(57)【要約】      （修正有）【課題】匂い物質または香り、特にインドールおよびスカトール悪臭に対する哺乳動物の嗅覚受容体の特異的ファミリーを特定するための新規の方法、並びにその活性を調節する化合物（遮断、増強、遮蔽または模倣する化合物）の発見に用いることができるアッセイにおける前記方法の使用を提供する。【解決手段】マウスのオーファン嗅覚受容体を、標的化合物に応答する嗅神経細胞から特定する。得られた受容体およびそのヒトのカウンターパートを、アッセイにおいて試験化合物に対してスクリーニングし、それによってそれらを匂い物質または香りの受容体、特に悪臭受容体と特定することができ、次いで、例えばヒトにおける悪臭の知覚を阻害するモジュレーターを発見することができる。【選択図】図１
2019004883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
匂いおよび／または香り化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下：
ａ）非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること；
ｂ）前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の悪臭受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること；
ｃ）前記嗅覚受容体と悪臭化合物とを接触させること；
ｄ）匂い物質により誘発される神経細胞活性の変化を測定すること；
ｅ）悪臭化合物によって活性化された１種以上の嗅神経細胞を単離すること；
ｆ）前記単離された嗅覚受容体のｍＲＮＡを増幅すること；
ｇ）次世代シーケンシングにより前記ｍＲＮＡの全トランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること；および
ｈ）前記トランスクリプトームの配列を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、さらに、請求項１において特定された悪臭嗅覚受容体と極めて密接に関連するヒト受容体を特定することを含む、前記方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、さらに、細胞株を改変することにより、請求項１において特定された少なくとも１種の悪臭嗅覚受容体を発現させることを含む、前記方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、さらに、細胞株を改変することにより、請求項２において特定された少なくとも１種のヒト受容体を発現させることを含む、前記方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、さらに、前記悪臭嗅覚受容体と試験化合物とを接触させることにより、該試験化合物が該悪臭嗅覚受容体に結合するかどうかを決定することを含む、前記方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、さらに、前記ヒト受容体と試験化合物とを接触させることにより、該試験化合物が該受容体に結合するかどうかを決定することを含む、前記方法。
【請求項７】
以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、単離された核酸。
【請求項８】
以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有する、単離された核酸。
【請求項９】
以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、単離された核酸。
【請求項１０】
以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する、単離された核酸。
【請求項１１】
以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、単離された核酸。
【請求項１２】
以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する、単離された核酸。
【請求項１３】
以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、単離された核酸。
【請求項１４】
以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、単離された核酸。
【請求項１５】
以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５，配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有する、単離された核酸。
【請求項１６】
以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列を有する、単離された核酸。
【請求項１７】
請求項７から１６までのいずれか１項に記載の単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。
【請求項１８】
請求項７から１６までのいずれか１項に記載の単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。
【請求項１９】
請求項７から１６までのいずれか１項に記載の単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。
【請求項２０】
請求項７から１６までのいずれか１項に記載の単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。
【請求項２１】
請求項７から１６までのいずれか１項に記載の単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。
【請求項２２】
請求項７から１６までのいずれか１項に記載の単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。
【請求項２３】
請求項７から１６までのいずれか１項に記載の単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。
【請求項２４】
請求項７から１６までのいずれか１項に記載の単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。
【請求項２５】
請求項７から１６までのいずれか１項に記載の単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも９８％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。
【請求項２６】
請求項７から１６までのいずれか１項に記載の単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列。
【請求項２７】
単離されたポリペプチドであって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
単離されたポリペプチドであって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
単離されたポリペプチドであって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
単離されたポリペプチドであって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
単離されたポリペプチドであって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
単離されたポリペプチドであって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
単離されたポリペプチドであって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項３５】
単離されたポリペプチドであって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項３６】
以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片。
【請求項３７】
以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片。
【請求項３８】
請求項２７から３７までのいずれか１項に記載のポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞。
【請求項３９】
請求項３８に記載の細胞であって、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、アフリカツメガエル卵母細胞、ＣＯＳ、酵母、細菌および嗅プラコード由来細胞からなる群から選択される、前記細胞。
【請求項４０】
インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される匂い物質または香り受容体からなる群から選択される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および／または増強する化合物を特定するための方法であって、以下：
ａ）前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること、ここで、前記受容体は請求項２７から３７までのいずれか１項に記載のポリペプチドであるものとする；
ｂ）前記化合物が前記受容体の活性を遮断、阻害、調節または増強する程度を測定すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術分野は、匂い物質および香り受容体、並びに匂い物質および／または香り化合物の特定に用いることができる、より具体的にはインドールまたはスカトールなどの悪臭化合物のインヒビターまたは抑制体の特定に用いることができるアッセイに関する。
【０００２】
背景技術
嗅覚は、ヒトの感覚系のうち、最も複雑でかつ十分な解明が進んでいないものの１つである。嗅覚受容体（ＯＲ）の活性化から知覚にかけては、なおもさらなる研究を要する多くのステップが存在する。個々の匂い物質および混合物に対するＯＲコードがどのようにして知覚に変換されるかが解明されれば、この知見を様々な分野において顕著な利点をもたらすべく利用することができる。こうした分野には、匂いのモジュレーター、例えば不快な匂いの知覚を遮断する悪臭中和剤、非生分解性または毒性化合物に代わる新たなフレーバーおよびフレグランス成分、並びに匂いの増強剤が含まれ、これらによって、天然源由来の供給源化合物に対する我々の依存性が制限されると考えられる。「嗅覚コード」の組み合わせの典型は、全ての単一のＯＲは複数の匂い物質によって活性化されることができ、かつ逆にほとんどの匂い物質は複数のＯＲを活性化しうるという所見に集約される。マウスゲノム中には、約１，２００種の異なるＯＲが存在する。一方で、ヒトは約４００種のＯＲを有する。どちらの場合にも、ＯＲレパートリーは世界中の何千もの匂い物質によって活性化され、そしてこの組み合わせの複雑さによって、我々が知覚しうる嗅覚が広がる。しかし、２０１０年現在で従来の脱オーファン化法を用いて特定されているのは、わずか８２種のマウスＯＲ（約７７％）および１７種のヒトＯＲ（約４４％）に対する匂い物質またはリガンドのみである。さらに、主にインビトロで特定されたヒトＯＲとの生理的関連性に関して試験が行われたリガンドは、ほとんどない。
【０００３】
文献には様々なＯＲの脱オーファン化法が記載されている［例えばTouhara 2007 Deorphanizing vertebrate olfactory receptors: Recent advances in odorant-response assays Neurochem Int 51, 132-139 and Saito et al (2009) Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal 2, ra9 and Peterlin et al. (2014), The State of the Art of Odorant Receptor Deorphanization: a Report from the Orphanage, J Gen Physiol; 143(5): 527-42］。これらの方法の多くは、ＯＲがハイスループットスクリーニングに適した非嗅細胞で発現される細胞ベースのアッセイに専ら依拠している。しかし、ＯＲは多くの場合、そのような異種細胞の小胞体内に保持されている。従って、細胞表面へのトラフィックなしでは、ＯＲは匂い物質と相互作用することができない。［Min et al. (2004) Endoplasmic reticulum degradation impedes olfactory G-protein coupled receptor functional expression. BMC Cell Biol 5, 34］。従って、数百ないし数千の様々な細胞株において各細胞株が匂い物質活性を評価できる特有のＯＲタンパク質を有する体系的なアプローチは、匂い物質とＯＲとの間の組み合わせの相互作用の包括的解読に適したアプローチではない。何故ならば、受容体の多くまたはほとんどはこのような細胞株において正常に機能しないためである。従って、生体内に存在するＯＲの全レパートリーの中から、１種以上の匂い物質によって特異的に活性化または阻害される比較的小さなＯＲのサブセットを迅速かつ確実に特定することができる新規の方法が求められている。さらに、嗅神経細胞自体からのＯＲの特定を含む方法であって、その際、ＯＲが完全に機能的であるものと推定され、従って非嗅細胞におけるＯＲアッセイの周知の困難が回避される前記方法も求められている。
【０００４】
悪臭化合物、例えばインドール、スカトール（３−メチルインドール）およびｐ−クレゾールは、例えばトイレや糞便を含む他の「バスルーム」の源から生じる不快な匂いを発生させる。従って、例えばヒトの匂い化合物を遮蔽または低減させる悪臭中和剤が望ましい。匂い物質受容体、より詳細には悪臭受容体を特定することが必要である。インドールまたはスカトールに結合する受容体は特定されつつあり、かつこうした受容体に結合する化合物が発見されつつあり、かつ悪臭の潜在的モジュレーターとして報告されつつある。しかし哺乳動物中には極めて多くのＯＲが存在しているため、悪臭、特にインドールまたはスカトールに結合する受容体の完全なレパートリーの迅速な特定が継続的に望まれている。さらに、こうした受容体に結合する新規の有効な化合物を特定するための新たな悪臭受容体に依拠したアッセイが望まれている。
【０００５】
概要
本明細書においては、匂い物質および／または香り化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下：
ａ）非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること；
ｂ）前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の匂い物質または香り受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること；
ｃ）前記嗅覚受容体と匂い物質または香り化合物とを順次接触させること；
ｄ）匂い物質または香りにより誘発された神経細胞活性の変化を測定すること；
ｅ）匂い物質または香り化合物によって活性化された１種以上の嗅神経細胞を単離すること；
ｆ）前記単離された嗅覚受容体のｍＲＮＡを増幅すること；
ｇ）次世代シーケンシングにより前記ｍＲＮＡのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること；および
ｈ）前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、匂い物質受容体および香り受容体からなる群から選択される嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
【０００６】
さらに本明細書においては、悪臭化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下：
ａ）非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること；
ｂ）前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の悪臭受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること；
ｃ）前記嗅覚受容体と悪臭化合物とを順次接触させること；
ｄ）匂い物質により誘発される神経細胞活性の変化を測定すること；
ｅ）悪臭化合物によって活性化された１種以上の嗅神経細胞を単離すること；
ｆ）前記単離された嗅覚受容体のｍＲＮＡを増幅すること；
ｇ）次世代シーケンシングにより前記ｍＲＮＡのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること；および
ｈ）前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
【０００７】
さらに本明細書においては、以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、単離された核酸配列が提供される。
【０００８】
さらに本明細書においては、上記の通りの単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列が提供される。
【０００９】
さらに本明細書においては、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドが提供される。
【００１０】
さらに、上記ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞が提供される。
【００１１】
さらに、インドールおよび／またはスカトール匂い物質受容体に結合する化合物を特定するためのアッセイが提供される。特に本明細書においては、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および／または増強する化合物を特定するための方法であって、以下：
ａ）前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること；
ｂ）前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること；
を含み、ここで、前記受容体は上記のポリペプチドであるものとする前記方法が提供される。
【００１２】
一実施形態においては、前記化合物の活性は、インドールおよび／またはスカトールへのその結合の比較により決定される。他の実施形態においては、前記受容体と化合物とは、スカトールおよび／またはインドールの存在下に、スカトールおよび／またはインドールを伴う前記受容体への前記化合物の結合を許容する条件下に、接触される。
【００１３】
本明細書において提供されるさらなる一実施形態においては、結合活性の測定に機能アッセイが用いられる場合には、本明細書において提供される受容体のシグナル伝達活性を測定するステップは、セカンドメッセンジャーのレベルの変化の検出を含むことができる。他の実施形態においては、シグナル伝達活性の測定が提供され、その際、前記シグナル伝達活性を測定するステップは、グアニンヌクレオチド結合／カップリングまたは交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、プロテインキナーゼＡ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウムフラックス、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性の測定、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイまたはレポーター遺伝子発現を含む。本明細書において提供される特定の一実施形態においては、シグナル伝達活性の測定は、蛍光または発光アッセイの使用を含む。蛍光および発光アッセイは、Ｃａ２＋感受性フルオロフォア、例えば００ｆｌｕ０３Ｆｌｕ０４  １５またはＦｕｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓｐｒｏｂｅｓ）；Ｃａ３キットファミリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）およびイクオリンの使用を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、悪臭受容体の脱オーファン化プロセスの概略図を示す。
【図２】図２は、インドールおよびスカトールの双方（各５０μΜ）によって特異的に活性化された６つの独立した嗅神経細胞についてのＣａ2+イメージングトレースを示す。
【図３】図３は、本明細書において概説した手順を用いて特定された悪臭受容体遺伝子を示す。
