(57)【要約】      （修正有）【課題】γ-Glu-Val-Glyを生成するのに適したグルタチオン合成酵素（GSHB）の変異体、及びそれを用いたγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供する。【解決手段】野生型グルタチオン合成酵素において特定の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する、変異型グルタチオン合成酵素遺伝子をエシェリヒア・コリに導入し、該組換え体を使用したγ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型グルタチオン合成酵素において下記より選ばれる１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する、変異型グルタチオン合成酵素：
V7、N13、I14、N15、K17、F22、F95、M165、N199、Y200、P202、I274、T285、P287。
【請求項２】
前記変異が、下記より選ばれる１つまたはそれ以上の変異に相当する変異を含む、請求項１に記載の変異型グルタチオン合成酵素：
V7（I）、N13（K）、I14（V）、N15（H, K）、K17（R, Y）、F22（I）、F95（L）、M165（A, C, F, G, H, S, W）、N199（A, E, G）、Y200（F, H）、P202（A）、I274（M）、T285（S）、P287（V）。
【請求項３】
前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、請求項１または２に記載の変異型グルタチオン合成酵素：
M165H/V7I、M165H/N13K、M165H/I14V、M165H/N15K、M165H/N15H、M165H/K17Y、M165H/K17R、M165H/F22I、M165H/I274M、Y200F/M165S、Y200F/N199A、Y200F/N199G、Y200F/N199E、Y200F/P202A、Y200F/T285S、Y200F/F95L。
【請求項４】
前記野生型グルタチオン合成酵素が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項５】
下記工程（Ｂ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素をγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
【請求項６】
さらに、下記工程（Ａ）：
（Ａ）γ−グルタミルバリン合成酵素をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程
を含み、
前記工程（Ｂ）におけるγ-Glu-Valが、前記工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｃ）γ−グルタミルバリン合成酵素および請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
【請求項８】
前記変異型グルタチオン合成酵素が、精製酵素である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記変異型グルタチオン合成酵素が、固定化酵素である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異型グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、また
は該菌体の処理物に含有されるものである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素および変異型グルタチオン合成酵素が、両酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１３】
下記工程（Ｂ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-ValおよびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
【請求項１４】
さらに、下記工程（Ａ）：
（Ａ）γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程
を含み、
前記工程（Ｂ）におけるγ-Glu-Valが、前記工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｃ）γ−グルタミルバリン合成酵素および請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGlu、Val、およびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
【請求項１６】
前記微生物が、γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、エシェリヒア・コリである、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記各工程がATPの存在下で実施される、請求項５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項６〜１２および１４〜１８のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２０】
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、野生型グルタミン酸−システインリガーゼにおいて下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する変異型グルタミン酸−システインリガーゼである、請求項６〜１２および１４〜１８のいずれか１項に記載の方法：
L135、Q144、Y241、N243、Y300。
【請求項２１】
前記野生型グルタミン酸−システインリガーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項２０に記載の方法：
（ａ）配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号２８に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子。
【請求項２３】
請求項２２に記載の遺伝子を搭載するベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載の遺伝子を有する微生物。
【請求項２５】
γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２６】
γ−グルタミルバリン合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項２４または２５に記載の微生物。
【請求項２７】
エシェリヒア・コリである、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型グルタチオン合成酵素、及びそれを用いたγ−グルタミルバリルグリシンの製造法に関する。γ−グルタミルバリルグリシンは、食品及び医薬品等の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
γ−グルタミルバリルグリシン（L-γ-glutamyl-L-valyl-glycine；以下、「γ-Glu-Val-Gly」ともいう。）のようなある種のペプチドは、カルシウム受容体活性化作用を有している（特許文献１）。このようなカルシウム受容体活性化作用を有するペプチドは、飲食品にコク味を付与できること（特許文献２）、低脂肪食品の呈味、特に脂肪様濃厚感及び滑らかさ、を改善できること（特許文献３）、及び、甘味物質のボディー感を改善し、甘味物質特有の苦味を改善できること（特許文献４）が知られている。
【０００３】
また、前記のようなペプチドは、下痢（特許文献５）、糖尿病（特許文献６）の予防又は治療効果、及び、消化管の重炭酸分泌促進効果（特許文献７）を有することが知られている。
【０００４】
一般に、γ−グルタミルトリペプチドの製造法としては、化学合成法および酵素法が知られている。化学合成法としては、N-保護グルタミン酸無水物を利用して、ジペプチドから選択的にγ−グルタミルトリペプチドを得る方法が知られている（特許文献８）。酵素法としては、グルタミン酸−システインリガーゼおよびグルタチオン合成酵素を利用する方法が知られている（特許文献９、１０）。また、酵素法としては、γ−グルタミルトランスフェラーゼを利用し、Val-Glyをγ−グルタミル化してγ-Glu-Val-Glyを生成する方法も知られている（特許文献１１）。
【０００５】
γ−グルタミル化合物の生合成に関する研究としては、グルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly；GSH）およびその前駆体であるγ-Glu-Cysに関する研究が多くなされている。GSHは、生体内では、グルタミン酸−システインリガーゼによりGluとCysからγ-Glu-Cysが生成し、更にグルタチオン合成酵素によりGlyが結合し、生成することが知られている。グルタミン酸−システインリガーゼはGSH1遺伝子またはgshA遺伝子に、グルタチオン合成酵素はGSH2遺伝子またはgshB遺伝子にコードされていることが知られており、その性質が調べられてきた。
【０００６】
グルタチオン合成酵素（以下、「GSHB」ともいう）は、γ-Glu-CysとGlyとATPを基質として、γ-Glu-Cys-GlyとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（EC 6.3.2.3）として知られている。GSHBは、通常、酵素反応にMg2+やMn2+等の２価の金属イオンを要求する。また、GSHBは、γ-Glu-Val-Gly等の、GSH以外のγ−グルタミルトリペプチドの合成も触媒し得る。
【０００７】
エシェリヒア・コリ（Escherichi coli）のGSHBについて、Ile-226からArg-241のループがグルタチオン合成反応を触媒するのに重要な構造単位であることが報告されている（非特許文献１）。同文献には、R233A、R233K、R241A、R241Kの各変異が記載されている。また、非特許文献２には、P227A、P227V、G229A、G229V、G240A、G240V、P227V/G240Vの各変異が記載されている。また、Ile-226からArg-241のループを切断、もしくは、欠失することで、グルタチオン合成活性が低下することが報告されている（非特許文献３）。
【０００８】
また、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のGSHBについて、γ-Glu-Val-Glyを生成するのに好ましい変異及びその組み合わせが報告されている（特許文献９）。
【０００９】
しかしながら、エシェリヒア・コリのGSHBについて、γ-Glu-Val-Glyを生成するのに好ましい変異及びその組み合わせは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO2007/055388
【特許文献２】WO2007/055393
【特許文献３】WO2008/139945
【特許文献４】WO2008/139946
【特許文献５】WO2008/139947
【特許文献６】WO2009/107660
【特許文献７】WO2009/119554
【特許文献８】特開平08-119916
【特許文献９】WO2013/054447
【特許文献１０】特開2012-85637
【特許文献１１】WO2013/051685
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Biochemistry, 31, 2259-2265 (1992)
【非特許文献２】Biochemistry, 32, 12398-12404 (1993)
【非特許文献３】Archives of biochemistry and biophysics, 339, 151-156 (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、γ-Glu-Val-Glyを生成するのに適したGSHBの変異体、及びそれを用いたγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、γ-Glu-Val-Gly合成活性が向上するGSHBの変異を見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち本発明は、以下のとおり例示できる。
［１］
野生型グルタチオン合成酵素において下記より選ばれる１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する、変異型グルタチオン合成酵素：
V7、N13、I14、N15、K17、F22、F95、M165、N199、Y200、P202、I274、T285、P287。
［２］
前記変異が、下記より選ばれる１つまたはそれ以上の変異に相当する変異を含む、前記変異型グルタチオン合成酵素：
V7（I）、N13（K）、I14（V）、N15（H, K）、K17（R, Y）、F22（I）、F95（L）、M165（A, C, F, G, H, S, W）、N199（A, E, G）、Y200（F, H）、P202（A）、I274（M）、T285（S）、P287（V）。
［３］
前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、前記変異型グルタチオン合成酵素：
M165H/V7I、M165H/N13K、M165H/I14V、M165H/N15K、M165H/N15H、M165H/K17Y、M165H/K17R、M165H/F22I、M165H/I274M、Y200F/M165S、Y200F/N199A、Y200F/N199G、Y200F/N199E、Y200F/P202A、Y200F/T285S、Y200F/F95L。
［４］
前記野生型グルタチオン合成酵素が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記変異型グルタチオン合成酵素：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
［５］
下記工程（Ｂ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｂ）前記変異型グルタチオン合成酵素をγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
［６］
さらに、下記工程（Ａ）：
（Ａ）γ−グルタミルバリン合成酵素をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程
を含み、
前記工程（Ｂ）におけるγ-Glu-Valが、前記工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valである、前記方法。
［７］
下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｃ）γ−グルタミルバリン合成酵素および前記変異型グルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
［８］
前記変異型グルタチオン合成酵素が、精製酵素である、前記方法。
［９］
前記変異型グルタチオン合成酵素が、固定化酵素である、前記方法。
［１０］
前記変異型グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［１１］
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［１２］
前記γ−グルタミルバリン合成酵素および変異型グルタチオン合成酵素が、両酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［１３］
下記工程（Ｂ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｂ）前記変異型グルタチオン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-ValおよびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
［１４］
さらに、下記工程（Ａ）：
（Ａ）γ−グルタミルバリン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程
を含み、
前記工程（Ｂ）におけるγ-Glu-Valが、前記工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valである、
前記方法。
［１５］
下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｃ）γ−グルタミルバリン合成酵素および前記変異型グルタチオン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGlu、Val、およびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
［１６］
前記微生物が、γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、前記方法。
［１７］
前記微生物が、エシェリヒア・コリである、前記方法。
［１８］
前記各工程がATPの存在下で実施される、前記方法。
［１９］
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
［２０］
前記γ−グルタミルバリン合成酵素が、野生型グルタミン酸−システインリガーゼにおいて下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する変異型グルタミン酸−システインリガーゼである、前記方法：
L135、Q144、Y241、N243、Y300。
［２１］
前記野生型グルタミン酸−システインリガーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号２８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号２８に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
［２２］
前記変異型グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子。
［２３］
前記遺伝子を搭載するベクター。
［２４］
前記遺伝子を有する微生物。
［２５］
γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、前記微生物。
［２６］
γ−グルタミルバリン合成酵素をコードする遺伝子を有する、前記微生物。
［２７］
