(57)【要約】【課題】本発明は、試料中の１つ以上の検体の検出および／または試料の分類のための方法およびシステムに関する。【解決手段】具体的には、本発明は、検体をリアルタイムで検出するために使用することができ、マイクロ流体デバイスを通じて、それぞれが１つ以上の検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含む１つ以上の種類のセンサ分子を流動させることに依存する、方法およびシステムに関し、ここで、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとの距離および相対配向は、検体の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の＋５０％以内である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の検体を検出する方法であって、
ｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスを通じて、
ａ）試料、
ｂ）前記検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含むセンサ分子であって、前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインとの距離および相対配向は、検体の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、センサ分子、
ｃ）前記化学発光ドナーの基質、を流動させることと、
ｉｉ）前記センサ分子、試料、および基質を、前記デバイスにおいて混合することと、
ｉｉｉ）電気光学感知デバイスを使用して、前記化学発光ドナーによる前記基質の修飾を検出することと、を含み、
前記アクセプタードメインに対する前記化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、前記検体が前記センサ分子に結合すると変化する、方法。
【請求項２】
前記センサ分子は、前記デバイスに固定されない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、前記検体をリアルタイムで検出するために使用することができる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じて前記デバイスに進入する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインとのフェルスター距離は、少なくとも５．６ｎｍである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインとのフェルスター距離は、約５．６ｎｍ〜約１０ｎｍである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記センサ分子に結合するか、前記センサ分子から解放される前記検体は、ＢＲＥＴ比における変化をもたらし、これは最大観測ＢＲＥＴ比の１５％以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記電気光学感知デバイスによって検出される量子収率は、約８％未満、または約５％未満、または約２％未満である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記アクセプタードメインは、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍのストークスシフトを有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アクセプタードメインは、約１００ｎｍのストークスシフトを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
約１秒〜約１００秒の範囲内で実行される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料は、液体、気体、エマルジョン、または懸濁液である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料は、気体で事前平衡化されている液体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記懸濁液は、無細胞抽出液であるか、またはそれを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記懸濁液は、細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記マイクロ流体デバイスを通る流量は、約１μｌ／時間〜約１．５ｍｌ／時間である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロ流体デバイスを通る流量は、約２００μｌ／時間〜約１ｍｌ／時間である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記センサ分子は、Ｇ共役型タンパク質受容体等のタンパク質受容体を含み、ステップｉｉ）後の前記センサ分子の濃度は、約１ｎＭ〜約１０μΜである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロ流体デバイスを通じた流動は、連続流動、バッチ流動、またはストップ流動である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記流動は、ポンプ、減圧、水圧、吸引、動電、化学浸透、毛管力、音響、電磁気、圧電のうちの１つ以上によって行われる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記混合は、前記試料、センサ分子、および基質を含むマイクロチャネルを通る流動の方向に垂直な寸法全体にわたる拡散によって達成される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料、センサ分子、および基質を含む前記マイクロチャネルの部分は、５ｍｍ〜１００ｍｍである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
各マイクロチャネルは、約１μｍ２〜約１ｍｍ２の断面積を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ステップｉｉｉ）は、約１ｐｌ〜約２００μｌの容積を有する反応チャンバにおいて行われる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ステップｉｉｉ）は、前記電気光学感知デバイスからの少なくとも１つのシグナルを処理して、前記検体が前記試料中に不在であるか存在するかを判定し、存在する場合は、前記試料中の前記検体の濃度を任意に判定することを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記検体に結合する前記ドメインは、タンパク質または核酸である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質は、受容体、臭気物質結合タンパク質、フェロモン結合タンパク質、酵素、リガンド担体、または細菌周辺質結合タンパク質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学発光ドナードメインは、生物発光タンパク質である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、またはβ−グルコシダーゼである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ルシフェラーゼは、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、腔腸動物ルシフェラーゼ、北アメリカツチボタルルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、レイルロードワームルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、エクオリン、ヒカリキノコバエルシフェラーゼ、あるいはそれらのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくはフラグメント、またはそれらの２つ以上のキメラである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記基質は、ルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン、またはセレンテラジンの誘導体もしくは類似体である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記アクセプタードメインは、蛍光性アクセプタードメインである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記蛍光性アクセプタードメインは、タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記蛍光性アクセプタードメインは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｏｐａｚ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｔ−ｄｉｍｅｒ２、ｔ−ｄｉｍｅｒ２（１２）、ｍＲＦＰｌ、ポキロポリン、ウミシイタケＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ  ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質、もしくはフィコビリタンパク質、またはそれらのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記蛍光性アクセプタードメインは、非タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記蛍光性アクセプタードメインは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、Ｃｙ色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光性ミクロスフェア、発光性ミクロスフェア、蛍光性ナノ結晶、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、テキサスレッド、希土類元素キレート、またはこれらの任意の組み合わせもしくは誘導体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物発光タンパク質の補因子を提供することをさらに含む、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記補因子は、ＡＴＰ、マグネシウム、酸素、ＦＭＮＨ２、カルシウム、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ｉ）前記生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼまたは生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントである、および／あるいは
ｉｉ）前記基質は、ルシフェリン、セレンテラジン、またはセレンテラジンの誘導体もしくは類似体である、および／あるいは
ｉｉｉ）前記アクセプタードメインは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、またはこれらのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントである、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
ｉ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼであり、前記アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、前記基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｉ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ２であり、前記アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、前記基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｉｉ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、前記アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、前記基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｖ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ２であり、前記アクセプタードメインはＶｅｎｕｓであり、前記基質はセレンテラジンである、
ｖ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、前記アクセプタードメインはＶｅｎｕｓであり、前記基質はセレンテラジンである、
ｖｉ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８．６−５３５であり、前記アクセプタードメインはｍＯｒａｎｇｅであり、前記基質はセレンテラジンである、または
ｖｉｉ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、前記アクセプタードメインはｍＯｒａｎｇｅであり、前記基質はセレンテラジンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
同じマイクロ流体デバイスを使用して、２つ以上の異なる検体を同時または順次に検出することを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記マイクロ流体デバイスは、
ａ）それぞれが前記センサ分子、基質、および試料用である３つの入力マイクロチャネル、または
ｂ）一方が前記基質用で、他方が前記センサ分子および試料の事前混合物用である、２つの入力マイクロチャネル、または
ｃ）一方が前記センサ分子用で、他方が前記基質および試料の事前混合物用である、２つの入力マイクロチャネル、
の１つ以上のセットを備える、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つのマイクロチャネルは、少なくとも１つの他のマイクロチャネルとは異なる容積を有する反応チャンバを備える、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１つのマイクロチャネルは、同じかまたは異なる容量の２つ以上の反応チャンバを備える、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記電気光学感知デバイスは、少なくとも２つの異なる波長チャネルを有する、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記センサ分子は、無細胞抽出液で存在する、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記検体は、細胞の表面上に曝露され、前記方法は、前記検体を含む細胞を、前記検体を欠く前記試料中の細胞とは異なるマイクロチャネルを通じて転向させることをさらに含む、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
試料中の検体を検出するためのマイクロ流体システムであって、
ｉ）前記検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含むセンサ分子を含有するのに好適な少なくとも１つのレザーバーであって、前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインとの距離および相対配向は、検体の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、少なくとも１つのレザーバーと、
ｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスと、
ｉｉｉ）前記センサ分子、前記試料、および前記化学発光ドナードメインの基質を、前記デバイスにおいて混合するための手段と、
ｉｖ）前記センサ分子への前記検体の結合を検出するための反応チャンバと、
ｖ）電気光学感知デバイスと、を備え、
前記アクセプタードメインに対する前記化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、前記検体が前記センサ分子に結合するときに変化する、システム。
【請求項５０】
前記センサ分子は、前記デバイスに固定されない、請求項４９に記載のシステム。
【請求項５１】
前記検体をリアルタイムで検出するために使用することができる、請求項４９または請求項５０に記載のシステム。
【請求項５２】
前記センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じて前記デバイスに進入する、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５３】
前記マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、前記入力マイクロチャネルのうちの１つは、前記センサ分子を前記デバイスに流動させるためのものである、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５４】
前記電気光学感知デバイスは、少なくとも２つの異なる波長チャネルを備える、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５５】
前記電気光学感知デバイスは、２つの異なる波長チャネルを同時または高速で連続して検出することができる、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５６】
前記電気光学感知デバイスは、２つの異なる波長チャネルを１秒未満以内に検出することができる、請求項５５に記載のシステム。
【請求項５７】
前記マイクロ流体デバイスは、２つ以上の検体の検出を可能にするように設計される、請求項４９〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５８】
試料を分類する方法であって、
ｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスを通じて、
ａ）前記試料、
ｂ）１つ以上の検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含むセンサ分子であって、前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインとの距離および相対配向は、検体（複数可）の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、センサ分子、
ｃ）前記化学発光ドナーの基質、
を流動させることと、
ｉｉ）前記センサ分子、試料、および基質を、前記デバイスにおいて混合することと、
ｉｉｉ）電気光学感知デバイスを使用して、前記化学発光ドナーによる前記基質の修飾を検出することと、
ｉｖ）前記電気光学感知デバイスからの少なくとも１つのシグナルを処理し、電気光学応答パターンを、１つ以上の目的の試料の１つ以上の所定の特徴と相関させることと、
ｖ）前記応答パターンの前記相関性に基づいて、前記試料を分類することと、
を含み、
前記アクセプタードメインに対する前記化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、前記１つ以上の検体が前記センサ分子に結合すると変化する、方法。
【請求項５９】
それぞれが異なる検体または検体の範囲に結合する、２つ以上の異なるセンサ分子を含み、ステップｖ）が、前記検体または検体の範囲のそれぞれの存在、不在、または濃度に基づいて、前記試料を分類することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記検体のうちの１つ以上が、未知である、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記試料をリアルタイムで分類するために使用することができる、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記センサ分子は、前記デバイスに固定されない、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じて前記デバイスに進入する、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
試料を分類するためのマイクロ流体システムであって、
ｉ）１つ以上の検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含むセンサ分子を含有するのに好適な少なくとも１つのレザーバーであって、前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインとの距離および相対配向は、検体の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、少なくとも１つのレザーバーと、
ｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスと、
ｉｉｉ）前記センサ分子、前記試料、および前記化学発光ドナードメインの基質を、前記デバイスにおいて混合するための手段と、
ｉｖ）前記センサ分子への前記検体の結合を検出するための反応チャンバと、
ｖ）電気光学感知デバイスと、
を備え、
前記アクセプタードメインに対する前記化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、前記１つ以上の検体が前記センサ分子に結合すると変化する、システム。
【請求項６５】
それぞれが異なる検体または検体の範囲に結合する、２つ以上の異なるセンサ分子を備える、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６６】
前記検体のうちの１つ以上、または検体の範囲が、未知である、請求項６４または請求項６５に記載のシステム。
【請求項６７】
試料をリアルタイムで分類するために使用することができる、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６８】
前記センサ分子は、前記デバイスに固定されない、請求項６４〜６７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６９】
前記センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じて前記デバイスに進入する、請求項６４〜６８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７０】
前記マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、前記入力マイクロチャネルのうちの１つは、前記センサ分子を前記デバイスに流動させるためのものである、請求項６４〜６９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７１】
目的の分子に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
ｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスを通じて、
ａ）候補化合物、
ｂ）前記目的の分子、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインを含むセンサ分子であって、前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインとの距離および相対配向は、前記候補化合物の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、センサ分子、
ｃ）前記化学発光ドナーの基質、
を流動させることと、
ｉｉ）前記センサ分子、前記候補化合物、および基質を、前記デバイスにおいて混合することと、
ｉｉｉ）電気光学感知デバイスを使用して、前記化学発光ドナーによる前記基質の修飾を検出することと、
ｖ）前記電気光学感知デバイスからの少なくとも１つのシグナルを処理して、前記候補化合物が前記センサ分子に結合するかどうかを判定することと、
ｖｉ）前記化合物が前記センサ分子に結合する場合、それを選択することと、
を含み、
前記アクセプタードメインに対する前記化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、前記候補化合物が前記センサ分子に結合すると変化する、方法。
【請求項７２】
前記センサ分子への前記候補化合物の結合をリアルタイムで検出するために使用することができる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記センサ分子は、前記デバイスに固定されない、請求項７１または請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じて前記デバイスに進入する、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
目的の分子に結合する化合物をスクリーニングするためのマイクロ流体システムであって、
ｉ）前記目的の分子、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインを含むセンサ分子を含有するのに好適な少なくとも１つのレザーバーであって、前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインとの距離および相対配向は、候補化合物の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、少なくとも１つのレザーバーと、
ｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスと、
ｉｉｉ）前記センサ分子、前記候補化合物、および前記化学発光ドナードメインの基質を、前記デバイスにおいて混合するための手段と、
ｉｖ）前記センサ分子への前記候補化合物の結合を検出するための反応チャンバと、
ｖ）電気光学感知デバイスと、
を備え、
アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、候補化合物がセンサ分子に結合すると変化する、システム。
【請求項７６】
前記センサ分子への前記候補化合物の結合をリアルタイムで検出するために使用することができる、請求項７５に記載のシステム。
【請求項７７】
前記センサ分子は、前記デバイスに固定されない、請求項７５または請求項７６に記載のシステム。
【請求項７８】
前記センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じて前記デバイスに進入する、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７９】
前記マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、前記入力マイクロチャネルのうちの１つは、前記センサ分子を前記デバイスに流動させるためのものである、請求項７５〜７８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８０】
試料中の検体を検出する方法であって、
ｉ）前記試料を、セレンテラジンの存在下で、
ａ）前記検体に結合するドメイン、
ｂ）ウミシイタケルシフェラーゼ、および
ｃ）緑色蛍光タンパク質２
を含む、センサ分子と接触させることと、
ｉｉ）前記生物発光タンパク質と前記アクセプター分子との間の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）が修飾されたかどうかを判定することと、
を含み、
前記アクセプター分子に対する前記生物発光タンパク質の空間位置および／または双極子配向は、前記検体が前記ドメインに結合すると変化する、方法。
【請求項８１】
１つ以上の検体、ウミシイタケルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質２に結合するドメインを含む、単離されたセンサ分子。
【請求項８２】
試料中の２−ペンタノンを検出する方法であって、
ｉ）試料を、２−ペンタノンに結合する、線虫ｓｔｒ−１１２（配列番号４１）もしくはｓｔｒ−１１３（配列番号４２）であるポリペプチド、またはその変異体と接触させることと、
ｉｉ）前記ポリペプチドのうちのいずれかが２−ペンタノンに結合したかどうかを検出することと、
を含む、方法。
【請求項８３】
前記ｓｔｒ−１１３の変異体は、ｓｔｒ−１１４／ｓｔｒ−１１３融合体（配列番号４３）である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ポリペプチドは、検出可能に標識化される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
試料中の細菌を検出する方法であって、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の方法を使用して、２−ペンタノンを検出することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の１つ以上の検体の検出および／または試料の分類のための方法およびシステムに関する。具体的には、本発明は、検体をリアルタイムで検出するために使用することができ、マイクロ流体デバイスを通じて、それぞれが１つ以上の検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含む１つ以上の種類のセンサ分子を流動させることに依存する、方法およびシステムに関し、ここで、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとの距離および相対配向は、検体の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である。
【背景技術】
【０００２】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）は、オワンクラゲおよびウミシイタケ等の海洋生物に天然に存在する（Ｍｏｒｉｎ  ａｎｄ  Ｈａｓｔｉｎｇｓ，１９７１）。ＢＲＥＴは、励起状態のドナーから基底状態のアクセプターへのエネルギーの非放射移動である、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の一形態である。２つの広く使用されるＢＲＥＴの原理、すなわち、ＢＲＥＴ１およびＢＲＥＴ２がある。いずれも、エネルギードナーとしてウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）を使用する。ＢＲＥＴ１では、基質は、天然のセレンテラジン（ＣＬＺ）またはセレンテラジンｈ（ＣＬＺｈ）である。ＲＬｕｃおよび黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）は、それぞれ、エネルギーのドナーおよびアクセプターであり、４７５ｎｍでピークドナー放出および５３５ｎｍでピークアクセプター放出をもたらす。ＢＲＥＴ２では、ＹＦＰがＧＦＰ２で置き換えられ、修飾ＣＬＺ基質、すなわちセレンテラジン−４００ａまたは（ＣＬＺ４００ａ）が使用される。ピークドナー放出およびアクセプター放出は、それぞれ、３９５ｎｍおよび５１５ｎｍにシフトする（Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ａ，ｂ;Ｐｆｌｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｅｉｄｎｅ，２００６）。第３の形態のＢＲＥＴ、すなわちＢＲＥＴ３は、最近開発された。これは、ＣＬＺｈを基質として、ＲＬｕｃ８をエネルギードナーとして、ｍＯｒａｎｇｅをアクセプターとして使用し、改善されたスペクトル分解能をもたらした（Ｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００３】
ＲＥＴは、アッセイ規模、アッセイ条件、およびプレート内の異なるウェルにわたるシグナル減衰の変動に起因する、光出力における揺らぎによってもたらされるデータの変動性を排除し得る、レシオメトリック技法である。ＲＥＴに基づく反応は、均質的であり、概して、固相の結合を伴わずに溶液中で起こる。これは、分離を伴うことなく、液体、気体、および微粒子といった異なる形態の検体の検出を可能にする。固相結合の回避は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）等の多数の表面に基づく技法で用いられる表面再生プロセスを排除し、速い反応速度と併せて、オンラインでの監視に使用することを可能にする。
【０００４】
しかしながら、現在のところ、ＢＲＥＴの使用は、高度な検出機器を使用する研究所に限定されている。マイクロ流体技術は、化学、生物学、医学、感知、および材料を含む、多数の分野で注目を集めている。従来技術に勝るそれらの利点には、試薬消費の低減、高速な反応速度、短い分析時間、ならびに自動化および量産に適していることが挙げられる（Ｈｏｌｄｅｎ  ａｎｄ  Ｃｒｅｍｅｒ，２００５）。
【０００５】
マイクロ流体技術において相当な研究および開発がなされている。例としては、蛍光光収集による統合型バイオチップ設計（ＥＰ２２２１６０６号）、ラマン分光法を用いたオンチップバイオセンシング（ＷＯ２００９／０２０４７９号）、表面プラズモン共鳴技術を用いてＧＰＣＲリガンド結合を検出するためのバイオセンシングデバイス（ＷＯ２００９／０１８４６７号）、反射体として鏡を用いた光検出チップ（ＵＳ２０１１／００３７０７７号およびＵＳ２００８０８５５５２号）、カートリッジ形式のアッセイデバイス（ＷＯ２００９／０４４０８８号）、化学発光に基づくマイクロ流体バイオチップ（ＵＳ２００２／０１２３０５９号）等が挙げられる。これらのデバイスの多くは、複数の構成要素の組み込みに起因してチップ当たりの費用が高いこと、表面再生が必要であり試薬反応が遅いためにリアルタイムでの監視を実行できないこと、検出感度が制限されること、またはシグナルドリフトという不都合を有する。
【０００６】
さらに、電子嗅覚および電子味覚の分野には相当な背景技術があり、これは、検体の検出および／または試料の分類のために、気体状または液体の試料を多数の固体センサと接触させる。電子嗅覚および味覚は、センサの選択性の制限、感度の悪さ、センサの飽和および遅い再生、ならびに経時的なセンサドリフトに起因する性能の悪さに悩まされている。
【０００７】
したがって、検体を検出し、含有する検体に基づいて試料を分類する方法、具体的には、リアルタイムで向上した感度で実行することができ、感知表面を再生する必要性のために休止時間に悩まされることがなく、センサドリフトの複雑な作用に耐える、方法に対する必要性が存在する。検出システムに電気光学的に接続された多数の生物学的に誘導されたセンサを展開する多重チャネルのマイクロ流体システムは、これらの問題に対する新規な解決策を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＥＰ２２２１６０６号
【特許文献２】ＷＯ２００９／０２０４７９号
【特許文献３】ＷＯ２００９／０１８４６７号
【特許文献４】ＵＳ２０１１／００３７０７７号
【特許文献５】ＵＳ２００８０８５５５２号
【特許文献６】ＷＯ２００９／０４４０８８号
【特許文献７】ＵＳ２００２／０１２３０５９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｎ  ａｎｄ  Ｈａｓｔｉｎｇｓ，１９７１
【非特許文献２】Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ａ
【非特許文献３】Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ｂ
【非特許文献４】Ｐｆｌｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｅｉｄｎｅ，２００６
【非特許文献５】Ｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９
【非特許文献６】Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５
【非特許文献７】Ｈｏｌｄｅｎ  ａｎｄ  Ｃｒｅｍｅｒ，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、試料中の検体を検出する改善された方法を特定した。
【００１１】
一態様において、本発明は、試料中の検体を検出する方法を提供し、この方法は、
ｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスを通じて、
ａ）試料、
ｂ）検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含むセンサ分子であって、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとの距離および相対配向は、検体の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、センサ分子、
ｃ）化学発光ドナーの基質、を流動させることと、
ｉｉ）センサ分子、試料、および基質を、デバイスにおいて混合することと、
ｉｉｉ）電気光学感知デバイスを使用して、化学発光ドナーによる基質の修飾を検出することと、を含み、
アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、検体がセンサ分子に結合すると変化する。
【００１２】
好ましい実施形態において、センサ分子は、デバイスに固定されない。
【００１３】
さらなる好ましい実施形態において、本方法は、検体をリアルタイムで検出するために使用することができる。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じてデバイスに進入する。代替的な実施形態において、センサ分子および基質は、同じマイクロチャネルを通じてデバイスに進入するが、しかしながら、この実施形態では、センサ分子および基質を、マイクロチャネルに進入する前に、直前（例えば、１０秒、より好ましくは１秒、またはそれ未満）に混合することが好ましい。
【００１５】
好ましい実施形態において、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとのフェルスター距離は、少なくとも５．６ｎｍ、または少なくとも６ｎｍである。別の好ましい実施形態において、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとのフェルスター距離は、約５．６ｎｍ〜約１０ｎｍ、または約６ｎｍ〜約１０ｎｍである。
【００１６】
さらなる好ましい実施形態において、センサ分子に結合するかまたはそこから解放される検体は、ＢＲＥＴ比の変化をもたらし、これは、最大観測ＢＲＥＴ比の１５％以上、２０％以上、３０％以上、３５％以上、約１５％〜約５０％、または約１５％〜約４０％である。１５％以上のＢＲＥＴ比の変化は、検体検出のシグナル対ノイズ比を増加させる。これは、任意の所与のサンプリング時間でより優れた検出限界をもたらし、検体の濃度レベルのより正確な符号化をもたらす。あるいは、固定の検出限界では、ＢＲＥＴ比におけるより大きな変化は、シグナル統合時間の短縮、およびしたがってより高速な検出を促進する。
