(57)【要約】【課題】人工多能性幹細胞を効率よく内胚葉細胞へと分化誘導できる分化誘導方法を提供する。【解決手段】少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成される培養容器に、ビトロネクチン濃度が０．５０〜１．２０μｇ／ｍｌのコート剤を用いて、少なくとも前記培養面にコーティングを施し、該コーティングが施された前記培養容器内で人工多能性幹細胞を培養し、前記培養面に人工多能性幹細胞を接着させて内胚葉細胞へと分化誘導させる、人工多能性幹細胞の分化誘導方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成される培養容器に、ビトロネクチン濃度が０．５０〜１．２０μｇ／ｍｌのコート剤を用いて、少なくとも前記培養面にコーティングを施し、
該コーティングが施された前記培養容器内で人工多能性幹細胞を培養し、前記培養面に人工多能性幹細胞を接着させて内胚葉細胞へと分化誘導させる、人工多能性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項２】
前記脂環構造含有重合体が、極性基を有しないものである、請求項１に記載の人工多能性幹細胞の分化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の分化誘導方法に関し、特に人工多能性幹細胞から内胚葉細胞への分化誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞の分化誘導においては、人工多能性幹細胞を浮遊培養することによって、三胚葉すべてに分化できる三次元の細胞塊である胚様体（embryoid body；ＥＢ）を形成する方法が一般的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2015/199117号
【特許文献２】国際公開第2017/115706号
【特許文献３】特開2017-018137号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kazutoshi Takahashiら、「Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors」、2006、Cell、Volume 126、Issue 4、p663-676
【非特許文献２】Kazutoshi Takahashiら、「Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors」、2007、Cell、Volume 131、Issue 5、p861-872
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、この方法では、胚様体がすべての胚葉に分化可能であるため（非特許文献１、２）、目的の胚葉への分化を制御する必要がある。
【０００６】
特許文献１および２には、胚様体を形成しない分化誘導の方法として、未分化細胞の分化誘導培養時に、当該未分化細胞が脂環構造含有重合体製成形体と接触すると、分化誘導が促進されることが記載されている。
【０００７】
ところで、未分化能を維持したまま人工多能性幹細胞を増殖させるためには、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、またはこれらの部分配列などの細胞外基質を含む溶液状のコート剤を培養容器内に入れて一定時間静置し、物理的にこれらを培養容器の内面に吸着させることよって、人工多能性幹細胞が培養容器に接着しやすくなるようにするのが一般的である（例えば、特許文献３）。
【０００８】
本発明は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、人工多能性幹細胞を効率よく内胚葉細胞へと分化誘導できる分化誘導方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる従来技術の下、本発明者は、人工多能性幹細胞を脂環構造含有重合体で構成される培養容器内で分化誘導し、高効率で内胚葉細胞を得るべく鋭意検討した結果、コート剤のビトロネクチンの濃度が一定範囲である場合に、脂環構造含有重合体で構成される培養容器に人工多能性幹細胞を接着させることができ、その結果、内胚葉細胞への高い分化誘導促進効果が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、上記の知見に基づきなされたものであって、上記課題を有利に解決することを目的とするものであり、本発明の一態様は、少なくとも培養面が脂環構造含有重合体で構成される培養容器に、ビトロネクチン濃度が０．５０〜１．２０μｇ／ｍｌのコート剤を用いて、少なくとも前記培養面にコーティングを施し、該コーティングが施された前記培養容器内で人工多能性幹細胞を培養し、前記培養面に人工多能性幹細胞を接着させて内胚葉細胞へと分化誘導させる、人工多能性幹細胞の分化誘導方法である。
脂環構造含有重合体で構成される培養容器に対してビトロネクチン濃度が０．５０〜１．２０μｇ／ｍｌのコート剤を用いることにより、人工多能性幹細胞を効率よく内胚葉細胞へと分化誘導することができる。
【００１１】
また、上記態様では、前記脂環構造含有重合体が、極性基を有しないものであることが好ましい。脂環構造含有重合体が極性基を有しない場合に、ビトロネクチンの濃度を制御することによるｉＰＳ細胞の接着性の調節が容易となるからである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、人工多能性幹細胞を効率よく内胚葉細胞へと分化誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ビトロネクチン濃度が０.１５〜５.００μｇ／ｍｌのコート剤で、表面処理されたノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物からなる培養容器上に、人工多能性幹細胞を播種した際の、顕微鏡観察像である。
【図２】図２は、ビトロネクチン濃度が０.５０〜５.００μｇ／ｍｌのコート剤で、表面処理されたノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物からなる培養容器上に、人工多能性幹細胞を播種し、ＡＣＴＩＶＩＮ  ＡおよびＢＭＰ４で内胚葉細胞へと分化誘導した際の、内胚葉マーカー遺伝子の転写量を定量したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明の方法は、人工多能性幹細胞を、中内胚葉細胞を経て内胚葉細胞へ分化させるにあたって、所定濃度のビトロネクチンを含むコート剤で、細胞や培地が接する面（以下、「培養面」という）を表面処理した脂環構造含有重合体で構成される培養容器を用いる点に特徴がある。
