(57)【要約】【課題】本開示は、温度応答性高分子を含む基材を用いる細胞構造体の作製方法において、温度応答性高分子を含む基材から、物理的な外力を加えることなく細胞構造体を剥離する手段を提供することを課題とする。【解決手段】本発明の一態様は、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の少なくとも一部と接触する保持面を有する、細胞構造体形成用基材を保持する保持部と、細胞構造体形成用基材の一部と接触する冷却面を有する、細胞構造体形成用基材を冷却する冷却部とを有する、細胞構造体形成用基材から細胞構造体を剥離するための治具に関する。本発明の別の一態様は、細胞構造体の作製装置及び細胞構造体の作製方法にも関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の少なくとも一部と接触する保持面を有する、細胞構造体形成用基材を保持する保持部と、
細胞構造体形成用基材の一部と接触する冷却面を有する、細胞構造体形成用基材を冷却する冷却部と、
を有する、細胞構造体形成用基材から細胞構造体を剥離するための治具。
【請求項２】
冷却面が、温度応答性高分子層の表面積未満の面積を有する、請求項1に記載の治具。
【請求項３】
保持面に、1個又は複数個の標識部を有する、請求項1又は2に記載の治具。
【請求項４】
複数個の冷却部を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の治具。
【請求項５】
保持部及び冷却部が互いに離間するように配置される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の治具。
【請求項６】
温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材を収容する収容部と、
収容部の温度を制御するための温度制御部と、
請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞構造体形成用基材から細胞構造体を剥離するための治具と、
を有する、細胞構造体の作製装置。
【請求項７】
温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の上で細胞を培養して、温度応答性高分子層の表面に細胞構造体を形成させる、細胞構造体形成工程；
温度応答性高分子層の下限臨界溶解温度を超える温度条件下で、細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層の一部の領域を下限臨界溶解温度以下の温度まで冷却して、形成された細胞構造体の一部を温度応答性高分子層の表面から剥離させる、部分剥離工程；
を含む、細胞構造体の作製方法。
【請求項８】
部分剥離工程において、温度応答性高分子層の下限臨界溶解温度と、細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層の一部の領域を冷却する温度との温度差が、20℃以上である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
部分剥離工程において、下限臨界溶解温度以下の温度まで冷却される細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層の一部の領域が、温度応答性高分子層の表面積未満の面積を有する範囲である、請求項7又は8に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞構造体を剥離するための治具、並びに細胞構造体の作製装置及び細胞構造体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞研究のような細胞生物学の研究分野、並びに再生医療分野及び臨床検査分野等において、細胞培養は必要不可欠な技術である。例えば、再生医療分野では、患者から採取した細胞を生体外で培養し、シート形状の細胞構造体（以下、「細胞シート」とも記載する）を作製した上で、該細胞シートを患者の生体内へ移植する技術が開発されている。
【０００３】
細胞シートのような細胞構造体は、通常は、基材の表面、例えば細胞取扱容器の底面に細胞を播種し、次いで該基材の表面上で該細胞を培養して細胞構造体を形成させることによって作製される。前記作製方法の場合、形成された細胞構造体は、細胞から分泌される接着分子を介して基材の表面と強固に結合する。このため、形成された細胞構造体を回収するために、該細胞構造体を基材の表面から剥離する必要がある。
【０００４】
例えば、特許文献1は、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性ポリマーで表面を被覆した細胞培養基材上で、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、骨芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来細胞、脂肪由来幹細胞から選択される１種類又はそれ以上の種類の細胞を培養し、（1）培養液温度を上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下とし、（2）培養した培養細胞シートをキャリアとしての支持膜に密着させ、（3）そのままキャリアと共に剥離し、（4）工程（3）で得られたキャリアに密着した培養細胞シートを、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性ポリマーで表面を被覆した別の細胞培養基材上で培養された別の細胞シート上に密着させ、（5）前記（1）〜（4）の操作を繰り返すことを特徴とする、積層化培養細胞シートの製造方法を記載する。当該文献に記載の方法では、温度応答性ポリマーで表面を被覆した細胞培養基材上で細胞を培養することによって形成された培養細胞シートをキャリアと密着させた後、該温度応答性ポリマーの上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下の温度で処理することによって、該培養細胞シート及びキャリアを該細胞培養基材から剥離する。
【０００５】
特許文献1に記載の方法のように、温度応答性高分子を含む基材を用いて細胞構造体を形成する場合、基材から細胞構造体を剥離するために、通常は、基材の周囲温度を室温にする、又は細胞の培養液を低温に冷却した培養液に置換する等の方法が実施される。