【図４】図４Ａは、本明細書に概説した手順を用いて特定されたＯｌｆｒ７４０に属するヒトおよび付加的なマウスの悪臭受容体を示し、図４Ｂは、本明細書に概説した手順を用いて特定されたＯｌｆｒ６６５ファミリーに属するヒトおよび付加的なマウスの悪臭受容体を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｅは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるマウスＯＲ  Ｏｌｆｒ７４３、Ｏｌｆｒ７４６およびＯｌｆｒ７４０のインドールおよびスカトール活性を示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒトＯＲ５２Ｎ２、ＯＲ１１Ｇ２のインドールおよびスカトール活性を示し、図６Ｄ〜図６Ｊは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒトＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ４Ｃ１５、ＯＲ８Ｓ１、ＯＲ１１Ｈ６およびＯＲ１１Ｈ４並びにマウスＯｌｆｒ６６５およびＯｌｆｒ７４０のインドールおよびスカトール活性を示す。
【図７】図７は、試験化合物の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるインドール受容体Ｏｌｆｒ７４３活性の阻害を示す。
【００１５】
詳細な説明
本明細書における説明および添付の特許請求の範囲では、別段の記載がない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。同様に、「含む」および「包含する」は互換的であり、かつ限定を意図するものではない。さらに、様々な実施形態の説明において「含む」という用語が用いられる場合、幾つかの特定の事例において、実施形態を「主に〜からなる」または「からなる」という用語を用いても説明することができることは、当業者の当然とするところであるものと理解されたい。
【００１６】
定義
以下の用語は、別段の記載がない限り、それらに与えられた意味を有する。
【００１７】
「ＯＲ」とは、嗅細胞において発現されるＧタンパク質共役受容体のファミリーの１つ以上のメンバーを指す。嗅覚受容体細胞は、形態に基づいて、または嗅細胞において特異的に発現されるタンパク質の発現によっても特定されることができる。ＯＲファミリーメンバーは、嗅覚伝達のための受容体として作用する能力を有しうる。
【００１８】
「インドール」および／または「スカトールＯＲ」とは、嗅細胞中で発現されるＧタンパク質共役受容体のファミリーのメンバーを指し、その受容体は、ＧＰＣＲに結合しかつ／またはＧＰＣＲを活性化させるリガンドを特定するための結合または活性アッセイにおいて、インドールおよび／またはスカトールと結合しかつ／またはインドールおよび／またはスカトールにより活性化される。このようなアッセイについて、以下に記載する。本明細書におけるインドールおよび／またはスカトール受容体には、インドールおよび／またはスカトールに応答または結合する、断片、合成のおよび自然に存在する変異体、並びにキメラが含まれる。
【００１９】
「ＯＲ」核酸は、「Ｇタンパク質共役受容体活性」を有する７つの膜貫通領域を有するＧＰＣＲのファミリーをコードし、例えば、それらは細胞外刺激に応答してＧタンパク質に結合し、かつセカンドメッセンジャー、例えばＩＰ３、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰおよびＣａ2+の産生を、酵素、例えばホスホリパーゼＣおよびアデニル酸シクラーゼの刺激を介して促進することができる。
【００２０】
「ＯＲ」ポリペプチドは、約１ｋｂの長さの単一エクソンによりコードされる７つの膜貫通ドメインを有するＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属し、かつ特徴的な嗅覚受容体特異的なアミノ酸モチーフを示すと考えられる。これら７つのドメインは「膜貫通」または「ＴＭ」ドメインＴＭ  Ｉ〜ＴＭ  ＶＩＩと称され、これらは３つの「細胞内ループ」または「ＩＣ」ドメインＩＣ  Ｉ〜ＩＣ  ＩＩＩ、および３つの「細胞外ループ」または「ＥＣ」ドメインＥＣ  Ｉ〜ＥＣ  ＩＩＩにより連結される。前記モチーフは、これらに限定されるものではないが、ＴＭ  ＩＩＩおよびＩＣ  ＩＩに重なるＭＡＹＤＲＹＶＡＩＣモチーフ、ＩＣ  ＩＩＩおよびＴＭ  ＶＩに重なるＦＳＴＣＳＳＨモチーフ、ＴＭ  ＶＩＩにおけるＰＭＬＮＰＦＩＹモチーフ、並びにＥＣ  ＩＩにおける３つの保存されたＣ残基、およびＴＭ  Ｉにおける高度に保存されたＧＮ残基の存在と定義される。((Zhang and Firestein (2002), The Olfactory Receptor Gene Superfamily of the Mouse. Nature Neuroscience: 5(2):124-33; Malnic et al., The Human Olfactory Receptor Gene Family: PNAS: 101(8):2584-9))。
【００２１】
「Ｎ末端ドメイン」領域は、Ｎ末端で始まり、かつ最初の膜貫通領域の始点に近い領域まで延びる。７つの「膜貫通領域」を含む「膜貫通ドメイン」とは、原形質膜内に存在するＯＲポリペプチドのドメインを指し、これには対応する細胞質（細胞内）および細胞外ループも含まれうる。７つの膜貫通領域並びに細胞外および細胞質ループは、Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982)またはStryerにおいて記載されているような標準的な方法を用いて特定することができる。膜貫通ドメインの一般的な二次および三次構造、特に嗅覚受容体のようなＧタンパク質共役受容体の７つの膜貫通ドメインは、当技術分野で知られている。従って、一次構造配列は、以下に詳細に説明するように、既知の膜貫通ドメイン配列に基づいて設計または予測されることができる。これらの膜貫通ドメインは、可溶性相および固相の双方でインビトロでのリガンド結合アッセイに有用である。
【００２２】
ＯＲファミリーメンバーにより媒介される嗅覚伝達を調節する化合物を試験するためのアッセイの文脈における「機能アッセイ」という用語には、間接的または直接的に受容体の影響下にある任意のパラメーター、例えば機能的、物理的および化学的作用の決定が含まれる。これには、リガンド結合、イオンフラックス、膜電位、電流、転写、Ｇタンパク質結合、ＧＰＣＲリン酸化または脱リン酸化、シグナル伝達受容体−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度（例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ  ＩＰ３または細胞内Ｃａ2+）のインビトロ、インビボおよびエキソビボでの変化が含まれ、さらに、他の生理学的作用、例えば神経伝達物質またはホルモン放出の増加または減少も含まれる。本明細書には、間接的または直接的にＯＲファミリーメンバーの影響下にあるパラメーター、例えば機能的、物理的および化学的作用を増加または減少させる化合物についての機能アッセイが含まれる。このような機能アッセイまたは作用は、当業者に知られている任意の手段によって測定されることができ、例えば分光学的特性（例えば蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的特性（例えば形状）、クロマトグラフ特性または溶解特性の変化、パッチクランプ、電位感受性色素、全細胞電流、放射性同位体流出、誘導マーカー、卵母細胞ＯＲ遺伝子発現；組織培養細胞ＯＲ発現；ＯＲ遺伝子の転写活性化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化；イオンフラックスアッセイ；細胞内セカンドメッセンジャー、例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰおよびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の変化；細胞内カルシウムレベルの変化；神経伝達物質放出などによって測定されることができる。
【００２３】
ＯＲ遺伝子またはタンパク質の「インヒビター」、「アクチベーター」、「抑制体」および「モジュレーター」は互換的に用いられ、嗅覚形質導入についてのエキソビボ、インビトロおよびインビボアッセイを用いて特定される阻害、活性化または調節分子を指し、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニストおよびそれらのホモログおよび模倣物を指す。インヒビターとは、例えば、結合することによって刺激を部分的または完全に遮断し、活性化を減少、妨害、遅延させ、嗅覚伝達を不活化、脱感作または下方調節する化合物であり、例えばアンタゴニストである。アクチベーターとは、例えば、結合することによって活性化を刺激、増大、開放、活性化、促進、増強させ、嗅覚伝達を感作または上方調節する化合物であり、例えばアゴニストである。モジュレーターには、例えば受容体と以下のものとの相互作用を変更する化合物が含まれる：アクチベーターまたはインヒビターに結合する細胞外タンパク質（例えば、匂い物質結合タンパク質、エブネリン（ｅｂｎｅｒｉｎ）、および疎水性キャリアファミリーの他のメンバー）；Ｇタンパク質；キナーゼ（例えば、受容体の不活性化および脱感作に関与するロドプシンキナーゼおよびβアドレナリン受容体キナーゼのホモログ）；およびアレスチン（これもまた、受容体を不活性化および脱感作する）。モジュレーターには、ＯＲファミリーメンバーの遺伝的に改変されたバージョン、例えば活性が改変されたバージョン、並びに天然由来および合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低化学分子などが含まれうる。インヒビターおよびアクチベーターについてのそのようなアッセイには、例えば、細胞または細胞膜におけるＯＲファミリーメンバーの発現、フレーバーまたはフレグランス分子、例えば甘味物質または悪臭の存在または不在下での推定モジュレーター化合物の適用、および次いで上記のような嗅覚伝達に対する機能作用の決定が含まれる。潜在的なアクチベーター、インヒビターまたはモジュレーターを用いて処理されたＯＲファミリーメンバーを含むサンプルまたはアッセイを、このインヒビター、アクチベーターまたはモジュレーターを含まない対照サンプルと比較することによって、調節の程度が調べられる。（モジュレーターで処理されない）対照サンプルは、１００％の相対的ＯＲ活性値に設定される。対照に対するＯＲ活性値が約８０％、場合により５０％、または２５〜０％である場合には、ＯＲの阻害が達成される。対照に対するＯＲ活性値が１１０％、場合により１５０％、場合により２００〜５００％、または１０００％〜３０００％超である場合には、ＯＲの活性化が達成される。
【００２４】
本明細書において用いられる場合に、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、本発明の化合物が通常その自然状態で結合している他の非類似化合物を含まない状態を指す。従って、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」対象物は、所与のサンプルを少なくとも０．５質量％、１質量％、５質量％、１０質量％または２０質量％、最も好ましくは少なくとも５０質量％または７５質量％含む。好ましい一実施形態においては、これらの用語は、所与のサンプルを少なくとも９５質量％含む本発明の化合物を指す。本明細書で使用される場合に、「精製された」「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、１種の核酸または１種のタンパク質、複数の核酸または複数のタンパク質に関する場合には、哺乳動物、特にヒトの体内で自然に生じるものとは異なる精製または濃縮の状態をも指す。（１）他の随伴される構造体または化合物からの精製、または（２）哺乳動物、特にヒトの体内では通常では随伴されることのない構造体または化合物の随伴を含む、哺乳動物、特にヒトの体内で自然に生じるものよりも高い精製または濃縮のいかなる程度も、「単離された」の意味に含まれる。本明細書に記載の１種の核酸若しくは１種のタンパク質または複数の核酸若しくは複数のタンパク質の群は、当業者に知られている様々な方法およびプロセスにより、単離されてもよいし、通常は自然にはこれらに随伴することのない構造体または化合物を伴っていてもよい。
【００２５】
本明細書で使用される場合に、「単離された」という用語は、核酸またはポリペプチドに関する場合には、哺乳動物、特にヒトの体内で自然に生じるものとは異なる精製または濃縮の状態を指す。（１）他の自然に生じる随伴構造体または化合物からの精製、または（２）体内では通常では随伴されることのない構造体または化合物の随伴を含む、体内で自然に生じるものよりも高い精製または濃縮のいかなる程度も、本明細書で使用される場合の「単離された」の意味に含まれる。本明細書に記載の複数の核酸または複数のタンパク質は、当業者に知られている様々な方法およびプロセスにより、単離されてもよいし、通常は自然にはこれらに随伴することのない構造体または化合物を伴っていてもよい。
【００２６】
本明細書において使用される場合に、「増幅する」および「増幅」という用語は、以下に詳細に説明するように、自然に発現された核酸の組換えの発生または検出に適した任意の増幅方法の使用を指す。例えば本発明は、本発明の自然に発現された（例えばゲノムまたはｍＲＮＡ）または組換えの（例えばｃＤＮＡ）核酸をインビボまたはインビトロで（例えばポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲにより）増幅するための方法および試薬（例えば特異的な縮重オリゴヌクレオチドプライマー対）を提供する。
【００２７】
「７回膜貫通型受容体」という用語は、原形質膜を７回貫通する７つのドメインを有する膜貫通型タンパク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する（従って、これら７つのドメインは「膜貫通」または「ＴＭ」ドメインＴＭ  Ｉ〜ＴＭ  ＶＩＩと称される）。嗅覚および特定の味覚受容体のファミリーのそれぞれが、このスーパーファミリーに属する。以下でさらに詳細に説明するように、７回膜貫通型受容体ポリペプチドは、類似しかつ特徴的な一次、二次および三次構造を有する。
【００２８】
「核酸」または「核酸配列」という用語は、１本鎖または２本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを指す。この用語には、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸、すなわちオリゴヌクレオチドが含まれる。またこの用語には、合成骨格を有する核酸様構造体も含まれる。別段の記載がない限り、個々の核酸配列には、その保存的に改変された改変体（例えば縮重コドン置換体）および相補配列、ならびに明示された配列が暗に含まれる。具体的には、縮重コドン置換体は、例えば１つ以上の選択されたコドンの第３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列の生成により達成されることができる。
【００２９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書においては互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「異種」という用語は、核酸の部分に関して使用される場合には、当該核酸が、自然において互いに同一の関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は典型的には組換えにより生成され、新たな機能的核酸を生成するために配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有し、例えばある供給源からのプロモーターおよび他の供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質とは、当該タンパク質が自然において互いに同一の関係では見出されない２つ以上の配列を含むこと（例えば、融合タンパク質またはキメラ）を示す。
【００３０】
本明細書で使用される場合に、「組換え」とは、合成されたかまたはさもなくばインビトロで操作されたポリヌクレオチド（例えば「組換えポリヌクレオチド」）、細胞または他の生物学的系における遺伝子産物の産生に組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を指す。
【００３１】
「組換え手段」には、本発明のトランスロケーションドメインおよび本発明のプライマーを用いて増幅された核酸配列を含む融合タンパク質を発現させる、例えば誘導的または構成的に発現させるための発現カセットまたはベクターへの、異なる供給源からの様々なコード領域またはドメインまたはプロモーター配列を有する核酸のライゲーションも含まれる。
【００３２】
「発現ベクター」という用語は、本発明の核酸配列を、インビトロまたはインビボで、原核生物、酵母、真菌、プラン、昆虫または哺乳動物の細胞を含む任意の細胞において構成的または誘導的に発現させる目的での任意の組換え発現系を指す。この用語には、線状または環状の発現系が含まれる。この用語には、エピソームのままであるかまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれた発現系が含まれる。この発現系は自己複製能力を有することも有しないこともでき、すなわち、細胞内で一過性の発現を駆動することができる。この用語には、組換え核酸の転写に必要な最低限の要素のみを含む組換え発現「カセットが含まれる。
【００３３】
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、かつ発現ベクターの複製または発現をサポートする細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌、または真核細胞、例えば酵母、昆虫、両生類または哺乳動物の細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３など、例えば培養細胞、外植片および生体内細胞であることができる。
【００３４】
一実施形態においては、本明細書において、以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３，配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１および配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する単離された核酸配列が提供される。
【００３５】
一実施形態においては、本明細書において、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２および配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、上記の単離された核酸配列が提供される。
【００３６】
さらなる一実施形態においては、本明細書において、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２および配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードする、単離された核酸配列が提供される。
【００３７】
さらなる一実施形態においては、本明細書において、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２および配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片が提供される。
【００３８】
さらなる一実施形態においては、本明細書において、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片が提供される。
【００３９】
本発明の目的のために、本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片は、断片になっている受容体のシグナル伝達活性を示すことができるポリペプチドの断片である。このような断片は、断片となっている受容体のシグナル伝達活性の６０％、７０％、８０％、９０％または実質的に全てを示すことができる。
【００４０】
