(57)【要約】【課題】イオン流入が抑制された脂質二分子膜基板を提供する。【解決手段】脂質二分子膜基板は、孔部が設けられた基板を備え、前記孔部の開口が脂質二分子膜で被覆された脂質二分子膜基板であって、前記脂質二分子膜により被覆されていない前記脂質二分子膜基板の最表面がタンパク質で被覆されている。【選択図】図１
2019037213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
孔部が設けられた基板を備え、前記孔部の開口が脂質二分子膜で被覆された脂質二分子膜基板であって、
前記脂質二分子膜により被覆されていない前記脂質二分子膜基板の最表面がタンパク質で被覆されている脂質二分子膜基板。
【請求項２】
更に、前記孔部の前記開口の幅を狭める方向に延びるように形成されたオーバーハング部を有する薄膜層を前記基板の表面上に備える請求項１に記載の脂質二分子膜基板。
【請求項３】
前記脂質二分子膜で被覆された前記孔部が前記基板に複数設けられている請求項１又は２に記載の脂質二分子膜基板。
【請求項４】
更に、前記孔部の底部に電極を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の脂質二分子膜基板。
【請求項５】
前記電極が銀及び塩化銀からなる電極（銀−塩化銀電極）である請求項４に記載の脂質二分子膜基板。
【請求項６】
前記タンパク質がウシ血清アルブミンである請求項１〜５のいずれか一項に記載の脂質二分子膜基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質二分子膜基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノテクノロジーによる微細加工技術と、ＤＮＡやタンパク質等の生体分子を扱うバイオテクノロジーとを融合させた、いわゆるナノバイオテクノロジーの動きが急速に展開しつつある。ナノバイオテクノロジーは、基礎研究分野だけではなく、医療、創薬等、様々な方面への応用が期待されている。分子生物学的な基礎研究の潮流としては、ポストゲノムの流れから、細胞膜中に存在する膜タンパク質の構造を制御し、その機能を活用及び解明する試みがなされている。
【０００３】
膜タンパク質は、生命維持に必要な物質の輸送やシグナル伝達を担っており、様々な病気の発生や薬剤応答及び免疫反応等の生理的機能に大きく関連した生体分子である。現在では市販医薬品の約６０％以上が膜タンパク質をターゲットとしていることが知られている。しかしながら、膜タンパク質は多種多様であり、しかもＤＮＡと比べ取り扱いが難しいため、機能解析には膨大な時間と費用がかかるという問題がある。そのため、膜タンパク質を半導体基板上にアレイ化した超小型のバイオチップが実現できれば、多くの膜タンパク質の機能を同時かつ高速に解析することが可能となるため、新薬開発に要する時間の短縮や費用の低減など多くの効果が期待される。
【０００４】
膜タンパク質を基板上で解析する方法としては、細胞そのものを基板上に配列し、パッチクランプ法により機能計測する方法が挙げられる。しかしながら、通常、細胞膜上には目的とする膜タンパク質以外の膜タンパク質も複数存在しており、ある薬剤で刺激しても得られた応答が目的の膜タンパク質によるものなのかが不明瞭であるという問題があった。そのため、精製した膜タンパク質を用いたインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）測定系の必要性が高まってきている。
【０００５】
インビトロ系で代表的な膜タンパク質配置方法として、脂質分子をｎ−デカン等の有機溶媒に溶解し、水溶液中で脂質溶液を基板上に設けられた小孔に塗りつけることにより形成した黒膜に膜タンパク質を融合させる方法（例えば、非特許文献１参照）が挙げられる。この方法では、形成された黒膜中の残留有機溶媒や不均一性が、膜タンパク質の生理活性に影響を与える可能性が指摘されている。また黒膜の安定性も低く、通常、寿命は数時間程度である。
【０００６】
これらの問題を改善するために、本発明者らは、まず、人工的に設けられた孔部と、前記孔部の開口の幅を狭める方向に延びるように形成されたオーバーハング部を有する薄膜層とを備える基板を作製した。次いで、前記孔部の前記開口に巨大脂質膜ベシクルを展開させることにより、膜タンパク質を含む人工脂質二分子膜を再構成した基板を提案した（例えば、非特許文献２参照）。このように作製した脂質二分子膜基板は、巨大脂質膜ベシクルを用いているために有機溶剤を含まず、脂質二分子膜の寿命も上記の黒膜と較べ格段に長い（数日程度）。また、再構成した膜タンパク質が活性を持つことも光学的手法（蛍光観察）によって確認されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「最新パッチクランプ実験技術法」岡田泰伸 編、158-159頁 (2001年，吉岡書店）
【非特許文献２】Sumitomo K et al., “Ca2+ ion transport through channels formed by α-hemolysin analyzed using a microwell array on a Si substrate.”, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 31, p445-450, 2012.