【００１７】
さらなる好ましい実施形態において、電気光学感知デバイスによって検出される量子収率は、約８％未満、または約５％未満、または約２％未満である。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、アクセプタードメインは、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍのストークスシフトを有する。ある実施形態において、アクセプタードメインは、約１００ｎｍのストークスシフトを有する。
【００１９】
本発明の方法の利点は、時間分解能が高いことである。したがって、好ましい実施形態において、本方法は、約１秒〜約１００秒の範囲内で実行される。
【００２０】
試料は、マイクロ流体デバイスを通じて流動することができる任意の形態であり得る。例としては、液体、気体、エマルジョン、または懸濁液が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。ある実施形態において、試料は、気体で事前平衡化されている液体である。
【００２１】
一実施形態において、懸濁液は、無細胞組成物であるか、またはそれを含む。代替的な実施形態において、懸濁液は、細胞を含む。
【００２２】
ある実施形態において、マイクロ流体デバイスを通る流量は、約１μｌ／時間〜約１０ｍｌ／時間、または１μｌ／時間〜約１ｍｌ／時間、または１μｌ／時間〜約１．５ｍｌ／時間、または約２０μｌ／時間〜約０．５ｍｌ／時間であり、好ましい流量は、約２００μｌ／時間〜約１ｍｌ／時間である。
【００２３】
好ましい実施形態において、試料、センサ分子、および基質を含むマイクロチャネルの部分の流量および長さは、試料、センサ分子、および基質が、少なくとも約５秒、少なくとも約１０秒、少なくとも約１５秒、少なくとも約２０秒、約５秒〜約５０秒、または約１０秒〜約３０秒間、その部分内に存在するようなものである。
【００２４】
一実施形態において、例えば、センサ分子がＧ共役型タンパク質受容体等のタンパク質受容体を含む場合、ステップｉｉ）後のセンサ分子の濃度は、約１ｎＭ〜約１０μΜまたは約１ｎＭ〜約１μΜである。別の実施形態において、例えば、センサ分子が切断可能なペプチド由来または周辺質結合タンパク質を含む場合、ステップｉｉ）後のセンサ分子の濃度は、約０．１μΜ〜約１０μΜである。
【００２５】
ある実施形態において、マイクロ流体デバイスを通じた流動は、連続流動、バッチ流動、またはストップ流動である。
【００２６】
試料、センサ分子、および基質は、機械的、動電的、音響的、または他の好適な手段を用いて、能動的に混合され得る。好ましい実施形態において、混合は、試料、センサ分子、および基質を含むマイクロチャネルを通る流動の方向に垂直な寸法全体にわたる拡散によって達成される。例えば、試料、センサ分子、および基質の効率的な混合（≧２０％）は、便宜的に、主に受動的拡散（非乱流）プロセスによって達成され得る。典型的な条件には、１時間当たりおおよそ１，０００マイクロリットルを上回らない流量、おおよそ１０ｍｍ以上の共通マイクロチャネル長、および積み重ねた入力の合計高さが、共通チャネルにおいて互いに接触して流動する際におおよそ２００マイクロメートル以下（流動方向に対して垂直方向に測定される）であることが挙げられる。
【００２７】
試料、センサ分子、および基質は、必ずしも限定されないが、ポンプ、減圧、水圧、吸引、動電、化学浸透、毛管力、音響、電磁気、圧電のうちの１つ以上といった任意の好適な手段によって、マイクロ流体デバイスを通じて流動され得る。ポンプ機序は、コンパクトな小型化されたミクロン寸法のポンプで実現され得る。好ましい実施形態において、試料、センサ分子、および基質は、吸引（陰圧）によって、例えば、シリンジポンプを吸い込みモードで使用して、マイクロ流体デバイスを通じて流動される。
【００２８】
ある実施形態において、各マイクロチャネルは、約１μｍ２〜約１ｍｍ２の断面積を有する。
【００２９】
さらなる実施形態において、試料、センサ分子、および基質のためのマイクロチャネルは、それぞれが、幅３００μｍ以上で高さ６０μｍ以上、幅６００μｍ以上で高さ３０μｍ以上、または幅１２００μｍ以上で高さ１５μｍ以上である。ある実施形態において、高さは、約１ｍｍまたは約０．５ｍｍを上回らない。別の実施形態において、高さは、約１５μｍ〜約１ｍｍまたは約１５μｍ〜約０．５ｍｍである。さらなる実施形態において、幅は、約１．５ｍｍを上回らない。なおもさらなる実施形態において、幅は約３００μｍ〜約１．５ｍｍまたは約３００μｍ〜約１．２ｍｍである。
【００３０】
基質、センサ分子、および試料のための入力マイクロチャネルの長さは、可能な限り短く、好ましくは１０ｍｍ未満、より好ましくは５ｍｍ未満である。
【００３１】
基質、センサ分子、および試料を混合および反応させることができる共通マイクロチャネルの長さは、５ｍｍ〜１００ｍｍ、または１０ｍｍ〜１００ｍｍ、好ましくは２０ｍｍ〜５０ｍｍであり得、線形、蛇形、または直線曲線形状の任意の好適な組み合わせであり得る。代替的な実施形態において、共通マイクロチャネルは、全面的に分注され得、センサ分子、基質、および試料は、能動的混合ありまたはなしで、反応チャンバに直接導入され得る。
【００３２】
さらなる実施形態において、ステップｉｉｉ）は、約１ｐｌ（すなわち、ピコリットルまたは１兆分の１リットル）〜約２００μｌの容積を有する反応チャンバで行われ、好ましい容積は０．５μｌ〜約８μｌ、または０．５μｌ〜約２μｌである。
【００３３】
さらなる別の実施形態において、ステップｉｉｉ）は、電気光学感知デバイスからの少なくとも１つのシグナルを処理して、検体が試料中に不在であるか存在するかを判定し、存在する場合は、試料中の検体の濃度を任意に判定することを含む。
【００３４】
ある実施形態において、検体に結合するドメインはタンパク質（ペプチドであり得る）または核酸である。好ましい実施形態において、このドメインはタンパク質である。ある実施形態において、タンパク質は、１つ以上の検体（リガンド）に結合する、天然のタンパク質であるか、または検体（リガンド）結合活性を保持するタンパク質の変異体である。例としては、受容体、臭気物質結合タンパク質、フェロモン結合タンパク質、酵素、リガンド担体、または細菌周辺質結合タンパク質が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。ある実施形態において、受容体は、嗅覚受容体または味覚受容体等のＧタンパク質共役型受容体である。さらなる実施形態において、嗅覚受容体または味覚受容体は、線形動物もしくは脊椎動物に由来するか、またはそれらの突然変異体である。
【００３５】
ある実施形態において、化学発光ドナードメインは、生物発光タンパク質である。例としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、またはβ−グルコシダーゼが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。ルシフェラーゼの例には、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、腔腸動物ルシフェラーゼ、北アメリカツチボタルルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、レイルロードワームルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、エクオリン、ヒカリキノコバエルシフェラーゼ、あるいはそれらのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくはフラグメント、またはそれらの２つ以上のキメラが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい実施形態において、ウミシイタケルシフェラーゼ変異体は、ＲＬｕｃ２またはＲＬｕｃ８である。
【００３６】
ある実施形態において、基質は、ルシフェリン（甲虫ルシフェリン等）、カルシウム、セレンテラジン、またはセレンテラジンの誘導体もしくは類似体である。
【００３７】
好ましい実施形態において、アクセプタードメインは、蛍光性アクセプタードメインである。
【００３８】
さらなる実施形態において、蛍光性アクセプタードメインは、タンパク質である。例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｏｐａｚ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｔ−ｄｉｍｅｒ２、ｔ−ｄｉｍｅｒ２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポキロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）、ウミシイタケＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ  ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質、もしくはフィコビリタンパク質、またはこれらのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００３９】
代替的な実施形態において、蛍光性アクセプタードメインは、非タンパク質である。例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、Ｃｙ色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光性ミクロスフェア、発光性ミクロスフェア、蛍光性ナノ結晶、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、テキサスレッド、希土類元素キレート、またはこれらの任意の組み合わせもしくは誘導体が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００４０】
ある実施形態において、本方法は、生物発光タンパク質の補因子を提供することをさらに含む。補因子の例には、ＡＴＰ、マグネシウム、酸素、ＦＭＮＨ２、カルシウム、またはこれらのいずれか２つ以上の組み合わせが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００４１】
好ましい実施形態において、
ｉ）生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼまたは生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントである、および／あるいは
ｉｉ）基質は、ルシフェリン、セレンテラジン、またはセレンテラジンの誘導体もしくは類似体である、および／あるいは
ｉｉｉ）アクセプタードメインは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、またはこれらのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントである。
【００４２】
さらなる好ましい実施形態において、
ｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼであり、アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ２であり、アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｉｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｖ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ２であり、アクセプタードメインはＶｅｎｕｓであり、基質はセレンテラジンである、
ｖ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、アクセプタードメインはＶｅｎｕｓであり、基質はセレンテラジンである、
ｖｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８．６−５３５であり、アクセプタードメインはｍＯｒａｎｇｅであり、基質はセレンテラジンである、または
ｖｉｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、アクセプタードメインはｍＯｒａｎｇｅであり、基質はセレンテラジンである。
【００４３】
より好ましくは、
ｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼであり、アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ２であり、アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｉｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、基質はセレンテラジン４００ａである、
iv）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８．６−５３５であり、アクセプタードメインはｍＯｒａｎｇｅであり、基質はセレンテラジンである、または
ｖ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、アクセプタードメインはｍＯｒａｎｇｅであり、基質はセレンテラジンである。
【００４４】
さらにより好ましくは、
ｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼであり、アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ２であり、アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、基質はセレンテラジン４００ａである、または
ｉｉｉ）ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、基質はセレンテラジン４００ａである、
【００４５】
ある実施形態において、本方法は、同じマイクロ流体デバイスを使用して、例えば、図１４ｂおよび１４ｃに示されるデバイスを使用して、２つ以上の異なる検体を同時または順次に検出することを含む。
【００４６】
ある実施形態において、マイクロ流体デバイスは、
ａ）それぞれがセンサ分子、基質、および試料用である３つの入力マイクロチャネル、または
ｂ）一方が基質用で、他方がセンサ分子および試料の事前混合物用である、２つの入力マイクロチャネル、または
ｃ）一方がセンサ分子用で、他方が基質および試料の事前混合用である、２つの入力マイクロチャネル、の１つ以上のセットを備える。
【００４７】
さらなる実施形態において、少なくとも１つのマイクロチャネルは、少なくとも１つの他のマイクロチャネルとは異なる容積を有する反応チャンバを備える。
【００４８】
別の実施形態において、少なくとも１つのマイクロチャネルは、同じかまたは異なる容積の２つ以上の反応チャンバを備える。
【００４９】
好ましい実施形態において、電気光学感知デバイスは、重複または非重複波長を検出し得る少なくとも２つの異なる波長チャネルを備える。代替的な実施形態において、電気光学感知デバイスは、単一の波長チャネルを備え、この実施形態では、ドナーがアクセプターからの放出を消光する。
【００５０】
ある実施形態において、電気光学感知デバイスは、ファイバ束または液体ライトガイドを備える。ある実施形態において、ファイバ束または液体ライトガイドの直径は、約１ｍｍ〜約１０ｍｍ、または約１ｍｍ〜約６ｍｍである。ある実施形態において、電気光学感知デバイスは、シャッターボックスをさらに備える。
【００５１】
ある実施形態において、電気光学感知デバイスは、二分岐型ライトガイドを備え、ダイクロイックブロックを有さない。
【００５２】
好ましい実施形態において、センサ分子は、無細胞抽出液で存在する。
【００５３】
代替的な実施形態において、センサ分子は、細胞によって発現され（例えば、細胞の表面上に存在するか、または細胞によって分泌される）、細胞懸濁液として提供され、この場合細胞は無傷である。
【００５４】
本方法は、細胞を選別するために使用することができる。したがって、ある実施形態において、検体は細胞の表面上に曝露され、本方法は、検体を含む細胞を、検体を欠く試料中の細胞とは異なるマイクロチャネルを通じて転向させること、ならびに検体を含む細胞を収集することおよび／または検体を欠く細胞を収集することをさらに含み、ここで、両方の細胞型が収集される場合、それらは、別個の容器に収集される。
【００５５】
別の態様において、本発明は、試料中の検体を検出するためのマイクロ流体システムを提供し、本システムは、
ｉ）検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含むセンサ分子を含有する（または含む）のに好適な少なくとも１つのレザーバーであって、化学発光ドナードメインおよびアクセプタードメインの距離および相対配向は、検体の存在下および／不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、少なくとも１つのレザーバーと、
ｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスと、
ｉｉｉ）センサ分子、試料、および化学発光ドナードメインの基質を、デバイスにおいて混合するための手段と、
ｉｖ）センサ分子への検体の結合を検出するための反応チャンバと、
ｖ）電気光学感知デバイスと、を備え、
アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、検体がセンサ分子に結合すると変化する。
【００５６】
好ましい実施形態において、センサ分子は、マイクロ流体デバイスに固定されない。
【００５７】
さらなる好ましい実施形態において、本システムは、検体をリアルタイムで検出するために使用することができる。
【００５８】
別の好ましい実施形態において、センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じてデバイスに進入する。
【００５９】
さらなる好ましい実施形態において、マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、ここで、入力マイクロチャネルのうちの１つは、センサ分子をデバイスに流動させるためのものである。
【００６０】
当業者には理解されるように、本発明の方法に関連する好ましい実施形態のそれぞれは、本発明のシステムおよび／または本システムがどのように動作し得るかにもまた関連する。
【００６１】
ある実施形態において、電気光学感知デバイスは、少なくとも２つの異なる波長チャネルを備える。
【００６２】
特に好ましい実施形態において、電気光学感知デバイスは、２つの異なる波長チャネルを同時に、または高速で連続して、検出することができる。例えば、電気光学感知デバイスは、２つの異なる波長チャネルを１秒未満以内に検出することができる。
【００６３】
さらなる実施形態において、マイクロ流体デバイスは、２つ以上の検体の検出を可能にするように設計される。ある実施形態において、このデバイスは、それぞれが異なるセンサ分子をデバイスに流動させるための別個のマイクロチャネルを備える。
【００６４】
ある実施形態において、混合は、反応チャンバで起こる。
【００６５】
本発明は、試料を分類するためにも使用することができる。この目的では、試料中のどの検体（複数可）が、実際に１つ以上のセンサ分子に結合するかが既に判明していることは必須ではない。したがって、別の態様において、本発明は、試料を分類する方法を提供し、この方法は、
ｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスを通じて、
ａ）試料、
ｂ）１つ以上の検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含むセンサ分子であって、化学発光ドナードメインおよびアクセプタードメインの距離および相対配向は、検体（複数可）の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、センサ分子、
ｃ）化学発光ドナーの基質、を流動させることと、
ｉｉ）センサ分子、試料、および基質を、デバイスにおいて混合することと、
ｉｉｉ）電気光学感知デバイスを使用して、化学発光ドナーによる基質の修飾を検出することと、
ｉｖ）電気光学感知デバイスからの少なくとも１つのシグナルを処理し、電気光学応答パターンを、１つ以上の目的の試料の１つ以上の所定の特徴と相関させることと、
ｖ）応答パターンの相関性に基づいて試料を分類することであって、アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、１つ以上の検体がセンサ分子に結合すると変化することと、を含む。
【００６６】
好ましい実施形態において、上述の方法は、それぞれが異なる検体（検体（ａｎｌａｙｔｅ）の異なるセットであり得る）または検体の範囲に結合する２つ以上の異なるセンサ分子を含み、ステップｖ）は、検体または検体の範囲のそれぞれの存在、不在、または濃度に基づいて試料を分類することを含む。
【００６７】
ある実施形態において、検体のうちの１つ以上は、未知である。
【００６８】
さらなる実施形態において、本方法は、試料をリアルタイムで分類するために使用することができる。
【００６９】
別の実施形態において、センサ分子は、デバイスに固定されない。
【００７０】
なおもさらなる実施形態において、センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じてデバイスに進入する、
【００７１】
試料を分類するためのマイクロ流体システムもまた提供され、このシステムは、
ｉ）１つ以上の検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含むセンサ分子を含有する（または含む）のに好適な少なくとも１つのレザーバーであって、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとの距離および相対配向は、検体の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、少なくとも１つのレザーバーと、
ｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスと、
ｉｉｉ）センサ分子、試料、および化学発光ドナードメインの基質を、デバイスにおいて混合するための手段と、
ｉｖ）センサ分子への検体の結合を検出するための反応チャンバと、
ｖ）電気光学感知デバイスと、を備え、
アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、１つ以上の検体がセンサ分子に結合すると変化する。
【００７２】
ある実施形態において、本システムは、それぞれが異なる検体（検体（ａｎｌａｙｔｅ）の異なるセット、または検体の範囲であり得る）に結合する、２つ以上の異なるセンサ分子を含む。
【００７３】
ある実施形態において、本システムは、それぞれが異なる部位および／または異なる親和性レベルで同じ検体に結合する、２つ以上の異なるセンサ分子を含む。
【００７４】
別の実施形態において、検体のうちの１つ以上、または検体の範囲が、未知である。
【００７５】
さらなる実施形態において、本システムは、試料をリアルタイムで分類するために使用することができる。
【００７６】
ある実施形態において、センサ分子は、デバイスに固定されない。
【００７７】
さらなる実施形態において、センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じてデバイスに進入する。
【００７８】
別の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、ここで、入力マイクロチャネルのうちの１つは、センサ分子をデバイスに流動させるためのものである。
【００７９】
さらなる態様において、本発明は、目的の分子に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、
ｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスを通じて、
ａ）候補化合物、
ｂ）目的の分子、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインを含むセンサ分子であって、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとの距離および相対配向は、候補化合物の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、センサ分子、
ｃ）化学発光ドナーの基質、を流動させることと、
ｉｉ）センサ分子、候補化合物、および基質を、デバイスにおいて混合することと、
ｉｖ）電気光学感知デバイスを使用して、化学発光ドナーによる基質の修飾を検出することと、
ｖ）電気光学感知デバイスからの少なくとも１つのシグナルを処理して、候補化合物がセンサ分子に結合するかどうかを判定することと、
ｖｉ）化合物がセンサ分子に結合する場合、それを選択することと、を含み、
アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、候補化合物がセンサ分子に結合すると変化する。
【００８０】
好ましい実施形態において、本方法は、センサ分子への候補化合物の結合をリアルタイムで検出するために使用することができる。
【００８１】
さらなる好ましい実施形態において、センサ分子は、デバイスに固定されない。
【００８２】
別の好ましい実施形態において、センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じてデバイスに進入する。
【００８３】
好ましい実施形態において、本方法は、候補化合物が目的の分子の結合ドメインに結合し、センサ分子の他のドメインには結合しないことを確認することをさらに含む。当業者には理解されるように、これは、目的の分子をカラムで用いて候補化合物を捕捉すること、競合的結合アッセイといった、当該技術分野における種々の技術のうちのいずれかを用いて行われ、続いて候補化合物を目的の分子とともにインキュベートすることが、目的の分子の移動を変化させるかどうかについてゲルクロマトグラフィー等を使用して判定することができる。
【００８４】
候補化合物および目的の分子は、同じ種類の物質であり得、例えば、いずれも、核酸、タンパク質（ペプチドを含む）、または小分子であり得る。一実施形態において、目的の分子は、限定されないが、受容体、臭気物質結合タンパク質、フェロモン結合タンパク質、酵素、リガンド担体、または細菌周辺質結合タンパク質等のタンパク質である。目的の分子は、天然に存在するまたはその突然変異体／変異体であり得る。
【００８５】
さらなる態様において、本発明は、目的の分子に結合する化合物をスクリーニングするためのマイクロ流体システムを提供し、このシステムは、
ｉ）目的の分子、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインを含むセンサ分子を含有する（または含む）のに好適な少なくとも１つのレザーバーであって、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとの距離および相対配向は、候補化合物の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、少なくとも１つのレザーバーと、
ｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスと、
ｉｉｉ）センサ分子、候補化合物、および化学発光ドナードメインの基質を、デバイスにおいて混合するための手段と、
ｉｖ）センサ分子への候補化合物の結合を検出するための反応チャンバと、
ｖ）電気光学感知デバイスと、を備え、
アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、候補化合物がセンサ分子に結合すると変化する。
【００８６】
好ましい実施形態において、本システムは、センサ分子への候補化合物の結合をリアルタイムで検出するために使用することができる。
【００８７】
さらなる好ましい実施形態において、センサ分子は、デバイスに固定されない。
【００８８】
別の好ましい実施形態において、センサ分子および基質は、異なるマイクロチャネルを通じてデバイスに進入する。
【００８９】
さらなる実施形態において、マイクロ流体デバイスは、少なくとも２つの入力マイクロチャネルを備え、ここで、入力マイクロチャネルのうちの１つは、センサ分子をデバイスに流動させるためのものである。
【００９０】
本発明者らまた、発光が弱いというＢＲＥＴ２の特性に悩まされることのない、ハイブリッドＢＲＥＴ（ＢＲＥＴＨ）検出システムも特定した。したがって、さらなる態様において、本発明は、試料中の検体を検出する方法を提供し、この方法は、
ｉ）試料を、セレンテラジンの存在下で、
ａ）検体に結合するドメイン、
ｂ）ウミシイタケルシフェラーゼ、および
ｃ）緑色蛍光タンパク質２を含む、センサ分子と接触させることと、
ｉｉ）生物発光タンパク質とアクセプター分子との間の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）が修飾されたかどうかを判定することと、を含み、アクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間位置および／または双極子配向は、検体がドメインに結合すると変化する。
【００９１】
当然ながら、上述の方法は、マイクロ流体デバイスを使用する本発明の方法において容易に使用することができる。
【００９２】
さらなる態様において、本発明は、１つ以上の検体、ウミシイタケルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質２に結合するドメインを含む、単離されたセンサ分子を提供する。
【００９３】
本発明者らは、２−ペンタノンに結合するポリペプチドを特定しており、したがって、これらのポリペプチドを、この化合物の検出に使用することができる。
【００９４】
したがって、さらなる態様において、本発明は、試料中の２−ペンタノンを検出する方法を提供し、この方法は、
ｉ）試料を、２−ペンタノンに結合する、線虫ｓｔｒ−１１２（配列番号４１）もしくはｓｔｒ−１１３（配列番号４２）であるポリペプチド、またはその変異体と接触させることと、
ｉｉ）ポリペプチドのうちのいずれかが２−ペンタノンに結合したかどうかを検出することと、を含む。
【００９５】
当業者には理解されるように、新しいリガンド／ポリペプチド結合対を特定した後に構成することができる、非常に多くの異なるアッセイが存在する。一実施形態において、本発明の方法は、試料中の２−ペンタノンを検出するために使用される。
【００９６】
ある実施形態において、ｓｔｒ−１１３の変異体は、ｓｔｒ−１１４／ｓｔｒ−１１３融合体（配列番号４３）である。
【００９７】
ある実施形態において、ポリペプチドは、検出可能に標識化される。このような検出可能に標識化されたポリペプチドの例には、配列番号１３、１４、１８、２７、２８、および３０として提供されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
２−ペンタノンは、細菌によって生成され、したがって、上述の方法は、例えば、細菌感染または汚染を検出するために使用することができる。
【００９９】
このように、さらなる実施形態において、本発明は、本発明の方法を使用して２−ペンタノンを検出することを含む、試料中の細菌を検出する方法を提供する。
【０１００】
ある実施形態において、細菌は、大腸菌等のエシェリキア属である。
【０１０１】
本明細書のいずれの実施形態も、別途具体的に示されない限り、必要な変更を加えて、任意の他の実施形態に適用されるものとする。
【０１０２】
本発明は、例示のみを目的とする本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が制限されるものではない。機能的に同等な生成物、組成物、および方法は、本明細書に記載されるように、当然ながら本発明の範囲内に含まれる。
【０１０３】
本明細書全体を通じて、別途具体的に示されるか、内容により別途必要とされない限り、単一のステップ、問題の組成物、ステップの群、または問題の組成物の群は、１つおよび複数の（すなわち、１つ以上の）これらのステップ、問題の組成物、ステップの群、または問題の組成物の群を包含するものとする。
【０１０４】
本発明を、以下の比限定的な実施例および添付の図面への参照により、以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】マイクロ流体チップ（マイクロチップ）およびＢＲＥＴ検出システムを示す、特許請求される方法を実行するための一般的な配設。ＤＭ＝ダイクロイックミラー、ＢＰ＝バンドパスフィルタ（波長中心ｎｍ、幅ｎｍ）。
【図２】（Ａ）２単位のトロンビンの添加ありおよびなしで５μΜの天然セレンテラジンをＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃ融合タンパク質に添加した際のハイブリッドＢＲＥＴシステムのスペクトル変化、ならびに（Ｂ）精製されたＨｉｓタグ化ＢＲＥＴタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって監視した、ＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃ融合タンパク質センサ分子のトロンビン切断。１レーン当たり２．５μｇのタンパク質を充填した。左から右へ；３０℃で９０分間５４ｎＭのトロンビンとともにインキュベートした後の分子マーカー（ＫＤａ）、ＲＬｕｃ、ＧＦＰ２、ＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃ、ＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃ；ＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃは、トロンビンを室温で１０分間２単位のヒルジンとともに事前インキュベートしたことを除き、前のレーンと同じ条件。
【図３】５μΜの天然のセレンテラジンの添加した際、１μΜの融合タンパク質のトロンビン切断（平均±標準偏差、ｎ＝３）後の正規化したＢＲＥＴＨ比における変化；５４ｎＭのトロンビンまたは２単位のヒルジンでの事前処理（１０分間、室温）後の５４ｎＭのトロンビンによる処理（９０分間、３０℃）で処理した後のＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃ。対照は、１μΜのＲＬｕｃおよびＧＦＰ２タンパク質からなり、ｐ≦０．００１は、高い有意差を示し、ｐ＝０．３３は、変化が有意でないことを示す。
【図４】オンチップ検出の実験的構成。（ａ）ハイブリッドＢＲＥＴ反応の略図、ならびに（ｂおよびｃ）ＢＲＥＴシグナル検出のためのマイクロ流体チップシステム（Ｃｌｚ＝天然のセレンテラジン、ＤＭ＝ダイクロイックミラー、ＢＰ＝バンドパス、ＰＭＴ＝光電子倍増管）。
【図５】セレンテラジン基質を添加したときのＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃトロンビンセンサタンパク質の生物発光強度（ＡＵ）、および図４ｂに標識付けしたＹ分岐点からの距離ｘの関数としてのＢＲＥＴＨ比。記号＋および▽は、それぞれ、ＲＬｕｃおよびＧＦＰ２チャネルの生物発光バックグラウンドを表す。Ｏおよび×は、それぞれ、ＲＬｕｃおよびＧＦＰ２チャネルの生物発光強度を表す。◆は、ＢＲＥＴ比を表す。融合タンパク質の濃度は、３．０μΜであった。天然のセレンテラジン濃度は、５８．６μΜであった；各水溶液の流量は、２０μｌ／時間であった；２０倍の対物レンズを使用した；ＧＦＰ２およびＲＬｕｃチャネルのフィルタのバンドパスは、それぞれ、５１５ｎｍ〜５５５ｎｍおよび４３０ｎｍ〜４５５ｎｍである；２００ミリ秒の内部ゲート時間をデータ取得に使用した。
【図６】水溶液流の合計流量（ａ）およびトロンビンセンサ濃度（ｂ）の関数としてのＢＲＥＴＨ比である。（ａ）トロンビンセンサタンパク質の濃度は、３．０μΜであり、天然のセレンテラジンの濃度は５８．６μΜであった；（ｂ）天然のセレンテラジンの濃度は５８．６μΜであった；各水溶液の流量は、２０μｌ／時間であった；２０倍の対物レンズを使用した；ＧＦＰ２およびＲＬｕｃチャネルのフィルタのバンドパスは、それぞれ、５１５ｎｍ〜５５５ｎｍおよび４３０ｎｍ〜４５５ｎｍである；２００ミリ秒の内部ゲート時間をデータ取得に使用した。
【図７】マイクロ流体およびマイクロプレート形式でのＢＲＥＴＨトロンビンセンサの較正曲線（平均±標準偏差、ｎ＝５）。すべてのマイクロ流体測定は、ｘ＝２．１ｍｍで取得した。Ｏおよび□は、それぞれ、マイクロチップおよびマイクロプレートの測定に関するデータを表す。中央のグラフは、低いトロンビン濃度でのデータを示し、一方で差し込み図は、対応する全範囲測定を示す。線は、線形回帰であり、これらは、マイクロチップデータではｙ＝０．８３５ｘ＋１．０１９（Ｒ２＝０．９９６）であり、マイクロプレートデータではｙ＝０．１７９７ｘ＋１．００１（Ｒ２＝０．９９５）である。マイクロチップ法については、融合タンパク質濃度は３．０μΜであり、天然のセレンテラジン濃度は５８．６μΜであり、各水溶液流量は２０μｌ／時間であった。マイクロプレート法では、融合タンパク質および天然のセレンテラジン濃度は、それぞれ、１μΜおよび５μΜであった。
【図８】受動的混合設計の例（ａ）線形接触領域を有するＹ型、（ｂ）狭い蛇形、（ｃ）広い蛇形、（ｄ）螺旋、（ｅ）寸法変動およびバッフルを有するＹ型チャネル、および（ｆ）狭い蛇形接触領域を有する３つの注入口。
【図９】本発明のチップおよびオンチップ光学検出システムの特定の例の略図。ＰＭＴ−光電子倍増管。ＰＤＭＳ−ポリジメチルシロキサンチップマトリックス。
【図１０】試料データは、ＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃトロンビンセンサのＢＲＥＴ２比の変化によるトロンビンの検出を示す。ａ．トロンビンが存在しない状態でのＧＦＰ（緑色−上）およびウミシイタケルシフェラーゼ（青色−下）のチャネル放出強度。ｂ．２７０ｐＭのトロンビンとともにセンサをインキュベートした後のＧＦＰ（緑色−下）およびウミシイタケルシフェラーゼ（青色−上）チャネルの放出強度。ｃ．トロンビンなしおよび２７０ｐＭのトロンビンの条件でのＢＲＥＴ２比。
【図１１】図９のマイクロ流体デバイスでＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃトロンビンセンサを使用した、ＢＲＥＴ２測定によるトロンビン検出の感度（青色線）と、市販入手可能なプレートリーダー機器の結果（赤色線）との直接比較。
【図１２】トロンビンバイオセンサ（１μΜ）と、トロンビン（５４０ｎＭ）およびセレンテラジン４００ａ基質（１２．５μΜ）を含有する調製物とを混合したときの、注入口が２つのマイクロ流体デバイスを用いて測定したＢＲＥＴ２比。
【図１３】本発明のシステムのサブシステムの例。
【図１４】単一および複数のセンサのセンサチップ設計の例。
【図１５】３つのマイクロ流体流動が接触するときの受動的または拡散に基づく試薬混合の領域の例。
【図１６】電気光学検出システムの例。
【図１７】２つのＢＲＥＴ光学検出素子の設計（ａ）両凸マイクロレンズは、反応チャンバの底部で反応チャンバ内部の多数のＢＲＥＴ点光源から蛍光を収集し、多重モードの光ファイバ（コア２００μｍ）に光を集中させるように機能し、（ｂ）平凸マイクロレンズもまた、反応チャンバの底部で機能する。しかしながら、上部に非球面マイクロミラー（フェルール上に微小機械加工されたもの）により、ＢＲＥＴ点光源の上部からの蛍光を収集し、マイクロレンズにコリメートする。（ａ）と同様に、平凸マイクロレンズは、次いで、蛍光を光ファイバのコアに集中させる。