【０００６】
基材から細胞構造体を剥離する別の剥離方法として、例えば特許文献2は、シート状細胞培養物を培養容器から剥離するシステムであって、（i）シート状細胞を培養している培養容器を収納する収納部、（ii）収納部内の培養容器に振動を与えて、シート状細胞培養物を剥離させる振動部、（iii）培養容器内のシート状細胞培養物の状態を測定するセンサー部、（iv）該センサー部によって測定された測定値と初期値との差が設定値を超えた場合に、剥離状態であると解析する解析部を含む、前記システムを記載する。
【０００７】
特許文献3は、シート状細胞培養物を培養容器から剥離するためのシステムであって、シート状細胞培養物を培養する培養容器を収納する収納部、前記シート状細胞培養物に対し1または2以上のノズルにより液体を噴射するノズル部、培養容器におけるシート状細胞培養物の剥離状態を計測するセンサー部、前記センサー部において計測された値に基づき、剥離の均一性を判断する解析部、ならびに前記解析部での判断に基づきノズルの位置および／または液体の噴射量を制御する制御部を含む、前記システムを記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第4921353号公報
【特許文献２】特開2011-115080号公報
【特許文献３】特開2011-155869号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
温度応答性高分子を含む基材を用いる細胞構造体の作製方法において、温度応答性高分子を含む基材から細胞構造体を剥離する工程にはいくつかの課題が存在した。例えば、温度応答性高分子を含む基材の周囲温度を室温にする、又は細胞の培養液を低温に冷却した培養液に置換する等の方法の場合、細胞構造体が基材の表面から部分的に若しくは不規則にめくれ上がる、皺が寄る又は折れ曲がることにより、細胞構造体が部分的に変形する場合がある。このような場合、例えば細胞構造体を移植用途に適用する前に、部分的に変形した細胞構造体の形状を元に戻す必要がある。しかしながら、細胞構造体は、通常は物理的強度が低く、且つ寸法が小さいことから、ピンセット等を用いて部分的に変形した細胞構造体の形状を破損なく元に戻すことは、高度な技術が要求され、且つ細心の注意を払って行う必要がある。
【００１０】
特許文献2又は3に記載の技術の場合、水流又は振動等の処理を用いて細胞構造体を剥離するが、細胞構造体への影響を最小限にするためには、このような物理的な外力を加えないプロセスによって細胞構造体を剥離することが望ましい。
【００１１】
それ故、本開示は、温度応答性高分子を含む基材を用いる細胞構造体の作製方法において、温度応答性高分子を含む基材から、物理的な外力を加えることなく細胞構造体を剥離する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決するための手段を種々検討した。本発明者らは、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の上で細胞構造体を作製する際、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の一部の領域を下限臨界溶解温度以下の温度まで冷却することにより、形成された細胞構造体の一部を温度応答性高分子層の表面から剥離し得ることを見出した。本発明者らは、前記知見に基づき本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明の要旨は、以下の態様及び実施形態を包含する。
（1）温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の少なくとも一部と接触する保持面を有する、細胞構造体形成用基材を保持する保持部と、
細胞構造体形成用基材の一部と接触する冷却面を有する、細胞構造体形成用基材を冷却する冷却部と、
を有する、細胞構造体形成用基材から細胞構造体を剥離するための治具。
（2）冷却面が、温度応答性高分子層の表面積未満の面積を有する、前記実施形態（1）に記載の治具。
（3）保持面に、1個又は複数個の標識部を有する、前記実施形態（1）又は（2）に記載の治具。
（4）複数個の冷却部を有する、前記実施形態（1）〜（3）のいずれかに記載の治具。
（5）保持部及び冷却部が互いに離間するように配置される、前記実施形態（1）〜（4）のいずれかに記載の治具。
（6）温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材を収容する収容部と、
収容部の温度を制御するための温度制御部と、
前記実施形態（1）〜（5）のいずれかに記載の細胞構造体形成用基材から細胞構造体を剥離するための治具と、
を有する、細胞構造体の作製装置。
（7）温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の上で細胞を培養して、温度応答性高分子層の表面に細胞構造体を形成させる、細胞構造体形成工程；
温度応答性高分子層の下限臨界溶解温度を超える温度条件下で、細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層の一部の領域を下限臨界溶解温度以下の温度まで冷却して、形成された細胞構造体の一部を温度応答性高分子層の表面から剥離させる、部分剥離工程；
を含む、細胞構造体の作製方法。
（8）部分剥離工程において、温度応答性高分子層の下限臨界溶解温度と、細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層の一部の領域を冷却する温度との温度差が、20℃以上である、前記実施形態（7）に記載の方法。
（9）部分剥離工程において、下限臨界溶解温度以下の温度まで冷却される細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層の一部の領域が、温度応答性高分子層の表面積未満の面積を有する範囲である、前記実施形態（7）又は（8）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本開示により、温度応答性高分子を含む基材を用いる細胞構造体の作製方法において、温度応答性高分子を含む基材から、物理的な外力を加えることなく細胞構造体を剥離する手段を提供することが可能となる。
