(57)【要約】  【課題】プロテアーゼ耐性が高い変異β−グルコシダーゼの提供。  【解決手段】配列番号２と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列であって、配列番号１の６４９位及び６５５位に相当する位置にそれぞれＧｌｎとＴｈｒを有するか、又は配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域にＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを有するアミノ酸配列を含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有する、変異β−グルコシダーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（i）、（ii）及び(iii)から選択される変異β−グルコシダーゼ：
（i）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基がＧｌｎに、かつ配列番号１の６５５位に相当する位置のアミノ酸残基がＴｈｒに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（ii）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列がＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（iii）該（i）又は（ii）のポリペプチドを含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の変異β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項４】
請求項２記載のポリヌクレオチド又は請求項３記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
糸状菌である、請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項１記載の変異β−グルコシダーゼを含有するバイオマス糖化剤。
【請求項７】
請求項１記載の変異β−グルコシダーゼでバイオマスを糖化することを含む、糖の製造方法。
【請求項８】
変異β−グルコシダーゼの製造方法であって、
（a）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基をＧｌｎに、かつ配列番号１の６５５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴｈｒに置換すること、又は
（b）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列をＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに置換すること、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異β−グルコシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースを含有するバイオマス材料（以下、「バイオマス」ということがある）中のセルロースから糖を製造し、それを発酵法などでエタノールをはじめとするエネルギーや化学品へ変換する技術が知られている。近年の環境問題への取り組みの観点から、バイオマスの工業的利用に関する様々な技術開発が進み、バイオマスを利用した燃料や化学品の大規模製造も実現化している。
【０００３】
バイオマスは、セルロース繊維と、それを取り巻く、キシランを主に含むヘミセルロース、及びリグニンとから構成されている。バイオマスを原料とした糖の製造では、セルロースやヘミセルロースの糖化効率を高めることが重要であり、そのためには、セルロースやヘミセルロースを加水分解するセルラーゼやヘミセルラーゼなどのバイオマス糖化酵素が必要となる。例えば、セルロースを効率よくグルコースへ分解するためには、少なくとも（1）結晶性及び非結晶性のセルロース繊維の末端からセロビオース単位で糖を切り出すセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）、（2）非結晶性セルロースに作用してセルロース鎖に切れ目を入れるエンドグルカナーゼ（ＥＧ）、及び（3）これらの酵素により生成したセロビオースを加水分解してグルコースを生成するβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）の３種類のセルラーゼが協調して作用する必要がある。
【０００４】
バイオマスの糖化に使用されるセルラーゼを生産する菌として、トリコデルマ属（Trichoderma）微生物、例えば、トリコデルマ・リーゼ（Trichoderma reesei）やトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）が有名である。しかしながら、トリコデルマ属微生物由来のセルラーゼを用いたバイオマス糖化では、β−グルコシダーゼ活性が相対的に低いことが指摘されている（非特許文献１）。アスペルギルス・アクリータス（Aspergillus aculeatus）のβ−グルコシダーゼをトリコデルマ属微生物で発現させ、トリコデルマ属微生物由来酵素のバイオマス糖化活性を高める技術が開発されている（例えば非特許文献１、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開公報第２０１３／１１５３０５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】森川  康、バイオマス分解酵素研究の最前線、2012、シーエムシー出版、p10-19
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、より効率的にバイオマスを糖化することができるβ−グルコシダーゼ変異体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、微生物に生産されたアスペルギルス属由来のβ−グルコシダーゼが、該微生物由来のプロテアーゼにより約１００ｋＤａと約３０ｋＤａの２つのポリペプチドに切断されることを見出した。これら切断された２つのポリペプチドは、非共有結合でつながり切断前と同じ立体構造を保った１つのタンパク質として働くため、該切断自体が酵素のβ−グルコシダーゼ活性に影響することはない。しかし、この切断が発端となって該酵素がさらに分解を受けることにより、そのβ−グルコシダーゼ活性が消失する。
【０００９】
本発明者らは、切断されたアスペルギルス属β−グルコシダーゼの約３０ｋＤａポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を解析し、プロテアーゼによる切断点がＶ６７５のＮ末側であることを同定した。この領域は、Ｘ線結晶構造解析により主鎖の位置が特定できないｄｉｓｏｒｄｅｒ領域と同定されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２０１３，４５２（２）：２１１−２２１）ことから、特定の構造を取っていないことでプロテアーゼなどの攻撃を受けやすくなっていると予想された。そこで本発明者らは、β−グルコシダーゼにおける当該切断点付近に変異を導入し、プロテアーゼ切断への影響を調べた。その結果、プロテアーゼ耐性の高い変異体を見出した。
【００１０】
したがって、本発明は、下記（i）、（ii）及び(iii)から選択される変異β−グルコシダーゼ：
（i）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基がＧｌｎに、かつ配列番号１の６５５位に相当する位置のアミノ酸残基がＴｈｒに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（ii）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列がＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（iii）該（i）又は（ii）のポリペプチドを含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
を提供する。
【００１１】
また本発明は、当該変異β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、当該ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
また本発明は、当該ポリヌクレオチド又はベクターを含む形質転換体を提供する。
また本発明は、当該変異β−グルコシダーゼを含有するバイオマス糖化剤を提供する。
また本発明は、当該変異β−グルコシダーゼでバイオマスを糖化することを含む、糖の製造方法を提供する。
【００１２】
さらに本発明は、変異β−グルコシダーゼの製造方法であって、
（a）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基をＧｌｎに、かつ配列番号２の６５５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴｈｒに置換すること、又は
