合ポリペプチドにおける第一及び第二のドメインの配置順とは逆順とする場合には、第一及び第二のドメインが連結された１つの融合ポリペプチドとして翻訳されるように適宜、開始コドンや終止コドンの設計を行えばよい。
【００６０】
（４）プロモータ配列
本発明の核酸は、前記の第一のコーディング配列（及び、第二のコーディング配列が存在する場合には、第二のコーディング配列）と作動可能に連結され、木質繊維細胞で前記コーディング配列の発現を誘導するプロモータ配列を更に含むことが好ましい。プロモータ配列としては、木質繊維細胞において遺伝子発現を誘導することが可能なプロモータ配列であれば、その種類は制限されない。例としては、NST3プロモータ若しくはそのオルソログ遺伝子のプロモータ、NST結合配列（SNBE）を繰り返してコアプロモータの上流に配置した人工プロモータ、二次細胞壁セルロース合成酵素のプロモータ、リグニン合成に関与する酵素類のプロモータ、キシラン合成に関与する酵素類のプロモータ等が挙げられる。特に、シロイヌナズナ由来のNST1遺伝子のプロモータ配列（配列番号１０）及びNST3遺伝子のプロモータ配列（配列番号１１）、並びにそれらの類似配列からなるプロモータ配列が、木質繊維細胞特異的に強い発現を促す点において好ましい。
【００６１】
具体的に、本発明の核酸が有するプロモータ配列は、NST1プロモータ（配列番号１０）又はNST3プロモータ（配列番号１１）の塩基配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが望ましい。また、本発明の核酸が有するプロモータ配列は、配列番号１０又は配列番号１１の塩基配列の相補配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。
【００６２】
（５）その他の配列
本発明の核酸は、その他の配列を有していてもよい。その他の配列としては、エンハンサ、ポリＡ付加シグナル、５’−ＵＴＲ（非翻訳領域）、標識又は選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等が挙げられる。
【００６３】
本発明の核酸は、発現カセットとして構成されることが好ましい。「発現カセット」とは、当該核酸が有するコーディング配列（主に遺伝子又はその断片）を自律的に発現することのできる一つの発現系単位をいう。発現カセットは、前記核酸を含む領域の他に、遺伝子発現に必要な発現調節領域を有する。そのような発現調節領域としては、例えば、前述したプロモータ配列やターミネータ配列が挙げられる。また、その他の構成として、発現カセットには、特定の遺伝子等を発現させる上で必要な一つの発現系単位をゲノム上からそのまま取り出したものや、様々な生物由来の発現調節領域等を組み合わせる等して人工的に構築したものが存在する。本発明においては、いずれの発現カセットも利用することが可能である。また、上述する発現調節領域の構成については、本明細書中に記載のない限り、当該分野において公知の構成を適宜選択することが可能である。
【００６４】
本発明の核酸を「発現カセット」として構成する場合、当該「発現カセット」は、目的とする植物の木質繊維細胞内で、本発明の核酸が有する第一のコーディング配列、及び有する場合には第二のコーディング配列及びポリヌクレオチドリンカーを、自律的に発現させる作用を有する。
【００６５】
（６）ベクター
本発明の核酸は、ベクターの形態としてもよい。斯かるベクター（以下適宜「本発明のベクター」と略称する）も本発明の対象となる。本明細書において「ベクター」とは、上記の「発現カセット」を含むものであって、上記「発現カセット」に含まれる塩基配列からなる核酸の増殖に使用される、大腸菌等へ導入されるベクターや、植物の形質転換を行うためのベクターを含む。本発明に使用されるベクターとしては、当該分野において公知のベクターを使用でき、導入する植物やベクターの使用する手法・目的に応じて適宜選択すればよい。ベクターの種類は制限されず、任意のベクターを用いることができる。例としては植物ウイルスベクター、バクテリウムベクター等が挙げられる。具体例としては、下記実施例にて使用されるpDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5などを使用することができる。但し、繰り返すが、ベクターはこれらのものに限定されず、当業者に周知の任意のベクターを用いることができる。
【００６６】
（７）導入方法
本発明の核酸（例えば発現カセット）又は本発明のベクターを植物中に導入する方法も、限定されるものではなく、任意の手法を用いることができる。例としてはアグロバクテリウム法が典型的であるが、他にもＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等、従来周知の方法が適用できる。
【００６７】
（８）キット
