(57)【要約】【課題】オリゴヌクレオチドの合成効率を正確に評価する技術を提供する。【解決手段】保護基を有するオリゴヌクレオチド誘導体の前記保護基を脱離させ、オリゴヌクレオチドを生成する第１工程と、前記オリゴヌクレオチドに保護基を有するヌクレオチド誘導体を結合させる第２工程と、を含む、オリゴヌクレオチドの合成反応において、前記オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する方法であって、脱離された前記保護基を定量する第３工程を更に含み、前記第３工程は、脱離された前記保護基を液体クロマトグラフィーで分画し吸光度分析若しくは質量分析により定量する工程であるか、又は除去された前記保護基をガスクロマトグラフィーで分画し質量分析により定量する工程であり、定量された前記保護基の量が前記オリゴヌクレオチドの合成効率に対応する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
保護基を有するオリゴヌクレオチド誘導体の前記保護基を脱離させ、オリゴヌクレオチドを生成する第１工程と、
前記オリゴヌクレオチドに保護基を有するヌクレオチド誘導体を結合させる第２工程と、を含む、オリゴヌクレオチドの合成反応において、前記オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する方法であって、
脱離された前記保護基を定量する第３工程を更に含み、
前記第３工程は、脱離された前記保護基を液体クロマトグラフィーで分画し吸光度分析若しくは質量分析により定量する工程であるか、又は脱離された前記保護基をガスクロマトグラフィーで分画し質量分析により定量する工程であり、
定量された前記保護基の量が前記オリゴヌクレオチドの合成効率に対応する、方法。
【請求項２】
前記吸光度分析を波長１９０〜２８０ｎｍの光の吸収を測定することにより実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保護基を有するオリゴヌクレオチド誘導体の前記保護基を脱離させ、オリゴヌクレオチドを生成する反応部と、
脱離された前記保護基を分画する分画部と、
分画された前記保護基を定量する検出部と、
を備える、オリゴヌクレオチド合成装置。
【請求項４】
前記分画部が液体クロマトグラフィー装置又はガスクロマトグラフィー装置である、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド合成装置。
【請求項５】
前記分画部が液体クロマトグラフィー装置であり、前記検出部が吸光度分析装置又は質量分析装置である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド合成装置。
【請求項６】
前記分画部がガスクロマトグラフィー装置であり、前記検出部が質量分析装置である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド合成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する方法に関する。より詳細には、オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する方法及びオリゴヌクレオチド合成装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドの合成は、通常、オリゴヌクレオチドの末端の保護基を脱離させて水酸基を露出させる工程、及び、当該水酸基に保護基を有するヌクレオチド誘導体を結合させる工程を繰り返し行い、ヌクレオチド鎖を伸長させる方法により行われている。また、オリゴヌクレオチドの合成を行う自動合成装置が市販されている。上記の保護基としてはトリチル基を有するものが使われる場合が多く、オリゴヌクレオチド合成装置は、通常、トリチルモニターと呼ばれる、脱離した保護基の量をモニターする装置を備えている。しかしながら、トリチルモニターは定性的な装置であり、トリチルモニターでオリゴヌクレオチドの合成効率を正確に評価することはできない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Expedite(TM) 8900 Nucleic Acid Synthesis System User's Guide, Part Number 601306, Rev.1, 1997［online］、PerSeptive Biosystems, Inc.、［平成２９年８月９日検索］、インターネット<URL：http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_095582.pdf>
【発明の概要】
【０００４】
本発明の１実施形態は、保護基を有するオリゴヌクレオチド誘導体の前記保護基を脱離させ、オリゴヌクレオチドを生成する第１工程と、前記オリゴヌクレオチドに保護基を有するヌクレオチド誘導体を結合させる第２工程と、を含む、オリゴヌクレオチドの合成反応において、前記オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する方法であって、脱離された前記保護基を定量する第３工程を更に含み、前記第３工程は、脱離された前記保護基を液体クロマトグラフィーで分画し吸光度分析若しくは質量分析により定量する工程であるか、又は脱離された前記保護基をガスクロマトグラフィーで分画し質量分析により定量する工程であり、定量された前記保護基の量が前記オリゴヌクレオチドの合成効率に対応する、方法である。
【０００５】
また、本発明の１実施形態は、保護基を有するオリゴヌクレオチド誘導体の前記保護基を脱離させ、オリゴヌクレオチドを生成する反応部と、脱離された前記保護基を分画する分画部と、分画された前記保護基を定量する検出部と、を備える、オリゴヌクレオチド合成装置である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】（１）〜（１３）はオリゴヌクレオチドアレイの製造方法の一例を示す概略図である。
【図２】（１）〜（１２）はオリゴヌクレオチドアレイの製造方法の一例を示す概略図である。
【図３】オリゴヌクレオチド合成装置の構成を説明する模式図である。
【図４】実験例１における、高速液体クロマトグラフィーによる解析結果を示すグラフである。
【図５】実験例１における、質量分析による解析結果を示すグラフである。
【図６】図４の高速液体クロマトグラフィーの結果に基づいて作成したＤＭＴの検量線である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
［オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する方法］