エシェリヒア・コリである、前記微生物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、γ-Glu-Val-Glyを生成するのに好適な変異型GSHBが提供される。また、本発明によれば、変異型GSHBを利用してγ-Glu-Val-Glyを効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】変異型GSHB発現株によるγ-Glu-Val-Gly生産の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。尚、本明細書において、アミノ酸は特記しない限りＬ−体である。
【００１８】
＜１＞変異型グルタチオン合成酵素（変異型GSHB）
「グルタチオン合成酵素（glutathione synthetase）」は、通常、γ-Glu-CysとGlyとATPを基質として、グルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly）とADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（EC 6.3.2.3）として知られている。本発明において、同活性を、「グルタチオン合成酵素活性」または「グルタチオン合成活性」ともいう。本発明において、グルタチオン合成酵素を、「GSHB」ともいう。また、本発明において、GSHBをコードする遺伝子を、「グルタチオン合成酵素遺伝子（GSHB遺伝子）」ともいう。
【００１９】
また、本発明において、γ-Glu-ValとGlyとATPを基質として、γ-Glu-Val-GlyとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素（gamma-Glutamylvalylglycine synthetase）活性」または「γ-Glu-Val-Gly合成活性」ともいう。
【００２０】
これらの酵素活性は、例えば、適切な条件で酵素を基質に作用させた際のγ−グルタミルトリペプチドの生成に基づいて測定することができる。これらの酵素活性は、例えば、２価の金属イオンの存在下で測定することができる。２価の金属イオンとしては、Ｍｇ２＋やＭｎ２＋が挙げられる。
【００２１】
γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性は、例えば、反応液組成を10mMγ-Glu-Val、10mM グリシン、10mM ATP、10mM MgS04、100mM Tris-HCl (pH9.0)として、反応温度30℃、反応時間1分〜50時間（例えば、30分）で、適切な量（例えば、精製酵素として0.025
mg/mL）の酵素を用いて測定することができる。本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Val-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性とする。
【００２２】
本発明において、「変異型グルタチオン合成酵素（変異型GSHB）」とは、「特定の変異」を有するGSHBをいう。また、本発明において、変異型GSHBをコードする遺伝子を、「変異型グルタチオン合成酵素遺伝子（変異型GSHB遺伝子）」ともいう。「特定の変異」については後述する。
【００２３】
本発明において、「特定の変異」を有しないグルタチオン合成酵素を「野生型グルタチオン合成酵素（野生型GSHB）」ともいう。また、本発明において、野生型GSHBをコードする遺伝子を、「野生型グルタチオン合成酵素遺伝子（野生型GSHB遺伝子）」ともいう。なお、ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。
【００２４】
以下、野生型GSHBについて説明する。
【００２５】
野生型GSHBとしては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のgshB遺伝子によりコードされるGshBタンパク質が挙げられる。エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のgshB遺伝子の塩基配列は、Blattner FR, et al. Science 277:1453-62 (1997) に開示されており、GenBank accession NC_000913.3としてNCBIデータベースに登録されているゲノム配列中の3,089,900〜3,090,850位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK-12 W3110株のgshB遺伝子の塩基配列は、MG1655株のものと同一である。W3110株のgshB遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。また、同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。すなわち、野生型GSHBは、例えば、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。また、野生型GSHBは、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。
【００２６】
野生型GSHBは、「特定の変異」を有さない限り、上記例示した野生型GSHB（例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。すなわち、野生型GSHBは、「特定の変異」を有さない限り、その他の変異を有していてもよい。バリアントとしては、例えば、上記例示した野生型GSHBのホモログや人為的な改変体が挙げられる。エシェリヒア・コリのGSHBのホモログとしては、エシェリヒア・コリのGSHBと構造の類似する他の微生物のGSHBホモログが挙げられる。他の微生物のGSHBホモログとしては、他のエシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌のGSHBホモログが挙げられる。他の微生物のGSHBホモログは、例えば、上記例示した野生型GSHBのアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから取得することができる。
【００２７】
野生型GSHBは、通常、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。ただし、本発明において、野生型GSHBは、それに対応する変異型GSHBがγ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する限り、グルタチオン合成酵素活性、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性、またはそれらの組み合わせを有していてもよく、それらのいずれも有していなくてもよい。
【００２８】
野生型GSHBは、「特定の変異」を有さない限り、上記例示した野生型GSHBのアミノ酸配列（例えば配列番号２に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、1〜50個、1〜40個、1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個を意味する。
【００２９】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異であってよい。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置
換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００３０】
また、野生型GSHBは、「特定の変異」を有さない限り、上記例示した野生型GSHBのアミノ酸配列（例えば配列番号２に示すアミノ酸配列）に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指す。
【００３１】
また、野生型GSHBは、「特定の変異」を有さない限り、上記例示した野生型GSHB遺伝子の塩基配列（例えば配列番号１に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記野生型GSHB遺伝子の塩基配列（例えば配列番号１に示す塩基配列）の全体または一部に対する相補配列を有するプローブ、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る遺伝子、例えばDNA、によってコードされるタンパク質であってもよい。そのようなプローブは、公知の野生型GSHB遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、野生型GSHB遺伝子の塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度および温度等の諸条件を適宜設定して、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３２】
また、野生型GSHB遺伝子は、野生型GSHBをコードする限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、野生型GSHB遺伝子は、コドンの縮重による上記例示した野生型GSHB遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、野生型GSHB遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されたものであってもよい。具体的には、例えば、開始コドンがATG以外である場合に、開始コドンをATGに改変することができる。
【００３３】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【００３４】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
【００３５】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST（BLAST 2.0）を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００３６】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００３７】
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、GSHAやGGT等の任意のタンパク質およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【００３８】
以下、変異型GSHBについて説明する。
【００３９】
変異型GSHBは、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する。
【００４０】
変異型GSHBは、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する限り、γ−グルタミルバリルグリシン以外のγ−グルタミルトリペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、例えば、変異型GSHBは、グルタチオン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
【００４１】
変異型GSHBは、野生型GSHBのアミノ酸配列において、「特定の変異」を有する。
【００４２】
すなわち、例えば、変異型GSHBは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHBは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有し、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、且つ、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。
【００４３】
また、言い換えると、変異型GSHBは、「特定の変異」を有する以外は、野生型GSHBと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。例えば、変異型GSHBは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHBは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、且つ、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHBは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。
【００４４】
変異型GSHBは、上記例示したような変異型GSHBのアミノ酸配列に加えて、他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。すなわち、変異型GSHBは、他のアミノ酸配列との融合タンパク質であってもよい。野生型GSHBについても同様である。「他のアミノ酸配列」は、変異型GSHBがγ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する限り、特に制限されない。「他のアミノ酸配列」は、その利用目的等の諸条件に応じて適宜選択できる。「他のアミノ酸配列」としては、例えば、ペプチドタグ、シグナルペプチド（シグナル配列ともいう）、プロテアーゼの認識配列が挙げられる。「他のアミノ酸配列」は、例えば、変異型GSHBのＮ末端、若しくはＣ末端、またはその両方に連結されてよい。「他のアミノ酸配列」としては、１種のアミノ酸配列を用いてもよく、２種またはそれ以上のアミノ酸配列を組み合わせて用いてもよい。
【００４５】
ペプチドタグとして、具体的には、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグ、Mycタグ、MBP（maltose binding protein）、CBP（cellulose binding protein）、TRX（Thioredoxin）、GFP（green fluorescent protein）、HRP（horseradish peroxidase）、ALP（Alkaline Phosphatase）、抗体のFc領域が挙げられる。Hisタグとしては、6xHisタグが挙げられる。ペプチドタグは、例えば、発現した変異型GSHBの検出や精製に利用できる。
【００４６】
シグナルペプチドは、変異型GSHBを発現させる宿主で機能するものであれば、特に制限されない。シグナルペプチドとしては、Sec系分泌経路で認識されるシグナルペプチドやTat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドが挙げられる。Tat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドとして、具体的には、E. coliのTorAシグナル配列、E. coliのSufIシグナル配列、Bacillus subtilisのPhoDシグナル配列、Bacillus subtilisのLipAシグナル配列、Arthrobacter globiformisのIMDシグナル配列が挙げられる（WO2013/118544）。シグナルペプチドは、例えば、変異型GSHBの分泌生産に利用できる。シグナルペプチドを利用して変異型GSHBを分泌生産する場合、分泌時にシグナルペプチドが切断され、シグナルペプチドを有さない変異型GSHBが菌体外に分泌され得る。すなわち、「変異型GSHBがシグナルペプチドを含む」とは、変異型GSHBが発現時にシグナルペプチドとの融合タンパク質を構成していれば足り、最終的に得られる変異型GSHBがシグナルペプチドとの融合タンパク質を構成していることを要さない。
【００４７】
プロテアーゼの認識配列として、具体的には、Factor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテアーゼの認識配列が挙げられる。プロテアーゼの認識配列は、例えば、発現した変異型GSHBの切断に利用できる。具体的には、例えば、変異型GSHBをペプチドタグとの融合タンパク質として発現させる場合、変異型GSHBとペプチドタグの連結部にプロテアーゼの認識配列を導入することにより、発現した変異型GSHBからプロテアーゼを利用してペプチドタグを切断し、ペプチドタグを有さない変異型GSHBを得ることができる。
【００４８】
変異型GSHB遺伝子は、上記のような変異型GSHBをコードする限り、特に制限されない。なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、ＤＮＡに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「変異型GSHB遺伝子」とは、変異型GSHBをコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。変異型GSHB遺伝子は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、その組み合わせであってもよい。変異型GSHB遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。変異型GSHB遺伝子は、一本鎖ＤＮＡであってもよく、一本鎖ＲＮＡであってもよい。変異型GSHB遺伝子は、二本鎖ＤＮＡであってもよく、二本鎖ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。変異型GSHB遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、ＤＮＡ残基とＲＮＡ残基の両方を含んでいてもよい。変異型GSHB遺伝子がＲＮＡを含む場合、上記例示した塩基配列等のＤＮＡに関する記載は、ＲＮＡに合わせて適宜読み替えてよい。変異型GSHB遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。
【００４９】
以下、「特定の変異」について説明する。
【００５０】
「特定の変異」とは、野生型GSHBに導入した際に、γ−グルタミルバリルグリシンの生成に適した性質を野生型GSHBに付与する変異をいう。すなわち、変異型GSHBは、「特定の変異」を有することにより、野生型GSHBと比較して、γ−グルタミルバリルグリシンの生成に適した性質を有する。γ−グルタミルバリルグリシンの生成に適した性質としては、例えば、γ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性（比活性）の上昇が挙げられる。変異型GSHBのγ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性（比活性）は、例えば、野生型GSHBのγ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性（比活性）の、１．１倍以上、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、または２０倍以上であってもよく、１０００万倍以下、１００万倍以下、１０万倍以下、１万倍以下、１０００倍以下、１００倍以下、５０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１０倍以下、７倍以下、５倍以下、３倍以下、または２倍以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。変異型GSHBのγ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性（比活性）は、具体的には、例えば、野生型GSHBのγ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性（比活性）の、１．１倍〜２倍、２倍〜３倍、３倍〜５倍、５倍〜７倍、７倍〜１０倍、１０倍〜１５倍、１．１倍〜３倍、３倍〜７倍、７倍〜１５倍、１．１倍〜７倍、または３倍〜１５倍であってもよい。これらの範囲の活性比率を示す変異として、具体的には、実施例の表３においてこれらの範囲の活性比率に該当するγ-Glu-Val-Gly合成相対活性を示す変異が挙げられる。
