(57)【要約】【課題】セラミド合成促進剤として、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子発現促進効果又はスフィンゴミエリナーゼ遺伝子発現促進効果を有する新規の成分及びそれらを含有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。【解決手段】ＭＥＬ、特にはＭＥＬ−Ａ，ＭＥＬ−Ｂ及びＭＥＬ−Ｃからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子発現促進剤又はスフィンゴミエリナーゼ遺伝子発現促進剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を含有することを特徴とするセラミド合成促進剤。
【請求項２】
前記ＭＥＬが、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ及びＭＥＬ−Ｃからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載のセラミド合成促進剤。
【請求項３】
前記セラミド合成促進剤が、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子発現促進剤であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセラミド合成促進剤。
【請求項４】
前記セラミド合成促進剤が、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）遺伝子発現促進剤であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセラミド合成促進剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のセラミド合成促進剤を含むことを特徴とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を含有することを特徴とするセラミド合成促進剤及び該セラミド合成促進剤を含有する皮膚外用剤に関する。さらに詳細には、ＭＥＬを有効成分としたセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子、あるいはスフィンゴミエリナーゼ遺伝子の発現量を向上させることのできるセラミド合成促進剤及び該セラミド合成促進剤を含有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、生体の最外層を覆い、外界との境界を形成して外界物質の浸入防止、水分を包含する体内成分の損失防止といったバリア機能を担っている。さらに、皮膚の最外層は角質層で構成され、その構造はレンガとモルタルに例えられ、約１５層に積み重なった角層細胞を細胞間脂質が繋ぎ止める形で強固なバリア膜を形成している。角層細胞は、アミノ酸を主成分とする天然保湿因子を細胞内に含有することによって水分を保持している。一方、細胞間脂質は、約５０％のセラミドを主成分とし、コレステロール、脂肪酸等の両親媒性脂質から構成されており、疎水性部分と親水性部分が交互に繰り返される層板構造、いわゆるラメラ構造を特徴としている。
【０００３】
この細胞間脂質の約５０％を構成するセラミドは、加齢、紫外線暴露等の内的又は外的な要因によって減少することで、バリア機能が低下し、アトピー性皮膚炎、魚鱗癬、ニキビ、皮膚免疫異常、皮膚感染症等の様々な皮膚障害を誘発することが知られている。従来、セラミドの減少によって誘発される皮膚障害を抑制するために、減少したセラミドを外部から補給する手法が試みられている。しかしながら、減少したセラミドを外部から補給する手法では、効果の持続性が不十分であったりするため、その効果は満足できるものではない。
【０００４】
一方、セラミドは、表皮細胞の角化の過程において、セリンとパルミトイルＣｏＡを基に、セラミド合成の律速酵素として知られるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）をはじめとした酵素の働きにより生成される。また、セラミドの生成に関わる経路としては、この新生合成経路とは別に、サルベージ経路が知られている。サルベージ経路は、セラミドが顆粒細胞内の層板顆粒として分泌されるまでにスフィンゴミエリンやグルコシルセラミドに変換され、角質細胞になる過程において、層板顆粒中のスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）やβグルコセレブロシダーゼにより、ホスホリルコリンが加水分解され、再びセラミドとなるものである。これらの経路によってセラミドが生成され、細胞間脂質としての機能を果たす（非特許文献１）。
【０００５】
そこで、近年、セラミドの減少によって誘発されるバリア機能低下を改善する手法として、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現を促進させることにより、細胞自身によるセラミドの合成を促進させる方法が検討されている。例えば、特許文献１には、アシタバの抽出物、イラクサの抽出物、インチンコウの抽出物、クマザサの抽出物、ゲンチアナの抽出物、及びトウニンの抽出物には、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を促進する作用があることが報告されている。また、特許文献２には、硫酸化グルコサミノグリカンがセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を促進する作用があることが報告されている。
