(57)【要約】【課題】リソソーム蓄積症等の疾患または障害において異常に発現されるタンパク質をコードする導入遺伝子配列の挿入のための方法および組成物を提供すること。【解決手段】ｉｎ  ｖｉｖｏでのアルブミンプロモーター（例えば、内在性または外来性アルブミンプロモーター）の制御下における導入遺伝子の発現に使用することができる方法および組成物が、本明細書に開示されている。一部の態様において、導入遺伝子は、目的の治療タンパク質をコードすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６１／９１３，８３８号および２０１４年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／９４３，８８４号の利益を主張し、その開示はそれらの全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
連邦政府資金による研究によってなされた発明に対する権利に関する記載
該当なし。
【０００３】
技術分野
本開示は、遺伝子改変および血友病の処置の分野にある。
【背景技術】
【０００４】
背景
遺伝子療法の特に魅力的な適用は、分泌された遺伝子産物の不全が原因の障害、または治療タンパク質の分泌によって処置可能な障害の処置に関与する。このような障害は、中程度の数の細胞への治療用導入遺伝子の送達により取り組むことができる可能性があるが、これは各レシピエント細胞が、高レベルの治療用遺伝子産物を発現することを条件とする。このようなシナリオにおいて、多数の細胞への遺伝子送達の必要からの解放は、他の方法では難治性の適応症に対する遺伝子療法の開発成功を可能にし得る。このような適用は、永続的で安全かつ非常に高レベルの導入遺伝子発現を必要とすると予想される。よって、これらの特性を提示するセーフハーバー（safe  harbor）の開発は、遺伝子療法の分野において実質的な有用性をもたらすと予想される。
【０００５】
血友病Ａおよび血友病Ｂ等の血友病は、関節および軟部組織への出血、ならびに外傷を経験しているまたは外科手術を受けているいずれかの部位への過剰な出血によって特徴付けられる血液凝固系の遺伝的障害である。血友病Ａは、血友病Ｂから臨床的に識別不能であるが、血友病Ａにおいて第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩまたはＦ８）が欠損または非存在である一方、血友病Ｂの患者において第ＩＸ因子（ＦＩＸまたはＦ．ＩＸ）が欠損または非存在である。Ｆ８遺伝子は、その不活性型でフォンウィルブランド（von  Wilebrand）因子と会合して循環する血漿糖タンパク質をコードする。表面傷害後に、内因性凝固カスケードが開始し、複合体から第ＶＩＩＩ因子が放出され、活性化される。この活性形態は、第ＩＸ因子と作用して、第Ｘ因子を活性化して、活性化Ｘａにし、最終的に、フィブリノーゲンをフィブリンに変化させかつ血餅誘導をもたらす。Levinsonら（１９９０年）Genomics  ７巻（１号）：１〜１１頁を参照されたい。血友病Ａ患者の４０〜５０％は、Ｆ８イントロン２２に影響を及ぼす染色体逆位（ＩＶＳ２２としても公知）を有する。逆位は、Ｆ８遺伝子のイントロン２２内の９．６ｋｂ配列と、Ｆ８遺伝子に対し遠位の約３００ｋｂに位置する２つの密接に関係した逆に配向された配列のうち１つとの間の染色体内組換え事象に起因し、エクソン２３〜２６に関してエクソン１〜２２の逆位を結果としてもたらす。Textbook  of  Hemophilia、Leeら（編）２００５年、Blackwell  Publishingを参照されたい。他の血友病Ａ患者は、活性部位変異ならびにナンセンスおよびミスセンス変異を含むＦ８における欠損を有する。その部分のため、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）は、凝血系に関与するセリンプロテアーゼの１種をコードし、野生型第ＩＸ因子タンパク質の正常循環レベルの３％の回復ではあるが、自発性の出血を予防することができることが示されている。追加の血友病は、他の凝固因子の異常発現に関連する。例えば、第ＶＩＩ因子欠損症は、３００，０００〜５００，０００人のうちおよそ１人に生じる常染色体劣性形質であり、患者における不適切な第ＶＩＩ因子レベルに関連する。同様に、第Ｘ因子欠損症も、５００，０００〜１，０００，０００人につき１人に生じる常染色体劣性形質であり、ＦＸ遺伝子の遺伝的バリアントに起因する。第Ｘ因子欠損症は、患者集団において様々な程度の重症度を有し得る。
【０００６】
血友病Ｂの現在の処置は、精製された組換え第ＩＸ因子の長期の反復的な静脈内注入に頼っており、多数の問題点を抱えている。これは、反復的な静脈内注入の必要を含み、インヒビター形成を伴い、治癒的ではなく予防的である。
【０００７】
機能的Ｆ８またはＦ．ＩＸタンパク質をコードするプラスミドおよび他のベクター（例えば、ＡＡＶ）の導入に関与する、血友病Ａ患者または血友病Ｂ患者のための遺伝子療法が記載されている。例えば、米国特許第６，９３６，２４３号；同第７，２３８，３４６号および同第６，２００，５６０号；Shiら（２００７年）J  Thromb  Haemost.（２巻）：３５２〜６１頁；Leeら（２００４年）Pharm.  Res.７巻：１２２９〜１２３２頁；Grahamら（２００８年）Genet  Vaccines  Ther.３巻：６〜９頁；Mannoら（２００３年）Blood  １０１巻（８号）：２９６３〜７２頁；Mannoら（２００６年）Nature  Medicine  １２巻（３号）：３４２〜７頁；Nathwaniら（２０１１年）Molecular  Therapy  １９巻（５号）：８７６〜８５頁；Nathwaniら（２０１１年）；N  Engl  J  Med.３６５巻（２５号）：２３５７〜６５頁を参照されたい。しかし、これらのプロトコールにおいて、阻害性抗第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子（抗Ｆ８または抗Ｆ．ＩＸ）抗体および送達ビヒクルに対する抗体の形成は、依然として、血友病のためのＦ８およびＦ．ＩＸ補充に基づく処置の主要合併症である。例えば、ScottおよびLozier（２０１２年）Br  J  Haematol.１５６巻（３号）：２９５〜３０２頁を参照されたい。
【０００８】
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、老廃脂質、糖タンパク質およびムコ多糖の分解に正常には関与する、機能的な個々のリソソームタンパク質の欠如によって特徴付けられる稀な代謝性一遺伝子性疾患の群である。これらの疾患は、特異的な酵素の誤機能のせいで再利用のために処理することができないことによる、細胞におけるこれらの化合物の集積によって特徴付けられる。最も一般的な例は、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ欠損症  −  遺伝子名：ＧＢＡ）、ファブリー病（αガラクトシダーゼ欠損症  −  ＧＬＡ）、ハンター病（イズロン酸−２−スルファターゼ欠損症  −  ＩＤＳ）、ハーラー病（アルファ−Ｌイズロニダーゼ欠損症  −  ＩＤＵＡ）およびニーマン・ピック病（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠損症  −  ＳＭＰＤ１）である。全てまとめてグループ化した場合、ＬＳＤは、人口における７０００人の出生に対し約１人の発生率を有する。これらの疾患は、これらに罹患する者に破壊的な影響を有する。これらは通常、特徴的な顔面および身体発育パターンを有することがあり、中等度から重度の精神遅滞を有することがある乳児で先ず診断される。処置選択肢は、欠損した酵素が通常、大用量の静脈内注射により患者に与えられる酵素補充療法（ＥＲＴ）を含む。このような処置は、症状を処置するだけのものであり、治癒的ではないため、患者は、残りの人生においてこれらのタンパク質の反復的な投薬を受ける必要があり、潜在的には注射されたタンパク質に対する中和抗体を発生する可能性がある。これらのタンパク質は多くの場合、短い血清半減期を有するため、患者は、タンパク質の頻繁な注入にも耐えなければならない。例えば、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）製品（イミグルセラーゼ）が与えられているゴーシェ病患者は、１週間に３回の注入を受けなければならない。酵素の生成および精製にも問題があるため、処置は非常に高価である（患者当たり年間１００，０００ドル超）。
【０００９】
ゲノムＤＮＡの標的化された開裂のための種々の方法および組成物が説明されてきた。かかる標的化された開裂事象を使用して、例えば、標的化された変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化された欠失を誘導し、所定の染色体遺伝子座における標的化された組換えを容易にすることができる。例えば、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第８，６２３，６１８号；同第８，０３４，５９８号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号、ならびに米国出願第１４／２７８，９０３号を参照されたい。これらの方法は、多くの場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等、エラーボーン過程による切断の修復または修復鋳型を使用した修復（相同組換え修復またはＨＤＲ）が、遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的化組込み）をもたらし得るような、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するための操作された開裂系の使用に関与する。本技法を使用して、ゲノム領域の特異的な欠失、または特異的な点変異もしくは局在化された変更（遺伝子補正としても公知）の導入を含む、ドナーオリゴヌクレオチドの使用により、ゲノム配列に部位特異的な変化を導入することもできる。操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等の特異的ヌクレアーゼの使用により、または特異的開裂をガイドするための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、開裂を生じることができる。さらに、標的化ヌクレアーゼは、ゲノム編集および遺伝子療法における使用の可能性も有し得るアルゴノート（Argonaute）系（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ由来、「ＴｔＡｇｏ」として公知、Swartsら（２０１４年）Nature  ５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁を参照）に基づき開発されている。
このヌクレアーゼ媒介性標的化導入遺伝子挿入アプローチは、遺伝子サイレンシングまたは近隣の癌遺伝子活性化の最小リスクのための正確な導入遺伝子配置を可能にするため、古典的組込みアプローチと比較して、改善された導入遺伝子発現、高められた安全性および発現耐久性の見込みをもたらす。
導入遺伝子の標的化組込みは、その同族遺伝子座への、例えば、変異体遺伝子を補正するための内在性遺伝子座への野生型導入遺伝子の挿入であり得る。あるいは、導入遺伝子は、非同族遺伝子座、例えば、「セーフハーバー」遺伝子座に挿入することができる。ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａおよびアルブミンを含む、数種類のセーフハーバー遺伝子座が記載されている。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号および同第８，１１０，３７９号；米国出願公開第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号、ならびに米国出願第１４／２７８，９０３号を参照されたい。例えば、米国特許出願公開第２０１１００２７２３５号は、単離された幹細胞への機能的タンパク質の標的化組込みに関し、米国特許出願公開第２０１２０１２８６３５号は、血友病Ｂを処置する方法について記載する。加えて、米国特許出願公開第２０１４−００１７２１２号および同第２０１４−０１１２８９６号は、リソソーム蓄積症を処置する方法について記載する。Liら（２０１１年）Nature  ４７５巻（７３５５号）：２１７〜２２１頁およびAnguelaら（２０１３年）Blood  １２２巻：３２８３〜３２８７頁も参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，９３６，２４３号明細書
【特許文献２】米国特許第７，２３８，３４６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２００，５６０号明細書
【特許文献４】米国特許第８，６２３，６１８号明細書
【特許文献５】米国特許第８，０３４，５９８号明細書
【特許文献６】米国特許第８，５８６，５２６号明細書
【特許文献７】米国特許第６，５３４，２６１号明細書
【特許文献８】米国特許第６，５９９，６９２号明細書
【特許文献９】米国特許第６，５０３，７１７号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，６８９，５５８号明細書
【特許文献１１】米国特許第７，０６７，３１７号明細書
【特許文献１２】米国特許第７，２６２，０５４号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，８８８，１２１号明細書
【特許文献１４】米国特許第７，９７２，８５４号明細書
【特許文献１５】米国特許第７，９１４，７９６号明細書
【特許文献１６】米国特許第７，９５１，９２５号明細書
【特許文献１７】米国特許第８，１１０，３７９号明細書
【特許文献１８】米国特許第８，４０９，８６１号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書
【特許文献２３】米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書
【特許文献２４】米国特許出願公開第２０１０／００２１８２６４号明細書
【特許文献２５】米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書
【特許文献２８】米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書
【特許文献２９】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書
【特許文献３０】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第２０１４／００１７２１２号明細書
【特許文献３２】米国特許出願公開第２０１４−０１１２８９６号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Levinsonら（１９９０年）Genomics  ７巻（１号）：１〜１１頁
【非特許文献２】Textbook  of  Hemophilia、Leeら（編）２００５年、Blackwell  Publishing
【非特許文献３】Shiら（２００７年）J  Thromb  Haemost.（２巻）：３５２〜６１頁
【非特許文献４】Leeら（２００４年）Pharm.  Res.７巻：１２２９〜１２３２頁
【非特許文献５】Grahamら（２００８年）Genet  Vaccines  Ther.３巻：６〜９頁
【非特許文献６】Mannoら（２００３年）Blood  １０１巻（８号）：２９６３〜７２頁
【非特許文献７】Mannoら（２００６年）Nature  Medicine  １２巻（３号）：３４２〜７頁
【非特許文献８】Nathwaniら（２０１１年）Molecular  Therapy  １９巻（５号）：８７６〜８５頁
【非特許文献９】Nathwaniら（２０１１年）；N  Engl  J  Med.３６５巻（２５号）：２３５７〜６５頁
【非特許文献１０】ScottおよびLozier（２０１２年）Br  J  Haematol.１５６巻（３号）：２９５〜３０２頁
【非特許文献１１】Swartsら（２０１４年）Nature  ５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁
【非特許文献１２】Liら（２０１１年）Nature  ４７５巻（７３５５号）：２１７〜２２１頁
【非特許文献１３】Anguelaら（２０１３年）Blood  １２２巻：３２８３〜３２８７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、依然として、１種または複数種のタンパク質が欠如している、欠損しているおよび／または異常に発現された疾患または障害を有する被験体に治療タンパク質を与える追加の組成物および方法の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
概要
ｉｎ  ｖｉｖｏでのアルブミンプロモーター（例えば、内在性または外来性アルブミンプロモーター）の制御下における導入遺伝子の発現に使用することができる方法および組成物が、本明細書に開示されている。一部の態様において、導入遺伝子は、目的の治療タンパク質をコードすることができる。本発明の方法を、欠損または欠如しているタンパク質の産生（例えば、「タンパク質補充」）に使用することができるように、導入遺伝子は、タンパク質をコードすることができる。一部の事例では、タンパク質は、リソソーム蓄積症の処置に関与し得る。表皮水疱症、糖尿病、がん、凝固障害またはＡＡＴ欠損肺気腫と同様に多様な状態に対するタンパク質療法を含む、他の治療タンパク質を発現させることができる。他の態様において、発現されたタンパク質が新規かつ望ましい特色（半減期の延長、血漿クリアランス特徴の変化等）をもたらす特徴を有するように、導入遺伝子は、配列（例えば、操作された配列）を含むことができる。操作された配列は、アルブミン配列に由来するアミノ酸を含むこともできる。一部の態様において、導入遺伝子は、治療タンパク質、治療ホルモン、血漿タンパク質、および抗体などをコードする。一部の態様において、導入遺伝子は、凝固障害等の血液障害に関与するタンパク質をコードすることができる。一部の態様において、導入遺伝子は、構造核酸（ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびｍｉＲＮＡなど）をコードする。
【００１４】
一態様において、機能的凝固因子タンパク質（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子および／または第Ｘ因子）をコードする配列の標的化組込みのための方法および組成物が、本明細書に開示されている。機能的第ＶＩＩＩ因子（「Ｆ８」）および／または第ＩＸ因子（「Ｆ．ＩＸ」または「ＦＩＸ」）タンパク質の発現は、例えば、血友病Ａ（Ｆ８）および／または血友病Ｂ（Ｆ．ＩＸ）の処置および／または予防をもたらし得る一方、機能的第ＶＩＩ因子または第Ｘ因子の発現は、第ＶＩＩ因子欠損症および／または第Ｘ因子欠損症に関連する血友病を処置または予防し得る。
【００１５】
別の態様において、リソソーム蓄積症の被験体において欠如する機能的タンパク質をコードする配列の標的化組込みのための方法および組成物が、本明細書に開示されている。ヌクレアーゼ、例えば、操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（制限エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインとＴＡＬＥエフェクタードメインとの融合体を含むＴＡＬＥＮ（メガＴＡＬＥおよびコンパクトＴＡＬＥＮ等））、Ｔｔａｇｏ系および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、遺伝子が挿入される細胞における「セーフハーバー」遺伝子の遺伝子座（例えば、ＣＣＲ５、ＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ、Ｒｏｓａまたはアルブミン）におけるＤＮＡの開裂に使用される。ドナー導入遺伝子の標的化された挿入は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同性修復機構（例えば、ＮＨＥＪドナー捕捉）によるものとなり得る。ヌクレアーゼは、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック）を誘導することができる。一部の実施形態において、２種のニッカーゼが、２個のニックを導入することによるＤＳＢの作製に使用される。場合によっては、ニッカーゼは、ＺＦＮであり、他の場合では、ニッカーゼは、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼである。
【００１６】
一態様において、ゲノムにおける目的の領域（例えば、アルブミン遺伝子）における標的部位に結合する非天然起源のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）であって、１個または複数個の操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含むＺＦＰが、本明細書に記載されている。一実施形態において、ＺＦＰは、目的の標的ゲノム領域を開裂させるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であって、１個または複数個の操作されたジンクフィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含むＺＦＮである。開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一実施形態において、開裂ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。ある特定の実施形態において、ジンクフィンガードメインは、アルブミン遺伝子における標的部位、例えば、表５の単一の行（row）に示す通りに並べられた認
識ヘリックスドメインを有するジンクフィンガータンパク質を認識する。
【００１７】
別の態様において、ゲノムにおける目的の領域（例えば、アルブミン遺伝子）における標的部位に結合する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質であって、ＴＡＬＥが、１個または複数個の操作されたＴＡＬＥ結合ドメインを含むＴＡＬＥタンパク質が、本明細書に記載されている。一実施形態において、ＴＡＬＥは、目的の標的ゲノム領域を開裂するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であって、１個または複数個の操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含むＴＡＬＥＮである。開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）から得ることができる。一実施形態において、開裂ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。他の実施形態において、開裂ドメインは、メガヌクレアーゼに由来し、このメガヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性を提示することもできる。
【００１８】
別の態様において、ゲノム中の目的の領域（例えば、アルブミン遺伝子）における標的部位に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であって、１種または複数種の操作された単一ガイドＲＮＡまたは機能的均等物と共にＣａｓ９ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、本明細書に記載されている。
【００１９】
本明細書に記載されているヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）は、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロン等の遺伝子内もしくはこれに隣接するコード領域もしくは非コード領域、またはコード領域の上流もしくは下流いずれかの非転写領域内における目的の領域に結合および／またはこれを開裂することができる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ）は、アルブミン遺伝子に結合および／またはこれを開裂する。
【００２０】
別の態様において、１種または複数種のヌクレアーゼ（例えば、本明細書に記載されているＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）をコードするポリヌクレオチドが、本明細書に記載されている。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡであってよい。一部の態様において、ｍＲＮＡは、化学修飾されていてよい（例えば、Kormannら（２０１１年）Nature  Biotechnology  ２９巻（２号）：１５４〜１５７頁を参照）。
【００２１】
別の態様において、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書に記載されている１種または複数種のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）をコードするポリヌクレオチドを含む、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ発現ベクターが、本明細書に記載されている。一実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。一態様において、ウイルスベクターは、組織特異的指向性を提示する。