この方法によって、当業者は、そのヒトの遺伝子のカウンターパートがヒトにおいて特定の匂い特性をコードするものと考えられる嗅覚受容体（ＯＲ）の比較的小さなサブセットを、齧歯類のゲノム中に存在する約１，２００種のＯＲの全集団の中から迅速に特定することが可能となる。図１は、この方法の概略図である。無傷マウスの嗅上皮（ＯＥ）組織を、機械的および酵素処理により単一細胞に解離する。生じる個々の嗅神経細胞（ＯＳＮ）をガラスカバースリップ上に播種し、かつカルシウム指示色素（例えばＦｕｒａ−２）を負荷することにより細胞活性を検出する。このカバースリップを、次いで灌流チャンバー中に配置し、かつ生理食塩水に浸漬する。悪臭試験匂い物質を生理食塩水中で希釈し、かつ細胞に灌流する。その後、ＯＳＮ活性を、Ｆｕｒａ−２蛍光の変化および蛍光顕微鏡による細胞内カルシウムフラックスの変化のモニタリングにより検出する。重要なことには、いくつかの例では、可能性のある約１，２００のＯＲ遺伝子のうち１つまたは２つのみが、所与のＯＳＮにおいて発現される。このことは、所与のＯＳＮの活性が、細胞表面上で発現された単一種類のＯＲタンパク質によってのみ駆動されることを意味する。細かく制御された匂い物質注入システムと可動ステージとを備えた半自動化カルシウムイメージングシステムでは、単一の実験で約２，５００のＯＳＮのモニタリングが可能である。マウスには約１，２００種のＯＲ遺伝子があるが、このスループットは全てのＯＲレパートリーの代表的なサンプリングを保証する。１種以上の試験匂い物質に応答する１種以上のＯＳＮをガラスマイクロピペットを用いて収集し、かつその後のＲＮＡの抽出、増幅およびＯＳＮのトランスクリプトームの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために、マイクロチューブへと移す。文献には、非常に少量（＜１００の細胞）の出発材料からのＮＧＳベースのトランスクリプトームシーケンシングが報告されている。しかし本出願人の知る限り、これは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、特に嗅覚受容体の脱オーファン化という特定の目的ではまだ適用されていない。所望であれば、本明細書に記載の方法を用いて、複数のＯＳＮを同一のマイクロチューブ内にプールすることができる。その後、生配列リードをリファレンスゲノムにマッピングし、適切なアライメントおよびアノテーションのために視覚的に検査し、かつ例えばゲノムの反復配列に基づく偽陽性マッピングについて解析する。その結果、マウスのＯＳＮのスクリーニングに使用したのと同一の１種以上の悪臭試験匂い物質により活性化されると考えられる候補マウスＯＲのリストが得られる。その後、この候補マウスＯＲタンパク質配列を用いて公共マウスゲノムデータベースを検索し（例えばＢＬＡＳＴＰ）、それにより候補マウスＯＲ配列の完全なリストを取得する。これらの候補は、もともとインドールおよび／またはスカトールによって活性化された神経細胞から特定されたＮＧＳ由来のＯＲ配列に対する配列相同性によって関連している（すなわちパラロガスである）。その後、これらのマウスパラログ（ＮＧＳおよびＢＬＡＳＴＰ由来）の完全なリストを用いて公共ヒトゲノムデータベースを検索することによって、このマウスＯＲ配列に関連する（すなわちオーソロガスな）候補ヒトＯＲ配列のリストを取得する。その結果、試験匂い物質によって活性化されると考えられる候補のマウスおよびヒトのＯＲの完全なリストが得られる。得られた候補ＯＲ遺伝子の活性を確認するために、これらの遺伝子のｃＤＮＡを利用可能な発現ベクターにクローニングし、かつハイスループットスクリーニングに適した培養細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ）へトランスフェクトすることができる。その後、それぞれ組換えにより発現された候補ＯＲ  ｃＤＮＡを含む得られた細胞株を、カルシウムイメージングにおいて使用される試験匂い物質および他の構造的または官能的に関連する匂い物質を用いた細胞ベースの活性アッセイにおいてスクリーニングすることができる。
【００４１】
特定の一実施形態においては、例えばAraneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756の記載に従って、非ヒト哺乳動物（例えばマウス）からのネイティブ嗅神経細胞を含む嗅上皮を単離し、かつ単一細胞に解離する。特定の一実施形態においては、各神経細胞は１度に１種または２種の受容体を発現する。一実施形態においては、嗅神経細胞の生成に使用される嗅覚組織は、受容体および関連する配列に関する公的に利用可能なデータを有する非ヒト哺乳動物に由来する。これには、マウス、ラットおよびハムスターの組織が含まれる。解離プロトコルは、記録可能な神経細胞の生存率が確実に高くなるように最適化されるべきである。特定の一実施形態においては、最低で約１，５００の異なる感覚神経細胞を記録する。
【００４２】
さらなる実施形態においては、指示体を、蛍光カルシウム指示色素、カルシウム指示タンパク質、蛍光ｃＡＭＰ指示薬、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）媒介性レポータータンパク質、生化学的ｃＡＭＰ  ＨＴＲＦアッセイ、β−アレスチンアッセイ、または電気生理学的記録から選択する。特に、嗅神経細胞の膜上で発現される嗅覚受容体の活性のモニタリングに使用可能なカルシウム指示色素を選択する（例えばＦｕｒａ−２  ＡＭ）。
【００４３】
特定の一実施形態においては、化合物を順次スクリーニングし、かつカルシウム色素蛍光の匂い物質依存性変化を、蛍光顕微鏡または蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて測定する。
【００４４】
例えば、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極またはＦＡＣＳ装置のいずれかを使用して１種以上の悪臭化合物をスクリーニングした後に、嗅神経細胞を単離する。より詳細には、少なくとも１つの神経細胞を単離する。マウス嗅神経細胞を、以前に記載された手順（Malnic et al.; Areneda et al., 2004）に類似したＣａ2+イメージングによりスクリーニングする。特に、電動式可動顕微鏡ステージを使用することによって、スクリーニング可能な細胞数を１回の試験当たり少なくとも１，５００に増加させる。マウスには約１，２００種の異なる嗅覚受容体が存在し、かつ各嗅神経細胞は１，２００種の嗅覚受容体遺伝子のうち１つまたは２つしか発現しないため、このスクリーニング能力は、事実上、全てのマウス嗅覚受容体レパートリーを網羅する。換言すれば、ハイスループットの嗅神経細胞スクリーニングのためのカルシウムイメージングの組み合わせによって、匂い物質の特定のプロファイルに応答する嗅覚受容体がほぼ全て特定される。特定の一態様においては、２つの一般的なトイレの悪臭化合物であるインドールおよびスカトールの双方に応答する匂い物質を単離することができる。
【００４５】
嗅神経細胞のカルシウムイメージングのために、主嗅上皮を、神経細胞の解離前にマウスから切開することができる。切開された嗅上皮を、その後、機械的および酵素的解離のために解離バッファーに移すことができる。解離された神経細胞を、その後、蛍光顕微鏡検査により数千の細胞のスクリーニングが可能なカバースリップ上に播種することができ、かつ、これらの細胞にカルシウム感受性色素（Ｆｕｒａ−２  ＡＭ）を例えば３１℃で約３０分間負荷し、かつスクリーニングの準備ができた顕微鏡上に移すことができる。解離された嗅神経細胞上に（生理食塩水中の）匂い物質の希釈溶液を灌流することによって、これらの細胞を刺激する。例えば受容体を悪臭化合物５０μｍで刺激した後、Ｆｕｒａ−２蛍光の変化により示される細胞内Ｃａ2+フラックスをモニタリングすることによって、悪臭化合物に応答する希少な細胞を特定する。解析の後、応答細胞を、吸引マイクロピペットを用いてガラスカバースリップから取り出すことができる。その後、単離された細胞を、これに続いて応答細胞中のｍＲＮＡとして発現される嗅覚受容体遺伝子を特定するためにプールして１つのサンプルとする。
【００４６】
特定の一実施形態においては、嗅神経細胞のｍＲＮＡを、Marko, N. F., et al., (2005) A robust method for the amplification of RNA in the sense orientation. BMC genomics, 6, 27; doi: 10.1186/1471-2164-6-27に包括的に記載されている方法（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法）によって精製および増幅する。トランスクリプトームの少なくとも一部（トランスクリプトーム全体までを含む）を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて配列決定するか、またはマイクロアレイ技術を用いて既知の遺伝子にハイブリダイズする。ＮＧＳは、Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics, 11(1), 31-46; doi: 10.1038/nrg262において包括的に議論され、かつ説明されている。特定の一実施形態においては、同一の応答プロファイルを示す神経細胞を最低で５つプールし、かつ２回の連続するインビトロ転写（ＩＶＴ）によりｍＲＮＡを増幅する。ｍＲＮＡを、ピッキング後すぐに細胞溶解により放出する；ＤＮアーゼなしで、かつ精製ステップを行わない。この増幅を、次のパラメーターを使用してＭｅｓａｇｅＡｍｐＩＩ  ａＲＮＡ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，  ＡＭＡ１７５１）により行うことができる：連続する１４時間にわたるＩＶＴを２回。
【００４７】
さらなる一実施形態においては、ＮＧＳの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体の群または遺伝子ファミリーを（例えば、ピッキングされた神経細胞の数と同数まで）特定する。特に、推定悪臭受容体は、嗅神経細胞由来のＮＧＳサンプル中でのｍＲＮＡの量が極めて多いか、または複数の独立した生物学的複製中に存在する。嗅覚コードの組み合わせの性質（１種の化合物が複数のＯＲを活性化し、かつ１種ＯＲが複数の化合物により活性化されうる）のために、所与の化合物によって活性化された複数の神経細胞をプールすることによって、単一のＮＧＳ試験においてこれらの分子を認識する役割を果たす受容体を事実上全て探索することが可能となる。従って、機能的に類似した神経細胞をプールすることによって、脱オーファン化のスループットおよび速度が大幅に改善される。
【００４８】
次に、標準的なバイオインフォマティクスツールを用いて、相同の受容体配列は類似の機能を保持するという仮定の下に、他の推定哺乳動物（非ヒト）の１種以上の悪臭受容体に極めて密接に関連するヒトの１種以上の匂い物質受容体を特定する。Adipietro et al. (2012) Functional Evolution of Mammalian Odorant Receptors. PLoS Genet 8(7): e1002821. doi:10.1371/ journal.pgen.1002821。ＢＬＡＳＴＰおよび／またはＢＬＡＳＴＮアルゴリズムのデフォルトパラメーターを使用することができる。
【００４９】
ヒトまたは非ヒト哺乳動物の悪臭受容体を、悪臭化合物の活性を模倣、遮断、調節および／または増強する化合物の特定に用いることができる機能アッセイに適合させることができる。特にこのアッセイは細胞アッセイであってよく、かつ化合物を特定する方法はハイスループットスクリーニングアッセイであってよい。より詳細には、本明細書において提供されるのは、調節化合物（例えば、遮断、増強および遮蔽）を発見するための化合物ライブラリーを用いた受容体のハイスループットスクリーニングに適合可能な受容体ベースのアッセイである。
【００５０】
特定の一実施形態においては、悪臭受容体遺伝子配列を、インドールおよびスカトール感受性細胞から以下のように特定する：プールされた神経細胞を７５℃に１０分間加熱することにより細胞膜を破壊し、かつそのｍＲＮＡを増幅できるようにする。限られた量の出発材料、典型的には１〜１５の細胞を用いてＮＧＳ技術を適用する場合には、この増幅ステップが重要である。Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法による線形的増幅（ＩＶＴ）によって、発現される遺伝子の相対的転写レベルの維持を保証する。一晩（１４時間）のインビトロ転写を連続して２回行うことにより、十分な量のｃＲＮＡを得る；次に、増幅されたｃＲＮＡを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙを作成する。得られた典型的には７５〜１５０の塩基対の短い配列（一般に「リード」と称される）をマウスのリファレンスゲノム（例えば、ＵＣＳＣのバージョンｍｍ９またはｍｍ１０）に対してアライメントすることにより、これらの細胞の完全なトランスクリプトームを形成する。このトランスクリプトームデータの定量的解析によって、転写された匂い物質受容体遺伝子およびそのそれぞれの発現レベルのリストが得られる。極めて高レベルの量のｍＲＮＡを示す（「リード」が極めて多い）かまたは複数の複製試験において存在する匂い物質受容体遺伝子が、推定インドールおよびスカトール受容体と考えられる。
【００５１】
その後、予測マウスＯＲ遺伝子を用いてマウスおよびヒトのゲノムデータベースの双方の最新版をマイニングすることによって、極めて密接に関連する（すなわち極めて高い配列類似性を示す）受容体を、マウスにおいて（パラロガス遺伝子）およびヒトにおいて（オーソロガス遺伝子）特定する。このプロセスは、配列類似性検索ツールであるＢＬＡＳＴ検索アルゴリズム（ＮＣＢＩのウェブサイトで公的に入手可能）を用いて行うことができ、その際、初期のトランスクリプトーム解析から予め得られた各推定遺伝子配列をクエリー配列として使用する。このデータマイニングプロセスから特定される新たに特定された遺伝子も、パラロガス遺伝子とオーソロガス遺伝子とが類似の活性を有する可能性が高いという仮定の下に、潜在的悪臭受容体と考えられる。特定の一実施形態においては、配列相同性のペアワイズ比較を行うことによって、以下の反復スキームを用いてマウスおよびヒトにおける密接に関連する受容体の特定を行う：ステップ検索配列ＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰ結果マウス候補１→マウスパラログ１およびヒトオーソログ１マウスパラログ１→ヒトオーソログ２ヒトオーソログ１→ヒトパラログ１ヒトオーソログ２→ヒトパラログ２  パラログ＝同種におけるホモログ、オーソログ＝異種におけるホモログ。パラロガス遺伝子を、その後、マルチアライメントツールを用いてアライメントすることによって系統樹を作成する。インビトロでの機能データを、密接に関連してはいるが異なる受容体間のそのような系統学的関係に照らして解釈することができる。このステップは、例えば、インドールおよびスカトールといった試験化合物に程度の差はあれ応答する完全なＯＲ遺伝子ファミリーの特定において不可欠である。脱オーファン化プロセスを完全なものとするために、候補ＯＲ遺伝子をさらに、嗅神経細胞の単離に使用された化合物および関心の持たれる他の構造的に関連する化合物に対する活性を確認するために、インビトロで発現させる。一実施形態においては、脱オーファン化プロセスを完全なものとするために、候補ＯＲ遺伝子をさらに、最初に前記嗅神経細胞の単離に使用された化合物に対する活性を確認するために、インビトロで発現させる。インビトロで発現された同一の候補ＯＲ遺伝子を、さらに、関心の持たれる他の構造的に関連する化合物を用いてスクリーニングする。
【００５２】
本明細書に記載のプロセスおよび方法を用いて、インドールおよびスカトール悪臭に応答する嗅神経細胞（マウスＯＲ）のトランスクリプトームのシーケンシング（ＮＧＳ）を行うことにより、以下の受容体を直接特定した。次いで、マウスＯＲに対して極めて高いアミノ酸同一性の程度を有するヒトのインドールおよびスカトール受容体を、利用可能なゲノムデータベースの検索により特定した（第１表）。インドールおよびスカトールの双方への曝露後に応答する細胞をピッキングした後に、本明細書に記載のＮＧＳ法によって、マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０およびＯｌｆｒ６６５を最初に特定した。対応するヒト相同受容体ＯＲ１１Ｇ２およびＯＲ５２Ｎ２のそれぞれを、さらにアミノ酸配列の類似性の比較により特定した。実施例４および５に示すように、候補マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０およびＯｌｆｒ６６５、並びにそれらのヒトのカウンターパートＯＲ１１Ｇ２およびＯＲ５２Ｎ２は、インドールによりおよびスカトールによりインビトロで活性化されたため、これらをインドールおよび／またはスカトール受容体と称する。同様に、候補マウス受容体Ｏｌｆｒ７４６、Ｏｌｆｒ７４５、Ｏｌｆｒ２０７、Ｏｌｆｒ２１１およびＯｌｆｒ２５７によって、同一のステップに従って、それぞれヒト受容体ＯＲ１１Ｈ４、ＯＲ１１Ｈ６、ＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ４Ｃ１５およびＯＲ８Ｓ１を特定した。これらのヒトＯＲ遺伝子も、インビトロでインドールおよびスカトールの双方に応答した。総合すると、本明細書に記載の方法によって特定された７種の試験された推定ヒト受容体のうち７種が、インドールおよびスカトール受容体として確認され、これはさらに、ヒトのインドールおよびスカトール受容体を効率的に特定するための前記方法を支持するものである。
【００５３】
匂い物質受容体の脱オーファン化へのこのアプローチは、以前に確立された単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ法に対して幾つかの主要な利点を有する。第１に、匂いおよび／または香りに対して類似の結合特性を共有する複数の神経細胞をプールすることにより、独自のｍＲＮＡシーケンシング試験（ＮＧＳ）で、標的悪臭化合物により活性化される受容体が事実上全て特定される。従って、スループットは以前に達成されたものよりも高い。第２に、複数の細胞をプールして１つのサンプルとすることができるため、このアプローチによって、試験間での複製サンプルの総合的な比較による遺伝子の選択が可能となる。第３に、ＮＧＳはＯＲに特異的なＰＣＲプライマーの使用を必要としない。ＮＧＳはまた、問題が多くかつ多くの場合非線形的または非特異的ＰＣＲ増幅のために偽陽性をもたらす、ＯＲに特異的な縮重プライマーの使用を必要としない。特に、ＯＲコード配列は単一エクソン内にあることから、ゲノムＤＮＡでのサンプル汚染がＯＲ遺伝子配列の非特異的増幅を容易に導きうる。第４に、ＲＴ−ＰＣＲ解析は、固有の偽陽性率のため、プールされたサンプルに対して行うことは困難である。単一細胞のｍＲＮＡのハイブリダイゼーション試験は、高密度ＤＮＡマイクロアレイチップを用いて行われている。しかし、このアプローチは一般的にＮＧＳより感度が低く、かつさらには、対応するＤＮＡプローブを合成する必要がある既知の遺伝子に制限されている。
【００５４】
従って、ＮＧＳの使用はＯＲの迅速な特定にとって著しく有利であり、かつ最終的には、標準的な（例えばＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイ）アプローチよりも正確な候補受容体の選択をもたらす。
【００５５】
さらなる一実施形態においては、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞から特定されたマウス受容体を、そのＮ末端で短ポリペプチド配列（例えばウシロドプシン受容体−ＲｈｏまたはＦｌａｇ）で修飾し、一過的にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、かつインドールおよびスカトールで別々に刺激し、それによって、それらが真のインドール／スカトール受容体であることを確認する。ヒトＧαサブユニットＧαolf（配列番号２１）の共発現によってＧｓ伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部ｃＡＭＰが増加する。その結果によって、Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）、Ｏｌｆｒ７４３（配列番号５および配列番号６）およびＯｌｆｒ７４６（配列番号３７および配列番号３８）がインドール−スカトール受容体であることが裏付けられる。
【００５６】
他の態様においては、ヒト受容体ＯＲ５２Ｎ２（配列番号１１および配列番号１２）を、マウスＯｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体と特定した（実施例６）。ヒト受容体ＯＲ１１Ｇ２（配列番号１３および配列番号１４）を、マウスＯｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体と特定した（実施例６）。ヒト受容体ＯＲ５ＡＣ２（配列番号７５および配列番号７６）を、マウスＯｌｆｒ２０７（配列番号７７および配列番号７８）とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体と特定した（実施例６）。ヒト受容体ＯＲ４Ｃ１５（配列番号７９および配列番号８０）を、マウスＯｌｆｒ２１１（配列番号８１および配列番号８２）とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体と特定した（実施例６）。ヒト受容体ＯＲ８Ｓ１（配列番号８３および配列番号８４）を、マウスＯｌｆｒ２５７（配列番号８５および配列番号８６）とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体と特定した（実施例６）。マウス受容体Ｏｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのＮＧＳデータから直接特定した（実施例６）。マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのＮＧＳデータから直接特定した（実施例６）。マウス受容体Ｏｌｆｒ７３６（配列番号２７および配列番号２８）を、マウスＯｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）とのその配列類似性ゆえにインドール／スカトール受容体と特定したが、これは嗅神経細胞から単離されたものであり、かつ恐らくは細胞表面発現の欠如のためにインドールにもスカトールに応答しない。マウス受容体Ｏｌｆｒ７４７（配列番号３９および配列番号４０）およびＯｌｆｒ７４８（配列番号４１および配列番号４２）も、マウスＯｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）とのその配列類似性ゆえに特定されたが、例外的に、免疫染色アッセイによって評価された際には適切な細胞表面発現であるにもかかわらず、インドールにもスカトールに応答しない。このことは、高い類似性を示す配列が常に同一の応答プロファイルを共有するとは限らないという、嗅覚受容体の多様な性質を強調している。