【０００６】
しかしながら、製剤処方の多様化や、安全で効果的なセラミド合成促進作用を有する成分の更なる開発といった要望に追従するために、低濃度であってもセラミド合成促進効果を発揮する成分や、植物エキス以外の天然物に由来するセラミド合成促進効果を発揮するような成分の開発が望まれている。
【０００７】
このような、製剤処方の多様化や、安全で効果的な成分の開発といった背景のもと、微生物が生産する発酵物をスキンケア素材として利用するための研究開発も近年盛んに行われている。
【０００８】
前述の微生物が生産するスキンケア素材として、親水基と親油基を併せもつ両親媒性物質で、界面活性能を有するバイオサーファクタントが一例として挙げられる。微生物由来の界面活性剤であるバイオサーファクタントは、安全性が高く、環境への負荷が少ない生分解性に優れた環境先進型界面活性剤として研究が進められている。
【０００９】
現在、バイオサーファクタントとしては、糖型、アシルペプチド型、リン脂質型、脂肪酸型及び高分子化合物型の５つに分類することができるが、中でも糖型バイオサーファクタントが最もよく研究されており、細菌及び酵母によって生産された多くの種類の物質が報告されている。
【００１０】
そのような糖型バイオサーファクタントとして、近年マンノシルエリスリトールリピッド（以下「ＭＥＬ」ということがある）がスキンケア分野において高機能エモリエント剤として用いられている。例えば非特許文献２（北本大，薬学雑誌，１２８（５）, ６９５−７０６（２００８））には、ＭＥＬの生化学的な特性として、（１）ヒト急性前骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０細胞）をはじめとする各種の白血病細胞に対する増殖抑制や分化誘導、（２）ラット褐色細胞腫由来細胞（ＰＣ１２）に対する神経突起の伸展促進、分化誘導、（３）悪性腫瘍であるマウスメラノーマ細胞（Ｂ１６）に対する増殖抑制、分化誘導、アポトーシスを示すことが報告されている。しかしながら、ＭＥＬのセラミド合成遺伝子に対する作用に関する報告は、従来全くなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００９−１０７９６５号公報
【特許文献２】特開２０１７−８８５５８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】芋川玄爾，セラミド―基礎と応用，セラミド研究会，６３−７３（２０１１年）
【非特許文献２】北本大，薬学雑誌，１２８（５）, ６９５−７０６（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、前記従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れたセラミド合成促進作用（セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子発現促進作用あるいはスフィンゴミエリナーゼ遺伝子発現促進作用等）を有し、かつ、安全性の高いセラミド合成促進剤、並びに、前記セラミド合成促進剤を利用した皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明者らは鋭意検討した結果、微生物が生産する発酵物であるマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）が、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子、あるいはスフィンゴミエリナーゼ遺伝子といったセラミド合成に関与する遺伝子の発現を促進する作用があり、表皮細胞におけるセラミド合成を促進できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下の構成から成る。
【００１５】
項１．マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を含有することを特徴とするセラミド合成促進剤。
項２．前記ＭＥＬが、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ及びＭＥＬ−Ｃからなる群より選択される少なくとも１種である項１に記載のセラミド合成促進剤。
項３．前記セラミド合成促進剤が、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子発現促進剤であることを特徴とする項１又は２に記載のセラミド合成促進剤。
項４．前記セラミド合成促進剤が、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）遺伝子発現促進剤であることを特徴とする項１又は２に記載のセラミド合成促進剤。
項５．項１から４のいずれかに記載のセラミド合成促進剤を含むことを特徴とする皮膚外用剤。
【００１６】