【非特許文献３】Johnson SJ et al., “Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons.”, Biophysical Journal, Vol. 59, p289-294, 1991.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献２に記載のとおり、膜タンパク質を含む人工脂質二分子膜を再構成した基板を用いて、光学的手法により計測することで膜タンパク質の機能を解析することに成功した。しかしながら、膜タンパク質が存在しない状態でも外部から孔部へのイオン流入を示唆する結果が観測された。基板と脂質二分子膜との間には厚さ１〜２ｎｍ程度の薄い水層が存在することが知られており（例えば、非特許文献３参照）、この水層を介したイオン拡散がイオン流入の原因であると考えられている。比較的短時間の光学的測定ではこのイオン流入はそれほど問題とはならなかった。しかしながら、分子レベルでのチャネル信号を計測する電気生理計測では、バックグラウンドノイズレベル（数ｐＡ）の微小電流を計測する必要があるため、このイオン流入は解決しなければならない問題であった。
【０００９】
上記事情に鑑み、本発明は、イオン流入が抑制された脂質二分子膜基板を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る脂質二分子膜基板は、孔部が設けられた基板を備え、前記孔部の開口が脂質二分子膜で被覆された脂質二分子膜基板であって、前記脂質二分子膜により被覆されていない前記脂質二分子膜基板の最表面がタンパク質で被覆されている。
【００１１】
上記第１態様に係る脂質二分子膜基板は、更に、前記孔部の前記開口の幅を狭める方向に延びるように形成されたオーバーハング部を有する薄膜層を前記基板の表面上に備えてもよい。
上記第１態様に係る脂質二分子膜基板において、前記脂質二分子膜で被覆された前記孔部が前記基板に複数設けられていてもよい。
上記第１態様に係る脂質二分子膜基板は、更に、前記孔部の底部に電極を有してもよい。
前記電極が銀及び塩化銀からなる電極（銀−塩化銀電極）であってもよい。
前記タンパク質がウシ血清アルブミンであってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
上記態様によれば、イオン流入が抑制された脂質二分子膜基板を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本実施形態における脂質二分子膜基板の一例を示した概念図である。
【図２】本実施形態における脂質二分子膜基板の一例を示した概念図である。
【図３】本実施形態における脂質二分子膜基板の一例を示した概念図である。
【図４】本実施形態における脂質二分子膜基板の一例を示した概念図である。
【図５】実施例１におけるカルセインを封入した脂質二分子膜基板の蛍光像である。
【図６】実施例１におけるＢＳＡによるブロッキングを施した荷電状態（青色光励起（Ｂ励起）及び緑色光励起（Ｇ励起））の脂質二分子膜基板の蛍光像である。（ａ）はアニオン性脂質膜を用いた脂質二分子膜基板であり、（ｂ）は中性脂質二分子膜を用いた脂質二分子膜基板であり、（ｃ）はカチオン性脂質二分子膜を用いた脂質二分子膜基板である。
【図７】試験例１における脂質二分子膜基板の経時変化を観察した蛍光像である。上段はＢＳＡによるブロッキングを施した脂質二分子膜基板（実施例１の中性脂質膜を用いた脂質二分子膜基板）、下段はＢＳＡによるブロッキングを施していない脂質二分子膜基板（比較例１）の蛍光像である。
【図８】試験例１における実施例１及び比較例１の中性脂質膜を用いた脂質二分子膜基板の蛍光強度の経時変化をプロットしたグラフである。
【図９】脂質二分子膜で覆われた孔部からのイオン流入について、推測し得るメカニズムを説明した模式図である。
【図１０】実施例２における脂質二分子膜基板の経時変化を観察した蛍光像である。
【図１１】実施例２における脂質二分子膜基板の蛍光強度の経時変化をプロットしたグラフである。
【図１２】実施例３における脂質二分子膜基板の作製途中（孔部２０の開口２１を脂質二分子膜３０で覆う前の段階）の断面の模式図である。
【図１３】実施例４における脂質二分子膜基板の作製途中（孔部２０の開口２１を脂質二分子膜３０で覆う前の段階）の断面の模式図である。
【図１４】実施例４における脂質二分子膜基板の作製途中（孔部２０の開口２１を脂質二分子膜３０で覆う前の段階）の孔部内部の電子顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の一実施形態を、図面を参照しながら説明する。
【００１５】
≪脂質二分子膜基板≫
本発明の一実施形態に係る脂質二分子膜基板は、孔部が設けられた基板を備え、前記孔部の開口が脂質二分子膜で被覆されている。また、本実施形態の脂質二分子膜基板において、脂質二分子膜により被覆されていない脂質二分子膜基板の最表面がタンパク質で被覆されている。
【００１６】
膜タンパク質のチャネル電流はバックグラウンドノイズと同等レベルであるため、従来の技術では、得られた応答がチャネル電流であるのかイオン流入によるものであるのか判別が困難であった。
一方、本実施形態の脂質二分子膜基板は、イオン流入が抑制されている。そのため、本実施形態の脂質二分子膜基板を用いることで、分子レベルでの膜タンパク質の機能計測が可能となる。さらに、本実施形態の脂質二分子膜基板において、孔部を複数設けてアレイ化することで、創薬分野でのハイスループットスクリーニングへの応用等が期待される。
【００１７】
