(57)【要約】【課題】二重特異性抗体の発現量および活性を向上させるための手段を提供すること。【解決手段】第１の抗原および第２の抗原に対する二重の抗原特異性を有する二重特異性抗体であって、第１の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列ならびに第２の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を任意の順で含み、下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドタグをＮ末端側、Ｃ末端側、またはその両方に有することを特徴とする、二重特異性抗体。Ｘm(ＰＹn)qＰＺr・・・（Ｉ）ここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）から独立して選択されるアミノ酸残基であり、ｍは０〜５の整数であり、ｎは１、２または３であり、ｑは１〜１０の整数であり、ｒ＝０〜１０の整数である。【選択図】図１２
2019146524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の抗原および第２の抗原に対する二重の抗原特異性を有する二重特異性抗体であって、第１の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列ならびに第２の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を任意の順で含み、下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドタグをN末端側、C末端側、またはその両方に有することを特徴とする、二重特異性抗体。
Ｘm(ＰＹn)qＰＺr・・・（Ｉ）
ここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）から独立して選択されるアミノ酸残基であり、ｍは０〜５の整数であり、ｎは１、２または３であり、ｑは１〜１０の整数であり、ｒ＝０〜１０の整数である。
【請求項２】
前記ペプチドタグの配列が配列番号２９〜８７のいずれかで表される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記ペプチドタグの配列が配列番号２９または３１のいずれかで表される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
第１の抗原に対する抗体の重鎖可変領域（1H）および軽鎖可変領域（1L）の配列ならびに第２の抗原に対する抗体の重鎖可変領域（2H）および軽鎖可変領域（2L）の配列の並びが以下のいずれかである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
1H-1L-2H-2L
1H-1L-2L-2H
1L-1H-2H-2L
1L-1H-2L-2H
1H-2L-1L-2H
1H-2L-2H-1L
1L-2H-2L-1H 
1L-2H-1H-2L
【請求項５】
各可変領域の配列がペプチドリンカーを介して連結されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
前記ペプチドリンカーの長さが、それぞれ１〜２０アミノ酸である、請求項５に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
第１の抗原および第２の抗原がヒト上皮細胞成長因子受容体１（EGFR1）およびヒトCD3である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
ヒトEGFR1に対する抗体由来の重鎖可変領域（5H）および軽鎖可変領域（5L）の配列が、それぞれ配列番号６および８のアミノ酸配列、または配列番号６および８のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、ヒトEGFR1に対する抗原特異性を維持したアミノ酸配列であり、
ヒトCD3に対する抗体由来の重鎖可変領域（OH）および軽鎖可変領域（OL）の配列が配列番号２および４のアミノ酸配列、または配列番号２および４のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、ヒトCD3に対する抗原特異性を維持したアミノ酸配列である、請求項７に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
前記二重特異性抗体が以下のいずれかの構造を有する、請求項８に記載の二重特異性抗体。
OL-5H-5L-OH・・・sc1
OH-5L-5H-OL・・・sc2
5L-OH-OL-5H・・・sc3
5H-OL-OH-5L・・・sc4
5L-OH-5H-OL・・・sc5
OL-5H-OH-5L・・・sc6
5H-OL-5L-OH・・・sc7
OH-5L-OL-5H・・・sc8
5L-5H-OH-OL・・・ta1
OH-OL-5L-5H・・・ta2
5H-5L-OL-OH・・・ta3
OL-OH-5L-5H・・・ta4
5L-5H-OL-OH・・・ta5
OH-OL-5H-5L・・・ta6
OL-OH-5H-5L・・・ta7
5H-5L-OH-OL・・・ta8
【請求項１０】
前記二重特異性抗体が以下のいずれかの構造を有する、請求項８に記載の二重特異性抗体。
OH-OL-5L-5H・・・ta2
OH-OL-5H-5L・・・ta6
OL-5H-5L-OH・・・sc1
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードするDNA。
【請求項１３】
請求項１２に記載のDNAを含む組み換えベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のDNAまたは請求項１３に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、原核細胞であることを特徴とする、請求項１４に記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
前記原核細胞が、大腸菌であることを特徴とする、請求項１５に記載の形質転換細胞。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の形質転換細胞を培地で培養し、培地中または形質転換細胞中に請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を蓄積させる工程を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬として有用な二重特異性抗体の発現量および機能を向上させる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性抗体はダイアボディとも呼ばれ、二種類の抗原に対して抗原特異性を示すため、その二重特異性を利用した医薬として期待されている。本発明者の一人である浅野のグループは、上皮細胞成長因子受容体（EGFR）とCD3に特異性を有する二重特異性抗体の作製に成功し、その後も抗体特性を上げるために構造や配列などについて改良を重ねてきた（例えば、特許文献１〜９）。