本発明により、ＭＥＬを有効成分としたセラミド合成促進剤を提供することができる。特に本発明においては、ＭＥＬによる皮膚のエモリエント効果に加え、表皮細胞のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子、スフィンゴミエリナーゼ遺伝子の発現を促進することにより、セラミドの合成を促進できる。つまり、エモリエント効果による皮膚機能の保全と、セラミド合成促進作用の２つの異なる作用を期待できるので、セラミドの減少によって誘発される皮膚障害の予防又は治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＭＥＬ−ＢによるＳＰＴ遺伝子発現促進効果（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を示す図である。
【図２】ＭＥＬ−Ａ及びＭＥＬ−ＣによるＳＰＴ遺伝子発現促進効果（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を示す図である。
【図３】ＭＥＬ−ＢによるＳＭａｓｅ遺伝子発現促進効果（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を示す図である。
【図４】ＭＥＬ−Ａ及びＭＥＬ−ＣによるＳＭａｓｅ遺伝子発現促進効果（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のセラミド合成促進剤は、ＭＥＬを有効成分とすることを特徴とする。本発明により提供されるセラミド合成促進剤は、セラミドの合成を促進できるので、セラミドの減少によって誘発される皮膚障害の予防又は治療に有効である。さらに、ＭＥＬ自身のエモリエント効果を有することから、保湿作用、細胞賦活作用、抗老化作用、育毛作用及び肌荒れ改善作用などの効果を有する。また、種々の配合成分を添加することにより、その効果の向上が期待される。このセラミド合成促進剤は、化粧品、医薬部外品 、医療用品、衛生用品、医薬品として提供することできる。
【００１９】
（ＭＥＬ)
ＭＥＬの構造を一般式（１）に示す。一般式（１）中、置換基Ｒ１は、同一でも異なっていてもよい炭素数４〜２４の脂肪族アシル基である。ＭＥＬは、マンノースの４位及び６位のアセチル基の有無に基づいて、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ及びＭＥＬ−Ｄの４種類に分類される。
【００２０】
【化１】
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【００２１】
具体的には、ＭＥＬ−Ａは、一般式（１）中、置換基Ｒ２およびＲ３がともにアセチル基である。ＭＥＬ−Ｂは、一般式（１）中、置換基Ｒ２はアセチル基であり、置換基Ｒ３は水素である。ＭＥＬ−Ｃは、一般式（１）中、置換基Ｒ２が水素であり、置換基Ｒ３はアセチル基である。ＭＥＬ−Ｄは、一般式（１）中、置換基Ｒ２及びＲ３がともに水素である。
【００２２】
上記一般式（１）で示されるＭＥＬにおける置換基Ｒ１の炭素数は、ＭＥＬ生産培地に含有させる油脂類であるトリグリセリドを構成する脂肪酸の炭素数、および、使用するＭＥＬ生産菌の脂肪酸の資化の程度によって変化する。また、上記トリグリセリドが不飽和脂肪酸残基を有する場合、ＭＥＬ生産菌が上記不飽和脂肪酸の二重結合部分まで資化しなければ、置換基Ｒ１として不飽和脂肪酸残基を含ませることも可能である。以上の説明から明らかなように、得られるＭＥＬは、通常、置換基Ｒ１の脂肪酸残基部分が異なる化合物の混合物の形態である。
【００２３】
本発明のセラミド合成促進剤に好ましく用いられるＭＥＬは、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−ＢもしくはＭＥＬ−Ｃであり、より好ましくは一般式（２）または一般式（３）にて示される構造を有するＭＥＬ−Ｂである。特に好ましくは、一般式（３）にて示される構造を有するＭＥＬ−Ｂである。尚、一般式（３）中、置換基Ｒ１は同一でも異なっていてもよく、炭素数４〜２４の脂肪族アシル基である。置換基Ｒ１の炭素数は上記範囲内であれば特に限定されないが、８個〜１４個であることがさらに好ましい。また、置換基Ｒ１は、飽和脂肪族アシル基であっても不飽和脂肪族アシル基であってもよく、特に限定されるものではない。不飽和結合を有している場合、例えば、複数の二重結合を有していても良い。炭素鎖は直鎖であっても分岐鎖状であってもよい。また、酸素原子含有炭化水素基の場合、含まれる酸素原子の数及び位置は特に限定されない。
【００２４】
【化２】
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【００２５】
【化３】
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【００２６】
なお、本発明において、ＭＥＬは１種類を単独で使用してもよいが、２種以上のＭＥＬを併用することもできる。
【００２７】
ＭＥＬは微生物を用いて培養生産することができる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｓｐ．等を培養して得られたＭＥＬ混合物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、それぞれのＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ及びＭＥＬ−Ｃを単離することが出来る。
【００２８】
本発明の組成物に添加する前記ＭＥＬの使用形態は任意である。例えば、ＭＥＬは、微生物培養液からの抽出物のまま、あるいは精製した高純度品を用いる。もしくは水に懸濁し、あるいは溶媒に溶かした後使用してもよい。好適なＭＥＬ−Ｂは精製した高純度品であり、８０％〜１００％の純度に精製されたものが好ましく用いられる。
