(57)【要約】【課題】抗癌療法としての正常細胞および腫瘍細胞の小分子ＴＲＡＩＬ遺伝子誘導を提供すること。【解決手段】ＴＩＣ１０に関する方法および組成物が本発明の態様に従って記載される。その組成物および方法は、疾患、特に癌の処置を必要とする被験体（ヒト被験体ならびに他の種の被験体を含む）において、そのような疾患を処置する際の有用性を有する。その組成物は、脳腫瘍の処置を必要とする被験体において脳腫瘍を処置する際の有用性を有する。本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０またはその薬学的に許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物；および薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１１年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／４８０，７４３号の優先権を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
支援への参照
本願は、国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｕ５４ＣＡ１０５００８の下、政府支援により成された。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、癌などの増殖性疾患の処置を必要とする被験体においてそのような疾患を処置するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ；Ａｐｏ２Ｌ）は、癌細胞のアポトーシスを選択的に誘導する内因性タンパク質である。
【０００５】
ＴＲＡＩＬは、外因性または内因性のアポトーシス経路の関与による、細胞表面のアポトーシス促進性デスレセプター４（ＤＲ４；ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）およびデスレセプター５（ＤＲ５；ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）を介した、幅広いヒト癌細胞株におけるアポトーシスの強力な誘導因子である。ＴＲＡＩＬは、免疫監視機構による腫瘍抑制において直接的な役割を果たすが、この抗腫瘍機序は、この疾患の進行中は失われる。ＴＲＡＩＬが癌細胞のアポトーシスを選択的に惹起する能力は、その２つのアポトーシス促進性デスレセプターのいずれかを標的にしている組換えＴＲＡＩＬおよびより長寿命のＴＲＡＩＬアゴニスト抗体の投与を用いた進行中の臨床試験に進んでいる。
【０００６】
組換えＴＲＡＩＬは、その潜在能力にもかかわらず、有効性を制限する特性（例えば、短い血清半減期、安定性、コストおよび送達）を有する。組換えＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬアゴニスト抗体の脳への送達は、組換えＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬアゴニスト抗体が血液脳関門を越えることができないことによって制限される。
【０００７】
抗癌性の組成物および方法が引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明の態様によると、本明細書中でＴＩＣ１０とも呼ばれる
【０００９】
【化１−１】
2019019145.tif 000002
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物が提供される。その組成物は、疾患の処置を必要とする被験体（ヒト被験体ならびに他の種の被験体を含む）においてそのような疾患を処置する際の有用性を有する。その組成物は、癌の処置を必要とする被験体（ヒト被験体ならびに他の種の被験体を含む）において癌を処置する際の有用性を有する。
【００１０】
本発明の態様によると、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；薬学的に許容され得るキャリア；ならびに第２の治療薬を含む薬学的組成物が提供される。
【００１１】
本発明の態様によると、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；薬学的に許容され得るキャリア；ならびに第２の抗癌剤を含む薬学的組成物が提供され、ここで、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグは、第１の抗癌剤である。
【００１２】
本発明の態様によると、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；薬学的に許容され得るキャリア；ならびに有糸分裂抑制剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００１３】
本発明の態様によると、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；薬学的に許容され得るキャリア；ならびにパクリタキセル、ドセタキセルまたはそれらの組み合わせを含む薬学的組成物が提供される。
【００１４】
本発明の態様によると、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；薬学的に許容され得るキャリア；ならびに抗血管新生剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００１５】
本発明の態様によると、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；薬学的に許容され得るキャリア；ならびにベバシズマブを含む薬学的組成物が提供される。
【００１６】
本発明の態様によると、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを含む、経口投与用に製剤化された薬学的組成物が提供される。
【００１７】
本発明の態様によると、処置の必要のある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含する。
【００１８】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含する。
【００１９】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０；および薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含する。
【００２０】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０の薬学的に許容され得る誘導体；および薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含する。
【００２１】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る塩、エステル、アミド、水和物および／または溶媒和物；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含する。
【００２２】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０またはその薬学的に許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物；および薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含する。
【００２３】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含し；さらに、その被験体から得られたサンプル中のＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドをアッセイして、その処置の効果を評価する工程を包含する。
【００２４】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含し；さらに、その被験体から得られた血液、血清、血漿または脳脊髄液サンプル中のＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドをアッセイして、その処置の効果を評価する工程を包含する。
【００２５】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含し；さらに、治療有効量の第２の抗癌剤を投与する工程を包含し、ここで、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグは、第１の抗癌剤である。
【００２６】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含し；さらに、治療有効量の抗有糸分裂剤を投与する工程を包含する。
【００２７】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含し；さらに、治療有効量のパクリタキセル、ドセタキセル、ベバシズマブまたはそれらの任意の２つ以上を投与する工程を包含する。
【００２８】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアの経口投与を包含する。
【００２９】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含し、ここで、その投与は、直腸、鼻、肺、硬膜外、眼球、耳、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨内、髄腔内、膀胱内、皮下、局所的、経皮的、経粘膜的、舌下、頬側、膣および吸入の投与経路からなる群から選択される経路による投与である。
【００３０】
本発明の態様によると、脳腫瘍を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを投与する工程を包含する。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
【化１４−１】
2019019145.tif 000003
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物。
（項目２）
第２の治療薬をさらに含む、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目３）
前記第２の治療薬が、抗癌剤である、項目２に記載の薬学的組成物。
（項目４）
前記抗癌剤が、有糸分裂抑制剤である、項目３に記載の薬学的組成物。
（項目５）
前記抗癌剤が、パクリタキセル、ドセタキセルおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３に記載の薬学的組成物。
（項目６）
前記第２の治療薬が、抗血管新生剤である、項目２に記載の薬学的組成物。
（項目７）
前記抗血管新生剤が、ベバシズマブである、項目６に記載の薬学的組成物。
（項目８）
経口投与用に製剤化されたものである、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目９）
処置を必要とする被験体を処置する方法であって、
薬学的に有効な量の
【化１２】
2019019145.tif 000004
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアの投与を包含する、方法。
（項目１０）
前記被験体から得られたサンプル中のＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドをアッセイする工程をさらに包含する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記被験体が、癌を有するかまたは有するリスクがある、項目９に記載の方法。
（項目１２）
追加の抗癌剤の投与をさらに包含する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記追加の抗癌剤が、抗有糸分裂剤である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記追加の抗癌剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、ベバシズマブまたはそれらの任意の２つ以上である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記被験体から得られた血液サンプルにおいて、増加したＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドがアッセイされる、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記投与が、経口投与である、項目９に記載の方法。
（項目１７）
前記投与が、直腸、鼻、肺、硬膜外、眼球、耳、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨内、髄腔内、膀胱内、皮下、局所的、経皮的、経粘膜的、舌下、頬側、膣および吸入の投与経路からなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目１８）
脳腫瘍を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法であって、
薬学的に有効な量の
【化１３】
2019019145.tif 000005
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアの投与を包含する、方法。
（項目１９）
処置を必要とする被験体を処置する方法であって、
薬学的に有効な量の
【化１４】
2019019145.tif 000006
、その薬学的に許容され得る塩、エステル、アミド、水和物または溶媒和物；および薬学的に許容され得るキャリアの投与を包含する、方法。
（項目２０）
癌を処置するための医薬を製造するための、
【化１５】
2019019145.tif 000007
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグの使用。
（項目２１）
癌を処置するための化合物
【化１６】
2019019145.tif 000008
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ。
（項目２２）
実質的に本明細書中に記載されるような薬学的組成物。
（項目２３）
実質的に本明細書中に記載されるような処置方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、転写開始の上流のヒトＴＲＡＩＬ遺伝子プロモーターの最初の５０４塩基対の転写調節下のＨＣＴ１１６  Ｂａｘ−／−細胞におけるルシフェラーゼレポーターの活性を示しているグラフである；
【図２】図２は、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ解析を示しているグラフである；
【図３】図３は、癌細胞のパネルにおける、ＴＩＣ１０によって誘導された表面ＴＲＡＩＬレベルを示しているグラフである；
【図４】図４は、表示の条件および時点における、ＴＩＣ１０処置後のＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞における表面ＴＲＡＩＬレベルを示しているグラフである；
【図５】図５は、ＴＩＣ１０処置開始の７２時間後における、フローサイトメトリーによるＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−ＴＲＡＩＬ表面レベルを示しているグラフである；
【図６】図６は、ＴＩＣ１０で処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−およびヒト包皮線維芽（ＨＦＦ）細胞の細胞周期プロファイルを示している；
【図７】図７は、ＴＩＣ１０で処理された癌細胞のコロニー形成アッセイの定量を示しているグラフである；
【図８】図８は、終了時点においてＨＦＦ細胞を数えたこと以外は図７におけるような類似の実験を示しているグラフである；
【図９】図９は、ＤＭＳＯ、ＴＩＣ１０またはｒｈＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）による処理後の、ＨＣＴ１１６  ＷＴ、ｐ５３−／−およびＢａｘ−／−細胞のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである；
【図１０】図１０は、ウエスタンブロット解析の結果を示している像である；
【図１１】図１１は、ｚＶＡＤ−ｆｍｋとともにプレインキュベートされたまたはｚＶＡＤ−ｆｍｋなしでプレインキュベートされた、ＴＩＣ１０処理癌細胞のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである；
【図１２】図１２は、短ヘアピンＲＮＡによってＴＲＡＩＬが安定的にノックダウンされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである；
【図１３】図１３は、ＴＩＣ１０処理細胞のフローサイトメトリー解析による、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｓｈＴＲＡＩＬノックダウンの実証を示しているグラフである；
【図１４】図１４は、内因性のＤＲ５、またはそのデスドメインがＥＧＦＰで置き換えられたＤＲ５構築物の過剰発現を有するＨ４６０細胞における、ＴＩＣ１０によって誘導された細胞死のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである；
【図１５】図１５は、ＴＲＡＩＬ隔離抗体であるＲＩＫ−２の存在下または非存在下においてＤＭＳＯ、ＴＩＣ１０またはｒｈＴＲＡＩＬで処理されたＨＣＴ１１６細胞のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである；
【図１６】図１６は、摘出されたばかりのヒト結腸癌細胞を用いたときの、ＴＩＣ１０によって誘導された表面ＴＲＡＩＬを示しているグラフである；
【図１７】図１７は、ＤＭＳＯ、ＴＩＣ１０または５−ＦＵで処理された、図１６の初代結腸癌細胞の細胞生死判別アッセイの結果を示しているグラフである；
【図１８】図１８は、ＴＩＣ１０またはｒｈＴＲＡＩＬが、表示の温度における１時間のプレインキュベート後のＨＣＴ１１６細胞の細胞生存率を低下させることができることを示しているグラフである；
【図１９】図１９は、ＴＩＣ１０、ＴＲＡＩＬまたはビヒクルで処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−異種移植片を示しているグラフである；
【図２０】図２０は、ＴＩＣ１０またはビヒクルで処理されたルシフェラーゼ感染ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−異種移植片の生物発光イメージングの結果を示しているグラフである；
【図２１】図２１は、ＴＩＣ１０、ＴＲＡＩＬまたはビヒクルで処理されたＲＫＯ異種移植片を示しているグラフである；
【図２２】図２２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ベクターまたはｓｈＴＲＡＩＬ異種移植片における、ＴＩＣ１０、ＴＲＡＩＬまたはビヒクルでの処理開始後９日目の腫瘍体積の箱ひげ図である；
【図２３】図２３は、ＴＲＡＩＬ、ＴＩＣ１０またはＤＭＳＯで処理されたＤＬＤ−１異種移植片の相対的な腫瘍体積を示しているグラフである；
【図２４】図２４は、ＳＷ４８０異種移植片におけるＴＩＣ１０のｉ．ｐ．投与と経口投与との比較を示しているグラフである；
【図２５】図２５は、ＨＣＴ１１６異種移植片において経口での単回投与として投与されたＴＩＣ１０またはビヒクルを示しているグラフである；
【図２６】図２６は、単回投与のＴＩＣ１０で処置された無胸腺雌ヌードマウスの体重を示しているグラフである；
【図２７】図２７は、経口ＴＩＣ１０による処置の第４週の終わりにおけるＣ５７／Ｂ６雌マウスの体重を示しているグラフである；
【図２８】図２８は、第９〜１２週の間に毎週、経口ＴＩＣ１０で処置されたΕμ−ｍｙｃの全生存を示しているグラフである；
【図２９】図２９は、パクリタキセルとともにＴＩＣ１０で処理されたＤＬＤ−１細胞の細胞生存率を示しているグラフである；
【図３０】図３０は、パクリタキセルとともにＴＩＣ１０で処理されたＳＷ６２０細胞の細胞生存率を示しているグラフである；
【図３１】図３１は、タキソテールとともにＴＩＣ１０で処理されたＤＬＤ−１細胞の細胞生存率を示しているグラフである；
【図３２】図３２は、タキソテールとともにＴＩＣ１０で処理されたＳＷ６２０細胞の細胞生存率を示しているグラフである；
【図３３】図３３は、Ｈ４６０異種移植において、ＴＩＣ１０もしくはタキソテールの単独で、組み合わせで、またはビヒクルで処理した後に腫瘍組織を保持するコホートのパーセントを示しているグラフである；
【図３４】図３４は、図３３に対する相対的な腫瘍体積のプロットを示しているグラフである；
【図３５】図３５は、Ｈ４６０異種移植において、ＴＩＣ１０またはパクリタキセルの単独で、組み合わせで、またはビヒクルで処理した後に腫瘍組織を保持するコホートのパーセントを示しているグラフである；
【図３６】図３６は、図３５に対する相対的な腫瘍体積のプロットを示しているグラフである；
【図３７】図３７は、盲腸内にＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−腫瘍を移植され、ＴＩＣ１０、ベバシズマブまたはＴＩＣ１０とベバシズマブとの組み合わせで処置され、終了時点において原発および遠位の部位に明白な腫瘍を有したコホートのパーセントを示しているグラフである；