（b）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列をＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに置換すること、
を含む、方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の変異β−グルコシダーゼは、プロテアーゼ耐性が高く、微生物により生産されるときに培地中でプロテアーゼによる分解を受けることなく、高い収量及びβ−グルコシダーゼ活性を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】野生型ＡａＢＧＬ１発現株の発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果。各レーン上の数字は培養日数を、Ｐは精製ＡａＢＧＬ１を示す。
【図２】Ｎ６４９Ｑ／Ｑ６５５Ｔ変異体発現株の発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果。各レーン上の数字は培養日数を、Ｐは精製変異体を示す。
【図３】６５３ＹＥＰＡＳＧ６５８変異体発現株の発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果。各レーン上の数字は培養日数を、Ｐは精製変異体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
【００１６】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列間の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。
【００１７】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関して記述する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性、さらに好ましくは９９．６％以上、さらに好ましくは９９．７％以上、さらに好ましくは９９．８％以上をいう。
【００１８】
本明細書において、アミノ酸の欠失、置換もしくは付加に関する「１〜複数個」とは、好ましくは１〜１６０個、より好ましくは１〜８０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。
【００１９】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」及び「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９４，２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
【００２０】
当業者であれば、上記で得られたアラインメントを、必要に応じて最適なアラインメントとなるようにさらに微調整することできる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；バリン、ロイシン及びイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドの位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、そこの当該アミノ酸残基又はヌクレオチドは「相当する位置のアミノ酸残基」又は「相当する位置のヌクレオチド」と称される。また、上述のアラインメントにより参照配列の任意の領域に対応する領域にアラインされた目的配列の領域は、当該任意の領域に「相当する領域」とみなされ、そこの当該アミノ酸配列又はヌクレオチド配列は「相当する領域のアミノ酸配列」又は「相当する領域のヌクレオチド配列」と称される。
【００２２】
本明細書において、「β−グルコシダーゼ」（あるいは「ＢＧＬ」とも称する）とは、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをいう。本明細書において、「β−グルコシダーゼ活性」とは、糖のβ−グリコシド結合を加水分解する活性をいい、好ましくは、セロビオースを加水分解してグルコースを生成する活性をいう。タンパク質のβ−グルコシダーゼ活性は、例えばｐＮＰ（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）法により、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドから酵素分解により遊離するｐＮＰの量を測定することによって決定することができる。β−グルコシダーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
【００２３】
本明細書において、「バイオマス」とは、植物や藻類が生産するセルロースを含むセルロース系バイオマスをいう。バイオマスの具体例としては、カラマツやヌマスギ等の針葉樹や、アブラヤシ（幹部）、ヒノキ等の広葉樹などから得られる各種木材；ウッドチップなどの木材の加工物又は粉砕物；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプなどのパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙などの紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲わら、とうもろこし茎もしくは葉などの植物の茎、葉、果房など；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻などの植物殻類；藻類、などからなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、入手容易性及び原料コストの観点から、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。該バイオマスは、単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。
【００２４】
本発明は、変異β−グルコシダーゼを提供する。本発明の変異β−グルコシダーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼを改変して、所定の位置のアミノ酸残基又は所定の領域のアミノ酸配列を置換することによって製造することができる。本発明の変異β−グルコシダーゼは、当該置換前のβ−グルコシダーゼ（親β−グルコシダーゼ）と比べてプロテアーゼ耐性が高く、プロテアーゼ分解を受けにくい。したがって、本発明の変異β−グルコシダーゼは、微生物により生産されるときに、培地中に存在する微生物由来のプロテアーゼによる分解を受けることなく、高い収量と活性を維持することができる。
【００２５】
したがって、一態様において、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列であって、配列番号１の６４９位及び６５５位に相当する位置にそれぞれＧｌｎとＴｈｒを有するか、又は配列番号２の６５３位から６５８位までに相当する領域にＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを有するアミノ酸配列を含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有する、変異β−グルコシダーゼを提供する。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明の変異β−グルコシダーゼは、下記（i）、（ii）及び(iii)から選択される：
（i）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基がＧｌｎに、かつ配列番号１の６５５位に相当する位置のアミノ酸残基がＴｈｒに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（ii）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列がＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（iii）該（i）又は（ii）のポリペプチドを含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【００２７】
別の態様において、本発明は、変異β−グルコシダーゼの製造方法を提供する。該方法は、以下の（a）又は（b）を含む：
（a）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基をＧｌｎに、かつ配列番号１の６５５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴｈｒに置換すること；
（b）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列をＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに置換すること。
【００２８】