＜第１実施形態＞
図１は、本実施形態における脂質二分子膜基板の一例を示した概念図である。本実施形態における脂質二分子膜基板は、光学的手法（蛍光測定）を利用した膜タンパク質の機能の測定に好適な脂質二分子膜基板としての態様である（以下、「脂質二分子膜基板１」と称する場合がある）。
【００１８】
脂質二分子膜基板１は、図１に示すように、基板１０に孔部２０が形成されている。また、孔部２０の開口２１が脂質二分子膜３０で被覆されている。一方、脂質二分子膜３０により被覆されていない脂質二分子膜基板１の最表面はタンパク質１５で被覆されている。脂質二分子膜基板１において、脂質二分子膜３０で被覆された孔部２０が基板１４に、１つ設けられていてもよく、２つ以上複数設けられていてもよい。脂質二分子膜３０で被覆された孔部２０が基板１４に複数設けられている場合、同じ又は異なる種類の複数の膜タンパク質の機能を同時に計測することができる。
【００１９】
脂質二分子膜による孔部２０の被覆効率を上げるために、脂質二分子膜基板１は、孔部２０の開口部（開口）２１の幅を狭める方向に延びるように形成されたオーバーハング部（ひさし部）１１ａを有する薄膜層１１を備えることが好ましい。
また、孔部２０内部には、蛍光物質２２が配置されている。
以下、各構成について詳述する。
【００２０】
○基板
基板１０の材質は、蛍光顕微鏡による孔部２０の蛍光観察を妨げない材質であればよい。基板１０の材質として、例えば、シリコン酸化物、シリコン窒化物、石英、マイカ、ガラス等を挙げることができる。
【００２１】
（孔部）
基板１０は、孔部２０を有している。孔部２０の数は特に限定されず、例えば１〜１００００個であることが好ましい。孔部２０の形状は、底面を有する凹状の孔である。
【００２２】
孔部２０の開口部２１（開口２１）の形状は、脂質二分子膜を安定に形成する観点から、円形状又は四角形状であることが好ましい。さらに、円形状の開口部２１の直径又は四角形状の開口部２１の一辺は、１００ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。１００ｎｍ以上である場合、膜タンパク質のサイズが１０〜２０ｎｍ程度であるため、膜タンパク質を配置することができる。１０μｍである場合、巨大脂質膜ベシクルにより孔部を覆うことができる。
【００２３】
また、孔部２０の深さは、脂質二分子膜３０が孔部２０の底面に接触しない深さがあればよく、開口部２１の大きさに応じて適宜設計すればよい。
【００２４】
基板１０への孔部２０の形成方法は、例えば、フォトリソグラフィ法、電子ビームリソグラフィ法、ドライエッチング法等の微細加工技術を適用することができる。
【００２５】
○薄膜層
基板１０の表面には、薄膜層１１が設けられている。脂質二分子膜による孔部２０の被覆効率を上げるために、脂質二分子膜基板１における薄膜層１１は、オーバーハング部（ひさし部）１１ａを有することが好ましい。オーバーハング部１１ａは、基板１０の天面を延長するように、孔部２０の開口部２１の幅を狭める方向に延びるように形成されている。オーバーハング部１１ａでは、脂質二分子膜３０と孔部２０の内側壁との引力が弱くなることに加え、側壁に沿って脂質二分子膜３０が落ち込む時に働く脂質の屈曲応力を大きくできる。そのため、脂質二分子膜３０が孔部２０内に落ち込むことなく安定に支持させることができる。
【００２６】
薄膜層１１の材質は、脂質二分子膜３０が付着すれば、基板１０の材質と同じでも、違う材質でも構わない。オーバーハング部１１ａの作製過程において、選択的エッチング法を適用できることから、異なる材質を用いることが好ましい。薄膜層１１の厚さは、５０ｎｍ〜５００ｎｍであることが好ましい。
【００２７】
○脂質二分子膜
本明細書において、「脂質二分子膜」とは、片方の末端に親水性の官能基を有し、もう片方の末端に疎水性の脂肪酸を有する脂質分子が、親水性の官能基を外側に、疎水性の脂肪酸を内側にして並び、二重層構造を形成した膜を意味する。また、「巨大脂質膜ベクシル」とは、上記脂肪二分子膜が水溶液中で小胞（ベクシル）化し、その平均粒径がμｍオーダー以上のものを意味する。
【００２８】
脂質二分子膜３０の脂質分子の種類としては、例えば１，２−ジオレイルー３−トリメチルアンモニウムプロパン、１、２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンなどのカチオン性脂質分子；ジフィタニルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）等のリン脂質、スフィンゴ脂質等の中性又はアニオン性脂質分子を挙げることができる。これら脂質分子は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を用いてもよい。また、これらの脂質で構成された脂質膜にコレステロールやエルゴステロール等のステロール類を混合してもよい。
中でも、脂質二分子膜３０の脂質分子の種類としては、脂質二分子膜上への後述するタンパク質の吸着を抑制できることから、電荷を持たない中性脂質分子であることが好ましく、ジフィタニルホスファチジルコリンであることがより好ましい。
【００２９】
脂質二分子膜３０の形成方法としては、例えば、その直径が１０μｍ以上の巨大脂質ベシクルを、基板上で展開することにより脂質二分子膜３０を得る方法が挙げられる。この形成方法を採用した場合、基板１０に複数の孔部２０を設けた場合に、それら複数の孔部２０を、一度に、また安定に脂質二分子膜３０で覆うことが可能となる。
【００３０】