１実施形態において、本発明は、保護基を有するオリゴヌクレオチド誘導体の前記保護基を脱離させ、オリゴヌクレオチドを生成する第１工程と、前記オリゴヌクレオチドに保護基を有するヌクレオチド誘導体を結合させる第２工程と、を含む、オリゴヌクレオチドの合成反応において、前記オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する方法であって、脱離された前記保護基を定量する第３工程を更に含み、前記第３工程は、脱離された前記保護基を液体クロマトグラフィーで分画し吸光度分析若しくは質量分析により定量する工程であるか、又は脱離された前記保護基をガスクロマトグラフィーで分画し質量分析により定量する工程であり、定量された前記保護基の量が前記オリゴヌクレオチドの合成効率に対応する、方法を提供する。
【０００８】
脱離した保護基は、可視光に吸光を有している場合がある。吸光特性は保護基の化学構造により、例えばジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基の場合、波長約５０４ｎｍの吸光を示す。従来のトリチルモニターでは、これを利用して、波長約５０４ｎｍの光の吸収を測定することにより、脱離した保護基の量を測定している。しかしながら、試料中の水等の夾雑物が、脱離した保護基と反応すると、保護基の吸光特性が変化したり消失したりする場合がある。このため、従来のトリチルモニターでは、オリゴヌクレオチドの合成過程で脱離した保護基の量を正確に評価することはできなかった。
【０００９】
これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、オリゴヌクレオチドの合成過程で脱離させた保護基を正確に定量し、オリゴヌクレオチドの合成効率を正確に評価することができる。
【００１０】
（保護基）
本実施形態の方法において、保護基としては、特に限定されず、例えば、アセチル基（Ａｃ）；ベンゾイル基（Ｂｚ）；トリチル基（Ｔｒ）、モノメトキシトリチル基（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）、トリメトキシトリチル基（ＴＭＴ）等のエーテル系保護基；β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、メトキシメチルエーテル基（ＭＯＭ）、テトラヒドロピラニル基（ＴＨＰ）等のアセタール系保護基；ｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）等のシリルエーテル基等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらの保護基は、保護する官能基が水酸基である場合に用いられる。保護する官能基がアミノ基等である場合も、適宜好適な保護基を選択して用いることができる。
【００１１】
保護基は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。例えば、ヌクレオチド誘導体を結合させる毎に、異なる化学構造を有する保護基を有するヌクレオチド誘導体を使用してもよい。後述する第３工程において、特に質量分析により保護基を定量する場合には、保護基の化学構造を識別し、異なる化学構造の保護基が混在していても各保護基を定量することができる。
【００１２】
（ヌクレオチド誘導体）
本実施形態の方法において、保護基を有するヌクレオチド誘導体は、一般的な核酸合成法に使用されるものであってよい。核酸合成法としては、一例として、ホスホロアミダイト法を挙げることができ、ヌクレオチド誘導体として、ホスホロアミダイト化されたヌクレオチド誘導体を用いることができる。また、ヌクレオチド誘導体の保護基としては、上述したものを例示することができる。
【００１３】
本実施形態の方法により合成効率を評価することができる、オリゴヌクレオチドの合成反応は、特に限定されず、固相合成であってもよく、液相合成であってもよい。
【００１４】
固相としては、例えば、基板やビーズ等を用いることができる。基板を使用する場合、基板の材質としては、例えば、シリコン、ガラス、石英、ソーダ石灰ガラス、ポリアミド樹脂、プラスチックフィルム等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１５】
また、オリゴヌクレオチドの液相合成においては、通常、オリゴヌクレオチドの合成効率をリアルタイムに評価することは困難であるが、本実施形態の方法によればリアルタイムに合成効率を評価することができる。オリゴヌクレオチドの液相合成は、例えば、Ｆｌｕｏｒｏｕｓ  Ｂｉｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＦＢＳ）と呼ばれる反応系を用いて行うことができるが、これに限定されない。
【００１６】
ここで、リアルタイムに合成効率を評価するとは、ヌクレオチドの伸長反応１回毎に又は複数回毎に合成効率を評価できることを意味する。
【００１７】
また、本実施形態の方法によれば、オリゴヌクレオチドの合成だけではなく、オリゴヌクレオチドアレイの合成においても合成効率を評価することができる。オリゴヌクレオチドアレイとは、基板上に、同一の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド分子群が固定された領域（以下、「スポット」という場合がある。）が、複数、アレイ状に配列したものである。通常、各スポットには、それぞれ異なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド分子群が固定されている。
【００１８】
また、保護基によって保護される官能基としては、リボース又はデオキシリボースの５位の炭素に結合する水酸基を挙げることができるが、これに限定されない。本工程で使用可能なヌクレオチド誘導体としては、例えば、ＤＭＴ−ｄＡホスホロアミダイト、ＤＭＴ−ｄＴホスホロアミダイト、ＤＭＴ−ｄＧホスホロアミダイト、ＤＭＴ−ｄＣホスホロアミダイト等を挙げることができるが、これらに限定されない。ヌクレオチド誘導体は、核酸合成用に市販されているものを用いてもよい。また、ヌクレオチド誘導体が由来するヌクレオチドは、ＲＮＡであってもよく、ＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）やＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）等の人工核酸であってもよい。
【００１９】
（第１工程）
本実施形態の方法において、オリゴヌクレオチド誘導体とは、合成途中のオリゴヌクレオチドであって、末端に保護基を有するものをいう。保護基は上述したものと同様のものであり、例えば、酸の作用により脱保護される酸分解性保護基であってよい。
【００２０】
第１工程においては、保護基を有するオリゴヌクレオチド誘導体に、例えば酸を作用させることにより保護基を脱離させ、オリゴヌクレオチドの５’末端に水酸基を生成する。脱離した保護基は後述する第３工程で定量される。本明細書において、「脱離した保護基」とは、脱離した保護基に由来する化合物を意味する。例えば、保護基がＤＭＴ基である場合、脱離した保護基はＤＭＴカチオンである場合がある。この場合、脱離した保護基の定量は、ＤＭＴカチオンを定量することにより行うことができる。
【００２１】
（第２工程）