【図３８】図３８は、ビヒクル、ＴＩＣ１０、ベバシズマブまたはＴＩＣ１０とベバシズマブとの組み合わせで処置された、盲腸内ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−腫瘍を移植されたマウスの体重を示しているグラフである；
【図３９】図３９は、ＴＩＣ１０またはドキソルビシンの後の、腫瘍を有しないマウスにおけるＴＲＡＩＬ血清レベルを示しているグラフである；
【図４０】図４０は、２３９ｎｍにピーク吸光度を有するＴＩＣ１０の吸光度プロファイルを示しているグラフである；
【図４１】図４１は、マウス血漿に添加され、ＨＰＬＣ解析によって曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して定量された、ＴＩＣ１０に対する検量線を示しているグラフである；
【図４２】図４２は、Ｃ５７／Ｂ６雌マウスに静脈内投与した後のＴＩＣ１０の血漿濃度を示しているグラフである；
【図４３】図４３は、ＴＩＣ１０処置（左から右に向かって０、２．５、５または１０μＭ）後のＨＦＦ細胞の表面ＴＲＡＩＬの解析を示しているグラフである；
【図４４】図４４は、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞と前処理されたＨＦＦとの共培養物のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである；
【図４５】図４５は、ＴＩＣ１０とともにインキュベートした後のＧＢＭ細胞株における表面ＴＲＡＩＬを示しているグラフである；
【図４６】図４６は、ＴＩＣ１０またはＤＭＳＯによる処置の７２時間後における表示のＧＢＭ細胞株の細胞生死判別アッセイから外挿されたＧＩ５０値を示しているグラフである；
【図４７】図４７は、ＤＭＳＯ、ＴＩＣ１０またはテモゾロマイドで処理された摘出されたばかりの神経膠芽腫組織の細胞生死判別アッセイの結果を示している；
【図４８】図４８は、ビヒクル、ＴＩＣ１０またはベバシズマブの単回投与を受けたマウスのＴ９８Ｇの皮下異種移植片を示しているグラフである；
【図４９】図４９は、経口での単回投与のビヒクル、ＴＩＣ１０、ベバシズマブまたはＴＩＣ１０およびベバシズマブで処置された、ＳＦ７６７頭蓋内腫瘍を有するマウスの全生存を示しているグラフである；
【図５０】図５０は、ＤＭＳＯと比べて、ＴＩＣ１０処理の４８時間後におけるＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の遺伝子発現プロファイリングからのＦＯＸＯシグナル伝達に関連する転写の変化を示しているグラフである；
【図５１】図５１は、ＴＩＣ１０またはＤＭＳＯで処理されたＨＣＴ１１６細胞におけるＤＲ５のウエスタンブロット解析の像である；
【図５２】図５２は、ＴＩＣ１０で処理された癌細胞および正常細胞における表面ＤＲ５レベルのフローサイトメトリー解析を示しているグラフである；
【図５３】図５３は、ＤＭＳＯまたはＴＩＣ１０で処理されたＨＣＴ１１６細胞の細胞全体の可溶化物（Ｗ）ならびに細胞質（Ｃ）および核（Ｎ）の抽出物のウエスタンブロット解析の像である；
【図５４】図５４は、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるＴＩＣ１０処置（左から右に向かって０、２．５、５または１０μＭ）の４８時間後の、ＴＲＡＩＬプロモーターに対するＦｏｘｏ３ａのＴＩＣ１０誘導性移行についてのクロマチン免疫沈降アッセイの結果の像である；
【図５５】図５５は、ｓｉＲＮＡを使用したＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるＦｏｘｏ１および／またはＦｏｘｏ３ａの一過性ノックダウン有りまたは無しでのＴＩＣ１０によって誘導された細胞表面ＴＲＡＩＬレベルのフローサイトメトリー解析の結果を示しているグラフである；
【図５６】図５６は、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦｏｘｏ３ａの安定的なノックダウン有りまたは無しにおけるＴＩＣ１０誘導性細胞死のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである；
【図５７】図５７は、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦｏｘｏ３ａの安定的なノックダウン有りまたは無しにおけるＴＩＣ１０によって誘導される表面ＴＲＡＩＬのフローサイトメトリー解析を示しているグラフである；
【図５８】図５８は、ビヒクルまたはＴＩＣ１０の経口での単回投与後の、Ｆｏｘｏ３ａの安定的なノックダウン有りまたは無しにおけるＨＣＴ１１６異種移植片の腫瘍体積を示しているグラフである；
【図５９】図５９は、ＴＩＣ１０（２．５、５、１０μＭ）で７２時間処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞のウエスタンブロット解析の像である；
【図６０】図６０は、ＴＩＣ１０で処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞のウエスタンブロット解析の像である；
【図６１】図６１は、図６０におけるような反復実験のウエスタンブロットのデンシトメトリーによって測定された、ＴＩＣ１０によって誘導された効果のタンパク質発現レベルの時間経過を示しているグラフである；
【図６２】図６２は、ＤＬＤ１ヒト結腸癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞およびＴ９８Ｇヒト多形神経膠芽腫細胞株におけるＦｏｘｏ３ａに対するＴＩＣ１０によって誘導される効果のウエスタンブロット解析の像である；
【図６３】図６３は、ｍｙｒ−Ａｋｔの過剰発現を示しているウエスタンブロット解析の像である；
【図６４】図６４は、ＴＩＣ１０処置を受けた、空ベクターまたはミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｅｄ）Ａｋｔ（ｍｙｒ−Ａｋｔ）を過剰発現しているＨＣＴ１１６細胞における表面ＴＲＡＩＬのフローサイトメトリー解析を示しているグラフである；
【図６５】図６５は、ＴＩＣ１０処理を受けた、空ベクターまたはｍｙｒ−Ａｋｔを過剰発現しているＨＣＴ１１６細胞のｓｕｂ−Ｇ１含有量を示しているグラフである；
【図６６】図６６は、Ａ６７３０（Ａｋｔ  ｉｎｈ）、Ｕ０１２６モノエタノレート（ＭＥＫ  ｉｎｈ）またはその両方とともにインキュベートした後のＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ解析を示しているグラフである；
【図６７】図６７は、Ｆｏｘｏ３ａの安定的なノックダウン有りまたは無しでの、図６６におけるような表面ＴＲＡＩＬの誘導を示しているグラフである；
【図６８】図６８は、Ａｋｔ  ｉｎｈ、ＭＥＫ  ｉｎｈまたはその両方とともにインキュベートした後の、ｓｈＲＮＡによるＴＲＡＩＬノックダウンの有りまたは無しにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである；
【図６９】図６９は、Ａ６７３０（Ａｋｔ  ｉｎｈ）、Ｕ０１２６モノエタノレート（ＭＥＫ  ｉｎｈ）またはその両方とともにインキュベートした後のＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の表面ＴＲＡＩＬ解析を示しているグラフである；
【図７０】図７０は、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるＡｋｔおよび／またはＥＲＫの一過性ノックダウン後のＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ解析を示しているグラフである；
【図７１】図７１は、ウエスタンブロット解析による、ＡｋｔおよびＥＲＫノックダウンの確認を示している像である；
【図７２】図７２は、ＨＣＴ１１６細胞におけるＡｋｔおよび／またはＥＲＫの一過性ノックダウン後の表面ＴＲＡＩＬ解析を示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
本明細書中で使用される科学用語および専門用語は、当業者が通常理解している意味を有すると意図されている。そのような用語は、様々な標準的な参考文献中の文脈において定義され、使用されていると見出されており、そのような参考文献としては、例証的には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄ  Ｅｄ．，２００１；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；５ｔｈ  Ｅｄ．，２００２；Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ，２００２；Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｃｏｘ，Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００４；Ｅｎｇｅｌｋｅ，Ｄ．Ｒ．，ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：Ｎｕｔｓ  ａｎｄ  Ｂｏｌｔｓ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤＮＡ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ，Ｅａｇｌｅｖｉｌｌｅ，ＰＡ，２００３；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（Ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４；Ａ．Ｎａｇｙ，Ｍ．Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ，Ｒ．Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １５，２００２，ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５９１９；Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ（Ｅｄ．），Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００２；１８５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＩＳＢＮ：９７８０４７０１５１８０８が挙げられる。
【００３３】
単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、限定であると意図されておらず、別のことが明示的に述べられていないか、または文脈が明らかに別のことを示していない限り、複数の指示対象を含む。
【００３４】
ｐ５３は、しばしば後期の癌において不活性化され、それにより、５−ＦＵおよびドキソルビシンなどの多くの標準療法（ｓｔａｎｄａｒｄ−ｏｆ−ｃａｒｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）に対する抵抗性が引き起こされるので、本発明の態様に係る方法および組成物は、ｐ５３に依存しない機序によってＴＲＡＩＬ遺伝子をアップレギュレートするＴＲＡＩＬ誘導化合物に対するスクリーニングによってＴＲＡＩＬ遺伝子の小分子転写誘導因子として本発明者らが同定したＴＲＡＩＬ誘導化合物１０（ＴＩＣ１０）に関する。
【００３５】
ＴＩＣ１０は、正常細胞と癌細胞の両方においてＴＲＡＩＬの発現を誘導する。ＴＩＣ１０またはその薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／もしくはプロドラッグの効果を記載するために本明細書中で使用される用語「ＴＲＡＩＬの発現を誘導する」、「ＴＩＣ１０によって誘導されるＴＲＡＩＬ」およびそれらの文法上の等価物は、ＴＩＣ１０またはその薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／もしくはプロドラッグと接触した細胞によってＴＲＡＩＬの検出可能な増加がもたらされることを指す。ＴＲＡＩＬの検出可能な増加は、周知のタンパク質または核酸アッセイ方法を用いるＴＲＡＩＬタンパク質またはＴＲＡＩＬ核酸に対するアッセイによって測定され得る。
【００３６】
ＴＩＣ１０によって誘導されるＴＲＡＩＬは、癌細胞ならびに正常細胞および血清において持続され、癌細胞および腫瘍に対するＴＲＡＩＬ媒介性バイスタンダー効果をもたらす。ＴＩＣ１０は、ＡｋｔおよびＥＲＫを不活性化して、Ｆｏｘｏ３ａの核移行およびＴＲＡＩＬ転写の誘導をもたらす。
【００３７】
ＴＩＣ１０によって誘導されるＴＲＡＩＬは、Ｆｏｘｏ３ａに依存し、Ｆｏｘｏ３ａは、他の標的の中でもＴＲＡＩＬデスレセプターＤＲ５をアップレギュレートし、いくつかのＴＲＡＩＬ抵抗性腫瘍細胞の感作を可能にする。ＴＩＣ１０によって引き起こされるＴＲＡＩＬの誘導は、腫瘍細胞、間質細胞および宿主細胞において持続される。
【００３８】
本発明の態様によると、ＴＩＣ１０またはその薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／もしくはプロドラッグを含む薬学的組成物、ならびにそれらを使用するための方法が提供される。
【００３９】
本発明の態様によると、構造（Ｉ）の化合物を含む薬学的組成物が提供される。
【００４０】
【化２−１】
2019019145.tif 000009
構造（Ｉ）の化合物は、本明細書中でＴＲＡＩＬ誘導化合物１０（ＴＩＣ１０）およびＮＳＣ３５０６２５とも称される。
【００４１】
構造（Ｉ）の化合物（ＴＩＣ１０）は、商業的に得ることができるか、または標準的な化学的合成方法を用いて合成することができる。
【００４２】
本発明の態様に係る薬学的組成物は、構造（Ｉ）の化合物の薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグでもあり得る。
【００４３】
構造（Ｉ）の化合物の薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグは、商業的に得ることができるか、または標準的な化学的合成方法を用いて合成することができる。
【００４４】
構造（Ｉ）の化合物に関して使用される用語「薬学的に許容され得る誘導体」は、構造（Ｉ）の化合物が細胞においてＴＲＡＩＬの発現を誘導する示される活性を実質的に保持する、任意の置換可能な位置でさらに置換された構造（Ｉ）の化合物である。例えば、構造（Ｉ）の化合物は、以下：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、低級アルキル基、低級アルコキシ基またはフッ素化低級アルキル基（例えば、ＣＦ３）のうちの１つ以上によって任意の置換可能な位置で必要に応じてさらに置換される。
【００４５】
「薬学的に許容され得る」塩、エステル、アミド、水和物、プロドラッグまたは溶媒和物は、被験体に対して過度の毒性または刺激なくその被験体において使用するのに適しており、意図される使用法にとって有効である。
【００４６】
薬学的に許容され得る塩には、薬学的に許容され得る酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。薬学的に許容され得る塩は、当該分野で周知であり、例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：１−１９，１９７７に詳述されている塩である。例示的な薬学的に許容され得る塩は、被験体に対して過度の毒性または刺激なくその被験体において使用するのに適しており、かつそれらの意図される使用法にとって有効な塩であり、それらの塩は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸およびスルファミン酸）；有機酸（例えば、酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、酪酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、ジグルコン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリセロリン酸、ヘミ硫酸（ｈｅｍｉｓｕｌｆｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプタン酸、ヘキサン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸（イセチオン酸）、乳酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メシチレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、２−ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチン酸、フェニル酢酸、３−フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸およびウンデカン酸）；無機塩基（例えば、アンモニア、アンモニウムの水酸化物、炭酸塩および炭酸水素塩）；有機塩基（例えば、第１級、第２級、第３級および第４級アミン化合物、アンモニウム、アルギニン、ベタイン、コリン、カフェイン、ジオールアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェンアミン（ｅｐｈｅｎａｍｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、エタノールアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、１ｈ−イミダゾール、リジン、メチルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピペラジン、トロラミン、メチルグルカミン、プリン、ピペリジン、ピリジン、テオブロミン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびトリブチルアミン）ならびに金属カチオン（例えば、アルミニウム、カルシウム、銅、鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛）を用いて形成される。
【００４７】
薬学的に許容され得る溶媒和物としては、例証的に水和物、エタノラート、メタノラートが挙げられる。
【００４８】
例示的な薬学的に許容され得るアミドとしては、アンモニア、第１級Ｃ１−Ｃ６アルキルアミンおよび第２級Ｃ１−Ｃ６ジアルキルアミンから得られるアミド（５または６員の窒素含有複素環の形態のアミドを含む）が挙げられる。
【００４９】
ＴＩＣ１０プロドラッグは、インタクトな活性ＴＩＣ１０をもたらす、ＴＩＣ１０から放出される部分に共有結合的に結合したＴＩＣ１０の形態である。プロドラッグの形態は、Ｓｌｏａｎ，Ｋ．Ｂ．，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；およびＴｅｓｔａ，Ｂ．ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｚｕｒｉｃｈ，２００３において例証されているように当該分野で周知である。
【００５０】
第１の治療薬として
【００５１】
【化３−１】
2019019145.tif 000010
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；薬学的に許容され得るキャリア；ならびに抗癌剤などの第２の治療薬を含む薬学的組成物が提供される。
【００５２】
本発明の態様によると、処置の必要のある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量の：
【００５３】
【化４−１】
2019019145.tif 000011
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアの投与を包含する。
【００５４】
処置の必要のある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、その被験体においてＴＲＡＩＬの発現を誘導するのに有効な、薬学的に有効な量の
【００５５】
【化５】
2019019145.tif 000012
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアの投与を包含する。
【００５６】
ＴＲＡＩＬタンパク質を、被験体から得られた試験サンプルにおいてアッセイすることにより、ＴＩＣ１０によって誘導されたＴＲＡＩＬの発現が検出され得る。
