(57)【要約】【課題】ＲＮＡアプタマーのスクリーニング効率をさらに向上させる技術を提供する。【解決手段】（Ａ）プロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及びＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖ＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡとで構成され、且つ相補鎖ＤＮＡに捕捉用タグ（Ｐｔ）が付加したタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンが固相担体の微小表面に多数固定化されている固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を準備する工程と；（Ｂ）転写反応を行い、ＲＮＡアプタマー候補が捕捉用タグ（Ｐｔ）に結合した固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を調製する工程と；（Ｃ）固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を標的物質と接触させ、標的物質と結合したＲＮＡアプタマー候補を選別する工程、を含むＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）工程から（Ｃ）工程を含む、ＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法：
（Ａ）ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含むタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンを、前記ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含む固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリであって；前記タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡが、一方端から他方端へ向かって、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及び前記ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖ＤＮＡと、その相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡと、前記相補鎖ＤＮＡの前記一方端に結合した、リンカー及び前記捕捉用配列を含む捕捉用タグ（Ｐｔ）とを含み、前記他方端で固相担体に固定されており；且つ、前記タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を準備する工程と、
（Ｂ）前記鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を転写反応に供し、前記捕捉用配列の相補配列が付加された前記ＲＮＡアプタマー候補を合成するとともに前記ＲＮＡアプタマー候補を前記捕捉用タグ（Ｐｔ）に捕捉させることによって、固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を調製する工程と、
（Ｃ）前記固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を標的物質と接触させ、前記標的物質と結合した前記ＲＮＡアプタマー候補を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが固定化された前記微小表面を選別する工程。
【請求項２】
前記（Ａ）工程が、以下の工程を含む、請求項１に記載の方法：
（Ａ１）前記一本鎖ＤＮＡのクローンを、前記ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含むＤＮＡライブラリであって、前記一本鎖ＤＮＡのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を準備する工程、及び
（Ａ２）前記固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を、前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ（Ｐｔ）と前記プロモータ配列とを含むプライマー（Ｐ）を用いたプライマー伸長反応に供し、前記固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を得る工程。
【請求項３】
前記（Ａ１）工程において、前記一本鎖ＤＮＡ、その相補鎖ＤＮＡ、又は、前記一本鎖ＤＮＡと前記相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡを、前記固相担体の存在下で、プライマーを用いた単分子ＰＣＲに供することによって、前記固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を得る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記（Ａ）工程が、以下の工程を含む、請求項１に記載の方法：
（Ａ１１）前記一本鎖ＤＮＡ、その相補鎖ＤＮＡ、又は、前記一本鎖ＤＮＡと前記相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡを、前記固相担体の存在下で、前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ（Ｐｔ）と前記プロモータ配列とを含むプライマー（Ｐ）を用いた単分子ＰＣＲに供し、前記固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を得る工程。
【請求項５】
前記固相担体が微粒子担体であり、前記微小表面が前記微粒子担体の表面であり、且つ、前記（Ｃ）工程において、前記標的物質と結合した前記ＲＮＡアプタマー候補を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが固定化された微粒子担体の分取を行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記（Ｃ）工程における分取をセルソータによって行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記固相担体が基板担体であり、前記微小表面が前記基板担体の表面上の特定の微小領域であり、且つ、前記（Ｃ）工程において、前記標的物質と結合した前記ＲＮＡアプタマー候補を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが固定化された微小領域の特定を行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記（Ｂ）工程の転写反応における一の条件及び前記（Ｃ）工程の標的物質との接触における一の条件あたり、前記（Ａ）工程から前記（Ｃ）工程を１回のみ行う、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記プロモータ配列がＴ７プロモータ配列である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンカーがポリアルキレングリコール鎖である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列と、捕捉用配列とを含む前記一本鎖ＤＮＡ、その相補鎖ＤＮＡ、又は、前記一本鎖ＤＮＡと前記相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡと、
前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ（Ｐｔ）と、前記プロモータ配列を含むプライマー（Ｐ）と、
を含む、ＲＮＡアプタマーのスクリーニングキット。
【請求項１２】
ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含むタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンを、前記ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含むライブラリであって、
前記タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡが、一方端から他方端へ向かって、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及びＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖ＤＮＡと、その相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡと、前記相補鎖の前記一方端に結合した、リンカー及び前記捕捉用配列を含む捕捉用タグ（Ｐｔ）を含み、前記他方端で固相担体に固定されており、且つ、
前記タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている、ＲＮＡアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
【請求項１３】
前記タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡから転写された、前記捕捉用配列の相補配列が付加された前記ＲＮＡアプタマー候補が、前記捕捉用タグ（Ｐｔ）に相補結合することでＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を構成している、請求項１２に記載のＲＮＡアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
【請求項１４】
前記固相担体が微粒子担体であり、前記微小表面が前記微粒子担体の表面である、請求項１２又は１３に記載のＲＮＡアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
【請求項１５】
前記固相担体が基板担体であり、前記微小表面が前記基板担体の表面上の特定の微小領域である、請求項１２又は１３に記載のＲＮＡアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法、キット、及びライブラリに関する。より具体的には、ＲＮＡアプタマー候補のクローンを固相担体の微小表面に集合して固定することによって、ＲＮＡアプタマーのスクリーニング効率を大幅に向上させる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸アプタマーは、標的を特異的に認識できる一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり、医薬品の開発及び診断技術への応用研究が盛んに行われている。特に、ＲＮＡはＤＮＡよりも複雑な構造を形成可能である点等で、核酸アプタマーとしてより優れている。
【０００３】
核酸アプタマーを取得する手法としては、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法が挙げられる。ＳＥＬＥＸ法では、標的分子を担体に固定化し、アプタマー候補配列のバリエーションを有するＤＮＡ又はＲＮＡの集団（ライブラリ）と接触させる。そして、担体を遠心分離等で回収することで、担体に固定化させておいた標的分子と相互作用したＤＮＡ又はＲＮＡを取得する。ＳＥＬＥＸ法では、回収した核酸を、ＲＮＡの場合はＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡの場合はＰＣＲによって増幅し、再度ＤＮＡライブラリ又はＲＮＡライブラリとして調製し、再び同様の選別操作に供する。このような同様の選別操作を繰り返すことによって、標的分子と特異的に相互作用したＤＮＡ又はＲＮＡ（ＤＮＡアプタマー又はＲＮＡアプタマー）を濃縮する。