【００２２】
別の態様において、１種または複数種のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）発現ベクターを含む宿主細胞が、本明細書に記載されている。
【００２３】
別の態様において、本明細書に記載されている発現ベクターを含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、医薬組成物は、１種より多くの発現ベクターを含むことができる。一部の実施形態において、医薬組成物は、第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクターと、第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクターとを含む。一部の実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、異なる。一部の実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、実質的に同じである。医薬組成物は、ドナー配列（例えば、ＬＳＤまたは血友病等の疾患または障害において欠如または欠損するタンパク質をコードする導入遺伝子）をさらに含むことができる。一部の実施形態において、ドナー配列は、発現ベクターに関連する。
【００２４】
一部の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質および野生型または操作された開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含む融合タンパク質が提供される。
【００２５】
一部の実施形態において、（ｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチド（例えば、プラスミド、ｍＲＮＡ、Ａｄベクター、ＡＡＶベクター等）であって、該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ＦｏｋＩ開裂ドメインと、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６に並べられた５または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質とを含み、各ジンクフィンガードメインが、認識ヘリックス領域を含み、ジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域が、表１、２または５の単一の行に示される第１のポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチド（例えば、プラスミド、ｍＲＮＡ、Ａｄベクター、ＡＡＶベクター等）であって、該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ＦｏｋＩ開裂ドメインと、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６に並べられた５または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質とを含み、各ジンクフィンガードメインが、認識ヘリックス領域を含み、ジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域が、表１、２または５の単一の行に示される第２のポリヌクレオチドと、（ｉｉｉ）疾患または障害（例えば、ＬＳＤまたは血友病）において欠如または欠損するタンパク質をコードするドナーを含む第３のポリヌクレオチド（例えば、プラスミド、ｍＲＮＡ、Ａｄベクター、ＡＡＶベクター等）ベクターとを含む医薬組成物が提供される。２種のＺＦＮのＺＦＰは、同じであっても異なっていてもよい。同様に、２種のＺＦＮの開裂ドメインは、同じであっても異なっていてもよい（例えば、偏性ヘテロ二量体を形成する変異体であってもよい）。一部の実施形態において、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、約１：１：１、約１：１：２、約１：１：３、約１：１：４、約１：１：５、約１：１：６、約１：１：７、約１：１：８、約１：１：９、約１：１：１０、約１：１：１１、約１：１：１２、約１：１：１３、約１：１：１４、約１：１：１５、約１：１：１６、約１：１：１７、約１：１：１８、約１：１：１９または約１：１：２０の比で提供される。
【００２６】
一態様において、本発明の方法および組成物は、血友病において異常に発現されるタンパク質（第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸおよび／または第Ｘ因子タンパク質）の機能的バージョンを発現する導入遺伝子を含む遺伝子改変された細胞であって、導入遺伝子が、細胞のゲノムの内在性セーフハーバー遺伝子（例えば、アルブミン遺伝子）に組み込まれた細胞を含む。別の態様において、本発明の方法および組成物は、リソソーム蓄積症の被験体において欠如するまたは異常的に発現されるタンパク質の機能的バージョンを発現する導入遺伝子を含む遺伝子改変された細胞を含む。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、少なくとも１種のヌクレアーゼを使用して、部位特異的な（標的化された）様式で組み込まれる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｔｔａｇｏおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）は、セーフハーバー遺伝子（例えば、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａまたはアルブミン。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号および同第８，１１０，３７９号；米国出願公開第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および２０１３０１７７９６０号、ならびに米国出願第１４／２７８，９０３号を参照されたい）に特異的である。一部の実施形態において、セーフハーバーは、アルブミン遺伝子である。
【００２７】
別の態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を遺伝子改変して、治療タンパク質（例えば、血友病（第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸおよび／または第Ｘ因子）またはリソソーム蓄積症（ＩＤＳ、ＩＤＵＡ等）等の疾患または障害において欠如するタンパク質）を産生する方法であって、治療タンパク質をコードする導入遺伝子が、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれ、細胞において発現されるように、１種または複数種のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）を使用して、細胞における内在性セーフハーバー遺伝子を開裂するステップを含む方法が、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態において、セーフハーバー遺伝子は、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａまたはアルブミン遺伝子である。さらなる態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を遺伝子改変して、リソソーム蓄積症において欠如するタンパク質を産生する方法が、本明細書に記載されている。これらのうち最も一般的な例は、ゴーシェ病に関連するグルコセレブロシダーゼ欠損症（遺伝子名：ＧＢＡ）、ファブリー病に関連するαガラクトシダーゼ欠損症（遺伝子名：ＧＬＡ）、ハンター病に関連するイズロン酸−２−スルファターゼ欠損症（遺伝子名：ＩＤＳ）、ハーラー病に関連するアルファ−Ｌイズロニダーゼ欠損症（遺伝子名：ＩＤＵＡ）およびニーマン・ピック病に関連するスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠損症（遺伝子名：ＳＭＰＤ１）である。ある特定の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、霊長類細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。実施形態の１セットにおいて、細胞（例えば、肝臓細胞）におけるアルブミン遺伝子を開裂するための方法であって、１種または複数種のタンパク質が発現され、アルブミン遺伝子が開裂されるような条件下で、細胞に、本明細書に開示されている１種または複数種の発現ベクターを導入するステップを含む方法が提供される。アルブミン遺伝子は、例えば、開裂されたアルブミン遺伝子へのドナー配列の組込みにより改変することができる。ある特定の実施形態において、本方法は、細胞を遺伝子改変して、リソソーム蓄積症において欠如する凝固因子またはタンパク質を産生するステップを含み、細胞に、表５に示すジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（またはこれらのＺＦＮをコードするポリヌクレオチド）およびドナーを投与するステップを含む。ＺＦＮおよびドナーは、同じまたはいずれかの組合せで異なるベクターに存在することができ、例えば、それぞれ構成成分のうち１種を保有する３種の別々のベクター（例えば、ＡＡＶベクター）；構成成分のうち２種を保有する１種のベクターおよび第３の構成成分を保有する別々のベクター；または全３種の構成成分を保有する１種のベクターに存在することができる。
【００２８】
他の態様では、本発明は、標的細胞へのドナー核酸の送達を含む。ドナーは、ヌクレアーゼ（複数可）をコードする核酸よりも前に、それよりも後に、またはそれと一緒に送達することができる。ドナー核酸は、細胞のゲノム、例えば、内因性遺伝子座中に組み込まれる外因性配列（導入遺伝子）を含み得る。一部の実施形態では、ドナーは、標的化された開裂部位との相同性の領域が隣接する全長遺伝子またはその断片を含み得る。一部の実施形態では、ドナーは、相同な領域を欠き、相同性非依存的機構（即ちＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座中に組み込まれる。ドナーは、いずれかの核酸配列、例えば、ヌクレアーゼ誘導性二本鎖切断の相同組換え修復の基質として使用される場合、内在性染色体遺伝子座におけるドナー特異的欠失の生成、あるいは（またはそれに加えて）、内在性遺伝子座の新規対立遺伝子形態（例えば、転写因子結合部位を切除する点変異）の作製をもたらす核酸を含むことができる。一部の態様において、ドナー核酸は、組込みが、遺伝子補正事象または標的化欠失をもたらすオリゴヌクレオチドである。一部の態様において、ドナーは、治療タンパク質、例えば、凝固因子を含む。
【００２９】
一部の実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の態様において、ｍＲＮＡは、化学修飾されていてよい（例えば、Kormannら（２０１１年）Nature  Biotechnology  ２９巻（２号）：１５４〜１５７頁を参照）。他の態様において、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含むことができる（米国特許第７，０７４，５９６号および同第８，１５３，７７３号を参照）。さらなる実施形態において、ｍＲＮＡは、改変されていないおよび改変されたヌクレオチドの混合物を含むことができる（米国特許出願公開第２０１２−０１９５９３６号を参照）。
【００３０】
別の態様において、例えば、被験体において欠如または欠損するタンパク質（複数可）を供給することにより疾患を処置するために、ＬＳＤおよび／または血友病の哺乳動物、または霊長類、例えばヒト霊長類、例えばヒト患者において欠如または欠損する１種または複数種の機能的タンパク質を提供するための方法が、本明細書に提供される。別の態様において、例えば、血友病Ｂを処置するために、血友病Ｂの哺乳動物、または霊長類、例えばヒト霊長類、例えばヒト患者において欠如または欠損する機能的タンパク質（例えば、Ｆ．ＩＸ）を提供するための方法が、本明細書に提供される。別の態様において、第ＶＩＩ因子欠損症に関連する血友病を処置するために、哺乳動物、または霊長類、例えばヒト霊長類、例えばヒト患者に機能的タンパク質（例えば、第ＶＩＩ因子）を提供するための方法が、本明細書に提供される。別の態様において、第Ｘ因子欠損症に関連する血友病を処置するために、機能的タンパク質（例えば、第Ｘ因子）を提供するための方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、ヌクレアーゼを使用して、それを必要とする被験体における細胞に機能的第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸおよび／または第Ｘ因子タンパク質をコードする配列を組み込むステップを含む。他の実施形態において、本方法は、ヌクレアーゼを使用して、リソソーム蓄積症において欠如または欠損する機能的タンパク質をコードする配列を組み込むステップを含む。他の実施形態において、本方法は、被験体に遺伝子改変された細胞（血友病の被験体において異常に発現されるタンパク質の機能的バージョンを発現する）を投与するステップを含む。よって、単離された細胞は、被験体に導入することができる（ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞療法）、あるいは細胞は、被験体の一部である場合改変することができる（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。例えば、疾患の処置のための医薬の調製における、血友病（例えば、第ＶＩＩＩ因子ドナーによる血友病Ａ、第ＩＸ因子ドナーによる血友病Ｂ、第ＶＩＩ因子による第ＶＩＩ因子欠損症、第Ｘ因子による第Ｘ因子欠損症、ＧＢＡドナーによるゴーシェ病、ＧＬＡドナーによるファブリー病、ＩＤＳドナーによるハンター病、ＩＤＵＡドナーによるハーラー病および／またはＳＭＰＤ１ドナーによるニーマン・ピック病）の処置のための、本明細書に記載されているドナーおよび／またはヌクレアーゼの使用も提供される。ある特定の実施形態において、Ｆ８タンパク質は、Ｂ−ドメイン欠失を含む。ある特定の実施形態において、Ｆ８および／またはＦ．ＩＸコード配列は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）および／またはこれらの組合せを使用して送達される。
【００３１】
記載されている組成物および方法のいずれかにおいて、ヌクレアーゼ（複数可）および／または導入遺伝子（複数可）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶ２／８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などのようなシュードタイプ化ＡＡＶが挙げられるがこれらに限定されない、ＡＡＶベクターにおいて運ばれ得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼおよび導入遺伝子ドナーは、同じＡＡＶベクター型を使用して送達される。他の実施形態において、ヌクレアーゼおよび導入遺伝子ドナーは、異なるＡＡＶベクター型を使用して送達される。ヌクレアーゼおよび導入遺伝子は、１種または複数種のベクターを使用して送達することができ、例えば、１種のベクターが、導入遺伝子およびヌクレアーゼ（複数可）の両方を保有する；１種がヌクレアーゼ（複数可）（例えば、例えば、２ＡペプチドによるＺＦＮ対の左および右ＺＦＮ）を保有し、１種が導入遺伝子を保有する２種のベクター；または１種のベクターが、ヌクレアーゼ対の一方のヌクレアーゼ（例えば、左ＺＦＮ）を保有し、別々のベクターが、ヌクレアーゼ対の他方のヌクレアーゼ（例えば、右ＺＦＮ）を保有し、第３の別々のベクターが、導入遺伝子を保有する３種のベクター。図２を参照されたい。２種またはそれを超えるベクターが使用される実施形態において、ベクターは、同じ濃度でまたは異なる比で使用することができ、例えば、導入遺伝子ドナーベクター（複数可）は、ヌクレアーゼベクター（複数可）よりも２倍、３倍、４倍、５倍またはそれを超えて高い濃度で投与することができる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼおよび／または導入遺伝子ドナーは、インタクトな動物の肝臓への静脈内（例えば、門脈内）投与により送達される。
【００３２】
本明細書に記載されている組成物および方法のいずれかにおいて、導入遺伝子にコードされるタンパク質は、Ｆ８タンパク質、例えば、Ｂ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（ＢＤＤ−Ｆ８）を含むことができる。他の実施形態において、導入遺伝子にコードされるタンパク質は、Ｆ．ＩＸタンパク質を含む。他の実施形態において、導入遺伝子にコードされるタンパク質は、第ＶＩＩ因子タンパク質を含む。他の実施形態において、導入遺伝子にコードされるタンパク質は、第Ｘ因子タンパク質を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子にコードされるタンパク質は、グルコセレブロシダーゼを含む。他の実施形態において、導入遺伝子にコードされるタンパク質は、αガラクトシダーゼを含む。さらなる実施形態において、導入遺伝子にコードされるタンパク質は、イズロン酸−２−スルファターゼを含む。一部の実施形態において、導入遺伝子にコードされるタンパク質は、アルファ−Ｌイズロニダーゼを含む。さらなる実施形態において、導入遺伝子にコードされるタンパク質は、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼを含む。本明細書に記載されている組成物または方法のいずれかにおいて、導入遺伝子は、転写調節因子も含むが、他方ではこれを含まず、転写は、内在性調節因子により調節される。別の態様において、本発明の方法は、それを必要とする被験体の治療的処置のための組成物を含む。一部の実施形態において、本組成物は、セーフハーバー特異的ヌクレアーゼと、第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸ、第Ｘ因子、ＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１タンパク質、あるいはこれらの機能的断片および／またはトランケーションをコードする導入遺伝子ドナーとを含む操作された幹細胞を含む。他の実施形態において、本組成物は、改変されており、第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸ、第Ｘ因子、ＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１タンパク質、あるいはこれらの機能的断片および／またはトランケーションをコードする導入遺伝子ドナーを発現する、操作された幹細胞を含む。
【００３３】
本明細書に記載されている組成物または方法のいずれかにおいて、細胞は、真核細胞であってよい。適した細胞の非限定例として、分泌細胞（例えば、肝臓細胞、粘膜細胞、唾液腺細胞、下垂体細胞等）、血液細胞（赤血球）、赤血球前駆細胞、肝細胞、筋肉細胞、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋））または内皮細胞（例えば、血管内皮細胞、糸球体内皮細胞および尿細管内皮細胞）等の、真核細胞または細胞株が挙げられる。よって、標的細胞は、霊長類細胞、例えば、ヒト細胞であってよく、または標的細胞は、哺乳動物細胞（獣医学的動物を含む）、例えば特に、非ヒト霊長類、ならびにげっ歯目（マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ目（ウサギ）、食肉目（ネコ、イヌ）および偶蹄目（Arteriodactyla）（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）の哺乳動物であってよい。一部の態様において、標的細胞は、組織（例えば、肝臓）を含む。一部の態様において、標的細胞は、本明細書に記載される方法のいずれかによる幹細胞（例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、肝臓幹細胞等）または動物胚であり、次いで、胚は、生きた動物が出生するように移植される。次いで、動物は、性的成熟になるまで育てられ、子孫を生じるようになり、ここで、子孫の少なくとも一部は、ゲノム改変を含む。細胞は、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは他の哺乳動物細胞胚の胚細胞を含むこともできる。細胞は、いかなる生物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌまたは他の哺乳動物細胞に由来してよい。細胞は、生物（例えば、被験体）から単離することができる、またはその一部であってよい。
【００３４】
本明細書に記載されている方法または組成物のいずれかにおいて、操作された遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子座）を含有する細胞は、治療目的に有用となり得る幹細胞であり得る。本発明の方法および組成物により使用することができる特異的な幹細胞型は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および肝幹細胞または肝臓幹細胞を含む。ｉＰＳＣは、患者試料および正常対照に由来することができ、患者由来ｉＰＳＣは、目的の遺伝子において正常遺伝子配列へと変異させることができる、あるいは正常細胞は、目的の遺伝子において公知の疾患対立遺伝子へと変更させることができる。同様に、肝幹細胞は、患者から単離することができる。続いてこれらの細胞は、目的の導入遺伝子を発現するように操作され、増やされ、次に患者に再導入される。
【００３５】
本明細書に記載されている方法および組成物のいずれかにおいて、導入遺伝子は、内在性セーフハーバー遺伝子に組み込むことができ、それにより、例えば、組み込まれた導入遺伝子との融合タンパク質として、該内在性遺伝子の一部、その全てが発現されるまたはそのいずれも発現されない。一部の実施形態において、内在性セーフハーバー遺伝子は、アルブミン遺伝子であり、内在性配列は、アルブミン配列である。内在性は、外来性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分および／または外来性タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在することができる。アルブミン配列は、全長野生型または変異体アルブミン配列を含むことができるか、あるいは、部分的アルブミンアミノ酸配列を含むことができる。ある特定の実施形態において、アルブミン配列（全長または部分的）は、それが融合された導入遺伝子によって発現されるポリペプチドの血清半減期の延長におよび／または担体として役立つ。他の実施形態において、導入遺伝子は、アルブミン配列を含み、ゲノム内の別のセーフハーバーへの挿入に標的化される。さらに、導入遺伝子は、その発現を駆動する外来性プロモーター（例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター）を含むことができるか、その発現は、内在性制御配列（例えば、内在性アルブミンプロモーター）によって駆動され得る。一部の実施形態において、ドナーは、例えばコドン最適化、およびグリコシル化部位の付加等が挙げられるがこれらに限定されない、追加の改変を含む。
【００３６】
本明細書に記載されている組成物または方法のいずれかにおいて、開裂は、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＴｔａｇｏもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と特異的開裂をガイドするための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）の使用等の、特異的ヌクレアーゼの使用により起こり得る。一部の実施形態において、２種のニッカーゼが使用されて、２個のニックを導入することによりＤＳＢを作製する。場合によっては、ニッカーゼはＺＦＮであるが、他方では、ニッカーゼは、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。標的化組込みは、相同組換え修復機構（ＨＤＲ）および／または非相同性修復機構（例えば、ＮＨＥＪドナー捕捉）により起こることができる。本明細書に記載されているヌクレアーゼは、例えば、コード領域の上流または下流のいずれかにおける、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロン、または非転写領域内等の、遺伝子内またはそれに隣接するコード領域または非コード領域における目的の領域に結合および／またはこれを開裂することができる。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、結合部位（例えば、表５に示す結合部位）におけるまたはその付近の標的配列を開裂する。開裂は、例えば、挿入、欠失またはこれらの組合せによる遺伝子の改変を結果としてもたらし得る。ある特定の実施形態において、改変は、ヌクレアーゼ（複数可）結合部位（複数可）および／または開裂部位（複数可）におけるまたはその付近、例えば、開裂の部位（複数可）の上流または下流の１〜３００（またはその間のいずれかの値）塩基対以内、より好ましくは、結合部位（複数可）および／または開裂部位（複数可）のいずれかの側の１〜１００塩基対（またはその間のいずれかの値）以内、さらにより好ましくは、結合部位（複数可）および／または開裂部位（複数可）のいずれかの側の１〜５０塩基対（またはその間のいずれかの値）以内である。