【００１５】
前記以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、本発明の一態様の治具の好ましい一実施形態を示す図である。（A）全体の上面図；（B）（1-I）-（1-I’）断面図。
【図２】図2は、本発明の一態様の治具の別の好ましい一実施形態を示す図である。（A）全体の上面図；（B）（2-I）-（2-I’）断面図。
【図３】図3は、本発明の一態様の治具の別の好ましい一実施形態を示す図である。（A）全体の上面図；（B）（3-I）-（3-I’）断面図。
【図４】図4は、本発明の一態様の治具の別の好ましい一実施形態を示す図である。（A）全体の上面図；（B）（4-I）-（4-I’）断面図。
【図５】図5は、本発明の一態様の治具の別の好ましい一実施形態を示す図である。（A）全体の上面図；（B）（5-I）-（5-I’）断面図。
【図６】図6は、本発明の一態様の治具の別の好ましい一実施形態を示す図である。（A）全体の上面図；（B）全体の上面図；（C）（6-I）-（6-I’）又は（7-I）-（7-I’）断面図。
【図７】図7は、従来技術の細胞構造体の作製方法において、細胞構造体が基材の表面から部分的にめくれ上がった結果を示す写真である。
【図８】図8は、実施例2において、ステンレス製分銅（直径1.5 cm）を、37℃の温度条件下で、培養プレート（直径2.1 cm）の裏面から、培養面の外縁と分銅の外縁とが内接するように、培養面の端部の領域に接触させた結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００１８】
＜1. 細胞構造体の作製方法＞
温度応答性高分子を含む基材を用いる細胞構造体の作製方法において、例えば、温度応答性高分子を含む基材の周囲温度を室温にする、又は細胞の培養液を低温に冷却した培養液に置換する等の方法によって、温度応答性高分子を含む基材から細胞構造体を剥離する場合、細胞構造体が基材の表面から部分的に若しくは不規則にめくれ上がる、皺が寄る又は折れ曲がることにより、細胞構造体が部分的に変形又は破損する場合があることが知られていた。例えば、図7は、従来技術の細胞構造体の作製方法において、細胞構造体が基材の表面から部分的にめくれ上がった結果を示す。
【００１９】
本発明者らは、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の上で細胞構造体を作製する際、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の一部の領域を下限臨界溶解温度以下の温度まで冷却することにより、形成された細胞構造体の一部を温度応答性高分子層の表面から剥離し得ることを見出した。それ故、本発明の一態様は、細胞構造体の作製方法に関する。
【００２０】
本発明の各態様において、細胞構造体を構成する細胞は、特に限定されない。生体に存在するあらゆる組織若しくは器官自体、又はそれに由来する各種の細胞を用いることができる。本発明の各態様に使用される細胞は、接着性の組織又は細胞であることが好ましい。例えば、生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞若しくは内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、軟骨細胞、神経系を構成するニューロン若しくはグリア細胞、線維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞、又は脂肪細胞等を使用することができる。或いは、本発明の各態様に使用される細胞は、胚性幹細胞（ES細胞）、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞、又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）等であってもよく、分化が終了した細胞であってもよい。本発明の各態様に使用される細胞は、前記組織又は器官から直接採取した初代細胞系でもよく、該初代細胞を何代か継代させた継代細胞系であってもよい。前記細胞は、1種類のみを使用してもよく、2種類以上を同時に使用してもよい。細胞が由来する動物も特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ又はヒツジ等の動物に由来する細胞を使用することができる。
【００２１】
本発明の各態様において、「細胞構造体」は、細胞同士が細胞外マトリクスを介して細胞間接着を形成することによって生じる、複数の細胞からなる細胞の集合体を意味する。本発明の各態様において、細胞構造体は、特定の組織又は器官に分化した形態であってもよく、未分化の形態であってもよい。また、本発明の各態様において、細胞構造体は、細胞構造体形成用基材の表面（以下、「培養面」とも記載する）に複数の細胞が配列することによって形成される二次元構造の一層形態であってもよく、培養面に配列した複数の細胞の上部にさらに複数の細胞が配列することによって形成される三次元構造の多層形態であってもよい。本発明の各態様において、細胞構造体としては、例えば、シート状の形態の細胞シートを挙げることができる。
【００２２】
本発明の各態様において、「細胞構造体形成用基材」は、その表面、すなわち培養面で細胞を培養して細胞構造体を形成する材料を意味する。本明細書において、細胞構造体形成用基材を単に「基材」と記載する場合がある。本発明の各態様で使用される基材は、当該技術分野で通常使用されるディッシュ型、角形プレート型又はフラスコ型等の各種形状の細胞取扱容器であることが好ましい。本発明の各態様で使用される基材を構成する材料は、特に限定されない。当該技術分野で細胞培養用の基材に通常使用される材料を使用することができる。
【００２３】
本発明の各態様で使用される細胞構造体形成用基材は、温度応答性高分子層を含む。細胞構造体形成用基材は、その表面、すなわち培養面の少なくとも一部に温度応答性高分子層を含むことが好ましく、培養面の略全面に温度応答性高分子層を含むことがより好ましい。例えば、本発明の各態様で使用される細胞構造体形成用基材が前記で例示した形状の細胞取扱容器である場合、その内部の表面の少なくとも一部、好ましくはその底面の少なくとも一部、より好ましくはその底面の略全面に温度応答性高分子層を含むことが好ましい。以下において説明するように、温度応答性高分子層は、細胞を培養する温度条件では細胞接着性を示すことができる。それ故、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材を本発明の各態様で使用することにより、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の上、好ましくはその表面の少なくとも一部に、細胞構造体を形成させることができる。