【０００４】
ＳＥＬＥＸ法に供される最初のライブラリにおいては、一般的に３０塩基以上のランダムな配列領域を含む配列がアプタマー候補配列として使用される。３０塩基のランダム配列のバリエーションは４30通りつまり１０18通り以上であり、すべての配列を１分子ずつ含むアプタマー候補配列の総量は重さに換算して約１８ｍｇとなる。さらにＰＣＲでプライマーを結合させるために必要な４０塩基程度の固定された配列をアプタマー候補配列に足すと、総量は約４０ｍｇとなる。したがって、最初の選別操作の段階で全てのバリエーションを最初のライブラリに含ませることは実験のスケールを考慮すると現実的ではないため、通常は、膨大な組み合わせの中からごく一部の組み合わせのみを最初のライブラリとして使用し、そこから上述の選別操作を繰り返し、標的分子と特異的に相互作用を示す核酸を濃縮する。濃縮されたアプタマー候補配列に対しては、標的分子との相互作用を示す配列をさらに最適化するため、濃縮された塩基配列間で共通性の高い配列を固定する一方で周囲の配列に変異を加えたライブラリを別途構築し、上述のように選別操作を繰り返すという作業が行われる。
【０００５】
従来のＳＥＬＥＸ法では、標的分子を担体上に化学的に固定化する必要があったが、近年では、様々な改変手法が報告されている。例えば、特許文献１では、標的分子を固定せず、核酸と標的分子との複合体形成に伴う分子サイズの変化を利用して選別を行う手法が報告されている。また、非特許文献１では、ライブラリとなる核酸の側を担体に固定化し、核酸と標的分子との結合に伴う蛍光シグナル変化等を利用して選別を行う手法が報告されている。核酸の側を担体に固定化する手段としてはエマルジョンＰＣＲを用いており、１個の担体粒子に十万コピー以上の多数のクローンＤＮＡを固定化することが可能であることから、標的分子との結合に伴う蛍光シグナル変化が増大することで、選別の効率が向上している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００３／１０２２１２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎｇｅｗ.Ｃｈｅｍ.Ｉｎｔ.Ｅｄ. （２０１４）５３，４７９６−４８０１.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一のライブラリからアプタマー候補の選別を繰り返してある程度まで絞り込んだとしても、通常は、さらなる最適化のために別のライブラリを新たに配列設計して構築し、再び選別を行う作業が控えている。このため、アプタマー候補を効率よく最適化していくには、一のライブラリからいかに効率よくアプタマー候補を絞り込むかが律速段階の１つとなる。
【０００９】
しかしながら、特許文献１の方法では、一のライブラリからアプタマー候補をある程度まで絞り込むために、何度も選別作業を繰り返さなければならず、その繰り返しの選別作業が煩雑であり非常に効率が悪い。また、非特許文献１の方法では、選別効率の向上は図れるものの、その設計上、ＤＮＡアプタマーの選別しかできず、ＲＮＡアプタマーの選別には適用できない。
【００１０】
そこで本発明は、ＲＮＡアプタマーのスクリーニング効率をさらに向上させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、微粒子担体に固定したＤＮＡライブラリを鋳型として転写されるＲＮＡアプタマー候補を、同一の微粒子担体に固定化したＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリの設計に着眼した。鋭意検討の結果、ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列とともに捕捉用配列を有するように設計した一本鎖ＤＮＡのクローンを微粒子担体に多数固定化したライブラリに対し、捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグを付加したプライマーによる伸長反応を行って、当該微粒子担体上で捕捉用配列の相補配列を含む二重鎖ＤＮＡのクローンを捕捉用タグが付加した態様で得た後、当該二重鎖ＤＮＡを鋳型にして転写反応を行い、転写産物として捕捉用配列の相補配列が付加されたＲＮＡアプタマーを得るとともに、当該転写産物を同一微粒子担体上の捕捉用タグに捕捉させることで、ＲＮＡアプタマー候補のクローンごとに同一微粒子担体上で固定されたＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を得ることに成功した。そして、このＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリを用いることによって、ＲＮＡアプタマーのスクリーニング効率が飛躍的に向上することを見出した。本発明は、この知見に基づき、さらに検討を重ねることにより完成された。
【００１２】
すなわち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  下記（Ａ）工程から（Ｃ）工程を含む、ＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法：
（Ａ）ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含むタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンを、前記ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含む固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリであって；前記タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡが、一方端から他方端へ向かって、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及び前記ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖ＤＮＡと、その相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡと、前記相補鎖ＤＮＡの前記一方端に結合した、リンカー及び前記捕捉用配列を含む捕捉用タグ（Ｐｔ）とを含み、前記他方端で固相担体に固定されており；且つ、前記タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を準備する工程と、
（Ｂ）前記鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を転写反応に供し、前記捕捉用配列の相補配列が付加された前記ＲＮＡアプタマー候補を合成するとともに前記ＲＮＡアプタマー候補を前記捕捉用タグ（Ｐｔ）に捕捉させることによって、固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を調製する工程と、
（Ｃ）前記固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を標的物質と接触させ、前記標的物質と結合した前記ＲＮＡアプタマー候補を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが固定化された前記微小表面を選別する工程。
項２．  前記（Ａ）工程が、以下の工程を含む、項１に記載の方法：
（Ａ１）前記一本鎖ＤＮＡのクローンを、前記ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含むＤＮＡライブラリであって、前記一本鎖ＤＮＡのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を準備する工程、及び
（Ａ２）前記固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を、前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ（Ｐｔ）と前記プロモータ配列とを含むプライマー（Ｐ）を用いたプライマー伸長反応に供し、前記固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を得る工程。
項３．  前記（Ａ１）工程において、前記一本鎖ＤＮＡ、その相補鎖ＤＮＡ、又は、前記一本鎖ＤＮＡと前記相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡを、前記固相担体の存在下で、プライマーを用いた単分子ＰＣＲに供することによって、前記固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を得る、項２に記載の方法。
項４．  前記（Ａ）工程が、以下の工程を含む、項１に記載の方法：
（Ａ１１）前記一本鎖ＤＮＡ、その相補鎖ＤＮＡ、又は、前記一本鎖ＤＮＡと前記相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡを、前記固相担体の存在下で、前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ（Ｐｔ）と前記プロモータ配列とを含むプライマー（Ｐ）を用いた単分子ＰＣＲに供し、前記固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を得る工程。
項５．  前記固相担体が微粒子担体であり、前記微小表面が前記微粒子担体の表面であり、且つ、前記（Ｃ）工程において、前記標的物質と結合した前記ＲＮＡアプタマー候補を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが固定化された微粒子担体の分取を行う、項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
項６．  前記（Ｃ）工程における分取をセルソータによって行う、項５に記載の方法。
項７．  前記固相担体が基板担体であり、前記微小表面が前記基板担体の表面上の特定の微小領域であり、且つ、前記（Ｃ）工程において、前記標的物質と結合した前記ＲＮＡアプタマー候補を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが固定化された微小領域の特定を行う、項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
項８．  前記（Ｂ）工程の転写反応における一の条件及び前記（Ｃ）工程の標的物質との接触における一の条件あたり、前記（Ａ）工程から前記（Ｃ）工程を１回のみ行う、項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
項９．  前記プロモータ配列がＴ７プロモータ配列である、項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
項１０．  前記リンカーがポリアルキレングリコール鎖である、項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
項１１．  ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列と、捕捉用配列とを含む前記一本鎖ＤＮＡ、その相補鎖ＤＮＡ、又は、前記一本鎖ＤＮＡと前記相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡと、
