(57)【要約】【課題】  より迅速で効率的な等温増幅反応により、標的核酸を増幅、検出する方法を提供すること。【解決手段】  等温増幅反応において、等温増幅反応を実施する温度よりも高い温度のサンプルを添加する標的核酸を増幅し検出する方法を用いることで、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
等温増幅反応において、等温増幅反応を実施する温度よりも高い温度のサンプルを反応試薬に添加する工程を含む、標的核酸を増幅し検出する方法。
【請求項２】
より高い温度が０．８℃以上である請求項１記載の方法。
【請求項３】
より高い温度が３．４℃以上である請求項１記載の方法。
【請求項４】
より高い温度が９．９℃以上である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記反応試薬が乾燥状態である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加熱したサンプルを用いた効率的な等温増幅反応を用いた標的核酸を増幅、検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を増幅する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が広く知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定塩基配列の一部と相補的または相同的な配列を有する一組のプライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ存在下で、熱変性−プライマーアニール−伸長反応からなるサイクルを繰り返し行なうことによってＤＮＡを増幅する方法である。また標的核酸がＲＮＡの場合、逆転写酵素によって一旦ｃＤＮＡを合成してからＰＣＲ法を行なう、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法が知られている。しかし、ＰＣＲ法およびＲＴ−ＰＣＲ法は急激に何度も反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
【０００３】
一方、ＲＮＡを標的として一定温度で核酸を増幅する方法としてＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２）、ＴＭＡ法（特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４および非特許文献１）といった方法が知られている。これらの方法は、反応温度を昇降させることなく一定温度で核酸が増幅する等温増幅反応のため、簡便に核酸を増幅することができる。そのため自動化の際の反応装置省力化や低コスト化ができる点で好ましい方法といえる。
【０００４】
感染症の臨床検査分野においては、簡便、迅速かつ高感度に病原体を検出することが重要である。高感度に病原体を検出する方法として、核酸増幅法を利用した検出法が知られている。しかし、これらの核酸増幅反応は、緊急を要する場合がしばしばある臨床検査分野ではより短時間に結果を得ることが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献２】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献３】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、より迅速で効率的な等温増幅反応により、標的核酸を増幅、検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の（１）〜（５）の態様を包含する。
（１）等温増幅反応において、等温増幅反応を実施する温度よりも高い温度のサンプルを反応試薬に添加する工程を含む、標的核酸を増幅し検出する方法
（２）より高い温度が０．８℃以上である（１）記載の方法。
（３）より高い温度が３．４℃以上である（１）記載の方法。
（４）より高い温度が９．９℃以上である（１）記載の方法。
（５）前記反応試薬が乾燥状態である（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明の一態様において等温増幅反応とは、等温で実施される核酸増幅反応であればよく、例えば、ウイルス核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、ウイルス核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、標的核酸を増幅する方法であって、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応したプロモーター配列を付加している方法（例えば、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法）が例示される。
【００１１】
本発明の一態様において等温増幅反応を実施する温度とは、それぞれの等温増幅反応に適した温度を適宜選択できる。例えばＴＲＣ法では用いる酵素の耐熱性により４３℃もしくは４６℃から選択される。
【００１２】
本発明の一態様におけるより高い温度のサンプルとは、上記等温増幅反応を実施する温度よりも高い温度であればよく、例えば０．８℃以上、好ましくは３．４℃以上、より好ましくは９．９℃以上高い液温に加熱されたサンプルである。加熱の方法はどのような方法でもよく、一般的なヒートブロックによる加熱が例示できる。
【００１３】
本発明の一態様において検出対象とする核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、例えばＴＲＣ法ではＲＮＡが選択されてよい。またこの核酸はＤＮＡ、ＲＮＡそのものであってもよく、さらにはＤＮＡ、ＲＮＡを含む微生物、細胞、ウイルス等であってもよい本発明の一態様における核酸を含んだ試料の一例として、好ましくはエンベロープを有するウイルスや一本鎖ＲＮＡを有するウイルスが例示される。エンベロープを有するウイルスとは、ウイルスカプシドが主に脂質から構成されるエンベロープにより覆われたウイルスのことをいい、一例として、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）があげられる。一本鎖ＲＮＡを有するウイルスとは、ボルティモア分類における第４群（１本鎖ＲＮＡ  ＋鎖）、第５群（１本鎖ＲＮＡ  −鎖）、第６群（１本鎖ＲＮＡ  逆転写）に属するウイルスであり、一例として、コロナウイルス、ＲＳウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、インフルエンザウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）があげられる。一本鎖ＲＮＡを有するウイルスは、ＴＲＣ法等のＲＮＡを出発物質とする核酸増幅法に適する点で好ましい。中でもインフルエンザウイルスは、本発明の抽出試薬における核酸を含んだ試料として特に好ましい。