この表面処理を施すことで、人工多能性幹細胞が培養容器に接着することができ、かつ、脂環構造含有重合体との接触により得られる分化誘導効率の向上効果が得られる。上記方法によれば、人工多能性幹細胞を浮遊状態で培養しないため、三胚葉いずれにも分化可能な胚様体は形成されない。
【００１５】
本明細書において、人工多能性幹細胞とは、体細胞に初期化因子を作用させることにより人工的に分化多能性を獲得した細胞を指す。
【００１６】
本明細書において、ビトロネクチンとは、ビトロネクチンレセプターを保有する細胞に対して接着活性を持つ４７８アミノ酸残基からなる糖タンパク質であり、動物細胞を培養する時に足場依存性細胞が培養面（専ら容器内側底面であるが、これに限定されない。）に接着し伸展して増殖を促すために用いられるものを指す。上記ビトロネクチンは、細胞接着分子として機能する範囲で、部分配列を欠失したものであってもよい。具体的には、Ｎ末端側にある２０アミノ酸からなるシグナルドメインが欠失した組み換えビトロネクチン；Ｃ末端部分（３９９番目のアミノ酸〜４７８番目のアミノ酸配列部分）が欠失した組み換えビトロネクチン；その他市販されている組み換えビトロネクチン；が挙げられる。
【００１７】
所定濃度のビトロネクチンを含むコート剤は、通常、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）など体液の浸透圧と等しくｐＨ緩衝性のある緩衝液に、上述したビトロネクチンを溶解させて調製される。緩衝液に溶解させるビトロネクチンの濃度は、０．５０〜１．２０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５０〜１.００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５０μｇ／ｍｌ〜０．８３μｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．５０μｇ／ｍｌ〜０．７０μｇ／ｍｌである。濃度が低すぎると、ビトロネクチンが培養面に十分にコートされず人工多能性幹細胞が接着せず、逆に高すぎると十分な分化誘導促進効果が得られなかったり、コーティングの操作性が悪くなったりする。
【００１８】
上記コート剤を用いて脂環構造含有重合体からなる培養容器の培養面を表面処理することで、培養面にビトロネクチンをコーティングする。
培養面の表面処理方法は、一般的な細胞基質を培養容器にコートする方法と同様であり、通常、培養容器に上述のコート剤を入れて培養温度付近の温度で、通常１０分間〜５時間、好ましくは３０分間〜２時間静置しコート剤を培養面に接触させた後、コート剤を除去する方法が採用される。接触時間が短すぎるとビトロネクチンのコートが不十分となる。一方で、脂環構造含有重合体からなる成形体表面へのタンパク質吸着性は低く、ポリスチレンなどのように多層吸着しないため、接触時間を長くしても、吸着量が増えることはない。従って、接触時間を長くする必要はない。
【００１９】
なお、コート剤除去後、ビトロネクチンの乾燥を防ぐために、速やかに培地を添加することが望ましい。
培養容器に添加するコート剤の量は、脂環構造含有重合体で構成される培養容器の表面は水性溶液をはじきやすいため、一般的なポリスチレン製細胞培養容器に添加するコート剤量より１．５〜３倍程度多く添加することが望ましく、具体的には培養容器底面積１ｃｍ２に対して、０．１５〜０．２５ｍｌを添加するのが好ましい。
【００２０】
本発明において、人工多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化誘導するためには、まず中内胚葉細胞への分化誘導が必要となる。中内胚葉細胞への分化誘導は、公知の中内胚葉細胞への分化誘導培地を用い、採用した分化誘導培地に適した培養条件で培養すればよい。その後、内胚葉細胞へ分化誘導するため、培地を、公知の内胚葉細胞への分化誘導培地に変更し、採用した分化誘導培地に適した培養条件で培養すれば良い。
【００２１】
液体培地には、添加剤を配合することもできる。添加剤としては、ミネラル、金属、ビタミン成分等が挙げられる。
これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２２】
本発明に用いる脂環構造含有重合体で構成される培養容器は、脂環構造含有重合体を培養容器として用いることが可能な任意の形状に成形してなるものである。培養容器のうち、少なくとも細胞や培養液と接する培養面が脂環構造含有重合体で構成されていればよい。あるいは、培養容器全体が脂環構造含有重合体からなることとしてもよい。例えば、バッグなどの場合、異なるポリマー材料からなるフィルムの積層体であって、最内層（バッグ内面）が脂環構造含有重合体からなるフィルムにより形成された層であればよい。また、培養ディッシュであれば、必要に応じて添加剤を加えて脂環構造含有重合体を成形し、実質的に容器全体を脂環構造含有重合体で構成することもできる。
【００２３】
培養容器の成形方法は、培養容器の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法の具体例としては、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
【００２４】
脂環構造含有重合体は、主鎖および／または側鎖に脂環構造を有する樹脂であり、機械的強度、耐熱性などの観点から、主鎖に脂環構造を含有するものが好ましく、分化誘導効率の観点から、極性基を有しないものがより好ましい。ここで、極性基とは、極性のある原子団を指す。極性基としては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、酸無水物基などが挙げられる。
【００２５】
上記脂環構造としては、飽和環状炭化水素（シクロアルカン）構造、不飽和環状炭化水素（シクロアルケン）構造などが挙げられるが、機械的強度、耐熱性などの観点から、シクロアルカン構造やシクロアルケン構造が好ましく、中でもシクロアルカン構造を有するものが最も好ましい。
【００２６】
脂環構造を構成する炭素原子数は、格別な制限はないが、通常４〜３０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは５〜１５個である。脂環構造を構成する炭素原子数がこの範囲内であるときに、機械的強度、耐熱性、および成形性の特性が高度にバランスされ、好適である。
【００２７】
脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常３０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上である。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合が過度に少ないと耐熱性に劣り好ましくない。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位以外の残部は、格別な限定はなく、使用目的に応じて適宜選択される。
【００２８】
脂環構造含有重合体の具体例としては、（１）ノルボルネン系重合体、（２）単環の環状オレフィン系重合体、（３）環状共役ジエン系重合体、（４）ビニル脂環式炭化水素系重合体、および（１）〜（４）の水素化物などが挙げられる。これらの中でも、耐熱性、機械的強度等の観点から、ノルボルネン系重合体およびその水素化物が好ましい。
【００２９】
（１）ノルボルネン系重合体
ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。
【００３０】
開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の開環重合体およびノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体、ならびにこれらの水素化物などが挙げられる。付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の付加重合体およびノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体などが挙げられる。これらの中でも、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物が、耐熱性、機械的強度等の観点から好ましい。
【００３１】
ノルボルネン系重合体の合成に使用可能なノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン（慣用名ノルボルネン）、５−メチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５，５−ジメチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチリデン−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−ビニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メチル−５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン等の２環式単量体；
トリシクロ［４．３．０１，６．１２，５］デカ−３，７−ジエン（慣用名ジシクロペンタジエン）、２−メチルジシクロペンタジエン、２，３−ジメチルジシクロペンタジエン、２，３−ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；
テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８，９−ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチル−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデン−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−メチル−８−カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、
７，８−ベンゾトリシクロ［４．３．０．１２，５］デカ−３−エン（慣用名メタノテトラヒドロフルオレン：１，４−メタノ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４−メタノ−８−メチル−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−クロロ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−ブロモ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。
【００３２】
ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４−シクロヘキサジエン、１，５−シクロオクタジエン、１，５−シクロデカジエン、１，５，９−シクロドデカトリエン、１，５，９，１３−シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。
これらの単量体は、置換基を１種または２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
【００３３】
ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等の炭素数２〜２０のα−オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０２，１０．０３，８］テトラデカ−３，５，７，１２−テトラエン（３ａ，５，６，７ａ−テトラヒドロ−４，７−メタノ−１Ｈ−インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４−ヘキサジエン、４−メチル−１，４−ヘキサジエン、５−メチル−１，４−ヘキサジエン、１，７−オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。
【００３４】
これらの中でも、ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、α−オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
これらの単量体は、置換基を１種または２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
【００３５】
ノルボルネン系単量体の開環重合体、またはノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウムなどの金属のハロゲン化物と、硝酸塩またはアセチルアセトン化合物、および還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデンなどの金属のハロゲン化物またはアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウムなどの遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素−炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。