本発明の変異β−グルコシダーゼ又はその製造方法において、当該配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列の好ましい例としては、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列；及び、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された（ただし配列番号１と少なくとも９０％同一な）アミノ酸配列、が挙げられる。
【００２９】
本明細書においては、上記アミノ酸置換を行う前の、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むβ−グルコシダーゼを、本発明の変異キシラナーゼの親β−グルコシダーゼ（又は、単に親β−グルコシダーゼもしくは親ＢＧＬ）ということがある。該親ＢＧＬにおいては、i）配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基がＧｌｎでなく、かつ６５５位に相当する位置のアミノ酸残基がＴｈｒでないか；ii）配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列がＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙでないか；又は、iii）該i）とii）の両方である。
【００３０】
当該親ＢＧＬの例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる、アスペルギルス・アクリータス（Aspergillus aculeatus）のβ−グルコシダーゼ１（本明細書においてＡａＢＧＬ１ともいう、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ１０９６８．１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４８８２５．１）が挙げられる。
【００３１】
当該親ＢＧＬの別の例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドの例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアスペルギルス属由来ＢＧＬが挙げられる。
【００３２】
当該親ＢＧＬのさらに別の例としては、上述したＡａＢＧＬ１（配列番号１）の変異体が挙げられる。このような変異体としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼが挙げられる。このような変異体は、天然に生じた変異体であってもよいが、人工的に作製されてもよい。
【００３３】
当該親ＢＧＬのさらに別の例としては、上述したＡａＢＧＬ１（配列番号１）又はその変異体と分泌シグナル配列とが連結した、ＢＧＬプレタンパク質が挙げられる。該プレタンパク質の好ましい例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配からなる、分泌シグナル配列を有するＡａＢＧＬ１のプレタンパク質が挙げられる。該プレタンパク質の別の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された（ただし配列番号１と少なくとも９０％同一な）アミノ酸配列からなるＢＧＬプレタンパク質が挙げられる。
【００３４】
好ましくは、上述した親ＢＧＬは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の６４９位に相当する位置にＡｓｎを、６５５位に相当する位置にＧｌｎを有する。また好ましくは、該親ＢＧＬは、配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域にＡｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒを有する。より好ましくは、該親ＢＧＬは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の６４９位に相当する位置にＡｓｎを、６５５位に相当する位置にＧｌｎを有し、かつ配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域にＡｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒを有する。
【００３５】
本発明の変異ＢＧＬは、例えば、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明の変異ＢＧＬは、当該変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。すなわち、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド又はこれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、当該形質転換体を適切な培地で培養し、導入したポリヌクレオチドを発現させることで、本発明の変異ＢＧＬが生産される。生産された変異ＢＧＬを該培養物から単離又は精製することにより、本発明の変異ＢＧＬを取得することができる。
【００３６】
したがって、本発明はさらに、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド、及びそれを含むベクターを提供する。本発明はさらに、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法を提供する。さらに本発明は、該ポリヌクレオチド又はベクターを含有する形質転換体を提供する。さらに本発明は、当該形質転換体を培養することを含む、変異ＢＧＬの製造方法を提供する。
【００３７】
本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００３８】
本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドは、該変異ＢＧＬのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的又は化学的に合成することができる。例えば、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、親ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド（以下、親ＢＧＬ遺伝子ともいう）において、配列番号１の６４９位及び６５５位に相当する位置のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を、それぞれＧｌｎ及びＴｈｒをコードするヌクレオチド配列（コドン）へと変異させることによって、調製することができる。あるいは、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、親ＢＧＬ遺伝子において、配列番号１の６５３〜６５８位に相当する領域をコードするヌクレオチド配列（コドン）を、Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙをコードするヌクレオチド配列（コドン）へと変異させることによって、調製することができる。当該変異したポリヌクレオチドを発現させることにより、置換対象のアミノ酸残基又は配列が目的のアミノ酸残基又は配列に置換された変異ＢＧＬを得ることができる。
【００３９】
親ＢＧＬ遺伝子の例としては、上述した配列番号１で示されるＡａＢＧＬ１をコードするポリヌクレオチド、その分泌シグナル配列を有するプレタンパク質（配列番号２）をコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。好ましい例としては、配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。当該ポリヌクレオチドは、当該分野で用いられる任意の方法により取得することができる。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓの全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号３の配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的核酸を選択的に増幅し、増幅した核酸を精製することで得ることができる。
【００４０】
あるいは、親ＢＧＬ遺伝子の例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列からなる上述した親ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。このようなポリヌクレオチドの例としては、上述したＡａＢＧＬ１又はその変異体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。親ＢＧＬ遺伝子は、天然に存在する遺伝子であってもよいが、配列番号１の配列に基づいて人工的に作製されてもよい。例えば、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（例えば配列番号３）に対して紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入し、得られた変異遺伝子がコードするポリペプチドのβ−グルコシダーゼ活性を調べる。所望の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を選択することによって、親ＢＧＬ遺伝子を得ることができる。必要に応じて、シークエンシング等により遺伝子配列を確認することができる。このような変異の手順は、当業者に周知である。