【００２９】
本発明は表皮細胞におけるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子発現促進剤又はスフィンゴミエリナーゼ遺伝子発現促進剤を提供するものであるが、ＭＥＬの配合量は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子又はスフィンゴミエリナーゼ遺伝子の発現を促進する範囲で添加すれば良く、セラミド合成促進剤中において通常０．０００１〜１．０質量％が好ましく、０．００５〜０．１質量％がより好ましく、０．００１〜０．００５質量％がさらに好ましい。０．０００１質量％未満の場合、表皮細胞におけるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子又はスフィンゴミエリナーゼ遺伝子発現促進剤への作用が微弱となる可能性があり、一方、１．０質量％を超える場合、ＭＥＬの界面活性効果による表皮細胞への影響が顕著となる可能性がある。
【００３０】
また、前記セラミド合成促進剤中に含まれ得る、前記ＭＥＬ以外のその他の成分としても、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。その他の成分としては、保湿剤、増粘剤、薬効成分、防腐剤、顔料、粉体、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、香料等が挙げられる。
【００３１】
前記した保湿剤としては、化粧料に一般的に使用される成分であればいずれを使用してもよく、例えばピロリドンカルボン酸、乳酸、乳酸ナトリウム、アミノ酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００３２】
前記した増粘剤としては、化粧料に一般的に使用される成分であればいずれを使用してもよく、例えばグアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ローカストビーンガム、サクシノグルカン、カロニン酸，キチン、キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ベントナイト等が挙げられる。
【００３３】
前記した薬効成分としては、化粧料に一般的に使用される成分であればいずれを使用してもよく、例えばビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６又はその誘導体、ビタミンＢ２又はその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類、各種動植物抽出物等が挙げられる。
【００３４】
前記した防腐剤としては、化粧料に一般的に使用される成分であればいずれを使用してもよく、例えばメチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等のパラベン類、フェノキシエタノール、エチルヘキシルグリセリン等が挙げられる。
【００３５】
前記したｐＨ調製剤としては、化粧料に一般的に使用される成分であればいずれを使用してもよく、例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。
【００３６】
本発明のセラミド合成促進剤は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子発現促進作用、スフィンゴミエリン遺伝子発現促進作用に基づく優れたセラミド合成促進作用を有すると共に、安全性に優れるため、例えば、後述する本発明の皮膚外用剤への利用に好適である。
【００３７】
本発明の皮膚外用剤は、前記した本発明のセラミド合成促進剤を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。ここで、前記皮膚外用剤とは、皮膚に適用される各種の薬剤を意味し、その区分としては特に制限されるものではなく、例えば、皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものである。
【００３８】
前記皮膚外用剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプーなどが挙げられる。
【００３９】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、皮膚外用剤を製造するにあたって通常用いられる成分、例えば、収斂剤、殺菌、抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、抗老化剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料などが挙げられる。
また、本発明のセラミド合成促進剤、並びに皮膚外用剤に、上述のような種々の成分を添加することにより、それらの成分に応じて、保湿作用、細胞賦活作用、抗老化作用、育毛作用及び肌荒れ改善作用などの効果を付与することが期待できる。
【００４０】