【００３７】
記載されている方法および組成物を使用して、それを必要とする被験体における血友病を処置または予防することができる。一部の実施形態において、本組成物は、ベクターを含み、肝臓細胞を標的とすることに使用される。他の実施形態において、本組成物は、操作された幹細胞を含み、骨髄移植片として患者に与えられる。一部の事例において、患者は、移植に先立ち部分的にまたは完全に免疫除去（immunoablate）される。他の事例において、患者は、内在性遺伝子のヌクレアーゼ媒介性改変（例えば、アルブミン遺伝子座への導入遺伝子の標的化組込み）の前、最中および／または後に１種または複数種の免疫抑制剤で処置される。さらに、本明細書に記載されている方法のいずれかは、部分的肝切除術、または形質導入を増強するおよび／または細胞周期を行うよう肝細胞を誘導する二次作用物質（secondary  agent）による処置を含む、追加のステップをさらに含むことができる。二次作用物質の例として、ガンマ線照射、ＵＶ照射、チミジン等のトリチウム標識ヌクレオチド、シス−白金、エトポシド、ヒドロキシ尿素、アフィディコリン、プレドニゾロン、四塩化炭素および／またはアデノウイルスが挙げられる。
【００３８】
本明細書に記載されている方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。ある特定の実施形態において、本組成物は、生きているインタクトな哺乳動物に導入される。哺乳動物は、送達の時点にいかなる発生のステージであってもよく、例えば、胚、胎児、新生児、乳児、若年または成体であり得る。その上、標的化細胞は、健康であっても罹患していてもよい。ある特定の実施形態において、組成物のうち１種または複数種は、静脈内（例えば、門脈内を介して、例えば尾静脈注射により肝臓に）、動脈内、腹腔内、筋肉内、肝臓実質へと（例えば、注射により）、肝動脈へと（例えば、注射により）および／または胆樹を通して（例えば、注射により）送達される。
【００３９】
特定の一態様において、本明細書に記載されている方法および組成物は、（ｉ）ＦＶＩＩＩをコードするドナー導入遺伝子、（ｉｉ）それぞれＦＶＩＩＩ以外の内在性遺伝子の遺伝子座を標的とする、例えば、血友病患者等、哺乳動物または霊長類またはヒトの内在性アルブミン遺伝子を標的とするヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔａｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含む治療組成物を含む。ある特定の実施形態において、治療組成物は、異なる量で、別々のＡＡＶベクター等、別々の独立的ベクターに、ＦＶＩＩＩドナー導入遺伝子およびアルブミン遺伝子特異的ヌクレアーゼを含み、一緒に投与することができる（例えば、単一の溶液へと混合してもよいし、または同時に投与してもよい）か、あるいは、別々に投与することができる（例えば、別々の溶液で、実質的な遅延、例えば、それぞれの投与の間に１０分間またはそれ超、３０分間またはそれ超、１時間またはそれ超、２時間またはそれ超、３時間またはそれ超、またはそれより長い遅延で投与することができる）。ある特定の実施形態において、治療組成物を投与して、非ＦＶＩＩＩ遺伝子座へのＦＶＩＩＩドナー導入遺伝子の組込みと、組み込まれたＦＶＩＩＩのその後の発現をもたらし、哺乳動物または霊長類またはヒトまたは血友病患者の血漿における治療レベルのＦＶＩＩＩを達成する。ある特定の実施形態において、治療レベルのＦＶＩＩＩは、例えば、ＦＶＩＩＩの臨床的に許容される正常血漿濃度の２％超、４％超、５％超、６％超、８％超、１０％超、１２％超、１５％超、２０％超、２５％超またはそれを超える濃度を含むことができる。あるいはまたはそれに加えて、治療レベルのＦＶＩＩＩは、例えば、個体へのＦＶＩＩＩドナー導入遺伝子およびアルブミン遺伝子ヌクレアーゼの投与に先立ち個々の哺乳動物または霊長類またはヒトまたは血友病患者において測定される機能的ＦＶＩＩＩの血漿濃度の２％超、４％超、５％超、６％超、８％超、１０％超、１２％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超またはそれを超える濃度を含むことができる。
【００４０】
特定の一態様において、本明細書に記載されている方法および組成物は、（ｉ）リソソーム蓄積タンパク質において欠損するタンパク質をコードするドナー導入遺伝子、（ｉｉ）それぞれリソソーム蓄積症において欠損するタンパク質の遺伝子以外の内在性遺伝子の遺伝子座を標的とする、例えば、リソソーム蓄積症の被験体等、哺乳動物または霊長類またはヒトの内在性アルブミン遺伝子を標的とするヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔａｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含む治療組成物を含む。ある特定の実施形態において、治療組成物は、異なる量で、別々のＡＡＶベクター等、別々の独立的ベクターに、ＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１から選択されるドナー導入遺伝子およびアルブミン遺伝子特異的ヌクレアーゼを含み、一緒に投与することができる（例えば、単一の溶液へと混合してもよいし、または同時に投与してもよい）か、あるいは別々に投与することができる（例えば、別々の溶液で、実質的な遅延、例えば、それぞれの投与の間に１０分間またはそれ超、３０分間またはそれ超、１時間またはそれ超、２時間またはそれ超、３時間またはそれ超、またはそれより長い遅延で投与することができる）。ある特定の実施形態において、治療組成物を投与して、それぞれＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１をコードする遺伝子座ではない遺伝子座へのＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１ドナー導入遺伝子の組込みと、組み込まれたＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１のその後の発現をもたらし、哺乳動物または霊長類またはヒトまたは血友病患者の血漿における治療レベルのＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１を達成する。ある特定の実施形態において、治療レベルのＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１は、例えば、ＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１の臨床的に許容される正常血漿濃度の２％超、４％超、５％超、６％超、８％超、１０％超、１２％超、１５％超、２０％超、２５％超、またはそれを超える濃度を含むことができる。あるいはまたはそれに加えて、治療レベルのＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１は、例えば、個体へのＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１ドナー導入遺伝子およびアルブミン遺伝子ヌクレアーゼの投与に先立つ個々の哺乳動物または霊長類またはヒトまたは患者において測定される機能的ＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡおよび／またはＳＭＰＤ１の血漿濃度の２％超、４％超、５％超、６％超、８％超、１０％超、１２％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、またはそれを超える濃度を含むことができる。
【００４１】
別の特定の態様において、本明細書に記載されている方法および組成物は、（ｉ）ＦＩＸをコードするドナー導入遺伝子、（ｉｉ）それぞれＦＩＸ以外の内在性遺伝子の遺伝子座を標的とする、例えば、血友病患者等、哺乳動物または霊長類またはヒトの内在性アルブミン遺伝子を標的とするヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔａｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含む治療組成物を含む。ある特定の実施形態において、治療組成物は、異なる量で、別々のＡＡＶベクター等、別々の独立的ベクターに、ＦＩＸドナー導入遺伝子およびアルブミン遺伝子ヌクレアーゼを含み、一緒に投与することができる（例えば、単一の溶液へと混合、または同時に投与することができる）か、あるいは別々に投与することができる（例えば、別々の溶液で、実質的な遅延、例えば、それぞれの投与の間に１０分間またはそれ超、３０分間またはそれ超、１時間またはそれ超、２時間またはそれ超、３時間またはそれ超、またはそれより長い遅延で投与することができる）。ある特定の実施形態において、治療組成物を投与して、非ＦＩＸ遺伝子座へのＦＩＸドナー導入遺伝子の組込みと、組み込まれたＦＩＸのその後の発現をもたらし、哺乳動物または霊長類またはヒトまたは血友病患者の血漿における治療レベルのＦＩＸを達成する。ある特定の実施形態において、治療レベルのＦＩＸは、ＦＩＸの臨床的に許容される正常血漿濃度の例えば、２％超、４％超、５％超、６％超、８％超、１０％超、１２％超、１５％超、２０％超、２５％超、またはそれを超える濃度を含むことができる。あるいはまたはそれに加えて、治療レベルのＦＩＸは、例えば、個体へのＦＩＸドナー導入遺伝子およびアルブミン遺伝子ヌクレアーゼの投与に先立ち個々の哺乳動物または霊長類またはヒトまたは血友病患者において測定される機能的ＦＩＸの血漿濃度の２％超、４％超、５％超、６％超、８％超、１０％超、１２％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、またはそれを超える濃度を含むことができる。
【００４２】
特定の種類の細胞、例えば、血小板、線維芽細胞、肝細胞等に組成物を標的とするため、投与される組成物の１種または複数種は、その細胞の表面受容体に特異的に結合するホーミング剤と会合することができる。例えば、ベクターは、ある特定の肝系細胞が受容体を有するリガンド（例えば、ガラクトース）にコンジュゲートすることができる。コンジュゲーションは、共有結合性、例えば、グルタルアルデヒド等の架橋剤、または非共有結合性、例えば、ビオチン化ベクターへのアビジン化リガンドの結合であり得る。コードされるコートタンパク質の１種または複数種が、リガンドがウイルス粒子表面に露出されるように、ネイティブＡＡＶコートタンパク質およびペプチドまたはタンパク質リガンドのハイブリッドとなることができるように、ベクターストックの調製に使用されるＡＡＶヘルパープラスミドを操作することにより、別の形態の共有結合性コンジュゲーションが提供される。
【００４３】
本発明の組成物（例えば、遺伝子改変された細胞、ＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および／またはＴＡＬＥＮならびに任意選択で導入遺伝子ドナー）を含むキットも提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子、または適切な発現ベクター中に含有されるヌクレアーゼコード遺伝子）、ドナー分子、適切な宿主細胞株、本発明の方法を実施するための指示書などを含み得る。
【００４４】
これらおよび他の態様は、全体としての開示を踏まえて、当業者に容易に明らかである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
表１、２または５の単一の行に示す通りのＦ１からＦ５またはＦ１からＦ６と命名されて並べられた５または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質。
（項目２）
項目１に記載のジンクフィンガータンパク質と、野生型または操作された開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインとを含む融合タンパク質。
（項目３）
項目１または項目２に記載の１種または複数種のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目４）
項目３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目５）
前記ベクターが、ＡＡＶベクターである、項目４に記載の発現ベクター。
（項目６）
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２／８ベクターである、項目５に記載の発現ベクター。（項目７）
項目４〜６のいずれかに記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
（項目８）
細胞におけるアルブミン遺伝子を開裂する方法であって、
前記１種または複数種のタンパク質が発現され、該アルブミン遺伝子が開裂されるような条件下で、項目４〜６のいずれかに記載の１種または複数種の発現ベクターを該細胞に導入するステップ
を含む方法。
（項目９）
改変が、開裂された前記アルブミン遺伝子へのドナー配列の組み込みを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ドナー配列が、ＡＡＶベクターを使用して導入される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２／８ベクターである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ドナー配列が、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）において欠如または欠損するタンパク質をコードする、項目８〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記細胞が、肝臓細胞である、項目８〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
リソソーム蓄積症の患者を処置する方法であって、リソソーム蓄積症の被験体において欠如する機能的タンパク質をコードする導入遺伝子の、内在性アルブミン遺伝子への標的化組込みを媒介する、項目４〜６のいずれかに記載の発現ベクターまたは項目７に記載の医薬組成物を該患者に投与するステップを含む方法。
（項目１５）
系が、
（ｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第１のポリヌクレオチドであって、該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ＦｏｋＩ開裂ドメインと、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６に並べられた５または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質とを含み、各ジンクフィンガードメインが、認識ヘリックス領域を含み、該ジンクフィンガータンパク質の該認識ヘリックス領域が、表１、２または５の単一の行に示される第１のポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドであって、該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ＦｏｋＩ開裂ドメインと、Ｆ１からＦ５またはＦ１からＦ６に並べられた５または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質とを含み、各ジンクフィンガードメインが、認識ヘリックス領域を含み、該ジンクフィンガータンパク質の該認識ヘリックス領域が、表１、２または５の単一の行に示される第２のポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）リソソーム蓄積症の被験体において欠如するタンパク質をコードするドナーを含む発現ベクターと
を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記発現ベクター（複数可）または医薬組成物および導入遺伝子が、静脈内投与される、項目１４または項目１５に記載の方法。
（項目１７）
項目４〜６のいずれかに記載の発現ベクターを含むキット。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、内在性アルブミン遺伝子座におけるタンパク質（例えば、治療タンパク質）をコードする導入遺伝子のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性挿入を描写する模式図である。「ＳＡ」は、スプライスアクセプター部位を指し；「ｐＡ」は、ポリアデニル化シグナルを指し；「Ａｌｂ  Ｅｘ１」は、内在性アルブミン遺伝子座のエクソン１を指す。
【００４６】
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、Ｆ８導入遺伝子ドナーのための例示的なヌクレアーゼおよびドナー設計を描写する模式図である。図２Ａは、例示的なドナー設計を示し、図２Ｂは、コドン最適化、異なるポリアデニル化シグナルの使用および／または推定グリコシル化モチーフ（「Ｖ３ペプチド」）の付加を含む別の例示的な設計（「最適化されたドナー」）を示す。図２Ａおよび図２Ｂに描写されるドナーは、プロモーター／エンハンサー領域を欠き、およそ４．４〜４．７ｋｂのサイズであり、これは、ＡＡＶへのパッケージングに理想的である。図２Ｃは、Ｆ８および／またはＦ９導入遺伝子の標的化組込みのためのセーフハーバー開裂のために使用される対のＺＦＮ毎の別々のベクターの設計を描写する模式図である。
【００４７】
【図３Ａ−Ｃ】図３Ａ〜図３Ｄは、ＡＡＶ２／８ベクターを使用したＺＦＮおよびドナー投与後のＨＡ／ＣＤ４−／−マウスの血漿におけるｈＦＶＩＩＩ活性を示すことにより、内在性アルブミン遺伝子座へのヒトＦ８タンパク質（ｈＦＶＩＩＩ）をコードする配列のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性標的化組込みの結果を描写する。図３Ａは、ＡＡＶ２／８導入遺伝子ドナーを描写する模式図である。図３Ｂおよび図３Ｃは、ＺＦＮベクターおよび導入遺伝子ドナーの両方（「ＺＦＮ＋ドナー」）または空ベクター（ＺＦＮ配列なし）ならびに導入遺伝子ドナー（「Ｍｏｃｋ＋ドナー」）を注射したＨＡ／ＣＤ４−／−マウスにおける正常レベルのパーセンテージとして、ｈＦＶＩＩＩの血漿レベルを描写するグラフである。投与２週間後（図３Ｂ）、または投与２および８週間後（図３Ｃ）の結果を示す。投与したベクターおよび量を示す。図３Ｄは、左および右ＺＦＮの両方をコードする単一のベクター（「２Ａ融合」）または図２Ｃに示す対の一方のＺＦＮをそれぞれコードする別々のベクター（「個々のＺＦＮ」）のいずれかを投与したマウスにおけるアルブミン遺伝子改変レベルを示すグラフである。使用したベクターは、ＡＡＶ２／８であり、横軸に沿って用量をプロットする（マウス当たりのウイルスゲノム（「ＶＧ」））。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｄは、ＡＡＶ２／８ベクターを使用したＺＦＮおよびドナー投与後のＨＡ／ＣＤ４−／−マウスの血漿におけるｈＦＶＩＩＩ活性を示すことにより、内在性アルブミン遺伝子座へのヒトＦ８タンパク質（ｈＦＶＩＩＩ）をコードする配列のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性標的化組込みの結果を描写する。図３Ａは、ＡＡＶ２／８導入遺伝子ドナーを描写する模式図である。図３Ｂおよび図３Ｃは、ＺＦＮベクターおよび導入遺伝子ドナーの両方（「ＺＦＮ＋ドナー」）または空ベクター（ＺＦＮ配列なし）ならびに導入遺伝子ドナー（「Ｍｏｃｋ＋ドナー」）を注射したＨＡ／ＣＤ４−／−マウスにおける正常レベルのパーセンテージとして、ｈＦＶＩＩＩの血漿レベルを描写するグラフである。投与２週間後（図３Ｂ）、または投与２および８週間後（図３Ｃ）の結果を示す。投与したベクターおよび量を示す。図３Ｄは、左および右ＺＦＮの両方をコードする単一のベクター（「２Ａ融合」）または図２Ｃに示す対の一方のＺＦＮをそれぞれコードする別々のベクター（「個々のＺＦＮ」）のいずれかを投与したマウスにおけるアルブミン遺伝子改変レベルを示すグラフである。使用したベクターは、ＡＡＶ２／８であり、横軸に沿って用量をプロットする（マウス当たりのウイルスゲノム（「ＶＧ」））。
【００４８】
【図４】図４は、アルブミン標的化ＺＦＮおよび図２Ｂに示す最適化された（Ｖ３）ドナー構築物を注射したＨＡ／ＣＤ４−／−マウスにおける正常レベルのパーセンテージとしてｈＦＶＩＩＩの血漿レベルを描写するグラフである。ＡＡＶ２／８−ＺＦＮ（５×１０１０ｖｇの各ＺＦＮ）＋ＡＡＶ２／８−ドナー（１×１０１１ｖｇ／マウス）を使用した。
【００４９】
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、アルブミン遺伝子座へのＦ．ＩＸ導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介性組込みを描写する。図５Ａは、使用したドナー導入遺伝子Ｆ．ＩＸ構築物の模式図である。ドナーは、ヒトＦ９遺伝子座と相同のドナーアームを含むため（「ヒトアーム左」および「ヒトアーム右」）、これらは、本実験においてＨＤＲを促進するとは予想されない。したがって、ドナーの挿入は、末端捕捉を介するＮＨＥＪに依存する。図５Ｂは、内在性マウスアルブミン遺伝子座に標的化したＺＦＮ（「ｍＡｌｂ  ＺＦＮ」）またはヒト第ＩＸ因子遺伝子座（「ｈＦ９  ＺＦＮ」）に標的化したＺＦＮおよびｈＦ９ドナー導入遺伝子（「ドナー」）の、野生型マウスへの投与後の循環ｈＦＩＸレベルを示す。投与したＡＡＶベクターおよび量を次に示す：ｍＡｌｂ  ＺＦＮおよびＦ．ＩＸドナーに対する１×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ２／８−ＺＦＮおよび５×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ２／８−ドナー、ならびにｈＦ９  ＺＦＮおよびＦ．ＩＸドナーに対する１×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ２／８−ＺＦＮおよび５×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ２／８−ドナー。ｈＦ９  ＺＦＮが、内在性マウスＦ９遺伝子座を開裂しないことに留意されたい。
【００５０】
【図６】図６は、マウスへのアルブミン標的化ＺＦＮおよびｈＦ．ＩＸドナーの投与後のｈＦ．ＩＸレベルを描写するグラフである。表示用量のＡＡＶ２／８−ＺＦＮを投与し、ＡＡＶ２／８−ドナーはＺＦＮの用量の５×である。ゲノム編集は、３桁にわたりＡＡＶ用量に比例する。
【００５１】
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ＺＦＮおよびｈＦ．ＩＸドナーで処置したＨＢマウスにおける凝固時間を描写するグラフである。図７Ａは、表示動物における血漿ｈＦ．ＩＸレベルを示し、図７Ｂは、活性化部分トロンボプラスチン時間（複数可）（ａＰＴＴ（複数可））を示す。ＡＡＶ投薬量を下部に示す。
【００５２】
【図８】図８Ａ〜図８Ｄは、アルブミン標的化ＺＦＮのみを受けている非ヒト霊長類におけるＺＦＮ投与後６５日目のＥＬＩＳＰＯＴデータを示すグラフである。「ＬＮ」は、リンパ節を指す。図示されている通り、ＡＡＶ８カプシドまたはＺＦＮに対する免疫応答はない。
【００５３】
【図９】図９は、初代ヒト肝細胞におけるアルブミン遺伝子座のヌクレアーゼ媒介性標的化を示すグラフである。ヒト初代肝細胞をＡＡＶ２／６  ｈＦ９ドナー（ＭＯＩ  ９×１０５ｖｇ／細胞）および２４時間後に５００ｎｇのｈＡＬＢ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡでｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入した。下パネル：ＭｉＳｅｑ解析によって測定された％インデル。５日目（各群の最も左のバー）、７日目（各群の中央バー）および９日目（各群の最も右のバー）に採取された上清を、ＥＬＩＳＡによってｈＦＩＸタンパク質レベルに関して解析した。エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．データは、少なくとも２回の独立的実験の代表である。
【００５４】