前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ（Ｐｔ）と、前記プロモータ配列を含むプライマー（Ｐ）と、
を含む、ＲＮＡアプタマーのスクリーニングキット。
項１２．  ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含むタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンを、前記ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含むライブラリであって、
前記タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡが、一方端から他方端へ向かって、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及びＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖ＤＮＡと、その相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡと、前記相補鎖ＤＮＡの前記一方端に結合した、リンカー及び前記捕捉用配列を含む捕捉用タグ（Ｐｔ）を含み、前記他方端で固相担体に固定されており、且つ、
前記タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている、ＲＮＡアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
項１３．  前記タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡから転写された、前記捕捉用配列の相補配列が付加された前記ＲＮＡアプタマー候補が、前記捕捉用タグ（Ｐｔ）に相補結合することでＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を構成している、項１２に記載のＲＮＡアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
項１４．  前記固相担体が微粒子担体であり、前記微小表面が前記微粒子担体の表面である、項１２又は１３に記載のＲＮＡアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
項１５．  前記固相担体が基板担体であり、前記微小表面が前記基板担体の表面上の特定の微小領域である、項１２又は１３に記載のＲＮＡアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＲＮＡアプタマー候補のクローンごとに同一微粒子担体上で固定されたＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のライブラリを構築することで、ＲＮＡアプタマー候補のスクリーニング効率を飛躍的に向上させることができる。例えば、１回のスクリーニングで、１万種類以上のＲＮＡアプタマー候補から数種類程度を絞り込むことができるため、一のライブラリからのＲＮＡアプタマー候補を絞り込むために同じ条件でのスクリーニングを多数繰り返す必要がない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法の一例を模式的に示す。
【図２】図１に示した固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）におけるタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡの一例を模式的に示す。
【図３】固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を得る工程（Ａ）の一例を模式的に示す。
【図４】固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を得る工程（Ａ）の他の例を模式的に示す。
【図５】工程（Ａ）の一例における核酸部分の模式的概念図を示す。
【図６】工程（Ｂ）における核酸部分の模式的概念図を示す。
【図７】本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニングキットの模式的概念図を示す。
【図８】実施例１で設計されたプライマー及びＤＮＡ鋳型の配列を示す。
【図９】実施例１によるスクリーニングの結果を示す。
【図１０】実施例２で設計されたプライマー及びＤＮＡ鋳型の配列を示す。
【図１１】実施例２によるスクリーニングの結果を示す。
【図１２】実施例２で絞り込まれたＲＮＡアプタマー候補の配列及び当該配列の出現率（出現頻度）を示す。
【図１３】実施例２で絞り込まれたＲＮＡアプタマー候補と標的分子との結合による蛍光シグナルの変化を示す。
【図１４】実施例３によるスクリーニングの結果を示す。
【図１５】実施例３で絞り込まれたＲＮＡアプタマー候補のうち実施例２では見られなかった配列及び当該配列と標的分子との結合による蛍光シグナルの変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［１．ＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法］
本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法は、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を準備する工程（Ａ）と、固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を調製する工程（Ｂ）と、ＲＮＡアプタマー候補を選別する工程（Ｃ）と、を含む。図１に本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法の一例を模式的に示す。図１に示すように、工程（Ａ）で準備された固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）は、工程（Ｂ）で転写に供されることにより、ＲＮＡアプタマー候補が固定化された固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）へ調製され、工程（Ｃ）で標的物質との接触に供されることにより、標的物質と結合したＲＮＡアプタマー候補を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが選別（図１の例では分取）される。
【００１６】
工程（Ａ）で準備される固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）は、図２に模式的概念図として示されるタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡが担体に固定されている。本発明において、工程（Ａ）には、工程（Ａ１）及び工程（Ａ２）を含む実施形態（図３）と、工程（Ａ１１）を含む実施形態（図４）とが含まれる。さらに、工程（Ａ）及び工程（Ｂ）の詳細を、それぞれ、図５及び図６に模式的概念図として示す。以下、図１〜図６を参照して、本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法について詳述する。
【００１７】
なお、本発明において相補又は相補的とは、ある塩基配列を有する核酸に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列を有することをいう。ここでいうストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール（商品名）、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが共存する条件等が挙げられる。
【００１８】
［１−１．工程（Ａ）］
工程（Ａ）では、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を準備する。図１に示すように、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）は、固相担体の微小表面に固定化されたタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンの多数のコピーを含む。図示された態様では、固相担体は微粒子担体である。この場合、固相担体の微小表面は、微粒子担体の表面全体を構成する。タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡは、図２に示すように、３’−５’方向に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列と、捕捉用配列Ｘ’と、ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列とをこの順番で含む一本鎖ＤＮＡと、その相補鎖ＤＮＡとから構成される二本鎖ＤＮＡと、相補鎖ＤＮＡの一方端に結合した捕捉用タグ（Ｐｔ）とを含む。固相担体（図２において図示省略）はタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡの他方端を固定している。
【００１９】
本発明において、ＲＮＡアプタマーとしては、標的物質に対し高い親和性を有することで特異的に結合しうる分子であればよく、塩基配列、分子の大きさ、及び立体構造は特に限定されない。また、塩基配列としても、人工配列及び天然配列を問わない。本発明においては、ＲＮＡアプタマーの用途（例えば、核酸医薬、診断薬等）等に応じてその候補を任意に設定し、設定したＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を設計する。
【００２０】
固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）においては、ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列が複数通りの配列で設計されてライブラリ化されている。なお、複数通りの配列としては、特定配列の特定箇所に任意の変異を導入することで異なる類似配列にバリエーション展開することによって設計された配列が挙げられる。このようなバリエーション展開に基づく配列設計を行う場合としては、例えば、人工的に設計したＲＮＡアプタマー候補を最適化する場合が挙げられる。また、複数通りの配列としては、異なる類似配列にバリエーション展開されたものだけではなく、長鎖ＲＮＡがランダムに断片化されて得られるＲＮＡ断片の配列等も挙げられる。このようなＲＮＡ断片に基づく配列設計を行う場合としては、例えば、細胞に内在する天然ＲＮＡ配列から、特定の標的物質（タンパク質などの生体分子）に特異的に結合する配列を濃縮する場合が挙げられる。
【００２１】
（Ａ）工程から（Ｃ）工程までの一連の工程１回に対して設定される、ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列の種類の数としては特に限定されないが、例えば３００万種類以下が挙げられ、より好ましいスクリーニング効率を得る観点では、好ましくは５万種類以下、より好ましくは３万種類以下が挙げられる。本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法はスクリーニング効率に非常に優れているため、ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列の種類の数としては、１０００種類以上、好ましくは１万種類以上が挙げられる。或いは、ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列の種類の数としては、例えば１〜１０塩基に任意の変異が導入される組み合わせ数（４〜４10パターン）、好ましくは２〜９塩基に任意の変異が導入される組み合わせ数（４2〜４9パターン）、より好ましくは３〜８塩基に任意の変異が導入される組み合わせ数（４3〜４8パターン）、さらに好ましくは４〜７塩基に任意の変異に変異が導入される組み合わせ数（４4〜４7パターン）が挙げられる。