【００５７】
受容体をＲｈｏ配列で修飾し、かつＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で安定的に発現させる。ヒトＧαサブユニットＧα15の共発現によってＧｑ伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部Ｃａ2+が増加する。
【００５８】
上記プロセスおよびここまでに得られた結果は、本プロセスが、悪臭化合物に対する哺乳動物の匂い物質受容体の迅速かつ確実な特定に有用であることの実証に寄与する。
【００５９】
さらに、上記ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞が提供される。
【００６０】
さらに、インドールおよび／またはスカトール匂い物質受容体に結合する化合物を特定するためのアッセイが提供される。特に本明細書において提供されるのは、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および／または増強する化合物を特定するための方法であって、以下：
ａ）前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること、
ｂ）前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること、その際、前記受容体は上記ポリペプチドであるものとする、
を含む、前記方法である。
【００６１】
一実施形態においては、前記化合物の活性を、インドールおよび／またはスカトールへのその結合の比較により決定する。他の実施形態においては、前記受容体またはそのキメラまたはその断片と前記化合物とを、スカトールおよび／またはインドールの存在下に、スカトールおよび／またはインドールを伴う前記受容体への前記化合物の結合を許容する条件下に、接触させる。
【００６２】
さらなる一実施態様においては、化合物を、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される受容体またはそのキメラまたはその断片と接触させ、その際、前記受容体またはそのキメラまたはその断片を、ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞内で発現させる。
【００６３】
前記化合物の活性を、インビボ、エクスビボ、インビトロおよびシンセティックスクリーニングシステム用いて決定することができる。
【００６４】
他の実施形態においては、前記接触を、本明細書に記載のポリペプチドを含むリポソームまたはウイルス誘発出芽膜を用いて行う。
【００６５】
他の実施形態においては、スカトールおよび／またはインドールに結合する受容体に結合する化合物を特定するための方法を、本明細書に記載のポリペプチドを発現する細胞からの膜画分上で実施されることができる。他の実施形態においては、
以下の実施例は単なる例示であり、要約、発明の詳細な説明または特許請求の範囲に記載される本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【００６６】
実施例
実施例１
インドールおよび／またはスカトールに結合する受容体を特定するためのマウス嗅神経細胞のスクリーニング、
マウス由来のネイティブ嗅神経細胞を含む嗅上皮を単離して単一細胞に解離した後、解離バッファーに移して穏やかに機械的および酵素的に解離した。解離プロトコルを最適化するために、新鮮な解離バッファーを作製するための一般的な手順を、Araneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756の記載に従ったが、次の変更を加えた：ＤＮアーゼＩＩに代えてＤＮアーゼＩにし、Ｃａ2+の濃度を５ｍＭに高め、かつｐＨを３２℃で７．３５に調整した。解離された神経細胞を、その後、蛍光顕微鏡検査により２，５００超の細胞のスクリーニングが可能なカバースリップ上に播種した。次いで、これらの細胞にカルシウム感受性色素（Ｆｒａ−２  ＡＭ）を３１℃で３０分間負荷し、かつスクリーニングの準備ができた顕微鏡上に移した。解離された嗅神経細胞を以前に記載された通りにスクリーニングしたが（Malnic et al.; Areneda et al., 2004）、電動式可動顕微鏡ステージを用いることで、スクリーニング可能な細胞数を増加させた。次いで、解離された嗅神経細胞上に（生理食塩水中の）匂い物質の希釈溶液を灌流することによって、これらの細胞を刺激した。
【００６７】
インドール５０μｍで、次いでスカトール５０μｍで受容体を刺激し、かつＦｕｒａ−２蛍光の変化により示される細胞内Ｃａ2+フラックスをモニタリングすることによって、インドールおよびスカトールに応答する嗅神経細胞を特定した。図２に、インドールおよびスカトールの双方（各５０μΜ）によって特異的に活性化された７つの独立した嗅神経細胞についてのＣａ2+イメージングトレースを示す。全ての細胞を、酵素アデニル酸シクラーゼＡＣＩＩＩの薬理学的活性化因子であるフォルスコリン（ｆｏｒｋ）２０μΜでも刺激し、それにより細胞の生存能力および神経細胞の特定を確認した。ｘ軸上の時間スケール単位は６秒のフレームである。平均蛍光強度は、レシオメトリックな３４０／３８０ｎｍの記録の結果としての相対的な蛍光単位である。
【００６８】
実施例２
インドールおよびスカトール感受性細胞からのｍＲＮＡの単離および増幅による、インドールおよびスカトール感受性受容体に関する「悪臭」遺伝子のｃＤＮＡ配列の作成
実施例１の活性化された嗅神経細胞をガラス吸引マイクロピペットを用いて単離した後に、引き続き、応答細胞中のｍＲＮＡとして発現された匂い物質受容体遺伝子を特定するためにプールして１つのサンプルとした。悪臭受容体遺伝子配列を、次のようにインドールおよびスカトール感受性細胞から特定した：１種以上の悪臭化合物によって活性化される５種超の嗅神経細胞（各６、１０、１５および１５の細胞）の４つの組を、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極を用いて単離した。マイクロピペットはホウケイ酸ガラス（品目＃Ｂ１５０−８６−１０、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から設計され、かつ次の条件下で微小電極プラー（Ｐ−１０００型、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて引かれたものである：熱、傾斜温度＋２０℃；Ｐｕｌｌ＝０、Ｖｅｌ＝１２０；圧力＝５００。引かれたピペットチップを手ではずし、かつカルシウムイメージングアッセイにおいて決定される際にインドールおよびスカトールにより活性化される嗅神経細胞を単離するためにＮｅｗｐｏｒｔマイクロマニピュレーター（ＭＷ３Ｒ型）上に固定した。活性化されたＯＳＮを、マイクロピペットの後端に適用される穏やかな吸引により単離した。
【００６９】
神経細胞のｍＲＮＡをＥｂｅｒｗｉｎｅ法に従って精製および増幅した（ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ＩＩ  ａＲＮＡ  ｋｉｔ  −  Ａｍｂｉｏｎ，  ＡＭ１７５１）。プールされた神経細胞を再懸濁バッファー中で１０分間にわたって７５℃に加熱し（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｃＤＮＡ  ｓｙｓｔｅｍ，  ４６−６３２１−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、それによって細胞膜を破壊し、かつそのｍＲＮＡを増幅できるようにした。Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法（インビトロ転写）による線形的増幅によって、発現される遺伝子の相対的転写レベルの維持を保証する。第１鎖ｃＤＮＡを、Ａｍｂｉｏｎキットに従って４２℃で２時間にわたるインキュベーションを行って得た。第２鎖ｃＤＮＡの合成を、１６℃で２時間にわたる第２のインキュベーション後に同一のキットを用いて行った。２本鎖ｃＤＮＡを、対応するｃＲＮＡを生成するためのテンプレートとして使用し（３７℃で１４時間のインキュベーション）、その後これを精製した。このｃＲＮＡ合成ステップを第２のＩＶＴのために繰り返した。一晩（１４時間）のインビトロ転写を連続して２回行うことにより、十分な量のｃＲＮＡを得た；次に、増幅されたｃＲＮＡを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙを作成した。その後、全トランスクリプトームの配列を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により得た。
【００７０】
ＮＧＳの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、マウス悪臭、特にインドールおよび／またはスカトールの嗅覚受容体を特定した。このために、得られたＮＧＳ由来の１５０の塩基対の短い配列（一般にリードと称される）をマウスのリファレンスゲノム（例えば、ＵＣＳＣのバージョンｍｍ９またはｍｍ１０など）に対してアライメントすることにより、これらの細胞の完全なトランスクリプトームを形成した。このトランスクリプトームデータの定量的解析によって、転写された匂い物質受容体遺伝子およびそのそれぞれの発現レベルのリストを得た。高レベルのｍＲＮＡを示す（リードが多い）かまたは複数の複製試験において存在する匂い物質受容体遺伝子を候補インドールおよびスカトール受容体と考え、これを図３に示す。図３は、４つの独立したスカトール／インドール細胞ピッキング試験からの代表的なＮＧＳの結果をまとめたものである。この棒グラフは、視覚的検査後に保持された極めて多いｍＲＮＡを有する候補インドール／スカトールＯＲ遺伝子を表す。Ｙ軸は、１サンプル当たりにピッキングされたＯＳＮの数を考慮した、ＯＭＰ  ｍＲＮＡのレベルに正規化されたｍＲＮＡの量レベルを表す。星印（＊）は、受容体を複数の試験で特定したことを示す。ＯＭＰ（嗅覚マーカータンパク質）は、成熟した嗅神経細胞のための特定のバイオマーカーである。上記の通りカルシウムイメージングおよびＮＧＳを組み合わせることによって、以下の５種の受容体配列を、推定マウスインドールおよびスカトールＯＲとして特定した：Ｏｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）、Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）、Ｏｌｆｒ７４１（配列番号３および配列番号４）、Ｏｌｆｒ７４３（配列番号５および配列番号６）およびＯｌｆｒ７４５（配列番号７および配列番号８）。
【００７１】
実施例３
マウスおよびヒトの悪臭受容体の特定
カルシウムイメージングとＮＧＳとの組み合わせによりマウスゲノムにおける約１，２００種のＯＲのうち５種のマウスインドールおよびスカトールＯＲのサブセットを特定することによって（実施例１、２）、インシリコ法による付加的なマウスおよび新規のヒトインドールおよびスカトールＯＲの迅速な特定が可能となる。類似する全体的なアミノ酸同一性を有するＯＲは、類似の匂い物質応答プロファイルを示すものと考えられるため［Adipietro et al. (2012)］、候補インドールおよびスカトールＯＲのリストを、カルシウムイメージングにより単離されたインドール／スカトール感受性嗅神経細胞のＮＧＳ解析に由来するマウスＯＲ配列を用いた公共のマウスおよびヒトゲノムデータベースの検索により拡張した。ＮＧＳの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、マウス悪臭嗅覚受容体を特定した。推定悪臭受容体は、嗅神経細胞由来のＮＧＳサンプル中でｍＲＮＡが極めて高レベルの量であるか、または、複数の独立した生物学的複製において存在するが１種以上の悪臭に応答する嗅神経細胞を含まない対照サンプル中には存在しない。標準的なバイオインフォマティクスツールを使用して、相同配列受容体は類似の機能を保持するという仮定の下で（Adipietro et al. (2012)）、推定哺乳動物（非ヒト）の１種以上の悪臭受容体に極めて密接に関連する１種以上のヒト匂い物質受容体を特定した。ＢＬＡＳＴＰおよび／またはＢＬＡＳＴＮアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いた。第１表に、特定されたマウス匂い物質受容体（ＯＲ）および予測ヒトオーソログを挙げる。
【００７２】
【表１】
2019004883.tif 000003
【００７３】
関連するヒトタンパク質配列は、第１表に挙げたＮＧＳで特定されたマウスＯＲ配列に対して少なくとも６０％の配列同一性の範囲内にある。同一性レベルは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム後のアミノ酸配列のペアワイズ比較に関連して与えられる。２６種の新規のヒトおよびマウスのＯＲを、公共のゲノムデータベースのＢＬＡＳＴＰ検索（デフォルトパラメーター）によって特定した。１６種が、ＮＧＳ由来遺伝子Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）、７４１（配列番号３および配列番号４）、７４３（配列番号５および配列番号６）、７４５（配列番号７および配列番号８）に密接に関連していた。これらは７４０ファミリーを構成する。１０種が、ＮＧＳ由来受容体Ｏｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）に密接に関連していた。これらはＯｌｆｒ６６５ファミリーを構成する。図４は、候補マウスインドールおよびスカトールＯＲ遺伝子と、Ｏｌｆｒ７４０（図４Ａ）およびＯｌｆｒ６６５（図４Ｂ）受容体ファミリーに属するそれらの予測ヒトオーソログとの系統学的関係を示す。この関係は、タンパク質配列に基づく近隣結合法による系統樹の再構成により得られたものである。対応するヒトオーソログを矢印で示す。偽遺伝子であるとの注釈が付されたヒトＯＲ遺伝子名に「Ｐ」の印を付した。偽遺伝子は非機能性であるものと考えられる。ＯＲ１１Ｈ７Ｐは、既知の機能対立遺伝子を有する分離偽遺伝子（ＳＰ）である。ダイヤ形（◇）は、ＮＧＳにより最初に特定された受容体を示す。追加候補のマウスおよびヒトのインドールおよびスカトールＯＲに関するアミノ酸同一性を決定するために、完全長のタンパク質配列を、全ＯＲレパートリーにわたって高度に保存されたアミノ酸モチーフに基づいて手動でアライメントした（Ｂｉｏｅｄｉｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｏｏｌ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．０．５．３）。第２表に、マウスＯｌｆｒ７４０ファミリーに関するペアごとのアミノ酸同一性およびそれらの予測ヒトオーソログを示す。第３表に、マウスＯｌｆｒ６６５ファミリーに関するペアごとのアミノ酸同一性およびそれらの予測ヒトオーソログを示す。
【００７４】
【表２】
2019004883.tif 000004
【００７５】
【表３】
2019004883.tif 000005
【００７６】
実施例４
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのマウスＯＲ  Ｏｌｆｒ７４３、Ｏｌｆｒ７４６およびＯｌｆｒ７４０のインドールおよびスカトール活性
インドールおよびスカトールの双方の悪臭に対する、候補マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）、Ｏｌｆｒ７４３（配列番号５および配列番号６）およびＯｌｆｒ７４６（配列番号３７および配列番号３８）の活性を、細胞ベースのｃＡＭＰアッセイで確認した。図５Ａおよび５Ｂにおいて、タグ付きＦＬＡＧ−Ｒｈｏ（配列番号１８）、Ｏｌｆｒ７４３（配列番号６）およびＯｌｆｒ７４０（配列番号２）ｃＤＮＡ配列を、Ｇαolf（配列番号２１）と共に共トランスフェクションし、かつインドール（左）またはスカトール（右）の濃度増加に曝露した。図５Ｃおよび５Ｄは、インドールおよびスカトールを用いた場合のＯｌｆｒ７４０（配列番号２）の活性およびＯｌｆｒ７４３（配列番号６）の活性が類似していることを示す反復試験である。図５Ｅにおいて、タグ付きＦＬＡＧ−Ｒｈｏ（配列番号１８）、Ｏｌｆｒ７４６（配列番号３８）ｃＤＮＡ配列を、Ｇαolf（配列番号２１）と共に共トランスフェクションし、かつインドールまたはスカトールの濃度増加に曝露した。匂い物質誘発活性を、ＨＴＲＦアプローチ（ＣｉｓＢｉｏキット）を用いて、細胞質ゾル内ｃＡＭＰレベルの測定により検出した。受容体活性の用量依存性増加を、双方の分子に対して３種全ての受容体に関して示す。Ｇαolf（配列番号２１）単独（受容体なし）を用いたＨＥＫ細胞の共トランスフェクションを、非特異的活性についての対照として使用した（対照）。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正ＨＴＲＦ比と定義される。結果を図５に示す。３種全ての受容体は、悪臭化合物に対する特異的な用量依存的活性を示し、かつそれ自体で、こうした化合物に対する受容体を特定するための方法の正当性を実証している。マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）およびＯｌｆｒ７４３（配列番号５および配列番号６）を、インドールおよびスカトールの双方に応答した単離された嗅神経細胞から特定した。マウス受容体Ｏｌｆｒ７４６（配列番号３７および配列番号３８）を、Ｏｌｆｒ７４０（配列番号２）およびＯｌｆｒ７４３（配列番号６）を検索配列として使用したデータベースマイニングによってインシリコで特定した。これらの受容体を、そのＮ末端でＦＬＡＧタグで修飾し、かつウシロドプシン受容体の最初の２０のアミノ酸（配列番号１８）を一過的にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、かつ別々にインドールおよびスカトールで刺激することによって、それらが真のインドール／スカトール受容体であることを確認した。ヒトＧαサブユニットＧαolf（配列番号２１）の共発現によってＧｓ伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部ｃＡＭＰが増加する。この結果は、Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）、Ｏｌｆｒ７４３（配列番号５および配列番号６）およびＯｌｆｒ７４６（配列番号３７および配列番号３８）がインドール−スカトール受容体であることを裏付けるものである。
【００７７】
実施例５
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのヒトＯＲ５２Ｎ２、ＯＲ１１Ｇ２、ＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ４Ｃ１５、ＯＲ８Ｓ１、ＯＲ１１Ｈ６およびＯＲ１１Ｈ４、並びにマウスＯｌｆｒ６６５およびＯｌｆｒ７４０のインドールおよびスカトール活性
