(57)【要約】      （修正有）【課題】酵母の亜硫酸生成能を向上させる方法、亜硫酸排出能が向上した変異型ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド、並びに、酵母の亜硫酸生成能を評価する方法、及び、亜硫酸生成能が高い酵母を選択する方法の提供することを目的とする。【解決手段】酵母に対して変異を導入することを含む酵母の亜硫酸生成能を向上させる方法であって、上記変異は、特定のアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチドにおいて、アミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン等の非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を含む、酵母の亜硫酸生成能向上方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母に対して変異を導入することを含む、酵母の亜硫酸生成能を向上させる方法であって、
前記変異は、下記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を含む、酵母の亜硫酸生成能向上方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１９番目のメチオニン以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
【請求項２】
酵母に対して変異を導入することを含む、酵母の亜硫酸耐性能を向上させる方法であって、
前記変異は、下記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を含む、酵母の亜硫酸耐性能向上方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１９番目のメチオニン以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
【請求項３】
酵母に対して変異を導入することを含む、亜硫酸生成能が向上した酵母の製造方法であって、
前記変異は、下記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を含む、亜硫酸生成能が向上した酵母の製造方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１９番目のメチオニン以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
【請求項４】
酵母に対して変異を導入することを含む、亜硫酸耐性能が向上した酵母の製造方法であって、
前記変異は、下記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を含む、亜硫酸耐性能が向上した酵母の製造方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１９番目のメチオニン以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
【請求項５】
前記変異は、前記ポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸を、メチオニンに置換する変異、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸を、ロイシンに置換する変異をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記変異が導入された酵母は、前記変異が導入されたポリペプチドを高発現する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記変異が導入された酵母は、亜硫酸還元が抑制されている請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸がバリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチド（配列番号３７〜４６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１９番目のメチオニン以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
【請求項９】
請求項８に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
被験酵母における、請求項８に記載の変異型ポリペプチドの発現を検出又は測定することを含む、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能を評価する方法。
【請求項１１】
被験酵母における、請求項９に記載のポリヌクレオチドの発現を検出又は測定することを含む、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能を評価する方法。
【請求項１２】
被験酵母における、請求項８に記載の変異型ポリペプチドの発現を検出又は測定することを含む、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法。
【請求項１３】
被験酵母における、請求項９に記載のポリヌクレオチドの発現を検出又は測定することを含む、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドの発現が検出された被験酵母、又は、前記ポリヌクレオチドの発現量が基準酵母よりも多い被験酵母を、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母として選択する請求項１３に記載の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法。
【請求項１５】
変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を含むポリヌクレオチドが導入された酵母形質転換体であって、
前記変異型ポリペプチドは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸がバリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドであり、
前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部は、前記変異型ポリペプチド中の、配列番号２の１９番目に相当する位置にある前記非極性アミノ酸（Ｘ）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである、酵母形質転換体。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１９番目のメチオニン以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
【請求項１６】
変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む酵母により麦汁を発酵させる工程を含むビールの製造方法であって、
前記変異型ポリペプチドは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸がバリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドである、ビールの製造方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１９番目のメチオニン以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
【請求項１７】
前記酵母は、上面発酵酵母である請求項１６に記載のビールの製造方法。
【請求項１８】
前記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸が前記非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンである、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンである、請求項１６又は１７に記載のビールの製造方法。
【請求項１９】
前記酵母は、前記変異型ポリペプチドを高発現する請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のビールの製造方法。
【請求項２０】
前記酵母は、亜硫酸還元が抑制されている請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のビールの製造方法。
【請求項２１】
亜硫酸を１ｐｐｍ以上含むエールビール。
【請求項２２】
亜硫酸を１ｐｐｍ以上含み、「エール」の表示が付されたビール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の亜硫酸生成能向上方法、酵母の亜硫酸耐性能向上方法、亜硫酸生成能が向上した酵母の製造方法及び亜硫酸耐性能が向上した酵母の製造方法に関する。本発明はまた、亜硫酸排出能を有する変異型ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能を評価する方法、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法、酵母形質転換体及びビールの製造方法に関する。本発明はまた、エールビールに関する。
【背景技術】
【０００２】
醸造酒であるビールは、原料作物や酵母由来のタンパク質、アミノ酸、糖などの多様な有機化合物を含んでいる。酵母が生成する亜硫酸は、有機化合物の非酵素的な酸化劣化を防ぐ作用や、他の混入菌の繁殖を抑える作用を有し、ビールの品質安定性には不可欠な成分である。ワイン醸造の現場では酸化防止の目的で亜硫酸を添加することが認められているが、一般的なビールでは亜硫酸を添加することはなく、酵母に由来する亜硫酸に依存しているのが現状である。
【０００３】
酵母における亜硫酸排出機構については、ＳＳＵ１遺伝子にコードされる膜タンパク質であるＳＳＵ１とよばれる亜硫酸輸送体が担っていることが知られている（非特許文献１）。上面発酵するエール酵母(サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））はＳｃ型のＳＳＵ１遺伝子を有している。一方、下面発酵するラガー酵母（サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ））は、Ｓｃ型のＳＳＵ１遺伝子に加え、サッカロミセス・ユウバヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｂａｙａｎｕｓ）由来と考えられているＳｂ型のＳＳＵ１遺伝子を有している。一般にラガー酵母はエール酵母より亜硫酸生成能が高く、これまでの研究でラガー酵母に特有のＳｂ型ＳＳＵ１がその高い生成能に寄与していることが報告されている（特許文献１及び非特許文献２）。しかしながら、なぜＳｂ型ＳＳＵ１が高い亜硫酸排出能を有しているかは明らかになっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２８３１６９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｖｒａｍ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｂａｋａｌｉｎｓｋｙ，  Ａ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７９，  ５９７１−５９７４．
【非特許文献２】藤村朋子（２００３）バイサイエンスとインダストリー  ６１，  ８０９−８１０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ビール発酵において、酵母が生成する亜硫酸は抗酸化作用を有しており、ビールの品質保持のために重要な役割を果たしていることが知られている。酵母の亜硫酸生成能を高めることができれば、香味安定性に優れ、品質保持期間が長いビール等の酒類を製造することができると考えられる。
【０００７】
本発明は、酵母の亜硫酸生成能を向上させる方法を提供することを目的とする。また、本発明は、亜硫酸排出能が向上した変異型ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。本発明はさらに、酵母の亜硫酸生成能を評価する方法及び亜硫酸生成能が高い酵母を選択する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、酵母由来の亜硫酸排出能を有するポリペプチド（亜硫酸トランスポーターということもできる）のアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸を改変することで、該ポリペプチドの亜硫酸排出能を向上させることができることからを見出した。また、上記ポリペプチドにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸に加えて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸及び／又は４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸を改変すると、亜硫酸排出能をさらに向上させることができることも見出した。
【０００９】
亜硫酸排出能を有するポリペプチド（例えば、ＳＳＵ１）において、配列番号２に示すアミノ酸配列の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸が亜硫酸排出能に影響を与えることから、天然に存在する遺伝資源について、該ポリペプチドの上記位置のアミノ酸配列情報を基に、高い亜硫酸生成能を有する酵母及び高い亜硫酸耐性能を有する酵母を選択することができる。高い亜硫酸生成能を有する酵母を使用することにより、例えば、亜硫酸含量が多く、抗酸化性の高いビールを製造することができる。一方、亜硫酸は硫黄化合物に由来する香りの原因になることが知られている。亜硫酸排出能を有するポリペプチドの上記位置のアミノ酸の情報は、硫黄化合物の量を制御するための亜硫酸生成能が高い又は低い酵母を選択する際の遺伝的指標としても利用できる。
【００１０】
本発明は、以下の酵母の亜硫酸生成能を向上させる方法等を包含する。
〔１〕酵母に対して変異を導入することを含む、酵母の亜硫酸生成能を向上させる方法であって、上記変異は、下記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を含む、酵母の亜硫酸生成能向上方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１９番目のメチオニン以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
【００１１】
〔２〕酵母に対して変異を導入することを含む、酵母の亜硫酸耐性能を向上させる方法であって、上記変異は、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を含む、酵母の亜硫酸耐性能向上方法。
【００１２】
〔３〕酵母に対して変異を導入することを含む、亜硫酸生成能が向上した酵母の製造方法であって、上記変異は、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を含む、亜硫酸生成能が向上した酵母の製造方法。
【００１３】
〔４〕酵母に対して変異を導入することを含む、亜硫酸耐性能が向上した酵母の製造方法であって、上記変異は、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を含む、亜硫酸耐性能が向上した酵母の製造方法。
〔５〕上記変異は、上記ポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸を、メチオニンに置換する変異、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸を、ロイシンに置換する変異をさらに含む、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕上記変異が導入された酵母は、上記変異が導入されたポリペプチドを高発現する上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕上記変異が導入された酵母は、亜硫酸還元が抑制されている上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
【００１４】
〔８〕上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸がバリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチド（好ましくは、配列番号３７〜４６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）。
〔９〕上記変異型ポリペプチドが、上記（ａ）又は下記（ｂ１）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸が、上記非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドである上記〔８〕に記載の変異型ポリペプチド。
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）からなる群より選択される１〜６個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
（ｉ）５２番目のアラニン、（ｉｉ）６１番目のアラニン、（ｉｉｉ）９０番目のアスパラギン、（ｉｖ）１２２番目のアラニン、（ｖ）１５７番目のプロリン及び（ｖｉ）１６４番目のチロシン
〔１０〕上記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸が上記非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンである、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンである、上記〔８〕に記載の変異型ポリペプチド。
〔１１〕上記変異型ポリペプチドが、上記（ａ）又は上記（ｂ１）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸が上記非極性アミノ酸（Ｘ）に置換され、かつ、２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンに置換、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンに置換されている変異型ポリペプチドである、上記〔１０〕に記載の変異型ポリペプチド。
〔１２〕上記〔８〕〜〔１１〕のいずれかに記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１５】
〔１３〕被験酵母における、上記〔８〕〜〔１１〕のいずれかに記載の変異型ポリペプチドの発現を検出又は測定することを含む、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能を評価する方法。
〔１４〕被験酵母における、上記〔１２〕に記載のポリヌクレオチドの発現を検出又は測定することを含む、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能を評価する方法。
〔１５〕上記〔１２〕に記載のポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能を評価する方法。