第２工程においては、脱保護されたオリゴヌクレオチドに保護基を有するヌクレオチド誘導体が結合され、ヌクレオチド鎖が伸長するとともに、末端に保護基を有するオリゴヌクレオチド誘導体が再度形成される。
【００２２】
第２工程は、未反応の官能基をアセチル化等によりキャッピングし、以降のサイクルに関与しないようにする工程や、オリゴヌクレオチドと末端のヌクレオチド誘導体との結合部分を酸化して、３価のリンから５価のリン酸エステルに変換する工程等を更に有していてもよい。第１工程と第２工程を繰り返すことにより、オリゴヌクレオチドが伸長する。
【００２３】
（第３工程）
第３工程においては、脱離された保護基を分画して定量する。従来のトリチルモニターでは、保護基を含む混合物である廃液をそのまま吸光度分析することにより、保護基の量を測定していた。これに対し、本実施形態の方法では、保護基を含む廃液を分画し分析する点が異なっている。
【００２４】
実施例において後述するように、発明者らは、廃液を分画することにより保護基の量を正確に定量することができることを明らかにした。
【００２５】
分画は、液体クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーにより行うことができる。保護基を含む廃液を液体クロマトグラフィーで分画した場合、保護基の測定は吸光度分析で行うこともできるし、蛍光分光計で行うこともできるし、示差屈折率計で行うこともできるし、質量分析で行うこともできるし、いずれかを併用することもできる。
【００２６】
吸光度分析の波長は、保護基の化学構造により異なるが、上述した保護基の場合、可視光では波長約４５０〜６００ｎｍであると測定できる場合が多い。また、波長１９０〜２８０ｎｍの光で吸光度分析を行うと、より正確に保護基を定量できる傾向にある。
【００２７】
また、保護基を含む廃液をガスクロマトグラフィーで分画した場合、保護基の測定は質量分析により行うことが現実的である。
【００２８】
以上の第１工程及び第２工程と、第３工程とを繰り返すことにより、オリゴヌクレオチドを合成するとともに、その効率をリアルタイムに評価することができる。なお、第１工程及び第２工程と、第３工程との順序は特に限定されない。例えば、第１工程と第２工程を繰り返す各サイクルにおいて、第２工程と第３工程を並行して行ってもよい。また、第１工程と第２工程の１サイクルの時間と、第３工程の１サイクルの時間が異なっていてもよい。
【００２９】
（合成効率）
第３工程で定量された保護基の量がオリゴヌクレオチドの合成効率に対応する。例えば、下記式（１）により、オリゴヌクレオチドの合成効率を算出することができる。合成効率は、第１工程を実施する毎に算出することができる。また、オリゴヌクレオチドの合成効率は、保護基の脱離効率といいかえることもできる。
合成効率（％）＝定量された保護基の量／脱離前の保護基の総量×１００  …（１）
【００３０】
ここで、脱離前の保護基の総量としては、予め測定した値を使用してもよいし、計算による予測値を使用してもよい。あるいは、１サイクル前の第３工程で定量された保護基の量を、脱離前の保護基の総量とみなしてもよい。すなわち、オリゴヌクレオチドへのヌクレオチド誘導体の結合効率が１００％であると仮定すると、１サイクル前に定量された保護基の量は、合成中のオリゴヌクレオチドに結合した、保護基を有するヌクレオチド誘導体の量と同量になる。
【００３１】
［オリゴヌクレオチドアレイの製造方法］
以下、具体的なオリゴヌクレオチドアレイの製造において、オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する方法を説明するが、本実施形態の方法は、以下の例に限定されるものではない。
【００３２】
オリゴヌクレオチドアレイの製造は、例えば、（ａ）保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された基板上に、露光により酸を発生する光酸発生剤（ＰＡＧ）を含有する層（ＰＡＧ層）を形成する工程と、（ｂ）ＰＡＧ層の所望の位置を露光する工程と、（ｃ）露光後のＰＡＧ層を除去する工程と、（ｄ）除去した廃液中に含まれる保護基を分画して定量する工程と、（ｅ）ＰＡＧ層を除去した基板を、保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程と、を含んでいてもよい。
【００３３】
ここで、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）が、上述したオリゴヌクレオチドの合成効率を評価する方法における第１工程に相当し、（ｄ）が第３工程に相当し、（ｅ）が第２工程に相当する。
【００３４】
ＰＡＧ層は、例えば、ＰＡＧを含有するポジ型レジスト組成物であってもよいし、ＰＡＧを含有する樹脂組成物、又は溶液であってもよい。
【００３５】
図１（１）〜（７）に基づいて、本実施形態の製造方法の一例を説明する。まず、図１（１）に示すように、保護基で保護された官能基を有する分子が固定された基板１を準備する。図１（１）の例では、保護基で保護されている官能基は、水酸基（−ＯＨ）である。また、図中、「ＰＧ」は、酸分解性保護基である。次に、図１（２）に示すように、光酸発生剤（Ｐｈｏｔｏ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ：ＰＡＧ）を含有する樹脂組成物を用いてＰＡＧ層２を形成する。その後、図１（３）に示すように、ＰＡＧ層２に対してパターン露光を行う。これにより、露光された部分のＰＡＧ層中のＰＡＧが酸を発生し、図１（４）に示すように、露光された部分３のＰＡＧ層２の下層の酸分解性保護基が脱保護される。図１（４）には脱保護された酸分解性保護基４を示す。
【００３６】
次に、露光後のＰＡＧ層２を、基板１上から除去する。ＰＡＧ層２は、適切な溶媒で溶解させる等の方法により除去することができる。ＰＡＧ層２を溶解後の廃液は、保護基を含んでいる。この廃液を分画し、保護基を定量する。廃液の分画及び定量は上述した通りに行う。保護基の定量値に基づいてオリゴヌクレオチドの合成効率を求めることができる。
【００３７】
図１（５）はＰＡＧ層２及び脱離した保護基が除去された状態を示す。続いて、図１（６）に示すように、保護基を有するヌクレオチド誘導体５を作用させる。なお、図１（６）の例では、ヌクレオチド誘導体５は、アデニンヌクレオチド誘導体である。ヌクレオチド誘導体５は、脱保護された官能基と反応し、図１（７）に示すように、前記官能基を介して基板１上に保持される。以下、各工程の詳細を説明する。
【００３８】
（ＰＡＧ層形成工程）
工程（ａ）は、ＰＡＧ層を形成する工程である。工程（ａ）では、まず、図１（１）に示されるように、保護基（ＰＧ）で保護された官能基を有する分子が固定化された基板１を準備する。基板１としては、オリゴヌクレオチドアレイの基板として上述したものと同様のものを使用することができる。
【００３９】
酸分解性保護基としては、上述した保護基を使用することができる。本実施形態においては、基板上に固定化された分子の官能基が、酸分解性保護基で保護されている。官能基は、特に限定されず、後述するヌクレオチド誘導体と結合できるものであればよい。一例として、官能基として、水酸基を挙げることができる。