巨大脂質膜ベシクルを作製する代表的な手法としては、静置水和法（参考文献１：Akashi K, et al., “Preparation of Giant Liposomes in Physiological Conditions and Their Characterization under an Optical Microscope.”, Biophysical Journal., Vol. 71, p3242-3250, 1996.）や電界形成法（参考文献２： Dimitrov DS et al., “Lipid swelling and liposome formation mediated by electric fields.”, Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Vol. 19, p323-336, 1988.）等が挙げられる。
【００３１】
ベシクルの作製手法は特に限定されないが、巨大ベシクルが作製しやすく、また反応時間や反応プロセスの簡易性から、電界形成法を採用することが好ましい。
電界形成法は、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）等の電極上に、脂質分子を薄膜化した後、交流電場をかけて水溶液中に巨大脂質膜ベシクルを形成する手法である。サイズのそろったベシクルを得るためには、ＩＴＯ基板上に厚さ数十ｎｍ〜数μｍの均一な脂質分子の薄膜を形成することが好ましく、また、交流電場は数百ｍＶ〜２Ｖ程度の印加条件が好ましい。交流電場が上記下限値以上であることで、ベシクルの収量がより高くできる。一方、交流電場が上記上限値以下であることで、ベシクルの構造破壊や水の電気分解が生じることをより防ぐことができる。
【００３２】
（膜タンパク質）
なお、図２に示すように、脂質二分子膜３０は、膜タンパク質３１を備えていてもよい。図２に示した本実施形態の脂質二分子膜基板において、例えば、蛍光強度の変化を、蛍光顕微鏡で観察することにより、膜タンパク質３１の機能測定を行うことができる。膜タンパク質３１を脂質二分子膜３０へ配置する方法は、ベシクルフュージョン法等の公知の方法を適用できる。
【００３３】
○タンパク質
タンパク質１５の種類としては、例えば、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）、カゼイン、グロブリン等を挙げられる。また、カゼインを含有するスキムミルクやグロブリンを含有する血清等を用いてもよい。タンパク質膜の均一性や価格の安価さから、タンパク質１５の種類としては、ＢＳＡであることが好ましい。
【００３４】
ＢＳＡ等の上記タンパク質は、通常、タンパク質等の非特異吸着を抑制するために用いられる。一方、本実施形態の脂質二分子膜基板では、後述の実施例に示すとおり、上記タンパク質からなる層が、イオン拡散のブロック層としての役割を果たしていると考えられる。すなわち、外液部からのイオン流入のインターフェイスとなっている脂質二分子膜の外周部をＢＳＡ等の上記タンパク質によってブロックすることで、イオン流入を抑制することができる。
【００３５】
脂質二分子膜３０で被覆されていない脂質二分子膜基板の最表面をタンパク質１５でブロッキングする方法としては、例えば、タンパク質水溶液中に脂質二分子膜３０による被覆後の脂質二分子膜基板を浸漬する方法（以下、「浸漬法」と称する場合がある）、タンパク質水溶液を脂質二分子膜３０による被覆後の脂質二分子膜基板に塗布する方法（以下、「塗布法」と称する場合がある）等が挙げられる。中でも、脂質二分子膜３０で被覆されていない脂質二分子膜基板の最表面をタンパク質１５により均一に被覆することができることから、タンパク質１５でブロッキングする方法としては、浸漬法であることが好ましい。
【００３６】
浸漬法である場合、過剰な吸着を防ぐために、タンパク質水溶液の濃度は０．０１質量％以上０．１重量％以下とすることが好ましい。また、タンパク質の変性を防ぐためにｐＨは７付近に調製することが好ましい。また、均一なタンパク質膜形成の観点から、浸漬時間は１０〜６０分とすることが望ましい。
【００３７】
○蛍光物質（蛍光分子）
また、孔部２０内部には、孔部内のイオン濃度変化計測のために、蛍光物質２２が配置されていてもよい。
「蛍光物質」としては、例えば、カルシウムイオンと結合することで蛍光特性が変化する蛍光プローブ、ｐＨ依存的に蛍光強度が変化する蛍光プローブ、塩素イオン濃度に比例して蛍光強度が変化する蛍光プローブ等が挙げられる。
蛍光物質として具体的には、例えば、１−［６−Ａｍｉｎｏ−２−（５−ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｏｘａｚｏｌｙｌ）−５−ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｙｌｏｘｙ］−２−（２−ａｍｉｎｏ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｅｔｈａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ｐｅｎｔａｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ（試薬名：Ｆｌｕｏ２）、１−［２−Ａｍｉｎｏ−５−（２，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−６−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−９−ｘａｎｔｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙ］−２−（２−ａｍｉｎｏ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｅｔｈａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（試薬名：Ｆｌｕｏ３）、１−［２−Ａｍｉｎｏ―５−（２，７−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−６−ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ−３−ｏｘｏ−９−ｘａｎｔｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙ］−２−（２−ａｍｉｎｏ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｅｔｈａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ｔｅｔｒａ（ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ｅｓｔｅｒ（試薬名：Ｆｌｕｏ４−ＡＭ）、２’，７’−Ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−４  ｏｒ  ５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（試薬名：ＢＣＥＣＦ）、Ｎ−Ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−６−ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（試薬名：ＭＱＡＥ）等が挙げられる。
【００３８】
＜第２実施形態＞
本発明の一実施形態に係る脂質二分子膜基板は、更に、孔部の底部に電極を有する。
【００３９】
本実施形態の脂質二分子膜基板によれば、電気生理的に膜タンパク質の機能測定を行うことができる。
【００４０】
図３は、本実施形態における脂質二分子膜基板の一例を示した概念図である。本実施形態の脂質二分子膜基板２は、孔部２０の内部に電極４０を有する点が、第一実施形態と相違する。第一実施形態と同一態様の部分については、同一符号を付して説明を省略し、第一実施形態と相違する点について、以下に説明する。
【００４１】
○電極
本実施形態の脂質二分子膜基板２は、孔部２０の内部に電極４０が埋め込まれている。
電極４０の材質としては、例えば、銀、塩化銀、銀表面を塩化銀で加工したもの（銀−塩化銀）、金、白金等が挙げられる。中でも、銀−塩化銀であることが好ましい。
また、電極の材質が金である場合、電解質溶液中で金表面に形成される電気二重層がしばしば微小な膜タンパク質のチャネル電流計測の妨げになる場合がある。よって、電極４０は銀−塩化銀等からなる不分極電極であることが好ましい。なお、電極４０は、後述の実施例（図１３参照）に示すように、金等からなる電極４０の上に、銀−塩化銀等からなる不分極電極６０が積層された構造であってもよい。
【００４２】
膜タンパク質の機能測定に際しては、孔部２０の外部２３に対向電極４１を配置すればよい。電極４０及び対向電極４１は、パッチクランプ測定装置等の電気生理計測システムに接続することができる。
【００４３】
また、本実施形態の脂質二分子膜基板２は、上述の第一実施形態と同様に、脂質二分子膜で被覆されていない脂質二分子膜基板の最表面がタンパク質１５で被覆されている。
【００４４】
なお、図４に示すように、上述の第一実施形態と同様に、脂質二分子膜３０は、膜タンパク質３１を備えていてもよい。図４に示した本実施形態の脂質二分子膜基板において、例えば、膜タンパク質３１を透過したイオン電流をパッチクランプ測定装置で計測することにより、膜タンパク質の機能測定を行うことができる。
【００４５】
本実施形態の脂質二分子膜基板２は、孔部２０の内部に蛍光物質２２を備えないことが好ましい。
【００４６】
以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
［実施例１］脂質二分子膜基板の作製
図１に示す構成を有する脂質二分子膜基板を作製した。
【００４９】
１．基板の作製
まず、基板本体１０には、シリコン基板を用いた。基板本体１０の上面に、１２０ｎｍの厚さのシリコン酸化膜層による薄膜層１１を、熱酸化法により形成した。さらに、フォトリソグラフィ法及びドライエッチング法を用いて、円形状の開口（直径２μｍ又は４μｍ）を持つ孔部２０を形成した。深さは、１μｍとした。さらに、水酸化カリウム溶液（１０重量％）を用いて、シリコン酸化膜層からなる薄膜層１１の下の基板本体１０を、選択的にエッチングすることにより、孔部２０の開口２１の四隅にオーバーハング部１１ａを形成した。
【００５０】
２．脂質二分子膜（巨大脂質膜ベシクル）の作製
脂質二分子膜３０はｐＨ７付近で荷電状態の異なる３種類の脂質二分子膜を以下のようにして形成した。
【００５１】
（１）脂質含有溶液の調製
中性脂質二分子膜として、ジフィタニルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）（８０モル％）とコレステロール（２０モル％）との混合クロロホルム溶液（濃度２．５ｍＭ）を調製した。カチオン性脂質二分子膜として、ＤＰｈＰＣ（７０モル％）と１、２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＥＤＯＰＣ）（１０モル％）とコレステロール（２０モル％）との混合クロロホルム溶液（濃度２．５ｍＭ）を調製した。アニオン性脂質二分子膜として、ＤＰｈＰＣ（７０モル％）とジオレイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）（１０モル％）とコレステロール（２０モル％）との混合クロロホルム溶液（濃度２．５ｍＭ）を調製した。この際、蛍光観察のために、ローダミン又はニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）付きの脂質を０．５モル％添加した。