〔１６〕被験酵母における、上記〔８〕〜〔１１〕のいずれかに記載の変異型ポリペプチドの発現を検出又は測定することを含む、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法。
〔１７〕被験酵母における、上記〔１２〕に記載のポリヌクレオチドの発現を検出又は測定することを含む、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法。
〔１８〕上記ポリヌクレオチドの発現が検出された被験酵母、又は、上記ポリヌクレオチドの発現量が基準酵母よりも多い被験酵母を、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母として選択する上記〔１７〕に記載の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法。
〔１９〕上記〔１２〕に記載のポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法。
【００１６】
〔２０〕変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を含むポリヌクレオチドが導入された酵母形質転換体であって、上記変異型ポリペプチドは、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸がバリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドであり、上記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部は、上記変異型ポリペプチド中の、配列番号２の１９番目に相当する位置にある上記非極性アミノ酸（Ｘ）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである、酵母形質転換体。
〔２１〕上記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸が上記非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンである、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンである、上記〔２０〕に記載の酵母形質転換体。
〔２２〕上記変異型ポリペプチドを高発現する上記〔２０〕又は〔２１〕に記載の酵母形質転換体。
〔２３〕亜硫酸還元が抑制されている上記〔２０〕〜〔２２〕のいずれかに記載の酵母形質転換体。
【００１７】
〔２４〕変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む酵母により麦汁を発酵させる工程を含むビールの製造方法であって、上記変異型ポリペプチドは、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸がバリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドである、ビールの製造方法。
〔２５〕上記酵母は、上面発酵酵母である上記〔２４〕に記載のビールの製造方法。
〔２６〕上記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸が上記非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンである、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンである、上記〔２４〕又は〔２５〕に記載のビールの製造方法。
〔２７〕上記酵母は、上記変異型ポリペプチドを高発現する上記〔２４〕〜〔２６〕のいずれかに記載のビールの製造方法。
〔２８〕上記酵母は、亜硫酸還元が抑制されている上記〔２４〕〜〔２７〕のいずれかに記載のビールの製造方法。
〔２９〕亜硫酸を１ｐｐｍ以上含むエールビール。
〔３０〕亜硫酸を１ｐｐｍ以上含み、「エール」の表示が付されたビール。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、酵母の亜硫酸生成能を向上させることができる。本発明によれば、酵母の亜硫酸耐性能を向上させることができる。また、本発明によれば、亜硫酸排出能が向上した変異型ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドを提供することができる。また、本発明によれば、酵母の亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能を評価することができ、亜硫酸生成能が高い酵母及び亜硫酸耐性能が高い酵母を選択することができる。本発明により提供される亜硫酸生成能が高い酵母を酒類の製造に用いることにより、製品中の亜硫酸含量を増加させることができる。これにより、香味安定性に優れるビール等の酒類を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ)ＷＥＩＨＥＮＳＴＥＰＨＡＮ  ３４／７０株（ＷＨ３４／７０株）のＳｂＳＳＵ１のアミノ酸配列（上段）と、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８Ｃ株のＳｃＳＳＵ１のアミノ酸配列（下段）との配列アラインメントを示す図である。
【図２】図２は、ＳｃＳＳＵ１又はその変異体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体、及び、ＳｂＳＳＵ１又はその変異体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の亜硫酸生成能の評価結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＳｃＳＳＵ１又はその変異体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体、及び、ＳｂＳＳＵ１又はその変異体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の亜硫酸耐性能の評価結果を示す写真である。
【図４】図４は、ＳｃＳＳＵ１若しくはその変異体、又は、ＳｂＳＳＵ１をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の亜硫酸生成能の評価結果を示すグラフである。
【図５】図５は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＯ００１株、ＷＨ３４／７０株及びサッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）ＥＯＹ００５株（ＥＯＹ００５株）の亜硫酸生成能の評価結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＷＨ３４／７０株及びＥＯＹ００５株の亜硫酸耐性能の評価結果を示す写真である。
【図７】図７は、ＥＯＹ００５株のＳｂＳＳＵ１のアミノ酸配列（上段）と、ＷＨ３４／７０株のＳｂＳＳＵ１のアミノ酸配列（下段）との配列アラインメントを示す図である。
【図８】図８は、ＳｃＳＳＵ１、ＳｂＳＳＵ１又はその変異体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の亜硫酸生成能の評価結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＳｃＳＳＵ１、ＳｂＳＳＵ１又はその変異体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の亜硫酸耐性能の評価結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、ｑＰＣＲによるＳｃＳＳＵ１遺伝子の発現解析結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜変異型ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド＞
本発明の変異型ポリペプチドは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸がバリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドである。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１９番目のメチオニン以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチド
本明細書中、アミノ酸の番号は、Ｎ末端からのアミノ酸番号である。
【００２１】
本明細書中、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニン（メチオニン残基）に相当する位置にあるアミノ酸（アミノ酸残基）とは、比較対象のポリペプチドのアミノ酸配列（一次構造）について、配列番号２のアミノ酸配列（基準のアミノ酸配列）とアミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントを行った場合に、配列番号２のアミノ酸配列中の１９番目に対応する位置のアミノ酸を意味する。従って、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸とは、配列番号２では１９番目のメチオニンであるが、配列番号２に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列のポリペプチドにおいては、１９番目とはならない場合がある。配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目以外のアミノ酸（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目のロイシン、４２３番目のセリン）に相当する位置にあるアミノ酸についても、同様である。
本明細書中、アミノ酸配列における配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置を、「配列番号２の１９番目に相当する位置」ともいう。同様に、アミノ酸配列における配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目のロイシンに相当する位置及び４２３番目のセリンに相当する位置を、それぞれ「配列番号２の２５９番目に相当する位置」、「配列番号２の４２３番目に相当する位置」ともいう。
【００２２】
配列番号２の１９番目に相当する位置のアミノ酸を、上記（ａ）〜（ｃ）等の任意のポリペプチドにおいて特定することは、容易である。
配列番号２の１９番目に相当する位置のアミノ酸の特定は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷのような既知の配列比較プログラムを用いて行うことができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、通常、デフォルトパラメーターを用いることができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、日本ＤＮＡデータバンク（Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ：ＤＤＢＪ）、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ）等のウェブサイトから利用することができる。比較を行いたい２つのポリペプチドのアミノ酸配列を入力してプログラムを実行することによって、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントを行うことができる。ここで、配列番号２のアミノ酸配列を、２つのポリペプチドの１つとして入力することによって、任意のポリペプチドの特定位置の残基が、配列番号２のポリペプチドにおいてどの位置に相当するかを容易に特定することができる。任意のポリペプチドにおける配列番号２の２５９番目に相当する位置、４２３番目に相当する位置についても同様である。
【００２３】
上記（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドは、亜硫酸排出能を有するポリペプチド（タンパク質）であり、亜硫酸トランスポーターということもできる。本明細書中、上記（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドを、非変異型ポリペプチドともいう。
【００２４】
後掲の実施例に示されるように、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）が保持するサッカロミセス・ユウバヤヌス由来のＳｂＳＳＵ１（Ｓｂ型ＳＳＵ１遺伝子にコードされる亜硫酸排出能を有するポリペプチド）において、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるバリン残基が高い亜硫酸排出能に大きく寄与していることが見出された。そして、配列番号２のアミノ酸配列において、１９番目のメチオニンをバリンに置換する変異（Ｍ１９Ｖ）を導入した変異型ポリペプチドでは、変異導入前（配列番号２のポリペプチド）と比較して亜硫酸排出能が向上し（増強され）、該変異型ポリペプチドを発現させた酵母の亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能（亜硫酸耐性）が向上することが見出された。また、配列番号２のアミノ酸配列において、１９番目のメチオニンを、アラニン、イソロイシン、グリシン又はロイシンに置換する変異（Ｍ１９Ａ、Ｍ１９Ｉ、Ｍ１９Ｇ又はＭ１９Ｌ）を導入した変異型ポリペプチドでも、変異導入前（配列番号２のポリペプチド）と比較して亜硫酸排出能が向上し、該変異型ポリペプチドを発現させた酵母の亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能が向上することが見出された。
【００２５】
本発明の変異型ポリペプチドは、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチド（非変異型ポリペプチド）において、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸が、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド（タンパク質）である。本発明において、非極性アミノ酸（Ｘ）は、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン、ロイシンであり、変異型ポリペプチドの亜硫酸排出能がより高くなる観点から、好ましくは、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシンであり、より好ましくはバリン、アラニン、イソロイシンであり、さらに好ましくは、バリンである。本発明の変異型ポリペプチドは、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸が、バリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが特に好ましい。本発明の変異型ポリペプチドは、このように配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸が非極性アミノ酸（Ｘ）であることにより、該位置にあるアミノ酸が非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されていないポリペプチド（非変異型ポリペプチド）と比較して、亜硫酸排出能が高い。本発明の変異型ポリペプチドは、亜硫酸排出能を有し、変異型亜硫酸トランスポーターということもできる。
【００２６】
本明細書中、ポリペプチドの亜硫酸排出能は、細胞内（好ましくは、酵母の細胞内）の亜硫酸を細胞外へ排出する機能であり、亜硫酸トランスポーター活性ということもできる。ポリペプチドが亜硫酸排出能を有することは、例えば、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入して発現させた酵母と、該ポリヌクレオチドを導入していない酵母（コントロール）とについて亜硫酸生成能を比較することにより確認することができる。ポリペプチドが亜硫酸排出能を有する場合、該ポリペプチドを発現させた酵母は、コントロールの酵母と比較して亜硫酸生成能が向上する。酵母の亜硫酸生成能は、酵母を培養し、培地中の亜硫酸濃度を測定することによって評価することができる。培地中の亜硫酸濃度は、例えば、Ｊ．  Ｗ．  Ｂｕｅｃｈｓｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｃ．  Ｓ．  Ｏｕｇｈ  Ａｍ  Ｊ  Ｅｎｏｌ  Ｖｉｔｉｃ．  Ｊａｎｕａｒｙ  １９７８  ２９：  １６１−１６４に記載の方法により測定することができる。亜硫酸濃度は、市販の亜硫酸測定キット（例えば、Ｆ−キット  亜硫酸（（株）ＪＫインターナショナル））を用いて測定することもできる。
【００２７】
配列番号２に示すアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＳｃＳＳＵ１（Ｓｃ型ＳＳＵ１遺伝子にコードされる亜硫酸排出能を有するポリペプチド）のアミノ酸配列の一例である。上記（ｂ）及び／又は（ｃ）のポリペプチドは、例えば、天然に存在する配列番号２のポリペプチド（上記（ａ）のポリペプチド）の変異体であってよい。（ｂ）及び／又は（ｃ）のポリペプチドは、公知の部位特異的変異導入法等の手法を用いて、人為的に取得することができるものであってもよい。
【００２８】
本明細書中、アミノ酸配列において、１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１〜９のアミノ酸配列中の位置において、１〜９個のアミノ酸（アミノ酸残基）の欠失及び／又は置換及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換及び付加のうち２以上が同時に生じていてもよい。
上記（ｂ）のポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列（（ａ）のアミノ酸配列）において、１９番目以外の領域中に好ましくは１〜８個（より好ましくは１〜７個、１〜６個、１〜５個又は１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、１〜２個又は１個）のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加された配列からなる。
【００２９】
上記（ｂ）のポリペプチドとして、例えば、（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）からなる群より選択される１〜６個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチドが好ましい。
（ｉ）５２番目のアラニン、（ｉｉ）６１番目のアラニン、（ｉｉｉ）９０番目のアスパラギン、（ｉｖ）１２２番目のアラニン、（ｖ）１５７番目のプロリン及び（ｖｉ）１６４番目のチロシン
【００３０】
上記（ｉ）〜（ｖｉ）のアミノ酸が置換される他のアミノ酸は特に限定されない。（ｂ１）のポリペプチドのアミノ酸配列の一例として、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、（ｉ−１）５２番目のアラニンのトレオニンへの置換（Ａ５２Ｔ）、（ｉｉ−１）６１番目のアラニンのトレオニンへの置換（Ａ６１Ｔ）、（ｉｉｉ−１）９０番目のアスパラギンのセリンへの置換（Ｎ９０Ｓ）、（ｉｖ−１）１２２番目のアラニンのセリンへの置換（Ａ１２２Ｓ）、（ｖ−１）１５７番目のプロリンのセリンへの置換（Ｐ１５７Ｓ）及び（ｖｉ−１）１６４番目のチロシンのヒスチジンへの置換（Ｙ１６４Ｈ）の（ｉ−１）〜（ｖｉ−１）からなる群より選択される１〜６の置換を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【００３１】