本発明のセラミド合成促進剤、並びに皮膚外用剤は、日常的に使用することが可能であり、有効成分である前記ＭＥＬの働きによって、少なくともセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子発現促進作用、スフィンゴミエリナーゼ遺伝子発現促進作用に基づくセラミド合成促進作用を、極めて効果的に発揮させることができるものである。そのため、本発明のセラミド合成促進剤、並びに皮膚外用剤は、表皮細胞自身のセラミド合成を活発化させ、セラミド産生機能を健常に戻すことができ、例えば、加齢、乾燥肌、荒れ肌、紫外線曝露、アトピー性皮膚炎などによって減少した角層中のセラミドを増加させ、高いバリア機能及び保湿機能を有する皮膚を取り戻すことを目的とした皮膚外用剤に好適に利用可能である。このような皮膚外用剤を利用することにより、例えば、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎、乾癬など、様々な皮膚症状の予防・改善を効果的に行えるようになることが期待される。
【００４１】
なお、本発明のセラミド合成促進剤、並びに皮膚外用剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、その作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サルなど）に対して適用することも可能である。また、本発明のセラミド合成促進剤、並びに皮膚外用剤は、微生物発酵による天然由来成分を有効成分としたものであり、安全性に優れる点でも、有利である。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに特に限定されるものではない。
【００４３】
（製造例）
製造例１  ＭＥＬ−Ａの製造
Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ（ＮＢＲＣ  １０７３６）を、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて、ＹＭ培地にて培養温度２６℃で４８時間通気攪拌培養した。得られた溶液を種培養液とする。得られた種培養液を、１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＹＭ培地（５％  オリーブ油を含む）にて、培養温度２６℃で７日間通気攪拌培養した。培養液に等量の酢酸エチルを加え攪拌し分配を行った。酢酸エチル層に無水硫酸Ｎａを適量加え３０分間静置させた後、加温濃縮し、粗ＭＥＬ−Ａを得た。得られた粗ＭＥＬ−Ａを、シリカゲルカラムを用いて、クロロホルム：アセトン＝１：０、クロロホルム：アセトン＝９：１、クロロホルム：アセトン１：１、クロロホルム：アセトン＝３：７、クロロホルム：アセトン＝０：１で溶出した。ＭＥＬ−Ａ画分を分取・濃縮し、精製ＭＥＬ−Ａを得た。
【００４４】
製造例２  ＭＥＬ−Ｂの製造
Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ（ＮＢＲＣ  １９４０）を、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて、ＹＭ培地にて培養温度２６℃で４８時間通気攪拌培養した。得られた溶液を種培養液とする。得られた種培養液を、１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＹＭ培地（５％  オリーブ油を含む）にて、培養温度２６℃で７日間通気攪拌培養した。培養液に等量の酢酸エチルを加え攪拌し分配を行った。酢酸エチル層に無水硫酸Ｎａを適量加え３０分間静置させた後、加温濃縮し、粗ＭＥＬ−Ｂを得た。得られた粗ＭＥＬ−Ｂを、シリカゲルカラムを用いて、クロロホルム：アセトン＝１：０、クロロホルム：アセトン＝９：１、クロロホルム：アセトン１：１、クロロホルム：アセトン＝３：７、クロロホルム：アセトン＝０：１で溶出した。ＭＥＬ−Ｂ画分を分取・濃縮し、精製ＭＥＬ−Ｂを得た。
【００４５】
製造例３  ＭＥＬ−Ｃの製造
Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｈｕｂｅｉｅｎｓｉｓ  ＫＭ−５９株（ＦＥＲＭ−２０９８７）を、５００ｍｌ容坂口フラスコを用いて、ＹＭ培地にて培養温度２６℃で４８時間通気攪拌培養した。得られた溶液を種培養液とする。得られた種培養液を、１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、ＹＭ培地（５％オリーブ油を含む）にて、培養温度２６℃で７日間通気攪拌培養した。培養液に等量の酢酸エチルを加え攪拌し分配を行った。酢酸エチル層に無水硫酸Ｎａを適量加え３０分間静置させた後、加温濃縮し、粗ＭＥＬ−Ｃを得た。得られた粗ＭＥＬ−Ｃを、シリカゲルカラムを用いて、クロロホルム：アセトン＝１：０、クロロホルム：アセトン＝９：１、クロロホルム：アセトン１：１、クロロホルム：アセトン＝３：７、クロロホルム：アセトン＝０：１で溶出した。ＭＥＬ−Ｃ画分を分取・濃縮し、精製ＭＥＬ−Ｃを得た。
【００４６】
本発明の実施例では、上述の製造例１〜３で得られたＭＥＬを用いた。
【００４７】
実施例１：セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子発現促進作用の評価
前記ＭＥＬを被験試料として用い、下記試験方法によりセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子発現促進作用を評価した。
【００４８】
Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ (東洋紡株式会社製)でコラーゲンコートしたＴ７５フラスコに対して、ヒト正常新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を播種し、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２）を添加して、３７℃, １０％ＣＯ２にて培養した。適宜培地交換をおこない、８０％以上コンフルエントになるまで培養を８日間継続した。培地を除去してＰＢＳでリンスした後、トリプシン処理を行って細胞を回収した。９６ウェルプレートに所定の細胞数となるように細胞を播種し、３７℃, １０％ＣＯ２にて１日培養した。
培地を除去し、被験試料を所定濃度含有した培地に交換し、３７℃, １０％ＣＯ２にて１４時間インキュベートした。培養後は細胞を回収し、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ＆  ＲＴ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｑＰＣＲ（東洋紡株式会社製）を用いて、細胞からｃＤＮＡ調製を行った。
【００４９】
得られたｃＤＮＡをもとに、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ（登録商標） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ (東洋紡株式会社製)を用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲにてセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ遺伝子及びスフィンゴミエリナーゼ遺伝子の増幅を行った。反応液組成は添付文書に従った。ただし、反応液量は２０μｌ／ｗｅｌｌとし、ｃＤＮＡ量は３μｌとした。反応サイクル条件は９５℃、１分→（９５℃、１５秒→６０℃、４５秒）×４０→９５℃、１５秒→６０℃、１分→９５℃、１５秒で実施した。プライマーは配列番号１〜６に示される塩基配列を使用した。機器はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を内部標準として使用し、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子、スフィンゴミエリナーゼ遺伝子の発現量を標準化した。これら遺伝子の発現量を、ＭＥＬを添加しなかった以外は前記と同様にして確認した遺伝子の発現量（コントロール）で除算し、相対値を算出した。
【００５０】
得られた結果を図１〜４に示す。図１〜４から分かるように、ＮＨＥＫにおいて、ＭＥＬを添加した条件において、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子及びスフィンゴミエリナーゼ遺伝子の発現量の増加が認められた。本結果から、ＭＥＬは、表皮細胞においてセラミド合成遺伝子の発現を促進し、セラミド合成を促進できることが明らかとなった。
【００５１】
以下に、本発明における皮膚外用剤としての処方例を示す。
化粧水
下記組成に従い、化粧水を常法により製造した。
・精製水・・・９０．７０ｇ
・グリセリン・・・３．００ｇ
・フェノキシエタノール・・・０．２０ｇ
・ブチレングリコール・・・５．００ｇ
・ペンチレングリコール・・・１．００ｇ
・ＭＥＬ−Ｂ・・・０．１０ｇ
【００５２】
ジェル
下記組成に従い、ジェルを常法により製造した。
・精製水・・・８８．８０ｇ
・カルボマー・・・０．３０ｇ
・キサンタンガム・・・０．１０ｇ
・アルギニン・・・０．４０ｇ
・グリセリン・・・５．００ｇ
・フェノキシエタノール・・・０．２０ｇ
・ブチレングリコール・・・５．００ｇ
・ＭＥＬ−Ｂ・・・０．２ｇ
【００５３】
クリーム
下記組成に従い、クリームを常法により製造した。
・精製水・・・５８．５０ｇ
・ブチレングリコール・・・１０．００ｇ
・グリセリン・・・５．００ｇ
・フェノキシエタノール・・・０．２０ｇ
・エチルヘキシルグリセリン・・・０．２０ｇ
・スクワラン・・・１０．００ｇ
・オリーブ油・・・１０．００ｇ
・ベヘニルアルコール・・・２．５０ｇ
・ペンタステアリン酸ポリグリセリル−１０・・・１．９０ｇ
・ステアロイル乳酸Ｎａ・・・０．６０ｇ
・パルミチン酸セチル・・・１．００ｇ
・ＭＥＬ−Ｂ・・・０．１０ｇ
【００５４】
これらの製剤は、いずれも表皮細胞のセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡの発現量を増大させる効果が期待され、セラミドの合成促進に有効である。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明のセラミド合成促進剤、並びに皮膚外用剤は、表皮細胞自身のセラミド合成を活発化させ、セラミド産生機能を健常に戻すことができるので、例えば、加齢、乾燥肌、荒れ肌、紫外線曝露、アトピー性皮膚炎などによって減少した角層中のセラミドを増加させ、高いバリア機能及び保湿機能を有する皮膚を取り戻すことを目的とした皮膚外用剤に好適に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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