【００５１】
「特定の変異」としては、下記より選ばれる１又はそれ以上のアミノ酸残基における変異に相当する変異が挙げられる。
V7、N13、I14、N15、K17、F22、F95、M165、N199、Y200、P202、I274、T285、P287。
上記表記において、数字は配列番号２に示す野生型GSHBのアミノ酸配列における位置を、数字の左側の文字は配列番号２に示す野生型GSHBのアミノ酸配列における当該位置のアミノ酸残基（すなわち、変異前のアミノ酸残基；一文字表記）を、各々示す。すなわち、例えば、「M165」は、配列番号２に示す野生型GSHBのアミノ酸配列における165位のMet残基を示す。
【００５２】
上記変異において、置換後のアミノ酸残基は、変異型GSHBがγ−グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する限り、元のアミノ酸残基以外のいずれのアミノ酸残基であってもよい。置換後のアミノ酸残基として、具体的には、K（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、W（Trp）、Y（Tyr）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）の内、元のアミノ酸残基以外のものが挙げられる。
【００５３】
「特定の変異」として、具体的には、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異に相当する変異が挙げられる。すなわち、「特定の変異」は、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異に相当する変異を含んでいてよい。「特定の変異」は、例えば、下記より選ばれるいずれかの変異に相当する変異であってもよく、下記より選ばれる２又はそれ以上の変異の組み合わせに相当する変異であってもよい。
V7（I）、N13（K）、I14（V）、N15（H, K）、K17（R, Y）、F22（I）、F95（L）、M165（A, C, F, G, H, S, W）、N199（A, E, G）、Y200（F, H）、P202（A）、I274（M）、T285（S）、P287（V）。
上記表記において、数字およびその左側の文字の意味は前記と同様である。数字の右側のカッコ内の文字は、変異後のアミノ酸残基（一文字表記）を示す。すなわち、例えば、「M165（A, C, F, G, H, S, W）」は、配列番号２に示す野生型GSHBのアミノ酸配列における165位のMet残基がAla、Cys、Phe、Gly、His、Ser、およびTrpのいずれかのアミノ酸残基に置換される変異を示す。なお、各変異後のアミノ酸をカッコなしで表記してもよい。すなわち、例えば、「M165H」は、配列番号２に示す野生型GSHBのアミノ酸配列における165位のMet残基がHis残基に置換される変異を示す。
【００５４】
変異の組み合わせは特に制限されない。変異の組み合わせとしては、M165およびY200の一方または両方における変異に相当する変異を含む組み合わせが挙げられる。変異の組み合わせとして、具体的には、M165（A, C, F, G, H, S, W）およびY200（F, H）の一方または両方に相当する変異を含む組み合わせが挙げられる。変異の組み合わせとして、より具体的には、M165（A, C, F, G, H, S, W）等のM165における変異に相当する変異を含む二重変異や、Y200（F, H）等のY200における変異に相当する変異を含む二重変異が挙げられる。変異の組み合わせとして、さらに具体的には、下記の組み合わせが挙げられる。
M165H/V7I、M165H/N13K、M165H/I14V、M165H/N15K、M165H/N15H、M165H/K17Y、M165H/K17R、M165H/F22I、M165H/I274M、Y200F/M165S、Y200F/N199A、Y200F/N199G、Y200F/N199E、Y200F/P202A、Y200F/T285S、Y200F/F95L。
上記表記において、数字、数字の左側の文字、および数字の右側の文字の意味は前記と同様である。また、上記表記において、「/」で区切られた２つ又はそれ以上の変異の併記は、二重変異又はそれ以上の多重変異を示す。すなわち、例えば、「M165H/V7I」は、M165HとV7Iの二重変異を示す。
【００５５】
任意の野生型GSHBのアミノ酸配列において、「配列番号２に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基の変異に相当する変異」とは、配列番号２に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基における変異を意味する。すなわち、例えば、「M165Hに相当する変異」とは、配列番号２に示す野生型GSHBのアミノ酸配列における165位のMet残基（M165）に相当するアミノ酸残基がHis残基に置換される変異を示す。なお、ここでいう「M165に相当するアミノ酸残基」は、通常Met残基であってよいが、Met残基でなくてもよい。すなわち、例えば、「M165Hに相当する変異」は、「M165に相当するアミノ酸残基」がMet残基である場合に当該Met残基がHis残基に置換される変異に限られず、「M165に相当するアミノ酸残基」がLys、Arg、Ala、Val、Leu、Ile、Gly、Ser、Thr、Pro、Phe、Trp、Tyr、Cys、Asp、Glu、Asn、またはGln残基である場合に当該アミノ酸残基がHis残基に置換される変異も包含する。他の変異についても同様である。
【００５６】
任意の野生型GSHBのアミノ酸配列において、「配列番号２に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とは、対象の野生型GSHBのアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号２に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。すなわち、上記変異において、アミノ酸残基の位置は、必ずしも野生型GSHBのアミノ酸配列における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号２に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すもの
である。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる野生型GSHBにおいて、n位よりもＮ末端側の位置で１アミノ酸残基が欠失した場合、元のn位のアミノ酸残基はN末端から数えてn-1番目のアミノ酸残基となるが、「配列番号２に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とみなされる。同様に、例えば、ある微生物のGSHBホモログのアミノ酸配列中の100位のアミノ酸残基が、配列番号２に示すアミノ酸配列中の101位に相当するときは、当該アミノ酸残基は、当該GSHBホモログにおける「配列番号２に示すアミノ酸配列における101位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」である。
【００５７】
アラインメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して実施できる。具体的な遺伝子解析ソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASIS、ゼネティックス製のGENETYX、DDBJが公開しているClustalWなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al.,
Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987；Thompson JD et al., Nucleic
acid Reseach, 22(22), 4673-80. 1994）。
【００５８】
＜２＞変異型グルタチオン合成酵素（変異型GSHB）の製造
変異型GSHBは、変異型GSHB遺伝子を有する宿主に変異型GSHB遺伝子を発現させることにより製造できる。変異型GSHB遺伝子を有する宿主は、変異型GSHB遺伝子を適当な宿主に導入することにより取得できる。なお、「変異型GSHB遺伝子を宿主に導入する」ことには、宿主の染色体上のgshB遺伝子を「特定の変異」を有するように改変することも含まれる。なお、変異型GSHB遺伝子を有する宿主を、変異型GSHBを有する宿主ともいう。また、変異型GSHBは、変異型GSHB遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
【００５９】
変異型GSHB遺伝子は、例えば、野生型GSHB遺伝子を、コードされるGSHBが上記「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。改変のもとになる野生型GSHB遺伝子は、例えば、野生型GSHB遺伝子を有する生物からのクローニングにより、または、化学合成により、取得できる。また、変異型GSHB遺伝子は、野生型GSHB遺伝子を介さずに取得することもできる。例えば、化学合成により変異型GSHB遺伝子を直接取得してもよい。取得した変異型GSHB遺伝子は、さらに改変して利用してもよい。例えば、変異型GSHB遺伝子をさらに改変することにより別の変異型GSHB遺伝子を取得してもよい。
【００６０】
遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
【００６１】
宿主は、機能する変異型GSHBを発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、例えば、細菌、放線菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、細菌や酵母等の微生物が挙げられる。より好ましい宿主としては、細菌が挙げられる。
【００６２】
細菌としては、グラム陰性細菌やグラム陽性細菌が挙げられる。グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌が挙げられる。グラム陽性細菌としては、バチルス（Bacillus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等のコリネ型細菌、放線菌が挙げられる。エシェリ
ヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株やRosetta 2(DE3)pLysS株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。コリネ型細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）やコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）が挙げられる。
【００６３】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。また、これらの菌株は、例えば、市販品を入手することができる。
【００６４】
変異型GSHB遺伝子を宿主に導入する手法は特に制限されない。宿主において、変異型GSHB遺伝子は、当該宿主で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主において、変異型GSHB遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。宿主は、変異型GSHB遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。宿主は、１種類の変異型GSHB遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の変異型GSHB遺伝子を有していてもよい。
【００６５】
変異型GSHB遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、gshB遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、gshB遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであるのが好ましい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において機能する強力なプロモーターとしては、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、msrAプロモーター、Bifidobacterium由来のPm1プロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌において機能する強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（（EF-Tu））プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003)
311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. R
ev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００６６】
また、変異型GSHB遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、gshB遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【００６７】
変異型GSHB遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主に導入することができる。変異型GSHB遺伝子を含むベクターを、変異型GSHB遺伝子の発現ベクターまたは組み換えベクターともいう。変異型GSHB遺伝子の発現ベクターは、例えば、変異型GSHB遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。変異型GSHB遺伝子の発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同ベクターが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；pCRY30（特開平3-210184）；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX（特開平2-72876、米国特許5,185,262号）；pCRY2およびpCRY3（特開平1-191686）；pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844（特開昭58-192900）；pCG1（特開昭57-134500）；pCG2（特開昭58-35197）；pCG4およびpCG11（特開昭57-183799）；pVK7（特開平10-215883）；pVK9（US2006-0141588）；pVC7（特開平9-070291）；pVS7（WO2013/069634）が挙げられる。発現ベクターの構築の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含む変異型GSHB遺伝子をそのままベクターに組み込んでもよく、変異型GSHBのコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっているプロモーターの下流に変異型GSHBのコード領域を組み込んでもよい。
【００６８】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００６９】
また、変異型GSHB遺伝子は、例えば、宿主の染色体上へ導入することができる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. S
ci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、本発明の実施に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。染色体への遺伝子の導入の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含む変異型GSHB遺伝子をそのまま染色体に組み込んでもよく、変異型GSHBのコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在するプロモーターの下流に変異型GSHBのコード領域を組み込んでもよい。
【００７０】
染色体上に遺伝子が導入されたことは、例えば、同遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
【００７１】
形質転換法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol.
Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、形質転換法としては、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791号公報）を利用することもできる。
【００７２】
変異型GSHB遺伝子を発現するための宿主は、野生型GSHB遺伝子を有していてもよく、有していなくともよい。変異型GSHB遺伝子を発現するための宿主は、野生型GSHB遺伝子を有していないのが好ましい。野生型GSHB遺伝子を有さない宿主は、染色体上の野生型GSHB遺伝子を破壊することにより取得できる。遺伝子を破壊する方法については後述する。例えば、染色体上の野生型GSHB遺伝子を変異型GSHB遺伝子で置換することにより、野生型GSHB遺伝子を有さず、且つ、変異型GSHB遺伝子を有する宿主を取得できる。野生型GSHB遺伝子を変異型GSHB遺伝子で置換するためには、例えば、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法、及びその応用による遺伝子に対して点変異を導入する方法（Heermann, R et al., Microbial Cell Factories 7:14(2008)）等の方法を利用できる。
【００７３】
変異型GSHB遺伝子を発現するための宿主は、γ−グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質の活性が低下するように改変されていてもよい。γ−グルタミルペプチドの分