【００２４】
本発明の各態様において、「温度応答性高分子層」は、細胞を培養する温度条件では細胞接着性を示す状態であるが、所定の温度以下の温度条件では細胞非接着性を示す状態に変化する高分子（以下、「温度応答性高分子」とも記載する）を含む層を意味する。
【００２５】
本発明の各態様において、「細胞接着性」及び「細胞非接着性」は、一の表面領域と他の表面領域とにおける細胞の接着度合いの相対的な強さを意味し、典型的には、「細胞接着性」は、細胞が接着しやすい表面特性を意味する。細胞接着性は、通常は、表面の化学的性質及び／又は物理的性質等に起因して、細胞の接着及び／又は伸展が起こりやすいか否かに基づき、決定される。細胞構造体形成用基材の細胞接着性を判断する指標としては、例えば、実際に該細胞構造体形成用基材で細胞を培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。本発明の各態様において、温度応答性高分子層が細胞接着性を示す状態の場合、該温度応答性高分子層の表面は、細胞接着伸展率が60％以上であることが好ましく、細胞接着伸展率が80％以上であることがより好ましい。温度応答性高分子層の細胞接着伸展率が高い場合、効率的に細胞を培養することができる。また、温度応答性高分子層が細胞非接着性を示す状態の場合、該温度応答性高分子層の表面は、細胞接着伸展率が60％未満であることが好ましく、40％未満であることがより好ましく、5％以下であることがさらに好ましく、2％以下であることが特に好ましい。
【００２６】
本発明の各態様において、細胞接着性の指標となる細胞接着伸展率は、例えば、以下の方法で決定することができる。培養しようとする細胞を、4000〜30000 cells/cm2の範囲の初期播種密度で測定対象表面に播種した後、37℃、5％のCO2濃度の条件下で培養する。培養開始3時間後に、培地交換を行い、接着していない細胞を除去した後、細胞が接着している数箇所を観察する。細胞接着伸展率を、次の式：（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×100（％））に基づき算出する。
【００２７】
温度応答性高分子における表面特性の変化は、以下のように説明することができる。但し、本発明の各態様の作用効果は、以下の説明に制限されるものではない。例えば、温度応答性高分子の温度を特定の温度未満に変化させることにより、該温度応答性高分子の周囲の水分子に対する親和性が向上する。これにより、温度応答性高分子は、水分子を取り込んで膨張し得る。膨張した温度応答性高分子は、該高分子間の網目構造が粗となるため、その表面に細胞が接着し難くなる。これに対し、温度応答性高分子の温度を特定の温度以上に変化させることにより、該高分子の周囲の水分子に対する親和性が低下する。これにより、温度応答性高分子は、取り込んでいる水分子を放出して収縮し得る。収縮した温度応答性高分子は、該高分子間の網目構造が密となるため、その表面に細胞が接着し易くなる。本明細書において、温度応答性高分子における前記のような変化の閾値となる温度を、「下限臨界溶解温度（Tc）」と記載する。
【００２８】
本発明の各態様において、温度応答性高分子層に含まれる温度応答性高分子の下限臨界溶解温度（Tc）は、細胞培養に通常適用される温度範囲内であることが好ましい。例えば、Tcは、5〜40℃の範囲であることが好ましく、10〜37℃の範囲であることがより好ましく、20〜35℃の範囲であることがさらに好ましい。前記範囲のTcを有する温度応答性高分子を用いる場合、本発明の各態様において、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材を用いて細胞を培養する際に、細胞の損傷を可能な限り少なくすることができる。
【００２９】
温度応答性高分子層に含まれる温度応答性高分子としては、アクリル系ポリマー及びメタクリル系ポリマーを挙げることができ、例えば、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド（PNIPAAm）（Tc=32℃）、ポリ-N-n-プロピルアクリルアミド（Tc=21℃）、ポリ-N-n-プロピルメタクリルアミド（Tc=32℃）、ポリ-N-エトキシエチルアクリルアミド（Tc=約35℃）、ポリ-N-テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Tc=約28℃）、ポリ-N-テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Tc=約35℃）及びポリ-N,N-ジエチルアクリルアミド（Tc=32℃）等を挙げることができる。温度応答性高分子層に含まれる温度応答性高分子は、前記高分子を形成し得るモノマーの2種以上を共重合させることによって形成される共重合体であってもよい。温度応答性高分子層に含まれる温度応答性高分子は、PNIPAAm、ポリ-N-n-プロピルメタクリルアミド又はポリ-N,N-ジエチルアクリルアミドであることが好ましく、PNIPAAmであることがより好ましい。温度応答性高分子は、前記で説明した好ましい範囲のTcを有する。それ故、前記温度応答性高分子を用いる場合、本発明の各態様において、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材を用いて細胞を培養する際に、細胞の損傷を可能な限り少なくすることができる。
【００３０】
温度応答性高分子を形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることが好ましい。前記モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、N-（若しくはN,N-ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体及びビニルエーテル誘導体等を挙げることができる。前記モノマーを単独で使用して重合する場合、得られる温度応答性高分子はホモポリマーの形態となり、前記モノマーの2種以上を使用して共重合する場合、得られる温度応答性高分子は共重合体（コポリマー又はヘテロポリマー）の形態となる。いずれの形態の温度応答性高分子であっても、本発明の細胞培養容器に使用することができる。