【００４１】
親ＢＧＬ遺伝子への目的の変異の導入は、当業者には周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。あるいは、親ＢＧＬ遺伝子への部位特異的変異導入は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｈｏｒｔｏｎ  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：６１−６８）、メガプライマー法などの公知の手法により行うことができる。
【００４２】
例えば、親ＢＧＬ遺伝子への部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、親ＢＧＬ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。置換対象及び置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し、選択することができる。
【００４３】
変異プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，７０５９−７０７１，１９８９）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。また変異プライマーは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて作製することもできる。変異プライマーを含むプライマーセットを使用し、親ＢＧＬ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
【００４４】
本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当該遺伝子をベクターに導入することによって作製することができる。当該ポリヌクレオチドを導入すべきベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。このうち、プラスミドベクターが好ましく、タンパク質の高発現を誘導するプラスミドベクターがより好ましい。当業者は、宿主細胞の種類にあわせて、好適なベクターを選択することができる。タンパク質発現用プラスミドベクターは、宿主に応じて作製してもよいが、市販品を使用してもよい。ベクターの例としては、酵母発現ベクターｐＮＡＮ８１４２（Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９６，６０：３８３−３８９）、ｐＭＡ９１（Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８，６２：１６１５−１６１８）などが挙げられる。
【００４５】
当該ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、当該ベクターにおいては、上記本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドに、プロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御領域が作動可能に連結されていてもよい。あるいは、当該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、本発明のベクターを導入する宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養をコードする遺伝子を含むベクターを用いてもよい。
【００４６】
当該制御領域の好適な例としては、Ｐ−Ｎｏ８１４２プロモーター（Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９６，６０：３８３−３８９）、トリコデルマ・リーゼ（Trichoderma reesei）由来ｃｂｈ１プロモーター配列（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ，１９９５，２８（１）：７１−７９）などが挙げられる。あるいは、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、βキシロシダーゼなどの糖化酵素を発現するプロモーターを使用してもよい。あるいは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどの代謝経路の酵素のプロモーターを使用してもよい。
【００４７】
本発明の変異ＢＧＬをコードする配列と上記制御領域や、マーカー遺伝子配列との連結は、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法などの方法によって行うことができる。ベクターへの遺伝子配列の導入手順は、当該分野で周知である。プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御領域の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。
【００４８】
本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド又はこれを含むベクターを含有する形質転換体は、該ベクターを宿主へ導入するか、又は該ポリヌクレオチドを宿主のゲノムに導入すればよい。宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
【００４９】
本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドを宿主のゲノムに導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。該ＤＮＡ断片は、上述する宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーター配列の下流に導入されてもよく、あるいは、予め該ＤＮＡ断片と上述した制御領域とを作動可能に連結した断片を作製し、当該連結断片を宿主のゲノムに導入してもよい。さらに、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリヌクレオチドが適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）と予め連結されていてもよい。
【００５０】
本明細書において、ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドと制御領域が「作動可能に連結されている」とは、該ポリヌクレオチドと制御領域が、該ポリヌクレオチドにコードされるＢＧＬが該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。
【００５１】
当該形質転換体の宿主の例としては、酵母、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。酵母の例として、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などが挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Escherichia coli）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、リステリア属（Listeria）、バチルス属（Bacillus）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ，２００７，１０４（２）：１３５−１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ，２０１１，３３（９）：１８４７−１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Trichoderma）、アスペルギルス属（Aspergillus）、リゾプス属（Rhizopus）などが挙げられ、このうち、酵素生産性の観点からはトリコデルマ属が好ましい。
【００５２】
斯くして得られた、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、当該ポリヌクレオチドが発現して、本発明の変異ＢＧＬが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。
【００５３】
あるいは、本発明の変異ＢＧＬは、無細胞翻訳系を使用して、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
【００５４】