解に関与するタンパク質としては、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）が挙げられる。GGTの活性が低下することにより、γ-Glu-Valおよびγ-Glu-Val-Glyの分解を抑制することが出来る。GGTの活性は、GGTをコードするGGT遺伝子を破壊等することにより、低下させることができる。GGTおよびGGT遺伝子の一例として、エシェリヒア・コリのggt遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２９および３０に示す。
【００７４】
以下、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【００７５】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して減少していることを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、宿主が属する種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、宿主の説明において例示した株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち宿主が属する種の基準株）と比較して低下してよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含される。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も包含される。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も包含される。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００７６】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して減少することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合も包含される。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００７７】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプ
ロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下（例えば、誘導物質の非存在下）でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【００７８】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が包含される。
【００７９】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。「遺伝子の欠失」とは、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失をいう。さらには、染色体上の遺伝子のコード領域の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域（タンパク質のＮ末端側をコードする領域）、内部領域、Ｃ末端領域（タンパク質のＣ末端側をコードする領域）等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。欠失させる領域は、例えば、遺伝子のコード領域全長の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さの領域であってよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、欠失させる領域の下流でフレームシフトが生じ得る。
【００８０】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドン（ナンセンス変異）を導入すること、または１〜２塩基の付加または欠失（フレームシフト変異）を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００８１】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の塩基配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００８２】
遺伝子の破壊は、特に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が欠失（欠損）するように実施してよい。言い換えると、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、
タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失させることにより、具体的には、アミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失したタンパク質をコードするように遺伝子を改変することにより、達成できる。なお、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の領域の欠失をいう。また、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質において元のアミノ酸配列が存在しなくなることをいい、元のアミノ酸配列が別のアミノ酸配列に変化する場合も包含される。すなわち、例えば、フレームシフトにより別のアミノ酸配列に変化した領域は、欠失した領域とみなしてよい。アミノ酸配列の欠失により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。
【００８３】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した破壊型遺伝子を作製し、該破壊型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、破壊型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。破壊型遺伝子としては、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を挿入した遺伝子が挙げられる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、破壊型遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、両端に染色体上の野生型遺伝子の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、野生型遺伝子の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することができる。破壊型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport,
R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００８４】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００８５】
上記のようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【００８６】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００８７】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【００８８】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００８９】
タンパク質の量が低下したことの確認は、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの強度を確認することによって行うことが出来る。また、タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００９０】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【００９１】
上記のようにして得られた、変異型GSHB遺伝子が導入された宿主を培養することにより、変異型GSHBを発現させることができる。宿主の培養条件や遺伝子の発現誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および宿主の種類等の諸条件に応じて適宜選択すればよい。培養に用いる培地は、宿主が増殖でき、且つ、変異型GSHBを発現できるものであれば特に制限されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
【００９２】
炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、糖蜜、でんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、エタノール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
【００９３】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
【００９４】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
【００９５】
無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カリウムイオン、鉄イオン、リン酸イオンが挙げられる。
【００９６】
その他の有機成分としては、有機微量栄養源が挙げられる。有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質や、それらを含む酵母エキス等が挙げられる。
【００９７】
培養温度は、例えば、20℃〜45℃、好ましくは24℃〜45℃であってよい。培養は、通気培養が好ましい。その際の酸素濃度は、例えば、飽和濃度に対して5〜50%に、好ましくは10%程度に調節してよい。培養中のpHは、5〜9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。
【００９８】
上記のような条件下で、好ましくは10時間〜120時間程度培養することにより、変異型GSHBを含む培養物が得られる。変異型GSHBは、例えば、宿主の菌体内に蓄積し得る。「菌体」は、宿主の種類に応じて、適宜「細胞」と読み替えてよい。尚、使用する宿主及び変異型GSHB遺伝子の設計によっては、ペリプラズムに変異型GSHBを蓄積させることや、菌体外に変異型GSHBを分泌生産させることも可能である。
【００９９】
変異型GSHBは、菌体等に含まれたまま使用してもよく、適宜、菌体等から分離精製し粗酵素画分又は精製酵素として使用してもよい。
【０１００】
すなわち、例えば、宿主の菌体内に変異型GSHBが蓄積する場合、適宜、菌体を破砕、溶解、または抽出等し、変異型GSHBを回収することができる。菌体は、遠心分離等により培養物から回収することができる。細胞の破砕、溶解、または抽出等は、公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、例えば、超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。また、例えば、培地に変異型GSHBが蓄積する場合、遠心分離等により培養上清を取得し、培養上清から変異型GSHBを回収することができる。
【０１０１】
変異型GSHBの精製は、酵素の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。変異型GSHBの精製は、所望の程度に行うことができる。例えば、GGT等のγ−グルタミルペプチドの分解に関与する成分が変異型GSHBと共存している場合には、そのような成分を除去するのが好ましい。
【０１０２】
精製された変異型GSHBは、本発明の方法における「変異型GSHB」として利用できる。変異型GSHBは、遊離の状態で利用されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で利用されてもよい。
【０１０３】
また、精製された変異型GSHBに限られず、変異型GSHBを含有する任意の画分を本発明の方法における「変異型GSHB」として利用してもよい。変異型GSHBを含有する画分は、変異型GSHBがγ-Glu-ValとGlyに作用できるように含有される限り特に制限されない。そのような画分としては、例えば、変異型GSHB遺伝子を有する宿主（変異型GSHBを有する宿主）の培養物、同培養物から回収した菌体（培養菌体）、同菌体の破砕物、同菌体の溶解物、同菌体の抽出物（無細胞抽出液）、同菌体をアクリルアミドやカラギーナン等の担体で固定化した固定化菌体等の菌体処理物、同培養物から回収した培養上清、それらの部分精製物（粗精製物）、それらの組み合わせが挙げられる。これらの画分は、いずれも、単独で利用されてもよいし、精製された変異型GSHBと共に利用されてもよい。
【０１０４】
＜３＞γ−グルタミルバリン合成酵素（GSHA）およびその製造
「γ−グルタミルバリン合成酵素（γ-glutamylvaline synthetase）」とは、GluとValとATPを基質として、γ-Glu-ValとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。同活性を、「γ−グルタミルバリン合成酵素（γ-glutamylvaline synt
hetase）活性」または「γ-Glu-Val合成活性」ともいう。本発明において、γ−グルタミルバリン合成酵素を、「GSHA」ともいう。また、本発明において、GSHAをコードする遺伝子を、「γ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子（GSHA遺伝子）」ともいう。なお、GSHAには、従来グルタミン酸−システインリガーゼと呼ばれてきた酵素であって、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するものも包含される。
【０１０５】
また、GluとGlyとATPを基質として、γ-Glu-GlyとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ−グルタミルグリシン合成酵素活性」または「γ-Glu-Gly合成活性」ともいう。
【０１０６】
また、GluとCysとATPを基質として、γ-Glu-CysとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ−グルタミルシステイン合成酵素（γ-glutamylcysteine synthetase）活性」または「γ-Glu-Cys合成活性」ともいう。
【０１０７】
これらの酵素活性は、例えば、適切な条件で酵素を基質に作用させた際のγ−グルタミルジペプチドの生成に基づいて測定することができる。これらの酵素活性は、例えば、２価の金属イオンの存在下で測定することができる。２価の金属イオンとしては、Ｍｇ２＋やＭｎ２＋が挙げられる。
【０１０８】
γ−グルタミルバリン合成酵素活性は、反応液（10mM グルタミン酸、10mM バリン、10mM ATP、10mM MnS04、100mM Tris-HCl (pH7.0〜9.0)）に適切な量の酵素を添加し、30℃で30分間反応を行い、生成したγ-Glu-Val量に基づいて測定することができる。本発明においては、本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Valを生成する酵素活性を1 Uのγ−グルタミルバリン合成酵素活性（Ｍｎ２＋存在下）とする。同様に、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性は、反応液（10mM グルタミン酸、10mM グリシン、10mM ATP、10mM MnS04、100mM Tris-HCl (pH7.0〜9.0)）に適切な量の酵素を添加し、30℃で30分間反応を行い、生成したγ-Glu-Gly量に基づいて測定することができる。本発明においては、本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ−グルタミルグリシン合成酵素活性（Ｍｎ２＋存在下）とする。
【０１０９】
また、10mM MnS04に代えて10mM MgS04を含有する反応液を用いることで、Ｍｇ２＋存在下でのγ−グルタミルバリン合成酵素活性およびγ−グルタミルグリシン合成酵素活性を測定することができる。すなわち、同反応液を用いて上記と同様の条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Valを生成する酵素活性を1 Uのγ−グルタミルバリン合成酵素活性（Ｍｇ２＋存在下）とする。同様に、同反応液を用いて上記と同様の条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ−グルタミルグリシン合成酵素活性（Ｍｇ２＋存在下）とする。
【０１１０】
また、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）に対するγ−グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の比率（すなわち、γ−グルタミルバリン合成酵素活性の比活性／γ−グルタミルグリシン合成酵素活性の比活性）を「Val選択性」ともいう。Val選択性は、γ−グルタミルバリン合成酵素活性およびγ−グルタミルグリシン合成酵素活性を測定し、算出できる。
【０１１１】
GSHAは、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、γ−グルタミルバリン以外のγ−グルタミルジペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、例えば、GSHAは、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。また、例えば、GSHAは、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。GSHAは、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性を有さないのが好ましい。γ−グルタミルバリン合成酵素活性およびγ−グルタミ
ルグリシン合成酵素活性の測定方法は上述したとおりである。GSHAは、適当な条件でγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有していればよい。GSHAは、例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋の存在下、特にＭｇ２＋の存在下、でγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有していてよい。また、GSHAは、例えば、pH7.0〜9.0の少なくともいずれかのpH、特にpH9.0、でγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有していてよい。