【００３１】
前記温度応答性高分子は、前記で説明した1種以上のモノマーと、前記以外のさらなるモノマーとを共重合することによって形成される共重合体であってもよい。或いは、前記温度応答性高分子は、前記で説明した1種以上のモノマーを重合又は共重合することによって形成される重合体又は共重合体と、さらなる重合体又は共重合体とをグラフト重合又はブロック重合することによって形成される、グラフト共重合体又はブロック共重合体であってもよい。或いは、前記温度応答性高分子は、前記で説明した1種以上の重合体又は共重合体の混合物の形態であってもよい。これらの形態の場合、使用される材料を適宜選択することにより、Tcを所望の範囲に調整することができる。
【００３２】
本態様の細胞構造体の作製方法は、細胞構造体形成工程、及び部分剥離工程を含む。本態様の方法に含まれる各工程について、以下において詳細に説明する。
【００３３】
［1-1. 細胞構造体形成工程］
本態様の方法は、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の上で細胞を培養して、温度応答性高分子層の表面に細胞構造体を形成させる、細胞構造体形成工程を含む。
【００３４】
本工程において、細胞構造体形成用基材の上で細胞を培養する条件、例えば、培地の種類及び外部環境（例えば、温度、湿度、光周期又はCO2濃度）等は、使用される細胞の種類に基づき、当該技術分野で通常使用される培養条件を適宜適用することができる。
【００３５】
前記条件で本工程を実施することにより、細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層の表面に、所望の細胞構造体を形成させることができる。
【００３６】
［1-2. 部分剥離工程］
本態様の方法は、温度応答性高分子層の下限臨界溶解温度を超える温度条件下で、細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層の一部の領域を下限臨界溶解温度以下の温度まで冷却して、形成された細胞構造体の一部を温度応答性高分子層の表面から剥離させる、部分剥離工程を含む。
【００３７】
本工程において、温度応答性高分子層の下限臨界溶解温度（Tc）を超える温度条件は、使用される温度応答性高分子のTcに基づき決定される。例えば、Tcが、5〜40℃の範囲である場合、本工程は、5〜40℃を超える温度条件下で実施することが好ましく；Tcが、10〜37℃の範囲である場合、本工程は、10〜37℃を超える温度条件下で実施することがより好ましく；Tcが、20〜35℃の範囲である場合、本工程は、20〜35℃を超える温度条件下で実施することがさらに好ましい。例えば、使用される温度応答性高分子がPNIPAAm（Tc=32℃）である場合、本工程は、32℃を超える温度条件下で実施することができる。前記で説明したように、Tcを超える温度条件下では、温度応答性高分子層は、細胞接着性を示す。このため、温度応答性高分子層において、以下において説明する部分冷却処理がなされる領域以外の領域では、Tcを超える温度を維持する限り、形成された細胞構造体は温度応答性高分子層の表面から実質的に剥離せず、接着状態を維持している。それ故、前記温度条件で本工程を実施することにより、形成された細胞構造体の一部を温度応答性高分子層の表面から剥離させることができる。
【００３８】
本工程において、細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層の一部の領域を下限臨界溶解温度以下の温度まで冷却する。本明細書において、本処理を、「部分冷却処理」と記載する場合がある。前記で説明したように、本工程において、Tcを超える温度条件下の温度応答性高分子層は、細胞接着性を示す。このため、細胞構造体形成工程で形成された細胞構造体は、温度応答性高分子層の表面に接着している。ここで、温度応答性高分子層の一部の領域をTc以下の温度まで部分冷却処理することにより、温度応答性高分子層の部分冷却処理された領域では、細胞接着性から細胞非接着性に特性が変化する。他方、部分冷却処理がなされる領域以外の領域では、Tcを超える温度を維持する限り、細胞接着性を維持し得る。このように、温度応答性高分子層を部分冷却処理することにより、細胞構造体が形成された温度応答性高分子層の表面特性を、一部の領域が細胞接着性であり、残りの領域が細胞非接着性であるように変化させることができる。これにより、細胞構造体のうち、細胞非接着性に特性変化した領域に形成された部分が、温度応答性高分子層の表面から徐々に剥離し得る。それ故、本工程において、部分冷却処理を実施することにより、物理的な外力を加えることなく、細胞構造体の一部を温度応答性高分子層の表面から剥離させることができる。
【００３９】
本工程において、部分冷却処理する温度条件は、使用される温度応答性高分子のTcに基づき決定される。部分冷却処理する温度は、Tcとの温度差が、20℃以上であることが好ましく、25℃以上であることがより好ましく、30℃以上であることがさらに好ましく、40℃以上であることがよりさらに好ましく、50℃以上であることが特に好ましい。前記温度条件で部分冷却処理を実施することにより、物理的な外力を加えることなく、細胞構造体の一部を温度応答性高分子層の表面から剥離させることができる。
【００４０】
本工程において、部分冷却処理される温度応答性高分子層の一部の領域の範囲は、通常は、温度応答性高分子層の表面積未満の面積を有する範囲であり、好ましくは、温度応答性高分子層の表面積の20％以上であり、より好ましくは、温度応答性高分子層の表面積の50％以上である。前記範囲の領域を部分冷却処理することにより、物理的な外力を加えることなく、細胞構造体の一部を温度応答性高分子層の表面から剥離させることができる。
【００４１】