【０００３】
一方、特許文献１０には特定のアミノ酸配列を有するペプチドタグが開示され、このペプチドタグをタンパク質のN末端またはC末端に付加したところタンパク質の発現量が向上したことが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2015-156836
【特許文献２】特開2012-179051
【特許文献３】特開2012-161324
【特許文献４】特開2005-333993
【特許文献５】特開2004-242638
【特許文献６】WO2015/146438
【特許文献７】WO2015/146437
【特許文献８】WO2010/109924
【特許文献９】WO2007/108152
【特許文献１０】WO2017/115853
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の通り、二重特異性抗体については改良が試みられてきたが、高分子であることから宿主における発現量は十分ではなく、また、活性についても改善の余地があった。そこで本発明は、二重特異性抗体の発現量および活性の両方を改善する手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、二重特異性抗体の発現量を上げるべく鋭意検討を行った結果、二重特異性抗体のN末端および／またはC末端に下記一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドタグを付加して発現させたところ、その発現量が顕著に向上することを見出した。さらに、驚くべきことに、ペプチドタグを付加した二重特異性抗体は発現量だけでなく活性（がん細胞殺傷効果）も向上することが判明した。このような知見に基づいて、本発明は完成に至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］第１の抗原および第２の抗原に対する二重の抗原特異性を有する二重特異性抗体であって、第１の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列ならびに第２の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を任意の順で含
み、下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドタグをN末端側、C末端側、またはその両方に有することを特徴とする、二重特異性抗体。
Ｘm(ＰＹn)qＰＺr・・・（Ｉ）
ここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）から独立して選択されるアミノ酸残基であり、ｍは０〜５の整数であり、ｎは１、２または３であり、ｑは１〜１０の整数であり、ｒ＝０〜１０の整数である。
［２］前記ペプチドタグの配列が配列番号２９〜８７のいずれかで表される、［１］に記載の二重特異性抗体。
［３］前記ペプチドタグの配列が配列番号２９または３１のいずれかで表される、［１］に記載の二重特異性抗体。
［４］第１の抗原に対する抗体の重鎖可変領域（1H）および軽鎖可変領域（1L）の配列ならびに第２の抗原に対する抗体の重鎖可変領域（2H）および軽鎖可変領域（2L）の配列の並びが以下のいずれかである、［１］〜［３］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
1H-1L-2H-2L
1H-1L-2L-2H
1L-1H-2H-2L
1L-1H-2L-2H
1H-2L-1L-2H
1H-2L-2H-1L
1L-2H-2L-1H 
1L-2H-1H-2L
［５］各可変領域の配列がペプチドリンカーを介して連結されている、［１］〜［４］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
［６］前記ペプチドリンカーの長さが、それぞれ１〜２０アミノ酸である、［５］に記載の二重特異性抗体。
［７］第１の抗原および第２の抗原がヒト上皮細胞成長因子受容体１（EGFR1）およびヒトCD3である、［１］〜［６］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
［８］ヒトEGFR1に対する抗体由来の重鎖可変領域（5H）および軽鎖可変領域（5L）の配列が、それぞれ配列番号６および８のアミノ酸配列、または配列番号６および８のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、ヒトEGFR1に対する抗原特異性を維持したアミノ酸配列であり、
ヒトCD3に対する抗体由来の重鎖可変領域（OH）および軽鎖可変領域（OL）の配列が配列番号２および４のアミノ酸配列、または配列番号２および４のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、ヒトCD3に対する抗原特異性を維持したアミノ酸配列である、［７］に記載の二重特異性抗体。
［９］前記二重特異性抗体が以下のいずれかの構造を有する、［８］に記載の二重特異性抗体。
OL-5H-5L-OH・・・sc1
OH-5L-5H-OL・・・sc2
5L-OH-OL-5H・・・sc3
5H-OL-OH-5L・・・sc4
5L-OH-5H-OL・・・sc5
OL-5H-OH-5L・・・sc6
5H-OL-5L-OH・・・sc7
OH-5L-OL-5H・・・sc8
5L-5H-OH-OL・・・ta1
OH-OL-5L-5H・・・ta2
5H-5L-OL-OH・・・ta3
OL-OH-5L-5H・・・ta4
5L-5H-OL-OH・・・ta5
OH-OL-5H-5L・・・ta6
OL-OH-5H-5L・・・ta7
5H-5L-OH-OL・・・ta8
［１０］前記二重特異性抗体が以下のいずれかの構造を有する、［８］に記載の二重特異性抗体。
OH-OL-5L-5H・・・ta2
OH-OL-5H-5L・・・ta6
OL-5H-5L-OH・・・sc1
［１１］［１］〜［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
［１２］［１］〜［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードするDNA。
［１３］［１２］に記載のDNAを含む組み換えベクター。
［１４］［１２］に記載のDNAまたは［１３］に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換細胞。
［１５］前記細胞が、原核細胞であることを特徴とする、［１４］に記載の形質転換細胞。
［１６］前記原核細胞が、大腸菌であることを特徴とする、［１５］に記載の形質転換細胞。