（ｂ１）のポリペプチドの好ましい態様の一例として、例えば、以下の（ｂ１−１）、（ｂ１−２）のポリペプチド等が挙げられる。
（ｂ１−１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、５２番目のアラニンがトレオニンに、９０番目のアスパラギンがセリンに、１２２番目のアラニンがセリンに、１５７番目のプロリンがセリンに及び１６４番目のチロシンがヒスチジンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（配列番号２に示されるアミノ酸配列中に、Ａ５２Ｔ、Ｎ９０Ｓ、Ａ１２２Ｓ、Ｐ１５７Ｓ及びＹ１６４Ｈのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド）
（ｂ１−２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、５２番目のアラニンがトレオニンに、６１番目のアラニンがトレオニンに、９０番目のアスパラギンがセリンに、１２２番目のアラニンがセリンに、１５７番目のプロリンがセリンに及び１６４番目のチロシンがヒスチジンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（配列番号２に示されるアミノ酸配列中に、Ａ５２Ｔ、Ａ６１Ｔ、Ｎ９０Ｓ、Ａ１２２Ｓ、Ｐ１５７Ｓ及びＹ１６４Ｈのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド）
（ｂ１−１）及び（ｂ１−２）のアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＳｃＳＳＵ１のアミノ酸配列である。
【００３２】
上記（ｃ）の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、同一性（配列同一性）は、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらにより好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
上記（ｃ）のポリペプチドは、そのアミノ酸配列における配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸が、非極性アミノ酸（Ｘ）以外のアミノ酸であることが好ましく、バリン以外のアミノ酸であることがより好ましい。一態様において、上記（ｃ）のポリペプチドのアミノ酸配列として、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目に相当するアミノ酸がメチオニンであるアミノ酸配列が好ましい。
【００３３】
アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることができる。
【００３４】
一態様において、本発明の変異型ポリペプチドとして、例えば、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、上記（ｉ）〜（ｖｉ）からなる群より選択される１〜６個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチドにおいて、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸が非極性アミノ酸（Ｘ）（好ましくはバリン）に置換されている変異型ポリペプチドが好ましい。上記（ａ）又は（ｂ１）のポリペプチドにおいて、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸が、非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されているアミノ酸配列からなる変異型ポリペプチドは、亜硫酸排出能の向上の点で好ましい。
一態様において、本発明の変異型ポリペプチドは、配列番号３７〜４６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドでないことが好ましい。本発明の変異型ポリペプチドは、配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、２５１番目のグルタミン及び／又は２９１番目のアルギニンが他のアミノ酸に置換された以下のポリペプチドでないことも好ましい。
配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、２５１番目のグルタミンがグルタミン以外の任意のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、２９１番目のアルギニンがアルギニン以外の任意のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号３９に示されるアミノ酸配列において、２５１番目のグルタミンがグルタミン以外の任意のアミノ酸に置換され、２９１番目のアルギニンがアルギニン以外の任意のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００３５】
例えば、上記（ａ）のポリペプチドにおいて、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸が非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンが、非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ポリペプチドと表すこともできる。
上記（ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸がバリンに置換されている変異型ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンが非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されたアミノ酸配列において、上記１９番目以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有する変異型ポリペプチドと表すこともできる。
上記（ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸がバリンに置換されている変異型ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸が、非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有する変異型ポリペプチドと表すこともできる。
【００３６】
亜硫酸排出能向上の観点から、本発明の変異型ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンである、及び／又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンであることが好ましい。より好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンであり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸がロイシンである。
このような変異型ポリペプチドとして、上記（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸が非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチドとして、２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンである、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンである、変異型ポリペプチドが挙げられる。
上記変異型ポリペプチドは、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸が非極性アミノ酸（Ｘ）に置換され、かつ、２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンに置換、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンに置換されている変異型ポリペプチドと記載することもできる。
後記の実施例に示されるように、ＳｂＳＳＵ１では、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるバリンが高い亜硫酸排出能に寄与しているが、さらに配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンである、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンであると、亜硫酸排出能がより向上する。
亜硫酸排出能向上の観点から、変異型ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンであることが好ましく、２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンであり、かつ、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンであることがより好ましい。
【００３７】
一態様において、亜硫酸排出能向上の観点から、本発明の変異型ポリペプチドとして、上記（ａ）又は上記（ｂ１）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸が非極性アミノ酸（Ｘ）に置換され、かつ、２５９番目のロイシンに相当する位置にあるアミノ酸がメチオニンに置換、及び／又は、４２３番目のセリンに相当する位置にあるアミノ酸がロイシンに置換されている変異型ポリペプチドも好ましい。（ｂ１）のポリペプチドの好ましい態様は上記の通りである。
【００３８】
本発明の変異型ポリペプチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法又は合成手法によって製造することができる。例えば遺伝子工学的手法を用いた製法においては、変異型ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、当該培養物から目的のポリペプチドを採取することにより本発明の変異型ポリペプチドを得ることができる。形質転換細胞等からの変異型ポリペプチドの抽出及び精製、又は、合成ポリペプチドの製造は、それ自体公知の方法に従って行われて良い。また、本発明の変異型ポリペプチドは、上述した非変異型ポリペプチドを改変して、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸を非極性アミノ酸（Ｘ）に置換することによって製造することができる。亜硫酸排出能向上の観点から、非変異型ポリペプチドの配列番号２の２５９番目に相当するアミノ酸がメチオニン以外のアミノ酸である場合には、さらに、当該アミノ酸をメチオニンに置換することが好ましい。非変異型ポリペプチドの配列番号２の４２３番目に相当するアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である場合には、当該アミノ酸をロイシンに置換することが好ましい。このようなアミノ酸の置換は、公知の部位特異的変異導入法により行うことができる。本発明の変異型ポリペプチドは、後述する酵母に変異を導入して亜硫酸生成能が高い酵母を製造する方法等により得られる酵母から単離することもできる。
【００３９】
本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。本明細書中、ポリヌクレオチドとは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡである。本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドともいう）は、変異型ポリペプチドのみをコードするポリヌクレオチドであってもよく、非翻訳領域、シグナルペプチドをコードする領域等を含んでいてもよい。本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってよい。本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、変異型亜硫酸トランスポーター遺伝子ということもできる。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、変異型ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、上記の非変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下では、非変異型ポリヌクレオチドともいう）の塩基配列において、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸をコードする塩基配列を、非極性アミノ酸（Ｘ）をコードする塩基配列に置換する変異を導入することによって調製することもできる。
非変異型ポリヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよい。非変異型ポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１９番目のメチオニン以外の領域中に１〜９個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜硫酸排出能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４２】
配列番号１に示す塩基配列は、上記（ａ）の配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。例えば、（ａ）のポリペプチドにおいて、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸がバリンに置換されている変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列として、配列番号１に示す塩基配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１９番目のメチオニンをコードする塩基配列（５５〜５７番目のａｔｇ）を、置換後のバリンをコードする塩基配列（ｇｔｃ、ｇｔａ、ｇｔｇ又はｇｔｔ）に置換した塩基配列が挙げられる。
このような塩基配列を有する本発明のポリヌクレオチドを発現させることにより、上述した本発明の変異型ポリペプチドが得られる。非変異型ポリヌクレオチドに目的の変異を導入する方法は特に限定されず、任意の部位特異的変異導入法、例えば、インバースＰＣＲ法等のＰＣＲによる変異導入等を用いることができる。
【００４３】
非変異型ポリヌクレオチドは、例えば、酵母から公知の方法により取得することができる。例えば、配列番号２の非変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば、酵母からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いたＰＣＲにより、目的とする塩基配列を有するポリヌクレオチドを増幅し、さらに増幅したポリヌクレオチドを精製することにより配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを取得することができる。また、非変異型ポリヌクレオチドは、例えば、非変異型ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。
【００４４】
本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、本発明の変異型ポリペプチドを発現するベクター又は酵母形質転換体の製造、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能の改変、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能の評価、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母の選択等に好適に使用され得る。
【００４５】
＜亜硫酸排出能を有するポリペプチドの亜硫酸排出能を向上させる方法＞
上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドに対して、そのアミノ酸配列中の配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸をバリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を導入することにより、該変異を導入する前と比較して、該ポリペプチドの亜硫酸排出能を向上させることができる。このような方法も本発明の１つである。このような変異は、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸の非極性アミノ酸（Ｘ）への置換を引き起こす変異を導入することにより行うことができる。非極性アミノ酸（Ｘ）の好ましい態様は上述した通りであり、バリンが特に好ましい。上記非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸を非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を、１９Ｘ変異ともいう。亜硫酸排出能向上の観点から、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドにおいて、１９Ｘ変異に加えて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸を、メチオニンに置換する変異、及び／又は、４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸を、ロイシンに置換する変異を導入することが好ましい。上記非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸をメチオニンに置換する変異を、２５９Ｍ変異ともいう。上記（ａ）〜（ｃ）の非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸をロイシンに置換する変異を、４２３Ｌ変異ともいう。（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドの配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸がメチオニン以外のアミノ酸である場合は、２５９Ｍ変異を導入することが好ましい。（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドの配列番号２の４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である場合には、４２３Ｌ変異を導入することが好ましい。
【００４６】
＜酵母形質転換体＞
本発明の酵母形質転換体は、上述した本発明の変異型ポリペプチド（上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸がバリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換されている変異型ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド又はその一部を含むポリヌクレオチドが導入された酵母形質転換体である。本発明の酵母形質転換体において、上記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部（以下、部分ポリヌクレオチドともいう）は、上記変異型ポリペプチド中の、配列番号２の１９番目に相当する位置にある上記非極性アミノ酸（Ｘ）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。非極性アミノ酸（Ｘ）及びその好ましい態様は、上記と同じである。