【００４０】
酸分解性保護基で保護された官能基を有する分子が固定化された基板を準備する方法は特に限定されず、例えば、基板表面に有機シラン化合物分子を固定し、該有機シラン化合物分子に酸分解性保護基を有する分子を結合させることによって行うことができる。基板表面に有機シラン化合物を固定する方法としては、例えば、酸素ガス等で基板表面のプラズマ処理を行った後、水又はエタノール中で有機シラン化合物を反応させることが挙げられる。有機シラン化合物としては、例えば、ヒドロキシアルキルシラン、ヒドロキシアルキルアミドシラン、ヒドロキシグリコールシラン等を挙げることができる。例えば、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド）等を用いることができる。
【００４１】
例えば、基板をプラズマ処理した後、有機シラン化合物溶液に浸漬して、７０〜１２０℃程度で５〜４０分程度加熱した後、イソプロパノール等の有機溶媒に浸漬して洗浄するとよい。なお、洗浄の際には、超音波処理を行ってもよい。洗浄後、基板を乾燥し、１００〜１４０℃程度で１〜１０分程度加熱することにより、有機シラン化合物分子を基板に固定することができる。
【００４２】
続いて、基板に固定化された有機シラン化合物分子に、酸分解性保護基を有する分子を反応させる。酸分解性保護基を有する分子としては、例えば、酸分解性保護基を有するホスホロアミダイトヌクレオチド、５’又は３’の水酸基を酸分解性保護基で保護したヌクレオチド等、核酸人工合成法として知られるホスホロアミダイト法やリン酸エステル法に適用可能な核酸モノマー等を挙げることができる。そのような分子としては、一例として、ＤＭＴ−ホスホロアミダイトヌクレオチドを挙げることができる。例えば、有機シラン化合物を固定化した基板を、酸分解性保護基を有するホスホロアミダイトヌクレオチド溶液に浸漬し、１〜１５分程度揺動することにより、酸分解性保護基を有する分子を基板表面に固定化することができる。当該反応は、禁水条件下で行ってもよい。反応後、適宜アセトニトリル等の有機溶媒で洗浄してもよい。なお、上記の例では、有機シラン化合物分子に酸分解性保護基を有する分子を結合させたが、有機シラン化合物分子を直接酸分解性保護基で保護してもよい。
【００４３】
続いて、基板上に、ＰＡＧ層を形成する。図１（２）の例ではＰＡＧと、当該ＰＡＧに酸を発生させる波長の光を透過する樹脂と、を含有する樹脂組成物を用いてＰＡＧ層２を形成している。しかしながら、ＰＡＧ層の形成方法はこれに限られず、例えばＰＡＧを含有するポジ型レジスト組成物を用いてレジスト膜を形成してもよい。
【００４４】
ポジ型レジスト組成物は、露光により現像液に対する溶解性が増大するレジスト組成物である。本実施形態の方法において、使用可能なポジ型レジスト組成物は、特に限定されない。フォトリソグラフィーに一般的に使用されるものを、特に制限なく、使用することができる。
【００４５】
ポジ型レジスト組成物は、ｇ線、ｈ線、ｉ線等の紫外線用、ＡｒＦエキシマレーザー、ＫｒＦエキシマレーザー等のエキシマレーザー用、極紫外線（ＥＵＶ）用、真空紫外線（ＶＵＶ）用、電子線（ＥＢ）用、Ｘ線用等であってもよい。一例として、ポジ型レジスト組成物は、ｉ線用のものであることができる。ポジ型レジスト組成物の例としては、例えば、ノボラック樹脂を含むノボラック系レジスト組成物、アクリル樹脂を含むアクリル系レジスト組成物等を挙げることができる。
【００４６】
ポジ型レジスト組成物は、市販のものを用いてもよい。例えば、ｉ線用ノボラック系レジスト組成物の市販品の例としては、スミレジスト（登録商標）（住友化学社製）、ＰＦＲシリーズ（ＪＳＲ社製）、ＯＦＰＲシリーズ（東京応化社製）等を挙げることができる。
【００４７】
基板上に、ポジ型レジスト組成物を用いてレジスト膜を形成する方法は、特に限定されず、レジスト膜の形成に一般的に用いられる方法を使用すればよい。レジスト膜の形成方法としては、例えば、スピンコート法、ディップコート法、スリットダイコート法、スプレーコート法等を挙げることができる。固相上に形成するレジスト膜の膜厚は、特に限定されず、例えば、５０ｎｍ〜３０μｍ、８０ｎｍ〜２５μｍ、１００ｎｍ〜２０μｍ程度とすることができる。
【００４８】
なお、レジスト膜の形成後、露光前ベーク（プリベーク）は行ってもよく、行わなくてもよい。プリベークを行う場合、一例として、９０℃でプリベークを行ってもよい。また、レジスト膜をより低温に維持し、レジスト膜における熱的架橋反応を抑制するために、プリベークを行わないようにしてもよい。
【００４９】
ＰＡＧは、露光により酸を発生する分子である。本実施形態の製造方法において、ＰＡＧは、特に限定されず、レジスト組成物などに一般的に用いられるものを使用することができる。ＰＡＧとしては、スルホニウム塩、ヨードニウム塩等のオニウム塩、ジアゾメタン、スルホン酸エステル等が挙げられる。ジアゾメタンやスルホン酸エステル等のノニオン系よりも、オニウム塩等のイオン系の方が、強い酸を生成することができる。一例として、ＰＡＧは、オニウム塩である。オニウム塩としては、トリフルオロメタンスルホン酸トリフェニルスルホニウム等のスルホニウム塩、パーフルオロプロパンスルホン酸ジフェニルヨードニウム等のヨードニウム塩等が挙げられる。そのようなオニウム塩から生成される酸としては、フルオロアンチモネート（ＳｂＨＦ６）、ＦＡＰ（フルオロアルキルフォスフェート）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＣＦ３ＳＯ３Ｈ：ＴｆＯＨ）、パーフルオロプロパンスルホン酸等が挙げられる。本実施形態の製造方法に用いるＰＡＧが生成する酸は、一例として、酸解離定数（ｐＫａ）が−３０〜５程度である。また、一例として、ｐＫａが−２５〜０である。さらに、ＰＡＧは、溶媒に対する溶解度が約１質量％以上のものを用いることができるが、溶解度がより高いものを用いてもよい。ＰＡＧとして、例えば、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）に対する溶解度が、３０質量％以上、４０質量％以上、又は５０質量％以上のものを用いてもよい。ＰＡＧは、レジスト用などに市販されているものを使用することもできる。一例として、サンアプロ社のＣＰＩ（登録商標）シリーズのＰＡＧを使用することができ、ＣＰＩ−２１０Ｓを例示することができる。
【００５０】
ＰＡＧに酸を発生させる波長の光を透過する樹脂は特に限定されない。前記光を透過する樹脂を用いることにより、樹脂組成物を露光した場合に樹脂組成物中のＰＡＧに前記波長の光が到達し、ＰＡＧが酸を発生する。ＰＡＧに酸を発生させる波長の光を透過する樹脂（以下、「光透過性樹脂」という。）は、ＰＡＧの種類に応じて、適宜選択すればよい。光透過性の高い透明な樹脂であれば、一般的なＰＡＧに酸を発生させる波長の光を透過するため、光透過性樹脂には、透明な樹脂を使用することができる。そのような樹脂としては、例えば、ポリウレタン樹脂；ポリメタクリル酸メチル樹脂等のアクリレート樹脂；イミド樹脂；アミド樹脂；スルホン樹脂；ビニル樹脂；シリコーン樹脂；ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン樹脂；ポリスチレン；ポリカーボネート；ポリエステルテレフタラート等のポリエステル；エポキシ樹脂；多糖やポリオール等の親水性樹脂；パーフルオロエーテル等の撥水性樹脂等を挙げることができるが、これらに限定されない。成膜後の樹脂組成物中のＰＡＧが酸を生成するものであれば、ＰＡＧと光透過性樹脂とは相溶する組み合わせでも分散する組み合わせでもよい。