【００３６】
ノルボルネン系単量体の付加重合体、またはノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウムまたはバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
【００３７】
（２）単環の環状オレフィン系重合体
単環の環状オレフィン系重合体としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテンなどの、単環の環状オレフィン系単量体の付加重合体を用いることができる。
（３）環状共役ジエン系重合体
環状共役ジエン系重合体としては、例えば、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエンなどの環状共役ジエン系単量体を１，２−または１，４−付加重合した重合体およびその水素化物などを用いることができる。
（４）ビニル脂環式炭化水素重合体
ビニル脂環式炭化水素重合体としては、例えば、ビニルシクロヘキセン、ビニルシクロヘキサンなどのビニル脂環式炭化水素系単量体の重合体およびその水素化物；スチレン、α−メチルスチレンなどのビニル芳香族系単量体の重合体の芳香環部分の水素化物；などが挙げられる。ビニル脂環式炭化水素重合体は、これらの単量体と共重合可能な他の単量体との共重合体であってもよい。
【００３８】
脂環構造含有重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーで測定したポリイソプレン換算の重量平均分子量で、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００〜５００，０００、より好ましくは８，０００〜２００，０００、特に好ましくは１０，０００〜１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
【００３９】
脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０〜３００℃、好ましくは１００〜２８０℃、特に好ましくは１００〜２５０℃、さらに好ましくは１００〜２００℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
本発明において脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、ＪＩＳ  Ｋ  ７１２１に基づいて測定されたものである。
【００４０】
上記脂環構造含有重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
また、脂環構造含有重合体には、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料などの着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤などの配合剤を、通常採用される量、添加することができる。
また、脂環構造含有重合体には、軟質重合体以外のその他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。脂環構造含有重合体に混合されるその他の重合体の量は、脂環構造含有重合体１００質量部に対して、通常２００質量部以下、好ましくは１５０質量部以下、より好ましくは１００質量部以下である。
脂環構造含有重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると細胞が浮遊し難くなるため、いずれも脂環構造含有重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
脂環構造含有重合体と配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合の順番に格別な制限はない。配合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機などを用いて樹脂を溶融状態で混練する方法、適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、または直接乾燥法により溶剤を除去する方法などが挙げられる。
二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。
【００４１】
脂環構造含有重合体で構成される容器の成形方法は、所望される培養容器の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法としては、例えば、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
培養容器の形状としては、ディッシュ、プレート、マイクロ流路チップ、バッグ、チューブ、スキャホールド、カップ、ジャー・ファーメンターなどが挙げられる。
【００４２】
本発明において培養容器は、滅菌処理することが好ましい。
滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法などの加熱法；γ線や電子線などの放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）などのガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から、成形体の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。なかでも、表面の極性状態の変化が少ないことから、ガス法が好ましい。
【００４３】
また、培養面を含む培養容器の内表面は、プラズマ処理、コロナ放電処理、オゾン処理、紫外線照射処理など培養容器に対して一般的に施す、滅菌目的以外の処理を行うこともできる。ただし、これらの表面処理操作を施すことにより発生する費用を抑えることができることや、表面処理に伴う培養容器内表面の部分分解により清浄性が損なわれるおそれがあることなどから、これらの内表面処理操作を行わない、または内表面処理前の容器底面（培養液に接する側）の水接触角に対して、使用時の同底面の水接触角が±２０％、好ましくは±１０％の弱い表面処理しかされていないことが好ましい。ここで、水接触角は、全自動接触角計（協和界面科学社製「ＬＣＤ−４００Ｓ」）を用い、ディッシュ底面をΦ３０ｍｍのサークルカッターで切り取って試料の中心と、そこを中央とする１辺２０ｍｍの正方形の頂点４か所の計５か所を測定点とし、液滴の半径ｒと高さｈを求め、ｔａｎθ１＝ｈ／ｒ,θ=２θ１→θ＝２ａｒｃｔａｎ（ｈ／ｒ）で求められるθである（θ／２法）。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（実施例Ｉ）