本発明の核酸及び本発明のベクターは、キットの形態としてもよい。斯かるキット（以下適宜「本発明のキット」と略称する）も本発明の対象となる。
【００６８】
本発明のキットは、植物の木質繊維細胞の一次細胞壁を増加させ、二次細胞壁中のリグニンを減少させるためのキットであって、本発明の核酸又は本発明のベクターを適切な媒体及び容器内に含んでなる。更に、斯かる本発明の核酸又は本発明のベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。当該試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材が添付されていてもよい。
【００６９】
３．細胞壁が改変された植物
本発明は、本発明の植物産生方法により得られる、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物若しくはその子孫、又はその部分（以下適宜「本発明の植物若しくはその子孫、又はその部分」、或いは単に「本発明の植物等」と略称する）にも関する。
【００７０】
また、本発明の核酸又はベクターを植物に導入して、本発明の植物産生方法を実施した場合、本発明の核酸又はベクターを木質繊維細胞内に含み、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加し、二次細胞壁中のリグニンが減少した植物若しくはその子孫、又はその部分が得られる。斯かる植物等も、本発明の植物等に含まれる。
【００７１】
なお、本発明において「植物の子孫」とは、当該植物の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫をいい、当該植物のクローンを含む。例えば、当該植物体やその子孫から繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に当該植物の子孫を作出することが可能である。また、本発明において「植物若しくはその子孫、又はそれらの一部」としては、当該植物又はその子孫の植物における、種子（発芽種子、未熟種子を含む）、器官又はその部分（葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストが挙げられる。
【００７２】
本発明の植物等は、下記の実施例で示すように、第一のポリペプチド（及び任意により第二のポリペプチド）が木質繊維細胞内で発現されることにより、木質繊維細胞の一次細胞壁が増加すると共に、二次細胞壁中のリグニンが減少している。斯かる効果によって、本発明の植物等では、セルロース及びその分解物であるグルコースが抽出し易くなっている。この点の評価は、例えば後述の「酵素糖化処理」によりグルコースを取得し、得られたグルコースの量を測定することにより行うことができる。
【００７３】
４．細胞壁が改変された植物からグルコースを製造する方法
本発明は、グルコースを製造する方法であって、本発明の植物若しくはその子孫、又はその部分に含まれる木質繊維細胞の細胞壁からグルコースを抽出することを含む方法（以下適宜「本発明のグルコース製造方法」と略称する）にも関する。
【００７４】
ここで、グルコースの抽出は、本発明の植物等の少なくとも一部に酵素糖化処理を施すことにより行うことが好ましい。「酵素糖化処理」は、細胞壁成分に含まれるセルロースからどれだけ容易にグルコースを抽出できるかを評価するための周知の手法である。好ましくは、セルラーゼを用いて本発明の植物若しくはその子孫、又はその部分を処理し、セルラーゼが触媒する酵素反応によって、遊離されたグルコースを取得する。
【００７５】
下記の実施例に示すように、本発明の植物の産生方法により得られた、第一のポリペプチドが木質繊維細胞内で発現されてなる植物（CEF2-VP16又はCEF4-VP16導入シロイヌナズナ植物）では、野生株よりも顕著に多いグルコースが得られた（例えば実施例３及び図５等参照）。このように、本発明の植物等は、野生株と比較した際に、セルロース及びその分解物であるグルコースが抽出し易くなっている。
【００７６】
５．その他
本発明においては、木質繊維細胞内で第一のポリペプチドを発現させ、又はその機能を強化することにより、セルロースの生産を増やしつつリグニンを適度に減少させることができる。その結果、植物の強度はある程度維持しながら、セルロース及びその分解物であるグルコースを抽出し易い植物の産生が可能となる。グルコースはエタノールの原料となるほか、様々な化合物の合成原材料となりうる。これにより、植物一個体あたりから抽出できるセルロースの量を増加することができる。斯かるセルロース及びその分解物であるグルコースの量を増加できれば、バイオ燃料やマテリアル生産量を増やすことができる。また、セルロースそのものも紙パルプや添加剤等など様々な用途に利用できる。これらバイオ燃料、マテリアルの生産促進により低炭素化社会の実現に向けて貢献できる。