【００５２】
（２）脂質二分子膜の作製
次いで、ＩＴＯ基板（ＳｉＯ２上に膜厚１００ｎｍのＩＴＯが薄膜化された基板、サイズ４０×４０ｍｍ、５０〜１００Ω／ｃｍ）上に、（１）で調製した各クロロホルム溶液２００μＬを均一に塗布した。この基板を、室温で２時間、減圧乾燥して、クロロホルム溶媒を完全に除去することで、均一なリン脂質薄膜をＩＴＯ基板上に形成した。その上に、窓部を有するシリコーンゴム（外寸３０×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコーンゴムを２０×２０ｍｍのサイズでくり貫いた窓部を有する）を密着して配置し、窓部に２００ｍＭのスクロース水溶液５００μＬを滴下した。さらに、その上部にＩＴＯ基板を気泡が入らないように配置し、シリコーンゴム窓部にある溶液をＩＴＯ基板で挟み込んだ。次いで、ＩＴＯ基板にクリップ電極を接合し、５０℃の恒温槽中で、交流電場（正弦波、１Ｖ、１０Ｈｚ）を２時間印加することで、電界形成法により脂質二分子膜（巨大脂質膜ベシクル）のスクロース分散液を回収した。
【００５３】
３．脂質二分子膜基板の作製
次いで、「１．」で作製した孔部２０を有する基板本体１０の上に、蛍光分子２２としてｆｌｕｏ−４を含む溶液（２００ｍＭグルコース、２０μＭ ｆｌｕｏ−４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ 塩化カリウムの混合溶液）１００μＬを滴下した。ｆｌｕｏ−４はカルシウムイオン指示薬であり、カルシウムイオンの存在可で緑色の蛍光を発する化合物である。さらに、「２．」の（２）で作製した巨大脂質膜ベシクルのスクロース分散液２μＬを基板上に滴下し、５分間静置することで巨大脂質膜ベシクルを基板上に展開し、脂質二分子膜３０で被覆された脂質二分子膜基板を得た。さらに、孔部２０の外部溶液２３を、２００ｍＭグルコース溶液に置換することで、外部溶液２３から蛍光分子２２を除去した。
【００５４】
孔部２０の内部に蛍光分子２２が安定に閉じ込められたことを示すために、ｆｌｕｏ−４の代わりにカルセインを封入した際の蛍光像を図５に示す。脂質二分子膜３０に覆われている孔部２０ａからは、明るい緑色蛍光が観察された。これにより、蛍光分子２２が孔部２０ａの内部に安定に閉じ込められていることが確かめられた。一方、脂質二分子膜３０に覆われていない孔部２０ｂからは、蛍光分子が流失し、蛍光は観察されなかった。
【００５５】
４．ウシ血清アルブミンによるブロッキング
次いで、脂質二分子膜で被覆されていない脂質二分子膜基板の最表面に、以下に示す方法を用いて、タンパク質１５としてウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）を被覆させた。
【００５６】
（１）ＢＳＡ溶液の調製
０．１重量％のＢＳＡ、２００ｍＭのグルコース、及び、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）となるようにＢＳＡ溶液を調製した。
【００５７】
（２）脂質二分子膜基板のＢＳＡ溶液への浸漬
次いで、（１）で調製したＢＳＡ溶液に脂質二分子膜基板を１時間浸漬した、浸漬後、２００ｍＭグルコース溶液で１０回洗浄し、ＢＳＡによるブロッキングを施した脂質二分子膜基板を得た。ブロッキング後の荷電状態の異なる３種類の脂質二分子膜基板の蛍光像を図６に示す。なお、蛍光観察のために脂質二分子膜中には０．５モル％のＮＢＤで蛍光ラベルした脂質を含有させ、ＢＳＡ中には１モル％のローダミンで蛍光ラベルしたＢＳＡが含有させた。また、図６において、（ａ）はアニオン性脂質膜を用いた脂質二分子膜基板であり、（ｂ）は中性脂質二分子膜を用いた脂質二分子膜基板であり、（ｃ）はカチオン性脂質二分子膜を用いた脂質二分子膜基板である。
【００５８】
図６から、青色光励起（Ｂ励起）の場合は、脂質二分子膜由来の緑色蛍光が観察された。緑色光励起（Ｇ励起）の場合は、いずれの基板においても、脂質二分子膜で被覆されていない脂質二分子膜基板の最表面にウシ血清アルブミン由来の赤色蛍光が観察された。さらに、アニオン性脂質二分子膜及びカチオン性脂質二分子膜を用いた脂質二分子膜基板では、脂質二分子膜上にも赤色蛍光が観察された。これは、アニオン性脂質二分子膜及びカチオン性脂質二分子膜では、脂質二分子膜上にもＢＳＡ分子が吸着しているためであると考えられる。
【００５９】
この結果から、脂質二分子膜基板で用いる脂質二分子膜としては、電荷を持たない中性脂質膜が特に好適であることが明らかとなった。
【００６０】
［比較例１］
実施例１の「４．」のＢＳＡによるブロッキングを行わない以外は、実施例１の「１．」〜「３．」と同様の方法を用いて、中性脂質膜を用いた脂質二分子膜基板を作製した。
【００６１】
［試験例１］イオン流入の計測