［１７］［１４］〜［１６］のいずれかに記載の形質転換細胞を培地で培養し、培地中または形質転換細胞中に［１］〜［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体を蓄積させる工程を含む、［１］〜［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体の製造法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の二重鎖特異性抗体は宿主細胞における発現量が多いという利点がある。また、本発明の二重特異性抗体はペプチドタグを付加しない場合と比べて活性（がん細胞傷害活性など）が高いという利点もある。したがって、本発明によれば、活性の高い二重鎖特異性抗体を効率よく製造することができ、医薬等の分野において貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、二重特異性抗体における各可変領域の配向性を示す図である。
【図２】図２は、酵母発現用の二重特異性抗体（ta6）の配列を示す図である。PG12タグを付加しないもの（ta6：配列番号２５）、PG12タグN末端付加（N-ta6：配列番号２６）、PG12タグC末端付加（C-ta6：配列番号２７）、PG12タグ両末端付加（NC-ta6：配列番号２８）、のそれぞれについて示した。
【図３】図３は、酵母における二重特異性抗体（ta6）の発現結果を示す図（一部写真）である。各群、ｎ＝３で評価した。
【図４】図４は、大腸菌発現用の二重特異性抗体（sc1）の配列を示す図である。PX12-20タグを付加しないもの（sc1：配列番号９）、PX12-20タグN末端付加（N-sc1：配列番号１０）、PX12-20タグC末端付加（C-sc1：配列番号１１）、PX12-20タグ両末端付加（NC-sc1：配列番号１２）、のそれぞれについて示した。
【図５】図５は、図４の二重特異性抗体の大腸菌における発現量を示すグラフである。発現量は培養上清、破砕上清、沈殿画分のそれぞれで調べた。
【図６】図６は、大腸菌発現用の二重特異性抗体（ta2）の配列を示す図である。PX12-20タグを付加しないもの（ta2：配列番号１３）、PX12-20タグN末端付加（N-ta2：配列番号１４）、PX12-20タグC末端付加（C-ta2：配列番号１５）、PX12-20タグ両末端付加（NC-ta2：配列番号１６）、のそれぞれについて示した。
【図７】図７は、図６の二重特異性抗体の大腸菌における発現量を示すグラフである。発現量は培養上清、破砕上清、沈殿画分のそれぞれで調べた。
【図８】図８は、大腸菌発現用の二重特異性抗体（ta2、第２リンカーをSTDGNTとしたもの）の配列を示す図である。PX12-20タグを付加しないもの（ta2-STDGNT：配列番号１７）、PX12-20タグN末端付加（N-ta2-STDGNT：配列番号１８）、PX12-20タグC末端付加（C-ta2-STDGNT：配列番号１９）、PX12-20タグ両末端付加（NC-ta2-STDGNT：配列番号２０）、のそれぞれについて示した。
【図９】図９は、図８の二重特異性抗体の大腸菌における発現量を示すグラフである。発現量は培養上清、破砕上清、沈殿画分のそれぞれで調べた。
【図１０】図１０は、大腸菌発現用の二重特異性抗体（ta6、第２リンカーをSTDGNTとしたもの）の配列を示す図である。PX12-20タグを付加しないもの（ta6-STDGNT：配列番号２１）、PX12-20タグN末端付加（N-ta6-STDGNT：配列番号２２）、PX12-20タグC末端付加（C-ta6-STDGNT：配列番号２３）、PX12-20タグ両末端付加（NC-ta6-STDGNT：配列番号２４）、のそれぞれについて示した。
【図１１】図１１は、図１０の二重特異性抗体の大腸菌における発現量を示すグラフである。発現量は培養上清、破砕上清、沈殿画分のそれぞれで調べた。
【図１２】図１２は、PX12-20をN末端、C末端またはNC両末端に付加した二重特異性抗体（sc1）の細胞傷害活性をMTSアッセイで調べた結果を示す図である。1fM〜0.01nMの濃度範囲で調べた。
【図１３】図１３は、PX12-20をN末端、C末端またはNC両末端に付加した二重特異性抗体（sc1）の細胞傷害活性をMTSアッセイで調べた結果を示す図である。0.063 pM〜1 pMの濃度範囲で調べた。
【図１４】図１４は、PX12-20をN末端、C末端またはNC両末端に付加した二重特異性抗体（ta2）の細胞傷害活性をMTSアッセイで調べた結果を示す図である。1 fM〜0.01 nMの濃度範囲で調べた。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の二重特異性抗体は、第１の抗原および第２の抗原に対する二重の抗原特異性を有する二重特異性抗体であって、一分子中に、第１の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列ならびに第２の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列を任意の順で含み、下記の一般式（Ｉ）で表されるペプチドタグをN末端、C末端、またはその両方に有することを特徴とする。
【００１１】
第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体の組み合わせは特に制限されず、目的に応じて適宜選択できる。例えば、抗体の標的部位（ヒトなどのがん細胞表面やウイルスまたは病原体表面など）に発現する２種類の抗原に対する抗体の組み合わせを選択することができる。第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体はヒト抗体、マウス抗体などが挙げられるが、ヒト化抗体やキメラ抗体でもよい。
【００１２】
第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域の配列は公知の配列でもよいし、新たに取得されたモノクローナル抗体について配列解析で同定される配列でもよい。なお、重鎖および軽鎖可変領域の配列は公知の配列そのものでもよいが、抗原認識機能が維持（向上を含む、以下同じ）される限り、各可変領域の配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入された配列でもよい。ここで、数個とは、例えば、２〜１０個、２〜５個、または２〜３個である。なお、置換は酸性アミノ酸同士、塩基性アミノ酸同士、中性アミノ酸同士というように類似の性質を有するアミノ酸間での置換などの保存的置換が好ましい。置換、欠失、付加または挿入が導入される部位は、可変領域における相補性決定領域（CDR）以外の領域でもよいし、CDR内でもよい。最近は、ファージデイスプレイなどのディスプレイ法を用いて、もとの抗体の抗原特異性を維持または向上させるようなCDR内のアミノ酸改変も数多く行われているからである。
【００１３】
二重特異性抗体の一例としては、具体的には、抗上皮細胞成長因子受容体（EGFR）抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびに抗CD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体が挙げられる。EGFRはヒトEGFRが好ましく、ヒトEGFR1（HER1と呼ばれることもある）がより好ましい。CD3はヒトCD3が好ましい。
抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域（5H）および軽鎖可変領域（5L）、ならびに抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域（OH）および軽鎖可変領域（OL）のアミノ酸配列は、特許文献１〜９のような公知の文献に記載の配列を採用することができる。
【００１４】
これらの中でも、後述の実施例で使用した配列を使用することが好ましい。
具体的には、抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号６および８で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましく、抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号２および４で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００１５】
ただし、抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびに抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、上記の通り、抗原特異性が維持される限り、上記各アミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の改変が導入された配列でもよい。ここで、数個とは、例えば、２〜１０個、２〜５個、または２〜３個である。なお、置換は同種のアミノ酸への置換などの保存的置換が好ましい。
言い換えると、抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列、ならびに抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれの抗原特異性が維持される限り、上記各アミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものでもよい。ここで、％同一性とは、２種類のアミノ酸配列を、両者で一致するアミノ酸の数が最大になるように必要に応じてギャップを挿入して並べたときの、全アミノ酸数に対する、一致するアミノ酸数の割合として定義される。
【００１６】
各可変領域配列はペプチドリンカーを介して配列されていることが好ましい。
すなわち、可変領域のアミノ酸配列は、第１の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、および第２の抗原に対する抗体由来の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、の４つが存在するが、それらの間には第１、第２、第３のペプチドリンカーが存在することができる。
ペプチドリンカーの配列は二重特異性抗体の抗原特異性に悪影響を与えない配列であれば特に制限されないが、グリシンとセリンを含むペプチドリンカーが好ましい。アルギニンやアラニンも含まれてよい。ペプチドリンカー配列におけるグリシンとセリンの割合は、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％である。
ペプチドリンカーの長さは、例えば、１〜２０アミノ酸である。
また、第２のペプチドリンカー、すなわち、N末から数えて２番目のリンカーはSTDGNT（配列番号８８）等の他の配列であってもよい。
【００１７】
二重特異性抗体における、４つの可変領域の並び（配向性）は特に限定されないが、二重特異性抗体が折り畳み構造を取った時に、第１の抗原に対する重鎖可変領域（1H）と軽鎖可変領域（1L）、第２の抗原に対する重鎖可変領域（2H）と軽鎖可変領域（2L）、とがそれぞれ会合しやすくなる並びが好ましく、以下のような並びが好ましい。
1H-1L-2H-2L
1H-1L-2L-2H
1L-1H-2H-2L
1L-1H-2L-2H
1H-2L-1L-2H
1H-2L-2H-1L
1L-2H-2L-1H 
1L-2H-1H-2L
すなわち、第１の抗原に対する重鎖可変領域（1H）と軽鎖可変領域（1L）がＮ末側から数えて１、２番目、１、３番目、１、４番目、２、３番目、３、４番目に配置される並びが好ましい。
【００１８】
例えば、抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域（5H）および軽鎖可変領域（5L）、ならびに抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域（OH）および軽鎖可変領域（OL）を含む二重特異性抗体の場合は、図１に示される並びが好ましい。
この中でも、以下の並びが好ましい。
OH-OL-5L-5H・・・ta2
OH-OL-5H-5L・・・ta6
OL-5H-5L-OH・・・sc1
【００１９】
二重特異性抗体のN末端側および／またはC末端側に付加されるペプチドタグは下記の配列を有する。
Ｘm(ＰＹn)qＰＺr・・・（Ｉ）
ここで、Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）から独立して選択されるアミノ酸残基である。
【００２０】
ＸmとはＸがｍ個連続することを意味し、この場合のｍ個のＸはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｈから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよい。ｍは０〜５の整数であるが、好ましくは１〜５の整数、より好ましくは１〜３の整数である。
【００２１】
(ＰＹn)qとはＰＹn、すなわち、ｎが１、２または３なので、ＰＹ、ＰＹＹまたはＰＹＹＹがq回連続することを意味する（Ｐはプロリンを示す）。ＰＹ、ＰＹＹとＰＹＹＹが合計でq回連続していればよい。
ここで、それぞれのＹはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｑから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよいが、q回連続するＰＹnに含まれるＹのうち、少なくとも１つはＫ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＨまたはＲであることが好ましい。q回連続するＰＹnに含まれるＹのうち、２つ以上がＫ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＨまたはＲであることがより好ましい。ｑは１〜１０の整数であり、好ましくは２〜１０の整数、より好ましくは２〜５の整数、さらに好ましくは２〜３の整数である。
【００２２】
ＰＺrとはＰの後にＺがｒ個連続することを意味し、この場合のｒ個のＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｑから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよい。ｒは０〜１０の整数であるが、好ましくは１〜１０の整数、より好ましくは１〜５の整数である。