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍＡｌｂ  ＺＦＮの特徴付けを示す図である。図１０Ａは、表示量のＺＦＮまたはＧＦＰ  ｍＲＮＡをトランスフェクトされたＨｅｐａ  １−６細胞におけるインデルによって測定されるＺＦＮ活性を示す。ゲノムＤＮＡを単離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑシーケンシングのために標的配列をＰＣＲ増幅した。パーセンテージは、開裂およびＮＨＥＪ修復と一致した挿入および／または欠失を含有する読み取りデータ（read）を示す。図１０Ｂは、処置されたマウスにおけるｈＦ．ＩＸのレベルが、５×１０１１ｖｇ  ＡＡＶ８−ｈＦ９−ドナーおよび１×１０１１ｖｇ  ＡＡＶ８−ｍＡＬＢ−ＺＦＮによるＩＶ注射後１年間を超えて安定的であり続けたことを示す。図１０Ｃは、処置後の血漿ＡＬＴ値が、正常範囲（陰影のある区域）から逸脱しなかったことを示す。図１０Ｄは、「ハイブリッドＦ９−ｍＡｌｂ」対野生型アルブミンｍＲＮＡの相対的存在量を決定するための定量的ＰＣＲの使用を描写する。マウスに、１：１比のＺＦＮ：ドナーを表示用量で注射した。注射２週間後のマウスの肝臓から全ＲＮＡを単離した。陰性対照として、各５×１０１１ｖｇのより高い用量でルシフェラーゼ（Ｍｏｃｋ）＋ドナーを与えた。両側マン・ホイットニー検定を使用して、２群を比較した。ｎ＝６〜８匹マウス／群。エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．＊＊Ｐ＜０．０１対Ｍｏｃｋ。
【図１０Ｃ−Ｄ】図１０Ａ〜図１０Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍＡｌｂ  ＺＦＮの特徴付けを示す図である。図１０Ａは、表示量のＺＦＮまたはＧＦＰ  ｍＲＮＡをトランスフェクトされたＨｅｐａ  １−６細胞におけるインデルによって測定されるＺＦＮ活性を示す。ゲノムＤＮＡを単離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑシーケンシングのために標的配列をＰＣＲ増幅した。パーセンテージは、開裂およびＮＨＥＪ修復と一致した挿入および／または欠失を含有する読み取りデータ（read）を示す。図１０Ｂは、処置されたマウスにおけるｈＦ．ＩＸのレベルが、５×１０１１ｖｇ  ＡＡＶ８−ｈＦ９−ドナーおよび１×１０１１ｖｇ  ＡＡＶ８−ｍＡＬＢ−ＺＦＮによるＩＶ注射後１年間を超えて安定的であり続けたことを示す。図１０Ｃは、処置後の血漿ＡＬＴ値が、正常範囲（陰影のある区域）から逸脱しなかったことを示す。図１０Ｄは、「ハイブリッドＦ９−ｍＡｌｂ」対野生型アルブミンｍＲＮＡの相対的存在量を決定するための定量的ＰＣＲの使用を描写する。マウスに、１：１比のＺＦＮ：ドナーを表示用量で注射した。注射２週間後のマウスの肝臓から全ＲＮＡを単離した。陰性対照として、各５×１０１１ｖｇのより高い用量でルシフェラーゼ（Ｍｏｃｋ）＋ドナーを与えた。両側マン・ホイットニー検定を使用して、２群を比較した。ｎ＝６〜８匹マウス／群。エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．＊＊Ｐ＜０．０１対Ｍｏｃｋ。
【００５５】
【図１１】図１１は、Ｆ．ＩＸ導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介性挿入の非ヒト霊長類（アカゲザル）試験のための試験設計を示す模式図である。「ＡＬＢ  ＺＦＮ」は、米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号に記載されているアルブミン標的化ＺＦＮを指す。「ＦｏｋＩ−ｅＨｉ／ｆｉ」は、ＺＦＮにおいて使用される場合の偏性ヘテロ二量体を形成する操作されたＦｏｋＩ開裂ドメインを指す。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号；米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号および同第２０１２０１４２０６２号を参照されたい。示されている通り高用量（単一ＺＦＮ：１．５ｅ１１ｖｇ／ｋｇ；ドナー：１．５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）または低用量（単一ＺＦＮ：５ｅ１２ｖｇ／ｋｇ；ドナー：５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）のいずれかで、ＡＡＶベクターおよび血清型を使用した。
【００５６】
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、マウスアルブミン遺伝子座のイントロン１を標的とするために使用される、それぞれ例示的なＺＦＮ  ＳＢＳ＃３０７２４およびＺＦＮ  ＳＢＳ＃３０７２５のアミノ酸配列を示す。図１２Ａは、試験において使用されるＺＦＮ左アミノ酸配列（配列番号１１５）であり、図１２Ｂは、試験において使用されるＺＦＮ右（配列番号１１６）アミノ酸配列である。３×ＦＬＡＧタグをイタリック体でアノテートする。ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化配列を下線によりアノテートする。ＦｏｋＩドメインを太字フォントでアノテートする。認識ヘリックス領域を二重下線およびイタリック体で示す。
【００５７】
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、リソソーム蓄積症において欠損するタンパク質の発現およびアルブミン特異的ＺＦＮおよびドナーによる改変後の細胞の上清における酵素活性の存在を示す。図１３Ａは、ウエスタンブロット解析によるアルファ−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）タンパク質の酵素発現（図１３Ｂ）および細胞の上清におけるＩＤＵＡ酵素活性の存在を示す。トランスフェクションならびに低または高用量いずれかのＺＦＮおよびＩＤＵＡドナーの後３日目および６日目に培養物を試料採取した。図１３Ｃおよび図１３Ｄは、ＺＦＮおよびＩＤＳドナーのトランスフェクション後のイズロン酸−２−スルファターゼ欠損症（ＩＤＳ）タンパク質の存在および酵素活性を測定するデータの同様のセットを示す。
【図１３Ｃ−Ｄ】図１３Ａ〜図１３Ｄは、リソソーム蓄積症において欠損するタンパク質の発現およびアルブミン特異的ＺＦＮおよびドナーによる改変後の細胞の上清における酵素活性の存在を示す。図１３Ａは、ウエスタンブロット解析によるアルファ−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）タンパク質の酵素発現（図１３Ｂ）および細胞の上清におけるＩＤＵＡ酵素活性の存在を示す。トランスフェクションならびに低または高用量いずれかのＺＦＮおよびＩＤＵＡドナーの後３日目および６日目に培養物を試料採取した。図１３Ｃおよび図１３Ｄは、ＺＦＮおよびＩＤＳドナーのトランスフェクション後のイズロン酸−２−スルファターゼ欠損症（ＩＤＳ）タンパク質の存在および酵素活性を測定するデータの同様のセットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
詳細な説明
改変前のその発現または遺伝子配列が異常であり、疾患または障害、例えば、血友病またはリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）に関連する１種または複数種のタンパク質を産生するように細胞を改変するための組成物および方法が、本明細書に開示されている。細胞は、細胞のセーフハーバー遺伝子（例えば、アルブミン）への、１種または複数種の機能的タンパク質をコードする導入遺伝子の標的化挿入により改変される。一部の実施形態において、導入遺伝子は、内在性アルブミン遺伝子に挿入される。導入遺伝子は、血友病に関与するいずれかのタンパク質またはペプチド、例えば、第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸ、第Ｘ因子、ＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡ、ＳＭＰＤ１および／またはこれらの機能的断片をコードすることができる。本明細書に記載されている細胞を使用して、および／または本明細書に記載されている通りに細胞を改変することにより（ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）、１種または複数種のタンパク質が欠如または欠損する障害（例えば、血友病またはリソソーム蓄積症）を処置する方法も開示される。細胞を改変するためのヌクレアーゼおよびドナー分子をコードする核酸を含む組成物と、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ
ｖｉｖｏで細胞を改変するための方法がさらに記載される。その上、本発明の方法および組成物によって改変された細胞を含む組成物が記載される。
【００５９】
本明細書に記載されているゲノム的に改変された細胞は、典型的に、変更された状態または異常な状態のその遺伝子が疾患に関連する治療タンパク質（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、グルコセレブロシダーゼ、αガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、アルファ−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）および／またはスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１）をコードする配列を被験体の１個または複数個の細胞のゲノムに（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ）挿入するように、ヌクレアーゼ媒介性（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）標的化組込みにより、該細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質を産生するように改変される。ある特定の実施形態において、本方法は、例えば、部分的肝切除術により、および／または細胞周期進行を受けるように肝細胞を誘導する１種もしくは複数種の化合物の投与により、増殖するように（細胞周期に入るように）被験体の細胞、特に、肝臓細胞を誘導するステップをさらに含む。被験体として、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、およびヤギ等のような獣医学的動物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
概要
本明細書に開示される方法、ならびに組成物の調製および使用の実施は、特に示さない限り、本技術分野の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期的更新；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．  ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．  Ｐ．  Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．  Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。
【００６１】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションの、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対合する。
【００６２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、相互交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１または複数のアミノ酸が、対応する天然起源のアミノ酸の化学的アナログまたは修飾された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００６３】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要はない。かかる相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を指す：増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関する。
【００６４】
「結合タンパク質」は、別の分子と非共有結合的に結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合できる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、それ自体と結合でき（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）および／または異なるタンパク質（単数もしくは複数）の１もしくは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、１つよりも多い型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
【００６５】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインであり、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００６６】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１または複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。これらのリピートドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも呼ぶ）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【００６７】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１または複数のアミノ酸を変更する）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」（engineer）得る。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然起源のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が合理的基準から主に生じる、天然起源でないタンパク質である。設計のための合理的基準には、置換ルールの適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計および結合データの情報を記憶するデータベース中の情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；および同第８，５８６，５２６号を参照されたい；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６もまた参照されたい。
【００６８】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験過程から主に生じる、天然には見出されないタンパク質である。例えば、ＵＳ第５，７８９，５３８号；ＵＳ第５，９２５，５２３号；ＵＳ第６，００７，９８８号；ＵＳ第６，０１３，４５３号；ＵＳ第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０  ＷＯ０１／８８１９７、およびＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
【００６９】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。（例えば、Swartsら、同書、G.  Shengら、（２０１３年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  １１１巻、６５２頁を参照されたい）。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による開裂のためのガイドＤＮＡを含めた、必要な構成成分の全てである。
【００７０】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の過程を指し、限定するものではないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組み換えによるドナー捕捉を含む。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性指向性の修復機構を介した細胞における二本鎖切断の修復の間に行われる、かかる交換の特殊化された形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「標的」分子（即ち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすので、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に公知である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、かかる移入は、切断された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／もしくは標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、ならびに／または関連する過程に関与し得る。かかる特殊化されたＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、標的分子の配列の変更をもたらす。
【００７１】
本開示の方法では、本明細書に記載される１または複数の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位において標的配列（例えば、細胞クロマチン）中に二本鎖切断を生じ、切断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが、細胞中に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組込みを容易にすることが示されている。このドナー配列は、物理的に組み込まれ得、またはあるいは、このドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、ドナーと同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は、変更され得、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列へと変換され得る。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による１つのヌクレオチド配列の置き換え（即ち、情報的な意味での配列の置き換え）を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる１つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも必要としない。
【００７２】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、さらなるジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥＮの対が、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖開裂に使用され得る。
【００７３】
細胞クロマチン中の目的の領域中の配列の標的化された組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。かかる相同組換えは、切断の領域と相同な配列が存在する場合に、細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。
【００７４】
本明細書に記載される方法のいずれかでは、第一のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的の領域中のゲノム配列と相同ではあるが同一ではない配列を含み得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列と相同なドナー配列の一部分は、置き換えられるゲノム配列に対して、約８０〜９９％の間（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は、例えば、１ヌクレオチドのみが１００個を超える連続する塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で異なる場合、９９％よりも高い。ある特定の場合、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含み得る。これらの例では、非相同配列には、一般に、目的の領域中の配列と相同または同一な、５０〜１，０００塩基対（またはそれらの間の任意の整数値）または１，０００よりも大きい任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の実施形態では、このドナー配列は、第一の配列とは非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム中に挿入される。
【００７５】
本明細書に記載される方法のいずれかは、目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化された組込みによる細胞中の１種もしくは複数種の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化に使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株もまた提供される。
【００７６】
さらに、本明細書に記載される標的化された組込みの方法は、１種または複数種の外因性配列を組み込むためにも使用され得る。外因性核酸配列は、例えば、１種もしくは複数種の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、および１種もしくは複数種の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、この外因性核酸配列は、１種または複数種のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。
【００７７】
「開裂」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２つの個別の一本鎖開裂事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化された二本鎖ＤＮＡ開裂に使用される。
【００７８】
「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）と協同して、開裂活性（好ましくは二本鎖開裂活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。用語「第１および第２の開裂ハーフドメイン」；「＋および−の開裂ハーフドメイン」ならびに「右および左の開裂ハーフドメイン」は、相互交換可能に使用されて、二量体形成する開裂ハーフドメインの対を指す。
【００７９】
「操作された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の操作された開裂ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された開裂ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号もまた参照されたい。
【００８０】
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得；直鎖状、環状または分枝状であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２ヌクレオチド長と１０，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間もしくはそれらを上回る任意の整数値）、好ましくは約１００ヌクレオチド長と１，０００ヌクレオチド長との間（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２００ヌクレオチド長と５００ヌクレオチド長との間のものであり得る。
【００８１】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、各々２つのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含む：リンカーＤＮＡ（生物に依存して変動する長さのもの）が、ヌクレオソームコア間に延びる。１分子のヒストンＨ１が、一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方の、全ての型の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。
【００８２】
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを構成する全ての染色体のコレクションであるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１または複数の染色体を含み得る。
【００８３】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製性の核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。