【００２２】
ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列の塩基長としては特に限定されず、目的とするＲＮＡアプタマーの塩基長に応じて決定される。具体的には、ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列の塩基長は、例えば２０〜４００塩基長、好ましくは３０〜１００塩基長が挙げられる。
【００２３】
固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）においては、プロモータ配列の相補配列及び捕捉用配列としては、ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列によらずそれぞれ共通の配列が設計される。プロモータ配列としては、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に認識する二本鎖プロモータ領域の相補配列（アンチセンス鎖）であればよく、後述の工程（Ｂ）で用いるＲＮＡポリメラーゼに応じて設計される。例えば、バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼが特異的に認識するＴ７プロモータ配列、Ｔ３プロモータ配列、Ｋ１１プロモータ配列、ＳＰ６プロモータ配列等が挙げられる。転写安定性等の観点から、好ましくはＴ７プロモータ配列が挙げられる。
【００２４】
捕捉用配列Ｘ’としては特に限定されず、後述の（Ｂ）工程においてＲＮＡアプタマー候補を捕捉する以外に不所望の結合を生じないように適宜設計される。捕捉用配列Ｘ’の塩基長としては特に限定されず、後述の（Ｂ）工程においてＲＮＡアプタマー候補を有効に捕捉できる塩基長を有していればよい。具体的には、捕捉用配列Ｘ’の塩基長としては、２０〜３０塩基長が挙げられる。
【００２５】
これらプロモータ配列の相補配列と捕捉用配列Ｘ’とＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列とを有する一本鎖ＤＮＡを含むタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡは、一のＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を有するクローンの複数コピーが一の微粒子担体の表面に結合し、他のＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を有するクローンの複数コピーが他の微粒子担体の表面に結合しているというように、クローンごとに異なる微粒子担体の表面に固定されている。１個の微粒子担体に結合しているクローンのコピー数は微粒子の大きさにもよるが、例えば百万コピー程度が挙げられる。
【００２６】
なお、図示した態様では、固相担体が微粒子担体である場合を例示しているが、固相担体の形状はこれに限定されるものではない。固相担体としては、基板担体も挙げられる。固相担体が基板担体である場合、固相担体の微小表面は、基板担体の表面上の特定の微小領域を構成する。そして、基板担体の表面上の区画された微小領域ごとに、タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンの多数のコピーが集合して固定されている。つまり、タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡは、一のＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を有するクローンの複数コピーが基板担体上の一の微小領域に集合して結合し、他のＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を有するクローンの複数コピーが、同一基板担体上の他の微小領域に集合して結合しているというように、クローンごとに同一基板担体上の異なる微小領域に固定されている。微小量領域１個あたりの面積としては、例えば直径数十μｍ〜数百μｍの円相当の面積が挙げられる。
【００２７】
固相担体の材料としては特に限定されず、たとえば、ガラス、金属、ポリマー、磁性体等が挙げられる。また、固相担体表面上におけるＤＮＡの固定態様としても特に限定されず、共有結合及び非共有結合を問わない。また、ＤＮＡ鎖は、アダプター配列を介して固相担体に固定化されていることが好ましい。
【００２８】
［１−１−１．工程（Ａ１）］
固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を調製する工程（Ａ）は、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を準備する工程（Ａ１）と、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）をプライマー（Ｐ）を用いたプライマー伸長反応に供する工程（Ａ２）とによって行うことができる。図３に、工程（Ａ１）及び工程（Ａ２）の一例を模式的に示す。また、工程（Ａ２）の詳細について、図５に模式的に示す。
【００２９】
固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）は、上述の固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）における相補鎖ＤＮＡ及びそれに付加された捕捉タグ（Ｐｔ）（図２参照）を未だ有していない一本鎖ＤＮＡのクローンの多数のコピーが、固相担体の微小表面に固定化されたものである。つまり、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）は、３’−５’方向に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列と、捕捉用配列Ｘ’と、ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列とをこの順番で含む一本鎖ＤＮＡ（図５参照）のクローンを、ＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含み、且つ、一本鎖ＤＮＡのクローンごとに固相担体の特定の微小表面に固定化されているものである。
【００３０】
工程（Ａ１）において、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）は、市販のものを準備してもよいし、図３に示された工程（Ａ１）に従って調製することで準備してもよい。図３に示された工程（Ａ１）によれば、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）は、担体存在下において、ＰＣＲプライマーを用いた鋳型ＤＮＡ断片の単分子ＰＣＲを行うことによって調製することができる。この場合用いられる鋳型ＤＮＡ断片としては、上述の一本鎖ＤＮＡ（つまり、上述のプロモータ配列の相補配列、上述の捕捉用配列Ｘ’、及び上述のＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列をこの順番で含む一本鎖ＤＮＡ）であってもよいし、当該一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡ（一本鎖）であってもよいし、それら一本鎖ＤＮＡ及び相補鎖ＤＮＡで構成される二本鎖ＤＮＡであってもよい。
【００３１】
例えば固相担体が微粒子担体である場合、単分子ＰＣＲとしては、エマルジョンＰＣＲを用いることができる。エマルジョンＰＣＲでは、上述の鋳型ＤＮＡ断片１分子と、ＰＣＲプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマーのうちの一方）と、ＰＣＲプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマーのうちの他方）が表面に固定された微粒子担体１個とが油中水滴エマルジョン中に封入されるように、それぞれの濃度を調整してエマルジョンＰＣＲ系を構築し、当該エマルジョン中でＰＣＲ反応を行うことで、微粒子担体表面に多数の二重鎖ＤＮＡのクローンが固定化される。油中水滴として区画されたエマルジョンごとに異なるＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含むＤＮＡのクローンが微粒子担体表面に固定化される。ＰＣＲ反応後、エマルジョンを破壊し、微粒子担体を回収して二重鎖ＤＮＡを一本鎖化することで、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）が得られる。
【００３２】
また、固相担体が基板担体である場合、単分子ＰＣＲとしては、ブリッジＰＣＲを用いることができる。ブリッジＰＣＲでは、基板上で上述一本鎖ＤＮＡの増幅を行う。この場合、増幅反応を行う基板表面には、一本鎖ＤＮＡの５’端部、３’端部に相補的に結合する２種類のＰＣＲプライマーのセットが、区画された微小領域のそれぞれに固定されている。このＰＣＲプライマーに結合した上述一本鎖ＤＮＡが基板上でＰＣＲされることにより、同一の配列からなり、上述ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及びＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含む二本鎖ＤＮＡのクラスターが基板上の一の微小領域に多数形成される。上述２種類のＰＣＲプライマーを直径数十μｍ〜数百μｍの円形スポット状の微小領域に固定化し、上述一本鎖ＤＮＡの濃度を適宜調節することで、区画された微小領域それぞれにおいて複数種類のライブラリ配列のうち一種類のみを増幅することができる。なお、ＰＣＲプライマーを微小領域に固定する場合、光開裂性基を介してＰＣＲプライマーを固定することによって、固定化された核酸種を後で回収できるようにしておくことが好ましい。光開裂性基としては、光照射によって開裂可能な連結基であれば特に限定されないが、例えば、光開裂性基として２−ニトロベンジル基を有する連結基が挙げられる。このような光開裂性基は、例えば、[４−（４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｂｕｔｙｒａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ]−１−（２−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−ｅｔｈｙｌ］−２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ−（Ｎ,Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅなどの２−ニトロ−４−置換ベンジル基を有する試薬を用いて導入することができる。
【００３３】
［１−１−２．工程（Ａ２）］
図３の工程（Ａ２）に示されるように、工程（Ａ２）では、上述の固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を、所定の配列設計がされたプライマー（Ｐ）を用いたプライマー伸長反応に供する。これによって、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）における一本鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡとなるとともに、二本鎖ＤＮＡの端部に一本鎖の捕捉用タグ（Ｐｔ）が付加された、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）が調製される。