【００５７】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫濾過アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、フローサイトメトリー、免疫ブロット、免疫沈降、免疫組織化学、免疫細胞化学、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）およびラジオイムノアッセイを含むがこれらに限定されないイムノアッセイ方法が、サンプル中のＴＲＡＩＬをアッセイするために使用され得る。定性的および／または定量的な結果を得るためのアッセイ方法が使用され得る。サンプルの定性的アッセイと定量的アッセイの両方に適したアッセイ方法の具体的な詳細は、標準的な参考文献に記載されており、そのような参考文献としては、例証的には、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８；Ｆ．Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄｕｅｂｅｌ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９；Ｈ．Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０００；Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００３；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｗｉｌｅｙ，２００２；Ｓ．Ｋｌｕｓｓｍａｎ，Ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，２００６；Ｏｒｍｅｒｏｄ，Ｍ．Ｇ．，Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；Ｇｉｖａｎ，Ａ．Ｌ．，Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ｆｉｒｓｔ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１；Ｇｏｒｃｚｙｃａ，Ｗ．，Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ−ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，２００６；Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；Ｗｉｌｄ，Ｄ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５およびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  ���ｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，２００１が挙げられる。
【００５８】
アプタマーは、ＴＲＡＩＬについてサンプルをアッセイするために使用され得る。用語「アプタマー」とは、特定の物質に実質的に特異的に結合するペプチドおよび／または核酸のことを指す。核酸アプタマーの場合、そのアプタマーは、第２および／または第３の核酸とのＷａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対形成または三重らせん結合以外の、標的との結合相互作用によって特徴付けられる。そのような結合相互作用としては、例えば、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、水素結合および／または静電相互作用が挙げられ得る。同様に、ペプチドベースのアプタマーは、標的との特異的結合によって特徴付けられ、ここで、そのアプタマーは、その標的に対する天然に存在するリガンドではない。ペプチドアプタマーおよび核酸アプタマーの同定および作製のための手法ならびにそれらの使用は、例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｗｉｌｅｙ，２００２；Ｓ．Ｋｌｕｓｓｍａｎ，Ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，２００６；およびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，２００１に記載されているように当該分野で公知である。
【００５９】
ＴＲＡＩＬについてサンプルをアッセイするために分光分析が使用される。例えば、質量分析が、本発明の態様に係るアッセイにおいて使用され得る。質量分析は、例えば、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析を用いて行われる。質量分析の手法は、当該分野で公知であり、タンパク質および／またはペプチドアッセイのための方法の例示的な詳細な説明は、Ｌｉ  Ｊ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．，４８（８）：１２９６−３０４，２００２；Ｈｏｒｔｉｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５２：１２２３−１２３７，２００６；Ｈｏｒｔｉｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５２：１２２３−１２３７，２００６；Ａ．Ｌ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら（Ｅｄｓ．），Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；およびＤ．Ｍ．Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０に見られる。
【００６０】
細胞の表面におけるＴＲＡＩＬの局在性をアッセイすることにより、本発明の薬学的組成物の効果が検出され得る。ＴＲＡＩＬの局在性の検出は、フローサイトメトリーなどのイムノアッセイならびに免疫組織化学によって行われ得る。
【００６１】
試験サンプルは、被験体の任意の生体液、細胞または組織（例証的には、血液、血漿、血清、尿、唾液、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、脳脊髄液、脳室液、胸膜液、肺および気管支肺胞洗浄液サンプル、粘液、汗、涙、精液、膀胱洗浄サンプル、羊水、リンパ液、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、滑液、骨髄穿刺液、腫瘍細胞または組織、器官細胞または組織（例えば、生検材料）を含む）であり得る。好ましい態様において、試験サンプルは、血液、血漿または血清である。
【００６２】
被験体由来の試験サンプルは、必要に応じて、ＴＲＡＩＬまたは他のバイオマーカーのアッセイのために精製される。試験サンプルの文脈における用語「精製される」とは、試験サンプルに存在する少なくとも１つの他の構成要素からのＴＲＡＩＬまたは別のバイオマーカーの分離のことを指す。試験サンプルの精製は、例証的に電気泳動的方法（例えば、ゲル電気泳動および２−Ｄゲル電気泳動）；クロマトグラフィー方法（例えば、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、薄層およびペーパークロマトグラフィー）を含む手法によって達成される。
【００６３】
ＴＲＡＩＬのアッセイは、細胞および組織において行われ得る。例えば、免疫組織化学的方法およびインサイチュハイブリダイゼーションが、細胞または組織試験サンプル中のＴＲＡＩＬタンパク質および／または核酸をアッセイするために使用され得る。
【００６４】
１つ以上の基準が、サンプル中のＴＲＡＩＬの定量的測定を可能にするために使用され得る。
【００６５】
試験サンプル中のＴＲＡＩＬのアッセイは、コントロールサンプル中のＴＲＡＩＬのアッセイと比較され得る。コントロールサンプルは、例えば、１つ以上の正常な被験体から得られることがある。
【００６６】
本発明の態様によると、ＴＲＡＩＬについてのアッセイは、被験体をモニターするために使用される。したがって、例えば、試験サンプルは、処置の有効性を評価するために、本発明の薬学的組成物による処置の前、ならびにその処置中および／または処置後の１以上の時点において被験体から得られる。さらなる例において、試験サンプルは、疾患の経過もしくは進行または治癒を評価するために、様々な時点において被験体から得られる。
【００６７】
特定の態様において、本発明の薬学的組成物による処置のモニターを助けるために、１つ以上の追加のバイオマーカーが、被験体から得られた試験サンプルにおいてアッセイされる。例えば、ホスホ−ＥＲＫ、ホスホ−Ａｋｔ、Ｆｏｘｏ３ａの局在性および／またはリン酸化の１つ以上が、本発明の薬学的組成物による処置のモニターを助けるために、被験体から得られた試験サンプルにおいてアッセイされる。そのような追加のバイオマーカーは、本明細書中に記載される方法のようなイムノアッセイ法によってアッセイされる。
【００６８】
ＴＩＣ１０誘導性ＴＲＡＩＬの発現を検出するために、被験体から得られた試験サンプルにおいてＴＲＡＩＬ核酸がアッセイされ得る。ＴＲＡＩＬ核酸、特にｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出するためのアッセイとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよびＲＮａｓｅプロテクションが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明によると、癌を処置するための方法および組成物が提供される。
【００７０】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、薬学的に有効な量の
【００７１】
【化６】
2019019145.tif 000013
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアの投与を包含する。
【００７２】
癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、その被験体においてＴＲＡＩＬの発現を誘導するのに有効な、薬学的に有効な量の
【００７３】
【化７】
2019019145.tif 000014
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアの投与を包含する。
【００７４】
本明細書中に記載される方法および組成物を用いて処置される癌は、異常な細胞増殖（新生物発生前の過剰増殖、上皮内癌、新生物および転移を含むがこれらに限定されない）によって特徴付けられる。本発明の方法および組成物は、癌の徴候および／または症状の予防ならびに回復のために使用され得る。被験体における癌の処置のことを指すために使用される用語「処置する」および「処置」には、その被験体における癌を予防すること、阻害することまたは回復すること（例えば、癌の進行を遅延させることおよび／または癌の徴候もしくは症状を減少もしくは回復させること）が含まれる。
【００７５】
本発明の組成物の薬学的に有効な量は、処置される被験体において有益な効果を有する量である。新生物発生前の過剰増殖、上皮内癌、新生物、転移、腫瘍、良性の成長、または本発明の組成物に対して応答性の他の状態を含むがこれらに限定されない異常な細胞増殖によって特徴付けられる状態などの癌を有するかまたは癌を有するリスクがある被験体において、薬学的に有効な量の本発明の組成物は、その状態の１つ以上の徴候および／または症状を回復させるかまたは予防するために有効である。例えば、薬学的に有効な量の本発明の組成物は、アポトーシスを検出可能な程度に増加させるおよび／または異常な細胞増殖（新生物発生前の過剰増殖、上皮内癌、新生物、転移、腫瘍、良性の成長、または本発明の組成物に対して応答性の他の状態を含むがこれらに限定されない）によって特徴付けられる癌の状態の細胞の増殖を減少させるのに有効である。
【００７６】
ＴＩＣ１０は、従来の治療に対して抵抗性である１次患者サンプルおよび細胞株において本明細書中に記載される広域の活性を有し、それは、ＴＩＣ１０の治療的作用が、癌において通常変化する分子（例えば、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＫＲＡＳまたはＰＴＥＮ）にもっぱら依存しないことを示唆する。ＴＩＣ１０の治療的な細胞機序の解明によって、本明細書中に記載される抵抗機序（例えば、過剰に活性化されたＡｋｔ）が同定され、癌におけるＴＩＣ１０の治療活性の相関性バイオマーカーとして、ホスホ−ＥＲＫ、ホスホ−Ａｋｔ、Ｆｏｘｏ３ａの局在化およびリン酸化、ならびに表面および血清ＴＲＡＩＬが提供される。
【００７７】
したがって、本発明の態様によると、癌におけるＴＩＣ１０治療活性の１つ以上の相関性バイオマーカーが、本発明の薬学的組成物による処置を評価するためにアッセイされる。
【００７８】
本発明の方法に従っておよび本発明の組成物を用いて処置される被験体は、哺乳動物または非哺乳動物であり得る。哺乳動物被験体は、任意の哺乳動物であり得、それらとしては、ヒト；非ヒト霊長類；げっ歯類（例えば、マウス、ラットまたはモルモット）；飼い慣らされたペット（例えば、ネコまたはイヌ）；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはウサギが挙げられるがこれらに限定されない。非哺乳動物被験体は、任意の非哺乳動物であり得、それらとしては、鳥類（例えば、アヒル、ガチョウ、ニワトリまたはシチメンチョウ）が挙げられるがこれらに限定されない。被験体は、いずれの性別であってもよく、任意の齢であってよい。本発明の薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含する方法の態様において、その被験体は、ヒトである。用語「被験体」および「患者」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００７９】
本発明に係る薬学的組成物は、通常、約０．１〜９９％のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを含む。薬学的組成物におけるＴＩＣ１０と、その少なくとも１つの薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグとの組み合わせもまた、本発明の範囲内であると考えられる。さらに、薬学的組成物におけるその薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物およびプロドラッグのうちの少なくとも２つの組み合わせもまた、本発明の範囲内であると考えられる。
【００８０】
本発明の態様によると、治療薬の組み合わせが投与される。本発明の態様によると、被験体における癌を処置する方法は、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに少なくとも１つの追加の治療薬の薬学的組成物の投与を包含する。本発明の態様によると、被験体における癌を処置する方法は、ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに少なくとも２つの追加の治療薬の薬学的組成物の投与を包含する。
【００８１】
用語「追加の治療薬」は、化学物質、化学物質の混合物、生物学的高分子（例えば、核酸、抗体、タンパク質またはその一部、例えば、ペプチド）、または被験体において局所的もしくは全身的に作用する生物学的、生理的もしくは薬理学的に活性な物質（単数または複数）である生物学的材料（例えば、細菌、植物、真菌または動物（特に哺乳動物）の細胞もしくは組織）から調製された抽出物のことを指すために本明細書中で使用される。
【００８２】
本発明の方法および組成物の態様に従って含められる追加の治療薬としては、抗生物質、抗ウイルス薬、抗新生物剤、鎮痛薬、解熱薬、抗うつ薬、抗精神病薬、抗癌剤、抗ヒスタミン剤、抗骨粗鬆症剤、抗骨壊死剤（ａｎｔｉ−ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｇｅｎｔｓ）、抗炎症剤、抗不安薬、化学療法剤、利尿薬、成長因子、ホルモン、非ステロイド性抗炎症剤、ステロイドおよび血管作用薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
ＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグならびに１つ以上の追加の治療薬を使用する併用療法は、相乗効果を示し得、例えば、単独療法としてＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／もしくはプロドラッグまたは１つ以上の追加の治療薬を単独で含む本発明の薬学的組成物を使用したときに観察され得る効果よりも大きな治療効果を示し得る。
【００８４】
態様によると、併用療法は、（１）１つ以上の追加の治療薬とともに単一組成物として一緒に製剤化される、本発明のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグを含む薬学的組成物を含む薬学的組成物；および（２）本発明のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグを含む薬学的組成物と１つ以上の追加の治療薬との共投与（ここで、本発明のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグを含む薬学的組成物と１つ以上の追加の治療薬とは、同じ組成物に製剤化されていない）を含む。別個の製剤を用いるとき、本発明のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグを含む薬学的組成物は、１つ以上の追加の治療薬の投与に対して、同時に、断続的な時点において、時差的な時点において、その１つ以上の追加の治療薬の投与の前に、１つ以上の追加の治療薬の投与の後に、またはそれらの組み合わせで、投与され得る。
【００８５】
併用処置は、本発明のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグならびに本発明の方法において使用される１つ以上の追加の治療薬を含む薬学的組成物の有効投与量を減少させることおよび治療指数を高めることを可能にし得る。
【００８６】
態様によると、併用療法は、（１）１つ以上の追加の抗癌剤とともに単一組成物として一緒に製剤化される、本発明のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグを含む薬学的組成物を含む薬学的組成物；および（２）本発明のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグを含む薬学的組成物と１つ以上の追加の抗癌剤との共投与（ここで、本発明のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグを含む薬学的組成物と１つ以上の追加の治療薬とは、同じ組成物に製剤化されていない）を含む。別個の製剤を用いるとき、本発明のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグを含む薬学的組成物は、１つ以上の追加の抗癌剤の投与に対して、同時に、断続的な時点において、時差的な時点において、その１つ以上の追加の抗癌剤の投与の前に、１つ以上の追加の抗癌剤の投与の後に、またはそれらの組み合わせで、投与され得る。
【００８７】
抗癌剤は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９０に記載されている。
【００８８】
抗癌剤としては、例証的には、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール（ａｃｏｄａｚｏｌｅ）、アクロニン（ａｃｒｏｎｉｎｅ）、アドゼレシン、アルデスロイキン、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、アンボマイシン（ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）、アメタントロン（ａｍｅｔａｎｔｒｏｎｅ）、アミホスチン（ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アスペルリン（ａｓｐｅｒｌｉｎ）、アザシチジン、アゼテパ（ａｚｅｔｅｐａ）、アゾトマイシン（ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）、バチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）、ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）、ベバシズマブ、ビカルタミド、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、ビスナフィド（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ）ジメシレート、ビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）、ブレオマイシン、ブレキナル、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カペシタビン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン（ｃａｒｕｂｉｃｉｎ）、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）、セデフィンゴール（ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ）、セレコキシブ、クロラムブシル、シロレマイシン（ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、デキソルマプラチン（ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロモスタノロン、ズアゾマイシン（ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、エフロミチン（ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）、エルサミトルシン（ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）、エンロプラチン（ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）、エンプロメート（ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）、エピプロピジン（ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）、エピルビシン、エルブロゾール（ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エストラムスチン、エタニダゾール、エトポシド、エトプリン（ｅｔｏｐｒｉｎｅ）、ファドロゾール、ファザラビン（ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）、フェンレチニド（ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン（ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ホスキドン（ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ）、ホストリエシン、フルベストラント、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン（ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ）、インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含むＩＬ−２）、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−ｎ１、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンベータ−Ｉａ、インターフェロンガンマ−Ｉｂ、イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）、イリノテカン、ランレオチド、レトロゾール、ロイプロリド、リアロゾール（ｌｉａｒｏｚｏｌｅ）、ロメト���キソール（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）、ロムスチン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、マソプロコール（ｍａｓｏｐｒｏｃｏｌ）、メイタンシン、塩酸メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｒｉｄｅ）、メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル（ｍｅｎｏｇａｒｉｌ）、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトプリン（ｍｅｔｏｐｒｉｎｅ）、メツレデパ（ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ）、ミチンドミド（ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）、ミトカルシン（ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）、ミトクロミン（ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）、ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、ミトマルシン（ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）、マイトマイシン、ミトスペル（ｍｉｔｏｓｐｅｒ）、ミトタン、ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ネララビン、ノコダゾール、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オルムナプラチン（ｏｒｍｎａｐｌａｔｉｎ）、オキシスラン（ｏｘｉｓｕｒａｎ）、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）、ペリオマイシン（ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）、ペンタムスチン（ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）、ペプロマイシン、ペルホスファミド（ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ピポブロマン、ピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）、ピロキサントロン（ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）塩酸塩、プリカマイシン、プロメスタン（ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）、ポルフィマー、ポルフィロマイシン（ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、プロカルバジン、ピューロマイシン、ピラゾフリン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）、リボプリン（ｒｉｂｏｐｒｉｎｅ）、ログレチミド（ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）、サフィンゴール（ｓａｆｉｎｇｏｌ）、セムスチン、シムトラゼン（ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ）、スパルホセート（ｓｐａｒｆｏｓａｔｅ）、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、スピロプラチン（ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル（ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）、タリソマイシン（ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）、タモキシフェン、テコガラン（ｔｅｃｏｇａｌａｎ）、テガフール、テロキサントロン（ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、テモポルフィン（ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）、テニポシド、テロキシロン（ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）、テストラクトン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、チラパザミン、トポテカン、トレミフェン、トレストロン（ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ）、トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ）、トリメトレキサート、トリプトレリン（ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、ツブロゾール（ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅ）、ウラシルマスタード、ウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）、バプレオチド（ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン（ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ）、ビングリシネート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、ビンロイロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、ビノレルビン、ビンロシジン（ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンゾリジン（ｖｉｎ��ｏｌｉｄｉｎｅ）、ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、ゼニプラチン（ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）、ジノスタチン、ゾレドロネート（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）およびゾルビシンが挙げられる。
【００８９】
ＴＩＣ１０を含む薬学的組成物と１つ以上の追加の抗癌剤（例えば、１つ以上の有糸分裂抑制剤および／または１つ以上の抗血管新生剤）との併用処置の相乗効果が、予想外にも、本明細書中に記載されるように見出されている。
【００９０】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある被験体を処置する方法は、治療有効量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに有糸分裂抑制剤の投与を包含する。
【００９１】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある被験体を処置する方法は、治療有効量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびにタキサン有糸分裂抑制剤（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルであるがこれらに限定されない）の投与を包含する。
【００９２】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある被験体を処置する方法は、治療有効量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに抗血管新生剤の投与を包含する。
【００９３】
本発明の態様によると、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある被験体を処置する方法は、治療有効量のＴＩＣ１０、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに抗血管新生剤（例えば、ベバシズマブであるがこれに限定されない）の投与を包含する。
【００９４】
本発明の組成物特定の態様において、投与される補助抗癌剤の量は、治療有効量の構造（Ｉ）、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグの投与なしで投与される場合に治療効果を達成するために必要な補助抗癌剤の量より少ない。したがって、本発明の組成物の特定の態様において、その組成物の単位用量における補助抗癌剤の量は、治療有効量の構造（Ｉ）、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグなしで投与される場合に治療効果を達成するために必要な補助抗癌剤の量より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％少ない。
【００９５】
本発明の態様によると、ＴＲＡＩＬは、ＴＩＣ１０の投与に加えて、１つ以上のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、Ｎｅｂｂｉｏｓｏ，Ａ．ら、２００５，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １１，７７−８４に記載されているボリノスタット（ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ））；１つ以上のＴＲＡＩＬアゴニスト抗体（例えば、レクサツムマブ（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）およびマパツムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ））；および／または組換えＴＲＡＩＬ（例えば、Ａｂｄｕｌｇｈａｎｉ，Ｊ．ら、２０１０，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  １４：１０９１−１１０８に記載されているようなアデノウイルスＴＲＡＩＬ）の投与などによる方法または組成物によって誘導され得るかまたは提供され得る。
【００９６】
必要に応じて、癌を有するかまたは癌を有するリスクがある被験体を処置する方法は、さらに、補助抗癌処置を含む。補助抗癌処置は、被験体または被験体の身体の患部の放射線照射処置であり得る。
【００９７】
本発明の薬学的組成物の投与によって被験体によって誘導されるＴＲＡＩＬ発現は、その被験体から得られたサンプル（例えば、その被験体から得られた血液サンプル）において検出可能である。
【００９８】
本発明の態様は、ＴＩＣ１０の単回投与後の３〜４日間にわたって、分泌されたＴＲＡＩＬの血清レベルが持続する、正常組織および腫瘍組織によるＴＲＡＩＬ遺伝子のアップレギュレーションを含む。通常、ＴＲＡＩＬタンパク質の血清半減期は、２０〜３０分である。
【００９９】
ＴＩＣ１０は、３８７．２１という質量計算値を有し、血液脳関門を越える。ＴＩＣ１０の投与によって、中枢神経系の細胞（例証的には、脳および脊髄のグリア細胞およびニューロンを含む）においてＴＲＡＩＬの誘導が可能になる。さらに、血液脳関門を越えるＴＩＣ１０の薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物またはプロドラッグの投与によって、中枢神経系の細胞においてＴＲＡＩＬの誘導が可能になる。
【０１００】
本発明の態様によると、中枢神経系（ＣＮＳ）の癌を有するかまたは有するリスクがある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、ＣＮＳへの直接的な投与以外の投与経路による、薬学的に有効な量の：
【０１０１】
【化８】
2019019145.tif 000015
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアの投与を包含する。
【０１０２】
本発明の態様によると、原発性ＣＮＳ癌および非ＣＮＳ癌のＣＮＳ転移（本明細書中で脳腫瘍とも呼ばれる）が処置される。本発明の態様に従って処置される原発性ＣＮＳ癌としては、グリオーマ、髄膜腫、下垂体腺腫および神経鞘腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。多形神経膠芽腫は、本発明の態様に従って処置される原発性ＣＮＳ癌である。乏突起膠腫は、本発明の態様に従って処置される原発性ＣＮＳ癌である。
【０１０３】
本発明の方法は、経口、直腸、鼻、肺、硬膜外、眼球、耳、動脈内、心臓内、脳室内、皮内、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨内、髄腔内、膀胱内、皮下、局所的、経皮的および経粘膜的（例えば、舌下、頬側、膣および吸入）の投与経路を含むがこれらに限定されない投与経路による本発明の薬学的組成物の投与を包含する。
【０１０４】
本発明の態様によると、処置の必要のある被験体を処置する方法が提供され、その方法は、経口投与用に製剤化された薬学的に有効な量の：
【０１０５】
【化９】
2019019145.tif 000016
、その薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグの経口投与を包含する。
【０１０６】
本発明の薬学的組成物は、被験体への投与に適した任意の剤形（例証的には、固体、半固体および液体の剤形（例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒剤、坐剤、丸剤、溶液、懸濁液、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ペースト、スプレーおよびエアロゾル）を含む）であり得る。リポソームおよびエマルジョンは、医薬品、特に疎水性医薬品を送達するために使用され得る周知のタイプの薬学的製剤である。本発明の薬学的組成物は、通常、薬学的に許容され得るキャリア（例えば、賦形剤、希釈剤および／またはビヒクル）を含む。組成物の遅延放出製剤および遅延放出システム（例えば、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス）が使用され得る。
【０１０７】
本発明の組成物の薬学的製剤は、薬学的に許容され得るキャリアを含み得る。用語「薬学的に許容され得るキャリア」とは、被験体に対して過度の毒性または刺激なくその被験体において使用するのに適しており、薬学的組成物中に含まれている他の成分と適合性である、キャリアのことを指す。
【０１０８】
薬学的に許容され得るキャリア、薬学的組成物および様々な剤形を調製するための方法、ならびに投与の様式は、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，ｅｄｓ．Ｈ．Ａ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８９；およびＬ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．ら、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００４；Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２１ｓｔ  ｅｄ．，２００５、特に、ｃｈａｐｔｅｒ  ８９；およびＪ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，１０ｔｈ  ｅｄ．，２００１に詳述されているように当該分野で周知である。
【０１０９】
本発明の態様に係る薬学的組成物は、経口投与用に製剤化される。
【０１１０】
投与用の固体の剤形または投与前に液体で懸濁するための固体の剤形としては、例証的には、カプセル、錠剤、散剤および顆粒剤が挙げられる。そのような固体の剤形において、１つ以上の活性物質は、少なくとも１つのキャリア（例証的には、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウムまたはアルカリ金属リン酸塩（例証的には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸カルシウムを含む））；充填剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）；結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート（ａｌｉｇｎａｔｅｓ）、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア）；吸湿剤（例えば、グリセロール）；崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、植物デンプン（例えば、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、アルギン酸、ある特定の複合珪酸塩および炭酸ナトリウム）；溶解遅延剤（例えば、パラフィン）；吸収促進剤（例えば、四級アンモニウム化合物）；湿潤剤（例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールおよびグリコール）；吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイト）；滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコールまたはラウリル硫酸ナトリウム）；保存剤（例えば、抗菌剤および抗真菌剤（例えば、ソルビン酸、ゲンタマイシンおよびフェノールを含む））；および安定剤（例えば、スクロース、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび酸化防止剤）を含む）と混和される。
【０１１１】
固体の剤形は、必要に応じて、腸溶コーティングなどのコーティングを含む。腸溶コーティングは、代表的には、ポリマー材料である。好ましい腸溶コーティング材料は、生体内分解性、漸進的な加水分解性および／または漸進的な水溶性のポリマーという特徴を有する。固体の製剤に適用されるコーティング材料の量は、一般に、摂取と薬物放出との間の時間間隔に影響する。コーティング全体が、胃酸に関連する３未満のｐＨの胃腸液に溶解しないが小腸の環境におけるｐＨ３超では溶解するような厚さを有するコーティングが適用される。ｐＨ依存性の溶解性プロファイルを示す任意のアニオン性ポリマーは、下部消化管に活性物質を送達するために本発明の実施において腸溶コーティングとして容易に使用されることが予想される。特定の腸溶コーティング材料の選択は、特性（例えば、胃での崩壊に対する抵抗性；胃液に対する不透過性および胃に存在する間の活性物質の拡散；標的の腸部位において放散させる能力；保管中の物理的および化学安定性；無毒性；ならびに適用の容易さ）に左右される。
【０１１２】
好適な腸溶コーティング材料としては、例証的には、セルロースポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、セルロースアセテートトリメリテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルローススクシネートおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム）；アクリル酸ポリマーおよびアクリル酸共重合体、好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アンモニウムメチルアクリレート、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチルおよび／またはエチルから形成されるもの；ビニルポリマーおよびビニル共重合体（例えば、ポリビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセテートフタレート、酢酸ビニルクロトン酸共重合体およびエチレン−酢酸ビニル共重合体）；シェラック；ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。特定の腸溶コーティング材料としては、例えば、米国特許第６，１３６，３４５号に記載されているアクリル酸ポリマーおよびアクリル酸共重合体が挙げられる。