このような酵母形質転換体は、酵母に上述した本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含むポリヌクレオチドを導入することにより作製される。導入するポリヌクレオチドは１種であってもよく、２種以上であってもよい。
【００４７】
上記部分ポリヌクレオチドは、上記変異型ポリペプチド中の、配列番号２の１９番目に相当する位置にある非極性アミノ酸（Ｘ）をコードする塩基配列を含む。上記部分ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列（変異型ポリペプチドをコードする塩基配列）の部分配列からなるポリヌクレオチドである。本発明における部分ポリヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上の非変異型ポリペプチドを発現している酵母に導入された場合に、該非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸を、非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異（１９Ｘ変異）をもたらし得るものであればよい。このような部分ポリヌクレオチドとして、例えば、導入する変異（変異型ポリペプチド中の、配列番号２の１９番目に相当する位置にある非極性アミノ酸（Ｘ）をコードする塩基配列、並びに、その上流域及び下流域に、酵母ゲノム中の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードする領域と相同組換えが生じ得る長さの、該領域に相同な塩基配列を有するポリヌクレオチドが好ましい。このような部分ポリヌクレオチドとして、変異型ポリペプチド中の、配列番号２の１９番目に相当する位置にある非極性アミノ酸（Ｘ）（好ましくはバリン）をコードする塩基配列、並びに、その上流域及び下流域にそれぞれ１５〜５０塩基（より好ましくは１７〜３０塩基、さらに好ましくは１８〜２５塩基）の塩基配列を有するポリヌクレオチドが好ましい。このようなポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
【００４８】
一態様において、本発明の酵母形質転換体は、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上の非変異型ポリペプチドを発現している酵母に導入された場合に、該非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸を、メチオニンに置換する変異（２５９Ｍ変異）をもたらし得るポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。酵母が有する非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸がメチオニン以外のアミノ酸である場合には、このようなポリヌクレオチドを含むことが好ましい。このようなポリヌクレオチドとして、例えば、上記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチドであって、変異型ポリペプチド中の、配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸としてメチオニンをコードする塩基配列、並びに、その上流域及び下流域にそれぞれ１５〜５０塩基（より好ましくは１７〜３０塩基、さらに好ましくは１８〜２５塩基）の塩基配列を有するポリヌクレオチドが好ましい。
【００４９】
また、本発明の酵母形質転換体は、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上の非変異型ポリペプチドを発現している酵母に導入された場合に、該非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸を、ロイシンに置換する変異（４２３Ｌ変異）をもたらし得るポリヌクレオチドをさらに含むことも好ましい。酵母が有する非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である場合には、このようなポリヌクレオチドを含むことが好ましい。このようなポリヌクレオチドとして、例えば、上記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチドであって、変異型ポリペプチド中の、配列番号２の４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸としてロイシンをコードする塩基配列、並びに、その上流域及び下流域にそれぞれ１５〜５０塩基（より好ましくは１７〜３０塩基、さらに好ましくは１８〜２５塩基）の塩基配列を有するポリヌクレオチドが好ましい。
【００５０】
本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を含むポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド又はその一部からなるポリヌクレオチドであってよい。また、後述する酵母に導入されたポリヌクレオチドの発現を調製するその他の配列、マーカー遺伝子の配列等を含んでいてもよい。本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含むポリヌクレオチドは、そのまま酵母に導入することができる。また、本発明のポリヌクレオチド又はその一部は、該ポリヌクレオチドが挿入されたベクター（発現ベクター）により酵母に導入されてもよい。本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含むベクターは、酵母形質転換体の製造に好適に使用される。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチド又はその一部が挿入されるベクターは、酵母で導入された遺伝子を発現できるベクターであれば特に限定されず、例えば多コピー型プラスミド（ＹＥｐ型）、単コピー型プラスミド（ＹＣｐ型）、染色体ＤＮＡ組み込み型プラスミド（ＹＩｐ型）のいずれもが利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしてはＹＥｐ５１（Ｊ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ８３，１９８３）等、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０（Ｍ．Ｄ．Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ６０，２３７，１９８７）等、ＹＩｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５（Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＰ，７６，１０３５，１９７９）等が挙げられる。これらのプラスミドは市販されており、容易に入手することができる。実施例で使用したベクター等も使用可能である。
【００５２】
ベクターは、例えば、導入される宿主（酵母）において、本発明のポリヌクレオチド又はその一部を発現可能なように、該ポリヌクレオチドを含んでいればよく、その他の構成は特に限定されない。ベクターは、酵母に導入されたポリヌクレオチドの発現を調製するその他の配列、例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、サイレンサー、リボソーム結合配列、ターミネーター等を有していてもよい。また、上記ポリヌクレオチドが導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（選択マーカー）の配列を有していてもよい。酵母の遺伝子を発酵初期から構成的に発現させるためのプロモーター及びターミネーターは、酵母中で機能し、発酵液中の亜硫酸濃度に非依存的なものが好ましいが、任意の組み合わせで用いてよい。例えばプロモーターとしては、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ(ＴＤＨ３）遺伝子のプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）遺伝子のプロモーター等が利用可能である。これらのプロモーターは公知であり容易に入手することができる。
【００５３】
上記ポリヌクレオチドやベクターを宿主酵母に導入して形質転換する方法は、公知の手段に従って行ってよい。例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ法（例えば、Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３，  １１６２−１１６４  （２０１５））等を用いることができる。
より具体的には、例えば、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばＹＥＰＤ培地“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１１７（１９７９）”等）で、ＯＤ６００ｎｍの値が１〜６となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約１〜２Ｍのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約６０分間静置した後、導入するポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）又はベクター（約１〜２０μｇ）とともに約３０℃で、約６０分間静置する。ポリエチレングリコール（好ましくは約４，０００ダルトンのポリエチレングリコール）を、最終濃度が約２０〜５０％となるように加える。約３０℃で、約３０分間静置した後、この細胞を約４２℃で約５分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約３０℃で約６０分間静置する。その後、必要に応じて選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。
その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第３版」、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｉｔｉｃｓ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）”等を参照することができる。
【００５４】
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、Ｇ４１８耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）“Ｍ．Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐ３３７，１９８４”、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（「猪腰淳嗣ら，生化学，６４，ｐ６６０，１９９２」、“Ｍ．Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，１０１，ｐ１４９，１９９１”）等が利用可能である。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含むポリヌクレオチドを宿主酵母に導入する際、宿主として用いられる酵母としては、醸造用に使用可能な酵母が好ましい。醸造用に使用可能な酵母として、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母などが挙げられる。醸造用酵母として広く用いられている任意の酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母等が挙げられる。酵母は、ビール酵母が好ましく、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）がより好ましい。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ１９５１、ＮＢＲＣ１９５２、ＮＢＲＣ１９５３、ＮＢＲＣ１９５４、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）ＷＨ３４／７０等のビール酵母が好適に使用できる。ビール酵母の中でも、上面発酵酵母が好ましい。上面発酵酵母として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。上面発酵酵母は、通常、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）と比較して亜硫酸生成能が低いが、上記ポリヌクレオチドを導入することにより、その亜硫酸生成能を向上させることができる。さらに、ウイスキー酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＣＹＣ９０等）、ワイン酵母（例えば協会ぶどう酒用１号、３号、４号等）、清酒酵母（例えば協会酵母清酒用７号、９号等）も同様に宿主に使用できる。
【００５６】
本発明の酵母形質転換体は、本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含むポリヌクレオチドが導入されたことにより、本発明の変異型ポリペプチドを生成するものであることが好ましい。このような酵母形質転換体は、上記ポリヌクレオチドの導入により本発明の変異型ポリペプチドの発現が増強された酵母ということもできる。
例えば、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを導入した酵母形質転換体を、酵母が生育可能な培地で培養することにより、該ベクター上の本発明のポリヌクレオチドが発現して本発明の変異型ポリペプチドが生成する。また、一態様において、本発明のポリヌクレオチド又はその一部を酵母に導入すると、導入されたポリヌクレオチドと、酵母のゲノム中の上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードする領域との間で相同組換えが起こる。これにより、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチド中の配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸を非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異（１９Ｘ変異）が導入され、亜硫酸生成能の向上した酵母形質転換体、亜硫酸耐性能が向上した酵母形質転換体が得られる。亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能向上の観点から、一態様においては、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドにおいて、上記変異に加えて、２５９Ｍ変異及び／又は４２３Ｌ変異が導入されることが好ましい。
上述したように本発明の変異型ポリペプチドは、非変異型ポリペプチドと比較して亜硫酸排出能が高い。このため該変異型ポリペプチドを生成し、該ポリペプチドを含む酵母形質転換体は、通常形質転換前の酵母（親株）と比較して亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能が向上している。このような酵母形質転換体を用いて酒類等の製造を行うと、培養物中の亜硫酸濃度が上昇して、香味安定性等に優れた製品を製造することができる。
【００５７】
亜硫酸生成能が向上する観点から、本発明の酵母形質転換体は、上記変異型ポリペプチドを高発現するものであることが好ましい。このような酵母形質転換体として、例えば、変異型ポリペプチドを高発現するプロモーター（高発現型プロモーターともいう）を有する酵母形質転換体、変異型ポリペプチドの発現を促進する転写因子（以下、単に転写因子という）の活性が高い酵母形質転換体、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの翻訳効率が高い酵母形質転換体などが挙げられる。高発現型プロモーターは、酵母で機能するものであればよく、例えば、ＴＤＨ３プロモーター等が挙げられる。例えば、上記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、高発現型プロモーターの下流に配置したベクターを酵母に導入することにより、変異型ポリペプチドを高発現する酵母形質転換体を得ることができる。転写因子の活性が高い酵母形質転換体として、転写促進活性が高い高活性型転写因子を有する酵母形質転換体が挙げられる。転写因子として、例えば、ＦＺＦ１遺伝子にコードされるＦＺＦ１タンパク質が挙げられる（Avram D, et al. (1999) Yeast  15(6):473-80）。例えば、酵母形質転換体においてＦＺＦ１タンパク質の活性が高いと、変異型ポリペプチドが高発現される。ＦＺＦ１タンパク質の活性が高い酵母形質転換体として、例えば、野生型のＦＺＦ１タンパク質よりも転写促進活性が高い高活性型ＦＺＦ１タンパク質を有する形質転換体が挙げられる。高活性型ＦＺＦ１タンパク質の一例として、野生型ＦＺＦ１タンパク質のアミノ酸配列(配列番号６４)において、１６２番目のシステインがチロシンに置換された配列（配列番号６６）を有する変異型ＦＺＦ１タンパク質（ＦＺＦ１−Ｃ１６２Ｙ）が挙げられる。
【００５８】
亜硫酸生成能が向上する観点から、本発明の酵母形質転換体は、亜硫酸の還元が抑制されていることが好ましい。亜硫酸の還元が抑制されると、酵母細胞内において変異型ポリペプチドの基質である亜硫酸量が増加し、亜硫酸生成能の向上につながる。酵母における亜硫酸の還元抑制は、公知の方法により行うことができる。例えば、亜硫酸の還元経路に係わるポリペプチドの発現を抑制することが挙げられる。亜硫酸の還元経路に係わるポリペプチドとして、例えば、メチオニンの合成経路に係わるＭＥＴ５にコードされるポリペプチド、ＭＥＴ１０にコードされるポリペプチド等が挙げられる（Masselot M and De Robichon-Szulmajster H (1975) Mol Gen Genet 139(2):121-32）。このようなポリペプチドの発現抑制は、公知の方法により、当該ポリペプチドをコードする遺伝子発現を抑制することにより行うことができる。亜硫酸の還元が抑制されている酵母形質転換体の一例として、このような亜硫酸の還元経路に係わるポリペプチドの発現が抑制された（好ましくは部分的に抑制された）酵母形質転換体が挙げられる。
本発明の酵母形質転換体は、上記の高発現型転写因子を有する酵母、亜硫酸還元が抑制された酵母等を宿主として得られるものであってよい。また、酵母形質転換体は、上記変異型ポリペプチドを高発現する変異、及び／又は、亜硫酸の還元を抑制する変異を酵母に導入して得られたものであってもよい。
【００５９】
＜酵母の亜硫酸生成能向上方法及び酵母の亜硫酸耐性能向上方法＞
本発明の酵母の亜硫酸生成能向上方法（以下、単に亜硫酸生成能向上方法ともいう）及び酵母の亜硫酸耐性能向上方法（以下、単に亜硫酸耐性能向上方法ともいう）は、酵母に対して変異を導入することを含む。
本発明の亜硫酸生成能向上方法及び亜硫酸耐性能向上方法において、上記変異は、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチド（非変異型ポリペプチド）において、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異（１９Ｘ変異）を含む。