【００３４】
具体的には、図５に示すように、プライマー（Ｐ）は、捕捉用タグ（Ｐｔ）とプロモータ配列とを含む。捕捉用タグ（Ｐｔ）は、捕捉用配列Ｘ’とリンカーとを有し、リンカーを介してプロモータ配列に直接的または間接的に結合している。プロモータ配列は、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）における一本鎖ＤＮＡのプロモータ配列の相補配列に結合する配列である。一方、捕捉用タグ（Ｐｔ）は、当該一本鎖ＤＮＡに非相補的な配列である。
【００３５】
捕捉用タグ（Ｐｔ）における捕捉用配列Ｘ’は、後述の（Ｂ）工程におけるＲＮＡアプタマー候補を確実に捕捉する観点から、上述の固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）の一本鎖ＤＮＡにおける捕捉用配列Ｘ’と同一であることが好ましい。但し、本発明においては、捕捉用タグ（Ｐｔ）における捕捉用配列Ｘ’は、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）の一本鎖ＤＮＡにおける捕捉用配列Ｘ’の転写配列と相補的、且つ当該一本鎖ＤＮＡに非相補的である限り、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）の一本鎖ＤＮＡにおける捕捉用配列Ｘ’と同一でなくてもよい。たとえば、捕捉用タグ（Ｐｔ）における捕捉用配列Ｘ’は、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）の一本鎖ＤＮＡにおける捕捉用配列Ｘ’の１個〜複数個（例えば１〜３個）の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されていてもよい。
【００３６】
捕捉用タグ（Ｐｔ）におけるリンカーは、捕捉用配列Ｘ’とプロモータ配列との間にヒンジ様に介在することにより、捕捉用配列Ｘ’に揺動性を与え、後述の（Ｂ）工程におけるＲＮＡアプタマー候補の捕捉を容易にする。リンカーとしては、一本鎖ＤＮＡ配列と非相補的であれば特に限定されず、たとえば、ポリアルキレングリコール鎖及びオリゴヌクレオチド鎖が挙げられ、好ましくはポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。ポリアルキレングリコール鎖は、一般式：−Ｏ−（Ｒ−Ｏ）n−  で表される構造であり、ｎは整数でアルキレンオキサイド単位の付加モル数を表し、Ｒはアルキレン基を表す。アルキレン基の炭素数は、好ましくは２又は３、より好ましくは炭素数が２のポリエチレングリコール鎖が挙げられる。付加モル数ｎとしては、ＲＮＡアプタマー候補の捕捉をより容易にする等の観点から、例えば２〜８、好ましくは３〜５が挙げられる。オリゴヌクレオチド鎖の種類としては、ＤＮＡ及びＲＮＡを問わない。好ましくは、ポリチミンが挙げられる。オリゴヌクレオチドの塩基長としては、ＲＮＡアプタマー候補の捕捉をより容易にする等の観点から、例えば３〜２０塩基長、好ましくは５〜１０塩基長が挙げられる。
【００３７】
プロモータ配列は、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）におけるプロモータ配列の相補配列と共にＲＮＡポリメラーゼが特異的に認識する二本鎖プロモータ領域を形成可能な配列である。
【００３８】
プライマー（Ｐ）は、上述の設計に従い、公知の方法によって合成することができる。例えば、ホスホアミダイト法等によって化学合成する方法、プライマー（Ｐ）に含ませるべき配列をあらかじめ含む核酸を制限酵素消化する方法等によって得ることができる。
【００３９】
プライマー伸長反応では、一本鎖ＤＮＡに対しプライマー（Ｐ）を相補結合させ、このプライマーの３’末端を起点としてＤＮＡ鎖を伸長させることで、一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡを合成する。具体的には、固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を、プライマー（Ｐ）、ＤＮＡポリメラーゼ及び基質デオキシリボヌクレオチドを含む緩衝液と接触させ、所定の反応条件下で伸長反応を進行させればよい。反応条件としては当業者が適宜決定することができるが、例えば、５０〜６０℃、１０秒〜３０秒間の条件でプライマー（Ｐ）を一本鎖ＤＮＡに相補結合させ、ＤＮＡポリメラーゼの至適温度（例えば、６８〜７２℃）、２０秒〜１分間の条件で、相補鎖ＤＮＡを伸長させることができる。これによって、固相担体上に捕捉用タグ（Ｐｔ）が付加されたタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのクローンが多数固定化された固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を得る。
【００４０】
［１−１−３．工程（Ａ１１）］
固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を調製する工程（Ａ）は、上述の工程（Ａ１）及び工程（Ａ２）によって行う他、以下の工程（Ａ１１）によっても行うことができる。図４に、工程（Ａ１１）の一例を模式的に示す。
【００４１】
工程（Ａ１１）は、ＰＣＲプライマーの代わりに、捕捉タグ（Ｐｔ）を有するプライマー（Ｐ）を用いることを除いて、上述の（Ａ１）工程で行われる単分子ＰＣＲと同様に行うことができる。つまり、工程（Ａ１１）では、上述の一本鎖ＤＮＡ、その相補鎖ＤＮＡ、又は、それら一本鎖ＤＮＡと相補鎖ＤＮＡとで構成される二本鎖ＤＮＡを、固相担体の存在下で、プライマー（Ｐ）を用いた単分子ＰＣＲに供する。これによって、図５で示したようなＰＣＲ伸長とＰＣＲ増幅とが行われ、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）が得られる。単分子ＰＣＲにおいて捕捉タグ（Ｐｔ）が直接ライブラリに導入されるため、簡略化された工程で固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を調製することができる。
【００４２】
［１−２．工程（Ｂ）］
工程（Ｂ）では、上述の固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を転写反応に供し、固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を調製する。図１に示すように、固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）は、上述の固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）において、補足用タグ（Ｐｔ）を介してＲＮＡアプタマー候補が結合した態様で調製される。
【００４３】
具体的には、図６に示すように、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を転写反応に供すると、ＲＮＡポリメラーゼがタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡのプロモータ領域に特異的に結合し、タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡ鎖が合成され、ＲＮＡアプタマー候補が得られる。
【００４４】
具体的には、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を、ＲＮＡポリメラーゼ及び基質リボヌクレオチドを含む緩衝液と接触させ、所定の反応条件下で転写反応を進行させればよい。
【００４５】
ＲＮＡポリメラーゼとしては、タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡにおけるプロモータ領域に対応するものである限り特に限定されない。例えば、バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼが挙げられ、より具体的には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｋ１１  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。転写安定性等の観点から、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、ＲＮＡポリメラーゼとしては、野生型に限定されるものではなく、本発明で用いられる基質リボヌクレオチドに対する基質特異性を有しているものであれば、遺伝子工学的に変異を導入したものであってもよい。
【００４６】
基質リボヌクレオチドとしては、天然物及び合成物を問わない。基質リボヌクレオチドの合成物としては、２’−修飾リボヌクレオチド（リボースの２’位に修飾基を有するリボヌクレオシドの５’−リン酸エステル）が挙げられ、具体的には、２’−ハロゲン化リボヌクレオチド及び２’−アルコキシリボヌクレオチド（２’−アルコキシ基の炭素数としては、たとえば１〜３、好ましくは１及び２、より好ましくは１）からなる群から１種または複数種が選択されうる。これら合成物としては、例えば、化学的安定性（生分解耐性）、細胞膜透過性、分子認識性の向上などの目的で核酸医薬の用途において有効とされているものを当業者が適宜選択することができる。
【００４７】
基質リボヌクレオチドの合成物における核酸塩基は、鋳型ＤＮＡに相補的となるものであればよい。具体的には、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシンから選択される１種または複数種が用いられる。基質リボヌクレオチドの合成物は、例えば基質リボヌクレオチドの天然物に適宜混合されて用いることができる。
【００４８】
緩衝液としては、適当な緩衝成分およびマグネシウム塩等を水中に含む溶液が挙げられる。緩衝成分としては、トリス酢酸、トリス塩酸、リン酸ナトリウム、及びリン酸カルシウム等のリン酸塩等が挙げられる。緩衝成分の最終濃度としては５ｍＭ〜１００ｍＭ、ｐＨとしてはｐＨ６．０〜９．５、より好ましくはｐＨ７．０〜８．０が挙げられる。また、マグネシウム塩としては塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等が挙げられる。更に、必要に応じて、塩化カリウム、グルタミン酸カリウム等のカリウム塩、ＤＭＳＯ、ベタイン、ゼラチン、Ｔｒｉｔｏｎ等の界面活性剤等が含まれていてよい。
【００４９】
なお、同じ鋳型を用いても、転写反応の溶液条件によっては異なるＲＮＡアプタマー候補が得られることがあるため、緩衝液中には、上述の成分の他にも、転写反応の溶液条件に実質的な影響を与える添加物をさらに含有させてもよい。このような添加物としては、例えば、エチレングリコール、ポリアルキレングリコール、デキストリン（Ｆｉｃｏｌ）、並びに、ＲＮＡ結合性を有するタンパク質、脂質、糖鎖、その他低分子化合物等の生体分子などが挙げられる。これらの添加物のうち、エチレングリコールは、核酸分子の標準的な構造である二本鎖構造を不安定化させる一方で、フーグスティーン型塩基対等を含む非標準的な構造を安定化させる作用が知られており、そのような構造の安定化及び不安定化に伴い、得られるＲＮＡアプタマーの標的物質への結合性が変わりうることが考えられる。したがって、エチレングリコールは、転写反応液への添加の有無でＲＮＡアプタマー候補の標的物質への結合性の違いを調べるために用いることができる。