本工程において、部分冷却処理される温度応答性高分子層の一部の領域の位置は、温度応答性高分子層の端部を含んでもよく、含まなくてもよい。例えば、温度応答性高分子層の端部を含む温度応答性高分子層の一部の領域を部分冷却処理する場合、細胞構造体は、部分冷却処理された温度応答性高分子層の端部の領域から徐々に剥離し得る。それ故、本実施形態の場合、温度応答性高分子層から細胞構造体が剥離する方向性を制御し得る。或いは、温度応答性高分子層の端部を含まない温度応答性高分子層の一部の領域、例えば、温度応答性高分子層の中央部を部分冷却処理する場合、細胞構造体は、部分冷却処理された温度応答性高分子層の中央部の領域から徐々に剥離し得るが、温度応答性高分子層の端部の領域では接着状態を維持し得る。それ故、本実施形態の場合、細胞構造体の端部の不規則なめくれ上がり、皺寄り若しくは折れ曲がり等の変形又は破損を実質的に生じることなく、細胞構造体を温度応答性高分子層の表面から剥離させることができる。
【００４２】
本工程において、部分冷却処理される温度応答性高分子層の一部の領域の位置及び／又は範囲は、部分冷却処理の間、一定であってもよく、変動してもよい。例えば、本態様の方法の一実施形態において、本工程における部分冷却処理される温度応答性高分子層の一部の領域の位置及び／又は範囲を、逐次的に又は連続的に変動させることが好ましい。部分冷却処理される温度応答性高分子層の一部の領域の位置及び／又は範囲を変動させることにより、温度応答性高分子層における細胞非接着性に特性変化する領域の位置及び／又は範囲も変動し得る。このような温度応答性高分子層の特性変化の位置及び／又は範囲の変動に対応して、温度応答性高分子層の表面に形成された細胞構造体も、最初に剥離した一部の領域から、表面特性の位置及び／又は範囲の変動に対応した方向性をもって剥離し得る。それ故、本実施形態において、部分冷却処理される温度応答性高分子層の一部の領域の位置及び／又は範囲を、逐次的に又は連続的に変動させることにより、物理的な外力を加えることなく、温度応答性高分子層から細胞構造体が剥離する方向性を制御し得る。
【００４３】
本態様の方法の一実施形態において、本工程における温度応答性高分子層の部分冷却処理を、一定時間維持することが好ましい。部分冷却処理を一定時間維持すると、温度応答性高分子層の部分冷却処理がなされた領域以外の領域も、部分冷却処理がなされた領域からの熱伝導により徐々に冷却されて温度が低下し、細胞接着性から細胞非接着性に特性が変化する。部分冷却処理から一定時間経過後は、温度応答性高分子層の表面の略全面が細胞非接着性に変化する。このような温度応答性高分子層の表面特性の経時的な変化に対応して、温度応答性高分子層の表面に形成された細胞構造体も、最初に剥離した一部の領域から、徐々に全体の領域に亘って剥離し得る。それ故、本実施形態において、温度応答性高分子層の部分冷却処理を一定時間維持することにより、物理的な外力を加えることなく、細胞構造体を温度応答性高分子層の表面から剥離させることができる。
【００４４】
本態様の方法の別の一実施形態において、本工程における温度応答性高分子層の部分冷却処理を実施した後で、細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層の全ての領域を、Tc以下の温度まで冷却することが好ましい。前記で説明したように、部分冷却処理することにより、細胞構造体の一部を温度応答性高分子層の表面から剥離させることができる。その後、温度応答性高分子層の全ての領域を、Tc以下の温度まで冷却することにより、温度応答性高分子層の部分冷却処理がなされた領域以外の領域も、細胞接着性から細胞非接着性に迅速に特性が変化する。温度応答性高分子層の全ての領域に亘る表面特性の変化に対応して、温度応答性高分子層の表面に形成された細胞構造体も、最初に剥離した一部の領域から全体の領域に亘って、迅速に剥離し得る。それ故、本実施形態において、部分冷却処理を実施した後で温度応答性高分子層の全ての領域を冷却することにより、温度応答性高分子層の表面特性を迅速に変化させて、物理的な外力を加えることなく、細胞構造体の全体を、より迅速に温度応答性高分子層の表面から剥離させることができる。
【００４５】
＜2. 細胞構造体形成用基材から細胞構造体を剥離するための治具＞
本発明の別の一態様は、細胞構造体形成用基材から細胞構造体を剥離するための治具に関する。本態様の治具は、前記で説明した本発明の一態様の方法に好適に使用することができる。
【００４６】
本態様の治具が適用される温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材は、通常は、前記で説明した特徴を有する。温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材に本態様の治具を適用することにより、温度応答性高分子層の一部の領域を部分冷却処理して、物理的な外力を加えることなく、特に細胞構造体に変形又は破損を実質的に生じることなく、細胞構造体を温度応答性高分子層の表面から剥離させることができる。
【００４７】
本態様の治具は、細胞構造体形成用基材を保持する保持部を有する。保持部は、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の少なくとも一部と接触する保持面を有する。保持面は、通常は、保持部の表面のうち、本態様の治具が適用される温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材と対向する面である。保持部を有することにより、本態様の治具は、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材を保持して、冷却部による部分冷却処理の位置及び／又は範囲を所望の範囲に保つことができる。
【００４８】
保持部を形成する材料は、特に限定されない。前記材料としては、例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、鉄、ステンレス、銅及びアルミニウム等の金属材料、並びにガラス及び石英等の無機材料を挙げることができる。前記樹脂材料は、所望により、1種以上のさらなる樹脂材料を組み合わせて使用してもよい。熱伝導率が低いことから、樹脂材料であることが好ましい。樹脂材料によって保持部を形成することにより、保持部を介して、部分冷却処理する一部の領域以外の領域が冷却されることを実質的に抑制することができる。これにより、冷却部による部分冷却処理をより確実なものとすることができる。
【００４９】
本態様の治具は、細胞構造体形成用基材を冷却する冷却部を有する。冷却部は、細胞構造体形成用基材の一部と接触する冷却面を有する。冷却面は、通常は、冷却部の表面のうち、本態様の治具が適用される温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材と対向する面である。冷却部を有することにより、本態様の治具は、細胞構造体形成用基材に含まれる温度応答性高分子層を部分冷却処理することができる。