【図１８】ＲＬｕｃ２およびＧＦＰ２に融合されたＯＤＲ−１０受容体構築物における共鳴エネルギー移動の原理。ＧＦＰ２は、ＯＤＲ−１０の３つ目の細胞内ループに挿入され、ＲＬｕｃ２はＣ末端に挿入される（ＯＧＯＲ２）。ジアセチル結合により、ＯＧＯＲ２バイオセンサの構造的変化がもたらされ、ＢＲＥＴ２構成成分間の距離の増加または双極子モーメントの配向の変化がもたらされる。Ｃｌｚ４００ａ＝セレンテラジン４００ａ基質。
【図１９】５μΜのＣｌｚ４００ａを２０ｎＭのセンサに添加したときのＯＧＯＲおよびＯＧＯＲ２センサの生物発光強度。
【図２０】１２．５μΜのＣｌｚ４００ａと１μΜのセンサとのオンチップ混合の際のＯＧＯＲおよびＯＧＯＲ２センサの生物発光強度。
【図２１】水中で１μΜのジアセチルとともに、または水のみの対照とともにインキュベートした後の、９６ウェルプレートのウェルにおけるＯＧＯＲ２からのＢＲＥＴ２シグナル（平均±標準偏差、ｎ＝３）。
【図２２】マイクロウェルプレート形式でのＯＧＯＲ２のＢＲＥＴ２シグナルのジアセチル濃度応答曲線。
【図２３】ＰＢＳ中１０ｆＭのジアセチルまたは対照としてＰＢＳのみとともにインキュベートした後、ＯＧＯＲ２シグナルのオンチップマイクロ流体アッセイで検出されたＢＲＥＴ２シグナルの変化（平均±標準偏差、ｎ＝３）。
【図２４】オンチップ（マイクロ流体）アッセイ測定によるＯＧＯＲ２用量応答。
【図２５】ある流量範囲にわたってＯＧＯＲ２をオンチップ接触させたときに、リアルタイムマイクロ流体測定を使用して検出されたＢＲＥＴ２シグナルの変化の平均。ＰＢＳ中１ｆＭのジアセチルまたはＰＢＳのみ、ならびに１２．５μΜのＣｌｚ４００ａ基質（４つの異なる流量でＢＲＥＴ２比の平均±標準偏差）。
【図２６】ＯＧＯＲ２（２９０ｎＭ）をＰＢＳ中１フェムトモルのジアセチル溶液および１２．５μΜのセレンテラジン４００ａと接触させたときに、注入口が３つのマイクロ流体デバイスを用いて異なる共通流量で測定されたＢＲＥＴ２比。
【図２７】ＢＲＥＴ２構成成分であるＧＦＰ２およびＲＬｕｃ２に融合したＭＢＰ受容体構築物におけるＢＲＥＴの原理。マルトース結合により、ＢＲＥＴ２タグ化ＭＢＰ受容体の構造的変化がもたらされ、ＢＲＥＴ２構成成分をより近接させ、ＲＬｕｃ２からＧＦＰ２へのエネルギー移動効率の増加をもたらす。Ｃｌｚ４００ａ＝セレンテラジン４００ａ基質。
【図２８】ＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２センサのＢＲＥＴ２比に対する種々の糖類０．１ｍＭの影響。ＢＲＥＴ２比（平均±標準偏差、ｎ＝３）は、１６．７μΜのセレンテラジン４００ａを１μΜのＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２またはＷ１４０Ａ突然変異体（斜線の棒）に添加した後、水（灰色の棒）または０．１ｍＭの表示される糖類とともに２８℃で３０分間インキュベートした後に、記録した。ＢＲＥＴ２比を、水での応答によって正規化した。＊＊Ｐ＜０．０１およびＰ＊＜０．０５。
【図２９】１６．６７μΜのセレンテラジン４００ａを添加した際、０．１ｍＭマルトースに対する１μΜのＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２の応答時間（分、平均±標準偏差、ｎ＝３）。任意の期間マルトースとともにインキュベートした後のＢＲＥＴ２応答を、同じ期間水とともにインキュベートした後のＢＲＥＴ２応答で正規化した。
【図３０】（Ａ）ＦＲＥＴ対ＢＲＥＴ２。１６．６７μΜのセレンテラジン４００ａを添加した際の１μΜのＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質のＢＲＥＴ２応答（平均±標準偏差、ｎ＝１１）のマルトース濃度依存性を、ＦＬＩＰｍａｌ−２μ（５３０／４８５−ｎｍ比）のＦＲＥＴ応答（平均±標準偏差、ｎ＝３）と比較したもの。後者の用量−応答曲線は、Ｆｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）によって提示されたデータからの再プロットであった。データをｌｏｇ［アゴニスト］対応答に適合させた。ＢＲＥＴ２はＥＣ５０＝０．４μΜであり、ＦＲＥＴではＥＣ５０＝３．２μΜである。（Ｂ）マイクロ流体チップとマイクロプレートアッセイを使用するものとを対比したマルトースに関するＢＲＥＴ２に基づくＭＢＰアッセイの比較。
【図３１】インライン光ファイバスイッチなし（Ａ）およびあり（Ｂ）のマイクロ流体チップシステムからデータを収集するための実験的構成。ＢＰ−バンドパス、ＰＭＴ−光電子倍増器；ＮＡ−開口数。
【図３２】光学スイッチなし（Ａ）およびあり（Ｂ）で３回の実行にわたり収集されたリアルタイムＲｌｕｃ／Ｃｌｚ４００ａ生物発光シグナル。
【図３３】光学スイッチありおよびなしでのＲｌｕｃ／Ｃｌｚ４００ａおよびＧＦＰチャネルに関する平均生物発光シグナルの比較。
【図３４】液体ライトガイドを通じて光検出器に接続された、直径を増加させたＢＲＥＴ反応チャンバ（θ＝４ｍｍ、ｈ＝２ｍｍ）の配設を示す例。
【図３５】狭い口径と広い口径のＢＲＥＴ検出チャンバ／光学システムの性能の比較。いずれの場合も、ＢＲＥＴ放出は、マイクロ流体チャネルを通じて流動するＯＧＯＲ２センサの１／１００希釈物から測定する。（ａ）狭い口径のシステム（チャンバ寸法θ＝２ｍｍ、ｈ＝２ｍｍ；ファイバコア径＝１ｍｍ、ＮＡ＝０．４８）。（ｂ）広い口径のシステム（チャンバ寸法θ＝４ｍｍ、ｈ＝２ｍｍ、ライトガイドコア径＝５ｍｍ、ＮＡ＝０．５９）。
【図３６】高度に希釈したＯＧＯＲ２センサを使用し、より広い直径のＢＲＥＴ反応チャンバ（４ｍｍ）および広い口径の液体ライトガイドに基づくより効率的な光捕捉システムを用いた、１μΜのジアセチルの検出の実証。（ａ）１００倍センサ希釈。ＢＲＥＴ２比のジアセチル依存性低減＝１３．７％、および（ｂ）５０倍のセンサ希釈、ＢＲＥＴ２比のジアセチル依存性低減＝１４．７％。エラーバーは、３回の実験（Ｎ＝３）の標準偏差を表す。
【図３７】二分岐型ライトガイドを使用し、ダイクロイックブロックを用いない単一のマイクロ流体チャネルおよびＢＲＥＴ光収集システムの例。フィルタを有する二分岐型ライトガイドの追加のセットおよび光検出器の対を、１つ以上の追加のマイクロ流体チャネルおよび／またはＢＲＥＴ反応チャンバに対応させるために、追加してもよい。
【図３８】多重チャネル測定を促進するシャッターボックスを有する光学構造
【図３９】二分岐型ライトガイドまたはダイクロイックブロックを用いて検出されたＢＲＥＴシグナルの強度の比較。ａ、ｂ：二分岐型ライトガイド、反応チャンバ寸法θ＝４ｍｍ；ｈ＝１ｍｍ、反射する蓋ありおよびなし。ｃ、ｄ：ダイクロイックブロックを有するライトガイド、反応チャンバ寸法θ＝４ｍｍ；ｈ＝２ｍｍ（すなわち、ａ、ｂの二倍の大きさ）。すべてのパネルは、ｔ＝０で流動を開始した後、時間とともにシグナルの増加を示す。パネルａおよびｃは青色チャネルであり、パネルｂおよびｄは緑色チャネルである。
【図４０】シャッターボックスからのＢＲＥＴ出力を測定するのに好適な多分岐型ライトガイドの配設。
【図４１】単一のダイクロイックブロックに合流する多分岐型ライトガイドと、２つの別個の色フィルタに分岐する二分岐型ライトガイドとの比較。相対光強度は、青色（ＲＬｕｃ；１、３）および緑色（ＧＦＰ；２、４）チャネルで収集した。１、２：図３８および４０のように、入力が異なるマイクロ流体チャネルに割り当てられ、出力が最適化されたダイクロイックフィルタを介してＰＭＴ対に向けられる、多分岐型ライトガイド。３、４：図３７のように、出力が異なるスペクトルチャネルに割り当てられる二分岐型ライトガイド。
【図４２】真空光電子倍増管技術を使用する超低レベルの光の光検出器の例。出典Ｈａｍａｍａｔｓｕ。
【図４３】固体技術を用いて実装される極度に低い光レベルの光検出器の例。寸法はｍｍ単位である。出典：Ｈａｍａｍａｔｓｕ。
【図４４】２つの異なる流量で動作する注入口が３つのマイクロ流体デバイスにおける層流および拡散的混合の直接可視化。３つの水溶液入力のうちの２つが、青色または赤色の食品着色料で着色されている。デバイスは、吸い込みモードで動作する単一のシリンジポンプを用いて操作した。流動の方向：右から左。
【図４５】垂直方向に積み重なった流れに基づく受動的混合の例示的な設計。チャネルの幅は、６００μｍ〜最大２ｍｍであり、厚さは２０〜６０μｍである。長さは、２０ｍｍ〜１００ｍｍで柔軟であり、角度は４５度である（これは、０°〜おおよそ１７０°付近まで広範に変動し得るか、または実際にはマイクロ流体チップの面に対する角度であり得る）。
【図４６】ＢＲＥＴ比測定の比較。エラーバーは標準偏差を反映する（ｎ＝３）。
【図４７】多重検出のためのマイクロ流体チップ設計の例。上部の注入口は、基質用に設計され、一方で底部の３つの注入口は、センサ１、試料、およびセンサ２を導入するために使用される。
【図４８】並列検出のためのマイクロ流体チップ設計の例。流動の方向は、下から上である。流量は、１５０μｌ／時間および１５００μｌ／時間であった。赤色の食用色素を、基質注入口から導入し、青色色素をセンサ注入口から導入した。試料注入口には食用着色料を使用しなかった。
【図４９】吸い込みモードで単一の吸引ポンプによって操作される注入口が３つのマイクロ流体デバイス。吸引モードのポンプは、デバイスの排出口で陰圧を発生させる。試料、センサ、および基質流は、共通チャネル（蛇形配設として示される）に吸い込まれ、受動的に混合される。ＢＲＥＴ反応チャンバは、排出口の直前に位置付けられる。ここで使用するポンプは、シリンジポンプであり、多様なポンピング方法もまた．利用可能である。
【図５０】吸い込みモードで機能するシリンジポンプを使用した、並列の独立した操作のための構造。４つの別個のシリンジを使用して、４つのセンサチャネルを独立して並列に操作する例。これは、種々の異なる要件を満たすために異なる流量でセンサチャネルを操作することを可能にする。
【図５１】ａ．多分岐型ライトガイドおよび最適化されたダイクロイックブロックを有する、吸引モードで動作するオンチップトロンビンセンサからのＲＬｕｃおよびＧＦＰシグナル。反応チャンバθ＝２ｍｍ、Ｈ＝１ｍｍ。ｂ．「ａ」からのＢＲＥＴ２シグナル。ｃ．同じ直径、および同等の滞留時間に基づいて変動する高さのチャンバに対する予測シグナルの実証。
【図５２】マイクロ流体形式で達成される特異的なマルトース検出。０．１ｍＭのマルトース、グルコース、およびスクロースに対するＢＲＥＴ２−ＭＢＰセンサのＢＲＥＴ２応答の比較。
【図５３】Ｎ末端にＧＦＰ２およびＣ末端にＲＬｕｃ２を有するＢＲＥＴ２トロンビンセンサを、プラスミンのκ−カゼイン標的配列：ＸＫＺＸ（式中、Ｚ＝Ｋ、Ｙ、Ｖ、またはＥ）を模倣するように修飾した。
【図５４】５μΜセレンテラジンの存在下でＧＦＰ２−ＦＬ１−ＲＬｕｃ２センサを用いて、ＰＢＳ、牛乳ｃ）およびｄ）またはオレンジジュース（ａおよびｂ）の種々の希釈物において生成されたＢＲＥＴ２シグナル強度および比。
【図５５】５μΜのセレンテラジンＡの存在下でＧＦＰ２−ＦＬ１−ＲＬｕｃ２センサを用いて、未希釈全乳において生成されたＢＲＥＴ２シグナルの経時変化。ａ．強度、ｂ．ＢＲＥＴ２比。
【図５６】トロンビン切断緩衝液または（ａ）血清（ｂ）オレンジジュースもしくは（ｃ）牛乳の種々の希釈物における、ＧＴＲ２タンパク質の生物発光強度（ＧＦＰ２チャネル−５１５ｎｍバンドパス３０ｎｍ）。
【図５７】トロンビン切断緩衝液または（ａ）血清（ｂ）オレンジジュースもしくは（ｃ）牛乳の種々の希釈物における、ＧＴＲ２タンパク質のＢＲＥＴ２比。
【図５８】ＧＴＲ２を使用した、トロンビン切断緩衝液、希釈した牛乳、オレンジジュース、または血清におけるトロンビンプロテアーゼ活性（２単位）の検出。絶対ＢＲＥＴ＾２比は試料およびその希釈物に応じて変動するため、結果を正規化されたＢＲＥＴ２比として表す。血清の１／１０希釈物におおける効果の不在は、血清の調製に使用したヘパリンによって生成された残留活性化抗トロンビンＩＩＩによる、添加したトロンビンの不活性化に起因する可能性があることに留意されたい。
【図５９】気体−液体分離実験のための標本ホルダー
【図６０】時間＝０で送風機を始動した後、酸素除去されたＳＡＳＳ２４００試料流体への酸素取り込みの経時変化。
【図６１】時間＝０で送風機を始動した後のＳＡＳＳ２４００試料流体へのフェノール取り込みの経時変化。相対フェノール濃度は任意の単位を使用して示される。
【図６２】３方向Ｌ型ポートの空気圧で動作するボール弁。これは、能動的なサンプリング中に、ＳＡＳＳ２４００空気流への揮発性ヘッドスペースの急速な（≦１秒）切り替えを可能にする。
【図６３】空気取り込みの急速な切り替えのための３方向弁でのＳＡＳＳ２４００試験のための構成を示す略図。
【図６４】Ｓｔｒ１１２（Ａ）、Ｓｔｒ１１４／１１３（Ｂ）、およびＳｔｒ１１３（Ｃ）の選択性。１μΜの臭気物質または水（灰色の棒）に対するＳｔｒ１１２（平均±標準偏差、ｎ＝３）、Ｓｔｒ１１４／１１３（平均±標準偏差、ｎ＝１４）、およびＳｔｒ１１３（平均±標準偏差、ｎ＝６）のＢＲＥＴ２応答。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、および＊Ｐ＜０．０５。
【図６５】２−ペンタノンに対するＢＲＥＴタグ化ＳＧＳＲ−１１２（Ａ）およびＳＧＳＲ−１１４／１１３（Ｂ）線形動物嗅覚受容体のＢＲＥＴ応答。
【図６６】ジアセチルおよび２−ペンタノンに対するＢＲＥＴタグ化（Ａ）Ｓｔｒ１１４／１１３線形動物嗅覚受容体、ならびに（Ｂ）１−ヘキサノールに対するＳｔｒ−１１３線形動物嗅覚受容体のＢＲＥＴ応答。
【図６７】ＧＭＲ  ＢＲＥＴ２に基づくセンサを用いた１μΜのマルトースのリアルタイムの連続的なオンチップ検出。Ａ）１００μＬ／時間の入力量で時間とともに変化するチャネルの発光性、Ｂ）１００μＬ／時間の入力で時間とともに変化するＢＲＥＴ２比。Ｃ）２００μＬ／時間の入力量で時間とともに変化するチャネルの発光性、Ｄ）２００μＬ／時間の入力量で時間とともに変化するＢＲＥＴ２比。Ｅ）１００μＬ／時間で２００〜２５０秒から平均化した、水対照と１μΜマルトースとの間のＢＲＥＴ２比の比較。Ｆ）２００μＬ／時間で２００〜２５０秒から平均化した、水対照と１μΜマルトースとの間のＢＲＥＴ２比の比較。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
配列表の説明
配列番号１  −  ＯＧＯＲ２融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号２  −  ＯＧＯＲ２融合タンパク質。
配列番号３  −  ＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号４  −  ＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号５  −  ＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２Ｗ１４０Ａ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号６  −  ＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２  Ｗ１４０Ａ融合タンパク質。
配列番号７〜１２  −  オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１３  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１２  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質。
配列番号１４  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１３  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質。
配列番号１５  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１４  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質。
配列番号１６  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１５  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質。
配列番号１７  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１６  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質。
配列番号１８  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１４／１１３  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質。
配列番号１９  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１２  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号２０  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１３  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号２１  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−ｌ１４  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号２２  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１５  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号２３  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−ｌ１６  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号２４  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１４／１１３  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号２５  −  ＧＦＰ２−ＯＧＯＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号２６  −  ＧＦＰ２−ＯＧＯＲ突然変異体−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号２７  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１２  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号２８  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１３  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号２９  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１４  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号３０  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１４／１１３  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号３１  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１５  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号３２  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１６  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号３３  −  ＧＦＰ２−ＯＧＯＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号３４  −  ＧＦＰ２−ＯＧＯＲ  突然変異体−ＲＬｕｃ２融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号３５  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１２  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号３６  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１３  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号３７  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１４  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号３８  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１４／１１３  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号３９  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１５  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号４０  −  ＧＦＰ２−ｓｔｒ−１１６  ＳＧＳＲ−ＲＬｕｃ２融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号４１  −  線虫ｓｔｒ−１１２。
配列番号４２  −  線虫ｓｔｒ−１１３。
配列番号４３  −  線虫ｓｔｒ−１１４／１１３  キメラタンパク質。
配列番号４４  −  線虫ｓｔｒ−１１２をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号４５  −  線虫ｓｔｒ−１１３をコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号４６  −  線虫ｓｔｒ−１１４／１１３キメラタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。
【０１０７】
一般技術および定義
別途具体的に定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生化学の）によって広く理解されているものと同じ意味を有するものとする。
【０１０８】
別途示されない限り、本発明に用いられる組み換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技法は、当業者に周知の標準的な手順である。そのような技法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５  ａｎｄ  １９９６）、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｌｌ  ｕｐｄａｔｅｓ  ｕｎｔｉｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、およびＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｌｌ  ｕｐｄａｔｅｓ  ｕｎｔｉｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ）等の文献に記載および説明されている。
【０１０９】
「および／または」という用語、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」とは、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味することを理解されたく、両方の意味またはいずれかの意味に対する明示的な支持を提供するものとする。
【０１１０】
内容により別途提示されない限り、センサ分子および基質といった用語の単数形での言及は、明らかに複数形もまた意味する。例えば、論理的には、単一の分子ではなく多数の個々のセンサ分子がデバイスを通じて流動するであろう。
【０１１１】
本明細書に使用される際、約という用語は、そうでないことが示されない限り、指定された値の＋／−２０％、より好ましくは＋／−１０％、なおもより好ましくは＋／−５％を指す。
【０１１２】
本明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群の除外を意味するものではないことが理解されよう。
【０１１３】
検出／分類／スクリーニングシステム
本発明は、試料中の検体を検出する方法に関し、この方法は、
ｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスを通じて、
ａ）試料、
ｂ）検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含むセンサ分子であって、化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとの距離および相対配向は、検体の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、センサ分子、
ｃ）化学発光ドナーの基質、を流動させることと、
ｉｉ）センサ分子、試料、および基質を、デバイスにおいて混合することと、ｉｉｉ）電気光学感知デバイスを使用して、化学発光ドナーによる基質の修飾を検出することと、を含み、
アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、検体がセンサ分子に結合すると変化する。
【０１１４】
本発明はまた、本発明の方法を実行するためのマイクロ流体システムに関し、このシステムは、
ｉ）検体、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインに結合するドメインを含むセンサ分子を含有する（または含む）のに好適な少なくとも１つのレザーバーであって、化学発光ドナードメインおよびアクセプタードメインの距離および相対配向は、検体の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、少なくとも１つのレザーバーと、
ｉｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスと、
ｉｉｉ）センサ分子、試料、および化学発光ドナードメインの基質を、デバイスにおいて混合するための手段と、
ｉｖ）センサ分子への検体の結合を検出するための反応チャンバと、
ｖ）電気光学感知デバイスと、を備え、
アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、検体がセンサ分子に結合すると変化する。
【０１１５】
当業者であれば、本発明の方法およびシステムは、試料中の検体の存在または不在を検出するために使用することができ、存在する場合には、検体の濃度を判定するためにも使用することができることを理解するであろう。
【０１１６】
本発明は、特に、センサ分子がデバイスに固定される方法およびシステムと比較した場合に、先行技術よりも優れた多数の利点を有する。第１に、デバイスを再生（リセット）する必要がない。第２に、本発明の方法およびシステムではシグナルのドリフトがより少ない。第３に、デバイスを、センサ分子が固定される場合よりも多く再使用することができるため、費用が低減される。第４に、本発明は、センサ分子の表面積および密度に起因して、固定型構成に伴うシグナルの弱さの問題を回避する。第５に、現在の技術は、体積に基づく検出技術であり、センサ分子を表面に付着させる必要がある表面プラズモン共鳴等の表面に基づく技術ではない。センサ−検体の反応は、いっそう急速に発生し、それによって、能動制御なしですら分析時間を低減する。
【０１１７】
さらに、ＢＲＥＴは、外部光源によりドナーを励起する必要がないため、蛍光に基づく技術よりも優れた複数の利点を有する。ＢＲＥＴは、ドナー部分の自己蛍光、光散乱、光退色、および／もしくは光異性化、または細胞への光損傷に悩まされない。ＢＲＥＴアッセイにおける外部光源の不在は、非常に弱いバックグラウンドおよび結果として検出感度の増加をもたらす。例えば、ＢＲＥＴは、トロンビンに触媒されるタンパク質分解切断を監視するためのＦＲＥＴよりも５０倍感度が高い（Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ｂ）。
【０１１８】
試料を分類するための本発明の方法の使用に関して、センサ分子、より具体的にはセンサ分子のセットを、特定の亜集団を代表する物質（検体）のパターンを検出するために使用することができる。一例として、本方法は、ビール、ワイン、チーズまたは他の消耗品の種類、熟成度、品質等を分類するために使用することができる。本方法は、食品、飲料、香水、香料等の試料に、甘味、苦味、旨味特性、例えばカプサイシンもしくはヒドロキシ−α−サンショオール（ｈｙｄｒｏｘｙ−α−ｓａｎｓｈｏｏｌ）と関連する「辛さ」、例えばメントールと関連する「清涼感」、および／または好適なセンサ分子を単離もしくは組み換えることができる任意の嗅覚香等といった、感覚刺激特性の分類または定量化を行うために使用することができる。本方法はまた、化学的特徴、例えば、ヘッドスペース、呼気、汗、尿、他の生体液の試料に基づくヒト、動物、または植物の健康、栄養、または疾患状態に基づいて、広範な種類の他の試料を分類するためにも使用することができる。本方法の他の用途は、爆発物または爆発物関連成分、毒性工業化学物質、化学もしくは生物兵器剤、または病原微生物の存在といった毒性または有害性に基づいて、試料を分類することである。本方法はまた、仕様への適合性、または任意の化学物質の群（複数可）のレベルの存在、不在を含む、工業的プロセスを監視するために使用することができる。本方法はまた、リアルタイムまたはバッチモードのいずれかで、環境試料を分類し、例えば、空気質、不快臭もしくは毒性化学物質の存在もしくはレベル、または、同様に、天然もしくは水道水設備、下水設備、または地下水の品質を判定するか、あるいは土壌または岩盤と接触した流体を分類するために使用することができる。
【０１１９】
試料の分類は、通常、区別しようとする試料のすべての分類を表すかまたは包含する訓練試料セットに対する電気光学応答パターンに基づいて、はっきりと異なる機能または分類子を生成することによって行われる。これは、主成分分析、線形判別分析、段階的判別分析等の多変量統計アプローチを用いて日常的に達成され得る。あるいは、多様な種類の機械学習アプローチを用いてもよく、その一例は、サポートベクターマシンである。類似のアプローチは、ベイジアンネットワークを使用するか、または人工神経ネットワークを訓練して、このような試験セットの試料間の判別を行うことである。１つの実行可能なアプローチは、したがって、電気光学応答パターンを試験または未知の試料（複数可）から捕捉し、それらをリアルタイムで処理し、それらを訓練試料セットにより取得した保存されたパターンと比較し、最良の一致に従ってそれらを既知の分類に割り当てるか、または類似のパターンが以前に観測されていない場合はそれらを新規の分類（複数可）に割り当てることである。分類方法については、実際の検体（複数可）が既知であることは必須ではなく、単純にセンサ分子（またはセンサ分子の群）が、異なる分類の試料では異なるパターンのシグナルを再現可能に生成し、これにより、ユーザが分析されている試料（複数可）を分類することが可能となる。
【０１２０】
感度に関しては、マイクロモル、ナノモル、フェムトモル、アトモル、またはさらにより低い程度の検体の濃度が、検出可能である。ある実施形態において、本発明の方法は、本方法を同じ試薬濃度を用いてマイクロウェルプレートで実行した場合よりも、少なくとも５倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは５倍〜１，０００倍、もしくは５倍〜１００倍、もしくは５倍〜５０倍、もしくは５倍〜２０倍、またはおよびいくつかの状況では、最大１００〜１，０００倍感度が高い。
【０１２１】
本発明は、検体をリアルタイムで検出するのに特に有用である。本明細書に使用される際、「リアルタイム」という用語は、ある特定の状態が、実質的に同時に別の形態（例えば、ディスプレイ上の画像または処理されたデータによるグラフ）で示されることを意味する。そのような場合において、「リアルタイム」は、データ処理に必要な時間の分、実際のイベントから遅れる。そのような時間差は、実質的に無視できる場合、「リアルタイム」の範囲内に含まれる。そのような時間差は、典型的には、限定することなく、１０秒以内であり、好ましくは１秒以内であり得る。好ましい実施形態において、本発明の方法は、約１秒〜約１００秒の範囲内で行われる。
【０１２２】
本明細書に使用される際、「フェルスター距離」とは、エネルギー移動が（平均で）５０％の効率である、ドナーとアクセプターとの間の距離である。フェルスター距離（Ｒｏ）は、アクセプターの不在下でのドナーの量子収率、溶液の屈折率、各ドメインの双極子角度配向、およびドナーとアクセプターのスペクトル重複積分（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｉｎｔｅｇｒａｌ）を含む、多数の要因に依存する。
【０１２３】
本明細書に使用される際、「量子収率」は、元のエネルギー供与の最終放出の尺度を指す。
【０１２４】
本明細書に使用される際、「ストークスシフト」は、吸収のバンド最大値の位置と、同じ電子遷移の放出スペクトルとの間の波長の差である。
【０１２５】
ある実施形態において、本発明は、デバイスにおいて、検体の濃度の増加（例えば、チップでの検体（ａｎａｙｌｙｔｅ）の合成を通じて）または減少（例えば、チップでの検体（ａｎａｙｌｙｔｅ）の分解もしくは修飾）を分析するために使用される。典型的に、これは、デバイス上の２つの異なる地点、例えば、検体がそこを通って流動する第１および第２の反応チャンバで、基質の修飾を検出する必要がある。したがって、ある実施形態において、センサ分子から解放される検体は、ＢＲＥＴ比の変化をもたらし、これは、最大観測ＢＲＥＴ比の１５％以上、２０％以上、３０％以上、３５％以上、約１５％〜約５０％、または約１５％〜約４０％である。
【０１２６】
さらなる実施形態において、センサ分子は、リガンドに結合した入力マイクロチャネルに進入し得、検出される検体（例えば、触媒酵素）がリガンドを切断および／または修飾し、結果として修飾されたリガンドがセンサ分子から解放される（もはやそれに結合しない）ようになる。
【０１２７】
本発明の方法およびシステムにおけるＢＲＥＴ感知は、マイクロ流体デバイスで実現される。一構成において、本システムは、（１）試料送達、（２）試薬の保管および取り扱い、（３）マイクロ流体チップおよび充填システム、（４）場合によっては温度制御、（５）光収集のための電気光学システム、（６）電気光学検出システム、（７）データの取得および処理、ならびに（８）ソフトウェアおよび組み込み制御システムを含む、複数のモジュールを備える（図１３）。
【０１２８】
試料送達
「試料」は、検出される検出される検体を含むことが既知であるかもしくは疑われる、または特定の物質、物質のセット、もしくは組成物が不在であることが予測されるか、もしくは必要とされる、任意の物質または組成物であり得る。試料の例には、空気、液体、および生物学的材料が挙げられる。試料は、環境もしくは供給源から直接入手され得るか、または本発明の方法を実行する前に好適な手順によって少なくとも部分的に精製され得る。
【０１２９】
試料は、マイクロ流体デバイスを通じて流動することができる任意の形態であり得る。例としては、液体、気体、エマルジョン、または懸濁液が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。ある実施形態において、試料は、気体で事前平衡化されている液体である。懸濁液の例には、油中水、水中油、および液体中の気体が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１３０】
より具体的な実施形態において、気体の濃度、検体の可溶性および分配計数、ならびに液相の組成に基づいて、気相から液相への検体の急速な質量移動が起こり得るように、目的の位置からの周囲空気もしくは他の気体、または目的の任意の物体もしくは試料からのヘッドスペースを、水または水溶液と緊密に接触させる。液体の体積に対して、大きな面積で気体−液体の界面を生成する任意の方法が、好適である可能性がある。例となる方法には、濡壁サイクロン、ミスティング、またはバブリングシステムが挙げられる。ＳＡＳＳ２４００濡壁サイクロンは、空気から水相への揮発物質の分離を加速させるための好適なデバイスの具体的な例である。好ましくは、本方法は、多量の空気を少量の液体と接触させ、それによって多量の気相のサンプリングを可能にし、濃縮ステップを提供する。ＳＡＳＳ２４００の公開されている仕様に基づくと、標準的な温度および圧力で、１分当たり１体積の水または水溶液を、４０，０００体積の気体と接触させることが可能である。使用される機器の寸法および動作特性に応じて、より低いかまたは高い気体−液体比のサンプリングが可能である。
【０１３１】
一実施形態において、懸濁液は、無細胞抽出液であるか、またはそれを含む。代替的な実施形態において、懸濁液は、細胞を含む。
【０１３２】
試料（ならびにセンサ分子および基質）は、必ずしも限定されないが、ポンプ、減圧、水圧、吸引、動電、化学浸透、毛管力、音響、電磁気、圧電等のうちの１つ以上といった任意の好適な手段によって、マイクロ流体デバイスを通じて流動され得る。ポンプ機序は、その用途のためのコンパクトな小型化されたミクロン寸法のポンプで実現され得る。粒子、有機液滴といった残屑を試料から濾過して除去するための事前調節デバイス、ならびに／または試料の温度、湿度、流量、および体積といったいくつかの基本的な試料パラメータを測定する状態監視デバイスが存在してもよい。
【０１３３】
試薬の保管および取り扱い
複数の試薬（ＢＲＥＴ試薬、洗浄ＤＩ水、基質等）の保管のための使い捨ての格納式液体保管システムを使用することができる。このデバイスは、研究室で事前充填し、操作の際に感知デバイスに挿入することができる。
【０１３４】
マイクロ流体デバイスおよび充填システム
マイクロ流体デバイス（当該技術分野においてチップまたは「ラボオンチップ」とも称される）は、断面がおおよそ１０〜５０μｍ（マイクロメートル）から最大おおよそ１００〜１０００μｍに寸法調整され、おおよそ１ｍｍ〜おおよそ２０ｃｍの直線寸法を有する通常は平坦基板上またはその中に形成されるチャンバおよび流路内の流体試薬を操作することによって、化学反応もしくは生化学反応または分析を実行する。マイクロ流体デバイスは、流体反応物質が、入力レザーバーからデバイスを通り排出ポートまでの連続流動として、または動作時にデバイスの流路およびチャンバを実質的に充填する流体アリコートの半連続流動としてのいずれかで、デバイスの流路およびチャンバを通じて流動するときに、それらを操作し得る。あるいは、マイクロ流体デバイスは、デバイスの寸法よりもおおよそ１桁以上小さい長さを有することを特徴とする別個かつはっきりと異なる微液滴として、流体試薬を操作し得る。
【０１３５】
マイクロ流体デバイスは、チップ充填システムに挿入されると、すべての試料および試薬送達口との接続を維持することができる。この充填システムは、温度制御および光学的構成要素の一部を形成し得る。単一から複数の反応器が、チップに組み込まれ得る（図１４）。３つの試薬（試料、センサ分子、および基質）は、チップにポンプ注入され、混合領域で混合され得る。代替的な構成では、一方が基質用で他方がセンサ分子および試料の事前混合物用である、２つの入力マイクロチャネルがある。さらなる構成では、一方がセンサ分子用で、他方が基質および試料の事前混合物用である、２つの入力マイクロチャネルがある。
【０１３６】
混合された試薬は、ＢＲＥＴ反応を受け、生成物が、連続的に検出チャンバにポンプで送られた後に廃棄物排出口から収集される（図１５）。
【０１３７】