【００８４】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。
【００８５】
「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しない分子であるが、１または複数の遺伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞中に導入され得る。「細胞中での通常の存在」は、特定の発生段階または細胞の環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックされていない細胞に関して、外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能障害性内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の機能障害性バージョンを含み得る。
【００８６】
外因性分子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアルケミストリー過程によって生成されるような小分子、または巨大分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾された誘導体、あるいは上記分子のうちの１または複数を含む任意の複合体であり得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得；直鎖状、分枝状または環状であり得；任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能な核酸、ならびに三重鎖形成性核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。
【００８７】
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入された感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ型の分子であり得るが、細胞が由来するのとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞株中に導入され得る。
【００８８】
対照的に、「内因性」分子は、特定の発生段階で特定の環境条件下で特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然起源のエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
【００８９】
「融合」分子は、２つまたはそれ超のサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって連結された分子である。これらのサブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと１または複数の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるがこれらに限定されない。第２の型の融合分子の例には、三重鎖形成性核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が含まれるがこれらに限定されない。
【００９０】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、このポリヌクレオチドは転写され、この転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生じる。トランス−スプライシング、ポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達のための方法は、本開示の他の場所に示される。
【００９１】
「遺伝子」には、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下を参照）、ならびにかかる調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接してもしなくても、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域が含まれる。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００９２】
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などの過程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質もまた含まれる。
【００９３】
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、開裂、変更、不活性化、ランダム変異）が、発現をモジュレートするために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰを含まない細胞と比較して、遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。
【００９４】
「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望まれる、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接した非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡ開裂および／または標的化された組換えを目的とすることができる。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小ささもしくは最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
【００９５】
「真核生物」細胞には、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００９６】
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結した（「ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ」または「ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ」）」は、２つまたはそれ超の構成成分（例えば、配列エレメント）の並置に関して相互交換可能に使用され、ここで、これらの構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能をこれらの構成成分のうちの少なくとも１つが媒介し得る可能性を許容するように、配置される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、１または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動可能に連結されるが、このコード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、エンハンサーとコード配列とが連続していない場合であっても、コード配列に作動可能に連結した転写調節配列である。
【００９７】
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結した」とは、構成成分の各々が、他の構成成分と連結して、そのように連結されていない場合にそれが果たすのと同じ機能を果たすという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、このＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、活性化ドメインは遺伝子発現を上方調節できる場合に、作動可能な連結状態にある。ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合した融合ポリペプチドの場合、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、この融合ポリペプチド中で、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合できるが、開裂ドメインは標的部位の近位においてＤＮＡを開裂できる場合に、作動可能な連結状態にある。
【００９８】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、その全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多い、より少ない、もしくは同じ数の残基を有し得、および／または、１もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、本技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって、決定され得る。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学的および生化学的の両方の補完によって、決定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
【００９９】
「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、標的細胞に遺伝子配列を移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む。
【０１００】
「セーフハーバー」遺伝子座は、遺伝子が宿主細胞に対する任意の有害な影響なしに挿入され得る、ゲノム内の遺伝子座である。挿入された遺伝子配列の発現が隣接する遺伝子からのいずれのリードスルー発現によっても乱されないセーフハーバー遺伝子座が、最も有益である。ヌクレアーゼ（複数可）によって標的化されるセーフハーバー遺伝子座の非限定例として、ＣＣＲ５、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａおよびアルブミンが挙げられる。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号および同第８，１１０，３７９号；米国出願公開第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号、ならびに米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号を参照されたい。
【０１０１】
ヌクレアーゼ
疾患または障害を有する被験体において欠如する、欠損するまたは異常に発現される機能的タンパク質（例えば、ＬＳＤの被験体において欠如または欠損するタンパク質および／または血友病ＡまたはＢの被験体由来のまたは被験体中の細胞のゲノムにおける凝固因子（例えば、Ｆ８および／またはＦ．ＩＸ）タンパク質）をコードする配列の組込みにおいて有用な組成物、特に、ヌクレアーゼが、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、このヌクレアーゼは、天然起源である。他の実施形態では、このヌクレアーゼは、非天然起源である、即ち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または開裂ドメインにおいて操作されている。例えば、天然起源のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更され得る（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメイン（例えば、異種開裂ドメインを有する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）ならびに／または操作された単一ガイドＲＮＡを利用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などの系を含む。
【０１０２】
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
本明細書に開示されている組成物および方法において、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＤＮＡ結合部分またはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインが挙げられるがこれらに限定されない、いかなるＤＮＡ結合ドメインを使用することもできる。
【０１０３】
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、天然起源のまたは操作された（非天然起源の）メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ  ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．  ２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログもまた参照されたい。操作されたメガヌクレーゼは、例えば、米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号に記載される。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてヌクレアーゼに関して変更され得（即ち、ヌクレアーゼが同族開裂ドメインを含むように）、または異種開裂ドメインに融合され得る。メガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインも、ヌクレアーゼ活性を提示することができる（例えば、ｃＴＡＬＥＮ）。
【０１０４】
他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のまたは操作された（非天然起源の）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。属Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞中に２５種よりも多い異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質のなかでも、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターである（Ｋａｙら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの集中したドメインを含有し、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含有する。さらに、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ、ら（２００６年）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照されたい）。さらに、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  １株ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ  ４株ＲＳ１０００における、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子が、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照されたい）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列において９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５塩基対の欠失が異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、その全体が本明細書に参考として援用される米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１０５】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、これらのタンデムリピート中に見出される配列に依存する。リピートされる配列は、およそ１０２塩基対を含み、これらのリピートは、典型的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。これらのリピートの多型は、１２位および１３位に通常位置し、１２位および１３位における超可変二残基（リピート可変二残基またはＲＶＤ領域）の正体と、ＴＡＬエフェクターの標的配列中の連続ヌクレオチドの正体との間には、一対一の相関が存在するようである（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０１頁ならびにＢｏｃｈら（２００９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードは、１２位および１３位におけるＨＤ配列（リピート可変二残基またはＲＶＤ領域）が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし；ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、そしてＩＮＧがＴに結合するように、決定されている。これらのＤＮＡ結合リピートは、新たな配列と相互作用でき植物細胞において非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化できる人工の転写因子を作製するために、新たな組合せおよびリピート数を有するタンパク質へとアセンブルされている（Ｂｏｃｈら、同書）。操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインに連結されて、酵母レポーターアッセイにおいて活性を示すＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）（非定型ＴＡＬＥＮを含む）を生じている（プラスミドベースの標的）。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１０６】
一部の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含む。他の実施形態において、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。このようなメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ開裂ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ開裂ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体形成を必要としない（Boisselら（２０１３年）Nucl  Acid  Res：１〜１３頁、doi:10.1093/nar/gkt1224を参照）。
【０１０７】
またさらなる実施形態において、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮを含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、ＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに関して位置する場所に応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在化されるニッカーゼとして作用することができる、あるいは二本鎖切断を生じさせることができる（Beurdeleyら（２０１３年）Nat  Comm：１〜８頁、DOI:10.1038/ncomms2782を参照）。加えて、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性を提示することもできる。追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１種または複数種のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ）と１種または複数種のメガＴＡＬＥ）と組み合わせて、いかなるＴＡＬＥＮを使用することもできる。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように操作されているという点で、非天然起源である。例えば、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０巻：４１１〜４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
【０１０９】
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ））ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数種のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１１０】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７中に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係るＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１１１】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
【０１１２】
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０  ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
【０１１３】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して、一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。
【０１１４】
Ｂ．開裂ドメイン
いずれか適した開裂ドメインをＤＮＡ結合ドメインに操作可能に連結して、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系等、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号および同第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号ならびに米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号を参照されたい。
【０１１５】
上述のように、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であり得る、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン。異種開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。開裂ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年カタログ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを開裂するさらなる酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年もまた参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１または複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの供給源として使用され得る。
【０１１６】
同様に、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体形成を必要とする、上記のような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。一般に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、開裂に必要とされる。あるいは、２つの開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。これら２つの開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得、または各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質についての標的部位は、好ましくは、互いに関して配置され、その結果、そのそれぞれの標的部位への２つの融合タンパク質の結合は、例えば二量体形成によって開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させる互いに対する空間的配向に、これらの開裂ハーフドメインを置く。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近くの端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離れている。しかし、任意の数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ超）。一般に、開裂の部位は、標的部位間に存在する。