【０１１２】
GSHAは、高いVal選択性を示すものであってよい。GSHAにおいて、Val選択性は、例えば、２．０以上、３．０以上、５．０以上、１０以上、１５以上、または２０以上であってよい。また、GSHAにおいて、Val選択性は、例えば、１０００万以下、１００万以下、１０万以下、１万以下、１０００以下、１００以下、または５０以下であってよい。また、GSHAにおいて、Val選択性は、例えば、それらの組み合わせの範囲であってもよい。GSHAは、適切な条件で上記例示したVal選択性を示すものであってよい。GSHAは、例えば、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋の存在下、特にＭｇ２＋の存在下、で上記例示したVal選択性を示すものであってよい。また、GSHAは、例えば、pH7.0〜9.0の少なくともいずれかのpH、特にpH9.0、で上記例示したVal選択性を示すものであってよい。
【０１１３】
特に、Val選択性が高いGSHAを変異型GSHBと組み合わせて利用することにより、Glu、Val、およびGlyから、γ−グルタミルグリシンの副生を低減しつつγ−グルタミルバリルグリシンを効率的に生産できると期待される。
【０１１４】
GSHAの由来は特に制限されず、微生物、植物、または動物等の任意の生物に由来する酵素を用いることができる。
【０１１５】
GSHAとしては、例えば、コクリア（Kocuria）属細菌、ミクロコッカス（Micrococcus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌のGSHAが挙げられる（WO2015/133547）。コクリア属細菌としては、コクリア・ロゼア（Kocuria rosea）やコクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）が挙げられる。ミクロコッカス属細菌としては、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）が挙げられる。コリネバクテリウム属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）が挙げられる。すなわち、GSHAは、例えば、このような微生物に由来するタンパク質であってよい。
【０１１６】
コクリア・ロゼア（AJ3132）のGSHA遺伝子の塩基配列、および同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２１および２２に示す。コクリア・リゾフィラDC2201株（ATCC 9341）のGSHA遺伝子の塩基配列、および同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２３および２４に示す。ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株（ATCC 15307）のGSHA遺伝子の塩基配列、および同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２５および２６に示す。すなわち、GSHAは、例えば、上記例示したGSHAのアミノ酸配列（例えば配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。また、GSHAは、例えば、上記例示したGSHA遺伝子の塩基配列（例えば配列番号２１、２３、または２５に示す塩基配列）を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。
【０１１７】
GSHAは、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、上記例示したGSHA（例えば、配列番号２２、２４、または２６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。同様に、GSHA遺伝子は、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、上記例示したGSHA遺伝子（例えば、配列番号２１、２３、または２５に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。GSHA遺伝子およびGSHAのバリアントについては、上述した野生型GSHB遺伝子および野生型GSHBのバリアントに関する記載を準用できる。同バリアントがγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有
する限り、基質特異性、２価の金属イオンの要求性、ｐＨ依存性等の、同バリアントの酵素学的性質は、いずれも、元のタンパク質の酵素学的性質と同一であってもよく、同一でなくてもよい。例えば、同バリアントは、γ−グルタミルバリン以外のγ−グルタミルジペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。また、例えば、同バリアントは、上記例示したVal選択性を示してもよい。
【０１１８】
また、GSHAとしては、例えば、WO2015/115612に記載の変異型グルタミン酸−システインリガーゼ（変異型GSHA）が挙げられる。
【０１１９】
本発明において、「変異型グルタミン酸−システインリガーゼ（変異型GSHA）」とは、「特定の変異」を有するグルタミン酸−システインリガーゼをいう。また、本発明において、変異型GSHAをコードする遺伝子を、「変異型グルタミン酸−システインリガーゼ遺伝子（変異型GSHA遺伝子）」ともいう。「特定の変異」については後述する。
【０１２０】
本発明において、「特定の変異」を有しないグルタミン酸−システインリガーゼを「野生型グルタミン酸−システインリガーゼ（野生型GSHA）」ともいう。また、本発明において、野生型GSHAをコードする遺伝子を、「野生型グルタミン酸−システインリガーゼ遺伝子（野生型GSHA遺伝子）」ともいう。なお、ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。
【０１２１】
野生型GSHAとしては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のgshA遺伝子によりコードされるGshAタンパク質が挙げられる。エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のgshA遺伝子の塩基配列、および同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２７および２８に示す。すなわち、野生型GSHAは、例えば、配列番号２７に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。また、野生型GSHAは、例えば、配列番号２８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【０１２２】
野生型GSHAは、「特定の変異」を有さない限り、上記例示した野生型GSHA（例えば配列番号２８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。野生型GSHA遺伝子および野生型GSHAのバリアントについては、上述した野生型GSHB遺伝子および野生型GSHBのバリアントに関する記載を準用できる。
【０１２３】
野生型GSHAは、通常、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。ただし、本発明において、野生型GSHAは、それに対応する変異型GSHAがγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性、γ−グルタミルバリン合成酵素活性、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性、またはそれらの任意の組み合わせを有していてもよく、それらのいずれも有していなくてもよい。
【０１２４】
変異型GSHAは、野生型GSHAのアミノ酸配列において、「特定の変異」を有する。すなわち、例えば、変異型GSHAは、配列番号２８に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHAは、配列番号２８に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有し、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。また、言い換えると、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、野生型GSHAと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。例えば、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２８に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ
酸配列を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。また、例えば、変異型GSHAは、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２８に示すアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。
【０１２５】
「特定の変異」とは、野生型GSHAに導入した際に、γ−グルタミルバリンの生成に適した性質を野生型GSHAに付与する変異をいう。すなわち、変異型GSHAは、「特定の変異」を有することにより、野生型GSHAと比較して、γ−グルタミルバリンの生成に適した性質を有する。γ−グルタミルバリンの生成に適した性質としては、例えば、γ−グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の上昇、γ−グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）の低下、Val選択性の上昇、およびそれらの組み合わせが挙げられる。変異型GSHAのγ−グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）は、例えば、野生型GSHAのγ−グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の、１．１倍以上、１．５倍以上、２倍以上、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、または２０倍以上であってもよく、１０００万倍以下、１００万倍以下、１０万倍以下、１万倍以下、１０００倍以下、１００倍以下、または５０倍以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
【０１２６】
「特定の変異」としては、下記より選ばれる１又はそれ以上のアミノ酸残基における変異に相当する変異が挙げられる。
L135、Q144、Y241、N243、Y300。
上記表記において、数字は配列番号２８に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における位置を、数字の左側の文字は配列番号２８に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における当該位置のアミノ酸残基（すなわち、変異前のアミノ酸残基；一文字表記）を、各々示す。すなわち、例えば、「L135」は、配列番号２８に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基を示す。
【０１２７】
上記変異において、置換後のアミノ酸残基は、変異型GSHAがγ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、元のアミノ酸残基以外のいずれのアミノ酸残基であってもよい。置換後のアミノ酸残基として、具体的には、K（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、W（Trp）、Y（Tyr）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）の内、元のアミノ酸残基以外のものが挙げられる。
【０１２８】
「特定の変異」として、具体的には、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異に相当する変異が挙げられる。すなわち、「特定の変異」は、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異に相当する変異を含んでいてよい。「特定の変異」は、例えば、下記より選ばれるいずれかの変異に相当する変異であってもよく、下記より選ばれる２又はそれ以上の変異の組み合わせに相当する変異であってもよい。また、「特定の変異」は、例えば、下記より選ばれる１又はそれ以上の変異と、それ以外のL135、Q144、Y241、N243、Y300より選ばれる１又はそれ以上のアミノ酸残基における変異との組み合わせに相当する変異であってもよい。
L135（I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T）、
Q144（F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
Y241（A）、
N243（I, W, K, R, H）、
Y300（A, H, R, K）。
上記表記において、数字およびその左側の文字の意味は前記と同様である。数字の右側のカッコ内の文字は、変異後のアミノ酸残基（一文字表記）を示す。すなわち、例えば、「L135（I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T）」は、配列番号２８に示す野生型
GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基がIle、Phe、Met、Val、Gly、Ala、Trp、Lys、His、Arg、Cys、Asn、Ser、およびThrのいずれかのアミノ酸残基に置換される変異を示す。なお、各変異後のアミノ酸をカッコなしで表記してもよい。すなわち、例えば、「L135I」は、配列番号２８に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基がIle残基に置換される変異を示す。
【０１２９】
変異の組み合わせは特に制限されない。変異の組み合わせとして、具体的には、下記の組み合わせが挙げられる。
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135F/N243W、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/N243F、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243Y、L135M/N243R、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144R/N243F、Q144D/N243W、Q144D/N243F、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144I、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135K/Q144L、L135H/Q144L、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135Q/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
上記表記において、数字、数字の左側の文字、および数字の右側の文字の意味は前記と同様である。また、上記表記において、「/」で区切られた２又はそれ以上の変異の併記は、二重変異又はそれ以上の多重変異を示す。すなわち、例えば、「L135I/Q144R」は、L135IとQ144Rの二重変異を示す。
【０１３０】
また、WO2015/115612の実施例においてγ−グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の顕著な上昇が認められた変異として、下記の変異が挙げられる。
L135（I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T）、
Q144（F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I）、
N243（R, H）、
Y300（R, K）、
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144D/N243W、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
【０１３１】
任意の野生型GSHAのアミノ酸配列において、「配列番号２８に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基の変異に相当する変異」とは、配列番号２８に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基における変異を意味する。すなわち、例えば、「L135Iに相当する変異」とは、配列番号２８に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基（L135）に相当するアミノ酸残基がIle残基に置換される変異を示す。なお、ここでいう「L135に相当するアミノ酸残基」は、通常Leu残基であってよいが、Leu残基でなくてもよい。すなわち、例えば、「L135Iに相当する変異」は、「L135に相当するアミノ酸残基」がLeu残基である場合に当該Leu残基がIle残基に置換される変異
に限られず、「L135に相当するアミノ酸残基」がLys、Arg、His、Ala、Val、Gly、Ser、Thr、Pro、Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Asp、Glu、Asn、またはGln残基である場合に当該アミノ酸残基がIle残基に置換される変異も包含する。他の変異についても同様である。
【０１３２】
任意の野生型GSHAのアミノ酸配列における「配列番号２８に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」の位置については、上述した野生型GSHBにおける変異の位置についての説明を準用できる。
【０１３３】
GSHAは、上記例示したようなGSHAのアミノ酸配列に加えて、他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。GSHAにおける「他のアミノ酸配列」については、変異型GSHBにおける「他のアミノ酸配列」についての記載を準用できる。
【０１３４】