脂環構造含有重合体として、ゼオノア（登録商標）１０６０Ｒ（日本ゼオン社製、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物；以下、単に「１０６０Ｒ」という）を用いて、射出形成法により、直径３５ｍｍのウェルを６つもつ、６ウェルプレートを得、次いで、エチレンオキサイド滅菌処理を行った。以下、この培養容器を「１０６０Ｒ製プレート」という。
培養容器として１０６０Ｒ製プレートに、ビトロネクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ａ１４７０００）を表１に記載の濃度になるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解して希釈したコート剤を２ｍｌ入れ、３７℃で１時間温置した後、コート剤を容器から除去し、ビトロネクチンコートしたプレートを得た。
通常、ビトロネクチンをコート剤として使用する場合、５.０μｇ／ｍｌでの使用が推奨されているので、その濃度を基準値（１倍）として、希釈列を作製し、各々コート剤として用いた。
得られたプレートの各ウェルに、基礎培地として３％血清代替品ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（以下、「ＫＳＲ」という；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＡＣＴＩＶＩＮ  Ａ（Ｒ＆Ｄ社製、最終濃度：１５ｕｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製、最終濃度：３．７５ｎｇ／ｍＬ）を、基礎培地（コージンバイオ社製）に添加し、合成培地（以下「ｉＰＳ分化誘導培地」という）を作製し、１０６０Ｒ製プレートの各ウェルに入れた。次いで、人工多能性幹細胞を３．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで、１０６０Ｒ製プレートの各ウェルに播種した後、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｗａｋｏ社製、最終濃度：１０μＭ）を添加し、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で２４時間培養した。その後、培地を除去し、再び、ｉＰＳ分化誘導培養培地を入れて、２日間、同じ条件下で培養を継続した。培地交換は２４時間毎に実施した。培養中の細胞の顕微鏡観察像を図１に示す。
コート剤のビトロネクチン濃度を、０．６０μｇ／ｍｌとした場合に、接着細胞数のわずかな減少が確認されたものの、ビトロネクチン濃度：０．６０μｇ／ｍｌ以上では分化誘導試験に供するに問題ない程度に十分な接着状態を保っていた。ビトロネクチン濃度を、０．５０μｇ／ｍｌまで下げた場合であっても、細胞の接着状態は保たれる。一方、ビトロネクチン濃度：０．３０μｇ／ｍｌおよび０.１５μｇ／ｍｌでは、細胞は十分に接着状態を保てず、浮遊してしまう細胞（丸くなっている部分）も見られ、分化誘導試験を実施することが困難であった。
また、これら細胞試料から、中内胚葉マーカーであるＣＥＲ１遺伝子の転写量を、リアルタイムＰＣＲ法（内部標準遺伝子は、ＧＡＰＤＨ遺伝子）により定量したところ、０．６０μｇ／ｍｌ以上のビトロネクチン濃度でコートしたプレートで培養した細胞試料では、いずれも、上記中内胚葉マーカーが発現されていた。
なお、ポリスチレン製６ウェルプレートを用いて同様の細胞培養を行ったところ、１０６０Ｒ製プレートと比較して接着細胞数に差が生じず、１０６０Ｒ製プレートにおいて十分に細胞の接着性が保たれていることを確認した。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
（実施例ＩＩ）
１０６０Ｒ製プレートに用いるコート剤の濃度を表２の量に変更したこと以外は、実施例Ｉと同様に人工多能性幹細胞の培養を行った。
その後、上述のｉＰＳ分化誘導培地からＢＭＰ４のみを除去した内胚葉細胞分化用培地に交換して、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で更に２日間培養し、内胚葉細胞へ分化誘導を行った。
次いで、内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７遺伝子の転写量を、リアルタイムＰＣＲ法（内部標準遺伝子は、ＧＡＰＤＨ遺伝子）により定量した。
比較対照として、培養容器を、市販のポリスチレン製６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に変えたこと以外は上述と同様にして、コート剤で表面処理した容器を作製し、上述と同様の細胞培養および分化誘導操作を行い、培養細胞の中内胚葉マーカーの発現を確認した後、内胚葉マーカーの発現を定量した。
ポリスチレン製６ウェルプレートに実施例Ｉと同様にしてビトロネクチン濃度５.００μｇ／ｍｌのコート剤を塗布して実施例Ｉと同様にして定量された内胚葉マーカー量を１としたときの、各プレートでの内胚葉マーカー量の相対量を図２に示す。図２中、「ＴＣＰＳ」は、ポリスチレン製６ウェルプレートを意味し、「ＣＯＰ」は、１０６０Ｒ製プレートを意味する。
図２に示されるように、ビトロネクチン濃度１.２０μｇ／ｍｌ、ビトロネクチン濃度０.８０μｇ／ｍｌ、ビトロネクチン濃度０.５０μｇ／ｍｌで、細胞あたりの内胚葉マーカー量が増加した。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
図１および図２の結果から、ビトロネクチン濃度が０.５０〜１.２０μｇ／ｍｌの範囲であるコート剤を用いると、細胞の接着能を保持しつつ、内胚葉分化誘導が促進されること示された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の人工多能性幹細胞の分化誘導方法によれば、人工多能性幹細胞を効率よく内胚葉細胞へと分化誘導することができる。
【図１】
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【図２】
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