【００７７】
なお、本明細書に記載の各種の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学的技術は、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning： A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., DNA Cloning, 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)等に記載の方法により、又はそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするＤＮＡについては、既存のデータベース（URL：http：//www.arabidopsis.org/又はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed等）から入手することができる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
【００７９】
［実施例１］ProNST3：CEF2-VP16又はProNST3：CEF4-VP16で形質転換したnst1/nst3二重変異シロイヌナズナ植物体の作製
（１−１）形質転換用ベクターProNST3：CEF2-VP16又はProNST3：CEF4-VP16の構築
以下の手順により形質転換ベクターを構築した。
【００８０】
終止コドンを除いたシロイヌナズナ由来のCEF2又はCEF4タンパク質のコーディング領域を、下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）で増幅した上で、ゲートウェイドナーベクターpDONR207ベクター（インビトロジェン社）に対し、BPクロナーゼ（登録商標）（サーモフィッシャー社）を用いてクローニングした。なお、下記塩基配列中、大文字はCEF2又はCEF4遺伝子に完全にマッチする部分を表し、小文字は付加配列（Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンを作成するためのＢＰ反応に必要なａｔｔＢ１（５’末端／Ｎ末端側）又はａｔｔＢ２（３’末端／Ｃ末端側）配列）を表す。
【００８１】
5’- ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccATGGGAAAACAAATCAACATAGAGAGTAG -3’（CEF2増幅用フォワードプライマー、配列番号１２）
5’- ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGTCATTTTGCCAATTAAACGGCTCTTCAAA -3’（CEF2増幅用リバースプライマー、配列番号１３）
5’- ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccATGGCAGAGGAATACTACAGCCTCCGCTC -3’（CEF4増幅用フォワードプライマー、配列番号１４）
5’- ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGAGATCCCATGACAAGCCATGGCCAAAATT-3’（CEF4増幅用リバースプライマー、配列番号１５）
【００８２】
次に、上記CEF2遺伝子又はCEF4遺伝子のタンパク質コーディング領域を、Plant Cell Physiology, 2014, 56:299-310に記載のpDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5ベクターに、LRクロナーゼ（登録商標）（サーモフィッシャー社）を用いて移し変え、形質転換に使用するベクターを構築した。
【００８３】
なお、pDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5ベクターには、NST3プロモータの下流に、CEF2遺伝子又はCEF4遺伝子のタンパク質コーディング領域とVP16転写活性化ドメインをコードする塩基配列とが、ポリヌクレオチドリンカーを介して連結された状態で配置されている。これにより、当該ベクターを用いて形質転換された植物の木質繊維細胞内では、配列番号１６（CEF2-VP16）又は配列番号１７（CEF4-VP16）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの融合ポリペプチド）が発現される。
【００８４】
（１−２）フローラルディップ法を用いたProNST3：CEF2-VP16又はProNST3：CEF4-VP16によるシロイヌナズナ野生株の形質転換