【０１１３】
腸溶コーティングは、必要に応じて、胃液が固体の剤形の中に侵入することを可能にする細孔および亀裂の形成を防止する可塑剤を含む。好適な可塑剤としては、例証的には、クエン酸トリエチル（Ｃｉｔｒｏｆｌｅｘ２）、トリアセチン（グリセリルトリアセテート）、クエン酸アセチルトリエチル（Ｃｉｔｒｏｆｌｅｃ  Ａ２）、Ｃａｒｂｏｗａｘ４００（ポリエチレングリコール４００）、フタル酸ジエチル、クエン酸トリブチル、アセチル化モノグリセリド、グリセロール、脂肪酸エステル、プロピレングリコールおよびフタル酸ジブチルが挙げられる。特に、アニオン性カルボキシアクリルポリマーから構成されるコーティングは、代表的には、およそ１０重量％〜２５重量％の可塑剤、特に、フタル酸ジブチル、ポリエチレングリコール、クエン酸トリエチルおよびトリアセチンを含む。コーティングは、コーティング材料を可溶化するためまたは分散するために、ならびにコーティング性能およびコーティングされた生成物を改善するために、他のコーティング賦形剤（例えば、粘着性低下剤（ｄｅｔａｃｋｉｆｉｅｒ）、消泡剤、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）および安定剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、酸または塩基））も含み得る。
【０１１４】
経口投与用の液体の剤形は、エマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤またはエリキシル剤として製剤化される、１つ以上の活性物質および薬学的に許容され得るキャリアを含む。本発明の組成物の液体の剤形は、着色剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料または芳香剤を含み得る。
【０１１５】
例えば、非経口投与用の組成物は、注射可能な液体として製剤化され得る。好適な水性および非水のキャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、それらの好適な混合物；オリーブ油などの植物油；およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は望ましい粒径を維持することによって、および／またはラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性物質を使用することによって、維持され得る。必要に応じて安定剤（例えば、スクロース、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよび酸化防止剤）が含められる。
【０１１６】
局所的投与の場合、組成物は、局所的効果などのための皮膚への投与のためにおよび／または経皮的送達用の「パッチ」製剤として製剤化され得る。局所的投与に適した薬学的製剤としては、例えば、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ペースト、スプレーおよびパウダーが挙げられる。軟膏、ローション、クリーム、ゲルおよびペーストは、１つ以上の活性物質に加えて、基剤（例えば、吸収基剤、水で除去可能な基剤、水溶性基剤または油性基剤）および賦形剤（例えば、増粘剤、ゲル化剤、着色剤、安定剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料または芳香剤）を含み得る。
【０１１７】
経皮的製剤は、経皮吸収促進剤（例えば、アセトン、アゾン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エタノール、オレイン酸、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールおよびラウリル硫酸ナトリウム）を含み得る。イオン導入（Ｉｏｎｏｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）および／またはソノフォレーシスを使用することにより、経皮的送達を促進することができる。
【０１１８】
１つ以上の活性物質の局所的投与用の粉末およびスプレーは、賦形剤（例えば、タルク、ラクトースおよび１種以上のケイ酸）を含み得る。スプレーは、薬学的噴霧剤（例えば、フッ素化炭化水素噴霧剤、二酸化炭素または好適な気体）を含み得る。あるいは、スプレーは、噴霧剤を必要としないポンプ方式の噴霧デバイスから送達され得る。噴霧デバイスは、例えば、送達量を制御するためのバルブを使用して、その中に含まれている定量の組成物を送達する。
【０１１９】
１つ以上の活性物質の眼科用（Ｏｐｔｈａｌｍｉｃ）製剤は、保存剤、緩衝剤および増粘剤などの成分を含み得る。
【０１２０】
本発明の薬学的組成物において薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤として有用な好適な表面活性剤としては、優良な乳化、分散および／または湿潤特性を有する非イオン性、カチオン性および／またはアニオン性界面活性物質が挙げられる。好適なアニオン性界面活性物質としては、水溶性のセッケンと水溶性の合成表面活性剤の両方が挙げられる。好適なセッケンは、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、高級脂肪酸（Ｃ１０〜Ｃ２２）の非置換または置換アンモニウム塩、例えば、オレイン酸もしくはステアリン酸、またはやし油もしくはタロー油から入手可能な天然の脂肪酸混合物のナトリウム塩もしくはカリウム塩である。合成界面活性物質には、ポリアクリル酸のナトリウム塩またはカルシウム塩；脂肪スルホネートおよびスルフェート；スルホン酸化ベンズイミダゾール誘導体およびアルキルアリールスルホネートが含まれる。脂肪スルホネートおよびスルフェートは、通常、アルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、非置換アンモニウム塩、または８〜２２個の炭素原子を有するアルキルもしくはアシルラジカルで置換されたアンモニウム塩、例えば、リグノスルホン酸もしくはドデシルスルホン酸のナトリウム塩もしくはカルシウム塩、または天然の脂肪酸から得られる脂肪アルコールスルフェートの混合物、硫酸エステルもしくはスルホン酸エステルのアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）および脂肪アルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸の形態である。好適なスルホン酸化ベンズイミダゾール誘導体は、好ましくは、８〜２２個の炭素原子を含む。アルキルアリールスルホネートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸またはジブチル−ナフタレンスルホン酸またはナフタレン−スルホン酸／ホルムアルデヒド縮合物のナトリウム塩、カルシウム塩またはアルカノールアミン塩である。対応するホスフェート、例えば、リン酸エステルの塩、ならびにｐ−ノニルフェノールとエチレンおよび／もしくはプロピレンオキシドとの付加物またはリン脂質も好適である。この目的に適した好適なリン脂質は、天然の（動物または植物細胞を起源とする）リン脂質またはケファリンもしくはレシチンタイプの合成のリン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、リゾレシチン、カルジオリピン、ジオクタニルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジル（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌ）−コリンおよびそれらの混合物）である。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物において薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤として有用な好適な非イオン性界面活性物質としては、アルキルフェノール、脂肪アルコール、脂肪酸、分子内に少なくとも１２個の炭素原子を含む脂肪族アミンまたはアミド、アルキルアレーンスルホネートおよびジアルキルスルホスクシネートのポリエトキシ化およびポリプロポキシ化された誘導体（例えば、脂肪族および脂環式アルコール、飽和および不飽和脂肪酸ならびにアルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘導体）（前記誘導体は、好ましくは、（脂肪族）炭化水素部分に３〜１０個のグリコールエーテル基および８〜２０個の炭素原子ならびにアルキルフェノールのアルキル部分に６〜１８個の炭素原子を含む）が挙げられる。さらに好適な非イオン性界面活性物質は、ポリエチレンオキシドと、ポリプロピレン（ｐｏｙｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコール、アルキル鎖に１〜１０個の炭素原子を含むエチレンジアミノポリプロピレングリコールとの水溶性付加物（それらの付加物は、２０〜２５０個のエチレングリコールエーテル基および／または１０〜１００個のプロピレングリコールエーテル基を含む）である。そのような化合物は、通常、プロピレングリコール単位あたり１〜５個のエチレングリコール単位を含む。非イオン性界面活性物質の代表的な例は、ノニルフェノール−ポリエトキシエタノール、ひまし油ポリグリコールエーテル類、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。ポリエチレンソルビタンの脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート）、グリセロール、ソルビタン、スクロースおよびペンタエリトリトールもまた、好適な非イオン性界面活性物質である。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物において薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤として有用な好適なカチオン性界面活性物質としては、第四アンモニウム塩、好ましくは、必要に応じてハロ、フェニル、置換フェニルまたはヒドロキシで置換される４個の炭化水素ラジカルを有するハロゲン化物；例えば、Ｎ−置換基として少なくとも１つのＣ８−Ｃ２２アルキルラジカル（例えば、セチル、ラウリル、パルミチル、ミリスチル、オレイルなど）、およびさらなる置換基として非置換またはハロゲン化低級アルキル、ベンジルおよび／またはヒドロキシ−低級アルキルラジカルを含む第四アンモニウム塩が挙げられる。
【０１２３】
この目的に適した表面活性剤のより詳細な説明は、例えば、“ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  Ａｎｎｕａｌ”（ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｒｏｐ．，Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９８１）、“Ｔｅｎｓｉｄ−Ｔａｓｃｈｅｎｂｕｃｈ”，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｈａｎｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｖｉｅｎｎａ，１９８１）および“Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ”（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）に見られる場合がある。
【０１２４】
構造形成剤、増粘剤またはゲル形成剤が、本発明の薬学的組成物および組み合わせ調製物に含められ得る。好適なそのような物質は、特に、高度に分散したケイ酸（例えば、商品名Ａｅｒｏｓｉｌとして商業的に入手可能な製品）；ベントナイト；モンモリロナイトのテトラアルキルアンモニウム塩（例えば、商品名Ｂｅｎｔｏｎｅとして商業的に入手可能な製品）（それらのアルキル基の各々は、１〜２０個の炭素原子を含み得る）；セトステアリルアルコールおよび加工ひまし油生成物（例えば、商品名Ａｎｔｉｓｅｔｔｌｅとして商業的に入手可能な製品）である。
【０１２５】
特定の態様において、薬学的に許容され得るキャリアは、粒状のキャリア（例えば、リポソーム、ミセル、単層または多層（ｍｕｌｉｔｌａｍｅｌｌａｒ）ベシクルを含む脂質粒子；ポリマー粒子（例えば、ヒドロゲル粒子、ポリグリコール酸粒子またはポリ乳酸粒子）；無機粒子（例えば、米国特許第５，６４８，０９７号に記載されているような、例えば、リン酸カルシウム粒子）；および粒状の無機／有機キャリア（例えば、米国特許第６，６３０，４８６号に記載されているようなもの））である。
【０１２６】
粒状の薬学的に許容され得るキャリアは、脂質粒子；ポリマー粒子；無機粒子；および無機／有機粒子の中から選択され得る。粒子タイプの混合物もまた、粒状の薬学的に許容され得るキャリアとして含められ得る。
【０１２７】
粒状のキャリアは、代表的には、粒子が約１ｎｍ〜１０ミクロンの範囲の平均粒径を有するように製剤化される。特定の態様において、粒状のキャリアは、粒子が約１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の平均粒径を有するように製剤化される。
【０１２８】
本発明の薬学的組成物の投与量は、因子（例えば、投与経路；その組成物が投与される被験体の齢、健康状態、性別および体重；もしあれば被験体の症状の性質および程度、ならびに所望の効果であるがこれらに限定されない）に基づいて変動し得る。投与量は、処置が短期間であるか継続的であるかに応じて調整され得る。当業者は、医療行為に特有のこれらおよび他の考慮すべき点に照らして薬学的に有効な量を決定できる。
【０１２９】
通常、本発明の薬学的組成物の１日投与量は、被験体の体重１キログラムあたり約０．００１〜１００ミリグラムの範囲であることが企図される。１日量は、所望の効果を得るために２以上の分割量として投与されてもよい。本発明の薬学的組成物は、所望の効果を得るために徐放用にも製剤化され得る。
【０１３０】
剤形を調製するための通例の成分、機器およびプロセスに関する詳細な情報は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，ｅｄｓ．Ｈ．Ａ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８９；およびＬ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．ら、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００４；Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２１ｓｔ  ｅｄ，，２００５、特にｃｈａｐｔｅｒ８９；およびＪ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，１０ｔｈ  ｅｄ．，２００１に見られる。
【０１３１】
本発明の態様に係る市販用パッケージは、本明細書中に記載される薬学的組成物を備える。本発明の態様によると、その薬学的組成物を投与するための指示書が含められる。
【０１３２】
本発明の態様によると、市販用パッケージは、
【０１３３】
【化１０】
2019019145.tif 000017
、その薬学的に許容され得る薬学的に許容され得る誘導体、塩、エステル、アミド、水和物、溶媒和物および／またはプロドラッグ；ならびに薬学的に許容され得るキャリアを備える。
【０１３４】
１つ以上の補助的な構成要素（例えば、緩衝剤または希釈剤）が、必要に応じて本発明の市販用パッケージに含められる。
【０１３５】
本発明の組成物および方法の態様は、以下の実施例において例証される。これらの実施例は、例証目的のために提供されるものであり、本発明の組成物および方法の範囲に対して限定と見なされない。
【実施例】
【０１３６】
試薬および細胞ベースアッセイ
Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＡ）から入手したＨＣＴ１１６  Ｂａｘ−／−およびＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞ならびにＡｋｉｖａ  Ｍｉｎｔｚ（Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｒｅｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ，ＮＣ）から入手したＧＢＭ細胞株を除くすべての細胞株をＡＴＣＣから入手した。ＴＲＡＩＬ  ｓｈＲＮＡまたはベクターを使用してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いて、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入したＦｏｘｏ３ａ  ｓｈＲＮＡまたはベクターを使用してＨＣＴ１１６を用いて、レンチウイルス感染を行った。デスドメインを含まないＤＲ５フラグメントをコードするｃＤＮＡを使用して、ＤＲ５（１〜２９８）融合タンパク質を発現するｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターにヒトＤＲ５遺伝子のアミノ酸１〜２９８を挿入することによってＨ４６０  ＤＲ５ΔＤＤ−ＥＧＦＰ細胞を構築した。その融合構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨ４６０細胞にトランスフェクトし、Ｇ４１８を用いて選択した。蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡観察およびウエスタンブロット解析によって、陽性クローンを確かめた。ＮＣＩ多様性セットＩＩを使用する生物発光ハイスループットスクリーニングを、ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子の転写開始の上流のＴＲＡＩＬプロモーターの最初の５０４塩基対の転写調節下でホタルルシフェラーゼ構築物を発現するように安定的にコトランスフェクトしたＨＣＴ１１６  Ｂａｘ−／−細胞において行った。２０ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭおよび１μＭという作用濃度において化合物を試験し、処置の１２、２４、３６および４８時間後に転写活性の生物発光評価を行った。このスクリーニングの方法の詳細は、Ｗａｎｇら、２００６，ＰＮＡＳ  １０３：１１００３−１１００８）に記載されている。ＴＩＣ１０（ＮＳＣ３５０６２５）を、ＮＣＩ  ＤＴＰから入手し、ＤＭＳＯにおいて２０ｍＭで再構成し、等分し、−２０℃で保管した。Ａ６７３０およびＵ０１２６モノエタノレートをＳｉｇｍａから入手した。精製された組換えＴＲＡＩＬを、Ｋｉｍら、２００４，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４００４４−４００５２に記載されているように作製した。ＲＩＫ−２抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１μｇ／ｍＬで使用し、ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を２０μＭで使用した。
【０１３７】
ヒト患者からの１次検体
ヒト患者からのすべての１次検体は、本明細書中に記載される実施例において使用するために、摘出の直後に受け取り、手作業にてコンプリートＤＭＥＭ中で消化し、１００μｍナイロンメッシュで濾過し、コンプリートＤＭＥＭにおいて２×１０５細胞／ｍＬでプレーティングした。
【０１３８】
マウス
皮下異種移植の場合、４〜６週齢の雌の無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の各背面側腹部に１×１０６個（Ｔ９８Ｇの場合２．５×１０６個）の表示の細胞株を１：１  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）：ＰＢＳの２００μＬの懸濁液として接種した。すべての腹腔内および静脈内注射を、２００μＬという総体積において行った。ＴＩＣ１０の経口製剤を、経口胃管栄養法を用いて投与し、２０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）、１０％ＤＭＳＯおよび７０％ＰＢＳを含む２００μＬの懸濁液として投与した。表示の時点においてデジタルノギスを使用して腫瘍をモニターした。すべての皮下腫瘍が、注射後１〜４週間、処置開始前に約１２５ｍｍ３の体積に達するまで確立された。腫瘍組織量の軽減を、腫瘍消失後３週間にわたってモニターし、安楽死後に目視検査によって確認した。
【０１３９】
盲腸内移植は、Ｃｅｓｐｅｄｅｓ，Ｍ．Ｖ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，２００７，１７０（３）：ｐ．１０７７−１０８５に記載されているように行った。
【０１４０】
頭蓋内異種移植の場合、麻酔された無胸腺ヌードマウスに、血清および抗生物質を含まないＲＰＭＩの２５μＬの懸濁液として２×１０５個のＳＦ７６７細胞を移植した。注入部位は、頭蓋の正中に対して１ｍｍ側方かつ冠状縫合に対して１ｍｍ前方に作られた穿頭孔だった。Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を用いて５分間にわたって徐々に注入物を投与し、骨ろうを使用して穿頭孔を塞いだ。移植の２週間後に生物発光イメージングにより腫瘍の生着を評価した。Ｗａｎｇら、２００３，ＰＮＡＳ  １００：１５０９５−１５１００に記載されているようにＩＶＩＳイメージングシステムにおいて腫瘍の生物発光イメージングを行った。