GSHAは、GSHA遺伝子を有する宿主にGSHA遺伝子を発現させることにより製造できる。GSHA遺伝子を有する宿主は、GSHA遺伝子を適当な宿主に導入することにより取得したものであってもよく、もともとGSHA遺伝子を有するものであってもよい。なお、GSHA遺伝子を有する宿主を、GSHAを有する宿主ともいう。もともとGSHA遺伝子を有する宿主としては、上記例示したGSHAが由来する微生物が挙げられる。もともとGSHA遺伝子を有する宿主は、GSHA遺伝子の発現が増大するよう改変されていてもよい。GSHA遺伝子の発現を増大させる手法としては、GSHA遺伝子のコピー数を増加させることやGSHA遺伝子の転写効率を向上させることが挙げられる。GSHA遺伝子のコピー数の増加は、GSHA遺伝子を宿主に導入することにより達成できる。GSHA遺伝子の取得や導入については、上述した変異型GSHB遺伝子の取得や導入に関する記載を準用できる。なお、導入されるGSHA遺伝子は、宿主由来であってもよく、異種由来であってもよい。GSHA遺伝子の転写効率の向上は、GSHA遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。より強力なプロモーターとしては上述したような強力なプロモーターを利用できる。GSHA遺伝子を発現するための宿主は、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）等のγ−グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質の活性が低下するように改変されていてもよい。また、GSHAは、GSHA遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
【０１３５】
GSHA遺伝子を有する宿主を利用したGSHAの製造については、上述した変異型GSHB遺伝子が導入された宿主を利用した変異型GSHBの製造に関する記載を準用できる。製造されたGSHA（精製されたGSHAやGSHAを含有する画分）は、本発明の方法における「GSHA」として利用できる。なお、GSHAは、単独で製造してもよく、変異型GSHBとまとめて製造してもよい。例えば、GSHA遺伝子と変異型GSHB遺伝子の両方を有する宿主にそれらの遺伝子を発現させることにより、GSHAと変異型GSHBをまとめて製造することができる。
【０１３６】
＜４＞γ−グルタミルバリルグリシン（γ-Glu-Val-Gly）の製造法
本発明は、変異型GSHBを利用したγ-Glu-Val-Gly（CAS 38837-70-6、Gluvalicineとも呼ぶ）の製造法を提供する。同方法を、「本発明の方法」ともいう。γ-Glu-Val-Glyの構造式を下記式（Ｉ）に示す。
【０１３７】
【化１】
2019146519.tif 000002
【０１３８】
本発明の方法においては、具体的には、GSHA、変異型GSHB、GSHAを有する微生物、変異型GSHBを有する微生物、GSHAおよび変異型GSHBを有する微生物、Glu、Val、Gly、およびγ-Glu-Val等を適宜組み合わせて利用することにより、γ-Glu-Val-Glyを製造することができる。
【０１３９】
本発明の方法において、GSHAおよび変異型GSHBを総称して「酵素」ともいう。また、GSHAを有する微生物、変異型GSHBを有する微生物、およびGSHAおよび変異型GSHBを有する微生物を総称して「微生物」ともいう。Glu、Val、およびGlyを総称して「アミノ酸」ともいう。γ-Glu-Valおよびγ-Glu-Val-Glyを総称して「ペプチド」ともいう。Glu、Val、Gly、およびγ-Glu-Valを総称して「基質」ともいう。「基質」には、特記しない限り、さらにATPを含めてよい。酵素とそれに対応する基質との反応を「酵素反応」ともいう。
【０１４０】
アミノ酸またはγ-Glu-Valとしては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。アミノ酸またはγ-Glu-Valの製造方法は特に制限されず、例えば、公知の方法を利用できる。アミノ酸またはγ-Glu-Valは、例えば、化学合成、酵素反応、またはその組み合わせにより製造することができる。また、アミノ酸またはγ-Glu-Valは、例えば、当該アミノ酸またはγ-Glu-Valの生産能を有する微生物を培養し、培養物から当該アミノ酸またはγ-Glu-Valを回収することにより、製造することができる。アミノ酸の生産能を有する微生物としては、例えば、後述するようなアミノ酸生産菌を利用できる。γ-Glu-Valの生産能を有する微生物としては、例えば、GSHAを有する微生物を利用できる。また、アミノ酸またはγ-Glu-Valは、例えば、当該アミノ酸またはγ-Glu-Valを含有する農水畜産物から回収することにより、製造することができる。アミノ酸またはγ-Glu-Valとしては、所望の程度に精製された精製品を用いてもよく、当該アミノ酸またはγ-Glu-Valを含有する素材を用いてもよい。アミノ酸またはγ-Glu-Valを含有する素材は、酵素が当該アミノ酸またはγ-Glu-Valに作用できる態様で当該アミノ酸またはγ-Glu-Valを含有する限り特に制限されない。アミノ酸またはγ-Glu-Valを含有する素材として、具体的には、例えば、当該アミノ酸またはγ-Glu-Valの生産能を有する微生物を培養して得られた培養物、該培養物から分離した培養上清、該培養物から分離した菌体、それらの濃縮物（濃縮液）や濃縮乾燥物等の処理物が挙げられる。
【０１４１】
具体的には、例えば、GSHAを利用することにより、GluとValとを反応させ、γ-Glu-Valを生成することができる。また、具体的には、例えば、GSHAを有する微生物を利用することにより、GluとValからγ-Glu-Valを発酵生産することができる。具体的な製造条件については、後述する酵素法や発酵法における各工程の実施条件を参照できる。
【０１４２】
本発明の方法において、アミノ酸およびペプチドは、いずれも、特記しない限り、フリー体、もしくはその塩、またはそれらの混合物であってよい。すなわち、「アミノ酸」という用語は、特記しない限り、フリー体のアミノ酸、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。また、「ペプチド」という用語は、特記しない限り、フリー体のペプチド、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩は、化学的に許容されるものであれば特に制限されない。また、製造されるγ-Glu-Val-Glyを経口用途（例えば飲食品への添加用途）に用いる場合、γ-Glu-Val-Glyの塩は、化学的に許容される可食性のものであれば特に制限されない。「化学的に許容される可食性の塩」として、具体的には、例えば、カルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミン酸との塩を挙げることができる。また、「化学的に許容される可食性の塩」として、具体的には、例えば、塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマ
ル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
【０１４３】
＜４−１＞酵素法
本発明は、変異型GSHBを利用してγ-Glu-Val-Glyを酵素的に製造する方法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）」ともいう。
【０１４４】
本発明においては、変異型GSHBを利用することにより、γ-Glu-ValとGlyとを反応させ、γ-Glu-Val-Glyを生成することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）の一態様（「第１の態様」ともいう）は、（Ｂ）変異型GSHBをγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
【０１４５】
第１の態様は、さらに、（Ａ）γ-Glu-Valを生成する工程を含んでいてもよい。その場合、工程（Ｂ）におけるγ-Glu-Valとしては、工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valを用いることができる。すなわち、第１の態様は、例えば、（Ａ）γ-Glu-Valを生成する工程、および（Ｂ）変異型GSHBを工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい。工程（Ａ）は、上記のような方法により実施できる。工程（Ａ）は、例えば、GSHAをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程であってもよいし、GSHAを有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程であってもよい。第１の態様は、具体的には、例えば、（Ａ）GSHAをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程、および（Ｂ）変異型GSHBを工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい。以下、工程（Ａ）がGSHAをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程である場合を想定して第１の態様について説明するが、当該説明は他の方法で工程（Ａ）を実施する場合にも準用できる。
【０１４６】
第１の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、それぞれ別個に実施してもよく、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。すなわち、例えば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始してもよく、工程（Ａ）の進行中または完了後に工程（Ｂ）を開始してもよい。反応開示時にGSHA、変異型GSHB、Glu、Val、およびGlyを反応系に共存させることで、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始することができる。また、変異型GSHBおよび／またはGlyが反応系に共存していない条件下で工程（Ａ）を開始し、工程（Ａ）の進行中または完了後に変異型GSHBおよび／またはGlyを反応系に共存させることで、工程（Ｂ）を開始することができる。また、工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valを回収し、回収したγ-Glu-Valを用いて工程（Ｂ）を実施してもよい。γ-Glu-Valは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、工程（Ｂ）に用いてもよい。
【０１４７】
また、本発明においては、GSHAおよび変異型GSHBを利用することにより、GluとValとGlyとを反応させ、γ-Glu-Val-Glyを生成することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）の別の態様（「第２の態様」ともいう）は、（Ｃ）GSHAおよび変異型GSHBを、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。第２の態様においては、GSHA、変異型GSHB、Glu、Val、およびGlyを反応系に共存させることにより、GSHAおよび変異型GSHBを、Glu、Val、およびGlyにまとめて作用させ、γ-Glu-Val-Glyを製造することができる。
【０１４８】
本発明の方法に用いられる各酵素の態様は上述した通りである。すなわち、各酵素としては、例えば、精製された酵素、酵素を含有する任意の画分、またはそれらの組み合わせを用いることができる。各酵素としては、１種の酵素を用いてもよく、２種またはそれ以上の酵素を組み合わせて用いてもよい。
【０１４９】
酵素反応は、酵素と基質を反応液中に共存させることにより達成できる。すなわち、酵素反応は、適当な反応液中で実施できる。酵素反応は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。酵素反応は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、反応容器内の反応液中で、酵素と基質を混合することにより、酵素反応を実施できる。酵素反応は、静置で実施してもよく、撹拌や振盪下で実施してもよい。カラム式の場合は、固定化菌体又は固定化酵素を充填したカラムに基質を含有する反応液を通液することにより、酵素反応を実施できる。反応液としては、必要な成分を含有する、水や緩衝液等を用いることができる。反応液は、例えば、酵素、基質、ATP、２価の金属イオンを含有していてよい。酵素反応に用いられる成分の組み合わせは、実施する工程の種類およびその実施態様（複数の工程を同時に実施するか等）に応じて適宜選択することができる。
【０１５０】
GSHAおよび変異型GSHBは、いずれも、酵素反応にATPを利用する。よって、反応系には、ATPを適宜供給する。すなわち、反応系（反応液）は、ATPを含有していてよい。前記工程（Ａ）〜（Ｃ）は、いずれも、ATPの存在下で実施することができる。ATPの供給方法は、酵素反応にATPを利用できる限り特に制限されない。ATPは、例えば、粉末あるいは水溶液等の任意の形態で、反応液に添加することができる。また、ATPは、例えば、ATPを生成または再生する方法により反応系に供給されてもよい。ATPを生成または再生する方法としては、コリネバクテリウム属細菌を利用して炭素源からATPを供給させる方法（Hori, H
et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 48(6): 693-698 (1997)）、酵母菌体とグルコースを利用してATPを再生する方法（Yamamoto, S et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69(4): 784-789 (2005)）、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法（C. Aug’e and Ch. Gautheron, Tetrahedron Lett. 29：789-790 (1988)）、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法（Murata, K et al., Agric. Biol. Chem. 52(6): 1471-1477 (1988)）等が知られている。ポリリン酸キナーゼとしては、例えば、Sinorhizobium meliloti由来ポリリン酸キナーゼ、Escherichia coli由来ポリリン酸キナーゼ、Corynebacterium glutamicum由来ポリリン酸キナーゼが挙げられる。
【０１５１】
また、例えば、GSHAおよび変異型GSHBは、いずれも、通常、酵素反応に２価の金属イオンを要求する。よって、反応系（反応液）は、２価の金属イオンを含有していてよい。前記工程（Ａ）〜（Ｃ）は、いずれも、２価の金属イオンの存在下で実施することができる。２価の金属イオンとしては、Ｍｇ２＋やＭｎ２＋が挙げられ、好ましい２価の金属イオンとしては、Ｍｇ２＋が挙げられる。２価の金属イオンの濃度は、例えば、１〜２００ｍＭであってよい。
【０１５２】
反応条件（反応液のpH、反応温度、反応時間、基質や酵素等の各種成分の濃度等）は、γ-Glu-Val-Glyが生成する限り特に制限されない。
【０１５３】
反応液のpHは、例えば、通常6.0〜10.0、好ましくは6.5〜9.0であってよい。
【０１５４】
反応温度は、例えば、通常15〜50℃、好ましくは15〜45℃、より好ましくは20〜40℃であってよい。
【０１５５】
反応時間は、第１の態様の工程（Ａ）および工程（Ｂ）のそれぞれについて、例えば、
5分〜200時間であってよい。反応時間は、第２の態様の工程（Ｃ）について、例えば、5分〜200時間であってよい。反応液の通液速度は、例えば、反応時間が上記例示した反応時間の範囲となるような速度であってよい。
【０１５６】
反応液中の各基質の濃度は、例えば、通常0.1〜2000ｍM、好ましくは1〜2000ｍM、より好ましくは10〜1000ｍMであってよい。
【０１５７】
反応液中の各基質のモル比は、第１の態様の工程（Ａ）については、例えば、通常、Glu：Val：ATP＝1：1：1であってよく、任意の基質の比率を0.1〜10に変化させてもよい。すなわち、例えば、Glu：Val：ATP＝0.1〜10：0.1〜10：0.1〜10であってよい。反応液中の各基質のモル比は、第１の態様の工程（Ｂ）については、例えば、通常、γ-Glu-Val：Gly：ATP＝1：1：1であってよく、任意の基質の比率を0.1〜10に変化させてもよい。すなわち、例えば、γ-Glu-Val：Gly：ATP＝0.1〜10：0.1〜10：0.1〜10であってよい。反応液中の各基質のモル比は、第２の態様の工程（Ｃ）については、例えば、通常、Glu：Val：Gly：ATP＝1：1：1：2であってよく、任意の基質の比率を0.1〜10に変化させてもよく、ATPの比率を0.2〜20に変化させてもよい。すなわち、例えば、Glu：Val：Gly：ATP＝0.1〜10：0.1〜10：0.1〜10：0.2〜20であってよい。なお、第１の態様において工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施する場合、第１の態様における各基質のモル比については、適宜、第２の態様における各基質のモル比を参考にしてもよい。
【０１５８】
酵素の使用量は、例えば、酵素活性に基づいて設定することができる。GSHAの使用量は、GluおよびValの合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val合成活性に換算して、通常0.01〜1000 U、好ましくは0.1〜500 U、より好ましくは0.1〜100 Uであってよい。変異型GSHBの使用量は、第１の態様の工程（Ｂ）については、γ-Glu-ValおよびGlyの合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val-Gly合成活性に換算して、通常0.01〜1000 U、好ましくは0.1〜500 U、より好ましくは0.1〜100 Uであってよい。変異型GSHBの使用量は、第２の態様の工程（Ｃ）については、Gluの半量、Valの半量、およびGlyの全量の合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val-Gly合成活性に換算して、通常0.01〜1000 U、好ましくは0.1〜500 U、より好ましくは0.1〜100 Uであってよい。なお、第１の態様において工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施する場合、第１の態様における変異型GSHBの使用量については、適宜、第２の態様における変異型GSHBの使用量を参考にしてもよい。
【０１５９】