（ａ）〜（ｃ）の非変異型ポリペプチド、非極性アミノ酸（Ｘ）及びこれらの好ましい態様等は上述した通りである。変異を導入するポリペプチドは（ａ）〜（ｃ）の１種であってもよく、２種以上であってもよい。上記変異を酵母に導入すると、酵母において、本発明の変異型ポリペプチドが生成する。変異型ポリペプチドは、通常、変異導入前の非変異型ポリペプチドと比較して亜硫酸排出能が高い。このため上記変異が導入された酵母は、該変異が導入される前と比較して、亜硫酸生成能が向上する（高くなる）。また上記変異が導入された酵母は、該変異が導入される前と比較して、亜硫酸耐性能が向上する（高くなる）。酵母に上記変異を導入することにより、変異導入前と比較して、亜硫酸生成能が向上した酵母又は亜硫酸耐性能が向上した酵母を製造することができる。亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能向上の観点から、上記変異は、２５９Ｍ変異及び／又は４２３Ｌ変異をさらに含むことが好ましい。つまり、上記ポリペプチドに、２５９Ｍ変異及び／又は４２３Ｌ変異をさらに導入することが好ましい。亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能向上の観点から、２５９Ｍ変異を導入することがより好ましく、２５９Ｍ変異及び４２３Ｌ変異を導入することがさらに好ましい。非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸がメチオニン以外のアミノ酸である場合には、２５９Ｍ変異を導入することが好ましい。非変異型ポリペプチドにおいて、配列番号２の４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である場合には、４２３Ｌ変異を導入することが好ましい。
【００６０】
変異が導入される酵母は特に限定されず、上述した酵母形質転換体を得る際に宿主として用いられる醸造用酵母等が好適に使用される。酵母は、好ましくはビール酵母であり、より好ましくは上面発酵酵母である。上記変異を導入することにより、上面発酵酵母の亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能を効果的に向上させることができる。このため本発明の方法は、上面発酵酵母の亜硫酸生成能の向上、又は、上面発酵酵母の亜硫酸耐性能の向上に好適に使用される。一態様において、変異が導入される酵母は、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドを含む酵母が好ましく、該ポリペプチドを含むビール酵母がより好ましく、上面発酵酵母がさらに好ましい。
【００６１】
変異を導入する方法は、酵母において、該変異が導入されたポリペプチド（上述した本発明の変異型ポリペプチド）を生成させることができればよく、特に限定されない。
変異の導入は、例えば、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸の非極性アミノ酸（Ｘ）への置換を引き起こす変異を導入することにより行うことができる。好ましくは、上記ポリヌクレオチドに、配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸のメチオニンへの置換を引き起こす変異、及び／又は、配列番号２の４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸のロイシンへの置換を引き起こす変異をさらに導入する。このような変異の導入には、例えば、公知の遺伝子工学的手法を適宜使用することができる。また、変異の導入には、酵母に突然変異処理を施す方法、酵母において自然変異を誘発する方法なども使用され得る。
【００６２】
変異を導入するための遺伝子工学的手法は特に限定されない。例えば、上述した本発明のポリヌクレオチド（変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）又はその一部（上記の部分ポリヌクレオチド）を含むポリヌクレオチドを導入する方法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム等が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、特定の部位に変異を導入することができる。
上記変異の導入は、例えば、酵母に上述した本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含むポリヌクレオチドを導入することにより行うことが好ましい。導入するポリヌクレオチドは１種であってもよく２種以上であってもよい。
一態様において、酵母に本発明のポリヌクレオチド又はその一部を導入すると、導入したポリヌクレオチドと、酵母のゲノム中の上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードする領域との間で相同組換えが起こり、該ポリペプチドの配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸を非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異（１９Ｘ変異）を導入することができる。２５９Ｍ変異及び４２３Ｌ変異についても同様の方法で導入することができる。また、本発明のポリヌクレオチドを酵母に導入して、該ポリヌクレオチドにコードされる変異型ポリペプチドを発現させることも、上記変異を導入することに含まれる。
本発明のポリヌクレオチド又はその一部を含むポリヌクレオチドをそのまま、又は、上述するベクターに挿入して酵母に導入し形質転換することにより、該酵母に上記変異を導入することができる。酵母に導入するポリヌクレオチドやベクター、その導入方法等は、上述した酵母形質転換体の製造に使用されるものと同じである。
本発明のポリヌクレオチドの一部を使用して上記変異を導入する方法として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム等を使用することもできる。変異の導入に使用される本発明のポリヌクレオチド及びその一部は、上述したＰＣＲによる変異導入等の方法により得ることができる。
【００６３】
突然変異処理は、例えば、紫外線照射、放射線（γ線等）等の高エネルギービーム線照射等の物理的方法；ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、亜硝酸（応用微生物学  改訂版、村井及び荒井共編、培風館）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、アジ化ナトリウム等の薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい。
自然変異を誘発する方法として、例えば、亜硫酸濃度が高い培地（例えば、亜硫酸濃度が０．５〜５ｍＭ）で酵母を培養して突然変異を誘発する方法が挙げられる。
【００６４】
酵母に上記の変異を導入後（例えば、上記ポリヌクレオチドを導入後、突然変異処理後又は突然変異を誘発後）、変異が導入された酵母を選抜することが好ましい。選抜方法は特に限定されず、例えば、選抜培地（例えば、０．５〜５ｍＭ）で培養することにより変異が導入された酵母を選抜することができる。一態様においては、上記選抜培地で生育可能な酵母を、変異が導入された酵母として選抜することができる。
【００６５】
酵母に上記変異が導入されていることは、例えば、ＰＣＲ法等により確認することができる。例えば、酵母からゲノムＤＮＡを抽出し、本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、酵母のゲノムに本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドに特異的な配列（好ましくは、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸をコードする塩基配列を含む配列）が存在するか否かを調べる。上記の特異的な配列として、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸をコードする配列に加えて、配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸及び／又は４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸をコードする塩基配列を含む配列の存在を調べることも好ましい。本発明のポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドに特異的な配列の存在が確認された酵母は、上記変異が導入されており、亜硫酸生成能や亜硫酸耐性能が向上している。プライマー又はプローブを用いて所望の塩基配列を含むポリヌクレオチドの存在を確認する方法は、公知の手法で実施することができる。このような方法として、後述する酵母の評価方法に記載の方法を使用することができる。変異が導入された酵母は、亜硫酸生成能が向上した酵母、亜硫酸耐性能が向上した酵母として好適に使用され得る。
【００６６】
亜硫酸生成能、亜硫酸耐性能が向上することから、上記変異が導入された酵母は、上記変異型ポリペプチドを高発現するものであることが好ましい。また上記変異が導入された酵母は、亜硫酸還元が抑制されていることが好ましい。亜硫酸還元が抑制されている酵母では、酵母細胞内において変異型ポリペプチドの基質である亜硫酸量が増加することから、亜硫酸生成能が向上する。
変異型ポリペプチドを高発現する酵母として、上述した変異型ポリペプチドのプロモーターとして高発現型プロモーターを有する酵母、転写因子の活性が高い酵母などが挙げられる。亜硫酸還元が抑制されている酵母として、例えば、上述した亜硫酸の還元経路に係わるポリペプチドの発現が抑制されている酵母などが挙げられる。
本発明においては、上記の変異を導入する酵母として、上記変異型ポリペプチドを高発現する酵母、亜硫酸還元が抑制されている酵母を使用してもよい。また、酵母に、上記変異型ポリペプチドを高発現させる変異を導入することにより、変異型ポリペプチドを高発現させてもよい。酵母に、亜硫酸還元を抑制する変異を導入してもよい。
【００６７】
上記変異型ポリペプチドを高発現させる変異を導入する方法として、酵母に上述した高発現型プロモーターを導入する、転写因子の活性を高める変異を導入する等の方法が挙げられる。酵母において転写因子の活性を高める方法として、高活性型転写因子を導入する等の方法が挙げられる。亜硫酸還元を抑制する変異を導入する方法として、例えば、上述した亜硫酸の還元経路に係わるポリペプチドの発現を抑制する方法等が挙げられる。これらの変異は、公知の方法で導入することができる。例えば、亜硫酸の還元経路に係わるポリペプチドの発現抑制は、当該ポリペプチドをコードする遺伝子発現を抑制することにより行うことができる。高発現型プロモーター、転写因子及び高活性型転写因子、亜硫酸の還元経路に関わるポリペプチドとしては、上述したものなどが挙げられる。
【００６８】
＜亜硫酸生成能が向上した酵母の製造方法及び亜硫酸耐性能が向上した酵母の製造方法＞
本発明の亜硫酸生成能が向上した酵母の製造方法及び亜硫酸耐性能が向上した酵母の製造方法は、酵母に対して変異を導入することを含む。本発明の亜硫酸生成能が向上した酵母の製造方法及び亜硫酸耐性能が向上した酵母の製造方法を、まとめて本発明の酵母の製造方法ともいう。
本発明の酵母の製造方法における上記変異は、上述した（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチド（非変異型ポリペプチド）において、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異（１９Ｘ変異）を含む。変異を導入するポリペプチドは（ａ）〜（ｃ）の１種であってもよく、２種以上であってもよい。非変異型ポリペプチド、非極性アミノ酸（Ｘ）及びこれらの好ましい態様等は上述した通りである。酵母に導入する変異及びその好ましい態様は、上述した酵母の亜硫酸生成能向上方法において酵母に導入する変異及びその好ましい態様と同じである。亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能向上の観点から、上記変異は、２５９Ｍ変異及び／又は４２３Ｌ変異をさらに含むことが好ましい。酵母に対して変異を導入する方法は、上述した酵母の亜硫酸生成能向上方法における変異を導入する方法と同じである。変異が導入される酵母も、上述したものと同じものを使用することができ、好ましくは上面発酵酵母である。
亜硫酸生成能、亜硫酸耐性能が向上することから、上記変異が導入された酵母は、上記変異型ポリペプチドを高発現するものであることが好ましい。また上記変異が導入された酵母は、亜硫酸還元が抑制されていることが好ましい。
【００６９】
本発明の酵母の製造方法では、上述した亜硫酸生成能向上方法と同様に、変異を導入後、変異が導入された酵母を選抜することが好ましい。
酵母に上記変異を導入することにより、該変異導入前と比較して、亜硫酸生成能が向上した（高い）酵母を製造することができる。亜硫酸生成能が向上した酵母は、変異導入前と比較して亜硫酸排出能が向上していることから、亜硫酸耐性能が向上している。
【００７０】
＜酒類の製造方法＞
本発明の変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含み、酒類の醸造に適した酵母は、酒類の製造に好適に用いられる。このような酵母を酒類の製造に用いることによって、所望の酒類で亜硫酸含量を増加させることができる。変異型ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド並びにこれらの好ましい態様は、上述したものと同じである。本発明の変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む酵母は、例えば、酵母（好ましくは酒類の醸造に適した酵母）に対して、上記（ａ）〜（ｃ）の１以上のポリペプチドにおいて、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１９番目のメチオニンに相当する位置にあるアミノ酸を、バリン、アラニン、イソロイシン、グリシン及びロイシンからなる群より選択されるいずれかの非極性アミノ酸（Ｘ）に置換する変異を導入することにより得ることができる。好ましい態様においては、上記ポリペプチドにおいて、２５９Ｍ変異及び／又は４２３Ｌ変異をさらに導入する。
上記変異が導入された酵母（例えば、上述した本発明の酵母の製造方法により得られる酵母）を酒類の製造に使用すると、所望の酒類で亜硫酸含量を増加させることができる。後述する酵母の評価方法によって亜硫酸生成能が高いと評価された酵母、後述する亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母の選択方法によって選択された酵母も同様に好適に酒類の製造に使用することができる。酒類は特に限定されないが、例えば、ビール、ワイン、ウイスキー、清酒等が挙げられ、ビールが好ましい。これらの酒類を製造する場合、変異導入前の酵母の代わりに本発明において得られた酵母を用いる以外は、公知の手法で各種類を製造することができる。本発明によれば、亜硫酸含量が多く、香味安定性等に優れた酒類を、既存の原料、施設等を用いて製造することができる。
また上記酵母が、上記変異型ポリペプチドを高発現する、及び／又は、亜硫酸還元が抑制されている酵母であると、上述したように亜硫酸生成能がより高くなる。従って、このような酵母を酒類の製造に使用すると、酒類の亜硫酸含量をより増加させることが可能となる。変異型ポリペプチドを高発現する酵母、亜硫酸還元が抑制されている酵母は、上述したものと同じである。
【００７１】
上述した本発明の変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む酵母により麦汁を発酵させる工程を含むビールの製造方法も、本発明に包含される。このような酵母を用いることにより、ビール中の亜硫酸含量を増加させることができる。酵母は、ビールの製造に使用可能な酵母であればよく、上述したビール酵母等が挙げられ、好ましくは上面発酵酵母である。本発明の変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む酵母は、上述した本発明の酵母形質転換体であってよい。
一態様において、本発明の変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む上面発酵酵母を使用し、上面発酵によりビールを製造すると、亜硫酸含量が高いエールビール（上面発酵ビール）を製造することが可能である。本発明の一態様においては、例えば、酵母に由来する亜硫酸を１ｐｐｍ以上（好ましくは、２ｐｐｍ以上、より好ましくは２．５ｐｐｍ以上）含むエールビールを製造することが可能である。エールビールとは、上面発酵酵母を使用して、上面発酵により製造されたビールを指す。上面発酵の温度は、通常１０℃以上であり、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは１８〜２５℃である。
本発明において、ビールの亜硫酸含量は、ランキン法（ａｅｒａｔｉｏｎ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ法）により測定される、ＳＯ２量に換算した総亜硫酸量（遊離型及び結合型の亜硫酸の合計値）を指す。本発明において、ｐｐｍはｐｐｍ（ｗ／ｖ）である。
【００７２】
＜エールビール＞
亜硫酸を１ｐｐｍ以上含むエールビールも、本発明の一つである。亜硫酸を１ｐｐｍ以上含み、「エール」の表示が付されたビールも、本発明の一つである。「エール」の表示が付されたビールは、通常、エールビールである。亜硫酸を１ｐｐｍ以上含むエールビールは、例えば、エールビールの製造において、上述した本発明の変異型ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む上面発酵酵母を使用することにより製造することができる。
【００７３】
亜硫酸を１ｐｐｍ以上含むエールビールは、従来のエールビールよりも亜硫酸含量が多く、これにより、香味安定性に優れ、品質保持期間が長いという効果を奏する。エールビールの亜硫酸含量は、香味安定性及び品質保持期間の向上の観点から、２ｐｐｍ以上が好ましく、２．５ｐｐｍ以上がより好ましく、３ｐｐｍ以上がさらに好ましい。ビールの香味の観点から、エールビールの亜硫酸含量は２０ｐｐｍ以下が好ましく、１５ｐｐｍ以下がより好ましい。
【００７４】
＜酵母の評価方法及び選択方法＞
本発明は、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能を評価する方法も包含する（単に評価方法ともいう）。本発明は、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法（単に酵母の選択方法ともいう）も包含する。
一態様において、本発明の酵母の評価方法及び酵母の選択方法は、被験（被検）酵母における、本発明の変異型ポリペプチドの発現を検出又は測定することを含む。本発明の変異型ポリペプチドは非変異型ポリペプチドと比較して亜硫酸排出能が高いことから、該変異型ポリペプチドの発現が検出される酵母は、検出されない酵母と比較して亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能が高いといえる。また、該変異型ポリペプチドの発現量が多い酵母は、少ない酵母と比較して、亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能が高いといえる。変異型ポリペプチドの発現は、例えば、該変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を検出又は測定することによって、検出又は測定することができる。
【００７５】