上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明の変異ＢＧＬは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドと分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたＢＧＬは菌体外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたＢＧＬは、公知の手段でさらに精製されてもよい。
【００５５】
後述の実施例に示すとおり、本発明の変異β−グルコシダーゼは、変異前のβ−グルコシダーゼ（親ＢＧＬ）と比べてプロテアーゼ耐性が高い。結果、本発明の変異β−グルコシダーゼは、親ＢＧＬと比べて、微生物に生産されるときに培地中のプロテアーゼによる加水分解を受けにくいので、高いβ−グルコシダーゼ活性を保持しており、かつ収率も高い（図１〜３）。
【００５６】
本発明の変異β−グルコシダーゼは、バイオマス糖化用の酵素として有用である。したがって、本発明はさらに、本発明の変異β−グルコシダーゼを含有するバイオマス糖化剤を提供する。さらに本発明は、本発明の変異β−グルコシダーゼでバイオマス糖化することを含む、糖の製造方法を提供する。
【００５７】
本発明のバイオマス糖化剤は、好ましくは本発明の変異β−グルコシダーゼを含有するバイオマス糖化用の酵素組成物（以下、本発明の酵素組成物ということもある）である。本発明の酵素組成物は、本発明の変異ＢＧＬを含み、また糖化効率の向上の観点から、好ましくは、さらに本発明の変異ＢＧＬ以外の他のバイオマス糖化酵素を含む。当該他のバイオマス糖化酵素は、動物、植物、微生物由来の酵素であればよい。当該他のバイオマス糖化酵素の例としては、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、本発明の変異ＢＧＬ以外のＢＧＬ等の本発明の変異ＢＧＬ以外の他のセルラーゼや、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ等のヘミセルラーゼなどが挙げられ、好ましくは本発明の変異ＢＧＬ以外の他のセルラーゼであり、より好ましくはセロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選ばれる１種以上である。これらのバイオマス糖化酵素は、単独で使用されても２種以上の組合せで使用されてもよい。バイオマス糖化効率の向上の観点から、本発明の酵素組成物は、セロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選ばれる１種以上を含むことが好ましい。
【００５８】
本発明の酵素組成物に含まれる本発明の変異ＢＧＬ以外の他のセルラーゼの具体例としては、これらに限定されるものではないが、トリコデルマ・リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼ；トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）由来のセルラーゼ；バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ１４５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２７）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ２５２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７４）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ１１５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２６）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ４４０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２８）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｎ６５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３０）などの各種バチルス株由来のセルラーゼ；パイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来の耐熱性セルラーゼ；フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ、などが挙げられる。これらの中で、糖化効率の向上の観点から、トリコデルマ・リーゼ、トリコデルマ・ビリデ、又はフミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼが好ましい。また、上記の微生物に対して外来性に導入したセルラーゼ遺伝子を発現させて得られた組換えセルラーゼを用いてもよい。具体例としては、トリコデルマ・リーゼに対してアスペルギルス・アクリータス由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子を導入して得られたＸ３ＡＢ１株（Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，１７４１−１７４９）が生産するセルラーゼＪＮ１１が挙げられる。あるいは、上記他のセルラーゼを含むセルラーゼ製剤を本発明の酵素組成物に含有させて、本発明の変異ＢＧＬと併用してもよい。当該セルラーゼ製剤の具体例としては、セルクラスト（登録商標）１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社製）、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、ＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅTMＤＵＥＴ（ジェネンコア社製）、及びウルトラフロ（登録商標）Ｌ（ノボザイムズ社製）などが挙げられる。
【００５９】
本発明の酵素組成物に含まれるセロビオハイドロラーゼの具体例としては、トリコデルマ・リーゼ、トリコデルマ・ビリデ、又はフミコーラ・インソレンス由来のセロビオハイドロラーゼ、パイロコッカス・ホリコシ由来の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、などが挙げられる。これらの中で、糖化効率の向上の観点から、トリコデルマ・リーゼ、トリコデルマ・ビリデ、又はフミコーラ・インソレンス由来のセロビオハイドロラーゼが好ましく、トリコデルマ・リーゼ由来のセロビオハイドロラーゼがより好ましい。
【００６０】
本発明の酵素組成物に含まれるエンドグルカナーゼの具体例としては、トリコデルマ・リーゼ、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium celluloriticus）、フミコーラ・インソレンス、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、バチルス（Bacillus）、サーモビフィダ（Thermobifida）、セルロモナス（Cellulomonas）由来の酵素などが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、トリコデルマ・リーゼ、フミコーラ・インソレンス、バチルス、セルロモナス由来のエンドグルカナーゼが好ましく、トリコデルマ・リーゼ由来のエンドグルカナーゼがより好ましい。
【００６１】
本発明の酵素組成物に含まれる本発明の変異ＢＧＬ以外のＢＧＬの例としては、アスペルギルス・ニガー由来のＢＧＬ（例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム１８８やメガザイム社製ＢＧＬ）、ならびにトリコデルマ・リーゼ又はペニシリウム・エメルソニイ（Penicillium emersonii）由来のＢＧＬなどが挙げられる。このうち、バイオマス糖化効率向上の観点から、ノボザイム１８８、トリコデルマ・リーゼ由来ＢＧＬが好ましく、トリコデルマ・リーゼ由来のＢＧＬがより好ましい。
【００６２】
本発明の酵素組成物に含まれるヘミセルラーゼの例としては、トリコデルマ・リーゼ由来のヘミセルラーゼ；バチルス・エスピー  ＫＳＭ−Ｎ５４６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２９）由来のキシナラーゼ；アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・ビリデ、フミコーラ・インソレンス、又はバチルス・アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）由来のキシラナーゼ；サーモマイセス（Thermomyces）、オウレオバシジウム（Aureobasidium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモトガ（Thermotoga）、サーモアスクス（Thermoascus）、カルドセラム（Caldocellum）、又はサーモモノスポラ（Thermomonospora）属由来のキシラナーゼ；バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）由来のβ−キシロシダーゼ；セレノモナス・ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）由来β−キシロシダーゼ、などが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、バチルス・エスピー、アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・ビリデもしくはストレプトマイセス由来のキシラナーゼ、又はセレノモナス・ルミナンティウム由来のβ−キシロシダーゼが好ましく、バチルス・エスピーもしくはトリコデルマ・ビリデ由来のキシナラーゼ、又はセレノモナス・ルミナンティウム由来のβ−キシロシダーゼがより好ましい。あるいは、好ましいヘミセルラーゼの例としては、特開２０１３−２４３９５３号公報、特開２０１３−２４３９５４号公報、特開２０１５−１６７５５２号公報、特開２０１６−１１９８７７号公報、特開２０１７−０１２００６号公報、又は特開２０１７−０３５００１号公報に記載の変異キシラナーゼが挙げられる。