【００５０】
転写反応の条件としては特に限定されず、ＲＮＡポリメラーゼの至適温度、ライブラリのスケール等に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、１０〜４５℃、好ましくは２０〜３７℃で、１０分〜１２時間、好ましくは１０分〜３０分の条件で、ＲＮＡ鎖を合成することができる。
【００５１】
転写反応によって、タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡにおける捕捉用配列Ｘ’及びアプタマー候補の鋳型配列が転写されるため、転写産物であるＲＮＡアプタマー候補は、補足用配列の相補配列Ｘが付加された態様で得られる。さらに、合成されたＲＮＡアプタマー候補分子は、捕捉用配列の相補配列Ｘが、近接する補足用タグ（Ｐｔ）の捕捉用配列Ｘ’に相補的に結合してＲＮＡ／ＤＮＡ塩基対（Ｘ／Ｘ’）を形成することによって固定される。
【００５２】
つまり、合成されたＲＮＡアプタマー候補分子は、その鋳型配列を提示したタグ付鋳型二本鎖ＤＮＡが固定化されている微小担体の表面と同一の表面上で固定化される。これは、タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡの多数のクローンが微小担体の表面に固定化されているため、当該タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡから転写されたＲＮＡアプタマー候補分子が転写反応系中へ遊離するより前に、近傍に存在する多数の捕捉用タグ（Ｐｔ）に極めて高い確率で捕捉されることによる。捕捉用タグ（Ｐｔ）においてリンカーが捕捉用配列Ｘ’を揺動可能にしていることも、ＲＮＡアプタマー候補分子が極めて高い確率で捕捉されることに寄与している。同一微粒子表面上で転写されたＲＮＡアプタマー候補分子が速やかに同一微粒子表面上で固定されるため、異なるクローン間つまり異なる微小担体の表面間でＲＮＡアプタマー候補分子が交換されることを抑制できる。これによって、固相担体上にＲＮＡアプタマー候補分子のＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが多数固定化された固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）が調製される。
【００５３】
すなわち、固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）は、図６に示されるように、一方端から他方端へ向かって、プロモータ配列の相補配列、捕捉用配列Ｘ’、及びＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を含むＤＮＡ鎖と、その相補鎖ＤＮＡと、を含み、且つ、相補鎖ＤＮＡの一方端に結合した、リンカー配列及び相補用配列Ｘ’を含む捕捉用タグ（Ｐｔ）と、捕捉用タグ（Ｐｔ）に相補結合したＲＮＡアプタマー候補と、を含むＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが、タグ付鋳型二本鎖ＤＮＡの他方端で固相担体（図６では図示省略。図１参照。）に固定されている。そして、ＲＮＡアプタマー候補の配列に応じてＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンを複数種含んでおり、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体は、クローンごとに微粒子担体の個々の表面に固定化されている。
【００５４】
［１−３．工程（Ｃ）］
工程（Ｃ）では、上述の固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を標的物質と接触させる。図１に示すように、上述の固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）に含まれる複数種のＲＮＡアプタマー候補のクローンのうち、特定のクローンに標的物質が特異的に結合する。さらに、標的物質と結合した前記ＲＮＡアプタマー候補を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが固定化された微小表面を選別することで、ＲＮＡアプタマー候補を絞り込むことができる。微小表面の選別は、固相担体が微粒子担体である場合は、標的物質と結合したクローンが固定化された微粒子担体の分取を行い、固相担体が基板担体である場合は、標的物質と結合したクローンが固定化された微小領域の特定を行う。
【００５５】
標的物質としては特に限定されず、ＲＮＡアプタマーの用途において標的となる物質が任意に選択される。例えば、構造上の観点からは、糖類、脂質類、オリゴペプチド、タンパク質、核酸等が挙げられる。また、機能上の観点からは、抗原、抗体、リガンド、レセプター、バイオマーカー等が挙げられる。
【００５６】
固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を標的物質と接触させる条件としては、ＲＮＡアプタマー候補と標的物質との間の検出すべき特異的結合性に障害を及ぼさない条件が適宜選択されうる。具体的には、標的物質を含む試験液のｐＨ、並びに、溶質及び／又は共存成分の含有量等を考慮して、当該条件を選択することができる。当該条件としては、ＲＮＡアプタマーの実際の適用環境と同様の条件（ｐＨ、並びに、溶質及び／又は共存成分の含有量等を）を選択することが、スクリーニングの信頼性の点で好ましい。
【００５７】
標的物質には、検出を容易とするため、シグナル基を有していることが好ましい。シグナル基としては、たとえば、蛍光物質、放射性元素含有物質、磁性物質等に由来する基が挙げられる。検出容易性等の観点から、上述のシグナル物質としては蛍光物質であることが好ましい。蛍光物質としては、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素などのシアニン系色素、ローダミン系色素などの蛍光色素；ＧＦＰなどの蛍光タンパク質；金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子などが挙げられる。上述の放射性元素含有物質としては、１８Ｆなどの放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸などが挙げられる。上述の磁性物質としては、フェリクロームなどの磁性体、フェライトナノ粒子、ナノ磁性粒子などが挙げられる。
【００５８】
本発明においては、固相担体の微小表面それぞれにＲＮＡアプタマー候補のクローンが多数固定化されているため、標的物質も当該微小表面に多数結合させることができる。したがって、標的物質がシグナル基を有している場合、特異的結合に伴うシグナル変化が大きいため検出が容易であり、選別の効率が良好となる。
【００５９】
固相担体が微粒子担体である場合、標的物質が特異的に結合したＲＮＡアプタマー候補の選別においては、セルソータを用いた分取を行うことができる。具体的には、標的物質に接触させた固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を含む液を流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の微粒子担体に固定化されたＲＮＡアプタマー候補に特異的結合した標的物質が発するシグナルを測定することによって、特異的結合した標的物質を定量的に検出することができる。好ましくは、蛍光活性化セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ）法に基づいた分取系を用いることができる。シグナル強度が最も強い画分を指定して分取することで、ＲＮＡアプタマー候補を分取することができる。セルソータを用いることによって、特定の画分を任意に指定することができるだけでなく、（Ｃ）工程に供したＲＮＡアプタマー候補全体に対する分取した画分の割合も明らかにすることができる。つまり、１回の（Ｃ）工程においてどの程度のスクリーニング効率で絞り込めたかについても明らかにすることができる。
【００６０】
分取された微粒子担体は、そのままで、又は固定された鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマー候補を遊離させて回収することで、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列解析を行うことができる。ＤＮＡを配列解析する場合は、微粒子担体に固定化されたＤＮＡの配列を直接解析するか、又は固定化されたＤＮＡをＰＣＲにより増幅した後に配列解析を行うことができる。ＲＮＡを配列解析する場合は、ヌクレオチド塩基の種別を見分けてＲＮＡを分解するＲＮＡ分解酵素、天然のデオキシヌクレオチドと共に２’‐３’‐ジデオキシヌクレオチドを基質として供した逆転写反応の停止、逆転写後のＰＣＲによる増幅等を利用して配列解析を行うことができる。得られた配列から、ＲＮＡアプタマーとして機能する配列を選出することができる。
【００６１】
固相担体が基板担体である場合、標的物質が特異的に結合したＲＮＡアプタマー候補の選別においては、イメージングスキャナー、アレイスキャナー、あるいは顕微鏡等を用いた微小領域の特定を行うことができる。具体的には、固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を含む基板状担体を標的物質と接触させた後、必要に応じて洗浄操作を行い、その後、特定の微小領域に固定化されたＲＮＡアプタマー候補に特異的結合した標的物質が発するシグナルをイメージングすることができる。これによって、標的物質と結合したＲＮＡアプタマー候補を有するＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のクローンが固定化された微小領域を特定することができる。特定された微小領域におけるＲＮＡ／ＤＮＡ複合体は、予め、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体が、光開裂性基を介して基板状担体へ固定化されている場合は、特定された微小領域に光を照射して光開裂性基を開裂させることで、特定した微小領域からＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を遊離し、回収することができる。
【００６２】
本発明によると、ＲＮＡアプタマー候補のスクリーニング効率を飛躍的に向上させることができる。同じライブラリからのスクリーニングであっても、（Ｂ）工程の転写反応における条件（たとえば溶液条件等）や、（Ｃ）工程の標的物質との接触における条件（例えば標的物質の種類及び溶液条件等）が異なれば、絞り込まれるＲＮＡアプタマー候補が変わりうるものの、（Ｂ）工程の転写反応における一の条件及び（Ｃ）工程の標的物質との接触における一の条件あたりでは、非常に少ないスクリーニング回数（（Ａ）工程から（Ｃ）工程を行う回数）で効率よくＲＮＡアプタマー候補を絞り込むことができる。ライブラリにおける配列の種類が例えば１０万種類以下、好ましくは５万種類以下、より好ましくは３万種類以下である場合は、スクリーニング回数は１回でもよい。したがって、一のライブラリからＲＮＡアプタマー候補を絞り込むために、同じ条件でのスクリーニングを多数繰り返す必要がない。
【００６３】
また、本発明によると、２種類のアプタマーが組合せられた機能性アプタマーであって、一方のアプタマーの結合部位における標的分子との結合が、他方のアプタマーの結合部位における標的分子との結合に影響するアロステリックな効果を有する機能性アプタマーを獲得すること；イオン濃度、ｐＨ、共存溶質の有無など、溶液中の分子環境に応答して標的分子との結合強度を変化させる機能性アプタマーを獲得すること；ＲＮＡアプタマー候補の特定塩基と標的分子の認識に対する寄与との関連を網羅的に解析すること；非天然塩基構造を有する人工ＲＮＡアプタマーの創出；タンパク質や代謝産物とＲＮＡとの相互作用に対する特定のＲＮＡ塩基の寄与を網羅的に解析すること；細胞内在性の塩基配列から、標的分子（タンパク質など）に相互作用するＲＮＡ配列を取得すること、等が可能となる。