本発明においては、被験酵母における、本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を検出又は測定することによって、酵母の亜硫酸生成能及び亜硫酸排出能を評価することができる。このような被験酵母における、本発明のポリヌクレオチドの発現を検出又は測定することを含む、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸排出能を評価する方法も本発明の１つである。
上記ポリヌクレオチドの発現の検出又は測定は、例えば、被験酵母における、該ポリヌクレオチドのｍＲＮＡを検出又は定量することによって行うことができる。ｍＲＮＡの検出又は定量は、公知の手法によって行うことができ、例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって行うことができる。例えば、本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現が検出された被験酵母は、該ポリヌクレオチドが検出されない酵母と比較して、亜硫酸生成能が高いと評価することができる。また、上記ポリヌクレオチドの発現が検出された被験酵母は、該ポリヌクレオチドが検出されない酵母と比較して、亜硫酸耐性能が高いと評価することができる。一方、上記ポリヌクレオチドの発現が検出されない被験酵母は、該ポリヌクレオチドが検出された酵母と比較して、亜硫酸生成能が低いと評価することができる。この亜硫酸生成能が低いと評価された酵母は、亜硫酸耐性能が低いと評価することもできる。一態様において、ポリヌクレオチドの発現の検出又は測定は、ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの発現量の測定により行われることが好ましい。亜硫酸生成能が高いと評価された酵母は、例えば、上述した酒類の醸造等に好適に使用される。
【００７６】
また、被験酵母における、本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を検出又は測定することによって、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択することができる。このような被験酵母における、本発明のポリヌクレオチドの発現を検出又は測定することを含む、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法も本発明の１つである。一態様において、上記ポリヌクレオチドの発現が検出された被験酵母を、亜硫酸生成能が高い酵母又は亜硫酸耐性能が高い酵母として選択することができる。また、別の一態様において、基準酵母及び被験酵母における上記ポリヌクレオチドの発現量を測定し、基準酵母と被験酵母の該ポリヌクレオチドの発現量を比較して、所望の酵母を選択することもできる。例えば、被験酵母及び基準酵母における、上記ポリヌクレオチドの発現量を測定し、該ポリヌクレオチドの発現量が基準酵母よりも多い被験酵母を、亜硫酸生成能が高い酵母又は亜硫酸耐性能が高い酵母として選択することもできる。
【００７７】
被験酵母又は基準酵母は、野生型の酵母、上述した本発明の酵母形質転換体、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母、上述した本発明の酵母の製造方法により得られた変異が導入された酵母等のいずれであってもよい。酵母は、好ましくは上記の醸造用に使用可能な任意の酵母であり、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母が挙げられ、ビール酵母が好ましく用いられる。中でも、上面発酵酵母が好ましい。基準酵母、被験酵母は、上記酵母から任意の組合せで選択してもよい。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドの発現の検出又は測定する方法の一態様として、該ポリヌクレオチド又はその特異的な配列を検出する方法が挙げられる。本発明のポリヌクレオチド又はその特異的な配列の検出は、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて行うことができる。
本発明は、上述した本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、酵母の亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能を評価する方法も包含する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、亜硫酸生成能又は亜硫酸耐性能が高い酵母を選択する方法も包含する。
【００７９】
プライマー又はプローブを用いる評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報等に記載されている。以下、この評価方法の一例について簡単に説明する。
まず、被験酵母のゲノムＤＮＡを調製する。調製方法は、Ｈｅｒｅｆｏｒｄ法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐ１３０  （１９９０））。得られたゲノムＤＮＡを対象にして、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列（好ましくはＯＲＦ配列）に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被験酵母のゲノムにそのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドに特異的な配列が存在するか否かを調べる。
プライマー又はプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
本発明のポリヌクレオチドに特異的な配列として、変異型ポリペプチドにおける配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸（上記の非極性アミノ酸（Ｘ）、好ましくはバリン）を含む部分配列をコードする塩基配列が挙げられる。本発明のポリヌクレオチド又はその特異的な配列が検出された被験酵母は、亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能が高いと評価される。このような被験酵母を、亜硫酸生成能が高い酵母又は亜硫酸耐性能が高い酵母として選択することができる。亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能がより高い酵母を選択する観点から、上記の塩基配列に加えて、変異型ポリペプチドにおける配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸を含む部分配列をコードする塩基配列、及び／又は、配列番号２の４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸を含む部分配列をコードする塩基配列を検出することも好ましい。配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸が非極性アミノ酸（Ｘ）（好ましくはバリン）であり、かつ、配列番号２の２５９番目に相当する位置にあるアミノ酸がメチオニン及び／又は４２３番目に相当する位置にあるアミノ酸がロイシンであると、亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能がより高い酵母と評価することができる。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチド又はその特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流又は下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド、又は、その塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、１０塩基以上が好ましく、１５〜２５塩基がより好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、３００〜２０００塩基が好ましい。また、挟み込む部分は、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸をコードする塩基配列を含むことが好ましい。ＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：９０〜９５℃、アニーリング温度：４０〜６０℃、伸長温度：６０〜７５℃、サイクル数：１０回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のＤＮＡ分子を含む大きさかどうかによって、その酵母の亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能について予測及び／又は評価することができる。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測及び／又は評価することが可能である。
【００８１】
本発明の酵母の選択方法において選択された亜硫酸生成能が高い酵母は、例えば、上述した酒類の醸造に好適に使用される。選択された亜硫酸生成能が高い酵母は、通常亜硫酸耐性能が高い酵母として選択することもできる。亜硫酸耐性能が高い酵母は、亜硫酸濃度が高い酒類の醸造に好適に使用される。さらに、被験酵母における本発明の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量を測定し、目的とする亜硫酸生成能に応じた該ポリヌクレオチドの発現量の被験酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な亜硫酸生成能を有する酵母を選択することもできる。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、これにより本発明の範囲を限定するものではない。
実施例において用いる分子生物学的手法は、特に詳述しない場合は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載の方法に従った。
【００８３】
＜実施例１＞
候補アミノ酸の抽出
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ２８８Ｃ株（以下、Ｓ２８８Ｃ株ともいう）のＳｃＳＳＵ１は、ラガービール酵母であるサッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）の有するＳｂＳＳＵ１（Ｓｂ型ＳＳＵ１遺伝子にコードされる亜硫酸排出能を有するポリペプチド）よりも亜硫酸排出能（亜硫酸排出活性）が低い。
Ｓ２８８Ｃ株のＳｃＳＳＵ１のアミノ酸配列（配列番号２）と、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ)  ＷＥＩＨＥＮＳＴＥＰＨＡＮ  ３４／７０株（ＷＨ３４／７０株ともいう）のＳｂＳＳＵ１のアミノ酸配列（配列番号４）についてＣｌｕｓｔａｌＷによりアライメントを行い、活性に寄与する候補酸残基を抽出した。ペアワイズアライメントパラメーターとしては、ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０、ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．１（デフォルトのパラメーター）とした。
図１は、ＷＨ３４／７０株のＳｂＳＳＵ１のアミノ酸配列（上段）と、Ｓ２８８Ｃ株のＳｃＳＳＵ１のアミノ酸配列（下段）との配列アラインメントを示す図である。
アライメントの結果、ＳｂＳＳＵ１（配列番号４）とＳｃＳＳＵ１（配列番号２）は７９％（３６２残基）の配列同一性を示し、両者の間に９６残基の異なるアミノ酸があることが分かった（図１）。
【００８４】
＜実施例２＞
ＳＳＵ１変異体の作出
配列番号４のＳｂＳＳＵ１及び配列番号２のＳｃＳＳＵ１の間で異なるアミノ酸残基のうち、１１箇所のアミノ酸（連続部分も含む）に着目し、ＳｃＳＳＵ１にＳｂＳＳＵ１型のアミノ酸置換変異導入を行った。配列番号２のＳｃＳＳＵ１をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号１に、配列番号４のＳｂＳＳＵ１をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号３にそれぞれ示す。
（１）ＳｃＳＳＵ１変異体
ＳｃＳＳＵ１変異体として、配列番号２に示すアミノ酸配列に以下のアミノ酸置換変異を導入した。以下では、置換位置の番号の前に非変異型のアミノ酸（置換前の配列番号２又は４中のアミノ酸残基）を記載し、該置換位置の番号の後に変異後のアミノ酸を記載して、アミノ酸を置換する変異を表記する（アミノ酸は、１文字表記）。例えば、１９番目のメチオニンをバリンに置換する変異は、Ｍ１９Ｖと表記する。
（１−１）１アミノ酸置換変異体
Ｍ１９Ｖ（ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖ）
Ａ５２Ｔ（ＳｃＳＳＵ１−Ａ５２Ｔ）
Ｈ８９Ｙ（ＳｃＳＳＵ１−Ｈ８９Ｙ）
Ｙ１６４Ｈ（ＳｃＳＳＵ１−Ｙ１６４Ｈ）
Ｎ１７５Ｈ（ＳｃＳＳＵ１−Ｎ１７５Ｈ）
Ｃ１９４Ｇ（ＳｃＳＳＵ１−Ｃ１９４Ｇ）
Ｌ２５８Ｖ（ＳｃＳＳＵ１−Ｌ２５８Ｖ）
Ｖ２６９Ｉ（ＳｃＳＳＵ１−Ｖ２６９Ｉ）
Ｇ３９０Ａ（ＳｃＳＳＵ１−Ｇ３９０Ａ）
（１−２）連続変異置換変異体
１１０−１２４番目のアミノ酸を配列番号４のＳｂＳＳＵ１の１１０−１２４番目の配列に置換（ＳｃＳＳＵ１（１１０−１２４））
１９８−２１６番目のアミノ酸を配列番号４のＳｂＳＳＵ１の１９８−２１６番目の配列に置換（ＳｃＳＳＵ１（１９８−２１６））
【００８５】
（２）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＯＹ００１株（以下、ＥＯＹ００１株という）のＳｃＳＳＵ１変異体
ＥＯＹ００１株のＳｃＳＳＵ１（以下、ＳｃＳＳＵ１（ＥＯＹ００１）という）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、５２番目及び６１番目のアラニンがトレオニンに（Ａ５２Ｔ、Ａ６１Ｔ）、９０番目のアスパラギンがセリンに（Ｎ９０Ｓ）、１２２番目のアラニンがセリンに（Ａ１２２Ｓ）、１５７番目のプロリンがセリンに（Ｐ１５７Ｓ）、１６４番目のチロシンがヒスチジンに（Ｙ１６４Ｈ）それぞれ置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ＳｃＳＳＵ１（ＥＯＹ００１）のアミノ酸配列において、１９番目のメチオニンをバリンに置換する変異（Ｍ１９Ｖ）を導入した。
Ｍ１９Ｖ（ＳｃＳＳＵ１（ＥＯＹ００１）−Ｍ１９Ｖ）
【００８６】
（３）ＳｂＳＳＵ１変異体
ＳｂＳＳＵ１変異体については、配列番号４に示すアミノ酸配列に、以下のアミノ酸置換変異を導入した。
Ｖ１９Ｍ（ＳｂＳＳＵ１-Ｖ１９Ｍ）
【００８７】
ＳＳＵ１又はＳＳＵ１変異体をコードするＤＮＡを酵母発現ベクターに組み込むために下記のプライマーセット（配列番号５〜３４）を設計した。ＰＣＲによる変異導入についてはＮｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００７に倣った（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２，  ２３５８１−２３５９０．）。配列番号２のＳｃＳＳＵ１及びその変異体はＳ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型にした。ＳｂＳＳＵ１及びその変異体は、ラガー酵母であるＷＨ３４／７０株のゲノムＤＮＡを鋳型とした。また、ＳｃＳＳＵ１（ＥＯＹ００１）及びその変異体については、ＥＯＹ００１株のゲノムＤＮＡを鋳型にした。
【００８８】
典型的なＰＣＲ条件は下記の通りである。
ＰＣＲ反応液（５０μＬ）は、酵母ゲノム（Ｓ２８８Ｃ株、ＷＨ３４／７０株又はＥＯＹ００１株）１μＬ、ＰｒｉｍｅｓｔａｒＭａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ  （２ｘ）（ＴａＫａＲａＢｉｏ）、プライマー各０．４ｐｍｏｌ／μＬからなる組成とした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１分間反応させた後、９５℃で１５秒、５５℃で１０秒、７２℃で３０秒の反応を計３０サイクルの増幅を行った。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルにより電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、推定された目的のサイズに増幅バンドが得られたことを確認した。
【００８９】
1. ScSSU1-TDH3pro-F  CATTAATGCAGGTTGCGGCCGCATGGTTGCCAATTGGGTACTT（配列番号５）
2. ScSSU1-TDH3pro-R  CGGGCATTTAAATGCGGCCGCTTATGCTAAACGCGTAAAATCTAGAG（配列番号６）
3. SbSSU1-TDH3pro-R  CATTAATGCAGGTTGCGGCCGCATGGTCGCTAGTTGGATGCTC（配列番号７）
4. SbSSU1-TDH3pro-R  GGGCATTTAAATGCGGCCGCTTATGTTAAATATGTACTATCGATAGCCG（配列番号８）
5. ScSSU1-M19V-F  ATGTTTGTCATGGTCATGGGTG（配列番号９）
6. ScSSU1-M19V-R  GACCATGACAAACATGAAGGGG（配列番号１０）
7. ScSSU1-H89Y-FW3  CAGAAATATGAAGTACAATTTATTTTGGGGTAC（配列番号１１）
8. ScSSU1-H89Y-RV3  GTACCCCAAAATAAATTGTACTTCATATTTCTG（配列番号１２）
9. ScSSU1-A52T-FW  GTTTGCTATCACTTGCCTTATTTTCATTGC（配列番号１３）
10. ScSSU1-A52T-RV  GAAAATAAGGCAAGTGATAGCAAACATG（配列番号１４）
【００９０】
11. ScSSU1-Y164H-FW  GATTGGGAATCATCCTTCATATAATATCAAAATGG（配列番号１５）
12. ScSSU1-Y164H-FW  CCATTTTGATATTATATGAAGGATGATTCCCAATC（配列番号１６）
13. ScSSU1-N175H-F  TCCGAACACATGAAAAGTGTATTG（配列番号１７）
14. ScSSU1-N175R-R  TTTCATGTGTTCGGATGCCA（配列番号１８）
15. ScSSU1-C194G-F  TCAAGTGGTGGAACATTCACAA（配列番号１９）
16. ScSSU1-C194G-R  TGTTCCACCACTTGAAGCGA（配列番号２０）
17. ScSSU1-L258V-F  TTCCTGGTATTGGGCCCG（配列番号２１）
18. ScSSU1-L258V-R  GCCCAATACCAGGAATAAGGT（配列番号２２）
19. ScSSU1-V269I-F  TTTGGAATTTTATTGCTTACAGATAATATA（配列番号２３）
20. ScSSU1-V269I-R  CAATAAAATTCCAAAACTTCCTTGGC（配列番号２４）
【００９１】
21. ScSSU1-G390A-FW2  GCATTTAGAGTCCTAGCAACCATATACG（配列番号２５）
22. ScSSU1-G390A-RV2  CGTATATGGTTGCTAGGACTCTAAATGC（配列番号２６）
23. ScSSU1-110-124Sense  ACTGTCACAAAAATTTACCACGACAAGCCCTGCGAATGCCAAGCACTTG（配列番号２７）
24. ScSSU1-110-124AntiS  CAAGTGCTTGGCATTCGCAGGGCTTGTCGTGGTAAATTTTTGTGACAGT（配列番号２８）
25. ScSSU1-110-124-F  AATGCCAAGCACTTGATGATATTTGTTTACGTCTTGTG（配列番号２９）