【００６３】
本発明のバイオマス糖化剤（又は本発明の酵素組成物）中における本発明の変異ＢＧＬの含有量は、その総タンパク質量中、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上さらに好ましくは２質量％以上であり、且つ好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、さらに好ましくは４０質量％以下、さらにより好ましくは３０質量％以下であるか、あるいは、総タンパク質量中、好ましくは０．５〜７０質量％、より好ましくは１〜５０質量％、さらに好ましくは２〜４０質量％、さらにより好ましくは２〜３０質量％である。好ましくは、本発明のバイオマス糖化剤（又は本発明の酵素組成物）の総タンパク質量は３〜２５質量％である。
【００６４】
本発明の酵素組成物中における本発明の変異ＢＧＬ以外の他のセルラーゼの含有量は、その総タンパク質量中、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは５０質量％以上であり、且つ好ましくは９９質量％以下、より好ましくは９５質量％以下であるか、あるいは、その総タンパク質量中、好ましくは１０〜９９質量％、より好ましくは３０〜９５質量％、さらに好ましくは５０〜９５質量％である。
【００６５】
本発明の酵素組成物中におけるエンドグルカナーゼの含有量は、その総タンパク質量中、好ましくは１質量％以上、より好ましくは５質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上であり、且つ好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、さらに好ましくは４０質量％以下であるか、あるいは、その総タンパク質量中、好ましくは１〜７０質量％、より好ましくは５〜５０質量％、さらに好ましくは１０〜４０質量％である。
【００６６】
本発明の酵素組成物中におけるヘミセルラーゼの含有量は、その総タンパク質量中、好ましくは０．０１質量以上％、より好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは０．５以上質量％であり、且つ好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下であるか、あるいは、その総タンパク質量中、好ましくは０．０１〜３０質量％、より好ましくは０．１〜２０質量％、さらに好ましくは０．５〜２０質量％である。
【００６７】
本発明の糖の製造方法は、上記本発明の変異ＢＧＬでバイオマスを糖化することを含む。当該方法においては、本発明の変異ＢＧＬとして、上述した本発明の酵素組成物を使用してもよい。当該本発明の方法における糖化処理の条件は、本発明の変異ＢＧＬ及び併用するその他酵素が失活しない条件であれば特に限定されない。適切な条件は、バイオマスの種類や前処理工程の手順、使用する酵素の種類により当業者が適宜決定することができる。
【００６８】
当該糖化処理においては、バイオマスを含む懸濁液に、本発明の変異ＢＧＬを添加することが好ましい。該懸濁液中のバイオマスの含有量は、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）の観点から、好ましくは０．５〜２０質量％、より好ましくは３〜１５質量％、さらに好ましくは５〜１０質量％である。
【００６９】
当該懸濁液に対する本発明の変異ＢＧＬの使用量は、バイオマスの種類、形状及び量、ならびに併用する酵素の種類及び性質などにより適宜決定される。好ましくは、バイオマス質量に対して、変異ＢＧＬの質量として０．０４〜６００質量％、より好ましくは０．１〜１００質量％、さらに好ましくは０．１〜５０質量％である。
【００７０】
当該糖化処理の反応ｐＨは、糖化効率又は糖生産効率向上、及び生産コスト低減の観点から、好ましくはｐＨ４〜９、より好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ５〜７である。当該糖化処理の反応温度は、糖化効率の向上、糖化効率又は糖生産効率向上、及び生産コスト低減の観点から、２０〜９０℃が好ましく、より好ましくは２５〜８５℃、さらに好ましくは３０〜８０℃、さらに好ましくは４０〜７５℃、さらに好ましくは４５〜６５℃、さらに好ましくは４５〜６０℃、さらに好ましくは５０〜６０℃である。当該糖化処理の反応時間は、バイオマスの種類、形状及び量や、酵素量などに合わせて適宜設定することができる。糖化効率又は糖生産効率向上、及び生産コスト低減の観点からは、好ましくは１〜５日間、より好ましくは１〜４日間、さらに好ましくは１〜３日間である。
【００７１】
さらに、バイオマスの糖化効率又は糖生産効率向上の観点からは、本発明の糖の製造方法は、バイオマスを本発明の変異ＢＧＬで糖化する前に、該バイオマスを前処理する工程をさらに含むことが好ましい。当該前処理としては、例えば、アルカリ処理、粉砕処理及び水熱処理からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。当該前処理としては、糖化効率向上の観点から、アルカリ処理が好ましく、糖化効率をさらに向上させる観点から、アルカリ処理と粉砕処理を行うことが好ましく、アルカリ処理と粉砕処理を並行して行うことがより好ましい。該粉砕処理は、湿式粉砕であっても乾式粉砕であってもよいが、乾式粉砕が好ましい。より好ましくは、固体のアルカリとバイオマスとを一緒に粉砕処理にかけアルカリ処理と並行して乾式粉砕を行う（アルカリ混合粉砕処理）。
【００７２】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の物質、製造方法、用途、方法等を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００７３】
〔１〕下記（i）、（ii）及び(iii)から選択される変異β−グルコシダーゼ：
（i）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基がＧｌｎに、かつ配列番号１の６５５位に相当する位置のアミノ酸残基がＴｈｒに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（ii）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列がＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（iii）該（i）又は（ii）のポリペプチドを含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
〔２〕好ましくは、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列が、
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列、又は、
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
である、〔１〕記載の変異β−グルコシダーゼ。
〔３〕好ましくは、親β−グルコシダーゼと比べてプロテアーゼ耐性が高い、〔１〕又は〔２〕記載の変異β−グルコシダーゼ。
〔４〕好ましくは、前記親β−グルコシダーゼが、i）配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基がＧｌｎでなく、かつ６５５位に相当する位置のアミノ酸残基がＴｈｒでないか；ii）配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列がＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙでないか；又は、iii）該i）とii）の両方である、〔３〕記載の変異β−グルコシダーゼ。
【００７４】
〔５〕該〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の変異β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド。
〔６〕該〔５〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔７〕該〔５〕のポリヌクレオチド又は該〔６〕記載のベクターを含む形質転換体。
〔８〕好ましくは糸状菌である、〔７〕記載の形質転換体。