本明細書に使用される際、「混合する」という用語またはその変化形は、検体（複数可）、センサ分子、および基質が、拡散（例えば、直線（層）流）および／または何らかの能動的混合手段によってであるかにかかわらず、任意の手段により接触することを意味する。したがって、一実施形態において、「混合の手段」は、直線（層）流での受動的拡散であり得る。この実施形態では、完全な混合は達成されないものの、本発明者らは、本発明の方法が適正に機能するのに十分な程度の混合が起こることを見出した。ある実施形態において、拡散混合は、試料、センサ分子、および基質を含むマイクロチャネルの少なくとも２０％が、これらの構成成分の均質な混合物を有することをもたらす。
【０１３８】
少なくとも２つのマイクロチャネルが合流して共通マイクロチャネルを形成する角度は、０°〜おおよそ１７０°近くで変動し得るか、または実際にはマイクロ流体チップ（デバイス）の面に対する角度であり得る。
【０１３９】
本明細書に使用される際、「共通マイクロチャネル」という用語またはその変化形は、試料、センサ分子、および基質を含む、マイクロチャネルまたはその部分を指す。
【０１４０】
本明細書に使用される際、「入力マイクロチャネル」という用語またはその変化形は、試料、センサ分子、もしくは基質等の特定の試薬、または試薬の組み合わせが、そこを通ってマイクロ流体デバイスに進入する、マイクロチャネルを指す。
【０１４１】
少なくともいくつかの実施形態において、層流領域の存在に起因して、混合手段は、好ましくは、反応物質の接触を強化するための混合領域に実装される。混合手段には、受動的混合（図８および図４４）、および／または音響混合器（例えば、ＷＯ２００６／１０５６１６号に記載される）によるもの等の能動的混合を挙げることができる。他の混合技術を、ＷＯ２００３／０１５９２３号に記載のものといった目的で実装してもよい。
【０１４２】
本明細書に使用される際、「センサ分子、試料、および基質を、デバイスにおいて混合する」という用語およびその変化形は、センサ分子、試料、および基質をデバイスのレザーバーにおいて混合すること、センサ分子、試料、および基質をデバイスのマイクロチャネル内に流入する管において混合すること、センサ分子、試料、および基質をデバイスのマイクロチャネルにおいて混合すること、もしくはセンサ分子、試料、および基質を反応チャンバにおいて混合すること、またはこれらの組み合わせもしくはこれらの２つ以上を包含する。好ましい実施形態において、センサ分子、試料、および基質は、マイクロチャネルにおいて混合される。好ましくは、センサ分子および試料は、マイクロチャネルで混合されず、マイクロチャネルに進入する前に、直前（例えば、１０秒、より好ましくは１秒、またはそれ未満）に混合される。
【０１４３】
ある実施形態において、混合ステップは、センサ分子、基質、および検体が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％均質な混合物を形成することをもたらす。上に示されるように、能動的混合は、任意の所与の流量およびチャネル設計で、より優れたレベルの均質性をもたらすが、これは、本発明を実行するのに必ずしも必要ではない。
【０１４４】
本発明の方法は、同じマイクロ流体デバイスを使用して、例えば、図１４ｂおよび１４ｃに示されるデバイスを使用して、２つ以上の異なる検体を同時または順次に検出するために使用することができる。ある実施形態において、異なるセンサ分子は、異なるマイクロチャネルを使用してデバイスに流入する。便宜上、分析される試料が、各検体で同じ場合、デバイスへ試料が入る単一の流動が存在し得、これが、次いで、枝分かれし、異なるセンサ分子を含む他のチャネルに合流する（図１４ｂおよび１４ｃを参照されたい）。センサ分子のそれぞれに対する基質が同じ場合にも、同じことが適用される。当業者であれば、分析される試料の数、各標的検体を検出するために必要なセンサ分子の数、および異なるセンサ分子が使用されていることを踏まえて対応する基質の必要数に応じて、マイクロチャネルの好適な構成を容易に設計することができる。
【０１４５】
マイクロ流体デバイスは、必要とされる化学的適合性および機械的強度の特徴を有する任意の材料から作製され得る。そのような物質の例には、シリコン、ガラス（例えば、溶融シリカ、溶融石英、ホウケイ酸塩、または異なる添加剤を有する任意の種類のガラス）、ポリジメチルシロキサン、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレンポリスルホン、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン、ａフッ化ポリビニリジン（ａ  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ポリシリコン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ（ブチレンテレフタレート）、ポリ（エーテルスルホン）、ポリ（エーテルエーテルケトン）、ポリ（エチレングリコール）、スチレン−アクリロニトリル樹脂、ポリ（トリメチレンテレフタレート）、ポリビニルブチラール、ポリフッ化ビニリデン、ポリ（ビニルピロリドン）、環状オレフィン−コポリマー、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１４６】
デバイス（チップ）は、単層および多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）技術、ならびに／または犠牲層封入法（例えば、Ｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）、ＷＯ０１／０１０２５号を参照されたい）といった当該技術分野における標準的な技術を使用して、構築することができる。マイクロ流体デバイスを製造するさらなる方法には、マイクロマシニング、マイクロミリング、レーザーに基づくマシニング、化学エッチング、（強）反応性イオンエッチング、インプリンティング技術が挙げられる。これらの技術は、マイクロデバイスの大量生産のための熱エンボス加工および／または射出成形技術と併せて使用することができる。製造技術には広範な先行技術が存在する。これらのうちのいくつかは、ＵＳ５，８５８，１９５号、ＵＳ５，１２６，０２２号、ＵＳ４，８９１，１２０号、ＵＳ４，９０８，１１２号、ＵＳ５，７５０，０１５号、ＵＳ５，５８０，５２３号、ＵＳ５，５７１，４１０号、ＵＳ５，８８５，４７０号、ＵＳ６，７９３，７５３号にも記載されている。独立型構造は、チャネルの幅および高さに関して非常に薄いかまたは非常に厚い壁部を有するように作製することができる。チャネルの壁部、ならびに上部および底部は、すべてが異なる厚さであってもよく、同じ材料または異なる材料もしくは材料の組み合わせ、例えばガラス、シリコン、およびＰＤＭＳ等の生体適合性材料から作製され得る。密封チャネルまたはチャンバは、全体がＰＤＭＳ等の生体適合性材料から作製されてもよい。
【０１４７】
本発明に有用なデバイスは、１つ以上のチャネルおよび／または反応チャンバを有し得る。例えば、デバイスは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のチャネルを備え得る。さらに、デバイスは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の反応チャンバを備え得る。
【０１４８】
反応チャンバおよびマイクロチャネルは、限定されないが、円筒形、長方形、半球、または台形等、当該技術分野で既知の任意の好適な形状であり得る。
【０１４９】
ある実施形態において、デバイスが、１つを上回る反応を行うことができる場合、チャネル設計は、各構成成分が、図４７に提供される左右対称な平行チャネルレイアウト等、同じ長さ、寸法、および構成を有するチャネルを通じて流動するようなものである。
【０１５０】
別の実施形態において、マイクロチャネルの機能および反応チャンバの機能は、中で混合が起こり、そこから光が収集される、単一の一体型マイクロ流体素子によって達成され得る。
【０１５１】
マイクロ流体デバイスは、典型的に、１つ以上の反応チャンバの容積が、約１ｐｌ（すなわち、ピコリットルまたは１兆分の１リットル）〜約２００μｌである。しかしながら、約０．０１ｎｌ（すなわち、ナノリットルまたは１０億分の１リットル）〜約１００ｎｌ、または約０．０１ｎｌ〜１０ｎｌの反応チャンバの容積が、ある特定の用途においては有利であり得る。いくつかの実施形態は、各反応チャンバの容積が、約０．２０ｎｌ〜約５ｎｌである場合に、最適に機能し得る。追加の実施形態は、各反応チャンバの容積が、約０．２５ｎｌ〜約２ｎｌである。さらなる実施形態において、反応チャンバ（複数可）は、約１μｌ〜約１２μｌの容積を有する。他の可能性のある反応チャンバの容積を、必要に応じて用いることができる。
【０１５２】
好ましい実施形態において、反応チャンバは、短いというよりは幅が広い。一例において、反応チャンバは、約１ｍｍ２〜１ｃｍ２の断面積を有し、約５ｍｍを上回らない高さを有する。
【０１５３】
いくつかの状況では、１つを上回る寸法および形状の反応チャンバを使用することが望ましい場合がある。例えば、本発明者らは、より大きな反応チャンバが、しばしば、標的検体を含有する試料を提示する際により遅い応答時間（ＢＲＥＴ比がピークに達するまでの時間）、および検体を除去する際により長いオフタイムをかけて、より多くの光を生成し、より放出の弱いセンサ分子の検出を可能にすることを観察した。したがって、異なるチャネルは、センサ分子と検体または検体のセットとの特定の組み合わせの感度、精度、および時間の動力学を適合させるために、異なる寸法の反応チャンバを備え得る。センサチャネル毎に１つを上回る反応チャンバを実装することも可能であり、いくつかの場合にはそれが望ましいこともある。これにより、より高い発光性および定量的精度（大型チャンバ）、ならびにより高い時間分解能（より小さなチャンバ）で、試料をほぼ同時に検出することが可能となる。これは、大型およびそれよりも小さなチャンバを、検出器へのそれら固有の光路に光スイッチまたは同等物を介して取り付けるか、またはそれぞれを別個の固体光検出器に取り付けることによって容易に達成され得る。
【０１５４】
マイクロチャネルの寸法は、デバイスの具体的なの用途に基づいて選択され得る。したがって、マイクロチャネルの幅は、例えば、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲に及び得る。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルの幅は、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍである。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルの幅は、約１ｍｍ〜約４ｍｍである。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルの幅は、約２．５ｍｍである。マイクロチャネルの奥行きまたは高さもまた、デバイスの特定の用途に基づいて選択され得る。したがって、マイクロチャネルの奥行きは、例えば、約５μｍ〜約２０００μｍの範囲に及び得る。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルの奥行きは、約１００μｍ〜約１０００μｍである。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルの奥行きは、約２５０μｍ〜約７５０μｍである。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルの奥行きは、約５６０μｍである。別の実施形態において、各マイクロチャネルは、約１μｍ２〜約１ｍｍ２の断面積を有する。
【０１５５】
当業者には理解されるように、デバイスは、関連する構成成分をデバイスを通じて流動させることができる、好適な注入および排出ポートを有するであろう。
【０１５６】
当業者であれば、マイクロ流体デバイスを通じた流動は、マイクロチャネルの寸法、流体の粘度、ならびに利用される検出および方法を含むがこれらに限定されない、種々の要因に依存することを十分に理解している。したがって、試料（センサ分子および基質）は、約１μｌ／時間〜約１０ｍｌ／時間の流量で、チップマイクロチャネルを通じて流動し得る。いくつかの実施形態において、試料（センサ分子および基質）は、約１μｌ／時間〜約１００μｌ／時間、約５μｌ／時間〜約２００μｌ／時間、約７．５μｌ／時間〜約５００μｌ／時間、または約１０μｌ／時間〜約１ｍｌ／時間の流量で、デバイスマイクロチャネルを通じて流動し得る。
【０１５７】
一実施形態において、デバイスは、例えば、同じ源（試料）中の異なる検体を感知するための複数の反応チャンバを備える。異なる検体を検出するためには異なるセンサ分子を使用する必要がある可能性が高いことから、いくつかの事例においては、異なる、好ましくは並列のチャネルの流量を変更することが望ましい場合がある。この点に関して、個々の流量は、個々のセンサ分子の感度を最適化するように設定され得る。
【０１５８】
一実施形態において、複数の反応チャンバを備えるデバイスにおいて、各反応チャンバへのおよびそこからの流量は、別個の手段によって制御され、例えば、別個の吸引ポンプが、各反応チャンバへのおよびそこからの流量を制御する。この構成により、複数のセンサチャネルを互いに独立して、異なり得る流量、および結果として異なる速度と感度とのバランスで、同時に操作することが可能になる。
【０１５９】
マイクロ流体チャネルの表面は、ウシ血清アルブミン、希釈した哺乳動物血清、魚皮ゼラチン、無脂肪乳タンパク質の０．１〜５％（ｗ／ｖ）水溶液といった好適な試薬溶液への曝露、および／またはＴｗｅｅｎ−２０等の非イオン性界面活性剤溶液の使用、または酵母ミクロソームの懸濁液の使用によって、不動態化され得る。
【０１６０】
試薬（試料、センサ分子、基質）がデバイスを通過した後、デバイスは、適切な流体、例えば、緩衝液等の洗浄流体を、マイクロチャネルを通じて流動させることによって洗浄され得る。これにより、デバイスを再使用することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、検体を検出した後に、緩衝液等の流体を、マイクロデバイスを通じて流動させるステップをさらに含む。マイクロデバイスを通じて流動される流体の量は、任意の量であり得、チップの大きさに基づき得る。いくつかの実施形態において、洗浄流体の量は、デバイスのマイクロチャネルの総容積の約０．５倍〜約１０倍である。一実施形態において、洗浄流体の量は、デバイスのマイクロチャネルの総容積の約１．５倍〜約２．５倍である。
【０１６１】
温度制御
存在する場合、このモジュールは、試薬保管では１〜８℃、好ましくは２〜４℃、ならびにＢＲＥＴ反応では２０〜３７℃、好ましくは２５〜２８℃の所望される温度を維持するために使用される。ＢＲＥＴ温度制御は、充填機序および電気光学収集デバイスに組み込まれてもよい。具体的には、それらは、制御機能のために局所抵抗加熱またはペルチェ素子冷却を用いる技術に従って構築される。例えば、熱的に制御されるプロセッサを、ベースラインよりも高い局所加熱によって制御される作動装置を有する、ペルチェ素子等の温度制御されたヒートシンクまたは冷却素子によってベースライン温度に維持することができる。あるいは、冷却は、小型ヒートポンプを使用して提供されてもよい。局所加熱は、好ましくは、例えば、５０、２５、１５、または１０Ｖ未満の低電圧によって有利に制御される、おおよそ１〜２Ｗ未満の低電力抵抗加熱器によって提供され得る。
【０１６２】
光収集のための電気光学システム
本明細書に使用される「シグナル」という用語は、吸収の変化として測定される発光を指す。いくつかの実施形態において、シグナルは、「放出される光」であり、シグナルを検出するステップは、１つ以上の光検出器による特定の波長の光の光子の検出である。例となる光検出器には、光電子倍増管（ＰＭＴ）、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、シリコンもしくは他の固体光電子倍増器（ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｓｉｌｉｃｏｎ＿ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）、またはＣＣＤカメラが挙げられ、これらは、冷却することができる。好ましくは、光検出器は、１０％以上、より好ましくは３０％以上、および最も好ましくは５０％以上の光子検出効率を有する。好ましくは、これらの効率は、光学スペクトルの青色および緑色のバンドで機能する。検出器は、さらに、検出される光を特定の波長（複数可）または特定の波長範囲に制限する手段を備える。これは、例えば、フィルタホイール、もしくはフィルタスライド、もしくはモノクロメータ、もしくはダイクロイックミラー、またはこれらのデバイスの２つ以上の組み合わせに任意で載置される好適なフィルタであり得る。
【０１６３】
電気光学システムは、主に、光ファイバおよび光学スイッチからなり得る（図１６）。光ファイバは、ファイバ束または液体ライトガイドで置き換えることができる。約１０μｍ〜約３０００μｍのコア径を有するファイバは、充填システムに固定され得る。ファイバ束または液体ライトガイドについては、コア径は、０．５ｍｍ〜１０ｍｍの範囲内であり得る。ファイバの平面端部は、反応チャンバのすぐ下に位置付けられ得、各ファイバが特定のチャンバから光を収集する。反応チャンバと一体化することが可能な２つのＢＲＥＴ電気光学検出素子を設計してもよい（図１７を参照されたい）。球状マイクロレンズを反応チャンバに組み込んで、ＢＲＥＴ光を光ファイバのコアに集中させるのを補助してもよい。
【０１６４】
別の実施形態において、光ファイバ／液体ライトガイドシステムは、各チャンバからの光が検出器に中継されるように、レンズとミラーのセットで置き換えることができる。多重チャネルシステムの切り替えは、機械的チョッパまたは他の切り替え機序によって実現され得る。
【０１６５】
収集されるＢＲＥＴシグナルをさらに増加させるために、平面または非球面ミラーを、反応チャンバの上部に設置してもよい（図１７ｂ）。この場合、上部に放出されるＢＲＥＴ光の大部分が、反射して光ファイバへと戻ることになる。多重チャネル検出については、光学スイッチを使用して、すべてのチャネルから光を収集することができる。この要素のための材料は、ポリジメチルシロキサン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等、優れた光学、化学特性を有する、ガラスまたはポリマー材料であり得る。ＢＲＥＴ反応チャンバは、試料の送達および混合のために、上で設計されたマイクロ流体ネットワークに接続される。
【０１６６】
デジタル光子集積
超低レベルの光の検出には、暗電流を排除するために、高感度な光電子倍増管（ＰＭＴ）およびデジタルシグナル処理装置が必要である。図４２は、ＰＭＴ、光子計数装置、ＵＳＢ計数装置という３つの装置から構成される、本発明で使用するための例示的なシステムを図示する。Ｈ１０７２１Ｐ−２１０は、可視波長で高い感度を提供する超バイアルカリ光電面を有する電流出力型ＰＭＴである。光感受性領域は、直径８ｍｍの円形である。光子が超バイアルカリ光電面に達すると、光電子が生成される。光電子は、電子の数が各段階で指数関数的に増加する一連のカスケード電極構造に向かって加速する。最終段階で、ＰＭＴは、生成された電子の合計を光電子のパルスまたは電流として出力する。
【０１６７】
暗電流は、入射光の不在下で、ＰＭＴから現れる電流出力として定義される。いわゆる「暗電流パルス」を識別および排除することにより、暗電流を最小限に抑えることが可能である。この例では、シグナル処理装置（Ｃ９７４４光子計数装置）を使用して、暗電流パルスを排除する。この装置は、ユーザ設定閾値の実装を可能にし、その結果、閾値よりも高い振幅を有するパルスのみが出力に送信される。残りのパルスは、出力シグナルからフィルタ除去される。この装置では、分別基準を通過するパルスは、５Ｖデジタルシグナルパルスに変換され、出力端末に送信される。
【０１６８】
Ｃ８８５５−０１は、不感時間なしにデジタルシグナルパルスを計数するように設計されたＵＳＢインターフェースの計数装置である。Ｃ９７４４光子計数装置で生成されるシグナルは、計数装置に入力され、結果が、ＵＳＢ接続でＰＣに送信される。
【０１６９】
光学検出システム
検出は、デバイスに組み込まれるか、またはデバイスとは別個であるが検出されるデバイスの領域と連携されている、検出器を使用することによって達成され得る。
【０１７０】
光学検出システムは、各ＢＲＥＴ反応チャンバを含む、各マイクロ流体チャネルから光出力の試料抽出を行う。各マイクロ流体チャネルは、専用の光検出器を備え得る。例えば、単一のＢＲＥＴ反応チャンバの光学出力の一部分は、青色バンドパスフィルタを通じてチャネルに入り得、残りは緑色バンドパスフィルタ（または使用されるＢＲＥＴの種類に応じて他の好適なバンドパス特徴部）を通じてチャネルに入り得る。これらのフィルタからの光は、光ファイバ、光ファイバ束、または液体ライトガイドを用いて別個の光電子倍増器に向けられる。あるいは、シリコンまたは他の高感度な固体光電子倍増器を、各マイクロ流体チャネルおよびＢＲＥＴ反応チャンバから光の放出を直接試料抽出できるように、バンドパスフィルタに近接近して設置してもよい。別の実施形態において、非球面レンズまたは非球面レンズのセットを、光ファイバ、光ファイバ束、または液体ライトガイドの端部に設置して、ＰＭＴに進入する前に出力ビームをコリメートし、したがって、光線がＰＭＴの感受性領域の外側に逸れることによる光学的損失を低減することができる。好ましい実施形態において、バンドパスフィルタを、マイクロ流体チップの対向する側面にそれと密着させて設置し、固体光電子倍増器または他の光検出器を、マイクロ流体チャネルのそれぞれにおけるバンドパスフィルタの両方と密着させて設置する。各マイクロ流体チャネルに専用の検出システムを提供する利点は、光学システムの複雑性を最小化し、各マイクロ流体チャネルがポーリングサイクルの大半において光学的に無変化である切り替え不感時間に起因するものを含む光子損失の可能性を最小化することである。
【０１７１】
あるいは、各マイクロ流体チャネルは、１つ以上の共有の光検出器によって順にポーリングされてもよい。
【０１７２】
一実施形態において、検出システムは、マイクロ流体チャネルのそれぞれから光ファイバまたはライトガイドを介して光を受容し、単一の光ファイバまたはライトガイドを介してこれらの入力のそれぞれの光シグナルを連続的に出力する、光学的または光学機械的切り替えデバイスからなり得る。チャンバからチャンバへの切り替え時間は、ナノ秒〜数秒（例えば、２または３秒）の範囲内、好ましくは１０〜５００ミリ秒以下の範囲内であり得る。光学切り替えデバイスの出力が衝突し、ダイクロイックミラー等の光検出器が、光を、それぞれＢＲＥＴドナーおよびアクセプターの放出に対応する２つの波長範囲、ならびにこれらの波長範囲のそれぞれの光を同時に検出するための２つの光子倍増管に分ける（図１６）。場合によっては、ダイクロイックブロックは、ＢＲＥＴドナーおよびアクセプターの放出スペクトルに調整されたバンドパスフィルタによって増大されてもよい。
【０１７３】
代替的な実施形態において、シャッターボックスが、光学スイッチの代わりに用いられてもよい。そのような配設において、シャッターボックスの出力は、多対一の多分岐型ライトガイドであり得、これは、すべての光学チャネルの出力を単一のライトガイドに制限し、これが光を光検出器へと導く。この配設において、シャッターは、各単一のマイクロ流体チャネルからの光が、連続的に光検出器に移るように、操作される。切り替えシステムの潜在的な利点は、費用、重量、および電力を抑えながら、より少数の光検出器によってより多数のマイクロ流体チャネルの光学出力の試料抽出を行うことが可能となることである。
【０１７４】
別の実施形態において、対をなす固体光検出器の動作特徴は、それらのピーク光子検出効率（ＰＤＥ）が、ＢＲＥＴドナーおよびアクセプターのピーク放出に選択的または半選択的となるように選択することができる。この場合、スペクトルフィルタおよびダイクロイックブロックを省略し、ＢＲＥＴ比の生成を固体光検出器の種類が異なる固有の差スペクトル感度に頼ることが可能である。
【０１７５】
データの取得および処理
計数／ゲート対時間に関するドナーおよびアクセプターのＢＲＥＴシグナルを、好適なソフトウェアによって収集する。ＢＲＥＴ比は、アクセプターチャネルから収集された光と、ドナーチャネルから収集された光との比率に基づいて計算される。ＢＲＥＴ比は、センサ分子および基質の流動比が一定にとどまり、検出される検体がＢＲＥＴチャンバにない場合、一定となるはずである。しかしながら、検体の存在下では、ＢＲＥＴ比は、反応チャンバ内の試薬の量に対応して変化するであろう。
【０１７６】
ソフトウェアおよび埋め込み型制御システム
好ましくは、本システムは、異なる化学試料の応答パターンの特徴を学習し、区別することができる、訓練可能なデータ処理および出力ソフトウェアアルゴリズムを含む。ソフトウェアは、ベースラインのＢＲＥＴ比、試料に曝露したときの定常状態のＢＲＥＴ比、および経時的なＢＲＥＴ比の変化の種々の特徴といった、各マイクロ流体チャネルからのシグナルの顕著な特徴を捕捉する。各チャネルからのこれらの特徴は、主成分分析、線形判別分析、段階的判別分析、サポートベクターマシン等の機械学習アルゴリズム、ベイジアンネットワーク分析、または神経ネットワークアルゴリズムといった種々の判別アルゴリズムに入力され、以前に学習済みの試料分類の結果と比較される。暫定的な試料分析または分類が、好ましくは、ＧＵＩおよび／または音響的出力を通じて、操作者に提供される。あるいは、各チャネルにおけるシグナル強度は、操作者が、応答パターンを、以前に認識するように訓練したものと一致させることができるように、視覚的および／または音響的に出力されてもよい。
【０１７７】
一実施形態において、ＧＵＩソフトウェアは、サンプリングサブシステムの速度および濃度の比率、マイクロ流体チャネルの流量、洗浄およびパージサイクルのタイミング、ポンプ、任意の能動的混合の速度および強度、光検出器システムの感度および集積時間、試薬レザーバーおよび反応チャンバの温度、ならびにデータの取得および処理のあらゆる側面といった、すべてのデバイス内構成要素を制御するために使用される。場合によっては、これらの機能の多くが、埋め込み型マイクロコントローラによって実行され得る。一部またはすべての機能が、ラップトップもしくはタブレットコンピュータまたは同等のデバイスで実行されてもよい。
【０１７８】
化学発光共鳴エネルギー移動
化学発光は、化学反応の結果として、制限された熱（発光）の放出を伴うエネルギーの放出である。「化学発光」という用語は、酵素の活性に依存する生物発光を包含して本明細書に使用される。
【０１７９】
本明細書に使用される際、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）とは、生物発光タンパク質ドナーとアクセプター分子との間の非放射性エネルギー移動に基づく近接性アッセイである。
【０１８０】
本明細書に使用される際、「空間位置」という用語は、検体がセンサ分子に結合するかまたはそこから解放される結果として変化する、アクセプター分子に対するドナーの３次元の位置付けを指す。
【０１８１】
本明細書に使用される際、「双極子配向」とは、３次元空間におけるその配向に対する、ドナーおよび／またはアクセプター分子のいずれかに関連する双極子モーメントの３次元空間における方向を指す。双極子モーメントは、分子に対する電荷の変動の結果である。
【０１８２】
ＢＲＥＴを例として用いると、ある実施形態において、生物発光タンパク質とアクセプター分子との間に起こるエネルギー移動は、特定の波長を選択する光学フィルタ（一方がアクセプター分子の放出用で、他方が生物発光タンパク質の放出用）を使用して測定された放出から計算された比率として提示される（等式１を参照されたい）。
Ｅａ／Ｅｄ＝ＢＲＥＴ比          （１）
式中、Ｅａは、アクセプター分子の放出強度（放出光は、アクセプターの放出に適合された特定のフィルタを用いて選択される）として定義され、Ｅｄは、生物発光タンパク質放出強度（放出光は、生物発光タンパク質の放出に適合された特定のフィルタを用いて選択される）として定義される。
【０１８３】
光学フィルタが、ＢＲＥＴに好適な波長判別を可能にする任意の種類のフィルタであり得ることが、当業者には理解されるはずである。例えば、本発明に従って使用される光学フィルタは、干渉フィルタ、ロングパスフィルタ、ショートパスフィルタ等であり得る。フィルタを通る波長の強度（通常、１秒当たりの計数（ＣＰＳ）または相対発光単位（ＲＬＵ）で）は、光電子倍増管（ＰＭＴ）、カスケードフォトダイオード、フォトダイオードアレイを含むフォトダイオード、または電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ等の感受性カメラのいずれかを使用して定量化され得る。続いて、定量化されたシグナルを使用して、ＢＲＥＴ比を計算し、エネルギー移動効率を表す。ＢＲＥＴ比は、アクセプター放出の強度が増加するにつれて、増加する。
【０１８４】
一般に、アクセプター放出強度とドナー放出強度との比率が判定され（等式１を参照されたい）、これは、エネルギー移動効率を反映する任意の単位で表される数である。この比率は、エネルギー移動効率が増加するにつれて、増加する（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９を参照されたい）。
【０１８５】
エネルギー移動効率はまた、ドナー放出強度とアクセプター放出強度との反比を使用して表してもよい（等式２を参照されたい）。この場合、比率は、エネルギー移動効率が増加するにつれて、減少する。この計算を行う前に、放出強度を、バックグラウンド光および基質の自己発光の存在について補正する。この補正は、概して、適切な波長で測定された放出強度を、基質を含有するが、生物発光タンパク質、アクセプター分子、または本発明のポリペプチドを含有しない対照試料から差し引くことによって行われる。
Ｅｄ／Ｅａ＝ＢＲＥＴ比          （２）
式中、ＥａおよびＥｄは、上述のように定義される。
【０１８６】
生物発光タンパク質およびアクセプター分子の放出の光強度はまた、蛍光光度計等のモノクロメータに基づく機器、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、またはダイオードアレイ検出器を使用して定量化することができる。蛍光光度計を使用して、放出スキャンは、基質の添加後に生物発光タンパク質およびアクセプター分子の両方の放出ピークが検出されるように、行われる。ピーク下面積は、相対的な光強度を表し、これは、上に概説されるように、比率の計算に使用される。同じ試料から生物発光タンパク質およびアクセプター分子の光を測定することができる任意の機器を使用して、本発明のＢＲＥＴシステムを監視してもよい。
【０１８７】
代替的な実施形態において、アクセプター分子の放出のみが、ＢＲＥＴの効果的な検出および／または定量化に好適である。この場合、エネルギー移動効率は、アクセプター放出強度のみを用いて表される。エネルギー移動を測定するために、いずれの比率計算も行うことなくアクセプター放出強度を使用できることが、当業者には容易に明らかとなろう。これは、理想的には、アクセプター分子が、生物発光タンパク質から移動した光を吸収する場合にのみ光を放出することになるという事実に起因する。この場合、１つのみの光フィルタが必要である。
【０１８８】
関連する実施形態において、生物発光タンパク質の放出のみが、ＢＲＥＴの効果的な検出および／または定量化に好適である。この場合、エネルギー移動効率は、生物発光タンパク質の放出強度のみを用いて計算される。エネルギー移動を測定するために、いずれの比率計算も行うことなくドナー放出強度を使用できることが、当業者には容易に明らかとなろう。これは、アクセプター分子が、生物発光タンパク質から移動した光を吸収するため、生物発光タンパク質からの検出可能な放出には対応する減少が存在するという事実に起因する。この場合、１つのみの光フィルタが必要である。
【０１８９】
代替的な実施形態において、エネルギー移動効率は、測定に１つの光学フィルタのみを必要とするレシオメトリック測定を用いて表される。この場合、適切な光学フィルタを用いてドナーまたはアクセプターの光強度を判定し、試料の別の測定は、いずれのフィルタも用いることなく行われる（オープンスペクトルの強度）。この後者の測定では、（すべての波長の）合計光出力を定量化する。比率計算は、次いで、等式３または４のいずれかを使用して行われる。等式３については、アクセプター用の光学フィルタのみが必要である。等式４については、ドナー用の光学フィルタのみが必要である。
Ｅａ／Ｅｏ−Ｅａ＝ＢＲＥＴ比または＝Ｅｏ−Ｅａ／Ｅａ      （３）
Ｅｏ−Ｅｄ／Ｅｄ＝ＢＲＥＴ比または＝Ｅｄ／Ｅｏ−Ｅｄ      （４）
式中、ＥａおよびＥｄは、上述のように定義され、Ｅｏは、すべての波長を合わせた放出強度として定義される（オープンスペクトル）。
【０１９０】
さらなる等式が、等式１〜４から導出され得ることが、当業者には容易に明らかなはずである。例えば、１つのそのような導出は、生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子の放出波長で存在するバックグラウンド光の補正を伴う。
【０１９１】
ＢＲＥＴアッセイを行う際、光放出は、ＢＲＥＴＣｏｕｎｔを使用して各ウェルから判定することができる。ＢＲＥＴＣｏｕｎｔ機器は、改変型ＴｏｐＣｏｕｎｔであり、ここで、ＴｏｐＣｏｕｎｔは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）から販売されているマイクロタイタープレートシンチレーションおよび発光計数器である。バックグラウンドノイズを排除するために同時に２つの光電子倍増管（ＰＭＴ）を利用する従来の計数器とは異なり、ＴｏｐＣｏｕｎｔは、ノイズ低減に単一ＰＭＴ技術および時間分解パルス計数を利用して、標準的な不透明マイクロタイタープレートでの計数を可能にする。不透明マイクロタイタープレートの使用により、光学的クロストークをごくわずかなレベルまで低減することができる。ＴｏｐＣｏｕｎｔには、１、２、６、および１２個の検出器（ＰＭＴ）を含む種々の形式があり、それぞれ、１、２、６、または１２個の試料の同時読み取りを可能にする。ＢＲＥＴＣｏｕｎｔの他に、他の市販の機器で、ＢＲＥＴを行うことができる：Ｖｉｃｔｏｒ  ２（Ｗａｌｌａｃ，Ｆｉｎｌａｎｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびＦｕｓｉｏｎ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｅｎ）。ＢＲＥＴは、少なくともアクセプター分子の放出、および好ましくは２つまたはそれ以上の波長（アクセプター分子および生物発光タンパク質）を検出することができる読み取り器を使用して行うことができる。
【０１９２】
化学発光
非酵素的化学発光は、触媒の存在下での有機色素と酸化剤との間の化学反応の結果である。化学発光放出は、化学的に誘導される励起状態の有機色素からのエネルギーとして生じ、基底状態へと減衰する。化学発光放出の期間および強度は、主に、反応溶液中に存在する化学試薬の割合に依存する。
【０１９３】
本明細書に使用される際、「生物発光タンパク質」という用語は、好適な基質に作用して、発光を生成することができる任意のタンパク質を指す。
【０１９４】
生物発光タンパク質は、基質を活性化された生成物に変換する酵素であり、この生成物は、次いで、緩和するとエネルギーを放出することが、当該技術分野で理解される。活性化された生成物（基質に対する生物発光タンパク質の活性によって生成される）は、生物発光タンパク質が生成し、アクセプター分子へと移動する発光の源である。
【０１９５】
本発明に利用することができる多数の異なる生物発光タンパク質が存在する（例えば、表１を参照されたい）。発光系は既知であり、細菌、原生動物、腔腸動物、軟体動物、魚類、ヤスデ、ハエ、菌類、蠕虫、甲殻類、および甲虫、特に、ピロフォラス（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ）属のコメツキムシ、ならびにフォティナス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）属、フォティリス（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ）属、およびルキオラ（Ｌｕｃｉｏｌａ）属のホタルを含む、多数の発光性生物から単離されている。生物発光を示すさらなる生物は、ＷＯ００／０２４８７８号、ＷＯ９９／０４９０１９号、およびＶｉｖｉａｎｉ（２００２）に列挙されている。
【０１９６】
１つの非常によく知られた例としては、特異的な生化学物質であるルシフェリン（天然に存在するフルオロフォア）がルシフェラーゼ活性を有する酵素によって酸化される、エネルギー生成化学反応を触媒するルシフェラーゼとして知られるタンパク質のクラスである（Ｈａｓｔｉｎｇｓ，１９９６）。細菌、藻類、菌類、昆虫類、魚類、および他の海洋形態を含む、原核生物および真核生物の両方の非常に多様な生物が、この様式で光エネルギーを放出し得、それぞれが、他の生物のものとは化学的に異なる特異的なルシフェラーゼ活性およびルシフェリンを有する。ルシフェリンルシフェラーゼ系は、形態、化学的性質、および機能が、非常に多様である。ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質は、従って、種々の源から、または種々の手段によって、入手可能である。ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質の例は、ＵＳ５，２２９，２８５号、同第５，２１９，７３７号、同第５，８４３，７４６号、同第５，１９６，５２４号、および同第５，６７０，３５６号に見出すことができる。最も広く使用されているルシフェラーゼのうちの２つは、（ｉ）ウミシイタケルシフェラーゼ（ウミシイタケ由来）、３５ｋＤａのタンパク質であり、基質としてセレンテラジンを使用し、４８０ｎｍで光を放出する（Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）；および（ｉｉ）ホタルルシフェラーゼ（フォティナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来）、６１ｋＤａのタンパク質であり、基質としてルシフェリンを使用し、５６０ｎｍで光を放出する（ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）である。
【０１９７】
ガウシアルシフェラーゼ（ガウシア・プリンセプス（Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ）由来）は、生化学アッセイで使用されている（Ｖｅｒｈａｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ガウシアルシフェラーゼは、急速な反応でセレンテラジンを酸化させ、４７０ｎｍで明るい発光をもたらす、２０ｋＤａのタンパク質である。
【０１９８】
本発明に有用なルシフェラーゼはまた、ヒカリキノコバエ（Ａｎａｃｈｎｏｃａｍｐａ）種（ＷＯ２００７／０１９６３４号）からも特徴付けられている。これらの酵素は、大きさが約５９ｋＤａであり、放出スペクトルが青色スペクトル部分の範囲内に入る、発光反応を触媒するＡＴＰ依存性ルシフェラーゼである。
【０１９９】
天然に存在する生物発光タンパク質の生物学的に活性な変異体またはフラグメントは、当業者によって容易に生成され得る。本発明に有用なそのような変異体の３つの例は、Ｒｌｕｃ２（Ｌｏｅｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、Ｒｌｕｃ８（Ｌｏｅｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、およびＲｌｕｃ８．６−５３５（Ｌｏｅｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）であり、これらは、それぞれ、ウミシイタケルシフェラーゼの変異体である。さらなる好ましい実施形態において、ＢＲＥＴ化学発光ドナーの配列は、天然のウミシイタケルシフェラーゼセンサを組み込んだセンサ分子よりも高い熱安定性を有するように選択される。ＲＬｕｃ２またはＲＬｕｃ８は、好適な選択肢の便宜的な例であり、これらは、結果として、天然のウミシイタケルシフェラーゼ配列を組み込んだセンサよりも５倍以上または１０倍以上高い発光性を呈する。このような強化された発光性は、より低い検出チャンバの容量および／またはより速いオンチップ流量の使用を、検出チャンバ容量と流量との任意の所与の組み合わせでの時間分解能の改善と同時にを可能にするため、大きな利点を有する。あるいは、これは、任意の所与の時間分解能に関してより経済的な試薬の使用を可能にする。