【００６４】
［２．ＲＮＡアプタマーのスクリーニングキット］
本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニングキットは、上述のＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法を実施するためのキットである。したがって、本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニングキットに含まれる、又は含まれてよいアイテムの構成、使用方法、作用、機能、その他の事項については、上述の「１．ＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法」で記載した通りである。
【００６５】
図７に示すように、本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニングキットは、アイテムとして、プライマー（Ｐ）と鋳型ＤＮＡ断片とを含む。鋳型ＤＮＡ断片としては、上述の一本鎖ＤＮＡ（つまり、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列と、捕捉用配列Ｘ’とを含む一本鎖ＤＮＡ）であってもよいし、当該一本鎖ＤＮＡの相補鎖ＤＮＡ（一本鎖）であってもよいし、それら一本鎖ＤＮＡ及び相補鎖ＤＮＡで構成される二本鎖ＤＮＡであってもよい。鋳型ＤＮＡ断片は、プロモータ配列の相補配列及び捕捉用配列が、プライマー（Ｐ）の配列に対応するようにあらかじめ設計されている一方、ユーザが設計したＲＮＡアプタマー候補に応じたカスタマイズが可能である。ユーザは、任意のＲＮＡアプタマー候補を複数種設計し、適当な固相担体及び単分子ＰＣＲ法に必要な試薬等を用意することで、設計したＲＮＡアプタマー候補の鋳型配列を有するＤＮＡが一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端に結合した固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を構築することができる。
【００６６】
ユーザのカスタマイズにより構築される固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）は、プライマー（Ｐ）を用い、上述の「１．ＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法」で述べた工程を経ることで、効率よくＲＮＡアプタマー候補を絞り込むことができる。
【００６７】
なお、本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニングキットにおいては、他のアイテムとして、本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法を実施するためのいかなる材料、試薬等を含んでもよい。他のアイテムとしては、例えば、固相担体；単分子ＰＣＲ用の、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、基質デオキシリボヌクレオチド；プライマー伸長反応用の、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、基質デオキシリボヌクレオチド；転写反応用の、緩衝液、ＲＮＡポリメラーゼ、基質リボヌクレオチド、エチレングリコール；標的物質、標的物質にシグナル基（一例として蛍光基）を付与するためのシグナル試薬（一例として蛍光試薬）等が挙げられる。これらの他のアイテムは、単独または２以上の組み合わせでキットに含まれてよい。
【００６８】
本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニングキットに含まれる各アイテムは、それぞれの物性等に応じ、活性及び／又は保存性等を考慮し、液状態様、粉末態様、凍結態様等の態様で提供される。さらに、それぞれのアイテムは、それぞれの物性等に応じ、活性及び／又は保存性等を考慮し、適宜、遮光、脱気、密封処理等が施された態様で包装されていてよい。
【００６９】
ＲＮＡアプタマーのスクリーニングキットには、上記のＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法の内容を示すプロトコル情報をさらに含んでよい。当該情報は、プロトコルを掲載した印刷物であってもよいし、プロトコルがインターネット等で閲覧または取得可能となるように、ウェブ上の閲覧または取得場所についての情報を掲載した印刷物であってもよい。
【００７０】
［３．ＲＮＡアプタマーのスクリーニング用ライブラリ］
本発明のＲＮＡアプタマーのスクリーニング用ライブラリは、上述のＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法に有用なライブラリである。具体的には、上述の「１．ＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法」の工程（Ｂ）に供される固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）、及び、工程（Ｃ）に供される固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）が挙げられる。それぞれのイブラリの構成、使用方法、作用、機能、その他の事項については、上述の「１．ＲＮＡアプタマーのスクリーニング方法」で記載した通りである。
【実施例】
【００７１】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００７２】
［概要］
蛍光分子である３’５’−ジフルオロ−４−ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン(ＤＦＨＢＩ)、およびその誘導体(ＤＦＨＢＩ−１Ｔ)に結合するＲＮＡアプタマー(Ｓｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡ)を利用し、Ｓｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡにおいて、結晶構造解析から明らかになっているＤＦＨＢＩの結合領域周辺の塩基を変異させたライブラリを構築し、配列最適化を試みた。ライブラリは、配列の１塩基に変異を導入しバリエーション展開したもの（実施例１）及び７塩基に変異を導入しバリエーション展開したもの（実施例２、実施例３）とを構築した。配列にバリエーションを含む鋳型二重鎖ＤＮＡ断片を作製し、エマルジョンＰＣＲにより微小担体に固定化して固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）を作製した（工程（Ａ１））後に、一本鎖となっているＤＮＡから二本鎖の鋳型ＤＮＡを合成して固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を作製した（工程（Ａ））。
【００７３】
その後、ＤＦＨＢＩ−１Ｔを含む転写溶液を、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）に添加し、転写反応をさせつつ変異を含むＳｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡを微小担体に固定化して固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を得た（工程（Ｂ））。転写反応を停止させ、微小担体を含む反応溶液をセルソータで解析しつつ、ＤＦＨＢＩ−１Ｔの蛍光シグナルを示す微小担体を選別（ソーティング）することで回収した（工程（Ｃ））。回収した微小担体の数が多い場合は、微小担体を再度精製した後に、微小担体に固定化されている鋳型ＤＮＡの配列を次世代型配列解析装置で直接解析した。回収した微小担体が少数であった場合は、回収したＤＮＡを一度ＰＣＲで増幅し、次世代型配列解析装置の常法に従いどのような配列が回収されているのかを解析した。
【００７４】
［実施例１：ＤＦＨＢＩ−１Ｔと相互作用する部位への一塩基変異導入体からのアプタマー候補のスクリーニングと直接配列解析］
本実施例で設計した鋳型二重鎖ＤＮＡ断片の作成方法、及び固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）から固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を調製する工程（工程（Ａ））において使用したプライマー（Ｐ）の配列を図８に示す。図８では、エマルジョンＰＣＲに必要な塩基配列領域を破線（塩基の表記は省略）で記し、プロモーター配列、捕捉用配列Ｘ’、バリエーションを展開したＳｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡの具体的な塩基配列（斜字体で表記）をそれぞれ記す。鋳型二重鎖ＤＮＡ断片は、化学合成で作製した部分的に相補配列を有する２本のＤＮＡを用いて、互いにＤＮＡを伸長させる反応（プライマー伸長反応）を行う事で作製した。プライマー伸長反応では、ＤＮＡを伸長させる酵素としてＴＯＹＯＢＯ社のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を用いた。
【００７５】
本実施例では、Ｓｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡの結晶構造解析から明らかにされている、ＤＦＨＢＩと直接的に相互作用する塩基１箇所をランダムに変異させた鋳型二重鎖ＤＮＡ断片を設計した。この場合、図８中Ｎで表した箇所においてＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの４種類の配列バリエーションが存在する。作製した鋳型二重鎖ＤＮＡを基に上述のエマルジョンＰＣＲの操作を行い、一本鎖ＤＮＡが固定化された微小担体（固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０)）を作製した（工程（Ａ１））。エマルジョンＰＣＲおよびその後の微小担体の精製と一本鎖化には、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈTM  ２  ＳｙｓｔｅｍおよびＩｏｎ  ＰＧＭTM  Ｈｉ−ＱTMＶｉｅｗ  ＯＴ２  Ｋｉｔを使用した。精製された固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０)にプライマー（Ｐ）と共にＤＮＡポリメラーゼを加えてプライマー伸長反応を行い、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を作製した（工程（Ａ））。工程（Ａ）におけるプライマー伸長反応では、プライマー（P）８２．５ｐｍｏｌと固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）１００万〜３００万個を混合し、ＴＯＹＯＢＯ社のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２を用いて５６℃で３０秒間の伸長反応を１サイクルのみ行った。
【００７６】