候補ヒトインドールおよびスカトール悪臭受容体ＯＲ５２Ｎ２（配列番号１１および配列番号１２）、ＯＲ１１Ｇ２（配列番号１３および配列番号１４）、ＯＲ５ＡＣ２（配列番号７５および配列番号７６）、ＯＲ４Ｃ１５（配列番号７９および配列番号８０）、ＯＲ８Ｓ１（配列番号８３および配列番号８４）、ＯＲ１１Ｈ６（配列番号１５および配列番号１６）およびＯＲ１１Ｈ４（配列番号４９および配列番号５０）、並びに候補マウスインドールおよびスカトール悪臭受容体Ｏｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）およびＯｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）の活性を、細胞ベースのカルシウムフラックスアッセイにおいて確認した（図６）。細胞で安定的に共発現するＲｈｏタグ付きヒトＯＲ５２Ｎ２（図６Ａ、Ｂ）またはＯＲ１１Ｇ２（図６Ｃ）およびＧαolf（配列番号２５）を、スカトールまたはインドールの濃度増加に曝露した。図６Ｂは、インドールおよびスカトールを用いたＯＲ５２Ｎ２の類似の活性を示す反復試験である。匂い物質誘発ＯＲ５２Ｎ２またはＯＲ１１Ｇ２活性を、匂い物質曝露後の最大のＣａｌｃｉｕｍ５色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）蛍光変化を測定することによって検出した。活性は、この試験における最も高い相対的蛍光単位（ＲＦＵ）に正規化されたベースライン補正ＲＦＵ比と定義される。受容体活性の用量依存的増加を記録し、かつ対応する用量反応曲線を双方の化合物について示す。受容体を欠く細胞株、例えばｈＯＲ５２Ｎ２を、高濃度での非特異的活性についての対照として用いた（「インドール対照」および「スカトール対照」）。活性は、この試験における最も高い相対的蛍光単位（ＲＦＵ）に正規化されたベースライン補正ＲＦＵ比と定義される。ヒト受容体ＯＲ５２Ｎ２（配列番号１１および配列番号１２）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体であるマウスＯｌｆｒ６６５（配列番号１０）に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体ＯＲ１１Ｇ２（配列番号１３および配列番号１４）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体であるマウスＯｌｆｒ７４０（配列番号２）に対するその配列類似性ゆえに特定した。これらの受容体をＲｈｏ配列で修飾し、かつＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で安定的に発現させた。さらなる例として、ヒト受容体ＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ４Ｃ１５、ＯＲ８Ｓ１、ＯＲ１１Ｈ６、ＯＲ１１Ｈ４、並びにマウス受容体Ｏｌｆｒ６６５およびＯｌｆｒ７４０に関するインドールおよびスカトールの用量反応曲線を示す（図６Ｄ−Ｊ）。ヒト受容体ＯＲ５ＡＣ２（配列番号７５および配列番号７６）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスＯｌｆｒ２０７（配列番号７８）に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体ＯＲ４Ｃ１５（配列番号７９および配列番号８０）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスＯｌｆｒ１２１１（配列番号８２）に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体ＯＲ８Ｓ１（配列番号８３および配列番号８４��を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスＯｌｆｒ２５７（配列番号８６）に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体ＯＲ１１Ｈ６（配列番号１５および配列番号１６）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスＯｌｆｒ７４５（配列番号８）に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体ＯＲ１１Ｈ４（配列番号４９および配列番号５０）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるＯｌｆｒ７４６（配列番号３８）に対するその配列類似性ゆえに特定した。マウス受容体Ｏｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのＮＧＳデータから直接特定した。マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのＮＧＳデータから直接特定した。ヒトＧαサブユニットＧα15の共発現によってＧｑ伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部Ｃａ2+が増加する。この結果は、本明細書に開示された方法が、悪臭化合物に対する哺乳動物の匂い物質受容体の迅速かつ確実な特定に有用であることの実証に寄与する。
【００７８】
実施例６
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるイリンドール受容体Ｏｌｆｒ７４３の活性の阻害
本明細書に概説した手順を使用して特定した後に、得られた悪臭受容体細胞株を使用して、その活性と可能性として考えられるヒトの知覚とを調節する化合物の化学ライブラリーをスクリーニングすることができる。この試験を、実施例４と同一の条件下に行った。Ｒｈｏタグ付きＯｌｆｒ７４３（配列番号６）と共にトランスフェクトされた細胞を、３００μＭの２−アセトナフトンの存在下または不在下に、インドールの濃度増加に曝露した。２−アセトナフトンは、インドールに対するＯｌｆｒ７４３（配列番号６）の活性を阻害する。結果を第４表および図７に示す。アンタゴニスト化合物の存在下では用量反応曲線の右方向へのシフトが認められ、その結果、インドールに対してＥＣ５０が４倍増加する。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正ＨＴＲＦ比と定義される。この結果は、２−アセトナフトンがインドール受容体に結合して、この受容体の活性を阻害することを示している。
【００７９】
【表４】
2019004883.tif 000006
【図１】
2019004883.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月10日(2018.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される匂い物質または香り受容体からなる群から選択される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および／または増強する化合物を特定するための方法であって、以下：
ａ）前記受容体の少なくとも一つまたはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること、ここで、前記受容体は、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるものとする；
ｂ）前記化合物が前記受容体の活性を遮断、阻害、調節または増強する程度を測定すること；および
ｃ）前記嗅覚受容体の応答を遮断、阻害、調節または増強する化合物を同定すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号５０、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、以下：
配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号３８、配列番号５０、配列番号７６、配列番号８０および配列番号８４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、前記アミノ酸配列の一つと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するアミノ酸を含む、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドを発現するために組み換えにより改変された細胞を使用することを含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、アフリカツメガエル卵母細胞、ＣＯＳ、酵母、細菌および嗅プラコード由来細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の少なくとも一つのポリペプチドを発現するために組み換えにより改変された細胞。
【請求項８】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、アフリカツメガエル卵母細胞、ＣＯＳ、酵母、細菌および嗅プラコード由来細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術分野は、匂い物質および香り受容体、並びに匂い物質および／または香り化合物の特定に用いることができる、より具体的にはインドールまたはスカトールなどの悪臭化合物のインヒビターまたは抑制体の特定に用いることができるアッセイに関する。
【０００２】
背景技術
嗅覚は、ヒトの感覚系のうち、最も複雑でかつ十分な解明が進んでいないものの１つである。嗅覚受容体（ＯＲ）の活性化から知覚にかけては、なおもさらなる研究を要する多くのステップが存在する。個々の匂い物質および混合物に対するＯＲコードがどのようにして知覚に変換されるかが解明されれば、この知見を様々な分野において顕著な利点をもたらすべく利用することができる。こうした分野には、匂いのモジュレーター、例えば不快な匂いの知覚を遮断する悪臭中和剤、非生分解性または毒性化合物に代わる新たなフレーバーおよびフレグランス成分、並びに匂いの増強剤が含まれ、これらによって、天然源由来の供給源化合物に対する我々の依存性が制限されると考えられる。「嗅覚コード」の組み合わせの典型は、全ての単一のＯＲは複数の匂い物質によって活性化されることができ、かつ逆にほとんどの匂い物質は複数のＯＲを活性化しうるという所見に集約される。マウスゲノム中には、約１，２００種の異なるＯＲが存在する。一方で、ヒトは約４００種のＯＲを有する。どちらの場合にも、ＯＲレパートリーは世界中の何千もの匂い物質によって活性化され、そしてこの組み合わせの複雑さによって、我々が知覚しうる嗅覚が広がる。しかし、２０１４年現在で従来の脱オーファン化法を用いて特定されているのは、わずか９５種のマウスＯＲ（約８％）および４１種のヒトＯＲ（約１０％）に対する匂い物質またはリガンドのみである。さらに、主にインビトロで特定されたヒトＯＲとの生理的関連性に関して試験が行われたリガンドは、ほとんどない。
【０００３】
文献には様々なＯＲの脱オーファン化法が記載されている［例えばTouhara (2007) Deorphanizing vertebrate olfactory receptors: Recent advances in odorant-response assays Neurochem Int 51, 132-139, Saito et al (2009) Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal 2, ra9, and Peterlin et al. (2014), The State of the Art of Odorant Receptor Deorphanization: a Report from the Orphanage, J Gen Physiol; 143(5): 527-42］。これらの方法の多くは、ＯＲがハイスループットスクリーニングに適した非嗅細胞で発現される細胞ベースのアッセイに専ら依拠している。しかし、ＯＲは多くの場合、そのような異種細胞の小胞体内に保持されている。従って、細胞表面へのトラフィックなしでは、ＯＲは匂い物質と相互作用することができない。［Min et al. (2004) Endoplasmic reticulum degradation impedes olfactory G-protein coupled receptor functional expression. BMC Cell Biol 5, 34］。従って、数百ないし数千の様々な細胞株において各細胞株が匂い物質活性を評価できる特有のＯＲタンパク質を有する体系的なアプローチは、匂い物質とＯＲとの間の組み合わせの相互作用の包括的解読に適したアプローチではない。何故ならば、受容体の多くまたはほとんどはこのような細胞株において正常に機能しないためである。従って、生体内に存在するＯＲの全レパートリーの中から、１種以上の匂い物質によって特異的に活性化または阻害される比較的小さなＯＲのサブセットを迅速かつ確実に特定することができる新規の方法が求められている。さらに、嗅神経細胞自体からのＯＲの特定を含む方法であって、その際、ＯＲが完全に機能的であるものと推定され、従って非嗅細胞におけるＯＲアッセイの周知の困難が回避される前記方法も求められている。
【０００４】
悪臭化合物、例えばインドール、スカトール（３−メチルインドール）およびｐ−クレゾールは、例えばトイレや糞便を含む他の「バスルーム」の源から生じる不快な匂いを発生させる。従って、例えばヒトの匂い化合物の知覚される強度を遮蔽若しくは低減させるかまたは知覚される質を変更する悪臭中和剤が望ましい。匂い物質受容体、より詳細には悪臭受容体を特定することが必要である。インドールまたはスカトールに結合する受容体は特定されつつあり、かつこうした受容体に結合する化合物が発見されつつあり、かつ悪臭の潜在的モジュレーターとして報告されつつある。しかし哺乳動物中には極めて多くのＯＲが存在しているため、悪臭、特にインドールまたはスカトールに結合する受容体の完全なレパートリーの迅速な特定が継続的に望まれている。さらに、こうした受容体に結合する新規の有効な化合物を特定するための新たな悪臭受容体に依拠したアッセイが望まれている。
【０００５】
概要
本明細書においては、匂い物質および／または香り化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下：
ａ）非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること；
ｂ）前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の匂い物質または香り受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること；
ｃ）前記嗅覚受容体と匂い物質または香り化合物とを順次接触させること；
ｄ）匂い物質または香りにより誘発された神経細胞活性の変化を測定すること；
ｅ）匂い物質または香り化合物によって活性化された１種以上の嗅神経細胞を単離すること；
ｆ）前記単離された嗅覚受容体のｍＲＮＡを、単離、または単離および増幅すること；
ｇ）次世代シーケンシングにより前記ｍＲＮＡのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること；および
ｈ）前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、匂い物質受容体および香り受容体からなる群から選択される嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
【０００６】
さらに本明細書においては、悪臭化合物により活性化される嗅覚受容体を特定する方法であって、以下：
ａ）非ヒト哺乳動物種から、各神経細胞が前記嗅覚受容体を発現するネイティブ嗅神経細胞を含む単離された嗅上皮を単一細胞に解離すること；
ｂ）前記嗅細胞に、前記嗅覚受容体の悪臭受容体結合活性の測定を可能にする指示色素を負荷すること；
ｃ）前記嗅覚受容体と悪臭化合物とを順次接触させること；
ｄ）匂い物質により誘発される神経細胞活性の変化を測定すること；
ｅ）悪臭化合物によって活性化された１種以上の嗅神経細胞を単離すること；
ｆ）前記単離された嗅覚受容体のｍＲＮＡを、単離、または単離および増幅すること；
ｇ）次世代シーケンシングにより前記ｍＲＮＡのトランスクリプトームの少なくとも一部を配列決定すること；および
ｈ）前記トランスクリプトームの配列を同種および他の脊椎動物種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体群を特定すること
を含む前記方法が提供される。
【０００７】
さらに本明細書においては、以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する、単離された核酸配列が提供される。
【０００８】
さらに本明細書においては、上記の通りの単離された核酸配列であって、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記単離された核酸配列が提供される。
【０００９】
さらに本明細書においては、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドが提供される。
【００１０】
さらに、上記ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞が提供される。
【００１１】
さらに、インドールおよび／またはスカトール匂い物質受容体に結合する化合物を特定するためのアッセイが提供される。特に本明細書においては、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および／または増強する化合物を特定するための方法であって、以下：
ａ）前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること；
ｂ）前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること；
を含み、ここで、前記受容体は上記のポリペプチドであるものとする前記方法が提供される。
【００１２】
一実施形態においては、前記化合物の活性は、インドールおよび／またはスカトールへのその結合の比較により決定される。他の実施形態においては、前記受容体と化合物とは、スカトールおよび／またはインドールの存在下に、スカトールおよび／またはインドールを伴う前記受容体への前記化合物の結合を許容する条件下に、接触される。
【００１３】
本明細書において提供されるさらなる一実施形態においては、結合活性の測定に機能アッセイが用いられる場合には、本明細書において提供される受容体のシグナル伝達活性を測定するステップは、セカンドメッセンジャーのレベルの変化の検出を含むことができる。他の実施形態においては、シグナル伝達活性の測定が提供され、その際、前記シグナル伝達活性を測定するステップは、グアニンヌクレオチド結合／カップリングまたは交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、プロテインキナーゼＡ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、カルシウムフラックス、アラキドン酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性の測定、メラノフォアアッセイ、受容体初期化アッセイ、ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴまたはレポーター遺伝子発現を含む。本明細書において提供される特定の一実施形態においては、シグナル伝達活性の測定は、蛍光または発光アッセイの使用を含む。蛍光および発光アッセイは、Ｃａ2+感受性フルオロフォア、例えばＦｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４またはＦｕｒａ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）；Ｃａｌｃｉｕｍ３アッセイキットファミリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）およびイクオリンの使用を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、悪臭受容体の脱オーファン化プロセスの概略図を示す。
【図２】図２は、インドールおよびスカトールの双方（各５０μΜ）によって特異的に活性化された６つの独立した嗅神経細胞について示されるＣａ2+イメージングトレースを示す。
【図３】図３は、本明細書において概説した手順を用いて特定された悪臭受容体遺伝子を示す。
【図４】図４Ａは、本明細書に概説した手順を用いて特定されたＯｌｆｒ７４０に属するヒトおよび付加的なマウスの悪臭受容体を示し、図４Ｂは、本明細書に概説した手順を用いて特定されたＯｌｆｒ６６５ファミリーに属するヒトおよび付加的なマウスの悪臭受容体を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｅは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるマウスＯＲ  Ｏｌｆｒ７４３、Ｏｌｆｒ７４６およびＯｌｆｒ７４０のインドールおよびスカトール活性を示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒトＯＲ５２Ｎ２、ＯＲ１１Ｇ２のインドールおよびスカトール活性を示し、図６Ｄ〜図６Ｊは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒトＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ４Ｃ１５、ＯＲ８Ｓ１、ＯＲ１１Ｈ６およびＯＲ１１Ｈ４並びにマウスＯｌｆｒ６６５およびＯｌｆｒ７４０のインドールおよびスカトール活性を示す。
【図７】図７は、試験化合物による、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるインドール受容体Ｏｌｆｒ７４３活性の阻害を示す。
【００１５】
詳細な説明
本明細書における説明および添付の特許請求の範囲では、別段の記載がない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。同様に、「含む」および「包含する」は互換的であり、かつ限定を意図するものではない。さらに、様々な実施形態の説明において「含む」という用語が用いられる場合、幾つかの特定の事例において、実施形態を「主に〜からなる」または「からなる」という用語を用いても説明することができることは、当業者の当然とするところであるものと理解されたい。
【００１６】
定義
以下の用語は、別段の記載がない限り、それらに与えられた意味を有する。
【００１７】
「ＯＲ」とは、嗅細胞において発現されるＧタンパク質共役受容体のファミリーの１つ以上のメンバーを指す。嗅覚受容体細胞は、形態に基づいて、または嗅細胞において特異的に発現されるタンパク質の発現によっても特定されることができる。ＯＲファミリーメンバーは、嗅覚伝達のための受容体として作用する能力を有しうる。
【００１８】
「インドール」および／または「スカトールＯＲ」とは、嗅細胞中で発現されるＧタンパク質共役受容体のファミリーのメンバーを指し、その受容体は、ＧＰＣＲに結合しかつその活性の活性化、阻害または増強によりＧＰＣＲを調節するリガンドを特定するための結合または活性アッセイにおいて、インドールおよび／またはスカトールと結合しかつ／またはインドールおよび／またはスカトールにより活性化される。このようなアッセイについて、以下に記載する。本明細書におけるインドールおよび／またはスカトール受容体には、インドールおよび／またはスカトールに応答または結合する、断片、合成のおよび自然に存在する変異体、並びにキメラが含まれる。
【００１９】
「ＯＲ」核酸は、「Ｇタンパク質共役受容体活性」を有する７つの膜貫通領域を有するＧＰＣＲのファミリーをコードし、例えば、それらは細胞外刺激に応答してＧタンパク質に結合し、かつセカンドメッセンジャー、例えばＩＰ３、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰおよびＣａ2+の産生を、酵素、例えばホスホリパーゼＣおよびアデニル酸シクラーゼの刺激を介して促進することができる。