【表１−１】
2019037244.tif 000002
【表１−２】
2019037244.tif 000003
【０２００】
本明細書に使用される際、「生物学的に活性なフラグメント」とは、本明細書に記載されるポリペプチドの一部分であり、これは、全長ポリペプチドの定義される活性を維持する。本明細書に使用される際、「生物学的に活性な変異体」とは、天然に存在する分子および／または定義された分子とは１つ以上のアミノ酸が異なるが、生物学的に活性なフラグメントに関して上に定義されたもの等、定義された活性を維持する、分子である。生物学的に活性な変異体は、典型的に、天然に存在する分子および／または定義された分子に、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９％同一である。
【０２０１】
本発明に利用することができる代替的な非ルシフェラーゼ生物発光タンパク質は、好適な基質に作用して発光シグナルを生成することができる任意の酵素である。そのような酵素の具体的な例は、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、およびβ−グルコシダーゼである。これらの酵素の合成発光性基質は、当該技術分野で周知であり、Ｔｒｏｐｉｘ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）等の企業から市販入手可能である。
【０２０２】
本発明に有用なペルオキシダーゼの例は、Ｈｕｓｈｐｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）によって記載されている。
【０２０３】
好ましい実施形態において、低分子量の生物発光タンパク質を使用して、立体障害に起因する相互作用の阻害を防止する。生物発光タンパク質は、好ましくは、単一のポリペプチド鎖からなる。さらに、生物発光タンパク質は、好ましくは、オリゴマーまたは凝集体を形成しない。生物発光タンパク質であるウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、およびホタルルシフェラーゼは、これらの基準のすべてまたは大部分を満たす。
【０２０４】
基質
本明細書に使用される際、「基質」という用語は、化学発光ドナーと併せて使用して、発光を生成または吸収させることができる任意の分子を指す。基質の選択は、化学発光ドナーによって生成される光の波長および強度に影響を及ぼし得る。
【０２０５】
広く知られている基質は、刺胞動物、橈脚動物、毛顎動物（ｃｈａｅｔｇｎａｔｈ）、有櫛動物、十脚類エビ、アミ類エビ、放散虫類、および一部の魚分類群に発生するセレンテラジンである（Ｇｒｅｅｒ  ａｎｄ  Ｓｚａｌａｙ，２００２）。例えば、ウミシイタケルシフェラーゼについては、４１８〜５１２ｎｍの光放出をもたらすセレンテラジン類似体／誘導体が利用可能である（Ｉｎｏｕｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。セレンテラジン類似体／誘導体（４００Ａ、ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ）は、ウミシイタケルシフェラーゼでは、４００ｎｍで光を放出することが説明されている（ＷＯ０１／４６６９１号）。セレンテラジン類似体／誘導体の他の例は、ＥｎｄｕＲｅｎおよびＶｉｖｉＲｅｎである。
【０２０６】
本明細書に使用される際、「ルシフェリン」という用語は、生物発光が可能な生物で見られる、光を放出する生物学的色素のクラスを指し、これは、酵素ルシフェラーゼの存在下で酸化されて、オキシルシフェリンおよび光の形態でエネルギーを生成する。ルシフェリンまたは２−（６−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）−２−チアゾリン−４−カルボン酸が、ホタルのフォティナス・ピラリスから初めて単離された。それ以来、多数の異なる生物、主に海洋生物、例えば魚類およびイカから、種々の形態のルシフェリンが発見され、研究されてきたが、多くは、陸上生物、例えば、蠕虫、甲虫、および種々の他の昆虫類において特定されている（Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｖｉｖｉａｎｉ，２００２）。
【０２０７】
ルシフェリンには少なくとも５つの一般的な型があり、これらは、それぞれが化学的に異なり、広範な異なる補因子を利用する化学的および構造的に異なるルシフェラーゼによって触媒される。１つ目は、ホタルルシフェリンというホタルルシフェラーゼの基質であり、触媒作用にＡＴＰを必要とする（ＥＣ  １．１３．１２．７）。２つ目は、細菌ルシフェリンであり、一部のイカおよび魚にも見出され、長鎖アルデヒドおよび還元型リン酸リボフラビンからなる。細菌ルシフェラーゼは、ＦＭＮＨ−依存性である。３つ目は、過鞭毛藻類ルシフェリンであり、夜間の海洋のリン光に関与する生物である過鞭毛藻類（海洋性プランクトン）に見出されるテトラピロールクロロフィル誘導体である。過鞭毛藻類ルシフェラーゼは、過鞭毛藻類ルシフェリンの酸化を触媒し、３つの同一で触媒的に活性なドメインからなる。４つ目は、イミダゾロピラジンヴァルグリンであり、これは、ある特定の貝虫類および深海魚、例えば、イサリビガマアンコウ（Ｐｏｒｉｃｈｔｈｙｓ）に見られる。最後は、セレンテラジン（ｃｏｅｌａｎｔｅｒａｚｉｎｅ）（イミダゾールピラジン（ｉｍｉｄａｚｏｌｐｙｒａｚｉｎｅ））であり、放散虫類、有櫛動物、刺胞動物、イカ、橈脚動物、毛顎動物、魚類、およびエビに見られる、タンパク質エクオリンの光放出物質である。
【０２０８】
アクセプター分子
本明細書に使用される際、「蛍光性アクセプタードメイン」という用語（本明細書において「アクセプター分子」とも称される）は、化学発光ドナー活性の結果として放出されたエネルギーを受け取り、光エネルギーとして再放出することができる、任意の化合物を指す。本発明に利用することができる多数の異なるアクセプター分子が存在する。アクセプター分子は、タンパク質であってもよく、または非タンパク質性であってもよい。タンパク質であるアクセプター分子の例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光変異体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光変異体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光変異体（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｏｐａｚ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｔ−ｄｉｍｅｒ２、ｔ−ｄｉｍｅｒ２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポキロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）、ウミシイタケＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ  ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質、もしくはフィコビリタンパク質、またはこれらのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質ではないアクセプター分子の例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、Ｃｙ色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光性ミクロスフェア、発光性ミクロスフェア、蛍光性ナノ結晶、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、テキサスレッド、希土類元素キレート、またはこれらの任意の組み合わせもしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
１つの非常によく知られた例は、クラゲのオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質、ならびに分子生物学の適用、例えば、突然変異生成およびキメラタンパク質技術により生じる多数の他の変異体（ＧＦＰ）を含む、フルオロフォアである（Ｔｓｉｅｎ，１９９８）。ＧＦＰは、それらの発色団の独特の成分に基づいて分類され、各クラスは、異なる励起および放出波長を有する：クラス１、中性フェノールとアニオン性フェノラートとの野生型混合物：クラス２、フェノラートアニオン：クラス３、中性フェノール：クラス４、積み重なったｓ電子系を有するフェノラートアニオン：クラス５、インドール：クラス６、イミダゾール：およびクラス７、フェニル。
【０２１０】
突然変異されている天然に存在するアクセプター分子（変異体）もまた、本発明に有用であり得る。ＢＲＥＴに好適な組み換え系の一例は、媒介タンパク質（複数可）（この場合、Ｇタンパク質共役型受容体）の不在下において単独では互いにそれほど直接的に相互作用しない、ウミシイタケルシフェラーゼとＧＦＰの高感度黄色突然変異体（ＥＹＦＰ）との対である（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０２１１】
別の実施形態において、アクセプター分子は、蛍光性ナノ結晶である。ナノ結晶、または「量子ドット」は、光分解耐性、明るさの改善、非毒性、および複数のプロセスを同時に監視することを可能にする寸法依存性の狭い放出スペクトルを含む、蛍光標識として有機分子を上回る複数の利点を有する。さらに、ナノ結晶の吸収スペクトルは、最初のピークを連続的に上回り、すべての寸法、およびしたがってすべての色が、単一の励起波長により励起されることを可能にする。
【０２１２】
蛍光性ナノ結晶は、種々の方法でタンパク質に結合、または「生体共役（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」させることができる。例えば、「量子ドット」の表面キャップを、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）または両親媒性ポリマーのいずれかに由来するカルボキシレート基を用いて負に荷電させることができる。タンパク質を、直接、または組み換えタンパク質に融合された正に荷電したロイシンジッパーペプチドからなる架橋を介してのいずれかで、静電的にＤＨＬＡ−ナノ結晶に共役させることができる。後者は、意図される標的に対する特異性により一次抗体に結合する。あるいは、抗体、ストレプトアビジン、または他のタンパク質は、従来のカルボジイミド化学によって、ナノ結晶のポリアクリル酸キャップに共有結合される。
【０２１３】
セレン化カドミウム、硫化カドミウム、ヒ化インジウム、およびリン化インジウムを含む、ナノ結晶を生成するためのコロイド法がある。これらの量子ドットは、量子ドットの体積内に１００〜１００，０００個程度の原子を含有し得、直径は１０〜５０個の原子である。一部の量子ドットは、一方の材料がもう一方に埋め込まれ、大きなバンドギャップを有する小さな領域である。これらは、いわゆるコアシェル構造、例えば、コアがＣｄＳｅでありシェルがＺｎＳであるもの、またはオルモシルと称されるシリカの特殊な形態に由来するものであり得る。ドットが大きいほど、その蛍光スペクトルは赤く（低エネルギーに）なる。逆に、小さいドットほど、青い（高エネルギーの）光を放出する。色合いは、量子ドットのエネルギーレベルに直接関連する。定量的に言うと、蛍光の光のエネルギー（およびしたがって色）を決定するバンドギャップエネルギーは、量子ドットの寸法の二乗に反比例する。大きな量子ドットほど、より狭い間隔のより高いエネルギーレベルを有する。これは、量子ドットが低いエネルギーを含有する光子、すなわち、スペクトルの赤色末端に近いものを吸収することを可能にする。
【０２１４】
代替的な実施形態において、アクセプター分子は、蛍光性ミクロスフェアである。これらは、典型的に、ポリマーから作製され、種々の試薬に共役させることができるポリマーマトリックスに組み込まれた蛍光性分子（例えば、フルオレセインＧＦＰまたはＹＦＰ）を含有する。蛍光性ミクロスフェアは、内部または表面を標識化することができる。内部標識化により、典型的には狭い蛍光放出スペクトルを有する非常に明るく安定した粒子が生成される。内部標識化すると、表面の基は、リガンド（例えば、タンパク質）をビーズの表面に共役させるために利用可能なままとなる。内部標識化したビーズは、それらが光退色に対して高い耐性を示すため、画像化用途で広く使用される。
【０２１５】
カルボキシレート修飾蛍光性ミクロスフェアは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）等の水溶性カルボジイミド試薬を使用したタンパク質の共有結合に好適である。硫酸塩蛍光性ミクロスフェアは、比較的疎水性であり、ほぼすべてのタンパク質に受動的かつほぼ不可逆的に吸着する。アルデヒド−硫酸塩蛍光性ミクロスフェアは、表面アルデヒド基を付加し、タンパク質と反応するように修飾されている、硫酸塩ミクロスフェアである。
【０２１６】
別の実施形態において、アクセプター分子は、発光性ミクロスフェアである。これらは、典型的に、ポリマーから作製され、種々の試薬に共役させることができる、ポリマーマトリックスに組み込まれた発光性分子（例えば、ユーロピウムまたは白金の複合体）を含有する。
【０２１７】
本発明に有用な非蛍光性アクセプタードメインの例には、ＤＡＢＣＹＬ［４−（（４−（ジメチルアミノ）フェンリウ）アゾ）安息香酸］、ＤＡＢＳＹＬ（ジメチルアミノアゾスルホン酸）、金および銀等の金属ナノ粒子、ラックホール消光剤（ｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）（ＢＨＱ）、およびＱＸＬ消光剤といった、消光剤が挙げられる。
【０２１８】
化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとの対
本明細書に使用される際、「化学発光ドナードメインとアクセプタードメインとの距離および相対配向は、検体の存在下および／または不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である」という用語は、Ｒ０の±５０％以内で実行され得る、安定状態のＲＥＴ測定値を指す。この語句は、１０〜９０％の範囲内の化学発光ドナードメインからアクセプタードメインへの発光エネルギー移動効率を包含する。これらの距離限界を超えると、距離の推定は依然として可能であるが、不確かさが増加する。
【０２１９】
好適な対合を判定する際に考慮すべき基準は、ドナーのものと比較したアクセプター分子の相対放出／蛍光スペクトルである。ドナーの放出スペクトルは、ドナー発光放出からの光エネルギーが、２つの分子が適正に近接し互いに対して適正な配向にある場合に、アクセプター分子を励起し、それによってアクセプター分子の蛍光を促進することができるように、アクセプター分子の吸収スペクトルと重複する必要がある。例えば、観察可能な放出スペクトルピークに基づいて、ウミシイタケルシフェラーゼ／ＥＧＦＰの対合は、ウミシイタケルシフェラーゼ／ＥＹＥＦの対合ほど良好でないことが実証されている（Ｘｕ，１９９９；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ｉｎ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｎｓ，ｅｄｓ．Ｈａｓｔｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．４１９−４２２）。可能性のある対合を研究するために、選択された生物発光タンパク質およびアクセプター分子を含有するタンパク質融合体（例えば）を調製し、適切な基質の存在下で試験する。
【０２２０】
ドナーおよびアクセプター分子が、誤って互いと結合しないこともまた確認する必要がある。これは、例えば、同じ細胞において、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を別個に共発現させ、次いで、ＢＲＥＴが生じるかを判定するために発光スペクトルを監視することによって達成され得る。これは、例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）の方法を用いて達成することができる。選択された生物発光タンパク質およびアクセプター分子は、ＢＲＥＴがほとんど観察されないか、または全く観察されない場合、好適なＢＲＥＴ対を形成する。
【０２２１】
ドナー放出は、基質に対する修飾によって操作することができる。ルシフェラーゼの場合、基質はセレンテラジンである。ドナー放出を変化させることの背後にある論理的根拠は、ドナー放出とアクセプター放出との間の分解能を改善することである。元のＢＲＥＴシステムは、ウミシイタケルシフェラーゼをドナーとして、ＥＹＦＰ（またはＴｏｐａｚ）をアクセプターとして、そしてセレンテラジンｈ誘導体を基質として使用する。これらの構成成分は、ＢＲＥＴアッセイにおいて組み合わせた場合、生物発光タンパク質については４７５〜４８０ｎｍの範囲で、アクセプター分子については５２５〜５３０ｎｍの範囲で光を生成し、４５〜５５ｎｍのスペクトル分解能が得られる。
【０２２２】
残念ながら、ウミシイタケルシフェラーゼでは、実質的にＧＦＰ放出と重複する広い放出ピークが生成され、これが、システムのシグナル対ノイズの低下に寄与する。ｃｏｅｌ４００ａをウミシイタケルシフェラーゼの基質として使用する本発明の１つのＢＲＥＴシステムは、ドナーとアクセプターとの放出波長間に広範なスペクトル分解能をもたらす（−１０５ｎｍ）。ｃｏｅｌ４００ａを用いるとウミシイタケルシフェラーゼは３９０〜４００ｎｍで光を生成し、この範囲内で光を吸収して５０５〜５０８ｎｍで光を再放出するＧＦＰが調製された。ウミシイタケルシフェラーゼとＧＦＰ放出との間のこのスペクトル分解能の増加により、このＢＲＥＴシステムは、本発明のポリペプチドの構造における小さな変化を監視するための優れた生物学的ツールをもたらす。これは、ドナーとアクセプターとの間の波長の差がおおよそ５１ｎｍである、セレンテラジンｈ誘導体およびＥＹＦＰを使用する以前に記載されたシステムを上回る著しい改善である。
【０２２３】
ウミシイタケルシフェラーゼ活性の結果として、種々の波長で光を生成する（野生型セレンテラジンによって生成されるものとは異なる）、ｃｏｅｌ４００ａを含む種々のセレンテラジン誘導体が当該技術分野で既知である。当業者であれば、ドナーの光放出ピークが変化したため、この波長で光を吸収するアクセプター分子を選択し、それによって効率的なエネルギー移動を可能にすることが必要であることを理解するであろう。これは、例えば、ＧＦＰクラス４を、クラス３または１のＧＦＰとなるように、変化させることによって行うことができる。ドナーの光放出とアクセプターの光吸収ピークとの間のスペクトル重複は、中でも、効率的なエネルギー移動の条件の１つである。クラス３および１のＧＦＰは、４００ｎｍで光を吸収し、５０５〜５１１ｎｍで再放出することが既知である。これは、おおよそ１１１ｎｍのドナーとアクセプターの放出波長の差をもたらす。
【０２２４】
さらなる生物発光タンパク質とアクセプター分子との対の例を、表２に提供する。
【０２２５】
センサ分子
本明細書に使用される際、「センサ分子」という用語は、任意の分子、２つ以上の共有結合または非共有結合で結合した分子複合体、またはドナーとアクセプターとの間のＲＥＴを可能にするように少なくともある段階で緊密に結合した２つ以上の分子を指す。さらに、存在する場合、ドメインを形成する２つ以上の別個の分子は、中間分子を介して結合されてもよい。一例において、センサ分子は、タンパク質複合体であり得、ここで、この複合体の各サブユニットは非共有結合で結合し、アクセプターおよびドメインは、タンパク質複合体の同じかまたは異なるサブユニット上にあり得る。別の例において、センサ分子は、一方がアクセプターで標識化され、他方がドナーで標識化される、２つの別個の核酸鎖であり、その結果、対象（検体）へのハイブリダイゼーションにより、ドナーとアクセプターがＲＥＴをもたらすのに十分に近接することになる。この例において、センサ分子は、検体に結合する際に形成されると考えることができる。
【表２−１】
2019037244.tif 000004
【表２−２】
2019037244.tif 000005
【表２−３】
2019037244.tif 000006
【０２２６】
検体（または候補化合物）に結合するドメインはいずれも、それが、ドナーおよびアクセプターと適切に結合し得る限り、どのような分子でもある。
【０２２７】
ある実施形態において、検体に結合するドメインは、タンパク質または核酸である。好ましい実施形態において、このドメインはタンパク質である。ある実施形態において、タンパク質は、１つ以上の検体（リガンド）に結合する天然のタンパク質であるか、または検体（リガンド）結合活性を保持するタンパク質の変異体である。例としては、受容体、臭気物質結合タンパク質、フェロモン結合タンパク質、酵素（例えば、プロテアーゼ、オキシダーゼ、フィターゼ、キチナーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシレナーゼ（ｘｙｌｅｎａｓｅ）、キナーゼ、ホスファターゼ、エロンガーゼ、トランスフェラーゼ、デサチュラーゼ）、リガンド担体、または細菌周辺質結合タンパク質が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。ある実施形態において、受容体は、嗅覚受容体または味覚受容体（例えば、Ｄｏｔｙ，２０１２に記載されるものといった甘味、苦味、または旨味受容体）等のＧタンパク質共役型受容体である。さらなる実施形態において、嗅覚受容体または味覚受容体は、線形動物もしくは脊椎動物に由来するか、またはそれらの突然変異体である。
【０２２８】
一実施形態において、センサ分子は、無細胞組成物として提供される。本明細書に使用される際、「無細胞組成物」とは、あるとしてもごくわずかな無傷細胞を含有し、センサ分子を構成する、単離組成物を指す。無細胞組成物の例には、単離および／または組み換えセンサ分子（タンパク質等）を含有する細胞（酵母細胞等）抽出液および組成物が挙げられる。細胞から無細胞組成物を調製する方法は、当該技術分野で周知であり、ＷＯ２０１０／０８５８４４号に記載される。ある特定の実施形態において、センサ分子は、細胞または無細胞抽出液で、リポソーム調製物等の脂質二重層に埋め込まれる。
【０２２９】
Ｇタンパク質共役型受容体
本明細書に使用される際、別途示されない限り、「Ｇタンパク質共役型受容体」という用語は、Ｇタンパク質を通じてシグナル伝達を行う７回膜貫通受容体を指す。
この受容体は、単一のサブユニットであってもよく、または２つ以上の受容体サブユニットであってもよい。２つ以上の受容体サブユニットが存在する場合、それらは、同じであるか、異なるか、またはそれらの組み合わせ（例えば、一方のサブユニットが２つと、もう一方のサブユニットが１つ）であり得る。さらに、別途指示または暗示されない限り、「Ｇタンパク質共役型受容体」および「Ｇタンパク質共役型受容体のサブユニット」という用語、またはそれらの変化形は、互換的に使用される。
【０２３０】
本明細書に使用される際、「嗅覚受容体」、「嗅受容体」、「ＯＲ」という用語、またはそれらの変化形は、生物の細胞中に存在する場合、化学感覚的知覚に関与するポリペプチドを指す。ある実施形態において、細胞は、ニューロンである。さらに、「嗅覚受容体」または「嗅受容体」とは、臭気物質リガンドに結合するか、または臭気物質リガンドに結合するタンパク質複合体の一部を形成し、生理学的応答をもたらす、ポリペプチドを指す。
【０２３１】
本明細書に使用される際、「の一部を形成する」という用語は、生物発光タンパク質またはアクセプター分子が、Ｇタンパク質共役受容体またはそのサブユニットの特定の領域内に位置付けられていることを意味する。この用語にはまた、生物発光タンパク質および／またはアクセプター分子が、Ｇタンパク質共役型受容体に付着または結合するが、連続的なアミノ酸鎖を形成しない可能性も含まれる。一実施形態において、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、Ｇタンパク質共役型受容体の特定の領域を完全に置き換える。別の実施形態において、Ｇタンパク質共役型受容体の特定の領域の一部が置き換えられるが、すべては置き換えられない。さらなる別の実施形態において、Ｇタンパク質共役型受容体の特定の領域のいずれも、置き換えられない。当業者には理解されるように、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、それが、ポリペプチドのＧタンパク質共役型受容体部分が検体に結合してアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の位置および／または双極子配向に空間的変化をもたらすことができないように挿入されることはない。
【０２３２】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、７回膜貫通受容体、７ＴＭ受容体、蛇形受容体、ヘリックス受容体、およびＧタンパク質結合型受容体（ＧＰＬＲ）としても知られている。ＧＰＣＲは、細胞外で分子を感知し、内部シグナル伝達経路、および最終的には細胞応答を活性化させる、膜貫通受容体の大きなタンパク質ファミリーである。これらの受容体に結合し、活性化するリガンドには、光感受性化合物、臭気物質、フェロモン、ホルモン、および神経伝達物質が挙げられ、これは、小分子から、ペプチド、大型タンパク質まで、寸法が多様である。ＧＰＣＲは、多数の疾患に関与しているが、すべての現代の医薬品のうち約半数の標的でもある。ＧＰＣＲは、配列の相同性および機能的類似性に基づいて、少なくとも５つの分類に分けることができる：
クラスＡ  ロドプシン様、
クラスＢ  セクレチン様、
クラスＣ  代謝調節型／フェロモン、
クラスＤ  真菌性フェロモン、および
クラスＥ  ｃＡＭＰ受容体。
【０２３３】
クラスＡのロドプシン様受容体には：アミン受容体：アセチルコリン、αアドレナリン受容体、βアドレナリン受容体、ドーパミン、ヒスタミン、セロトニン、オクトパミン、および微量アミン；ペプチド受容体：アンジオテンシン、ボンベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、Ｆｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、ＡＰＪ様、インターロイキン−８、ケモカイン受容体（Ｃ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、ＢＯＮＺＯ受容体（ＣＸＣ６Ｒ）、Ｃ−Ｘ３−Ｃケモカイン、およびＸＣケモカイン）、ＣＣＫ受容体、エンドセリン受容体、メラノコルチン受容体、神経ペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、ソマトスタチン受容体、タキキニン受容体、（物質Ｐ（ＮＫ１）、物質Ｋ（ＮＫ２）、ニューロメジンＫ（ＮＫ３）、タキキニン様１、およびタキキニン様２）、バソプレシン様受容体（バソプレシン、オキシトシン、およびコノプレシン）、ガラニン様受容体（ガラニン、アラトスタチン、およびＧＰＣＲ５４）、プロテイナーゼ活性化様受容体（例えば、トロンビン）、オレキシン＆神経ペプチドＦＦ、ウロテンシンＩＩ受容体、アドレノメジュリン（Ｇ１０Ｄ）受容体、ＧＰＲ３７／エンドセリンＢ様受容体、ケモカイン受容体様受容体、およびニューロメジンＵ受容体；ホルモンタンパク質受容体：卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−絨毛性ゴナドトロピンホルモン、チロトロピン、およびゴナドトロピン；オプシン（ロドプシン）受容体；嗅受容体；プロスタノイド受容体：プロスタグランジン、プロスタサイクリン、およびトロンボキサン；ヌクレオチド様受容体：アデノシンおよびプリン受容体；カンナビス受容体；血小板活性化因子受容体；ゴナドトロピン放出ホルモン受容体；チロトロピン放出ホルモンおよび分泌促進因子受容体：チロトロピン放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進因子、および成長ホルモン分泌促進因子様；メラトニン受容体；ウイルス受容体；リゾスフィンゴ脂質およびＬＰＡ（ＥＤＧ）受容体；ロイコトリエンＢ４受容体：ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴｌおよびロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ２；ならびにクラスＡのオーファン／他の受容体：血小板ＡＤＰおよびＫＩ０１受容体、ＳＲＥＢ、Ｍａｓ癌原遺伝子、ＲＤＣ１、ＯＲＰＨ、ＬＧＲ様（ホルモン受容体）、ＧＰＲ、ＧＰＲ４５様、システイニルロイコトリエン、Ｍａｓ関連受容体（ＭＲＧ）、ならびにＧＰ４０様受容体が挙げられる。
【０２３４】
ＧＰＣＲのクラスＢ（セクレチン受容体ファミリー）には、ポリペプチドホルモンの受容体（カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、胃抑制ペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１，−２、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、血管作用性腸管ポリペプチド、利尿ホルモン、ＥＭＲ１、ラトロフィリン）、原形質膜で細胞間相互作用を媒介すると見られる分子（脳特異的血管新生阻害因子（ＢＡＩ））、ならびにストレス応答および寿命を調節するショウジョウバタエンパク質（メトセラ（Ｍｅｔｈｕｓｅｌａｈ）様タンパク質）が挙げられる。
【０２３５】
クラスＣの代謝調節型グルタミン酸／フェロモン受容体には、代謝調節型グルタミン酸、代謝調節型グルタミン酸Ｉ群、代謝調節型グルタミン酸ＩＩ群、代謝調節型グルタミン酸ＩＩＩ群、代謝調節型グルタミン酸その他、細胞外カルシウム感知、推定上のフェロモン受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ１、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ２、およびオーファンＧＰＲＣ５受容体が挙げられる。
【０２３６】
本発明に有用なセンサ分子は、Ｇタンパク質共役型受容体を含み得、これは、細胞に発現する際、受容体のＮ末端が細胞外にあり、Ｃ末端が細胞内にある。当業者であれば、膜貫通タンパク質の配向を検出するための好適な技術を理解している。そのような技術には、結晶学、ＮＭＲ研究、モデリング研究、ならびに顕微鏡技術、例えば、光学または電子顕微鏡標本の界面活性剤透過化対照と組み合わせた免疫標識、２つのポリペプチドのフラグメント相補性タグ化等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３７】
好ましい実施形態において、Ｇタンパク質共役型受容体は、クラスＡのＧＰＣＲである。さらなる好ましい実施形態において、クラスＡ（ロドプシン様）ＧＰＣＲは、嗅覚受容体、ドーパミン受容体、ムスカリン受容体、またはアドレナリン作動性受容体であり、より好ましくは嗅覚受容体である。嗅覚受容体は、細胞に発現する際に、受容体のＮ末端が細胞外にあり、Ｃ末端が細胞内にある限り、いずれの源に由来するものであってもよい。例としては、脊索動物受容体、線形動物受容体、またはそれらのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。脊索動物受容体の例には、哺乳動物受容体、鳥類受容体、および魚類受容体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、嗅覚受容体は、線形動物受容体、またはその生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントである。ある実施形態において、線形動物受容体は、線虫受容体、またはその生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントである。本発明のポリペプチドを生成するために使用され得る、および／または本発明の方法で使用され得る、嗅覚受容体は、Ｂｕｃｋ  ａｎｄ  Ａｘｅｌ（１９９１）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（１９９８  ａｎｄ  ２００１）、Ａｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）、Ｆｅｌｄｍｅｓｓｅｒ（２００６）、Ｏｌｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４ａ  ａｎｄ  ｂ）、Ｇｌｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００ａ，  ２０００ｂ  ａｎｄ  ２００１）、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、Ｐｉｌｐｅｌ  ａｎｄ  Ｌａｎｃｅｔ（１９９９）、Ｓｈａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、Ｚｏｚｕｌｙａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、Ｎｉｉｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｎｅｉ（２００３）、Ｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ（２００２）、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）、およびＦｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｏｔｈ（２００５）に記載される。さらに、嗅覚受容体の包括的な一覧は、ＳｅｎｓｅＬａｂのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｎｓｅｌａｂ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ）から入手可能である。
【０２３８】
他の実施形態において、ＧＰＣＲは、クラスＢまたはクラスＣの受容体であり、これらの２つの実施形態のうちではクラスＣがより好ましい。
【０２３９】
特に好ましい実施形態において、Ｇタンパク質共役型受容体は、７回膜貫通ドメインを含む。
【０２４０】
生物発光タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体（または本発明のポリペプチド）の１、３、５つ目の非膜貫通ループ（ドメイン）またはＣ末端の一部を形成し得る。アクセプター分子もまた、Ｇタンパク質共役型受容体（または本発明のポリペプチド）の１、３、５つ目の非膜貫通ループ（ドメイン）またはＣ末端の一部を形成し得る。これらの領域のそれぞれは、Ｇタンパク質共役型受容体が細胞に発現しそこに存在する際、細胞内にある。
【０２４１】
アクセプター分子は、同じ分子の一部（すなわち、同じ単一のポリペプチド鎖）であるとき、生物発光タンパク質と同じ領域内には存在し得ないが、アクセプター分子は、Ｇタンパク質共役型受容体が二量体またはより高度な多量体として存在する場合、生物発光タンパク質と同等の領域内にあり得る。例えば、生物発光タンパク質は、受容体の１つのサブユニットのＣ末端の一部を形成し得、アクセプター分子は、受容体の別のサブユニットのＣ末端の一部を形成し得る。この例において、標識が結合されるサブユニットは、同じかまたは異なり得、例えば、２つのサブユニットが、１つが生物発光タンパク質で標識化され、他方がアクセプター分子で標識化されることを除き、同一であってもよい。
【０２４２】
一実施形態において、生物発光タンパク質は、ＧＰＣＲサブユニットの３つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子は、５つ目の非膜貫通ループの一部を形成する。代替的な実施形態において、アクセプター分子は、ＧＰＣＲサブユニットの３つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は、５つ目の非膜貫通ループの一部を形成する。
【０２４３】
別の実施形態において、生物発光タンパク質は、ＧＰＣＲサブユニットの１つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子は、３つ目の非膜貫通ループの一部を形成する。別の実施形態において、アクセプター分子は、ＧＰＣＲサブユニットの１つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は、３つ目の非膜貫通ループの一部を形成する。
【０２４４】
好ましい実施形態において、生物発光タンパク質は、ＧＰＣＲサブユニットの５つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子は、Ｃ末端の一部を形成する。代替的な実施形態において、アクセプター分子は、ＧＰＣＲサブユニットの５つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は、Ｃ末端の一部を形成する。
【０２４５】
別の実施形態において、Ｇタンパク質共役型受容体は、少なくとも２つのサブユニットを含み、ここで、生物発光タンパク質は、第１のサブユニットの３つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子は、第２のサブユニットの５つ目の非膜貫通ループの一部を形成する。代替的な実施形態において、アクセプター分子は、第１のサブユニットの３つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は、第２のサブユニットの５つ目の非膜貫通ループを形成する。
【０２４６】
別の実施形態において、Ｇタンパク質共役型受容体は、少なくとも２つのサブユニットを含み、ここで、生物発光タンパク質は、第１のサブユニットの１つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子は、第２のサブユニットの３つ目の非膜貫通ループの一部を形成する。別の実施形態において、アクセプター分子は、第１のサブユニットの１つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は、第２のサブユニットの３つ目の非膜貫通ループを形成する。
【０２４７】
別の実施形態において、Ｇタンパク質共役型受容体は、少なくとも２つのサブユニットを含み、ここで、生物発光タンパク質は、第１のサブユニットの５つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子は、第２のサブユニットのＣ末端の一部を形成する。代替的な実施形態において、アクセプター分子は、第１のサブユニットの５つ目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質は、第２のサブユニットのＣ末端の一部を形成する。
【０２４８】
別の実施形態において、Ｇタンパク質共役型受容体は、少なくとも２つのサブユニットを含み、ドナーおよびアクセプター分子は、それぞれ、第１および第２のサブユニットの同じ部位にある。
【０２４９】
ある実施形態において、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、５つ目の膜貫通ドメインの２番目のアミノ酸の後、かつ６つ目の膜貫通ドメインの開始前の２つ目のアミノ酸の前に位置する。別の実施形態において、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、５つ目の膜貫通ドメインの後、アミノ酸８付近の後ろ、または５つ目の膜貫通ドメインの後、アミノ酸２２付近の後ろに位置する。さらなる実施形態において、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、６つ目の膜貫通ドメインから約１０または１２個のアミノ酸の前に挿入される。最も好ましくは、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、３つ目の非膜貫通ループ（ドメイン）の中央に位置する。