【００５１】
光透過性樹脂は、市販のものを用いてもよい。例えば、ポリウレタン樹脂の市販品としては、ＲｕｓＰａｃｋ（株式会社オーデック）等を例示することができる。光透過性樹脂は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００５２】
樹脂組成物は、ＰＡＧ及び光透過性樹脂以外の、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、例えば、溶剤、樹脂製品の調製に一般的に使用される添加剤等を例示することができる。樹脂内を塩基性〜中性に保つための塩基性物質や界面活性剤等を添加することもできる。ＰＡＧから発生する酸の熱拡散を抑制する目的として、塩基性物質を添加することもできる。塩基性物質として、例えば、アルキルアミン等を添加してもよい。また、ＰＡＧから発生する酸の界面脱保護反応を抑制しなければ、樹脂組成物の離形性を高めるための添加剤を添加してもよい。例えば、シリコーン系離型剤を添加してもよい。
【００５３】
樹脂組成物は、例えば、ＰＡＧと光透過性樹脂とを溶剤に溶解し、適宜他の成分を添加して撹拌することにより調製することができる。溶剤は、ＰＡＧ及び光透過性樹脂の種類に応じて、適宜選択すればよい。溶剤は、一般的に使用される有機溶剤等を用いることができる。溶剤としては、例えば、エタノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール、ベンジルアルコール等のアルコール系溶剤；プロピレングリコールモノエチルエーテル（ＰＧＭＥ）、ＰＧＭＥＡ等のエーテル系溶剤；アセトン、シクロヘキサンなどのケトン系溶剤；酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶剤；トルエン、キシレン、シクロヘキサン等の炭化水素系溶剤等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、溶剤は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上の混合溶剤であってもよい。
【００５４】
樹脂組成物において、ＰＡＧの含有量は特に限定されないが、例えば、光透過性樹脂１００質量部に対して、０．００５〜２０質量部、０．５〜１５質量部、１〜１０質量部等とすることができる。
【００５５】
また、樹脂組成物における光透過性樹脂の含有量は特に限定されず、例えば、樹脂組成物１００質量％に対して、０．１〜７０質量％、０．５〜６０質量％、１〜５０質量％等とすることができる。樹脂組成物中の光透過性樹脂の含有量を少なくすると、膜厚の薄いＰＡＧ層を形成することができる。
【００５６】
樹脂組成物を用いたＰＡＧ層の形成は、レジスト膜の形成等に一般的に用いられる方法で行えばよい。ＰＡＧ層の形成には、例えば、スピンコート法、ディップコート法、スリットダイコート法、スプレーコート法等を用いることができる。前記のような方法で成膜した後、加熱等を行って膜を乾燥してもよい。
【００５７】
ＰＡＧ層の膜厚は特に限定されず、例えば、１０〜２００００ｎｍ程度、３０〜１００００ｎｍ程度とすることができる。膜厚が薄くなるほど、より微細なオリゴヌクレオチドアレイを製造することができる。一方、膜厚が厚くなると、剥離によりＰＡＧ層を除去することができる。剥離可能な膜厚は、光透過性樹脂の種類により異なるが、例えば１０００ｎｍ以上を挙げることができる。したがって、オリゴヌクレオチドアレイの微細化の程度に応じて、適宜膜厚を選択すればよい。
【００５８】
（露光工程）
工程（ｂ）は、上記工程（ａ）で形成したＰＡＧ層２の所望の位置を露光する工程である。図１（３）に示すように、ＰＡＧ層２に対してパターン露光を行うと、露光部分のＰＡＧ層２に含まれるＰＡＧから酸（Ｈ＋）が生成する。この酸により、ＰＡＧ層２の下層に存在する酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護され、保護基で保護されていた官能基が露出する。なお、図１（４）は、露光後のＰＡＧ層２を示している。図１（４）では、ＰＡＧ層２の露光部分３において酸が生成しており、その下層の酸分解性保護基が脱保護されて、官能基（−ＯＨ）が露出している。
【００５９】
工程（ｂ）における露光は、ＰＡＧの種類に応じて、ｇ線、ｈ線、ｉ線、ＡｒＦエキシマレーザー、ＫｒＦエキシマレーザー、ＥＵＶ、ＶＵＶ、ＥＢ、Ｘ線等を放射する適切な光源を用いて行うことができる。例えば、ＡｒＦ用ＰＡＧを用いた場合には、ＡｒＦエキシマレーザーを用いて露光することができる。また、ｉ線用ＰＡＧを用いた場合には、ｉ線を用いて露光することができる。
【００６０】
工程（ｂ）における露光において、露光量は特に限定されないが、例えば、１０〜６００ｍＪ／ｃｍ２、又は５０〜２００ｍＪ／ｃｍ２とすることができる。アフィメトリクス型のＤＮＡマイクロアレイの作製方法では、感光性塩基の脱保護のために数Ｊ以上が必要であり、本実施形態の製造方法では、アフィメトリクス型の方法と比較して、少ない露光量で核酸アレイの製造を行うことができる。
【００６１】
露光は、後述する酸分解性保護基を有するヌクレオチド誘導体との接触工程において、当該ヌクレオチド誘導体を結合させたい位置のＰＡＧ層２に対してのみ行う。このようなパターン露光を行うことにより、露光した部分のＰＡＧ層２に位置する酸分解性保護基のみが脱保護され、未露光部分の酸分解性保護基は脱保護されずに維持される。このようなパターン露光には、例えば、フォトマスク等を用いて行う方法、レンズやミラー等の光学系を用いたプロジェクション露光、空間光変調素子、レーザービームなどを用いたマスクレス露光等の手段を用いることができる。
【００６２】
（ＰＡＧ層除去工程）
工程（ｃ）は、上記工程（ｂ）で露光した露光後のＰＡＧ層を除去する工程である。ＰＡＧ層の除去の方法は、特に限定されないが、ＰＡＧ層を溶剤を用いて溶解させる方法等を例示することができる。
【００６３】
溶剤を用いてＰＡＧ層を溶解する場合、樹脂組成物に含有される光透過性樹脂の種類に応じて、当該光透過性樹脂を溶解可能な溶剤を適宜選択して、ＰＡＧ層を溶解すればよい。溶剤としては、アセトン、イソプロピルアルコール等を例示できるが、これらに限定されない。また、溶解効果を高めるために、溶解操作中に、基板に対して超音波照射を行ってもよい。
【００６４】
ＰＡＧ層の溶解後は、固相上に残存するＰＡＧ層の残渣を除去するため、固相の洗浄を行ってもよい。洗浄は、適切な有機溶剤等を用いて行えばよく、そのような溶剤としては、アセトン、イソプロピルアルコール等を例示することができる。また、洗浄効果を高めるために溶剤蒸気を用いたベーパー洗浄を行ってもよい。また、洗浄効果を高めるために、洗浄操作中に、基板に対して超音波照射を行ってもよい。