〔９〕該〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の変異β−グルコシダーゼを含有するバイオマス糖化剤。
〔１０〕該〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の変異β−グルコシダーゼでバイオマスを糖化することを含む、糖の製造方法。
【００７５】
〔１１〕変異β−グルコシダーゼの製造方法であって、
（a）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基をＧｌｎに、かつ配列番号１の６５５位に相当する位置のアミノ酸残基をＴｈｒに置換すること、又は
（b）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列をＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙに置換すること、
を含む、方法。
〔１２〕好ましくは、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドが、i）配列番号１の６４９位に相当する位置のアミノ酸残基がＧｌｎでなく、かつ６５５位に相当する位置のアミノ酸残基がＴｈｒでないか；ii）配列番号１の６５３位から６５８位までに相当する領域のアミノ酸配列がＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙでないか；又は、iii）該i）とii）の両方である、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕好ましくは、前記変異β−グルコシダーゼが、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドと比べてプロテアーゼ耐性が高い、〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
〔１４〕好ましくは、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドが、
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列、又は、
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列に対して、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなる、〔１１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の方法。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。
【００７７】
実施例１  変異ＢＧＬ発現プラスミドの構築
（１）Ｎ６４９Ｑ／Ｑ６５５Ｔ変異体の発現プラスミドの構築
アスペルギルス・アクリータスのβ−グルコシダーゼ１（ＡａＢＧＬ１；配列番号１）に対してＮ６４９Ｑ及びＱ６５５Ｔの変異を導入した変異体（Ｎ６４９Ｑ／Ｑ６５５Ｔ）をコードする発現プラスミドを構築した。
ＰＣＲ−ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ法により、分泌シグナル配列を有するＡａＢＧＬ１プレタンパク質をコードする遺伝子（ＡａＢＧＬ１遺伝子、配列番号３）に変異導入した。すなわち、表１記載のプライマーＢＧＬ１−Ｎ６４９Ｑ／Ｑ６５５ＴとＢＧＬ１−Ｒを用いて、アスペルギルス・アクリータス  Ｎｏ．Ｆ−５０株ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して付属のプロトコルに従い、ＡａＢＧＬ１遺伝子の変異導入部位から下流側の遺伝子を増幅した。増幅断片はアガロースゲル電気泳動によって分離し回収した。得られた増幅断片をメガプライマーとしてＢＧＬ１−Ｆプライマーとともに用いて、Ｆ−５０株ゲノムＤＮＡを鋳型として同様の方法でＰＣＲを行い、変異が導入された全長ＡａＢＧＬ１遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡ断片をプライマー由来のNot I及びSph Iサイトで切断し、糸状菌発現ベクターｐＮＡＮ８１４２（Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９６，６０：３８３−３８９）の同サイトに組み込んで発現プラスミドを構築した。ＤＮＡ断片に変異が正しく導入されていることをシークエンシングにより確認した。
【００７８】
（２）６５３ＹＥＰＡＳＧ６５８変異体の発現プラスミドの構築
ＡａＢＧＬ１のアミノ酸配列（配列番号１）における６５３〜６５８位のアミノ酸配列ＮＡＱＶＡＴが、オルソログの配列ＹＥＰＡＳＧに置換された変異体（６５３ＹＥＰＡＳＧ６５８）をコードする発現プラスミドを構築した。上記（１）と同様の手順で、ただしプライマーＢＧＬ１−Ｎ６４９Ｑ／Ｑ６５５Ｔの代わりに表１記載のプライマーＢＧＬ１−６５３ＹＥＰＡＳＧを用いて、発現プラスミドを構築した。
【００７９】
【表１】
2019146520.tif 000002
【００８０】
実施例２  変異ＢＧＬ発現株の作製
形質転換体の作製はＧｏｍｉらの方法（Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９８７，５１：２５４９−２５５５）に従って行った。すなわち、ＭＭ（ＮＨ4+）平板培地（１．０％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｔａｒｔｒａｔｅ、０．１３％ ＫＣｌ、０．１３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３８％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０００１１％ Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、０．０００１１％ Ｈ3ＢＯ3、０．０００１６％ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０００１６％ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．００５％ ＥＤＴＡ、０．０００５％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０００５％ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．００２２％ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ｐＨ６．５）に生育したアスペルギルス・オリザ（A. oryzae）ｎｉａＤ３００株に５ｍＬのＴｗｅｅｎ／ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、０．０１％ ＮａＣｌ）を加え、スプレッダーを用いて胞子を懸濁した。この胞子懸濁液をＭＭ（ＮＨ4+）液体培地２００ｍＬ（５００ｍＬ容バッフルつき三角フラスコ）に加え、３０℃、１６０ｒｐｍで１晩振盪培養した。適度に生育させて培養を終了し、ミラクロス上で集菌し、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（以下、ＰＢ；０．８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４）で洗浄した。回収した菌体を５０ｍＬ容遠心管に入れ、Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ社製）３０ｍｇ、Ｌｙｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｒｄｒｉｃｈ社製）５０ｍｇの入ったＰＢ１０ｍＬに懸濁し，ゆっくりと振盪しながらインキュベート（３０℃、９０ｍｉｎ）した。また、３０分毎にピペッティングすることで菌体をほぐした。その後、プロトプラストのみを回収するためにミラクロスでろ過し、得られたろ液を遠心分離（４℃、２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。沈殿をＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（以下、ＴＢ Ｉ；０．８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、５０ｍＭ ＣａＣｌ2）１０ｍＬに懸濁し、遠心分離（４℃、２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。その後、上清を除去し、沈殿を２００μＬのＴＢ Ｉに懸濁したものをプロトプラスト溶液とした。プロトプラスト数を顕微鏡により確認し、およそ１０7個／ｍＬのプロトプラストをその後の操作に用いた。
【００８１】