【００２０】
「ＯＲ」ポリペプチドは、約１ｋｂの長さの単一エクソンによりコードされる７つの膜貫通ドメインを有するＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属し、かつ特徴的な嗅覚受容体特異的なアミノ酸モチーフを示すと考えられる。これら７つの予測ドメインは「膜貫通」または「ＴＭ」ドメインＴＭ  Ｉ〜ＴＭ  ＶＩＩと称され、これらは３つの予測「細胞内ループ」または「ＩＣ」ドメインＩＣ  Ｉ〜ＩＣ  ＩＩＩ、および３つの予測「細胞外ループ」または「ＥＣ」ドメインＥＣ  Ｉ〜ＥＣ  ＩＩＩにより連結される。前記モチーフは、これらに限定されるものではないが、ＴＭ  ＩＩＩおよびＩＣ  ＩＩに重なるＭＡＹＤＲＹＶＡＩＣモチーフ、ＩＣ  ＩＩＩおよびＴＭ  ＶＩに重なるＦＳＴＣＳＳＨモチーフ、ＴＭ  ＶＩＩにおけるＰＭＬＮＰＦＩＹモチーフ、並びにＥＣ  ＩＩにおける３つの保存されたＣ残基、およびＴＭ  Ｉにおける高度に保存されたＧＮ残基の存在と定義される。[Zhang and Firestein (2002), The Olfactory Receptor Gene Superfamily of the Mouse. Nature Neuroscience: 5(2):124-33; Malnic et al., The Human Olfactory Receptor Gene Family: PNAS: 101(8):2584-9]。
【００２１】
「Ｎ末端ドメイン」領域は、Ｎ末端で始まり、かつ最初の予測膜貫通領域の始点に近い領域まで延びる。７つの予測「膜貫通領域」を含む「膜貫通ドメイン」とは、原形質膜内に存在するＯＲポリペプチドのドメインを指し、これには対応する細胞質（細胞内）および細胞外ループも含まれうる。７つの膜貫通領域並びに細胞外および細胞質ループは、Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982)またはStryerにおいて記載されているような標準的な方法を用いて特定することができる。膜貫通ドメインの一般的な二次および三次構造、特に嗅覚受容体のようなＧタンパク質共役受容体の７つの膜貫通ドメインは、当技術分野で知られている。従って、一次構造配列は、以下に詳細に説明するように、既知の膜貫通ドメイン配列に基づいて設計または予測されることができる。これらの膜貫通ドメインは、可溶性相および固相の双方でインビトロでのリガンド結合アッセイに有用である。
【００２２】
ＯＲファミリーメンバーにより媒介される嗅覚伝達を調節する化合物を試験するためのアッセイの文脈における「機能アッセイ」という用語には、間接的または直接的に受容体の影響下にある任意のパラメーター、例えば機能的、物理的および化学的作用の決定が含まれる。これには、リガンド結合、イオンフラックス、膜電位、電流、転写、Ｇタンパク質結合、ＧＰＣＲリン酸化または脱リン酸化、シグナル伝達受容体−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度（例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ  ＩＰ３または細胞内Ｃａ2+）の変化、インビトロ、インビボおよびエキソビボで行われるアッセイが含まれる。これにはさらに、他の生理学的作用、例えば神経伝達物質またはホルモン放出の増加または減少も含まれる。本明細書には、間接的または直接的にＯＲファミリーメンバーの影響下にあるパラメーター、例えば機能的、物理的および化学的作用を増加または減少させる化合物についての機能アッセイが含まれる。このような機能アッセイまたは作用は、当業者に知られている任意の手段によって測定されることができ、例えば分光学的特性（例えば蛍光、発光、吸光度、屈折率）、流体力学的特性（例えば形状）、クロマトグラフ特性または溶解特性の変化、パッチクランプ、電位感受性色素、全細胞電流、放射性同位体流出、誘導マーカー、卵母細胞ＯＲ遺伝子発現；組織培養細胞ＯＲ発現；ＯＲ遺伝子の転写活性化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化；イオンフラックスアッセイ；細胞内セカンドメッセンジャー、例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰおよびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の変化；細胞内カルシウムレベルの変化；神経伝達物質放出などによって測定されることができる。
【００２３】
ＯＲ遺伝子またはタンパク質の「インヒビター」、「ブロッカー」、「アクチベーター」、「抑制体」および「モジュレーター」は互換的に用いられ、嗅覚形質導入についてのエキソビボ、インビトロおよびインビボアッセイを用いて特定される阻害、活性化または調節分子を指し、例えばリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストおよびそれらのホモログおよび模倣物を指す。インヒビターおよびブロッカーとは、例えば、結合することによって刺激を部分的または完全に遮断し、活性化を減少、妨害、遅延させ、嗅覚伝達を不活化、脱感作または下方調節する化合物であり、例えばアンタゴニストである。アクチベーターとは、例えば、結合することによって活性化を刺激、増大、開放、活性化、促進、増強させ、嗅覚伝達を感作または上方調節する化合物であり、例えばアゴニストである。モジュレーターには、例えば受容体と以下のものとの相互作用を変更する化合物が含まれる：アクチベーターまたはインヒビターに結合する細胞外タンパク質（例えば、匂い物質結合タンパク質、リポカリン、および疎水性キャリアファミリーの他のメンバー）；Ｇタンパク質；キナーゼ（例えば、受容体の不活性化および脱感作に関与するロドプシンキナーゼおよびβアドレナリン受容体キナーゼのホモログ）；およびアレスチン（これもまた、受容体を不活性化および脱感作する）。モジュレーターには、ＯＲファミリーメンバーの遺伝的に改変されたバージョン、例えば活性が改変されたバージョン、並びに天然由来および合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低化学分子などが含まれうる。インヒビターおよびアクチベーターについてのそのようなアッセイには、例えば、細胞または細胞膜におけるＯＲファミリーメンバーの発現、フレーバーまたはフレグランス分子、例えば香料原料、香料配合物または悪臭の存在または不在下での推定モジュレーター化合物の適用、および次いで上記のような嗅覚伝達に対する機能作用の決定が含まれる。潜在的なアクチベーター、インヒビターまたはモジュレーターを用いて処理されたＯＲファミリーメンバーを含むサンプルまたはアッセイを、このインヒビター、アクチベーターまたはモジュレーターを含まない対照サンプルと比較することによって、調節の程度が調べられる。（モジュレーターで処理されない）対照サンプルは、１００％の相対的ＯＲ活性値に設定される。対照に対するＯＲ活性値が約８０％、場合により５０％、または２５〜０％である場合には、ＯＲの阻害が達成される。対照に対するＯＲ活性値が１１０％、場合により１５０％、場合により２００〜５００％、または１０００％〜３０００％超である場合には、ＯＲの活性化が達成される。
【００２４】
本明細書において用いられる場合に、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」という用語は、本発明の化合物が通常その自然状態で結合している他の非類似化合物を含まない状態を指す。従って、「精製された」、「実質的に精製された」および「単離された」対象物は、所与のサンプルを少なくとも０．５質量％、１質量％、５質量％、１０質量％または２０質量％、最も好ましくは少なくとも５０質量％または７５質量％含む。好ましい一実施形態においては、これらの用語は、所与のサンプルを少なくとも９５質量％含む本発明の化合物を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合に、「単離された」という用語は、核酸またはポリペプチドに関する場合には、哺乳動物、特にヒトの体内で自然に生じるものとは異なる精製または濃縮の状態を指す。（１）他の自然に生じる随伴構造体または化合物からの精製、または（２）体内では通常では随伴されることのない構造体または化合物の随伴を含む、体内で自然に生じるものよりも高い精製または濃縮のいかなる程度も、本明細書で使用される場合の「単離された」の意味に含まれる。本明細書に記載の複数の核酸または複数のタンパク質は、当業者に知られている様々な方法およびプロセスにより、単離されてもよいし、通常は自然にはこれらに随伴することのない構造体または化合物を伴っていてもよい。
【００２６】
本明細書において使用される場合に、「増幅する」および「増幅」という用語は、以下に詳細に説明するように、自然に発現された核酸の組換えの発生または検出に適した任意の増幅方法の使用を指す。例えば本発明は、本発明の自然に発現された（例えばゲノムまたはｍＲＮＡ）または組換えの（例えばｃＤＮＡ）核酸をインビボ、エクスビボまたはインビトロで（例えばポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲにより）増幅するための方法および試薬（例えば特異的な縮重オリゴヌクレオチドプライマー対）を提供する。
【００２７】
「７回膜貫通型受容体」という用語は、原形質膜を７回貫通する７つのドメインを有する膜貫通型タンパク質のスーパーファミリーに属するポリペプチドを意味する（従って、これら７つのドメインは「膜貫通」または「ＴＭ」ドメインＴＭ  Ｉ〜ＴＭ  ＶＩＩと称される）。嗅覚および特定の味覚受容体のファミリーのそれぞれが、このスーパーファミリーに属する。以下でさらに詳細に説明するように、７回膜貫通型受容体ポリペプチドは、類似しかつ特徴的な一次、二次および三次構造を有する。
【００２８】
「核酸」または「核酸配列」という用語は、１本鎖または２本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを指す。この用語には、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸、すなわちオリゴヌクレオチドが含まれる。またこの用語には、合成骨格を有する核酸様構造体も含まれる。別段の記載がない限り、個々の核酸配列には、その保存的に改変された改変体（例えば縮重コドン置換体または一塩基多型）および相補配列、ならびに明示された配列が暗に含まれる。具体的には、縮重コドン置換体は、例えば１つ以上の選択されたコドンの第３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列の生成により達成されることができる。
【００２９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書においては互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、および天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「異種」という用語は、核酸の部分に関して使用される場合には、当該核酸が、自然において互いに同一の関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は典型的には組換えにより生成され、新たな機能的核酸を生成するために配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有し、例えばある供給源からのプロモーターおよび他の供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質とは、当該タンパク質が自然において互いに同一の関係では見出されない２つ以上の配列を含むこと（例えば、融合タンパク質）を示す。
【００３０】
本明細書で使用される場合に、「組換え」とは、合成されたかまたはさもなくばインビトロで操作されたポリヌクレオチド（例えば「組換えポリヌクレオチド」）、細胞または他の生物学的系における遺伝子産物の産生に組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を指す。
【００３１】
「組換え」手段には、本発明のトランスロケーションドメインおよび本発明のプライマーを用いて増幅された核酸配列を含む融合タンパク質を発現させる、例えば誘導的または構成的に発現させるための発現カセットまたはベクターへの、異なる供給源からの様々なコード領域またはドメインまたはプロモーター配列を有する核酸のライゲーションも含まれる。
【００３２】
「発現ベクター」という用語は、本発明の核酸配列を、インビトロまたはインビボで、原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物の細胞を含む任意の細胞において構成的または誘導的に発現させる目的での任意の組換え発現系を指す。この用語には、線状または環状の発現系が含まれる。この用語には、エピソームのままであるかまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれた発現系（例えば安定発現）が含まれる。この発現系は自己複製能力を有することも有しないこともでき、すなわち、細胞内で一過性の発現を駆動することができる。この用語には、組換え核酸の転写に必要な最低限の要素のみを含む組換え発現「カセット」が含まれる。
【００３３】
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含み、かつ発現ベクターの複製または発現をサポートする細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌、または真核細胞、例えば酵母、昆虫、両生類または哺乳動物の細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３など、例えば培養細胞、外植片および生体内細胞であることができる。
【００３４】
一実施形態においては、本明細書において、以下：
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３，配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３および配列番号８５
からなる群から選択される核酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する単離された核酸配列が提供される。
【００３５】
一実施形態においては、本明細書において、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、上記の単離された核酸配列が提供される。
【００３６】
さらなる一実施形態においては、本明細書において、以下：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２および配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４および配列番号８６
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または前記ポリペプチドの生物学的に活性な断片が提供される。
【００３７】
この方法によって、当業者は、そのヒトの遺伝子のカウンターパートがヒトにおいて特定の匂い特性をコードするものと考えられる嗅覚受容体（ＯＲ）の比較的小さなサブセットを、齧歯類のゲノム中に存在する約１，２００種のＯＲの全集団の中から迅速に特定することが可能となる。図１は、この方法の概略図である。無傷マウスの嗅上皮（ＯＥ）組織を、機械的および酵素処理により単一細胞に解離する。生じる個々の嗅神経細胞（ＯＳＮ）をガラスカバースリップ上に播種し、かつカルシウム指示色素（例えばＦｕｒａ−２）を負荷することにより細胞活性を検出する。このカバースリップを、次いで灌流チャンバー中に配置し、かつ生理食塩水に浸漬する。悪臭試験匂い物質を生理食塩水中で希釈し、かつ細胞に灌流する。その後、ＯＳＮ活性を、Ｆｕｒａ−２蛍光の変化および蛍光顕微鏡による細胞内カルシウムフラックスの変化のモニタリングにより検出する。重要なことには、いくつかの例では、可能性のある約１，２００のＯＲ遺伝子のうち１つまたは２つのみが、所与のＯＳＮにおいて発現される。このことは、所与のＯＳＮの活性が、細胞表面上で発現された単一種類または２種類のＯＲタンパク質によってのみ駆動されることを意味する。細かく制御された匂い物質注入システムと可動ステージとを備えた半自動化カルシウムイメージングシステムでは、単一の実験で１，５００超のＯＳＮのモニタリングが可能である。マウスには約１，２００種のＯＲ遺伝子があるが、このスループットは全てのＯＲレパートリーの代表的なサンプリングを保証する。１種以上の試験匂い物質に応答する１種以上のＯＳＮをガラスマイクロピペットを用いて収集し、かつその後のＲＮＡの抽出、増幅およびＯＳＮのトランスクリプトームの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために、マイクロチューブへと移す。文献には、非常に少量（＜１００の細胞）の出発材料からのＮＧＳベースのトランスクリプトームシーケンシングが報告されている。しかし本出願人の知る限り、これは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、特に嗅覚受容体の脱オーファン化という特定の目的ではまだ適用されていない。所望であれば、本明細書に記載の方法を用いて、複数のＯＳＮを同一のマイクロチューブ内にプールすることができる。その後、生配列リードをリファレンスゲノムにマッピングし、適切なアライメントおよびアノテーションのために視覚的に検査し、かつ例えばゲノムの反復配列に基づく偽陽性マッピングについて解析する。その結果、マウスのＯＳＮのスクリーニングに使用したのと同一の１種以上の悪臭試験匂い物質により活性化されると考えられる候補マウスＯＲのリストが得られる。その後、この候補マウスＯＲタンパク質配列を用いて公共マウスゲノムデータベースを検索し（例えばＢＬＡＳＴＰ）、それにより候補マウスＯＲ配列の完全なリストを取得する。これらの候補は、もともとインドールおよび／またはスカトールによって活性化された神経細胞から特定されたＮＧＳ由来のＯＲ配列に対する配列相同性によって関連している（すなわちパラロガスである）。その後、これらのマウスパラログ（ＮＧＳおよびＢＬＡＳＴＰ由来）の完全なリストを用いて公共ヒトゲノムデータベースを検索することによって、このマウスＯＲ配列に関連する（すなわちオーソロガスな）候補ヒトＯＲ配列のリストを取得する。その結果、試験匂い物質によって活性化されると考えられる候補のマウスおよびヒトのＯＲの完全なリストが得られる。得られた候補ＯＲ遺伝子の活性を確認するために、これらの遺伝子のｃＤＮＡを利用可能な発現ベクターにクローニングし、かつハイスループットスクリーニングに適した培養細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ）へトランスフェクトすることができる。その後、それぞれ組換えにより発現された候補ＯＲ  ｃＤＮＡを含む得られた細胞株を、カルシウムイメージングにおいて使用される試験匂い物質および他の構造的または官能的に関連する匂い物質を用いた細胞ベースの活性アッセイにおいてスクリーニングすることができる。
【００３８】
特定の一実施形態においては、例えばAraneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756の記載に従って、非ヒト哺乳動物（例えばマウス）からのネイティブ嗅神経細胞を含む嗅上皮を単離し、かつ単一細胞に解離する。特定の一実施形態においては、各神経細胞は１度に１種または２種の受容体を発現する。一実施形態においては、嗅神経細胞の生成に使用される嗅覚組織は、受容体および関連する配列に関する公的に利用可能なデータを有する非ヒト哺乳動物に由来する。これには、マウス、ラットおよびハムスターの組織が含まれる。解離プロトコルは、記録可能な神経細胞の生存率が確実に高くなるように最適化されるべきである。特定の一実施形態においては、最低で約１，５００の異なる感覚神経細胞を記録する。
【００３９】
さらなる実施形態においては、指示体を、蛍光カルシウム指示色素、カルシウム指示タンパク質、蛍光ｃＡＭＰ指示薬、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）媒介性レポータータンパク質、生化学的ｃＡＭＰ  ＨＴＲＦアッセイ、β−アレスチンアッセイ、または電気生理学的記録から選択する。特に、嗅神経細胞の膜上で発現される嗅覚受容体の活性のモニタリングに使用可能なカルシウム指示色素を選択する（例えばＦｕｒａ−２  ＡＭ）。
【００４０】
特定の一実施形態においては、化合物を順次スクリーニングし、かつカルシウム色素蛍光の匂い物質依存性変化を、蛍光顕微鏡または蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて測定する。
【００４１】