【００６５】
（保護基の分画及び定量）
工程（ｄ）は、ＰＡＧ層の溶解液及び洗浄液等の廃液を分画して脱離された保護基を定量する工程である。分画及び定量は上述したようにして行うことができる。その結果、定量された保護基の量に基づいてオリゴヌクレオチドの合成効率を評価することができる。
【００６６】
例えば、オリゴヌクレオチドの合成効率が十分に高い場合には、製造したオリゴヌクレオチドの品質が高いと保証することができる。また、オリゴヌクレオチドの合成効率が低い場合には、その段階でオリゴヌクレオチドの製造を中止し、試薬のロスを最低限に抑制することができる。あるいは、例えば、保護基の脱離反応をやり直し、オリゴヌクレオチドの合成を継続することを選択することもできる。
【００６７】
（ヌクレオチド誘導体反応工程）
工程（ｅ）は、上記工程（ｃ）でＰＡＧ層を除去した固相を、保護基を有するヌクレオチド誘導体と接触させる工程である。保護基を有するヌクレオチド誘導体としては、上述したものを用いることができる。図１（６）及び（７）に示されるように、酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体５を、ＰＡＧ層２除去後の固相１に接触させると、脱保護により露出した官能基（−ＯＨ）とカップリングして結合する。これにより、固相１上の所望の位置において、所望の配列のオリゴヌクレオチドを合成することができる。これらの反応は公知であり、公知の条件で反応を行うことができる。また、これらの反応に用いる試薬は、市販のものを用いることができる。なお、上記の方法は、固相上の官能基とヌクレオチド誘導体との結合方法の一例であり、他の方法により結合反応を行ってもよい。
【００６８】
ヌクレオチド誘導体との反応を行う前に、固相は、乾燥させておいてもよい。乾燥には、例えば、乾燥アセトニトリルや窒素フロー等を使用することができる。また、固相上の官能基とヌクレオチド誘導体との結合反応は、禁水条件下で行ってもよい。
【００６９】
（オリゴヌクレオチドの伸長）
工程（ａ）〜工程（ｅ）を任意の回数繰り返すことにより、基板上でオリゴヌクレオチドの伸長を行い、所望の配列及び塩基長を有するオリゴヌクレオチドアレイを製造することができる。
【００７０】
例えば、ＤＮＡアレイを製造する場合には、アデニン、チミン、シトシン、及びグアニンを塩基としてそれぞれ有する４種類のヌクレオチド誘導体を使用して、工程（ａ）〜工程（ｅ）を繰り返すことにより、任意の配列及び塩基長を有するＤＮＡを基板１上で合成し、ＤＮＡアレイを製造することができる。
【００７１】
以下、基板上でのＤＮＡの合成例について、図１（１）〜（１３）及び図２（１）〜（１２）を参照して説明する。
【００７２】
図１（１）〜（７）は、１巡目の工程（ａ）〜（ｅ）を示す。詳細は、上述した通りである。図１（１）〜（７）では、ヌクレオチド誘導体５として、アデニンヌクレオチド誘導体を固相１上の官能基（−ＯＨ）に結合している。アデニンヌクレオチド誘導体は、標識原子で標識されていてもよい。
【００７３】
図１（８）〜（１３）は、２巡目の工程（ａ）〜（ｅ）を示す。図１（８）では、１巡目の工程（ａ）〜（ｅ）でアデニンヌクレオチド誘導体が結合された固相１に対して、再度ＰＡＧ層２の形成を行っている（工程（ａ））。図１（９）では、ＰＡＧ層２に対して１巡目とは異なる位置に露光を行っており、これにより露光された部分のＰＡＧ層２中のＰＡＧが酸を発生し、図１（１０）に示すように、露光された部分のＰＡＧ層３の下層の酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護される（工程（ｂ））。図１（１０）には脱保護された酸分解性保護基４を示す。次に、図１（１１）に示すように、露光後のＰＡＧ層２を除去する（工程（ｃ））。
【００７４】
続いて、ＰＡＧ層２の除去及び洗浄に用いた廃液中に含まれる保護基を分画及び定量し、オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する（工程（ｄ））。図１（１１）はＰＡＧ層２及び脱離した保護基が除去された状態を示す。続いて、図１（１２）に示すように、ＰＡＧ層２を除去した基板１を酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体５と接触させる（工程（ｅ））。図１（１２）の例では、ヌクレオチド誘導体５として、チミジンヌクレオチド誘導体を、基板１上の官能基（−ＯＨ）に作用させている。その結果、図１（１３）に示すように、基板１上の官能基（−ＯＨ）にチミジンヌクレオチド誘導体が結合する。
【００７５】
図２（１）〜（６）は、３巡目の工程（ａ）〜（ｅ）を示す。図２（１）では、１巡目でアデニンヌクレオチド誘導体、２巡目でチミジンヌクレオチド誘導体が結合された基板１に対して、再度ＰＡＧ層２の形成を行っている（工程（ａ））。図２（１）では、ＰＡＧ層２に対して１巡目及び２巡目とは異なる位置に露光を行っており、これにより露光された部分のＰＡＧ層２中のＰＡＧが酸を発生し、図２（３）に示すように、露光された部分のＰＡＧ層３の下層の酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護される（工程（ｂ））。図２（３）には脱保護された酸分解性保護基４を示す。次に、図２（４）に示すように、露光後のＰＡＧ層２を除去する（工程（ｃ））。
【００７６】
続いて、ＰＡＧ層２の除去及び洗浄に用いた廃液中に含まれる保護基を分画及び定量し、オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する（工程（ｄ））。図２（４）はＰＡＧ層２及び脱離した保護基が除去された状態を示す。続いて、図２（５）に示すように、ＰＡＧ層２を除去した基板１を酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体５と接触させる（工程（ｅ））。図２（５）の例では、ヌクレオチド誘導体５として、グアニンヌクレオチド誘導体を、固相１上の官能基（−ＯＨ）に作用させている。その結果、図２（６）に示すように、固相１上の官能基（−ＯＨ）にグアニンヌクレオチド誘導体が結合する。
【００７７】
図２（７）〜（１２）は、４巡目の工程（ａ）〜（ｄ）を示す。図２（７）では、１巡目でアデニンヌクレオチド誘導体、２巡目でチミジンヌクレオチド誘導体、３巡目でグアニンヌクレオチド誘導体が結合された固相１に対して、再度ＰＡＧ層２の形成を行っている（工程（ａ））。図２（８）では、ＰＡＧ層２に対して１巡目乃至３巡目とは異なる位置に露光を行っており、これにより露光された部分のＰＡＧ層２中のＰＡＧが酸を発生し、図２（９）に示すように、露光された部分のＰＡＧ層２の下層の酸分解性保護基（ＰＧ）が脱保護される（工程（ｂ））。図２（９）には脱保護された酸分解性保護基４を示す。次に、図２（１０）に示すように、露光後のＰＡＧ層２を除去する（工程（ｃ））。
【００７８】