実施例１（１）又は（２）で得られた発現プラスミドＤＮＡ約１０μｇを含む溶液に等量の２×ＴＢ Ｉを加え、これをプロトプラスト溶液に添加した。さらにその０．２倍量のＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  II（以下、ＴＢ II；５０％ＰＥＧ６０００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、５０ｍＭ ＣａＣｌ2）を加え、穏やかに混合して１０ｍｉｎ氷上に静置した。その後１ｍＬのＴＢ IIを加え、室温で１５ｍｉｎ静置した。次に１０ｍＬのＴＢ Ｉを加え、遠心分離（４℃、２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。上清を除去し，沈殿を２００μＬのＴＢ Ｉに懸濁し、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＲＥ；１．０％ Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ ＮａＮＯ3、４．６８％ ＮａＣｌ、０．１３％ ＫＣｌ、０．１３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３８％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０００１１％ Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、０．０００１１％ Ｈ3ＢＯ3、０．０００１６％ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０００１６％ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．００５％ ＥＤＴＡ、０．０００５％ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０００５％ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．００２２％ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ｐＨ６．５）に乗せ、トップアガー（ＲＥ、０．７％寒天）を重層した。得られた形質転換体は核を純化するためにモノクロ化を行った。すなわち、マイクロチューブに２００μＬのＴｗｅｅｎ／ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えたものを２つ用意し、形質転換体が生育したＲＥ培地プレートから白金耳の先端に付着させた形質転換体の胞子を片方のＴｗｅｅｎ／ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎに懸濁した。そこから２μＬ取り、もう片方のＴｗｅｅｎ／ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎと混合することで１００倍希釈した。その溶液から１００μＬをＭＭ（ＮＯ3-、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）（ＭＭ（ＮＨ4+）のＡｍｍｏｎｉｕｍ  ｔａｒｔｒａｔｅの代わりにＮａＮＯ3を添加し、さらにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加したもの）平板培地にスプレッドし、３０℃で３〜４日間静置培養した。そこに生育してきたコロニーから１株選択し，ＭＭ（ＮＯ3-）平板培地に単離した。
【００８２】
実施例３  変異ＢＧＬのプロテアーゼ耐性
実施例２で得られた形質転換体及び野生型ＡａＢＧＬ１（ＷＴ）発現株をそれぞれＭＭ（ＮＯ3-）液体培地１００ｍＬに植菌し、３０℃で振とう培養した。毎日（培養１〜８日後）培養上清を１ｍＬずつサンプリングし、そのうちの２０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルには、分離ゲル７．５％、濃縮ゲル５％からなるポリアクリルアミドゲル（Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ：Ｎ，Ｎ’−Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ＝２９．２：０．８）を用いた。培養上清に６×Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．３７５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、６％ ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．００３％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ［ｐＨ６．８］）を添加し、１００℃で１０分間処理して試料とした。縦型スラブ電気泳動装置（ＡＴＴＯ社製）を用い、泳動用緩衝液（０．１％ ＳＤＳ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ）中で２０ｍＡの定電流下で電気泳動を行った。電気泳動後、ＣＢＢ溶液（０．２％ ＣＢＢ Ｒ−２５０、５０％ Ｅｔｈａｎｏｌ、１０％ Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）中で染色を行い、脱色液（１０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ、７．５％ Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）で脱色した。タンパク質の分子量マーカーにはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）（タカラバイオ社製）を用いた。
【００８３】
培養上清中における発現産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した結果を図１〜３に示す。野生型ＡａＢＧＬ１（ＷＴ）では、培養３〜４日後には約１３０ｋＤａのタンパク質として生産されているが、５日後以降は約１００ｋＤａと約３０ｋＤａのタンパク質に切断され、さらに７日後以降にはタンパク質の切断が進んで約３０ｋＤａのタンパク質がなくなっていた（図１）。この約３０ｋＤａのタンパク質の消失はＡａＢＧＬ１の活性の低下を意味する。これに対して、Ｎ６４９Ｑ／Ｑ６５５Ｔ変異体は、培養８日後でも約１３０ｋＤａのタンパク質がメインのバンドとして観察され、プロテアーゼによる切断に耐性を有していることが示された（図２）。さらに６５３ＹＥＰＡＳＧ６５８変異体では、観察した培養期間において約１３０ｋＤａのタンパク質の分解はほとんど見られなかった（図３）。以上のことから、本発明の変異ＢＧＬは、培養中における菌体外プロテアーゼによる分解を免れることが示された。
【００８４】
ＷＴで約１３０ｋＤａバンドの分解が観察された６日目の培養上清中のＢＧＬ活性を、ｐＮＰ（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）法にて測定した。培養上清を希釈して酵素溶液を調製した。１．５ｍＭ  ｐＮＰ−Ｇｌｃ溶液（１００ｍＭ Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．０）を基質溶液とした。３７℃で５ｍｉｎプレインキュベートした１００μＬの酵素溶液に、１．５ｍＭの基質溶液を等量混合することで酵素反応を開始した。３７℃、１０ｍｉｎの反応後、２ｍＬの１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3溶液を加えて反応を停止させた。その後４０５ｎｍの吸光度を測定し、ｐＮＰの吸光係数（ε４０５ｎｍ＝０．０１８５ｍＬ／ｎｍｏｌ・ｃｍ−１）を用いて遊離したｐＮＰ濃度を算出し、酵素活性を求めた。ブランクには、酵素溶液１００μＬに１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3 ２ｍＬ、基質溶液１００μＬの順に加えた酵素反応が生じない液を用いた。１分間に１μｍｏｌのｐＮＰを遊離させる酵素量を１Ｕｎｉｔと定義し、以下の式により培養上清中の酵素活性を算出した。
酵素活性（Ｕｎｉｔ／ｍＬ）＝Ａ４０５／１８．５×２．２ｍＬ／（１０ｍｉｎ）×（１／０．１ｍＬ）×培養上清の希釈率
その結果、Ｎ６４９Ｑ／Ｑ６５５Ｔ変異体、および６５３ＹＥＰＡＳＧ６５８変異体では、６日目の培養上清において、野生型に比べてＢＧＬ活性が高く維持されていた。
【００８５】
【表２】
2019146520.tif 000003
【００８６】
実施例４  変異ＢＧＬの活性
実施例２で得られた変異ＢＧＬ発現株から変異ＢＧＬ酵素を精製し、そのＢＧＬ活性を実施例３と同様の手順でｐＮＰ法にて測定した。以下の式により精製酵素の比活性を算出した。
比活性（Ｕｎｉｔ／ｍｇ）＝酵素活性（Ｕｎｉｔ／ｍＬ）／タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）
結果を表３に示す。変異ＢＧＬは、インタクトなＷＴのＢＧＬと同等又はそれ以上の比活性を示した。
【００８７】
【表３】
2019146520.tif 000004
【００８８】
以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
【図１】
2019146520.tif 000005
【図２】
2019146520.tif 000006
【図３】
2019146520.tif 000007
【配列表】
2019146520000001.app