例えば、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極またはＦＡＣＳ装置のいずれかを使用して１種以上の悪臭化合物をスクリーニングした後に、嗅神経細胞を単離する。より詳細には、少なくとも１つの神経細胞を単離する。マウス嗅神経細胞を、以前に記載された手順（Malnic et al.,1999; Areneda et al., 2004）に類似したＣａ2+イメージングによりスクリーニングする。特に、電動式可動顕微鏡ステージを使用することによって、スクリーニング可能な細胞数を１回の試験当たり少なくとも１，５００に増加させる。マウスには約１，２００種の異なる嗅覚受容体が存在し、かつ各嗅神経細胞は１，２００種の嗅覚受容体遺伝子のうち１つまたは２つしか発現しないため、このスクリーニング能力は、事実上、全てのマウス嗅覚受容体レパートリーを網羅する。換言すれば、ハイスループットの嗅神経細胞スクリーニングのためのカルシウムイメージングの組み合わせによって、匂い物質の特定のプロファイルに応答する嗅覚受容体がほぼ全て特定される。特定の一態様においては、２つの一般的なトイレの悪臭化合物であるインドールおよびスカトールの双方に応答する匂い物質を単離することができる。
【００４２】
嗅神経細胞のカルシウムイメージングのために、主嗅上皮を、神経細胞の解離前にマウスから切開することができる。切開された嗅上皮を、その後、機械的および酵素的解離のために解離バッファーに移すことができる。解離された神経細胞を、その後、蛍光顕微鏡検査により数千の細胞のスクリーニングが可能なカバースリップ上に播種することができ、かつ、これらの細胞にカルシウム感受性色素（Ｆｕｒａ−２  ＡＭ）を例えば３１℃で約３０分間負荷し、かつスクリーニングの準備ができた顕微鏡上に移すことができる。解離された嗅神経細胞上に（生理食塩水中の）匂い物質の希釈溶液を灌流することによって、これらの細胞を刺激する。例えば受容体を悪臭化合物５０μｍで刺激した後、Ｆｕｒａ−２蛍光の変化により示される細胞内Ｃａ2+フラックスをモニタリングすることによって、悪臭化合物に応答する希少な細胞を特定する。解析の後、応答細胞を、吸引マイクロピペットを用いてガラスカバースリップから取り出すことができる。その後、単離された細胞を、これに続いて応答細胞中のｍＲＮＡとして発現される嗅覚受容体遺伝子を特定するためにプールして１つのサンプルとする。
【００４３】
特定の一実施形態においては、嗅神経細胞のｍＲＮＡを、Marko, N. F., et al., (2005) A robust method for the amplification of RNA in the sense orientation. BMC genomics, 6, 27; doi: 10.1186/1471-2164-6-27に包括的に記載されている方法（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法）によって精製および増幅する。トランスクリプトームの少なくとも一部（からトランスクリプトーム全体までを含む）を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いて配列決定するか、またはマイクロアレイ技術を用いて既知の遺伝子にハイブリダイズする。ＮＧＳは、Metzker, M. L. (2010). Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics, 11(1), 31-46; doi: 10.1038/nrg262において包括的に議論され、かつ説明されている。特定の一実施形態においては、同一の応答プロファイルを示す神経細胞を最低で５つプールし、かつ２回の連続するインビトロ転写（ＩＶＴ）によりｍＲＮＡを増幅する。ｍＲＮＡを、ピッキング後すぐに細胞溶解により放出する；ＤＮアーゼなしで、かつ精製ステップを行わない。この増幅を、次のパラメーターを使用してＭｅｓａｇｅＡｍｐＩＩ  ａＲＮＡ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，  ＡＭＡ１７５１）により行うことができる：連続する１４時間にわたるＩＶＴを２回。
【００４４】
さらなる一実施形態においては、ＮＧＳの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、悪臭嗅覚受容体の群または遺伝子ファミリーを（例えば、ピッキングされた神経細胞の数と同数まで）特定する。特に、推定悪臭受容体は、嗅神経細胞由来のＮＧＳサンプル中でのｍＲＮＡの量が極めて多いか、または複数の独立した生物学的複製中に存在する。嗅覚コードの組み合わせの性質（１種の化合物が複数のＯＲを活性化し、かつ１種ＯＲが複数の化合物により活性化されうる）のために、所与の化合物によって活性化された複数の神経細胞をプールすることによって、単一のＮＧＳ試験においてこれらの分子を認識する役割を果たす受容体を事実上全て探索することが可能となる。従って、機能的に類似した神経細胞をプールすることによって、脱オーファン化のスループットおよび速度が大幅に改善される。
【００４５】
次に、標準的なバイオインフォマティクスツールを用いて、相同の受容体配列は類似の機能を保持するという仮定の下に、他の推定哺乳動物（非ヒト）の１種以上の悪臭受容体に極めて密接に関連するヒトの１種以上の匂い物質受容体を特定する。ある研究によって、オーソロガスＯＲ遺伝子対の約８２％が共通のリガンドに応答したことが実証された。このことは、オーソロガス遺伝子対の約１８％が異なるリガンドに応答しうることを示唆している；さらに、パラロガスＯＲ遺伝子対の３３％が共通のリガンドに応答したことが実証された。このことは、パラロガス対の少なくとも約６７％が異なるリガンドに応答しうることを示唆している。[Adipietro et al. (2012) Functional Evolution of Mammalian Odorant Receptors. PLoS Genet 8(7): e1002821. doi:10.1371/ journal.pgen.1002821]。ＢＬＡＳＴＰおよび／またはＢＬＡＳＴＮアルゴリズムのデフォルトパラメーターを使用することができる。
【００４６】
ヒトまたは非ヒト哺乳動物の悪臭受容体を、悪臭化合物の活性を模倣、遮断、調節および／または増強する化合物の特定に用いることができる機能アッセイに適合させることができる。特にこのアッセイは細胞アッセイであってよく、かつ化合物を特定する方法はハイスループットスクリーニングアッセイであってよい。より詳細には、本明細書において提供されるのは、調節化合物（例えば、遮断、増強および遮蔽）を発見するための化合物ライブラリーを用いた受容体のハイスループットスクリーニングに適合可能な受容体ベースのアッセイである。
【００４７】
特定の一実施形態においては、悪臭受容体遺伝子配列を、インドールおよびスカトール感受性細胞から以下のように特定する：プールされた神経細胞を７５℃に１０分間加熱することにより細胞膜を破壊し、かつそのｍＲＮＡを増幅できるようにする。限られた量の出発材料、典型的には１〜１５の細胞を用いてＮＧＳ技術を適用する場合には、この増幅ステップが重要である。Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法による線形的増幅（ＩＶＴ）によって、発現される遺伝子の相対的転写レベルの維持を保証する。一晩（１４時間）のインビトロ転写を連続して２回行うことにより、十分な量のｃＲＮＡを得る；次に、増幅されたｃＲＮＡを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙを作成する。得られた典型的には７５〜１５０の塩基対の短い配列（一般に「リード」と称される）をマウスのリファレンスゲノム（例えば、ＵＣＳＣのバージョンｍｍ９またはｍｍ１０）に対してアライメントすることにより、これらの細胞の完全なトランスクリプトームを形成する。このトランスクリプトームデータの定量的解析によって、転写された匂い物質受容体遺伝子およびそのそれぞれの発現レベルのリストが得られる。極めて高レベルの量のｍＲＮＡを示す（「リード」が極めて多い）かまたは複数の複製試験において存在する匂い物質受容体遺伝子が、推定インドールおよびスカトール受容体と考えられる。
【００４８】
その後、予測マウスＯＲ遺伝子を用いてマウスおよびヒトのゲノムデータベースの双方の最新版をマイニングすることによって、極めて密接に関連する（すなわち極めて高い配列類似性を示す）受容体を、マウスにおいて（パラロガス遺伝子）およびヒトにおいて（オーソロガス遺伝子）特定する。このプロセスは、配列類似性検索ツールであるＢＬＡＳＴ検索アルゴリズム（ＮＣＢＩのウェブサイトで公的に入手可能）を用いて行うことができ、その際、初期のトランスクリプトーム解析から予め得られた各推定遺伝子配列をクエリー配列として使用する。このデータマイニングプロセスから特定される新たに特定された遺伝子も、パラロガス遺伝子とオーソロガス遺伝子とが類似の活性を有する可能性が高いという仮定の下に、潜在的悪臭受容体と考えられる。
【００４９】
特定の一実施形態においては、配列相同性のペアワイズ比較を行うことによって、以下の反復スキームを用いてマウスおよびヒトにおける密接に関連する受容体の特定を行う：
【化１】
2019004883.tif 000015
【００５０】
パラロガス遺伝子を、その後、マルチアライメントツールを用いてアライメントすることによって系統樹を作成する。インビトロでの機能データを、密接に関連してはいるが異なる受容体間のそのような系統学的関係に照らして解釈することができる。このステップは、例えば、インドールおよびスカトールといった試験化合物に程度の差はあれ応答する完全なＯＲ遺伝子ファミリーの特定において不可欠である。
【００５１】
脱オーファン化プロセスを完全なものとするために、候補ＯＲ遺伝子をさらに、嗅神経細胞の単離に使用された化合物および関心の持たれる他の構造的に関連する化合物に対する活性を確認するために、インビトロで発現させる。一実施形態においては、脱オーファン化プロセスを完全なものとするために、候補ＯＲ遺伝子をさらに、最初に前記嗅神経細胞の単離に使用された化合物に対する活性を確認するために、インビトロで発現させる。インビトロで発現された同一の候補ＯＲ遺伝子を、さらに、関心の持たれる他の構造的に関連する化合物を用いてスクリーニングすることにより、例えば受容体のアクチベーター、インヒビターまたはモジュレーターを特定する。
【００５２】
本明細書に記載のプロセスおよび方法を用いて、インドールおよびスカトール悪臭に応答する嗅神経細胞（マウスＯＲ）のトランスクリプトームのシーケンシング（ＮＧＳ）を行うことにより、以下の受容体を直接特定した。次いで、マウスＯＲに対して極めて高いアミノ酸同一性の程度を有するヒトのインドールおよびスカトール受容体を、利用可能なゲノムデータベースの検索により特定した（第１表）。インドールおよびスカトールの双方への曝露後に応答する細胞を単離または「ピッキング」した後に、本明細書に記載のＮＧＳ法によって、マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０およびＯｌｆｒ６６５を最初に特定した。対応するヒト相同受容体ＯＲ１１Ｇ２およびＯＲ５２Ｎ２のそれぞれを、さらにアミノ酸配列の類似性の比較により特定した。実施例４および５に示すように、候補マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０およびＯｌｆｒ６６５、並びにそれらのヒトのカウンターパートＯＲ１１Ｇ２およびＯＲ５２Ｎ２は、インドールによりおよびスカトールによりインビトロで活性化されたため、これらをインドールおよび／またはスカトール受容体と称する。同様に、候補マウス受容体Ｏｌｆｒ７４６、Ｏｌｆｒ７４５、Ｏｌｆｒ２０７、Ｏｌｆｒ２１１およびＯｌｆｒ２５７によって、同一のステップに従って、それぞれヒト受容体ＯＲ１１Ｈ４、ＯＲ１１Ｈ６、ＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ４Ｃ１５およびＯＲ８Ｓ１を特定した。これらのヒトＯＲ遺伝子も、インビトロでインドールおよびスカトールの双方に応答した。総合すると、本明細書に記載の方法によって特定された７種の試験された推定ヒト受容体のうち７種が、インドールおよびスカトール受容体として確認され、これはさらに、ヒトのインドールおよびスカトール受容体を効率的に特定するための前記方法を支持するものである。
【００５３】
匂い物質受容体の脱オーファン化へのこのアプローチは、以前に確立された単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ法に対して幾つかの主要な利点を有する。第１に、匂いおよび／または香りに対して類似の結合特性を共有する複数の神経細胞をプールすることにより、独自のｍＲＮＡシーケンシング試験（ＮＧＳ）で、標的悪臭化合物により活性化される受容体が事実上全て特定される。従って、スループットは以前に達成されたものよりも高い。第２に、複数の細胞をプールして１つのサンプルとするため、ある１つの特定の化合物に対する複数のＯＲが単一の実験で明らかとなる。特定の一実施形態においては、試験間での複製サンプルの総合的な比較による遺伝子の選択が可能となる。第３に、ＮＧＳはＯＲに特異的なＰＣＲプライマーの使用を必要としない。ＮＧＳはまた、問題が多くかつ多くの場合非線形的または非特異的ＰＣＲ増幅のために偽陽性をもたらす、ＯＲに特異的な縮重プライマーの使用を必要としない。特に、ＯＲコード配列は単一エクソン内にあることから、ゲノムＤＮＡでのサンプル汚染がＯＲ遺伝子配列の非特異的増幅を容易に導きうる。第４に、ＲＴ−ＰＣＲ解析は、固有の偽陽性率のため、プールされたサンプルに対して行うことは困難である。単一細胞のｍＲＮＡのハイブリダイゼーション試験は、高密度ＤＮＡマイクロアレイチップを用いて行われている。しかし、このアプローチは一般的にＮＧＳより感度が低く、かつさらには、対応するＤＮＡプローブを合成する必要がある既知の遺伝子に制限されている。
【００５４】
従って、ＮＧＳの使用はＯＲの迅速な特定にとって著しく有利であり、かつ最終的には、標準的な（例えばＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイ）アプローチよりも正確な候補受容体の選択をもたらす。
【００５５】
さらなる一実施形態においては、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞から特定されたマウス受容体を、そのＮ末端で短ポリペプチド配列（例えばウシロドプシン受容体−ＲｈｏまたはＦｌａｇ）で修飾し、一過的にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、かつインドールおよびスカトールで別々に刺激し、それによって、それらが真のインドール／スカトール受容体であることを確認する。ヒトＧαサブユニットＧαolf（配列番号２１）の共発現によってＧｓ伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部ｃＡＭＰが増加する。その結果によって、Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）、Ｏｌｆｒ７４３（配列番号５および配列番号６）およびＯｌｆｒ７４６（配列番号３７および配列番号３８）がインドール−スカトール受容体であることが裏付けられる。
【００５６】
他の態様においては、ヒト受容体ＯＲ５２Ｎ２（配列番号１１および配列番号１２）を、マウスＯｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体と特定した（実施例６）。ヒト受容体ＯＲ１１Ｇ２（配列番号１３および配列番号１４）を、マウスＯｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体と特定した（実施例６）。ヒト受容体ＯＲ５ＡＣ２（配列番号７５および配列番号７６）を、マウスＯｌｆｒ２０７（配列番号７７および配列番号７８）とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体と特定した（実施例６）。ヒト受容体ＯＲ４Ｃ１５（配列番号７９および配列番号８０）を、マウスＯｌｆｒ２１１（配列番号８１および配列番号８２）とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体と特定した（実施例６）。ヒト受容体ＯＲ８Ｓ１（配列番号８３および配列番号８４）を、マウスＯｌｆｒ２５７（配列番号８５および配列番号８６）とのその配列類似性ゆえに、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体と特定した（実施例６）。マウス受容体Ｏｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのＮＧＳデータから直接特定した（実施例６）。マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのＮＧＳデータから直接特定した（実施例６）。マウス受容体Ｏｌｆｒ７３６（配列番号２７および配列番号２８）を、マウスＯｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）とのその配列類似性ゆえにインドール／スカトール受容体と特定したが、これは嗅神経細胞から単離されたものであり、かつ恐らくは細胞表面発現の欠如のためにインドールにもスカトールに応答しない。マウス受容体Ｏｌｆｒ７４７（配列番号３９および配列番号４０）およびＯｌｆｒ７４８（配列番号４１および配列番号４２）も、マウスＯｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）とのその配列類似性ゆえに特定されたが、例外的に、免疫染色アッセイによって評価された際には適切な細胞表面発現であるにもかかわらず、インドールにもスカトールに応答しない。このことは、高い類似性を示す配列が常に同一の応答プロファイルを共有するとは限らないという、嗅覚受容体の多様な性質を強調している。
【００５７】
受容体をＲｈｏ配列で修飾し、かつＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で安定的に発現させる。ヒトＧαサブユニットＧα15の共発現によってＧｑ伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部Ｃａ2+が増加する。
【００５８】
上記プロセスおよびここまでに得られた結果は、本プロセスが、悪臭化合物に対する哺乳動物の匂い物質受容体の迅速かつ確実な特定に有用であることの実証に寄与する。
【００５９】
さらに、上記ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞が提供される。
【００６０】
さらに、インドールおよび／またはスカトール匂い物質受容体に結合する化合物を特定するためのアッセイが提供される。特に本明細書において提供されるのは、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される嗅覚受容体の活性を遮断、阻害、調節および／または増強する化合物を特定するための方法であって、以下：
ａ）前記受容体またはそのキメラまたはその断片と化合物とを接触させること、
ｂ）前記化合物が前記受容体の活性に影響を及ぼすかどうかをアッセイすること、その際、前記受容体は上記ポリペプチドであるものとする、
を含む、前記方法である。
【００６１】
一実施形態においては、前記化合物の活性を、インドールおよび／またはスカトールへのその結合の比較により決定する。他の実施形態においては、前記受容体またはそのキメラまたはその断片と前記化合物とを、スカトールおよび／またはインドールの存在下に、スカトールおよび／またはインドールを伴う前記受容体への前記化合物の結合を許容する条件下に、接触させる。
【００６２】
さらなる一実施態様においては、化合物を、インドールおよびスカトールからなる群から選択される化合物によって活性化される受容体またはそのキメラまたはその断片と接触させ、その際、前記受容体またはそのキメラまたはその断片を、ポリペプチドを発現するように組換えにより改変された細胞内で発現させる。
【００６３】
前記化合物の活性を、典型的には１０，０００種の化合物または化合物の混合物を含む大きな化合物ライブラリーのスクリーニングを許容するインビボ、エクスビボ、インビトロおよびシンセティックスクリーニングシステム用いて決定することができる。
【００６４】
他の実施形態においては、前記接触を、本明細書に記載のポリペプチドを含むリポソームまたはウイルス誘発出芽膜を用いて行う。
【００６５】
他の実施形態においては、スカトールおよび／またはインドールに結合する受容体に結合する化合物を特定するための方法を、本明細書に記載のポリペプチドを発現する細胞からの膜画分上で実施されることができる。
【００６６】
以下の実施例は単なる例示であり、要約、発明の詳細な説明または特許請求の範囲に記載される本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【００６７】
実施例
実施例１
インドールおよび／またはスカトールに結合する受容体を特定するためのマウス嗅神経細胞のスクリーニング、
マウス由来のネイティブ嗅神経細胞を含む嗅上皮を単離して単一細胞に解離した後、解離バッファーに移して穏やかに機械的および酵素的に解離した。解離プロトコルを最適化するために、新鮮な解離バッファーを作製するための一般的な手順を、Araneda et al. (2004), A Pharmacological Profile of the Aldehyde Receptor Repertoire in Rat Olfactory Epithelium. Journal of Physiology: 555:743-756の記載に従ったが、次の変更を加えた：ＤＮアーゼＩＩに代えてＤＮアーゼＩにし、Ｃａ2+の濃度を５ｍＭに高め、かつｐＨを３２℃で７．３５に調整した。解離された神経細胞を、その後、蛍光顕微鏡検査により２，５００超の細胞のスクリーニングが可能なカバースリップ上に播種した。次いで、これらの細胞にカルシウム感受性色素（Ｆｒａ−２  ＡＭ）を３１℃で３０分間負荷し、かつスクリーニングの準備ができた顕微鏡上に移した。解離された嗅神経細胞を以前に記載された通りにスクリーニングしたが（Malnic et al., 1999; Areneda et al., 2004）、電動式可動顕微鏡ステージを用いることで、スクリーニング可能な細胞数を増加させた。次いで、解離された嗅神経細胞上に（生理食塩水中の）匂い物質の希釈溶液を灌流することによって、これらの細胞を刺激した。