続いて、ＰＡＧ層２の除去及び洗浄に用いた廃液中に含まれる保護基を分画及び定量し、オリゴヌクレオチドの合成効率を評価する（工程（ｄ））。図２（１０）はＰＡＧ層２及び脱離した保護基が除去された状態を示す。続いて、図２（１１）に示すように、ＰＡＧ層２を除去した固相１を酸分解性保護基（ＰＧ）を有するヌクレオチド誘導体５と接触させる（工程（ｅ））。図２（１１）の例では、ヌクレオチド誘導体５として、シトシンヌクレオチド誘導体を、固相１上の官能基（−ＯＨ）に作用させている。その結果、図２（１２）に示すように、固相１上の官能基（−ＯＨ）にシトシンヌクレオチド誘導体が結合する。
【００７９】
上記のようにして、図１及び図２の例では、工程（ａ）〜（ｅ）を４回繰り返すことにより、１段目のヌクレオチドを固相１に結合させている。同様にして、工程（ａ）〜（ｅ）をさらに４回繰り返すことにより、１段目のヌクレオチドに対して、２段目のヌクレオチドを結合させることができる。同様にして、工程（ａ）〜（ｅ）をさらに４回繰り返すことにより、２段目のヌクレオチドに対して、３段目のヌクレオチドを結合させることができる。このように、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンの各ヌクレオチド誘導体を各回で用いる４回の工程（ａ）〜（ｅ）を１セットとして、当該セットを所望の回数行うことにより、所望の塩基長の配列を基板１上に合成することができる。例えば、前記セットを１０回行うことにより、１０塩基のＤＮＡを基板１上に合成することができる。
【００８０】
このように、工程（ａ）〜（ｅ）を任意の回数繰り返すことにより、基板１上の所望の位置に、所望の配列を有する核酸を合成することができる。このようにして、基板１上に、任意の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、オリゴヌクレオチドアレイを製造することができる。
【００８１】
なお、図１及び図２の例では、アデニン、チミン、グアニン、シトシンの順にヌクレオチド誘導体を反応させているが、ヌクレオチド誘導体を反応させる順序はこれに限定されず、これらのヌクレオチド誘導体を任意の順序で反応させることができる。また、ヌクレオチド誘導体を反応させる順序は、各セット間で同じである必要はなく、セット毎に異なる順序でヌクレオチド誘導体を反応させてもよい。
【００８２】
また、上記説明した例では、基板上で１段ずつヌクレオチドを伸長させているが、必ずしも１段ずつヌクレオチドを伸長させる必要はない。例えば、１巡目でアデニンヌクレオチド誘導体を用い、２巡目でチアミンヌクレオチド誘導体を用いる場合、１巡目と２巡目で一部重複する位置を露光し、１巡目と２巡目の露光が重複する位置にアデニン−チミンの塩基配列を有するジヌクレオチド誘導体を結合させてもよい。
【００８３】
［オリゴヌクレオチド合成装置］
１実施形態において、本発明は、保護基を有するオリゴヌクレオチド誘導体の前記保護基を脱離させ、オリゴヌクレオチドを生成する反応部と、脱離された前記保護基を分画する分画部と、分画された前記保護基を定量する検出部と、を備える、オリゴヌクレオチド合成装置を提供する。
【００８４】
上述したように、従来のトリチルモニター等の装置では、オリゴヌクレオチドの合成過程で脱離させた保護基の量を正確に評価することはできない。これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の合成装置によれば、オリゴヌクレオチドの合成過程で脱離させた保護基を正確に定量し、オリゴヌクレオチドの合成効率を正確に評価することができる。
【００８５】
図３は、本実施形態のオリゴヌクレオチド合成装置１００の構成を説明する模式図である。オリゴヌクレオチド合成装置１００は、反応部１１０と、分画部１２０と、検出部１３０とを備える。
【００８６】
反応部１１０は、保護基を有するオリゴヌクレオチド誘導体の前記保護基を脱離させ、オリゴヌクレオチドを生成する。反応部１１０では、保護基の脱離のほか、オリゴヌクレオチドにヌクレオチド誘導体を結合させる反応等も行われる。
【００８７】
反応部１１０で形成された、脱離基を含む廃液は分画部１２０に導入され分画される。分画部１２０は液体クロマトグラフィー装置又はガスクロマトグラフィー装置である。
【００８８】
検出部１３０は、分画された保護基を定量する。分画部１２０が液体クロマトグラフィー装置である場合には、検出部１３０は吸光度分析装置又は質量分析装置である。また、分画部１２０がガスクロマトグラフィー装置である場合には、検出部１３０は質量分析装置である。検出部１３０を通過した試料は廃液として処分される。
【００８９】
オリゴヌクレオチド合成装置１００は、試薬導入部１４０を更に備えていてもよい。試薬導入部１４０は、各種の薬液や不活性ガス等を反応部１１０に供給する。また、オリゴヌクレオチド合成装置１００は、反応部１１０と分画部１２０との間にスプリッター１５０を更に備えていてもよい。
【００９０】
スプリッター１５０は、反応部１１０から排出された廃液のうち、分画部１２０に導入する廃液の量を調節する。すなわち、反応部１１０から排出された廃液の全量を分画部１２０に導入して保護基を定量してもよいし、反応部１１０から排出された廃液の一部のみを分画部１２０に導入して保護基を定量してもよい。
【００９１】
また、スプリッター１５０は、保護基を含まない廃液を分画部１２０に導入しないように作動してもよい。例えば、反応部１１０にヌクレオチド誘導体を導入する工程における廃液は、脱離された保護基を含まないため、分画部１２０に導入しなくてもよい。
【００９２】
オリゴヌクレオチド合成装置１００は、試薬導入部１４０、反応部１１０、スプリッター１５０、分画部１２０、検出部１３０等を自動制御するための信号を伝える配線１６０や、自動制御するプログラムを動作させるＣＰＵ１７０等を更に備えていてもよい。そして、例えば、検出部１３０で検出された保護基の量が、予定される量と比較して低かった場合等に、オリゴヌクレオチド合成装置１００の管理者にエラーメッセージを送信する等の動作を行うように構成されていてもよい。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９４】
［実験例１］
ＤＭＴの検量線を作成した。ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−ｄＴホスホロアミダイト（ＤＭＴ−ｄＴ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を、２ｗｔ％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有するアセトニトリル溶液に溶解させてＤＭＴ基を脱離させたものを標準試料とした。標準試料は、ＤＭＴ−ｄＴの濃度１．３μＭ〜１３４．３μＭの範囲で２０水準調製した。
【００９５】
（保護基の定量）