【０２５０】
Ｃ末端に関しては、天然のＣ末端の約５〜２５個のアミノ酸が、７つ目の膜貫通ドメインに残ることが好ましい。好ましくは、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、７つ目の膜貫通部分の後、約１６または２０個のアミノ酸の後に挿入される。
【０２５１】
１つ目の非膜貫通ループ（ドメイン）における生物発光タンパク質またはアクセプター分子の位置については、前記標識を、１つ目の膜貫通ドメインの末端から約２個のアミノ酸の後、かつ２つ目の膜貫通ドメインの開始から約２個のアミノ酸の前に挿入することが好ましい。最も好ましくは、生物発光タンパク質またはアクセプター分子は、１つ目の非膜貫通ループ（ドメイン）の中央に位置する。
【０２５２】
さらなる実施形態において、生物発光タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体（または本発明のポリペプチド）のＮ末端、２、４、または６つ目の非膜貫通ループ（ドメイン）の一部を形成し得る。アクセプター分子もまた、Ｇタンパク質共役型受容体（または本発明のポリペプチド）のＮ末端、２、４、または６つ目の非膜貫通ループ（ドメイン）の一部を形成し得るが、それは、同じ分子の一部である場合、生物発光タンパク質と同じ領域内にある可能性はない。これらの領域のそれぞれは、Ｇタンパク質共役型受容体が細胞に発現しそこに存在するとき、細胞外にある。
【０２５３】
ＧＰＣＲは、２つ以上の異なるＧＰＣＲの非天然のキメラであり得る。具体的には、これにより、１つの受容体の部分が、常に、検出される化合物に応じて多様なＧＰＣＲの他の部分が挿入されるキメラで存在する、形質導入カセットの生成を可能にする。
【０２５４】
一実施形態において、サブユニットは、第１のＧタンパク質共役型受容体サブユニットのＮ末端および１つ目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分、第２のＧタンパク質共役型受容体サブユニットの１つ目の非膜貫通ループの少なくとも大部分から５つ目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分まで、ならびに第１のＧタンパク質共役型受容体サブユニットの５つ目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からＣ末端まで、を含む。
【０２５５】
別の実施形態において、サブユニットは、第１のＧタンパク質共役型受容体サブユニットのＮ末端から５つ目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分まで、および第２のＧタンパク質共役型受容体サブユニットの５つ目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からＣ末端まで、を含む。
【０２５６】
本明細書に使用される際、Ｇタンパク質共役型受容体の指定部分（ドメイン）の「少なくとも大部分」という用語は、指定領域の少なくとも５１％、より好ましくは少なくとも７５％、およびさらにより好ましくは少なくとも９０％を指す。
【０２５７】
当業者であれば、Ｇタンパク質共役型のＮ末端、膜貫通ドメイン、非膜貫通ループ（ドメイン）、およびＣ末端を容易に判定することができる。例えば、種々の生物情報学アプローチを用いて、タンパク質における膜貫通ドメインの位置およびトポロジーを、そのアミノ酸配列およびＧタンパク質共役型受容体の既知の膜貫通ドメインとの類似性に基づいて、判定することができる。アライメントおよびアミノ酸配列比較は、例えば、ＢＬＡＳＴプログラムまたはＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラムを使用して、当該技術分野で日常的に行われている。既知の膜貫通ドメイン含有タンパク質とのアライメントに基づいて、当業者であれば、膜貫通ドメインの位置を予測することが可能であり、さらに、一部の膜貫通タンパク質の３次元構造が既知であり、例えば、７回膜貫通Ｇタンパク質共役型ロドプシン光受容体構造が、Ｘ線結晶学によって解析されている。そのような３Ｄ構造の分析および比較に基づいて、他の膜タンパク質における膜貫通ドメインの位置およびトポロジーを予測することが可能であり得る。また、タンパク質における膜貫通ドメインの位置およびトポロジーを予測するために利用可能な多数のプログラムがある。例えば、膜貫通タンパク質のセグメントを予測するＴＭｐｒｅｄ（Ｈｏｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｆｆｅｌ，１９９３）；膜タンパク質のトポロジーを予測するＴｏｐＰｒｅｄ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）；単一または複数の配列から２次構造ＰＲＥＤＡＴＯＲ（Ｆｒｉｓｈｍａｎ  ａｎｄ  Ａｒｇｏｓ，１９９７）；多重アライメントを行った配列からタンパク質の膜貫通領域を予測するＴＭＡＰ（Ｐｅｒｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｒｇｏｓ，１９９４）；および単一の配列から膜貫通領域を予測するＡＬＯＭ２（Ｋｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）のうちの１つまたは組み合わせを使用することができる。
【０２５８】
標準的な命名法に従って、膜貫通ドメインおよび非膜貫通ループ（ドメイン）の番号付けは、ポリペプチドのＮ末端に関して行う。
【０２５９】
２−ペンタノンに結合する線虫の変異体ｓｔｒ−１１２（配列番号４１）および／またはｓｔｒ−１１３（配列番号４２）には、ｓｔｒ−１１２（配列番号４１）および／またはｓｔｒ−１１３（配列番号４２）に少なくとも９０％同一な分子、ｓｔｒ−１１２（配列番号４１）および／またはｓｔｒ−１１３（配列番号４２）に少なくとも９０％同一な生物学的に活性なフラグメント、ならびにｓｔｒ−１１４／１１３（配列番号４３）等それらの融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、同一性％を判定する際、配列番号１３、１４、１８、２７、２８、および３０におけるアクセプターおよびドナー等、標識を含むタンパク質の部分は、好ましくは無視されることを理解するであろう。
【０２６０】
核酸
一実施形態において、ドメイン（または目的の分子）は核酸である。当業者には理解されるように、核酸結合に依存する多数の検出システムがあり、これは本発明の方法で使用するために適合される。
【０２６１】
分子標識（ＭＢ）は、均質溶液中の特定の核酸を検出するのに有用なプローブの構築において広く研究されている。ＭＢは、ステムアンドループ構造を有し、５’および３’末端においてＢＲＥＴ構成成分で標識化される、単一の標準的な核酸配列からなる。５’および３’末端の近接性は、エネルギー移動を発生させる。標的ＤＮＡ配列は、プローブ核酸配列とハイブリダイズして、ＢＲＥＴ構成成分を引き離し、ＢＲＥＴ比の減少をもたらす。フルオロフォア−アクセプター対の組み合わせが研究されているが、この方法は、核酸の自己蛍光を引き起こし得る励起源が必要であるという欠点がある。フルオロフォアを生物発光タンパク質と置き換えることにより、この問題が克服される。
【０２６２】
別の例において、アクセプターおよびドナーは、それぞれが同じ標的核酸配列の別の部分に相補的な２つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合し得る。標的配列の異なる部分は、標的核酸配列内で近接して位置する。ＢＲＥＴ構成成分は、標的核酸とのハイブリダイゼーションにより近接近し、ＢＲＥＴ比の増加をもたらす。
【０２６３】
さらなる例において、標的核酸の不在下で、アクセプターおよびドナーで標識化された相補的オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズすることにより、エネルギー移動がもたらされる。標的核酸の存在下では、標的およびドナーで標識化されたものは、アクセプタータンパク質とのハイブリダイズをめぐって競合し、したがって、ＢＲＥＴ比を低下させる。ＢＲＥＴ比の減少は、試料中に存在する総核酸量と相関性がある。
【０２６４】
使用
本発明を使用して、揮発性および不揮発性の有機小分子、巨大分子、ならびに生物学的粒子および細胞を含む、広範な種類の検体の存在もしくは不在または濃度を検出することができる。本発明は、Ｇタンパク質共役型および他の受容体、結合タンパク質、酵素、ペプチド、ならびに核酸分子を含む、化学発光伝達システムに機能的に連結させることができる、ほとんどすべての生物学的認識要素と適合性がある。本発明のマイクロ流体方法の使用例は、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｌｉｎ（２００９）、Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）、Ｔｈｅｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）、Ｍｏｈａｍｍｅｄ  ａｎｄ  Ｄｅｓｍｕｌｌｉｅｚ（２０１１）、Ｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）、Ｙｅｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）、Ｎｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）、およびＧｏｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）に記載されている。
【０２６５】
特に好ましい実施形態において、検体は臭気物質である。典型的に、臭気物質は、少なくとも１つの生物の化学感覚的嗅覚受容体によって検出され得る揮発性の有機もしくは無機化合物または無機ガスであろう。これらには、アミンおよび／またはスルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｙｒｌ）含有化合物、カルボン酸、アルコール、アルデヒド、アルカン、アルケン、芳香族化合物、エステル、テルペンまたはテルペン誘導体、エーテル、ＣＯ２等、ならびにこれらの特徴の組み合わせを有する化合物が含まれ得る。
【０２６６】
臭気物質は、ヒトにとって価値があるかまたは興味深い、何らかの生物学的もしくは化学的状態を示し得る。そのような提示には次のものが含まれ得る：
・食品および飲料、医薬品、または関連材料の感覚的な訴え、品質、または安全性。
・ヒトまたは動物の健康、栄養、または運動状態。
・病原体を含む有害物質の存在または不在。
・工業的プロセスの進行または状態。
・環境の汚染または状態。
・香水、香料、または他の化粧品の感覚的訴え、品質、または安全性。
【０２６７】
特に好ましい実施形態において、検体は、ドナーまたはアクセプタードメインに結合しない。
【０２６８】
別の実施形態において、本方法は、センサ分子に結合する化合物のスクリーニングに使用することができる。当業者であれば、これにより、例えば、創薬および／または開発での本発明の使用が可能となることを理解するであろう。より具体的には、検体が結合するドメインが、可能性のある治療法の標的である。したがって、この実施形態において、検体が結合するドメインは、アドレナリン作動性受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体、代謝調節型／グルタミン酸受容体、ＧＡＢＡ受容体、鋤鼻受容体、味覚受容体、またはセクレチン様受容体等であるが、これらに限定されない、臨床的に重要な分子であることが好ましい。
【０２６９】
別の例として、本発明の方法は、超高温（ＵＨＴ）処理乳等の牛乳の腐敗を検出するために使用することができる。この例では、センサ分子は、少なくとも部分的に牛乳の腐敗をもたらす、細菌プロテアーゼによって切断される分子であり得る。例えば、センサ分子は、化学発光ドナードメインおよびアクセプタードメインで標識化されたプロテアーゼ（複数可）によって切断される、κ−カゼイン等の乳タンパク質の領域を含み得る。
【０２７０】
当業者であれば理解するように、本発明は、多重化することもできる。このシステムでは、異なる化合物に結合する２つ以上の異なるセンサ分子が提供される。各異なるセンサ分子には、異なるドナーおよび／またはアクセプター分子が含まれ、その結果、異なる波長で放出して、異なる標的化合物の検出および定量化が可能となる。
【０２７１】
実施例
実施例１−トロンビン切断アッセイのためのマイクロ流体システムにおけるハイブリッドＢＲＥＴシステムの実施
材料および方法
ＢＲＥＴシステム
ＢＲＥＴ１およびＢＲＥＴ２技術の組み合わせを使用し、これを、本明細書ではハイブリッドＢＲＥＴと称した。具体的には、天然のセレンテラジン基質とともにＲＬｕｃを生物発光ドナーとして使用し、ＧＦＰ２をアクセプター分子として使用した。ドナーおよびアクセプターを、トロンビン切断部位を含有するペプチド配列（ＬＱＧＳＬＶＰＲ↓ＧＳＬＱ（ＲＧ））によって連結させ（ＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃ）、大腸菌に発現させた。切断部位のトロンビン切断は、ハイブリッドＢＲＥＴシグナルに変化をもたらした。ＢＲＥＴシステムの機序を、図１Ａに示す。
【０２７２】
材料
ＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃバイオセンサを、既報（Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９ａ）のように発現させ、精製した。精製した融合タンパク質を、トロンビン切断緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に入れた。マイクロ流体に基づくアッセイに使用した天然のセレンテラジン基質（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）の最終濃度は、５８．６μΜであり、プレートリーダーに基づくアッセイでは５μΜであった。１単位（Ｕ）／μｌのトロンビンプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液を、１倍リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に調製した。
【０２７３】
マイクロ流体チップの製造および実験的構成
同時二重放出ハイブリッドＢＲＥＴ測定を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いたマイクロプレート、および以下に記載のマイクロ流体装置の両方において、実行した。ＢＲＥＴ構築物のスペクトルスキャンは、５μΜの天然のセレンテラジン基質を１μΜのバイオセンサに添加した後、発光スキャンモードを用いて４００〜６５０ｎｍで記録した。
【０２７４】
マイクロチップＢＲＥＴ測定のために、幅７０μｍで高さ５０μｍの単純なＹ型マイクロチャネルマイクロチップ（図１Ｂ）を、標準的なフォトリソグラフィーを用いてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作製した。チップの設計は、市販の描画パッケージ（Ａｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＳ４）で完成させ、設計パターンを、透明マスク（５，０８０ｄｐｉ、Ａｌｌａｒｄｉｃｅ）に印刷した。マイクロ流体デバイスのマスターパターンを、ｌａｍｉｎａｒドライフィルムレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ  ５０３８）を用いて作製した。複数のレジスト層を、１１３℃で、研磨したステンレス鋼の基質に積層加工した。チャネルを、２０ｍＪ／ｃｍ２で動作するコリメートＵＶ源（λ＝３５０〜４５０ｎｍ）および透明フィルムマスクを使用してリソグラフィーによりパターン形成した。露光した後、試験パターンを、２０％Ｎａ２ＣＯ３溶液で現像した。
【０２７５】
レジストのパターンを、続いて、１００ｎｍのＮｉをまずスパッタリング蒸着した後、１５０μｍの厚さに電気メッキすることによりニッケルシムとして複製した。次いで、１０／１（ｗ／ｗ）の比率のＰＤＭＳと硬化剤を、シム上に注ぎ、脱気し、７５℃で一晩乾燥させた。デバイスを切断し、シムを剥離し、次いで、１０分間空気プラズマに晒した。次いで、ＰＤＭＳを即座にスライドガラスで密封し、７５℃で３時間乾燥させた後、ＰＤＭＳはガラスの表面に強く接着し、ＰＤＭＳガラスマイクロチップはすぐに使用可能な状態となった。
【０２７６】
マイクロ流体測定のためのセットアップの略図を、図１Ｃに示す。ｎｅＭＥＳＹＳ高圧ポンプシステム（Ｃｅｔｏｎｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、５０μｌ容量の２つのＳＧＥシリンジ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）からマイクロチップに流体をポンプ注入した。いずれの流れの流量も、２０μｌ／時間であった。マイクロチップを、可視化および測定のために顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ）のステージに設置した。サファイアレーザー（４８８ｎｍ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を使用して検出スポットの位置付けを行った。放出された生物発光を、２０倍対物レンズ（Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ，Ｎｉｋｏｎ）で収集した。ＧＦＰ２については５１５ｎｍ〜５５５ｎｍ、ＲＬｕｃについては４３０ｎｍ〜４５５ｎｍのバンドパスフィルタ（Ｎｉｋｏｎ）を、２つのチャネルに使用した。縮小レンズ（Ｎｉｋｏｎ  Ｃ−０．４５ｘ）を使用して、各チャネルから放出された光を、光電子倍増管（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｈ７４２１）に集めた。積分時間は、各チャネルの光のデータ取得については２００ミリ秒であった。測定位置は、入力チャネルの最初の合流地点（ｘ＝０）で始まる主要チャネルからマイクロチップの端部まで多様であった。
【０２７７】
トロンビンアッセイ
種々の濃度のトロンビンを、精製したＧＦＴ２−ＲＧ−ＲＬｕｃバイオセンサに添加し、３０℃で９０分間インキュベートした。トロンビン切断の程度を測定するために、インキュベーション後の試料混合物および天然のＣＬＺ溶液を、別個のシリンジから２つの注入チャネルにポンプ注入し、主要チャネルを通して流動させた。２つの流れ間の拡散が、界面でＢＲＥＴ反応を誘導した。酵母由来の組み換えヒルジン（Ｓｉｇｍａ）を、プロテアーゼアッセイの前に、室温で１０分間トロンビンとともにインキュベートした。
【０２７８】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃバイオセンサの完全なトロンビン切断を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実行した。タンパク質（２．５μｇ）を、ＭＯＰＳ泳動緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル中、ＳＤＳゲル電気泳動用の１倍試料ローディング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈した。バンドを、Ｆａｓｔ  Ｓｔａｉｎ（商標）（Ｆｉｓｈｅｒ）で染色した後、可視化した。
【０２７９】
データ分析
マイクロプレート分光計を使用して、ハイブリッドＢＲＥＴ比を、５００ｎｍおよび４７０ｎｍで測定した生物発光放出の比率として計算した。マイクロチップシステムを使用して、ハイブリッドＢＲＥＴ比を、長波長放出（５１５ｎｍ〜５５５ｎｍ）と短波長放出（４３０ｎｍ〜４５５ｎｍ）との比率として計算した（Ｐｆｌｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｅｉｄｎｅ，２００６）。２つの異なる検出システム間の比較を可能にするために、ハイブリッドＢＲＥＴ比を、同じ測定システムでトロンビンを添加しなかったＢＲＥＴ比の倍数として表すことによって、正規化した。すべてのデータは、平均±標準偏差（ＳＤ）として報告する。対応のない両側ｔ検定を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン５．００、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて行った。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５として定義する。
【０２８０】
結果
ＢＲＥＴスペクトルおよび比率に対するトロンビンの影響
トロンビン処理の前のトロンビンバイオセンサの生物発光スペクトルは、ＲＬｕｃ放出を表す４７０ｎｍでのピークおよびＧＦＰ２放出を表す５００ｎｍでのピークを有する二峰性であった（図２Ａ）。これは、励起状態の天然のセレンテラジンからＧＦＰ２へのエネルギー移動を示す。トロンビン切断後、スペクトルの緑色成分が低減され、トロンビンバイオセンサのトロンビン切断が、ドナーとアクセプターとの間のエネルギー移動の効率を低下させたことを示した。
【０２８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ｂ）により、トロンビン処理の後、融合タンパク質は、Ｈｉｓタグ化ＧＦＰ２および非タグ化ＲＬｕｃに対応する３２．４ＫＤａおよび３６．４ＫＤａの分子量を有する２つの成分に切断されたことを確認した（レーン５、図２Ｂ）。ＢＲＥＴバイオセンサをヒルジンとともに事前インキュベートすることにより、トロンビン特異性を示す２つの成分の形成を阻害した（レーン６）。
【０２８２】
バイオセンサ切断に対するトロンビンの影響を、ＢＲＥＴＨ比における変化を用いて定量化した。トロンビン切断後、ＢＲＥＴＨ比は、おおよそ３２％、１．１１±０．０６から０．７５±０．０４に、有意に（Ｐ＝０．０００９）低下した。トロンビン切断後の０．７９±０．０５のハイブリッドＢＲＥＴ比は、ＲＬｕｃおよびＧＦＰ２を１μΜずつ混合することによって得たものと有意に異なるものではなかった（Ｐ＝０．３３０９）（図３、対照）。ヒルジンの事前添加は、トロンビンに誘導される１．０８±０．１４のＢＲＥＴＨ比の低減を阻止した。これは、トロンビンなしで測定した比率と有意に異なるものではなかった（Ｐ＝０．７６６３）。
【０２８３】
オンチップＢＲＥＴ測定
ＢＲＥＴバイオセンサを検出するための流動条件を最適化するために、一連の実験を行って、異なる位置、流量、およびバイオセンサ濃度でのＢＲＥＴ発光性を画像化および定量化した（図５）。融合タンパク質および基質の２つの流体流が最初に接触する段階では、拡散層は狭く、少量の液体のみが生物発光を放出した（データは示されない）。生物発光の強度もまた低かった（約４５７）が、バックグラウンド（約２．３）よりは有意に高かった。ｘ＝１〜５ｍｍでは、生物発光強度は、ほぼ一定に留まったが、ｘ＝７ｍｍでは有意な増加があった。この増加は、領域における混合の増加を反映し得る。生物発光の強度にかかわらず、ＢＲＥＴＨ比は、全測定領域を通してほぼ一定（約５．２）に留まった。オンチップ測定をベンチマーク評価するために、ＢＲＥＴ比を、市販のＢＲＥＴ検出機器を用いて測定したマイクロプレートデータと比較した。ＢＲＥＴ比の相対的変化、すなわち、トロンビンを用いて測定したＢＲＥＴ比となしで測定したものとは、マイクロチップおよびマイクロプレートの測定間で非常に一定している（±４％以内）。
【０２８４】
ＢＲＥＴＨ比に対する流量およびバイオセンサ濃度を変化させることの影響もまた、調査した（図６）。流量依存性を、２つの位置ｘ＝０および４．９ｍｍで測定した（図６ａ）。ｘ＝０では、ＢＲＥＴＨ比はまた、研究した流量、すなわち２０〜６０μｌ／時間の範囲内で、一定であった（±１．１％以内）。ｘ＝４．９ｍｍでは、流動条件における変化に起因して、わずかに大きなＢＲＥＴ比の変動があった（±２％の範囲内）。しかしながら、２つの測定位置の間の全体的な不確かさは、±５％以内であった。図６ｂは、バイオセンサ濃度の関数として、ハイブリッドＢＲＥＴ比を示す。低いタンパク質濃度の不確かさは、比較的高かった（例えば、１．４９μΜのバイオセンサ濃度で標準偏差＝７．７％）が、平均ＢＲＥＴＨ比の全体的な変動は、バイオセンサ濃度でのもの、すなわち、２．７％の標準偏差よりも低かった。異なる測定条件下でのＢＲＥＴＨ比の変動が小さいことは、ＢＲＥＴＨ反応の完全性が、生物発光が測定できる限り、定量化に重要ではないことを意味するため、重要な発見である。より完全な混合によりシステムの発光度が増加することが予測されるが、我々のデータは、それが、ＢＲＥＴＨ比への影響をほとんど有さないことを示す。これは、少なくともこの研究で考慮されるトロンビン濃度のレベルに関して、ＢＲＥＴに基づく検出のためのマイクロ流体デバイスの設計要件を単純化する可能性がある。
【０２８５】
トロンビン濃度の影響
ｘ＝２．１ｍｍで固定した測定（図５）で２０μｌ／時間の流量およびバイオセンサ濃度２．９７２μΜを使用して（図６）、マイクロチップおよびマイクロプレートシステムを、ある範囲のトロンビン濃度（図７）を用いたトロンビンの測定に関して比較した。ＢＲＥＴＨ比は、マイクロ流体測定では０．２４ｎＭおよびマイクロプレート測定では２．７ｎＭまで、トロンビン濃度の増加により線形変化した。より高い濃度では、ＢＲＥＴ比の変化は、トロンビンの飽和のためあまり顕著ではない。低トロンビン濃度領域では、較正は、Ｒ２値が０．９９５を上回る、線形であった。較正の勾配の比較により、マイクロ流体法が、マイクロプレート法の４．７倍、トロンビン濃度の変化に対して高感度であった。トロンビンの検出限界は、マイクロプレートに基づく技術を使用した３１０ｐＭと比較して、マイクロチップに基づく技術では２７ｐＭである。マイクロチップに基づくＢＲＥＴＨシステムは、ＢＲＥＴ２およびＢＲＥＴ１のマイクロプレートに基づくアッセイで計算されたそれぞれ１５ｐＭおよび５３ｐＭの値の中間の検出限界を有する（Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９ａ）。
【０２８６】
結論
生物発光共鳴エネルギー移動方法は、流体相トロンビン感受性バイオセンサを用いて、流動形式で初めて実証された。使用したＢＲＥＴＨ技術は、測定可能な発光性によるＢＲＥＴ２構成成分の試験を可能にする、ＢＲＥＴ１とＢＲＥＴ２との組み合わせである。ＢＲＥＴ反応および検出を、マイクロチップにおけるＹ型マイクロチャネルネットワークで行った。実験により、測定位置、流量、およびバイオセンサ濃度の影響を定量化した。これらの要因は、両方の光学チャネルにおける生物発光強度に影響を及ぼしたが、ＢＲＥＴＨ比には影響を及ぼさなかった。マイクロチップに基づく技術は、市販の機器を用いて測定される同等のマイクロプレートに基づく技術と比較して、改善されたトロンビン検出感度を示した。トロンビンの検出限界は、マイクロプレートに基づく技術を使用した３１０ｐＭと比較して、マイクロチップに基づく技術では２７ｐＭであった。
【０２８７】
実施例２−マイクロ流体システムにおけるＢＲＥＴ２の実施
ＢＲＥＴ２システムにおいて、セレンテラジン４００ａ（ＣＬＺ４００Ａ）基質とともにウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）を光子ドナーとして使用し、ＧＦＰ２をアクセプター分子として使用した。ＢＲＥＴ２の発光はＢＲＥＴ１．５のものよりも１００倍小さいため、ＢＲＥＴ２反応は、最も高い生物発光シグナルを生成するために最適な温度、検出チャンバ寸法、流量、および濃度での効果的な混合を要する。したがって、このシステムを使用して、異なる混合機序（図８）、反応チャンバ設計、および反応条件を評価する。
【０２８８】
３つの混合要素を有するＹ型マイクロチャネルを有し、マイクロチャネルに長方形の断面（幅２００μｍおよび高さ３０μｍ）を有するＰＤＭＳチップ（図８）を使用して、ＢＲＥＴ２アッセイを監視した。異なる直径および高さを有する検出チャンバを、マイクロチャネルの端部に位置付けた。放出される生物発光を、検出チャンバの下に位置付けられる多重モードの光ファイバによって収集した。放出は、ダイクロイックブロックによって分けられ、ドナーの放出バンド（４３０ｎｍ〜４５５ｎｍ）およびアクセプターの放出バンド（５１５ｎｍ〜５５５ｎｍ）に対応する２つのバンドパスフィルタを通った後、２つの対応する光電子倍増管（Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｈ７４２１）に入る。
【０２８９】
本方法は、タンパク質溶液をＹ型チャネルの一方の注入口に流動させ、セレンテラジン４００ａ基質をチャネルのもう一方の注入口に流動させることを伴う。
【０２９０】
本方法は、タンパク質流動と基質流動を、好適な流量で、受動的混合要素によって効果的に混合することを要する。
【０２９１】
本方法は、混合要素、チャンバ寸法、タンパク質および基質の濃度、流量、温度等を変動させることによって、可能な限り高い生物発光シグナルを収集することを目的とする。結果として、最適なマイクロ流体混合チップ設計および反応条件が得られ、他のＢＲＥＴアッセイに変換される。
【０２９２】
効率を高めるために、大きな光検出チャンバに一体化された流体チップを使用する。光ファイバをチャンバの下に位置付けることによって、ＢＲＥＴ２反応により放出される光を収集し、検出サブシステムに伝送する（図９）。このアプローチは、最小限の消失およびしたがって高感度を確実にし、２つの波長で放出レベルにおける微細な変化を同時に捕捉することを可能にする。
【０２９３】
発明者らは、モデルプロテアーゼ（トロンビン）を検出することができるセンサタンパク質を用いて検出感度を試験した。結果は、市販入手可能なマイクロプレートリーダーと比較して、ＢＲＥＴ２検出感度に５倍の改善を示した。これらの試験において、検出限界が２０ｐＭ未満であったこともまた確認した。
【０２９４】
図１０は、感度試験からの試料データを示す。ＧＦＰおよびＲｌｕｃの放出計数を、それぞれ、緑色（第１のパネルの上の線、第２のパネルの下の線）および青色の線（第１のパネルの下の線、第２のパネルの上の線）で示す。未加工データを、トロンビンなしのブランクおよび２７０ｐＭのトロンビンを用いた条件について示す。放出レベル間の比率（ＢＲＥＴ２比：ＧＦＰ／ＲＬｕｃ）は、２７０ｐＭのトロンビンを用いたセンサの消化に応じて、おおよそ１０倍の変化を示す。
【０２９５】
図１１は、トロンビン濃度を０〜２７０ｐＭに変化させた際のセンサの応答を示す。この図はまた、同じ実験を市販利用可能な機器で繰り返した際の結果も示す。感度（スロープ）は、マイクロ流体システムでは５倍高い。計算した検出限界は、２０ｐＭである。
【０２９６】
ＢＲＥＴ２比を、センサタンパク質（１μΜ）をトロンビン（５４０ｎＭ）および基質（１２．５μΜ）を用いた調製物と混合した後、２注入口のマイクロ流体デバイスで測定した。センサタンパク質（１μΜ）を基質（１２．５μΜ）と混合することによって、対照実験を行った。ＢＲＥＴ２シグナルにおけるおおよそ７５％の減少が、５０μＬ／時間の入力流量で、オンチップ反応に関して測定された（図１２）。
【０２９７】
実施例３−マイクロ流体システムにおけるＢＲＥＴ２に基づく臭気物質センサの性能
ＢＲＥＴ２システムは、ＦＲＥＴ（ＷＯ２０１０／０８５８４４号）または標準的なＢＲＥＴと比較して、ＧＰＣＲにおいてリガンドに誘導される分子転位を測定するのにより好適である。これは、好ましいＧＰＣＲ構築物において６．８ｎｍ間隔のＢＲＥＴ対（Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ａｎｄ  ２０１１）が、ＢＲＥＴ２のドナーとアクセプターとの組み合わせのフェルスター距離に良く一致するためである。しかしながら、１つのトレードオフは、ＢＲＥＴ２化学を用いた際、ＲＬｕｃドナーの量子収率が低いことである。これは、検出に利用可能な光子がより少ないことをもたらす。ＲＬｕｃ２および８突然変異の使用は、ＢＲＥＴ２システムの量子収率を改善することが示されているが（Ｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ＢＲＥＴ２システムのフェルスター距離への影響は最小限である（図１）。本発明者らは、臭気物質アッセイの感度を損なうことなく光子収率を増加させる目的で、ＯＧＯＲセンサにおけるＲＬｕｃをＲＬｕｃ２またはＲＬｕｃ８と置き換えた。図１８は、ＲＬｕｃ２を組み込んだＯＧＯＲ２を用いたジアセチル検出のための伝達スキームを示す。
【０２９８】
材料および方法
タグ化線虫嗅覚受容体を組み込んだＢＲＥＴ２−ＧＰＣＲセンサの構築
キメラＢＲＥＴ２タグ化嗅覚受容体は、線虫嗅覚受容体の３つ目の細胞内ループ（ＩＣ３）およびＣ末端にＢＲＥＴ２構成成分が、ＩＣ３には緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ２、およびタンパク質（ＯＧＯＲ）のＣ末端にはウミシイタケルシフェラーゼＲＬｕｃとともに、挿入されている。部位特異的突然変異生成を用いることにより、ＲＬｕｃ２突然変異を、ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ−５２  ＯＧＯＲ配列に導入した。プライマー１および２（表３）を使用して、突然変異Ｃ１２４Ａを導入し、プライマー対３および４を使用して、Ｍ１８５Ｖ突然変異を導入して、ＯＧＯＲ２と称される構築物を作製した（図１８、配列番号１、配列番号２）。
【表３】
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【０２９９】
ＯＧＯＲ２試料調製物
酵母コロニーを、２％グルコースを補充した１０ｍＬのＳＣＭＭ−Ｕ（出芽酵母最少培地、２００ｍＬ当たりの組成物：１．３４ｇの酵母抽出物（アミノ酸なし）および０．３８ｇの酵母補充培地（ウラシルなし））に接種し、２８℃で一晩インキュベートした。一晩培養物のアリコートを使用して、２％ラフィノースおよび２％ガラクトースを補充して０．４の最終Ｏ．Ｄ．６００にしたＳＣＭＭ−Ｕを接種し、２００ｒｐｍで振盪させながら１５℃でさらに７２時間インキュベートした。
【０３００】
細胞培養物を、４℃で５分間１５００ｘｇで遠心分離した。細胞を、１ｍＬの滅菌水中に再懸濁させ、１０，０００ｘｇで１分間遠心分離した。細胞を、４ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。細胞を、フレンチプレス（〜１８０００ｐｓｉ）によって溶解させ、細胞残屑を１５０００ｘｇ（４℃）で１５分間の遠心分離によって除去した。これに続いて、上清部分を、４℃で１時間、４０，０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌ−８０  ｕｌｔｒａ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）で遠心分離した。上清を傾瀉し、膜ペレットを１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、４℃で４８時間保管した。
【０３０１】
ジアセチルアッセイ
すべてのリガンド溶液を、水中に直接調製した。ＯＧＯＲ濃度は、ＧＦＰ２強度を５１０ｎｍで用いて正規化した。アッセイは、リン酸緩衝食塩水中１００μＬの総体積で９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）において行った。ＯＧＯＲを、Ｔｏｐｓｅａｌ−Ａ（商標）（Ｐａｃｋａｒｄ）で密封したウェルにおいて、各リガンドとともに２８℃で４５分間インキュベートした。
【０３０２】
プレートリーダー測定
インキュベーションの後、セレンテラジン４００ａ基質（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）を、５μΜの最終濃度まで添加した。同時二重放出ＢＲＥＴ２測定は、ＲＬｕｃ／Ｃｌｚ４００ａ放出フィルタ（４１０ｎｍバンドパス８０ｎｍ）およびＧＦＰ２放出フィルタ（５１５ｎｍバンドパス３０ｎｍ）を含むＢＲＥＴ２放出フィルタセットを使用して、０．５秒の積分時間で２つのチャネルについて、それぞれ、増進を３３００および４０９５に設定し、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ）で記録した。
【０３０３】
エンドポイントオンチップマイクロ流体測定
エンドポイントマイクロ流体アッセイを、光学検出チャンバを搭載する２つの注入口を有するマイクロ流体混合デバイスにおいて、オンチップで行った。セレンテラジン４００ａ基質（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）を、最終濃度１２．５μΜに調製し、第１の注入口に導入した。ＯＧＯＲおよびＯＧＯＲ２膜ペレットを、１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、必要に応じて希釈し、２８℃で４５分間、１ａＭ〜１μΜの範囲の濃度でジアセチル溶液とともにインキュベートした。調製物を、第２の注入口に導入した。オンチップ混合を、各注入口の入力流量４００μｌ／時間で開始した。ＢＲＥＴ２測定を、一方がＲＬｕｃ／Ｃｌｚ４００ａ放出フィルタ（４１０ｎｍバンドパス８０ｎｍ）を装備し、他方がＧＦＰ２放出フィルタ（５１５ｎｍバンドパス３０ｎｍ）を装備した２つの光電子倍増管を使用して記録した。光学出力を、オンチップ光学検出チャンバに沿ったコア径１ｍｍの光ファイバを使用して収集した。
【０３０４】
リアルタイムオンチップマイクロ流体測定
オンチップリアルタイム測定を、光学検出チャンバを搭載した、３つの注入口のマイクロ流体混合デバイスで行った。第１の注入口を使用して、ＰＢＳ中、１２．５μΜの最終濃度となるように調製したセレンテラジン４００ａ基質（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）を導入した。第２の注入口は、ＰＢＳ中１ｆＭの最終濃度となるように希釈したジアセチル（２，３−ブタンジオン）、または対照としてＰＢＳのみを含んだ。第３の注入口を使用して、１ｍＬのＰＢＳ中に上述の膜ペレットを再懸濁させ、必要に応じてさらに希釈することによって調製したセンサタンパク質懸濁液を導入した。オンチップ混合を、５０〜４００μｌ／時間の範囲の入力流量を用いて開始した。ＢＲＥＴ２測定を、一方がＲＬｕｃ／Ｃｌｚ４００ａ放出フィルタ（４１０ｎｍバンドパス８０ｎｍ）を装備し、他方がＧＦＰ２放出フィルタ（５１５ｎｍバンドパス３０ｎｍ）を装備した２つの光電子倍増管を使用して記録した。光学出力を、オンチップ光学検出チャンバに沿ったコア径１ｍｍの光ファイバを使用して収集した。
【０３０５】
分析
ＢＲＥＴ２シグナルを、５１５ｎｍでの放出強度と４１０ｎｍでのものとの比として計算した。すべてのデータは、文中に記載の通り平均±標準偏差（ＳＤ）または平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。曲線を、データの正規化後、Ｗｉｎｄｏｗｓ用Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０３を用いて複合法面を有するｌｏｇ［アゴニスト］対応答曲線に適合させた。対応のない両側ｔ検定を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍで行った。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５として定義した。
【０３０６】
結果
強度
ＲＬｕｃ２突然変異をＯＧＯＲに導入することにより、生物発光強度が、ＯＧＯＲでの１７６６±１２５ＲＬＵからＯＧＯＲ２での２７２８８６±２６７５４ＲＬＵへとおおよそ約１５０倍増加した（図１９）。ＯＧＯＲのこの突然変異体形態は、したがって、マイクロ流体チップ上でＯＧＯＲ２による臭気物質結合のＢＲＥＴ２検出を促進する能力を示した。この予測を、オンチップ測定によって確認した。ＲＬｕｃ２突然変異により、生物発光強度が、６．４５±２．９ＲＬＵから８０９．７４±１１６ＲＬＵにおおよそ約１２６倍増加した（図２０）．
【０３０７】
マルチウェルプレートにおけるＯＧＯＲ２による臭気物質結合の実証