【０１１７】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在しており、（認識部位における）ＤＮＡへの配列特異的結合が可能であり、結合の部位またはその近傍でＤＮＡを開裂させることが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り出された部位においてＤＮＡを開裂させ、分離可能な結合ドメインおよび開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの場所において、ＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．
ＵＳＡ  ９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９巻：３１，９７８〜３１，９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、操作されてもされなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素および１または複数のジンクフィンガー結合ドメイン由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）を含む。
【０１１８】
その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示の目的のため、開示された融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の一部は、開裂ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した細胞配列の標的化された二本鎖開裂および／または標的化された置き換えのために、各々がＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成するために使用され得る。あるいは、１つのジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子もまた、使用され得る。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化された開裂および標的された配列変更のためのパラメーターは、本開示の別の場所に提供される。
【０１１９】
開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、機能的開裂ドメインを形成するために、開裂活性を保持するまたは多量体形成する（例えば、二量体形成する）能力を保持する、タンパク質の任意の部分であり得る。
【０１２０】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、国際公開ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合および開裂ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、開裂ドメインは、例えば、その全ての開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００７０３０５３４６号および同第２００８０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体形成を最小化または予防する１種または複数種の操作された開裂ハーフドメイン（二量体形成ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位および５３８位におけるアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体形成に影響を与えるための標的である。
【０１２２】
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された開裂ハーフドメインには、第１の開裂ハーフドメインが、ＦｏｋＩの４９０位および５３８位のアミノ酸残基において変異を含み、第２の開裂ハーフドメインが、アミノ酸残基４８６および４９９において変異を含む、対が含まれる。
【０１２３】
したがって、一実施形態では、４９０位における変異によりＧｌｕ（Ｅ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ、５３８位における変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられ、４８６位における変異によりＧｌｎ（Ｑ）がＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられ、４９９位における変異によりＩｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）で置き換えられる。特に、本明細書に記載される操作された開裂ハーフドメインは、一方の開裂ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と称される操作された開裂ハーフドメインを産生し、および別の開裂ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と称される操作された開裂ハーフドメインを産生することにより調製された。本明細書に記載される操作された開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小化または消失される、偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、あらゆる目的でそれらの開示が参照によりそれらの全体が組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号を参照されたい。ある特定の実施形態では、操作された開裂ハーフドメインは、４８６位、４９９位および４９６位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換える変異、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＥＬＤ」ドメインおよび「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作された開裂ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＫＫ」ドメインおよび「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、操作された開裂ハーフドメインは、４９０位および５３７位における変異（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付けた）、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異、および５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＩＫ」ドメインおよび「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む（例えば、米国特許第８，６２３，６１８号を参照されたい）。他の実施形態では、操作された開裂ハーフドメインは、「シャーキー」および／または「シャーキー」変異を含む（Ｇｕｏら（２０１０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４００巻（１号）：９６〜１０７頁を参照されたい）。
【０１２４】
本明細書に記載される操作された開裂ハーフドメインは、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号に記載されるように、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発によって、任意の適切な方法を使用して調製できる。
【０１２５】
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「開裂酵素」技術を使用して、核酸標的部位においてｉｎ  ｖｉｖｏでアセンブルされ得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照されたい）。かかる開裂酵素の構成成分は、別々の発現構築物のいずれか上に発現され得るか、または、例えば、自己開裂性２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって個々の構成成分が分離されて、１つのオープンリーディングフレームで連結され得る。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【０１２６】
ヌクレアーゼは、例えば、ＷＯ２００９／０４２１６３および２００９００６８１６４に記載される酵母ベースの染色体系における使用の前に、活性についてスクリーニングされ得る。ヌクレアーゼ発現構築物は、本技術分野で公知の方法を使用して容易に設計することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６０１８８９８７号；同第２００６００６３２３１号；および国際公開ＷＯ／０１４２７５を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。この系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２年．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３巻：１５６５〜１５７５頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２年．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０巻：４８２〜４９６頁；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６年．  Ｂｉｏｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  １巻：７頁；Ｈａｆｔら、２００５年．  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．  １巻：ｅ６０頁）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主中のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸開裂の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
【０１２８】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられた系の１つであり、４つの連続的ステップで、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実施する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識のためのさらなる要求、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を介して、標的ＤＮＡにＣａｓ９を指向させる。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトスペーサー内の二本鎖切断を生じる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップから構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれる過程における、さらなる攻撃を予防するための、ＣＲＩＳＰＲアレイ中への異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後の、（ｉｉｉ）異質核酸によるＲＮＡ媒介性の干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能と関連し、異質ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然起源のＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有することを条件として、天然配列の断片ならびに天然配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的修飾、およびその融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合物、共有結合的修飾が含まれるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、およびＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から取得可能であり得るか、もしくは化学的に合成され得るか、またはこれらの２つの手順の組合せによって、取得可能であり得る。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、もしくは外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であり得、この核酸は、内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする。一部の場合には、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然には産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
【０１３０】
セーフハーバー遺伝子および他の遺伝子に標的化された例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が、例えば、米国仮特許出願第６１／８２３，６８９号に開示されている。
【０１３１】
よって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望ましいいずれかの遺伝子における標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０１３２】
標的部位
上に詳細に記載したように、ＤＮＡ結合ドメインは、（例えば、アルブミンなどのセーフハーバー遺伝子座における）選択された任意の配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、トリプレット（またはクアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットのヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数種のアミノ酸配列と関連する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、共有に係る米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計もまた実施され得る。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１３３】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有に係るＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１３４】
標的部位の選択；融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのヌクレアーゼおよび方法は、当業者に公知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。
【０１３５】
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質）は、例えば、５またはそれ超のアミノ酸のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。６またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列について、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間に適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。米国特許第８，５８６，５２６号もまた参照されたい。
【０１３６】
機能的Ｆ８および／またはＦ．ＩＸタンパク質をコードする配列の標的化挿入による血友病の処置のため、被験体のゲノムにおけるいずれか所望の挿入部位が、ヌクレアーゼにより開裂され、これは、Ｆ８および／またはＦ．ＩＸコード配列を保有するドナーポリヌクレオチドの標的化挿入を刺激する。ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ゲノムにおけるいずれか所望の部位に標的化され得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、内在性セーフハーバー遺伝子座、例えば、内在性アルブミン遺伝子座に標的化される。
【０１３７】
ドナー配列
本明細書に記載されているヌクレアーゼ媒介性標的化組込みによりいかなるドナーを挿入し得る。ある特定の実施形態において、ドナーは、治療タンパク質、例えば、疾患または障害の被験体において欠如する、欠損するおよび／または異常に発現されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド（導入遺伝子）を含む。このような障害の非限定例として、表皮水疱症、糖尿病、がん、凝固障害またはＡＡＴ欠損肺気腫、凝固障害および／またはリソソーム蓄積症が挙げられる。
【０１３８】
血友病を処置するため、ドナー配列（「外来性配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、機能的凝固因子タンパク質またはその一部をコードする配列を含み、ドナー組込み後に機能的凝固因子タンパク質をコードおよび発現する配列を結果としてもたらす。凝固因子タンパク質導入遺伝子の非限定例として、第ＶＩＩＩ因子および／または第ＩＸ因子が挙げられ、これらのタンパク質の機能的断片を含む。ある特定の実施形態において、Ｆ８タンパク質のＢ−ドメインが欠失される。例えば、Chuahら（２０
０３年）１０１巻（５号）：１７３４〜１７４３頁を参照されたい。他の実施形態において、導入遺伝子は、機能的Ｆ．ＩＸタンパク質またはその一部をコードする配列を含み、ドナー組込み後に機能Ｆ．ＩＸタンパク質をコードおよび発現する配列を結果としてもたらす。同様に、ＬＳＤを処置するため、ドナー配列は、ＬＳＤの被験体において欠如する１種または複数種のタンパク質をコードする。このようなタンパク質の非限定例として、ゴーシェ病において欠損するグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）；ファブリー病において欠損するαガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）；ハンター病において欠損するイズロン酸−２−スルファターゼ欠損症（ＩＤＳ）；ハーラー病において欠損するアルファ−Ｌイズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）；ニーマン・ピック病において欠損するスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（ＳＭＰＤ１）が挙げられる。
【０１３９】
ドナー分子は、内在性遺伝子の全てもしくは一部が発現されるまたは内在性遺伝子のいずれも発現されないように、内在性遺伝子に挿入することができる。例えば、本明細書に記載されている機能的凝固因子タンパク質（例えば、Ｆ８および／またはＦ．ＩＸ）配列を含む導入遺伝子は、導入遺伝子と共に内在性アルブミンの一部が発現されるまたはそのいずれも発現されないように、内在性アルブミン遺伝子座に挿入することができる。
【０１４０】
ドナー（導入遺伝子）配列は、融合タンパク質（複数可）（例えば、ヌクレアーゼ）の発現に先立ち、それと同時に、またはその後に、細胞に導入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、これと、これが相同性を有するゲノム配列との間の相同組換え（または相同組換え修復）を支持するために、ゲノム配列に対し十分な相同性（連続的または非連続的領域）を含有することができるか、あるいは、ドナー配列は、非ＨＤＲ機構（例えば、ＮＨＥＪドナー捕捉）により組み込むことができ、この場合、ドナーポリヌクレオチド（例えば、ベクター）は、細胞クロマチンにおける目的の領域と相同な配列を含有する必要がない。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号および同第７，９７２，８４３号ならびに米国特許出願公開第２０１１０２８１３６１号；同第２０１０００４７８０５号および同第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。
【０１４１】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖、二本鎖または部分的に一本鎖かつ部分的に二本鎖であり得、直鎖状または環状（例えば、小環状）形態で細胞に導入することができる。米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号、同第２０１１０２８１３６１号、同第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。直鎖状の形態で導入される場合、当業者に公知の方法によって、ドナー配列の末端を保護する（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）ことができる。例えば、１つまたは複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加する、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドを一端または両端にライゲーションする。例えば、Ｃｈａｎｇら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４巻：４９５９〜４９６３頁、Ｎｅｈｌｓら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加の方法としては、末端アミノ基（複数可）の付加、および例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダートやＯ−メチルリボースもしくはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間の結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターや抗生物質耐性をコードしている遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の部分として、細胞内に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドを、ネイキッド核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの剤と複合体を形成した核酸として、導入することができ、また、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）によって送達することができる。
【０１４２】
ドナーは、一般に、その発現が、組込み部位における内在性プロモーター（例えば、ドナーが、患者のアルブミン遺伝子座に組み込まれる場合は、内在性アルブミンプロモーター）によって駆動されるように挿入される。よって、導入遺伝子は、典型的には、その発現を駆動する制御エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を欠如する（例えば、「プロモーターなし構築物」とも称される）。にもかかわらず、ドナーが、組込みにより機能的タンパク質の発現を駆動するプロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的（例えば、肝臓特異的または血小板特異的）プロモーターを含むことができることが明らかである。
【０１４３】
ドナー配列は、いずれか最適な標的部位に特異的に組み込まれ、これにより、伝統的な遺伝子療法におけるランダムな組込みに伴う課題を排除することができる。
【０１４４】
アルブミン配列（内在性または導入遺伝子の一部）が、導入遺伝子と共に発現される場合、アルブミン配列は、全長配列（野生型もしくは変異体）または部分的配列であり得る。好ましくは、アルブミン配列は、機能的である。これらの全長または部分的アルブミン配列の機能の非限定例として、導入遺伝子（例えば、治療用遺伝子）によって発現されるポリペプチドの血清半減期の延長および／または担体としての作用が挙げられる。
【０１４５】
さらに、発現を必要としていなくとも、外因性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルをも含み得る。
【０１４６】
ドナー配列のいずれかは、次の改変のうち１種または複数種を含むことができる：コドン最適化（例えば、ヒトコドンへの）、および／または１個もしくは複数個のグリコシル化部位の付加。例えば、McIntoshら（２０１３年）Blood（１７巻）：３３３５〜４４頁