【００１４】
本発明の一態様においてサンプルとは、検出対象の核酸を含む試料を含んでいればよく、例えば、単にＲＮＡ、ＤＮＡ、微生物、細胞、ウイルス等を水、生理食塩水や緩衝液に溶解したものや、微生物、細胞、ウイルス等を含んだ生体試料そのものや、前記生体試料を含んだ濾紙、スワブ等があげられる。前記生体試料の一例として、血液、糞便、尿、痰、リンパ液、血漿、射精液、肺吸引物、脳脊髄液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、うがい液、唾液、涙液があげられるが、これらに限定されない。サンプルには、さらに核酸の抽出に必要な成分として、界面活性剤、変性剤、有機溶媒等を含んでいてよく、等温増幅反応に必要な成分、例えばマグネシウム塩、カリウム塩等の塩類、トレハロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、核酸成分、有機溶媒、プライマーやプローブ等の核酸類、緩衝液成分等を含むことができる。
【００１５】
本発明の一態様における反応試薬には、等温増幅反応に必要な成分が含まれ、例えば酵素、マグネシウム塩、カリウム塩等の塩類、トレハロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、核酸成分、有機溶媒、プライマーやプローブ等の核酸類、緩衝液成分等を含むことができ、前記核酸を含む試料とあわせ、最終的に必要な濃度になるように調整される。
【００１６】
本発明の一態様における反応試薬は、乾燥形態であってもよい。反応試薬には酵素が含まれるため、乾燥状態にすることで液状の場合よりも保存期間を延ばし、保存に適する温度もより室温に近い状態にすることが出来る。さらに乾燥状態にすることで輸送や使う際に操作し易いという利点がある。
【００１７】
乾燥形態とする方法としては酵素の活性を失わない方法であればいずれの方法であってもよく、凍結乾燥法、蒸発乾燥法などを例示できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、増幅温度よりも高温のサンプルを用いることで、高温にしない場合と比べて、より迅速かつ高効率で等温増幅反応を実施することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、ウイルスとしてインフルエンザウイルスを用いたときの実施例および参考例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら例により限定されるものではない。
【００２０】
実施例１  標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したプライマー及びインターカレーター性蛍光色素標準核酸プローブは特開２０１６−１３１４９８号公報に記載の方法で調製した。
【００２１】
実施例２  蒸発乾燥増幅試薬の調製方法
以下の組成からなる試薬液１８．５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、真空凍結乾燥機（Ｖｉｒｔｉｓ  ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｐｌｕｓ、セントラル科学貿易社製）にて、２５℃  １００ｔｏｒｒ１６時間、５０℃  １．５時間、２５℃  で庫内温度が落ち着くまで蒸発乾燥した。乾燥後の増幅試薬は密栓した上で乾燥剤と共に４℃で保存した。
【００２２】
試薬液の組成：濃度はＴＲＣ反応（３０μＬ中）の最終濃度
６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．７ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ  ＩＴＰ
１９８．９ｍＭ  トレハロース
９．１Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（配列番号１；実施例１で調製）
第一のプライマー（配列番号２；実施例１で調製）
第二のプライマー（配列番号３；実施例１で調製）
８．２％（ｗ／ｗ）２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン。
【００２３】
実施例３  加熱サンプルの効果
以下の方法により、加熱サンプルの効果を調べた。
（１）Ｂ型インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／２／２０１２株）を、注射用水で１．０×１０−１ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度に希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料５０μＬを、以下の組成からなるウイルス抽出液１０００μＬに添加、撹拌しサンプル液とした。
【００２４】
ウイルス抽出液の組成：  
２２．２ｍＭ  塩化マグネシウム
７５．０ｍＭ  塩化カリウム
１．２％  グリセロール
１１．０％  ＤＭＳＯ
０．０５％  （ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０
１．５％  （ｗ／ｗ）コール酸ナトリウム
５４ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６５）
４ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
３ｍＭ  ＫＯＨ
（３）（２）のサンプル液を表１に記載の設定温度で１分間加熱した後、実施例２で作製した蒸発乾燥試薬にマイクロピペットで３０μＬ添加、混合した。
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。試薬混合時を０分として、陽性判定が得られるまでに要した時間を検出時間とし表１に記載した。
（５）また、別途調整したウイルス抽出液１０００μＬを同様に加熱し、その液温を測定することで、加熱したサンプルの液温とし表１に記載した。
【００２５】
【表１】
2019129798.tif 000002
【００２６】
その結果、サンプルの温度を反応温度と同じ約４６℃にした場合は検出時間が６．３９分であるのに対し、サンプルの温度をより高い４６．８℃にした場合は４．８３分とより迅速に増幅反応を実施することができた。さらにこの効果は液温を上げていくと向上し、反応温度よりも約１０℃高い液温５５．９℃で２．９２分となり、その後は７４．４℃までほぼ同等の迅速性を示した。
【００２７】
すなわち増幅温度よりも高温のサンプルを用いることで、高温にしない場合と比べて、より迅速かつ高効率で等温増幅反応を実施することができることが示された。
【配列表】
2019129798000001.app