１μΜのジアセチルをマイクロプレートのウェルにおいてＯＧＯＲ２を含有する膜調節物に添加した際、ＢＲＥＴ２シグナルに２１．４％の減少があった（図２１）。ジアセチルに誘導されるＢＲＥＴ２シグナルの変化は、対照の水への応答とは有意に異なる（Ｐ＝０．０１３６）。ジアセチルに応答したシグナルの変化率は、天然のＲＬｕｃを組み込んだ元のＯＧＯＲセンサ（３２％）で見られたものよりも小さい。しかしながら、ブランク測定における変動は小さく、ＯＧＯＲに対する１．０±１３．５％（ｎ＝４）と比較して、ＯＧＯＲ２センサでは１．０±７．０％（ｎ＝３）であった。したがって、ＯＧＯＲ２センサは、検出限界はブランクシグナル±３×Ｓ．Ｄとして計算されるため、より低いジアセチル濃度を検出することができる可能性がある。
【０３０８】
ジアセチルに対するＯＧＯＲ２の応答（図２２）は、線形範囲で用量依存性である（１０−１８から１０−１２Ｍまで６対数単位に及ぶ（図２２）。計算されたＥＣ５０値は、１１．４ａＭジアセチルである。これは、マイクロウェルでのＯＧＯＲ応答よりも２桁低く、ジアセチルに対する感度の向上を示唆する。
【０３０９】
マイクロ流体エンドポイントアッセイを使用した、ＯＧＯＲ２によるジアセチル結合の検出
１０ｆＭのジアセチルを、ＯＧＯＲ２を含有する懸濁液とともにインキュベートした後、マイクロ流体オンチップ測定は、ＢＲＥＴ２シグナルにおける３６．９％の減少を示した（図２３）。ＢＲＥＴ２シグナルにおける減少は、プレートリーダーを使用して行った同等の測定よりも１．５倍大きかった（図２１）。これは、ＯＧＯＲファミリーのバイオセンサを用いたマイクロ流体測定が、厳密にはプレートリーダー測定よりもより感受性である可能性があることを示す。
【０３１０】
ＯＧＯＲ２の濃度依存性応答は、１０−１８から１０−１６Ｍの２対数単位に及ぶ（図２４）。計算されたＥＣ５０値は、おおよそ約１０ａＭジアセチルである。このレベルは、プレートリーダー測定と良好に一致する（図２２）。
【０３１１】
マイクロ流体デバイスを用いたＯＧＯＲ２による臭気物質結合のリアルタイムオンチップ検出
リアルタイムオンチップ測定は、５０、１００、２００、および３００μｌ／時間（図２５および２６）の入力流量で１ｆＭのジアセチルを２９０ｎＭのタンパク質および１２．５μΜの基質とオンチップで混合した後、ＢＲＥＴ２比に２７．４％の減少を示した。
【０３１２】
実施例４−マイクロ流体システムにおけるＢＲＥＴ２に基づく周辺質結合タンパク質センサの性能
周辺質結合タンパク質（ＰＢＰ）は、細菌に見られる、大型の多様な可溶性タンパク質ファミリーを形成する。ＰＢＰは、数例挙げると、炭水化物、アミノ酸、および神経伝達物質、金属およびイオンを含む、広範な化学的に異なる種に結合する（Ｍｅｄｉｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＰＢＰは、一次配列では無関係であるが、それらは、すべて、一般に「ハエジゴク」機序と称される大きなリガンド誘導型立体配座転位を受ける（Ｓｈａｒｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  ａｎｄ  １９９３；Ｓｐｕｒｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【０３１３】
ＭＢＰのＦＲＥＴタグ化ＮおよびＣ末端間の測定距離６．９３ｎｍ（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）は、ＧＰＣＲ内の測定距離と類似の規模であり、ＢＲＥＴが、ＦＲＥＴと比較して、この範囲の距離を測定するための優れた選択肢であり得ることを示唆する。マイクロ流体チップ上でのＰＢＰによるリガンド結合の測定は、安全対策、食品および飲料の品質管理、環境および健康管理を含む、広範な適用分野での包括的な変換プラットホームをもたらし得る。発明者らは、ＭＢＰが、ＰＢＰスーパーファミリーの良く特徴付けられたメンバーであり、すべてのＰＢＰの代表となり得るため、この概念の初期試験としてこれを選択した。周辺質タンパク質ＭＢＰによるマルトース結合のためのＢＲＥＴ２変換機序を、図２７に示す。このセンサは、類似の構造を有するすべてのＰＢＰおよび／またはＭＢＰへのリガンドの結合機序の概念実証である。マルトースに対するＭＢＰに基づくバイオセンサの親和性は、ＭＢＰドメインの標的化した突然変異によって変化させることができることが周知である。類似のアプローチは、他のＰＢＰに適応可能である。
【０３１４】
材料および方法
ＢＲＥＴタンパク質の構築
ＲＬｕｃ２を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させ、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）にクローニングした。これにより、増幅された遺伝子の下流へのＢｓｔＢＩ部位の導入、および増幅された遺伝子のすぐ上流へのＸｈｏＩ制限部位の導入をもたらした。ＤＮＡのシークエンシングにより、正確なアンプリコン配列を確認した。アンプリコンを、ｐＲＳＥＴ  ＧＦＰ２−ＦＬｌ−ＲＬｕｃ（Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）のＢｓｔＢＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入し、ＲＬｕｃを置き換えてｐＲＳＥＴ  ＧＦＰ２−ＦＬ１−ＲＬｕｃ２を得た。
【０３１５】
ＭＢＰを増幅させ、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙベクターにライゲーションした。このプロセス中に、ＢｓｔＢＩ部位を、増幅した遺伝子の上流に挿入し、ＰｓｔＩ部位を下流に挿入した。ＭＢＰを、ｐＲＳＥＴ  ＧＦＰ２−ＦＬ１−ＲＬｕｃ２のＰｓｔＩおよびＢｓｔＢＩ部位に制限クローニングし、ＦＬ１配列をＭＢＰと置き換えて、ｐＲＳＥＴ  ＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２を得た。
【０３１６】
Ｗ１４０突然変異を、プライマーＣ１（ＣＡＧＡＴＧＴＣＣＧＣＴＴＴＣＧＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＧＣＧＴＡＣ）（配列番号１１）およびＣ２（ＧＴＡＣＧＣＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＣＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＡＴＣＴＧ）（配列番号１２）を使用して、部位特異的突然変異生成（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、ｐＲＳＥＴ  ＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２に導入した。ＢＲＥＴ２タグ化ＭＢＰ受容体のヌクレオチド５およびアミノ酸配列は、配列番号３〜６）として提供される。
【０３１７】
ＢＲＥＴ２タンパク質の発現および精製
タンパク質を、大腸菌株ＢＬ２１  ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）に発現させた。一晩培養物を、３７℃、２００ｒｐｍで、１００μｇ／ｍＬアンプリコンおよび２％グルコースを含有するＬＢ（１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、５ｇ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））において単一コロニーから成長させた。発現を、１００μｇ／ｍＬアンプリコンを含有する５００ｍＬのＬＢを０．１のＡ６００まで接種し、３７℃（２００ｒｐｍ）で３．５時間インキュベートした後、２２℃（２００ｒｐｍ）で一晩インキュベートすることによって、誘導した。細胞を、接種２４時間後に採取した。
【０３１８】
タンパク質の精製のために、細胞を、４３３５ｘｇ（４℃）で１５分間の遠心分離によって採取し、平衡緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、約２２０００ｐｓｉの圧力でホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ  ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ３（ＡＴＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））に通し、可溶性タンパク質部分を、１５０００ｘｇ（４℃）で１５分間の遠心分離によって単離した。タンパク質を、提供された指示にしたがって、コバルト親和性クロマトグラフィーを用いて精製した（ＢＤ  Ｔａｌｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））。精製されたタンパク質を１５０ｍＭイミダゾールで溶出した後、試料を、セルロース膜（１２，０００分子量カットオフ（Ｓｉｇｍａ））を使用して５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡに対して透析した。５００μＬのタンパク質アリコートを、ドライアイス上で瞬間凍結させ、−８０℃で保管した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍの吸光度で判定し、Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ（１９８９）の方法に従って計算した。
【０３１９】
スペクトルのスキャン
すべてのスペクトルのスキャンは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２プレートリーディング蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で記録した。反応は、９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）において行った。ＢＲＥＴ２構築物の生物発光スキャンは、３６０〜６５０ｎｍを２０ｎｍ間隔でスキャンする発光スキャンモードを用いて記録した。
【０３２０】
エンドポイントオンチップマイクロ流体測定
オンチップ測定は、２つの注入口、受動的マイクロ混合器、および一体型光学検出チャンバを有するマイクロ流体混合器で行った。ＢＲＥＴ２測定は、一方がＲＬｕｃ／Ｃｌｚ４００ａ放出フィルタ（４１０ｎｍバンドパス８０ｎｍ）を備え、他方がＧＦＰ２放出フィルタ（５１５ｎｍバンドパス３０ｎｍ）を備える、２つの光電子倍増管を使用して記録した。光学放出を、オンチップ光学検出チャンバからダイクロイックミラーに沿ったコア径１ｍｍの光ファイバを使用して収集した。
【０３２１】
リアルタイムオンチップマイクロ流体測定
リアルタイムオンチップ測定を、３つの注入口、受動的マイクロ混合器、および一体型光学検出チャンバを有するマイクロ流体混合器で行った。ＢＲＥＴ２測定は、一方がＲＬｕｃ／Ｃｌｚ４００ａ放出フィルタ（４１０ｎｍバンドパス８０ｎｍ）を備え、他方がＧＦＰ２放出フィルタ（５１５ｎｍバンドパス３０ｎｍ）を備える、２つの光電子倍増管を使用して記録した。光学放出を、オンチップ光学検出チャンバからダイクロイックミラーに沿ったコア径１ｍｍの光ファイバを使用して収集した。
【０３２２】
ＢＲＥＴタンパク質アッセイ
１μΜの精製タンパク質を、すべてのエネルギー移動アッセイに使用した（最終体積１００μＬ）。１μΜの精製タンパク質は、タンパク質をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、０．０５８Ｍ  Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４、０．０１７  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０６８Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））中に希釈することによって調製した。精製タンパク質を、二重脱イオン水または水に溶解した糖とともに２８℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、１６．６７μΜのセレンテラジン４００ａを添加し、シグナルを即座に記録した。
【０３２３】
オンチップＢＲＥＴタンパク質アッセイ
オンチップアッセイのために、１μΜの精製タンパク質を、１ｍＭのマルトース溶液とともに２８℃で４０分間インキュベートした。次いで、調製物を、オンチップで５μΜのセレンテラジン４００ａと混合し、光学シグナルを検出チャンバから記録した。対照実験を、タンパク質調製物を水とともにインキュベートし、同じ条件下でチップ上で混合することによって行った。結果を比較して、マルトースの添加後のＢＲＥＴ２シグナルの変化率を判定し、マルトースの感度の判定するよう拡張した。
【０３２４】
リアルタイムオンチップＢＲＥＴタンパク質アッセイ
リアルタイムアッセイのために、タンパク質調製物、マルトース、および基質を、同時にチップ上で混合した。１μΜの精製タンパク質を、１ｍＭのマルトース溶液および５μΜのセレンテラジン４００ａ基質溶液と混合した。光学シグナルを、検出チャンバから記録した。オンチップ反応時間は、流量を変動させることによって制御した。ＢＲＥＴ２シグナルにおける変化を、異なる反応時間で測定し、結果を、水を用いた対照実験と比較した。
【０３２５】
ＢＲＥＴ比の判定
ＢＲＥＴ比を、最大アクセプター放出強度と最大ドナー放出強度との比として計算した。
【０３２６】
マルトースのリアルタイムオンチップ検出
２つの流入チャネルおよび１８ｍｍの長さの蛇形共通チャネルを有するｙ型チップを使用した。共通チャネルの断面寸法は、０．２ｍｍ×０．０３５ｍｍであった。ＢＲＥＴ反応チャンバは、θ＝４ｍｍおよびＨ＝１ｍｍであった。チャンバの上部表面にミラーはなかった。光を捕捉し、流入部を有する二分岐型ライトガイド（胴体部径６ｍｍおよびＮＡ＝０．５９）を用いて標準的なダイクロイック検出器に移した。ＰＭＴゲート時間は、５００ミリ秒であった。共通チャネルにおいて１時間当たり２００μＬおよび４００μＬの２つの異なる流量を試験した。
【０３２７】
流入部Ａは、１μΜのマルトースおよび３１．２５μΜのＣｌｚ４００ａ基質、または陰性対照の場合は３１．２５μΜのＣｌｚ４００ａ基質のみを含有するように調製した。流入部Ｂは、１μΜのＧＭＲセンサを含有した。ＡおよびＢを、１００μＬ／時間または２００μＬ／時間の入力流量で、Ｙ型マイクロ流体チップの別個のアームにポンプ注入して、それぞれ２００μＬ／時間または４００μＬ／時間の共通チャネル流量を得た。合計滞留時間は、前者の場合ではおおよそ２３０秒、後者の場合では１１５秒と推定した。ＢＲＥＴ２比を、流動開始後２００〜２５０秒で収集した平均データにおいて判定した。
【０３２８】
データ分析
すべてのデータ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて行った（Ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン５、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）。すべてのデータは、別途文中に記載されない限り、平均±標準偏差（ＳＤ）として報告する。対応のない両側ｔ検定を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍを使用して行う。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５として定義する。
【０３２９】
結果
ＭＢＰ  ＢＲＥＴ比によるマルトース検出−プレートリーダーアッセイ
ＢＲＥＴタグ化ＭＢＰタンパク質の選択性を、単糖類、二糖類、および三糖類を含む、種々の糖に対する応答を試験することによって判定した（図２８）。マルトース（Ｐ＝．００１）およびマルトトリオース（Ｐ＝０．０２）のみが、ＢＲＥＴタグ化ＭＢＰからのＢＲＥＴシグナルに有意な（Ｐ＜０．０５）変化をもたらした。ＢＲＥＴバイオセンサは、グルコース、フルクトース、スクロース、またはラフィノースには応答しなかった。Ｆｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）は、ＦＲＥＴバイオセンサが、マルトースおよび種々のマルトースオリゴ糖類を検出することができたが、α−１，４−グルコシド結合を含有しないいずれのペントース類、ヘキソース類、糖アルコール類、二糖類、または三糖類も特異的に認識しなかったことを示した。ＢＲＥＴ比における変化の振幅は、マルトース鎖の長さが２単位（マルトース）から３（マルトトリオース）に増加するにつれ２９．６５％から１７．０３％へと低下した（図２８）。これは、電子常磁性（ｅｌｅｃｔｒｏｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）共鳴（ＥＰＲ）研究（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）およびＦＲＥＴ測定（Ｆｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）によって示されるように、より大きなα  １，４−オリゴマルトシド鎖の存在下での閉鎖運動の低減と一致する。ＢＲＥＴ２応答の相対寸法と文献に報告されたＦＲＥＴ応答（Ｆｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）のものとの比較は、ＢＲＥＴ構成成分とＦＲＥＴ構成成分との置換により、バイオセンサの動的範囲が増加し、ＦＲＥＴの約１２％（Ｆｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）と比較して、ＢＲＥＴでは２９．６５±１．１１％のシグナル変化をもたらし得ることを示した。発明者らは、フェルスター距離における類似性に基づいて、従来的なＢＲＥＴ１のシグナル変化が、ＦＲＥＴのものと同程度であると予測する。
【０３３０】
Ｗ１４０Ａ突然変異体をＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２に導入することにより、マルトースに対するＢＲＥＴ２応答を消失させた（図２８）。水またはマルトースのいずれかに対するＢＲＥＴ２応答間に、有意差は観察されなかった（Ｐ＝０．６３）。Ｗ１４０Ａ突然変異体は、マルトースに対して１００ｍＭよりも高い解離定数を有し、以前には、酵母へのマルトースの取り込みの監視に適用した際のＦＲＥＴタグ化ＭＢＰの対照として使用されていた（Ｆｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。Ｗ１４０Ａ突然変異体のマルトースに対する応答の欠如は、ＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬｕｃ２のＢＲＥＴ２比に対するマルトースの影響が、マルトースとＢＲＥＴ構成成分自体との間の直接的な相互作用に起因するものではないことを示す。これらの結果により、ＢＲＥＴ２に基づくマイクロ流体チップアッセイにおけるＧＦＰ２−ＭＢＰ−ＲＬＵＣ２（ＧＭＲ）および類似のセンサの好適性の可能性が確認される。
【０３３１】
応答時間
ＢＲＥＴ２応答は、インキュベーション時間を３０分まで増加させるにつれて増加し、この時点で応答が最大に達した（図２９）。３０分間を、さらなるアッセイに使用した。現在のマイクロプレートアッセイ形式では、ＢＲＥＴ２応答をリアルタイムで記録することはできないが、リアルタイムマルトースアッセイを、マイクロ流体チップ形式を用いて行うことができる。
【０３３２】
感度
ＢＲＥＴ２タグ化ＭＢＰバイオセンサは、３．７１×１０−７ＭのＥＣ５０で、１×１０−８Ｍ〜３．１６×１０−６Ｍの範囲の３対数単位に及ぶ異なる濃度のマルトースを定量化することができた（図３０ａ）。ＦＲＥＴタグ化ＭＢＰ受容体の応答は、３．２４μＭのＥＣ５０で、０．２６〜２１．１２μΜの範囲の２対数単位にわたってのみ線形であった。
【０３３３】
オンチップアッセイ測定
感度アッセイを、Ｌ≒１８ｍｍの蛇形共通チャネルを有する２つの流入部のマイクロ流体混合デバイス（図８ｂ）で行った。ＢＲＥＴ反応チャンバは、ミラーを有さず、θ＝４ｍｍおよびＨ＝１ｍｍであった。６ｍｍ胴体部およびＮＡ＝０．５９の二分岐型ライトガイドを使用した。１μΜのＧＭＲセンサを、１０−９〜１０−３Ｍの範囲の濃度で、マルトースとともに２８℃で４０分間インキュベートした。インキュベートした試料および３１．２５μΜのＣｌｚ４００ａ基質を、それぞれ、４００μｌ／時間の入力流量で、チップにポンプ注入した。ライトガイドの胴体部末端を、ＢＲＥＴ反応チャンバからのシグナルの収集に使用した。ライトガイドの２つの分岐部を、２つのＰＭＴの前の２セットのフィルタブロック（青色は４１０／８０、緑色は５１５／３０）に向けた。ＢＲＥＴ２シグナルを、各濃度で測定した。実験を、同じバッチのＧＭＲセンサを使用して３日間毎日反復した。全３日にわたり、試験する各濃度に対して１つずつ、９つのチップを使用した。オンチップ検出のｌｏｇ濃度応答曲線は、ＥＣ５０＝２．２×１０−７Ｍであった以前のプレートに基づく測定のものと効果的に同一であった（図３０ｂ）。
【０３３４】
糖類のグルコースおよびスクロースよりもマルトースに対するセンサの特異性を、チップにおいて調査した。放出の振幅は、Ｒｌｕｃ／Ｃｌｚ４００ａシグナルが１００００〜２５０００計数／ゲート（５００ミリ秒）の範囲およびＧＦＰ２シグナルが２０００〜１００００計数／ゲート（５００ミリ秒）の範囲と高かった。検体の不在化において、ＢＲＥＴ２比は、０．２２５であった。マルトースの結合（図５２）は、ＢＲＥＴ２比における大きな変化をもたらし、平均ＢＲＥＴ２比が０．１ｍＭマルトースでは０．３５であり、糖なしの対照よりも５２％増加した。グルコースおよびスクロースでの反応は、それぞれ、ＢＲＥＴ２比における７および１５％の増加をもたらし、マルトースに対するＢＲＥＴ２に基づくセンサが、マイクロ流体形式で維持されることを確認した。
【０３３５】
マルトースのリアルタイムオンチップ検出
発明者らは、プロテアーゼおよび揮発性物質の検出について以前に示したように、本発明は、試料を、チップ上でセンサおよび基質と混合することができ、その結果、全体的な検出反応は、チップ上における連続流動形式で行うことができる。発明者らは、これが、ＯＧＯＲ２センサおよびジアセチルを使用した、試料、センサ、およびセレンテラジン４００Ａ基質の３つの入力（図２６）、ならびにトロンビンでは３つの入力（例えば、図５１を参照されたい）で機能することを実証した。発明者らは、これを拡張し、同じプロセスが、ＢＲＥＴに基づくマルトースセンサで機能することを示す。この場合、便宜上、発明者らはさらに、２つの入力マイクロ流体チップを使用した。セレンテラジン基質およびマルトースを含有する試料溶液（またはマルトースなしの陰性対照）を事前混合して一方の入力部にポンプ注入し、ＧＭＲセンサ溶液を他方の入力部にポンプ注入した。
【０３３６】
シグナルは、両方の流量で流動を開始したおおよそ４０秒後に検出されたが、より速い流量（１時間当たり２００μＬの入力）の場合には、より迅速に安定化した（６０秒対おおよそ１３０秒）（図６７）。合計した発光性は強力であり、１００μｌ／時間ではＲｌｕｃ／Ｃｌｚ４００ａで１０００〜１５００計数／ゲートおよびＧＦＰ２で６０００〜７０００計数／ゲート、または２００μｌ／時間ではＲｌｕｃ／Ｃｌｚ４００ａで２０００〜３０００計数／ゲートおよびＧＦＰ２で７０００〜９０００計数／ゲートが容易に検出された。
【０３３７】
安定化された後、１μΜのマルトースは、いずれの流量でも容易に対照と区別され（図６４）、遅い方の流動ではＢＲＥＴ２比に≒２０％の変化がもたらされ、速い方の流動では≒２７％の変化が示された。
【０３３８】
実施例５−光ファイバスイッチありおよびなしでの生物発光シグナル収集の比較
本発明において使用するための機器の非常に好ましい要件の１つは、多重化である、すなわち、機器は、ほぼ同時に複数の検体を検出することができなければならない（すなわち、１つの検体と次のものとの間の時間遅延が非常に小さい）。機器の費用および空間、ならびに重量を低減するために、光ファイバスイッチを使用して、多重化を可能にすることができる。ある実施形態において、複数の入力光ファイバは、少なくとも６つの検出チャンバからの生物発光シグナルを同時に収集する。次いで、光学スイッチは、１つの特定の入力ファイバを、シグナルを分割およびバンドパスさせる２つの光電子倍増管（ＰＭＴ）に接続した単一の出力ファイバに、短期間（数百ミリ秒）接続する。同じ方式で、次の入力ファイバのスイッチを入れる。現在の例では、入力ファイバ間のスイッチ切り替えに５０ミリ秒かかる。光学スイッチ切り替えにより、必然的に収集したシグナルに光学的損失が生じる。したがって、この実験は、光学スイッチを通じたシグナルの収集が可能であるかどうかを確認し、光学スイッチ切り替えによるシグナル損失の量を計算するために行われた。
【０３３９】
実験的構成
実験的設定を図３１に示す。図３１Ａは、光学スイッチなしの構成を示す。単一のファイバを、マイクロ流体チップの光学検出チャンバの下に並ぶように操作した。ファイバを、次いで、光学ブロックに直接接続させる。図３１Ｂは、光学スイッチありの構成を示す。Ｌｅｏｎｉ  １×９ｍｏｌのファイバの光学スイッチを使用した。９つの入力は、サブミニチュアＡ（ＳＭＡ）コネクタで終端処理され、一方で出力ファイバは、フェルールコネクタ（ＦＣ）により終端処理されている。ステンレス板を、ＳＭＡレセプタクルのアレイを含有するように機械加工して、底部からの光ファイバの接続を可能にした。板の上部に、ファイバの先端と揃った光学チャンバを有するマイクロ流体チップを置いた。この実験では、１つの入力ファイバを使用した。出力ファイバを、次いで、光学ブロックに接続した。
【０３４０】
材料および方法
エンドポイントマイクロ流体アッセイを、光学検出チャンバを搭載する２つの注入口を有するマイクロ流体混合デバイスにおいて、オンチップで行った。セレンテラジン４００ａ基質（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）を、最終濃度１２．５μΜのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に調製し、第１の注入口に導入した。ＧＴＲ膜タンパク質を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に、１μΜの濃度で希釈した。調製したＧＴＲ溶液を、第２の注入口に導入した。オンチップ混合を、各注入口の入力流量４００μｌ／時間で開始した。ＢＲＥＴ２測定を、一方がＲＬｕｃ／Ｃｌｚ４００ａ放出フィルタ（４１０ｎｍバンドパス８０ｎｍ）を備え、他方がＧＦＰ２放出フィルタ（５１５ｎｍバンドパス３０ｎｍ）を備える２つの光電子倍増管を用いて記録した。光学出力を、いずれの場合についても図３１にある１つの単一入力ファイバを用いて収集した。ゲート時間は５００ミリ秒であった。
【０３４１】
結果
図３２は、３回の実行について、光学スイッチ切り替えなしおよびありで収集したＲｌｕｃ／Ｃｌｚ４００チャネルにおけるリアルタイム生物発光シグナルを示す。ＧＦＰもまた、類似の挙動を示す（データは示されない）。これらの結果から、生物発光シグナルが、光学スイッチを無事に通過したことが確認される。損失に関しては、図３３は、ＲＬｕｃ／Ｃｌｚ４００ａおよびＧＦＰチャネルの両方において、光学スイッチなしおよびありで収集した発光シグナルを比較する。ＲＬｕｃ／Ｃｌｚ４００ａチャネルの光学スイッチによる損失は、４０％であったが、ＧＦＰチャネルでは２８％であった。
【０３４２】
実施例６−全体的なシステム発光性および光子検出効率の最適化
本発明の重要な特徴の１つは、非常に低いレベルの検体を、経済的試薬使用でリアルタイムに検出するその能力である。これを達成する鍵の１つは、センサ溶液の単位体積当たり最大数の光子を生成することである。ＲＬｕｃ２突然変異等の改良を組み込むことにより、これを助ける。光学検出システムにおける光子損失の最小化もまた、重要である。高い光子検出効率は、応答時間、試薬の経済性、およびシグナル対ノイズ比の望ましい組み合わせを可能にする。ＢＲＥＴ反応チャンバおよび共通チャネルの容積を増加させることにより、利用可能な光シグナルが増加する傾向にあり、これは、シグナル対ノイズ比を改善するが、システムの時間分解能を低減させる。その他のものは同じままデバイスにおける流量を増加させることにより、デバイスの時間分解能を改善させるが、試薬の経済性およびシグナル対ノイズ比が低下する。光学検出システムにおける損失の最小化もまた重要である。多数の代替的な実験的構成を展開し、光子検出効率を改善した。
【０３４３】
実験的構成
２つの注入口、受動的混合要素、および検出チャンバを有する、図３１Ａに示されるものに類似のマイクロ流体チップを用いて、オンチップ測定を行った。アルミニウムミラーを、反応チャンバの上部に設置して、ＢＲＥＴシグナルを増強させた。一方がＲＬｕｃ／Ｃｌｚ４００ａ放出フィルタ（４１０ｎｍバンドパス８０ｎｍ）を備え、他方がＧＦＰ２放出フィルタ（５１５ｎｍバンドパス３０ｎｍ）を備える２つの光電子増幅管を使用して、ＢＲＥＴ放出を記録した。
【０３４４】
多数の変化形を、元の構成と比較した（図３１Ａ）。反応チャンバの直径を、元の直径２ｍｍから４ｍｍに増加させた（図３４Ａ）。反応チャンバの高さを、１〜２ｍｍで変動させた。直径０．４〜１．０ｍｍの単一の光ファイバ（図３１Ａ）を、ダイクロイックブロックに入るコア径５ｍｍでＮＡ＝０．５９の液体ライトガイドもしくは光ファイバ束（図３４Ａ）、または胴体部のコア径６ｍｍ、分岐部のコア径４ｍｍの二分岐型ライトガイド（図３７）、または胴体部のコア径８ｍｍで分岐部のコア径４ｍｍの多分岐型ライトガイド（図３８および４０）と置き換えた。
【０３４５】
材料および方法
４日目に、ＯＧＯＲ２センサ溶液を、ストック溶液から高希釈比（１００および５０倍）でＰＢＳ中に調製した。Ｃｌｚ４００ａを、３１．２５μΜでＰＢＳ中に調製した。ジアセチルが含まれた場合は、１μΜの最終濃度でＯＧＯＲ２センサ溶液に添加した。対照実験については、ＤＩ水のみを添加した。ジアセチルなしおよびありのセンサ管を、いずれも２８℃で３０分間インキュベートした。
【０３４６】
結果
ファイバ径１．０ｍｍの元のシステムと、単一のコア５ｍｍの液体ライトガイドを用いた改変型システムとの間で、光収集を比較した（図３５）。１００倍希釈のセンサでは、元のシステムは、高いノイズレベルを有し、ＲＬｕｃ２およびＧＦＰ２のいずれのシグナルも、ノイズと区別できなかった。対照的に、液体ライトガイドを使用することにより、バックグラウンドノイズレベルが有意に低下し、システムを作動させたおおよそ５０秒後までに、両方の放出チャネルをノイズとはっきり区別することができた。最大シグナルレベルは、試薬のポンプ注入を開始したおおよそ２００秒後までに達成された。新しい方の構成は、ＢＲＥＴ反応チャンバの容積が元のものよりも４倍大きいため、この条件ではシグナルの飽和まで最大１００秒長くかかることに留意されたい。いずれにせよ、ベースラインとの区別は５０秒までに検出することができる。類似の結果が、５０倍の希釈比で観察された（結果は示されない）。改良したシステムでは、５０倍および１００倍希釈でＯＧＯＲ２を使用して検体を検出することが可能であった（図３６）。
【０３４７】
各マイクロ流体チャネルが専用の光検出器を有する場合、各マイクロ流体チャネルが二分岐型ライトガイドと接合され、それが１対の光電子倍増器または同等の検出器に光をチャネル伝達する（図３７）に示されるもの等のスキームが、好適な配設である。この配設をダイクロイックブロックと比較することにより、これが、その他の条件が同等である場合、より良好な光子検出効率およびシグナル対ノイズ特性を有し得ることが示される（図３９）。
【０３４８】
ライトガイド（コア径≧１．０ｍｍ）を光ファイバ（コア径≦１．０）の代わりに用いる場合、異なるマイクロ流体チャネル間での光学検出システムの時間領域切り替えに好適な光学スイッチを得ることは困難である。この場合、シャッターボックスを使用することができる。好適な光学的構成の例は、図３８に示される。多チャネルのチップから収集された光がシャッターボックスに集められ、出力は、多分岐型ファイバ束を介して光学検出器にチャネル伝達される。シャッターは、多分岐型ファイバ束の入力側に位置付けられ、チャネル配列および監視期間のソフトウェア選択が可能である。
【０３４９】
好適な多分岐型ライトガイドの配設を、図４０に示す。この配設とチャネル特異的二分岐型ライトガイド（図３７）とを比較して得られた結果は、ダイクロイックファイバが、二分岐型ライトガイドと比較して、ＧＦＰチャネルにおいては８倍高いシグナル、およびＲｌｕｃチャネルにおいては６．６倍高いシグナルをもたらすことを示す（図４１）。ＢＲＥＴ２比は、ダイクロイックフィルタでは４．６７±０．０７であり、二分岐型配設では３．８５±０．２５であった。
【０３５０】
実施例７−好適な弁および固体に基づく光検出器の例
多種多様な真空に基づくセンサおよび固体センサが市販入手可能であり、これらは、ＢＲＥＴ反応により生成される光を測定するためにマイクロ流体チップと接合され得る。図４２は、従来的な真空管を使用した高い計数効率、高い増幅率、低い暗ノイズ集合率を図示する。図４３は、固体技術を使用して実装された、高い光子検出効率、高い増幅率、低い暗ノイズ集合率を図示する。これらの２つのアプローチには多数の変異体が利用可能である。
【０３５１】
実施例８−マイクロ流体チップにおける拡散的混合の実験的および理論的最適化
層流条件が、本発明で使用される典型的な寸法のマイクロ流体チップに関与し得る。この場合、混合は、主に拡散によって生じ、完了を達成するために低い流量および長い滞留時間を要し得る。低い流量は、検体（複数可）の最初の検出までの時間がそうでない場合よりも結果として遅くなるため、望ましくない。この制限は、例えば、より複雑なマイクロ流体の幾何形状および／もしくは拍動流、ならびに／または微小機械的混合、ならびに／または音響的および／もしくは動電的手段を使用して、乱流混合を強制的に行うことによって、克服することができる。これらの方法のすべては、実行可能ではあるが、追加の工学的複雑性および費用を伴う可能性がある。したがって、発明者らは、層流環境において拡散的混合を強化することができる単純な受動的設計の特徴を研究した。
【０３５２】
実験的構成
色素を用いた研究のため、発明者らは、注入口が３つのマイクロ流体ネットワークを使用した（図４４）。トロンビン検出実験では、Ｙ型形状を有する、注入口が２つのマイクロ流体ネットワークを使用した（図３１ａ）。ＢＲＥＴ反応チャンバ（示されない）は、直径２ｍｍまたは４ｍｍのいずれかであった。すべてのマイクロチャネルの寸法は、幅２００μｍで深さ３５μｍであった。元の（並列型）構成では、チャネルはそれらの垂直方向の（３５μｍ）側面に沿って互いが接触しており、長さがおおよそ２８ｍｍの蛇形混合領域を有して製造されていた（図４４）。改良された（パンケーキ状積層）構成（図４５）では、２つの入力チャネルは、深さ３０μｍで幅６００μｍであり、互いに積み重ねられており、それらの水平方向（６００μｍ）の側面を介して接触して、幅６００μｍで深さ６０μｍの線形共通チャネルを形成していた。共通チャネルの長さは、２０ｍｍであった。
【０３５３】
色素実験のために、食用色素の溶液を、１時間当たり３０〜３００μＬの流量で単一のポンプを吸い込みモードで使用して、３つの入力マイクロチャネルから汲み出した。トロンビン感知実験のために、１２．５μΜのセレンテラジンＡ基質を使用し、これは、試験濃度のトロンビンと事前混合し、Ｙ型マイクロチャネルの一方のアームにポンプ注入した。既述（Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ｂ）のように調製した１μΜのＢＲＥＴ２に基づくトロンビンバイオセンサを、マイクロチャネルの他方のアームにポンプ注入した。入力チャネル流量は、１時間当たり５０〜４００μＬで変動させた。検出限界を、１時間当たり５０μＬの入力試薬流量で、ＢＲＥＴ２比における変化をはっきりと識別することができた最も低いトロンビン濃度として略式的に推定した。
【０３５４】
結果
図４４に示されるように、並列型の構成を使用すると、流動は、２．３５秒の滞留時間に対応する高流量（共通チャネル流量＝３００μＬ時間）では層流であり、観察可能な混合がほとんどないか、または全くない。流動は、２３．５秒の滞留時間に対応する低流量（共通チャネル流量＝１時間当たり３０μＬ）では層流のままであったが、この期間に大幅な拡散的混合が検出され得る。
【０３５５】
滞留時間の計算
ｉ）１時間および３つの入力ネットワーク当たり３００μｌの吸い込み流量について：蛇形領域の容積は、０．２ｍｍ×０．０３５ｍｍ×２８ｍｍ＝＞０．１９６μＬである。
共通チャネルの流量は、１時間当たり３００μＬである。
０．１９６／３００＝６．５３×１０−４時間＝２．３５２秒。
ｉｉ）１時間当たり３０μＬの入力流量については：
滞留時間は、１０倍長い、すなわち、２３．５２秒である。
ｉｉｉ）並列型積層では：
蛇形領域の容積は、０．２ｍｍ×０．０３５ｍｍ×２８ｍｍ＝＞０．１９６μＬである。共通チャネルの流量は、１時間当たり１００μＬである。
０．１９６／１００＝１．９６×１０−３時間＝７．０５６秒である。
ＢＲＥＴ反応チャンバの容積（π１２×１ｍｍ３）＝３．１４μＬ
流量は１時間当たり１００μＬである。３．１４／１００＝１時間当たり０．０３１４＝１１３秒
合計滞留時間は、１２０秒である。
ｉｖ）パンケーキ状積層では：
チャネルの容積は、０．６ｍｍ×０．０６×２０ｍｍ＝＞０．７２μＬである。チャネルの流量は、１時間当たり１００μＬである。
０．７２／１００＝７．２×１時間当たり１０−３＝２５．９２秒
ＢＲＥＴ反応チャンバの容積（π２２×１ｍｍ３）＝１２．６μＬ
流量は１時間当たり１００μＬである。１２．６／１００＝１時間当たり０．１２６＝４５２秒。
合計滞留時間は、４７８秒または７分５８秒である。
【０３５６】
トロンビンアッセイは、検体およびセンサのいずれも低い拡散係数を有する巨大分子であるため、またトロンビン（ｋｃａｔ≒８５ｓ−１）はシグナルが検出可能となる前にタンパク質分解切断により非常に多くのセンサを処理する必要があり、これに時間がかかるため、不十分な混合には非常に敏感である。
【０３５７】
従来的な並列型ネットワークを各入力アームで１時間当たり５０μｌの流量で使用すると、リアルタイム（１２０秒）で観察可能な最も低いトロンビン濃度は５４０ｎＭであった。パンケーキ状積層ネットワークを同じ流量（４７８秒の滞留時間）使用した場合、２７ｎＭのトロンビンが容易に検出可能であった（図４６）。トロンビンは、試験した最も低い濃度である１４ｎＭに至るまで検出可能であった。滞留時間を４倍差に調整すると、パンケーキ状積層については、より低い濃度のトロンビンの検出に少なくとも１０倍の便益がある。
【０３５８】
発明者らは、この改善がパンケーキ状積層構造での改善された拡散的混合に起因すると考える。したがって、マイクロ流体チャネルの長さ（並列型の例では２８ｍｍであり、パンケーキ状積層の例では２０ｍｍ）を、これらの異なる構成で混合を完了するために必要な理論的距離と比較した。
【０３５９】
完全な拡散的混合に必要な距離の計算
Ｌ：チャネルの長さ（ｍｍ）
Ｑ：体積流量（μｌ／時間）または（ｍｍ３／秒）
Ｑ＝２００μｌ／時間＝２００ｍｍ３／時間＝０．０５５ｍｍ３／秒
Ｄ：拡散係数（トロンビンの）Ｄ＝４．１６  １０−５ｍｍ２／秒
Ｕ：チャネルにおける平均速度（ｍｍ／秒）＝Ｑ／幅×高さ（チャネルの断面積）
Ｘ：期間ｔに移動する拡散的距離は、Ｘ２＝ｔＤにより推算する。
【０３６０】
混合を完了させるためのＸ値は、チャネルの構成に依存する。入力チャネルが２つの構造であるとすると、並列型設計では、Ｘは共通チャネル幅の半分であり、パンケーキ状積層設計では、Ｘはチャネルの高さの半分である。
【０３６１】
完全な混合のための滞留時間＝Ｌ／Ｕ＝Ｘ２／Ｄ＝＞ＱＸ２／幅×高さ×Ｄ
【０３６２】
したがって：
１．現在の（並列型）設計では：
Ｈ（チャネルの高さ）＝３４μｍ＝０．０３４ｍｍ、および
Ｗ（チャネルの幅）＝２００μｍ＝０．２ｍｍ
【０３６３】
Ｌ≒ＱＷ２／４ＷＨＤ＝０．０５５ｍｍ３／秒×０．０４ｍｍ２／４×０．２ｍｍ×０．０３４ｍｍ×４．１６  １０−５ｍｍ２／秒＝＝１９４４ｍｍ
【０３６４】
２．現在の（パンケーキ状積層）設計では：
Ｈ（チャネルの高さ）＝６０μｍ＝０．０６０ｍｍ、および
Ｗ（チャネルの幅）＝６００μｍ＝０．６ｍｍ
【０３６５】
Ｌ≒ＱＨ２／４ＷＨＤ＝０．０５５ｍｍ３／秒×３．６  １０−３ｍｍ２／４×０．６ｍｍ×０．０６ｍｍ×４．１６  １０−５ｍｍ２／秒＝３３ｍｍ