26. ScSSU1-110-124-R  AAATTTTTGTGACAGTGCTCCTAAGAAATTTATAATTGTAAC（配列番号３０）
27.ScSSU1-198-216Sense  CAAAAATATTCGGTACCACTTTTGATAGGAATATTCAATTGCTAACACTG（配列番号３１）
28.ScSSU1-198-216AntiS  CAGTGTTAGCAATTGAATATTCCTATCAAAAGTGGTACCGAATATTTTTG（配列番号３２）
29. ScSSU1-198-216-F  CAATTGCTAACACTGGTCATATGTGCCTTAACG（配列番号３３）
30. ScSSU1-198-216-R  GGTACCGAATATTTTTGACATTGTGAATGTTCCACA（配列番号３４）
31．SbSSU1-V19M-F  CCTTTCATGTTTATGATGGTTATGG（配列番号３５）
32．SbSSU1-V19M-R  AACCATCATAAACATGAAAGGGTT（配列番号３６）
【００９２】
１アミノ酸置換変異体をコードするＤＮＡを含むプラスミドについては、以下のように調製した。例えばＭ１９Ｖ（ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖ）については、上記の１＋６のプライマーセット（配列番号５及び配列番号１０）でＳ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲして得られたＤＮＡ断片、２＋５のプライマーセット（配列番号６及び配列番号９）でＰＣＲして得られたＤＮＡ断片（鋳型はＳ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡ）、及び、酵母発現ベクターＹＣｐＧ−ＴＤＨ３ｐｔベクター（特開２０１６−０７７１６０号公報）をＳｔｕＩで消化した断片、の合計３断片をＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｅａｍｌｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で連結して、ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖ変異体をコードするＤＮＡを含むプラスミドを得た。その他の変異体をコードするＤＮＡを含むプラスミドも同様にして調製した。
ＳｃＳＳＵ１（ＥＯＹ００１）−Ｍ１９ＶをコードするＤＮＡを含むプラスミドは、Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡの代わりに、ＥＯＹ００１株のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた以外は、上記のＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９ＶをコードするＤＮＡを含むプラスミドの調製と同じ方法で調製した。
【００９３】
連続置換変異体ＳｃＳＳＵ１（１１０−１２４）については、上記の２３と２４（配列番号２７及び配列番号２８）をアニーリングさせたＤＮＡ断片、１＋２６のプライマーセット（配列番号５及び配列番号３０）でＰＣＲして得られたＤＮＡ断片（鋳型はＳ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡ）、２＋２５のプライマーセット（配列番号６及び配列番号２９）でＰＣＲして得られたＤＮＡ断片（鋳型はＳ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡ）、及び、ＹＣｐＧ−ＴＤＨ３ｐｔベクターをＳｔｕＩで消化した断片、合わせて４断片をＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｅａｍｌｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で連結して、ＳｃＳＳＵ１（１１０−１２４）をコードするＤＮＡを含むプラスミドを得た。連続置換変異体ＳｃＳＳＵ１（１９８−２１６）をコードするＤＮＡを含むプラスミドについても同様にして調製した。
【００９４】
得られたプラスミドから、各変異体をコードするＤＮＡ断片を酵母発現用ＹＣｐＧ＿ＴＤＨ３ｐｔベクターにサブクローニングして発現ベクターを得た。この発現ベクターについて、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的の遺伝子及び変異のみが導入されていることを確認した。本発現ベクターにおいてはＴＤＨ３遺伝子のプロモーターの下流に導入遺伝子が挿入されることで、構成的に挿入された遺伝子が発現する。
【００９５】
＜実施例３＞
酵母の形質転換
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＯＹ００２株（以下、ＥＯＹ００２株ともいう）を宿主として、酢酸リチウム法で、上記で作製したＳＳＵ１（ＳｃＳＳＵ１又はＳｂＳＳＵ１）又はその変異体をコードするＤＮＡを含む発現ベクター（プラスミド）を用いて形質転換した。形質転換株として、ＹＰＤ＋Ｇ４１８寒天培地（１Ｌあたり、グルコース２０ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ、ペプトン２０ｇ、Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ２０ｇ、Ｇ４１８硫酸塩２０μｇ／ｍＬ）で生育するものを選抜した。
各プラスミドを保持したＥＯＹ００２形質転換体を、Ｇ４１８硫酸塩を２０μｇ／ｍＬ含むＹＰＤ培地（１Ｌあたり、グルコース２０ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ、ペプトン２０ｇ）で一晩、３０℃で培養した。１×１０７ｃｅｌｌｓの菌体を１０ｍＬのＳＳＹ培地（１Ｌあたり、グルコース１０ｇ、マルトース６０ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ、ペプトン１０ｇ）に移し、２０℃で３日間振とう培養した。３日後、上清を回収した。
上清の亜硫酸の測定はＦ−キット  亜硫酸（（株）ＪＫインターナショナル）を用い、プロトコルに従って測定した。この測定方法は、溶存している亜硫酸を亜硫酸オキシダーゼと反応させ、生成された過酸化水素を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の存在下、ＮＡＤＨペルオキシダーゼで還元し、減少するＮＡＤＨを３４０ｎｍの吸光度変化により求めることで、亜硫酸を定量する方法である。実施例中、亜硫酸は、ＳＯ２量に換算した量で求めた。Ｆ−キット  亜硫酸で測定した亜硫酸測定結果は、基準株のＳＯ２量を１とした比で表した。
【００９６】
ＳＳＵ１の亜硫酸生成能の評価結果
図２は、ＳｃＳＳＵ１又はその変異体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体、及び、ＳｂＳＳＵ１又はその変異体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の亜硫酸生成能の評価結果を示す図である。図２に示す結果は、Ｓ２８８Ｃ株のＳｃＳＳＵ１（配列番号２）を導入した形質転換体（ＳｃＳＳＵ１）の亜硫酸生成量（培地上清中の亜硫酸濃度）を１とした、各形質転換体の亜硫酸生成量の比（濃度比）である。Ｓ２８８Ｃ株のＳｃＳＳＵ１を導入した形質転換体（ＳｃＳＳＵ１）の亜硫酸生成量を１とした場合、空ベクターであるＹＣｐＧ＿ＴＤＨ３ｐｔベクターで形質転換した酵母（コントロール）では約０．３程度の相対活性が見られ、これが酵母のバックグラウンドレベルであった（図２）。それに対してＳｂＳＳＵ１（配列番号４)を導入した形質転換体（ＳｂＳＳＵ１）は、ＳｃＳＳＵ１に対して約２．２倍の相対活性を示し、ラガー酵母の高い亜硫酸生成に大きく寄与していると考えられる。
次に、ＳｃＳＳＵ１の１９番目のＭｅｔ残基をＶａｌに置換した変異体を導入した形質転換体（ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖ）を評価したところ、ＳｃＳＳＵ１の約１．８倍の亜硫酸生成を検出した。
同様にＥＯＹ００１株由来のＳｃＳＳＵ１（ＥＯＹ００１）（Ｓ２８８Ｃ株由来のＳＳＵ１と比べ６か所のアミノ酸多型を有する（Ａ５２Ｔ、Ａ６１Ｔ、Ｎ９０Ｓ、Ａ１２２Ｓ、Ｐ１５７Ｓ、Ｙ１６４Ｈ））についてもＭ１９Ｖ変異を導入したところ、Ｍ１９Ｖを導入しない元々のＳｃＳＳＵ１（ＥＯＹ００１）に比べ約１．９倍の高い相対活性を示した。したがってＳｃＳＳＵ１の亜硫酸排出能（亜硫酸排出活性）を、例えばＳｂＳＳＵ１並に高めるためにはＭ１９Ｖ変異が重要であることが明らかとなった。
逆に、ＳｂＳＳＵ１の１９番目のＶａｌ残基をＭｅｔに置換した変異体を導入した形質転換体（ＳｂＳＳＵ１-Ｖ１９Ｍ）について評価したところ、ＳｃＳＳＵ１と同程度の低い亜硫酸生成活性を示した。従って、ＳｂＳＳＵ１の高い亜硫酸排出能を１９番目のＶａｌ残基が大きく担っていることが示された。
その他の１０種のＳｃＳＳＵ１変異体では元のＳｃＳＳＵ１とあまり活性の変化が認められなかったため、これらは単独では亜硫酸生成にほとんど寄与していないと予想された。
【００９７】
＜実施例４＞
ＳＳＵ１の亜硫酸耐性の評価系（培地）
実施例３で作製した一部の株（形質転換体）を、ピロ亜硫酸カリウム（Ｋ２Ｓ２Ｏ５）を含む培地で培養することにより、亜硫酸耐性を評価した。
ピロ亜硫酸カリウムを含む培地の組成は以下である。ＳＤ寒天培地（１Ｌあたり、グルコース２０ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ６．７ｇ、Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ  ２０ｇ）にピロ亜硫酸カリウムを１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭになるように添加した。
Ｇ４１８硫酸塩を２０μｇ／ｍＬ含むＹＰＤ培地（１Ｌあたり、グルコース２０ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ、ペプトン２０ｇ）で一晩、３０℃で各形質転換体を培養した。培養後、上記のピロ亜硫酸カリウムを含む培地に、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの菌体液をそれぞれ３μＬスポットした。３０℃で３日間培養した。
【００９８】
ＳＳＵ１の亜硫酸耐性の評価（結果）
図３に、ＳｃＳＳＵ１又はその変異体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体、及び、ＳｂＳＳＵ１又はその変異体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の亜硫酸耐性能の評価結果を示す。図３は、各形質転換体をピロ亜硫酸カリウム濃度０ｍＭ又は５ｍＭで３日間培養後のプレートの写真である（菌数（スポットした菌体液の１ｍＬあたり）は、左から１×１０６ｃｅｌｌｓ、１×１０５ｃｅｌｌｓ、１×１０４ｃｅｌｌｓ）。
ネガティブコントロール区の空ベクターを保持している酵母（コントロール）については５ｍＭピロ亜硫酸カリウムを含む培地では生育できなかったが、ＳｃＳＳＵ１（配列番号２）を構成的に発現させた酵母（ＳｃＳＳＵ１）については菌数を増やすと生育が確認できた（図３）。ＳｃＳＳＵ１を構成的に発現させた酵母は５ｍＭピロ亜硫酸カリウムを含む培地では生育阻害が確認されたが、ＳｂＳＳＵ１(配列番号４)を発現させた酵母（ＳｂＳＳＵ１）はピロ亜硫酸カリウムを含まない対照区（０ｍＭ）と同程度の増殖を示した。したがって、亜硫酸生成能は外部からの亜硫酸の排出にも寄与することが確認された。
先述の亜硫酸生成活性が高まったＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖ変異体及びＳｃＳＳＵ１（ＥＯＹ００１株）−Ｍ１９Ｖ変異体を導入した形質転換体について評価したところ、１アミノ酸残基の変異導入にもかかわらず５ｍＭピロ亜硫酸カリウムを含む培地でも生育し、ＳｂＳＳＵ１と同等の亜硫酸耐性を示した。逆に亜硫酸排出能の低下したＳｂＳＳＵ１-Ｖ１９Ｍ変異体を導入した形質転換体については、亜硫酸耐性がＳｃＳＳＵ１の形質転換体と同レベルまで低下しており、Ｍ１９Ｖ変異による亜硫酸生成活性と亜硫酸耐性との間に正の相関が確認された。
本プレート培地では亜硫酸が酵母の細胞外に与えられるため、細胞外亜硫酸に対する耐性を観察しており、酵母のＳｂＳＳＵ１は内生の亜硫酸を排出するだけでなく、外部から曝露された亜硫酸に対しても排出を行うことで、亜硫酸耐性に寄与していることが示された。特にＳｂＳＳＵ１の１９番目のＶａｌ残基がこの高い活性に重要で、活性が低いＳｃＳＳＵ１の１９番目のＭｅｔ残基をＶａｌ残基に置き換えるだけでその亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性を付与することができることが明らかとなった。
【００９９】
＜実施例５＞
上記のように、酵母のＳＳＵ１において、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸を、ＳｃＳＳＵ１型のメチオニン残基からＳｂＳＳＵ１で見られるバリン残基に置換すると、ＳＳＵ１の亜硫酸排出能及び酵母の亜硫酸耐性能が大きく向上する。
次に、ＳＳＵ１において、配列番号２の１９番目に相当する位置にあるアミノ酸を、バリン残基以外のアミノ酸に置換することによってＳＳＵ１の活性を向上させられないか検討した。下記の変異導入用のプライマーセット（配列番号４９〜５６）を用いて、前述の実施例２に記載のＭ１９Ｖ変異体の作製と同様の方法で、配列番号２に示すアミノ酸配列の１９番目のメチオニン（Ｍ）をグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）又はイソロイシン（Ｉ）に置換した以下の４種のＳｃＳＳＵ１変異体をコードするＤＮＡを含むプラスミドを作製した。鋳型には、Ｓ２８８Ｃ株のゲノムＤＮＡを用いた。
Ｍ１９Ｇ（ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｇ）
Ｍ１９Ａ（ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ａ）
Ｍ１９Ｌ（ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｌ）
Ｍ１９Ｉ（ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｉ）
【０１００】
ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｇ
ScSSU1-M19G-FW：CTTCATGTTTGGAATGGTCATGGGTGTC（配列番号４９）
ScSSU1-M19G-RV：ATGACCATTCCAAACATGAAGGGGTCAAA（配列番号５０）
ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ａ
ScSSU1-M19A-FW：CTTCATGTTTGCAATGGTCATGGGTGTC（配列番号５１）
ScSSU1-M19A-RV：ATGACCATTGCAAACATGAAGGGGTCAAA（配列番号５２）
ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｌ
ScSSU1-M19L-FW：CTTCATGTTTCTGATGGTCATGGGTGTC（配列番号５３）
ScSSU1-M19L-RV：ATGACCATCAGAAACATGAAGGGGTCAAA（配列番号５４）
ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｉ
ScSSU1-M19I-FW：CTTCATGTTTATCATGGTCATGGGTGTC（配列番号５５）
ScSSU1-M19I-RV：ATGACCATGATAAACATGAAGGGGTCAAA（配列番号５６）
【０１０１】
作製したプラスミドを用いて、実施例３と同じ方法で酵母形質転換体を作製した。得られた酵母形質転換体について、実施例３と同じ方法で、Ｆ−キット  亜硫酸（（株）ＪＫインターナショナル）を用いて亜硫酸生成能を評価した。対比のため、空ベクターを導入した酵母形質転換体、配列番号２のＳｃＳＳＵ１を導入した形質転換体（ＷＴ）、実施例２〜３で作製したＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖ、配列番号４のＳｂＳＳＵ１を導入した形質転換体についても同様に評価を行った。結果を図４に示す。
【０１０２】
図４は、ＳｃＳＳＵ１若しくはその変異体又はＳｂＳＳＵ１をコードするＤＮＡを導入した形質転換体をコードするＤＮＡを導入した形質転換体の亜硫酸生成能の評価結果を示すグラフである。図４に示す結果は、配列番号２のＳｃＳＳＵ１を導入した形質転換体（ＷＴ）の亜硫酸生成量（培地上清中の亜硫酸濃度）を１とした、各形質転換体の亜硫酸生成量の比（濃度比）である。Ｖｅｃｔｏｒは、空ベクターを保持している酵母（コントロール）である。上記で作製した４種のＳｃＳＳＵ１変異体を導入した酵母は、いずれの点変異体においてもＭ１９Ｖ変異には若干及ばないものの、野生型のＳｃＳＳＵ１に比べて亜硫酸生成能の向上が確認された（図４）。したがって配列番号２の１９番目に相当する位置のアミノ酸をＶ以外のＧ、Ａ、Ｌ又はＩ残基に置換することでも、ＳＳＵ１タンパク質の活性を向上させられることを見出した。
【０１０３】
＜実施例６＞
ＳｂＳＳＵ１のＶ１９の効果に相加的にかかわるアミノ酸残基の同定
ラガー酵母サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）ＷＨ３４／７０株の持つＳｂＳＳＵ１はユニークな１９番目のＶａｌ（Ｖ１９）の効果により高活性型であること分かった。
実施例３で使用した亜硫酸生成量の評価系（Ｆ−キット  亜硫酸、（株）ＪＫインターナショナル）を用いて亜硫酸生成能の高いラガー酵母を探索した。種々のラガー酵母を評価した結果、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）ＥＯＹ００５株（以下、ＥＯＹ００５株ともいう）が、亜硫酸生成能が高いことが分かった。
【０１０４】
亜硫酸生成能の評価においては、実施例３と同様に１０ｍＬのＳＳＹ培地に、酵母を１×１０７ｃｅｌｌｓ植菌し、２０℃で３日間振とう培養した。３日後、上清を回収した。実施例３と同様に、Ｆ−キット  亜硫酸を用いて上清の亜硫酸濃度を測定した。エールビール酵母であるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＯＹ００２（以下、ＥＯＹ００２株ともいう）についても同様の方法で亜硫酸生成能を評価した。
図５に、ＥＯＹ００２株、ＷＨ３４／７０株及びＥＯＹ００５株の亜硫酸生成能の評価結果を示す。図５に示す結果は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＳｃＳＳＵ１を、酵母ＥＯＹ００２株に導入した形質転換体（図８中のＳｃＳＳＵ１）の亜硫酸生成量（培地上清中の亜硫酸濃度）を１とした、各株の亜硫酸生成量の比（濃度比）で示した。
【０１０５】
エールビール酵母であるＳｃＳＳＵ１を持つＥＯＹ００２株に比べ、ＳｂＳＳＵ１を持つラガー酵母ＷＨ３４／７０株では、この評価系で約２倍の亜硫酸生成能が認められた。さらに別のラガー酵母であるＥＯＹ００５株については、ＷＨ３４／７０株と比べさらに４倍程度の高い亜硫酸生成能を有することが分かった（図５）。
【０１０６】
さらに、亜硫酸耐性能を評価するため、実施例４に記載の方法において、ＷＨ３４／７０株及びＥＯＹ００５株を１ｍＭのピロ亜硫酸カリウムを含む培地上で培養した。図６に結果を示す。図６は、ＷＨ３４／７０株及びＥＯＹ００５株をピロ亜硫酸カリウム濃度０ｍＭ又は１ｍＭで３日間培養後のプレートの写真である（スポットした菌体液中の菌数（１ｍＬあたり）は、左から１×１０６ｃｅｌｌｓ、１×１０５ｃｅｌｌｓ、１×１０４ｃｅｌｌｓ）。上記濃度の菌体液を、それぞれ３μＬスポットした。１ｍＭのピロ亜硫酸カリウム存在下において、ＷＨ３４／７０株と比べＥＯＹ００５株は良好な生育を示すことから、亜硫酸耐性能も高いと確認された。