その後、固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を遠心分離により精製し、転写反応溶液（４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）、３０ｍＭＬ−グルタミン酸カリウム、８ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）とＲＮＡポリメラーゼを加えることでＲＮＡを転写し、転写されたＲＮＡが固定化された微小担体（固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ））を作製した（工程（Ｂ））。工程（Ｂ）では、ＴＡＫＡＲＡ社のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用い、一般的な転写反応条件よりも低い濃度の基質リボヌクレオチド（４０μM）を添加して転写反応を行い、転写反応溶液にはＤＦＨＢＩ−１Ｔ（５μM）を含ませた。２５℃で１０分転写反応を行い、競合ＤＮＡ（Ｔ７プロモーター配列を有する二重鎖ＤＮＡ）を添加して転写反応を停止させた後に、セルソータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａTM  ＩＩ）により蛍光シグナルの解析とＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）の分取を行った（工程（Ｃ））。
【００７７】
工程（Ｃ）で、セルソータにより、４８８  ｎｍの励起レーザー、５１５−５４５  ｎｍのバンドパスフィルターで微小担体が示す蛍光シグナルを解析したところ、蛍光シグナルの強度が異なる複数のピークが確認された（図９（ａ１））。蛍光強度が最も強いピーク領域（Ｐ３領域（存在比１０％程度））、及びＰ３領域の１／１０程度の蛍光強度を示すピーク領域（Ｐ４領域（存在比３０％程度））を指定し、それぞれ約３０万個程度の微小担体を分取した。得られた微小担体を、プライマー（Ｐ）に修飾されているビオチンを利用し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈTM  ＥＳを用いて再精製し、分取操作を行う前の微小担体と共に、次世代型のＤＮＡ配列解析装置（Ｉｏｎ ＰＧＭTM  Ｓｙｓｔｅｍ：  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて直接配列解析した。
【００７８】
Ｐ３領域、Ｐ４領域から分取した微小担体に固定化されている配列をそれぞれ約１万〜２．５万配列解析した結果、分取前の微小担体では、図８中Ｎで表した箇所においてＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（Ｕ）を有する配列の割合が、Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔ（Ｕ）＝３６．５７：２６．６８：１６．１４：２０．６２であった（図９（ａ２））のに対し、Ｐ３領域に存在していた微小担体の当該配列の割合は、Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔ（Ｕ）＝０．１０：０．０９：９９．６３：０．１８（図９（ｂ２））であり、Ｐ４領域に存在していた微小担体の当該配列の割合は、Ａ：Ｃ：Ｇ：Ｔ（Ｕ）＝９６．６２：１．７４：０．１２：１．５２（図９（ｂ１））であった。オリジナルのＳｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡにおける変異部位の配列はＧであり、蛍光シグナル強度が強かったＰ３領域では、元々のＳｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡと同じＧの配列が９９．６３％にまで濃縮された。また、弱い蛍光シグナルを示したＰ４領域においては、Ａの配列が９６．６２％にまで濃縮されており、配列の違いによる蛍光シグナル強度の変化を基に明確にＲＮＡアプタマーの選別を行う事ができた。
【００７９】
［実施例２：７塩基の変異を有する配列バリエーションからのアプタマー候補のスクリーニングと配列解析］
本実施例で設計した鋳型二重鎖ＤＮＡ断片の作成方法、及び固定化一本鎖ＤＮＡライブラリ（Ｌ０）から固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を調製する工程（工程（Ａ））において使用したプライマー（Ｐ）の配列を図１０に示す。図１０では、エマルジョンＰＣＲに必要な塩基配列領域を破線（塩基の表記は省略）で記し、プロモーター配列、捕捉用配列Ｘ’、バリエーションを展開したＳｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡの配列（斜字体で表記）をそれぞれ記す。鋳型二重鎖ＤＮＡ断片は、実施例１と同様にプライマー伸長反応を行う事で作製した。
【００８０】
Ｓｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡにおけるＤＦＨＢＩが結合する領域周辺の7箇所（7塩基）にランダムな変異を導入した鋳型二重鎖ＤＮＡ断片を設計した。この場合、図１０中Ｎで表した箇所において４7＝１６，３８４種類の配列バリエーションが存在する。実施例１と同様にして、転写されたＲＮＡが固定化された微小担体（固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ））を作製し、セルソータによる解析を行った。その結果、ほとんどの担体は蛍光シグナルを示さなかった（図１１（ａ））ものの、全体の０．０１％を下回る程度の極少数の担体、具体的には４５，８６１個の担体を解析したうちの３個の担体が、実施例１で確認されたのと同程度の強い蛍光シグナルを示した（図１１（ｂ）のＰ５で示した領域）。
【００８１】
百万個以上の微小担体をセルソーターに流し、そのうちＰ５領域に含まれる６２個の微小担体を回収した。得られた微小担体に熱（９５℃、１５分間）をかけることでＤＮＡを溶出し、ＰＣＲで増幅させた後に、再度次世代型のＤＮＡ配列解析装置を用いて配列解析を行った。その結果、元々のＳｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡと同じ配列を含む配列番号１（Ｎｏ.１）〜配列番号８（Ｎｏ.８）の８種類の配列が濃縮されてきていることが確認された（図１２（ａ））。８種類の配列のうち、配列番号８以外の７種類の配列では、変異を導入した７箇所のうち４箇所の配列が全く同じ配列であった（図１２（ｂ）の一重下線を付した配列）。また、残り３箇所の変異箇所のうち、元々のＳｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡが塩基対を形成している領域に変異を加えた２箇所では、Ｇ−Ｃの塩基対、もしくはＡ−Ｔの塩基対を組むように配列が保存されていた（図１２（ｂ）の二重下線を付した配列）。
【００８２】
濃縮されてきた８種類のＲＮＡアプタマー候補を生体外で転写してＤＦＨＢＩ−１Ｔとの結合を確認した。反応溶液（４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）、３０ｍＭＬ−グルタミン酸カリウム、８ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で２０ｎＭのＤＦＨＢＩ−１Ｔと４μＭのＲＮＡを混合して蛍光シグナル（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５０５ｎｍ）を測定した結果、配列に共通性が見られなかった配列番号８を除く７つの配列全てで、ＲＮＡとＤＦＨＢＩ−１Ｔとの結合に伴う蛍光シグナルの上昇が確認された（図１３）。微小担体の分取（選別）を行う前の固定化鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）の配列を解析し、選別前後における各配列の出現率を比較したところ、ＤＨＦＩＢＩ−１Ｔとの結合による蛍光シグナル上昇を示した上記７種類の配列については、２千倍から２万５千倍の濃縮効率を示すことが確認された（図１２（ｂ））。
【００８３】
［実施例３：溶液環境に応答するアプタマー候補のスクリーニング］
本発明では、鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）に対して異なる溶液条件で転写反応を行う、もしくは通常の転写反応で固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を作製した後に微小担体を遠心分離しつつ溶液を交換することで、様々な溶液条件で標的分子との結合を指標にアプタマーを選別することができる。そこで、実施例２で用いた１６，３８４種類の配列バリエーションを有する鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を用いて、溶液環境の違いで異なるアプタマーが選別されてくるか否かを検討した。具体的には、鋳型二重鎖ＤＮＡライブラリ（ＬＡ）を転写反応（工程（Ｂ））に供する際に、転写反応溶液に３０ｗｔ％のエチレングリコールを添加したことを除いて、実施例２と同様の工程（Ｃ）を行った。
【００８４】
エチレングリコールが多量に存在する溶液環境では、核酸分子の標準構造である二重鎖構造が不安定化する反面、フーグスティーン塩基対などを含む非標準的な構造が安定化される傾向にあることが知られている。そのため、ＤＦＨＢＩ−１Ｔに対する結合親和性も各配列バリエーションによって変化すると考えられる。転写反応後の固定化ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体ライブラリ（ＬＢ）を、実施例２と同様にセルソータで解析したところ、ほとんどの担体は蛍光シグナルを示さなかった（図１４（ａ））ものの、全体の０．０１％を下回る程度の極少数の担体、具体的には４５，８３２個の担体を解析したうちの４個の担体が、実施例２で確認されたのと同じＰ５領域に存在した（図１４（ｂ））。そのうちＰ５領域に含まれる７５個の微小担体を回収した。
【００８５】
実施例２と同様に配列解析を行った結果、３０ｗｔ％のエチレングリコールを添加した溶液条件でのみ選別されてきた配列が２種類（配列番号９（Ｎｏ．９）及び配列番号１０（Ｎｏ．１０））存在していた（図１５（ａ））。これら２種類のＲＮＡについて実施例２と同様に生体外でＲＮＡを転写して精製し、３０ｗｔ％のエチレングリコールの有無によるＤＦＨＢＩ−１Ｔとの結合親和性を評価した。反応溶液（４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）、３０ｍＭＬ−グルタミン酸カリウム、８ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で２０ｎＭのＤＦＨＢＩ−１Ｔと４μＭのＲＮＡを混合して蛍光シグナル（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５０５ｎｍ）を測定した。その結果、２種類の配列どちらにおいても、３０ｗｔ％のエチレングリコールの存在下で蛍光シグナルが上昇することが確認された（図１５（ｂ））。一方で、元々のＳｐｉｎａｃｈ  ＲＮＡでは３０ｗｔ％のエチレングリコール存在下で蛍光シグナルが減少した。つまり、本発明による手法を用いて、溶液環境の異なる２つの条件で選択されてきた配列を比較することで、特定の溶液環境に応答して標的分子との結合親和性を変化させるアプタマーをスクリーニング可能であることが示された。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明はそれらのみに限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な実施形態が他になされる。
【配列表フリーテキスト】
【００８７】
配列番号１〜１０は、ＲＮＡアプタマー候補の配列に対応するＤＮＡ配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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