【０１４１】
マウスの近赤外イメージングを、製造者のプロトコルに従ってＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ（登録商標）６８０（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）の尾静脈注入後にＰｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅイメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）において行った。６週齢のΕμ−ｍｙｃマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＩｇｈＭｙｃ）２２Ｂｒｉ／Ｊ）から入手した。
【０１４２】
ＣＢＣ／ディファレンシャルおよび血清化学アッセイのために、左心室の末端心臓穿刺によって、麻酔されたマウスから１ｍＬの血液を回収した。血清化学のために、５００μＬをマイクロチューブに入れ、室温において３０分間凝固させた後、遠心分離した。血清を取り出し、再度遠心分離することによって、任意のさらなる血餅を除去し、血清を解析にまわした。ＣＢＣ／ディファレンシャルのために、５００μＬの血液をＥＤＴＡチューブに回収し、解析した。
【０１４３】
統計解析。対比較の場合、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してスチューデントの両側ｔ検定によってデータを解析した。統計パッケージＲと連動するウェブベースのスクリプトを使用して、ログランク統計解析を行った。
【０１４４】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
製造者の指示書に従うことによってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μｇのＲＮＡおよびｏｌｉｇｏｄＴとともに使用して、ｃＤＮＡを生成した。プライマーは、ＴＲＡＩＬ順方向（ＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＣＡＴＴ、配列番号１）、ＴＲＡＩＬ逆方向（ＧＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＧ、配列番号２）、ＧＡＰＤＨ順方向（ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ、配列番号３）、ＧＡＰＤＨ逆方向（ＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＧＴ、配列番号４）だった。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＰＣＲ増幅を行った。サンプルを１０ｎｇ／μｌに標準化し、次いで、１サンプルあたり２０ｎｇのｃＤＮＡを、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，ＵＳＡ）を使用するリアルタイムＰＣＲ用の鋳型として使用した。サンプルを、同一条件下で使用したＧＡＰＤＨに対して正規化した。定量は、正規化用の内因性コントロールとしてのＧＡＰＤＨと、Ｌｉｖａｋら、２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１  Ｄｅｃ；２５（４）：４０２−８に記載されている閾値を交差させる２ΔΔＣｔ法を用いた。１０μｌの反応体積を用いて、７９００ＨＴ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において３８４ウェル光学プレートにおいて反応を行った。データ解析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ２．２ソフトウェアを使用した。ゲノムＤＮＡの混入の可能性を排除するために、各遺伝子特異的プライマーセットに対して、ｃＤＮＡ鋳型を含まないおよびＲＴを含まないコントロールサンプルを用いたコントロールＰＣＲ反応も行った。各ＰＣＲ反応の四つ組を行い、得られたデータを平均した。
【０１４５】
免疫蛍光法
表示の細胞株を、７２時間にわたって、表示の作用濃度のＴＩＣ１０の非存在下の存在下の６ウェルプレートにおいて対数期の成長において増殖させた。細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）溶液を使用して透過処理した。細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中において、１：１００で抗ＴＲＡＩＬ（ａｂ２４３５，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）とともに、または１：２５０で抗活性カスパーゼ−３（５５９５６５，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とともに、光の非存在下において１時間インキュベートした。抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液中にて２０分間、室温において１：２００でインキュベートし、ＰＢＳですすいだ。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者のプロトコルに従って核対比染色として使用した。ｉＶｉｓｉｏｎイメージングシステム（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用してＡｘｉｏｖｅｒｔ倒立顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ）において蛍光イメージングを行った。
【０１４６】
フローサイトメトリーおよび細胞死アッセイ
すべてのフローサイトメトリー解析のために、浮遊細胞および接着細胞をＣｏｕｌｔｅｒ−Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｅｌｉｔｅ  Ｅｐｉｃｓ血球計算器において解析した。表面ＴＲＡＩＬ実験のために、接着細胞を、短時間のトリプシン処理によって回収し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドにおいて２０分間固定し、抗ＴＲＡＩＬ抗体とともに２時間（Ａｂｃａｍ）インキュベートし、洗浄し、抗ウサギＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに３０分間インキュベートし、解析した。細胞に対して前方散乱および側方散乱のゲーティングを行うことにより、残骸および死細胞を解析から除外した。表面ＴＲＡＩＬデータは、別段示されない限り、コントロールサンプルに対する蛍光強度の中央値として表される。Ｓｕｂ−Ｇ１および細胞周期プロファイル実験のために、すべての細胞をペレットにし、エタノール固定した後、ＲＮＡｓｅの存在下においてヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）で染色した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者のプロトコルに従って使用して、９６ウェル黒壁透明底プレートにおいて、細胞生死判別アッセイを行った。これらのアッセイのイメージングおよび定量をＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）において行った。
【０１４７】
コロニー形成アッセイ
表示の細胞株を、１ウェルあたり５００個の細胞でプレーティングし、翌日、接着後に、新鮮完全培地で処理した。処理の３日後、その培地を、薬物を含まない培地に置き換え、３日ごとに１回新鮮培地を与えて、細胞を１０日間にわたって増殖させた。その１０日間の終わりに、定量のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノールで固定し、クマシーブルーで染色し、すすぎ、乾燥した。
【０１４８】
組織解析。マウスを、表示の時点において人道的に屠殺し、切除した正常組織または腫瘍を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で４℃において一晩固定した。血漿サンプルが望まれる場合、麻酔下の末端心臓穿刺によって５００μＬの血液をＥＤＴＡ−Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（ＢＤ）に回収した。微量遠心管以外は同様の様式で血清サンプルを回収した後、室温で３０分間インキュベートして凝固させた。次いで、５分間の遠心分離後に血清を取りだした。パラフィン包埋されたブロック、連続切片スライドならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色を、標準的な手順に従って調製した。ＡｐｏｐＴａｇ（登録商標）Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＴＵＮＥＬ染色を行った。ＩＨＣ解析のために、スライドをキシレン中で脱ろうし、エタノールを徐々に減少させて水和させた。１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．０）中で６分間煮沸することによって、抗原回復を行った。ストレプトアビジンおよびビオチンブロッキング溶液ならびにヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、サンプルをブロッキングした。１次抗体を、湿度チャンバー内において４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化２次抗体とのインキュベーションおよびＤＡＢの沈着を製造者のプロトコルに従って行った（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）。サンプルを、ヘマトキシリン（ＤＡＫＯ）で６分間対比染色し、ｄＨ２Ｏ中で５分間すすぎ、ＰＢＳですすぎ、脱水し、カバーガラスで密封した。ＱＣａｐｔｕｒｅソフトウェア（ＱＩｍａｇｉｎｇ）を使用してＡｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡において像を記録した。
【０１４９】
共培養
ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−およびＨＦＦ細胞の共培養を、コンプリートＤＭＥＭおよびＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地の１：１混合物において行った。蛍光イメージのために、その２種類の細胞を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒｓ  Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ）を製造者のプロトコルに従って使用して別々に標識した。免疫蛍光法の項に記載したようにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で細胞を対比染色した。細胞死のフローサイトメトリー解析のために、細胞の２つの集団を、光散乱の差異によって判別し、細胞死アッセイの項のｓｕｂ−Ｇ１解析について記載したように解析した。
【０１５０】
ＥＬＩＳＡ
ＴＲＡＩＬに対するＥＬＩＳＡを、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０キットを製造者のプロトコルに従って使用して行った（ＤＴＲＬ００，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。５４０ｎｍにおける吸光度を用いて、製造者が提案するように光学的補正を行った。ＤＴＸ８８０プレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて吸光度を測定した。
【０１５１】
ＴＩＣ１０の薬物動態解析
ＴＩＣ１０の吸光度プロファイルを、Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃ  ＩＩＩ分光計（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）において測定した。Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）および１００μＬ注入ループを使用するＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）での２３９ｎｍにおける吸光度検出によって、ＨＰＬＣ解析を行った。１ｍＬ／分におけるアイソクラティック溶出を、ｄＨ２Ｏ中の．１％トリフルオロ酢酸において行った。アセトニトリル（ＡＣＮ）グラジエントを、溶出のために、０〜５分では１５〜２０％ＡＣＮ、５〜１２分では２０〜２３％、１２〜１８分では２５％として行った。無関係な実験の無胸腺ヌードマウスから回収された血漿にある濃度のＴＩＣ１０を添加することによって、検量線を作成した。すべての血漿サンプルについて、左心室の末端心臓穿刺によって血液を得て、ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ）に回収した。サンプルを５００ｇで１０分間遠心分離した。血漿を、３０μＬの過塩素酸を１００μＬのサンプルに加えることによって脱タンパクし、１５秒間ボルテックスし、２分間遠心分離し、直ちに上清をＨＰＬＣに注入した。ＡＵＣを、８．１分の保持時間を有する内部血清ピークに対して正規化した。時間に対するＡＵＣデータを、式ＡＵＣ＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔ（ここで、ｔ＝時間であり、ＡおよびＢは、２つの相（分布および排泄）の開始時の外挿された濃度である）を使用する中心コンパートメントからの１次排泄を用いる２コンパートメントオープンモデルに適合させた。半減期をｔ１／２α＝．６９３／αおよびｔ１／２β＝．６９３／βとして計算した。計算のために使用される他の式としては、ＣＬ＝用量／ＡＵＣ０−∞およびＶｄ＝用量／（ＡＵＣ０−∞×β）が挙げられる。
【０１５２】
遺伝子発現解析
ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞を対数期において増殖させ、ＤＭＳＯまたはＴＩＣ１０（１０μＭ）で処理した。４８時間後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを単離した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ−１２  Ｂｅａｄｃｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してマイクロアレイ解析を行った。ＲＮＡの質および濃度を、ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ）とともにＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して評価した。製造者の指示書に従ってＴｏｔａｌＰｒｅｐＴＭＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ａｍｂｉｏｎ）によって５００ｎｇのＲＮＡからｃＲＮＡを合成した。Ｔ７オリゴ（ｄＴ）をプライマーとする逆転写を用いて、第１鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡを生成した。次いで、ｃＤＮＡにおいて第２鎖合成ならびにＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅ  ＨによるＲＮＡ分解を行った後、濾過精製を行った。インビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して、複数コピー数のビオチン化ｃＲＮＡを生成した。標識されたｃＲＮＡを、濾過を使用して精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐによって定量し、合計７５０ｎｇ／サンプルとなるように体積を調整した。サンプルを断片化し、変性させた後、５８℃で１８時間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、ビーズチップを洗浄し、蛍光標識した。ＢｅａｄＡｒｒａｙ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてビーズチップをスキャンした。得られたスキャンデータをＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ１．０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にインポートして、プロジェクトを作成した。結果をＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  Ｇｘｌｌ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にエクスポートした。次いで、０．０１未満の測定値を０．０１に設定し、アレイを５０番目のパーセンタイルに対して正規化し、個別の遺伝子をコントロールの中央値に対して正規化した。ＴＩＣ１０によって誘導される転写の変化のネットワーク解析のために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してデータセットを解析した。
【０１５３】
ウエスタンブロット解析
ＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを使用して、Ｗａｎｇ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ  １０３，１１００３−１１００８，２００６に記載されているようにウエスタンブロット解析を行い、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＸ線フィルムを使用して可視化した。細胞質溶解緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＫＣｌおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）に続いて核溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０μＭ  ＥＤＴＡ、２５％グリセロール）を使用して、核および細胞質の抽出物を調製した。すべての溶解緩衝液について、新鮮なプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）および１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを使用直前に加えた。
【０１５４】
クロマチン免疫沈降アッセイ
Ｎｅｂｂｉｏｓｏ，Ａ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１１（１），７７−８４，２００５にＴＲＡＩＬプロモーターついて記載されているように、Ｆｏｘｏ３ａに対するＣｈＩＰグレードの抗体（Ａｂｃａｍ）または非特異的コントロールとして等濃度のウサギＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して、クロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）アッセイを行った。
【０１５５】
ＴＩＣ１０はＴＲＡＩＬ遺伝子のｐ５３非依存的転写誘導を引き起こす
ＴＲＡＩＬ遺伝子プロモーターを使用するＴＲＡＩＬ抵抗性ＢａｘヌルＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞において行われた細胞ベースの生物発光レポータースクリーニングによって、小分子ＴＩＣ１０がＴＲＡＩＬ誘導化合物として得られた。
【０１５６】
ＴＩＣ１０は、Ｔａｋｉｍｏｔｏら、２０００，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，１７３５−１７４３において特定されたｐ５３ＤＮＡ結合応答エレメントを除外するＴＲＡＩＬプロモーターの最初の５０４塩基対の調節制御下のルシフェラーゼレポーター構築物のＴＲＡＩＬプロモーター依存的転写活性を誘導した。図１は、転写開始の上流のヒトＴＲＡＩＬ遺伝子プロモーターの最初の５０４塩基対の転写調節下のＨＣＴ１１６  Ｂａｘ−／−細胞におけるルシフェラーゼレポーターの活性を示しているグラフである（ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１５７】
ＴＩＣ１０は、ＴＲＡＩＬメッセンジャーＲＮＡの用量依存的増加を引き起こした。図２は、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ解析を示しているグラフである（４８時間、ｎ＝４）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。ＴＩＣ１０は、いくつかの癌細胞株の細胞表面に局在するＴＲＡＩＬタンパク質の用量依存的増加をｐ５３非依存的様式で引き起こした。図３は、癌細胞のパネルにおける、ＴＩＣ１０によって誘導された表面ＴＲＡＩＬレベルを示しているグラフである（１０μＭ、７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１５８】