上記（１−１）で得られた形質転換用ベクターProNST3：CEF2-VP16又はProNST3：CEF4-VP16を、土壌細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)株（koncz and Schell, 1986）に対して、エレクトロポレーション法で導入した。導入後の菌を、２００ｍＬの抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５ｍｇ／Ｌ、及びリファンピシリン（Ｒｉｆ）５０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地で２日間培養した後、培養液から菌体を回収し、５００ｍＬの浸潤培地（Infiltration medium）（特許文献1：国際公開第２００７／１０２３４６号を参照）に懸濁させた。
【００８５】
一方、形質転換対象の植物体としては、米国シロイヌナズナバイオリソースセンター（Arabidopsis Biological Resource Center：ＡＢＲＣ）から取り寄せたシロイヌナズナ野生株Col-0を、４５日間〜６０日間育てて開花させ、主茎を切った後に、更に１０日間育ててから形質転換に用いた。
【００８６】
形質転換は以下の手順で行った。前記のシロイヌナズナを、前記の菌体を懸濁させた浸潤培地に２分間浸して感染させ、通常通り育成してＴ１種子を収穫した。このＴ１種子を５０％ブリーチ、０．０２％Triton X-100溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、３０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含むＭＳ選択培地に播種した。上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体（ProNST3：CEF2-VP16又はProNST3：CEF4-VP16が導入された植物体、Ｔ１）を選抜し、土壌に植え換えて生育し、種子を採取して播種し、次世代（Ｔ２）のシロイヌナズナ植物を得た。
【００８７】
［実施例２］ProNST3：CEF2-VP16及びProNST3：CEF4-VP16導入シロイヌナズナ植物体の花茎の切片観察
上記（１−２）で得られたProNST3：CEF2-VP16及びProNST3：CEF4-VP16導入シロイヌナズナＴ１植物について、播種後約８０日の時点で花茎を採取し、バイブレーションミクロトームを用いて地上高約２ｃｍのところで５０μｍ厚の横断切片を作製し、明視野条件化で木質繊維細胞の細胞壁を観察した。その結果、CEF2-VP16導入植物体及びCEF4-VP16導入植物体では、木質繊維細胞の二次細胞壁間に一次細胞壁が肥厚しているのが明瞭に見て取れた（図１Ａ−Ｆ）。また、同横断切片を紫外線照射下に置きリグニンの自家蛍光を観察した。その結果、二次細胞壁間において自家蛍光のないリグニンが存在しない細胞壁の肥厚が確認できた（図１Ｇ−Ｉ）。野生株では、細胞壁肥厚が見られる木質繊維細胞及び維管束細胞で蛍光が観察されたのに対し、CEF2-VP16導入植物体では維管束細胞でしか蛍光が認められなかった（図１）。また、同横断切片をルテニウムレッドで染色したところ、CEF2-VP16導入植物体及びCEF4-VP16導入植物体では、野生株に比べてより強い染色が確認できた（図１Ｊ−Ｌ）。
【００８８】
また、同横断切片を２％（ｗ／ｖ）フロログルシン塩酸水溶液で５分間染色し、１０％（ｗ／ｖ）塩酸で封入してリグニン沈着の様子を観察した。また、モイレ染色液（１％（ｗ／ｖ）ＫＭｎＯ４）で５分間染色し、超純水及び１０％（ｗ／ｖ）塩酸で洗浄後に１．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液で封入して、同様にリグニン沈着の様子を観察した。その結果CEF2-VP16導入植物体及びCEF4-VP16導入植物体では、野生株に比べてより染色強度が弱かった（図３Ａ〜Ｅ）。胚軸については、胚軸の上部より４ｍｍのところで５０μｍ厚の横断切片をバイブレーションミクロトームを用いて作製し、明視野条件化で木質繊維細胞の細胞壁を観察した。また、同横断切片を用いたリグニンの自家蛍光・フロログルシン染色、モイレ染色によるリグニンの沈着の様子の観察は、花茎の横断切片の場合と同様に行った。その結果CEF4-VP16導入植物体では野生株と異なりほとんど染色が見られなかった（図３Ｆ−Ｇ）。
【００８９】
［実施例３］ProNST3：CEF2-VP16及びProNST3：CEF4-VP16導入シロイヌナズナ植物の細胞壁成分分析
（３−１）細胞壁成分の抽出と秤量