を参照されたい。外来性配列は、治療タンパク質の標的化送達を可能にするペプチド配列を含むこともできる。例えば、ヒトｐ９７ポリペプチドおよび／またはその断片をコードする核酸配列は、融合タンパク質が血液脳関門を横断する潜在力を有するように、ドナー外来性配列に連結することができる（例えば、米国仮特許出願第２０１３０１８３３６８号およびKarkanら（２００８年）PLOS  One.DOI:10.1371／journal.pone.0002469を参照
）か、他のペプチドを使用して、ミトコンドリア等、細胞内小器官へと導入遺伝子ドナーコードタンパク質を標的化することができる（例えば、Jacototら（２００６年）Biochim
Biophys  Acta  Bioenerg  １７５７巻：１３１２〜１３２３頁）。
【０１４７】
送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されているタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、任意の適当な手段によってｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで送達してもよい。
【０１４８】
本明細書に記載されているようなヌクレアーゼの送達方法は、例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号に記載されており、それらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。
【０１４９】
また、本明細書に記載されているようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を、１種または複数種のジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（複数可）をコードする配列を含有するベクターを使用して送達してもよい。以下に限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターなどを含めた任意のベクター系を使用してもよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号および同第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、任意のこれらのベクターが、求められる１種または複数種の配列を含んでもよいことは明らかである。そのため、１種または複数種のヌクレアーゼおよびドナー構築物を細胞内に導入する際に、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドを同じベクターまたは異なるベクターに保有させてもよい。複数のベクターを使用する際には、各ベクターは、１種または複数種のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列を含んでもよい。ある特定の実施形態において、導入遺伝子およびヌクレアーゼ（複数可）の両方を保有するために１種のベクターが使用される。他の実施形態において、１種のベクターがヌクレアーゼ（複数可）（例えば、ＺＦＮ対の左および右ＺＦＮ、例えば、２Ａペプチドによる）を保有し、１種が導入遺伝子を保有する、２種のベクターが使用される（同じまたは異なるベクター型）。またさらなる実施形態において、第１のベクターがヌクレアーゼ対の一方のヌクレアーゼ（例えば、左ＺＦＮ）を保有し、第２のベクターがヌクレアーゼ対の他方のヌクレアーゼ（例えば、右ＺＦＮ）を保有し、第３のベクターが導入遺伝子を保有する、３種のベクターが使用される。図２を参照されたい。
【０１５０】
ドナーおよび／またはヌクレアーゼは、任意の適切な濃度で使用され得る。特定の実施形態において、ドナーおよび別々のヌクレアーゼベクター（複数可）は、同じ濃度で使用される。他の実施形態において、ドナーおよび別々のヌクレアーゼベクター（複数可）は、異なる濃度で使用され、例えば、１つのベクターは、他のベクターの２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ超倍である（例えば、ヌクレアーゼベクター（複数可）よりも多くのドナーベクター（複数可））。ＡＡＶベクターが送達のために使用される場合、例えば、ドナーおよび／またはヌクレアーゼを含むウイルスベクター（複数可）は、１用量（例えば、細胞または動物）あたり１×１０８〜１×１０１３粒子である。
【０１５１】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルとの複合体を形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは細胞へ送達された後に、エピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのどちらかを有する。操作されたＤＮＡ結合タンパク質およびこれらの結合タンパク質を含む融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ送達の総説については、Ｒｅｂａｒ（２００４年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｒｕｇｓ、１３巻（７号）：８２９〜８３９頁、Ｒｏｓｓｉら（２００７年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２５巻（１２号）：１４４４〜１４５４頁、ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）、ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）、ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ，  ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）、Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）、Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻：３５〜３６頁（１９９５年）、ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）、Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中のＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ著（１９９５年）ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：１３〜２６頁（１９９４年）などの一般的な遺伝子送達の文献を参照されたい。
【０１５２】
核酸の非ウイルス送達方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤で増強されたＤＮＡ取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。
【０１５３】
追加の例示の核酸送達系としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ケルン、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド州）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、マサチューセッツ州）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ、（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質としては、ＦｅｌｇｎｅｒのＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。
【０１５４】
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）、Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）、Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、５巻：６４７−６５４（１９９４年）、Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）、Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）、ならびに米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号および同第４，９４６，７８７号を参照されたい）。
【０１５５】
追加の送達方法としては、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）内へのパッケージングを使用することが挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織に対する特異性を有し、かつ他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞の表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれる。細胞内に取り込まれると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら、（２００９年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７巻（７号）、６４３頁を参照されたい）。
【０１５６】
操作されたヌクレアーゼ／ドナーをコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスに体内の特定の細胞を標的とさせ、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化した過程を利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与（ｉｎ  ｖｉｖｏ）することができるか、またはインビトロで細胞を処置するために使用することができ、改変された細胞は患者に投与される（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。ヌクレアーゼ／ドナーを送達するための従来のウイルスに基づく系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチン、および単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノム内の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
【０１５７】
レトロウイルスの向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み入れることによって変更することができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大させる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させることができるレトロウイルスベクターであり、典型的には高ウイルス力価を生じる。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列に用いるパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングには十分であり、それらは、次いで、治療遺伝子を標的細胞内に組み込むために使用されて、導入遺伝子の永続的な発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）、Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．、１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
【０１５８】
一過性発現が好適な用途では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い効率で形質移入が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現を得ている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。また、アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療の手順（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照されたい）に用いるために、細胞に標的核酸を形質導入することもできる。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ、８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）、およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含めた多数の刊行物に記載されている。
【０１５９】
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験の遺伝子移入に利用可能であり、それらは、形質導入薬剤を生成するために、ヘルパー細胞株内に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用する。
【０１６０】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ、８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）、Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）、Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ、９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓでパッケージされたベクターについて、５０％またはそれ超の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）、Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１巻：１１１〜２頁（１９９７年）。）
【０１６１】
組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型および非病原性のパルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達システムである。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５塩基対の逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム内への組込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の鍵となる特長である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１巻：９１１７号  １７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶ２／８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などのようなシュードタイプ化ＡＡＶ、ならびに任意の新規ＡＡＶ血清型を含めた他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。
【０１６２】
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させる。アデノウイルスベクターのほとんどは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えて、その後、複製欠損性ベクターが、欠失した遺伝子機能をトランスに供給するヒト２９３細胞で増殖するように、操作される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉で見出されるものなど非分裂性の分化細胞を含む、複数の種類の組織をｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな保有能力を有する。臨床試験でＡｄベクターを使用する例では、筋肉内注入を用いた抗腫瘍免疫化のポリヌクレオチド治療が含められた（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子移入に用いるアデノウイルスベクターの使用の追加の例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２４巻：１号、５〜１０頁（１９９６年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、９巻：７号、１０８３〜１０８９頁（１９９８年）、Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）、Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）、Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）、Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が挙げられる。
【０１６３】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を形成する。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内に核酸ベクターをパッケージングする生産細胞株によって生成される。これらのベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列（適用可能な場合）、発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている他のウイルス配列を含有する。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。例えば、遺伝子治療に使用するＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム内へのパッケージングおよび組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを具える。ウイルスＤＮＡは、細胞株中にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子即ち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするもののＩＴＲ配列を欠失したヘルパープラスミドを含有する。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠失しているため、有意な量にはパッケージングされない。アデノウイルスによる夾雑は、例えば、ＡＡＶよりも感受性があるアデノウイルスに対する熱処理によって低減することができる。
【０１６４】
多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターが、高度な特異性で特定の細胞型に送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、ウイルスベクターを所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選ばれる。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスを改変して、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現しているある特定のヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質をウイルスが発現する、他のウイルス−標的細胞の対にまで及び得るものである。例えば、線状ファージを操作して、事実上いかなる選ばれた細胞受容体にも特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示することができる。上記の記載は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターを操作して、特異的な標的細胞による取り込みに好都合な特異的な取り込み配列を含有させることができる。
【０１６５】
遺伝子治療ベクターは、下記に説明するように、個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）や万能ドナーの造血幹細胞などの細胞に、ベクターをｅｘ  ｖｉｖｏで送達し、続いて、通常はベクターを組み入れた細胞を選択した後に、患者への細胞の再移植を行うことができる。
【０１６６】
また、ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することもできる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触の内に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかに依り、そのような経路としては、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する適当な方法は、利用可能であり、当業者に周知であり、そして、１つよりも多い経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路は、別の経路よりも速やかかつ有効な反応を提供することができる。
【０１６７】
本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、ヌクレアーゼをコードするおよび／またはドナー）の導入に適したベクターとしては、非組込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が挙げられる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻：１１３８２〜１１３８８頁、Ｄｕｌｌら（１９９８年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：８４６３〜８４７１頁、Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９８７３〜９８８０頁、Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５巻：２１７〜２２２頁、米国特許出願公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。
【０１６８】
薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度は決定される。したがって、下記に記載するように、利用可能な医薬組成物の実に様々な適当な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照されたい）。
【０１６９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの送達は、ナノ粒子の使用により達成することもできる。現在調査されている多くのナノ粒子は、脂質またはポリマーによりナノ構造へと自己組織化する治療分子で構成される。これらの粒子は、標的組織（例えば、腫瘍細胞、特異的器官等）へと治療用量の核酸を送達する潜在力を有する。例えば、Rinkら（２０１３年）Curr  Opin  Oncol：２５巻（６号）：６４６〜６５１頁を参照されたい。
【０１７０】
ヌクレアーゼをコードする配列とドナー構築物とを、同じまたは異なる系を使用して送達することができることは明らかである。例えば、ヌクレアーゼおよびドナーを同じベクター（例えば、ＡＡＶ）によって保有することができる。あるいは、ドナーポリヌクレオチドをプラスミドによって保有することができ、一方、１種または複数種のヌクレアーゼを異なるベクター（例えば、ＡＡＶベクター）によって保有することができる。さらに、これらの異なるベクターを、同じまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって投与することができる。これらのベクターを、同時にまたは任意の順番で、送達することができる。
【０１７１】
よって、本開示は、あるタンパク質が欠如または欠損した疾患または障害のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ処置および／または予防を含む。例えば、血友病Ａは、Ｆ８コード配列のヌクレアーゼ媒介性組込みにより処置することができる。本開示は、Ｆ．ＩＸコード配列のヌクレアーゼ媒介性組込みによる、血友病Ｂのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ処置も含む。同様に、本開示は、それぞれ第ＶＩＩ因子または第Ｘ因子コード配列のヌクレアーゼ媒介性組込みによる、第ＶＩＩ因子欠損症および第Ｘ因子欠損症関連血友病の処置を含む。加えて、本開示は、ＬＳＤにおいて欠如または欠損する１種または複数種のタンパク質のヌクレアーゼ媒介性組込みによる、１種または複数種のＬＳＤの処置を含む。組成物は、血清、肝臓または標的細胞で所望の濃度の治療ポリペプチドを得るために、有効量でヒト患者へ投与される。投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段に依ることができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの両方の方法が意図される。門脈への静脈内注射は、好ましい投与方法である。他のｉｎ