いずれの態様においても、酵素反応の過程において、基質、酵素、および／またはその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、追加的に反応系に添加してもよい。これらの成分は、１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。また、反応条件は、酵素反応の開始から終了まで均一であってもよく、酵素反応の過程において変化してもよい。「反応条件が酵素反応の過程において変化する」とは、反応条件が時間的に変化することに限られず、反応条件が空間的に変化することを含む。「反応条件が空間的に変化する」とは、例えば、カラム式で酵素反応を実施する場合に、反応温度や酵素濃度等の反応条件が流路上の位置に応じて異なっていることをいう。
【０１６０】
このようにして酵素反応を実施することにより、γ-Glu-Val-Glyを含有する反応液が得られる。γ-Glu-Val-Glyが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。γ-Glu-Val-Glyは、適宜、反応液から回収することができる。γ-Glu-Val-Glyの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、溶液からの結晶化、再結晶が挙げられる。これらの手法は、
１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。回収されるγ-Glu-Val-Glyは、γ-Glu-Val-Gly以外の成分、例えばγ-Glu-Val-Glyの製造に用いられた成分や水分等、を含んでいてもよい。γ-Glu-Val-Glyは、所望の程度に精製されていてよい。γ-Glu-Val-Glyは、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上の純度に精製されてよい。また、γ-Glu-Valの回収も、γ-Glu-Val-Glyの回収と同様に行うことができる。
【０１６１】
＜４−２＞発酵法
本発明は、変異型GSHBを利用してγ-Glu-Val-Glyを発酵により製造する方法を提供する。具体的には、本発明は、変異型GSHBを有する微生物を利用してγ-Glu-Val-Glyを発酵により製造する方法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）」ともいう。
【０１６２】
本発明においては、変異型GSHBを有する微生物を利用することにより、γ-Glu-ValとGlyからγ-Glu-Val-Glyを発酵生産することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）の一態様（「第３の態様」ともいう）は、（Ｂ）変異型GSHBを有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-ValおよびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
【０１６３】
第３の態様は、さらに、（Ａ）γ-Glu-Valを生成する工程を含んでいてもよい。その場合、工程（Ｂ）におけるγ-Glu-Valとしては、工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valを用いることができる。すなわち、第３の態様は、例えば、（Ａ）γ-Glu-Valを生成する工程、および（Ｂ）変異型GSHBを有する微生物を培地で培養することにより工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい。工程（Ａ）は、上記のような方法により実施できる。工程（Ａ）は、例えば、GSHAをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程であってもよいし、GSHAを有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程であってもよい。第３の態様は、具体的には、例えば、（Ａ）GSHAを有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程、および（Ｂ）変異型GSHBを有する微生物を培地で培養することにより工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい。以下、工程（Ａ）がGSHAを有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程である場合を想定して第３の態様について説明するが、当該説明は他の方法で工程（Ａ）を実施する場合にも準用できる。
【０１６４】
第３の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、それぞれ別個に実施してもよく、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。すなわち、例えば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始してもよく、工程（Ａ）の進行中または完了後に工程（Ｂ）を開始してもよい。また、第３の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、GSHAを有する微生物と、それとは別個の、変異型GSHBを有する微生物を用いて実施してもよく、GSHAおよび変異型GSHBの両方を有する単一の微生物を用いて実施してもよい。例えば、GSHAおよび変異型GSHBの両方を有する微生物を利用し、Glu、Val、およびGlyが利用可能な状態で培養を実施すれば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施することができる。また、工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valを回収し、回収したγ-Glu-Valを培地に添加して工程（Ｂ）を実施してもよい。γ-Glu-Valは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、工程（Ｂ）に用いてもよい。
【０１６５】
また、本発明においては、GSHAおよび変異型GSHBの両方を有する微生物を利用することにより、GluとValとGlyとからγ-Glu-Val-Glyを発酵生産することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）の別の態様（「第４の態様」ともいう）は、
（Ｃ）GSHAおよび変異型GSHBを有する微生物を培地で培養することによりGlu、Val、およびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
【０１６６】
基質となる各アミノ酸の供給方法は、酵素反応に当該アミノ酸を利用できる限り特に制限されない。各アミノ酸は、例えば、各工程で用いられる微生物により生合成されてもよく、培地に添加されてもよく、その組み合わせであってもよい。すなわち、例えば、Glu、Val、およびGlyの全てが微生物により生合成されてもよく、Glu、Val、およびGlyの全てが培地に添加されてもよい。また、例えば、Glu、Val、およびGlyの内、１種または２種のアミノ酸が微生物により生合成され、他のアミノ酸が培地に添加されてもよい。Glu、Val、およびGlyのいずれも、微生物により生合成され、且つ、培地に添加されてもよい。
【０１６７】
すなわち、第３の態様の一態様は、例えば、（Ｂ１）変異型GSHBを有する微生物をγ-Glu-ValおよびGlyを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法であってもよく、（Ｂ２）変異型GSHBを有し、且つ、Glyの生産能を有する微生物をγ-Glu-Valを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法であってもよい。
【０１６８】
また、第３の態様の一態様は、例えば、（Ａ１）と（Ａ２）のいずれか、および、（Ｂ１）と（Ｂ２）のいずれかを含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい：
（Ａ１）GSHAを有する微生物をGluおよびValを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程；
（Ａ２）GSHAを有し、且つ、GluおよびValの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程；
（Ｂ１）変異型GSHBを有する微生物を工程（Ａ１）または（Ａ２）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程；
（Ｂ２）変異型GSHBを有し、且つ、Glyの生産能を有する微生物を工程（Ａ１）または（Ａ２）で生成したγ-Glu-Valを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
【０１６９】
また、第４の態様の一態様は、例えば、（Ｃ１）GSHAおよび変異型GSHBを有する微生物をGlu、Val、およびGlyを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよく、（Ｃ２）GSHAおよび変異型GSHBを有し、且つ、Glu、Val、およびGlyの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい。
【０１７０】
GSHAを有する微生物としては、上述したようなGSHA遺伝子を有する微生物を、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。変異型GSHBを有する微生物としては、上述したような変異型GSHB遺伝子を有する微生物を、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。GSHAおよび変異型GSHBを有する微生物としては、上述したようなGSHA遺伝子と変異型GSHB遺伝子の両方を有する微生物を、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。
【０１７１】
アミノ酸の生産能を有する微生物は、本来的にアミノ酸の生産能を有するものであってもよく、アミノ酸の生産能を有するように改変されたものであってもよい。アミノ酸の生産能を有する微生物は、微生物にアミノ酸生産能を付与することにより、または、微生物のアミノ酸生産能を増強することにより、取得できる。GSHA遺伝子および／または変異型GSHB遺伝子の導入等の酵素生産能の付与または増強と、アミノ酸生産能の付与または増強とは、いずれを先に実施してもよい。すなわち、GSHAおよび／または変異型GSHBを有し、且つ、アミノ酸の生産能を有する微生物は、GSHAおよび／または変異型GSHBを有する微生
物を、アミノ酸生産能を有するように改変することにより取得してもよく、アミノ酸生産能を有する微生物を、GSHAおよび／または変異型GSHBを有するように改変することにより取得してもよい。Ｌ−アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、目的のアミノ酸の分解に関与する酵素も含まれる。
【０１７２】
Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ（glnA）、グルタミン酸シンターゼ（gltBD）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（icdA）、アコニテートヒドラターゼ（acnA, acnB）、クエン酸シンターゼ（gltA）、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyc）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（aceEF, lpdA）、ピルビン酸キナーゼ（pykA, pykF）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（ppsA）、エノラーゼ（eno）、ホスホグリセロムターゼ（pgmA, pgmI）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（pgk）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（gapA）、トリオースリン酸イソメラーゼ（tpiA）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（fbp）、グルコースリン酸イソメラーゼ（pgi）、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（edd）、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（eda）、トランスヒドロゲナーゼが挙げられる。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、例えば、イソクエン酸リアーゼ（aceA）、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（sucA, odhA）、アセト乳酸シンターゼ（ilvI）、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（pfl）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ldh）、アルコールデヒドロゲナーゼ（adh）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（gadAB）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（sdhABCD）が挙げられる。なお、カッコ内は、その酵素をコードする遺伝子の一例である（以下の記載においても同様）。また、Ｌ−グルタミン酸生産菌として、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869株より取得されたodhA欠損株に、V197M変異を有するmviN遺伝子を導入した組換え株（特開2010-161970）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来gltA（クエン酸シンターゼ）遺伝子を導入したパントエア・アグロメランスAJ13355株（特許第4285582号）、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有するエシェリヒア属細菌（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）が挙げられる。
【０１７３】
Ｌ−バリン生合成系酵素としては、例えば、ilvGMEDAオペロンのilvGMED遺伝子やilvBNCオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。ilvGMはアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムII（AHAS II）を、ilvEはトランスアミナーゼを、ilvDはジヒドロキシ酸デヒドラターゼを、それぞれコードする。ilvBNはアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムI（AHAS I）を、ilvCはイソメロリダクターゼを、それぞれコードする（WO00/50624）。なお、ilvGMEDAオペロンおよびilvBNCオペロンは、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、および／またはＬ−ロイシンによる発現抑制（アテニュエーション）を受ける。よって、酵素活性の増強のためには、アテニュエーションに必要な領域を除去または改変し、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するのが好ましい。また、ilvA遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、Ｌ−イソロイシン生合成系の律速段階であるＬ−スレオニンから２−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する酵素である。よって、ilvGMEDA
オペロンを利用する場合には、機能するスレオニンデアミナーゼを発現しないようにilvA遺伝子を破壊または欠損して利用するのが好ましい。Ｌ−バリンの生合成経路から分岐してＬ−バリン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、例えば、Ｌ−イソロイシン生合成に関与するスレオニンデアミナーゼ（ilvA）や、Ｄ−パントテン酸生合成に関与する酵素（panB, panC）が挙げられる。また、Ｌ−バリン生産菌として、具体的には、エシェリヒア・コリVL1970株（米国特許第5658766号）、生育のためにリポ酸を要求する変異および／またはH+-ATPaseを欠損する変異を有するエシェリヒア属細菌、および、これらの性質に加えて、少なくともilvG、ilvM、ilvE、およびilvDの各遺伝子を発現し、且つ、機能するスレオニンデアミナーゼを発現しないilvGMEDAオペロンが導入されたエシェリヒア属細菌（WO96/06926）が挙げられる。
【０１７４】
また、Ｌ−アミノ酸生産能を付与又は増強する方法としては、例えば、糖代謝に関与するタンパク質やエネルギー代謝に関与するタンパク質の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。
【０１７５】
すなわち、例えば、これらの改変を微生物に導入することにより、アミノ酸生産能を付与または増強できる。これらの改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。
【０１７６】
また、微生物は、培地中に添加されたアミノ酸を取り込む能力が向上するよう改変されていてもよい。また、微生物は、その利用態様に応じて、生成したγ-Glu-Valを菌体外に排出する能力が向上するよう改変されていてもよく、培地中に添加されたγ-Glu-Valを取り込む能力が向上するよう改変されていてもよい。また、微生物は、生成したγ-Glu-Val-Glyを菌体外に排出する能力が向上するよう改変されていてもよい。
【０１７７】
培養条件は、微生物が増殖でき、γ-Glu-Val-Glyが生成する限り、特に制限されない。培養条件については、上述した変異型GSHBの製造法における培養条件の記載を参照できる。
【０１７８】
GSHAおよび変異型GSHBは、いずれも、酵素反応にATPを利用する。よって、反応系には、ATPを適宜供給する。すなわち、反応系は、ATPを含有していてよい。前記工程（Ａ）〜（Ｃ）は、いずれも、ATPの存在下で実施することができる。ATPの供給方法は、酵素反応にATPを利用できる限り特に制限されない。ATPは、例えば、各工程で用いられる微生物により生成されてもよく、上述したようなATPを生成または再生する方法により反応系に供給されてもよい。ATPの供給には、例えば、通常のエネルギー代謝によるATP再生系が強化された微生物やポリリン酸キナーゼの作用でATPを再生する能力を有する微生物を培養液中に共存させる方法等の共培養系（特公平7-16431、特公平6-69386）が好適に利用できる。
【０１７９】