続いて、上記の各標準資料を高速液体クロマトグラフィー−質量分析装置（「ＬＣ２０３０−ＬＣＭＳ２０２０」、島津製作所）に供して分画し、波長２５４ｎｍの吸光度を測定した。エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ；Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）四重極型質量分析によりＤＭＴ（ｍ／ｚ＝３０３）を定性することで、同保持時間（５．５ｍｉｎ）の成分をＤＭＴと同定し、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器を用いて波長２５４ｎｍにおける吸収面積百分率法で定量を行った。
高速液体クロマトグラフィーの条件は次の通りであった。
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
インジェクション容量：０．５μＬ
カラム：型式「ＸＲ−ＯＤＳ」、粒子径２．２μｍ、内径２ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、島津製作所
移動相：アセトニトリル：ギ酸アンモニウム水溶液（ＡＦ、５ｍＭ）＝６０：４０
検出波長：１９０〜８００ｎｍ
【００９６】
図４は、２０水準の標準試料の高速液体クロマトグラフィーによる解析結果のうち、１０個（サンプル１〜１０という。）の結果を示すグラフである。下記表１にサンプル１〜１０のＤＭＴ−ｄＴの濃度を示す。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
図４中、横軸は保持時間を示し、縦軸は吸光度（相対値）を示す。高速液体クロマトグラフィー装置は質量分析装置に接続されており、分画された試料の質量分析も行った。その結果、保持時間約５．５分に脱離した保護基であるＤＭＴのピークを検出することができた。また、保持時間約５．５分のピークがＤＭＴであることは質量分析の結果からも確認された。
【００９９】
図５は、質量分析の代表的な結果を示すグラフである。図５中、横軸はｍ／ｚ値を示し、縦軸はシグナル強度（相対値）を示す。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝３０３にピークが確認され、ＤＭＴが検出されたことが確認された。また、この結果は、ＤＭＴ以外の保護基を混在して使用した場合であっても、保護基を識別して定量することができることを示す。
【０１００】
また、図６は、上述したサンプル１〜１０を含む、２０水準の標準試料の解析結果から作成したＤＭＴの検量線である。横軸は高速液体クロマトグラフィーで測定されたピークの面積（相対値）を示し、縦軸はＤＭＴの濃度（μＭ）を示す。その結果、高速液体クロマトグラフィーで分画して波長２５４ｎｍの吸光度で検出することにより、脱離した保護基を正確に定量することができることが明らかとなった。
【０１０１】
以下の検討では、図６の結果に基づいて、ＤＭＴ濃度ｙ＝０．００３６×面積ｘ（相関係数Ｒ＝０．９９９４）の検量線を用いた。
【０１０２】
［実験例２］
基板上に保護基を有するヌクレオチド誘導体を結合させた。続いて、当該保護基を脱離させて定量した。
【０１０３】
（基板上でのリンカー層の形成及び保護基の導入）
まず、ビーカーに、シランカップリング剤（Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド、Ｇｅｌｅｓｔ社製）を１５０ｍｇ秤量し、９０℃に加温した１５０ｍＬのイオン交換水を加えた。９０℃で５分間撹拌した後、１．５ｍＬの酢酸を添加し、さらに３０分間加熱撹拌してシラン溶液を作成した。
【０１０４】
次に、基板となる石英ウエハーを大気圧酸素プラズマ装置（ＹＡＰ５１０；ヤマト科学社製）で４００Ｗ×３回処理し活性化させた後、反応容器に入れ、上記シラン溶液を加えて設定温度９０℃で２０分間加熱を行った。
【０１０５】
続いて、１２０℃で１０分間更に加熱を行うことにより、シランを基板に定着させてリンカー層の形成を行った。加熱後、容器から基板を取り出し、イソプロパノール（ＩＰＡ）に浸漬して、２８ｋＨｚ超音波洗浄を５分間行った後、窒素フローで乾燥した。
【０１０６】
次に、酸素濃度０．０％、湿度３．３％以下の窒素雰囲気に制御したグローブボックス内にて、以下の作業を行った。
【０１０７】
ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−ｄＴホスホロアミダイト（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）１ｇに、テトラゾールのアセトニトリル溶液（４５０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を２０ｍＬ、乾燥アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１０ｍＬ加えた。このようにしてＤＭＴ−ｄＴ溶液を３０ｍＬ調製した。
【０１０８】
上記のようにリンカー層を形成した基板を乾燥アセトニトリルに浸漬し、窒素フローで乾燥した。乾燥後、反応容器に入れ、上記ＤＭＴ−ｄＴ溶液を加えて２分間揺動した。基板を容器から取り出し、搬送用の別容器に乾燥アセトニトリルを基板と共に入れ、グローブボックスから取り出した。
【０１０９】
続いて、基板をアセトニトリル１００ｍＬが入った洗浄用容器に浸漬し、２８ｋＨｚ超音波洗浄を５分間行った。別の容器にアセトニトリル１００ｍＬを用意し、同様の洗浄をさらに２回行い、合計３回洗浄した。この結果、基板上にチミン残基が導入された。続いて、窒素フローで乾燥後、基板をグローブボックス内で保管した。
【０１１０】
（粉砕）
上記の基板をダイアモンドペンで割断し、２０ｃｃのバイアルに投入し金属棒で撹拌して粉砕した。
【０１１１】
（脱保護）
続いて、破砕した基板に２質量％トリフルオロ酢酸−アセトニトリルを３ｍＬ添加し、ボルテックスミキサーで撹拌し、２８ｋＨｚ超音波を５分間照射することにより、基板上のＤＭＴ基を脱離させた。続いて、反応液を４５０ｎｍのポアサイズを有するメンブレンフィルターでろ過し、ろ液を解析して保護基を定量した。
【０１１２】
（保護基の定量）
続いて、上記ろ液を実験例１と同様にして、高速液体クロマトグラフィー−質量分析装置（「ＬＣ２０３０−ＬＣＭＳ２０２０」、島津製作所）に供して分画し、波長２５４ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１３】
基板から脱離させた保護基を高速液体クロマトグラフィー−質量分析装置で測定した場合には、図４に示す１．０分付近のピークは基板に残るためほとんど観測されず、５．５分付近のピークのみ検出された。続いて、実験例１で作成した検量線に基づいて定量した結果、基板から脱離したＤＭＴの濃度は３．５７μＭと定量された。
【符号の説明】
【０１１４】
１…基板、２…ＰＡＧ層、３…露光された部分、４…脱保護された酸分解性保護基、５…保護基を有するヌクレオチド誘導体、１００…オリゴヌクレオチド合成装置、１１０…反応部、１２０…分画部、１３０…検出部、１４０…試薬導入部、１５０…スプリッター、１６０…配線、１７０…ＣＰＵ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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