【００２３】
ペプチドタグは、長さが６〜５０アミノ酸であることが好ましく、６〜４０アミノ酸であることがより好ましく、８〜４０アミノ酸であることがさらに好ましく、１０〜３０アミノ酸であることがいっそう好ましく、１２〜２５アミノ酸であることがよりいっそう好ましく、１２〜２０アミノ酸であることが特に好ましい。
【００２４】
ペプチドタグにおいて、全アミノ酸に対するグリシンとセリンを合わせた含有率が６０％未満であることが好ましく、５７％未満であることがより好ましい。
【００２５】
ペプチドタグは下記のPG12、またはPG17であってもよい。
RSPGSGPGSPRS・・・PG12（配列番号２９）
RSPGSGPGSPRSPGSRS・・・PG17（配列番号３０）
これらのうち、好ましくは、PG12である。
【００２６】
また、本発明で使用可能なペプチドタグの一態様としては、上記PG12またはPG17において、１〜数個（例えば、１〜６個、好ましくは２〜６個）のアミノ酸がＫ、Ｌ、ＮまたはＱに置換されたアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。また、PG12またはPG17において、Ｐ、Ｒ以外のアミノ酸のうち、１〜数個（例えば、１〜５個、好ましくは２〜５個）のアミノ酸がＲに置換されたアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。ここで、PG12またはPG17において置換されるアミノ酸はＰとＰの間のアミノ酸であることがより好ましい。
【００２７】
このようなペプチドタグの具体例としては、例えば、配列番号３１〜８７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドタグである。その中では、下記のPX12-20が好ましい。
RKPGKGPGKPRS・・・PX12-20（配列番号３１）
【００２８】
本発明の二重特異性抗体は、二重特異性抗体に上記ペプチドタグが結合したものである。二重特異性抗体のN末端にペプチドタグが結合してもよいし、二重特異性抗体のC末端にペプチドタグが結合してもよいし、二重特異性抗体のN末端とC末端の両方にペプチドタグが結合してもよい。
ここで、C末端とは、二重特異性抗体における４つの可変領域のうち、もっともC末側の可変領域のC末端にペプチドタグが付加されていればよく、必ずしも、タンパク質全体のC末端にペプチドタグが存在していることを要求しない。すなわち、二重特異性抗体においては、C末端側にタグが付加され、さらに、そのC末端に他の配列（例えば、Hisタグ、HNタグ、FLAGタグなどの検出や精製などに必要なタグ配列、分泌シグナルペプチド配列、輸送シグナルペプチド配列など）が付加されてもよい。
N末端および両末端に付加される場合も同様に定義される。
なお、二重特異性抗体のN末端および／またはC末端にペプチドタグが直接結合してもよいし、１〜数アミノ酸（例えば、１〜５アミノ酸）の配列を介して結合してもよい。１〜数アミノ酸の配列は二重特異性抗体の機能や発現量に悪影響を及ぼさない配列であれば任意の配列でよい。
【００２９】
上記分泌シグナルペプチドとしては、酵母を宿主とする場合は、インベルターゼ分泌シグナル、P3分泌シグナル、α因子分泌シグナルなどが挙げられ、大腸菌を宿主とする場合はPelB分泌シグナルが挙げられ、ブレビバチルスを宿主とする場合はP22分泌シグナルが挙げられる。また、植物や哺乳動物など宿主に応じた分泌シグナルが使用できる。
【００３０】
上記輸送シグナルペプチドとしては、宿主に応じて選択することができるが、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等が例示される。
【００３１】
本発明の二重特異性抗体は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。
【００３２】
本発明の二重特異性抗体をコードするDNAは、第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域の配列をそれぞれコードするDNA、ペプチドタグをコードするDNAおよび必要に応じてリンカーをコードするDNAやシグナル配列などをコードするDNAを含む。
【００３３】
本発明の二重特異性抗体をコードするDNAは、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Mani
atis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載された一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、例えば、第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域の配列をそれぞれコードするDNA、ペプチドタグをコードするDNAおよび必要に応じてリンカーをコードするDNAやシグナル配列などをコードするDNA等をPCR等の公知の方法で取得し、それらをPCRやDNAリガーゼ等を用いて連結することで構築することができる。なお、各DNAはコドンの読み枠を合わせて連結される。
【００３４】
第１の抗原に対する抗体および第２の抗原に対する抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域の配列をそれぞれコードするDNAとしては、公知の配列でもよいし、新たにクローニングして得られる配列でもよい。例えば、抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域コードするDNA、ならびに、抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするDNAは特許文献１〜９に記載されている配列が例示される。
抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域コードするDNAは、好ましくは、それぞれ、上記配列番号６および８のアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、より具体的には、それぞれ、配列番号５および７の塩基配列を含むDNAである。
また、抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域コードするDNAは、好ましくは、上記配列番号２および４のアミノ酸配列をそれぞれをコードする塩基配列であり、より具体的には、それぞれ、配列番号１および３の塩基配列を含むDNAである。
ただし、これらの塩基配列は目的のアミノ酸配列をコードする限り、コドンを変更してもよい。また、コードされる可変領域が二重特異性を維持する限り、上記各塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列でもよい。