実施例１及び比較例１の脂質二分子膜基板について、外部２３に塩化カルシウム水溶液を加え、蛍光顕微鏡を用いて、孔部内部の蛍光強度の経時変化を計測した。結果を図７に示す。ここでは、典型的な観測結果として、塩化カルシウム水溶液を加えた直後（ｔ＝０）、１０分後、２０分後及び３０分後の蛍光像を示す。なお、図７上段はＢＳＡコーティングをした脂質二分子膜基板（実施例１の中性脂質膜を用いた脂質二分子膜基板）、図７下段はＢＳＡコーティングをしていない脂質二分子膜基板（比較例１）の結果を示している。いずれの画像においても、円形状の脂質二分子膜３０と、脂質二分子膜で覆われた孔部２０ａと、脂質二分子膜で覆われていない孔部２０ｂと、から構成されている。
【００６２】
塩化カルシウム水溶液を加えた直後（ｔ＝０）は、いずれの脂質二分子膜基板でもほとんど蛍光強度の変化は見られなかった。比較例１のＢＳＡによるブロッキングを施していない脂質二分子膜基板では、１０分程度でカルシウムイオンの流入を示すｆｌｕｏ−４の蛍光が脂質二分子膜で覆われた孔部２０ａから観測された。一方、ＢＳＡによるブロッキングを施した脂質二分子膜基板では、３０分以上経過しても大きな蛍光強度の変化は観測されなかった。
【００６３】
実施例１及び比較例１の脂質二分子膜基板の蛍光強度の経時変化をプロットしたグラフを図８に示す。
図８から、実施例１のＢＳＡによるブロッキングを施した脂質二分子膜基板では、比較例１のＢＳＡによるブロッキングを施していない脂質二分子膜基板と比較して、イオン流入がごくわずかであることが確かめられた。
【００６４】
図９は、脂質二分子膜で覆われた孔部からのイオン流入について、推測し得るメカニズムを説明した模式図である。従来から、脂質二分子膜と基板表面との間に厚さ１〜２ｎｍの薄い水層が存在することが知られている。この水層を通してカルシウムイオンが拡散し、イオン流入が起こると考えられる。ＢＳＡは、通常、タンパク質等の非特異吸着を抑制するために用いられるが、本実施形態の脂質二分子膜基板では、イオン拡散のブロック層としての役割を果たしていると考えられる。すなわち、脂質二分子膜の外周部は、外液部からのイオン流入のインターフェイスとなっており、この脂質二分子膜の外周部をＢＳＡによってブロックすることで、イオン流入が抑制されたものと推察された。
【００６５】
［実施例２］膜タンパク質含有脂質二分子膜基板の作製
図２に示す構成を有する脂質二分子膜基板を作製した。
【００６６】
１．基板の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、基板を作製した。
【００６７】
２．脂質二分子膜（巨大脂質膜ベシクル）の作製
次いで、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、中性脂質膜を用いた脂質二分子膜（巨大脂質膜ベシクル）のスクロース分散液を作製した。
【００６８】
３．脂質二分子膜基板の作製
次いで、実施例１の「３．」と同様の方法を用いて、脂質二分子膜基板を作製した。
【００６９】
４．ＢＳＡによるブロッキング
次いで、実施例１の「４．」と同様の方法を用いて、ＢＳＡによるブロッキングを施した脂質二分子膜基板を得た。
【００７０】
５．膜タンパク質の埋め込み
次いで、モデルチャネルタンパク質としてα−ヘモリシンを、脂質二分子膜基板の脂質二分子膜に導入した。α−ヘモリシン分子は脂質二分子膜中において７量化し、膜貫通孔を形成することが知られている。そのため、蛍光顕微鏡観察下で、まず、外部２３に塩化カルシウム水溶液を添加し、その２０分後に終濃度が２ｎＭとなるようにα−ヘモリシン溶液を脂質二分子膜基板の外液部に添加し、膜貫通孔形成させた。脂質二分子膜基板の経時変化を図１０に示す。
【００７１】
図１０から、２０分経過しても孔部内部２０ａからイオン流入を示す蛍光は観察されず、脂質二分子膜基板においてイオン流入がないことが確認された。２０分後にα−ヘモリシンを添加したところ、約５０分後に孔部内部２０ａからカルシウムイオンの流入を示す緑色蛍光が観察された。これは、α−ヘモリシンにより形成された膜貫通孔を通してカルシウムイオンが孔部内部２０ａに流入したことを示唆している。
【００７２】
脂質二分子膜基板の蛍光強度の経時変化をプロットしたグラフを図１１に示す。
図１１から、約２５００秒で蛍光強度の急激な増加が見られた。これは、α−ヘモリシンによるカルシウムイオン輸送によるものと考えられる。
これらの結果から、本実施形態の脂質二分子膜基板を用いることにより、膜タンパク質の機能計測が可能となることが確かめられた。
【００７３】
［実施例３］電気生理測定用の脂質二分子膜基板の作製
図３に示す構成を有する脂質二分子膜基板を作製した。
図１２は、脂質二分子膜基板の作製途中（孔部２０の開口２１を脂質二分子膜３０で覆う前の段階）の断面の模式図である。図１２を参照して、電気生理測定用の脂質二分子膜基板の作製方法を説明する。
【００７４】
１．基板の作製
絶縁層１３（厚さ１２０ｎｍの熱酸化膜を使用した。）で被覆されたＳｉウエハを基板１４として用いた。このＳｉウエハ１４上に、金６０ｎｍを堆積してフォトリソグラフィ法によりパターニングすることにより、厚さ約６０ｎｍの電極層４０（電極４０）を形成した。この電極層４０は、十分に大きなパッド部（３００μｍ四方）に接続され、通常のワイヤボンディングによりパッチクランプ計測器等の電気生理測定装置へ接続することが可能である。
さらに、電極層４０の上に、絶縁層１２としてシリコン窒化膜をプラズマＣＶＤ法により１μｍ堆積した。さらに、絶縁層１２の上に、オーバーハング形状層である薄膜層１１としてシリコン酸化膜を、スパッタ法を用いて、２００ｎｍ堆積した。
このように形成した基板１０に、レジスト膜５０を用いてフォトリソグラフィ法とドライエッチング法とにより孔部２０及び開口２１を形成した。この孔部形成のエッチングは、電極層４０に届くまで行った。
【００７５】