上記（１−２）で得られたProNST3：CEF2-VP16及びProNST3：CEF4-VP16導入シロイヌナズナＴ１植物において播種後約８０日で基部より１０ｃｍの部分を採取し、新鮮重量を測定した後、直ちに１ｃｍ以下の長さになるよう花茎を刻み、メタノールに浸し一晩以上静置した後、新しいメタノールで２回リンスすることでクロロフィルを除去した。８０℃で１０分間煮沸した後、新しいメタノールに交換した。この操作を２度繰り返した後、５０％クロロホルム、５０％メタノール溶液に浸し、７０℃で煮沸した後、新しい５０％クロロホルム、５０％メタノール溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、アセトン溶液に浸し、７０℃で煮沸した後、新しいアセトン溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、１００％エタノール溶液で３回リンスした後、７０℃で２日間乾燥させた。これをアルコール不溶性残渣とし、重量を測定した。新鮮重量あたりのアルコール不溶性残渣の割合を細胞壁含量として評価したところ、CEF2-VP16導入植物体及びCEF4-VP16導入植物体の細胞壁含量は、野生株のそれより向上していた（図２Ａ）。
【００９０】
（３−２）単糖組成の分析
前記（３−１）で得たアルコール不溶性残渣を、ホモジナイザー（シェイクマスターネオ；バイオメディカルサイエンス社）を用いて、２０００ｒｐｍ、１０分間の粉砕処理を行い、細胞壁粉末を得た。得られた細胞壁粉末を１ｍＬの５０ｍＭマレイン酸、２ｍＭ塩化カルシウム、０．０２％アジ化ナトリウム溶液に懸濁し、７０℃で１０分間デンプンを糊化した後、４ｍＬの５０ｍＭマレイン酸、２ｍＭ塩化カルシウム、０．０２％アジ化ナトリウム溶液を加えて、室温で１０分間静置した。その次に、５００Ｕのα−アミラーゼ、０．３３Ｕのアミログルコシダーゼ、５０ｍＭマレイン酸、２ｍＭ塩化カルシウム、０．０２％アジ化ナトリウム溶液１ｍＬを加えた後、３７℃で１８時間、デンプンを加水分解し、除デンプンを行った。除デンプンを行った細胞壁粉末懸濁液は、蒸留水で３回、１００％エタノールで２回リンスした後、７０℃で１晩乾燥させ、細胞壁精製粉末を得た。この細胞壁精製粉末を約２ｍｇ分取し、５０ｍＬの７２％（ｗ／ｗ）硫酸を加えて、常温で１時間処理した。２ｍｇ／ｍＬの２ｍＧｌｃを１０ｍＬ加え、超純水を１．４ｍＬ加えて希釈したのち、１２１℃、１時間の処理により、全糖分解溶液と残渣を得た。２００ｍＬの全糖分解溶液を炭酸カルシウム粉末の添加により中和し、ＡＢＥＥ混合液中で適宜撹拌しながら３０分間処理した。その後、２００ｍＬの超純水と２００ｍＬのクロロホルムを加え、分離した水層を０．２マイクロメートルのフィルターで濾過した溶液をＵＰＬＣで分析した。その結果、一次細胞壁を構成する単糖であるラムノース（Ｒｈａ）、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、及びガラクツロン酸（ＧａｌＡ）の量が、CEF2-VP16導入植物体及びCEF4-VP16導入植物体で向上していた(図２Ｂ）。
【００９１】
（３−３）リグニンの定量分析
前記（３−２）で得た全糖分解後の残渣を１０％エタノールで１回、１００％エタノールで２回洗浄し、一晩乾燥ののち精密天秤で秤量し、単位乾燥重量あたりのクラソンリグニンの量（ｍｇ／ｇＡＩＲ）を算出した。その結果、クラソンリグニン量はCEF2-VP16導入植物体で８４％（０．８４倍）に、CEF4-VP16導入植物体で６２％（０．６２倍）に減少していた（図４）。
【００９２】
（３−４）グルコース収量の分析
前記（３−２）で得た細胞壁精製粉末２〜３ｍｇを２ｍＬマイクロチューブに分取した後、１ｍＬの５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）、０．０２％アジ化ナトリウム、０．４ＦＰＵセルクラスト（Celluclast）（ノボザイムズ社）１．５Ｌ、０．８ＣＢＵノボザイム１８８（Novozyme 188）（ノボザイムズ社）溶液を加えて、５０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪しながら、酵素糖化反応を行い得られるグルコース量を調べた。その結果、CEF4-VP16導入植物体は、野生株に比べて酵素糖化性が約２０％（１．２倍）高かった（図５）。この結果から、NST3pro: CEF2-VP16導入シロイヌナズナ植物系統は、対照系統に比べて単位栽培面積当たりより多くのグルコースを得ることができ、バイオエタノール生産等に有利であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、植物からセルロースやグルコース等を抽出する用途に広く利用でき、その有用性は極めて高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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