ここで、ストリンジェントな条件としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのＤＮＡ同士、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのＤＮＡがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのＤＮＡがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば２×ＳＳＣ（３３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  クエン酸）、４２℃が挙げられ、好ましくは０．１×ＳＳＣ（３３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  クエン酸）、６０℃で洗浄する条件が挙げられる。
【００３５】
ペプチドタグをコードするDNAは上記ペプチドタグをコードする限り特に制限されないが、特許文献１０などに開示された配列が例示される。
【００３６】
また、リンカーをコードするDNAやシグナル配列などをコードするDNAもコードするアミノ酸配列から推定される塩基配列を有するDNAとすることができ、公知の塩基配列を有するDNAを利用することができる。
【００３７】
また、本発明の二重特異性抗体をコードするDNAは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、二重特異性抗体を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
【００３８】
本発明のDNAは、宿主細胞における発現を向上させるために、宿主細胞において機能するエンハンサー配列等を含むものであってもよい。エンハンサーとしては、Kozak配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域が挙げられる。
【００３９】
本発明の組換えベクターは、本発明の二重特異性抗体をコードするDNAが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されているものであれ
ばよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。具体的なプラスミドベクターとして、例えば、pTrcHis2ベクター、pUC119、pBR322、pBluescript II KS+、pYES2、pAUR123、pQE-Tri、pET、pGEM-3Z、pGEX、pMAL、pRI909、pRI910、pBI221、pBI121、pBI101、pIG121Hm、pTrc99A、 pKK223、pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等が例示される。
【００４０】
ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、酵母で発現させる場合、GAL1プロモーター、PGK1プロモーター、TEF1プロモーター、ADH1プロモーター、TPI1プロモーター、PYK1プロモーターなどが使用可能である。植物で発現させる場合、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター、レタスのユビキチンプロモーターなどが使用可能である。大腸菌で発現させる場合、T7プロモーターなどが挙げられ、ブレビバチルスで発現させる場合、P2プロモーターやP22プロモーターなどが挙げられる。哺乳動物細胞で発現させる場合、CMVプロモーター、CAGプロモーター、EF-1αプロモーターなどが挙げられる。
誘導可能なプロモーターであってもよく、例えば、IPTGにより誘導可能なプロモーターであるlac、tac、trcの他、IAAで誘導可能なtrp、L-アラビノースで誘導可能なara、テトラサイクリンを用いて誘導可能なPzt-1、高温（42℃）で誘導可能なPLプロモーター、コールドショック遺伝子の一つであるcspA遺伝子のプロモーターなどが使用できる。
また、必要に応じ、ターミネーター配列も宿主細胞に応じて含めることができる。
【００４１】
本発明の組換えベクターは、例えば、本発明の二重特異性抗体をコードするDNAを適当な制限酵素で切断またはPCRによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入することによって作製することができる。
【００４２】
本発明の形質転換細胞は、前記DNAまたはそれを含む組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は原核細胞および真核細胞の何れでもよいが、原核細胞が好ましい。
原核細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、乳酸菌（Lactobacillus）、枯草菌（Bacillus）、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）、放線菌などが挙げられる。真核細胞としては、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが好ましく用いられる。酵母としては、Saccharomyces cerevisiaeやCandida utilisやSchizosaccharomyces pombe、Pichia pastorisなどが挙げられる。さらに、麹菌（Aspergillus）等の微生物を用いることもできる。植物細胞としては、アキノノゲシ属（Lactuca）などのキク科（Astaraceae）、ナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、バラ科（Rosaceae）、アカザ科（Chenopodiaceae）に属する植物の細胞などが挙げられる。哺乳動物細胞としては、CHO細胞、COS細胞、Hela細胞、HEK細胞などが挙げられる。
【００４３】
本発明の形質転換細胞は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki, et al., FEBS Lett. 1998 May 29;428(3):235-40.）などの方法を用いることが可能である。なお、遺伝子発現は一過的発現でもよく、染色体に組み込まれる安定的発現でもよい。
【００４４】
本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって形質転換体を選抜することができる。そして、選抜した形質転換体を培養することにより、本発明の二重特異性抗体を生産することができる。培養に用いる培地および条件は、形質転換細胞の種類に応じて適宜選択することができる。培養時間は十分量生産される時間であればよく、例えば、１０時間〜５０時間である。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内または植物細胞の細胞膜外に前記二重特異性抗体を蓄積させることができる。
【００４５】