【００６８】
インドール５０μｍで、次いでスカトール５０μｍで受容体を刺激し、かつＦｕｒａ−２蛍光の変化により示される細胞内Ｃａ2+フラックスをモニタリングすることによって、インドールおよびスカトールに応答する嗅神経細胞を特定した。図２に、インドールおよびスカトールの双方（各５０μΜ）によって特異的に活性化された６つの独立した嗅神経細胞についてのＣａ2+イメージングトレースを示す。全ての細胞を、酵素アデニル酸シクラーゼＡＣＩＩＩの薬理学的活性化因子であるフォルスコリン（ｆｏｒｋ）２０μΜでも刺激し、それにより細胞の生存能力および神経細胞の特定を確認した。ｘ軸上の時間スケール単位は６秒のフレームである。平均蛍光強度は、レシオメトリックな３４０／３８０ｎｍの記録の結果としての相対的な蛍光単位である。
【００６９】
実施例２
インドールおよびスカトール感受性細胞からのｍＲＮＡの単離および増幅による、インドールおよびスカトール感受性受容体に関する「悪臭受容体」遺伝子のｃＤＮＡ配列の作成
実施例１の活性化された嗅神経細胞をガラス吸引マイクロピペットを用いて単離した後に、引き続き、応答細胞中のｍＲＮＡとして発現された匂い物質受容体遺伝子を特定するためにプールして１つのサンプルとした。悪臭受容体遺伝子配列を、次のようにインドールおよびスカトール感受性細胞から特定した：１種以上の悪臭化合物によって活性化される５種超の嗅神経細胞（各６、１０、１５および１５の細胞）の４つの組を、マイクロマニピュレーターに取り付けられたガラス微小電極を用いて単離した。マイクロピペットはホウケイ酸ガラス（品目＃Ｂ１５０−８６−１０、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）から設計され、かつ次の条件下で微小電極プラー（Ｐ−１０００型、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて引かれたものである：熱、傾斜温度＋２０℃；Ｐｕｌｌ＝０、Ｖｅｌ＝１２０；圧力＝５００。引かれたピペットチップを手ではずし、かつカルシウムイメージングアッセイにおいて決定される際にインドールおよびスカトールにより活性化される嗅神経細胞を単離するためにＮｅｗｐｏｒｔマイクロマニピュレーター（ＭＷ３Ｒ型）上に固定した。活性化されたＯＳＮを、マイクロピペットの後端に適用される穏やかな吸引により単離した。
【００７０】
神経細胞のｍＲＮＡをＥｂｅｒｗｉｎｅ法に従って精製および増幅した（ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ＩＩ  ａＲＮＡ  ｋｉｔ  −  Ａｍｂｉｏｎ，  ＡＭ１７５１）。プールされた神経細胞を再懸濁バッファー中で１０分間にわたって７５℃に加熱し（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｃＤＮＡ  ｓｙｓｔｅｍ，  ４６−６３２１−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、それによって細胞膜を破壊し、かつそのｍＲＮＡを増幅できるようにした。Ｅｂｅｒｗｉｎｅ法（インビトロ転写）による線形的増幅によって、発現される遺伝子の相対的転写レベルの維持を保証する。第１鎖ｃＤＮＡを、Ａｍｂｉｏｎキットに従って４２℃で２時間にわたるインキュベーションを行って得た。第２鎖ｃＤＮＡの合成を、１６℃で２時間にわたる第２のインキュベーション後に同一のキットを用いて行った。２本鎖ｃＤＮＡを、対応するｃＲＮＡを生成するためのテンプレートとして使用し（３７℃で１４時間のインキュベーション）、その後これを精製した。このｃＲＮＡ合成ステップを第２のＩＶＴのために繰り返した。一晩（１４時間）のインビトロ転写を連続して２回行うことにより、十分な量のｃＲＮＡを得た；次に、増幅されたｃＲＮＡを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙを作成した。その後、全トランスクリプトームの配列を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により得た。
【００７１】
ＮＧＳの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、マウス悪臭、特にインドールおよび／またはスカトールの嗅覚受容体を特定した。このために、得られたＮＧＳ由来の１５０の塩基対の短い配列（一般にリードと称される）をマウスのリファレンスゲノム（例えば、ＵＣＳＣのバージョンｍｍ９またはｍｍ１０など）に対してアライメントすることにより、これらの細胞の完全なトランスクリプトームを形成した。このトランスクリプトームデータの定量的解析によって、転写された匂い物質受容体遺伝子およびそのそれぞれの発現レベルのリストを得た。高レベルのｍＲＮＡを示す（リードが多い）かまたは複数の複製試験において存在する匂い物質受容体遺伝子を候補インドールおよびスカトール受容体と考え、これを図３に示す。図３は、４つの独立したスカトール／インドール細胞ピッキング試験からの代表的なＮＧＳの結果をまとめたものである。この棒グラフは、視覚的検査後に保持された極めて多いｍＲＮＡを有する候補インドール／スカトールＯＲ遺伝子を表す。Ｙ軸は、１サンプル当たりにピッキングされたＯＳＮの数を考慮した、ＯＭＰ  ｍＲＮＡのレベルに正規化されたｍＲＮＡの量レベルを表す。星印（＊）は、受容体を複数の試験で特定したことを示す。ＯＭＰ（嗅覚マーカータンパク質）は、成熟した嗅神経細胞のための特定のバイオマーカーである。上記の通りカルシウムイメージングおよびＮＧＳを組み合わせることによって、以下の５種の受容体配列を、推定マウスインドールおよびスカトールＯＲとして特定した：Ｏｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）、Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）、Ｏｌｆｒ７４１（配列番号３および配列番号４）、Ｏｌｆｒ７４３（配列番号５および配列番号６）およびＯｌｆｒ７４５（配列番号７および配列番号８）。
【００７２】
実施例３
マウスおよびヒトの悪臭受容体の特定
カルシウムイメージングとＮＧＳとの組み合わせによりマウスゲノムにおける約１，２００種のＯＲのうち５種のマウスインドールおよびスカトールＯＲのサブセットを特定することによって（実施例１、２）、インシリコ法による付加的なマウスおよび新規のヒトインドールおよびスカトールＯＲの迅速な特定が可能となる。類似する全体的なアミノ酸同一性を有するＯＲは、類似の匂い物質応答プロファイルを示すものと考えられるため［Adipietro et al. (2012)］、候補インドールおよびスカトールＯＲのリストを、カルシウムイメージングにより単離されたインドール／スカトール感受性嗅神経細胞のＮＧＳ解析に由来するマウスＯＲ配列を用いた公共のマウスおよびヒトゲノムデータベースの検索により拡張した。ＮＧＳの結果を同種のリファレンスゲノム配列と比較することにより、マウス悪臭嗅覚受容体を特定した。推定悪臭受容体は、嗅神経細胞由来のＮＧＳサンプル中でｍＲＮＡが極めて高レベルの量であるか、または、複数の独立した生物学的複製において存在するが１種以上の悪臭に応答する嗅神経細胞を含まない対照サンプル中には存在しない。標準的なバイオインフォマティクスツールを使用して、相同配列受容体は類似の機能を保持するという仮定の下で（Adipietro et al. (2012)）、推定哺乳動物（非ヒト）の１種以上の悪臭受容体に極めて密接に関連する１種以上のヒト匂い物質受容体を特定した。ＢＬＡＳＴＰおよび／またはＢＬＡＳＴＮアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いた。第１表に、特定されたマウス匂い物質受容体（ＯＲ）および予測ヒトオーソログを挙げる。
【００７３】
【表１】
2019004883.tif 000016
【００７４】
関連するヒトタンパク質配列は、第１表に挙げたＮＧＳで特定されたマウスＯＲ配列に対して少なくとも６０％の配列同一性の範囲内にある。同一性レベルは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム後のアミノ酸配列のペアワイズ比較に関連して与えられる。２６種の新規のヒトおよびマウスのＯＲを、公共のゲノムデータベースのＢＬＡＳＴＰ検索（デフォルトパラメーター）によって特定した。１６種が、ＮＧＳ由来遺伝子Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）、７４１（配列番号３および配列番号４）、７４３（配列番号５および配列番号６）、７４５（配列番号７および配列番号８）に密接に関連していた。これらは７４０ファミリーを構成する。１０種が、ＮＧＳ由来受容体Ｏｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）に密接に関連していた。これらはＯｌｆｒ６６５ファミリーを構成する。図４は、候補マウスインドールおよびスカトールＯＲ遺伝子と、Ｏｌｆｒ７４０（図４Ａ）およびＯｌｆｒ６６５（図４Ｂ）受容体ファミリーに属するそれらの予測ヒトオーソログとの系統学的関係を示す。この関係は、タンパク質配列に基づく近隣結合法による系統樹の再構成により得られたものである。対応するヒトオーソログを矢印で示す。偽遺伝子であるとの注釈が付されたヒトＯＲ遺伝子名に「Ｐ」の印を付した。偽遺伝子は非機能性であるものと考えられる。ＯＲ１１Ｈ７Ｐは、既知の機能対立遺伝子を有する分離偽遺伝子（ＳＰ）である。ダイヤ形（◇）は、ＮＧＳにより最初に特定された受容体を示す。追加候補のマウスおよびヒトのインドールおよびスカトールＯＲに関するアミノ酸同一性を決定するために、完全長のタンパク質配列を、全ＯＲレパートリーにわたって高度に保存されたアミノ酸モチーフに基づいて手動でアライメントした（Ｂｉｏｅｄｉｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｏｏｌ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．０．５．３）。第２表に、マウスＯｌｆｒ７４０ファミリーに関するペアごとのアミノ酸同一性およびそれらの予測ヒトオーソログを示す。第３表に、マウスＯｌｆｒ６６５ファミリーに関するペアごとのアミノ酸同一性およびそれらの予測ヒトオーソログを示す。
【００７５】
【表２】
2019004883.tif 000017
【００７６】
【表３】
2019004883.tif 000018
【００７７】
実施例４
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのマウスＯＲ  Ｏｌｆｒ７４３、Ｏｌｆｒ７４６およびＯｌｆｒ７４０のインドールおよびスカトール活性
インドールおよびスカトールの双方の悪臭に対する、候補マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）、Ｏｌｆｒ７４３（配列番号５および配列番号６）およびＯｌｆｒ７４６（配列番号３７および配列番号３８）の活性を、細胞ベースのｃＡＭＰアッセイで確認した。図５Ａおよび５Ｂにおいて、タグ付きＦＬＡＧ−Ｒｈｏ（配列番号１８）、Ｏｌｆｒ７４３（配列番号６）およびＯｌｆｒ７４０（配列番号２）ｃＤＮＡ配列を、Ｇαolf（配列番号２１）と共に共トランスフェクションし、かつインドール（左）またはスカトール（右）の濃度増加に曝露した。図５Ｃおよび５Ｄは、インドールおよびスカトールを用いた場合のＯｌｆｒ７４０（配列番号２）の活性およびＯｌｆｒ７４３（配列番号６）の活性が類似していることを示す反復試験である。図５Ｅにおいて、タグ付きＦＬＡＧ−Ｒｈｏ（配列番号１８）、Ｏｌｆｒ７４６（配列番号３８）ｃＤＮＡ配列を、Ｇαolf（配列番号２１）と共に共トランスフェクションし、かつインドールまたはスカトールの濃度増加に曝露した。匂い物質誘発活性を、ＨＴＲＦアプローチ（ＣｉｓＢｉｏキット）を用いて、細胞質ゾル内ｃＡＭＰレベルの測定により検出した。受容体活性の用量依存性増加を、双方の分子に対して３種全ての受容体に関して示す。Ｇαolf（配列番号２１）単独（受容体なし）を用いたＨＥＫ細胞の共トランスフェクションを、非特異的活性についての対照として使用した（対照）。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正ＨＴＲＦ比と定義される。結果を図５に示す。３種全ての受容体は、悪臭化合物に対する特異的な用量依存的活性を示し、かつそれ自体で、こうした化合物に対する受容体を特定するための方法の正当性を実証している。マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）およびＯｌｆｒ７４３（配列番号５および配列番号６）を、インドールおよびスカトールの双方に応答した単離された嗅神経細胞から特定した。マウス受容体Ｏｌｆｒ７４６（配列番号３７および配列番号３８）を、Ｏｌｆｒ７４０（配列番号２）およびＯｌｆｒ７４３（配列番号６）を検索配列として使用したデータベースマイニングによってインシリコで特定した。これらの受容体を、そのＮ末端でＦＬＡＧタグで修飾し、かつウシロドプシン受容体の最初の２０のアミノ酸（配列番号１８）を一過的にＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、かつ別々にインドールおよびスカトールで刺激することによって、それらが真のインドール／スカトール受容体であることを確認した。ヒトＧαサブユニットＧαolf（配列番号２１）の共発現によってＧｓ伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部ｃＡＭＰが増加する。この結果は、Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）、Ｏｌｆｒ７４３（配列番号５および配列番号６）およびＯｌｆｒ７４６（配列番号３７および配列番号３８）がインドール−スカトール受容体であることを裏付けるものである。
【００７８】
実施例５
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのヒトＯＲ５２Ｎ２、ＯＲ１１Ｇ２、ＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ４Ｃ１５、ＯＲ８Ｓ１、ＯＲ１１Ｈ６およびＯＲ１１Ｈ４、並びにマウスＯｌｆｒ６６５およびＯｌｆｒ７４０のインドールおよびスカトール活性
候補ヒトインドールおよびスカトール悪臭受容体ＯＲ５２Ｎ２（配列番号１１および配列番号１２）、ＯＲ１１Ｇ２（配列番号１３および配列番号１４）、ＯＲ５ＡＣ２（配列番号７５および配列番号７６）、ＯＲ４Ｃ１５（配列番号７９および配列番号８０）、ＯＲ８Ｓ１（配列番号８３および配列番号８４）、ＯＲ１１Ｈ６（配列番号１５および配列番号１６）およびＯＲ１１Ｈ４（配列番号４９および配列番号５０）、並びに候補マウスインドールおよびスカトール悪臭受容体Ｏｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）およびＯｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）の活性を、細胞ベースのカルシウムフラックスアッセイにおいて確認した（図６）。細胞で安定的に共発現するＲｈｏタグ付きヒトＯＲ５２Ｎ２（図６Ａ、Ｂ）またはＯＲ１１Ｇ２（図６Ｃ）およびＧαolf（配列番号２５）を、スカトールまたはインドールの濃度増加に曝露した。図６Ｂは、インドールおよびスカトールを用いたＯＲ５２Ｎ２の類似の活性を示す反復試験である。匂い物質誘発ＯＲ５２Ｎ２またはＯＲ１１Ｇ２活性を、匂い物質曝露後の最大のＣａｌｃｉｕｍ５色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）蛍光変化を測定することによって検出した。図６Ａにおいては、活性は、この試験における最も高い相対的蛍光単位（ＲＦＵ）に正規化されたベースライン補正ＲＦＵ比と定義される。図６Ｂ〜Ｊにおいては、受容体活性の測定に相対的蛍光単位を用いる。受容体活性の用量依存的増加を記録し、かつ対応する用量反応曲線を双方の化合物について示す。受容体を欠く細胞株、例えばｈＯＲ５２Ｎ２を、高濃度での非特異的活性についての対照として用いた（「インドール対照」および「スカトール対照」）。ヒト受容体ＯＲ５２Ｎ２（配列番号１１および配列番号１２）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体であるマウスＯｌｆｒ６６５（配列番号１０）に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体ＯＲ１１Ｇ２（配列番号１３および配列番号１４）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離されたインドール／スカトール受容体であるマウスＯｌｆｒ７４０（配列番号２）に対するその配列類似性ゆえに特定した。これらの受容体をＲｈｏ配列で修飾し、かつＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で安定的に発現させた。さらなる例として、ヒト受容体ＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ４Ｃ１５、ＯＲ８Ｓ１、ＯＲ１１Ｈ６、ＯＲ１１Ｈ４、並びにマウス受容体Ｏｌｆｒ６６５およびＯｌｆｒ７４０に関するインドールおよびスカトールの用量反応曲線を示す（図６Ｄ−Ｊ）。ヒト受容体ＯＲ５ＡＣ２（配列番号７５および配列番号７６）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスＯｌｆｒ２０７（配列番号７８）に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体ＯＲ４Ｃ１５（配列番号７９および配列番号８０）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスＯｌｆｒ１２１１（配列番号８２）に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体ＯＲ８Ｓ１（配列番号８３および配列番号８４）を、インドールおよびスカ��ールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスＯｌｆｒ２５７（配列番号８６）に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体ＯＲ１１Ｈ６（配列番号１５および配列番号１６）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるマウスＯｌｆｒ７４５（配列番号８）に対するその配列類似性ゆえに特定した。ヒト受容体ＯＲ１１Ｈ４（配列番号４９および配列番号５０）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する嗅神経細胞から単離された受容体であるＯｌｆｒ７４６（配列番号３８）に対するその配列類似性ゆえに特定した。マウス受容体Ｏｌｆｒ６６５（配列番号９および配列番号１０）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのＮＧＳデータから直接特定した。マウス受容体Ｏｌｆｒ７４０（配列番号１および配列番号２）を、インドールおよびスカトールの双方に応答する単離された嗅神経細胞からのＮＧＳデータから直接特定した。ヒトＧαサブユニットＧα15の共発現によってＧｑ伝達経路が活性化され、これによって適したリガンドへの結合時に内部Ｃａ2+が増加する。この結果は、本明細書に開示された方法が、悪臭化合物に対する哺乳動物の匂い物質受容体の迅速かつ確実な特定に有用であることの実証に寄与する。
【００７９】
実施例６
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるインドール受容体Ｏｌｆｒ７４３の活性の阻害
本明細書に概説した手順を使用して特定した後に、得られた悪臭受容体細胞株を使用して、その活性と可能性として考えられるヒトの知覚とを調節する化合物の化学ライブラリーをスクリーニングすることができる。この試験を、実施例４と同一の条件下に行った。Ｒｈｏタグ付き（配列番号１８）Ｏｌｆｒ７４３（配列番号６）と共にトランスフェクトされた細胞を、３００μＭの２−アセトナフトンの存在下または不在下に、インドールの濃度増加に曝露した。２−アセトナフトンは、インドールに対するＯｌｆｒ７４３（配列番号６）の活性を阻害する。結果を第４表および図７に示す。アンタゴニスト化合物の存在下では用量反応曲線の右方向へのシフトが認められ、その結果、インドールに対してＥＣ５０が４倍増加する。活性は、この試験における最も高いシグナルに正規化されたベースライン補正ＨＴＲＦ比と定義される。この結果は、２−アセトナフトンがインドール受容体に結合して、この受容体の活性を阻害することを示している。
【００８０】
【表４】
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【外国語明細書】
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【配列表】
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