このドライエッチングの過程で、シリコン酸化膜からなるオーバーハング形状層である薄膜層１１とシリコン窒化膜からなる絶縁層１２との間の選択性を利用することで、図１２に示すようなオーバーハング部１１ａを形成した。孔部２０及び開口２１を形成後に、レジスト膜５０を洗浄及び除去することで、電極４０を孔部２０の底部に備えた基板（作製途中の脂質二分子膜基板３）を得た。
【００７６】
２．脂質二分子膜（巨大脂質膜ベシクル）の作製
次いで、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、中性脂質膜を用いた脂質二分子膜（巨大脂質膜ベシクル）のスクロース分散液を作製した。
【００７７】
３．脂質二分子膜基板の作製
次いで、実施例１の「３．」と同様の方法を用いて、脂質二分子膜基板を作製した。
【００７８】
４．ＢＳＡによるブロッキング
次いで、実施例１の「４．」と同様の方法を用いて、ＢＳＡによるブロッキングを施した脂質二分子膜基板を得た。
【００７９】
５．膜タンパク質の埋め込み
さらに、膜タンパク質を導入することで、図４に示す構成を有する脂質二分子膜基板を作製した。具体的には、脂質二分子膜３０において開口部２１を覆う部分に、膜タンパク質３１をベシクルフュージョン法により再構成した。これにより、電極４０と対向電極４１との間に電圧を印加した場合に、その間に流れる電流を計測することで、膜タンパク質を介したイオン電流を検出することができる。
【００８０】
［実施例４］電極上に不分極電極層を備える脂質二分子膜基板の作製
図１３は、脂質二分子膜基板の作製途中（孔部２０の開口２１を脂質二分子膜３０で覆う前の段階）の断面の模式図である。図１３を参照して、電極上に不分極電極層を備える電気生理測定用の脂質二分子膜基板の作製方法を説明する。
【００８１】
１．基板の作製
電極４０を孔部２０の底部に備えた基板を得るまでは、実施例３の「１．」と同様の方法を用いて、基板を作製した。なお、不分極電極部６０として、銀−塩化銀電極を採用した。まず、銀メッキ液（プレシャスファブ  Ａｇ４７１０、田中貴金属社製）２００μＬを孔部上に滴下した。次いで、メッキ液中にマニュアルプローバに接続した銀線を入れ、電極部４０もマニュアルプローバに接続した。次いで、銀線と電極４０との間に定電流（０．１〜０．５ｎＡ）を１分間通電することにより、電極部４０の表面を銀メッキした。その後、塩素系漂白液に２分間浸漬させることにより、銀表面を塩素化し、銀−塩化銀電極を備える基板（作製途中の脂質二分子膜基板４）を得た。図１４に孔部内部の電子顕微鏡像を示す。
【００８２】
図１４から、孔部底部に、銀−塩化銀電極部が形成されていることが確かめられた。また、銀−塩化銀表面が凹凸を有し、表面積が増大しているため、電気生理計測をする上でより好ましい形状になっていることがわかった。
【００８３】
２．脂質二分子膜（巨大脂質膜ベシクル）の作製
次いで、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、中性脂質膜を用いた脂質二分子膜（巨大脂質膜ベシクル）のスクロース分散液を作製した。
【００８４】
３．脂質二分子膜基板の作製
次いで、実施例１の「３．」と同様の方法を用いて、脂質二分子膜基板を作製した。
【００８５】
４．ＢＳＡによるブロッキング
次いで、実施例１の「４．」と同様の方法を用いて、ＢＳＡによるブロッキングを施した脂質二分子膜基板を得た。
【００８６】
５．膜タンパク質の埋め込み
さらに、膜タンパク質を導入することで、膜タンパク質を有する脂質二分子膜基板を作製した。具体的には、脂質二分子膜において開口を覆う部分に、膜タンパク質をベシクルフュージョン法により再構成した。これにより、電極と対向電極との間に電圧を印加した場合に、その間に流れる電流を計測することで、膜タンパク質を介したイオン電流を検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本実施形態の脂質二分子膜基板は、イオン流入が抑制されている。そのため、本実施形態の脂質二分子膜基板を用いることで、分子レベルでの膜タンパク質の機能計測が可能となる。
【符号の説明】
【００８８】
１  脂質二分子膜基板１
２  脂質二分子膜基板２
３  作製途中の脂質二分子膜基板３
４  作製途中の脂質二分子膜基板４
１０  基板本体（基板）
１１  薄膜層（シリコン酸化膜層、オーバーハング形状形成層）
１１ａ  オーバーハング部
１２  絶縁層
１３  絶縁層
１４  シリコンウエハ（基板）
１５  タンパク質
２０  孔部
２０ａ  脂質二分子膜で覆われた孔部
２０ｂ  脂質二分子膜で覆われていない孔部
２１  開口部（開口）
２２  蛍光物質（蛍光分子）
２３  孔部の外液部
３０  脂質二分子膜
３１  膜タンパク質
４０  電極（電極層）
４１  対向電極
５０  レジスト膜
６０  不分極電極
【図１】
2019037213.tif 000003
【図２】
2019037213.tif 000004
【図３】
2019037213.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019037213.tif 000010
【図９】
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【図１０】
2019037213.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
2019037213.tif 000014
【図１３】
2019037213.tif 000015
【図１４】
2019037213.tif 000016