培地や細胞内に蓄積した本発明の二重特異性抗体は、当業者によく知られた方法に従って分離精製することができる。例えば、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、本発明の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とする。本発明の医薬組成物の用途は含まれる可変領域の配列によって適宜定められるが、抗がん剤であることが好ましい。抗ヒトEGFR1抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびに抗ヒトCD3抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む二重特異性抗体を有効成分とする場合は、当該二重特異性抗体がインビトロおよびインビボで上皮細胞成長因子受容体を発現する（陽性）腫瘍細胞を有意に排除・殺傷・傷害する作用を有しているので、このようながん細胞に対する抗がん剤として使用することが出来る。
【００４７】
本発明の医薬組成物の有効成分の有効量は、例えば治療目的、疾患の種類、部位および大きさ等の投与対象における病状、患者の諸条件、および投与経路等によって当業者が適宜決めることが出来る。典型的な１回の投与量または日用量は、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００４８】
本発明の医薬組成物には、有効成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、有効成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することが出来る。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、および、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、およびマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。
【００５０】
投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特には胆管内、または病変内経路による注入または注射、および持続放出型システム製剤による方法が挙げられる。
【００５１】
＜実施例＞
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の態様は以下の実施例の態様には限定されない。
【実施例１】
【００５２】
＜酵母での発現＞
N末端および／またはC末端にペプチドタグを付加したEGFR1およびCD3に対する二重特異性を有する二重特異性抗体を発現させるためのDNAを構築し、Pichia酵母（Pichia pastor
is，PPS-9010株，DNA2.0社）において発現させ、発現量に対するペプチドタグ付加の効果を調べた。
ペプチドタグ（PG-12）をta6のN末端、C末端およびNC両末端に付加し（図２）、これにKozak配列と分泌シグナル（α-Factor由来）を付加したうえで、制限酵素BsaIで線状化したPichia酵母用ベクター（pJ902-15，DNA2.0社）に結合させた。得られたプラスミドを制限酵素sacIで線状化し、エレクトロポレーションにてPichia酵母を形質転換した。
【００５３】
形質転換後のシングルコロニーをYPDプレート培地に塗株し、30℃、24時間インキュベーター中に静置し培養を行った。次に、培養後のプレート培地より滅菌ディスポループで菌体をかきとり、3ml前培養培地（BMGY）を分注した滅菌ポリスチレン製14mlチューブに植菌し、30℃、150 rpm、48時間振盪培養を行った。前培養物を、1,500g・室温で10分間遠心分離を行い、上清を除去後、沈殿を3mLの誘導培地（BMMY）に懸濁し、200 rpm，25℃にて振盪培養を行った。誘導培養中、12時間ごとに培養量の0.5%相当量のメタノールを添加した。
【００５４】
培養終了後、培養上清に等量の2xサンプルバッファー（ATTO，EzApply，AE-1430）を加え、95℃で10分間加温し、サンプルのSDS化を行った。このサンプルを用いてSDS-PAGEを行った。電気泳動後のゲルを、ニトロセルロースメンブレンに転写し、室温で1時間ブロッキング（ブロッキング溶液 TBS系, ナカライテスク)し、室温で1時間振盪後、TBS-Tでウォッシュし、anti c-myc, monoclonal antibody（wako, 017-21871） を溶解したTBS-Tを加えて1時間インキュベートした。TBS-Tでウォッシュしたのち、anti-Mouse IgG, AP-linked antibody（Cell Signaling Technology，7056）溶解したTBS-Tを加えて1時間インキュベートした。TBS-Tでウォッシュし、アルカリホスファターゼによる発色反応は、ニトロブルーテトラゾリウムと5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸を含む検出試薬で発色を検出した。
【００５５】
結果
結果を図３に示す。PG12タグをC末端または両末端に付加したときに発現量の向上が見られた。
【実施例２】
【００５６】
＜大腸菌での発現＞
N末端および／またはC末端にペプチドタグ（PX12-20）を付加したEGFR1およびCD3に対する二重特異性を有する二重特異性抗体を発現させるためのDNAを構築し、大腸菌（Escherichia coli）において発現させ、発現量に対するペプチドタグ付加の効果を調べた。
【００５７】
配列は以下の通りとし、大腸菌発現ベクターでありT7プロモーターを有するpRAベクターに組み込んで発現させた。
PX12-20をsc1のN末端、C末端およびNC両末端に付加（図４）
PX12-20をta2のN末端、C末端およびNC両末端に付加（図６）
PX12-20をリンカー改変体ta2-STDGNTのN末端、C末端およびNC両末端に付加（図８）
PX12-20をリンカー改変体ta6-STDGNTのN末端、C末端およびNC両末端に付加（図１０）
【００５８】
培養方法および発現確認方法は以下の通りである。
【表１】
2019146524.tif 000003
(50x 5052の組成:Glycerol 25g, Glucose 2.5 g, Lactose monohydrate 10.4 g, DW up to 100 mL)
(20x NPSの組成:(NH4)2SO4 6.6 g, KH2PO4 13.6 g, Na2HPO4 14.2 g, DW up to 100 mL)
LB培地以外は培養を始めるときに添加
【００５９】
【表２】
2019146524.tif 000004
【００６０】
3 mLスケールでの発現確認
大腸菌BL21 star (DE3)を形質転換し、オートインダクション用のLB培地3 mL (Amp (+))に植菌した。28℃, 170 rpmで一晩浸とう培養を行い、培養液を1 mLずつマイクロチューブに取り分けた。4℃, 12000 rpmで5分間遠心し、培地上清(=Culture supernatant)、沈殿に分けた。沈殿にはPBSを200 μL加えたのち超音波破砕を行い、100 μL分のみマイクロチューブに取り分けて4℃, 15000 rpmで5分間遠心し破砕上清(=Intracellular soluble