【００５０】
冷却部を形成する材料は、鉄、ステンレス、銅及びアルミニウム等の金属材料、又はガラスを含むことが好ましい。前記材料は、熱伝導率が高い。このため、前記材料を含む材料によって形成された冷却部は、前記で説明した部分冷却処理する温度条件まで迅速に冷却することができる。それ故、冷却部を、前記材料を含む材料によって形成することにより、本態様の治具を短時間で使用可能な状態にすることができる。
【００５１】
冷却部は、それ自体を所望の温度まで冷却する温度制御手段を有していてもよい。冷却部の温度制御手段としては、ペルチェ素子、及び冷媒の循環等を挙げることができる。冷却部が温度制御手段を有する場合、前記で説明した部分冷却処理する温度条件まで、冷却部をより迅速に冷却することができる。それ故、冷却部を、前記材料を含む材料によって形成することにより、本態様の治具を短時間で使用可能な状態にすることができる。
【００５２】
本態様の治具において、保持部及び冷却部は、着脱可能に構成されていてもよい。本実施形態の場合、例えば、冷却部を取り外し、本態様の治具の使用時まで、前記で説明した部分冷却処理する温度条件まで冷却しておくことができる。これにより、冷却部が温度制御手段を有していない場合であっても、冷却部を簡便に冷却することができる。
【００５３】
本態様の治具の好ましい一実施形態を図1に示す。図1に示すように、本態様の治具11は、保持部1と冷却部2とを有する。本実施形態の場合、保持面及び冷却面は、保持部1及び冷却部2の表面のうち、治具11が適用される温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材と対向する面（すなわち、使用時の配置において上面）となる。保持部1の形状及び寸法は、治具11が適用される温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の形状及び寸法に基づき、適宜設定することができる。例えば、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材が、当該技術分野で通常使用される直径2〜10 cmの範囲のディッシュ型の形状の場合、保持部1も、同様の寸法を有する同様の円形であることが好ましい。保持部が温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材と同様の形状及び寸法を有することにより、本態様の治具を該基材に適用する際の位置決めが容易になる。
【００５４】
本態様の治具の別の好ましい一実施形態を図2に示す。図2に示すように、保持部1は、治具21が適用される温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材と嵌合可能な形状であってもよい。保持部が前記形状の場合、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材の保持をより確実なものとすることができる。これにより、冷却部による部分冷却処理の位置及び／又は範囲を所望の範囲に保つことができる。
【００５５】
本態様の治具の別の好ましい一実施形態において、本態様の治具は、保持部と冷却部とに加えて、標識部を有することが好ましい。標識部は、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材を保持部の保持面に配置する際の位置決めの標識として使用することができる。標識部の形状、色彩、数及び寸法は、特に限定されない。標識部の形状としては、例えば、円形、多角形、線、点（ドット）、格子（グリッド）、矢印及び文字等の形状を挙げることができる。標識部の色彩は、細胞構造体の観察を実質的に妨げないために、無色透明であることが好ましい。標識部の数は、形状及び寸法によって変動し得るが、通常は1個又は複数個である。
【００５６】
本実施形態の治具を図3に示す。図3に示すように、本実施形態の治具31は、保持部1と冷却部2とに加えて、標識部3を有する。標識部3は、通常は、保持部1の保持面に配置される。標識部を有することにより、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材を保持部の保持面に配置する際の位置決めをより確実なものとすることができる。これにより、冷却部による部分冷却処理の位置及び／又は範囲を所望の範囲に保つことができる。
【００５７】
本態様の治具において、保持部及び冷却部の配置は特に限定されない。部分冷却処理する領域の位置及び範囲に基づき、当業者が適宜設定することができる。例えば、温度応答性高分子層の中央部を部分冷却処理する場合、図1に示すように、冷却部2を中央部に配置し、保持部1を冷却部2の外縁に配置することが好ましい。
【００５８】
本態様の治具の別の好ましい一実施形態を図4に示す。図4に示すように、本態様の治具41は、保持部1を中央部に配置し、冷却部2を保持部1の外縁に配置してもよい。本実施形態の場合、温度応答性高分子層の端部を含む温度応答性高分子層の一部の領域を部分冷却処理することができる。
【００５９】
本態様の治具において、保持部及び冷却部は、互いに接触するように配置されていてもよく、互いに離間するように配置されていてもよい。本態様の治具の一実施形態において、保持部及び冷却部は、互いに離間するように配置されることが好ましい。本実施形態の治具を図5に示す。図5に示すように、本実施形態の治具51は、保持部1と冷却部2とを有し、保持部1及び冷却部2は、互いに離間するように配置される。このような配置の場合、冷却部からの熱伝導によって保持部の温度が低下することを実質的に抑制することができる。このため、保持部を介して、部分冷却処理する一部の領域以外の領域が冷却されることを実質的に抑制することができる。これにより、冷却部による部分冷却処理をより確実なものとすることができる。
【００６０】