また、例えば、GSHAおよび変異型GSHBは、いずれも、通常、酵素反応に２価の金属イオンを要求する。よって、反応系は、２価の金属イオンを含有していてよい。前記工程（Ａ）〜（Ｃ）は、いずれも、２価の金属イオンの存在下で実施することができる。
【０１８０】
アミノ酸を含有する培地を用いる場合、アミノ酸は、培養開始時から培地に含まれていてもよく、培養途中の任意の時点で培地に添加されてもよい。添加のタイミングは、培養時間等の諸条件に応じて適宜変更できるが、一例としては、培養終了時の好ましくは０〜５０時間前、より好ましくは０．１〜２４時間前、特に好ましくは０．５〜６時間前であってよい。アミノ酸は、１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。培地中の各アミノ酸の濃度は、例えば、通常0.1〜2000ｍM、好ましくは1〜2000ｍM、より好ましくは10〜1000ｍMであってよい。また、培地中の各基質のモル比については、酵
素法における反応液中の各基質のモル比に関する記載を準用してもよい。
【０１８１】
このようにして培養を行うことにより、γ-Glu-Val-Glyを含む培養物が得られる。γ-Glu-Val-Glyが生成したことは、上述したように、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。γ-Glu-Val-Glyは、適宜、培養物から回収することができる。γ-Glu-Val-Glyの回収は、上述したように、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。なお、菌体内にγ-Glu-Val-Glyが蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってγ-Glu-Val-Glyを回収することができる。
【０１８２】
また、変異型GSHBを有する微生物が酵母であり、γ-Glu-Val-Glyが菌体内に蓄積する場合、同酵母は、例えば、γ-Glu-Val-Glyを含有する酵母エキスの製造に利用できる。すなわち、本発明は、同酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを含む、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法を提供する。酵母からの酵母エキスの調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。また、必要に応じて、得られた酵母エキスを濃縮してもよいし、乾燥し粉末の形態にしてもよい。
【実施例】
【０１８３】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。
【０１８４】
〔実施例１〕野生型gshB遺伝子発現プラスミドの構築
エシェリヒア・コリW3110株（ATCC 27325）のグルタチオン合成酵素をコードするgshB遺伝子（配列番号1）の発現プラスミドpET-EcgshB（特開2012-85637）を用いてエシェリヒア・コリBL21(DE3)（Life Technologies社製）を形質転換し、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-EcgshBを得た。gshB遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるGSHBのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号1および配列番号2に示す。なお、pET-EcgshBによれば、GSHBはC末端にHisタグが付加された形態で発現する。
【０１８５】
〔実施例２〕変異型gshB遺伝子発現プラスミドの構築
変異型gshB遺伝子を構築するため、Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社）を使用し、製造元のプロトコールに従って、各種変異型gshB遺伝子に対応するプライマー（配列番号3〜18）を用いて、実施例１に記載したpET21-EcGshBを鋳型として、PCRを実施した。各変異とプライマーの関係を表１に示す。表中、大文字表記の配列が変異の導入されるアミノ酸残基に対応する。
【０１８６】
得られたPCR産物をDpnIで消化した後、該反応液によりエシェリヒア・コリJM109株を形質転換し、100μg/mLのアンピシリンナトリウム（Amp）を含むLB寒天培地に塗布後、30℃で20時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから、公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、3130ジェネティックアナライザー（Life Technologies社製）を用いて塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドを変異型gshB遺伝子の発現プラスミドとして取得した。続いて、得られたプラスミドを用いてエシェリヒア・コリBL21(DE3)（Life Technologies社製）を形質転換した。なお、pET21-EcGshBによればGSHBはC末端にHisタグが付加された形態で発現するため、これら変異型gshB遺伝子の発現プラスミドによってもGSHBはC末端にHisタグが付加された形態で発現する。
【０１８７】
【表１】
2019146519.tif 000003
【０１８８】
〔実施例３〕C末端にHisタグ付加されたエシェリヒア・コリW3110株由来GSHBの精製
実施例１及び実施例２で取得した各菌株（各gshB遺伝子発現プラスミドを有するBL21(DE3)株）を100μg/mLのAmpを含むLB培地（1.0%（w/v）ペプトン、0.5%（w/v）酵母エキス、1.0%（w/v）NaCl）3mLに接種し、30℃、120往復/分で20時間振とう培養することで前培養液を調製した。得られた前培養液150μlを、100μg/mLのAmpを含むOvernight Express Instant TB培地（Novagen社）15mLを張り込んだ70mL容の試験管（φ25mm）に接種した。30℃、120往復/分で20時間振とう培養した後に、遠心分離（4℃、12,000×g、5分）によって集菌した。沈殿として得られた菌体を0.2 mLの緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300
mM NaCl, 10 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）に懸濁し、冷却しながら超音波破砕処理に供して菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（4℃、29,100×ｇ、10分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
【０１８９】
得られた無細胞抽出液を、予め緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）で平衡化したNi Sepharose 6 Fast Flowビーズ（GEヘルスケア社製）にアプライし、溶離緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl,
250 mM イミダゾール, 15 % グリセロール）により酵素を溶出し、活性画分を得た。この活性画分を精製GSHBとして、以降の実験に用いた。
【０１９０】
〔実施例４〕各精製GSHBによるγ−グルタミルジペプチドの生成
実施例３で取得した各精製GSHBについて、γ-Glu-Val-Gly（CAS 38837-70-6、Gluvalicineとも呼ぶ）の合成活性を測定した。
【０１９１】
γ-Glu-Val-Gly合成活性の測定条件は以下の通りである。反応液組成は10mMγ-Glu-Val、150mM グリシン、10mM ATP、10mM MgS04、100mM Tris-HCl (pH9.0)とした。反応液量は0.2mLとし、精製酵素を添加することによって酵素反応を開始した。この時、精製GSHBは0.025 mg/mLとなるように反応液に添加した。反応温度は30℃とし、反応時間は30分間とし
た。反応を停止する際には、反応液0.2mLに対して、0.2mLの200mM 硫酸を添加した。反応終了後に、HPLCにて生成したγ-Glu-Val-Glyを定量した。
【０１９２】
γ-Glu-Val-Glyの定量条件は以下の通りである。カラムには、Phenomenex社製Synergi 4μ Hydro-RP 80A（粒子径4ミクロン、内径4.6mm、長さ250mm）を用いた。溶離液には、50mMリン酸二水素ナトリウム（pH2.5、リン酸によってpH調整）、3.5%(v/v)アセトニトリルの混合液を用いた。流速は1.0mL/min、カラム温度は40℃、UV検出波長は210nmとした。
【０１９３】
以上の方法により、γ-Glu-Val-Gly生成量を定量し、比活性を算出した。結果を表２に示す。表中、「GSHB-WT」は、野生型GSHBを示す。また、酵素単位（U）は、上記の条件下で、1分間に1 μmolのγ-Glu-Val-Glyを生成させる酵素量を示す。
【０１９４】
【表２】
2019146519.tif 000004
【０１９５】
〔実施例５〕無細胞タンパク質合成系を用いたC末端にHisタグ付加されたエシェリヒア・コリW3110株由来の精製GSHBの取得
独立行政法人理化学研究所の無細胞タンパク質合成サービス（http://www.ynmr.riken.jp/apply_inform/fee.html）に委託して、エシェリヒア・コリW3110株（ATCC 27325）由来の野生型GSHBと変異型GSHBの精製酵素を取得し、以降の実験に用いた。なお、タンパク質合成後、Niに対するaffinity精製により得られた溶出画分を精製酵素とした。溶出には緩衝液（50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0), 10% グリセロール, 300mM イミダゾール, 300mM NaCl, 1mM DTT）を用いた。また、野生型GSHBおよび変異型GSHBはC末端に6個のHis残基が付加された形態で発現する。
【０１９６】
〔実施例６〕無細胞タンパク質合成系により合成された各精製GSHBによるγ−グルタミルジペプチドの生成
実施例５で取得した各精製GSHBについて、γ-Glu-Val-Gly合成活性を測定した。
【０１９７】
γ-Glu-Val-Gly合成活性の測定条件は以下の通りである。反応液組成は10mMγ-Glu-Val、10mM グリシン、10mM ATP、10mM MgS04、100mM Tris-HCl (pH9.0)とした。反応液量は0.1mLとし、精製酵素を添加することによって酵素反応を開始した。この時、精製GSHBは0.025 mg/mLとなるように反応液に添加した。反応温度は30℃とし、反応時間は30分間とした。反応を停止する際には、反応液0.1mLに対して、0.1mLの200mM 硫酸を添加した。反応終了後に、生成した-Glu-Val-Glyを実施例４に記載の方法で定量し、比活性を算出した。
この時の野生型GSHBの比活性は0.34U/mgであった。なお、酵素単位（U）は、上記の条件下で、1分間に1 μmolのγ-Glu-Val-Glyを生成させる酵素量を示す。各変異型GSHBの野生型GSHBに対する相対活性値を表３に示す。表中、「GSHB-WT」は、野生型GSHBを示す。
【０１９８】
【表３】
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【０１９９】
〔実施例７〕Val生成能を向上させた宿主（Escherichia coli WY-01株）の構築
Escherichia coli K-12 MG1655株（ATCC 47076）にilvGMEDオペロン（10コピー）およびscrKYABRオペロン（1コピー）をMini-Mu法（Elena G. Abalakina et. al., Appl Microbiol Biotechnol 81:191-200 (2008)）を用いて導入し、Val生成能を向上させた菌株（以下、WY-01株とする）を構築した。導入したilvGMEDオペロンはEscherichia coli由来であり、ilvG遺伝子としては、Val蓄積による生育遅延を回避するため、フレームシフト変異が解消し活性のあるAHAS IIを発現するilvG603遺伝子（特開2005-333984）を用いた。導入したscrKYABRオペロンはトランスポゾンTn2555由来である（特開2001-346578）。
【０２００】
〔実施例８〕KrgshA発現プラスミドpMW219-Plac-KrgshAの構築
Kocuria rosea株由来のγ−グルタミルバリン合成酵素遺伝子（以下、「KrgshA」とい
う）をGenScript社に委託して合成し、pMW219（ニッポン・ジーン, Code No. 310-02571）のマルチクローニングサイトのXbaI部位にIn-Fusion法によりクローニングしてKrgshA発現プラスミドpMW219-KrgshAを得た。なお、KrgshAの開始コドンのgtgはatgに置換した。KrgshAの塩基配列（開始コドンの改変前）を配列番号２１に示す。
【０２０１】
〔実施例９〕野生型gshB遺伝子発現プラスミドpUC19-Plac-gshBの構築
E. coli K-12 MG1655株（ATCC 47076）のゲノムを鋳型とし、配列番号１９及び２０に示したプライマーを用いPCRした。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（55℃、10 sec）、伸張（72℃、1 min）、25 cycleとし、GeneAmp PCR System 9700を用いて行った。得られたDNA断片を、制限酵素XbaIで消化し線状にしたpUC19にin-fusionクローニング法により導入し、野生型gshB遺伝子発現プラスミドpUC19-Plac-gshBを得た。
【０２０２】
【表４】
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【０２０３】
〔実施例１０〕GshB改変体プラスミドの構築
変異型gshB遺伝子を構築するため、実施例９で構築したpUC19-Plac-gshBを鋳型として、配列番号３〜６に示した変異導入用プライマーを用いてPCRを実施した。各変異とプライマーの関係を表１に示す。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとし、GeneAmp PCR System 9700を用いて行った。得られたPCR産物をDpnIで消化した後、反応液でコンピテント細胞JM109を形質転換し、3種の変異型gshB遺伝子発現プラスミドを得た。なお、「gshB*」と表記した場合、変異導入遺伝子であることを示す。
【０２０４】
〔実施例１１〕KrgshA発現プラスミドpMW219-Plac-KrgshA及びgshB遺伝子発現プラスミドが導入されたEscherichia coli WY-01株の構築
実施例７で構築したWY-01株に、実施例８で構築したKrgshA発現プラスミドpMW219-Plac-KrgshAを形質転換法により導入した。更に、得られた株に実施例９で構築した野生型gshB遺伝子発現プラスミドpUC19-Plac-gshB、または実施例１０で構築した変異型gshB遺伝子発現プラスミドを形質転換により導入し、WY-01/pMW219-Plac-KrgshA, pUC19-Plac-gshB、WY-01/pMW219-Plac-KrgshA, pUC19-Plac-gshB*P287V、WY-01/pMW219-Plac-KrgshA, pUC19-Plac-gshB*M165F、及びWY-01/pMW219-Plac-KrgshA, pUC19-Plac-gshB*M165F株を構築した。
【０２０５】
〔実施例１２〕菌体内における変異型GSHBのγ-Glu-Val-Gly合成活性の検証
実施例１１で構築した菌株のフラスコ系での培養評価を実施した。プレート上に生育させた各菌株を、OD600=0.2となるようフラスコ内の40 mLのMS-ピルビン酸培地（Amp, Km等の抗生物質を適宜添加したもの）に植菌し、培養した（120 rpm、30 ℃）。培養21.5時間後に培養液をサンプリングし、グルコース濃度を測定し、グルコース濃度が0 g/Lであることを確認した。培地に、グルコースを終濃度10 g/L、IPTGを終濃度1 mM、Glyを終濃度1
g/Lとなるよう添加した。その後、さらに3.5時間培養した後、培養液のγ-Glu-Val-Gly濃度を分析した。結果、野生型GSHB発現株と比較して、P287Vの変異型GSHB発現株において約14%、M165F及びM165Cの変異型GSHB発現株において約67％のγ-Glu-Val-Gly蓄積向上が見られた（図１）。
【０２０６】
＜MS-ピルビン酸培地組成＞
[A区]
Glucose                  40.0 g/L
MgSO4・7H2O               1.0 g/L
pH無調整、115℃、15分オートクレーブ滅菌
[B区]
(NH4)2SO4                24.0 g/L
KH2PO4                    1.0 g/L
Yeast extract             2.0 g/L
FeSO4・7H2O              10.0 mg/L
MnSO4・4H2O               8.0 mg/L
pH7.0（KOH）、115℃、15分オートクレーブ滅菌
[C区]
炭酸カルシウム           50g/L
180℃、乾熱滅菌
A区、B区、C区をそれぞれ個別に殺菌後、混合した。ピルビン酸は、250 g/L溶液（500倍濃縮液）を調製してフィルター滅菌し、培養直前に最終濃度500 mg/Lとなるように添加した。
【０２０７】
＜配列表の説明＞
配列番号１：Escherichia coli K-12 W3110株のgshB遺伝子の塩基配列
配列番号２：Escherichia coli K-12 W3110株のGSHBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３〜２０：プライマー
配列番号２１：Kocuria rosea AJ3132のGSHA遺伝子の塩基配列
配列番号２２：Kocuria rosea AJ3132のGSHAのアミノ酸配列
配列番号２３：Kocuria rhizophila DC2201株のGSHA遺伝子の塩基配列
配列番号２４：Kocuria rhizophila DC2201株のGSHAのアミノ酸配列
配列番号２５：Micrococcus luteus NCTC2665株のGSHA遺伝子の塩基配列
配列番号２６：Micrococcus luteus NCTC2665株のGSHAのアミノ酸配列
配列番号２７：Escherichia coli K-12 MG1655株のgshA遺伝子の塩基配列
配列番号２８：Escherichia coli K-12 MG1655株のGshAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２９：Escherichia coli K-12 MG1655株のggt遺伝子の塩基配列
配列番号３０：Escherichia coli K-12 MG1655株のGgtタンパク質のアミノ酸配列
【図１】
2019146519.tif 000007
【配列表】
2019146519000001.app