fraction)と破砕沈殿(=Insoluble fraction)に分離した。
培地上清、破砕上清についてはTCA(トリクロロ酢酸)沈殿による濃縮を行った。1 mLの培地上清には100 μLのTCAを加え、100 μLの破砕上清には、900 μLのMQを加えることで液量を1 mLにした後に100 μLのTCAを加えた。これらを転倒混和して室温で10分間静置し、4℃, 15000 rpmで10分間遠心を行った。上清を捨て、MQを500 μL加え転倒混和して洗浄した後に再度4℃, 15000 rpmで5分間遠心を行い、上清を捨てた。さらに、デシケーターを用いて残った水を蒸発させ、SDS-PAGE用Sample Bufferを30 μLとMQを30 μLずつ加えて95℃で10分間熱処理を行った。
これらのサンプルを用いてSDS-PAGEを行った。泳動後のゲルを用いてニトロセルロースメンブレンに転写し、転写を終えたゲルをCBB染色した。ニトロセルロースメンブレンは5% skimmed milk/PBS-Tで30分〜１時間ブロッキングを行った後、PBS-Tでウォッシュし、HRP conjugate抗Hisタグ抗体を溶解したPBS-Tを加えて30分間インキュベートした。PBS-Tでウォッシュした後、ルミノールと過酸化水素を含む検出試薬で化学発光を検出した。
【００６１】
フラスコを用いた培養とWestern blottingによる発現確認
大腸菌BL21 star (DE3)を形質転換し、生えたコロニーに対して1 mLのLB培地を加えて混合し、50 μL分取して3 mLのLB培地(Amp (+))に植菌した。28℃, 170 rpmで17時間前培養を行った。1 mLの前培養液を100 mLまたは200 mLのオートインダクション用培地、また
は200 mL の2x YT培地に添加し、20℃, 170 rpmで46時間行った。2x YT培地については22時間後に、IPTG誘導をかけた(終濃度1 mM)。
培養後、1 mLサンプリングし、3 mLスケールでの発現確認の方法と同様にWestern blottingを行った。
また、200 mLスケールでの培養を行ったものについては、種々の濃度に希釈したmultitopeタグの蛍光強度から検量線を引き、定量を行った。
【００６２】
結果
図４の配列をコードするDNAで形質転換された大腸菌を2x YT培地 200 mLで培養した。抗His tag抗体を用いてWestern blottingを行い、multitopeタグの蛍光強度から発現量を算出した結果を図５に示す。その結果、PX12-20タグをsc１のN末端または両末端に付加した時に沈殿画分における発現量の向上が見られた。
【００６３】
図６の配列をコードするDNAで形質転換された大腸菌をオートインダクション用培地200
mLで培養した。抗His tag抗体を用いてWestern blottingを行い、multitopeタグの蛍光強度から発現量を算出した結果を図７に示す。その結果、PX12-20タグをta2のN末端、C末端または両末端に付加した時に沈殿画分における発現量の向上が見られた。
【００６４】
図８の配列をコードするDNAで形質転換された大腸菌をオートインダクション用培地 3 mLで培養した。抗His tag抗体を用いてWestern blottingを行い、multitopeタグの蛍光強度から発現量を算出した結果を図９に示す。その結果、PX12-20タグをta2（STDGNTリンカー）のC末端または両末端に付加した時に沈殿画分および破砕上清における発現量の向上が見られた。
【００６５】
図１０の配列をコードするDNAで形質転換された大腸菌をオートインダクション用培地 3 mLで培養した。抗His tag抗体を用いてWestern blottingを行い、multitopeタグの蛍光強度から発現量を算出した結果を図１１に示す。その結果、PX12-20タグをta6（STDGNTリンカー）のN末端、C末端または両末端に付加した時に沈殿画分における発現量の向上が見られた。また、PX12-20タグをta6（STDGNTリンカー）のC末端に付加した時には破砕上清および培地上清においても発現量の向上が見られた。
【実施例３】
【００６６】
＜細胞傷害活性＞
実施例2において、大腸菌で発現させたPX12-20をsc1またはta2のN末端、C末端およびNC両末端に付加した分子について、以下の手順でがん細胞に対する細胞傷害活性を調べた。
【００６７】
細胞傷害活性
96穴プレートにTFK-1細胞を1 well あたり5000 cells/100 μLになるように播種した。37℃、5% CO2濃度で一昼夜インキュベートし、上清を吸引除去した。次に、MQ 100 μLまたは培地100 μL、あるいはT-LAK細胞を1ウェルあたり25000 cells/50 μLになるように加えた。次に、サンプルを50 μLずつ加え、37℃、5% CO2濃度で24時間または48時間インキュベートした。上清を除去した後PBSを用いて3回ウォッシュし、MTS試薬(CellTiter 96
AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)を培地11 mLに対し1 mL加え懸濁したものを1ウェルあたり50 μLずつ加えた。37℃、5% CO2濃度で30分~1時間程度インキュベートし、プレートリーダーを用いて490 nmの吸光度を測定した。RPMIのみを加えたウェルが0.8程度になるまでインキュベートし、検出したデータを用いてがん細胞傷害活性を算出した。
【００６８】
MTS試薬には還元されると培地に可溶な有色のホルマザン産物に変換されるテトラゾリウム塩と電子受容体であるPESが含まれる。テトラゾリウム塩は生細胞の脱水素酵素由来
のNADHまたはNADPHにより還元され、490 nmに吸収をもつ有色のホルマザン産物にかわるため生細胞数とホルマザン産物の量には比例関係が生じる。この原理を利用して、以下の式を用いてがん細胞傷害活性を算出した。
がん細胞傷害活性 (%) = (1−(サンプルを添加したウェルの吸光度の平均値−水のみを添加したウェル)/(培地のみを添加したウェル−水のみを添加したウェル))×100
【００６９】
細胞傷害活性で用いたサンプルの定量方法
280 nmにおける吸光度および、アミノ酸配列から算出される吸光係数の値をもとに定量を行った。
【００７０】
結果
図１２〜１４の結果から、PX12-20を付加した二重特異性抗体は、細胞傷害活性が顕著に向上することが分かった。
【図１】
2019146524.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019146524.tif 000013
【図１０】
2019146524.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2019146524.tif 000017
【図１４】
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【配列表】
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