ｖｉｖｏ投与の様式としては、例えば、肝動脈を通じることを含めて肝臓葉もしくは胆管への直接注射および肝臓遠位への静脈内注射、肝実質への直接注射、肝動脈を介した注射ならびに／または胆管を通じた逆行注射が挙げられる。ｅｘ  ｖｉｖｏ投与の様式としては、切除した肝細胞または肝臓の他の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入し、続いて形質導入された切除肝細胞をヒト患者の門脈脈管、肝実質または胆管へ戻して注入することが挙げられる。例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６巻：３３５〜３４１頁（１９９４年）を参照されたい。他の投与機序は、患者または同種異系間幹細胞におけるセーフハーバー位置への、第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸ、第Ｘ因子、グルコセレブロシダーゼ、αガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼおよび／またはアルファ−Ｌイズロニダーゼコード導入遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏヌクレアーゼ媒介性挿入を含む。改変後に、処置された細胞は次に、疾患または障害（例えば、ＬＳＤおよび／または血友病）の処置のために患者へと再注入される。
【０１７２】
投与する有効量のヌクレアーゼ（複数可）およびドナー（例えば、第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸ、第Ｘ因子、ＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡまたはＳＭＰＤ１）は、患者に応じておよび目的の治療ポリペプチドによって変化することになる。したがって、有効量は、その組成物を投与する医師によって最適に決定され、適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。十分な時間で組込みおよび発現させた後（例えば、典型的には４〜１５日間）、治療ポリペプチドの血清または他の組織のレベルの分析、および投与前の初期レベルとの比較によって、投与されている量が少なすぎるのか、適正な範囲内であるか、または多すぎるのかを決定する。また、初期投与およびそれに引き続いての投与に適したレジメンも変化し得るが、初期投与と、必要であればそれに引き続いての投与とを行うのが典型的である。引き続いての投与は、種々の間隔で投与されてもよく、毎日から毎年まで数年に１回までの範囲に及ぶ。当業者は、適切な免疫抑制技法が、送達ベクターの免疫抑制による形質導入の阻害または遮断を回避するために推奨され得ることを理解する。例えば、Ｖｉｌｑｕｉｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、６巻：１３９１〜１４０１頁（１９９５年）を参照されたい。
【０１７３】
ｅｘ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｖｏとの両方の投与に用いる製剤としては、液体中懸濁液物または乳濁液が挙げられる。多くの場合、活性成分は、薬学的に許容され、かつ活性成分に適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組合せが挙げられる。さらに、組成物は、湿潤剤もしくは乳濁剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の効果を高める他の試薬などの微量の補助的な物質を含有していてもよい。
【０１７４】
適用
本発明の方法および組成物は、標的化された細胞からタンパク質（複数可）が分泌されるように、１種または複数種のタンパク質をコードする導入遺伝子を供給することが望ましいいずれかの状況において使用することができる。よって、本技術は、患者が、問題（例えば、発現レベルにおける問題または正常機能に満たないもしくは機能しない状態で発現されるタンパク質に伴う問題）のせいで、あるタンパク質を欠損する状態に有用である。その上、分泌性器官による外来性タンパク質の供給によって緩和され得る、ＣＯＰＤもしくは肝臓損傷等、Ａ１ＡＴ欠損障害または他の障害、状態もしくは疾患は、本発明の方法および組成物により処置成功させることができる。リソソーム蓄積症は、糖尿病等の代謝性疾患と同様に、本発明の方法および組成物によって処置することができる。
【０１７５】
治療的に有用であり、注射または注入によって典型的に送達されるタンパク質も、本発明の方法および組成物に有用である。非限定例として、糖尿病療法における使用のためのＣ−ペプチド（例えば、ＣｅｂｉｘによるＥｒｓａｔｔａ（商標））またはインスリンの生成。さらに別の適用は、コラーゲンＶＩＩの生成による表皮水疱症の処置を含む。本明細書に記載されている分泌性組織におけるＩＧＦ−１の発現を使用して、リポタンパク質リパーゼの発現により、肝硬変およびリポタンパク質リパーゼ欠損症の患者におけるこのタンパク質のレベルを増加させることができる。抗体は、治療上の利益のために、例えば、がん、自己免疫疾患および他の疾患の処置のために分泌させることもできる。治療抗体の例として、ＴＮＦ−α、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＶＥＧＦＲ、およびＣＤ５２などに対する抗体が挙げられる。分泌性組織において産生させることができる凝固に関する他のタンパク質は、フィブリノーゲン、プロトロンビン、組織因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォンウィルブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン子ファクターＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼインヒビター、プラスミノゲン、アルファ２−抗プラスミン、組織プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノゲン活性化因子インヒビター−１およびプラスミノゲン活性化因子インヒビター−２を含む。
【０１７６】
本発明の方法および組成物は、１種または複数種の非コード核酸または構造核酸（例えば、ｓｈＲＮＡまたはＲＮＡｉ）をコードする導入遺伝子を供給および発現させることが望ましいいずれかの状況において使用することもできる。このようなＲＮＡは、阻害性構造を形成することができ、脂質障害（例えば、ＡｐｏＢ−１００、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＰＣＳＫ９を標的とする）；冠動脈疾患（例えば、ＣＲＰ、Ａｐｏ（ａ）を標的とする）；凝固障害および血液障害（例えば、Ｆ．ＸＩ、ＦＶＩＩ、アンチトロンビン、ＴＭＰＲＳＳ６を標的とする）；自己免疫疾患（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＧＣＣＲ、ＧＣＧＲ、ＰＴＰ−１Ｂ、ＶＬＡ−４を標的とする）；ＴＴＲアミロイドーシス；筋疾患（例えば、ＳＭＮ２、ＧＨｒ、ＤＭＰＫを標的とする）；炎症性疾患（例えば、ＰＫＫを標的とする）；肥満（例えば、ＦＧＦＲ４を標的とする）；肝臓疾患（例えば、ＤＧＡＴ２、ＡＬＡＳ−１、Ｃ５、ＡＡＴを標的とする）；がん（例えば、クラスタリン、ｅＩＦ−４Ｅ、Ｈｓｐ２７、ＡＲを標的とする）；線維性疾患（例えば、ＣＴＧＦを標的とする）；眼性疾患（例えば、Ｃ−ｒａｆキナーゼを標的とする）；または感染性疾患（例えば、アミノグリコシド（aminoglycodise）、ヘプシジン、ＲＧ−１０１を標的とする）等の疾患の処置において有用であり得る。
【０１７７】
以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。このことが、実例のみの目的にあること、ならびに他のヌクレアーゼが使用され得ること、例えば、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）が使用され得ること、および／または天然起源のもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）のＤＮＡ結合ドメインと異種由来開裂ドメインとの融合物、操作された単一ガイドＲＮＡを含むＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が使われ得ることであることは理解されよう。
【実施例】
【０１７８】
（実施例１）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦ８導入遺伝子の標的化組込み
ＨＡ／ＣＤ４−／−マウスに、米国特許出願公開第２０１２０１２８６３５号に記載されている通り、（１）対照ＡＡＶ２／８ベクターおよびＦ８をコードするＡＡＶ２／８ドナー導入遺伝子（「Ｍｏｃｋ＋ドナー」）または（２）アルブミン遺伝子座を標的化するＺＦＮ対をコードするＡＡＶベクター（米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号ならびに図１０Ａおよび図１０Ｂに記載）およびＦ８をコードするＡＡＶドナー導入遺伝子（「ＺＦＮ＋ドナー」）のいずれかを、両者共に尾静脈への注射により投与した。ドナーは、図１および図２に模式的に示す通りに使用され、およそ４．４〜４．７ｋｂのサイズのプロモーターなしＢ−ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（ＢＤＤ−Ｆ８）ｃＤＮＡを含む。２種の投薬レベル、ＡＡＶ８−ＺＦＮ（１ｅ１１ｖｇ／マウス）＋ＡＡＶ８−ドナー（１ｅ１１ｖｇ／マウス）を含む「低」投薬レベル：図３Ｂ；およびＡＡＶ８−ＺＦＮ（５ｅ１１ｖｇ／マウス）＋ＡＡＶ８−ドナー（５ｅ１１ｖｇ／マウス）を含む「高」投薬レベル：図３Ｃで、用量をマウスに投与した。
【０１７９】
その上、標準プロトコールに従った哺乳動物細胞における発現のためのコドン最適化により、また、グリコシル化部位によるリンカー（Ｖ３）の付加によりＦ８ドナーを最適化した（McIntoshら（２０１３年）Blood  １２１巻：３３３５頁を参照）。本実験におい
て、ＨＡ／ＣＤ４−／−マウスに、ＡＡＶ８−ＺＦＮ（５ｅ１０ｖｇの各ＺＦＮ）＋ＡＡＶ８−ドナー（１ｅ１１ｖｇ／マウス）を投薬した：図４。
【０１８０】
標準技法を使用して、Ｆ８の血漿レベルを評価した。
【０１８１】
図３および図４に示す通り、マウスアルブミン遺伝子座への第８因子ドナーの標的化組込みは、いずれかのドナーを使用した場合、血友病Ａマウスにおいて正常の最大５０％の活性レベルを結果としてもたらした。しかし、最適化されたＦ８ドナー構築物を使用した場合、用量の２０％のみを使用して、匹敵するＦ８血漿レベルが観察された。加えて、対に必要とされる２種のＺＦＮの一方をそれぞれ含む２種のＺＦＮベクターを使用した場合、１種の発現ベクターにおいて２Ａ部位により離間されて一緒にＺＦＮが導入された場合よりも高レベルの開裂が観察された（図３Ｄ）。
【０１８２】
（実施例２）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦ９導入遺伝子の標的化組込み
Ａ．ヒト肝細胞
本発明者らは先ず、ヒトアルブミンの第１のイントロン内の部位を標的とするＺＦＮ対をコードするｍＲＮＡのトランスフェクションと共に、Ｆ９ドナーを含有するＡＡＶ６ベクターをヒト初代肝細胞に形質導入した。
【０１８３】
図９に示す通り、ドナーおよびＺＦＮで処置した肝細胞は、培養上清における測定可能なヒトＦ．ＩＸを提示した。
【０１８４】
Ｂ．マウス
本発明者らは次に、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのこのアプローチを実証しようと努力した。これを達成するために、本発明者らは先ず、後述する通り、マウスアルブミンイントロン１（図１２に示す）における類似の位置を標的とするＺＦＮ対を操作し（下の表１に示す）、マウスヘパトーマ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの対の活性を確認した。
【表１】
2019037254.tif 000002
【０１８５】
図１０に示す通り、対は、マウスヘパトーマ細胞において活性であった。
【０１８６】
加えて、野生型マウス（群当たり３匹の動物）に、図１２Ａおよび１２Ｂに示す、米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号に記載されているマウスアルブミン標的化ＺＦＮ対をコードするＡＡＶベクター（「ｍＡｌｂ  ＺＦＮ」）または米国特許出願公開第２０１２０１２８６３５号に記載されているヒトＦ．ＩＸ標的化ＺＦＮ対（「ｈＦ９  ＺＦＮ」）をコードするＡＡＶベクターのいずれかにより、Ｆ．ＩＸをコードするＡＡＶ２／８ドナー導入遺伝子（図５Ａを参照）を尾静脈注射により投与した。ベクター構築物および投薬量は以下の通りであった：１×１０１１ｖｇ／マウスのアルブミンＡＡＶ２／８−ＺＦＮおよび５×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ドナー、ならびに１×１０１１ｖｇ／マウスのＦ．ＩＸ  ＡＡＶ８−ＺＦＮおよび５×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ドナー。
【０１８７】
市販の抗体を使用した標準市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、Ｆ９の血漿レベルを評価した。加えて、米国特許出願公開第２０１２０１２８６３５号ならびにPerezら（２０
０８年）Nat.  Biotechnol.２６巻：８０８〜８１６頁およびGuschinら（２０１０年）Methods  Mol  Biol.６４９巻：２４７〜５６頁）に記載されている通り、Ｃｅｌ−Ｉアッ
セイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）を行った。
【０１８８】
図５Ｂに示す通り、アルブミンＺＦＮおよびＦ９ドナー送達後に、頑強な循環ｈＦＩＸレベルが得られた。ヒトＦ．ＩＸ特異的ＺＦＮは、内在性マウスＦ．ＩＸ遺伝子座を認識しないため、このヌクレアーゼ対を使用したＦ９ドナーの認識できる組込みがない。さらに、図６に示す通り、ゲノム編集は、３桁にわたってＡＡＶ用量に比例する。
【０１８９】
加えて、血友病マウス（ＨＢマウス）に、上記の通りドナーおよびアルブミン−ＺＦＮを投与し（１×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−ｍＡｌｂ−ＺＦＮおよび５×１０１１ｖｇ／マウスのＡＡＶ８−Ｆ９ドナー、Liら（２０１１年）同書およびAnguelaら（２０
１３年）同書も参照）、標準の市販キット（例えば、Ｒｏｓｓｉｘ製のＲｏｘ第ＩＸ因子発色キットおよびＶｉｔａｃｌｏｔ、Ｖｉｔａｌ（登録商標）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により、ｈＦ．ＩＸの血漿レベルおよび活性化部分トロンボプラスチン時間（複数可）（ａＰＴＴ（複数可））も決定した。
【０１９０】
図７に示す通り、ＨＢマウスのアルブミン遺伝子座へのＦ９ドナー導入遺伝子のＺＦＮ媒介性組込みは、血漿における高レベルのＦ．ＩＸおよび延長された凝固時間の補正を結果としてもたらした。
【０１９１】
Ｃ．アカゲザル
より大型の動物におけるＺＦＮ駆動されたゲノム改変および導入遺伝子挿入を検査するため、２種の試験を行った。使用したＺＦＮを下の表２に示す。標的配列における大文字は、結合されるヌクレオチドを表示し、小文字は、結合されないヌクレオチドを表示する。
【表２】
2019037254.tif 000003
【０１９２】
表２に示すあらゆる設計は、その標的部位に結合した。
【０１９３】
次の通り、ＺＦＮ対３６８０６および３５３９６（対２）による例示的な試験を行った。アカゲザル（目的−繁殖）、年齢２〜４歳、体重３〜４．６ｋｇを、ｒＡＡＶ２／６および２／８中和抗体の存在、アルブミン遺伝子座の遺伝子型ならびに正常血清化学および血液学に関してプレスクリーニングした。動物を群居して（socially）収容した（同じ投薬群の最大３匹の動物を共に収容した）。速度１ｍＬ／分で約１０〜３０分間に及ぶ投薬持続時間の末梢静脈へのＩＶ注入によりベクター投与を行った（試験１は各１０ｍＬ、試験２は各２９ｍＬ）。ルーチン方法論を使用して、死亡／瀕死、ルーチン臨床観察、ケージサイド観察および摂食量（毎日）、体重（試験前および毎週）、肝臓酵素レベル（ＡＬＴおよびＡＳＴ）を含む臨床病理学、臨床化学および血液学ならびに凝血に関して試験を通じてサルを評価した。肝臓生検を行い、病理組織学およびｒＡＡＶベクターの薬物動態に関して組織を検査すると共に、ｍｉＳＥＱ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により遺伝子改変およびウエスタン解析によりＺＦＮ発現を評価した。試験を通して抗薬物抗体解析を行い、ＥｌｉＳｐｏｔ解析（上記を参照）のために全血からＰＢＭＣを単離した。試験の終わりに、組織評価における肉眼的および顕微鏡的病理学検査を行った。
【０１９４】
試験番号１：米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号に記載されている通り、アカゲザルに、ＡＡＶ２／８ベクターにおけるアルブミン標的化ＺＦＮを投与した。本試験において、標準技法（ＤＮＡ２．０）に従って哺乳動物発現のために配列が最適化された、野生型Ｆｏｋ１開裂ドメインのバリアントも使用した。投薬群および動物ＩＤを下の表３に示す。
【表３】
2019037254.tif 000004
【０１９５】
６５日目の動物から単離された脾臓および腸間膜リンパ節組織において、酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ、Markusicら（２０１３年）EMBO  Mol  Med  ５巻：１６９８〜１７０９頁を参照）を行ったところ、図８に示す通り、動物においてＡＡＶ８カプシドまたはＺＦＮ導入遺伝子に対し誘発された免疫応答は存在しない。動物７００１および７００２（図８、パネルＡおよびＣ）並びに動物８００１および８００２（図８、パネルＢおよびＣ）は全て、抗体応答が陰性であった。
【０１９６】
試験番号２：別々の試験において、アカゲザルのアルブミン遺伝子座へのＦ９導入遺伝子のＺＦＮ媒介性挿入に関して、各２匹の動物の３群を評価した。図１１を参照されたい。
【０１９７】
上記の通り、ＡＡＶ２／８ベクターまたはＡＡＶ２／６ベクターのいずれかに、表示の通りに野生型ＦｏｋＩヌクレアーゼ開裂ドメイン（「Ｆｏｋ１  ＷＴ」と標識）または操作されたドメイン（「Ｆｏｋ１  ｅＨｉＦｉ」と標識、米国特許第８，６２３，６１８号を参照）のいずれかを含む対２を使用して、例示的な結果を得た。ＡＡＶを含有するドナーを受けた動物に、ＡＡＶ２／８ベクターにおけるＦ９ドナー（アルブミン相同性アームを有する）を与えた。下の表４を参照されたい。表中、「高」および「低」用量は、与えたＡＡＶの総量を指す。
【表４】
2019037254.tif 000005
【０１９８】
ＺＦＮのみ（ドナーなし）を受ける動物は、投与後１４日目に頑強な開裂（０．４〜４．１％）を示した。
【０１９９】
試料においてウエスタン解析を行って、ＺＦＮ発現を評価した。加えて、ＺＦＮおよびドナーベクターの両方を受けた動物における血漿中のＦ．ＩＸタンパク質の発現を検出した。ＺＦＮおよびドナーの両方の存在下で、血漿中のｈＦＩＸレベルは検出可能であり、経時的に増加した。
【０２００】
総合すると、これらのデータは、アルブミン遺伝子座への第８因子または第９因子ドナーの標的化挿入が、血友病Ａマウスにおける正常ＦＶＩＩＩの最大５０％を含む、活性レベルを増加させることを示す。さらに、ドナーおよびＺＦＮ構築物の両方の最適化（例えば、コドン最適化、グリコシル化部位の包含および／または別々のベクター上のＺＦＮの投与）により、導入遺伝子活性を維持しつつＡＡＶ用量を低下させることができる。実際に、ｈＦ．ＩＸドナーとアルブミン特異的ＺＦＮのそれぞれをコードするＡＡＶの単一静脈内共注射は、検出可能なＤＮＡ開裂およびアカゲザルの血漿におけるｈＦ．ＩＸ発現をもたらした。
【０２０１】
（実施例３）
ヒトアルブミン特異的ヌクレアーゼの設計、構築および全般的特徴付け
アルブミンに標的化されたヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）は、米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号ならびに米国特許出願第１４／２７８，９０３号に記載されている。これらの実験のため、ＺＦＰを含むＺＦＮ（操作された開裂ドメインに作動可能に連結した）を使用して、ヒト細胞における内在性アルブミン遺伝子座を開裂した。ヒトアルブミン特異的対を下の表５に示す。表５におけるあらゆるヌクレアーゼは、その標的に結合した。
【表５−１】
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【表５−２】
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【０２０２】
これらの実験において、ＺＦＮを、ｍＲＮＡの形態で細胞にトランスフェクトし、標準方法によってＢＴＸヌクレオフェクションにより導入した。ＺＦＮ  ｍＲＮＡの濃度は、実験によって変動した。本技術分野で公知の方法に従って為されるＭｉＳｅｑ解析（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によりＮＨＥＪ活性を測定した。
【０２０３】
ヒト初代肝細胞における検査のために、対の各ＺＦＮをコードするＲＮＡ５０ｎｇを使用した。結果を下に示し（表６）、ＺＦＮ対が全て活性を有したことを実証する。ヒトＨｅｐＧ２における検査のため、対の各ＺＦＮをコードするＲＮＡ１００ｎｇを使用した。結果を下に示し（表７）、ＺＦＮ対が全て活性を有したことを実証する。ヒトＫ５６２細胞はまた、二つ組で７５ｎｇを使用して検査し（表８）、対が活性であることを実証した。
【表６】
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【表７】
2019037254.tif 000009
【表８】
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【０２０４】
（実施例５）
ヒトアルブミン特異的ＺＦＮを使用したＬＳＤドナーの組込み
これらの実験のため、ＡＡＶ２／８粒子によりＩＤＳ  ｃＤＮＡドナーまたはＩＤＵＡ
ｃＤＮＡドナーを送達し、このｃＤＮＡ導入遺伝子は、カット部位を挟むアルブミン領域の相同性アームを含んだ。これらのドナー構築物において、治療用遺伝子は、アルブミン遺伝子に相同な配列に挟まれていた。導入遺伝子の５’、ドナー構築物は全て、マウスアルブミンイントロン１に相同な配列を含有する一方、遺伝子の３’、構築物は、マウスアルブミンイントロン１−エクソン２境界に相同な配列を含有する（米国特許出願公開第２０１４−００１７２１２号に記載）。
【０２０５】
ＩＤＳ  ｃＤＮＡ導入遺伝子またはＩＤＵＡ  ｃＤＮＡ導入遺伝子を組み込み、その発現をアッセイするために、ｍＲＮＡの形態のアルブミン特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼを、ヒトＨｅｐＧ２／Ｃ３ａ細胞にトランスフェクトした。簡潔に説明すると、標準方法によるウイルス送達により、１００，０００個の細胞に、ｚｆｎ：ｚｆｎ：ドナーが１００：１００：２００（「低」または「Ｌ」）または３００：３００：６００（「高」または「Ｈ」）のＭＯＩ×１０００をトランスフェクトした。細胞上清における導入遺伝子にコードされるタンパク質の酵素活性のアッセイによるか、または６日後の細胞ペレットにおけるウエスタンブロットを実施することによるかのいずれかにより、発現を解析した。図１３に示すデータは、細胞におけるドナーＩＤＳおよびＩＤＵＡの発現を実証する。
【０２０６】
本明細書にて言及されている全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０７】
開示は、理解を明確にする目的で、説明および実施例によっていくらか詳細に提供されているが、本開示の精神または範囲を逸脱することなく様々な変形および改変が実践され得ることは、当業者にとって明らかである。したがって、前出の記載および実施例は、限定として解釈されるべきものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019037254.tif 000019
【図９】
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【図１０Ａ−Ｂ】
2019037254.tif 000021
【図１０Ｃ−Ｄ】
2019037254.tif 000022
【図１１】
2019037254.tif 000023
【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
2019037254.tif 000025
【図１３Ｃ−Ｄ】
2019037254.tif 000026
【配列表】
2019037254000001.app
【外国語明細書】
2019037254000001.pdf