ＴＩＣ１０曝露によって、癌細胞の細胞表面上にＴＲＡＩＬが有意かつ持続的に存在するようになる。経時的解析から、ＴＲＡＩＬが、遅発の事象として細胞表面に局在したが、培地からＴＩＣ１０を除去した後でさえもこの誘導は時間的に持続することができることが見出された。図４は、表示の条件および時点における、ＴＩＣ１０処置後のＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞における表面ＴＲＡＩＬレベルを示しているグラフである（ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。図５は、ＴＩＣ１０処置開始の７２時間後における、フローサイトメトリーによるＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−ＴＲＡＩＬ表面レベルを示しているグラフである（５μＭ、ｎ＝３）。細胞を、プレインキュベーションの表示の時間にわたって処理し、次いで、７２時間後の解析までの残りの時間にわたって、薬物を含まない培地に交換した。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１５９】
ＴＩＣ１０はＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスを誘導する
ＴＩＣ１０は、等用量において正常な線維芽細胞の細胞周期プロファイルを変更せずに、ＴＲＡＩＬ感受性ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞における細胞死を示唆するｓｕｂ−Ｇ１のＤＮＡ含有量を誘導した。図６は、ＴＩＣ１０で処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−およびＨＦＦ細胞の細胞周期プロファイルを示している（５μＭ、７２時間、ｎ＝３）。
【０１６０】
ＴＩＣ１０は、正常な線維芽細胞を残しつつ、癌細胞株のクローン原性生存を減少させた。図７は、ＴＩＣ１０で処理された癌細胞のコロニー形成アッセイの定量を示しているグラフである（１０μＭ、７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。図８は、終了時点においてＨＦＦ細胞を数えたこと以外は図７におけるような類似の実験を示しているグラフである（ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。
【０１６１】
ＴＩＣ１０は、ｐ５３非依存的かつＢａｘ依存的様式においてｓｕｂ−Ｇ１含有量を誘導した。図９は、７２時間にわたるＤＭＳＯ、ＴＩＣ１０（１、５または１０μＭ）またはｒｈＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）による処理後の、ＨＣＴ１１６  ＷＴ、ｐ５３−／−およびＢａｘ−／−細胞のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである（ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１６２】
アポトーシス細胞死に一致して、５μＭ  ＴＩＣ１０で７２時間処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞における免疫蛍光アッセイによって、および１μＭ、２．５μＭ、５μＭまたは１０μＭ  ＴＩＣ１０で７２時間処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるウエスタンブロット解析によって示されるように、ＴＩＣ１０は、活性なカスパーゼ−３のレベルを上昇させた。図１０は、ウエスタンブロット解析の結果を示している像である。ＴＩＣ１０によって誘導されるｓｕｂ−Ｇ１含有量は、パンカスパーゼアポトーシス阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋと同時にインキュベートすることによって、有意に阻害された。図１１は、ｚＶＡＤ−ｆｍｋとともにプレインキュベートされたまたはｚＶＡＤ−ｆｍｋなしでプレインキュベートされた、ＴＩＣ１０処理癌細胞のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである（１０μＭ、７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１６３】
ＴＩＣ１０によって誘導されるアポトーシスは、ｓｈＲＮＡによるＴＲＡＩＬの安定的なノックダウン後のＴＩＣ１０誘導性細胞傷害性の阻害によって示されるように、ＴＲＡＩＬによって特異的に媒介されるとみられる。図１２は、短ヘアピンＲＮＡによってＴＲＡＩＬが安定的にノックダウンされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである（７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。図１３は、ＴＩＣ１０処理細胞のフローサイトメトリー解析による、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｓｈＴＲＡＩＬノックダウンの実証を示しているグラフである（５μＭ、７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１６４】
ＴＩＣ１０によって誘導される腫瘍細胞死においてＴＲＡＩＬが必要であることに対する追加の証拠は、アポトーシス促進性のＴＲＡＩＬシグナル伝達を調節するＤＲ５デスドメインの破壊後に観察された。図１４は、内因性のＤＲ５、またはそのデスドメインがＥＧＦＰで置き換えられたＤＲ５構築物の過剰発現を有するＨ４６０細胞におけるＴＩＣ１０誘導性細胞死のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである（１０μＭ、７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１６５】
遮断抗体を使用することによるＴＲＡＩＬの実験的隔離は、ＴＩＣ１０によって誘導される腫瘍細胞死においてＴＲＡＩＬが必要であることを示した。図１５は、ＴＲＡＩＬ隔離抗体であるＲＩＫ−２の存在下または非存在下においてＤＭＳＯ、ＴＩＣ１０（１０μＭ）またはｒｈＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）で処理されたＨＣＴ１１６細胞のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである（７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１６６】
ヒト患者由来の摘出されたばかりの結腸腫瘍細胞におけるＴＩＣ１０の活性を調べたところ、ＴＩＣ１０が、ＴＲＡＩＬを誘導し、かつ５−ＦＵとは異なる強力な細胞傷害作用を誘導することが見出された。図１６は、摘出されたばかりの結腸癌細胞を用いたときの、ＴＩＣ１０によって誘導された表面ＴＲＡＩＬを示しているグラフである（１０μＭ、７２時間）。組織は、８５歳の女性患者から摘出された粘液性腺癌だった。データは、蛍光強度の中央値として表されている。図１７は、ＤＭＳＯ、ＴＩＣ１０（．６、１．２５、２．５、５、１０、２０μＭ）または５−ＦＵ（５μＭ）で処理された、図１６の初代結腸癌細胞の細胞生死判別アッセイの結果を示しているグラフである（ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。
【０１６７】
ＴＩＣ１０の細胞傷害活性は、ＴＲＡＩＬとは異なり、熱的に安定である。図１８は、ＴＩＣ１０（５μＭ）またはｒｈＴＲＡＩＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）が、表示の温度における１時間のプレインキュベート後のＨＣＴ１１６細胞における細胞生存率を低下させることができることを示しているグラフである（７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。
【０１６８】
ＴＩＣ１０はインビボにおいて強力なＴＲＡＩＬ媒介性抗腫瘍剤である
ＴＩＣ１０は、両方を複数回投与として投与したとき、ＴＲＡＩＬを用いたときに観察されるものに匹敵する程度にＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−異種移植片において腫瘍退縮を引き起こした。図１９は、灰色の垂直バーで示されているように０、３および６日目に投与された３回のＴＩＣ１０（ｉ．ｐ．）、ＴＲＡＩＬ（ｉ．ｖ．）またはビヒクル（ｉ．ｐ．）で処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−異種移植片を示しているグラフである（ｎ＝１０）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜．００５。
【０１６９】
ＨＣＴ１１６  ＷＴ）およびＲＫＯヒト結腸癌異種移植片を有するマウスにおける単回投与実験は、ＴＩＣ１０の強力な抗腫瘍活性を裏付け、所与の条件下のＲＫＯ異種移植片におけるＴＲＡＩＬの優位性を明らかに証明した。図２０は、ＴＩＣ１０またはビヒクルの単回ｉ．ｐ．注射を受けたルシフェラーゼ感染ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−異種移植片の生物発光イメージングの結果を示しているグラフである（ｎ＝６）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜．００５。
【０１７０】
図２１は、単回投与のＴＩＣ１０（ｉ．ｐ．）、ＴＲＡＩＬ（ｉ．ｖ．）またはビヒクル（ｉ．ｐ．、ｎ＝１０）によるＲＫＯ異種移植片を示しているグラフである。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜．００５。
【０１７１】
ＴＩＣ１０は、ＴＲＡＩＬの安定的なノックダウンによって有意に阻害される作用であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌異種移植片の退縮を誘導した一方で、ＴＲＡＩＬで処理された腫瘍は、進行した。図２２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ベクターまたはｓｈＴＲＡＩＬ異種移植片における、単回投与のＴＩＣ１０（ｉ．ｐ．）、ＴＲＡＩＬ（ｉ．ｖ．）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、ｉ．ｐ．）での処理開始後９日目の腫瘍体積の箱ひげ図である（ｎ＝８）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜．００５。５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのＴＩＣ１０による処置の２日後における、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ベクターおよびｓｈＴＲＡＩＬ異種移植片からの腫瘍のＴＵＮＥＬ染色は、ベクターで処理されたがｓｈＴＲＡＩＬで処理されていない細胞においてＴＵＮＥＬ染色の増加を示す。
【０１７２】
このことは、ＴＩＣ１０の抗腫瘍活性が、これらの条件下において単回投与として投与されたとき、ＴＲＡＩＬのそれよりも優れており、腫瘍細胞が産生するＴＲＡＩＬによって少なくとも部分的に調節されることを直接証明する。ＤＬＤ−１異種移植片では、ＴＩＣ１０は、処置の１週間後に腫瘍の停滞を誘導したが、ＴＲＡＩＬで処理された腫瘍は、単回投与後に進行した。図２３は、０日目に表示の濃度での単回投与としてＴＲＡＩＬ（ｉ．ｖ．）、ＴＩＣ１０（ｉ．ｐ．）またはＤＭＳＯ（ｉ．ｐ．）で処理されたＤＬＤ−１異種移植片の相対的な腫瘍体積を示しているグラフである（ｎ＝８）。
【０１７３】
腹腔内または経口送達による単回投与としてのＴＩＣ１０は、ＳＷ４８０異種移植片の持続的な退縮も誘導したことから、好ましいバイオアベイラビリティが示唆される。図２４は、ＳＷ４８０異種移植片における、０日目に処置された３０ｍｇ／ｋｇでの単回投与のＴＩＣ１０のｉ．ｐ．投与と経口投与との比較を示しているグラフである（ｎ＝６）。
【０１７４】
ＨＣＴ１１６異種移植片モデルにおける経口的に投与された単回投与のＴＩＣ１０の用量設定によって、２５ｍｇ／ｋｇにおける持続的な抗腫瘍の有効性が明らかになった。図２５は、ＨＣＴ１１６異種移植片において経口での単回投与として投与されたＴＩＣ１０またはビヒクルを示しているグラフである（ｎ＝６）。エラーバーは、反復実験の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜．００５。
【０１７５】
体重または肝臓の組織学的検査に対して有害作用が無いことに加えて、以前の異種移植片においてこの治療用量より４倍高い用量で送達された複数回投与において明らかな毒性が無いことは、ＴＩＣ１０が広い治療濃度域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）を有することを示唆している。図２６は、単回投与のＴＩＣ１０（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で処置された無胸腺雌ヌードマウスの体重を示しているグラフである。図２７は、４週間にわたる１週間に１回の経口ＴＩＣ１０の投与（２５ｍｇ／ｋｇ）による処置の第４週の終わりにおけるＣ５７／Ｂ６雌マウスの体重を示しているグラフである。ＴＩＣ１０（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）による処置の３日後に回収された無胸腺雌ヌードマウス由来の肝臓のＨ＆Ｅ染色による組織学的解析は、ＴＩＣ１０に明らかな毒性が無いことを示した。
【０１７６】
免疫適格性マウスが４週間にわたって毎週２５ｍｇ／ｋｇの経口ＴＩＣ１０に長期間曝露されても、表ＩＡおよびＩＢに示されるように、血清化学マーカーのパネルにはいかなる変化も生じなかった。
【０１７７】
表ＩＡおよびＩＢは、４週間にわたって毎週、ビヒクルまたはＴＩＣ１０（２５ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＣ５７／Ｂ６マウスの血清化学を示している。
【０１７８】
【表１】
2019019145.tif 000018
免疫適格性の前臨床癌モデルにおいてＴＩＣ１０の有効性を試験するために、リンパ腫を自然に発症するΕμ−Ｍｙｃトランスジェニックマウスを使用した。９〜１２週齢において安全であると証明された上記と同じ経口投薬スケジュールを使用した。ＴＩＣ１０は、これらのマウスの生存期間を４週間、有意に延長した。図２８は、第９〜１２週の間に毎週、経口ＴＩＣ１０（２５ｍｇ／ｋｇ）で処置されたΕμ−ｍｙｃの全生存を示しているグラフである。Ｐ値は、ログランク検定によって決定された。相対的な腫瘍体積のプロットについては、腫瘍サイズは、処置開始日と定義される０日目の腫瘍サイズに対して表されている。１４週齢におけるΕμ−ｍｙｃおよびＷＴ  Ｃ５７／Ｂ６の腋窩リンパ節のＨ＆Ｅ染色による組織学的解析から、ＴＩＣ１０に明らかな毒性が無いことが示された。
【０１７９】
ＴＩＣ１０と化学療法剤との相乗的な組み合わせ
驚いたことに（Ｓｙｒｐｒｉｓｉｎｇｌｙ）、ＴＩＣ１０とタキサン類のパクリタキセルおよびドセタキセル（商品名Ｔａｘｏｔｅｒｅ）との間のインビトロ相乗作用が観察される。図２９は、表示の条件においてパクリタキセルとともにＴＩＣ１０で処理されたＤＬＤ−１細胞の細胞生存率を示しているグラフである（７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。図３０は、表示の条件においてパクリタキセルとともにＴＩＣ１０で処理されたＳＷ６２０細胞の細胞生存率を示しているグラフである（７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。図３１は、表示の条件においてタキソテールとともにＴＩＣ１０で処理されたＤＬＤ−１細胞の細胞生存率を示しているグラフである（７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。図３２は、表示の条件においてタキソテールとともにＴＩＣ１０で処理されたＳＷ６２０細胞の細胞生存率を示しているグラフである（７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。
【０１８０】
ＴＩＣ１０とタキサンのパクリタキセルまたはドセタキセルのいずれかとの組み合わせが協力することにより、Ｈ４６０非小細胞肺癌異種移植において持続的な治癒がもたらされた。図３３は、Ｈ４６０異種移植において、単回投与として、ＴＩＣ１０（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）もしくはタキソテール（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の単独で、組み合わせで、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、ｉ．ｐ．）で処理した後に腫瘍組織を保持するコホートのパーセントを示しているグラフである（ｎ＝８）。図３４は、図３３に対する相対的な腫瘍体積のプロットを示しているグラフである。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。
【０１８１】
図３５は、Ｈ４６０異種移植において、単回投与として、ＴＩＣ１０（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）またはパクリタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の単独で、組み合わせで、またはビヒクル（ＤＭＳＯ、ｉ．ｐ．）で処理した後に腫瘍組織を保持するコホートのパーセントを示しているグラフである（ｎ＝８）。図３６は、図３５に対する相対的な腫瘍体積のプロットを示しているグラフである。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。
【０１８２】
この実施例において、ＴＩＣ１０とベバシズマブの両方を、ｐ５３欠損直腸結腸癌の転移性同所性マウスモデルにおいて１週間に１回与えたとき、ＴＩＣ１０はベバシズマブと協力することにより、原発の盲腸腫瘍および遠位の転移部位（肺、肝臓、リンパ節および腹膜を含む）における腫瘍の出現率を減少させると見出された。図３７は、盲腸内にＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−腫瘍を移植され、終了時点において原発および遠位の部位に明白な腫瘍を有したコホートのパーセントを示しているグラフである（ｎ＝５）。時系列によって示されるように、処置を、移植の２週間後から開始して１週間に１回行い、コホートに、ビヒクル、ＴＩＣ１０（２５ｍｇ／ｋｇ、経口）、ベバシズマブ（ｂｅｖ、１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）またはＴＩＣ１０とベバシズマブとの組み合わせを投与した。
【０１８３】
ＴＩＣ１０の単独およびベバシズマブとの組み合わせは、この複数回投与レジメンを用いたとき、十分許容され、終了時点において体重を有意に変化させなかった。図３８は、終了時点におけるマウスの体重を示しているグラフである。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。
【０１８４】
ＴＩＣ１０は、ＴＲＡＩＬによって媒介される直接的な効果およびバイスタンダー効果によって、腫瘍特異的細胞死を引き起こす
０日目にＴＩＣ１０を単回投与（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）した後のＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−異種移植腫瘍の免疫組織化学的（ＩＨＣ）解析から、ＴＲＡＩＬ、およびＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに関与するイニシエーターカスパーゼである切断型カスパーゼ−８のタンパク質レベルの上昇が明らかになった。
【０１８５】
組織学的検査によって観察された断片化された核、およびＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識）染色の増大から、処置された腫瘍においてＴＩＣ１０がアポトーシスを誘導したことがさらに確認された。さらに、処置の２日後にＴＩＣ１０（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）またはビヒクルで処置した後における、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−異種移植片腫瘍の腫瘍と間質線維芽細胞との境界におけるＴＲＡＩＬに対するＨ＆ＥおよびＩＨＣ解析によって示されるように、ＴＩＣ１０は、腫瘍においてだけでなく、腫瘍を縁取る間質線維芽細胞においてもＴＲＡＩＬを誘導した。
【０１８６】
線維芽細胞におけるＴＩＣ１０誘導性ＴＲＡＩＬの発現に注目して、ＴＩＣ１０で処置された腫瘍を有しないマウスにおける可溶性ＴＲＡＩＬをアッセイして、正常細胞がＴＩＣ１０に応答してＴＲＡＩＬを分泌するかを判定した。ＴＩＣ１０は、組換えＴＲＡＩＬの血清半減期（約３０分）より長い７２時間を超えて続く様式でＴＲＡＩＬの血清レベルを急速に上昇させる。図３９は、ＴＩＣ１０（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）またはドキソルビシン（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の後の、腫瘍を有しないマウスにおけるＴＲＡＩＬ血清レベルを示しているグラフである（ｎ＝２）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。
【０１８７】