【０３６６】
３．最適化された（パンケーキ状積層）設計では：
Ｈ（チャネルの高さ）＝１４μｍ＝１４×１０−３ｍｍおよび
Ｗ（チャネルの幅）＝１２００μｍ＝１．２ｍｍ
【０３６７】
Ｌ≒ＱＨ２／４ＷＨＤ＝０．０５５ｍｍ３／秒×１９６  １０−６ｍｍ２／４×１．２ｍｍ×１４  １０−３ｍｍ×４．１６  １０−５ｍｍ２／秒＝３．９ｍｍ
【０３６８】
したがって、並列型積層は、完全な混合に必要とされる１９４４ｍｍ中２８ｍｍ（すなわち１．４％）のみを提供するが、試験したパンケーキ状積層配設は、完全な混合に必要とされる３３ｍｍ中２０（すなわち６１％）を提供した。計算は、小規模な追加の変更を行うことで、拡散的混合を、７．７ｍｍ以内、すなわち現在の設計で利用可能な長さの４０％未満で完了するように配設することが実現可能であろうことを示す。
【０３６９】
実施例９−マイクロ流体ネットワーク設計およびポンプ注入配設に対する改善
共通ポートに接続される複数の試薬入力チャネルの長さが例えば図１４のように多様であるマイクロ流体ネットワークは、背圧の差が長い方のチャネルの流動を阻止し、すべての流動を短い方のチャネルを通して行う傾向があるため、信頼性が低かった（結果は示されない）。これらの設計はまた、同様の理由から、気泡による遮断の影響を非常に受けやすい。したがって、発明者らは、多重チャネルデバイスの信頼性を改善するために、多数の異なる設計特徴およびポンプ注入配設を試験した。
【０３７０】
対合型対称マイクロ流体センサの実験的構成
一例（図４７）において、発明者らは、２つの異なるセンサを使用して２つの同時の反応を行うために、左右対称な平行チャネルレイアウトを有するネットワークを設計した。この配設は、任意の偶数のセンサチャネルが得られるように再現することができる。
【０３７１】
結果
発明者らは、２つの流量で食用着色色素を使用してチップ上の流体流動を実証した（図４８）。拡散的混合は、１５０μｌ／時間の流量では大部分が完了したが、１５００μｌ／時間では入力流は大部分が分離したままであった。
【０３７２】
流動は連続的であり、ネットワークの両方のアームにわたってすら、遮断は、非対称設計でのものよりも低い頻度で発生した。いずれにせよ、この設計は、気泡または他の障害物が２つの平行なアームのうちの１つに詰まる場合には、依然として遮断または不規則な流動を被りやすい。したがって、発明者らは、試料および試薬にマイクロ流体ネットワークを通過させるための他のアプローチを調査した。
【０３７３】
各共通チャネルが、いずれの他の共通チャネルとも共有されない、それ専用の圧力源（複数可）を有することが望ましい。これは、何らかの理由によりネットワーク内に背圧の変動が存在する場合、流動を異なる共通チャネルに転向することが不可能であることを意味する。残念ながら、陽圧モードで動作している場合、この原理の観察は、各共通チャネルが、センサ、基質、および試料に１つずつの３つの専用ポンプを必要とし、複雑で、高費用な可能性のある工学的要件を有するシステムをもたらすことを意味するであろう。的確かつ優れた代替法は、吸引（陰圧）モードで動作する単一の専用ポンプを使用して、試薬を個別の共通チャネルに流すことである。これは、図４９に示されるように、１つの共通チャネルに単一のポンプを要するだけである。吸気圧力によって駆動されるネットワークの層流の品質は、図４４に示されるように一定であり、信頼性がある。最悪の場合、１つの共通チャネルまたはそこに繋がるマイクロ流体チャネルにおける遮断または部分的閉塞は、そのセンサチャネルにのみ影響を及ぼす。
【０３７４】
各共通マイクロ流体チャネルに（およびしたがって、各異なるセンサに）専用の圧力源を提供することの副次的利点は、それが、複数のセンサチャネルを、可能性として異なる流量で、および結果としては異なる速度と感度のバランスで、互いに独立して同時に操作することを可能にすることである（図５０）。これは、例えば、多様な異なる検出限界および時間定数を得るために、２つ以上のチャネルが同じセンサを異なる流量で使用することを可能にする。別の選択肢は、異なるセンサを有する複数のチャネルを、各センサに関して最適化された異なる流量で操作することである。この極端な例は、ＧＰＣＲに基づく揮発性センサおよびプロテアーゼセンサ等、完全に異なるセンサの種類を、同じかまたは異なる試料とともに、同じチップに平行して流し、２つの反応クラスの非常に異なる反応動態に関して流量を調整することであろう。本明細書に記載されるように、吸気ポンプを使用して、チップ上で異なる種類または希釈率の試料または基質化学的性質の使用を補助することも可能である。
【０３７５】
吸引モードの使用は、ネットワークの注入口側において単純な使い捨てカートリッジで試薬を提供するという概念と完全に適合する。カートリッジの交換は、同じ基本的なハードウェアを使用して、用途および標的の単純かつ迅速な切り替えを可能にするであろう。さらなる利点は、試料間、または検体検出後にポンプ注入デバイスを消毒する必要性が、吸引モードでは最小化されることである。
【０３７６】
発明者らは、実施例６からの好ましい光の収集および検出構成を、この実施例の好ましい吸引モードのポンプ注入および実施例２からのＢＲＥＴ２に基づくトロンビンセンサとともに組み込む、追加の実験を行った。この実験では、寸法が０．２ｍｍ×０．０３５ｍｍ×２８ｍｍの蛇形共通チャネルを有する、単純なＹ型マイクロ流体ネットワークを使用した。ＢＲＥＴ反応チャンバは、θ＝２ｍｍおよび高さ１ｍｍであり、３．１４μＬの容積であった。反応チャンバを、４つに分岐した光ファイバ束のうちの１つに入れ、そこから専用のダイクロイックフィルタおよび２つのＰＭＴによる同時二重波長測定のために直径２５．４ｍｍ（１インチ）の光学ブロックに入れた。チップに緩衝液で前処理を行い、５０μＬの入力レザーバーに、５０μＬの１μΜ  ＧＴＲトロンビンセンサおよび５０μＬの１２．５μΜセレンテラジン４００ａ基質を充填した。流動は、排出口で陰圧（吸引モード）を用いて、２００μＬ／時間＝０．０５５μＬ／秒の共通チャネル流量で開始した。これらの条件下では、ＢＲＥＴ反応チャンバの滞留時間は、５７秒であった。
【０３７７】
図５１に示されるように、始動が完了した後、システムは、両方の光学チャネルにおいて、優れたシグナル対ノイズ比で非常に強力なシグナルを生成した（図１０ａと比較して）。シグナルが生じる速度および直径２ｍｍのチャンバのＢＲＥＴ反応チャンバ滞留時間に基づいて、３００μｍというチャンバの最低限の高さが、依然としてバックグラウンドよりも高い測定可能なシグナルをもたらすであろうと推定する（図５１ｃ）。指定の流量では、これは、おおよそ２０秒の反応混合物集積時間に相当するであろう。４ｍｍというチャンバの直径は、同じシグナル強度および反応混合物集積時間を維持しながら、チャンバの高さを７５μｍまで低減することができる可能性がある。
【０３７８】
実施例１０−ＵＨＴ乳のプラスミン腐敗を予測する予言的実施例を含む、飲料および他の流体への本発明の適用の実施例
背景
本発明は、水溶液に分かれる揮発性化学物質を含む、水または水溶液中に溶解する任意の検体に容易に適用可能である。牛乳、果汁、他の飲料、および血清を含む体液を含む、水性の液体中に既に存在する検体は、検体の測定前に、気体と液体の事前分離を必要としないため、検出に特に適している。
【０３７９】
この分野での用途の単純な例には、ＵＨＴ乳の腐敗の予測が挙げられる。ＵＨＴ処理によって殺滅された細菌からのプロテアーゼは、保管時に全乳ＵＨＴ乳および脱脂ＵＨＴ乳において、増加した粘度、ゲル化、および苦味をもたらし、それによって保存可能期間の短縮をもたらし得る。具体的には、ＵＨＴ乳においてこれらの問題を引き起こすのは、プラスミンによるカゼインのタンパク質分解である。プロテアーゼの検出に広く使用されているアッセイは、低速であり、周囲温度で６〜９か月保管した後にＵＨＴ乳の腐敗をもたらし得る非常に低いレベルのプロテアーゼを検出するには感受性が不十分である。本発明は、ＵＨＴ乳中のそのような非常に低いレベルのプラスミンを、優れた感度でリアルタイムで測定することができる。これは、商業環境でのインライン監視にも適用可能であろう。これにより、製品の保存可能期間の推定が可能になり、パッケージ化前の追加的処理のあらゆる必要性が特定されるであろう。トロンビンおよびカスパーゼプロテアーゼに関する以前のＢＲＥＴ２センサに基づいて、標的ペプチド配列、好ましくはリジン−Ｘ（Ｘ＝リジン、チロシン、バリン、またはグルタミン酸）をＢＲＥＴドナーとアクセプターとの間のリンカーに組み込むことによって、牛乳中のプラスミン活性を検出するためのバイオセンサを構築することができた（図５３）。このセンサは、本発明の農場および工場内での使用に好適な形態に組み込まれる。しかしながら、取り扱いが容易なそのようなセンサがなかったため、トロンビンを検出するものを含むいくつかの既存のセンサを使用して、牛乳中、または実際にはオレンジジュースおよび哺乳動物血清といった他の商業的もしくは医療的に重要な流体中のプロテアーゼを検出するために本方法を使用することの実行可能性を実証した。
【０３８０】
方法
一実験において、５μΜセレンテラジンＡとともにＰＢＳ中、または高脂肪な「Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｍｉｌｋ」ブランド牛乳、「Ｊｕｓｔ  Ｊｕｉｃｅ」再構成オレンジジュース、および哺乳動物の血液もしくは血清の種々の希釈物中に１／１２５（すなわち、≒０．５μΜ）希釈した、Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）によって記載のＧＦＰ２−ＦＬ１−ＲＬｕｃ２構築物を使用した。
【０３８１】
別の実験では、発明者らは、ＲＬｕｃをＲＬｕｃ２で置き換えた実施例１および２に記載のＧＴＲ  ＢＲＥＴ２に基づくトロンビンセンサ（ＧＦＰ２−ＲＧ−ＲＬｕｃ２（ＧＴＲ２））、すなわち、５μΜセレンテラジンＡとともに、トロンビン切断緩衝液中、または牛乳、オレンジジュース、もしくは血清の種々の希釈物中に１／１００（≒０．５μΜ）希釈したＤａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）によって記載の構築物を使用した。牛乳、オレンジジュース、または血清の種々の希釈物中でのＧＴＲ２のトロンビン切断は、試料を２単位の外因性トロンビンでスパイクして内因性プロテアーゼを刺激することによって評価した。血清は、哺乳動物のヘパリン化（２５０ＩＵ／ｍｌ）血液試料から調製した。血清を調製するために、血液試料を室温で３０分間放置し、次いで、１５分間１，０００〜２，０００×ｇで遠心分離した。上清を血清と称する。血清試料は、処理の間２〜８℃で維持した。すべての実験は、マイクロウェルプレートにおいて１００μＬの最終体積で行われ、ＢＲＥＴ２シグナルは、前述のようにＰｏｌａｒｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）で読み取った。
【０３８２】
結果
ＧＦＰ２−ＦＬ１−ＲＬｕｃ２を使用した予備的結果は、ＢＲＥＴ２化学が、ＰＢＳで１／１０希釈した全乳およびオレンジジュースの水溶液環境で良好に機能することを示した（図５４）。図５５は、全乳におけるＧＦＰ２−ＦＬ１−ＲＬｕｃ２のＢＲＥＴ２シグナルの時間依存性減衰を示す。
【０３８３】
ＧＴＲ２を用いた結果は、ＢＲＥＴ２化学がまた、トロンビン切断緩衝液中に１／１０希釈した場合、血清において機能することを示す（図５６および５７）。生物発光活性は、トロンビンアッセイ緩衝液単独への再懸濁と比較して、トロンビンアッセイ緩衝液中の血清では１／５００、オレンジでは１／５０、および牛乳では１／１０に希釈した場合、完全に回復した（図５６）。ＢＲＥＴ２比は、緩衝液中の１／１０００希釈物を除き、すべての血清希釈物で緩衝液と比較して高かった（図５７ａ）。オレンジジュースに再懸濁した場合、ＢＲＥＴ２比は、緩衝液中に１／１０希釈した場合、緩衝液単独と比較して高かったが、他のすべての希釈物で一定の値であった（図５７ｂ）。未希釈牛乳に再懸濁したＧＴＲ２のみが、他のすべての牛乳希釈物と比較して、緩衝液単独中に再懸濁した場合よりも高いＢＲＥＴ２比をもたらした（図５７ｃ）。
【０３８４】
トロンビン活性が、牛乳およびオレンジジュースの１／１０希釈物中に検出された（図５８）。血清では、緩衝液中の血清試料の１／１００希釈物が、トロンビン活性をもたらした。トロンビン活性をもたらしたすべての希釈物が、トロンビンの添加なしの試料と比較して、ＢＲＥＴ２比に有意な変化（Ｐ＜０．０００１）をもたらした。緩衝液中に１／１０００希釈した血清、１／１００希釈したオレンジジュース、および１／１００希釈した牛乳におけるトロンビン活性は、トロンビン切断緩衝液において生成されたものとの有意差がない（Ｐ＞０．２５）ＢＲＥＴ２シグナルの変化をもたらした。
【０３８５】
実施例１１−濡壁サイクロンを用いた揮発物質の気液移動の実証
本発明の利点の１つは、揮発性の検体の検出に適用できることである。しかしながら、センサを、水溶液中に溶解または懸濁する必要があるため、揮発性の検体を、それらがセンサとの接触に利用可能となる前に、気相から水溶液中に分離させる必要がある。発明者らは、揮発性の化学物質を、本発明と適合性がある形式で空気から液体に移行させることの実行可能性を実証することを試みた。液体中の気体のバブリングまたはミスティングを含む、空気または標的ヘッドスペースを水性試料液と平衡するためにすぐに使用可能な多数の方法が存在する。しかしながら、発明者らは、好適な装置が市販利用可能であるため、濡壁サイクロンを選択してこの概念を実証した。
【０３８６】
初回試験のための実験的構成
初回試験は、ＳＡＳＳ２４００濡壁サイクロン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して達成した。内部送風機は、４０Ｌ／分で空気を吸い込み、それを１ｍＬの水で平衡させる。蒸発を補うために、試料レベルを監視し、１３００ｍＬのレザーバーから脱イオン水を補充する。
【０３８７】
試料化合物を、１．７〜２ｍＬのエッペンドルフ管に入れた。アルミニウム管の８０ｍｍ部分に孔を開け、ＳＡＳＳ２４００の注入ポートに管を載置した（図５９と同様）。これらの試験のサンプリング時間は、送風機の始動および試料液の充填時間を含んだ。
【０３８８】
方法
各試験に対して２回の連続した実施を行い、総体積２ｍＬの試料を得た。試験は、窒素ならびにアセトアルデヒドおよびフェノールを散布することにより酸素除去した脱イオン水中への酸素の再吸収の時間動態に従って行った。酸素濃度を、酸素電極で測定した。ＳＡＳＳ２４００試料流体中の揮発物質の濃度を、液体またはガスクロマトグラフィーによって、標準物質と比較して推定した。
【０３８９】
結果
サンプラーの濡壁動作は、試料流体の大部分を試料空気流に曝露させ、これは、窒素散布した試料の再酸素化に非常に有効であった（図６０）。この装置で測定され得る最も早い時点では、酸素による８０％飽和が約７秒以内に達成され、このプロセスは、６０秒未満で完了した。
【０３９０】
測定した最も早い時点で、フェノールがＳＡＳＳ２４００試料中に検出され（図６１）、６０秒の最後のサンプリング時点まで、時間とともにおおよそ線形様式で蓄積を続けた。
【０３９１】
このプロトコルを使用して、アセトアルデヒドで得られた結果は、サンプリング時間が長くなるにつれて濃度が減少し、信頼できないものであった。発明者らは、これが、アセトアルデヒドの高い揮発性、および試料レザーバーから急速に脱気する傾向によるものと考えた。
【０３９２】
改良した装置構成
早い時点での実験の時間分解能を改善するために、発明者らは、ＳＡＳＳ２４００の送風機が適切な速度となり、試料チャンバが充填された後（これには最大約１２秒、通常は約９秒かかる）、入力気流の急速な方向転換ができるように、装置を改良した。
【０３９３】
ＳＡＳＳ２４００の送風機は、デバイスの周囲から空気を吸い込むように設計される。狭いかまたは必要以上の長さの配管を通る空気流を制限することは、設計された４０Ｌ／分の空気流に影響を及ぼし得、空気路の切り替えは、サンプリング時間が一定となるように迅速である必要がある（図６３）。ソレノイド弁またはバタフライ弁は、空気流に対するそれらの影響のため、理想的ではないとみなした。３方向Ｌ型ポートの空気圧で動作するボール弁（ＢＬＳ３Ｌ６Ｂ）を選択して、空気取り込みを、室内空気から室内空気に加えて揮発性標本へと、急速に切り替えることを可能にした（図６０）。弁を、空気流の狭窄を最小限にするために１インチのＢＳＰ取付具で接続し、これは、３方向弁であるため、必要とされる追加の配管が最小限であり、弁をＳＡＳＳ２４００の空気注入口のすぐ近くに載置することができた。弁を、６バールの空気供給部に接続された複動式ソレノイドおよび１２ソレノイド（ＥＮＳ１２７５）によって駆動させた。
【０３９４】
マイクロコントローラ回路により、ソレノイド弁の動作を制御した。動作時間は、プログラム可能であり、１５秒に設定した。ＳＡＳ２４００にはマイクロコントローラの同期に利用可能なデジタル出力がなく、そのためＳＡＳＳ２４００の試験サイクルの開始時に作動される手動の押しボタンによってトリガした。３方向弁の応答は、１秒未満であった。
【０３９５】
すべての試験は、揮発性試料の性質のため、排気フードにおいて行った。ＳＡＳＳ２４００に吸い込まれる標本の濃度は排気フードにおける任意の空気流変化により多様であり得たため、標本を３方向弁の注入口の付近に単純に設置することは不可能であった。１＋１／４インチのｐｖｃタケノコ継手（ｂａｒｂ  ｆｉｔｔｉｎｇ）を、ソレノイドの標本注入口側に取り付けた（図６２）。２ｍｌのセーフロック円錐管を載置するための孔を、ＰＶＣ継手の下側にソレノイドから最も遠い端部から２０ｍｍ内側に開けた。この地点での空気流は、ＳＡＳＳ２４００の送風機のため４０Ｌ／秒で一定しているはずである。試験する標本を、蓋を取った１．７〜２ｍｌのセーフロック円錐管に入れた。円錐管は、各試験の開始時に上部縁まで充填した。一定の表面積を空気流に曝露することにより、各試験サイクル内で蒸発速度が確実に一定となるはずである。
【０３９６】
改良した試験手順
すべての実験は、排気フードにおいて行った。ガウン、手袋、靴カバー、およびフルフェイスマスクを含む、個人保護装置を使用した。
【０３９７】
電源を入れ、コンピュータ接続を確立した後、ＳＡＳＳ２４００を、２０秒間試料曝露なしで室内空気のみを取り込んで実行するように設定して、システムを洗浄した。ソレノイドおよび弁は、この段階では作動していなかった。ソレノイドおよびその制御回路の電源を入れ、ソレノイド弁の複数の動作を実行させて、気圧が確実に弁の迅速な動作に適したものとなるようにした。
【０３９８】
ＳＡＳＳは、試験実行の期間がプログラムされていた。これは、サンプリングに加えてさらに１５秒間の初回送風機始動に所望される曝露時間であり、その間に、３方向空気取り込み弁を、標本から離して切り替えた。
【０３９９】
清浄な８ｍＬの試料瓶を、サンプラーの手前の収集位置に設置した。０．６ｍＬの脱イオン水を、試験後の試料を取る準備ができた新しい２ｍｌの試料バイアルに入れた。温度、湿度、および気圧を記録した。
【０４００】
清浄な２ｍＬのセーフロック管から蓋を取り除いた。フェノール標本を、セーフロック管に入れ、それを可能な限り縁部の近くまで充填した後、管を載置穴に入れた。液体標本については、管をその載置部に入れ、次いで、標本を充填した。液体が標本管の縁部まで充填されることを確実にし、その結果一定な液体の表面領域が空気流に曝露されるように、注意を払った。
【０４０１】
ＳＡＳＳ２４００およびソレノイドの遅延トリガを、同時に作動させた。１５秒後に、標本をＳＡＳＳ２４００の空気取り込みに切り替えた。サンプリング時間の最後に、送風機の電源を切り、試料を、２０秒間ＳＡＳＳ２４００の手前の８ｍｌの収集瓶にポンプで入れて、試料のすべてが試料瓶に移動したことを確実にした。
【０４０２】
各試験サイクルの終了時に、ＳＡＳＳ２４００を、２０秒間内部蠕動ポンプを起動して１ｍＬの試験試料をＳＡＳＳ２４００の前に取り付けられた８ｍｌ瓶に移動させるようにプログラムした。０．８ｍＬｌの試料を、収集瓶から分析バイアルに移し、さらに０．６ｍＬの脱イオン水を使用してバイアルを充填した後、それを密封して分析に送った。試験は、５秒〜６００秒のサンプリング時間で、アセトアルデヒドおよびフェノールについて行い、クロマトグラフィー分析に送った。
【０４０３】
新しい手順を使用した結果
θ＝６ｍｍの表面積で≒１グラムのフェノール試料に１５秒間だけ曝露した後、ＳＡＳＳ２４００試料中の平均フェノール濃度は、７．７μｇ／ｍＬ（すなわち、≒８ｐｐｍ  ｗ／ｖ）であった。フェノールは、２０℃で蒸気圧＝０．４７４×１０−４大気を有する高度に揮発性の化合物の例である。たった数秒曝露した後ですら、試料バイアル中のアセトアルデヒドは、オフスケール（すなわち、＞＞ｍｇ／Ｌ）となり、アセトアルデヒドの水への非常に急速な分離を示す。これらの揮発性有機化合物の急速な取り込みおよび平衡は、オンチップマイクロ流体検出の前の濡壁サイクロンの気体−液体移動モジュールとしての実行可能性を示す。
【０４０４】
実施例１２−開発した追加のＧＰＣＲ揮発性センサ
発明者らは、ＲＬｕｃまたはＲＬｕｃ２およびＧＦＰ２ドメインを、線虫由来のｏｄｒ−１０ジアセチル受容体の配列に挿入することによるＢＲＥＴ２に基づくジアセチルセンサの構築について既に説明した。このセンサを、出芽酵母において発現させ、粗製膜懸濁液を調製し、プレートに基づくアッセイにおいて、また上述の実施例３に記載のマイクロ流体形式においても、ジアセチルに対する鋭敏な感度および選択性で応答することを実証した。しかしながら、記載のように、本発明の利点の１つは、複数のマイクロ流体センサチャネルを、複数の個々の検体を検出するために、適切なセンサ選択により、同時に操作して、複合試料の化学的特徴を得ることができることである。これを可能にするためには、異なる特異性を有する多数の適合可能な揮発性センサを誘導することが必要である。発明者らは、したがって、新規なＢＲＥＴ２に基づくセンサの設計の開始点として、線虫由来の５つの追加の推定上の化学受容体ｃＤＮＡを選択した。発明者らはまた、天然の配列からは容易に利用可能でない新規なリガンド特異性を有する可能性のある、天然の受容体の合成分子ハイブリッドであるセンサを誘導することの実行可能性を実証するために、ｓｔｒ−１１３およびｓｔｒ−１１４のキメラを構築した。
【０４０５】
ＳＧＳＲは、それぞれ、３つ目の細胞内ループおよびＣ末端にＢＲＥＴ２のタグであるＧＦＰ２およびＲＬｕｃまたはＲＬｕｃ２を用いた、線虫ｓｔｒ−１１２、ｓｔｒ−１１３、ｓｔｒ−１１４、ｓｔｒ−１１５、ｓｔｒ−１１６、およびｓｔｒ−１１４／１１３のキメラである。ＳＴＲタンパク質の３つ目の細胞内ループの位置を、「Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ」（膜貫通セグメントの予測のためのウェブを基盤とするツールｈｔｔｐ：／／ｓｅｑｔｏｏｌ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ）からのアルゴリズム「ＴＭＡＰ」を使用して予測した。これらを、ＳＧＳＲ−１１２、ＳＧＳＲ−１１３、ＳＧＳＲ−１１４／１１３、ＳＧＳＲ−１１４、ＳＧＳＲ−１１５、およびＳＧＳＲ−１１６と命名した。
【０４０６】
ＢＲＥＴ２タグ化線虫ｓｔｒ嗅覚受容体の設計および構築の方法。
化学的に合成したＳＧＳＲ−１１２以外は、ＳＧＳＲ発現カセットを設計し、複数の制限部位を関連する遺伝子特異的ＰＣＲプライマーに導入することによって作製した。それらの部位を含有するＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ  ＰＣＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、次いで、対応する制限酵素（ＲＥ）で消化させ、発現カセットにライゲーションした。それらがカセットによって使用される１つ以上のＲＥ部位を有した場合、特定の遺伝子に適合するようにいくつかの改変を行った。
【０４０７】
ｓｔｒフラグメント１のＲＥ部位は、ＮｃｏＩ（５’）およびＢｓｐＥＩ（３’）であり、ＧＦＰ２ではＢｓｐＥＩおよびＳａｌＩであり、ｓｔｒフラグメント２では、ＥｃｏＲＩがＳｔｒ１１６フラグメント２を切断するためＳａｌＩおよびＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩであり、ウミシイタケルシフェラーゼではＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩであった。
【０４０８】
ＳＧＳＲ  １１４／１１３キメラは、線虫ＳＧＳＲ−１１３を修飾することによって構築した（ｓｔｒ−１１３の第１のフラグメントである１１３−１を、カセットにおいて制限部位ＮｃｏＩおよびＢｓｐＥＩを用いて、対応するフラグメントｓｔｒ−１１４、ｓｔｒ−１１４−１と置き換えることによって）。Ｓｔｒ１１４−１は、その最初の２４０個のアミノ酸に対応する、最初の７２０個のｓｔｒ−１１４ヌクレオチドを含有し、５’末端にＮｃｏＩおよび３’末端にＢｓｐＥＩの制限部位を組み込むプライマーを使用する忠実性の高いＰＣＲによって増幅した。
【０４０９】
すべての構築物は、制限消化およびＤＮＡシークエンシングによりエラーがないことを確認した。
【０４１０】
ＧＦＰ２  Ｒｌｕｃ標識化したＳＧＳＲ−１１２、ＳＧＳＲ−１１３、ＳＧＳＲ−１１４、ＳＧＳＲ−１１５、ＳＧＳＲ−１１６、およびＳＧＳＲ−１１４／１１３受容体のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１３〜１８として提供し、一方で対応するオープンリーディングフレームは、それぞれ、配列番号１９〜２４として提供する。
【０４１１】
追加の６つのセンサによる結果。
すべてのＳＧＳＲ酵母膜調製物は、１５℃で７２時間ガラクトースを誘導した後に強力なＧＦＰ２およびＢＲＥＴ２シグナルを有し、そのすべてが、ＬＢ培地単独と比較して、ＯＰ５０大腸菌（線虫の食料供給源）で調整した培地に曝露した際、ＢＲＥＴ２に変化を示した。発明者らは、多数の特異的揮発性物質（１−ヘキサノール、１ブタノール、ブタン−２，３−ジオン、３−ヒドロキシブタノン、２−ペンタノン、および２ノアノンを含む）を、ＬＢで成長するＯＰ５０細菌のヘッドスペースのＧＣ−ＭＳ分析に基づくさらなる試験に選択した。揮発性リガンドである２−ペンタノンの試験は、これらのセンサのうちの３つ、ＳＧＳＲ−１１２、ＳＧＳＲ−１１３、およびＳＧＳＲ−１１４／１１３に陽性であった（図６４）。非修飾親ＧＰＣＲを用いた研究に基づく事前のリガンドの情報なしに、揮発性リガンドが（または実際にはどのようなリガンドでも）、ＢＲＥＴに基づくＧＰＣＲセンサに対して特定されたのは、これが初めてである。これは、一般的には受容体を、また具体的には線虫の化学受容体を、脱オーファン化するためのＢＲＥＴシステムの有用性の証明である。
【０４１２】
濃度−応答特性（図６５）は、ＥＣ５０がピコモル範囲にある可能性が高いことを示す。これにより、新規な揮発性センサの設計、脱オーファン化、および特徴付けのプロセスの実施を低減させるだけでなく、少なくともＳＧＳＲ−１１２の場合には、親の天然の受容体を脱オーファン化させる実行可能な方法も実証し、ほぼ２０年間で初めてこれが達成された。
【０４１３】
ＢＲＥＴ２タグ化ＳＧＳＲ−１１４／１１３およびＳＧＳＲ−１１３センサは、アルコールおよびケトンを含む広範囲の揮発性リガンドに応答した（図６４）。発明者らは、ＳＧＳＲ−１１４／１１３には６つの揮発性リガンドを特定し、ＳＧＳＲ−１１３には４つを特定した。２−ペンタノンに対するＳＧＳＲ−１１２の応答は、１．５×１０−１０Ｍ（１．３ｐｐｔ）のＥＣ５０で、１×１０−１４Ｍ〜１×１０−５Ｍの９対数単位にわたって線形であった（図６５）。この広い濃度依存性は、これもまた９対数単位にわたり直線であり、また全生物の応答であった、ＢＲＥＴ２タグ化ＯＤＲ−１０と一致する。
【０４１４】
発明者らは、そのリガンドの２つである２−ペンタノンおよびジアセチルに対するＳＧＳＲ−１１４／１１３の感受性、ならびに１−ヘキサノールに対するＳＧＳＲ−１１３の感受性をインビトロで定量化した（図６６）。ＢＲＥＴ２タグ化Ｓｔｒ１１４／１１３受容体は、１０００兆分の１（ｐＭ未満）のレベルのジアセチルおよび１０億分の１（ｎＭ）のレベルの２−ペンタノンを検出することができ、Ｓｔｒ−１１３受容体は、１０億分の１（ｎＭ）のレベルの１−ヘキサノールを検出することができる。これらは、本発明での使用に有用な準広範なセンサであろう。
【０４１５】
ＲＬｕｃ２を有するＢＲＥＴ２タグ化線虫嗅覚受容体の構築
プレートに基づくアッセイで達成した５つの追加の天然および１つのキメラＢＲＥＴ２タグ化センサの脱オーファン化に続いて、発明者らは、それらのそれぞれに、ＲＬｕｃ２突然変異を組み込んだ。これは、上述のように、ＲＬｕｃ２がより明るく、したがってマイクロ流体規模での実際の使用に必須であることが示されていたため、必要であった。
【０４１６】
ＢＲＥＴ２構成成分を、線虫嗅覚受容体の３つ目の細胞内ループ（ＩＣ３）およびＣ末端に、タンパク質のＩＣ３には緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ２、およびＣ末端にはウミシイタケルシフェラーゼＲＬｕｃとともに、挿入した。部位特異的突然変異生成を用いて、ＲＬｕｃ２突然変異を、ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ−５２  ＢＲＥＴ２タグ化嗅覚受容体配列に導入した。プライマー１および２（表３）を使用して、突然変異Ｃ１２４Ａを導入し、プライマー対３および４を使用して、Ｍ１８５Ｖ突然変異を導入した。ＲＬｕｃ２突然変異を、ＯＧＯＲ、Ｓｔｒ−１１２、Ｓｔｒ−１１３、Ｓｔｒ−１１４、Ｓｔｒ−１１４／１１３、Ｓｔｒ−１１５、およびＳｔｒ−１１６、ならびにジアセチルに対する不応答性が以前に既に示されている、Ｓｅｎｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）によって特定された元のｏｄｒ−１０突然変異（Ｈ１１０Ｙ）を含有する、ＯＧＯＲ突然変異体と称される追加のモデル受容体に基づくセンサのすべてに導入した。
【０４１７】
ＧＦＰ２  Ｒｌｕｃ２標識化ＯＧＯＲ、ＯＧＯＲ突然変異体、ＳＧＳＲ−１１２、ＳＧＳＲ−１１３、ＳＧＳＲ−１１４、ＳＧＳＲ−１１４／１１３  ＳＧＳＲ−１１５、およびＳＧＳＲ−１１６、および受容体のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２５〜３２として提供し、一方で対応するオープンリーディングフレームは、それぞれ配列番号３３〜４０として提供する。
【０４１８】
当業者であれば、多数の変化形および／または修正が、広く記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示される本発明になされてもよいことを理解するであろう。本実施形態は、したがって、あらゆる点で例示として見なされ、制限として見なされるものではない。
【０４１９】
本出願は、２０１２年４月１６日に出願されたＵＳ６１／６２４，８９９号、２０１３年４月１２日に出願されたＡＵ２０１３２０４３３２号の優先権を主張し、これらのいずれの全内容も、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４２０】
本明細書に記載および／または参照されるすべての出版物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０４２１】
本明細書に含まれている文書、法令、材料、デバイス、品目等に関するいずれの論議も、単に本発明の内容を提供するためのものである。これらの内容のいずれかまたはすべてが、従来技術の基盤の一部をなすこと、または本出願の各特許請求の範囲の優先日よりも前に存在していたとして本発明に関する分野における一般的知識であったという承認として捉えられるべきではない。
［参考文献］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月7日(2018.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼで切断可能なドメイン、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインを含むセンサー分子であって、前記プロテアーゼが牛乳タンパク質を切断することが可能であり、前記アクセプタードメインに対する前記化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、前記ドメインがプロテアーゼにより切断されると変化する、センサー分子。
【請求項２】
前記プロテアーゼが少なくとも部分的に牛乳の腐敗をもたらす、請求項１に記載のセンサー分子。
【請求項３】
前記プロテアーゼが細菌プロテアーゼである、請求項１または２に記載のセンサー分子。
【請求項４】
前記プロテアーゼがプラスミンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項５】
前記ドメインがアミノ酸配列ＫＺ（式中、Ｚ＝Ｋ、Ｙ、Ｖ、またはＥ）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項６】
前記ドメインがアミノ酸配列ＬＱＸＸＸＸＫＺＫＬＱ（式中、Ｚ＝Ｋ、Ｙ、Ｖ、またはＥ、Ｘ＝任意のアミノ酸）を含む、請求項５に記載のセンサー分子。
【請求項７】
牛乳タンパク質がカゼインである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項８】
牛乳が超高温（ＵＨＴ）処理乳である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項９】
プロテアーゼの不在下で、前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインとの距離および相対配向がフェルスター距離の±５０％以内である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項１０】
前記化学発光ドナードメインは、生物発光タンパク質である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項１１】
前記生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、またはβ−グルコシダーゼである、請求項１０に記載のセンサー分子。
【請求項１２】
前記ルシフェラーゼは、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、腔腸動物ルシフェラーゼ、北アメリカツチボタルルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、レイルロードワームルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、エクオリン、ヒカリキノコバエルシフェラーゼ、あるいはそれらのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくはフラグメント、またはそれらの２つ以上のキメラである、請求項１１に記載のセンサー分子。
【請求項１３】
前記化学発光ドナードメインは、基質を修飾することができる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項１４】
前記基質は、ルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン、またはセレンテラジンの誘導体もしくは類似体である、請求項１３に記載のセンサー分子。
【請求項１５】
前記アクセプタードメインは、蛍光性アクセプタードメインである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項１６】
ｉ）前記生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼまたは生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントである、および／あるいは
ｉｉ）前記基質は、ルシフェリン、セレンテラジン、またはセレンテラジンの誘導体もしくは類似体である、および／あるいは
ｉｉｉ）前記アクセプタードメインは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、またはこれらのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくはフラグメントである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のセンサー分子。
【請求項１７】
ｉ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼであり、前記アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、前記基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｉ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ２であり、前記アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、前記基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｉｉ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、前記アクセプタードメインはＧＦＰ２であり、前記基質はセレンテラジン４００ａである、
ｉｖ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ２であり、前記アクセプタードメインはＶｅｎｕｓであり、前記基質はセレンテラジンである、
ｖ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、前記アクセプタードメインはＶｅｎｕｓであり、前記基質はセレンテラジンである、
ｖｉ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８．６−５３５であり、前記アクセプタードメインはｍＯｒａｎｇｅであり、前記基質はセレンテラジンである、または
ｖｉｉ）前記ルシフェラーゼはウミシイタケルシフェラーゼ８であり、前記アクセプタードメインはｍＯｒａｎｇｅであり、前記基質はセレンテラジンである、請求項１６に記載のセンサー分子。
【請求項１８】
牛乳またはチーズを分類する方法であって、
ｉ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載のセンサー分子、化学発光ドナーの基質、および牛乳もしくはチーズを混合する工程、
ｉｉ）化学発光ドナーによる基質の修飾を検出する工程
を含み、前記アクセプタードメインに対する前記化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、前記ドメインがプロテアーゼにより切断されると変化する、方法。
【請求項１９】
牛乳またはチーズを分類する方法であって、
ｉ）１つ以上のマイクロチャネルを備えるマイクロ流体デバイスを通じて、
ａ）牛乳またはチーズ、
ｂ）プロテアーゼで切断可能なドメイン、化学発光ドナードメイン、およびアクセプタードメインを含むセンサ分子であって、前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインとの距離および相対配向は、プロテアーゼの不在下で、フェルスター距離の±５０％以内である、センサ分子、
ｃ）前記化学発光ドナーの基質
を流動させることと、
ｉｉ）前記センサ分子、基質、および牛乳またはチーズを、前記デバイスにおいて混合することと、
ｉｉｉ）電気光学感知デバイスを使用して、前記化学発光ドナーによる前記基質の修飾を検出することと、
を含み、前記アクセプタードメインに対する前記化学発光ドナードメインの空間位置および／または双極子配向は、前記ドメインがプロテアーゼにより切断されると変化する、方法。
【請求項２０】
ａ）前記センサ分子は、前記デバイスに固定されない、および/または
ｂ）前記化学発光ドナードメインと前記アクセプタードメインの間のエネルギー移動を比率として計算する工程をさらに含む、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
牛乳またはチーズの品質および/または保存可能期間を評価するために使用される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2019037244000001.pdf