【０１０７】
ラガー酵母であるＥＯＹ００５株の高い亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能の原因を調べる為に、ＥＯＹ００５株が有するＳｂＳＳＵ１（ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５）遺伝子の配列を確認した。ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号４７に、ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５のアミノ酸配列を配列番号４８にそれぞれ示す。ＷＨ３４／７０株のＳｂＳＳＵ１のアミノ酸配列と、ＥＯＹ００５株のＳｂＳＳＵ１のアミノ酸配列について、ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアライメント（デフォルト設定）したところ、ＷＨ３４／７０株のＳｂＳＳＵ１と比べＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５は２か所（Ｍ２５９及びＬ４２３）のアミノ酸多型を有していることが分かった（図７）。図７は、ＥＯＹ００５株のＳｂＳＳＵ１のアミノ酸配列（上段、ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５）と、ＷＨ３４／７０株のＳｂＳＳＵ１のアミノ酸配列（下段、ＳｂＳＳＵ１）との配列アラインメントを示す図である。なお、ＥＯＹ００５株のＳｂＳＳＵ１の２５９番目及び４２３番目のアミノ酸は、配列番号２に示すアミノ酸配列の２５９番目及び４２３番目にそれぞれ相当する位置にあるアミノ酸である。
【０１０８】
ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５が有するアミノ酸多型がＳｂＳＳＵ１タンパク質の活性に寄与するかどうかを調べる為に、実施例２〜３に記載の方法でＳＳＵ１遺伝子を酵母（ＥＯＹ００２株）で構成的に発現させて、その亜硫酸生成及び耐性能を評価した。
ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５の変異体として、ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５の１９番目のバリンをメチオニンに置換した変異体（ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｖ１９Ｍ変異体）、２５９番目のメチオニンをロイシンに置換した変異体（ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｍ２５９Ｌ変異体）及び４２３番目のロイシンをプロリンに置換した変異体（ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｌ４２３Ｐ変異体）を酵母に導入するためのベクターを作製した。Ｖ１９Ｍ変異体を導入するためのベクターは、実施例２〜３に記載の方法で、上記の配列番号３５及び３６のプライマーセットを用いて作製した。Ｍ２５９Ｌ変異体については、配列番号５７及び５８のプライマーセットを、Ｌ４２３Ｐ変異体については配列番号５９及び６０のプライマーセットを用いて、各変異体を導入するためのベクターを作製した。これらのＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５の変異体作製において、Ｍ２５９Ｌ変異体の作製には、ＥＯＹ００５株のゲノムＤＮＡを鋳型に、Ｌ４２３Ｐ変異体の作製には、ＷＨ３４／７０株のゲノムＤＮＡを鋳型に、それぞれ用いた。なお、Ｌ４２３Ｐ変異体（ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｌ４２３Ｐ変異体）のアミノ酸配列は、ＷＨ３４／７０株のＳｂＳＳＵ１（配列番号４）の２５９番目のロイシンをメチオニンに置換（Ｌ２５９Ｍ）したアミノ酸配列と同じである。
SbSSU1-EOY005-M259L-FW  5’-GTTGTTCTTGGTATTGGGGCCATTG（配列番号５７）
SbSSU1-EOY005-M259L-RV  5’-CAATGGCCCCAATACCAAGAACAAC（配列番号５８）
SbSSU1-L259M-FW  5’-GTTGTTCTTGGTAATGGGGCCATTG（配列番号５９）
SbSSU1-L259M-RV  5’-CAATGGCCCCATTACCAAGAACAAC（配列番号６０）
得られたベクターを酵母ＥＯＹ００２株に導入して、ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｖ１９Ｍ変異体、ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｍ２５９Ｌ変異体及びＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｌ４２３Ｐ変異体をそれぞれ発現する酵母形質転換体を作製した。
【０１０９】
この３種のＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５変異体を発現する酵母形質転換体の亜硫酸生成能を、実施例３と同様に、Ｆ−キット  亜硫酸（（株）ＪＫインターナショナル）を用いて評価した。また、この３種のＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５変異体をそれぞれ発現させた酵母の亜硫酸耐性能について、実施例４に記載の方法で評価した。
ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５変異体の代わりに、ＥＯＹ００５株のＳｂＳＳＵ１（野生型）をコードするＤＮＡを導入した形質転換体（ＳｂＳＳＵ１（ＥＯＹ００５））も作製し、上記と同様に亜硫酸生成能及び亜硫酸耐性能を評価した。実施例２〜３で作製した配列番号２のアミノ酸配列からなるＳｃＳＳＵ１を発現させた形質転換体（ＳｃＳＳＵ１）、ＷＨ３４／７０株のＳｂＳＳＵ１を発現させた形質転換体（ＳｂＳＳＵ１）及びＳｂＳＳＵ１−Ｖ１９Ｍ変異体を発現する酵母についても同様に評価を行った。
【０１１０】
図８に、上記の各形質転換体の亜硫酸生成能の評価結果を示す。図８に示す結果は、ＳｃＳＳＵ１を発現させた形質転換体（ＳｃＳＳＵ１）の亜硫酸生成量を１とした、各形質転換体の亜硫酸生成量の比（濃度比）である。
ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５変異体の亜硫酸生成能を評価したところ、ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｖ１９Ｍ変異体を発現させた酵母（ＳｂＳＳＵ１（ＥＯＹ００５）−Ｖ１９Ｍ）では、野生型のＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５を発現させた酵母（ＳｂＳＳＵ１（ＥＯＹ００５））と比べて亜硫酸生成能が低下し、ＳｃＳＳＵ１と同レベルであった（図８）。一方、ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｍ２５９Ｌ変異体を発現させた酵母（ＳｂＳＳＵ１（ＥＯＹ００５）−Ｍ２５９Ｌ）では野生型のＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５に比べ約３１％の活性の低下が見られ、その活性はＳｂＳＳＵ１と同程度であった（図８）。また、ＳｂＳＳＵ１−Ｌ２５９Ｍ（つまり、ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５のアミノ酸配列において、４２３番目のロイシンをプロリンに置換したＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５変異体（ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｌ４２３Ｐ））においては野生型のＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５に比べ約１７％の活性の低下が見られた（図８）。
【０１１１】
各形質転換体の亜硫酸耐性能を評価した結果を図９に示す。図９は、ピロ亜硫酸カリウム濃度０ｍＭ又は５ｍＭで３日間培養後のプレートの写真である（スポットした菌体液中の菌数（１ｍＬあたり）は、左から１×１０６ｃｅｌｌｓ、１×１０５ｃｅｌｌｓ、１×１０４ｃｅｌｌｓ）。上記濃度の菌体液を、それぞれ３μＬスポットした。図９において、Ｖｅｃｔｏｒは、空ベクターを保持している酵母（コントロール）である。ＳｃＳＳＵ１は、上記のＳｃＳＳＵ１を発現させた酵母、ＳｂＳＳＵ１は、ＷＨ３４／７０のＳｂＳＳＵ１を発現させた酵母、ＳｂＳＳＵ１−Ｖ１９Ｍは、ＷＨ３４／７０のＳｂＳＳＵ１−Ｖ１９Ｍ変異体を発現させた酵母である。
ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｖ１９Ｍ変異体を発現させた酵母（ＳｂＳＳＵ１（ＥＯＹ００５）−Ｖ１９Ｍ）では著しく亜硫酸耐性能が低下し、ＳｃＳＳＵ１を発現させた株と同程度であった（図９）。一方のＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｍ２５９Ｌ変異体を発現させた酵母（ＳｂＳＳＵ１（ＥＯＹ００５）−Ｍ２５９Ｌ）及びＳｂＳＳＵ１−Ｌ２５９Ｍ（つまりＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５−Ｌ４２３Ｐ）変異体を発現させた酵母においては、野生型のＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５を発現させた酵母（ＳｂＳＳＵ１（ＥＯＹ００５））に比べ生育阻害が共に見られた（図９）。したがって、酵母の亜硫酸生成量と亜硫酸耐性能の間には相関関係が確認できた。以上の結果から、ＥＯＹ００５株由来のＳｂＳＳＵ１の持つ二つのユニークなアミノ酸は高い亜硫酸生成能及び耐性能に寄与していることが示された。表１に、実施例６で酵母に導入して発現させたＳＳＵ１又はその変異体と、そのアミノ酸配列中の配列番号２に示すアミノ酸配列における１９番目、２５９番目及び４２３番目にそれぞれ相当する位置にあるアミノ酸を示す。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
以上の結果から、ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５においてもＶ１９はＳＳＵ１の高い亜硫酸生成活性及び耐性活性に寄与していることが明らかとなるとともに、ＳｂＳＳＵ１−ＥＯＹ００５に特徴的なＭ２５９残基及びＬ４２３残基についてはＶ１９残基に相加的に亜硫酸生成及び耐性能に寄与するアミノ酸残基であることが示された。従って、これらの知見に基づいて、活性の高いＳＳＵ１タンパク質の単離やタンパク質デザイン、並びに亜硫酸生成能の高い酵母の選抜及びそれを利用した亜硫酸含量の高いビール（エールビール）の醸造が可能となる。
【０１１４】
＜実施例７＞
ＳｃＳＳＵ１におけるＭ１９Ｖ変異導入の効果の確認
ビール発酵過程におけるＳｃＳＳＵ１の１９番目のメチオニン残基をバリン残基に置換（Ｍ１９Ｖ）した効果を確認した。まずＳ２８８Ｃ株のＳｃＳＳＵ１のプロモーターからターミネーターまでを含むゲノミックＤＮＡ断片（約２．３ｋｂ）を下記のプライマーセットと、前述のＭ１９Ｖ変異導入用のプライマーセット（配列番号９及び１０）用いて、Ｖ１９型の変異を持ったＳｃＳＳＵ１（ｇＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖ）を含むゲノミックＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ＹＣｐＧベクターのＮｏｔＩサイトにＧｅｎｅＡｒｔシステム（サーモフィッシャー社）を用いて、製造業者が推奨する方法で組み込んだ。
SSU1-F-790：  CATTAATGCAGGTTGCGGCCGCTAATCTTTTTGGGCTGGTAGG（配列番号６１）
SSU1-R+405：  CGGGCATTTAAATGCGGCCGCGTAATGCTTGGTGTTCGTG（配列番号６２）
変異塩基配列以外に、変異がないことを確認した後、ｇＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖを含むベクターをエール酵母株３（以下、ＥＯＹ００３株という）及びエール酵母株４（以下、ＥＯＹ００４株という）に導入し、これらをＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖに形質転換した。ＥＯＹ００３株及びＥＯＹ００４株はいずれも上面発酵酵母である。
【０１１５】
ＥＯＹ００３株は、ＥＯＹ００２株の保有するＭＥＴ５遺伝子の機能を一般的な相同組換え法により部分的に破壊した株である。ＭＥＴ５遺伝子は、メチオニン合成に関わるタンパク質をコードする（Masselot M and De Robichon-Szulmajster H (1975) Methionine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. I. Genetical analysis of auxotrophic mutants. Mol Gen Genet 139(2):121-32）。ＭＥＴ５にコードされるポリペプチドは亜硫酸をさらに還元する反応を担う酵素の構成因子であるため、その機能抑制によってＥＯＹ００３株はＳＳＵ１タンパク質の基質である細胞内亜硫酸量を高める効果が期待される。
ＥＯＹ００４株は、ＥＯＹ００２株の遺伝的背景を持ちながら、ＳＳＵ１遺伝子発現量を高める転写因子であるＦＺＦ１タンパク質（Avram D, et al. (1999) Fzf1p of Saccharomyces cerevisiae is a positive regulator of SSU1 transcription and its first zinc finger region is required for DNA binding. Yeast 15(6):473-80））の活性が高い変異株である。具体的にはＥＭＳによる突然変異処理により、ＥＯＹ００４株は、野生型のＦＺＦ１遺伝子（配列番号６３）にコードされるＦＺＦ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６４）の１６２番目のＣｙｓ残基がＴｙｒ残基に置換したＣ１６２Ｙ変異を有している。上記のＣ１６２Ｙ変異を有する変異型ＦＺＦ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を配列番号６５に、該変異型ＦＺＦ１タンパク質（ＦＺＦ１−Ｃ１６２Ｙ）のアミノ酸配列を配列番号６６に、それぞれ示す。ＦＺＦ１の活性化変異はこれまでいくつか報告があるが、本変異型（Ｃ１６２Ｙ変異）は新規なものである。
【０１１６】
実際にＥＯＹ００４株及びＦＺＦ１−Ｃ１６２Ｙ変異の遺伝子をＥＯＹ００２株に導入した株では、ＥＯＹ００２株に比べてＳｃＳＳＵ１遺伝子発現が上昇することを確かめるために、下記の配列番号６７〜７０のプライマーセットを用いて、一般的なｑＰＣＲを行った。
scSSU1-F-RT：ACGACGAAGAGCCCCACTAA（配列番号６７）
scSSU1-R-RT：TTCCCAATCCCTTCCAAAGA（配列番号６８）
TDH3-F-RT：CGGTAACATCATCCCATCC（配列番号６９）
TDH3-R-RT：CGGCAGCCTTAACAACCTTC（配列番号７０）
各株のＳｃＳＳＵ１の発現量は、ＴＤＨ３遺伝子発現により標準化した。図１０は、ｑＰＣＲによるＳｃＳＳＵ１遺伝子の発現解析結果を示すグラフである。図１０（ａ）は、ＥＯＹ００２株及びＥＯＹ００４株のＳｃＳＳＵ１遺伝子の発現量を示し、図１０（ｂ）は、ＥＯＹ００２株に空ベクターを導入した株（ｖｅｃ（ＥＯＹ００２））、ＥＯＹ００２株に野生型のＦＺＦ１を導入した株（ＦＺＦ１）及びＥＯＹ００２株に変異型ＦＺＦ１（ＦＺＦ１−Ｃ１６２Ｙ）を導入した株（ＦＺＦ１−Ｃ１６２Ｙ）のＳｃＳＳＵ１遺伝子の発現量を示す。図１０（ａ）及び（ｂ）に示すＳｃＳＳＵ１遺伝子の発現量はいずれも、ＳｃＳＳＵ１遺伝子の発現量をＴＤＨ３遺伝子発現量により標準化し（ＳｃＳＳＵ１遺伝子／ＴＤＨ３遺伝子）、図１０（ａ）のＥＯＹ００２株の該ＳｃＳＳＵ１遺伝子発現量（ＳｃＳＳＵ１遺伝子／ＴＤＨ３遺伝子）を１としたときの相対発現量である。
【０１１７】
ＥＯＹ００２株のＳｃＳＳＵ１発現量を１とした相対発現量は、ＥＯＹ００４株では８．５６、ＦＺＦ１−Ｃ１６２Ｙ変異遺伝子を導入したＥＯＹ００２株（ＦＺＦ１−Ｃ１６２Ｙ）では１８．７であり、ＳｃＳＳＵ１の遺伝子発現量が顕著に上昇していることを確認した（図１０）。したがって、ＥＯＹ００４株は、活性型ＦＺＦ１−Ｃ１６２Ｙ変異により、ＳｃＳＳＵ１の発現量が高まることでＳｃＳＳＵ１を介した亜硫酸生成能が高まると期待される。
【０１１８】
下記の麦汁を用いてビール発酵試験を行った。
＜麦汁＞
麦汁エキス濃度  １３％
麦汁ＦＡＮ（遊離アミノ態窒素）濃度  ３０ｍｇ／１００ｍＬ
＜発酵試験＞
麦汁容量  ２Ｌ
麦汁溶存酸素濃度  １０ｐｐｍ
発酵温度  １９℃
酵母投入量  １×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
６日間発酵させ、発酵終了後の発酵液（ビール）の麦汁エキス、亜硫酸濃度を測定した。亜硫酸濃度測定はランキン法（ａｅｒａｔｉｏｎ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ法）により行った（酒類総合研究所標準分析法、「９−１６  亜硫酸」）。なお測定した亜硫酸濃度は、総亜硫酸（遊離型及び結合型の亜硫酸の合計値）の濃度であり、ＳＯ２量に換算した値で示した。麦汁エキス濃度は、ＤＭＡ４５００Ｍ（振動式密度・比重・濃度計、アントンパール社）により測定した。
【０１１９】
結果を表２に示す。エキス（％）は、麦汁エキス濃度（％）である。ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖ非導入株の２種の酵母株（ＥＯＹ００３株及びＥＯＹ００４株）を用いて得られたビールでは、共にＳＯ２は０．１６ｐｐｍ以下であったが、ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖを導入したＥＯＹ００３株（ＥＯＹ００３＋ｇＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖ）を用いて得られたビールでは、ＳＯ２は２．７ｐｐｍ以上であった。また、ＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖを導入したＥＯＹ００４株（ＥＯＹ００４＋ｇＳｃＳＳＵ１−Ｍ１９Ｖ）では、５．５ｐｐｍ以上のＳＯ２産生が確認された。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
以上の結果より、麦汁を使った実際のビール発酵試験においても、異なる２種のエール酵母においてＳｃＳＳＵ１へのＭ１９Ｖ変異導入による亜硫酸生成上昇が確認された。
ＥＯＹ００３株とＥＯＹ００４株はＳＳＵ１の発現量と基質量を高めるための遺伝的背景を持つものだが、このように異なる変異型においても同様の効果が得られることから、ＳＳＵ１を介して亜硫酸産生が向上したといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明によれば、ビール等の酒類中の亜硫酸含量を増加させることができ、香味安定性に優れ、より品質保持期間が長いビール等の酒類を製造することが可能となる。本発明は、飲食品分野等で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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