ＴＩＣ１０によって誘導された血清ＴＲＡＩＬが、投与の２時間後もの早さで検出され、これは、本明細書中に記載される実施例においてインビトロで観察された動態よりも急速である。薬物動態解析から、ＴＩＣ１０が、直ちに分配され、約６．５時間という血漿半減期を有することが明らかになった。表ＩＩは、Ｃ５７Ｂ６マウスの血漿中のＴＩＣ１０の薬物動態解析の結果を示している。図４０は、２３９ｎｍにおけるピーク吸光度を有するＴＩＣ１０の吸光度プロファイルを示しているグラフである。図４１は、マウス血漿に添加され、ＨＰＬＣ解析によって曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して定量された、ＴＩＣ１０に対する検量線を示しているグラフである。図４２は、Ｃ５７／Ｂ６雌マウスに２５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した後のＴＩＣ１０の血漿濃度を示しているグラフである（ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験の標準誤差の平均値を示している。
【０１８８】
【表２】
2019019145.tif 000019
ＴＩＣ１０は、組換えＴＲＡＩＬより長い半減期を有し、ＴＩＣ１０の効果、すなわち、ＴＲＡＩＬの誘導は、インビトロで見られるようにインビボにおいて数日間にわたって時間的に持続される。
【０１８９】
０日目にＴＩＣ１０（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を投与された後の、腫瘍を有しない無胸腺ヌードマウスの正常組織のＩＨＣ解析から、組織学的検査およびＴＵＮＥＬ染色によって判定されたとき、明らかな毒性なしにマウスの脳、腎臓および脾臓のタンパク質レベルにおいてＴＲＡＩＬがアップレギュレートされることが明らかになった。ＴＩＣ１０に応答したＴＲＡＩＬのアップレギュレーションは、いずれの時点においても肝臓を含む他の組織では顕著でなかった。
【０１９０】
正常な線維芽細胞に対するＴＩＣ１０の効果および正常細胞に対するその選択性を、この実施例において試験した。ＴＩＣ１０は、ｐ５３欠損腫瘍細胞においてアポトーシスを選択的に誘導したが、ＴＩＣ１０（１０μＭ）またはＤＭＳＯで３日間処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−およびＨＦＦ細胞を使用した共培養実験における正常な線維芽細胞ではアポトーシスを誘導しなかった。
【０１９１】
ＴＩＣ１０は、有意であるが中程度の量のＴＲＡＩＬを正常な線維芽細胞の表面上に誘導する。図４３は、ＴＩＣ１０処置（左から右に向かって０、２．５、５または１０μＭ）後のＨＦＦ細胞の表面ＴＲＡＩＬの解析を示しているグラフである（７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１９２】
正常細胞が、ＴＲＡＩＬ媒介性のバイスタンダー効果を介したＴＩＣ１０の抗腫瘍性の有効性に寄与するかを試験するために、ＴＩＣ１０とともにプレインキュベートさせた正常な線維芽細胞を、ｐ５３欠損結腸癌細胞との共培養物に移植した。これにより、癌細胞の部分集団のＴＲＡＩＬ特異的細胞死が中程度であるが有意に増加した。図４４は、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞と前処理されたＨＦＦとの共培養物のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである（２４時間、ｎ＝３）。ＨＦＦの前処理は、ＴＩＣ１０（１０μＭ）またはＤＭＳＯとの７２時間にわたるインキュベーションからなるものだった。これらの実験は、ＴＲＡＩＬ隔離抗体（ＲＩＫ−２）の存在下または非存在下において行われた。スケールバーは、１００μｍである。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１９３】
したがって、本明細書中で証明されるように、ＴＩＣ１０は、好ましい治療指数を有し、腫瘍細胞、間質細胞および正常細胞においてＴＲＡＩＬを誘導し、これは、直接的な機序ならびにバイスタンダー機序を介したＴＩＣ１０の抗腫瘍性の有効性に寄与し得る。
【０１９４】
ＴＩＣ１０は多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）において効果的な抗腫瘍剤である
ＴＩＣ１０は、脳においてＴＲＡＩＬを誘導し、脳腫瘍に対する抗腫瘍剤として有用である。この実施例において、ＧＢＭ細胞株におけるＴＩＣ１０の活性を試験したところ、ＴＩＣ１０が、ＴＲＡＩＬを誘導し、他の癌細胞株と同程度の低マイクロモル濃度の範囲のｐ５３非依存的ＧＩ５０を有することが見出された。図４５は、ＴＩＣ１０とともにインキュベートした後のＧＢＭ細胞株における表面ＴＲＡＩＬを示しているグラフである（５μＭ、７２時間、ｎ＝３）。表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。図４６は、ＴＩＣ１０またはＤＭＳＯによる処置の７２時間後における表示のＧＢＭ細胞株の細胞生死判別アッセイから外挿されたＧＩ５０値を示しているグラフである（ｎ＝３）。
【０１９５】
ＴＩＣ１０は、テモゾロマイド抵抗性でありかつこの実施例において事前に放射線照射された単離されたばかりのＧＢＭ細胞に対して細胞傷害作用を有する。図４７は、ＤＭＳＯ、ＴＩＣ１０またはテモゾロマイド（ＴＭＺ、１０μＭ）で処理された摘出されたばかりの神経膠芽腫組織の細胞生死判別アッセイの結果を示している（７２時間、ｎ＝３）。組織は、事前に腫瘍縮小術および放射線照射を受けていた３８歳の女性患者から採取された乏突起膠腫細胞の構成要素を含むグレードＩＶの神経膠芽腫だった。
【０１９６】
単剤（ｍｏｎｏａｇｅｎｔ）としておよびベバシズマブとの併用でのＧＢＭの前臨床モデルにおいてＴＩＣ１０を試験した。ＴＩＣ１０は、ＧＢＭ細胞株のパネル（Ｔ９８Ｇなどのテモゾロマイド抵抗性ＧＢＭ細胞株を含む）に対してｐ５３非依存的細胞傷害性を発揮し、経口での単回投与として与えられたとき、ベバシズマブと類似の程度まで皮下Ｔ９８Ｇ異種移植片の持続的な退縮を誘導した。図４８は、０日目にビヒクル、ＴＩＣ１０（３０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ）またはベバシズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の単回投与を受けたマウスのＴ９８Ｇの皮下異種移植片を示しているグラフである（ｎ＝８）。表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０１９７】
単回投与のＴＩＣ１０は、ＳＦ７６７細胞株を使用するヒトＧＢＭの侵襲性頭蓋内異種移植における単剤として、マウスの全生存を有意に倍増させ、ベバシズマブと協力することにより、そのような脳腫瘍を有するマウスの生存期間を３倍にした。
【０１９８】
図４９は、移植の２週間後に経口での単回投与のビヒクル（ｎ＝８）、ＴＩＣ１０（２５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、ベバシズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、ｎ＝６）またはＴＩＣ１０およびベバシズマブ（ｎ＝７）で処置された、ＳＦ７６７頭蓋内腫瘍を有するマウスの全生存を示しているグラフである。
【０１９９】
表ＩＩＩは、ＳＦ７６７頭蓋内腫瘍を有するマウスコホートの全生存の変化を示している。
【０２００】
【表３】
2019019145.tif 000020
ＴＩＣ１０誘導性ＴＲＡＩＬのアップレギュレーションはＦｏｘｏ３ａ依存的である
ＴＩＣ１０誘導性ＴＲＡＩＬのアップレギュレーションを支持する分子事象を特定するために、ＴＩＣ１０で処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞における遺伝子発現プロファイルを測定した。ＦＯＸＯファミリーの転写因子（Ｍｏｄｕｒ，Ｖ．ら、２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４７９２８−４７９３７に記載されているように選択される領域内に含まれる結合部位におけるＴＲＡＩＬ遺伝子プロモーターを制御すると以前に示されているＦｏｘｏ３ａを含む）の標的遺伝子の転写の変化が観察された。図５０は、ＤＭＳＯと比べて、ＴＩＣ１０処理（１０μＭ）の４８時間後におけるＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の遺伝子発現プロファイリングからのＦＯＸＯシグナル伝達に関連する転写の変化を示しているグラフである（ｎ＝３）。これらの変化のすべてが、ＤＭＳＯ処置群とＴＩＣ１０処置群との間においてＰ＜．０５だった。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０２０１】
ＦＯＸＯ標的遺伝子ＤＲ５は、いくつかの癌細胞株およびそれほどではないにせよ正常細胞においてＴＩＣ１０によってアップレギュレートされ、これは、ＴＩＣ１０で処理された腫瘍でも観察された。図５１は、表示の濃度のＴＩＣ１０またはＤＭＳＯで７２時間処理されたＨＣＴ１１６細胞におけるＤＲ５のウエスタンブロット解析の像である。Ｒａｎは、充填コントロールとして示されている。図５２は、ＴＩＣ１０で処理された癌細胞および正常細胞における表面ＤＲ５レベルのフローサイトメトリー解析を示しているグラフである（７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０２０２】
ビヒクル（ｉ．ｐ．）またはＴＩＣ１０（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で処理されたＨＣＴ１１６異種移植片腫瘍におけるＤＲ５のＩＨＣ解析は、インビトロでの観察結果と一致して、ＴＩＣ１０で処理された異種移植片腫瘍においてＤＲ５の高発現が明白だったことを示している。
【０２０３】
ＦＯＸＯファミリーのメンバーであるＦｏｘｏ３ａは、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦｏｘｏ３ａの免疫蛍光法およびウエスタンブロット解析、ならびにＤＭＳＯまたはＴＩＣ１０，１０μＭで４８時間処理されたＨ４６０およびＳＷ４８０細胞におけるＦｏｘｏ３ａの免疫蛍光解析によって測定されたとき、ＴＩＣ１０に応答して核移行を起こした（が、Ｆｏｘｏ１ａは起こさなかった）。
【０２０４】
図５３は、ＤＭＳＯまたはＴＩＣ１０（４８時間、１０μＭ）で処理されたＨＣＴ１１６細胞の細胞全体の可溶化物（Ｗ）ならびに細胞質（Ｃ）および核（Ｎ）の抽出物のウエスタンブロット解析の像である。β−アクチンおよびラミンＢ１は、それぞれ細胞質および核の充填コントロールとして示されている。
【０２０５】
クロマチン免疫沈降アッセイによって示されるようなＴＲＡＩＬプロモーターに局在するＦｏｘｏ３ａの量のＴＩＣ１０用量依存的増加が見出された。図５４は、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるＴＩＣ１０処置（左から右に向かって０、２．５、５または１０μＭ）の４８時間後の、ＴＲＡＩＬプロモーターに対するＦｏｘｏ３ａのＴＩＣ１０誘導性移行についてのクロマチン免疫沈降アッセイの結果の像である。
【０２０６】
Ｆｏｘｏ３ａおよびＦｏｘｏ１の一過性ノックダウンから、Ｆｏｘｏ３ａがＴＩＣ１０誘導性ＴＲＡＩＬのアップレギュレーションを特異的に媒介することが明らかになった。図５５は、ｓｉＲＮＡを使用したＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるＦｏｘｏ１および／またはＦｏｘｏ３ａの一過性ノックダウン有りまたは無しでのＴＩＣ１０（１０μＭ）によって誘導された細胞表面ＴＲＡＩＬレベルのフローサイトメトリー解析の結果を示しているグラフである（７２時間、ｎ＝３）。ノックダウンは、ウエスタンブロット解析によって確認される。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０２０７】
Ｆｏｘｏ３ａの安定的なノックダウンは、ＴＩＣ１０誘導性ＴＲＡＩＬ産生のアップレギュレーションおよびその後の腫瘍細胞死を有意に阻害した。図５６は、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦｏｘｏ３ａの安定的なノックダウン有りまたは無しにおけるＴＩＣ１０誘導性細胞死のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである（１０μＭ、７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。図５７は、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦｏｘｏ３ａの安定的なノックダウン有りまたは無しにおけるＴＩＣ１０によって誘導される表面ＴＲＡＩＬのフローサイトメトリー解析を示しているグラフである（１０μＭ、７２時間、ｎ＝３）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。Ｆｏｘｏ３ａの安定的なノックダウンの結果は、ウエスタンブロット解析によって確認された。
【０２０８】
腫瘍細胞におけるＦｏｘｏ３ａの安定的なノックダウンは、インビボでの腫瘍において、ＴＩＣ１０の抗腫瘍活性、およびＴＩＣ１０によって誘導されるＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスの特徴も有意に阻害した。図５８は、０日目におけるビヒクルまたはＴＩＣ１０（２５ｍｇ／ｋｇ）の経口での単回投与後の、Ｆｏｘｏ３ａの安定的なノックダウン有りまたは無しにおけるＨＣＴ１１６異種移植片の腫瘍体積を示しているグラフである（ｎ＝１０）。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０２０９】
ＴＩＣ１０（２５ｍｇ／ｋｇ、経口）の単回投与の３日後に、Ｆｏｘｏ３ａの安定的なノックダウンの有りまたは無しにおけるＨＣＴ１１６腫瘍のＩＨＣ解析およびＴＵＮＥＬ染色を行い、それらは、腫瘍細胞におけるＦｏｘｏ３ａの安定的なノックダウンが、インビボでの腫瘍において、ＴＩＣ１０の抗腫瘍活性、およびＴＩＣ１０によって誘導されるＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスの特徴も有意に阻害することを示した。
【０２１０】
ＴＩＣ１０によるＡｋｔおよびＥＲＫの二重の不活性化は協同的にＴＲＡＩＬを誘導する
Ｆｏｘｏ３ａの制御因子（例えば、ＩＫＫ、ＡｋｔおよびＥＲＫ）の、ＴＩＣ１０によって誘導される変化を測定した。図５９は、ＴＩＣ１０（２．５、５、１０μＭ）で７２時間処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞のウエスタンブロット解析の像である。
【０２１１】
ｐＡｋｔとｐＥＲＫの両方のレベルが、Ｆｏｘｏ３ａ上のそれぞれのリン酸化部位の脱リン酸化と同時のＴＩＣ１０処理によって用量依存的様式で消滅することが見出された。経時的解析から、Ｆｏｘｏ３ａの脱リン酸化およびＴＲＡＩＬのアップレギュレーションと協調する動態である、ＴＩＣ１０によって誘導されるＡｋｔおよびＥＲＫの不活性化が４８時間後に生じたことが明らかになった。図６０は、表示の時間にわたってＴＩＣ１０（１０μＭ）で処理されたＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞のウエスタンブロット解析の像である。図６１は、図６０におけるような反復実験のウエスタンブロットのデンシトメトリーによって測定された、ＴＩＣ１０によって誘導される効果のタンパク質発現レベルの時間経過を示しているグラフである（ｎ＝３）。データは、各時点に対するコントロールサンプルに対して表されており、Ｒａｎに対して正規化されている。並行の実験としてフローサイトメトリーによってＴＲＡＩＬを定量した（ｎ＝３）。
【０２１２】
これらのＦｏｘｏ３ａに対するＴＩＣ１０によって誘導される効果は、種々の腫瘍タイプのいくつかの癌細胞株（ｐ５３、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮなどに発癌性の変化を含む多様な遺伝的背景を有するヒト癌細胞株を含む）において明白だった。図６２は、ＤＬＤ１ヒト結腸癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞およびＴ９８Ｇヒト多形神経膠芽腫細胞株におけるＦｏｘｏ３ａに対するＴＩＣ１０によって誘導される効果のウエスタンブロット解析の像である（１０μＭ、７２時間）。
【０２１３】
Ａｋｔは、ＴＩＣ１０およびそのＴＲＡＩＬアップレギュレーションに対する細胞傷害性感受性の決定因子であると見出されており、ＴＩＣ１０処理（１０μＭ、４８時間）を受けた、空ベクターまたはミリスチル化Ａｋｔ（ｍｙｒ−Ａｋｔ）を過剰発現しているＨＣＴ１１６細胞におけるＦｏｘｏ３ａの免疫蛍光解析によって示されるように、Ａｋｔの過剰活性化は、基礎レベルのＴＲＡＩＬでさえも抑制し得る。ウエスタンブロット解析によるｍｙｒ−Ａｋｔの過剰発現の確認は、図６３に示されている。図６４は、ＴＩＣ１０処置（１０μＭ、４８時間）を受けた、空ベクターまたはミリスチル化Ａｋｔ（ｍｙｒ−Ａｋｔ）を過剰発現しているＨＣＴ１１６細胞における表面ＴＲＡＩＬのフローサイトメトリー解析を示しているグラフである。図６５は、ＴＩＣ１０処理を受けた、空ベクターまたはｍｙｒ−Ａｋｔを過剰発現しているＨＣＴ１１６細胞のｓｕｂ−Ｇ１含有量を示しているグラフである（１０μＭ、７２時間、ｎ＝３）。
【０２１４】
ＡｋｔおよびＭＡＰＫ経路の二重阻害は、協同的にＦｏｘｏ３ａの核移行およびそれに続くＴＲＡＩＬのアップレギュレーションをもたらす。Ａ６７３０およびＵ０１２６モノエタノレートは、商業的に入手可能であり、Ａｋｔ１／２（Ｄｅｓｐｌａｔ，Ｖ．ら、２００８，Ｊ．Ｅｎｚ．Ｉｎｈｉｂ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２３：６４８−６５８）およびＭＥＫ（Ｆａｖａｔａ，Ｍ．Ｆ．ら、１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１８６２３−１８６３２）の以前に報告されている阻害剤であり、それらは、ＡｋｔおよびＭＡＰＫ経路の二重阻害が、協同的にＦｏｘｏ３ａの核移行およびそれに続くＴＲＡＩＬアップレギュレーションをもたらすかを判定するために、この実施例においてそれぞれ使用された。ＭＥＫ阻害剤とＡｋｔ阻害剤との組み合わせは、Ｆｏｘｏ３ａ依存的ＴＲＡＩＬアップレギュレーションを協同的におよびＴＲＡＩＬ媒介性細胞死を相乗的に誘導すると見出された。図６６は、１０μＭ  Ａ６７３０（Ａｋｔ阻害剤（Ａｋｔ  ｉｎｈ））、Ｕ０１２６モノエタノレート（ＭＥＫ阻害剤（ＭＥＫ  ｉｎｈ））またはその両方とともにインキュベートした後のＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ解析を示しているグラフである（４８時間、ｎ＝３）。Ａｋｔ＋ＭＥＫ  ｉｎｈについては、他のすべての条件と比較してＰ＜．０５。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０２１５】
図６７は、Ｆｏｘｏ３ａの安定的なノックダウン有りまたは無しでの、図６６におけるような表面ＴＲＡＩＬの誘導を示しているグラフである（ｎ＝３）。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。
【０２１６】
図６８は、１０μＭ  Ａｋｔ  ｉｎｈ、ＭＥＫ  ｉｎｈまたはその両方とともに４８時間インキュベートした後の、ｓｈＲＮＡによるＴＲＡＩＬノックダウンの有りまたは無しにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１のｓｕｂ−Ｇ１解析を示しているグラフである（ｎ＝３）。別段示されない限り、表示の条件とコントロールとの間において＊Ｐ＜０．０５。図６９は、１０μＭ  Ａ６７３０（Ａｋｔ  ｉｎｈ）、Ｕ０１２６モノエタノレート（ＭＥＫ
ｉｎｈ）またはその両方とともにインキュベートした後のＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞の表面ＴＲＡＩＬ解析を示しているグラフである（４８時間、ｎ＝３）。
【０２１７】
この実施例におけるｓｉＲＮＡ実験は、ＥＲＫおよびＡｋｔが阻害されることにより、ＴＲＡＩＬを協同的にアップレギュレートできることを示す。図７０は、ＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞におけるＡｋｔおよび／またはＥＲＫの一過性ノックダウン後（ノックダウンの４８時間後）のＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ解析を示しているグラフである（ｎ＝３）。ｓｉＥＲＫおよびｓｉＡｋｔの組み合わせについては、他のすべての条件と比較してＰ＜．０５。
【０２１８】
図７１は、ウエスタンブロット解析による、ＡｋｔおよびＥＲＫノックダウンの確認を示している像である。エラーバーは、反復実験のｓ．ｄ．を示している。図７２は、ＨＣＴ１１６細胞におけるＡｋｔおよび／またはＥＲＫの一過性ノックダウン後（ノックダウンの４８時間後）の表面ＴＲＡＩＬ解析を示しているグラフである（ｎ＝３）。
【０２１９】
ＴＩＣ１０は、ＡｋｔおよびＥＲＫ（これらは、インビボにおいて細胞死および強力な抗腫瘍効果を増強するユニークな標的遺伝子としてＴＲＡＩＬ遺伝子を転写的に誘導するそれらの相互の基質Ｆｏｘｏ３ａの核移行を協同的にもたらす）の二重不活性化を引き起こす。
【０２２０】
この明細書において言及されたいずれの特許または刊行物も、各個別の刊行物が、参照により援用されると明確かつ個別に示されたかのように同程度に本明細書中に参照により援用される。
【０２２１】
本明細書中に記載される組成物および方法は、現在、好ましい態様の代表であり、例示的であり、本発明の範囲に対する限定と意図されていない。本明細書中の変更および他の使用が当業者には思い当たるだろう。そのような変更および他の使用は、請求項に示されるような本発明の範囲から逸脱することなく、行われ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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