本実施形態の治具において、保持部及び冷却部の数は特に限定されない。本態様の治具の一実施形態において、治具は、複数個の冷却部を有することが好ましい。本実施形態の場合、複数個の冷却部は、互いに同一の形状であってもよく、互いに異なる形状であってもよい。また、複数個の冷却部は、互いに同一の寸法であってもよく、互いに異なる寸法であってもよい。本実施形態の治具を図6に示す。図6に示すように、本実施形態の治具61及び71は、複数個の冷却部2を有する。例えば、治具61は、異なる形状及び寸法の複数の冷却部2を有する。また、例えば、治具71は、同一の形状及び寸法の複数の冷却部2を有する。本実施形態の場合、それぞれの冷却部による部分冷却処理を逐次的に又は連続的に実施することにより、部分冷却処理される温度応答性高分子層の一部の領域の位置及び／又は範囲を逐次的に又は連続的に変動させることができる。それ故、本実施形態において、それぞれの冷却部による部分冷却処理を逐次的に又は連続的に実施することにより、温度応答性高分子層から細胞構造体が剥離する方向性を制御し得る。
【００６１】
＜3. 細胞構造体の作製装置＞
本発明の別の一態様は、細胞構造体の作製装置に関する。本態様の装置は、前記で説明した本発明の一態様の方法を実施することにより、物理的な外力を加えることなく、特に細胞構造体の端部の不規則なめくれ上がり、皺寄り若しくは折れ曲がり等の変形又は破損を実質的に生じることなく、細胞構造体を作製することができる。
【００６２】
本態様の装置は、収容部と、温度制御部と、本発明の一態様の治具とを有する。本態様の装置に含まれる本発明の一態様の治具は、前記で説明した特徴を有する。
【００６３】
本態様の装置において、収容部は、温度応答性高分子層を含む細胞構造体形成用基材を収容するために使用される。収容部としては、例えば、当該技術分野で通常使用される、細胞培養用のインキュベーターを挙げることができる。
【００６４】
本態様の装置において、温度制御部は、収容部の温度を制御するために使用される。温度制御部は、通常は、温度を測定するセンサー、並びにセンサーによって取得した温度の情報に基づき温度を調整する加熱及び冷却器を備える温度制御装置を含む。温度制御部としては、例えば、当該技術分野で通常使用される、細胞培養用のインキュベーターに設置された温度制御装置を挙げることができる。
【００６５】
本態様の装置は、例えば、当該技術分野で通常使用される、細胞培養用のインキュベーターと、本発明の一態様の治具とを組み合わせて構成することができる。このような構成を有する本態様の装置により、細胞構造体の形成及び剥離を一緒に実施して、細胞構造体を効率的に作製することができる。
【００６６】
以上、詳細に説明したように、本発明の各態様により、物理的な外力を加えることなく、特に細胞構造体の端部の不規則なめくれ上がり、皺寄り若しくは折れ曲がり等の変形又は破損を実質的に生じることなく、細胞構造体を作製することができる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６８】
＜I：冷却部位の検討＞
［I-1：実施例1］
ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド（PNIPAAm）（Tc=32℃）で形成された温度応答性高分子層を培養面（底面）に有する培養プレート（直径2.1 cm）に、マウス筋芽細胞を播種し、37℃の温度条件下で細胞シートを形成させた。直径1.5 cmのステンレス製分銅を、-20℃に冷却した。この分銅を、37℃の温度条件下で、培養プレートの裏面から、培養面の中心を含む中央部に接触させた。この場合、部分冷却処理される温度応答性高分子層の領域は、温度応答性高分子層の表面積の51％である。30分間経過後、細胞シートが培養面から剥離する状態を観察した。その結果、細胞シートは、端部がめくれることなく、培養面の中央部から徐々に剥離した。このとき、細胞シートの部分的なめくれ上がり、皺寄り若しくは折れ曲がり等の変形又は破損は観察されなかった。
【００６９】
［I-2：実施例2］
実施例1と同様の条件で、細胞シートを形成させた。直径1.5 cmのステンレス製分銅を、-20℃に冷却した。この分銅を、37℃の温度条件下で、培養プレートの裏面から、培養面の外縁と分銅の外縁とが内接するように、培養面の端部の領域に接触させた（図8）。30分間経過後、細胞シートが培養面から剥離する状態を観察した。その結果、細胞シートは、分銅を接触させた培養面の端部の領域から徐々に剥離した。
【００７０】
［I-3：比較例1］
実施例1と同様の条件で、細胞シートを形成させた。直径1.5 cmのステンレス製分銅を、-20℃に冷却した。この分銅を、室温（約20℃）の温度条件下で、培養プレートの裏面から、培養面の外縁と分銅の外縁とが内接するように、培養面の端部に接触させた。30分間経過後、細胞シートが培養面から剥離する状態を観察した。その結果、細胞シートは、培養面の全体から剥離した。このとき、細胞シートの部分的なめくれ上がり、皺寄り若しくは折れ曲がり等の変形又は破損が観察された。また、細胞シートの剥離の方向性は観察されなかった。
【００７１】
＜II：冷却温度の検討＞
［II-1：実施例3］
実施例1と同様の条件で、細胞シートを形成させた。直径1.5 cmのステンレス製分銅を、4℃に冷却した。この分銅を、37℃の温度条件下で、培養プレートの裏面から、培養面の外縁と分銅の外縁とが内接するように、培養面の端部の領域に接触させた。30分間経過後、細胞シートが培養面から剥離する状態を観察した。その結果、細胞シートは、分銅を接触させた培養面の端部の領域から徐々に剥離した。このとき、細胞シートの皺寄り若しくは折れ曲がり等の変形又は破損は観察されなかった。
【００７２】
なお、本発明は、前記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施例は、本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加、削除及び／又は置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００７３】
11, 21, 31, 41, 51, 61，71…本発明の一態様の治具
1…保持部
2…冷却部
3…標識部
【図１】
2019129797.tif 000003
【図２】
2019129797.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2019129797.tif 000007
【図６】
2019129797.tif 000008
【図７】
2019129797.tif 000009
【図８】
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